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Fundação Oswaldo Cruz
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
Departamento de Saúde Coletiva
Mestrado em Saúde Pública
Caracterização do Perfil Isotípico das
Imunoglobulinas G de Indivíduos
Chagásicos Frente aos Antígenos
Recombinantes CRA e FRA de
Trypanosoma cruzi
Recife, 2006
Alinne Fernanda Amaral Verçosa
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A
LINNE
F
ERNANDA
A
MARAL
V
ERÇOSA
C
ARACTERIZAÇÃO DO
P
ERFIL
I
SOTÍPICO DAS
I
MUNOGLOBULINAS
G
DE
I
NDIVÍDUOS
C
HAGÁSICOS
F
RENTE AOS
A
NTÍGENOS
R
ECOMBINANTES
CRA
E
FRA
DE
T
RYPANOSOMA CRUZI
Dissertação apresentada ao
Departamento de Saúde Coletiva do
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
da Fundação Oswaldo Cruz para a
obtenção do título de Mestre em Saúde
Pública.
Orientadora: Yara de Miranda Gomes, PhD.
Co-orientador: Wayner Vieira de Souza, PhD.
Recife, 2006
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Catalogação na fonte: Biblioteca do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
V481c
Verçosa, Alinne Fernanda Amaral.
Caracterização do Perfil Isotípico das
Imunoglobulinas G de Indivíduos Chagásicos Frente aos
Antígenos Recombinantes CRA e FRA de Trypanosoma
cruzi / Alinne Fernanda Amaral Verçosa. — Recife: A.
F. A. de Verçosa, 2006.
103 p. : il.
Dissertação (mestrado em saúde pública) — Centro
de Pesquisas Aggeu, Magalhães, Fundação Oswaldo
Cruz, 17 fev. 2006.
Orientadora: Yara de Miranda Gomes
Co-orientador: Wayner Vieira de Souza.
1. Doença de Chagas - imunologia. 2.
Imunoglobulina G. 3. Isotipos da Imunoglobulina. 4.
Marcadores biológicos. 5. Proteínas recombinantes. I.
Gomes, Yara de Miranda. II. Souza, Wayner Vieira de.
III. Título.
CDU 616.937
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
CENTRO DE PESQUISAS AGGEU MAGALHÃES
DEPARTAMENTO DE SAÚDE COLETIVA
Esta dissertação intitulada:
C
ARACTERIZAÇÃO DO
P
ERFIL
I
SOTÍPICO DAS
I
MUNOGLOBULINAS
G
DE
I
NDIVÍDUOS
C
HAGÁSICOS
F
RENTE AOS
A
NTÍGENOS
R
ECOMBINANTES
CRA
E
FRA
DE
T
RYPANOSOMA CRUZI
apresentada por
ALINNE FERNANDA AMARAL VERÇOSA
Foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Titulares:
Dra. Valéria Rêgo Alves Pereira
Dr. Eduardo José Moura do Nascimento
Suplentes:
Dra. Laura Helena Vega Gonzales Gil
Dr. Rafael Dhália
Dissertação defendida e aprovada em 17 de fevereiro de 2006.
D edico este trabalho
D edico este trabalhoD edico este trabalho
D edico este trabalho
A os m eu s pa is, F ern an do e M ônica, qu e
sem pre m e in cen tivaram e a poiaram a fa zer
tu do aq uilo q u e desejei.
U m gra n de beijo.
A
GRADECIMENTOS
À Dra. Yara Gomes, por ter me orientado desde a iniciação científica até o
mestrado, me dando a oportunidade de crescer cientificamente, e por acreditar no
meu trabalho.
Ao Dr. Wayner Souza, pela co-orientação.
A todos que compõem o Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fiocruz, por
fazer deste Centro de pesquisas um local de formação de recursos humanos muito
importante no nosso país.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pelo
financiamento da bolsa a mim creditada durante todo o mestrado.
À Biomanguinhos/Fiocruz, pelo apoio financeiro deste trabalho, além do
fornecimento das proteínas utilizadas no estudo.
À coordenação da pós-graduação e à secretaria acadêmica, pelo apoio
constante.
Aos bibliotecários do CPqAM/Fiocruz, pelos artigos científicos fornecidos.
Ao Laboratório de Métodos Quantitativos do CPqAM/Fiocruz, pela
contribuição nas análises estatísticas realizadas neste trabalho.
Ao Setor de Transporte do CPqAM/Fiocruz, por disponibilizar a viatura ao
Ambulatório de Doença de Chagas do HUOC.
Aos Ambulatórios de Doença de Chagas do Hospital das Clínicas-UFPE e do
Hospital Universitário Oswaldo Cruz-UPE, pela permissão para seleção de pacientes
chagásicos cadastrados.
Aos meus amigos, integrantes do departamento de Imunologia ou não, que
torceram por e acreditaram em mim.
Aos pacientes chagásicos e indivíduos saudáveis que aceitaram participar
deste estudo e contribuir para o progresso da ciência, conscientes de que podem até
não estar sendo beneficiados diretamente, mas que o benefício de sua colaboração
será proporcionado a todos os chagásicos.
Agora, o meu maior agradecimento vai para uma pessoa que, sem ela, talvez
hoje eu não estivesse concluindo esta importante etapa de minha vida: Virginia
Lorena. Sempre com uma palavra de incentivo e confiança, me ajudou a permanecer
na vida científica. Além disso, foi um exemplo para mim de responsabilidade e
critério na pesquisa científica. Hoje eu a considero como amiga e irmã. Vi, sei que
posso contar com você pra tudo. E você pode considerar o mesmo. Um grande
beijo.
R
ESUMO
Em virtude da magnitude da infecção, onde cerca de 18 milhões de pessoas estão
infectadas na América Latina, de sua elevada morbimortalidade, com destaque para
a cardiopatia, além da quase ineficácia do tratamento etiológico, justificam-se
estudos que visem à melhoria da qualidade de vida dos portadores da enfermidade
de Chagas. Sabe-se que a resposta de isotipos específicos tem sido associada às
manifestações clínicas da doença de Chagas. Assim, nos propomos a pesquisar as
subclasses de IgG no soro de indivíduos chagásicos frente a dois antígenos
específicos do Trypanosoma cruzi, visando a obtenção de um perfil isotípico que
seja capaz de discriminar as formas clínicas cardíaca (CARD), mista (MIS) e
indeterminada (IND). Para isso, coletamos sangue para obtenção de soro de 60
pacientes chagásicos (CARD= 33, MIS= 7 e IND= 20), selecionados no Ambulatório
de Doença de Chagas do Hospital das Clínicas e do Hospital Universitário Oswaldo
Cruz, ambos situados na cidade de Recife-PE. Todos os pacientes foram avaliados
clinicamente para caracterização das formas clínicas e realizaram exames
confirmatórios para infecção pelo T. cruzi. Além disso, também coletamos sangue de
40 indivíduos sadios (indivíduos não-chagásicos= 20 e controles negativos para o
cut-off= 20) que apresentaram sorologia negativa para infecção pelo T. cruzi. Todos
os indivíduos tiveram participação voluntária e os procedimentos adotados no
trabalho foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães. Os antígenos recombinantes (Ags-Recs) Cytoplasmic
Repetitive Antigen (CRA) e Flagellar Repetitive Antigen (FRA) foram analisados
através de SDS-PAGE, seguido por colorações pela prata e pelo ácido periódico de
Schiff, ficando comprovada a integridade dos Ags-Recs e ausência de
contaminações bacterianas. As concentrações ideais dos Ags-Recs e dos anti-
isotipos foram estabelecidas após titulação dos mesmos. Para detecção dos isotipos
utilizamos a metodologia do ELISA indireto, onde as placas de ELISA foram
sensibilizadas com os Ags-Recs CRA ou FRA. As amostras de soro foram
depositadas em duplicata nos poços. A ligação dos anticorpos específicos foi
detectada pela incubação dos anti-isotipos (anti-IgG1, anti-IgG2, anti-IgG3 e anti-
IgG4) conjugados à biotina, seguida da incubação de estreptavidina conjugada à
peroxidase. A quantificação da reação foi determinada através do leitor de ELISA a
490 nm. Os resultados foram analisados através de um índice de reatividade, onde
as densidades ópticas das amostras foram divididas pelo cut-off (média dos
controles negativos adicionada de dois desvios-padrão) de suas respectivas placas.
Verificamos que a resposta imune humoral gerada pelos pacientes frente aos Ags-
Recs foi bastante variada, com produção de quase todas as subclasses de IgG.
Entretanto, apenas o isotipo IgG2 específico contra o Ag-Rec FRA foi capaz de
diferenciar pacientes chagásicos portadores da forma CARD daqueles portadores da
forma IND, podendo, após um estudo prospectivo, servir como marcador de
evolução clínica para a forma cardíaca. Esta informação é importante, uma vez que
permite ao médico avaliar a possibilidade de redirecionar a conduta do tratamento
de seu paciente.
Palavras-chave: Perfil isotípico; Antígenos recombinantes; Doença de Chagas.
A
BSTRACT
Chagas’ disease is an important public health disorder in Latin America, where 18
million people are estimated to be infected. The wide range of clinical manifestations,
of which heart involvement is the most significant in the case of Chagas’ disease,
because of its characteristics, frequency and consequences, and lack of treatment
and cure, justify research in this area. The specific immunoglobulin G (IgG) antibody
subclass has been associated with human Chagas’ disease. Thus, in this study, the
profile of IgG subclasses against two T. cruzi specific antigens was correlated with
different clinical manifestations of Chagas’ disease. At two hospitals located in Recife
in the State of Pernambuco, Brazil we selected 60 patients with Chagas’ disease, of
whom 33 exhibited cardiac (CARD) manifestations, 7 had both cardiac and digestive
manifestations and 20 had asymptomatic T. cruzi infection (IND). All patients were
asked about their clinical status and whether they had received a positive diagnosis
for Chagas’ disease. We also selected 40 healthy individuals who had tested
negative in serological tests for Chagas’ disease (20 non-chagasic and 20 negative
controls to calculate the cut-off). The inclusion of all subjects in our investigation had
the approval of the Ethics Committees of the Aggeu Magalhaes Research Center.
The recombinant antigens (Ags-Recs) CRA and FRA were analysed using SDS-
PAGE, followed by a specific stain with silver and Schiff reagent confirming their
integrity and lack of bacterial contamination. The optimal concentration of Ags-Recs
and anti-isotypes was established by titration. In order to detect the isotypes, wells of
polystyrene micotiter plate were coated with CRA or FRA. Serum samples were
added in duplicate to each well and specific binding was detected using biotinylated
anti-isotypes (anti-IgG1, anti-IgG2, anti-IgG3 and anti-IgG4) followed by streptavidin-
horseradish peroxidase incubation. Optical density was determined (490nm) using an
automated ELISA reader. Our results were analysed using a reactivity index, where
the optical density of samples was divided by respective cut-off (negative control
average plus two standard-deviations) of each plate. IgG subclasses were detected
in almost all Chagas patients studied. Nevertheless, only specific IgG2 isotype FRA
was found with a significant statistical difference in CARD patients when compared to
IND patients. This result suggests the potential use of this isotype for prognostic
purposes, for monitoring the progression of chronic Chagas’ disease, and for
predicting the risk of CARD damage. However, a follow-up study is necessary to
confirm this result. This is important information, as it could help physicians to
evaluate and manage the treatment of their patients.
Key words: Isotypic profile; Recombinant antigens; Chagas’ disease.
L
ISTA DE
F
IGURAS
Pág.
F
IGURA
1- Padronização das concentrações dos Ags-Recs CRA e FRA...
43
F
IGURA
2- Padronização das diluições dos anti-isotipos de IgG para o
Ag-Rec CRA...............................................................................
44
F
IGURA
3- Padronização das diluições dos anti-isotipos de IgG para o
Ag-Rec FRA...............................................................................
45
F
IGURA
4-
SDS-PAGE dos Ags-Recs CRA e FRA de Trypanosoma cruzi
purificados através de cromatografia de metal quelado, corado
pela prata...................................................................................
50
F
IGURA
5-
SDS-PAGE dos Ags-Recs CRA e FRA de Trypanosoma cruzi
e da glicoproteína IgG2a de camundongo, corado pelo Ácido
Periódico de Schiff.....................................................................
51
F
IGURA
6 – Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes
chagásicos crônicos portadores da forma CARD, frente ao Ag-
Rec CRA....................................................................................
53
F
IGURA
7 – Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes
chagásicos crônicos portadores da forma MIS, frente ao Ag-
Rec CRA....................................................................................
54
F
IGURA
8 – Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes
chagásicos crônicos portadores da forma IND, frente ao Ag-
Rec CRA....................................................................................
55
F
IGURA
9 – Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes
chagásicos crônicos portadores da forma CARD, frente ao Ag-
Rec FRA.....................................................................................
56
F
IGURA
10 –
Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes
chagásicos crônicos portadores da forma MIS, frente ao Ag-
Rec FRA.....................................................................................
57
F
IGURA
11 –
Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes
chagásicos crônicos portadores da forma IND, frente ao Ag-
Rec FRA.....................................................................................
58
F
IGURA
12 –
Índices de reatividade dos isotipos IgG1, IgG2 e IgG3 de
pacientes chagásicos crônicos portadores das formas CARD,
MIS e IND, frente ao Ag-Rec CRA.............................................
60
F
IGURA
13 –
Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes
chagásicos crônicos portadores das formas CARD, MIS e
IND, frente ao Ag-Rec FRA........................................................
62
L
ISTA DE
A
BREVIATURAS
, S
IGLAS E
S
ÍMBOLOS
Marca registrada
°C
Grau Celsius
Ag(s)-Rec(s) Antígeno(s) recombinante(s)
APS
Ácido periódico de Schiff
BSA Albumina sérica bovina
CARD Forma cardíaca
CO
Cut-off
CPqAM Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
CRA
Cytoplasmic Repetitive Antigen
DIG Forma digestiva
DNA
DesoxiriboNucleic Acid
DO Densidade óptica
DP Desvio-padrão
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay
Fiocruz Fundação Oswaldo Cruz
FRA
Flagellar Repetitive Antigen
h Hora
HC Hospital das Clínicas
HUOC Hospital Universitário Oswaldo Cruz
IgA Imunoglobulina da classe A
IgG Imunoglobulina da classe G
IgG1 Imunoglobulina da classe G do tipo 1
IgG2 Imunoglobulina da classe G do tipo 2
IgG3 Imunoglobulina da classe G do tipo 3
IgG4 Imunoglobulina da classe G do tipo 4
IgM Imunoglobulina da classe M
IND Forma indeterminada
kDa kilo Dalton
M Molar
mA Miliampere
min Minuto
MIS Forma mista
mL Mililitro
n Número de amostra
NC Não-chagásico
ng Nanograma
nm Nanômetro
PAGE
Polyacrylamide Gel Electrophoresis
PBS
Phosphate-buffered saline
PE Pernambuco
pH Potencial hidrogeniônico
PM Peso molecular
SDS Dodecil sulfato de sódio
SPSS
Statistical Package for Social Sciences Incorporation
T. cruzi Trypanosoma cruzi
TA Temperatura ambiente
Tw
Tween 20
UFPE Universidade Federal de Pernambuco
UPE Universidade de Pernambuco
xg Aceleração da gravidade
%
Porcentagem
<
Menor que
=
Igual
>
Maior que
µg
Micrograma
µL
Microlitro
S
UMÁRIO
Pág.
F
OLHA DE ROSTO
F
OLHA DE APROVAÇÃO
D
EDICATÓRIA
A
GRADECIMENTOS
R
ESUMO
A
BSTRACT
L
ISTA DE
F
IGURAS
L
ISTA DE
A
BREVIATURAS
, S
IGLAS E
S
ÍMBOLOS
1 I
NTRODUÇÃO
....................................................................................................
18
1.1 Objetivos.................................................................................................
21
1.1.1 Objetivo Geral......................................................................................
21
1.1.2 Objetivos Específicos...........................................................................
21
2 A
SPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
,
CLÍNICOS E IMUNES DA DOENÇA DE
C
HAGAS
.........
23
2.1 Situação epidemiológica da doença de Chagas.....................................
23
2.2 Formas clínicas da doença de Chagas...................................................
24
2.3 O papel das imunoglobulinas na doença de Chagas.............................
26
2.4 Os antígenos recombinantes CRA e FRA de Trypanosoma cruzi..........
29
2.5 Perfil isotípico..........................................................................................
31
3 M
ATERIAIS E
M
ÉTODOS
.....................................................................................
