( PDF ) Avaliação do swab conjuntival para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina por PCR-hibridização

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“Avaliação do

swab

conjuntival para o diagnóstico da

leishmaniose visceral canina por PCR-hibridização”

Sidney de Almeida Ferreira

Dissertação apresentada como parte dos requisitos

para obtenção do grau de Mestre em Ciência e

Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais

2008

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Comissão Nacional de Energia Nuclear

CENTRO DE DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA NUCLEAR

Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e

Materiais

AVALIAÇÃO DO SWAB CONJUNTIVAL PARA O DIAGNÓSTICO DA

LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA POR PCR-HIBRIDIZAÇÃO

Sidney de Almeida Ferreira

Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em

Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais,

como requisito parcial à obtenção do Grau de Mestre.

Área de Concentração: Ciência e Tecnologia das Radiações.

Orientador: Dr. Antero Silva Ribeiro de Andrade.

Belo Horizonte

2008

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DEDICO

Dedico este trabalho a meus pais, os quais lançaram

os sólidos alicerces para que eu pudesse me apoiar e

chegar onde estou. Avante!

AGRADECIMENTOS

Agradeço, incondicionalmente:

A DEUS...

Aos meus pais, meus exemplos mais valiosos de honestidade, profissionalismo e sabedoria.

Aos meus irmãos, pelo aprendizado mútuo.

Ao Prof. Dr. Antero, pela orientação técnico-científica de alta qualidade e pelo constante

incentivo.

À professora Maria Norma de Melo pela excelente consultoria científica, sempre disposta,

desprendida e bastante agradável.

Ao Leonardo Ituassu pela essencial colaboração na coleta de amostras dos cães.

Aos membros do Centro de Controle de Zoonoses de Belo Horizonte, especialmente ao

Adamastor por sua diligência, ótimo humor e boa vontade.

Ao Prof. Marcos Silva pela excelente consultoria estatística.

Aos cães evolvidos nesse estudo, pois eles deram, literalmente, sangue e lágrimas por esse

trabalho.

Aos companheiros de laboratório: Luciana (por sua “vasta ironia”), Marcella (por me fazer

rir muito, afinal...eu peguei no seu pé...), Estefânia (pelos estudos e viagens juntos), Márcia

(pelo constante incentivo, simpatia e boa vontade no aprendizado), Fred (valeu pelas

caronas e pela festa ofertada para a galera do lab!), Juliana (pelas boas conversas de

bancada de laboratório), Baiano (pelo bom humor e pelo “eterno” sossego...acorda

Baiano!!), Bárbara (La belle de jour, daqui a pouco você entra para o horário integral...), à

carinhosa Marina e demais estagiários pela convivência, festas e afins.

Ao Zacarias e Geraldinho pela vital contribuição nas atividades técnicas no laboratório.

A todos da minha turma de mestrado pelas cervejas, festas, churrascos, sítios, basquete, e

todo o tipo de curtição: a turma mais animada que já vi. Aprontamos muito mais em três

meses de cadeirão do que em toda a graduação!!!

Aos colegas das outras turmas de mestrado: Carol, Karynne e Cíntia (pelo papo cabeça e

risadas sem fim...), Jack, Wellington (Cascão), Elizabeth, José Augusto, Tati e Patrícia

pelas excelentes conversas.

Aos grandes amigos de infância: Gustavo Martins e Kris Kristofeson, pelas rodas de violão

e pela parceria extremamente edificante.

Aos grandes amigos Daniel (“Great Big”), Andreza, Punk, Rafa & Cia. Talvez vocês não

saibam, mas as nossas farras e convivência foram imprescindíveis para que eu voltasse

renovado na segunda-feira seguinte e continuasse este trabalho sempre como se fosse a

primeira vez.

Aos amigos do esporte: Edmar, Conceição, Zezé, Rogerim, Vilmar, Nem & CIA pelas

disputas acirradas, porém construtivas e é claro, pela ótima convivência.

Aos amigos do PEMJA: Vivien, Cassimiro, Alê, Alex e Renata Top, seres diferenciados,

iluminados e elevados, sempre com diálogos altamente qualificados tanto para as coisas

“sérias como não sérias”...VIVA OS PEMJEROS!!!

À Eloísa, Fabíola Bono Fukushima e Rosângela pelos artigos, cães soronegativos e

amostras de DNA respectivamente. Vocês são peças fundamentais para a concretização

deste trabalho.

À Virgínia, Nivia, Lenira e Romário pelo auxílio essencial na biblioteca com artigos,

normalização, COMUT e tudo o mais.

Ao Machado por seu incentivo constante, seja pelo diálogo, seja por suas ótimas mensagens

em seu quadro de avisos.

Ao Eduardo pelas caronas para o CDTN e pelas ótimas conversas.

Aos membros da banca examinadora por terem aceitado o convite de participação.

À Comissão Nacional de Energia Nuclear (CNEN) pela bolsa concedida.

A todos os professores da pós-graduação do CDTN/CNEN.

Aos membros da secretaria da pós-graduação do CDTN/CNEN pelos serviços prestados.

E a todos que, de alguma forma, contribuíram para a conclusão deste projeto. Uma ação,

uma boa conversa, um pensamento construtivo que seja, foram, sem dúvida, de grande

valia.

MUITO OBRIGADO MESMO!!!

“E não vos conformeis com este mundo, mas transformai-vos pela renovação de

vosso entendimento.”

(Romanos 12:2)

“A ciência é uma interação equilibrada entre a mente e a natureza”

(Stephen Jay Gould)

VII

AVALIAÇÃO DO SWAB CONJUNTIVAL PARA O DIAGNÓSTICO DA

LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA POR PCR-HIBRIDIZAÇÃO

Sidney de Almeida Ferreira

RESUMO

A leishmaniose visceral (LV) no Brasil é causada pela espécie Leishmania chagasi (L.

infantum) e os cães são considerados o principal reservatório doméstico desse parasita.

