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Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Departamento de Bioquímica e Imunologia
PAPEL DAS CATECOLAMINAS E DO AMP CÍCLICO
NO METABOLISMO DE PROTEÍNAS EM MÚSCULO
ESQUELÉTICO DE RATOS DIABÉTICOS
Amanda Martins Baviera
Tese apresentada ao Departamento de
Bioquímica e Imunologia da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto - USP para
obtenção do grau de Doutor em Ciências -
Área de concentração: Bioquímica
Ribeirão Preto
2007
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FICHA CATALOGRÁFICA
Baviera, Amanda Martins
Papel das catecolaminas e do AMP cíclico no metabolismo de
proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos. Ribeirão
Preto, 2007.
183p. 30cm
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto/USP - Departamento de Bioquímica e Imunologia
- Área de concentração: Bioquímica
Orientadora: Kettelhut, Isis do Carmo
Data da defesa: 09/03/2007
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DEDICO ESTA TESE
A Deus, pela força dada, pelas oportunidades, pela vida,
A minha mãe Zeni, por ser o exemplo máximo de verdadeiro amor, não
medindo esforços ao tentar me compreender e oferecer seu apoio em todas as
minhas decisões; pela paciência nos momentos de ausência; por nunca dizer
não em lutar ao meu lado pelos meus sonhos; pelo exemplo de força e amor
incondicionais; enfim, por tudo,
A minha irmã Valéria, pelo amor, apoio e compreensão em tantos
momentos de ausência; por ser tão sensata ao me aconselhar durante os
períodos de esmorecimento; ao meu cunhado Gino, pelo apoio e exemplo de
máxima dedicação na realização de seu trabalho,
A minha sobrinha Mariana, pelo grande amor, por ser minha grande
companheirinha e meu verdadeiro orgulho, por fazer renascer em mim um
sentimento que há muito tempo eu tinha abandonado, a vontade de ser uma
eterna criança,
A meu pai Antonio Augusto (in memorian) pelo extremo amor e por me
dar mais de uma vez a chance de viver e seguir meu caminho, e a minha avó
Benedita (in memorian), pelo amor e pelo exemplo de vontade de viver e fazer o
bem ao próximo. Mesmo longe sei que vocês me acompanham sempre...
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
A Profa. Isis do Carmo Kettelhut, por ter oferecido a oportunidade única
de aprender tantas coisas, de âmbito profissional e pessoal. Agradeço por me
receber e me aceitar em seu laboratório nestes 5 anos, permitindo o
aprimoramento de minha formação cientifica, e por me ensinar a compreender a
importância do estudo do Controle do Metabolismo. Agradeço por oferecer um
misto entre a paciência em me ensinar e a liberdade dada na realização da
tese; pelo carinho, amizade e respeito pela individualidade dos alunos que é sua
marca registrada. E agradeço especialmente pelo exemplo de garra pela vida,
dedicação e amor por aquilo que faz, que nos serve de eterna lição,
Ao Prof. Renato Hélios Migliorini, por ser tão incansável na sua
tentativa de despertar em seus alunos a vontade de aprender e aprender bem;
“Toda a arte de ensinar é apenas a arte de acordar a curiosidade
natural nas mentes jovens, com o propósito de serem satisfeitas mais tarde.”
(Anatole France)
Pelo seu amor à pesquisa e pelos inesquecíveis momentos de apoio,
A Profa. Maria Teresa Pepato, pela amizade e pela paciência durante
minha passagem em seu Laboratório onde, sob sua orientação, construí os
melhores alicerces para a minha posterior formação aqui em Ribeirão Preto; por
ser meu grande exemplo de empenho para realização do melhor trabalho, e de
sinceridade em todos os momentos; pelo apoio tão especial que permitiu com
que eu realizasse o sonho de fazer meu Doutorado junto à equipe da Profa. Isis,
e por ter me dado a chance inicial de perceber que a pesquisa científica era o
meu caminho,
Ao Prof. Luiz Carlos Carvalho Navegantes, pela amizade e pelo exemplo
deixado no Laboratório de extrema dedicação e empenho naquilo que faz e pelo
brilhante trabalho realizado, que hoje serve de referência para quem aqui quer
trilhar sua carreira científica em Metabolismo. Pelas valiosas sugestões dadas
em tantos momentos, especialmente durante a escrita do projeto de Pós-
doutoramento e para a finalização desta tese.
AGRADECIMENTOS
A Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, por servir de berço para a
realização deste meu grande sonho e por oferecer a mais bela visão do
amanhecer,
Ao Laboratório de Controle do Metabolismo, que me recebeu de portas
abertas e permitiu que eu adquirisse ensinamentos científicos e crescimento
pessoal para o resto da vida,
A Neusa Maria Zanon, pela amizade e pelo apoio técnico de extrema
qualidade; por me indicar a maneira mais coerente de conduzir as práticas
científicas; pela paciência em me ensinar a mesma coisa mais de uma vez; pela
energia e força de vontade contagiantes; sem seu apoio com certeza este
trabalho não teria chegado até aqui,
A Elza Aparecida Filippin (Pila), pela especial amizade, agradáveis e
divertidas conversas, pelo valioso auxílio nos experimentos, por sua sinceridade
e pelas caronas; a Maria Antonieta Garófalo, pela amizade, agradável
convivência e apoio técnico; a Andreza Bonifácio e Adriano Duran, pela
agradável convivência,
Aos especiais amigos que ganhei durante os 5 anos de convivência
neste Laboratório: ao irmão proteolítico Walter Dias Junior e irmã
gliceroneogênica Valéria Ernestânia Chaves, pela grande amizade; por
momentos tão divertidos no Laboratório, em minha casa ou nos eventos festivos;
pelas conversas, pelo apoio, trocas de idéias e principalmente por me escutarem
e me levantarem em momentos de esmorecimento; enfim, meus eternos e
verdadeiros irmãos,
Aos amigos do Laboratório de Controle do Metabolismo, pela
convivência tão agradável e harmoniosa; por muitas vezes transformarem os
momentos de tensão em situações de alegria; por criarem um ambiente
verdadeiramente familiar, inesquecível: Danúbia Frasson e seu humor
contagiante, Maria Emília S. Santos, Lidiany Góis e Renata Boschini. E aos
amigos mais recentes: Eduardo C. Lira, Dawit A. Gonçalves, Julia Bueno,
Luciana Carvalho, Silvia de Paula, Alexandre Machado e Marcos de Jesus,
Aos ex-alunos do Laboratório de Controle do Metabolismo que tive a
feliz oportunidade de conhecer: Prof. Elísio Evangelista e Profa. Nair Kawashita,
por serem pessoas realmente especiais; Profa. Analúcia Xavier; Prof. Célio
Machado; Profa. Eliana Pinheiro, pelo carinhoso auxílio no período de minha
mudança de nível; Maria Ida Ravanelli, pela amizade e momentos divertidos,
Aos amigos do Departamento de Bioquímica, que tornaram a passagem
pela pós-graduação um momento especialmente único: Gyselle Baccan,
Fernanda Cabral, Carlos Ono, Olavo Pereira Junior, William Borges e a todos os
demais não citados aqui, mas que com certeza contribuíram para tornar esta
passagem agradável. A Letícia Maragno por sua carinhosa amizade e pela
realização dos experimentos de PCR. Aos “meninos do Porão”, pela especial
amizade: Renê Beleboni, pelo exemplo de dedicação e inteligência e pelo
empenho em ajudar os colegas; Ricardo Mendonça (Pancinha), por ser o melhor
e único companheiro de disciplinas, por sua amizade e por me ensinar uma
maneira tão tranqüila de conduzir os problemas; e Ruither Carolino, pela
amizade, apoio e oportunidade na realização de experimentos,
Aos amigos especiais que ganhei neste período: Victor Diaz Galban,
pela grande e inesquecível amizade, na verdade vinda desde minha passagem
por Araraquara, onde tivemos longas conversas “informáticas” via telefone;
pelas conversas divertidas, auxílios incansáveis e muitos ensinamentos. Ao
Prof. Ithamar Vugman, pela tão delicada amizade e por me fazer enxergar um
lado tão bonito do mundo que até então eu não percebia. Ao Seu Duda (Zezão),
por me acompanhar tantas vezes ao ponto de ônibus altas horas da noite, me
divertindo ao contar suas aventuras pelo Nordeste, e pelos deliciosos sorvetes,
Aos amigos de longa data, cujo apoio constante foi essencial para a
concretização de minha vida profissional: Marília Micelli, Carlos E. Micelli, Paulo
R. Testa, Idelfonso Baviera, Carlos Laurato, Eunice Marques, Marlei Manfrin,
Luiz César Manetti e Luiz Felício Colombini (Batatais); Dona Helena Paschoa e
Angelina Morales (Araraquara). Obrigada por acreditarem em mim e por me
acolherem em tantos momentos,
Aos professores do Departamento de Bioquímica e Imunologia, em
especial ao Prof. Dr. Marcelo Damário Gomes pelo uso de seu laboratório e pela
realização dos experimentos de PCR e aos professores Dr. Vanderlei Rodrigues,
Dr. Wilson Lodi e Dr. Cláudio Costa Neto pelo uso de equipamentos de seus
laboratórios; ao Dr. Fernando Cunha (Farmacologia) e Dr. José Antunes
Rodrigues (Fisiologia) pelos experimentos realizados em seus laboratórios,
Aos funcionários do Departamento de Bioquímica e Imunologia, em
especial Ivone, Lúcia, Téia e Ronaldo,
Aos ratos, que há tanto tempo têm tornado possível a realização de meu
trabalho,
A todos aqueles que contribuíram que alguma forma para minha
formação acadêmica,
Ao apoio financeiro de CNPq e FAPESP.
Índice
Resumo.....................................................................................................................i
Summary.................................................................................................................iii
1. Introdução............................................................................................................ 1
2. Objetivos............................................................................................................ 15
3. Materiais e Métodos
3.1. Animais....................................................................................................... 17
3.2. Indução do diabetes: administração de estreptozotocina (STZ) ................. 17
3.3. Coleta de sangue para determinação de glicemia......................................18
3.4. Estudo do papel do sistema nervoso simpático no metabolismo de
proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos
3.4.1. Modelo Experimental: simpatectomia química através da
administração de guanetidina ......................................................... 18
3.4.2. Grupos experimentais.......................................................................19
3.4.3. Determinação das catecolaminas no plasma e nos músculos
esqueléticos soleus e EDL .............................................................. 20
3.4.4. Velocidade de renovação de noradrenalina nos músculos
esqueléticos soleus e EDL .............................................................. 21
3.4.5. Procedimento experimental para o estudo da proteólise em
músculos esqueléticos de ratos em diferentes períodos de
diabetes e simpatectomia................................................................ 22
3.4.6. Avaliação da atividade proteolítica....................................................23
3.4.7. Procedimentos experimentais para a avaliação das vias
proteolíticas ..................................................................................... 24
a. Via Lisossomal .............................................................................. 24
b. Via Dependente de Cálcio.............................................................26
c. Via Dependente de ubiquitina-proteassoma e Via Residual..........27
3.4.8. Procedimento experimental para a avaliação da síntese total de
proteínas........................................................................................... 29
3.5. Estudo do papel da pentoxifilina no metabolismo de proteínas em
músculo esquelético de ratos diabéticos
3.5.1. Modelo experimental: tratamento in vivo com pentoxifilina............... 32
3.5.2. Efeito direto in vitro da pentoxifilina................................................... 32
a. Efeito da insulina in vitro................................................................ 33
b. Efeito do H89 in vitro ..................................................................... 33
3.5.3. Avaliação da ação da pentoxifilina in vivo e in vitro nas
concentrações intracelulares de AMP cíclico (AMPc) em músculo
esquelético de ratos normais e diabéticos....................................... 33
3.5.4. Medida dos níveis plasmáticos de TNF-
α
(Fator de Necrose
Tumoral
α
) após tratamento com pentoxifilina ................................ 34
3.5.5. Quantificação da m-calpaína e da calpastatina em músculos de
ratos após tratamento com pentoxifilina............................................ 35
a. Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS
(SDS-PAGE).................................................................................. 35
b. Western blot para detecção de m-calpaína e calpastatina............ 36
3.5.6. Trancrição reversa acoplada a PCR (RT-PCR) para determinação
da expressão do RNAm da atrogin-1 (ou MAFbx)............................. 37
a. Extração de RNA........................................................................... 37
b. Quantificação da amostra de RNA ................................................38
c. Produção de cDNA - Transcrição Reversa (RT)............................ 38
d. PCR semi-quantitativa................................................................... 39
e. Densitometria ................................................................................ 39
f. PCR quantitativa............................................................................. 40
3.5.7. Avaliação da ação da pentoxifilina in vivo e in situ no metabolismo
de proteínas em músculo esquelético de ratos adultos normais e
diabéticos com a utilização da técnica de microdiálise ..................... 41
3.6. Análise estatística....................................................................................... 42
3.7. Reagentes................................................................................................... 42
4. Resultados
Estudo do papel do sistema nervoso simpático no metabolismo de proteínas em
músculo esquelético de ratos diabéticos
4.1. Modelo Experimental: simpatectomia química através da administração de
guanetidina .......................................................................................................43
4.1.1. Efeito da simpatectomia química no peso corporal........................... 44
4.1.2. Efeito da simpatectomia química na concentração plasmática de
glicose .............................................................................................. 45
4.1.3. Efeito da simpatectomia química na concentração das
catecolaminas plasmáticas e musculares...................................... 50
4.1.4. Efeito do diabetes na velocidade de renovação de noradrenalina
muscular............................................................................................ 58
4.1.5. Efeito da simpatectomia química na proteólise total e na
participação das vias proteolíticas de soleus e EDL de ratos em
diferentes períodos de diabetes...................................................... 62
a. Proteólise total em soleus e EDL de ratos diabéticos
simpatectomizados..................................................................... 62
b. Participação das vias proteolíticas em soleus e EDL de ratos
diabéticos simpatectomizados....................................................... 64
- Via Lisossomal ........................................................................... 66
- Via Dependente de Cálcio.......................................................... 72
- Via Dependente de ubiquitina-proteassoma e Via Residual....... 78
4.1.6. Velocidade da síntese de proteínas em soleus de ratos diabéticos
simpatectomizados na ausência ou presença de adrenalina in vitro.....87
Estudo do papel da pentoxifilina no metabolismo de proteínas em músculo
esquelético de ratos diabéticos
4.2. Modelo Experimental: Estudo das ações in vivo da pentoxifilina em
músculo esquelético de ratos normais e diabéticos ................................... 91
4.2.1. Níveis intracelulares de AMPc .......................................................... 91
4.2.2. Proteólise total .................................................................................. 91
4.2.3. Participação das vias proteolíticas.................................................... 94
- Via Lisossomal................................................................................ 94
- Via Dependente de Cálcio............................................................... 94
- Via Dependente de ubiquitina-proteassoma e Via Residual ........... 99
4.2.4. Detecção das proteínas m-calpaína e calpastatina......................... 103
4.2.5. Expressão do RNAm da atrogin-1................................................... 105
4.2.6. Níveis plasmáticos de TNF-
α
.......................................................... 107
4.2.7. Efeito de uma única injeção de pentoxifilina na degradação de
proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos................... 107
4.3. Estudo das ações in vitro da pentoxifilina em músculo esquelético de
ratos normais e diabéticos ........................................................................112
4.3.1. Níveis intracelulares de AMPc......................................................... 112
4.3.2. Proteólise total................................................................................. 114
4.3.3. Participação das vias proteolíticas .................................................. 114
- Via Lisossomal.............................................................................. 114
- Via Dependente de Cálcio............................................................. 118
- Via Dependente de ubiquitina-proteassoma e Via Residual ......... 118
4.3.4. Efeito da insulina in vitro na ação anti-proteolítica da pentoxifilina
em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos .................. 123
4.3.5. Efeito do H89 in vitro na ação anti-proteolítica da pentoxifilina em
músculo esquelético de ratos normais e diabéticos........................ 127
4.4. Estudo das ações in vivo da pentoxifilina na síntese protéica em músculo
esquelético de ratos normais e diabéticos................................................ 132
4.5. Estudo das ações in vivo e in situ da pentoxifilina em músculo
esquelético de ratos normais e diabéticos adultos.................................. 132
5. Discussão ........................................................................................................138
5.1. Concentração de noradrenalina muscular em animais submetidos ao
diabetes experimental............................................................................... 138
5.2. Papel das catecolaminas no metabolismo de proteínas em músculos
esqueléticos de animais diabéticos .......................................................... 140
a. Proteólise total e vias proteolíticas em músculos de animais
diabéticos simpatectomizados - 1 dia de diabetes ...................... 140
b. Proteólise total e vias proteolíticas em músculos de animais
diabéticos simpatectomizados - 3 dias de diabetes..................... 146
c. Proteólise total e vias proteolíticas em músculos de animais
diabéticos simpatectomizados - 5 dias de diabetes..................... 149
d. Síntese protéica em soleus de animais diabéticos
simpatectomizados...................................................................... 150
5.3. Papel da pentoxifilina no metabolismo de proteínas em músculos
esqueléticos de animais diabéticos........................................................... 152
6. Referências Bibliográficas ............................................................................. 163
Anexo
Resumo
Resumo
i
Resumo
Estudos prévios de nosso laboratório demonstraram que o sistema nervoso
simpático (SNS) exerce ações anabólicas no metabolismo de proteínas na
musculatura esquelética de ratos normais, estimulando a síntese protéica e inibindo a
proteólise total em músculos de animais normais. No entanto, a importância do SNS
no controle do metabolismo protéico em uma situação de catabolismo permanece
desconhecida. Assim, a primeira parte do presente trabalho teve como objetivo
investigar o papel das catecolaminas no controle dos processos de degradação e
síntese de proteínas em músculos esqueléticos de animais diabéticos.
Para isso, foram estudadas as alterações ocorridas na proteólise total e a
participação das vias proteolíticas em músculos soleus e extensor digitorum longus -
EDL de ratos diabéticos simpatectomizados (administração de guanetidina). Foram
estudados animais jovens com 1, 3 e 5 dias de diabetes (indução por estreptozotocina
- STZ) tratados ou não com guanetidina durante 1 ou 2 dias.
A instalação do diabetes promoveu um aumento progressivo no conteúdo de
noradrenalina (NOR) em soleus e EDL de animais, provavelmente por conseqüência
de uma queda na velocidade de degradação da catecolamina nestes animais. Estes
animais também apresentam uma menor atividade simpática neste tecido. A
simpatectomia química foi capaz de promover uma redução eficiente no conteúdo da
NOR muscular nestes animais diabéticos.
Os resultados do presente trabalho mostraram que a simpatectomia química foi
capaz de promover um aumento adicional nos valores de proteólise total em soleus de
animais após 1 e 3 dias de diabetes (33% e 15%, respectivamente) e em EDL de
animais 1 dia pós-STZ (17% em relação ao grupo diabético controle). Estas respostas
são decorrentes do surpreendente aumento nas atividades da via proteolítica
lisossomal (soleus), da via dependente de cálcio (EDL) e da via dependente de
ubiquitina-proteassoma (soleus e EDL). A simpatectomia química não promoveu
alterações na degradação protéica muscular no 5
o
dia de deficiência insulínica. Assim,
parece que as catecolaminas têm efeito na atividade dos processos de degradação
protéica em músculo esquelético de ratos nas fases iniciais do diabetes (1 e 3 dias
pós-STZ); em períodos mais prolongados de deficiência insulínica, a presença ou
ausência das catecolaminas parece não interferir com as respostas observadas na
proteólise muscular.
Resumo
ii
Em trabalhos anteriores do laboratório ficou demonstrado que as
catecolaminas são capazes de inibir a proteólise muscular através da ligação a
receptores adrenérgicos dos subtipos β
2
e β
3
e conseqüente aumento de AMPc
intracelular na musculatura esquelética de ratos normais. A pentoxifilina (PTX) é uma
droga com comprovada ação anti-proteolítica em situações de atrofia muscular, sendo
este efeito atribuído à redução nos níveis plasmáticos de TNF-α. No entanto, tornou-se
interessante a investigação da possibilidade da PTX exercer diretamente seu efeito
anti-proteolítico muscular, através de aumento nas concentrações de AMPc, uma vez
que ela é capaz de inibir a fosfodiesterase do AMPc (enzima responsável pela
degradação do nucleotídeo). Assim, o segundo objetivo deste trabalho foi investigar o
efeito in vivo e in vitro da PTX nos processos de degradação de proteínas na
musculatura esquelética de animais normais e diabéticos.
Os resultados do presente trabalho mostraram uma redução na proteólise total
e na atividade das vias proteolíticas dependentes de cálcio e de ubiquitina-
proteassoma em EDL de animais diabéticos (3 dias pós-STZ) tratados in vivo durante
4 dias com PTX em comparação aos animais não tratados. Este efeito foi atribuído ao
aumento nas concentrações de AMPc. Nestes mesmos animais foi observada redução
nos níveis protéicos de m-calpaína (protease do sistema proteolítico dependente de
cálcio) e na expressão do RNAm da atrogin-1 (componente do sistema proteolítico
dependente de ubiquitina-proteassoma). Músculos de ratos normais e diabéticos
incubados na presença de PTX apresentaram aumento no conteúdo de AMPc e
redução na proteólise total e na participação das vias proteolíticas citadas
anteriormente. Assim, ficou demonstrado que a PTX é capaz de promover diretamente
redução na proteólise total em músculos de animais normais (in vitro) e diabéticos (in
vivo e in vitro), e que este efeito pode ser mediado por um mecanismo ligado ao
aumento de AMPc intracelular, semelhante ao efeito anti-proteolítico muscular
atribuído às catecolaminas. Ainda vale a pena salientar que o mesmo efeito da PTX foi
observado em ratos diabéticos adultos com a utilização da técnica de microdiálise.
Summary
Summary
iii
Summary
Studies from our laboratory have previously shown that sympathetic nervous
system (SNS) exerts anabolic effects on skeletal muscle protein metabolism from
normal rats, through stimulation of protein synthesis and inhibition of proteolysis.
However, the importance of SNS in the control of protein metabolism in a catabolic
situation remains unknown. Thus the present work was performed to elucidate the role
of catecholamines in the control of the protein degradation and synthesis on the
skeletal muscles from diabetic rats.
The alterations in the overall proteolysis and participation of proteolytic systems
were investigated in soleus and extensor digitorum longus - EDL muscles from diabetic
rats after chemical sympathectomy (guanethidine administration). Male young rats
were used after 1, 3 and 5 days of diabetes (induced by streptozotocin - STZ injection)
and treated or not with guanethidine during 1 or 2 days.
A progressive increase in the norepinephrine content in soleus and EDL
muscles after diabetes induction is probably due to a reduction in the rate of
catecholamine degradation in these animals and a lower sympathetic activity. The
guanethidine administration resulted in a marked decrease in the norepinephrine
content of muscles from these diabetic rats.
The data from the present work showed that the chemical sympathectomy
promoted an additional increase in the rate of total protein degradation in soleus from
rats after 1 and 3 days of diabetes (33% and 15%, respectively) and in EDL muscles 1
day after STZ administration (17% in comparison to diabetic control group). These
responses were consequence of the surprising increase in the participation of the
lysosomal (soleus), the Ca
2+
-dependent (EDL) and the ubiquitin-proteasome-
dependent proteolytic pathways (soleus and EDL).
The chemical sympathectomy induced changes in the muscle protein
degradation of rats after 1 and 3 days of diabetes, without any effect in the 5
th
day of
insulin deficiency. These findings suggest that catecholamines control the activity of the
proteolytic systems in skeletal muscle from animals in the early stage of diabetes (1
and 3 days after STZ); in prolonged periods of insulin deficiency, catecholamines seem
not interfere in muscle proteolysis.
Summary
iv
Previous studies from our laboratory demonstrated that catecholamines inhibit
muscle proteolysis in normal rats by binding to β
2
and β
3
-adrenoceptors and promoting
increase in the cAMP intracellular levels.
The pentoxifylline (PTX, a xanthine derivative compound) has an antiproteolytic
action in situations of skeletal muscle wasting attributed to the inhibition of TNF-α
synthesis. Nevertheless, an alternative hypothesis is that PTX reduces muscle protein
catabolism directly by increasing cAMP intracellular levels in skeletal muscle, because
this drug is a cAMP-phosphodiesterase inhibitor (enzyme that degrades the
nucleotide). So, the second goal of the present work was to investigate the effect of
PTX in vivo and in vitro on protein degradation in skeletal muscle from normal and
acutely diabetic rats.
In vivo four days PTX treatment induced a decrease in the rate of overall
proteolysis and in the activities of Ca
2+
-dependent and ubiquitin-proteasome-dependent
proteolytic systems in EDL muscles from diabetic rats (3 days after STZ). This effect
was attributed to an increase in cAMP content in these muscles. The increased protein
levels of m-calpain (Ca
2+
-dependent protease) and mRNA of atrogin-1 (ubiquitin-
proteasome-dependent component) in muscles from diabetic rats were reduced after
PTX in vivo treatment. The addition of PTX to the incubation medium induced an
increase in the cAMP levels and reduced the rate of overall proteolysis and the
activities of Ca
2+
-dependent and ubiquitin-proteasome-dependent degradative systems
in EDL muscles from normal and diabetic rats.
These results showed that PTX exerts a direct inhibitory effect on protein
degradation in muscles from normal (in vitro) and diabetic (in vivo and in vitro) rats, by
increasing cAMP intracellular levels, similar to the antiproteolytic effect of
catecholamines in skeletal muscle. Similar results were also found in adult diabetic rats
using a microdialysis technique with PTX treatment and perfusion.
Introdução
Introdução
1
1) Introdução
A manutenção da massa muscular esquelética é resultado do balanço
dinâmico existente entre os processos de síntese e de degradação de
proteínas. Embora a contínua degradação de proteínas celulares pareça ser
uma condição de gasto desnecessário de energia, este processo exerce uma
série de funções importantes para a manutenção da homeostase celular:
- Rápida remoção de proteínas regulatórias (por exemplo, fatores
transcricionais, enzimas, fatores inibitórios) essenciais para o controle do
metabolismo e crescimento celular. Diferente da maioria dos mecanismos de
regulação, a degradação de proteínas é um processo irreversível. A destruição
de um componente protéico pode levar à finalização rápida e completa de
processos celulares e conseqüente mudança na composição celular;
- Eliminação seletiva de proteínas anormais conseqüentes de
mutações, erros biossintéticos, ação de radicais livres ou desnaturação
(especialmente a altas temperaturas), consistindo em um mecanismo de
controle essencial para a sobrevivência celular;
- Funcionamento adequado do sistema imune, onde a fração de
pequenos peptídeos gerada durante a degradação protéica é dirigida ao
retículo endoplasmático e transportada para a superfície celular por moléculas
do complexo de histocompatibilidade maior. Tais peptídeos são reconhecidos
por linfócitos que monitoram as superfícies celulares, promovendo assim
destruição da célula;
- Em situações de ingestão calórica inadequada ou doenças catabólicas
(como diabetes, câncer, SIDA, sepse entre outras), a degradação total de
proteínas celulares, especialmente no tecido muscular esquelético,
disponibilizam aminoácidos essenciais para a neoglicogênese, síntese de
novas proteínas e geração de energia.
Introdução
2
Portanto, o estudo do controle dos processos de síntese e degradação
de proteínas fornece informações importantes para o entendimento dos
mecanismos envolvidos na regulação da massa muscular esquelética. O
metabolismo de proteínas neste tecido é regulado por numerosos fatores
nutricionais, hormonais e neurais, que promovem ajustes metabólicos frente às
mais diversas situações fisiológicas ou patológicas. Qualquer desequilíbrio
entre estes dois distintos processos poderá promover atrofia ou hipertrofia do
tecido muscular. Assim, a atrofia muscular pode ser conseqüência de uma
redução na síntese protéica, ou de uma ativação da degradação de proteínas,
ou ainda uma associação de ambos os processos.
A perda de massa corporal, que é característica freqüente de vários
estados patológicos, resulta principalmente da perda de proteínas do tecido
muscular, que em um adulto normal representa aproximadamente metade das
proteínas totais do corpo. A persistência de um estímulo catabólico afeta
significativamente a homeostase do tecido muscular esquelético, resultando em
perda de massa e fraqueza, com conseqüente atraso ou prejuízo da
reabilitação, piorando a qualidade de vida do paciente.
A atrofia muscular origina-se principalmente de um aumento da
velocidade de degradação de proteínas, sendo os mecanismos e os fatores
envolvidos para a geração da resposta hipercatabólica (e, portanto, ativadores
dos sistemas de degradação protéica muscular) alvos de intenso estudo
atualmente. Além disso, a contribuição relativa dos diferentes sistemas de
degradação de proteínas para o aumento da velocidade de proteólise é ainda
um campo para elucidação. Tem sido aceito que as diferentes vias de
degradação de proteínas atuam coordenadamente para a promoção do
catabolismo protéico.
A regulação da degradação de proteínas reflete a integração de
diferentes fatores, tais como redução na disponibilidade de nutrientes, níveis
elevados de citocinas pró-inflamatórias, alterações na homeostase hormonal,
interferência na sinalização intracelular e/ou na junção neuromuscular, falta de
exercício, etc. Experimentalmente, manipulações hormonais (por exemplo,
hipercorticosteronemia ou hipoinsulinemia), redução da atividade contrátil (por
Introdução
3
exemplo, desnervação ou desuso) ou aumento artificial das citocinas
circulantes resultam em um aumento na velocidade de degradação de
proteínas, isto é, uma resposta hipercatabólica na musculatura esquelética. O
aparecimento de atrofia muscular é resultado da persistência do
hipercatabolismo, e a manutenção deste quadro torna-se uma condição
extremamente prejudicial, uma vez que o organismo pode apresentar perdas
na habilidade de se recuperar dos danos conseqüentes de estresse e/ou
patologias. Assim, situações de contínua perda de massa muscular resultam
em aumento de morbidade e mortalidade, quando importantes músculos (por
exemplo, aqueles associados com processos respiratórios) tornam-se
atrofiados. Consequentemente, um grande número de pacientes em situações
de caquexia promovida por câncer, sepse, queimaduras ou traumas morrem
quando a perda de massa protéica muscular excede 70% (que corresponde a
uma perda de peso corporal de aproximadamente 30%). Portanto, o
entendimento da ativação diferencial das vias proteolíticas e a compreensão
dos fatores que controlam sua atividade oferecem informações úteis que
auxiliam na identificação de novos alvos terapêuticos para o desenvolvimento
de compostos anti-atróficos.
Durante a década passada muitos estudos foram realizados na tentativa
de elucidar a relativa contribuição dos diferentes sistemas de degradação de
proteínas para o desenvolvimento da atrofia muscular, além dos mecanismos
responsáveis por sua ativação. Todas as células possuem os seguintes
sistemas responsáveis pela degradação das proteínas intracelulares:
lisossomal, dependente de cálcio (Ca
2+
), dependente de ubiquitina (Ub)-
proteassoma e residual (ou independente de ATP).
Sistema proteolítico lisossomal
A proteólise lisossomal foi o primeiro sistema proteolítico descrito, sendo
o mais conhecido. O lisossomo corresponde a uma importante organela
envolvida em processos degradativos nas células de mamíferos, contendo
altas concentrações de diferentes hidrolases ácidas e normalmente possuindo
Introdução
4
um lúmen acídico (pH 4-5). Catepsinas B, D, H e L são as principais proteases
lisossomais, determinando a capacidade proteolítica dos lisossomos. O
principal papel funcional das catepsinas está associado à degradação de
proteínas exógenas endocitadas, proteínas de membranas e glicoproteínas
(Rechsteiner, 1987; Lecker et al., 1999a), em diferentes tecidos como fígado,
coração, músculo esquelético, dentre outros.