35
3.1 Análise da pureza dos Ags-Recs CRA e FRA........................................
35
3.1.1 SDS-PAGE..........................................................................................
35
3.1.2 Coloração pela prata............................................................................
36
3.1.3 Coloração pelo reativo de Schiff..........................................................
37
3.2 População do estudo..............................................................................
38
3.2.1 Local de seleção de pacientes chagásicos e de indivíduos
saudáveis......................................................................................................
38
3.2.2 Critérios de seleção de pacientes chagásicos e de indivíduos
saudáveis......................................................................................................
39
3.2.2 População selecionada........................................................................
40
3.3 Aspectos éticos.......................................................................................
40
3.4 Coleta das amostras...............................................................................
41
3.5 Diagnóstico etiológico.............................................................................
41
3.6 Determinação do perfil isotípico..............................................................
42
3.6.1 Padronização das concentrações dos Ags-Recs................................
42
3.6.2 Padronização das diluições dos anti-isotipos......................................
43
3.6.3 Determinação do perfil isotípico contra os Ags-Recs CRA ou FRA....
45
3.7 Análise estatística...................................................................................
47
4
R
ESULTADOS
....................................................................................................
49
4.1 Análise da pureza dos Ags-Recs CRA e FRA........................................
49
4.1.1 Coloração pela prata............................................................................
49
4.1.2 Coloração pelo Ácido Periódico de Schiff............................................
50
4.2 Diagnóstico etiológico.............................................................................
51
4.3 Avaliação das subclasses de IgG...........................................................
52
4.3.1 Análise das subclasses de
IgG em pacientes chagásicos portadores
das diferentes formas clínicas utilizando o Ag-Rec CRA..............................
52
4.3.2 Análise das subclasses de IgG em pacientes chagásicos portadores
das diferentes formas clínicas utilizando o Ag-Rec FRA..............................
55
4.4 Correlação dos isotipos com as formas clínicas.....................................
59
5 D
ISCUSSÃO
......................................................................................................
64
6 C
ONCLUSÕES
...................................................................................................
72
7 P
ERSPECTIVAS
.................................................................................................
74
R
EFERÊNCIAS
B
IBLIOGRÁFICAS
............................................................................
76
A
PÊNDICES
........................................................................................................ 83
Apêndice A – Termo de Consentimento Livre e Esclarescido......................
84
Apêndice B - Formulário de Pesquisa..........................................................
85
Apêndice C – Artigo em preparação.............................................................
86
A
NEXO
................................................................................................................
102
Anexo A –
Comissão de Ética do CPqAM/Fiocruz.......................................
103
I
NTRODUÇÃO
V
ERÇOSA
AFA I
NTRODUÇÃO
18
1 I
NTRODUÇÃO
A doença de Chagas é uma enfermidade de características clínicas
peculiares. Os indivíduos infectados pelo Trypanosoma cruzi, agente etiológico desta
enfermidade, podem apresentar, após um período variável de tempo, uma das
quatro formas clínicas mais freqüentes, que são a forma cardíaca (CARD), a forma
digestiva (DIG), a forma mista (MIS) e a forma indeterminada (IND).
Pouco ainda se conhece sobre os mecanismos imunes e patogênicos que
estão envolvidos na transição da fase aguda para a crônica, bem como os fatores
que favorecem o desenvolvimento de uma determinada forma clínica (RIBEIRO-
RODRIGUES et al., 1996). Vários estudos têm demonstrado que a heterogeneidade
clínica observada entre os pacientes chagásicos está associada a uma distinta e
complexa relação parasita-hospedeiro, com o envolvimento direto do sistema imune
(ANDRADE, 1999; GAZZINELLI & BRENER, 1991; POWELL & WASSOM, 1993).
A enfermidade é circunscrita a 15 países endêmicos na América Latina, onde
se estima uma prevalência de infecção humana em cerca de 18 milhões de casos e
que cerca de 120 milhões de pessoas estão sob o risco de contrair a infecção
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002). Somando-se a isso, ainda não existe
um medicamento eficaz para o tratamento e nenhuma vacina que previna a doença
(CANÇADO, 1985).
Em virtude da magnitude da infecção, de sua elevada morbimortalidade, com
destaque para a cardiopatia, que gera um grande impacto social e médico-
trabalhista (MALTA, 1996; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2005), além da quase ineficácia
do tratamento etiológico, justificam-se estudos que visem à melhoria da qualidade de
vida dos portadores da enfermidade de Chagas.
V
ERÇOSA
AFA I
NTRODUÇÃO
19
Com o intuito de tentar diferenciar os pacientes com potencial evolutivo para
as formas clínicas severas, vários grupos de pesquisa tentam estabelecer
marcadores biológicos de evolução do prognóstico da doença através de
abordagens imunológicas. Alguns deles buscam por um padrão de imunoglobulinas
associadas a um ou mais antígenos de T. cruzi que sejam capazes de diferenciar as
formas clínicas e predizer seu potencial evolutivo. É por meio desta abordagem que
o presente trabalho estudou a resposta imune humoral estabelecida pelo indivíduo
chagásico frente a dois antígenos recombinantes de T. cruzi, e relacionar esta
resposta com as formas clínicas CARD, DIG, MIS e IND da doença de Chagas.
Para tal finalidade, foram utilizados dois antígenos específicos de T. cruzi, o
CRA e o FRA, obtidos através da tecnologia do DNA recombinante. Esses dois
antígenos apresentam uma estrutura de epítopos repetitivos, e por este motivo o
antígeno repetitivo que está localizado na região do flagelo recebeu o nome de
Flagellar Repetitive Antigen (FRA). Ele é encontrado nas formas epimastigota e
tripomastigota de T. cruzi. Da mesma forma, o antígeno repetitivo que está
localizado no citoplasma foi chamado de Cytoplasmic Repetitive Antigen (CRA), e
está presente nas formas evolutivas epimastigota e amastigota do parasito
(KRIEGER et al., 1992; LAFAILLE et al., 1989). A resposta imune frente a estes
antígenos já foi extensivamente estudada experimentalmente (PEREIRA et al.,
2003a, 2003b, 2004, 2005), e o potencial diagnóstico deles também já foi
comprovado (GADELHA et al., 2003; GOMES et al., 2001). Não se conhece, porém,
os isotipos de IgG que estão envolvidos na resposta imune humoral gerada por
pacientes chagásicos frente a estes Ags-Recs.
A utilização de proteínas puras e quimicamente definidas e ainda, específicas
do parasito, é sugerida por vários autores para fornecer maior especificidade aos
V
ERÇOSA
AFA I
NTRODUÇÃO
20
resultados na identificação de moléculas alvo de uma interação parasita-hospedeiro
bem sucedida, e para estudar a imunopatologia da doença de Chagas (CERBAN et
al., 1993; LORCA et al., 1992; MOTRAN et al., 1994). Assim, com a utilização das
proteínas CRA e FRA, poderíamos avaliar os resultados de respostas imunes
específicas durante a fase crônica da doença de Chagas, estabelecendo um perfil
isotípico que discriminasse as diferentes formas clínicas da doença.
Existe uma grande diversidade de resultados obtidos pelos vários autores que
dirigem seus esforços para estudar o tema. Alguns encontraram uma estreita
associação entre as manifestações clínicas e o reconhecimento antígeno-específico
(AZNAR et al., 1995), enquanto outros autores obtiveram resultados parciais, e às
vezes até controversos para predizer a possibilidade de evolução da doença
(MORGAN et al., 1996).
Considerando que os estudos realizados com antígenos complexos de T.
cruzi, avaliando a resposta imune humoral, ainda não discriminaram completamente
as diferentes formas clínicas da doença de Chagas, que estudos prévios sugerem a
existência de uma relação entre o reconhecimento antígeno-específico e as formas
clínicas da doença de Chagas (AZNAR et al., 1995), que a detecção de antígenos
específicos por um isotipo particular de anticorpo sugere uma correlação com as
manifestações clínicas da doença de Chagas (MORGAN et al., 1998), e que ainda
não se conhecem os isotipos de IgG que estão envolvidos na resposta imune frente
aos Ags-Recs CRA e FRA, a utilização destes Ags-Recs poderia evidenciar uma
associação com o estado clínico dos pacientes.
V
ERÇOSA
AFA I
NTRODUÇÃO
21
1.1 Objetivos
1.1.1 Objetivo Geral
Analisar a associação entre o perfil isotípico das imunoglobulinas G de
pacientes chagásicos crônicos frente aos antígenos recombinantes CRA e FRA de
Trypanosoma cruzi e as formas clínicas da doença de Chagas.
1.1.2 Objetivos Específicos
• Identificar o perfil isotípico das imunoglobulinas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4,
presentes no soro de indivíduos chagásicos crônicos, frente aos Ags-Recs CRA e
FRA de Trypanosoma cruzi;
• Correlacionar o perfil isotípico identificado com as diferentes formas clínicas da
doença de Chagas (CARD, DIG, MIS e IND).
A
SPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
,
CLÍNICOS E IMUNES DA
DOENÇA DE
C
HAGAS
V
ERÇOSA
AFA A
SPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
,
CLÍNICOS E IMUNES DA DOENÇA DE
C
HAGAS
23
2 A
SPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
,
CLÍNICOS E IMUNES DA DOENÇA DE
C
HAGAS
2.1 Situação epidemiológica da doença de Chagas
Apesar de estar próximo o centenário de descobrimento da doença, que foi
descoberta em 1909 pelo médico Carlos Chagas, a infecção humana pelo
Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas, ainda representa um
grande problema de saúde pública em 15 países endêmicos. A enfermidade é
circunscrita à América Latina, onde se estima que a prevalência da infecção humana
é cerca de 18 milhões de casos e que cerca de 40 milhões de pessoas estão sob o
risco de infecção (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002).
No Brasil ainda existem cerca de 6 milhões de pessoas infectadas, com uma
prevalência estimada em 0,13%, segundo inquéritos sorológicos realizados entre
1989 e 1990 (FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 2002). Apesar de estar
declarado livre da transmissão vetorial, o Brasil apresentará este quadro por muitas
décadas. Isso decorre da característica crônica da enfermidade, e porque o risco da
infecção ainda permanece, através das transfusões de sangue contaminado, da
transmissão vertical, dos acidentes de laboratório e dos transplantes de órgãos
contaminados, além de transmissões esporádicas por via oral. Há também a
possibilidade do retorno da transmissão vetorial, já que o risco de reinfestação das
habitações rurais em nosso país é permanente (WORLD HEALTH ORGANIZATION,
2005).
Devido a pouca ou nenhuma expressão clínica que os indivíduos infectados
apresentam na fase aguda da infecção, e do longo período de latência observado na
fase crônica, há uma dificuldade de detecção destes indivíduos infectados e,
V
ERÇOSA
AFA A
SPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
,
CLÍNICOS E IMUNES DA DOENÇA DE
C
HAGAS
24
conseqüentemente, de introduzir o tratamento etiológico. Se iniciado na fase aguda
ou na fase crônica recente, o tratamento é mais eficaz, porém as percentagens de
cura ainda são divergentes (CANÇADO, 1985). Além disso, o seu potencial de cura
parasitológica é dependente do tipo de cepa albergada pelo hospedeiro (ANDRADE
et al., 1985). Já na fase crônica tardia, ainda faltam evidências concretas de
benefício pós-tratamento. Somando-se a isso ainda não existe uma vacina que
previna a doença.
2.2 Formas clínicas da doença de Chagas
Durante o curso da infecção chagásica, o indivíduo passa por uma fase
clínica aguda, que dura cerca de 2 a 4 meses. Se a infecção ocorrer por meio
natural, os indivíduos podem apresentar ou não os sinais de porta de entrada da
infecção, que são o sinal de Romaña e o chagoma de inoculação. Quando a clínica
é aparente, manifestações como febre, mal-estar, anorexia e cefaléia são
freqüentes. Além disso, manifestações sistêmicas como o edema localizado ou
generalizado, aumento de linfonodos, alterações exantemáticas, hepatomegalia,
esplenomegalia, manifestações nervosas, além de comprometimento cardíaco
podem ser observadas nesta fase (HUGGINS et al., 1996; PRATA, 2001).
No sangue circulante há uma elevada concentração de parasitos, que
confirmam o diagnóstico nesta fase (GOMES, 1996). Devido à inespecificidade dos
sintomas, o diagnóstico da infecção nesta fase torna-se raro (PRATA, 2001) e a
possibilidade de cura parasitológica com o uso de tratamento específico diminui.
Nesta fase, a mortalidade é baixa e assim, a maior parte dos indivíduos infectados
evolui para a fase crônica (PRATA, 2001).
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Na fase crônica, o indivíduo pode permanecer num período de latência pelo
restante da vida, não apresentando sinais e sintomas quaisquer, apenas
apresentando sorologia positiva para infecção pelo T. cruzi. Os indivíduos infectados
também podem vir apresentar, depois deste período de latência ou imediatamente
após a fase aguda, alterações em vários sistemas e órgãos, acometendo
predominantemente o coração, esôfago, cólon e sistema nervoso, o que vai
caracterizar as diferentes formas clínicas desta fase (ANDRADE, 1999; PRATA,
2001).
A forma clínica indeterminada, ou o período de latência, é caracterizada pela
ausência de alterações clínicas investigadas por eletrocardiograma, raios X
contrastado de esôfago e intestino grosso e raios X de coração, além da ausência
de sintomatologia, e por isso é considerada uma forma clínica de bom prognóstico,
pelo menos em médio prazo (5 a 10 anos). Entretanto, ao serem examinados com
mais profundidade, podem-se encontrar alterações cardíacas e/ou digestivas. Estas,
por serem também ocasionalmente encontradas em indivíduos saudáveis, não
possuem valor prognóstico definido (MACÊDO, 1999; MARIN-NETO et al., 2002;
OLIVEIRA JR, 1996; PRATA, 2001).
Apesar de ser considerada de bom prognóstico, esta forma clínica é de
grande interesse científico, visto que é nela que parece se decidir o destino do
chagásico, podendo este permanecer assintomático ou evoluir com alterações
cardíacas, digestivas ou nervosas (OLIVEIRA JR, 1996).
Cerca de 2% dos pacientes que apresentam a forma indeterminada evoluem
para a forma cardíaca a cada ano, gerando um contingente de cerca de 20-30% de
pacientes chagásicos com algum tipo de alteração cardíaca, seja ela estrutural ou
funcional (PRATA, 2001). Diversos são os sintomas encontrados na cardiopatia
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chagásica crônica, relacionados com quadros de insuficiência cardíaca, arritmias e
tromboembolismo, seu caráter fibrosante, considerado o mais expressivo dentre as
miocardites, além da morte súbita. Todo esse quadro torna esta forma clínica a mais
importante dentre as formas clínicas desta doença, não somente por sua alta
prevalência, mas principalmente por sua morbimortalidade (MALTA, 1996).
As manifestações digestivas acometem cerca de 15-20% dos pacientes
chagásicos, com taxa de incidência de 1,1% ao ano (CASTRO et al., 1994). Ocorrem
alterações da motilidade do tubo digestivo, acometendo principalmente o esôfago e
o cólon, podendo ter como evolução máxima da doença a formação do
megaesôfago e do megacólon. A sintomatologia apresentada pelos pacientes está
na dependência do órgão atingido (VASCONCELOS, 1996). Também pode haver o
acometimento de algum órgão do aparelho digestivo e do coração simultaneamente,
caracterizando a forma clínica mista da doença de Chagas (GOMES, 1993).
Menos freqüentemente há alterações no sistema nervoso, caracterizando a
forma clínica nervosa da doença (PRATA, 2001). Esta baixa freqüência deve-se ao
fato de ser difícil o encontro de alterações de motricidade, de coordenação, do
psiquismo, das manifestações de natureza compulsiva dentre a totalidade dos
indivíduos chagásicos. Porém, o comprometimento do sistema nervoso é a base da
etiopatogenia do megaesôfago e do megacólon (JARDIM, 1996).
2.3 O papel das imunoglobulinas na doença de Chagas
As imunoglobulinas ou anticorpos têm a propriedade de se ligarem
especificamente com o antígeno que induziu sua formação e então poder agir direta
ou indiretamente sobre este através de suas funções efetoras. Sendo assim, os
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anticopos podem neutralizar a invasão de organismos estranhos nas células do
hospedeiro, opsonizar os antígenos, facilitando a ação do sistema complemento e
promover a morte celular através das células natural killer (LAGES-SILVA, et al.,
1987; LIMA-MARTINS et al., 1985; SONG et al., 1990). Entretanto, os anticorpos
podem produzir um efeito indesejável no organismo se forem produzidos
autoanticorpos, anticorpos idiotípicos autoreativos e deposição de imunocomplexos.