Portanto, o diagnóstico correto e seguro é muito importante para evitar a transmissão da

doença ou o sacrifício desnecessário de cães. O objetivo deste trabalho foi avaliar o swab

conjuntival (SC), um método não invasivo de amostragem, para o diagnóstico da LV canina

por PCR-hibridização. Primeiramente, um teste in vitro foi delineado utilizando-se swabs

contaminados com 10

até 1,0 célula de L. chagasi. Três métodos de extração de DNA

foram testados: fenol-clorofórmio, kit Wizard

e fervura. Em seguida, dois grupos de 23

cães soropositivos foram utilizados. Foram feitos esfregaços por SC em ambos os olhos de

cada animal. A extração de DNA de SC foi realizada utilizando-se o método fenol-

clorofórmio no grupo 1 e a técnica de fervura no grupo 2. Além disso, sangue foi coletado

de cada cão sendo que 30µL foram aplicados em papel filtro (PF) e 1,0mL foi tratado para

obtenção do anel leucocitário (AL). A purificação de DNA para PF e AL foi realizada da

mesma forma em ambos os grupos utilizando-se kits comerciais. A análise de todas as

amostras foi feita por PCR seguida de hibridização com sondas de DNA marcadas com

O experimento com swabs contaminados com L. chagasi mostrou positividade na PCR para

até 25, 10 e 1,0 célula pelos métodos da fervura, kit Wizard® e fenol-clorofórmio

respectivamente. A hibridização aumentou a sensibilidade para até 10 e 1,0 célula pelos

métodos da fervura e kit Wizard® respectivamente. As positividades da PCR para os cães

VIII

do grupo 1 e 2 foram respectivamente: 73,9% e 52,2% (SC), 8,7% e 30,4% (AL), 8,7% e

17,4% (PF). A hibridização aumentou essas positividades para: 91,3% e 65,2% (SC),

21,7% e 34,8% (AL), 30,4% e 43,5% (PF) respectivamente. Os melhores resultados foram

obtidos pela associação de SC com o método de fenol-clorofórmio para extração de DNA.

O resultado final obtido desse tratamento foi estatisticamente diferente daqueles referentes

ao AL e PF no grupo 1 (p<0,01). No grupo 2, o resultado final proveniente do SC associado

com a técnica de fervura para o isolamento de DNA foi estatisticamente distinto apenas do

resultado referente ao AL (p<0,05). Concluiu-se que a combinação de SC com a extração

de DNA por fenol-clorofórmio é uma ferramenta valiosa para o diagnóstico da LV canina e

pode ser recomendada para o diagnóstico em cães sintomáticos.

Palavras-chave:

Leishmaniose visceral; PCR; Hibridização; Swab conjuntival; Diagnóstico; Cães.

EVALUATION OF THE CONJUNCTIVAL SWAB FOR CANINE VISCERAL

LEISHMANIASIS DIAGNOSIS BY PCR-HYBRIDIZATION

Sidney de Almeida Ferreira

ABSTRACT

The visceral leishmaniasis (VL) in Brazil is caused by Leishmania chagasi (L. infantum)

and dogs are considered to be the main domestic reservoir. Therefore the correct diagnosis

is very important in order to avoid the disease transmission or unnecessary culling of dogs.

The aim of this study was to evaluate the conjunctival swab (CS) as a noninvasive sampling

method for the canine VL diagnosis by the PCR-hybridization procedure. Firstly, an in

vitro test was carried out using cotton swabs seeded with 10

to one cell of L. chagasi.

Three DNA purification techniques were tested: phenol-chloroform, Wizard

kit and

boiling. After that, two groups of 23 seropositive dogs were used. CS samples were

obtained from both eyes of each animal. The DNA extraction from CS was performed by

the phenol chloroform method in group 1 and by boiling in group 2. In addition, blood was

collected from each animal so that 30µL were spotted onto filter paper (FP) and 1.0mL was

treated to obtain the buffy coat (BC). The DNA extraction from the BC and FP was

accomplished by the same way in both groups using commercial kits. The analysis of all

samples was made by PCR associated to the hybridization with

P labeled DNA probes.

The in vitro test with seeded parasites showed positivity to until 25, 10 and one cell for

boiling, Wizard® kit and phenol chloroform methods respectively. The hybridization step

increased the sensitivity until 10 and one cell for the boiling and Wizard® respectively. The

PCR positivities for the dogs in groups 1 and 2 were respectively: 73.9% and 52.2% (CS),

8,7% and 30.4% (BC), 8.7% and 17.4% (FP). The hybridization step increased the

positivities for: 91.3% and 65.2% (CS), 21.7% and 34.8% (BC), 30.4% and 43.5% (FP)

respectively. The best frequency of positivity was obtained by the association between CS

and the DNA extraction by phenol chloroform. The final result obtained from this treatment

was statistically different from the BC and FP data in group 1 (p<0,05). In group 2, the

result from CS associated with DNA purification by boiling was distinct only from the BC

data (p<0,05). We conclude that the CS associated with the DNA extraction by phenol

chloroform is a valuable tool for diagnosis of canine LV and can be recommended for

diagnosis of symptomatic dogs.

Key words

Visceral Leishmaniasis; Polimerase Chain Reaction (PCR); Hybridization; Conjunctival

Swab; Diagnosis; Dogs.

LISTA DE ABREVIATURAS

DNA: “Deoxyribonucleic Acid” (Ácido Desoxirribonucléico);

EDTA: “Ethylenediaminetetracetic Acid” (Ácido Etilenodiaminotetracético);

ELISA: “Enzyme Linked Immunosorbent Assay” (Ensaio Imunosorbente Ligado à

Enzima);

FUNASA: Fundação Nacional de Saúde;

Gp63: Glicoproteína de 63 kiloDaltons;

Hsp70: “70kDa Heat Shock Protein” (Proteína de Choque Térmico de 70 kiloDaltons);

kDNA: DNA de cinetoplasto;

LC: Leishmaniose Cutânea;

LV: Leishmaniose Visceral;

α MEM: “Minimum Essential Medium” (Meio Essencial Mínimo);

MeV: Megaeletronvolt;

OMS (WHO): Organização Mundial de Saúde (“World Health Organization”);

P: Fósforo trinta e dois;

pb: Pares de base;

PCR: “Polymerase Chain Reaction” (Reação em Cadeia da Polimerase);

RIFI: Reação de Imunofluorescência Indireta;

SDS: Sulfato Dodecil de Sódio;

SSC: “Solution of Sodium Citrate” (Solução de citrato de sódio);

TBE: Tris Borato EDTA;

TE: Tris EDTA.