Inicialmente, acreditava-se que a degradação protéica que ocorre no
interior dos lisossomos era inespecífica e isenta de regulação; porém, na
continuidade dos estudos ficou comprovado que a proteólise lisossomal
apresenta especificidade, onde proteínas que possuem uma seqüência de
aminoácidos KFERQ (Lys-Phe-Glu-Arg-Gln) se ligam a uma proteína da família
HSP70 (proteínas de choque térmico) de 73KDa presente na membrana dos
lisossomos, conhecida por HSC73. O complexo formado entre o substrato e a
HSC73 é importante para promover o transporte da proteína para o interior da
organela, ocorrendo assim sua degradação (Dice, 1990; Cuervo et al., 1995).
O aumento na velocidade de degradação de proteínas pelos lisossomos
pode ser observado em determinados tecidos e em alguns estados patológicos,
sendo as proteínas solúveis ou citoplasmáticas os principais substratos. No
jejum, por exemplo, ocorre um aumento na degradação de proteínas pelos
lisossomos em tecidos como fígado e coração, porém não em músculos
esqueléticos (Wing et al., 1991).
Em alguns modelos de atrofia muscular pode ser observada uma
estimulação coordenada do processo proteolítico lisossomal com os sistemas
dependentes de Ca
2+
e de Ub-proteassoma. No entanto, dentre as
endopeptidases lisossomais envolvidas na proteólise intracelular, as catepsinas
B e L têm sido consideradas como as principais proteases ativadas em
situações de atrofia muscular.
A importância do processo proteolítico lisossomal para o
desenvolvimento de atrofia muscular tem sido pouco avaliada; parece que seu
papel restringe-se aparentemente na degradação de proteínas não-
miofibrilares (Blommaart et al., 1997). No entanto, trabalhos têm demonstrado
um aumento na expressão de proteases lisossomais em situações
Introdução
5
características de hipercatabolismo muscular. Foi observado aumento na
expressão do RNAm da catepsina L em músculos obtidos de animais
submetidos a modelos de atrofia como desuso (Taillandier et al., 1996), câncer
(Deval et al., 2001; Combaret et al., 2002), uremia (Lecker et al., 2004) e sepse
(Jagoe et al., 2002). Aumento na atividade da catepsina B tem sido
demonstrado em músculos de camundongos distróficos (Sanada et al., 1978;
Sano et al., 1988) e em pacientes com distrofia muscular de Duchenne
(Katunuma et al., 1978). Atrofia muscular induzida por administração de
glicocorticóide (Dardevet et al., 1995) e pelo desuso (Taillandier et al., 1996)
também está associada com níveis aumentados de RNAm das catepsinas B e
D.
Em animais hipofisectomizados (Kettelhut et al., 1988) ou submetidos a
uma dieta deficiente em proteínas (Tawa et al., 1992), nas quais há uma
diminuição da proteólise muscular total, ocorre uma concomitante redução na
atividade do sistema proteolítico lisossomal, que parece ser devido à queda
dos hormônios tireoidianos.
Sistema proteolítico dependente de Ca
2+
O sistema proteolítico dependente de Ca
2+
envolve a atividade de
cisteína-proteases denominadas de calpaínas (Ono et al., 1999), que se
dividem em duas principais isoformas: a microcalpaína (µ-calpaína ou calpaína
I), que apresenta metade da atividade máxima em concentrações de 5 a 50 µM
de Ca
2+
(Inomata et al., 1983), e a milicalpaína (m-calpaína ou calpaína II),
ativada com concentrações de Ca
2+
compreendida entre 200 a 1000 µM (Tsuji
& Imahori, 1981; Inomata et al., 1983). As células que contêm calpaínas
também possuem um inibidor endógeno específico para esta protease, a
calpastatina, já tendo sido isolada de diversos tecidos (Waxman & Krebs, 1978;
Murachi, 1983; Otsuka & Goll, 1987), inclusive da musculatura esquelética
(Nakamura et al., 1984).
Alguns trabalhos correlacionam um aumento na atividade do sistema
proteolítico dependente de Ca
2+
na musculatura esquelética com alterações na
homeostase intracelular dos íons Ca
2+
. Situações de perda de massa em
Introdução
6
distrofias musculares, queimaduras e sepse normalmente estão associadas
com aumento nos níveis intracelulares de Ca
2+
(Tidball et al., 2000;
Christensen et al., 2004). O aumento na proteólise observado em modelos de
atrofia muscular (como sepse e imobilização) foi revertido após tratamento dos
animais com drogas (nifedipina, por exemplo) que restauram as concentrações
intracelulares de Ca
2+
a valores normais (Williams et al., 1999; Wagatsuma et
al., 2002). No entanto, situações de perda de massa muscular também têm
sido correlacionadas com alterações na expressão dos componentes deste
sistema proteolítico. Foi observado um aumento na expressão de m-calpaína
em músculos esqueléticos de ratos portadores de sarcoma de Yoshida
(Temparis et al., 1994).
A participação da via proteolítica dependente de Ca
2+
em músculos
esqueléticos também tem importância em situações, como por exemplo, atrofia
muscular por desnervação (Furuno et al., 1990) e no diabetes (Pepato et al.,
1996). Alguns hormônios parecem ter efeito na atividade desta via; as
catecolaminas (Navegantes et al., 1999, 2001) e a testosterona (Galo, 1995)
exercem ação anti-proteolítica na musculatura esquelética através de inibição
da via dependente de Ca
2+
.
Sistema proteolítico dependente de Ub-proteassoma
O sistema proteolítico dependente de Ub-proteassoma é a principal
maquinaria intracelular responsável pela degradação de proteínas contráteis da
musculatura esquelética, desempenhando importante papel no
desenvolvimento de atrofia muscular. A via dependente de Ub-proteassoma
compreende dois passos sucessivos. Inicialmente, as proteínas destinadas à
degradação são “marcadas” por um processo de poliubiquitinação que envolve
a ação seqüencial da enzima ativadora de ubiquitina (E1), enzimas
conjugadoras de ubiquitina (E2) e enzimas ligadoras de ubiquitina (E3)
(Hershko et al., 1979; Ciechanover et al., 1980). Após a identificação e
marcação da proteína a ser degradada, ocorre participação do complexo
enzimático de natureza citosólica, formado pelo proteassoma 20S (Orlowski,
1990), o qual constitui o centro catalítico de uma protease maior, o
Introdução
7
proteassoma 26S (Rechsteiner, 1987), que degrada o substrato em pequenos
peptídeos. Ao contrário dos demais componentes proteolíticos, esse sistema é
ativado na presença de ATP (Goldberg & St. John, 1976; Hershko &
Ciechanover, 1982). Esta maquinaria proteolítica está envolvida na degradação
de proteínas anormais oriundas de erros pós-sintéticos, mutações, oxidações,
desnaturações (Jagoe & Goldberg, 2001) além da degradação de produtos de
oncogenes viral e celular (Ciechanover et al., 1994; Stancovski et al., 1995) e
de proteínas reguladoras de meia vida curta, como fatores de transcrição
(Jentsch et al., 1990) e enzimas chaves de vias metabólicas.
Trabalhos têm demonstrado ativação da via dependente de Ub-
proteassoma em várias situações fisiológicas e patológicas: jejum (Wing &
Goldberg, 1993; Medina et al., 1995), ausência de gravidade (Taillandier et al.,
1996), diabetes (Dice, 1987; Pepato et al., 1996; Galban et al., 2001),
desnervação muscular (Furuno et al., 1990; Tawa et al., 1997), após tratamento
com hormônios tireoidianos e glicocorticóides (Dardevet et al., 1995),
septicemia (Tiao et al., 1996; Voisin et al., 1996), câncer (Temparis et al., 1994;
Attaix et al., 1998) e acidose metabólica (Mitch et al., 1994).
Recentemente, avanços têm sido obtidos na elucidação dos detalhes da
participação do sistema proteolítico dependente de Ub-proteassoma no
desenvolvimento da atrofia muscular em várias situações, além do controle da
atividade dos componentes desta via por diferentes fatores hormonais. Dentre
estes componentes, tem recebido um grande destaque a investigação da
contribuição de uma proteína da família das ubiquitina ligases (E3), cuja
expressão é específica para o tecido muscular, denominada atrogin-1 (ou
MAFbx). Alterações na expressão gênica da atrogin-1 foram inicialmente
estudadas por Gomes et al. (2001), sendo demonstrado um aumento no RNAm
desta enzima na musculatura esquelética de camundongos submetidos a
diversas situações que apresentavam atrofia muscular, como jejum, diabetes,
câncer e falência renal. Assim, foi proposto que este componente parece ser
um elemento essencial para o processo de ubiquitinação dos substratos
protéicos a serem degradados, levando ao desenvolvimento de atrofia
muscular nestas diferentes condições estudadas.
Introdução
8
Em músculos depletados de ATP permanece ainda uma atividade
proteolítica chamada de via residual ou independente de ATP. Não se
conhecem as enzimas envolvidas neste processo proteolítico, nem os
substratos preferenciais ou sua regulação (Kettelhut et al., 1988). Apenas
alguns trabalhos realizados em nosso laboratório mostraram que esta via
também pode ser regulada, tendo sido encontrada redução em sua atividade
em músculos soleus de ratos diabéticos, após 10 dias da administração de
estreptozotocina (Pepato et al., 1996) e após 4 dias de simpatectomia química
induzida pelo tratamento com guanetidina (Navegantes et al., 1999), mas o
significado fisiológico de tais alterações permanece ainda para ser esclarecido.
Dentre as proteases que podem estar contribuindo com a atividade do
processo proteolítico residual na musculatura esquelética, as caspases, as
aminopeptidases e as endopeptidases (como as thimet oligopeptidases - TOP)
parecem exercer um papel importante na degradação de proteínas ou
peptídeos no interior da célula em colaboração com outros processos
proteolíticos. As caspases parecem ter envolvimento na degradação das
miofibrilas e dos complexos de actomiosina, liberando unidades monoméricas
de actina e miosina para a subseqüente degradação pela via dependente de
Ub-proteassoma (Du et al., 2004; Lee et al., 2004). Já as aminopeptidases e as
TOP degradam os oligopeptídeos de 3 a 24 aminoácidos gerados pelo
proteassoma em aminoácidos livres (Saric et al., 2004).
Trabalhos realizados em nosso laboratório mostraram a importância de
diferentes fatores hormonais e neurais no controle do metabolismo de
proteínas na musculatura esquelética de ratos. Vale a pena destacar os
estudos que verificaram o papel da insulina e do sistema nervoso simpático
(SNS, representado pelas catecolaminas) no controle da degradação protéica
em músculos de ratos.
A deficiência de insulina está geralmente associada com atrofia
muscular esquelética. Trabalhos anteriores do nosso laboratório (Pepato et al.,
1996) mostraram que, após a indução do diabetes com estreptozotocina (STZ),
Introdução
9
ocorrem variações temporais na atividade das diferentes vias proteolíticas no
músculo, sendo observado um aumento na proteólise muscular na fase aguda
e uma redução em períodos mais prolongados de deficiência insulínica. Assim,
foi demonstrado que a deficiência aguda de insulina (1 e 3 dias após a
instalação do diabetes) é capaz de promover um aumento na proteólise total
em músculos soleus e EDL de ratos, conseqüência da elevação na atividade
dos sistemas proteolíticos dependente de Ca
2+
(soleus e EDL, 1 dia de
diabetes; soleus, 3 dias de diabetes) e dependente de Ub-proteassoma (EDL, 3
dias de diabetes). Na deficiência crônica de insulina (5 e 10 dias após a
indução do diabetes) foi observada queda na atividade de ambas as vias
proteolíticas, tanto em soleus quanto em EDL (Pepato et al., 1996), alcançando
valores até menores que as taxas de proteólise observadas em soleus de ratos
controles. Esses dados sugerem que a ativação destas vias proteolíticas na
fase inicial do diabetes é responsável, pelo menos em parte, pela perda de
massa na deficiência de insulina, considerando ainda a queda da velocidade de
síntese de proteínas, que ocorre desde o primeiro dia de ausência insulínica.
Desta maneira, ficou demonstrado que as alterações ocorridas nas atividades
dos diferentes sistemas proteolíticos dependem tanto da duração do diabetes
quanto do tipo de fibra que prevalece no tecido muscular (soleus - fibras
predominantemente oxidativas do tipo I; EDL - fibras predominantemente
glicolíticas do tipo II).
A maioria dos trabalhos que investigam a participação dos sistemas
proteolíticos no desenvolvimento da atrofia muscular na deficiência de insulina
prioriza o estudo da participação da via proteolítica dependente de Ub-
proteassoma, sem a preocupação em observar a alteração em outros sistemas
envolvidos na degradação de proteínas. Assim, o aumento na atividade da via
dependente de Ub-proteassoma observado em músculos de animais diabéticos
tem sido atribuído à elevação na expressão do RNAm de diferentes
componentes deste sistema, tal como ubiquitina, E2
14k
, E3α e subunidades do
proteassoma (Price et al., 1996; Lecker et al., 1999b; Liu et al., 2000; Combaret
et al., 2004).
Introdução
10
Além disso, trabalhos de Mitch e colaboradores têm relatado a
contribuição de uma protease apoptótica, a caspase-3, na degradação de
proteínas em músculo esquelético de animais diabéticos. A elevação na
atividade desta protease em músculos gastrocnemius de ratos diabéticos foi
demonstrada através do aumento na geração de fragmentos de actina de
14KDa, produto característico da atividade da caspase (Du et al., 2004; Lee et
al., 2004). De acordo com estes estudos, a atividade da caspase-3 parece ser
um passo inicial importante para a perda de proteínas musculares no estado
diabético, uma vez que esta caspase estaria gerando produtos que seriam
rapidamente removidos pela proteólise dependente de Ub-proteassoma. Como
esta ação da caspase-3 parece semelhante àquela atribuída as calpaínas para
o processo de degradação de proteínas na musculatura esquelética, e devido
aos resultados anteriores do laboratório que mostraram a importância da via
dependente de Ca
2+
em diversas situações, o presente trabalho se propôs a
continuar o estudo para investigar a contribuição da via dependente de Ca
2+
na
degradação de proteínas musculares.
Além da insulina, as catecolaminas também exercem um papel
anabólico no controle do metabolismo de proteínas na musculatura esquelética.
Trabalhos na literatura demonstraram que a administração de agonistas β
2
-
adrenérgicos é capaz de estimular hipertrofia muscular esquelética (Yang &
McElligott, 1989; Mersmann, 1998) e reduzir a atrofia de músculos
desnervados (Zeman et al., 1987). Trabalho de Navegantes et al. (1999)
demonstrou que o bloqueio adrenérgico agudo resulta em aumento na
proteólise total em músculos soleus, devido a uma elevação da atividade da via
proteolítica dependente de Ca
2+
. A incubação de músculos de ratos
previamente simpatectomizados com isoproterenol (agonista β adrenérgico)
reduziu a proteólise total, sugerindo que o SNS exerce ações anti-proteolíticas
na musculatura esquelética. Na investigação dos mecanismos intracelulares
envolvidos neste efeito anabólico do SNS, foi demonstrado que a incubação de
músculos na presença de adrenalina, clembuterol (agonista β
2
seletivo) ou CL
316,243 (agonista β
3
seletivo) é capaz de diminuir os valores de proteólise total
Introdução
11
em cerca 20% em comparação aos controles (Navegantes et al., 2000, 2006).
Dibutiril AMPc e isobutilmetilxantina (inibidor da fosfodiesterase de AMPc,
enzima responsável pela degradação deste nucleotídeo) reduzem a proteólise
em soleus e EDL (Navegantes et al, 2000). Estas ações são mediadas através
da inibição do sistema proteolítico dependente de Ca
2+
(Navegantes et al.,
2001). Assim, ficou demonstrado que as catecolaminas exercem um controle
inibitório na proteólise muscular esquelética, efeito este mediado por receptores
adrenérgicos dos subtipos β
2
e β
3
, com a participação de vias intracelulares
dependentes de AMPc. Além disso, foi confirmado que o efeito anabólico das
catecolaminas ocorre pelo controle da proteólise dependente de Ca
2+
,
possivelmente através de fosforilação direta e inibição das calpaínas, ou
fosforilação e ativação da calpastatina, ou mesmo através de controle direto da
expressão gênica destes componentes (Navegantes et al., 2001, 2002). Não
pode ainda ser afastada a possibilidade das catecolaminas interferirem também
na concentração intracelular de íons Ca
2+
.
Tendo em vista a importância do sistema nervoso simpático no controle
do metabolismo de proteínas na musculatura esquelética de ratos em uma
situação basal, promovendo inibição da proteólise principalmente por
diminuição da atividade da via dependente de Ca
2+
, o objetivo deste trabalho
foi estudar o papel das catecolaminas no metabolismo protéico muscular de
animais submetidos a uma situação de catabolismo. Assim, foi avaliado no
presente trabalho a influência do SNS no metabolismo de proteínas em
músculos soleus e EDL de ratos diabéticos. A alta atividade proteolítica
observada em animais com diabetes agudo pode ser ainda maior na ausência
de catecolaminas? Para isso, foram estudados os processos de degradação e
síntese de proteínas de animais em diferentes tempos de diabetes e
submetidos à simpatectomia química induzida pela administração de
guanetidina, um inibidor pré-sináptico da liberação de noradrenalina.
O estudo do metabolismo protéico em uma situação experimental que se
caracteriza pela ausência tanto da insulina quanto das catecolaminas pode
trazer esclarecimentos importantes relacionados ao cross-talk entre as
Introdução
12
cascatas de sinalização de ambos os hormônios. As ações desempenhadas
isoladamente por estes hormônios têm sido bastante estudadas, no entanto,
pouco se sabe sobre as interações existentes entre eles e seu significado no
controle de processos fisiológicos. Atualmente, tem sido demonstrado o cross-
talk existente entre as cascatas de sinalização da insulina e das catecolaminas
(principalmente do sinal que envolve ativação de receptores β
2
-adrenérgicos e
aumento de AMPc intracelular). No entanto, merece destaque o papel
desempenhado pela proteína quinase B (PKB ou AKT), um intermediário da
sinalização da insulina que está envolvido no mecanismo inibitório da proteólise
muscular exercido pela insulina e IGF-1 (Glass, 2003; Guttridge, 2004; Latres
et al., 2005; Nader, 2005). Trabalhos recentes na literatura têm comprovado a
ativação da AKT por intermediários da sinalização que envolve o AMPc em
vários tecidos (Klein et al., 1999; Misra & Pizzo, 2005; Machida et al., 2005).
Trabalhos de Brennesvik et al. (2005) e Jensen et al. (2005) demonstraram um
aumento na fosforilação e na atividade da AKT em músculo esquelético
incubado na presença de adrenalina, e esta ativação ocorre através de uma
sinalização dependente de AMPc. Assim, a AKT pode ser um intermediário
comum no controle do metabolismo protéico muscular pela insulina e pelas
catecolaminas, sendo esse um campo muito interessante que necessita de
maiores investigações. Portanto, o estudo do metabolismo de proteínas em
animais diabéticos simpatectomizados pode trazer importantes informações
sobre as inter-relações entre os mecanismos de ação intracelulares da insulina
e das catecolaminas no controle do metabolismo de proteínas musculares.
É sabido que os derivados de xantinas são compostos que promovem
inibição da fosfodiesterase do AMPc e aumento nas concentrações
intracelulares deste nucleotídeo. Nesta classe de drogas, merece destaque a
pentoxifilina (PTX), a qual tem sido bastante utilizada em seres humanos, pois
além de ser bem tolerada, apresenta propriedades terapêuticas por seus
efeitos vasculares, aumentando o fluxo sanguíneo pulmonar, diminuindo a
viscosidade sanguínea (Berman et al., 1994; Kamphuis et al, 1994; Skjeldal et
al., 1994), além de exercer ações no sistema imune, com efeitos benéficos em
Introdução
13
transplantes de órgãos, SIDA e diabetes (Balazs & Kiss, 1994; Liang et al.,
1998; Stosic-Grujicic, 2001). Além disso, existem relatos na literatura
demonstrando a capacidade da PTX na redução da degradação de proteínas
da musculatura esquelética em algumas situações caracterizadas por atrofia
muscular, tal como sepse (Breuillé et al., 1993; Vary et al., 1999) e câncer
(Combaret et al., 1999). Tais estudos têm sugerido que este papel da PTX seja
decorrente do seu efeito na inibição da síntese e secreção do TNF-α (Fator de
Necrose Tumoral-α), citocina que parece estar relacionada com o aumento de
degradação protéica (Breuillé et al., 1993; Vary et al., 1999). A maioria destes
trabalhos demonstrou que a PTX é capaz de promover uma redução da
proteólise muscular pela inibição da via proteolítica dependente de Ub-
proteassoma em músculos de ratos sépticos ou portadores de tumor. Costelli et
al. (2002) também comprovaram a ação anti-proteolítica muscular da PTX
através de redução na atividade do proteassoma e da calpaína em músculos
gastrocnemius de ratos portadores de sarcoma de Yoshida AH-130.
Recentemente, o efeito anti-atrófico da PTX in vivo foi também
observado em músculos de animais desnervados e imobilizados, modelos
experimentais nos quais não ocorrem alterações nos níveis circulantes de
citocinas (Hinkle et al., 2005). Considerando trabalhos anteriores de nosso
laboratório que demonstraram que outro derivado de xantina e inibidor da
fosfodiesterase de AMPc, a isobutilmetilxantina, é capaz de promover inibição
da proteólise total em músculos incubados na presença da droga (Navegantes
et al., 2000), tornou-se interessante investigar a possibilidade de uma ação
anti-proteolítica muscular direta da PTX, diferente de seu efeito clássico de
redução da síntese de TNF-α. De acordo com esta hipótese, a droga estaria
inibindo a velocidade de degradação de proteínas por um mecanismo
semelhante ao proposto anteriormente por Navegantes et al. (1999-2002) para
explicar a ação anabólica do SNS no metabolismo protéico da musculatura
esquelética, isto é, através da ativação de proteína G e adenilato ciclase, e
conseqüente aumento nos níveis de AMPc.
Introdução
14
Portanto, o presente trabalho também teve como objetivo investigar o
papel anti-proteolítico direto da PTX, tanto in vivo quanto in vitro, no
metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos normais e ratos
submetidos a uma situação de catabolismo, o diabetes.
Objetivos
Objetivos
15
2) Objetivos Gerais
2.1) Considerando que as catecolaminas exercem um efeito anti-proteolítico, o
objetivo deste trabalho foi investigar o papel destes hormônios na resposta
proteolítica de músculos de ratos diabéticos. Para isto foram estudados ratos
diabéticos submetidos ao modelo de simpatectomia química pela administração
de guanetidina, droga que promove bloqueio simpático seletivo através da
inibição da liberação dos grânulos secretórios e da depleção das reservas de
noradrenalina nos neurônios pré-sinápticos.
Os objetivos específicos foram investigar o efeito da simpatectomia
química:
a) na proteólise total em músculos soleus (de fibras predominantemente
oxidativas do tipo I) e EDL (de fibras predominantemente glicolíticas do tipo II)
de ratos após 1, 3 e 5 dias de diabetes;
b) nos diferentes sistemas proteolíticos (lisossomal, dependente de Ca
2+
,
dependente de Ub-proteassoma e residual) em soleus e EDL de ratos após 1,
3 e 5 dias de diabetes;
c) na velocidade de síntese de proteínas em soleus de ratos após 1 e 3 dias de
diabetes, assim como o papel da adrenalina in vitro nesta via metabólica.
2.2) Considerando que o aumento nos níveis intracelulares de AMPc parecem
ser responsáveis pelo controle da proteólise dependente de Ca
2+
na
musculatura esquelética de ratos normais, o objetivo geral foi verificar o efeito
da pentoxifilina (droga que inibe a fosfodiesterase do AMPc) no metabolismo
de proteínas tanto em ratos normais como em animais submetidos à situação
de atrofia muscular, o diabetes mellitus.
Objetivos específicos:
Objetivos
16
a) Investigar o efeito in vivo e in vitro da pentoxifilina nas concentrações
intracelulares de AMPc em EDL de ratos normais e diabéticos (3 dias após a
administração de STZ);
b) Investigar o efeito in vivo e in vitro da pentoxifilina na proteólise total em EDL
de ratos normais e diabéticos (3 dias após a administração de STZ);
c) Investigar o efeito in vivo e in vitro da pentoxifilina nos diferentes sistemas
proteolíticos (lisossomal, dependente de Ca
2+
, dependente de Ub-proteassoma
e residual) em EDL de ratos normais e diabéticos (3 dias após a administração
de STZ);
d) Uma vez encontradas alterações na participação dos sistemas proteolíticos
em músculos de animais tratados com pentoxifilina, investigar o efeito in vivo
da droga na quantidade das proteínas m-calpaína e calpastatina e do RNAm da
atrogin-1, componentes dos sistemas proteolíticos dependentes de Ca
2+
e de
Ub-proteassoma, respectivamente, em músculos EDL de animais normais e
diabéticos;
e) Investigar o efeito in vivo da pentoxifilina na velocidade de síntese de
proteínas em EDL de ratos normais e diabéticos (3 dias após a administração
de STZ);
f) Investigar o efeito in vivo da pentoxifilina nas concentrações plasmáticas de
TNF-α de ratos normais e diabéticos (3 dias após a administração de STZ);
g) Investigar o efeito in vivo e in situ da pentoxifilina na concentração intersticial
de tirosina de músculos tibialis anterior de ratos normais e diabéticos adultos (3
dias após a administração de aloxana).
Materiais e Métodos
Materiais e Métodos
17
3) Materiais e Métodos
3.1) Animais
Foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar, pesando entre 70 e
80g, provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto (FMRP) - USP. Os animais foram mantidos no Biotério do Departamento
de Bioquímica, recebendo dieta balanceada (NUVLAB CR1 - NUVITAL) para
roedores e água ad libitum em ambiente com ciclos luz-escuro de 12 horas
(luzes acesas às 7:00 horas e apagadas às 19:00 horas) e temperatura
controlada de 25
o
C. Todos os animais permaneceram nestas condições
ambientais por pelo menos 24 horas antes de qualquer procedimento
experimental.
Os animais utilizados para a indução do diabetes permaneceram por
pelo menos dois dias no biotério antes da administração de STZ, recebendo
água e alimento ad libitum. Precedendo o dia da indução do diabetes, os
mesmos animais foram colocados em jejum de 14 a 16 horas, sendo mantidos
somente com água.
Todos os experimentos foram realizados pela manhã, entre 8:00 e
11:00 horas. O sacrifício dos animais foi realizado por deslocamento cervical ou
decapitação (quando necessária coleta de sangue). Os músculos soleus e EDL
foram imediatamente removidos e pesados em balança digital (ACATEC BEM
0100).
3.2) Indução do diabetes: administração de estreptozotocina (STZ)
A droga foi dissolvida em tampão citrato 0,01M (pH 4,5), sendo
protegida da luz. Após jejum de 14 a 16 horas e anestesia dos animais com
éter etílico, a STZ foi injetada na veia jugular em até 5 minutos após sua
dissolução. Foram administrados 135mg STZ/kg de peso corporal em volume
de 0,2mL por 80g de peso do animal (Pepato et al., 1996), que neste dia
apresentavam peso corporal de cerca de 70g. Após 90 minutos da
administração de STZ, os animais voltaram a receber alimento ad libitum.
Materiais e Métodos
18
Os experimentos para determinação da proteólise nos músculos
esqueléticos foram conduzidos em animais com 1, 3 ou 5 dias de diabetes, de
acordo com Pepato et al. (1996). A indução do diabetes foi comprovada pela
determinação da glicemia dos animais. Foram utilizados apenas animais que
apresentaram valores de glicemia iguais ou superiores a 400mg/dL.
3.3) Coleta de sangue para determinação de glicemia
O sangue foi coletado em tubos heparinizados, após decapitação dos
animais ou obtido pela cauda (realização de corte cerca de 2mm de sua
extremidade distal), 30 minutos antes do experimento. Após a coleta, o sangue
foi centrifugado para obtenção do plasma e a determinação das concentrações
de glicose foi realizada pelo método enzimático da glicose-oxidase (Bergmeyer
& Bernt, 1974) através do Glucose Analyser Beckman Instruments Inc. ou pelo
Kit glicose-oxidase da Labtest, através do espectrofotômetro U-200I HITACHI
em comprimento de onda de 505nm.
3.4) Estudo do papel do sistema nervoso simpático no
metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos
diabéticos
3.4.1) Modelo Experimental: simpatectomia química através da
administração de guanetidina
Para a indução da simpatectomia química, foi preparada solução de
sulfato de guanetidina (1-[2-guanidinoetil]-octahidroazocina) dissolvida em
salina 0,9% na concentração de 4mg/mL e pH ajustado para 7,4. A droga foi
administrada na região dorso-cervical, via subcutânea (s.c.), aos animais
diabéticos durante 1 ou 2 dias sucessivos (Navegantes et al., 1999), na dose
de 100 mg/Kg de peso corporal ao dia, entre 8:00 e 9:00 horas da manhã. O
grupo experimental, desta maneira, foi composto de animais diabéticos que
receberam injeções diárias de guanetidina (grupo DG). Os grupos controle
foram constituídos de ratos normais (grupo N) e diabéticos (grupo D) que
receberam injeções de salina pela mesma via. Os animais foram sacrificados
Materiais e Métodos
19
por deslocamento cervical ou decapitação 24 horas após a última injeção. A
indução da simpatectomia química foi comprovada através das determinações
das concentrações das catecolaminas no plasma, na medular adrenal e nos
músculos soleus e EDL.
3.4.2) Grupos experimentais
Todos os experimentos de determinação da concentração das
catecolaminas teciduais e de investigação da proteólise total e participação das
vias proteolíticas em músculos soleus e EDL foram conduzidos em três grupos
de animais:
a) grupo normal controle: ratos não injetados com estreptozotocina (STZ) e
portanto utilizados como controle dos demais grupos diabéticos. Além disso,
esse grupo recebeu injeção(ões) diária(s) de solução de NaCl 0,9% via s.c., a
fim de simular a situação experimental dos animais que passaram pela
simpatectomia química;
b) grupo diabético salina: ratos que receberam injeção única de STZ (135
mg/kg peso, i.v.) para a instalação do diabetes. Os experimentos foram
realizados nos períodos de 1, 3 e 5 dias após a administração da droga
diabetogênica. Tal grupo também era submetido à administração s.c. de salina
0,9%, configurando desta maneira o grupo controle do procedimento de
simpatectomia;
c) grupo
diabético guanetidina: ratos cujo quadro diabético foi instalado pela
administração de STZ e utilizados nos experimentos após 1, 3 e 5 dias da
injeção desta droga. Nos experimentos realizados 1 dia pós-STZ, os animais
receberam uma única dose da solução de guanetidina (100 mg/kg peso, s.c.)
no mesmo dia da indução do diabetes, porém no período da tarde, por volta
das 18:00 horas. Nos demais tempos de diabetes (3 e 5 dias pós-STZ) os
grupos foram tratados com guanetidina por 2 dias, sendo estes imediatamente
precedentes ao dia do experimento.
Nos experimentos após 5 dias de diabetes, os animais não receberam
o tratamento com guanetidina durante todo o período de instalação do quadro
diabético, devido à alta mortalidade causada por este procedimento; portanto,
Materiais e Métodos
20
tais animais forma submetidos à simpatectomia química 2 dias antes do
experimento (injeções no 3
o
e 4
o
dias pós-STZ).