Existem vários tipos de anticorpos presentes durante a infecção chagásica e
que podem desempenhar ou não algum papel na patogênese da doença: anticorpos
líticos, anticorpos da sorologia convencional, anticorpos idiotípicos, autoanticorpos e
os anticorpos naturais (GAZZINELLI et al., 1990; HERNÁNDEZ et al., 2003;
KRETTLI & BRENER, 1982).
Sabe-se que os anticorpos líticos podem mediar a lise das formas
tripomastigotas do T. cruzi, além de neutralizar estas formas evolutivas, impedindo,
assim, a infecção de novas células (KRETTLI & BRENER, 1976; 1982). Além disso,
também são responsáveis pela citotoxicidade celular dependente de anticorpo, visto
que apenas anticorpos líticos são capazes de mediar esta resposta (LIMA-MARTINS
et al., 1985). Estes achados sugerem um papel protetor para estas imunogobulinas
na resistência do hospedeiro contra o T. cruzi (KRETTLI & BRENER, 1982). Esta
hipótese foi corroborada em um estudo mais recente, desenvolvido por Cordeiro et
al. (2001), no qual os níveis destes anticorpos eram maiores nos pacientes que
apresentavam a forma IND, sendo baixos nos indivíduos portadores da forma CARD.
Os anticorpos da sorologia convencional não apresentam esta função
protetora (KRETTLI & BRENER, 1982), sendo amplamente utilizados para o
diagnóstico sorológico para infecção pelo T. cruzi. A detecção destes anticorpos
após tratamento etiológico gera discordâncias sobre a efetividade do tratamento.
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Isso ocorre porque o critério de cura atualmente estabelecido (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2005) refere que a cura só é confirmada após negativação sorológica,
porém a sorologia pode permanecer reagente até mesmo por décadas pós-
tratamento (CANÇADO, 1999).
O envolvimento dos anticorpos como mediadores da reatividade celular na
doença de Chagas humana foi sugerido pela demonstração de que anticorpos
idiotípicos anti-epimastigota, isolados de soro de pacientes chagásicos, podiam
ativar a proliferação celular in vitro (GAZZINELLI et al., 1990). Estes anticorpos
idiotípicos também apresentam características estimulatórias diferentes,
dependendo da forma clínica do paciente do qual eles foram isolados (REIS et al.,
1993). Alguns estudos evidenciaram a presença de anticorpos (autoanticorpos),
presentes em pacientes chagásicos e ausentes em indivíduos saudáveis ou com
outras patologias, que são específicos para proteínas próprias, e que podem explicar
algumas anormalidades funcionais nos órgãos acometidos durante o curso da
infecção pelo T. cruzi (HERNÁNDEZ et al., 2003; STERIN-BORDA et al., 2005).
Resíduos galactosil α1-3 galactose estão presentes em vários
microrganismos, patogênicos (AVILA et al., 1989) e não-patogênicos (GALILI et al.,
1988). Desta forma, indivíduos saudáveis e infectados produzem anticorpos naturais
frente a este estímulo antigênico, com maior produção nestes últimos (TOWBIN et
al., 1987). Na infecção chagásica estes anticorpos podem estar envolvidos na lise
dos parasitos (GOZÁLEZ et al., 1996; MILANI & TRAVASSOS, 1988). Esse estímulo
inespecífico, gerado pelos resíduos de carboidratos comuns entre agentes
patogênicos e não-patogênicos, faz com que persistam os resultados positivos
através da sorologia convencional após o tratamento etiológico dos pacientes
chagásicos (GAZZINELLI et al., 1988; 1993).
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Embora alguns achados científicos tenham sugerido que os anticorpos
possuem um papel na imunopatologia da doença de Chagas, ainda há uma
escassez de estudos que correlacionem a função dos anticorpos presentes com o
estado clínico dos pacientes.
2.4 Os antígenos recombinantes CRA e FRA de Trypanosoma cruzi
Em 1989, Lafaille et al. caracterizaram molecularmente dois genes de T. cruzi
que codificavam antígenos que possuíam uma estrutura de epítopos repetitivos. A
localização celular destes antígenos também foi investigada, resultando na
nomenclatura deles: um dos antígenos exibia uma estrutura de 14 aminoácidos que
se repetiam, localizado no citoplasma das formas epimastigotas e amastigotas,
recebendo o nome de Cytoplasmic Repetitive Antigen (CRA); o outro, com uma
estrutura de 68 aminoácidos que se repetiam, localizado na região do flagelo
adjacente ao corpo das formas epimastigota e tripomastigota recebeu o nome de
Flagellar Repetitive Antigen (FRA).
Posteriormente, Krieger et al. (1990) verificaram que os genes que codificam
estes dois antígenos são altamente polimórficos em diferentes cepas de T. cruzi.
Embora polimórficos, estes antígenos são reconhecidos por soros de pacientes
chagásicos (GOLDENBERG et al., 1991), e uma mistura de CRA e FRA foi proposta
como reagente de diagnóstico da doença de Chagas (KRIEGER et al., 1992).
A partir destes estudos foi produzido um kit de diagnóstico sorológico para a
infecção pelo T. cruzi, o EIE-Recombinante-Chagas-Biomanguinhos
(Bio-
Manguinhos), que utiliza os Ags-Recs CRA e FRA em associação, produzidos
através da tecnologia do DNA recombinante. Este kit foi bastante explorado no
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sentido de detectar a infecção pelo T. cruzi em indivíduos chagásicos de área
endêmica (GOMES et al., 2001), na triagem sorológica em bancos de sangue
(GADELHA et al., 2003) e na avaliação da cura parasitológica após tratamento
etiológico (SILVA et al., 2002), demonstrando ótima performance como teste de
diagnóstico e de triagem sorológica da doença de Chagas, e como triagem inicial
para avaliar a cura de pacientes chagásicos tratados etiologicamente.
Os Ags-Recs CRA e FRA também foram bastante estudados com relação às
respostas imunes geradas experimentalmente em camundongos, e seu efeito
protetor, com a proposta de avaliar seu potencial imunogênico para vacinação
(PEREIRA et al., 2003a, 2003b).
Ambos Ags-Recs são capazes de gerar uma resposta imune humoral, em
camundongos, após imunização. Os principais isotipos detectados após imunização
foram IgG1 e IgG3 para CRA e IgG1 para FRA, sugerindo que estes isotipos
poderiam estar relacionados com um efeito protetor em camundongos, ajudando a
controlar a parasitemia após desafio (PEREIRA et al., 2003a). Posteriormente,
verificou-se que, apesar de presentes, estes isotipos não foram capazes de controlar
a infecção pelo T. cruzi, embora tenham aumentado o tempo de sobrevida dos
camundongos desafiados (PEREIRA et al., 2005).
Resposta imune celular específica também é gerada em camundongos após
imunização (PEREIRA et al., 2003b, 2004, 2005), induzindo uma resposta protetora
do tipo Th1 (PEREIRA et al., 2004), porém sem ser capaz de controlar a infecção
pelo T. cruzi, embora também tenham aumentado o tempo de sobrevida dos
camundongos desafiados (PEREIRA et al., 2005).
Um estudo piloto já foi conduzido por Pereira et al. (2002), avaliando o
potencial destes antígenos para detectarem citocinas como marcadores biológicos
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da evolução das formas clínicas da doença de Chagas. Neste estudo, os Ags-Recs
CRA e FRA foram capazes de estimular PBMC de pacientes chagásicos a produzir
determinado padrão de citocinas intracitoplasmáticas avaliadas através de citometria
de fluxo. Os resultados obtidos mostraram que FRA estimulou PBMC de pacientes
com a forma CARD a produzirem IFN-γ e TNF-α e, CRA estimulou a produção de IL-
10 por indivíduos portadores da forma IND da doença, sugerindo que os Ags-Recs,
juntos, poderiam identificar distintos perfis de citocinas entre os indivíduos
chagásicos portadores das diferentes formas clínicas crônicas da doença.
Com relação ao perfil isotípico detectado em indivíduos chagásicos, frente
aos Ags-Recs CRA e FRA, nenhum estudo foi realizado até o momento. Sabe-se
que anticorpos específicos para estes antígenos são produzidos por indivíduos
chagásicos, como foi visto nos vários estudos realizados (GADELHA et al., 2003;
GOMES et al., 2001). Porém, os isotipos que se destacam no reconhecimento
destes antígenos, durante a infecção chagásica não são conhecidos.
2.5 Perfil isotípico
A comunidade científica que estuda os aspectos relacionados à imunidade
humoral vem realizando seu trabalho através das várias técnicas imunológicas
existentes, principalmente por meio do ELISA, da imunofluorescência indireta e da
hemaglutinação. Os antígenos de T. cruzi utilizados para a avaliação das respostas
imunes são variados. Atualmente a utilização de antígenos puros e específicos do
parasita tem sido proposta para tal fim, porém vários estudos se apóiam em
resultados obtidos com antígenos complexos do parasito.
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Utilizando antígenos complexos de T. cruzi, Primavera et al. (1988, 1990)
sugerem que a presença de anticorpos IgA específicos para a forma evolutiva
amastigota do parasita está relacionada com o risco de progressão da doença com o
desenvolvimento da forma DIG, em ambos pacientes portadores das formas IND e
CARD. Morgan et al. (1996) demonstraram a associação entre os anticorpos IgA
anti-epimastigota e a forma clínica DIG, mas não estabeleceu nenhum risco de
progressão da doença para esta forma clínica. Este resultado difere do previamente
obtido por Primavera et al. (1990), que obtiveram repostas inespecíficas desta
imunoglobulina associada à forma epimastigota.
A descoberta dos anticorpos líticos em camundongos, que possuem função
protetora, por Krettli e Brener (1976, 1982), levaram Cordeiro et al. (2001) a
realizarem um estudo com a forma tripomastigota sanguínea viva, para avaliar os
isotipos protetores presentes nos pacientes chagásicos. Estes autores conseguiram
então demonstrar que o anticorpo lítico do isotipo IgG1 poderia ser utilizado para
monitorar a progressão da doença de Chagas crônica, com o início de danos
cardíacos, nos indivíduos com a forma IND.
Entretanto outros autores realizaram seus estudos utilizando antígenos
purificados de T. cruzi, a fim de encontrar respostas anticórpicas mais específicas.
Verificaram que o padrão de reconhecimento antigênico é bastante variável para as
diferentes manifestações clínicas. A maioria não associou nenhum antígeno
purificado ao risco de progressão da doença crônica (CERBAN et al., 1993; LORCA
et al., 1992). Posteriormente, Aznar et al. (1995) demonstraram que o peptídeo R-13
induzia uma resposta imune humoral apenas em pacientes portadores da forma
CARD, em comparação com pacientes portadores das formas DIG e IND da doença
de Chagas.
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Duschak et al. (2001) e Laucella et al. (1996) demonstraram que o
monitoramento dos níveis de anticorpos monoclonais 5A9B11 seriam úteis para
acompanhar a evolução da doença de Chagas crônica. Estes anticorpos possuem
estreita relação com a resposta imune humoral anti-cruzipaína e a gravidade da
doença. O monitoramento da resposta imune humoral de pacientes chagásicos com
a forma CARD foi realizado por Zauza e Borges-Pereira (2001) durante um período
de 10 anos. Por meio deste estudo, os autores verificaram que a progressão da
cardiopatia chagásica crônica possui uma correlação positiva com o aumento dos
títulos de IgG total para antígenos complexos de T. cruzi.
Também foi encontrado maiores níveis de IgM em pacientes portadores da
forma CARD em comparação com pacientes portadores da forma IND, associando
este resultado à hipótese da autoimunidade presente na doença de Chagas
(MORGAN et al., 1996). Esta imunoglobulina é característica da fase aguda da
doença de Chagas (UMEZAWA et al., 1996), porém ela também está presente na
fase crônica, em virtude das alterações antigênicas na superfície do T. cruzi que
ocorrem nesta fase (MAGNANI et al., 1973).
Entretanto, alguns autores não encontraram nenhuma associação entre a
resposta imune humoral e o risco de progressão da doença nos pacientes com as
diferentes manifestações clínicas com graus variáveis de comprometimento,
utilizando tanto os antígenos complexos do parasito (GUSMÃO et al., 1982) como
antígenos purificados (MICHAILOWSKY et al., 2003) de T. cruzi.
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ATERIAIS E MÉTODOS
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ETODOLOGIA
Para determinarmos o perfil isotípico de pacientes chagásicos crônicos
apresentando as formas clínicas IND, CARD e MIS, frente aos Ags-Recs CRA e FRA
de T. cruzi, realizamos várias etapas, que serão descritas a seguir:
3.1 Análise da pureza e integridade dos Ags-Recs CRA e FRA
Os Ags-Recs CRA e FRA, obtidos como descrito por Krieger et al. (1992),
foram preparados no Laboratório de Reativos do Instituto de Tecnologia em
Imunobiológicos (Bio-Manguinhos) da Fiocruz e enviados para o Laboratório de
Imunoparasitologia do CPqAM/Fiocruz em condições apropriadas.
Para obtenção de uma resposta imune humoral específica para os Ags-Recs
em questão, através de ELISA, é necessário que eles estejam íntegros quanto à sua
estrutura molecular e livres de contaminação por proteínas e carboidratos. A
verificação da pureza e integridade dos Ags-Recs foi feita através de uma
eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE),
seguida de colorações específicas para proteínas e carboidratos.
3.1.1 SDS-PAGE
A eletroforese uni-dimensional em gel de uma proteína fornece informações
sobre o tamanho molecular e a pureza dela. A adição de um agente redutor, como o
dodecil sulfato de sódio (SDS), ainda permite determinar o número e o tamanho das
subunidades de uma proteína pura.
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36
O método de Laemmli (1970), no qual é realizada uma eletroforese em gel
descontínuo sob condições de desnaturação, foi utilizado para analisar os Ags-Recs
CRA e FRA. Neste método, as proteínas são separadas de acordo com seu
tamanho molecular.
Sumariamente, os Ags-Recs foram submetidos à desnaturação na presença
de SDS, a uma temperatura de 100°C, por 3min. Em se guida, dois géis foram
preparados para serem, posteriormente, corados pela prata e pelo Ácido Periódico
de Schiff. As concentrações de acrilamida dos géis de “empilhamento” e de “corrida”
foram de 4,5% e 10%, respectivamente. Alíquotas dos Ags-Recs CRA (5µg) e FRA
(3µg), previamente desnaturados, foram submetidas à SDS-PAGE, junto com o peso
molecular (PM) (SIGMA, St. Louis, MO). Inicialmente, o gel foi submetido a uma
corrente constante de 10mA, até que o tampão da amostra penetrasse no gel de
corrida. Neste momento, a corrente foi aumentada para 15mA. A voltagem foi
mantida aberta durante toda a corrida eletroforética. A eletroforese teve fim quando
o tampão da amostra chegou ao final do gel de corrida.
3.1.2 Coloração pela prata
Terminada a corrida eletroforética, um dos géis foi submetido à coloração pela
prata, de acordo com Morrisey (1981). Esta coloração permite localizar as bandas de
proteínas no gel, onde a prata se liga a vários grupos químicos (p. ex. sulfidrila e
carboxila), com um limite de detecção de 2 a 5ng por banda de proteína.
Sumariamente, o gel foi fixado em três soluções: metanol a 50% contendo
ácido acético a 10%, seguido de outra fixação em metanol a 5% contendo ácido
acético 7% e por fim, fixado em glutaraldeído a 10%, durante 30 min em cada uma
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das soluções. Em seguida, foram realizadas várias lavagens com água destilada,
durante 2h. O gel foi, então, tratado com ditiotreitol, a uma concentração de 5µg/mL,
durante 30min. Após uma rápida lavagem com água destilada, o gel foi embebido
em uma solução contendo nitrato de prata a uma concentração de 0,1%, durante
30min protegido da luz. Em seguida, após descartar a solução contendo a prata,
adicionou-se a solução de revelação, composta por 50µl de formaldeído a 37% em
100mL de carbonato de sódio a 3%. O gel ficou embebido nesta solução até haver a
precipitação da prata, com aparecimento das bandas de proteína. Neste momento a
reação foi bloqueada com 5mL uma solução de ácido cítrico 2,3M durante 10min. O
gel foi então lavado com água destilada e fotografado.
3.1.3 Coloração pelo Ácido Periódico de Schiff
O outro gel foi submetido à coloração pelo Ácido Periódico de Schiff (APS)
(JANN, et al., 1975) a fim de verificar a presença de carboidratos contaminantes.
O ácido periódico tem a capacidade de oxidar os grupamentos glicol dos
carboidratos, transformando-os em grupamentos aldeído. A fucsina básica presente
no reativo de Schiff forma um complexo com os grupamentos aldeídos formados,
produzindo um composto insolúvel vermelho.