XII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Distribuição mundial da leishmaniose cutânea. .................................................... 24

Figura 2: Distribuição mundial da leishmaniose visceral ..................................................... 24

Figura 3: Avaliação da sensibilidade a partir da contaminação artificial de swabs com

células de L. chagasi. ......................................................................................................... 51

Figura 4: Coleta de amostra pelo método de swab conjuntival. ........................................... 55

Figura 5: Processo de análise das amostras caninas para diagnóstico da leishmaniose por

PCR-hibridização. .............................................................................................................. 61

Figura 6: Resultado de dot blot referente aos produtos de PCR obtidos dos swabs

contaminados artificialmente com L. chagasi ............................................................... 65

Figura 7: Gel de agarose dos produtos de PCR referentes aos swabs conjuntivais da ocular

direita (D) dos cães do grupo 1. ..................................................................................... 68

Figura 8: Resultado de dot blot com produtos de PCR referentes aos swabs conjuntivais dos

cães do grupo 1. ............................................................................................................. 69

Figura 9: Gel de agarose dos produtos de PCR referentes ao anel leucocitário de cães do

grupo 1. .......................................................................................................................... 72

Figura 10: Resultado de dot blot com os produtos de PCR de anel leucocitário dos cães do

grupo 1. .......................................................................................................................... 73

Figura 11: Gel de agarose dos produtos de PCR referentes aos papéis filtros contaminados

com sangue de cães do grupo 1. .................................................................................... 75

Figura 12: Resultado de dot blot com produtos de PCR obtidos a partir de papéis filtros

contaminados com sangue dos cães do grupo 1. ........................................................... 76

Figura 13: Gel de agarose dos produtos de PCR referentes aos swabs conjuntivais da ocular

esquerda (E) de cães do grupo 2. ................................................................................... 79

Figura 14: Resultado de dot blot com produtos de PCR referentes aos swabs conjuntivais

dos cães do grupo 2. ....................................................................................................... 80

Figura 15: Gel de agarose dos produtos de PCR referentes ao anel leucocitário de cães do

grupo 2. .......................................................................................................................... 82

Figura 16: Resultado de dot blot com produtos de PCR de anel leucocitário dos cães do

grupo 2. .......................................................................................................................... 83

XIII

Figura 17: Gel de agarose dos produtos de PCR referentes aos papéis filtros contaminados

com sangue dos cães do grupo 2. ................................................................................... 86

Figura 18: Resultado de dot blot com produtos de PCR obtidos a partir de papéis filtros

contaminados com sangue dos cães do grupo 2. ........................................................... 87

Figura 19: Porcentagem de positividade da PCR seguida de hibridização para os swabs

conjuntivais das oculares direita e esquerda dos cães de ambos os grupos. .................. 88

Figura 20: Porcentagem de positividade para a PCR e PCR seguida de hibridização para as

amostras clínicas dos cães de ambos os grupos. ............................................................ 89

XIV

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Classificação dos cães do grupo 1. ....................................................................... 52

Tabela 2: Classificação dos cães do grupo 2. ....................................................................... 53

Tabela 3: Resultados da PCR para os swabs contaminados artificialmente com L. chagasi.

....................................................................................................................................... 64

Tabela 4: Resultados da PCR e hibridização para swabs conjuntivais dos cães do grupo 1.

....................................................................................................................................... 67

Tabela 5: Resultados da PCR e hibridização para anel leucocitário dos cães do grupo 1. ... 71

Tabela 6: Resultados da PCR e hibridização para papel filtro contaminado com sangue dos

cães do grupo 1. ............................................................................................................. 74

Tabela 7: Resultados da PCR e hibridização para os swabs conjuntivais dos cães do grupo

2. .................................................................................................................................... 78

Tabela 8: Resultados da PCR e hibridização para anel leucocitário dos cães do grupo 2. ... 81

Tabela 9: Resultados da PCR e hibridização para papel filtro contaminado com sangue dos

cães do grupo 2. ............................................................................................................. 85

Tabela 10: Análise estatística das positividades da PCR seguida de hibridização referentes

aos tratamentos envolvendo swabs e anel leucocitário para cães do grupo 1. ............... 91

Tabela 11: Análise estatística das positividades da PCR seguida de hibridização referentes

aos tratamentos envolvendo swabs e papel filtro contaminado com sangue para cães do

grupo 1. .......................................................................................................................... 91

Tabela 12: Análise estatística das positividades da PCR seguida de hibridização referentes

aos tratamentos envolvendo anel leucocitário e papel filtro contaminado com sangue

para cães do grupo 1. ..................................................................................................... 91

Tabela 13: Análise estatística das positividades da PCR seguida de hibridização referentes

aos tratamentos envolvendo swabs e anel leucocitário para cães do grupo 2. ............... 93

Tabela 14: Análise estatística das positividades da PCR seguida de hibridização referentes

aos tratamentos envolvendo swabs e papel filtro contaminado com sangue para cães do

grupo 2. .......................................................................................................................... 93

Tabela 15: Análise estatística das positividades da PCR seguida de hibridização referentes

aos tratamentos envolvendo anel leucocitário e papel filtro contaminado com sangue

para cães do grupo 2. ..................................................................................................... 93

SUMÁRIO

RESUMO.............................................................................................................................VII

ABSTRACT..........................................................................................................................IX

LISTA DE ABREVIATURAS.............................................................................................XI

LISTA DE FIGURAS.........................................................................................................XII

LISTA DE TABELAS.......................................................................................................XIV

1) INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 18

1.1) Manifestações clínicas da leishmaniose em humanos e os principais complexos de

espécies de Leishmania no Brasil ..................................................................................... 20

1.2) Epidemiologia das leishmanioses ................................................................................. 22

1.3) Epidemiologia da leishmaniose visceral no Brasil ........................................................ 25

1.4) O processo de urbanização da leishmaniose ................................................................. 28

1.5) O papel do cão no ciclo da leishmaniose ...................................................................... 30

1.6) Principais medidas profiláticas ..................................................................................... 32