Animais normais tratados somente com guanetidina foram estudados
em nosso laboratório, cujos resultados fizeram parte da dissertação de
Mestrado e tese de Doutorado do Dr. Luiz Carlos C. Navegantes e foram
publicados no American Journal of Physiology (1999, 2000, 2001) e no Current
Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care (2002). Por esta razão não
foram repetidos aqui e alguns desses dados serão aqui apresentados, quando
necessários.
3.4.3) Determinação das catecolaminas no plasma e nos músculos
esqueléticos soleus e EDL
Plasma: para a determinação das concentrações plasmáticas de
adrenalina e noradrenalina os animais foram sacrificados por decapitação e o
sangue coletado em tubos heparinizados. Após centrifugação sob refrigeração
a 4
o
C, alíquotas de 500 a 700µL de plasma foram transferidas para tubos de
plástico contendo 50mg de metabissulfito de sódio (antioxidante), tampão Tris-
HCl 2M (pH 8,9) com 0,5% de metabissulfito de sódio e 2,5% de EDTA e 50mg
de alumina previamente ativada em estufa a 100
o
C, por meia hora.
Diidroxibenzilamina foi utilizada como padrão interno. As amostras foram
agitadas durante 20 minutos, centrifugadas e após aspiração do sobrenadante
a alumina foi lavada repetidamente. As catecolaminas foram extraídas da
alumina pela adição de solução eluidora contendo ácido perclórico 0,1N, sob
agitação de 10 minutos (Krstulovic, 1982). Alíquotas de 50µL das amostras
assim obtidas foram analisadas através de cromatografia líquida de alta
performance (HPLC) em um cromatógrafo modelo LC-7A, equipado com uma
coluna de fase reversa Spherisorb ODS II (Sigma-Aldrich), acoplado a um
detector eletroquímico modelo L-ESD-6A e a um polígrafo modelo C-R5A,
todos da marca Shimadzu.
Músculos: para a determinação do conteúdo de noradrenalina nos
músculos soleus e EDL os animais foram sacrificados por deslocamento
cervical. Tais tecidos foram rapidamente retirados e imediatamente congelados
Materiais e Métodos
21
em nitrogênio líquido, mantidos sob refrigeração a -70
o
C, para posterior
análise.
Os tecidos foram homogeneizados em ácido perclórico 0,2N, contendo
metabissulfito de sódio 1% e EDTA 1mM. O homogeneizado foi centrifugado
sob refrigeração a 10000 rpm, durante 10 minutos. O sobrenadante foi então
processado e analisado como descrito anteriormente.
3.4.4) Velocidade de renovação de noradrenalina nos músculos
esqueléticos soleus e EDL
A velocidade de renovação de noradrenalina foi avaliada nos músculos
soleus e EDL de ratos normais e diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ) através da
medida da velocidade de queda da concentração de noradrenalina após 6 e 12
horas da administração intraperitonial de α-metil-éster-tirosina (300mg/Kg peso
corporal), um inibidor da síntese de noradrenalina, que bloqueia a atividade da
enzima tirosina hidroxilase. O grupo 12h recebeu uma segunda dose da droga
no intervalo de 6 horas. O grupo 0h não recebe o tratamento com α-metil-
tirosina.
Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. Os músculos
foram imediatamente removidos e processados para a extração de
noradrenalina, tal como descrito anteriormente (item 3.4.3). O conteúdo de
noradrenalina foi determinado através de HPLC.
A velocidade de renovação (VR) da noradrenalina é o produto da
concentração de noradrenalina no tempo 0 [NOR
0
] pela velocidade de
renovação fracional (k):
Após o bloqueio da síntese pela α-metil-tirosina, o declínio na
concentração de noradrenalina muscular é dado pela seguinte equação:
VR = k . [NOR
0
]
[NOR] = [NOR
0
] e
–
k
t
Materiais e Métodos
22
O valor de k pode ser determinado pelo cálculo da regressão linear dos
logaritmos naturais da concentração de noradrenalina versus o tempo (Costa et
al., 1966).
O intervalo de confiança de 95% da velocidade de renovação (VR) da
noradrenalina foi determinado da seguinte maneira:
a) o intervalo de confiança do valor médio da velocidade de renovação
fracional (k) e da concentração de noradrenalina no tempo 0 [NOR
0
] foi
estabelecido utilizando o erro padrão da média de cada um dos fatores;
b) Os limites inferiores de k e de [NOR
0
] foram multiplicados para
determinação do limite inferior do intervalo de confiança de 95% da velocidade
de renovação (VR) da noradrenalina;
c) Os limites superiores de k e de [NOR
0
] foram multiplicados para
determinação do limite superior do intervalo de 95% de confiança da
velocidade de renovação (VR) da noradrenalina. (Taubin et al.; 1972).
O t ½, tempo em que a concentração de noradrenalina inicial cai à
metade, é calculado a partir da equação [NOR
0
] . 2
-1
= [NOR
0
] e
–kt
.
A diferença da velocidade de renovação fracional (k), da concentração
de noradrenalina [NOR
0
] e da velocidade de renovação (VR) da noradrenalina
entre os grupos foi analisada utilizando o test t de Student com P<0,05 para
nível de significância.
3.4.5) Procedimento experimental para o estudo da proteólise em
músculos esqueléticos de ratos em diferentes períodos de diabetes e
simpatectomia
A avaliação da degradação de proteínas em músculos esqueléticos de
ratos foi realizada em diferentes períodos de simpatectomia química e de
diabetes.
Na manhã do experimento, os animais diabéticos simpatectomizados e
os controles foram pesados e escolhidos aqueles com pesos próximos a 75g.
O sacrifício foi realizado por deslocamento cervical numa seqüência alternada
entre os grupos (a seqüência obedecida era um animal N, D e DG),
removendo-se rapidamente os músculos soleus e EDL, que foram pesados e
Materiais e Métodos
23
posteriormente incubados em tampão Krebs Ringer-bicarbonato (0,120M de
NaCl; 0,015M de NaHCO
3
; 4,828mM de KCl; 1,2mM de MgSO
4
; 1,212mM de
KH
2
PO
4
; 2,4mM de CaCl
2
- pH 7,4) e aerados.
Para a medida da atividade proteolítica, os músculos íntegros foram
fixados por meio dos seus tendões a suportes de alumínio (soleus) ou de
acrílico (EDL), mantendo-os assim em seus comprimentos de repouso
(“stretch”). A manutenção dos músculos nestas condições possibilita a difusão
de oxigênio e nutrientes, evitando-se anóxia das fibras musculares centrais. A
maioria dos experimentos foram repetidos 2 vezes e o número de animais
utilizados em cada grupo foi de 7 a 9 animais.
3.4.6) Avaliação da atividade proteolítica
A atividade proteolítica foi estimada por meio da liberação de tirosina
(Tyr) de proteínas de músculos incubados na presença de cicloheximida, que
impede a reutilização dos aminoácidos para a síntese de proteínas. A Tyr é
normalmente escolhida para a avaliação da proteólise, uma vez que não é um
aminoácido catabolizado e nem sintetizado "de novo" pelo músculo. Além
disso, a Tyr é facilmente dosada por meio de um método fluorimétrico simples
e de grande sensibilidade, descrito por Waalkes & Udenfriend (1957). Essa
liberação de Tyr deve refletir a velocidade de degradação de todas as classes
de proteínas celulares, uma vez que este aminoácido é distribuído em todas
proteínas celulares (Jefferson et al., 1977).
Para a determinação da degradação de proteínas, os músculos foram
incubados em meios adequados, aerados com carbogênio (95% de O
2
e 5% de
CO
2
), permanecendo por 1 hora em banho sob agitação constante a 37
o
C, a
fim de estabelecer o equilíbrio da velocidade de liberação de Tyr para o meio
de incubação. Após esse período de pré-incubação, os meios foram renovados
e assim dada continuidade à incubação com o mesmo tipo de meio por mais 2
horas. No final deste período, 1mL do meio foi coletado e adicionado a 0,25mL
de ácido perclórico 1,5N para a determinação da Tyr liberada.
Materiais e Métodos
24
3.4.7) Procedimentos experimentais para a avaliação das vias
proteolíticas
As seguintes vias proteolíticas foram estudadas em músculos
esqueléticos soleus e EDL: via lisossomal, via dependente de cálcio (Ca
2+
), via
dependente
de Ub-proteassoma e via residual, seguindo os protocolos
metodológicos descritos a seguir.
a) via lisossomal
A quantificação da atividade proteolítica lisossomal foi feita através de
método que utiliza a inibição desta via, com a adição ao meio de incubação de
metilamina e aminoácidos de cadeia ramificada - BCAA (leucina, isoleucina e
valina) A metilamina é uma base fraca que se acumula nos lisossomos,
aumentando o pH intralisossomal para valores próximos à neutralidade,
inibindo assim a atividade das catepsinas e hidrolases ácidas lisossomais
(Mortimore, 1982; Kettelhut et al., 1988). Os BCAA atuam através de bloqueio
da formação de vacúolos autofágicos e também diminuindo a fragilidade
lisossomal nos músculos esquelético e cardíaco e, portanto, inibindo a
degradação protéica, sem alteração do conteúdo total de enzimas lisossomais
(Rannels et al., 1975; Jefferson et al., 1977; Kettelhut et al., 1988).
O esquema a seguir ilustra as condições de incubação dos músculos
soleus e EDL utilizados.
Materiais e Métodos
25
PROTOCOLO DA VIA LISOSSOMAL
MÚSCULOS (COM TENDÕES FIXOS A SUPORTES)
RETIRADOS DAS 2 PATAS (1; 2)
COMPONENTES DO MEIO MÚSCULOS
1 2
Tampão Krebs Ringer Bicarbonato (pH 7,4) + +
Glicose (5mM) + +
Cicloheximida (0,5mM) + +
Metilamina (10mM) - +
BCAA* - +
* leucina: 0,5mM; isoleucina: 0,85mM; valina: 1,0mM
A diferença entre a proteólise observada com o músculo 1 e 2 reflete a
participação da via lisossomal. Vale a pena salientar que os valores de tirosina
liberada para o meio de incubação do músculo 1 representam a atividade
proteolítica “total” (embora haja uma relativa inibição da via dependente de
Ca
2+
devido ao estiramento do músculo com manutenção do seu comprimento
de repouso e inibição da entrada do íon).
Os aminoácidos liberados na degradação das proteínas celulares
podem também ser utilizados na síntese protéica. Assim, para avaliar a
degradação protéica total, a síntese foi bloqueada pela adição de 0,5 mM de
cicloheximida, que bloqueia a síntese de proteínas por inibir a atividade peptidil
transferase da subunidade ribossomal 60S. Essa concentração do inibidor
acarreta em redução de 95% na incorporação de
14
C-Tyr em proteína, sendo
linear por 3 horas, além de não afetar a atividade proteolítica (Fulks et
al.,1975). Por tal ação, a cicloheximida foi utilizada no estudo da determinação
da atividade de todas as vias de degradação de proteínas.
Materiais e Métodos
26
b) via dependente de cálcio
O protocolo empregado para o estudo deste processo proteolítico foi a
incubação dos músculos soleus e EDL em tampão Krebs Ringer-bicarbonato
na presença de inibidores da via lisossomal. O músculo de uma pata foi
incubado de forma livre, ativando-se assim as calpaínas, proteases
pertencentes ao sistema dependente de Ca
2+
; o músculo da outra pata foi
incubado com seus tendões fixos aos suportes adequados, ocorrendo assim
inibição da via proteolítica estudada. A diferença de proteólise observada entre
os músculos das duas patas reflete a atividade do processo dependente de
Ca
2+
. O esquema a seguir ilustra as condições de incubação dos músculos
soleus e EDL.
PROTOCOLO
DA VIA DEPENDENTE DE CÁLCIO
MÚSCULOS (COM TENDÕES FIXOS A SUPORTES)
RETIRADOS DAS 2 PATAS (1; 2)
COMPONENTES DO MEIO MÚSCULOS
1 2
Tampão Krebs Ringer Bicarbonato (pH 7,4) + +
Glicose (5mM) + +
Cicloheximida (0,5mM) + +
Metilamina (10mM) + +
BCAA* + +
“free” “stretch”
* leucina: 0,5mM; isoleucina: 0,85mM; valina: 1,0mM
A diferença de proteólise observada entre os músculos 1 e 2 reflete a
atividade da via dependente de Ca
2+
.
Materiais e Métodos
27
c) via dependente de Ub-proteassoma e via residual
O estudo da participação do sistema proteolítico dependente de Ub-
proteassoma foi realizado utilizando-se dois tipos de protocolos. No primeiro os
músculos foram incubados com seus tendões fixos a suportes em meio isento
de Ca
2+
, contendo E64 e leupeptina (bloqueio da via proteolítica dependente de
Ca
2+
) e metilamina e BCAA (acrescentados com a finalidade de bloquear a via
proteolítica lisossomal). E64 tem como função inibir as tiol proteases, inibindo,
além das calpaínas, as enzimas lisossomais. O músculo na presença de
dinitrofenol (0,5mM de DNP) e ausência de glicose apresenta 95% de depleção
do seu conteúdo de ATP tecidual por inibição da fosforilação oxidativa e
glicólise (Kettelhut et al., 1988). O músculo nestas condições apresenta uma
grande queda na degradação de proteínas (Goldberg & St. John, 1976;
Ciechanover, 1987). A ausência de Ca
2+
no meio de incubação é fundamental
para a observação de tal achado, pois músculos depletados de ATP, se
incubados em meio contendo Ca
2+
, apresentam aumento do influxo e acúmulo
intracelular deste íon, que ativa as proteases dependentes de Ca
2+
e aumento
da proteólise. Nestas condições, portanto, pode ser avaliada a participação da
via dependente de Ub-proteassoma.
O segundo tipo de protocolo utilizado neste estudo baseia-se na
inibição das vias proteolíticas lisossomal e Ca
2+
tal como descrito
anteriormente, além de promover uma inibição direta da atividade proteolítica
do proteassoma com o uso do inibidor MG132 (N-carboxibenzoxi-Leu-Leu-
Leucinal). O MG132 é um peptídeo aldeído que inibe a atividade proteolítica do
proteassoma sem afetar as atividades ATPásicas ou isopeptidásicas. Com este
protocolo, também fica estimada a contribuição da atividade proteolítica
dependente de Ub-proteassoma.
Pela medida da diferença entre a proteólise observada no músculo da
pata 1 (que seria a proteólise não lisossomal e não dependente de Ca
2+
), a
qual chamamos de "basal" e a proteólise observada no músculo da pata 2, na
ausência de ATP (que seria a proteólise residual independente de energia) ou
com a atividade do proteassoma bloqueada, é possível quantificar com
reprodutibilidade o processo proteolítico dependente de Ub-proteassoma.
Materiais e Métodos
28
Nada ainda se conhece sobre o controle, quais são as enzimas
responsáveis e os substratos que fazem parte do processo proteolítico residual.
A proteólise residual é aquela que permanece quando as três outras vias estão
bloqueadas. Assim sendo, corresponde à proteólise encontrada na pata 2 dos
protocolos descritos adiante.
PROTOCOLO 1 DA VIA DEPENDENTE DE UB-PROTEASSOMA
MÚSCULOS (COM TENDÕES FIXOS A SUPORTES)
RETIRADOS DAS 2 PATAS (1; 2)
COMPONENTES DO MEIO MÚSCULOS
1 2
Tampão Krebs Ringer Bicarbonato (pH 7,4) + +
Glicose (5mM) + -
Cicloheximida (0,5mM) + +
Metilamina (10mM) + +
BCAA* + +
E64 (25µM); Leupeptina (50µM)
+ +
Dinitrofenol (0,5mM) - +
* leucina: 0,5mM; isoleucina: 0,85mM; valina: 1,0mM
Materiais e Métodos
29
PROTOCOLO 2 DA VIA DEPENDENTE DE UB-PROTEASSOMA
MÚSCULOS (COM TENDÕES FIXOS A SUPORTES)
RETIRADOS DAS 2 PATAS (1; 2)
COMPONENTES DO MEIO MÚSCULOS
1 2
Tampão Krebs Ringer Bicarbonato (pH 7,4) + +
Glicose (5mM) + +
Cicloheximida (0,5mM) + +
Metilamina (10mM) + +
BCAA* + +
E64 (25µM); Leupeptina (50µM)
+ +
MG132 (20µM)
- +
* leucina: 0,5mM; isoleucina: 0,85mM; valina: 1,0mM
3.4.8) Procedimento experimental para a avaliação da síntese total de
proteínas
A síntese protéica foi determinada nos músculos soleus de animais
normais, diabéticos controles e diabéticos submetidos à simpatectomia
química; foram utilizados os períodos de 1 e 3 dias de diabetes. Os músculos
foram incubados com seus tendões fixos a suportes apropriados para
manutenção dos seus comprimentos de repouso, em tampão Krebs Ringer-
bicarbonato, contendo glicose (5 mM) e todos os vintes aminoácidos, em
concentrações semelhantes às encontradas no plasma de ratos, conforme
apresentadas na Tabela I.
Materiais e Métodos
30
Tabela I - Aminoácidos adicionados no meio de incubação (Scharff & Wool,
1966) para avaliação da velocidade de síntese protéica total.
Aminoácido
Concentração
(mM)
Aminoácido
Concentração
(mM)
Ác. aspártico 0,035 Isoleucina 0,100
Àc. glutâmico 0,174 Leucina 0,170
Alanina 0,450 Lisina 0,400
Arginina 0,200 Metionina 0,070
Asparagina 0,061 Prolina 0,180
Cisteína 0,070 Serina 0,280
Fenilalanina 0,500 Tirosina 0,100
Glicina 0,400 Treonina 0,300
Glutamina 0,350 Triptofano 0,070
Histidina 0,080 Valina 0,200
Uma vez que a tirosina também foi adicionada ao meio de incubação,
não foi possível usar o mesmo músculo para a avaliação de síntese e
degradação protéica simultaneamente, pois a proteólise foi estimada pela
medida da tirosina liberada e o método não tem sensibilidade para detectar
estas diferenças.
Materiais e Métodos
31
Após 1 hora de pré-incubação, o meio era substituído a cada 2 horas
por outro idêntico, permanecendo os músculos incubados por um período final
de 6 horas. Nas últimas 2 horas, os músculos eram incubados na presença de
tirosina marcada no
14
C ([U-
14
C]Tyr; 0,05µCi/mL). Nestes experimentos
também foi verificado o efeito de 10
-5
M de adrenalina em músculos de animais
normais, diabéticos e diabéticos simpatectomizados, e os músculos foram
incubados na presença do hormônio durante um período total de 6 horas.
Em seguida, os músculos foram removidos de seus suportes e lavados
com água destilada fria, secos em papel de filtro e colocados em 2mL de TCA
10%. Após homogeneização e centrifugação a 1800g por 10 minutos, 1mL do
sobrenadante foi utilizado para a avaliação da tirosina livre total no músculo e
uma alíquota de 100µL usada na medida da radioatividade, para determinação
da atividade específica da tirosina de cada músculo separadamente.
Posteriormente o precipitado foi lavado 3 vezes com 2mL de TCA 10%. A
dissolução do precipitado final foi obtida pela adição de 1mL de dodecil sulfato
de sódio (SDS) 10%, a temperatura ambiente por 12 horas ou em banho-maria
a 40°C por 2 horas. A seguir, foram adicionados 10mL de coquetel de cintilação
para contagem da radioatividade em espectrômetro de cintilação líquida (TRI-
CARB 2100TR, Packard BioScience Company).
Materiais e Métodos
32
3.5) Estudo do papel da pentoxifilina no metabolismo de
proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos
3.5.1) Modelo experimental: tratamento in vivo com pentoxifilina
A pentoxifilina (PTX) foi diluída em água destilada MilliQ e foram
administradas injeções intraperitoniais diárias na concentração de 100mg/kg de
peso corporal por dia. O início do tratamento ocorreu na véspera da indução do
diabetes, continuando nos demais dias após a administração de STZ.
Assim, para os experimentos foram utilizados ratos diabéticos (3 dias
pós-STZ) e controles tratados com PTX por 4 dias. Após este tempo de
tratamento os animais foram sacrificados, o sangue coletado para
determinação dos níveis plasmáticos de TNF-α, os músculos EDL foram
retirados, pesados e posteriormente incubados para quantificação da atividade
proteolítica total, participação das diferentes vias de degradação de proteínas e
determinação da síntese protéica, tal como descrito anteriormente.
Nestes experimentos de investigação da atividade proteolítica total, da
participação das vias proteolíticas e avaliação da síntese protéica em músculos
EDL de ratos tratados com pentoxifilina (PTX), foram conduzidos quatro grupos
de animais: normal controle (NS), tratado com salina via intraperitonial; normal
PTX
(NPTX), que recebeu as injeções diárias de PTX; diabético controle (DS),
tratado diariamente com salina; e diabético
PTX (DPTX), grupo que recebeu
tratamento diário de PTX.
3.5.2) Efeito direto in vitro da pentoxifilina
Para verificação de possível efeito direto da droga no metabolismo
protéico em EDL de ratos normais e diabéticos, PTX (10mM) foi adicionada ao
meio de incubação. Os grupos experimentais foram os mesmos daqueles
utilizados para estudo do tratamento in vivo com a droga, isto é, ratos normais
e diabéticos (3 dias pós-STZ), onde os músculos destes animais foram
incubados ou não na presença de PTX. Foram analisadas alterações ocorridas
na atividade proteolítica total e na participação das diferentes vias de
degradação de proteínas em EDL, tal como anteriormente descrito.
Materiais e Métodos
33
a) Efeito da insulina in vitro
Para verificar o efeito da insulina na atividade proteolítica de músculos
incubados in vitro na presença de PTX, foram realizados experimentos de
avaliação da liberação de tirosina em músculos EDL de ratos normais e
diabéticos incubados na presença de 10mM de PTX e na ausência ou
presença de insulina (0,1U/mL) in vitro. No entanto, pelo fato da insulina
adicionada ao meio de incubação ser capaz de promover inibição da
participação do sistema proteolítico lisossomal, os experimentos foram
realizados a partir da investigação dos valores de tirosina relacionados à
proteólise basal, isto é, os músculos foram incubados na presença dos
inibidores do sistema proteolítico lisossomal, metilamina e BCAA (como
descrito anteriormente).
b) Efeito do H89 in vitro
Foram realizados experimentos para investigação do possível
envolvimento da proteína quinase dependente de AMPc (PKA) na ação in vitro
da PTX na proteólise muscular. Para isso, foram realizados experimentos de
incubação de músculos de animais normais e diabéticos na presença de 10mM
de PTX e na ausência ou presença de N-(2-[p-bromocinamilamino]-etil)-5-
isoquinolinesulfonamida. 2 HCl, droga também conhecida como H89 (50µM),
inibidor especifico da atividade da PKA.
3.5.3) Avaliação da ação da pentoxifilina in vivo e in vitro nas
concentrações intracelulares de AMP cíclico (AMPc) em músculo
esquelético de ratos normais e diabéticos
Para a realização destes experimentos, foram utilizados os mesmos
grupos experimentais descritos anteriormente para a investigação da ação da
PTX no metabolismo de proteínas em músculo EDL de ratos.
Após o período de tratamento com PTX ou após o período de incubação
com a droga, os músculos foram imediatamente removidos, embalados em
papel alumínio e congelados a -70
o
C. O processamento dos músculos para
posterior realização dos testes foi feito da seguinte maneira: os músculos foram
Materiais e Métodos
34
homogeneizados em TCA 6%, na proporção 5% peso/volume. As amostras
foram centrifugadas a 10000 rpm durante 15 minutos a 4
o
C. O sobrenadante foi
recolhido, lavado 2 vezes com 4mL de éter dietílico para remoção de resíduos
lipídicos. A fração aquosa foi separada e liofilizada para a determinação dos
níveis de AMPc. O extrato seco foi ressuspendido em 1000µL do tampão de
ensaio do teste.
Para a determinação dos níveis de AMPc nas amostras foi utilizado um
método imunoenzimático comercial da Amersham Biosciences (cAMP Biotrak
Enzymeimmunoassay EIA System - RPN225). Este método baseia-se em um
princípio imunoenzimático competitivo, onde os poços da placa para o teste
são tratados com anticorpo de cabra anti-IgG de coelho; este anticorpo IgG de
coelho reconhece especificamente o AMPc. O ensaio é baseado na
competição entre o AMPc da amostra tecidual e uma quantidade fixa de AMPc
marcado com peroxidase (oferecido pelo próprio kit). Desta maneira, a
quantidade de AMPc marcado ligado ao anticorpo anti-AMPc foi oposta à
concentração de AMPc da amostra desconhecida.
O complexo anti-IgG/anti-AMPc/AMPc-peroxidase pode ser quantificado
após a adição do substrato para a peroxidase [3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina
(TMB) e peróxido de hidrogênio], ocorrendo a formação de produto colorido
que pode ser quantificado em comprimento de onda de 630nm (coloração azul)
ou 450nm (após a adição de 1M de ácido sulfúrico, coloração amarela), em
espectrofotômetro para microplaca (leitor de ELISA). A sensibilidade do método
é na faixa de detecção de 12,5 a 3200 fmol de AMPc por poço. Os resultados
foram expressos em fmol de AMPc/mg de músculo.
3.5.4) Medida dos níveis plasmáticos de TNF-α (Fator de Necrose Tumoral
α) após tratamento com pentoxifilina
A determinação dos níveis plasmáticos de TNF-α em animais normais e
diabéticos tratados ou não com PTX foi realizada utilizando-se a metodologia
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) tipo duplo ligante. Tais
experimentos foram realizados no Laboratório de responsabilidade do Prof. Dr.
Fernando Q. Cunha, no Departamento de Farmacologia desta faculdade.
Materiais e Métodos
35
A placa de ELISA de 96 poços para microtestes foi tratada com
100µL/poço com anticorpo específico em diluição de 2 µg/mL em tampão
próprio e incubada overnight a 4
o
C. Posteriormente, a placa foi lavada e
bloqueada para ligações não-específicas com albumina bovina sérica a 1%,
durante 120 minutos a 37
o
C. As amostras e os padrões foram adicionados à
placa. Uma curva-padrão de TNF-α recombinante de roedor foi utilizada para
calcular a concentração da citocina. A placa foi lavada em seguida e
adicionado anticorpo anti-TNF-α biotinilado. Após 1 hora foi adicionado em
cada poço o complexo avidina-peroxidase (diluição 1:5000), sendo permitida
reação durante 15 minutos. Após lavagem da placa foi colocado o substrato
(4mg de o-fenilenediamina diidrocloreto e 0,4µL de H
2
O
2
em 1mL de tampão) e
a reação foi bloqueada após a adição de 1M de ácido sulfúrico. A densidade
óptica foi medida em scanner de ELISA (Spectra Max 250 - Molecular Device)
a 490nm. Os resultados foram expressos em pg de TNF-α/mL de plasma, após
comparação entre as densidades ópticas das amostras com a curva padrão.
3.5.5) Quantificação da m-calpaína e da calpastatina em músculos de
ratos após tratamento com pentoxifilina
O presente trabalho investigou as alterações ocorridas na quantidade
das proteínas m-calpaína e calpastatina, componentes do sistema proteolítico
dependente de Ca
2+
, em músculos EDL de animais normais e diabéticos
tratados com PTX.
a) Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE)
Os músculos EDL de ratos dos diferentes grupos experimentais foram
homogeneizados em Politrom, em volume de tampão A (20mM de Tris, 5mM
de EDTA, pH 7,5 ajustado com 1M de HCl) na proporção de 20% peso/volume.
O homogenado foi centrifugado a 10000 rpm, 4
o
C, durante 20 minutos. O
sobrenadante foi utilizado para a quantificação de proteína e posteriormente
para a identificação dos níveis de m-calpaína e calpastatina. A parte do
sobrenadante utilizada para quantificação da m-calpaína foi liofilizada e
ressupendida no tampão da amostra (solução de dodecil sulfato de sódio
Materiais e Métodos
36
(SDS) 4%, 125mM de Tris-HCl, glicerol 20%, 100mM de DTT, azul de
bromofenol 2% e pH 6,8 ajustado com 1M de HCl). O volume do sobrenadante
utilizado para a determinação da calpastatina foi inicialmente fervido durante 10
minutos (desnaturação das calpaínas). Em seguida, as amostras foram
novamente centrifugadas a 13000 rpm, 4
o
C, durante 15 minutos e o
sobrenadante finalmente liofilizado e diluído no tampão da amostra.
A eletroforese em gel de SDS-PAGE foi realizada de acordo com o
método descrito por Laemmli (1970). As amostras foram aquecidas a 100
o
C
por 5 minutos e aplicadas em sistema de gel largo (modelo Protean II Cell -
BioRad) de acrilamida:bisacrilamida com 1,0 mm de espessura, gel de
separação variando de 7,5% (para a calpastatina) a 8% (para a m-calpaína).
Na lateral do gel foi aplicado padrão de peso molecular da Santa Cruz
Biotechnology (10-250 kDa). As corridas eletroforéticas foram realizadas em
cubas de acrílico contendo tampão de corrida (25mM de Tris-HCl pH 8,3,
115mM de glicina, SDS 0,1%), sob voltagem de 120 Volts, durante 1 hora e 30
minutos.
b) Western blot para detecção de m-calpaína e calpastatina
Após a corrida eletroforética, o gel foi preparado para a transferência
(BioRad Trans-Blot, Hemel Hempstead, U.K.) de acordo com o método descrito
por Towbin et al., 1979. Inicialmente, o gel foi colocado na solução de
transferência (25mM de Tris-HCl, 0,192M de glicina, 20% etanol absoluto, pH
8,3%) por cerca de 20 minutos. Após a montagem do sistema de transferência,
as proteínas presentes no gel de poliacrilamida foram transferidas para uma
membrana de nitrocelulose (NC), sendo o processo de transferência realizado
durante 3 horas sob voltagem fixa de 100 Volts, à temperatura ambiente. Após
o término da transferência, a membrana de NC foi submetida à immunoblot.
Para isto foi incubada por 40 minutos, sob agitação, à temperatura ambiente
com leite desnatado em pó 5%, diluído em TBS-T (0,02M de Tris-HCl, 0,16M
de NaCl, 0,1% Tween 20). Após o bloqueio, a membrana foi incubada overnight
a 4
o
C com anticorpos primários para detecção de m-calpaína (anticorpo de
cabra anti-calpaína de rato - Santa Cruz Biotecnology, USA) ou calpastatina
Materiais e Métodos
37
(anticorpo de cabra anti-calpastatina de rato - Santa Cruz Biotecnology, USA).
As diluições dos anticorpos primários foram realizadas em solução de TBS-T
contendo 2,5% de albumina bovina sérica e 0,01% de azida sódica e utilizadas
as seguintes razões dos anticorpos: 1:500 ou 1:1000, para detecção de m-
calpaina e calpastatina, respectivamente. O anticorpo foi então retirado e a
membrana devidamente lavada com solução de TBS-T, posteriormente
incubada durante 1 hora à temperatura ambiente, com o anticorpo secundário
anti-IgG ligado à peroxidase (anti-IgG de cabra, diluição de 1:10000 em leite
em pó 5%/TBS-T). Após lavagem das membranas para remoção do excesso
de anticorpo secundário não ligado, a membrana foi revelada com filme
autoradiográfico (Hyperfilm ECL), na ausência de luz, 20 minutos após a adição
de partes iguais dos reagentes do Kit de Quimioluminescência Amplificada
(ECL, Amersham). As bandas reveladas foram quantificadas por densitometria.