Sumariamente, o gel foi fixado em ácido acético glacial a 7,5% durante 1h a
temperatura ambiente (TA), seguido de uma incubação com solução aquosa de
ácido periódico a 0,2%, durante 45min a 4°C. Após e sta incubação, a solução foi
desprezada e o gel foi incubado, durante 45min a 4°C, protegido da luz, com o
reativo de Schiff. O gel foi então lavado com ácido acético glacial a 10% para
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aparecimento das bandas e posteriormente fotografado. O controle positivo utilizado
neste gel foi uma glicoproteína (IgG2a).
3.2 População do estudo
3.2.1 Local de seleção dos pacientes chagásicos e indivíduos saudáveis
Os pacientes chagásicos foram selecionados no Ambulatório de Doença de
Chagas do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco (HC-
UFPE) e do Hospital Universitário Oswaldo Cruz da Universidade de Pernambuco
(HUOC-UPE), ambos situados na cidade de Recife-PE. Os indivíduos saudáveis
foram selecionados na Região Metropolitana do Recife-PE.
O Hospital das Clínicas-HC da UFPE é uma instituição vinculada ao Ministério
da Educação, com função básica de apoiar o ensino de graduação e pós-graduação
do Centro de Ciências da Saúde, atuando como hospital-escola e centro de
pesquisa científica em todas as áreas da medicina, orientando operacionalmente
para três focos básicos, a saber: ensino, pesquisa e extensão voltada a assistência
à população, desempenhando importante papel como Hospital Referencial da
Região.
O ambulatório de doença Chagas do HUOC-UPE é referência no estado de
Pernambuco para o Nordeste, com mais de 2000 pacientes cadastrados e uma
média de 1200 consultas por mês, procurando dar atenção integral ao paciente, não
apenas com ações de tratamento, mas com o enfoque biopsicossocial.
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3.2.2 Critérios de seleção dos pacientes chagásicos e indivíduos saudáveis
Para uma caracterização isotípica fidedigna, tivemos que selecionar pacientes
chagásicos que apresentassem as formas clínicas CARD, DIG, MIS e IND bem
definidas e que não receberam o tratamento etiológico para infecção pelo T. cruzi.
Esta seleção foi realizada por médicos dos ambulatórios de doença de Chagas do
HC-UFPE e HUOC-UPE, com experiência no atendimento ao paciente chagásico.
Os pacientes chagásicos foram submetidos a exames clínico-laboratoriais que
compreendiam: exame físico, raios X contrastado de esôfago, raios X de tórax,
eletrocardiograma e sorologia para infecção pelo T. cruzi.
Foram categorizados como pacientes portadores de cardiopatia chagásica
crônica aqueles que apresentaram alguma alteração no eletrocardiograma e/ou
dilatação do coração, com ausência de dilatação do esôfago e/ou sem
sintomatologia digestiva alta e baixa, e apresentando sorologia positiva para
infecção pelo T. cruzi.
Foram categorizados como pacientes portadores da forma DIG aqueles que
apresentaram sintomatologia digestiva característica da fase crônica da doença de
Chagas, comprovados através de raios X contrastado de esôfago, com
megaesôfago e/ou megacólon, tratados cirurgicamente ou não, e apresentando
sorologia positiva para infecção pelo T. cruzi.
Foram categorizados como pacientes portadores da forma MIS, aqueles que,
além das evidências encontradas para os portadores da cardiopatia chagásica
crônica, também apresentaram megaesôfago e/ou megacólon, tratados
cirurgicamente ou não, e apresentando sorologia positiva para infecção pelo T. cruzi.
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Foram categorizados como pacientes portadores da forma IND aqueles que
não apresentaram nenhuma das alteraçãoes descritas para a forma CARD e DIG, e
apresentaram sorologia positiva para infecção pelo T. cruzi.
Foram considerados indivíduos saudáveis aqueles que apresentaram
sorologia negativa para infecção pelo T. cruzi em dois testes sorológicos, nunca
receberam transfusão de sangue e nem habitaram em área endêmica.
3.2.3 População selecionada
De acordo com os critérios acima estabelecidos, foram selecionados 65
pacientes chagásicos, com idades variando entre 22 e 82 anos dos quais 35
apresentavam a forma CARD, 2 a forma DIG, 7 a forma MIS e 21 a forma IND.
Também foram selecionados 40 indivíduos saudáveis, com idades entre 19 e
58 anos, dos quais 20 foram utilizados como grupo de indivíduos não-chagásicos
(NC) para comparação com os grupos de indivíduos chagásicos, e os outros 20
foram utilizados para estabelecimento do ponto de corte ou cut-off (CO) (ver seções
3.6.1 a 3.6.3).
3.3 Aspectos éticos
Os pacientes chagásicos e indivíduos saudáveis envolvidos neste estudo
tiveram participação voluntária, assinando o “Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido” (Apêndice A) e responderam a um formulário de pesquisa (Apêndice B).
A conduta de inclusão dos mesmos e os protocolos experimentais foram aprovados
pelo Comitê de Ética em Pesquisa do CPqAM/Fiocruz (Anexo A).
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3.4 Coleta das amostras
A coleta das amostras foi realizada no Ambulatório de Doença de Chagas do
HUOC-UPE e no Ambulatório do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães
(CPqAM/Fiocruz), seguindo as normas de biossegurança.
Cinco mililitros de sangue foram coletados pelo sistema a vácuo, Vacutainer
.
O sangue foi deixado à TA até sua completa coagulação, seguido de uma
centrifugação a 1500xg por 10min. O soro assim obtido foi aliquotado e armazenado
a –20°C. Todas as amostras foram processadas no Lab oratório de
Imunoparasitologia do Departamento de Imunologia do CPqAM e incorporadas à
soroteca do mesmo.
3.5 Diagnóstico etiológico
Segundo o Ministério da Saúde (2005), é considerado indivíduo portador da
doença de chagas crônica aquele que apresente poisitividade sorológica para IgG
em pelo menos dois testes sorológicos de metodologias diferentes ou, quando da
mesma metodologia, que os testes apresentem preparações antigênicas diferentes.
Como já havíamos selecionado pacientes com pelo menos uma sorologia
positiva, utilizamos o kit EIE-Chagas-Biomanguinhos
(lote 054CE002Z), produzido
por Bio-Manguinhos/Fiocruz, seguindo a orientação do fabricante, para confirmar a
infecção pelo T. cruzi.
A ausência da infecção pelo T. cruzi nos indivíduos saudáveis foi confirmada
pelos kits Premier Chagas’ IgG ELISA (Lote TCE100.011) da empresa Meridian
V
ERÇOSA
AFA M
ATERIAIS E MÉTODOS
42
Diagnostics, Inc., e pelo kit EIE-Recombinante-Chagas-Biomanguinhos
(Lote
014CR001Z ), produzido por Bio-Manguinhos.
3.6 Determinação do perfil isotípico
Para determinarmos o perfil isotípico dos pacientes chagásicos, utilizamos a
metodologia de ELISA indireto. Esta metodologia, introduzida em 1971 por Engvall e
Perlmann, é hoje amplamente utilizada em uma variedade de ensaios, avaliando
diferentes antígenos e anticorpos, em diferentes áreas da ciência (KEMENY, 1992;
VENKATESAN & WAKELIN, 1993).
Inicialmente, padronizamos as concentrações ótimas dos Ags-Recs CRA e
FRA, seguida das padronizações das diluições dos anti-isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e
IgG4 para cada Ag-Rec.
3.6.1 Padronização das concentrações dos Ags-Recs
Para determinarmos a concentração ideal dos Ags-Recs CRA e FRA, foram
feitas diluições seriadas com fator 2 dos mesmos, partindo de 5µg/mL até
0,625µg/mL. Sete soros de pacientes chagásicos e três soros de indivíduos
saudáveis foram utilizados. A imunoglobulina anti-IgG total conjugada à biotina
(SIGMA, St. Louis, MO) foi diluída 1:40000. O CO foi estabelecido para cada placa
calculando-se a média das densidades ópiticas (DOs) dos indivíduos saudáveis
adicionada de dois desvios-padrão (DP).
Foi escolhida a concentração de Ag-Rec que apresentou maiores DOs para
os pacientes chagásicos e menor CO, levando-se também em consideração os
V
ERÇOSA
AFA M
ATERIAIS E MÉTODOS
43
custos. Desta forma, para o Ag-Rec CRA, a concentração ideal foi de 5µg/mL
(Figura 1A), e para o Ag-Rec FRA foi de 2,5µg/mL (Figura 1B).
0,625ug/mL 1,25ug/mL 2,5ug/mL 5,0ug/mL
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
CRA
DO(490nm)
0,625ug/mL 1,25ug/mL 2,5ug/mL 5,0ug/mL
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
FRA
DO(490nm)
F
IGURA
1 – Padronização das concentrações dos Ags-Recs CRA e FRA. O eixo das ordenadas
apresenta as densidades ópticas das amostras a 490nm. As barras horizontais representam o cut-off.
*
= concentração escolhida. DO= densidade óptica.
3.6.2 Padronização das diluições dos anti-isotipos
Para determinarmos as diluições dos anti-isotipos de IgG para os Ags-Recs
CRA e FRA, foram utilizados placas de ELISA sensibilizadas com CRA ou FRA nas
concentrações de 5µg/mL e 2,5µg/mL, respectivamente. As imunoglobulinas anti-
IgG1, anti-IgG2, anti-IgG3 e anti-IgG4 (SIGMA, St. Louis, MO) foram diluídas em
série com fator 2, partindo de 1:1000 até 1:8000. Sete soros de pacientes
chagásicos e três soros de indivíduos saudáveis foram utilizados.
Foi escolhida a diluição de cada isotipo que apresentou maiores DOs para os
pacientes chagásicos e menor CO, levando-se também em consideração os custos.
Desta forma, para o Ag-Rec CRA, a diluição da imunoglobulina anti-IgG1 foi de
1:4000 (Figura 2A), a da anti-IgG2 foi de 1:2000 (Figura 2B), a da anti-IgG3 foi de
1:4000 (Figura 2C) e a da anti-IgG4 foi de 1:4000 (Figura 2D). Para o Ag-Rec FRA,
*
*
A) B)
V
ERÇOSA
AFA M
ATERIAIS E MÉTODOS
44
a diluição da anti-IgG1 foi de 1:8000 (Figura 3A), a da anti-IgG2 foi de 1:1000 (Figura
3B), a da anti-IgG3 foi de 1:1000 (Figura 3C) e a da anti-IgG4 foi de 1:4000 (Figura
3D).
1:8000 1:4000 1:2000 1:1000
0.0
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
IgG1
DO(490nm)
1:8000 1:4000 1:2000 1:1000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
IgG2
DO(490nm)
1:8000 1:4000 1:2000 1:1000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
IgG3
DO(490nm)
1:8000 1:4000 1:2000 1:1000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
IgG4
DO(490nm)
F
IGURA
2 – Padronização das diluições dos anti-isotipos de IgG para o Ag-Rec CRA. O eixo das
ordenadas apresenta as densidades ópticas das amostras a 490nm. As barras horizontais
representam o cut-off
. *
= concentração escolhida. DO= densidade óptica.
A) B)
*
C) D)
*
*
*
V
ERÇOSA
AFA M
ATERIAIS E MÉTODOS
45
1:8000 1:4000 1:2000 1:1000
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
IgG1
DO(490nm)
1:8000 1:4000 1:2000 1:1000
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
IgG2
DO(490nm)
1:8000 1:4000 1:2000 1:1000
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
IgG3
DO(490nm)
1:8000 1:4000 1:2000 1:1000
0.0
0.1
0.2
0.3
IgG4
DO(490nm)
F
IGURA
3 – Padronização das diluições dos anti-isotipos de IgG para o Ag-Rec FRA. O eixo das
ordenadas apresenta as densidades ópticas das amostras a 490nm. As barras horizontais
representam o cut-off
. *
= concentração escolhida. DO= densidade óptica.
3.6.3 Determinação do perfil isotípico contra os Ags-Recs CRA ou FRA
Placas de ELISA (Nunc-Immuno Plates, MaxiSorp, 96 poços, Nalge Nunc
International Corporation) foram sensibilizadas com os Ags-Recs CRA ou FRA nas
concentrações de 5 e 2,5µg/mL (100µL/poço), respectivamente, diluídos em tampão
carbonato-bicarbonato 0,05M pH 9,6 e incubadas “overnight” a 4°C. As placas foram
lavadas 3 vezes com 200µL de Phosphate-buffered saline (PBS) 0,157M contendo
Tween 20 (Tw) a 0,05% (PBS-Tw) (SIGMA, St. Louis, MO) e os sítios inespecíficos
presentes nos poços foram bloqueados com 200µL de PBS-Tw contendo 1% de
albumina sérica bovina (BSA) (SIGMA, St. Louis, MO) durante 4h à TA. Após o
A) B)
C) D)
*
*
*
*
V
ERÇOSA
AFA M
ATERIAIS E MÉTODOS
46
bloqueio, uma nova etapa de lavagem foi realizada. Em seguida, os soros foram
diluídos em PBS-Tw a 1:100 e 100µL foram depositados em duplicata nos poços,
sendo posteriormente incubados “overnight” a 4
o
C. No dia seguinte, as placas foram
lavadas como descrito anteriormente e a ligação dos anticorpos específicos foi
detectada pela incubação (TA durante 1h30min) de 100µL dos anti-isotipos (anti-
IgG1, anti-IgG2, anti-IgG3 e anti-IgG4) conjugados à biotina (SIGMA, St. Louis, MO),
diluídos em PBS-Tw contendo 0,1% de BSA nas diluições previamente
estabelecidas, e incubadas à TA durante 1h30min. Após nova lavagem, as placas
foram incubadas à TA durante 1h com 100µL estreptavidina conjugada à peroxidase
(Pharmingen, San Jose, CA), diluída em PBS-Tw a 1:3000. Após a etapa de
lavagem, a reação foi revelada pela adição de ortofenilenodiamina (0,01%) (SIGMA,
St. Louis, MO) mais peróxido de hidrogênio (0,01%) (VETEC, Rio de Janeiro, RJ),
diluídos em tampão citrato-fosfato 0,077M, pH 5,0. A reação foi bloqueada pela
adição de 100µL de ácido sulfúrico 2,5M. A quantificação da reação foi determinada
através do leitor de ELISA (BIO-RAD 3550) a 490 nm.
O CO foi estabelecido para cada placa calculando-se a média das DOs dos
indivíduos saudáveis adicionada de dois desvios-padrão. Os resultados foram
expressos na forma de índice de reatividade, de acordo com Pereira-Chioccola et al.
(2003), onde os valores das médias das DOs das amostras foram divididas pelo CO
de sua respectiva placa, a fim de tornar comparáveis os resultados das diferentes
placas.
V
ERÇOSA
AFA M
ATERIAIS E MÉTODOS
47
3.7 Análise estatística
Foi utilizado o programa Statistical Package for Social Sciences Incorporation,
US versão 8 (SPSS) para análise dos resultados. O teste de normalidade
Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para verificar se os índices calculados para cada
isotipo apresentavam distribuição normal. Os testes não-paramétricos Mann-Whitney
e Wilcoxon foram utilizados para avaliar as diferenças entre os índices calculados
para cada amostra.
Os gráficos foram construídos utilizando-se o programa Graphpad Prism
versão 3.0.
A diferença entre os resultados obtidos foi considerada significativa quando
p<0,05.
R
ESULTADOS
V
ERÇOSA
AFA R
ESULTADOS
49
4 R
ESULTADOS
4.1 Análise da pureza dos Ags-Recs CRA e FRA
Para termos certeza de que a resposta imune humoral para os antígenos em
questão foi específica, foi realizada uma SDS-PAGE dos Ags-Recs, seguida de
colorações específicas para proteínas e carboidratos.
4.1.1 Coloração pela prata
A pureza e a integridade dos Ags-Recs CRA e FRA foram avaliadas após a
eletroforese através de um gel de poliacrilamida a 10%, contendo SDS, e
posteriormente corado pela prata (Figura 4).
Através deste gel podemos observar que o Ag-Rec CRA tem um peso
molecular de 50kDa e o FRA tem 30kDa (PEREIRA et al., 2004), indicando a não-
contaminação por proteínas derivadas da Escherichia coli, bactéria onde os Ags-
Recs são produzidos. Além disso, também se pode observar que os Ags-Recs estão
bem conservados, visto que não há degradação dos mesmos.