1.7) Principais métodos de diagnóstico da leishmaniose visceral ........................................ 32

2) JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 37

3) OBJETIVOS ................................................................................................................... 45

3.1) Objetivo geral ............................................................................................................ 46

3.2) Objetivos específicos ................................................................................................. 46

4) MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... 47

4.1) Teste de contaminação artificial de swabs com células de Leishmania chagasi .......... 48

4.1.1) Extração de DNA por fenol-clorofórmio ................................................................ 48

4.1.2) Purificação de DNA genômico - Wizard

(Promega) ............................................ 49

4.1.3) Extração de DNA por fervura ................................................................................. 50

4.2) Cães ............................................................................................................................... 50

4.3) Coleta de amostras ........................................................................................................ 54

4.4) Extração de DNA das amostras caninas ........................................................................ 54

4.4.1) Extração de DNA dos swabs .................................................................................. 56

4.4.2) Tratamento dos papéis filtros contaminados com sangue ...................................... 56

4.4.3) Extração de DNA do anel leucocitário ................................................................... 56

4.5) PCR ............................................................................................................................... 57

4.6) Eletroforese em gel de agarose...................................................................................... 58

4.7) Dot Blot ......................................................................................................................... 58

4.8) Hibridização .................................................................................................................. 59

4.9) Análise estatística .......................................................................................................... 60

5) RESULTADOS ............................................................................................................... 62

5.1) Contaminação artificial de swabs .................................................................................. 63

5.2) Cães do grupo 1 ............................................................................................................. 66

5.2.1) PCR e hibridização para os swabs .......................................................................... 66

5.2.2) PCR e hibridização para anel leucocitário .............................................................. 70

5.2.3) PCR e hibridização para sangue em papel filtro ..................................................... 70

5.3) Cães do grupo 2 ............................................................................................................. 77

5.3.1) PCR e hibridização para os swabs conjuntivais ...................................................... 77

5.3.2) PCR e hibridização para anel leucocitário .............................................................. 77

5.3.3) PCR e hibridização para sangue em papel filtro ..................................................... 84

5.4) Síntese dos resultados referentes aos cães dos grupos 1 e 2 ......................................... 84

5.5) Análise estatística .......................................................................................................... 90

5.5.1) Grupo 1 ................................................................................................................... 90

5.5.2) Grupo 2 ................................................................................................................... 92

6) DISCUSSÃO ................................................................................................................... 94

7) CONCLUSÕES ............................................................................................................ 103

8) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 105

ANEXOS ........................................................................................................................... 113

ANEXO A: Artigo aceito para publicação. ........................................................................ 113

ANEXO B: Aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA-UFMG)

......................................................................................................................................... 120

1) INTRODUÇÃO

A leishmaniose é uma doença parasitária de caráter zoonótico e representa hoje um

grande problema de saúde pública mundial. Seus aspectos epidemiológicos são complexos,

dada a grande variedade de fatores envolvidos. Exemplos destes fatores são a diversidade

de hospedeiros, as diferentes espécies do agente etiológico e a dinâmica dos processos

ecológicos e sociais que determinam a distribuição geográfica dessa enfermidade.

Em relação ao agente etiológico da doença, são conhecidas cerca de 30 espécies

heteroxênicas, todas pertencentes à Ordem Kinetoplastida, Família Trypanosomatidae e

gênero Leishmania. Desse total, 13 ocorrem no continente americano (GRIMALDI; TESH,

1993). Estes parasitas são intracelulares obrigatórios quando presentes nos hospedeiros

vertebrados, se apresentando sob a forma amastigota. Nos hospedeiros invertebrados, as

0células de Leishmania se transformam nas formas promastigotas, as quais passam por dois

estágios de desenvolvimento bem distintos. O primeiro se caracteriza por células de alta

capacidade de divisão chamadas de promastigotas procíclicas. No segundo estágio, as

células de Leishmania passam a apresentar formato alongado, e um longo flagelo sendo

chamadas promastigotas metacíclicas, que se constituem na forma infectante para os

hospedeiros vertebrados (OLIVIER; GREGORY; FORGET, 2005).

O modo mais importante de sua transmissão se dá através da picada de fêmeas de

dípteros da família Psychodidae, subfamília Phlebotominae, conhecidos como

flebotomíneos. No Velho Mundo, as espécies transmissoras do parasita se incluem no

gênero Phlebotomus, enquanto que, no Novo Mundo, predomina o gênero Lutzomyia

(GRIMALDI; TESH, 1993; DESJEUX, 1996).

Inicialmente, as espécies de Leishmania tinham sua caracterização baseada em

dados clínicos e geográficos. Posteriormente, foi utilizado também como critério, o

comportamento desses protozoários em cultura, nos vetores e em outros hospedeiros

(ANDRADE, 2000). Desde os anos 80, muitos métodos bioquímicos, imunológicos e de

biologia molecular têm sido desenvolvidos para detectar e caracterizar espécies desse

protozoário com resultados promissores. A identificação de subgêneros, espécies e cepas

têm sido possível mediante a utilização de zimodemos que são perfis eletroforéticos de

isoenzimas (CARVALHO et al., 2006), (CUPOLILLO; GRIMALDI; MOMEN, 1994).

Além disso, padrões eletroforéticos de DNA gerados por restrição enzimática são também

um importante recurso para determinação de espécies de Leishmania (DEGRAVE, et al.,

1994).

1.1) Manifestações clínicas da leishmaniose em humanos e os principais complexos de

espécies de Leishmania no Brasil

Quanto ao caráter clínico, a leishmaniose é polimórfica para os humanos e apresenta

algumas manifestações principais a saber:

• Leishmaniose visceral (LV). É também chamada de calazar e é considerada uma doença

crônica e sistêmica. Nesta modalidade, os parasitas demonstram tropismo pelas células

do sistema fagocitário mononuclear do fígado, baço, medula óssea e tecidos linfóides.