3.5.6) Trancrição reversa acoplada a PCR (RT-PCR) para determinação da
expressão do RNAm da atrogin-1 (ou MAFbx)
A expressão do RNAm da atrogin-1 foi investigada em músculos EDL de
animais normais e diabéticos tratados in vivo com PTX através da utilização da
metodologia de RT-PCR descrita com maiores detalhes a seguir. Tais
experimentos foram realizados no Laboratório do Prof. Dr. Marcelo Damário
Gomes, no Departamento de Bioquímica e Imunologia desta faculdade.
a) Extração de RNA
Os músculos EDL de ambas as patas de animais normais e diabéticos
foram retirados e seguido protocolo de extração de RNA pelo método do
Trizol
™
(Invitrogen Life Technologies). Os tecidos foram homogeneizados em
solução de Trizol
™
na proporção de 100mg tecido para 1mL Trizol
™
, sendo as
amostras incubadas por 10 minutos à temperatura ambiente. Para a separação
de ácidos nucléicos foi adicionado 200µL de clorofórmio, e após 15 segundos
de agitação vigorosa as amostras foram centrifugadas por 15 minutos a 12000g
à 4ºC. A fase superior aquosa (contendo RNA), foi coletada e em seguida
precipitada com 500 µL de álcool isopropílico, incubada por 10 minutos à
Materiais e Métodos
38
temperatura ambiente, e novamente centrifugada. Ao final, os precipitados
foram lavados duas vezes com etanol 75% e solubilizados em 50µL de H
2
O
DEPC
(água destilada tratada com dietil-pirocarbonato 0,01% e autoclavada).
b) Quantificação da amostra de RNA
As amostras foram quantificadas por densidade óptica (A) em
espectrofotômetro (260nm), e a qualidade da extração foi verificada pela
relação A
260
/A
280
. As amostras de RNA foram conservadas em freezer -80
o
C
para posterior utilização nas reações de transcrição reversa.
c) Produção de cDNA - Transcrição Reversa (RT)
As reações de transcrição reversa foram realizadas para obtenção de
cDNAs, utilizando 2µg de RNA total na presença de 50ng de primer oligo(dT) e
ImProm-II
TM
Reverse Transcriptase (Promega), seguindo as condições padrão
do fabricante. As condições usadas no termociclador modelo PTC 100 (MJ
Research) foram: 5 minutos à 70ºC, seguindo-se da adição da enzima
transcriptase reversa e 60 minutos à 42ºC e 15 minutos à 70ºC para inativação
da enzima.
O conteúdo de RNAm da proteína β-actina de camundongo foi utilizado
como controle para verificação da quantificação dos RNAs purificados. Os
primers foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Cláudio M. da Costa-Neto, do
Departamento de Bioquímica e Imunologia desta faculdade.
Como controle da pureza do RNA extraído, foi feito um controle
negativo, em que não foi adicionada a enzima transcriptase reversa, com o
objetivo de identificarmos a presença de DNA genômico na amostra. Nenhuma
banda foi observada nesta amostra nas PCRs para os três genes analisados.
Materiais e Métodos
39
d) PCR semi-quantitativa
- primers utilizados
A seqüência dos primers foi obtida a partir da seqüência gênica
depositada no GenBank para atrogin-1 e β-actina (Tabela II).
TABELA II - Seqüências dos primers utilizados para as reações de RT-PCR.
Gene Seqüência Produto
atrogin-1
Sense: TGAAGACCGGCTACTGTGGAAGAGAC
Antisense: TTGGGGTGAAAGTGAGACGGAGCAG
486 bp
β-actina
Sense: CTAAGGCCAACCGTGAAAAGA
Antisense: ATTGCCGATAGTGATGACCTG
422 bp
- amplificação do cDNA gerado por transcrição reversa
Reações de PCR com volume final de 25µL foram realizadas utilizando
uma concentração final de 0,1µM de cada primer (Sense e Antisense), 1,5mM
MgCl
2,
1X tampão NH
4
+
, 200µM de cada dNTP, 10% DMSO, 2 unidades de Taq
Polimerase Pht (Promega) e 1-2 µL de cDNA, o volume final foi completado
com ddH
2
O. O programa utilizado no termociclador PTC100 (MJ Research) foi
de 94ºC por 5 minutos, seguido de 25 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 47ºC
por 1 minuto e 72ºC por 1,5 minutos, finalizando com uma etapa de 10 minutos
a 72ºC. Metade do volume do produto final das reações foi aplicado em gel de
agarose (1.5%), corado com brometo de etídio e visualizado em transluminador
UV, após eletroforese em tampão TBE 1X e voltagem de 100V.
e) Densitometria
Os géis foram foto-documentados e o arquivo “.jpg” foi aberto no
software Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/
) para análise de densitometria. A
partir dos valores das áreas de cada banda, foi calculada a razão entre a
Materiais e Métodos
40
expressão de atrogin-1 e de β-actina. Os resultados foram expressos de acordo
com os níveis de expressão diferencial de atrogin-1 nas diferentes amostras.
f) PCR quantitativa
A expressão do RNAm da atrogin-1 também foi analisada em amostras
de EDL de ratos normais e diabéticos tratados in vivo com PTX através da
metodologia de RT-PCR quantitativa, sendo os procedimentos descritos a
seguir.
Após a extração e quantificação do RNA das amostras tal como descrito
anteriormente, foi adicionado a 2µg de RNA total o primer de oligo(dT)
12-18
(20pmols, Invitrogen Life Technologies) em volume total de 5µL e a mistura foi
preparada em água DEPC.
O RNA e o primer foram aquecidos a 70
o
C durante 5 minutos e
posteriormente colocados em gelo. Os seguintes reagentes foram então
adicionados: 4µL de 5X tampão de reação (Promega), 1µL de mistura de
deoxinucleosídeo trifosfato (dNTP, 10mM de cada), 6,6µL de água DEPC,
2,4µL de MgCl
2
e 1µL de recombinante
ImProm-II
TM
Reverse T. A mistura foi
incubada a 25
o
C durante 5 minutos para anelamento e depois a 42
o
C para
polimerização. A síntese do cDNA foi interrompida por aquecimento da mistura
de reação a 70
o
C por 15 minutos.
Os cDNAs foram posteriormente submetidos ao real-time PCR
utilizando-se Platinum® SYBR® Green qPCR Supermix UDG (Invitrogen) com
as seguintes seqüências de primers:
ciclofilina B sense - 5'-AAGGACTTCATGATCCAGGG-3'
ciclofilina B antisense - 5'-TGACATCCTTCAGTGGCTTG-3'
atrogin-1 sense - 5'- TGAAGACCGGCTACTGTGGAAGAGAC-3'
atrogin-1 antisense - 5'- TTGGGGTGAAAGTGAGACGGAGCAG-3'
Os resultados foram coletados em sistema de detecção Perkin-Elmer
ABI Prism 7000 com os seguintes parâmetros: 50
o
C (2 minutos), 95
o
C (2
minutos), 40 ciclos de 95
o
C (15 segundos), 57
o
C (30 segundos), 60
o
C (30
segundos), seguido pelo ciclo de dissociação para verificação de um produto
através de análise pela curva melting.
Materiais e Métodos
41
Para a análise do RNAm, o nível relativo da expressão do gene foi calculado
em referência à expressão da ciclofilina B na amostra, utilizando-se o método
do ciclo threshold (Ct). Nenhuma amplificação foi observada quando o real-time
PCR foi realizado sem o passo da transcriptase reversa, demonstrando que os
produtos atrogin-1/ciclofilina B não são resultantes de contaminação por DNA.
3.5.7) Utilização da técnica de microdiálise para avaliação da ação da
pentoxifilina in vivo e in situ no metabolismo de proteínas em músculo
esquelético de ratos adultos normais e diabéticos
Foram utilizados cateteres de microdiálise do tipo linear, manualmente
confeccionados: uma membrana de diálise semi-permeável (Cuprophane,
18mm de comprimento por 0,3mm de diâmetro, 3kDa de limite de
permeabilidade) foi colada em ambas as extremidades a tubos de polietileno
PE-10 (comprimento padrão de 50mm).
No dia do experimento, os animais foram anestesiados com tiopental
sódico (50mg/kg peso corporal, i.p.), traqueostomizados com cateter de
polietileno PE-240 (Becton Dickinson, Nova Jersey, EUA) e mantidos em
mesas cirúrgicas aquecedoras (Insight
®
) sob temperatura constante de 37
o
C. O
cateter de microdiálise foi inserido longitudinalmente no músculo tibialis anterior
e perfundido a um fluxo constante de 1µL/min com a solução de perfusão
(solução de NaCl 0,9% contendo 50µM de tirosina, albumina bovina 0,5% e
0,05mmol/L de
14
C-tirosina ≈ 2500 DPM). Os primeiros 30 minutos de perfusão
ficaram estabelecidos como período de equilíbrio e os 90 minutos posteriores
foram considerados para a coleta das amostras de dialisado.
Após este período, a cavidade abdominal dos animais foi aberta e a
aorta exposta para coleta de sangue arterial. O sangue foi imediatamente
centrifugado, sendo o plasma separado e desproteinizado com ácido perclórico
(PCA) 1N. O plasma desproteinizado era utilizado para a determinação da
concentração de tirosina e do fator de recuperação do cateter.
O dialisado foi coletado diretamente em Eppendorfs estéreis. Após o
período de 90 minutos de coleta, o dialisado era devidamente mantido à -20
o
C
em solução de ácido tricloroacético (TCA) 5%. As concentrações de tirosina no
Materiais e Métodos
42
dialisado (50µL), na solução de perfusão (50µL) e no plasma (100µL) foram
determinadas de acordo com método fluorimétrico de Waalkes & Udenfriend
(1957).
Para a realização destes experimentos, foram utilizados ratos adultos de
peso entre 220 e 250g. O mesmo procedimento descrito para os experimentos
de indução de diabetes em animais jovens foi aqui utilizado para a obtenção
dos grupos normais e diabéticos. No entanto, a droga utilizada para a
instalação do diabetes foi a aloxana (ALX), na dose de 45mg/kg peso corporal.
Os experimentos foram realizados 3 dias após a administração de ALX. Foram
verificados os efeitos: a) do tratamento de ratos normais e diabéticos durante 4
dias com PTX (100mg/kg peso, i.p.), sendo o tratamento iniciado no dia anterior
à instalação do quadro diabético. Assim, foi estudado o efeito do tratamento in
vivo da PTX no metabolismo de proteínas na musculatura esquelética de ratos
adultos; b) da adição de 10mM de PTX no meio de perfusão, sendo o
experimento realizado com animais normais e diabéticos perfundidos ou não
com a droga, para verificação de seu efeito direto in situ no metabolismo
protéico muscular.
3.6) Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média
(EPM) ou como médias percentuais ± EPM dos grupos diabéticos em relação
ao normal controle (considerado como 100%). Para a análise estatística dos
resultados entre os grupos foi empregado o teste t de Student e níveis de
significância de 0,05 (5%) e 0,01 (1%).
3.7) Reagentes
Os reagentes utilizados nos diferentes experimentos foram obtidos dos
laboratórios Sigma Chemicals, Calbiochem EMD Biosciences, Amershan
Biosciences, Santa Cruz Biotechnology, Roche, Merck, New England Nuclear,
Pierce Co, Peptides International, Alexis Biochemicals, Promega e Invitrogen
Life Technologies.
Resultados
Resultados
43
4) Resultados
Estudo do papel do sistema nervoso simpático no metabolismo
de proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos
4.1) Modelo Experimental: simpatectomia química através da
administração de guanetidina
Após os primeiros minutos da primeira administração de guanetidina
em ratos diabéticos, ocorriam algumas mudanças comportamentais nos
animais, tais como imobilidade na caixa e aumento da freqüência cardíaca.
Além disso, depois de alguns minutos, estes animais apresentavam uma
ingestão líquida adicional àquela observada no quadro diabético e diminuição
da ingestão alimentar neste dia. O aumento transitório da ingestão hídrica não
foi observado nos animais ao receberem a segunda injeção da droga; a
ingestão alimentar também era normalizada após o segundo dia de tratamento.
Além disso, algumas horas após a administração de guanetidina, os animais
apresentavam ptose bilateral, característica esta mantida até o final do
experimento. Estas alterações eram semelhantes às observadas nos animais
normais que recebiam 1 ou 2 injeções de guanetidina (Navegantes et al.,
1999).
A diminuição da ingestão alimentar após a primeira injeção de
guanetidina não comprometeu os experimentos realizados com animais no
tempo de 1 dia pós-STZ, uma vez que eles se alimentaram durante todo o
período da tarde, após a administração da droga diabetogênica (no período da
manhã), e recebiam a única dose de guanetidina no final do dia. Além disso,
antes da remoção dos tecidos, era realizada prévia confirmação da presença
de alimento no estômago dos animais pertencentes ao grupo diabético
guanetidina. Assim, qualquer resultado obtido nos experimentos com animais
após 1 dia de diabetes seria conseqüência da simpatectomia e não de uma
possível diminuição da ingestão alimentar.
Resultados
44
4.1.1) Efeito da simpatectomia química no peso corporal
Os resultados de peso corporal (g) dos grupos normal, diabético salina
e diabético guanetidina após 1, 3 e 5 dias de diabetes estão apresentados,
respectivamente, nas Figuras 1, 2 e 3.
Como pode ser analisado nestas figuras, os grupos iniciam o
tratamento com valores de peso corporal diferentes entre si, para que
alcancem no dia do sacrifício um peso aproximado de 70g. Isto pode ser
justificado pelos diferentes perfis de crescimento corporal observado nos
grupos. Os animais pertencentes aos grupos diabéticos apresentam uma
tendência à manutenção do peso corporal quando da administração de STZ, ou
então pequeno ganho ponderal em relação a este dia. Para o tratamento com
guanetidina, no entanto, eram selecionados os ratos maiores, uma vez que
estes animais diabéticos tinham uma queda significativa do peso corporal após
a primeira injeção da droga simpatolítica, sendo este peso mantido até o dia do
experimento. Assim, ambos os grupos de ratos diabéticos (salina e
guanetidina) apresentavam valores de peso corporal semelhantes no dia do
sacrifício. Já os animais normais, embora iniciassem o tratamento com valores
de peso inferiores em relação aos grupos diabéticos, apresentavam um ganho
ponderal diário de aproximadamente 7g, atingindo no dia do experimento
valores de peso corporal próximos aos animais diabéticos.
Na Figura 1 encontram-se os valores de peso corporal obtidos em
típico experimento realizado após 1 dia de diabetes. Todos os grupos
apresentaram um ganho ponderal de aproximadamente 7g no período da tarde,
em relação à manhã do mesmo dia; isto se deve ao fato dos animais terem
sido submetidos a um período de jejum de cerca de 14 horas antes do
momento da indução do diabetes, permitindo-se livre acesso à comida após 1
hora aproximadamente à administração da droga. Porém, no dia seguinte (1
dia pós-STZ), era observado nos animais diabéticos uma perda de peso
corporal, tendendo aos valores ponderais da manhã da indução do diabetes. Já
os animais normais continuavam com ganho de peso corporal. Mesmo sendo
selecionados os maiores animais para o tratamento com guanetidina, o grupo
diabético simpatectomizado apresentou uma perda de peso ainda maior em
Resultados
45
relação ao grupo diabético salina (queda de 10g no grupo tratado em
comparação a 4g no grupo não tratado).
Nos experimentos realizados após 3 e 5 dias de diabetes (Figuras 2 e
3, respectivamente), os animais normais apresentaram um constante ganho
ponderal. Já no grupo diabético salina pode ser observado manutenção ou
discreto aumento de peso corporal em relação ao peso no dia da administração
de STZ. Foi observada perda de peso (7 a 9g) nos animais diabéticos
simpatectomizados após a primeira injeção de guanetidina, com tendência à
manutenção deste peso até o dia do experimento.
4.1.2) Efeito da simpatectomia química na concentração plasmática de
glicose
Na Figura 4 estão apresentados os valores médios de glicemia
(mg/dL) dos animais pertencentes aos grupos normal, diabético salina e
diabético guanetidina, obtidos após 1, 3 e 5 dias de deficiência insulínica.
Houve um aumento significativo nos valores glicêmicos dos animais
tratados com STZ, em relação aos animais normais, confirmando-se assim a
instalação do diabetes. Não ocorreram flutuações nos valores de glicemia
durante os diferentes tempos de diabetes utilizados. A simpatectomia química
não acarretou em alterações adicionais nos valores glicêmicos, em qualquer
período estudado. Também a administração de guanetidina não altera a
glicemia de animais normais (Navegantes et al., 1999).
Resultados
46
FIGURA 1: Peso corporal (g) de ratos diabéticos tratados com guanetidina (100
mg/kg.dia, s.c.), um dia após a administração de estreptozotocina (STZ). Os
resultados são expressos como média ± EPM de 7 a 9 animais por grupo.
65
70
75
80
85
90
indução
diabetes
(manhã)
guanetidina
ou salina
(tarde)
dia do
experimento
(1 dia pós-STZ)
normal
diabético salina
diabético guanetidina
peso corporal
(g)
Resultados
47
FIGURA 2: Peso corporal (g) de ratos diabéticos tratados com guanetidina (100
mg/kg.dia, s.c.), três dias após a administração de estreptozotocina (STZ). Os
resultados são expressos como média ± EPM de 7 a 9 animais por grupo.
60
65
70
75
80
85
90
dia do
experimento
(3 dias pós-STZ)
guanetidina
ou
salina
(2 dias pós-STZ)
guanetidina
ou
salina
(1 dia pós-STZ)
indução
diabetes
normal
diabético salina
diabético guanetidina
peso corporal
(g)
Resultados
48
FIGURA 3: Peso corporal (g) de ratos diabéticos tratados com guanetidina (100
mg/kg.dia, s.c.), cinco dias após a administração de estreptozotocina (STZ).
Os resultados são expressos como média ± EPM de 7 a 9 animais por grupo.
As linhas pontilhadas e a quebra no eixo x significam o período inicial de
diabetes onde os animais não receberam tratamento com guanetidina ou
salina.
55
60
65
70
75
80
85
90
dia do
experimento
(5 dias pós-STZ)
guanetidina
ou
salina
(4 dias pós-STZ)
guanetidina
ou
salina
(3 dias pós-STZ)
indução
diabetes
normal
diabético salina
diabético guanetidina
peso corporal
(g)
Resultados
49
FIGURA 4: Glicemia (mg/dL) de ratos diabéticos tratados com guanetidina (100
mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são
expressos como média ± EPM de 7 a 9 animais por grupo. ∗∗ p<0,01 D x N;
## p<0,01 DG x N.
0123456
0
100
200
300
400
500
600
##
##
##
**
**
**
glicemia
(mg/dL)
dias pós-STZ
normal
diabético salina
diabético guanetidina
Resultados
50
4.1.3) Efeito da simpatectomia química na concentração das
catecolaminas plasmáticas e musculares
A comprovação da simpatectomia foi feita através da quantificação das
catecolaminas plasmáticas e musculares nos três grupos de animais, N, D e
DG.
Na Figura 5 e Tabela 1 encontram-se os valores de adrenalina
plasmática (ng/mL) após a administração de guanetidina, nos diferentes
tempos de diabetes estudados. Não foram encontradas diferenças nas
concentrações de adrenalina no plasma de animais diabéticos em relação aos
animais normais, em qualquer período de diabetes estudado. Ocorreu uma
redução significativa na concentração de adrenalina no plasma de animais
diabéticos tratados com guanetidina (queda de 51 a 70% em relação aos
animais do grupo diabético salina). A administração de guanetidina em ratos
normais leva à idêntica redução dos níveis plasmáticos de adrenalina
observada nos animais diabéticos, de cerca de 50 a 70% (Navegantes et al.,
1999).
Resultados
51
FIGURA 5: Concentrações plasmáticas de adrenalina (ng/mL) de ratos
diabéticos e diabéticos tratados com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5
dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos como média ±
EPM de 7 a 9 animais por grupo. ## p<0,01 DG x N; φφ p<0,01 DG x D.
0123456
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
##
φφ
##
φφ
##
φφ
adrenalina plasmática
(ng/mL)
dias pós-STZ
normal
diabético salina
diabético guanetidina
52
Resultados
TABELA 1: Concentração plasmática de adrenalina em ratos normais controles, diabéticos
controles e diabéticos tratados com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.) em diferentes períodos de
diabetes.
Adrenalina plasmática
(ng/mL)
normal controle
(N)
diabético salina
(D)
diabético guanetidina
(DG)
Dias pós-STZ
Diferença
(%)
D x N DG x D
1
13,18 ± 1,03
(12)
14,56 ± 1,13
(13)
6,32 ± 0,89
(7)
ns - 57 **
3
13,60 ± 0,95
(14)
13,04 ± 0,82
(14)
3,91 ± 0,31
(8)
ns - 70 **
5
10,83 ± 0,51
(11)
9,34 ± 0,51
(16)
4,54 ± 0,63
(7)
ns - 51 **
Os valores representam a média ± EPM. O valor entre parênteses expressa o número de animais
utilizados. ns: não significativo; ** p< 0,01 na comparação entre os grupos.
Resultados
53
Os valores de noradrenalina em músculos soleus (ng/g) estão
apresentados na Tabela 2 e Figura 6, após 1, 3 e 5 dias de indução do quadro
diabético e tratamento com guanetidina. Como pode ser observado, houve um
aumento significativo nas concentrações de noradrenalina em músculos soleus
de animais diabéticos em relação aos normais. Um dia após a instalação do
quadro diabético ocorreu elevação de 26% nas concentrações da catecolamina
em soleus de ratos diabéticos em comparação aos controles. Esta elevação
tende a ser progressiva, atingindo um aumento de 83% quando a mesma
comparação é feita após 5 dias de diabetes. O tratamento com guanetidina foi
eficaz em promover a simpatectomia química nos animais diabéticos, levando à
queda de 97, 83 e 91% nos valores de noradrenalina em soleus, 1, 3 e 5 dias
após a administração de STZ, respectivamente.
A Tabela 3 e Figura 7 apresentam os valores de noradrenalina em
músculos EDL de ratos após a simpatectomia química nos diferentes tempos
de diabetes estudados. O mesmo perfil de resposta foi observado para ambos
os músculos: houve um aumento progressivo nas concentrações de
noradrenalina em EDL de animais diabéticos em relação aos normais (de 21 a
97% de elevação), sendo o tratamento com guanetidina efetivo na redução
destes valores, após 1, 3 e 5 dias de diabetes (queda de 97, 87 e 78%,
respectivamente).
A administração de guanetidina em ratos normais reduz drasticamente
(quase 100%) a concentração muscular de noradrenalina, tanto em soleus
quanto em EDL. Desta maneira foi comprovada a eficácia na indução da
simpatectomia.
Resultados
54
soleus
FIGURA 6: Concentração de noradrenalina (ng/g) em músculos soleus de ratos
diabéticos e diabéticos tratados com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5
dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos como média ±
EPM de 7 a 9 músculos por grupo. ∗ p<0,05 D x N; ∗∗ p<0,01 D x N;
## p<0,01 DG x N; φφ p<0,01 DG x D.
0123456
0
30
60
90
120
150
180
210
**
##
φφ
##
φφ
**
*
##
φφ
noradrenalina soleus
(ng/g)
dias pós-STZ
normal
diabético salina
diabético guanetidina
55
Resultados
TABELA 2: Concentração de noradrenalina em músculos soleus de ratos normais controles,
diabéticos controles e diabéticos tratados com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.) em diferentes
períodos de diabetes.
Noradrenalina muscular (soleus)
(ng/g)
normal controle
(N)
diabético salina
(D)
diabético guanetidina
(DG)
Dias pós-STZ
Diferença
(%)
D x N DG x D
1
102,0 ± 6,26
(6)
129,0 ± 8,43
(5)
4,00 ± 2,01
(8)
+ 26 * - 97 **
3
110,9 ± 7,16
(12)
141,7 ± 5,47
(13)
24,19 ± 1,76
(6)
+ 28 ** - 83 **
5
108,0 ± 5,79
(12)
197,9 ± 10,83
(17)
17,45 ± 6,61
(7)
+ 83 ** - 91 **
Os valores representam a média ± EPM. O valor entre parênteses expressa o número de animais
utilizados. ns: não significativo; * p<0,05 e ** p< 0,01 na comparação entre os grupos.
Resultados
56
EDL
FIGURA 7: Concentração de noradrenalina (ng/g) em músculos EDL de ratos
diabéticos e diabéticos tratados com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5
dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos como média ±
EPM de 7 a 9 músculos por grupo. ∗ p<0,05 D x N; ∗∗ p<0,01 D x N;
## p<0,01 DG x N; φφ p<0,01 DG x D.
0123456
0
50
100
150
200
250
*
**
**
##
φφ
##
φφ
##
φφ
noradrenalina EDL
(ng/g)
dias pós-STZ
normal
diabético salina
diabético guanetidina
57
Resultados
TABELA 3: Concentração de noradrenalina em músculos EDL de ratos normais controles,
diabéticos controles e diabéticos tratados com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.) em diferentes
períodos de diabetes.
Noradrenalina muscular (EDL)
(ng/g)
normal controle
(N)
diabético salina
(D)
diabético guanetidina
(DG)
Dias pós-STZ
Diferença
(%)
D x N DG x D
1
124,8 ± 5,34
(6)
151,0 ± 9,50
(6)
5,10 ± 1,33
(8)
+ 21 * - 97 **
3
132,7 ± 6,51
(12)
196,3 ± 10,06
(13)
25,64 ± 4,62
(6)
+ 48 ** - 87 **
5
115,6 ± 4,07
(13)
227,5 ± 13,05
(18)
49,02 ± 4,16
(8)
+ 97 ** - 78 **
Os valores representam a média ± EPM. O valor entre parênteses expressa o número de animais
utilizados. ns: não significativo; * p<0,05 e ** p< 0,01 na comparação entre os grupos.
Resultados
58
4.1.4) Efeito do diabetes na velocidade de renovação de noradrenalina
muscular
Uma vez que foi encontrado um aumento progressivo no conteúdo de
noradrenalina em músculos soleus e EDL de animais após a instalação do
diabetes em comparação aos animais normais controles, tornou-se
interessante investigar a atividade do sistema nervoso simpático para estes
tecidos, através da medida da velocidade de renovação de noradrenalina após
administração de um inibidor de sua síntese.
O declínio na concentração de noradrenalina (NOR) nos músculos
soleus e EDL de ratos normais e diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ) estão
apresentados nas Figuras 8 e 9, respectivamente. O declínio da concentração
de NOR apresentou-se reduzido em músculos soleus e EDL de animais
diabéticos em comparação aos controles, nos dois períodos de diabetes
estudados.
A Tabela 4 apresenta os valores da concentração de NOR no tempo 0,
da velocidade de renovação fracional (k), da velocidade de renovação de NOR
(VR) e do t
1/2
em soleus e EDL de animais normais e diabéticos após
administração de α-metil-tirosina. Como descrito anteriormente, o conteúdo de
NOR no tempo 0 foi significativamente maior em ambos os músculos de
animais com 1 e 3 dias de diabetes em comparação aos controles. Os valores
de k e de VR em soleus e EDL de animais diabéticos apresentaram-se
significativamente menores em relação aos mesmos valores em animais
normais, indicando ocorrer uma menor atividade simpática em músculos de
animais com deficiência insulínica. A instalação do diabetes promoveu uma
elevação nos valores de t
1/2
em ambos os músculos dos ratos.
Resultados
59
soleus
FIGURA 8: Concentração de noradrenalina em músculos soleus de animais
normais e diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ) após a administração de α-metil-
tirosina. Cada ponto representa a média e o erro padrão de 6-8 animais.
0612
37
46
5555
78
102
125
148148
noradrenalina soleus
(ng/g)
t
1/2
= 18,33h
1 DIA PÓS-STZ
horas após α-MT
diabético
t
1/2
= 9,09h
normal
0612
46
5555
78
102
125
148148
t
1/2
= 18,33h
horas após
α
-MT
noradrenalina soleus
(ng/g)
3 DIAS PÓS-STZ
diabético
t
1/2
= 10,21h
normal
Resultados
60
EDL
FIGURA 9: Concentração de noradrenalina em músculos EDL de animais
normais e diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ) após a administração de α-metil-
tirosina. Cada ponto representa a média e o erro padrão de 6-8 animais.
t
1/2
= 7,83h
normal
0612
37
46
5555
78
102
125
148148
t
1/2
= 20,32h
1 DIA PÓS-STZ
horas após
α
-MT
noradrenalina EDL
(ng/g)
diabético
0612
46
5555
78
102
125
148148
212
horas após α-MT
t
1/2
= 17,72h
3 DIAS PÓS-STZ
diabético
noradrenalina EDL
(ng/g)
t
1/2
= 8,09h
normal
Resultados
61
TABELA 4: Conteúdo de Noradrenalina (NOR), velocidade de renovação fracional (k)
e velocidade de renovação de noradrenalina (VR) em músculos soleus e EDL de
ratos normais e diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ).
1 dia pós-STZ
3 dias pós-STZ
NOR (ng/g)
k (%/h)
VR (ng/g.h) t
1/2
soleus
normal
102,0 ± 6,26 7,62 ± 0,36
7,77 (6,95-8,64) 9,09
diabético
129,0 ± 8,43 3,78 ± 0,29
4,88 (4,21-5,59) 18,33
EDL
normal
124,8 ± 5,34 8,85 ± 0,11
11,04 (10,44-11,65) 7,83
diabético
151,0 ± 9,5 3,41 ± 0,32
5,15 (4,37-5,99) 20,32
NOR (ng/g)
k (%/h)
VR (ng/g.h) t
1/2
soleus
normal
110,9 ± 7,16 6,79 ± 0,23
7,53 (6,81-8,29) 10,21
diabético
141,7 ± 5,47 3,78 ± 1,33
5,36 (3,34-7,52) 18,33
EDL
normal
132,7 ± 6,51 8,57 ± 0,46
11,37 (10,23-12,57) 8,09
diabético
196,3 ± 10,06 3,91 ± 0,77
7,67 (5,85-9,66) 17,72
Resultados
62
4.1.5) Efeito da simpatectomia química na proteólise total e na
participação das vias proteolíticas de soleus e EDL de ratos em diferentes
períodos de diabetes
Sabendo-se que as catecolaminas exercem um papel anti-proteolítico
no metabolismo de proteínas da musculatura esquelética de ratos normais, o
presente trabalho investigou o papel do sistema nervoso simpático no
metabolismo protéico muscular frente a uma situação catabólica, caracterizada
pelo diabetes. Estes estudos avaliaram assim o efeito da simpatectomia
química na proteólise total de músculos soleus e EDL de ratos após 1, 3 e 5
dias de diabetes; além disso, foram estudadas as alterações ocorridas nas
atividades das vias proteolíticas lisossomal, dependente de cálcio, dependente
de Ub-proteassoma e residual nestas mesmas condições.
a) Proteólise total em soleus e EDL de ratos diabéticos
simpatectomizados
Na Figura 10 estão apresentados os valores de proteólise total
(expressos como percentuais médios em relação aos animais controles
normais, considerados como 100%) de soleus de animais diabéticos controles
e simpatectomizados, nos diferentes períodos de diabetes estudados.
Podemos verificar que o perfil de resposta da proteólise total de soleus de
ratos diabéticos reproduziu resultados anteriormente obtidos no laboratório
(Pepato et al, 1996): houve um aumento de aproximadamente 14% na
degradação de proteínas neste músculo após 1 dia de diabetes; no entanto,
estes valores aproximaram-se daqueles obtidos no grupo normal quando os
animais encontravam-se no 3
o
dia de deficiência insulínica. Já os valores de
proteólise total em soleus de ratos após 5 dias de diabetes apresentaram-se
significativamente menores que os normais (queda de 24%).