V
ERÇOSA
AFA R
ESULTADOS
50
(Pereira et al., 2004)
F
IGURA
4- SDS-PAGE dos Ags-Recs CRA e FRA de Trypanosoma cruzi purificados através de
cromatografia de metal quelado, corado pela prata. PM = peso molecular em kilo Daltons (kDa)
(fosforilase b -94, albumina sérica bovina - 67, ovalbumina - 43, anidrase carbônica - 30, inibidor
tríptico de soja - 20,1, e α-lactalbumina - 14,4). Em cada poço foram depositados 5µg e 3µg de CRA e
FRA, respectivamente. CRA= Cytoplasmic Repetitive Antigen; FRA= Flagellar Repetitive Antigen.
4.1.2 Coloração pelo Ácido Periódico de Schiff
O gel corado pelo APS (Figura 5) não mostrou contaminação por carboidrato,
pois nenhuma banda foi visualizada nas preparações contendo CRA ou FRA. As
bandas de 55 e 22 kDa referentes à glicoproteína IgG2a, utilizada para controle
positivo da reação, garantiu a confiabilidade da coloração pelo APS.
Visto que os Ags-Recs mostraram-se livres de contaminação, seja por
proteínas ou carboidratos, e também íntegros quanto à sua estrutura molecular, eles
poderão ser utilizados no ELISA para detecção dos isotipos de IgG produzidos por
pacientes chagásicos frente a estes Ags-Recs.
50 kDa
30 kDa
94 kDa
67 kDa
43 kDa
30 kDa
PM CRA FRA
20,1 kDa
14,4 kDa
V
ERÇOSA
AFA R
ESULTADOS
51
PM IgG2a CRA FRA
F
IGURA
5 – SDS-PAGE dos Ags-Recs CRA e FRA de Trypanosoma cruzi e da glicoproteína IgG2a de
camundongo, corado pelo Ácido Periódico de Schiff. PM = peso molecular em kilo Daltons (kDa)
(fosforilase b - 94, albumina sérica bovina - 67, ovalbumina - 43, anidrase carbônica - 30, inibidor
tríptico de soja - 20,1, e α-lactalbumina - 14,4). Em cada poço foram depositados 5 µg, 3 µg e 5 µg de
IgG2a de camundongo, FRA e CRA, respectivamente. CRA= Cytoplasmic Repetitive Antigen; FRA=
Flagellar Repetitive Antigen.
4.2 Diagnóstico etiológico
Foi utilizado o kit EIE-Chagas-Biomanguinhos (Bio-Manguinhos) para
confirmar o diagnóstico etiológico dos 65 pacientes chagásicos previamente
selecionados. Sessenta e dois pacientes chagásicos apresentaram reatividade para
anticorpos anti-T. cruzi, sendo, então, incluídos no estudo de determinação do perfil
isotípico das imunoglobulinas frente aos Ags-Recs CRA e FRA de T. cruzi. Foram
eliminados 3 pacientes que apresentaram reação negativa neste teste, sendo 1 da
forma IND e 2 da forma CARD.
94 kDa
67 kDa
43 kDa
30 kDa
20,1 kDa
14,4 kDa
55 kDa
22 kDa
V
ERÇOSA
AFA R
ESULTADOS
52
A ausência da infecção pelo T. cruzi nos 40 indivíduos saudáveis,
previamente selecionados, foi confirmada pelos kits Premier Chagas’ IgG ELISA
(Meridian Diagnostics, Inc.), e pelo kit EIE-Recombinante-Chagas-Biomanguinhos
(Bio-Manguinhos), sendo todos incluídos no estudo.
4.3 Avaliação das subclasses de IgG
Nas próximas seções iremos descrever os resultados que obtivemos a partir
dos ELISAs que foram realizados com 60 amostras de soro de pacientes chagásicos
distribuídos entre as formas clínicas CARD, MIS e IND e com 20 amostras de
indivíduos NC.
Em virtude do tamanho amostral do grupo de pacientes chagásicos
portadores da forma DIG, estes não foram incluídos no estudo, visto que não foi
possível analisar estatisticamente os resultados obtidos.
Foram construídos gráficos a fim de facilitar a visualização dos resultados
descritos no texto. Eles apresentam os resultados dos índices de reatividade de
todas as amostras analisadas para cada isotipo, frente aos Ags-Recs CRA e FRA.
4.3.1 Análise das subclasses de IgG em pacientes chagásicos portadores das
diferentes formas clínicas utilizando o Ag-Rec CRA
Analisando, de uma forma geral, a resposta imune humoral gerada por
pacientes chagásicos portadores de diferentes formas clínicas, frente ao Ag-Rec
CRA, verificamos que diversos isotipos de IgG são produzidos em resposta à
presença deste Ag, com variados índices de reatividade para cada isotipo nas
diferentes manifestações clínicas da doença de Chagas (Figuras de 6 a 8).
V
ERÇOSA
AFA R
ESULTADOS
53
Pacientes chagásicos portadores da forma CARD puderam ser diferenciados
dos indivíduos NC através dos isotipos IgG1, IgG2 e IgG3 específicos para o Ag-
Rec CRA, visto que os índices de reatividade destes pacientes foram
significativamente superiores aos dos indivíduos NC. Dentre esses três isotipos,
IgG1 apresentou, significativamente, os maiores índices de reatividade comparados
aos dos outros isotipos (IgG1 vs IgG2, p< 0,001; vs IgG3, p=0,05; vs IgG4, p<
0,001), sendo a principal subclasse de IgG produzida frente ao Ag-Rec CRA,
nestes pacientes. Secundariamente, o isotipo IgG3 apresenta, significativamente,
índices de reatividade superiores aos do isotipo IgG2 (p= 0,024). O isotipo IgG4
apresenta os menores índices, não podendo ser diferenciado dos índices dos
indivíduos NC (Figura 6).
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
0
2
4
6
8
10
12
<0,001
0,048
0,013
Indivíduos
não-chagásicos (n=20)
Pacientes
chagásicos (n=33)
DO (490nm)/CO
F
IGURA
6 – Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes chagásicos crônicos
portadores da forma CARD, frente ao Ag-Rec CRA. O eixo das ordenadas apresenta os índices de
reatividade, resultantes da divisão entre a média de densidade óptica de cada amostra pelo cut-off.
Os símbolos representam os índices de reatividade de cada amostra. Estão destacados os p-valores
dos índices que apresentaram diferença significativa (p< 0,05). † = isotipo que apresenta os maiores
índices de reatividade. ‡= isotipo que apresenta os segundos maiores índices de reatividade. CO=
cut-off; DO= densidade óptica.
†
‡
V
ERÇOSA
AFA R
ESULTADOS
54
Pacientes portadores da forma MIS puderam ser diferenciados dos indivíduos
NC através dos isotipos IgG1 e IgG3, visto que seus índices de reatividade foram
significativamente superiores aos dos indivíduos NC. Na resposta imune humoral
gerada por esses pacientes frente ao Ag-Rec CRA, não houve diferença
estatisticamente significativa entre a produção destes dois isotipos (p= 0,735). Os
índices de reatividade dos isotipos IgG2 e IgG4 foram baixos o suficiente para não
diferenciá-los dos índices dos indivíduos NC (Figura 7).
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
0
3
6
9
12
15
<0,001
0,017
Pacientes
chagásicos (n= 7)
Indivíduos
não-chagásicos (n=20)
DO (490nm)/CO
F
IGURA
7 – Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes chagásicos crônicos
portadores da forma MIS, frente ao Ag-Rec CRA. O eixo das ordenadas apresenta os índices de
reatividade, resultantes da divisão entre a média de densidade óptica de cada amostra pelo cut-off.
Os símbolos representam os índices de reatividade de cada amostra. Estão destacados os p-valores
dos índices que apresentaram diferença significativa (p< 0,05). CO= cut-off; DO= densidade óptica.
Com relação aos pacientes portadores da forma IND, apenas o isotipo IgG1
foi capaz de diferenciá-los dos indivíduos NC, visto que seus índices de reatividade
foram significativamente superiores aos dos indivíduos NC. Todos os outros
V
ERÇOSA
AFA R
ESULTADOS
55
isotipos apresentaram índices de reatividade comparáveis aos dos indivíduos NC,
não podendo, portanto, serem distinguidos destes (Figura 8).
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
0
3
6
9
12
15
18
21
<0,001
Indivíduos
não-chagásicos (n=20)
Pacientes
chagásicos (n=20)
DO (490nm)/CO
F
IGURA
8 – Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes chagásicos crônicos
portadores da forma IND, frente ao Ag-Rec CRA. O eixo das ordenadas apresenta os índices de
reatividade, resultantes da divisão entre a média de densidade óptica de cada amostra pelo cut-off.
Os símbolos representam os índices de reatividade de cada amostra. Estão destacados os p-valores
dos índices que apresentaram diferença significativa (p< 0,05). CO= cut-off; DO= densidade óptica.
4.3.2 Análise dos isotipos de IgG em pacientes chagásicos portadores das
diferentes formas clínicas utilizando o Ag-Rec FRA
A resposta imune humoral gerada por pacientes chagásicos portadores de
diferentes formas clínicas frente ao Ag-Rec FRA também foi bastante variada quanto
à produção das subclasses de IgG, com variados índices de reatividade para cada
isotipo nas diferentes manifestações clínicas da doença de Chagas (Figuras de 9 a
11).
Frente ao Ag-Rec FRA, os pacientes portadores da forma CARD puderam
ser diferenciados dos indivíduos NC através de todas as subclasses de IgG, visto
V
ERÇOSA
AFA R
ESULTADOS
56
que os índices de reatividade de todos os isotipos analisados foram superiores,
significativamente, aos dos indivíduos NC (Figura 9). Com relação à superioridade
de um isotipo com relação ao outro, na resposta imune humoral gerada por estes
pacientes frente ao Ag-Rec FRA, houve diferenças significativas entre todos eles,
sendo IgG1 a principal subclasse produzida (IgG1 vs IgG2, p< 0,001; vs IgG3, p=
0,001; vs IgG4, p< 0,001), seguida da IgG3 (IgG3 vs IgG2, p= 0,001; vs IgG4, p<
0,001), IgG2 (IgG2 vs IgG4, p< 0,001) e IgG4.
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
0
7
14
21
28
35
42
<0,001
<0,001
<0,001
Indivíduos
não-chagásicos (n=20)
Pacientes
chagásicos (n= 33)
0,011
DO (490nm)/CO
F
IGURA
9 – Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes chagásicos crônicos
portadores da forma CARD, frente ao Ag-Rec FRA. O eixo das ordenadas apresenta os índices de
reatividade, resultantes da divisão entre a média de densidade óptica de cada amostra pelo cut-off.
Os símbolos representam os índices de reatividade de cada amostra. Estão destacados os p-valores
dos índices que apresentaram diferença significativa (p< 0,05). †= isotipo que apresenta os maiores
índices de reatividade; *= isotipo que apresenta o terceiro maior índices de reatividade; ‡= isotipo que
apresenta o segundo maior índice de reatividade; CO= cut-off; DO= densidade óptica.
Pacientes chagásicos portadores da forma MIS puderam ser diferenciados
dos indivíduos NC através dos isotipos IgG1, IgG2 e IgG3, visto que seus índices
de reatividade foram significativamente superiores aos dos indivíduos NC. Na
resposta imune humoral gerada por esses pacientes frente ao Ag-Rec FRA, o
†
‡
*
V
ERÇOSA
AFA R
ESULTADOS
57
isotipo IgG1 apresentou, significativamente, os maiores índices de reatividade
comparados aos dos outros isotipos (IgG1 vs IgG2, p= 0,18; vs IgG3, p= 0,043; vs
IgG4, p= 0,18), sendo a principal subclasse de IgG produzida frente ao Ag-Rec
FRA. Secundariamente, a produção dos isotipos IgG2 e IgG3 nestes pacientes foi
semelhante (p= 0,176) (Figura 10).
Através do isotipo IgG4 não foi possível diferenciar pacientes portadores da
forma MIS dos indivíduos NC, visto que os índices de reatividade deste isotipo,
tanto nos pacientes chagásicos como nos indivíduos NC foram comparáveis
(Figura 10).
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
0
3
6
9
12
15
18
Pacientes
chagásicos (n= 7)
Indivíduos
não-chagásicos (n=20)
<0,001
0,011
0,011
DO (490nm)/CO
F
IGURA
10 – Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes chagásicos crônicos
portadores da forma MIS, frente ao Ag-Rec FRA. O eixo das ordenadas apresenta os índices de
reatividade, resultantes da divisão entre a média de densidade óptica de cada amostra pelo cut-off.
Os símbolos representam os índices de reatividade de cada amostra. Estão destacados os p-valores
dos índices que apresentaram diferença significativa (p< 0,05). † = isotipo que apresenta os maiores
índices de reatividade comparados aos dos outros isotipos; ‡= isotipos que apresentam os segundos
maiores índices de reatividade; CO= cut-off; DO= densidade óptica.
Já os pacientes portadores da forma IND, frente ao Ag-Rec FRA, puderam
ser diferenciados dos indivíduos NC através de todas as subclasses de IgG, visto
†
‡
‡
V
ERÇOSA
AFA R
ESULTADOS
58
que os índices de reatividade de todos os isotipos analisados foram
significativamente superiores aos dos indivíduos NC. Com relação à superioridade
de um isotipo com relação ao outro, na resposta imune humoral gerada por estes
pacientes frente ao Ag-Rec FRA, o isotipo IgG1 foi a principal subclasse produzida
(IgG1 vs IgG2, p= 0,010; vs IgG3, p= 0,028; vs IgG4, p< 0,001), seguida da IgG2 e
da IgG3, que apresentaram índices de reatividade semelhantes entre si (p= 0,052)
e superiores aos da IgG4 (IgG2 vs IgG4, p= 0,006; IgG3 vs IgG4, p= 0,001) (Figura
11).
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
0
4
8
12
16
20
24
<0,001
Indivíduos
não-chagásicos (n=20)
Pacientes
chagásicos (n= 20)
0,042
0,048
0,001
DO (490nm)/CO
F
IGURA
11 – Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes chagásicos crônicos
portadores da forma IND, frente ao Ag-Rec FRA. O eixo das ordenadas apresenta os índices de
reatividade, resultantes da divisão entre a média de densidade óptica de cada amostra pelo cut-off.
Os símbolos representam os índices de reatividade de cada amostra. Estão destacados os p-valores
dos índices que apresentaram diferença significativa (p< 0,05). † = isotipo que apresenta os maiores
índices de reatividade comparados aos dos outros isotipos. ‡= isotipos que apresentam os segundos
maiores índices de reatividade.CO= cut-off; DO= densidade óptica.
†
‡
‡
V
ERÇOSA
AFA R
ESULTADOS
59
4.4 Correlação dos isotipos com as formas clínicas
A partir das análises descritas nas seções anteriores, selecionamos as
respostas isotípicas, frente aos Ags-Recs CRA e FRA, que poderiam ter valor na
diferenciação de pacientes chagásicos portadores das formas clínicas CARD, MIS e
IND.
Frente ao Ag-Rec CRA, o isotipo IgG1 foi capaz de diferenciar os pacientes
chagásicos portadores das formas CARD, MIS e IND dos indivíduos NC (Figuras 6,
7 e 8). Entretanto, não houve diferença significativa entre os índices de reatividade,
para este isotipo, entre os pacientes portadores da forma CARD, MIS e IND (Figura
12A).
Com relação ao isotipo IgG2, vimos que apenas pacientes portadores da
forma CARD puderam ser diferenciados dos indivíduos NC através deste isotipo
(Figuras 6, 7 e 8). Entretanto, estes pacientes chagásicos não puderam ser
diferenciados dos pacientes portadores das formas MIS e IND, visto que a
reatividade para este isotipo não apresentou diferença estatisticamente significativa
entre estes grupos de indivíduos chagásicos (Figura 12B).
Apesar do isotipo IgG3 poder diferenciar pacientes chagásicos, portadores
das formas CARD e MIS, dos indivíduos NC (Figuras 6, 7 e 8), os índices de
reatividade deste isotipo não apresentaram diferença entre estas duas formas
clínicas. Também não houve diferença estatisticamente significativa entre os índices
de reatividade, para este isotipo, entre os pacientes portadores da forma CARD ou
MIS e os pacientes portadores da forma IND (Figura 12C).
Como o isotipo IgG4 não foi capaz de diferenciar os pacientes chagásicos
com diferentes manifestações clínicas dos indivíduos NC (Figuras 6, 7 e 8), não
V
ERÇOSA
AFA R
ESULTADOS
60
selecionamos este isotipo para diferenciar os pacientes chagásicos participantes do
estudo.