Os sintomas clássicos que podem ocorrer nos indivíduos afetados são acessos febris

irregulares, palidez cutâneo-mucosa e hepatoesplenomegalia. A LV é considerada a

forma mais grave da doença, sendo fatal em 95% dos casos não tratados;

• Leishmaniose tegumentar: Existem duas formas principais que dependem da espécie

envolvida do agente etiológico e da resposta imune do hospedeiro:

a) Leishmaniose cutânea (LC): Nessa forma, uma lesão bem delimitada, ulcerada ou não,

se desenvolve no local da picada do inseto vetor e pode se curar espontaneamente ou

persistir por longo tempo. Em algumas situações, a lesão pode se difundir especialmente

nos pacientes imunodeprimidos.

b) Leishmaniose mucocutânea: Essa manifestação caracteriza-se por progressão lenta e

crônica. Implica em metástases da lesão primária, as quais podem atingir as mucosas

nasobucal e faringiana, causando destruição extensiva e desfigurante de tecidos moles e

cartilagens, o que pode incapacitar o indivíduo para o trabalho e o convívio social.

A classificação dos parasitas do gênero Leishmania é muito importante para o estudo de

qualquer aspecto relacionado a estes protozoários e às doenças por eles causadas. Há

algumas décadas, a classificação das espécies de Leishmania e a confirmação de sua

participação em lesões humanas eram muito conflitantes. A taxonomia desses parasitas

também apresentava problemas. Isso levou alguns especialistas a reunirem as espécies de

Leishmania em grandes grupos ou complexos, tendo como base, critérios essencialmente

biológicos (LAINSON; SHAW, 1972, 1987). Os principais complexos existentes no Brasil

são: Leishmania (Viannia) braziliensis, L. (L.) mexicana e L. (L.) donovani. As espécies

predominantes em território nacional referentes a esses três complexos são

respectivamente: L. braziliensis, causadora da forma cutânea ou mucocutânea, L.

amazonensis responsável pela manifestação cutânea localizada ou difusa, e L. chagasi,

causadora da forma visceral da doença.

Todos os tipos da doença podem começar com uma pequena lesão cutânea, mas o

subseqüente desenvolvimento e prognóstico são determinados, em grande parte, pela

espécie de Leishmania envolvida (GRIMALDI; TESH, 1993).

1.2) Epidemiologia das leishmanioses

Em termos globais, a leishmaniose é a terceira moléstia mais importante dentre as

veiculadas por vetores, ficando aquém apenas da malária e da filariose linfática (DAVIES;

REITHINGER, 2002). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a leishmaniose é

endêmica em 88 países, aproximadamente 14 milhões de pessoas são consideradas

infectadas e outras 350 milhões estão expostas a situações de risco. São notificados, por ano

no mundo, cerca de 2 milhões de novos casos dessa enfermidade sendo que a LC contribui

com aproximadamente 1,5 milhão de casos enquanto a forma visceral tem 500 mil registros

(WHO, 2007).

Verifica-se que a leishmaniose possui hoje uma distribuição geográfica muito maior

em relação ao passado e novos casos têm sido relatados em regiões previamente não

endêmicas (WHO, 2002b). Isso se deve, em grande parte, à adaptação do vetor em novas

áreas, ao ressurgimento da leishmaniose como doença oportunista nas infecções com o

vírus da imunodeficiência humana (HIV), urbanização não planejada, desflorestamento,

resistência do parasita a drogas e dificuldades econômicas de grande parte dos países

afetados (DESJEUX, 2004), (REITHINGER; DUJARDIN, 2007).

Na realidade, os dados numéricos relativos à prevalência e à abrangência da

leishmaniose são apenas aproximações, pois, de todos os países assolados, apenas 33 têm

obrigatoriedade de notificar os casos da doença. Somado a isso, a transmissão da

leishmaniose continua a ocorrer em regiões rurais remotas desprovidas de quaisquer

políticas públicas de saúde, permanecendo muitos casos sem a devida comprovação (WHO,

2007). Portanto, os dados oficiais são certamente subestimados.

As nações mais afetadas por esta enfermidade são indiscutivelmente as consideradas

subdesenvolvidas nas quais se incluem a maioria absoluta dos casos confirmados em

humanos. Dos 88 países em que ocorre essa moléstia, 72 são subdesenvolvidos (WHO,

2002a). O sudoeste asiático e a América Latina apresentam alguns países que respondem

juntos pela maior parte dos casos de leishmaniose no mundo (FIG. 1 e FIG. 2). O Brasil

integra a lista das nações mais afetadas pelas duas principais formas da doença: a visceral,

com 90% dos casos em Bangladesh, Brasil, Índia, Nepal e Sudão bem como a tegumentar

com 90% dos casos no Afeganistão, Argélia, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Sudão. O

tratamento, especialmente para a LV, é caro e de difícil acesso para a grande maioria de

pessoas que vivem em estado de pobreza, as quais constituem a parcela da população mais

vulnerável à doença. Com isso, tem-se observado um aumento nos fatores de risco para

leishmaniose (DESJEUX, 2001), (WHO, 2007).

Um fator agravante que dificulta o controle da leishmaniose nos países endêmicos é

a contínua negligência do setor privado da economia. Os investimentos no desenvolvimento

de novas drogas e métodos diagnósticos nessas nações têm ficado sob responsabilidade do

setor público, o qual, não raro, enfrenta escassez de recursos e falta de infra-estrutura

adequada (GONTIJO; MELO, 2004).

Figura 1: Distribuição mundial da leishmaniose cutânea.

Fonte: WHO, 2007.

Figura 2: Distribuição mundial da leishmaniose visceral

Fonte: WHO, 2007.

Em relação à LV, são conhecidas três espécies do agente etiológico. No Sudão,

Kênia, Nepal, Bangladesh, China Oriental, Paquistão e Índia predomina L. donovani e

nessas regiões a doença tem caráter antroponótico. No sudeste asiático, nordeste da China,

norte da África e Europa mediterrânea, prevalece L. infantum enquanto que L. chagasi está

presente nas Américas (TAVARES; FERNANDES; MELO, 2003). Nestes dois últimos

casos, a LV assume um perfil zoonótico. Estas duas últimas espécies eram antes

consideradas diferentes, porém estudos de caracterização molecular feitos por Mauricio e

colaboradores (2000), indicaram serem elas indistingüíveis.