O tratamento com guanetidina acarretou em aumento de 33% e 15%
na degradação de proteínas de soleus de animais após 1 e 3 dias de diabetes,
respectivamente, em comparação aos animais diabéticos controles. Já os
valores de proteólise total de animais com 5 dias de deficiência insulínica e
Resultados
63
soleus
FIGURA 10: Efeito da simpatectomia química na proteólise total em músculos
soleus de ratos diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100 mg/kg.dia,
s.c.), 1, 3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos
como médias percentuais ± EPM dos grupos diabéticos em relação ao grupo
normal controle (considerado como 100%). Os valores foram obtidos de 7 a 9
músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo
menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. ∗ p<0,05 D x N;
∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DG x N; ## p<0,01 DG x N; φ p<0,05 DG x D;
φφ p<0,01 DG x D.
12345
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
*
**
##
# φ
##
φφ
proteólise total
(% dos controles)
dias pós-STZ
diabético salina
diabético guanetidina
Resultados
64
tratados com guanetidina foram semelhantes aos observados em músculos de
ratos só diabéticos, embora ambos menores que os valores controles. A falta
das catecolaminas neste período de diabetes não interferiu na resposta
proteolítica como foi observado nos períodos mais agudos de deficiência
insulínica.
Os valores de proteólise total obtidos em músculos EDL de ratos
diabéticos simpatectomizados encontram-se na Figura 11. Foi observado um
aumento nos valores de proteólise total em EDL de animais 1 e 3 dias pós-STZ
(elevação de 27% e 51%, respectivamente), quando comparados com o grupo
normal. Os níveis de degradação de proteínas em EDL de ratos com 5 dias de
diabetes foram próximos daqueles obtidos com os animais normais. Estes
resultados foram semelhantes aos já observados no laboratório por Pepato e
colaboradores (1996).
Em animais diabéticos simpatectomizados, houve uma elevação
adicional (17% em relação ao grupo diabético salina) na degradação protéica
no músculo EDL após 1 dia de diabetes. Nos demais tempos a simpatectomia
química não acarretou em alterações significativas nos valores de proteólise
total de músculos EDL além daquelas já observadas nos ratos diabéticos.
b) Participação das vias proteolíticas em soleus e EDL de ratos diabéticos
simpatectomizados
Com a demonstração das alterações ocorridas na proteólise total em
músculos soleus e EDL de ratos diabéticos submetidos à simpatectomia
química, o presente trabalho passou a investigar qual(is) via(s) proteolítica(s)
estaria(m) contribuindo para estas respostas. Assim, foram estudadas as
participações das vias proteolíticas lisossomal, dependente de cálcio,
dependente de Ub-proteassoma e residual em soleus e EDL de animais com 1,
3 e 5 dias de diabetes submetidos à simpatectomia pelo tratamento com
guanetidina.
Resultados
65
EDL
FIGURA 11: Efeito da simpatectomia química na proteólise total em músculos
EDL de ratos diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100 mg/kg.dia,
s.c.), 1, 3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos
como médias percentuais ± EPM dos grupos diabéticos em relação ao grupo
normal controle (considerado como 100%). Os valores foram obtidos de 7 a 9
músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo
menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N;
## p<0,01 DG x N; φ p<0,05 DG x D.
12345
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
**
**
##
##
φ
proteólise total
(% dos controles)
dias pós-STZ
diabético salina
diabético guanetidina
Resultados
66
- Via Lisossomal
A Figura 12 mostra os valores médios percentuais em relação ao
grupo normal da participação da via lisossomal em soleus de animais
diabéticos controle e tratados com guanetidina, 1, 3 e 5 dias após a
administração de STZ. A instalação do quadro diabético não promoveu
alterações na contribuição desta via neste músculo, em comparação aos
animais normais, assim como o obtido em trabalhos anteriores do laboratório
(Pepato et al., 1996). Porém, o tratamento de animais diabéticos com
guanetidina levou a uma mudança na participação da via lisossomal em soleus:
houve aumento de 48% e 96% nos valores desta via em ratos com 1 e 3 dias
de diabetes, respectivamente, após a simpatectomia. O tratamento com
guanetidina não acarretou em alterações nesta via em soleus de animais com 5
dias de deficiência insulínica.
A participação da via lisossomal em EDL de ratos diabéticos
submetidos à simpatectomia química encontra-se na Figura 13. As respostas
obtidas em músculos ricos em fibras do tipo II foram diferentes daquelas
obtidas em músculos de fibras do tipo I: tanto a instalação do quadro diabético
quanto o tratamento dos animais com guanetidina não levaram a alterações na
participação da via lisossomal em EDL, em nenhum período de diabetes
estudado, em relação aos animais controles.
Nas Tabelas 5, 6 e 7 estão sumarizados os valores médios da
contribuição da via lisossomal nos grupos normal, diabético salina e diabético
guanetidina 1, 3 e 5 dias pós-STZ, respectivamente. Os valores médios da
proteólise total em soleus e EDL podem ser avaliados pelos resultados obtidos
com a ausência de inibidores da via, representados na tabelas pelo sinal (-).
Resultados
67
soleus
FIGURA 12: Participação da via lisossomal em músculos soleus de ratos
diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5
dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos como médias
percentuais ± EPM da participação da via nos grupos diabéticos em relação ao
grupo normal controle (considerado como 100%). Os valores foram obtidos de
7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi
repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.
## p<0,01 DG x N; φ p<0,05 DG x D; φφ p<0,01 DG x D.
0123456
0
25
50
75
100
125
150
175
200
##
φ
##
φφ
via lisossomal
(% dos controles)
dias pós-STZ
diabético salina
diabético guanetidina
Resultados
68
EDL
FIGURA 13: Participação da via lisossomal em músculos EDL de ratos
diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5
dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos como médias
percentuais ± EPM da participação da via nos grupos diabéticos em relação ao
grupo normal controle (considerado como 100%). Os valores foram obtidos de
7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi
repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.
0123456
0
25
50
75
100
125
150
via lisossomal
(% dos controles)
dias pós-STZ
diabético salina
diabético guanetidina
69
Resultados
TABELA 5: Tirosina liberada no meio (nmol/mg.2h) pelos músculos soleus e EDL de ratos normais controles, diabéticos
controles e diabéticos tratados, 1 dia pós-STZ e 10 horas após a administração de guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.).
Avaliação da proteólise total e da participação da via proteolítica lisossomal.
Adição Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
BCAA e metilamina
normal controle
(N)
diabético salina
(D)
diabético guanetidina
(DG)
Diferença
(%)
soleus
D x N DG x D
(-)
0,302 ± 0,012 0,345 ± 0,011 0,457 ± 0,012
+ 14 * + 33 **
(+)
0,227 ± 0,010 0,259 ± 0,009 0,330 ± 0,011
+ 14 * + 27 **
componente lisossomal
0,075 ± 0,011
#
0,086 ± 0,013
#
0,127 ± 0,008
#
ns + 48 *
EDL
D x N DG x D
(-)
0,192 ± 0,010 0,244 ± 0,010 0,286 ± 0,010
+ 27 ** + 17 *
(+)
0,113 ± 0,004 0,157 ± 0,009 0,205 ± 0,005
+ 39 ** + 31 **
componente lisossomal
0,079 ± 0,007
#
0,087 ± 0,006
#
0,081 ± 0,008
#
ns ns
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e ** p< 0,01 na comparação
entre os grupos.
#
p< 0,05 em relação à ausência dos inibidores da via.
70
Resultados
TABELA 6: Tirosina liberada no meio (nmol/mg.2h) pelos músculos soleus e EDL de ratos normais controles, diabéticos
controles e diabéticos tratados, 3 dias pós-STZ e 2 dias após a administração de guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.).
Avaliação da proteólise total e da participação da via proteolítica lisossomal.
Adição Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
BCAA e metilamina
normal controle
(N)
diabético salina
(D)
diabético guanetidina
(DG)
Diferença
(%)
soleus
D x N DG x D
(-)
0,364 ± 0,016 0,358 ± 0,015 0,411 ± 0,014
ns + 15 *
(+)
0,307 ± 0,012 0,307 ± 0,010 0,311 ± 0,010
ns ns
componente lisossomal
0,057 ± 0,009
#
0,051 ± 0,005
#
0,100 ± 0,007
#
ns + 96 **
EDL
D x N DG x D
(-)
0,203 ± 0,012 0,306 ± 0,019 0,282 ± 0,012
+ 51 ** ns
(+)
0,133 ± 0,009 0,221 ± 0,007 0,203 ± 0,006
+ 66 ** ns
componente lisossomal
0,070 ± 0,007
#
0,085 ± 0,012
#
0,079 ± 0,006
#
ns ns
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e ** p< 0,01 na
comparação entre os grupos.
#
p< 0,05 em relação à ausência dos inibidores da via.
71
Resultados
TABELA 7: Tirosina liberada no meio (nmol/mg.2h) pelos músculos soleus e EDL de ratos normais controles,
diabéticos controles e diabéticos tratados, 5 dias pós-STZ e 2 dias após a administração de guanetidina (100
mg/kg.dia, s.c.). Avaliação da proteólise total e da participação da via proteolítica lisossomal.
Adição Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
BCAA e metilamina
normal controle
(N)
diabético salina
(D)
diabético guanetidina
(DG)
Diferença
(%)
soleus
D x N DG x D
(-)
0,344 ± 0,009 0,260 ± 0,009 0,290 ± 0,012
- 24 ** ns
(+)
0,270 ± 0,010 0,182 ± 0,006 0,196 ± 0,007
- 33 ** ns
componente lisossomal
0,074 ± 0,013
#
0,078 ± 0,009
#
0,094 ± 0,009
#
ns ns
EDL
D x N DG x D
(-)
0,253 ± 0,009 0,235 ± 0,006 0,264 ± 0,013
ns ns
(+)
0,184 ± 0,007 0,152 ± 0,005 0,179 ± 0,007
ns ns
componente lisossomal
0,069 ± 0,009
#
0,083 ± 0,008
#
0,085 ± 0,007
#
ns ns
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; ** p< 0,01 na comparação entre os
grupos.
#
p< 0,05 em relação à ausência dos inibidores da via.
Resultados
72
- Via Dependente de Cálcio
Na Figura 14 encontram-se os valores médios percentuais (em relação
ao grupo normal) da contribuição da via dependente de cálcio em soleus obtidos
de ratos pertencentes aos grupos diabéticos salina e guanetidina. Os resultados
mostram aumento na participação desta via em soleus de animais com 1 dia de
diabetes (elevação de aproximadamente 81% em relação ao grupo normal); após
3 dias da indução do diabetes, a participação da via dependente de cálcio foi da
mesma magnitude da observada no grupo normal. Já com 5 dias de diabetes
houve queda (48%) na contribuição do processo dependente de cálcio em soleus,
em relação aos animais normais. Estes resultados corroboram dados
anteriormente obtidos em nosso laboratório por Pepato et al. (1996).
A simpatectomia química realizada em animais diabéticos (com a
redução das catecolaminas musculares e plasmáticas) promoveu alteração na
participação do processo dependente de cálcio em soleus de ratos apenas com
3 dias de diabetes: foi observada uma queda surpreendente de 72% nos
valores desta via quando os grupos diabético salina e diabético guanetidina
foram comparados. Nos demais tempos estudados o tratamento com
guanetidina não acarretou em modificações neste processo proteolítico.
São apresentados na Figura 15 os valores da participação da via
dependente de cálcio em músculos EDL de ratos diabéticos submetidos à
simpatectomia, 1, 3 e 5 dias pós-STZ. Tal como era esperado, a contribuição
desta via em EDL de ratos diabéticos estava aumentada nos tempos de 1 e 3
dias de diabetes, em comparação aos ratos normais (66% e 93%,
respectivamente), sem diferenças entre os mesmos grupos após 5 dias de
deficiência insulínica.
O tratamento com guanetidina levou a uma resposta bifásica na
participação da via dependente de cálcio em EDL de animais diabéticos: a
simpatectomia promoveu aumento de 49% nos valores desta via em EDL de
animais com 1 dia de diabetes e, posteriormente, levou a uma queda 3 dias
pós-STZ (41%, aproximadamente). Não foram encontradas diferenças na
contribuição do processo proteolítico dependente de cálcio quando os grupos
Resultados
73
soleus
FIGURA 14: Participação da via dependente de cálcio em músculos soleus
de ratos diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1,
3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos como
médias percentuais ± EPM da participação da via nos grupos diabéticos em
relação ao grupo normal controle (considerado como 100%). Os valores foram
obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento típico, que
foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.
∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DG x N; ## p<0,01 DG x N; φφ p<0,01 DG x D.
0123456
0
50
100
150
200
250
**
**
#
##
##
φφ
via dependente de cálcio
(% dos controles)
dias pós-STZ
diabético salina
diabético guanetidina
Resultados
74
EDL
FIGURA 15: Participação da via dependente de cálcio em músculos EDL de
ratos diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e
5 dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos como
médias percentuais ± EPM da participação da via nos grupos diabéticos em
relação ao grupo normal controle (considerado como 100%). Os valores foram
obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento típico, que
foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.
∗ p<0,05 D x N; ∗∗ p<0,01 D x N; ## p<0,01 DG x N; φ p<0,05 DG x D;
φφ p<0,01 DG x D.
0123456
0
50
100
150
200
250
*
**
φ
##
φφ
via dependente de cálcio
(% dos controles)
dias pós-STZ
diabético salina
diabético guanetidina
75
Resultados
TABELA 8: Tirosina liberada no meio (nmol/mg.2h) pelos músculos soleus e EDL de ratos normais controles,
diabéticos controles e diabéticos tratados, 1 dia pós-STZ e 10 horas após a administração de guanetidina (100
mg/kg.dia, s.c.). Avaliação da participação da via proteolítica dependente de Ca
2+
.
Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
manutenção do
comprimento de repouso
normal controle
(N)
diabético salina
(D)
diabético guanetidina
(DG)
Diferença
(%)
soleus
D x N DG x D
(-)
0,265 ± 0,009 0,310 ± 0,008 0,373 ± 0,015
+ 17 ** + 20 **
(+)
0,239 ± 0,008 0,263 ± 0,008 0,324 ± 0,010
+ 11 * + 23 **
componente dep. cálcio
0,026 ± 0,002
#
0,047 ± 0,005
#
0,049 ± 0,008
#
+ 81 ** ns
EDL
D x N DG x D
(-)
0,212 ± 0,005 0,295 ± 0,015 0,400 ± 0,016
+ 39 ** + 36 **
(+)
0,139 ± 0,004 0,174 ± 0,007 0,220 ± 0,008
+ 25 ** + 26 **
componente dep. cálcio
0,073 ± 0,009
#
0,121 ± 0,011
#
0,180 ± 0,007
#
+ 66 * +49 **
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e ** p< 0,01 na comparação
entre os grupos.
#
p< 0,05 em relação à manutenção do comprimento de repouso.
76
Resultados
TABELA 9: Tirosina liberada no meio (nmol/mg.2h) pelos músculos soleus e EDL de ratos normais controles, diabéticos
controles e diabéticos tratados, 3 dias pós-STZ e 2 dias após a administração de guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.).
Avaliação da participação da via proteolítica dependente de Ca
2+
.
Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
manutenção do
comprimento de repouso
normal controle
(N)
diabético salina
(D)
diabético guanetidina
(DG)
Diferença
(%)
soleus
D x N DG x D
(-)
0,392 ± 0,033 0,352 ± 0,030 0,323 ± 0,011
ns ns
(+)
0,294 ± 0,012 0,256 ± 0,012 0,296 ± 0,009
ns + 16 *
componente dep. cálcio
0,098 ± 0,013
#
0,096 ± 0,012
#
0,027 ± 0,010
#
ns - 72 **
EDL
D x N DG x D
(-)
0,249 ± 0,007 0,352 ± 0,018 0,338 ± 0,010
+ 41 ** ns
(+)
0,173 ± 0,010 0,205 ± 0,008 0,252 ± 0,011
+ 18 * + 23 *
componente dep. cálcio
0,076 ± 0,009
#
0,147 ± 0,016
#
0,086 ± 0,016
#
+ 93 ** - 41 *
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e ** p< 0,01 na comparação
entre os grupos.
#
p< 0,05 em relação à manutenção do comprimento de repouso.
77
Resultados
TABELA 10: Tirosina liberada no meio (nmol/mg.2h) pelos músculos soleus e EDL de ratos normais controles,
diabéticos controles e diabéticos tratados, 5 dias pós-STZ e 2 dias após a administração de guanetidina (100
mg/kg.dia, s.c.). Avaliação da participação da via proteolítica dependente de Ca
2+
.
Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
manutenção do
comprimento de repouso
normal controle
(N)
diabético salina
(D)
diabético guanetidina
(DG)
Diferença
(%)
soleus
D x N DG x D
(-)
0,325 ± 0,010 0,270 ± 0,010 0,263 ± 0,010
- 17 ** ns
(+)
0,271 ± 0,010 0,242 ± 0,009 0,233 ± 0,008
- 11 * ns
componente dep. cálcio
0,054 ± 0,005
#
0,028 ± 0,003
#
0,030 ± 0,003
#
- 48 * ns
EDL
D x N DG x D
(-)
0,264 ± 0,016 0,283 ± 0,024 0,273 ± 0,013
ns ns
(+)
0,195 ± 0,008 0,219 ± 0,012 0,214 ± 0,009
ns ns
componente dep. cálcio
0,069 ± 0,009
#
0,064 ± 0,016
#
0,059 ± 0,009
#
ns ns
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e ** p< 0,01 na
comparação entre os grupos.
#
p< 0,05 em relação à manutenção do comprimento de repouso.
Resultados
78
diabético salina e diabético guanetidina foram comparados após 5 dias da
injeção da droga diabetogênica.
Os valores médios da participação da via dependente de cálcio nos
grupos normal, diabético salina e diabético guanetidina 1, 3 e 5 dias pós-STZ
estão apresentados, respectivamente, nas Tabelas 8, 9 e 10, com as
diferenças percentuais observadas na contribuição desta via em soleus e EDL
entre os referidos grupos.
- Via Dependente de Ub-proteassoma e Via Residual
Na Figura 16 estão apresentados os valores da participação da via
dependente de Ub-proteassoma expressos como percentuais médios em
relação aos animais normais (considerados como 100%) de soleus de animais
diabéticos controles e simpatectomizados, 1, 3 e 5 dias após a administração
de STZ. Como era esperado, não ocorreu alteração na contribuição desta via
em soleus de ratos após 1 e 3 dias de diabetes, quando comparados aos
resultados obtidos com o grupo normal. Após 5 dias de deficiência insulínica,
no entanto, pôde ser observada uma queda de aproximadamente 24% nos
valores da via dependente de Ub-proteassoma em relação aos controles,
corroborando dados de Pepato et al. (1996).
A simpatectomia química acarretou em um aumento de cerca de 27%
na participação da via dependente de Ub-proteassoma em músculos soleus de
animais após 1 dia de diabetes, quando comparados ao grupo diabético tratado
com salina e ao grupo normal. Nos demais tempos estudados o tratamento
com guanetidina não acarretou em modificações neste processo proteolítico,
além daqueles já observados no quadro diabético.
A Figura 17 apresenta os valores da participação da via dependente
de Ub-proteassoma em músculos EDL de ratos com 1, 3 e 5 dias de diabetes e
submetidos à simpatectomia. Não existem alterações na participação desta via
em EDL de ratos com 1 dia de diabetes em comparação aos normais. Após 3
dias de deficiência insulínica houve aumento (48%) na contribuição da via
dependente de Ub-proteassoma neste músculo, não existindo diferenças
Resultados
79
soleus
FIGURA 16: Participação da via dependente de Ub-proteassoma em
músculos soleus de ratos diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100
mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são
expressos como médias percentuais ± EPM da participação da via nos grupos
diabéticos em relação ao grupo normal controle (considerado como 100%). Os
valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um
experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos
resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DG x N; ## p<0,01 DG x N;
φφ p<0,01 DG x D.
0123456
0
20
40
60
80
100
120
140
160
**
##
##
φφ
via dependente de Ub-proteassoma
(% dos controles)
dias pós-STZ
diabético salina
diabético guanetidina
Resultados
80
EDL
FIGURA 17: Participação da via dependente de Ub-proteassoma em
músculos EDL de ratos diabéticos tratados com salina ou guanetidina (100
mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são
expressos como médias percentuais ± EPM da participação da via nos grupos
diabéticos em relação ao grupo normal controle (considerado como 100%). Os
valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um
experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos
resultados semelhantes. ∗ p<0,05 D x N; ## p<0,01 DG x N; φφ p<0,01 DG x D.
0123456
0
25
50
75
100
125
150
175
200
*
##
##
φφ
via dependente de Ub-proteassoma
(% dos controles)
dias pós-STZ
diabético salina
diabético guanetidina
Resultados
81
entre os mesmos grupos quando a via foi analisada em EDL de ratos com 5
dias de diabetes. Estes resultados foram semelhantes aos de Pepato et al.
(1996).
O tratamento com guanetidina levou ao mesmo perfil de resposta
observado em soleus. Com a diminuição das catecolaminas (muscular e
plasmática), ocorreu aumento de 53% na contribuição da via dependente de
Ub-proteassoma em EDL de animais com 1 dia de diabetes. Entretanto
nenhuma diferença foi observada quando os grupos diabético salina e diabético
guanetidina foram comparados 3 e 5 dias após a administração de STZ.
Nas Tabelas 11, 12 e 13 estão apresentados os valores médios da
contribuição das vias dependente de Ub-proteassoma e residual nos grupos
normal, diabético salina e diabético guanetidina 1, 3 e 5 dias pós-STZ,
respectivamente. O tratamento com guanetidina não promoveu alterações na
participação da via residual, tanto em soleus quanto em EDL dos animais nos
diferentes tempos de diabetes estudados.
Em seguida apresentamos nas Figuras 18 (soleus) e 19 (EDL) um
resumo da participação das 3 principais vias proteolíticas em músculos de ratos
diabéticos controles e simpatectomizados. Acrescentamos também para
comparação dados obtidos de ratos que foram tratados apenas com
guanetidina (durante 1 e 2 dias) antes do sacrifício (Navegantes et al., 1999).
82
Resultados
TABELA 11: Tirosina liberada no meio (nmol/mg.2h) pelos músculos soleus e EDL de ratos normais controles, diabéticos
controles e diabéticos tratados, 1 dia pós-STZ e 10 horas após a administração de guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.).
Avaliação da participação da via proteolítica dependente de Ub-proteassoma e da via residual.
Adição Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
DNP glicose
normal controle
(N)
diabético salina
(D)
diabético guanetidina
(DG)
Diferença
(%)
soleus
D x N DG x D
(-) (+)
0,191 ± 0,008 0,200 ± 0,006 0,237 ± 0,007
ns + 19 **
(+) (-)
0,088 ± 0,009 0,079 ± 0,004 0,083 ± 0,002
ns ns
componente dep.
Ub-proteassoma
0,103 ± 0,008
#
0,121 ± 0,006
#
0,154 ± 0,007
#
ns + 27 **
EDL
D x N DG x D
(-) (+)
0,100 ± 0,005 0,110 ± 0,003 0,148 ± 0,004
ns + 34 **
(+) (-)
0,046 ± 0,004 0,050 ± 0,002 0,056 ± 0,003
ns ns
componente dep.
Ub-proteassoma
0,054 ± 0,005
#
0,060 ± 0,002
#
0,092 ± 0,003
#
ns + 53 **
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; ** p< 0,01 na comparação entre os grupos.
#
p< 0,05 em relação ao basal.
83
Resultados
TABELA 12: Tirosina liberada no meio (nmol/mg.2h) pelos músculos soleus e EDL de ratos normais controles, diabéticos
controles e diabéticos tratados, 3 dias pós-STZ e 2 dias após a administração de guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.). Avaliação
da participação da via proteolítica dependente de Ub-proteassoma e da via residual.
Adição Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
DNP glicose
normal controle
(N)
diabético salina
(D)
diabético guanetidina
(DG)
Diferença
(%)
soleus
D x N DG x D
(-) (+)
0,209 ± 0,006 0,224 ± 0,012 0,228 ± 0,010
ns ns
(+) (-)
0,079 ± 0,004 0,081 ± 0,003 0,082 ± 0,003
ns ns
componente dep.
Ub-proteassoma
0,130 ± 0,007
#
0,143 ± 0,012
#
0,146 ± 0,011
#
ns ns
EDL
D x N DG x D
(-) (+)
0,129 ± 0,007 0,166 ± 0,010 0,170 ± 0,013
+ 29 ** ns
(+) (-)
0,071 ± 0,004 0,080 ± 0,005 0,083 ± 0,006
ns ns
componente dep.
Ub-proteassoma
0,058 ± 0,004
#
0,086 ± 0,008
#
0,087 ± 0,007
#
+ 48 * ns
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e ** p< 0,01 na comparação
entre os grupos.
#
p< 0,05 em relação ao basal.
84
Resultados
TABELA 13: Tirosina liberada no meio (nmol/mg.2h) pelos músculos soleus e EDL de ratos normais controles, diabéticos
controles e diabéticos tratados, 5 dias pós-STZ e 2 dias após a administração de guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.). Avaliação
da participação da via proteolítica dependente de Ub-proteassoma e da via residual.
Adição Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
DNP glicose
normal controle
(N)
diabético salina
(D)
diabético guanetidina
(DG)
Diferença
(%)
soleus
D x N DG x D
(-) (+)
0,224 ± 0,009 0,176 ± 0,007 0,177 ± 0,010
- 21 ** ns
(+) (-)
0,098 ± 0,005 0,080 ± 0,006 0,081 ± 0,005
- 18 ** ns
componente dep.
Ub-proteassoma
0,126 ± 0,005
#
0,096 ± 0,003
#
0,096 ± 0,005
#
- 24 * ns
EDL
D x N DG x D
(-) (+)
0,146 ± 0,004 0,153 ± 0,020 0,160 ± 0,006
ns ns
(+) (-)
0,081 ± 0,006 0,085 ± 0,010 0,088 ± 0,007
ns ns
componente dep.
Ub-proteassoma
0,065 ± 0,007
#
0,068 ± 0,009
#
0,072 ± 0,003
#
ns ns
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e ** p< 0,01 na comparação
entre os grupos.
#
p< 0,05 em relação ao basal.
Resultados
85
FIGURA 18: Vias proteolíticas lisossomal (A), dependente de cálcio (B) e dependente de Ub-
proteassoma (C) em músculos soleus de ratos diabéticos e diabéticos tratados com
guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são
expressos como médias percentuais ± EPM dos grupos relação ao grupo normal controle
(considerado como 100%). Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e
representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos
resultados semelhantes. γ p<0,05 NG x N; γ γ p<0,01 NG x N; * p<0,05 D x N; ** p<0,01 D x N;
# p<0,05 DG x N; ## p<0,01 DG x N; φ p<0,05 DG x D; φφ p<0,01 DG x D.
soleus
0
50
100
150
1 3 5
dias pós-STZ
##
**
##
φφ
γ
via dep. Ub-proteassoma
(% dos controles)
50
100
150
200
250
γγ
γ
##
**
##
φφ
#
**
via dep. cálcio
(% dos controles)
50
100
150
200
##
φφ
##
φ
via lisossomal
(% dos controles)
normal guanetidina
diabético salina
diabético guanetidina
A
B
C
Resultados
86
FIGURA 19: Vias proteolíticas lisossomal (A), dependente de cálcio (B) e dependente de Ub-
proteassoma (C) em músculos EDL de ratos diabéticos e diabéticos tratados com guanetidina
(100 mg/kg.dia, s.c.), 1, 3 e 5 dias após a administração de STZ. Os resultados são expressos
como médias percentuais ± EPM dos grupos em relação ao grupo normal controle
(considerado como 100%). Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e
representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos
resultados semelhantes. . g p<0,05 NG x N; g g p<0,01 NG x N; * p<0,05 D x N; ** p<0,01 D x
N; # p<0,05 DG x N; ## p<0,01 DG x N; φ p<0,05 DG x D; φφ p<0,01 DG x D.
EDL
0
50
100
150
200
1 3 5
dias pós-STZ
##
*
##
φφ
γγ
via dep. Ub-proteassoma
(% dos controles)
50
100
150
200
250
φ
**
##
φφ
*
via dep. cálcio
(% dos controles)
50
100
150
via lisossomal
(% dos controles)
normal guanetidina
diabético salina
diabético guanetidina
A
B
C
Resultados
87
4.1.6) Velocidade da síntese de proteínas em soleus de ratos diabéticos
simpatectomizados na ausência ou presença de adrenalina in vitro
Após a verificação do papel das catecolaminas na proteólise total e na
atividade das vias proteolíticas em músculos soleus e EDL de ratos diabéticos,
o presente trabalho passou a investigar as alterações ocorridas na velocidade
de síntese protéica em soleus de animais diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ)
simpatectomizados. Também foi verificado o efeito da adição de 10
-5
M de
adrenalina in vitro na síntese de proteínas destes mesmos músculos.
Os valores da velocidade de síntese protéica em soleus de animais
normais, diabéticos controles e diabéticos simpatectomizados (1 dia pós-STZ)
incubados na ausência ou na presença de adrenalina encontram-se na Figura
20. Tal como era esperado, ocorreu uma redução de aproximadamente 31% na
velocidade de síntese protéica em soleus de animais com 1 dia de diabetes em
comparação aos valores obtidos com o grupo normal. A simpatectomia
promoveu uma redução adicional nos valores de síntese protéica em soleus de
animais diabéticos (15% em comparação ao grupo diabético controle). A adição
de adrenalina ao meio de incubação não causou modificações na síntese de
proteínas nos músculos de ratos normais, sendo este resultado já observado
anteriormente (Navegantes et al., 2004). A presença de adrenalina também
não promoveu alterações adicionais na velocidade de síntese protéica em
soleus de animais diabéticos controles ou diabéticos simpatectomizados, 1 dia
após a administração de STZ.
A Figura 21 apresenta os valores de síntese protéica obtidos em soleus
de animais normais, diabéticos controles e diabéticos simpatectomizados,
incubados na ausência ou presença de adrenalina, 3 dias após a indução de
diabetes. A instalação do diabetes promoveu uma queda na velocidade de
síntese protéica em soleus em relação aos valores obtidos no grupo normal
(redução de aproximadamente 36%). Não ocorreram alterações adicionais na
síntese protéica em músculos de animais diabéticos simpatectomizados em
comparação aos diabéticos controles. A presença de adrenalina no meio de
incubação não causou modificações na velocidade de síntese de proteínas em
Resultados
88
soleus de animais normais e diabéticos; no entanto, foi observado um aumento
de 22% na velocidade de síntese protéica em músculos de animais diabéticos
(3 dias pós-STZ) simpatectomizados incubados na presença de adrenalina em
comparação aos mesmos músculos incubados na ausência do hormônio.
Resultados
89
FIGURA 20: Efeito da simpatectomia química e da adrenalina (10
-5
M) na
síntese protéica em músculos soleus de ratos diabéticos e diabéticos tratados
com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 1 dia após a administração de STZ. Os
resultados são expressos como médias ± EPM dos grupos experimentais. Os
valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um
experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos
resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N ou Dadr x N; φ p<0,05 DG x D ou
DGadr x D.