CARD MIS IND NC
0
4
8
12
16
20
IgG1
DO (490nm)/CO
CARD MIS IND NC
0
2
4
6
8
10
IgG2
DO (490nm)/CO
CARD MIS IND NC
0
2
4
6
8
10
12
IgG3
DO (490nm)/CO
F
IGURA
12 – Índices de reatividade dos isotipos IgG1, IgG2 e IgG3 de pacientes chagásicos crônicos
portadores das formas CARD, MIS e IND, frente ao Ag-Rec CRA. O eixo das ordenadas apresenta os
índices de reatividade, resultantes da divisão entre a média de densidade óptica de cada amostra
pelo cut-off. Os símbolos representam os índices de reatividade de cada amostra. CO= cut-off; DO=
densidade óptica; CARD= forma cardíaca (n= 33); MIS= forma mista (n= 7); IND= forma
indeterminada (n= 20) e NC= não-chagásico (n= 20).
Frente ao Ag-Rec FRA, o isotipo IgG1 foi capaz de diferenciar os pacientes
chagásicos portadores das formas CARD, MIS e IND dos indivíduos NC (Figuras 9,
10 e 11). Entretanto, não houve diferença significativa entre os índices de
reatividade, para este isotipo, entre os pacientes portadores da forma CARD, MIS e
IND (Figura 13A).
C)
A)
B)
VERÇOSA AFA RESULTADOS
61
Com relação ao isotipo IgG2, vimos que todos os pacientes chagásicos
portadores das diferentes manifestações clínicas puderam ser diferenciados dos
indivíduos NC através deste isotipo (Figuras 9, 10 e 11). Este isotipo também foi
capaz de diferenciar pacientes chagásicos portadores das formas CARD e IND, visto
que os índices de reatividade do primeiro grupo de pacientes foram
significativamente superiores aos do segundo grupo (p= 0,010). Pacientes
portadores da forma MIS não puderam ser diferenciados, através deste isotipo, dos
pacientes portadores das formas CARD e IND (Figura 13B).
Apesar de o isotipo IgG3 poder diferenciar pacientes chagásicos portadores
das formas CARD, MIS e IND dos indivíduos NC (Figuras 9, 10 e 11), este isotipo
não foi capaz de diferenciar as diferentes formas clínicas da doença de Chagas
(Figura 13C).
Situação semelhante ocorreu com o isotipo IgG4, que foi capaz de diferenciar
os pacientes chagásicos portadores das formas CARD e IND dos indivíduos NC
(Figuras 9, 10 e 11), porém não foi capaz de diferenciar os pacientes portadores
destas formas, e nem diferenciá-los dos pacientes portadores da forma MIS (Figura
13D).
VERÇOSA AFA RESULTADOS
62
CARD MIS IND NC
0
6
12
18
24
30
36
42
IgG1
DO (490nm)/CO
CARD MIS IND NC
0
4
8
12
16
IgG2
DO (490nm)/CO
CARD MIS IND NC
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
IgG3
DO (490nm)/CO
CARD MIS IND NC
0
2
4
6
8
IgG4
DO (490nm)/CO
F
IGURA
13 – Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes chagásicos crônicos
portadores das formas CARD, MIS e IND, frente ao Ag-Rec FRA. O eixo das ordenadas apresenta os
índices de reatividade, resultantes da divisão entre a média de densidade óptica de cada amostra
pelo cut-off. Os símbolos representam os índices de reatividade de cada amostra. † = isotipos que
podem ser diferenciados através deste isotipo (p= 0,010). CO= cut-off; DO= densidade óptica;
CARD= forma cardíaca (n= 33); MIS= forma mista (n= 7); IND= forma indeterminada (n= 20) e NC=
não-chagásico (n= 20).
C)
A)
B)
D)
†
†
D
ISCUSSÃO
V
ERÇOSA
AFA D
ISCUSSÃO
64
5 D
ISCUSSÃO
A existência de um amplo espectro de manifestações clínicas da fase crônica
na doença de Chagas, variando de pacientes que não apresentam nenhum sintoma
até aqueles que apresentam severas complicações cardíacas e digestivas, ainda
desperta o interesse de vários grupos de pesquisa. Isso se deve ao fato de ainda
não haver explicação para o polimorfismo clínico apresentado na enfermidade de
Chagas.
A diferenciação das formas clínicas é feita atualmente através do
eletrocardiograma e das radiografias de tórax e de abdômen, além da anamnese do
paciente. Porém, quando se deseja investigar alterações precoces cardíacas e
digestivas, esta avaliação convencional torna-se inadequada. Técnicas
propedêuticas mais sensíveis estão sendo utilizadas para a detecção de alterações
cardíacas mais precoces do indivíduo com a forma indeterminada. Porém, os dados
fornecidos pelas técnicas atualmente utilizadas ainda são insuficientes para a
detecção de alterações incipientes do aparelho digestivo (OLIVEIRA JR, 1996).
Alguns autores, ao realizarem um estudo prospectivo para avaliar a evolução
do megaesôfago em indivíduos com esofagograma normal ou com diversos graus de
evolução, utilizando as técnicas propedêuticas concluíram que, com o passar do
tempo, muitos deles evoluíram para o megaesôfago, porém não se podem
prognosticar quais são esses pacientes com potencial evolutivo e nem se pode fazer
a prevenção da evolução (CASTRO et al., 1994). Desta forma, os métodos
propedêuticos não-invasivos atualmente existentes não conseguem discriminar os
pacientes com potencial evolutivo para as diferentes formas clínicas da doença, eles
apenas revelam a situação clínica atual (OLIVEIRA JR, 1996).
V
ERÇOSA
AFA D
ISCUSSÃO
65
A pesquisa de imunoglobulinas específicas no soro de indivíduos chagásicos,
juntamente com a utilização de antígenos puros e específicos, poderiam formar um
conjunto chave para a elucidação de alguns fatores que estariam envolvidos na
indução e manutenção das manifestações clínicas da doença (CERBAN et al., 1993;
LORCA et al., 1992; MOTRAN et al., 1994). Adicionalmente, poderíamos obter
importantes informações que pudessem contribuir para a busca de um marcador de
evolução de prognóstico das formas clínicas da doença de Chagas.
Os Ags-Recs CRA e FRA, proteínas específicas do T. cruzi, foram utilizados
neste estudo com o objetivo de evidenciar uma associação entre a resposta imune
humoral específica gerada por pacientes chagásicos e o estado clínico destes
pacientes. A metodologia de ELISA foi a escolhida por já ser bem estabelecida há
três décadas, além de ser de fácil execução (KEMENY, 1992).
De acordo com os critérios estabelecidos na seção Metodologia item 3.2.3,
conseguimos selecionar 60 pacientes chagásicos portadores das formas clínicas
crônicas CARD, MIS e IND. Também selecionamos vinte indivíduos saudáveis para
servir como grupo de indivíduos não-chagásicos e outros vinte para o cálculo do cut-
off.
Assim, analisamos inicialmente a resposta imune humoral, constituída pelas
subclasses de IgG, gerada pelos pacientes chagásicos frente aos Ags-Recs CRA e
FRA de T. cruzi, verificando as possíveis diferenças entre as respostas, para cada
Ag-Rec. Posteriormente analisamos, para cada grupo de forma clínica, os isotipos
que são predominantes nas respostas específicas, seguido da diferenciação dos
grupos de formas clínicas CARD, MIS e IND através dos isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e
IgG4, quando possível.
V
ERÇOSA
AFA D
ISCUSSÃO
66
O T. cruzi, assim como outros agentes patógenos, tem a capacidade de ativar
o sistema imune, levando ao aparecimento de respostas imunes humorais e
celulares, importantes no controle da infecção (REINA-SAN-MARTÍN et al., 2000).
Apesar de protetora, esta resposta imune também pode contribuir para o
aparecimento das manifestações clínicas crônicas presentes na doença de Chagas
(BRODSKYN & BARRAL-NETTO, 2000).
As imunoglobulinas têm participação efetiva na infecção chagásica desde a
fase aguda, onde são gerados anticorpos específicos principalmente para os
antígenos superficiais do T. cruzi. Na fase crônica há uma maior diversidade de
imunoglobulinas, sendo estas específicas principalmente para antígenos internos do
parasita (UMEZAWA et al., 1996). Além das respostas anticórpicas serem geradas
contra diferentes antígenos nas fases aguda e crônica da doença, elas também são
variadas quanto aos isotipos produzidos em cada fase e nas diferentes formas
clínicas da doença (GONZÁLEZ et al., 1996; GUSMÃO et al., 1982; LORCA et al.,
1992; MORGAN et al., 1996).
Através dos ELISAs realizados no presente trabalho pudemos confirmar que
os pacientes chagásicos desenvolvem uma resposta imune humoral frente aos Ags-
Recs CRA e FRA. Entretanto, os vários trabalhos publicados apenas revelam o
potencial diagnóstico destes Ags-Recs sem, contudo, identificar as subclasses de
IgG que predominam nas respostas imunes identificadas (GADELHA et al., 2003;
GOLDENBERG et al., 1991; GOMES et al., 2001; SILVA et al., 2002).
Nos pacientes chagásicos que selecionamos, as respostas imunes geradas
foram bastante diversificadas com relação às subclasses de IgG produzidas e às
formas clínicas nas quais elas estavam presentes, tanto para o Ag-Rec CRA como
para o Ag-Rec FRA. Estas respostas foram constituídas principalmente pelos
V
ERÇOSA
AFA D
ISCUSSÃO
67
isotipos IgG1 e IgG3, podendo estes diferenciar a maioria dos pacientes chagásicos
dos indivíduos NC. Também estavam presentes os isotipos IgG2 e IgG4, este último
sempre apresentando os menores índices, além de menor capacidade de
discriminação entre indivíduos infectados e os não infectados.
Trabalhos mostram uma diversidade de respostas imune humoral encontrada
nas formas clínicas, levando a crer que as imunoglobulinas possam estar relacionas
com o estado clínico dos indivíduos chagásicos (BRODSKYN & BARRAL-NETTO,
2000; LORCA et al., 1992). De fato, as imunoglobulinas presentes na infecção
chagásica desempenham vários papéis, tanto na resistência do hospedeiro contra o
parasita (GONZÁLEZ et al., 1996; KRETTLI & BRENER, 1976; 1982), como
causando danos teciduais e modulando a fisiologia dos órgãos acometidos
(HERNÁNDEZ et al., 2003; STERIN-BORDA et al., 2005).
O predomínio dos isotipos IgG1 e IgG3, identificados para os Ags-Recs CRA
e FRA, também foi verificado em respostas imunes humorais identificadas para
antígenos brutos (CERBAN et al., 1993; MORGAN et al., 1996), vivos (CORDEIRO
et al., 2001) e até mesmo purificados de T. cruzi, como PFR (Paraflagellar Rod
Proteins) (MICHAILOWSKY et al., 2003). Entretanto, outros trabalhos revelam
diferentes isotipos predominantes frente a antígenos brutos, onde se destaca a
presença de IgG1 e IgG2 (HERNÁNDEZ-BECERRIL et al., 2001) e frente a frações
purificadas do parasito, onde o isotipo IgG1 predomina frente às demais subclasses
de IgG (CERBAN et al., 1993).
Sabe-se que, frente a parasitas vivos, estes isotipos são capazes de ativar o
sistema complemento, contribuindo na resistência do hospedeiro contra infecção
(KRETTLI; BRENER, 1976, 1982; CORDEIRO et al., 2001). Foi mostrado que o
isotipo IgG1 lítico estava presente em altos níveis em pacientes assintomáticos,
V
ERÇOSA
AFA D
ISCUSSÃO
68
podendo ser utilizado para predizer o risco de dano cardíaco na doença de Chagas
(CORDEIRO et al., 2001). Um outro estudo, realizado por Romeiro et al. (1984)
também mostrou que o isotipo IgG2 apresenta atividade lítica.
Alguns trabalhos já evidenciaram uma resposta imune humoral mais intensa
em pacientes que apresentam as formas severas da doença de Chagas em relação
àqueles que são assintomáticos ou que apresentam cardiomiopatia leve (GUSMÃO
et al., 1982; ZAUZA & BORGES-PEREIRA, 2001). Entretanto, não ficou evidenciado
os isotipos que poderiam estar envolvidos na imunopatologia dessas formas
severas.
Após a identificação das subclasses de IgG envolvidas na resposta imune
humoral específica para os Ags-Recs CRA e FRA, gerada por pacientes chagásicos
portadores das manifestações clínicas da doença de Chagas, e de verificarmos
quais os isotipos que são capazes de discriminar os pacientes chagásicos dos
indivíduos NC, selecionamos aqueles que poderiam ser utilizados como marcadores
de evolução clínica da doença de Chagas. Posteriormente fizemos correlações entre
a detecção de cada subclasse de IgG e as formas clínicas CARD, MIS e IND.
Através dos nossos resultados, pudemos perceber que há uma diversidade
de respostas imune humoral frente aos Ags-Recs CRA ou FRA nos pacientes
chagásicos portadores das diferentes formas clínicas. Entretanto, apenas o isotipo
IgG2 específico para o Ag-Rec FRA foi capaz de discriminar pacientes chagásicos
portadores da forma CARD dos pacientes portadores da forma IND, visto que os
índices de reatividade deste isotipo foram significativamente superiores nos
pacientes que apresentaram a forma CARD (p= 0,010).
Elevados níveis deste isotipo foram encontrados em um grupo de indivíduos
chagásicos, pertencentes a uma comunidade ameríndia chamada Toba, em
V
ERÇOSA
AFA D
ISCUSSÃO
69
comparação a outro grupo de indivíduos chagásicos, pertencentes à comunidade
ameríndia chamada Mataco, esta última apresentando maior freqüência de
anormalidades eletrocardiográficas (MOTRAN et al., 1994). Outros estudos
encontraram elevados níveis deste isotipo em pacientes portadores das formas
CARD e MIS, quando comparados aos níveis deste isotipo nos indivíduos NC
(MORGAN et al., 1996). Entretanto, os vários achados da literatura pesquisada não
revelam a capacidade de discriminação de pacientes chagásicos que apresentem
diferentes manifestações clínicas, provenientes de diferentes regiões endêmicas da
doença de Chagas, utilizando-se tanto antígenos brutos (MORGAN et al., 1996),
vivos (CORDEIRO et al., 2001) e purificados de T. cruzi (MICHAILOWSKY et al.,
2003; MOTRAN et al., 1994) através do isotipo IgG2. Apenas um estudo, realizado
por Hernández-Becerril et al. (2001), revela elevados níveis deste isotipo
associdados à cardiomegalia. Porém, não ficou estabelecida a possibilidade
monitoramento de evolução clínica através deste isotipo, visto que não houve grupo
de indivíduos chagásicos portadores da forma IND para comparação neste estudo.
A hipótese de que a utilização de antígenos purificados, em substituição aos
antígenos brutos de T. cruzi, poderia revelar respostas isotípicas interessantes
(MOTRAN et al., 1994; LORCA et al., 1992) foi, neste estudo, confirmada. A
natureza antigênica do Ag-Rec FRA proporcionou a diferenciação dos pacientes que
apresentam a forma CARD da doença de Chagas daqueles que são considerados
assintomáticos através do isotipo IgG2. Entretanto, a relevância da presença deste
isotipo na imunopatologia da cardiomiopatia chagásica ainda não é conhecida.
Este marcador, após ser avaliado num estudo prospectivo, poderia ser uma
ferramenta a mais na identificação de pacientes chagásicos assintomáticos com
V
ERÇOSA
AFA D
ISCUSSÃO
70
potencial evolutivo para a forma CARD. O médico, ao identificar a possibilidade de
progressão da doença, redirecionaria a conduta do tratamento de seu paciente.
Os isotipos IgG1 e IgG3 específicos para os Ags-Recs CRA ou FRA, que
também foram selecionados como potenciais marcadores de evolução clínica,
apresentaram níveis elevados nos pacientes chagásicos como um todo,
independente da forma clínica apresentada por eles. Como os métodos
propedêuticos atualmente utilizados na determinação da forma clínica IND não são
sensíveis, pacientes com alterações cardíacas leves podem estar sendo agrupados
junto com os pacientes que apresentam a forma IND (DUTRA et al., 2005) e, assim,
a resposta humoral uniforme nas formas CARD e IND impossibiltou a diferenciação
destas através dos isotipos utilizados.