Sessenta e cinco países são considerados endêmicos para LV e estima-se que 200

milhões de pessoas estão sob condições de risco de contaminação. O número de óbitos

anuais registrados chega a 59.000 e este é somente ultrapassado pelo número de mortes

causadas pela malária dentre as doenças parasitárias (ALVAR; YACTAYO; BERN, 2006).

Dada a ampla abrangência e o significativo aumento de casos da doença, o Programa

Especial de Pesquisas e Treinamento em Doenças Tropicais (TDR), vinculado à OMS,

considera a leishmaniose uma prioridade em suas pesquisas dentre as 10 principais

endemias tropicais do mundo (WHO, 2007).

1.3) Epidemiologia da leishmaniose visceral no Brasil

Especificamente em relação ao Brasil, a LV demonstra ampla distribuição atingindo

as regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste. Por isso, a LV possui aspectos

geográficos e sociais bem diferenciados e complexos. Das 27 unidades federativas do país,

19 possuem casos autóctones registrados da doença totalizando cerca de 1.600 municípios

afetados. A região Nordeste concentrou mais de 90% dos casos humanos na década de 90 e

atualmente responde por 67% do total de casos no país (ELKHOURY, 2005).

A partir dos anos 90, novos surtos e focos da doença foram registrados nos estados

do Pará e Tocantins (região Norte), Mato Grosso do Sul (região Centro-Oeste), bem como

Minas Gerais e São Paulo (região Sudeste). Estas regiões passaram então a influir

significativamente nas estatísticas da LV no Brasil. A partir daí, vem ocorrendo uma

tendência crescente da incidência de casos de LV até então. Esse aumento vem ocorrendo

de maneira mais pronunciada desde 1999 (FUNASA, 2002). Cerca 3.500 casos de LV são

notificados, em média, a cada ano no país. As taxas de letalidade, segundo registros

oficiais, chegam a 10% em algumas localidades (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007a).

A LV ocorre tipicamente em regiões caracterizadas por baixo nível socioeconômico

o que é muito comum em áreas rurais e periurbanas do Brasil. No entanto, esse quadro vem

se modificando especialmente nos estados das regiões Centro-Oeste e Sudeste, onde a LV

vem sofrendo um processo de urbanização (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003).

A espécie do agente etiológico presente no Brasil para LV é L. chagasi e esta possui

como reservatórios silvestres, as raposas e marsupiais. Estes animais possuem hábitos

sinantrópicos e isso provavelmente está relacionado à ligação entre os ciclos silvestre e

doméstico da doença. Entretanto, mais estudos são necessários para elucidar o real papel

desses animais no ciclo de transmissão da LV. No ambiente domiciliar, o cão é o principal

hospedeiro de L. chagasi. Os flebótomos Lutzomyia longipalpis e Lutzomyia cruzi estão

diretamente relacionados com a transmissão da doença. A primeira espécie é considerada a

principal transmissora de L. chagasi no Brasil. A segunda espécie foi posteriormente

apontada como vetor no estado do Mato Grosso do Sul (SANTOS, et al., 1998).

A LV pode ocorrer em pessoas de qualquer idade, mas tem se observado que, em

grande parte das regiões endêmicas brasileiras, cerca de 59% dos casos registrados são de

crianças de até 10 anos, sendo que 46% desses casos são registrados em menores de 5 anos

(ELKHOURY, 2005). Essa maior vulnerabilidade pode estar relacionada a uma

susceptibilidade imunológica agravada pela desnutrição infantil muito comum nas regiões

mais assoladas pela doença, além de uma maior exposição ao flebotomíneo no

peridomicílio. Por outro lado, nas regiões urbanas, existem também altos índices de

infecção para o público de adultos jovens (SILVA, et al., 2001a). O sexo masculino é mais

atingido pela LV com 60% dos casos registrados (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003).

O Brasil detém a maior parte de casos registrados de LV na América Latina

(MILES, et al., 1999). Seu comportamento epidemiológico é cíclico, com elevação do

número de casos em intervalos médios de 5 anos (ELKHOURY, 2005).

Um programa de combate e controle da LV surgiu no Brasil na década de 50 e tinha

como principal objetivo interromper a cadeia de transmissão da doença. No entanto, tal

iniciativa mostrou-se ineficiente ao longo das últimas décadas o que levou o Ministério da

Saúde e a Fundação Nacional de Saúde (FUNASA) a convocarem um comitê para

reexaminar seu plano de ação (COSTA, 2001). Esta reavaliação vem sendo orientada por

estudos científicos e outros fatores de ordem operacional como: constatação de que outros

reservatórios como raposas e marsupiais podem ser fontes de transmissão dos parasitas;

conflitos entre os estudos a respeito do real impacto do sacrifício de cães sobre a infecção

humana; existência de pouco conhecimento sobre o impacto das estratégias de combate ao

vetor; inexistência de uma padronização dos métodos diagnósticos da doença em humanos

e em cães (GONTIJO; MELO, 2004).

Desde 1993, Belo Horizonte vem sofrendo com o acréscimo de casos humanos e

caninos da LV. Sabe-se hoje que a doença foi introduzida nessa capital a partir de um

município vizinho (GONTIJO; MELO, 2004). De fato, na região metropolitana de Belo

Horizonte, houve um aumento no número de municípios com notificação da doença de 6 no

biênio 94/95 para 15 no biênio 98/99 (LUZ, et al., 2001), (SILVA, et al., 2001a). De

acordo com dados da Secretaria de Vigilância em Saúde, Belo Horizonte foi o terceiro

município brasileiro mais afetado pela LV em 2006, ficando atrás somente de Fortaleza e

Campo Grande (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007b).

1.4) O processo de urbanização da leishmaniose

O estabelecimento de uma doença parasitária em uma determinada região depende

fundamentalmente da presença de hospedeiros e vetores igualmente susceptíveis. No

passado, a leishmaniose possuía um caráter essencialmente silvestre dado que o inseto vetor

vive naturalmente em regiões de mata e de florestas. No entanto, a colonização humana

abrupta, descontrolada e intensa nas áreas naturais reduziu drasticamente o habitat natural

dos flebotomíneos bem como a disponibilidade de seus hospedeiros naturais. Tais fatores

permitiram que o inseto vetor se adaptasse muito bem ao ambiente peridomiciliar próximo

onde passou a infectar, via repasto sangüíneo, o cão e o homem. Isso fez com que a

leishmaniose adquirisse um caráter tipicamente rural.