0,00
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
**
φ
**
**
φ
**
síntese protéica
(nmol Tyr/mg.2h)
normal
normal + ADR
diabético
diabético + ADR
diabético guanetidina
diabético guanetidina + ADR
Resultados
90
FIGURA 21: Efeito da simpatectomia química e da adrenalina (10
-5
M) na
síntese protéica em músculos soleus de ratos diabéticos e diabéticos tratados
com guanetidina (100 mg/kg.dia, s.c.), 3 dias após a administração de STZ. Os
resultados são expressos como médias ± EPM dos grupos experimentais. Os
valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um
experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos
resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N ou Dadr x N; ω p<0,05 DGadr x DG.
0,00
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
ω
**
**
síntese protéica
(nmol Tyr/mg.2h)
normal
normal + ADR
diabético
diabético + ADR
diabético guanetidina
diabético guanetidina + ADR
Resultados
91
Estudo do papel da pentoxifilina no metabolismo de proteínas
em músculo esquelético de ratos diabéticos
4.2) Modelo experimental: Estudo das ações in vivo da pentoxifilina em
músculo esquelético de ratos normais e diabéticos
4.2.1) Níveis intracelulares de AMPc
Os valores intracelulares de AMPc em músculos de animais normais e
diabéticos tratados ou não com PTX encontram-se na Figura 22. Como pode ser
observado, não existem diferenças nas concentrações intracelulares de AMPc
entre músculos de animais normais e diabéticos controles, isto é, na ausência do
tratamento com PTX. Não ocorreram diferenças nos valores deste nucleotídeo
cíclico em músculos de ratos normais tratados durante 4 dias com PTX quando
comparados ao grupo não tratado. No entanto, ocorreu um aumento de 22% nos
níveis de AMPc em músculos de animais diabéticos tratados com PTX em
relação ao grupo diabético não tratado.
4.2.2) Proteólise total
Na Figura 23 e Tabela 14 estão apresentados os valores médios da
proteólise total de músculos EDL de animais normais e diabéticos, controles e
tratados durante 4 dias com PTX. O perfil de resposta da proteólise total de
EDL de ratos diabéticos reproduziu resultados previamente obtidos no
laboratório: ocorreu um aumento de aproximadamente 60% na degradação de
proteínas neste músculo após 3 dias de diabetes. O tratamento com PTX
promoveu uma queda significativa de 17% nos valores de proteólise total em
EDL de animais no 3
o
dia de deficiência insulínica.
Na Tabela 14 encontram-se os valores médios da proteólise total em
EDL, que correspondem aos resultados obtidos na ausência de inibidores da
via (BCAA e metilamina), representados na tabela pelo sinal (-).
Resultados
92
FIGURA 22: Efeito do tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia, i.p.) nas
concentrações intracelulares de AMPc em músculos EDL de ratos normais e
diabéticos. Os resultados são expressos como médias ± EPM dos grupos
experimentais. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e
representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo
sido obtidos resultados semelhantes. # p<0,05 DPTX x D.
300
400
500
600
700
#
conteúdo de AMPc
(fmol/mg músculo)
normal
normal + PTX (in vivo)
diabético
diabético + PTX (in vivo)
Resultados
93
FIGURA 23: Efeito do tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia, i.p.) na
proteólise total em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os
resultados são expressos como médias ± EPM dos grupos experimentais. Os
valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um
experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos
resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DPTX x D.
0.00
0.08
0.16
0.24
0.32
0.40
0.48
**
#
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
Proteólise total
normal
normal + PTX (in vivo)
diabético
diabético + PTX (in vivo)
Resultados
94
4.2.3) Participação das vias proteolíticas
Como o tratamento com PTX levou a alterações na proteólise total em
músculos EDL de ratos diabéticos, o presente trabalho passou a investigar
qual(is) via(s) proteolítica(s) estaria(m) contribuindo para estas respostas.
Assim, foram estudadas as participações das vias proteolíticas lisossomal,
dependente de cálcio, dependente de Ub-proteassoma e residual nos músculos
destes animais.
- Via Lisossomal
A Figura 24 e a Tabela 14 apresentam os valores médios da
participação da via lisossomal em EDL de animais normais e diabéticos
controles e tratados com PTX. Como pode ser observado, o quadro diabético
não promoveu alterações significativas na atividade desta via neste músculo,
em comparação aos animais normais. O tratamento destes animais durante 4
dias com PTX também não promoveu modificações na participação desta via
proteolítica em nenhum dos grupos estudados.
- Via Dependente de Cálcio
São apresentados na Figura 25 e na Tabela 15 os valores de tirosina
liberada de músculos EDL de ratos normais e diabéticos submetidos ao
tratamento com PTX. Tais medidas permitem a avaliação da participação da
via proteolítica dependente de cálcio. Tal como era esperado, a contribuição
deste processo proteolítico em EDL de ratos diabéticos está aumentada
(aproximadamente 175%) após 3 dias de diabetes, em comparação aos ratos
normais. A administração de PTX durante 4 dias aos animais normais não
promoveu alterações na atividade da via dependente de cálcio em EDL quando
comparados aos controles tratados com salina; contudo, o tratamento com PTX
acarretou uma queda de cerca de 47% na participação desta via em EDL de
ratos diabéticos em relação aos animais diabéticos controles.
Resultados
95
FIGURA 24: Efeito do tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia,
i.p.) na via
lisossomal em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os resultados
são expressos como médias
± EPM dos grupos experimentais. Os valores
foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento
típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados
semelhantes.
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
Via lisossomal
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
normal
normal + PTX (in vivo)
diabético
diabético + PTX (in vivo)
96
Resultados
TABELA 14: Proteólise total e participação da via proteolítica lisossomal em músculos EDL de
ratos normais e diabéticos controles e tratados com pentoxifilina.
Adição Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
BCAA e
metilamina
normal
salina
(NS)
normal
PTX
(NPTX)
diabético
salina
(DS)
diabético
PTX
(DPTX)
Diferença
(%)
EDL
DS x NS DPTX x DS
(-)
0,245 ± 0,013 0,241 ± 0,011 0,391 ± 0,016 0,326 ± 0,018
+ 60 ** - 17 *
(+)
0,184 ± 0,010 0,172 ± 0,013 0,306 ± 0,009 0,240 ± 0,011
+ 66 ** - 21 *
componente
lisossomal
0,061 ± 0,014
#
0,069 ± 0,013
#
0,085 ± 0,020
#
0,086 ± 0,008
#
ns ns
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e **
p
< 0,01 na comparação entre os grupos.
#
p< 0,05 em relação à ausência dos inibidores da via.
Resultados
97
FIGURA 25: Efeito do tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia,
i.p.) na via
dependente de cálcio em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os
resultados são expressos como médias
± EPM dos grupos experimentais. Os
valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um
experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos
resultados semelhantes.
∗∗ p<0,01 D x N; ## p<0,01 DPTX x D.
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
Via dependente de cálcio
normal
normal + PTX (in vivo)
diabético
diabético + PTX (in vivo)
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
**
##
98
Resultados
TABELA 15: Participação da via proteolítica dependente de Ca
2+
em músculos EDL de ratos
normais e diabéticos controles e tratados com pentoxifilina.
Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
manutenção
comprimento
de repouso
normal
salina
(NS)
normal
PTX
(NPTX)
diabético
salina
(DS)
diabético
PTX
(DPTX)
Diferença
(%)
EDL
DS x NS DPTX x DS
(-)
0,224 ± 0,007 0,226 ± 0,021 0,342 ± 0,011 0,305 ± 0,010
+ 53 ** - 11 *
(+)
0,175 ± 0,008 0,183 ± 0,010 0,207 ± 0,008 0,233 ± 0,020
+ 18 * ns
componente
dep. cálcio
0,049 ± 0,003
#
0,043 ± 0,011
#
0,135 ± 0,008
#
0,072 ± 0,007
#
+ 175 ** - 47 **
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e
** p
< 0,01 na comparação entre os grupos.
#
p< 0,05 em relação à manutenção do comprimento
de repouso.
Resultados
99
- Via Dependente de Ub-Proteassoma e Via Residual
Os valores da participação da via proteolítica dependente de Ub-
proteassoma em músculos EDL de ratos diabéticos e tratados com PTX
encontram-se na Figura 26 e Tabela 16. Após 3 dias da injeção de STZ,
ocorreu aumento de 97% na atividade da via dependente de Ub-proteassoma
neste músculo, sendo este resultado semelhante ao encontrado por Pepato et
al. (1996). O tratamento com PTX não levou a alterações na participação desta
via em EDL de animais normais, mas acarretou em queda de 23% na atividade
da via dependente de Ub-proteassoma neste mesmo músculo de ratos
diabéticos, quando comparada aos valores obtidos no grupo diabético controle.
Na Tabela 16 estão apresentados os valores médios da contribuição
da via residual nos grupos normal e diabético, tratados ou não com PTX, os
quais correspondem aos valores de tirosina liberada na presença de MG132
(inibidor do proteassoma). A administração de PTX não promoveu alterações
na participação da via residual em EDL dos animais nos diferentes grupos
estudados.
Está apresentado na Figura 27 um resumo da participação das 3
principais vias proteolíticas em músculo EDL de ratos normais e diabéticos
controles e tratados com PTX durante 4 dias.
Resultados
100
FIGURA 26: Efeito do de tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia,
i.p.) na
via dependente de Ub-proteassoma em músculos EDL de ratos normais e
diabéticos. Os resultados são expressos como médias
± EPM dos grupos
experimentais. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e
representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo
sido obtidos resultados semelhantes.
∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DPTX x D.
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
0.15
Via dependente de Ub-proteassoma
normal
normal + PTX (in vivo)
diabético
diabético + PTX (in vivo)
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
**
#
101
Resultados
TABELA 16: Participação da via proteolítica dependente de Ub-proteassoma e da via residual em
músculos EDL de ratos normais e diabéticos controles e tratados com pentoxifilina.
Adição Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
MG132
normal
salina
(NS)
normal
PTX
(NPTX)
diabético
salina
(DS)
diabético
PTX
(DPTX)
Diferença
(%)
EDL
DS x NS DPTX x DS
(-)
0,146 ± 0,008 0,160 ± 0,009 0,209 ± 0,011 0,178 ± 0,007
+ 43 * - 15 **
(+)
(via residual)
0,085 ± 0,004 0,084 ± 0,007 0,089 ± 0,009 0,085 ± 0,010
ns ns
componente dep.
Ub-proteassoma
0,061 ± 0,006
#
0,076 ± 0,008
#
0,120 ± 0,008
#
0,093 ± 0,011
#
+ 97 ** - 23 *
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e
** p
< 0,01 na comparação entre os grupos.
#
p< 0,05 em relação à ausência do inibidor da via.
Resultados
102
FIGURA 27: Vias proteolíticas lisossomal (A), dependente de cálcio (B) e dependente de Ub-
proteassoma (C) em músculos EDL de ratos normais e diabéticos tratados com pentoxifilina.
Os resultados são expressos como médias ± EPM dos grupos experimentais. Os valores foram
obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido
pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. ∗∗ p<0,01 D x N;
# p<0,05 DPTX x D; ## p<0,01 DPTX x D.
C
B
A
0.00
0.04
0.08
0.12
via dependente de Ub-proteassoma
(nmol Tyr/mg.2h)
**
#
0.04
0.08
0.12
0.16
via dependente de Ca
2+
(nmol Tyr/mg.2h)
**
##
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
via lisossomal
(nmol Tyr/mg.2h)
normal
normal + PTX (in vivo)
diabético
diabético + PTX (in vivo)
Resultados
103
4.2.4) Determinação do conteúdo das proteínas m-calpaína e calpastatina
Uma vez que foi observada uma redução na participação da via
proteolítica dependente de cálcio, em músculos EDL de ratos diabéticos
tratados com PTX, o presente trabalho passou a investigar as alterações que
estariam ocorrendo nos componentes deste sistema de degradação de
proteínas. Desta maneira, foi analisado o conteúdo protéico da m-calpaína,
protease do sistema, e da calpastatina, inibidor fisiológico endógeno desta
protease, sendo os resultados deste estudo apresentados nas Figuras 28A e
28B, respectivamente.
Foi observado um aumento de 115% no conteúdo protéico da m-
calpaína em músculos de animais diabéticos quando comparados aos
músculos de animais do grupo controle (Figura 28A). Já o conteúdo protéico da
calpastatina apresentou-se reduzido (31%) nos músculos após 3 dias de
instalação do diabetes (Figura 28B), em relação aos animais normais.
O tratamento com PTX promoveu uma redução de 70% nos níveis
protéicos da m-calpaína em músculos de ratos diabéticos, mas nenhuma
alteração foi observada neste mesmo parâmetro no grupo normal (Figura 28A);
o menor conteúdo de calpastatina presente em músculos de animais diabéticos
não foi afetado pelo tratamento com PTX (Figura 28B).
104
Resultados
FIGURA 28: Níveis protéicos de m-calpaína (A) e calpastatina (B) em músculos EDL de animais normais e diabéticos
tratados ou não com PTX. Os resultados são expressos como médias percentuais em relação ao grupo normal. Os
valores foram obtidos de 5 a 7 pares de músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido
pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. ∗ p<0,05 D x N; # p<0,05 DPTX x D.
0
50
100
150
200
250
M-CALPAÍNA
A
#
*
níveis protéicos
(% do grupo normal)
0
25
50
75
100
125
CALPASTATINA
B
*
*
níveis protéicos
(% do grupo normal)
normal diabético
normal PTX diabético PTX
80KDa
120KDa
Resultados
105
4.2.5) Expressão do RNAm da atrogin-1
A
atrogin-1 é uma enzima E3 ligase pertencente ao sistema
proteolítico dependente de Ub-proteassoma e alterações na sua expressão
podem ser observadas após a instalação de situações que promovam atrofia
muscular. Tendo em vista a redução da atividade da via dependente de Ub-
proteassoma encontrada em músculos de animais diabéticos tratados com
PTX, foi verificado se a expressão do RNAm da
atrogin-1 também estava
alterada nestas condições.
A Figura 29 apresenta os resultados da expressão do RNAm da
atrogin-
1
em músculos de animais normais e diabéticos tratados ou não com PTX,
tanto pela utilização de PCR semi-quantitativa quanto por PCR quantitativa.
Como pode ser observado, a instalação do diabetes promoveu uma elevação
significativa na expressão do RNAm da
atrogin-1 em EDL de rato. Quando
animais normais foram tratados com PTX, não foram encontradas alterações
na expressão da
atrogin-1 em comparação ao grupo normal controle (Figura
29). A PCR semi-quantitativa detectou uma queda de 27% na expressão da
atrogin-1 em músculos de animais diabéticos tratados com PTX em
comparação ao grupo diabético não tratado. Com a utilização da metodologia
de PCR quantitativa, esta diferença apresentou-se mais significativa, sendo
observada uma diminuição de 65% na expressão do RNAm da
atrogin-1 em
músculos de animais diabéticos tratados com a droga.
106
Resultados
FIGURA 29: Expressão do RNAm da atrogin-1 em músculos EDL de animais normais e diabéticos tratados ou não com PTX.
Determinação realizada através de PCR semi-quantitativa (A) e PCR quantitativa (B). Os valores foram obtidos de 5 a 7 pares
de músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos
resultados semelhantes. ** p<0,01 D x N; # p<0,05 DPTX x D.
0
20
40
60
80
100
120
#
##
**
RNAm da atrogin-1
(% do grupo diabético)
normal
normal + PTX
diabético
diabético + PTX
atrogin-1
β-actina
0
20
40
60
80
100
120
140
160
#
##
**
RNAm da atrogin-1
(atrogin-1/ciclofB)
normal
normal + PTX
diabético
diabético + PTX
A
B
Resultados
107
4.2.6) Níveis plasmáticos de TNF-α
Na Figura 30 encontram-se os valores dos níveis plasmáticos de TNF-
α
de animais normais e diabéticos tratados ou não com PTX
in vivo. Como pode
ser observado, ocorreu um aumento significativo (63%) nas concentrações
plasmáticas de TNF-
α em animais diabéticos quando comparados aos animais
normais. O tratamento com PTX promoveu uma queda de 68% nos níveis de
TNF-
α no plasma de animais diabéticos, no entanto, não provocou alterações
nas concentrações plasmáticas desta citocina no grupo normal.
4.2.7) Efeito de uma única injeção de pentoxifilina na degradação de
proteínas em músculo esquelético de ratos diabéticos
Sabendo-se que o tratamento de animais diabéticos com PTX durante
4 dias acarretou em redução nos valores de proteólise total em músculos EDL,
um próximo passo do presente trabalho foi investigar a possibilidade da PTX
exercer seus efeitos em uma situação mais aguda.
Para isso, os animais foram divididos em dois grupos: normais e
diabéticos (3 dias pós-STZ). Na véspera da data onde os animais completariam
3 dias de diabetes, ratos de ambos os grupos receberam injeção única de PTX
(100 mg/kg,
i.p.). Quatorze horas após esta única administração de PTX os
músculos EDL de animais normais e diabéticos tratados e não-tratados foram
removidos para a avaliação das concentrações intracelulares de AMPc (Figura
31) e para o estudo dos valores de proteólise total (Figura 32).
A Figura 31 apresenta os resultados do conteúdo de AMPc em
músculos de animais normais e diabéticos após a administração de uma única
injeção de PTX. O tratamento agudo com PTX reproduziu o mesmo perfil de
resposta encontrado com o tratamento crônico, isto é, as concentrações de
AMPc são semelhantes em músculos de animais normais e diabéticos e o
tratamento com PTX foi capaz de promover um aumento de 17% nos níveis
deste nucleotídeo cíclico apenas em músculos de animais pertencentes ao
grupo diabético.
Posteriormente, foram avaliados os valores de proteólise total nos
músculos nesta mesma condição. Como pode ser observado na Figura 32,
Resultados
108
uma única administração de PTX já foi capaz de promover uma redução (15%)
nos valores de proteólise total em EDL de ratos diabéticos. Da mesma maneira
que observado com o tratamento durante 4 dias, animais normais que
receberam uma única injeção de PTX não demonstraram alterações na
degradação de proteínas em músculos EDL.
Resultados
109
FIGURA 30: Efeito do tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia,
i.p.) nos
níveis plasmáticos de TNF-
α de ratos normais e diabéticos. Os resultados
são expressos como médias
± EPM dos grupos experimentais. Os valores
foram obtidos de 7 a 9 animais por grupo e representam um experimento típico,
que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados
semelhantes.
∗ p<0,05 D x N; ## p<0,01 DPTX x D.
0
20
40
60
80
##
*
TNF-α
(pg/mL de plasma)
normal
normal + PTX (in vivo)
diabético
diabético + PTX (in vivo)
Resultados
110
FIGURA 31: Efeito do tratamento agudo (14 horas antes do experimento) com
pentoxifilina (100 mg/kg,
i.p.) nas concentrações intracelulares de AMPc em
músculos EDL de ratos normais e diabéticos, 3 dias após a administração de
STZ. Os resultados são expressos como médias
± EPM dos grupos
experimentais. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e
representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo
sido obtidos resultados semelhantes. # p<0,05 DPTX x D.
0
300
400
500
600
700
#
conteúdo de AMPc
(fmol/mg músculo)
normal
normal + PTX (in vivo)
diabético
diabético + PTX (in vivo)
Resultados
111
FIGURA 32: Efeito do tratamento agudo (14 horas antes do experimento) com
pentoxifilina (100 mg/kg,
i.p.) na proteólise total em músculos EDL de ratos
normais e diabéticos, 3 dias após a administração de STZ. Os resultados são
expressos como médias
± EPM dos grupos experimentais. Os valores foram
obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento típico, que
foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.
∗∗
p<0,01 D x N; # p<0,05 DPTX x D.
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
**
#
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
Proteólise total
normal
normal + PTX (in vivo)
diabético
diabético + PTX (in vivo)
Resultados
112
4.3) Estudo das ações in vitro da pentoxifilina em músculo esquelético de
ratos normais e diabéticos
Uma vez que a PTX administrada
in vivo promoveu alterações
significativas no metabolismo de proteínas na musculatura esquelética de ratos
diabéticos, foi investigado um possível efeito direto da droga em músculos EDL
de ratos normais e diabéticos, 3 dias pós-STZ. Para isso, os músculos foram
incubados na ausência e na presença de 10mM de PTX. Foi avaliado o efeito
da PTX
in vitro no conteúdo intracelular de AMPc, na proteólise total de
músculos EDL de ratos normais e diabéticos, assim como nas atividades das
vias proteolíticas lisossomal, dependente de cálcio, dependente de Ub-
proteassoma e residual nestes mesmos músculos incubados
in vitro com a
droga.
4.3.1) Níveis intracelulares de AMPc
Na Figura 33 podem ser observados os resultados das concentrações
de AMPc em EDL de ratos normais e diabéticos incubados na presença ou não
de PTX. Não foram observadas diferenças nas concentrações intracelulares de
AMPc entre músculos de animais normais e diabéticos controles. No entanto,
diferente dos resultados observados com o tratamento
in vivo com PTX, a
adição da droga no meio de incubação foi capaz de promover aumento nos
níveis intracelulares de AMPc tanto em músculos de animais normais (22%)
quanto em músculos de animais diabéticos (51%), em comparação aos
músculos incubados na ausência da droga.
Resultados
113
FIGURA 33: Efeito da pentoxifilina
in vitro (10mM) nas concentrações
intracelulares de AMPc em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os
resultados são expressos como médias
± EPM. Os valores foram obtidos de 7
a 9 músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido
pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes. # p<0,05
NPTX x N ou DPTX x D.
0
400
600
800
1000
#
#
conteúdo de AMPc
(fmol/mg músculo)
normal
normal + PTX (in vitro)
diabético
diabético + PTX (in vitro)
Resultados
114
4.3.2) Proteólise total
Os resultados do efeito da PTX
in vitro na proteólise total em EDL de
ratos normais e diabéticos são mostrados na Figura 34 e Tabela 17 (valores
médios obtidos na ausência de inibidores da via lisossomal, BCAA e
metilamina). Como esperado, o diabetes promoveu um aumento (44%) na
degradação total de proteínas em músculos EDL. A incubação destes
músculos na presença de PTX promoveu uma resposta diferente em relação
ao tratamento
in vivo com a droga; além de ser observada uma significativa
redução de aproximadamente 17% nos valores de proteólise total em EDL de
animais diabéticos incubados com PTX
in vitro, a adição da droga ao meio de
incubação também levou à diminuição na degradação total de proteínas em
músculos de animais normais (25%).
4.3.3) Participação das vias proteolíticas
Após a observação da redução nos valores de proteólise total em EDL
de animais normais e diabéticos incubados na presença de PTX, o próximo
passo deste trabalho foi analisar o(s) sistema(s) proteolítico(s) afetado(s)
nestas condições. Músculos EDL de animais normais ou após 3 dias de
diabetes foram incubados
in vitro com PTX e posteriormente investigadas as
participações das vias proteolíticas lisossomal, dependente de cálcio,
dependente de Ub-proteassoma e residual.
- Via Lisossomal
Os valores médios da participação do sistema proteolítico lisossomal
em EDL de animais normais e diabéticos incubados ou não com PTX
in vitro
encontram-se na Figura 35 e na Tabela 17. De acordo com resultados obtidos
anteriormente em nosso laboratório (Pepato et al., 1996), não são observadas
alterações significativas na participação da via lisossomal em EDL de animais
após 3 dias de diabetes, em comparação aos animais normais. Da mesma
Resultados
115
FIGURA 34: Efeito da pentoxifilina
in vitro (10mM) na proteólise total em
músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os resultados são expressos
como médias
± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e
representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo
sido obtidos resultados semelhantes.
∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DPTX x D ou
NPTX x N.
0,00
0,16
0,24
0,32
0,40
0,48
0,56
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
#
**
#
Proteólise total
normal
normal + PTX (in vitro)
diabético
diabético + PTX (in vitro)
Resultados
116
FIGURA 35: Efeito da pentoxifilina
in vitro (10mM) na via lisossomal em
músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os resultados são expressos
como médias
± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e
representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo
sido obtidos resultados semelhantes.
0,00
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
Via lisossomal
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
normal
normal + PTX (in vitro)
diabético
diabético + PTX (in vitro)
117
Resultados
TABELA 17: Proteólise total e participação da via proteolítica lisossomal em músculos EDL de ratos
normais e diabéticos incubados na ausência ou na presença de pentoxifilina (10mM).
Adição Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
BCAA e
metilamina
normal
controle
(N)
normal
PTX
in vitro
diabético
controle
(D)
diabético
PTX
in vitro
Diferença
(%)
EDL
NPTX in vitro
x
N
DPTX in vitro
x
D
(-)
0,312 ± 0,010 0,234 ± 0,010 0,448 ± 0,021 0,374 ± 0,025
- 25 ** - 17 *
(+)
0,238 ± 0,011 0,170 ± 0,010 0,364 ± 0,016 0,295 ± 0,014
- 28 ** - 19 **
componente
lisossomal
0,074 ± 0,010
#
0,064 ± 0,004
#
0,085 ± 0,010
#
0,079 ± 0,012
#
ns ns
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e
** p
< 0,01 na comparação entre os grupos.
#
p< 0,05 em relação à ausência dos inibidores da via.
Resultados
118
maneira, a adição de 10mM de PTX ao meio de incubação não acarretou em
modificações na participação desta via em músculos desses mesmos animais.
- Via Dependente de Cálcio
Na Figura 36 encontram-se os valores referentes à contribuição do
sistema proteolítico dependente de cálcio em músculos de ratos normais e
diabéticos incubados na presença de PTX. A participação deste processo
proteolítico encontra-se elevada (cerca de 14%) em EDL de ratos diabéticos
quando comparado aos animais normais. A adição de PTX ao meio de
incubação promoveu em redução na atividade desta via em músculos tanto de
animais normais (11%) quanto de animais diabéticos (14%), em comparação
aos músculos incubados na ausência da droga.
- Via Dependente de Ub-Proteassoma e Via Residual
Os valores da participação da via proteolítica dependente de Ub-
proteassoma em músculos EDL de ratos normais e diabéticos incubados na
presença de PTX encontram-se na Figura 37 e Tabela 18. Houve um aumento
de cerca de 25% na participação do sistema proteolítico dependente de Ub-
proteassoma em músculos de ratos diabéticos, dado este semelhante ao
encontrado por Pepato et al. (1996). Quando músculos de ratos normais e
diabéticos foram incubados na presença de PTX, ocorreu uma diminuição
significativa na participação da via proteolítica dependente de Ub-proteassoma,
em ambos os músculos (13% e 20% em EDL de ratos normais e diabéticos,
respectivamente).
Os valores médios da participação da via proteolítica residual em
músculos desses mesmos animais estão apresentados na Tabela 18, e
correspondem aos valores de tirosina liberada na presença de inibidores dos
sistemas proteolíticos lisossomal, dependente de cálcio e de MG132 (inibidor
do proteassoma). Não ocorreram alterações na contribuição da via residual em
qualquer das situações estudadas.
Resultados
119
FIGURA 36: Efeito da pentoxifilina in vitro (10mM) na via dependente de
cálcio em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os experimentos
foram realizados na presença de inibidores da via lisossomal (metilamina e
BCAA) e da via dependente de Ub-proteassoma (MG132). Os resultados são
expressos como médias
± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos
por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2
vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.
∗ p<0,05 D x N; # p<0,05
DPTX x D ou NPTX x N.
0,00
0,09
0,12
0,15
0,18
Via dependente de cálcio
#
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
normal
normal + PTX (in vitro)
diabético
diabético + PTX (in vitro)
*
#
Resultados
120
FIGURA 37: Efeito da pentoxifilina
in vitro (10mM) na via dependente de Ub-
proteassoma em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os resultados
são expressos como médias
± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9
músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo
menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.
∗∗ p<0,01 D x N; #
p<0,05 DPTX x D ou NPTX x N.
0.00
0.15
0.18
0.21
0.24
0.27
Via dependente de Ub-proteassoma
#
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
normal
normal + PTX (in vitro)
diabético
diabético + PTX (in vitro)
**
#
121
Resultados
TABELA 18: Participação da via proteolítica dependente de Ub-proteassoma e da via residual em músculos EDL
de ratos normais e diabéticos incubados na ausência ou na presença de pentoxifilina (10mM).
Adição Tirosina liberada (nmol/mg.2h)
MG132
normal
controle
(N)
normal
PTX
in vitro
diabético
controle
(D)
diabético
PTX
in vitro
Diferença
(%)
EDL
NPTX in vitro
x
N
DPTX in vitro
x
D
(-)
0,280 ± 0,011 0,241 ± 0,009 0,330 ± 0,013 0,278 ± 0,019
- 14 * - 16 *
(+)
(via residual)
0,090 ± 0,008 0,079 ± 0,009 0,092 ± 0,012 0,088 ± 0,011
ns ns
componente dep.
Ub-proteassoma
0,188 ± 0,005
#
0,163 ± 0,005
#
0,234 ± 0,013
#
0,188 ± 0,014
#
- 13 ** - 20 *
Os valores representam a média ± EPM de 7 a 9 músculos. ns: não significativo; * p< 0,05 e
** p
< 0,01 na comparação entre os grupos.
#
p< 0,05 em relação à ausência do inibidor da via.
Resultados
122
FIGURA 38: Vias proteolíticas lisossomal (A), dependente de cálcio (B) e dependente de Ub-
proteassoma (C) em músculos EDL de ratos normais e diabéticos na presença de pentoxifilina in vitro
(10 mM). Os resultados são expressos como médias ± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos
por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos
resultados semelhantes. ∗ p<0,05 D x N; ∗∗ p<0,01 D x N; # p<0,05 DPTX x D ou NPTX x N.
C
B
A
0.00
0.16
0.20
0.24
#
via dependente de Ub-proteassoma
(nmol Tyr/mg.2h)
**
#
0.09
0.12
0.15
#
via dependente de Ca
2+
(nmol Tyr/mg.2h)
*
#
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
via lisossomal
(nmol Tyr/mg.2h)
normal
normal + PTX (in vitro)
diabético
diabético + PTX (in vitro)
Resultados
123
A Figura 38 apresenta um resumo da participação dos 3 sistemas de
degradação de proteínas em músculo EDL de ratos normais e diabéticos
controles e incubados na presença de 10mM de PTX.
4.3.4) Efeito da insulina in vitro na ação anti-proteolítica da pentoxifilina
em músculo esquelético de ratos normais e diabéticos
Os resultados do presente trabalho indicam que o tratamento
in vivo
com PTX promove diminuição na degradação de proteínas na musculatura
esquelética de animais diabéticos, e esta ação anti-proteolítica da droga é
exercida através da redução na atividade das vias proteolíticas dependentes de
Ca
2+
e de Ub-proteassoma. A ausência do efeito da PTX em músculos de
animais normais tratados em comparação aos diabéticos levantou a
possibilidade de uma possível ação da insulina existente nos animais normais.
Provavelmente os efeitos da insulina, ativando a fosfodiesterase do AMPc e
promovendo redução nos níveis deste nucleotídeo cíclico, poderiam estar
prevalecendo em relação aos efeitos da PTX na musculatura esquelética de
ratos normais. Esta hipótese pareceu ainda mais provável após a observação
da ação anti-proteolítica da PTX em EDL de animais normais incubados na
presença da droga
in vitro, isto é, em uma situação onde a insulina não está
presente.
Para confirmar esta hipótese, foram realizados experimentos de
avaliação da liberação de tirosina em músculos EDL de ratos normais e
diabéticos incubados na presença de 10mM de PTX, na ausência ou na
presença de insulina
in vitro (Figuras 39 e 40). Uma vez que a insulina
adicionada ao meio de incubação é capaz de promover uma redução na
participação do sistema proteolítico lisossomal, estes experimentos foram
realizados em uma condição de inibição prévia desta via, onde foram
adicionados metilamina e BCAA. Assim, o efeito anti-proteolítico observado
nestes experimentos são atribuídos somente à ação da PTX
in vitro.