Em virtude dos vários estudos já publicados mostrando as funções protetoras
(KRETTLI & BRENER, 1976, 1982) e agressoras (HERNÁNDEZ et al., 2003;
STERIN-BORDA et al., 2005) dos anticorpos na infecção chagásica, os diferentes
isotipos produzidos durante a infecção podem ter importante significado na
imunopatologia da doença de Chagas, no que se refere à sua presença nas
diferentes manifestações clínicas (LORCA et al., 1992). Assim, a discriminação de
pacientes que manifestam apenas alterações cardíacas daqueles que manifestam
alterações cardíacas e digestivas simultaneamente, através de uma resposta imune
humoral, seria difícil devido ao componente cardíaco presente em ambos os grupos
de pacientes. A inclusão de pacientes chagásicos portadores da forma DIG seria útil
para confirmação desta hipótese.
C
ONCLUSÕES
V
ERÇOSA
AFA C
ONCLUSÕES
72
6 C
ONCLUSÕES
1. Os índices de reatividade dos isotipos de IgG não apresentaram diferença
estatisticamente significante entre os pacientes chagásicos portadores das
formas CARD, MIS e IND quando o Ag-Rec CRA foi utilizado. Estes
resultados sugerem que esses isotipos não poderão servir como marcadores
de evolução de prognóstico dessas formas clínicas utilizando o Ag-Rec CRA;
2. Os isotipos IgG1, IgG3 e IgG4 específicos para o Ag-Rec FRA não poderão
ser utilizados como marcadores de prognóstico de evolução das formas
clínicas CARD, MIS e IND. Além disso, os índices de reatividade do isotipo
IgG2 não apresentaram diferença estatisticamente significativa quando foram
comparados entre os pacientes chagásicos portadores das formas CARD e
MIS, e entre os portadores da formas MIS e IND. Estes resultados sugerem
que esses isotipos não poderão servir como marcadores de evolução de
prognóstico dessas formas clínicas utilizando o Ag-Rec FRA;
3. O isotipo IgG2 foi capaz de diferenciar indivíduos chagásicos portadores da
forma CARD daqueles portadores da forma IND quando o Ag-Rec FRA foi
utilizado. Este resultado indica que o isotipo IgG2 poderá servir como
marcador de evolução clínica para forma CARD.
P
ERSPECTIVAS
V
ERÇOSA
AFA P
ERSPECTIVAS
74
7 P
ERSPECTIVAS
1. Realizar um estudo prospectivo para verificar se os indivíduos portadores da
forma IND analisados no presente estudo, caso evoluam para a forma CARD,
apresentam o marcador IgG2;
2. Analisar o perfil isotípico das IgG em pacientes chagásicos provenientes das
áreas endêmicas de Minas Gerais, Bahia, Goiás e Piauí onde circulam cepas
de T. cruzi de diferentes biodemas;
3. Realizar um estudo prospectivo nas áreas endêmicas acima citadas, caso
seja definido um marcador de evolução clínica;
4. Selecionar pacientes chagásicos portadores da forma DIG para fazerem parte
das futuras pesquisas;
5. Incluir em todas as análises a pesquisa das imunoglobulinas do tipo A e M.
R
EFERÊNCIAS
B
IBLIOGRÁFICAS
V
ERÇOSA
AFA R
EFERÊNCIAS
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A
PÊNDICES
V
ERÇOSA
AFA A
PÊNDICE
A
84
A
PÊNDICE
A- T
ERMO DE
C
ONSENTIMENTO
L
IVRE E
E
SCLARESCIDO
Resolução 196/96
Projeto: “Caracterização do Perfil Isotípico das Imunoglobulinas de Indivíduos
Chagásicos Frente aos Antígenos Recombinantes CRA e FRA de Trypanosoma
cruzi”.
Eu, __________________________________, RG ______________________,
aceito participar desse estudo, cujo objetivo é avaliar o padrão de anticorpos no
soro de pessoas portadoras da doença de Chagas com forma cardíaca,
digestiva, mista e indeterminada. Para obtermos esse padrão o soro deve ser
testado frente a duas proteinas (antígenos) que têm sido usadas no diagnóstico
da doença de Chagas. Fui informado que eu terei meu sangue coletado para o
teste e o mesmo será utilizado no estudo acima referido. Fui orientado em
relação aos benefícios desse estudo, que visa a detecção de um padrão que
poderá ajudar no acopanhamento do tratamento da doença de Chagas. Fui
informado ainda que o material coletado será incorporado ao Laboratório de
Imunoparasitologia do Departamento de Imunologia do Centro de Pesquisas
Aggeu Magalhães/FIOCRUZ, podendo ser utilizado em pesquisas posteriores
onde os meus dados serão preservados em sigilo absoluto quando da
publicação dos resultados. Fui informado que tenho liberdade de recusar ou
retirar o consentimento sem sofrer nenhum tipo de penalização ou pressão e
que não serei ressarcido financeiramente para participar deste estudo. Fui
informado também que deverei ficar com uma cópia do presente documento.
Contato: Dra. Yara Gomes – Departamento de Imunologia (CPqAM/Fiocruz)
Recife, ______ de________________de ______.
_______________________________________
Paciente, pai ou responsável
_______________________________________
testemunha
_______________________________________
Médico responsável
V
ERÇOSA
AFA A
PÊNDICE
B
85
A
PÊNDICE
B - Formulário de Pesquisa
PROJETO: “Avaliação dos antígenos recombinantes CRA e FRA de Trypanosoma cruzi
como marcadores das formas clínicas crônicas da doença de Chagas”.
1. Nome: __________________________________________________________________
Prontuário n°:___________________________ Registro CPqAM: __________________
Data da coleta:______________________
2. Sexo: (1) Feminino (2) Masculino
3. Idade: _____ (1) De 0 a 12 anos
(2) De 13 a 19 anos
(3) De 20 a 59 anos
(4) A partir de 60 anos
(9) IGN
Endereço: _________________________________________________________________
Bairro:______________________________ Município:_____________________________
Estado:______ Telefone: (__) - ___________________ Celular: (__) - _______________
5. Município de nascimento: ______________________________________ 6. Estado: ____
6. Forma de contaminação: (1) Vetorial
(2) Transfusional
(3) Congênita
(4) Oral
(5) Transplante de órgão
(6) Acidente de laboratório
(9) IGN
7. Exames clínicos convencionais:
RX coração: (1) normal (2) dilatação
ECG: (1) normal (2) anormal
RX esôfago (1) normal (2) dilatação
Enema opaco: (1) normal (2) dilatação
9. Forma clínica crônica: (1) Forma cardíaca
(2) Forma digestiva
(3) Forma indeterminada
(4) Forma mista
10. Medicação: (1) Sim (2) Não
4. Situação trabalhista: (1) Empregado
(2) Desempregado
(3) Aposentado
(4) Do lar
(9) IGN
8. Sorologia:
IFI: (1) positivo (2) negativo
HAI: (1) positivo (2) negativo
ELISA: (1) positivo (2) negativo
V
ERÇOSA
AFA A
PÊNDICE
C
86
APÊNDICE C – ARTIGO EM PREPARAÇÃO
PESQUISA DE IMUNOGLOBULINAS G EM PACIENTES CHAGÁSICOS
CRÔNICOS FRENTE AOS ANTÍGENOS RECOMBINANTES CYTOPLASMIC
REPETITIVE ANTIGEN E FLAGELLAR REPETITIVE ANTIGEN DE
TRYPANOSOMA CRUZI
Verçosa AFA¹, Lorena VMB¹, Carvalho CL¹, Melo MFAD¹, Machado RCA¹,
Cavalcanti MGA
2
, Silva ED
3
, Ferreira AGP
3
, Pereira VRA¹, Souza WV¹, Gomes YM¹
1
Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães-CPqAM/Fiocruz, Recife-PE,
2
Hospital
Oswaldo Cruz – HUOC/Universidade de Pernambuco/UPE, Recife-PE,
3
Bio-
Manguinhos/Fiocruz, Rio de Janeiro-RJ.
Correspondência para:
Yara M. Gomes, Departamento de Imunologia, Centro de
Pesquisas Aggeu Magalhães/FIOCRUZ, Av. Moraes Rego s/n, Cidade Universitária,
50670-420, Recife, PE, Brazil. Fax: 55-81-34532449, Phone: 55-81-2101-2559.
email: yara@cpqam.fiocruz.br
RESUMO
Em virtude da magnitude da infecção, de sua elevada morbimortalidade, com
destaque para a cardiopatia, além da quase ineficácia do tratamento etiológico,
justificam-se estudos que visem à melhoria da qualidade de vida dos portadores da
enfermidade de Chagas. A pesquisa das subclasses de IgG no soro de indivíduos
chagásicos frente a dois antígenos específicos do Trypanosoma cruzi é o objetivo
deste trabalho, visando a obtenção de um perfil isotípico que seja capaz de
discriminar as formas clínicas cardíaca (CARD), mista (MIS) e indeterminada (IND).
Verificamos que a resposta imune humoral gerada pelos pacientes frente aos Ags-
Recs é bastante variada, com produção de quase todas as subclasses de IgG
específicas nos grupos de formas clínicas analisados. Entretanto, apenas o isotipo
V
ERÇOSA
AFA A
PÊNDICE
C
87
IgG2 específico para o Ag-Rec FRA foi capaz de diferenciar pacientes chagásicos
portadores da forma CARD daqueles portadores da forma IND, podendo, após um
estudo prospectivo, servir como marcador de evolução clínica com danos cardíacos.
Esta informação é importante, uma vez que permite ao médico avaliar a
possibilidade de redirecionar a conduta do tratamento de seu paciente.
Palavas-chave: Perfil isotípico; Antígenos recombinantes; Doença de Chagas
INTRODUÇÃO
A doença de Chagas é uma enfermidade de características clínicas peculiares. Os
indivíduos infectados pelo Trypanosoma cruzi, agente etiológico desta enfermidade,
podem apresentar, após um período variável de tempo, uma das quatro formas
clínicas mais freqüentes, que são a forma cardíaca (CARD), forma digestiva (DIG),
forma mista (MIS) e forma indeterminada (IND).
Pouco ainda se conhece sobre os mecanismos imunes e patogênicos que
estão envolvidos na transição da fase aguda para a crônica, bem como os fatores
que favorecem o desenvolvimento de uma determinada forma clínica (RIBEIRO-
RODRIGUES et al., 1996). Vários estudos têm demonstrado que a heterogeneidade
clínica observada entre os pacientes chagásicos está associada a uma distinta e
complexa relação parasita-hospedeiro, com o envolvimento direto do sistema imune
(ANDRADE, 1999; GAZZINELLI; BRENER, 1991; POWELL; WASSOM, 1993).
A enfermidade é circunscrita em 15 países endêmicos na América Latina,
onde se estima uma prevalência de infecção humana em cerca de 18 milhões de
casos e que cerca de 120 milhões de pessoas estão sob o risco de infecção (WHO,
2002). Somando-se a isso, ainda não existe um medicamento eficaz para o
tratamento e nenhuma vacina que previna a doença (CANÇADO, 1985).
Em virtude da magnitude da infecção, de sua elevada morbimortalidade, com
destaque para a cardiopatia, que gera um grande impacto social e médico-
trabalhista (MALTA, 1996; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2005), além da quase ineficácia
do tratamento etiológico, justificam-se estudos que visem à melhoria da qualidade de
vida dos portadores da enfermidade de Chagas.
V
ERÇOSA
AFA A
PÊNDICE
C
88
Com o intuito de tentar diferenciar os pacientes com potencial evolutivo,
vários grupos de pesquisa tentam estabelecer marcadores biológicos de evolução
do prognóstico da doença através de abordagens imunológicas. Alguns deles
buscam por um padrão de imunoglobulinas associadas a um ou mais antígenos de
T. cruzi que sejam capazes de diferenciar as formas clínicas e predizer seu potencial
evolutivo. É por meio desta abordagem que o presente trabalho vai estudar a
resposta imune humoral estabelecida pelo indivíduo chagásico frente a dois
antígenos recombinantes de T. cruzi, e relacionar esta resposta com as formas
clínicas CARD, DIG, MIS e IND da doença de Chagas.
Para tal finalidade, serão utilizados dois antígenos específicos de T. cruzi, o
CRA e o FRA, construídos através da tecnologia do DNA recombinante. Esses dois
antígenos apresentam uma estrutura de epítopos repetitivos, e por este motivo o
antígeno repetitivo que está localizado na região do flagelo recebeu o nome de FRA
(Flagellar Repetitive Antigen). Ele é encontrado nas formas epimastigota e
tripomastigota de T. cruzi. Da mesma forma, o antígeno repetitivo que está
localizado no citoplasma foi chamado de CRA (Cytoplasmic Repetitive Antigen), e
está presente nas formas evolutivas epimastigota e amastigota do parasito
(KRIEGER et al., 1992; LAFAILLE et al., 1989). A resposta imune frente a estes
antígenos já foi extensivamente estudada experimentalmente (PEREIRA et al.,
2003a, 2003b, 2004, 2005), e o potencial diagnóstico deles também já foi
comprovado (GADELHA et al., 2003; GOMES et al., 2001). Não se conhece, porém
que isotipos de IgG estão envolvidos na resposta imune humoral gerada por
pacientes chagásicos frente a estes Ags-Recs.
A utilização de proteínas puras e quimicamente definidas e ainda, específicas
do parasito, é sugerida por vários autores para fornecer maior especificidade aos
resultados na identificação de moléculas alvo de uma interação parasita-hospedeiro
bem sucedida, e para estudar a imunopatologia da doença de Chagas (CERBAN et
al., 1993; LORCA et al., 1992; MOTRAN et al., 1994). Assim, com a utilização das
proteínas CRA e FRA, poderíamos avaliar os resultados de respostas imunes
específicas durante a fase crônica da doença de Chagas, estabelecendo um perfil
isotípico que discriminasse as diferentes formas clínicas da doença.
V
ERÇOSA
AFA A
PÊNDICE
C
89
METODOLOGIA
Análise da pureza dos Ags-Recs CRA e FRA
Os Ags-Recs CRA e FRA, obtidos como descrito por Krieger et al. (1992), e
preparados no Laboratório de Reativos do Instituto de Tecnologia em
Imunobiológicos (Bio-Manguinhos) da Fiocruz. A verificação da pureza e integridade
dos Ags-Recs foi feita através de uma eletroforese em gel de poliacrilamida com
dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) através do método de método de Laemmli
(1970), seguida de colorações específicas para proteínas (MORRISEY, 1981) e
carboidratos (JANN, et al., 1975).
População do estudo
Os pacientes chagásicos foram selecionados no Ambulatório de Doença de
Chagas do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco (HC-
UFPE) e do Hospital Universitário Oswaldo Cruz da Universidade de Pernambuco
(HUOC-UPE), ambos situados na cidade de Recife-PE. Os indivíduos sadios foram
selecionados na cidade de Recife-PE.
Os pacientes chagásicos foram submetidos a exames clínico-laboratoriais que
compreendiam: exame físico, raios X contrastado de esôfago, raios X de tórax,
eletrocardiograma e sorologia para infecção pelo T. cruzi.
Foram categorizados como pacientes portadores de cardiopatia chagásica
crônica aqueles que apresentaram alguma alteração no eletrocardiograma e/ou
dilatação do coração, com ausência de dilatação do esôfago e/ou sem
sintomatologia digestiva alta e baixa, e apresentando sorologia positiva para
infecção pelo T. cruzi.
Foram categorizados como pacientes portadores da forma MIS, aqueles que,
além das evidências encontradas para os portadores da cardiopatia chagásica
crônica, também apresentaram megaesôfago e/ou megacólon, tratados
cirurgicamente ou não, e apresentando sorologia positiva para infecção pelo T. cruzi.
Foram categorizados como pacientes portadores da forma IND aqueles que
não apresentaram nenhuma das alteraçãoes descritas para a forma CARD e MIS, e
apresentando sorologia positiva para infecção pelo T. cruzi.
V
ERÇOSA
AFA A
PÊNDICE
C
90
Foram considerados indivíduos saudáveis aqueles que apresentaram
sorologia negativa para infecção pelo T. cruzi em dois testes sorológicos, nunca
receberam transfusão de sangue e nem habitaram em área endêmica.
De acordo com os critérios acima estabelecidos, o sangue foi coletado de 60
pacientes chagásicos, dos quais 33 apresentavam a forma CARD, 7 a forma MIS e
20 a forma IND. Também foi coletado sangue de 40 indivíduos saudáveis, dos quais
20 foram utilizados como grupo de indivíduos não-chagásicos (NC) para
comparação com os grupos de indivíduos chagásicos, e os outros 20 foram
utilizados para estabelecimento do ponto de corte ou cut-off (CO).
Aspectos éticos
Os pacientes chagásicos e indivíduos saudáveis envolvidos neste estudo
tiveram participação voluntária, assinando o “Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido” e responderam a um formulário de pesquisa. A conduta de inclusão dos
mesmos e os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em
Pesquisa do CPqAM/Fiocruz.