Por outro lado, a enfermidade vem se urbanizando cada vez mais. Isso se deve a

diversos fatores como a globalização econômica, a concentração de riquezas, êxodo rural

proveniente de regiões mais pobres, desmatamentos, alta densidade populacional e à grande

susceptibilidade da população à doença. Em 1950, menos de um terço da população

mundial vivia nas cidades. Hoje, mais de 50% desta está nas grandes metrópoles e é

estimado que mais de 5 bilhões de pessoas estejam nas regiões urbanas dentro de 50 anos

(DAULAIRE, 1999). Na América do Sul, mais de 70% da população é urbanizada. Isso

tende a levar endemias rurais para áreas metropolitanas onde a concentração humana e a

presença de vetores aumentam a incidência de doenças. Ao mesmo tempo, houve grande

proliferação de subúrbios pobres onde os cães vadios são numerosos e as condições

sanitárias e nutricionais são precárias. As restrições alimentares graves associadas com a

presença de indivíduos imunossuprimidos como os portadores do vírus HIV expõem uma

parcela significativa de pessoas extremamente vulneráveis ao avanço da leishmaniose

(DESJEUX; ALVAR, 2003).

Paralelamente, o flebótomo acabou por encontrar no ambiente urbano um habitat

favorável à sua reprodução. Como resultado, o Lutzomyia longipalpis, por exemplo, tornou-

se muito numeroso nessas regiões o que tem aumentado o número de casos da doença

(WHO, 2002b).

Todo esse panorama se deve a mudanças comportamentais de caráter sócio

ambiental as quais têm provocado impactos sem precedentes. O aumento e a expansão da

LV para áreas urbanas e periferias estão também relacionados às migrações humanas,

envolvendo o transporte de cães infectados para regiões onde o inseto vetor já existe

(ARIAS, et al., 1996). A partir disso, criaram-se condições concretas para a transição

efetiva do ciclo rural da doença para o ciclo em grandes metrópoles e regiões periféricas.

A adaptação do vetor aos ambientes urbanos foi concretamente comprovada no

Brasil no final da década de 80. Nesse cenário, os flebotomíneos passaram a ser

encontrados em paióis, canis e também no ambiente intradomiciliar. Desde então, muitas

cidades brasileiras como Fortaleza (CE), Aracaju (SE), Santarém (PA), Corumbá (MS),

Palmas (TO), Araçatuba (SP), Teresina (PI), Natal (RN), São Luís (MA), Campo Grande

(MS), Montes Claros e Belo Horizonte (MG) vêm apresentando, de maneira preocupante,

mais casos autóctones da doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2007a).

Por ser a urbanização da LV no Brasil um evento relativamente recente, pouco se

sabe sobre sua epidemiologia no meio urbano. As relações entre os componentes da cadeia

de transmissão da doença nas cidades e regiões adjacentes brasileiras parecem ser bem mais

complexas e diversificadas do que no ambiente rural e carecem de mais estudos para serem

inteiramente explicadas (GONTIJO; MELO, 2004).

1.5) O papel do cão no ciclo da leishmaniose

Em relação aos diversos hospedeiros da L. chagasi, o cão assume um papel central

na manutenção do ciclo da enfermidade dada a grande susceptibilidade desse animal e à sua

proximidade com o homem. Nas regiões brasileiras endêmicas da doença, os cães são

muito expostos ao flebótomo, pois freqüentemente dormem ao relento e próximos às aves

domesticadas. Estas são refratárias à moléstia, mas atraem fortemente os insetos vetores

(BRUCE, et al., 2002). A pele canina, uma vez infectada, passa a apresentar altos níveis de

amastigotas o que aumenta a chance de contaminação de outros flebotomíneos.

Em geral, a doença no cão é crônica e sistêmica. Porém, a forma aguda e grave pode

ocorrer levando o animal à morte em poucas semanas. Após a infecção da pele em cães

susceptíveis, há a disseminação do parasita para vários órgãos e posteriormente surgem os

sintomas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003). As manifestações clínicas clássicas incluem

lesões na pele como dermatite exfoliativa e ulcerações, alopecia, perda de peso, caquexia,

onicogrifose, linfoadenopatia, esplenomegalia e falência renal sendo esta última uma das

principais causas de óbito (MORENO; ALVAR, 2002). A alopecia gerada pela infecção

expõe maiores áreas da pele extensamente parasitadas o que facilita ainda mais a infecção

de outros flebotmíneos. A extensão dos sinais clínicos está intimamente relacionada com o

tipo de resposta imunológica apresentada pelo animal infectado.

Estudos com infecções experimentais em cães mostraram que o período de

incubação é bastante variável girando em torno de três meses a vários anos (ANDRADE,

2000). Então, é comum o fato de muitos animais infectados não apresentarem sintomas

clínicos durante um longo tempo, o que prejudica os levantamentos epidemiológicos e o

combate à doença. De acordo com dados estatísticos, cerca de 52% dos cães infectados

assintomáticos podem evoluir para cura espontânea, 12% permanecem longo tempo

parasitados e sem sintomas e 36% manifestam a doença mais tarde (NEVES, 2006).

Tem sido amplamente relatado que o fluxo de transmissão da LV é independente da

extensão dos sintomas apresentados pelo cão. Há relatos de que cães soropositivos

assintomáticos permitiram a transmissão do parasito para flebotomíneos (SOLANO-

GALLEGO, et al., 2001), (SOUZA, et al., 2001), (ALVAR, et al., 2004). Sendo assim, os

cães são um reservatório competente e importante do protozoário em questão. Essa

relevância foi confirmada mediante observações especialmente nas zonas urbanas com

transmissão recente onde os casos caninos da doença precederam os casos humanos. Nessas

regiões, foi comprovada uma associação na distribuição espacial da LV em cães e no

homem (DI LORENZO; PROIETTI, 2002).