Resultados
124
A Figura 39 apresenta os valores de tirosina liberada de músculos de
animais normais incubados na presença de PTX e de insulina. Como pode ser
observado, a adição de metilamina e BCAA ao meio de incubação promoveu
diminuição (cerca de 21%) nos valores de tirosina liberada, correspondendo
esta diferença à participação do sistema proteolítico lisossomal. A incubação
destes músculos na presença de PTX levou a uma inibição adicional (14%) na
liberação de tirosina em comparação aos músculos incubados somente na
presença dos inibidores da via lisossomal, comprovando que realmente esta
droga não exerce sua ação anti-proteolitica via inibição da atividade do sistema
lisossomal. No entanto, quando a insulina foi adicionada ao meio de incubação,
ocorreu praticamente um bloqueio da ação anti-proteolítica da PTX, sendo os
valores de tirosina liberada para o meio de incubação semelhantes àqueles
observados quando os músculos foram incubados na ausência da PTX.
Os valores de tirosina liberada pelos músculos EDL de animais
diabéticos incubados na presença de PTX e insulina encontram-se na Figura
40. A participação do sistema proteolítico lisossomal pôde ser observada
quando os músculos foram incubados na presença de metilamina e BCAA,
ocorrendo uma queda de 16% na liberação de tirosina destes músculos em
comparação aos valores obtidos com músculos incubados na ausência dos
inibidores. Foi observada inibição adicional da liberação de tirosina quando
músculos de animais diabéticos foram incubados na presença de PTX, sendo
estes valores cerca de 19% menores em relação aos músculos incubados na
presença somente dos inibidores da via lisossomal. Diferentemente dos
resultados obtidos com o grupo de ratos normais, a adição de insulina ao meio
de incubação de EDL de animais diabéticos não foi capaz de promover
alterações na ação anti-proteolítica da PTX, sendo os valores de tirosina
liberada semelhantes aos músculos incubados na presença da droga e
ausência do hormônio.
Resultados
125
FIGURA 39: Efeito da pentoxifilina e da insulina
in vitro na proteólise basal em
músculos EDL de ratos normais. Os resultados são expressos como médias
±
EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um
experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos
resultados semelhantes.
∗∗ p<0,01 proteólise total x metilamina + BCAA; #
p<0,05 na presença de PTX;
φ p< 0,05 na presença de insulina.
0,00
0,16
0,20
0,24
0,28
0,32
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
φ
#
**
proteólise total
metilamina + BCAA
metilamina + BCAA + PTX
metilamina + BCAA + PTX + insulina
EDL - ratos normais
Resultados
126
FIGURA 40: Efeito da pentoxifilina e da insulina
in vitro na proteólise basal em
músculos EDL de ratos diabéticos. Os resultados são expressos como médias
± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam
um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos
resultados semelhantes.
∗∗ p<0,01 proteólise total x metilamina + BCAA; #
p<0,05 e ## p<0,01 na presença de PTX.
0,00
0,24
0,30
0,36
0,42
0,48
#
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
##
**
proteólise total
metilamina + BCAA
metilamina + BCAA + PTX
metilamina + BCAA + PTX + insulina
EDL - ratos diabéticos
Resultados
127
4.3.5) Efeito do H89 in vitro na ação anti-proteolítica da pentoxifilina em
músculo esquelético de ratos normais e diabéticos
Na tentativa de elucidar o mecanismo intracelular da ação anti-
proteolítica da PTX, o presente trabalho investigou o possível envolvimento da
proteína quinase A (PKA) na ação intracelular da droga, uma vez que a PTX
promoveu alterações nos níveis intracelulares de AMPc. Para isso, foram
realizados experimentos de incubação de músculos de animais normais e
diabéticos na presença de PTX e na ausência ou presença de H89, inibidor
específico da atividade da PKA.
Sabendo-se que as catecolaminas ativam a PKA em diversos tecidos, e
que estas aminas exercem ação anti-proteolítica na musculatura esquelética,
foram realizados experimentos para verificar se o H89, inibidor da PKA,
promovia alteração no efeito inibitório da adrenalina na proteólise em EDL de
ratos normais.
A Figura 41 mostra que a adição de adrenalina ao meio de incubação
reduziu em cerca de 20% os valores de liberação de tirosina em EDL, resultado
este similar ao obtido em trabalhos anteriores do laboratório (Navegantes et al.,
2000). Músculos de animais normais incubados na presença de H89 não
apresentam alteração na liberação de tirosina em comparação aos músculos
incubados na ausência do inibidor. No entanto, a adição de H89 foi capaz de
bloquear completamente a ação anti-proteolítica da adrenalina: os valores de
tirosina de músculos EDL incubados na presença de adrenalina e H89 foram
semelhantes àqueles obtidos com músculos incubados na ausência de ambos.
Tendo sido confirmado o envolvimento da PKA no efeito anti-proteolítico
da adrenalina, o passo seguinte foi verificar o envolvimento desta enzima no
efeito inibitório da proteólise exercido pela PTX. Como pode ser observado na
Figura 42, PTX
in vitro foi capaz de promover uma redução de 14% nos valores
de proteólise total em músculos de animais normais. A incubação dos
músculos na presença somente de H89 não promoveu diferenças na liberação
de tirosina em comparação aos mesmos incubados na ausência da droga.
Entretanto, a adição do inibidor de PKA (H89) ao meio de incubação promoveu
um bloqueio total da ação anti-proteolítica da PTX; a proteólise total em
Resultados
128
músculos de animais normais incubados na presença de PTX e H89 foram
semelhantes aos valores obtidos em músculos incubados na ausência das
drogas.
A Figura 43 mostra que a PTX
in vitro foi capaz de reduzir em 23% os
valores de tirosina liberada pelos músculos de ratos diabéticos em comparação
aos mesmos incubados na ausência da droga. Tal como observado nos
experimentos prévios, a adição de H89 ao meio de incubação não acarretou
em diferenças nos valores de proteólise total nestes músculos. Porém, a
redução da proteólise provocada pela PTX foi bloqueada quando H89 foi
adicionado no meio.
Resultados
129
FIGURA 41: Efeito do H89 (50µM) na ação anti-proteolítica in vitro da
adrenalina (10
-5
M) em músculos EDL de ratos normais. Os resultados são
expressos como médias
± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos
por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2
vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.
φφ p<0,01 presença de ADR
x N;
ψψ p<0,01 presença de H89 x ausência de H89.
0,00
0,20
0,25
0,30
0,35
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
ψψ
φφ
normal
normal + H89
normal + ADR
normal + ADR + H89
Resultados
130
FIGURA 42: Efeito do H89 (50
µM) na ação anti-proteolítica in vitro da
pentoxifilina (10mM) em músculos EDL de ratos normais. Os resultados são
expressos como médias
± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos
por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2
vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.
φ p<0,05 presença de PTX x
N;
ψ p<0,05 presença de H89 x ausência de H89.
0,00
0,20
0,25
0,30
0,35
Proteólise total
ψ
φ
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
controle normal
+ H89
+ PTX
+ PTX + H89
Resultados
131
FIGURA 43: Efeito do H89 (50
µM) na ação anti-proteolítica in vitro da
pentoxifilina (10mM) em músculos EDL de ratos diabéticos. Os resultados são
expressos como médias
± EPM. Os valores foram obtidos de 7 a 9 músculos
por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo menos 2
vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.
φ p<0,05 presença de PTX x
N;
ψ p<0,05 presença de H89 x ausência de H89.
0,00
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
controle diabético
+ H89
+ PTX
+ PTX + H89
ψ
φ
tirosina liberada
(nmol Tyr/mg.2h)
Proteólise total
Resultados
132
4.4) Estudo das ações in vivo da pentoxifilina na síntese protéica em
músculo esquelético de ratos normais e diabéticos
Após a investigação dos efeitos in vivo e in vitro da PTX nos processos
de degradação de proteínas em músculos esqueléticos de animais normais e
diabéticos, foi estudado o papel da droga nos processos de síntese protéica em
músculos EDL de animais tratados com PTX.
Os valores da síntese protéica em músculos de animais normais e
diabéticos tratados com PTX estão apresentados na Figura 44. Tal como era
esperado, ocorreu uma queda significativa (cerca de 50%) na síntese protéica
em músculos de animais após 3 dias de instalação do diabetes. O tratamento
com PTX não foi capaz de promover alterações nos valores de síntese protéica
em músculos desses animais.
4.5) Estudo das ações in vivo e in situ da pentoxifilina em músculo
esquelético de ratos normais e diabéticos adultos
Com o objetivo de estudar as alterações promovidas pela PTX no
metabolismo de proteínas em músculo esquelético de animais normais e
diabéticos adultos, foi utilizada a metodologia de microdiálise muscular. Assim,
foram realizados experimentos na tentativa de elucidar o papel deste derivado
de xantina em duas situações distintas:
a) estudos in vivo, analisando animais
adultos normais e diabéticos (3 dias pós-ALX) tratados durante 4 dias com PTX
e
b) estudos in situ, investigando o metabolismo de proteínas em animais
adultos normais e diabéticos (3 dias pós-ALX) perfundidos com solução
contendo 10mM de PTX.
Resultados
133
FIGURA 44: Efeito do tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia,
i.p.) na
síntese protéica em músculos EDL de ratos normais e diabéticos. Os
resultados são expressos como médias
± EPM dos grupos experimentais. Os
valores foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um
experimento típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos
resultados semelhantes.
∗∗ p<0,01 D x N ou DPTX x N.
0.00
0.08
0.16
0.24
0.32
0.40
**
síntese protéica
(nmol Tyr/mg.2h)
**
normal
normal + PTX (in vivo)
diabético
diabético + PTX (in vivo)
Resultados
134
Os resultados relacionados ao efeito in vivo da PTX estão apresentados
na Figura 45. O diabetes promoveu um aumento nas concentrações de tirosina
do interstício (I) (30%) e do plasma arterial (A) (33%). O índice I-A apresentou
uma elevação de 79% no grupo diabético em comparação ao grupo normal.
Não ocorreram alterações nos valores de tirosina intersticial e plasmática ou no
valor do índice I-A em animais normais tratados com PTX. No entanto, o
tratamento de ratos diabéticos durante 4 dias com PTX foi capaz de promover
uma queda de 20% nos valores de tirosina intersticial, quando comparados ao
grupo diabético não tratado; conseqüentemente, pode ser observada uma
redução de 54% nos valores da diferença I-A no grupo diabético tratado com a
droga em comparação ao mesmo grupo não tratado.
A Figura 46 apresenta os resultados obtidos em músculos de animais
normais e diabéticos perfundidos com solução contendo 10mM de PTX. Tal
como observado no resultado anterior (Figura 45), ocorreu um aumento nos
valores de tirosina intersticial e plasmática no grupo diabético em relação ao
normal, e conseqüente elevação no índice I-A. PTX
in situ (na solução de
perfusão) não promoveu alterações nos valores de tirosina no interstício, no
plasma e no índice I-A em animais normais. No entanto, tal como nos
experimentos
in vivo, a PTX adicionada ao meio de perfusão foi capaz de
reduzir os valores de tirosina intersticial nos animais diabéticos (cerca de 17%);
assim, a PTX
in situ promoveu uma queda de 40% na diferença I-A no grupo
diabético em comparação ao grupo diabético controle.
Resultados
135
FIGURA 45: Efeito do tratamento com pentoxifilina (100 mg/kg.dia,
i.p.) na
concentração intersticial (I), arterial (A) e na diferença I-A de tirosina em
músculos tibialis anterior de ratos adultos normais e diabéticos. Os resultados
são expressos como médias
± EPM dos grupos experimentais. Os valores
foram obtidos de 7 a 9 músculos por grupo e representam um experimento
típico, que foi repetido pelo menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados
semelhantes.
∗ p<0,05 D x N; # p<0,05 DPTX x D.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
#
#
*
*
*
*
(I) (A)
interstício plasma I - A
tirosina
(nmol/mL)
normal
normal PTX (in vivo)
diabético
diabético PTX (in vivo)
Resultados
136
FIGURA 46: Efeito da pentoxifilina
in situ (10mM) na concentração intersticial
(I), arterial (A) e na diferença I-A de tirosina em músculos tibialis anterior
de ratos adultos normais e diabéticos. Os resultados são expressos como
médias
± EPM dos grupos experimentais. Os valores foram obtidos de 7 a 9
músculos por grupo e representam um experimento típico, que foi repetido pelo
menos 2 vezes, tendo sido obtidos resultados semelhantes.
∗ p<0,05 D x N; #
p<0,05 DPTX x D.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
#
#
*
*
*
*
(I) (A)
interstício plasma I - A
tirosina
(nmol/mL)
normal
normal PTX (in situ)
diabético
diabético PTX (in situ)
Resultados
137
Com estes resultados, pode-se comprovar que as respostas
encontradas em animais adultos após a instalação do diabetes e o tratamento
in vivo e in situ com PTX são semelhantes às respostas observadas em
animais jovens. Além disso, foi possível comprovar que a microdiálise muscular
é uma técnica adequada para o estudo do metabolismo de proteínas em
músculos de ratos adultos submetidos a diferentes situações fisiológicas ou
patológicas que promovam alterações na liberação de tirosina pelo tecido
muscular.
Discussão
Discussão
138
5) Discussão
A primeira parte deste trabalho teve como objetivo investigar as
alterações ocorridas na proteólise total e a participação das vias proteolíticas
em soleus e EDL de animais diabéticos submetidos à simpatectomia. Antes de
transcorrer sobre os principais achados relacionados ao metabolismo de
proteínas neste estudo, vale a pena ressaltar os interessantes resultados
obtidos em relação aos níveis de catecolaminas (neste caso, noradrenalina) em
ambos os músculos de animais diabéticos.
5.1) Concentração de noradrenalina muscular em animais submetidos ao
diabetes experimental
Podemos observar, tanto em soleus quanto em EDL, um aumento
significativo e progressivo no conteúdo de noradrenalina nos períodos de 1, 3 e
5 dias pós-STZ (ver Figuras 6 e 7 e Tabelas 2 e 3 para soleus e EDL,
respectivamente). Este acréscimo nas concentrações musculares de
noradrenalina poderia explicar algumas das respostas obtidas por Pepato et al.
(1996) no que se refere às quedas nas participações das vias proteolíticas,
especialmente na via dependente de cálcio em soleus após 3 e 5 dias de
diabetes. Esta sugestão baseia-se em trabalhos de nosso laboratório
(Navegantes et al., 1999 - 2002) que mostraram ter as catecolaminas um papel
anti-proteolítico inibindo a atividade proteolítica da via dependente de cálcio. No
entanto, esta elevação das catecolaminas nos músculos soleus e EDL de ratos
diabéticos não interfere na interpretação dos resultados obtidos no presente
trabalho, uma vez que a administração de guanetidina nestes animais reduziu
os níveis de adrenalina e noradrenalina (plasmáticas e musculares) na mesma
magnitude da redução promovida pela droga em animais normoinsulinêmicos
(Navegantes et al, 1999). Ou seja, as alterações encontradas no presente
trabalho não poderão ser explicadas pelas alterações do conteúdo e/ou dos
níveis de catecolaminas nos músculos e plasma de ratos diabéticos
simpatectomizados, pois foram exatamente iguais aos dos ratos normais
simpatectomizados.
Discussão
139
Alguns trabalhos na literatura relatam aumento de conteúdo tecidual
das catecolaminas em animais submetidos ao diabetes. Adeghate et al. (2001)
encontraram elevação nas concentrações de noradrenalina em pâncreas de
ratos após 4 semanas de diabetes estreptozotocínico, sem aumento
significativo nas concentrações plasmáticas de adrenalina ou noradrenalina,
resposta semelhante encontrada neste trabalho (em relação à ausência de
alteração nos níveis de catecolaminas no plasma de animais diabéticos).
Também existem relatos de aumento no conteúdo de noradrenalina em tecido
cardíaco de ratos diabéticos (Paulson et al., 1981; Fushimi et al., 1982;
Ganguly et al., 1987). Este aumento nas concentrações musculares das
catecolaminas de animais diabéticos pode ser explicado, dentre outros fatores,
pela queda na atividade da enzima monoamino oxidase (MAO), que promove a
metabolização das catecolaminas em seus produtos finais inativos (como o
ácido vanililmandélico) que são excretados pelas vias urinárias. Alguns
trabalhos demonstram ocorrer redução significativa na atividade da MAO em
pâncreas, plaquetas e outros tecidos de indivíduos diabéticos (Mosnaim et al.,
1979; Quasah et al., 1981; Adeghate et al., 2004).
As alterações ocorridas na atividade do sistema nervoso simpático em
músculos soleus e EDL de animais diabéticos foram estudadas através da
realização da medida da queda na concentração tecidual de noradrenalina após
administração de um inibidor de sua síntese, permitindo-se desta maneira a
determinação da velocidade de renovação de noradrenalina nos tecidos citados.
Nestes experimentos, uma vez que a velocidade de queda das concentrações
de noradrenalina encontra-se reduzida em músculos de animais diabéticos
quando comparados aos controles, podemos sugerir que esta redução seja
realmente conseqüência de queda na velocidade de metabolização
(degradação) da catecolamina, uma vez que a síntese estava inibida pela
administração de metil-tirosina. Como pode ser observado nas Figuras 8 e 9, os
valores de t
1/2
(isto é, o tempo gasto para que o conteúdo de noradrenalina atinja
metade do valor inicial) encontram-se aumentados em cerca de 50 a 60% em
músculos de animais diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ). Estes dados nos permitem
sugerir que nestes tecidos haja uma menor atividade simpática.
Discussão
140
5.2) Papel das catecolaminas no metabolismo de proteínas em músculos
esqueléticos de animais diabéticos
A seguir está apresentado um resumo dos principais achados
relacionados ao estudo do papel das catecolaminas na proteólise muscular de
ratos diabéticos:
- As catecolaminas parecem ter efeito na atividade das vias
proteolíticas de músculo esquelético de ratos nas fases iniciais do diabetes (1 e
3 dias após a administração de STZ);
- Em períodos mais prolongados de deficiência insulínica, a presença
ou ausência das catecolaminas parece não interferir com as respostas
observadas na proteólise muscular;
- O efeito das catecolaminas na atividade das vias proteolíticas de
músculo de ratos diabéticos depende do tipo de músculo, ou seja, se
predominam fibras do tipo I ou do tipo II.
a) Proteólise total e vias proteolíticas em músculos de animais diabéticos
simpatectomizados - 1 dia de diabetes
Para facilitar a compreensão, vamos resumir primeiramente os
resultados obtidos em músculos soleus (rico em fibras oxidativas do tipo I) e
EDL (rico em fibras glicolíticas do tipo II) de ratos com 1 dia de diabetes e
simpatectomizados.
A ausência das catecolaminas musculares em animais com 1 dia de
diabetes foi capaz de promover um aumento ainda maior da proteólise total em
músculos soleus (a qual já era alta em ratos diabéticos em relação aos
controles - ver Figura 10). Este aumento adicional da proteólise total em soleus
de ratos diabéticos simpatectomizados foi decorrente da elevação na atividade
de dois sistemas proteolíticos, o lisossomal e o dependente de Ub-
proteassoma. Inicialmente será feita uma descrição do surpreendente aumento
na atividade da via proteolítica lisossomal após 1 e 3 dias de diabetes.
Discussão
141
A atividade do sistema proteolítico lisossomal na musculatura
esquelética não sofre qualquer alteração quando o diabetes ou a
simpatectomia são estudados isoladamente (Pepato et al., 1996; Navegantes
et al., 1999). Como foi observado no presente trabalho, nas fases agudas de
diabetes (1 e 3 dias após STZ), a simpatectomia promoveu uma ativação de
48% e 96%, respectivamente, do sistema proteolítico lisossomal. Este
resultado inesperado indica que as catecolaminas e a insulina exercem ações
comuns na regulação do metabolismo de proteínas, podendo um hormônio
compensar o efeito anti-proteolítico do outro em um quadro de deficiência
hormonal aguda de um deles.
Existem poucos trabalhos na literatura demonstrando o envolvimento do
sistema proteolítico lisossomal no desenvolvimento da perda de massa
muscular esquelética. Na maioria das vezes estes trabalhos demonstram que,
quando existe uma situação de perda de proteínas pelo tecido muscular com
ativação do sistema proteolítico lisossomal, o aumento na participação deste
processo degradativo não ocorre isoladamente. Normalmente, a elevação na
velocidade da via proteolítica lisossomal na musculatura esquelética acontece
concomitantemente ao aumento na participação de outros sistemas
proteolíticos, principalmente os dependentes de cálcio e de Ub-proteassoma.
No presente trabalho, foi observado um aumento concomitante na
atividade dos sistemas proteolíticos lisossomal e dependente de Ub-
proteassoma em soleus de animais diabéticos simpatectomizados. A ativação
conjunta de diferentes vias de degradação de proteínas na musculatura
esquelética permite que ocorra, inicialmente, a degradação específica de
proteínas contráteis ou proteínas de citoesqueleto, passo qualitativamente
importante para a proteólise subseqüente de componentes como actina e
miosina. Sabe-se que as catepsinas (proteases lisossomais) estão envolvidas
na degradação de proteínas endocitadas, e que as calpaínas são responsáveis
pela degradação de proteínas do citoesqueleto e pela proteólise limitada de
algumas proteínas específicas; portanto, as vias lisossomal e dependente de
cálcio não são responsáveis pela degradação completa de proteínas
miofibrilares, e a contribuição individual destes sistemas proteolíticos para o
Discussão
142
desenvolvimento de atrofia muscular não é significativa. Assim, um aumento na
participação destes dois processos pode ter um papel permissivo para a
degradação de proteínas miofibrilares pelo processo dependente de Ub-
proteassoma, principal sistema responsável pelo aparecimento de atrofia
muscular em situações catabólicas.
Trabalho de Taillandier et al. (1996) também demonstrou uma ativação
coordenada dos sistemas proteolíticos lisossomal, dependente de cálcio e
dependente de Ub-proteassoma em soleus de ratos submetidos à atrofia
muscular pelo modelo de suspensão das patas inferiores durante 9 dias. A
incubação de músculos soleus destes animais mostrou um aumento importante
na velocidade dos sistemas degradativos lisossomal e dependente de cálcio,
além de elevação na atividade proteolítica e na expressão do RNAm das
catepsinas B e L e da m-calpaína. Ao mesmo tempo, foi encontrado nestes
músculos uma elevação na expressão do RNAm da ubiquitina, E2 14KDa e
subunidades do proteassoma, componentes do sistema proteolítico
dependente de Ub-proteassoma.
Similarmente, Mansoor et al. (1996) observaram aumento na
participação de vários processos de degradação de proteínas (inclusive o
processo lisossomal) em músculo esquelético de pacientes hospitalizados por
traumatismo craniano. Estes pacientes apresentam um balanço nitrogenado
negativo, elevação na velocidade de degradação corporal de proteínas e
contínuo aumento na excreção urinária de 3-metil-histidina (um indicador da
degradação de proteínas miofibrilares). O estudo de diferentes proteases em
músculo vastus lateralis destes pacientes demonstrou um aumento no
conteúdo de RNAm de m-calpaína, ubiquitina, E2 14KDa, subunidades do
proteassoma e da catepsina D. De acordo com esse trabalho, uma ativação
coordenada dos diferentes sistemas proteolíticos seria importante para a
eliminação de diferentes classes de proteínas celulares (Furuno et al., 1990).
Estudo realizado por Jagoe et al. (2002) é exemplo de um dos poucos
relatos na literatura demonstrando elevação isolada na expressão do RNAm de
uma protease do sistema lisossomal em músculo esquelético, sem ativação de
componentes de outros sistemas proteolíticos. Neste trabalho, foi encontrado
Discussão
143
aumento nos níveis de RNAm de catepsina B em músculos latissimus dorsi de
pacientes com câncer pulmonar, sem qualquer alteração na expressão de
componentes do sistema dependente de Ub-proteassoma. No entanto, os
autores não descartam a possibilidade de serem encontradas alterações em
componentes de outros sistemas proteolíticos nas fases mais tardias do
câncer, e supõem que o aumento na expressão da catepsina B esteja
ocorrendo em um estágio inicial da doença, sendo assim importante para o
início do aparecimento da atrofia muscular nesta condição. O trabalho ainda
sugere que estas mudanças no perfil de expressão das proteases sejam
amplificadas, com conseqüente ativação do sistema dependente de Ub-
proteassoma na musculatura esquelética de pacientes em períodos mais
avançados do câncer.
Apesar de não encontrarmos em nosso laboratório alterações na
participação do sistema proteolítico lisossomal em músculos de animais
diabéticos (Pepato et al., 1996), recente trabalho de Skurk et al. (2005)
demonstrou que um importante intermediário da sinalização intracelular
desencadeada pela insulina, a proteína quinase B (PKB ou AKT) é capaz de
controlar a expressão gênica da catepsina L em cardiomiócitos. Neste trabalho
foram utilizados cardiomiócitos de camundongos transgênicos que expressam
uma forma constitutivamente ativa da AKT e camundongos que não expressam
a AKT (através de repressão gênica), sendo observado, respectivamente,
supressão e indução do gene da catepsina L nestes tecidos, ou seja, a AKT
teria um efeito inibitório na expressão gênica desta protease.
A catepsina L tem sido considerada, atualmente, a principal protease do
sistema lisossomal que é ativada em processos que culminam em atrofia
muscular, juntamente com o aumento na participação de outros processos
proteolíticos. Lecker et al. (2004), identificando o perfil transcricional obtido do
músculo gastrocnemius de ratos e camundongos em situações catabólicas
como jejum, diabetes, tumor e falência renal (uremia), encontraram um
aumento na expressão do RNAm de vários componentes envolvidos em
maquinaria de degradação de proteínas intracelulares, inclusive da catepsina L.
Discussão
144
Animais submetidos ao quadro de sepse também desenvolvem uma
significativa perda de massa muscular. A importância da catepsina L para o
desenvolvimento de atrofia nesta condição também tem sido identificada. Deval
et al. (2001) encontraram aumento na expressão do RNAm e nos níveis
protéicos da catepsina L no músculo gastrocnemius de ratos em diferentes
fases da sepse. Além da catepsina L, os autores encontraram também uma
elevação na expressão do RNAm de outras catepsinas (C, D e H) e de
componentes do sistema proteolítico dependente de Ub-proteassoma.
Recentemente, Fareed et al., 2006 demonstraram que a presença de
inibidor da catepsina L no meio de incubação de músculos EDL de ratos
sépticos foi capaz de reduzir o aumento na proteólise total destes músculos.
Porém, quando estes mesmos músculos foram incubados na presença de
inibidores da catepsina B, nenhuma diferença foi encontrada em relação aos
valores de proteólise total. Encontraram também nestes animais aumento na
atividade proteolítica da calpaína e na expressão do RNAm da atrogin-1,
demonstrando assim que o aumento na atividade da catepsina L, juntamente
com outros sistemas proteolíticos, contribuem para o desenvolvimento da
atrofia muscular em ratos sépticos.
Somente um único trabalho na literatura (Dwyer et al., 2004) havia
mostrado previamente que as catecolaminas seriam capazes de controlar a
atividade de uma protease do processo lisossomal. Em ratas tratadas durante
10 dias com guanetidina, ocorreu um aumento na expressão do RNAm da
catepsina K no ligamento colateral médio em comparação aos animais não
simpatectomizados. Neste tecido, a catepsina K está envolvida em processos
de remodelamento ósseo por promover a degradação do colágeno tipo I.
Não houve nenhuma alteração na atividade da via proteolítica
lisossomal em músculos EDL de animais diabéticos simpatectomizados.
Parece que a presença ou ausência de insulina e catecolaminas em músculo
com predominância de fibras glicolíticas (tipo II) não promove nenhuma
alteração na participação deste processo proteolítico.
Desta maneira, o presente trabalho demonstra, pela primeira vez, que o
sistema nervoso simpático é capaz de exercer agudamente um controle na
Discussão
145
atividade das proteases do sistema lisossomal na musculatura oxidativa de
animais. As catecolaminas parecem inibir a atividade deste processo
proteolítico em situações de deficiência insulínica.
As alterações observadas em músculos EDL de ratos com 1 dia de
diabetes indicam que a falta das catecolaminas promove uma elevação ainda
maior nos valores de proteólise total (ver Figura 11), que pode ser explicado
pelo aumento na atividade da via dependente de cálcio (a qual já estava alta
em EDL de ratos diabéticos controles). Esses achados parecem demonstrar
que em músculos EDL, na deficiência de insulina, as catecolaminas
apresentam um efeito inibidor da proteólise dependente de cálcio pois, quando
esses hormônios ficam ausentes, os valores de proteólise aumentam e ficam
ainda mais elevados que os verificados nos músculos de ratos só diabéticos.
A elevação nos valores de proteólise total em soleus e EDL de ratos
após 1 dia de diabetes e simpatectomizados é também conseqüência de um
surpreendente aumento na atividade da via dependente de Ub-proteassoma. A
ausência de ambos os hormônios promoveu estimulação deste processo
proteolítico. Vale a pena lembrar que a presença de pelo menos um destes
(insulina ou catecolaminas) é capaz que inibir a atividade da via dependente de
Ub-proteassoma, justificando a hipótese de que cada um desses hormônios
parece exercer o papel do outro em uma situação de ausência aguda de um
deles, promovendo assim inibição deste processo proteolítico. Apenas quando
os dois estão ausentes é que se observa elevação da proteólise dependente de
Ub-proteassoma. Este resultado, juntamente com as observações de aumento
na atividade do sistema proteolítico lisossomal em soleus (até então nunca
observado em animais somente diabéticos ou somente simpatectomizados) e
do sistema dependente de cálcio em EDL (1 dia de diabetes), nos leva a
concluir que exista um cross-talk positivo entre as cascatas de sinalização da
insulina e das catecolaminas na musculatura esquelética. Este cross-talk
parece ser importante na manutenção da inibição da atividade de diferentes
processos proteolíticos, uma vez que a ausência de um destes hormônios
anabólicos poderia levar a uma perda de massa muscular excessiva.
Discussão
146
Recentemente, alguns trabalhos na literatura já elucidaram os intermediários
da cascata de sinalização da insulina responsáveis pela inibição da proteólise
muscular. Além disso, já foi demonstrado que estes intermediários do sinal da
insulina também participam da sinalização desencadeada pelas catecolaminas,
especificamente aquela envolvida com a ativação dos receptores β
2
-
adrenérgicos e subseqüente aumento de AMPc intracelular. Uma vez que a
segunda parte deste trabalho demonstrou que a PTX parece exercer suas
ações anabólicas através de elevação nos níveis deste nucleotídeo, a
descrição detalhada deste possível cross-talk anabólico entre o sinal da
insulina e das catecolaminas será demonstrada na segunda parte desta
Discussão e elucidada na Figura 47.
b) Proteólise total e vias proteolíticas em músculos de animais diabéticos
simpatectomizados - 3 dias de diabetes
As principais alterações observadas em relação ao metabolismo de
proteínas em músculos de animais após 3 dias de diabetes e
simpatectomizados estão relacionadas ao aumento na atividade do processo
proteolítico lisossomal em soleus (já descrito com detalhes anteriormente) e
também à curiosa queda na participação do sistema proteolítico dependente de
cálcio, em ambos os músculos. Talvez seja esta a razão do aumento nos
valores de proteólise total em soleus de animais diabéticos simpatectomizados
não ter sido tão grande neste período de diabetes (ver Figuras 10 e 18), apesar
do considerável aumento na atividade da via lisossomal. Este também parece
ser o motivo da falta de alteração nos valores de proteólise total em EDL de
ratos com 3 dias de diabetes e simpatectomizados, apesar da alta atividade da
via dependente de Ub-proteassoma em EDL, neste período (ver Figuras 11 e
19).