Determinação do perfil isotípico contra os Ags-Recs CRA ou FRA
Placas de ELISA (Nunc-Immuno Plates, MaxiSorp, 96 poços, Nalge Nunc
International Corporation) foram sensibilizadas com os Ags-Recs CRA ou FRA nas
concentrações de 5 e 2,5µg/mL (100µL/poço), respectivamente, diluídos em tampão
carbonato-bicarbonato 0,05M pH 9,6 e incubadas “overnight” a 4°C. Após lavagens e
bloqueio dos sítios inespecíficos com 200µL de PBS-Tween 20 a 0,05% contendo
1% de albumina bovina sérica (BSA) (SIGMA, St. Louis, MO), os soros foram
diluídos em PBS-Tw a 1:100 e 100µL e foram depositados em duplicata nos poços,
sendo posteriormente incubados “overnight” a 4
o
C. No dia seguinte, as placas foram
lavadas e a ligação dos anticorpos específicos foi detectada pela incubação (TA
durante 1h30min) de 100µL dos anti-isotipos (anti-IgG1, anti-IgG2, anti-IgG3 e anti-
IgG4) conjugados à biotina (SIGMA, St. Louis, MO), diluídos em PBS-Tw contendo
0,1% de BSA nas diluições previamente estabelecidas, e incubadas à TA durante
1h30min. Após nova lavagem, as placas foram incubadas à TA durante 1h com
100µL estreptavidina conjugada à peroxidase (Pharmingen, San Jose, CA), diluída
em PBS-Tw a 1:3000. A reação foi revelada pela adição de ortofenilenodiamina
V
ERÇOSA
AFA A
PÊNDICE
C
91
(0,01%) (SIGMA, St. Louis, MO) mais H
2
O
2
(0,01%) (VETEC, Rio de Janeiro, RJ),
diluídos em tampão citrato-fosfato, pH 5,0. A quantificação da reação foi
determinada através do leitor de ELISA (BIO-RAD 3550) a 490 nm.
O CO foi estabelecido para cada placa calculando-se a média das DOs dos
indivíduos saudáveis adicionada de dois desvios-padrão. Os resultados foram
expressos na forma de índice, onde os valores das médias das DOs das amostras
foram divididas pelo CO de sua respectiva placa, a fim de tornar comparáveis os
resultados das diferentes placas.
Análise estatística
Foi utilizado o programa SPSS versão 8 (Statistical Package for Social
Sciences Incorporation, US) para análise dos resultados. O teste de normalidade
Kolmogorov-Smirnov foi utilizado para verificar se os índices calculados para cada
isotipo apresentavam distibuição normal. Os testes não-paramétricos Mann-Whitney
e Wilcoxon foram utilizados para avaliar as diferenças entre os índices calculados
para cada amostra.
Os gráficos foram construídos utilizando-se o programa Graphpad Prism
versão 3.0. A diferença entre os resultados obtidos foi considerada significativa
quando p<0,05.
RESULTADOS
Frente ao Ag-Rec CRA, o isotipo IgG1 foi capaz de diferenciar os pacientes
chagásicos portadores das formas CARD, MIS e IND dos indivíduos NC, visto que
seus índices de reatividade foram significativamente superiores aos dos indivíduos
NC. Entretanto, não houve diferença significativa entre os índices de reatividade,
para este isotipo, entre os pacientes portadores da forma CARD, MIS e IND (Figura
1A).
Com relação ao isotipo IgG2, apenas pacientes portadores da forma CARD
puderam ser diferenciados dos indivíduos NC através deste isotipo. Entretanto, estes
pacientes chagásicos não puderam ser diferenciados dos pacientes portadores das
formas MIS e IND, visto que a reatividade para este isotipo não apresentou diferença
estatisticamente significativa entre estes grupos de indivíduos chagásicos (Figura
1B).
V
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C
92
Apesar do isotipo IgG3 poder diferenciar pacientes chagásicos, portadores
das formas CARD e MIS, dos indivíduos NC, os índices de reatividade deste isotipo
não apresentaram diferença entre estas duas formas clínicas. Também não houve
diferença estatisticamente significativa entre os índices de reatividade, para este
isotipo, entre os pacientes portadores da forma CARD ou MIS e os pacientes
portadores da forma IND (Figura 1C).
Como o isotipo IgG4 não foi capaz de diferenciar os pacientes chagásicos
com diferentes manifestações clínicas dos indivíduos NC (dados não mostrados),
não selecionamos este isotipo para diferenciar os pacientes chagásicos participantes
do estudo.
Frente ao Ag-Rec FRA, o isotipo IgG1 foi capaz de diferenciar os pacientes
chagásicos portadores das formas CARD, MIS e IND dos indivíduos NC. Entretanto,
não houve diferença significativa entre os índices de reatividade, para este isotipo,
entre os pacientes portadores da forma CARD, MIS e IND (Figura 2A).
Com relação ao isotipo IgG2, vimos que todos os pacientes chagásicos
portadores dads diferentes manifestações clínicas puderam ser diferenciados dos
indivíduos NC através deste isotipo. Este isotipo também foi capaz de diferenciar
pacientes chagásicos portadores das formas CARD e IND, visto que os índices de
reatividade do primeiro grupo de pacientes foram significativamente superiores aos
do segundo grupo (p= 0,010). Pacientes portadores da forma MIS não puderam ser
diferenciados, através deste isotipo, dos pacientes portadores das formas CARD e
IND (Figura 2B).
Apesar de o isotipo IgG3 poder diferenciar pacientes chagásicos portadores
das formas CARD, MIS e IND dos indivíduos NC, este isotipo não foi capaz de
diferenciar as diferentes formas clínicas da doença de Chagas (Figura 2C).
Situação semelhante ocorreu com o isotipo IgG4, que foi capaz de diferenciar
os pacientes chagásicos portadores das formas CARD e IND dos indivíduos NC,
porém não foi capaz de diferenciar os pacientes portadores destas formas, e nem
diferenciá-los dos pacientes portadores da forma MIS (Figura 2D).
DISCUSSÃO
A pesquisa de imunoglobulinas específicas no soro de indivíduos chagásicos,
juntamente com a utilização de antígenos puros e específicos, poderia formar um
V
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C
93
conjunto chave para a elucidação de alguns fatores que estariam envolvidos na
indução e manutenção das manifestações clínicas da doença (CERBAN et al., 1993;
LORCA et al., 1992; MOTRAN et al., 1994). Adicionalmente, poderíamos obter
importantes informações que pudessem contribuir para a busca de um marcador de
evolução de prognóstico das formas clínicas da doença de Chagas.
Os Ags-Recs CRA e FRA, proteínas específicas do T. cruzi, foram utilizados
neste estudo com o objetivo de evidenciar uma associação entre a resposta imune
humoral específica gerada por pacientes chagásicos e o estado clínico destes
pacientes. A metodologia de ELISA foi a escolhida por já ser bem estabelecida há
três décadas, além de ser de fácil execução (KEMENY, 1992).
Através dos ELISAs realizados pudemos confirmar que os pacientes
chagásicos desenvolvem uma resposta imune humoral frente aos Ags-Recs CRA e
FRA. Entretanto, os vários trabalhos publicados apenas revelam o potencial
diagnóstico destes Ags-Recs sem, contudo, identificar as subclasses de IgG que
predominam nas respostas imunes identificadas (GADELHA et al., 2003;
GOLDENBERG et al., 1991; GOMES et al., 2001; SILVA et al., 2002).
Nos pacientes chagásicos que selecionamos, as respostas imunes geradas
foram bastante diversificadas com relação às subclasses de IgG produzidas e às
formas clínicas nas quais elas estavam presentes, tanto para o Ag-Rec CRA como
para o Ag-Rec FRA. Estas respostas foram constituídas principalmente pelos
isotipos IgG1 e IgG3, podendo estes diferenciar a maioria dos pacientes chagásicos
dos indivíduos NC. Também estavam presentes os isotipos IgG2 e IgG4, porém com
menor magnitude, além de menor capacidade de discriminação entre indivíduos
infectados e os não infectados.
A diversidade de respostas encontrada nas formas clínicas nos leva a crer
que as imunoglobulinas possam estar relacionas com o estado clínico dos indivíduos
chagásicos (BRODSKYN; BARRAL-NETTO, 2000; LORCA et al., 1992). De fato, as
imunoglobulinas presentes na infecção chagásica desempenham vários papéis,
tanto na resistência do hospedeiro contra o parasita (GONZÁLEZ et al., 1996;
KRETTLI; BRENER, 1976, 1982), como causando danos teciduais e modulando a
fisiologia dos órgãos acometidos (HERNÁNDEZ et al., 2003; STERIN-BORDA et al.,
2005).
O predomínio dos isotipos IgG1 e IgG3 identificados para os Ags-Recs CRA e
FRA não se diferencia das respostas imunes humorais identificadas para antígenos
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brutos fixados (MORGAN et al., 1996), vivos (CORDEIRO et al., 2001) e até mesmo
purificados de T. cruzi (MICHAILOWSKY et al., 2003). Sabe-se que, frente a
parasitas vivos, estes isotipos são capazes de ativar o sistema complemento,
contribuindo na resistência do hospedeiro contra infecção (KRETTLI; BRENER,
1976, 1982; CORDEIRO et al., 2001). Foi mostrado que o isotipo IgG1 lítico estava
presente em altos níveis em pacientes assintomáticos, podendo ser utilizado para
predizer o risco de dano cardíaco na doença de Chagas (CORDEIRO et al., 2001).
Um outro estudo, realizado por Romeiro et al. (1984) também mostrou que o isotipo
IgG2 também apresenta atividade lítica.
Alguns trabalhos já evidenciaram uma resposta imune humoral mais intensa
em pacientes que apresentam as formas severas da doença de Chagas em relação
àqueles que são assintomáticos ou que apresentam cardiomiopatia leve (GUSMÃO
et al., 1982; ZAUZA; BORGES-PEREIRA, 2001). Entretanto, não ficou evidenciado
os isotipos que poderiam estar envolvidos na imunopatologia dessas formas
severas.
Através dos nossos resultados, pudemos perceber que há uma diversidade
de respostas imune humoral frente aos Ags-Recs CRA ou FRA. Entretanto, apenas
o isotipo IgG2 específico para o Ag-Rec FRA foi capaz de discriminar pacientes
chagásicos portadores da forma CARD dos pacientes portadores da forma IND, visto
que os índices de reatividade deste isotipo foram significativamente superiores nos
pacientes que apresentaram a forma CARD (p= 0,010).
Elevados níveis deste isotipo foram encontrados em um grupo de indivíduos
chagásicos que eram geneticamente diferentes de um outro grupo, que
apresentavam maior freqüência de anormalidades eletrocariográficas (MOTRAN et
al., 1994). Também encontraram elevados níveis deste isotipo em pacientes
portadores das formas CARD e MIS, quando comparados aos níveis nos indivíduos
NC (MORGAN et al., 1996). Entretanto, não há relatos na literatura pesquisada
sobre a capacidade de discriminação de pacientes chagásicos que apresentem
diferentes manifestações clínicas, provenientes de diferentes regiões endêmicas da
doença de Chagas, utilizando-se tanto antígenos brutos (MORGAN et al., 1996)
como purificados de T. cruzi (MICHAILOWSKY et al., 2003; MOTRAN et al., 1994)
através do isotipo IgG2.
A hipótese de que a utilização de antígenos purificados, em substituição aos
antígenos brutos de T. cruzi, poderia revelar respostas isotípicas interessantes
V
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C
95
(MOTRAN et al., 1994; LORCA et al., 1992) foi, neste estudo, confirmada. A
natureza antigênica do Ag-Rec FRA proporcionou a diferenciação dos pacientes que
apresentam a forma CARD da doença de Chagas daqueles que são considerados
assintomáticos através do isotipo IgG2. Entretanto, a relevância da presença deste
isotipo na imunopatologia da cardiomiopatia chagásica ainda não é conhecida.
Este marcador, após ser avaliado num estudo prospectivo, poderia ser uma
ferramenta a mais na identificação de pacientes chagásicos assintomáticos com
potencial evolutivo para a forma CARD. O médico, ao identificar a possibilidade de
progressão da doença, redirecionaria a conduta do tratamento de seu paciente.
Os isotipos IgG1 e IgG3 específicos para os Ags-Recs CRA ou FRA, que
também foram selecionados como potenciais marcadores de evolução clínica,
apresentaram níveis elevados nos pacientes chagásicos como um todo,
independente da forma clínica apresentada por eles. Como os métodos
propedêuticos atualmente utilizados na determinação da forma clínica IND não são
sensíveis, pacientes com alterações cardíacas leves podem estar sendo agrupados
junto com os pacientes que apresentam a forma IND (DUTRA et al., 2005) e, assim,
a resposta humoral uniforme nas formas CARD e IND impossibiltou a diferenciação
destas através dos isotipos utilizados.
Em virtude dos vários estudos já publicados mostrando as funções protetoras
(KRETTLI; BRENER, 1976, 1982) e agressoras (GAZZINELLI et al., 1990;
HERNÁNDEZ et al., 2003; STERIN-BORDA et al., 2005) dos anticorpos na infecção
chagásica, os diferentes isotipos produzidos durante a infecção podem ter
importante significado na imunopatologia da doença de Chagas, no que se refere à
sua presença nas diferentes manifestações clínicas (LORCA et al., 1992). Assim, a
discriminação de pacientes que manifestam apenas alterações cardíacas daqueles
que manifestam alterações cardíacas e digestivas simultaneamente, a forma mista,
através de uma resposta imune humoral, seria difícil devido ao componente cardíaco
presente em ambos os grupos de pacientes.
Agradecimentos
Nós agradecemos a Mineo Nakazawa pela sua excelente assitência técnica, a
Carlos Luna, Ulisses Montarroyos, Vanessa e Alessandro pela assistência na análise
estatística, e as Dras. Cristina Tavares, Marisa Melo e Sílvia, e ao Dr. Jarbas Malta
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C
96
pela seleção de alguns pacientes chagásicos que participaram deste estudo. Este
trabalho foi financiado por Biomanguinhos/Fiocruz, (grant Nº ...), Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq e Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-CAPES. Yara M. Gomes é
pesquisadora do CNPq, Camila L. Carvalho, Myllena F. A. D. Melo e Raquel C. A.
Machado são bolsistas do PIBIC/Fiocruz, Alinne F. A. Verçosa e Virginia M. B.
Lorena são bolsitas da CAPES e cursam o mestrado de Saúde Pública do
CPqAM/Fiocruz.
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V
ERÇOSA
AFA A
PÊNDICE
C
100
CARD MIS IND NC
0
4
8
12
16
20
IgG1
DO (490nm)/CO
CARD MIS IND NC
0
2
4
6
8
10
IgG2
DO (490nm)/CO
CARD MIS IND NC
0
2
4
6
8
10
12
IgG3
DO (490nm)/CO
F
IGURA
1 – Índices de reatividade dos isotipos IgG1, IgG2 e IgG3 de pacientes chagásicos crônicos
portadores das formas CARD, MIS e IND, frente ao Ag-Rec CRA. O eixo das ordenadas apresenta os
índices de reatividade, resultantes da divisão entre a média de densidade óptica de cada amostra
pelo cut-off. Os símbolos representam os índices de reatividade de cada amostra. CO= cut-off; DO=
densidade óptica; CARD= forma cardíaca (n= 33); MIS= forma mista (n= 7); IND= forma
indeterminada (n= 20) e NC= não-chagásico (n= 20).
C)
A)
B)
VERÇOSA AFA APÊNDICE C
101
CARD MIS IND NC
0
6
12
18
24
30
36
42
IgG1
DO (490nm)/CO
CARD MIS IND NC
0
4
8
12
16
IgG2
DO (490nm)/CO
CARD MIS IND NC
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
IgG3
DO (490nm)/CO
CARD MIS IND NC
0
2
4
6
8
IgG4
DO (490nm)/CO
F
IGURA
2 – Índices de reatividade das subclasses de IgG de pacientes chagásicos crônicos
portadores das formas CARD, MIS e IND, frente ao Ag-Rec FRA. O eixo das ordenadas apresenta os
índices de reatividade, resultantes da divisão entre a média de densidade óptica de cada amostra
pelo cut-off. Os símbolos representam os índices de reatividade de cada amostra. † = isotipos que
podem ser diferenciados através deste isotipo (p= 0,010). CO= cut-off; DO= densidade óptica;
CARD= forma cardíaca (n= 33); MIS= forma mista (n= 7); IND= forma indeterminada (n= 20) e NC=
não-chagásico (n= 20).
C)
A)
B)
D)
†
†
A
NEXO
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