Uma possível explicação para esta queda na participação da via
dependente de cálcio em músculos de animais diabéticos (3 dias pós-STZ) na
falta das catecolaminas reside na possibilidade de um mecanismo contra-
regulatório que a insulina promove em relação ao sinal adrenérgico. Existem
vários trabalhos na literatura que demonstram a clara interação entre esses
Discussão
147
dois hormônios (Hadcock et al., 1992; Karoor & Malbon, 1998a; Doronin et al.,
2002a; Gavi et al., 2006), mostrando que o receptor β-adrenérgico é um
substrato-alvo do receptor enzimático da insulina e que, quando fosforilado em
determinados resíduos de tirosina (Tyr
364
e especialmente Tyr
350
), ocorre a
internalização do adrenoceptor e perda do sinal adrenérgico (Baltensperger et
al. 1996; Karoor et al. 1998b). Assim, pode ser observado um desacoplamento
entre o receptor β
2
-adrenérgico e a proteína Gs, com subseqüente perda da
capacidade funcional de ativação da adenilato ciclase. Esta dessensibilização
do sinal adrenérgico ocorre porque as fosforilações dos resíduos de tirosina da
região C-ternimal do receptor β
2
-adrenérgico pelo receptor da insulina criam
sítios de interações com domínios SH2 de moléculas adaptadoras como Grb2,
dinamina e subunidade p85 da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3-quinase). A
interação destas proteínas e o recrutamento de microfilamentos para a
formação de F-actina compõem a maquinaria responsável pela internalização
do receptor β-adrenérgico. Além disso, a própria ativação da proteína AKT pela
ação da insulina também tem um efeito importante na fosforilação de resíduos
de serina (Ser
345
e Ser
346
) na região C-terminal do receptor adrenérgico, o que
parece favorecer a fosforilação dos resíduos de tirosina (Doronin et al., 2002b;
Shumai et al., 2003).
De acordo com estes trabalhos realizados por Malbon e colaboradores,
a internalização de receptores β
2
-adrenérgicos estimulada pela insulina pode
ser observada em diferentes tipos celulares, como células de musculatura lisa
DDT
1
MF-2, células de ovário de hamster CHO, adipócitos NIH3T3-L1 e células
de carcinoma humano A431. A característica comum entre estes tipos celulares
para o aparecimento do referido fenômeno reside na necessidade da
integridade do resíduo de Tyr
350
do receptor β
2
-adrenérgico e ativação das
proteínas PI3-quinase e AKT.
Desta maneira, este mecanismo de contra-regulação poderia estar
ocorrendo, fisiologicamente, nos tecidos frente a situações de necessidade de
refinado controle dos mecanismos intracelulares onde um hormônio poderia,
desta maneira, compensar a ausência ou o excesso de outro. Neste sentido,
em nosso modelo experimental, devido à ausência de insulina promovida pela
Discussão
148
instalação do diabetes por um tempo um pouco mais prolongado, o processo
de internalização dos receptores β
2
-adrenérgicos nos tecidos, inclusive na
musculatura esquelética, ficaria comprometido; assim, haveria uma maior
exposição dos adrenoceptores tanto em soleus como em EDL destes animais
diabéticos simpatectomizados. Esta maior exposição de receptores β-
adrenérgicos na superfície celular fica ainda mais pronunciada pelos
mecanismos de up-regulation em decorrência da queda do conteúdo de
noradrenalina no tecido muscular após a administração de guanetidina;
provavelmente este fenômeno não aparece em tempos imediatos à
simpatectomia, sendo necessários períodos um pouco mais prolongados para
que o número de receptores realmente se altere. Isto poderia levar a uma
maior responsividade destes receptores às catecolaminas plasmáticas ainda
presentes nestes animais, uma vez que a simpatectomia química promovida
pela guanetidina não leva à completa depleção nos níveis de adrenalina
circulantes (ver Figura 5), apesar da redução drástica nas concentrações
musculares. Assim, através deste possível mecanismo compensatório utilizado
em uma situação “emergencial”, as catecolaminas (neste caso a adrenalina)
desencadeariam processos de sinalização via estimulação de proteína G,
geração de AMPc e ativação da PKA – proteína quinase dependente de AMPc
ou da Epac – Exchange protein directy activated by cAMP (proteína trocadora
diretamente ativada por AMPc), que levariam à inibição da via dependente de
cálcio. Esta inibição poderia ser através de fosforilação direta das calpaínas,
sendo assim inibidas, ou por ação no inibidor calpastatina (por fosforilação ou
aumento na formação do RNAm) (Navegantes et al., 2002). Esta seqüência de
eventos poderia, então, justificar a inesperada queda na participação da via
dependente de cálcio observada tanto em soleus quanto em EDL de animais
simpatectomizados após 3 dias de diabetes.
Este mecanismo contra-regulatório que a insulina pode exercer na
sinalização das catecolaminas em músculos de animais em situações especiais
também pode ser corroborado pela ação de outros hormônios e metabólitos, na
tentativa de promover um ajuste metabólico para a preservação da massa
muscular e sobrevivência do animal. Possíveis candidatos para este papel
Discussão
149
seriam os hormônios tireoidianos (Kettelhut et al., 1988), assim como ácidos
graxos e corpos cetônicos (Fagan et al., 1987; Saudek & Felig, 1976), assunto
que mereceria ser melhor estudado.
c) Proteólise total e vias proteolíticas em músculos de animais diabéticos
simpatectomizados - 5 dias de diabetes
Após 5 dias de diabetes, a diminuição das catecolaminas induzida pela
administração da guanetidina não provocou nenhuma alteração nos valores de
proteólise total e na atividade das vias proteolíticas, tanto em soleus quanto em
EDL de ratos diabéticos, permanecendo iguais às observadas apenas nos
animais diabéticos controles (ver Figuras 18 e 19).
Desta maneira, parece que as catecolaminas influenciam a velocidade
dos processos de degradação de proteínas apenas nas fases agudas de
deficiência insulínica.
As diferenças encontradas nas respostas relacionadas ao metabolismo
protéico dos músculos soleus e EDL frente à ausência de insulina e
catecolaminas pode ser justificada pelo fato destes músculos apresentarem
diferenças quanto à responsividade a estes hormônios, diferença esta ligada ao
tipo de fibra predominante em cada um destes músculos.
Song et al. (1999) demonstraram que o músculo soleus, com
predominância de fibras oxidativas, apresenta maior responsividade à ação da
insulina, com níveis mais elevados de fosforilação do receptor da insulina (IR),
dos substratos do IR 1 e 2 (IRS-1 e IRS-2) e da proteína AKT, além de maior
atividade da enzima PI 3-quinase, em comparação às respostas encontradas
em músculos compostos principalmente de fibras glicolíticas (EDL e
epitrochlearis).
Estudando-se a densidade de receptores β-adrenérgicos na superfície
de células da musculatura esquelética com o ligante hidrofílico [
3
H]CGP 12177
(isto é, um composto que não atravessa a membrana plasmática, ligando-se
somente a receptores na superfície celular), Jensen et al. (2002) comprovaram
que a densidade de receptores do tipo β-adrenérgicos em músculos de fibras
Discussão
150
glicolíticas (como vastus lateralis branco e EDL) era de 30 a 35% menor em
comparação aos músculos soleus.
d) Síntese protéica em soleus de animais diabéticos simpatectomizados
O papel das catecolaminas na síntese protéica de animais diabéticos
foi verificado em músculos soleus de animais 1 e 3 dias após a injeção de STZ
e 1 e 2 dias após a administração de guanetidina. Além disso, foi estudado o
efeito da adição de 10
-5
M de adrenalina in vitro na síntese de proteínas destes
mesmos músculos.
A redução nos valores de síntese de proteínas em músculos de animais
diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ) estão de acordo com dados prévios de nosso
laboratório (Pepato et al., 1996), bem como a ausência de efeito da adrenalina
in vitro na síntese protéica em músculos de animais normais (Navegantes et
al., 2004). No entanto, era de se esperar que a adrenalina adicionada ao meio
de incubação pudesse reverter ou reduzir a queda nos valores de síntese
protéica em soleus de ratos diabéticos, uma vez que dados anteriores do
laboratório comprovaram que adrenalina e clembuterol (agonista β
2
-
adrenérgico) in vitro eram capazes de aumentar a síntese protéica em soleus
de ratos jejuados, corroborando a hipótese de que as catecolaminas teriam um
efeito estimulatório na síntese de proteínas em situações de deficiência de
hormônios anabólicos (Navegantes et al., 2004).
No entanto, músculos soleus de animais diabéticos (1 e 3 dias pós-STZ)
não apresentaram alterações nos valores de síntese protéica (já reduzidos)
após a incubação na presença de adrenalina. Esta falta de responsividade dos
músculos de animais diabéticos poderia ser explicada pelas altas
concentrações de noradrenalina encontradas em soleus de animais após 1 ou
3 dias de deficiência insulínica. Os níveis elevados de catecolaminas
musculares em animais diabéticos poderiam ser responsáveis pelo efeito
clássico de down-regulation dos receptores β
2
-adrenérgicos neste tecido, o que
explicaria, portanto, a ausência de efeito da adrenalina in vitro. Como o tempo
de simpatectomia em animais com 1 dia de diabetes é consideravelmente
curto, pode-se supor que em soleus destes animais a exposição dos receptores
Discussão
151
adrenérgicos na membrana plasmática não tenha sido alterado, o que também
explicaria a ausência de resposta da catecolamina adicionada in vitro.
A simpatectomia foi capaz de promover uma redução adicional nos
valores de síntese protéica em músculos de animais com 1 dia de diabetes,
porém nenhuma alteração adicional foi observada em músculos de animais
simpatectomizados após 3 dias de diabetes.
No entanto, após 3 dias de diabetes e 2 dias de simpatectomia, as
concentrações musculares de catecolaminas que se encontram drasticamente
reduzidas pelo tratamento com guanetidina poderiam ser responsáveis, agora,
pelo aumento na densidade de receptores β
2
-adrenérgicos na membrana
plasmática neste tecido, levando a uma maior responsividade do músculo ao
sinal catecolaminérgico. Além disso, vale a pena ressaltar a possibilidade de
aumento ainda maior na exposição destes receptores corroborado pelo
mecanismo relacionado à falta de insulina, que portanto não estaria
promovendo internalização dos receptores β
2
-adrenérgicos (mecanismo
explicado anteriormente para justificar a queda na participação da via
dependente de cálcio em músculos de ratos diabéticos simpatectomizados no
3
o
dia de diabetes). Estas hipóteses poderiam, também neste caso, explicar o
aumento nos valores de síntese protéica promovido pela adrenalina in vitro em
soleus de animais com 3 dias de diabetes e simpatectomizados durante 2 dias.
Desta maneira, fica registrada a necessidade de investigar o número de
receptores β
2
-adrenérgicos na membrana plasmática de músculos de animais
diabéticos, nos diferentes tempos de simpatectomia.
Discussão
152
5.3) Papel da pentoxifilina no metabolismo de proteínas em músculos
esqueléticos de animais diabéticos
A segunda parte deste trabalho se propôs a estudar o efeito da
pentoxifilina (inibidor da fosfodiesterase do AMPc) in vivo e in vitro no
metabolismo de proteínas em músculo esquelético de ratos jovens normais e
diabéticos. Além disso, foi investigado o papel in vivo e in situ da droga no
metabolismo protéico em músculo esquelético de ratos adultos submetidos às
mesmas condições.
A PTX previne o aumento da proteólise total, resposta característica do
diabetes, em músculo EDL 3 dias pós-STZ, através de sua ação em vias
proteolíticas específicas. É sabido que, neste tempo de diabetes, ocorre um
aumento nos valores de proteólise total em músculos EDL (Pepato et al.,
1996), promovido pela elevação nas participações dos sistemas proteolíticos
dependentes de cálcio e de Ub-proteassoma. Já o tratamento de animais
normais com PTX não levou a qualquer alteração nos valores de proteólise
total neste músculo. Vary et al. (1999) também não encontraram diferenças na
degradação protéica de músculos epitrochlearis obtidos de animais normais
tratados com PTX quando comparados aos controles não tratados. Porém,
estes mesmos autores verificaram que quando ocorre uma elevação na
proteólise total muscular em animais submetidos à situação de sepse induzida
por E. coli, pode ser observada uma nítida redução do catabolismo protéico
muscular após a administração de PTX.
A maioria dos trabalhos na literatura que comprovaram esta
capacidade da PTX na redução da proteólise não investigou qual(is) a(s) via(s)
proteolítica(s) eram afetada(s) pelo tratamento, analisando somente
parâmetros relacionados ao ganho de massa muscular ou à quantificação da
proteólise total em músculos incubados in vitro. Alguns outros estudos
demonstraram inibição na atividade e na expressão de componentes de
sistemas proteolíticos após o tratamento com PTX, mas estas alterações foram
encontradas somente em componentes dos processos proteolíticos lisossomal
e dependente de Ub-proteassoma. Assim, por exemplo, o aumento da
liberação de tirosina observado em músculos EDL de ratos portadores de
Discussão
153
sarcoma de Yoshida foi totalmente bloqueado após a administração de PTX
(Combaret et al., 1999). Este efeito foi atribuído à redução na atividade da via
dependente de Ub-proteassoma (aumentada em EDL de animais portadores do
câncer), uma vez que a PTX reduziu a expressão do RNAm da ubiquitina, da
enzima conjugadora E2 14KDa e da subunidade C2 do proteassoma 20S.
Deval et al. (2001) observaram que o aumento na expressão do RNAm
da catepsina L em músculos gastrocnemius e tibialis anterior de ratos em
situação de septicemia (indução por E. coli) foi parcialmente bloqueado após a
administração de PTX. No presente trabalho não foi encontrado qualquer efeito
da PTX na atividade da via lisossomal. Isto pode ser decorrente do fato desta
via não se encontrar alterada em EDL de ratos diabéticos e, portanto, a PTX
poderia não atuar em um sistema que se encontra em atividade basal.
Além de promover queda já esperada na atividade do sistema
proteolítico dependente de Ub-proteassoma, o tratamento in vivo com PTX, no
presente trabalho, promoveu inibição na participação da via dependente de
cálcio em EDL de ratos diabéticos. Trabalho de Costelli et al. (2002) também
comprovou esta ação anti-proteolítica muscular da PTX, mostrando ocorrer
queda na atividade proteolítica do proteassoma e da calpaína em músculos
gastrocnemius de ratos portadores de sarcoma de Yoshida AH-130 (situação
de comprovada atrofia muscular) após tratamento com PTX.
Esta ação anti-proteolítica da PTX tem sido atribuída ao seu papel
inibitório da síntese de TNF-α, citocina pró-inflamatória freqüentemente
associada a quadros de caquexia (Costelli et al., 1993; Goodman, 1991; Lin et
al., 2005). Desta maneira, parte da resposta anti-proteolítica promovida pela
PTX em ratos diabéticos poderia ser explicada pela redução nos níveis
plasmáticos da citocina, que estavam aumentados em comparação aos níveis
encontrados em animais normais (ver Figura 30). Não foi detectada nenhuma
alteração nas concentrações plasmáticas de TNF-α em ratos normais, tratados
ou não com PTX.
No entanto, a redução nas concentrações de TNF-α não seria capaz de
explicar o efeito anti-proteolítico da PTX encontrado em situações onde os
níveis plasmáticos da citocina permanecem inalterados. Recente trabalho de
Discussão
154
Hinkle et al. (2005) demonstrou que o tratamento de camundongos com
inibidores da fosfodiesterase do AMPc reduziram a perda de massa e função
muscular decorrente do desuso e da desnervação atrófica, situações onde não
são observadas alterações nas concentrações plasmáticas de TNF-α. Além
disso, foi demonstrado no presente trabalho que a PTX reduziu diretamente a
velocidade de degradação de proteínas, tanto em músculos de animais
normais quanto em músculos de animais diabéticos incubados in vitro na
presença da droga. Assim, uma outra hipótese provável para justificar esta
ação anti-proteolítica da PTX é o fato desta droga promover aumento
nas
concentrações
intracelulares de AMPc, uma vez que ela inibe diretamente a
enzima responsável pela degradação deste nucleotídeo cíclico, a
fosfodiesterase do AMPc. De fato, o presente trabalho encontrou elevação nas
concentrações intracelulares de AMPc em músculos de animais diabéticos
tratados in vivo com PTX (ver Figura 22) e em músculos de animais normais e
diabéticos incubados in vitro com a droga (ver Figura 33), em comparação aos
controles não tratados.
Uma vez que a PTX promove aumento nas concentrações de AMPc, o
efeito inibitório da degradação protéica pela xantina pode ser atribuído a um
mecanismo muito semelhante àquele estudado por Navegantes et al. (2002),
demonstrando a ação anti-proteolítica das catecolaminas. Com o aumento dos
níveis intracelulares de AMPc, poderia estar ocorrendo estimulação das vias de
sinalização ligadas à PKA e/ou à proteína Epac que conseqüentemente
estariam promovendo, através de mecanismos de modificação covalente direta
ou controle da expressão gênica, a inibição dos sistemas proteolíticos
responsáveis pela redução da proteólise muscular. Os dados apresentados no
presente trabalho comprovaram o envolvimento da PKA nas ações
desencadeadas pela PTX na musculatura esquelética. O efeito anti-proteolítico
in vitro da PTX foi completamente bloqueado após a incubação dos músculos
na presença de H89, um inibidor específico da PKA, efeito este observado em
EDL de animais normais e diabéticos. Este achado comprova a existência de
um mecanismo de ação direto da PTX, promovendo aumento nas
concentrações intracelulares de AMPc e estimulando a sinalização que envolve
Discussão
155
a PKA, que conseqüentemente estaria envolvida na prevenção da proteólise
muscular na musculatura esquelética.
Músculos de animais normais tratados com PTX não apresentaram
alterações nos valores de proteólise total quando comparados aos mesmos
animais não tratados. Em contraste, a adição de PTX ao meio de incubação
promoveu redução na proteólise total tanto em músculos de animais normais
quanto diabéticos. Uma possível explicação para esta resposta diferenciada em
músculos de animais normais pode estar ligada à insulina. Quando animais
normais são tratados in vivo com PTX, o aumento esperado nas concentrações
intracelulares de AMPc pode não ocorrer, devido ao mecanismo de ação
oposto da insulina, que estimula a atividade das fosfodiesterases do AMPc no
tecido muscular, que impede o aumento deste nucleotídeo, bloqueando a
redução da proteólise induzida pela PTX. Assim, pode ser sugerido que,
fisiologicamente, as ações do hormônio prevaleçam sobre as ações da droga
na musculatura esquelética. Esta hipótese foi corroborada pelo aumento nos
níveis de AMPc encontrados somente em músculos de animais diabéticos
tratados in vivo com PTX mas não em animais normais tratados com a droga.
Além disso, a adição de PTX ao meio de incubação, sem insulina, é
responsável pela elevação nas concentrações de AMPc e diminuição da
proteólise total nos músculos de animais normais (ver Figura 33). Finalmente,
esclarecendo o envolvimento da insulina no impedimento da ação da PTX, os
experimentos de adição do hormônio in vitro mostraram que a insulina é capaz
de bloquear totalmente o efeito anti-proteolítico da PTX, tanto em músculos de
animais normais quanto diabéticos (ver Figuras 33 e 34).
Em síntese, a PTX é capaz de promover uma redução nos valores de
proteólise total na musculatura esquelética através da inibição da atividade das
vias proteolíticas que se apresentam ativadas nos diabetes, as vias
dependente de cálcio e dependente de ATP-proteassoma, tanto em EDL de
animais diabéticos tratados in vivo quanto em EDL de animais normais e
diabéticos incubados in vitro com a droga. Corroborando estes dados, estudos
de Navegantes et al. (2001) demonstraram diminuição na atividade da via
proteolítica dependente de cálcio em músculos de animais normais incubados
Discussão
156
na presença de dibutiril AMPc (análogo de AMPc) ou isobutilmetilxantina
(inibidor não-específico da fosfodiesterase do AMPc). Assim, o aumento nas
concentrações musculares de AMPc podem explicar o efeito anti-proteolítico da
PTX, através de um mecanismo muito similar ao demonstrado por Navegantes
et al. (1999-2002, 2006), onde foi demonstrado que as catecolaminas, após
ligação aos receptores β
2
e β
3
-adrenérgicos, ativam as vias intracelulares
dependentes de AMPc, que inibem a degradação protéica muscular pela
redução na atividade da via proteolítica dependente de cálcio.
O presente trabalho demonstrou que o conteúdo da proteína m
-calpaína,
aumentado em EDL de animais diabéticos, foi reduzido após o tratamento
destes animais com PTX (ver Figura 28A), sugerindo que a diminuição na
participação da via proteolítica dependente de cálcio promovida pela droga seja
conseqüência de uma redução no conteúdo e/ou atividade das calpaínas. Além
da regulação da expressão das calpaínas, a redução na atividade desta
protease pela PTX também pode ser mediada por mecanismos de fosforilação
direta. Shiraha et al. (2002) demonstraram em fibroblastos que o fator de
crescimento epidermal ativa PKA e esta é capaz de fosforilar diretamente a m-
calpaína, inibindo sua atividade. Dados do presente trabalho mostram que o
aumento na atividade do sistema proteolítico dependente de cálcio observado
em músculos de animais diabéticos pode em parte ser explicado tanto pelo
aumento nos níveis de m-calpaína (ver Figura 28A) quanto pela redução nos
níveis de calpastatina, inibidor fisiológico das calpaínas (ver Figura 28B).
Embora os níveis de calpastatina não tenham sido alterados pelo tratamento
com PTX, não pode ser descartada a possibilidade de aumento na atividade
desta proteína em músculos de animais diabéticos tratados com PTX, através
de controle direto, via fosforilação. Pontremoli et al. (1992) demonstraram que a
calpastatina pode ser diretamente fosforilada in vitro pela PKA em músculo
esquelético, sendo aumentada sua atividade inibitória sobre as calpaínas.
Estas possibilidades merecem ser investigadas.
Discussão
157
Estudos anteriores relatam que o tratamento de ratos com derivados de
xantina promove redução na expressão de diferentes componentes do sistema
proteolítico dependente de ATP-proteassoma em animais com câncer
(Combaret et al., 1999) ou sepse (Combaret et al., 2002). Mais recentemente
foi demonstrado que o tratamento de ratos com clembuterol (agonista β
2
-
adrenérgico) atenua a atrofia muscular desencadeada pela falta de gravidade
(modelo de suspensão do animal pela cauda) através de redução na formação
dos conjugados poliubiquitinados em músculos fast plantaris e tibialis anterior
(Yimlamai et al. 2005). Assim, as ações da PTX podem ser atribuídas à
ativação da PKA, que conseqüentemente regularia a atividade do proteassoma
e/ou os processos de ubiquitinação de proteínas. A redução na alta expressão
do RNAm de atrogin-1 em músculos de animais diabéticos tratados com PTX
(ver Figura 29) corrobora esta hipótese. Da mesma maneira, Navegantes et al.
(2006, dados não publicados) encontraram inibição na atividade proteolítica
dependente de ATP-proteassoma e redução na expressão gênica de ubiquitina
ligases em músculos de ratos normais incubados in vitro na presença de
clembuterol ou isobutilmetilxantina.
Assim, a ação anti-proteolítica direta da PTX está ligada a um
mecanismo que envolve aumento nas concentrações intracelulares de AMPc e
ativação da PKA. No entanto, uma outra possibilidade é que a ação inibitória da
proteólise muscular ligada ao AMPc poderia ocorrer via ativação da AKT, um
intermediário da sinalização intracelular da insulina.
Trabalho de Mei et al. (2002) elucidou pela primeira vez a estimulação
da AKT por intermediários da cascata de sinalização do AMPc. Foi
demonstrado que o aumento dos níveis de AMPc promovido pela adição de
forskolina (ativador da adenilato ciclase) ou dibutitil AMPc, em cultura de
células HEK 293, ativa a Epac, sendo esta proteína capaz de aumentar os
níveis de fosforilação (e conseqüentemente ativação) da AKT. A integração
entre a sinalização que envolve AMPc e elevação nos níveis de fosforilação e
na atividade da AKT, por mecanismo independente de PKA, também já foi
observada em outros tipos celulares, como tecido adiposo marrom (Klein et al.
Discussão
158
1999), macrófagos (Misra & Pizzo, 2005), eosinófilos (Machida et al. 2005) e
musculatura esquelética (Brennesvik et al. 2005; Jensen et al., 2005).
Recentemente, uma série de trabalhos tem investigado a regulação
exercida pela insulina ou pelo IGF-1 no metabolismo protéico da musculatura
esquelética, especificamente na identificação das cascatas de sinalização
responsáveis pela regulação da massa muscular (revisões em: Glass, 2003;
Guttridge, 2004). Assim, foi demonstrado que a via PI3-quinase/AKT está
diretamente envolvida no controle exercido pela insulina na maquinaria de
degradação de proteínas em células musculares esqueléticas (Latres et al.,
2005; Nader, 2005). Neste contexto, uma das principais ações atribuídas à AKT
é a regulação inibitória de proteínas Foxo, fatores de transcrição que participam
no controle de processos biológicos relacionados ao metabolismo celular,
diferenciação e apoptose (Birkenkamp & Coffer, 2003; Tran et al. 2003; Barthel
et al., 2005). A AKT seria responsável em prevenir a atrofia muscular através
de fosforilação e inibição da atividade dos fatores de transcrição Foxo1 e
Foxo3a, que controlam a expressão de “atrogenes” que expressam enzimas do
tipo ubiquitina ligases (E3), componentes chave para o processo de
ubiquitinação das proteínas a serem degradadas pelo proteassoma (Sandri et
al, 2004; Stitt et al., 2004).
Baseado neste conjunto de dados que mostram que a AKT promove
inibição da degradação de proteínas e no fato de que a sinalização dependente
de AMPc pode ativar a AKT, outra hipótese para explicar os resultados do
presente trabalho seria que a AKT pudesse ser outro intermediário ligado às
ações anabólicas da PTX na musculatura esquelética. Além disso, vale aqui
ressaltar os resultados obtidos na primeira parte deste trabalho que
demonstraram um aumento surpreendente na participação das vias
proteolíticas dependentes de cálcio e de ATP-proteassoma em EDL de ratos
diabéticos submetidos a um quadro de simpatectomia aguda. Estas mesmas
vias, em contrapartida, foram inibidas em músculos EDL de ratos diabéticos
tratados in vivo e in vitro com PTX. Estas informações reforçam a possibilidade
da existência de intermediários comuns nas cascatas de sinalização do AMPc
e da insulina na regulação do metabolismo protéico (ver Figura 47). Assim, esta
Discussão
159
hipótese merece maiores estudos na tentativa de esclarecer quais os
intermediários envolvidos neste cross-talk.
O efeito anti-catabólico da PTX em músculo esquelético também foi
verificado em animais adultos
, empregando-se para tal a metodologia da
microdiálise. As ações da in vivo e in situ da PTX foram estudadas em
músculos tibialis anterior de ratos normais e diabéticos (3 dias após a
administração de aloxana). O perfil de resposta observado nos animais foi
semelhante àquele encontrado no estudo realizado com músculos incubados in
vitro de animais jovens. Ocorreu um aumento nas concentrações de tirosina
intersticial muscular e plasmática de animais diabéticos adultos. Assim, o índice
I-A apresentou-se elevado em ratos diabéticos quando comparado aos
normais, indicando que o aumento da concentração intersticial de tirosina
resultante da deficiência insulínica foi decorrente de alterações metabólicas
locais, na musculatura (decorrente de aumento da degradação e/ou diminuição
da síntese de proteínas) e não de alterações no metabolismo protéico de
outros tecidos como fígado, intestino, etc. Em animais diabéticos tratados
durante 4 dias com PTX ocorreu uma redução nos valores de tirosina
intersticial, e conseqüentemente no índice I-A, em comparação aos ratos não
diabéticos tratados. Tal como encontrado nos animais jovens, ratos adultos
normais tratados com PTX não apresentaram alterações nos valores de tirosina
intersticial ou no índice I-A em comparação aos animais não tratados com a
droga.
A PTX adicionada ao meio de perfusão também foi capaz que promover
diminuição nos valores de tirosina intersticial em músculos de animais
diabéticos perfundidos, e o índice I-P apresentou-se menor nestes animais em
comparação aos ratos diabéticos não perfundidos com PTX. Nenhuma
alteração da PTX in situ foi observada em animais normais.
Apesar de não terem sido determinados os níveis plasmáticos de TNF-α
nos animais adultos utilizados nestes experimentos, pode-se sugerir que um
dos mecanismos de ação anti-proteolítica da PTX seja atribuído à redução nas
concentrações desta citocina no plasma de animais diabéticos tratados com a
Discussão
160
droga. Porém, não pode ser descartada a possibilidade de um efeito direto da
droga no metabolismo de proteínas na musculatura esquelética, considerando
a resposta anti-catabólica observada nos músculos de animais perfundidos
com a xantina. Esta última hipótese pode ser corroborada pelos estudos
recentes realizados em nosso laboratório por Lira e colaboradores (dados não
publicados), onde foi demonstrado um aumento local nos níveis de AMPc em
músculos tibialis anterior de ratos sépticos perfundidos in situ com
isobutilmetilxantina, um outro composto derivado de xantina que apresenta um
efeito anti-proteolítico in situ semelhante à PTX na musculatura esquelética.
Apesar de a PTX in vivo ser capaz de promover uma resposta anti-
proteolítica em músculos EDL de animais diabéticos, o tratamento durante 4
dias com esta droga não promoveu alterações na velocidade da síntese de
proteínas destes mesmos animais. Resultados similares também foram
encontrados por Combaret et al. (2002), que estudaram o efeito da torbafilina
(HWA 448), um derivado de xantina tal como a PTX, no metabolismo protéico
em EDL de animais portadores de sarcoma de Yoshida, tratados durante 9 dias
com a droga. Apesar da torbafilina promover redução na proteólise muscular,
também não foi encontrado efeito da droga na velocidade de síntese protéica
em músculos EDL de animais tratados.
Desta maneira, os resultados do presente trabalho demonstraram que a
PTX é capaz de promover redução na proteólise total e na participação das
vias proteolíticas dependente de cálcio e dependente de ATP-proteassoma em
músculos de animais diabéticos (efeito in vivo e in vitro) e normais (efeito in
vitro). Esta ação anti-proteolítica pode ser uma associação entre o efeito
indireto da PTX na redução das concentrações plasmáticas de TNF-α e um
efeito direto da droga promovendo aumento nos níveis intracelulares de AMPc.
Assim, este é o primeiro relato, tanto quanto saibamos, que a PTX é capaz de
inibir diretamente a proteólise muscular em uma situação clássica de atrofia
muscular, o diabetes. Estes achados apontam para a possibilidade de
Discussão
161
utilização da PTX ou seus derivados no tratamento de quadros agudos de
atrofia muscular em diferentes situações de perda de massa corporal.
A Figura 47 elucida as diferentes possibilidades de cross-talk entre os
intermediários da sinalização da insulina e das catecolaminas que poderiam
levar a uma inibição na expressão e/ou atividade de diferentes componentes
dos sistemas proteolíticos na musculatura esquelética.
Discussão
162
FIGURA 47: Cross-talk entre os intermediários da sinalização da insulina e das catecolaminas que podem ser
responsáveis pelo controle dos processos de síntese e degradação de proteínas em músculo esquelético.
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Anexo
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