1.6) Principais medidas profiláticas

O Ministério da Saúde recomenda três medidas básicas de controle: tratamento

precoce das pessoas infectadas, combate ao vetor e eliminação dos cães infectados

(PALATNIK-DE-SOUZA, et al., 2001). Portanto, o diagnóstico da leishmaniose canina é

uma etapa fundamental no controle da enfermidade e inquéritos extensivos para a

sondagem de animais contaminados têm sido preconizados. O diagnóstico deve ser feito, de

preferência, de uma maneira precoce através de um método suficientemente confiável e

robusto. Ainda hoje, o desenvolvimento e a padronização de uma técnica enquadrada

nesses critérios e que seja rápida, barata e de simples manuseio permanecem como

objetivos a serem alcançados.

Nesse contexto, tem sido ressaltada nos últimos anos a necessidade de uma maior

aproximação e sinergia entre pesquisadores e agentes de saúde pública no combate à

doença. Diante das dificuldades operacionais de combate à LV especialmente nas regiões

urbanas, tornam-se necessários mais investimentos na área técnico-científica e

aperfeiçoamento das estratégias de controle e vigilância da doença. Todas essas medidas

devem ser integradas de modo que elas possam ser mais efetivas (ELKHOURY, 2005).

1.7) Principais métodos de diagnóstico da leishmaniose visceral

Para um diagnóstico mais seguro da LV, recomenda-se a combinação de diferentes

métodos uma vez que essa doença apresenta um amplo espectro clínico tanto em humanos

(REITHINGER; DUJARDIN, 2007) quanto em cães (GONTIJO; MELO, 2004) e ainda

não existe um teste 100% específico e sensível (ALVAR, et al., 2004). Sendo assim, é

muito importante considerar conjuntamente dados laboratoriais, clínicos e epidemiológicos

para a realização do diagnóstico do calazar.

Um diagnóstico definitivo da LV canina exige a detecção direta do parasita. Para

sua demonstração, são comumente utilizados materiais de biópsias ou aspirados de medula

óssea, linfonodos, baço ou fígado (REITHINGER; DUJARDIN, 2007). Com o material

coletado são feitos esfregaços e colorações específicas em lâminas para análise

microscópica e detecção de formas amastigotas do parasita. Para isso, a lâmina deve ser

exaustivamente examinada antes de ser considerada negativa (DIETZE, 2005).

Podem ser feitos também cortes histológicos, inoculação de aspirados em animais

de laboratório ou cultura in vitro em meio bifásico (GOMES, et al., 2006). Essa modalidade

de diagnóstico é considerada um padrão ouro, pois apresenta alta especificidade e, diante da

positividade, não há dúvida quanto à presença da infecção. No entanto, a forma de coleta de

amostras envolvida nesses procedimentos é invasiva, possui contra-indicações e pode

causar complicações mais sérias em algumas ocasiões (GUERIN, et al., 2002).

Devido à freqüente ausência de sintomas clínicos nos cães e à dificuldade da

detecção direta do parasito, o diagnóstico rápido e indireto da infecção canina tem se

transformado em uma parte essencial dos programas de controle (BADARÓ, 1988). Muitos

métodos de diagnóstico sorológico freqüentemente utilizados nestes programas apresentam

sensibilidades variando de 80% a 100%, e especificidades que vão de 80% a 98% (REED,

et al., 1990). Tais testes partem do pressuposto de que a maioria ou todos os animais

infectados desenvolvem uma resposta imunológica humoral específica a qual pode ser

detectada pelas metodologias disponíveis.

Nas áreas endêmicas do Brasil, onde a prevalência da LV é a maior das Américas,

os cães são periodicamente analisados por sorologia, geralmente pela reação de

imunofluorescência indireta (RIFI) e o imunoensaio ou ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay), (BADARÓ; REED; CARVALHO, 1981) (DIETZE, 2005). Ambos

os testes envolvem a utilização de antígenos brutos e possuem algumas limitações quanto à

sua especificidade e reprodutibilidade (SUNDAR; RAI, 2002), (SINGH, 2006). Nos

últimos anos, novos antígenos purificados e recombinantes contendo epítopos específicos

de L. chagasi e L. donovani têm sido obtidos, e com eles, melhores sensibilidades e

especificidades vêm sendo apresentadas (GOMES, et al., 2006). O teste RIFI é considerado

menos sensível e mais específico do que o método de ELISA (GONTIJO; MELO, 2004).

Estas metodologias têm sido normalmente escolhidas para a realização de inquéritos

populacionais.

Os resultados da RIFI são normalmente expressos em diluições em que

normalmente se considera um resultado positivo com um título igual ou superior a 1:40. No

caso do ELISA, os resultados são medidos em unidades de absorbância com base em

espectrofotometria na qual podem ser utilizadas diluições fixas (resultado quantitativo) ou

somente presença ou ausência de reação (resultado qualitativo), (DIETZE, 2005).

Badaró e colaboradores (1996), desenvolveram o Teste Rápido Anticorpo

Leishmania donovani (TRALd) que se baseia num método imunocromatográfico no qual a

proteína recombinante de L. chagasi rK39 é fixada em membrana de nitrocelulose. Esse

procedimento se revelou simples e rápido e permitiu a obtenção de bons resultados no

diagnóstico em cães e humanos. No entanto, a mesma técnica foi incapaz de detectar

infecção em animais com baixos títulos de RIFI (GENARO, et al., 1997).

Outro tipo de diagnóstico é baseado em testes moleculares os quais permitem a

detecção de seqüências de DNA específicas do parasita. A Reação em Cadeia da

Polimerase ou Polymerase Chain Reaction (PCR) é um importante exemplo e é um

procedimento que permite a amplificação de segmentos de DNA em até 1.000.000 de

vezes. Existem diferentes alvos de amplificação no genoma de Leishmania que já foram

descritos para diagnóstico. Esses são normalmente seqüências repetitivas e/ou polimórficas.

Como exemplos, tem-se os genes para o RNA ribossomal e seus espaçadores, β-tubulina,

locus gp63, hsp70, cisteino proteinases e minicírculos do DNA de cinetoplasto (kDNA),

(REITHINGER; DUJARDIN, 2007; SINGH, 2006). Este último tem sido considerado um

dos melhores alvos para PCR sendo que podem ser amplificados os minicírculos completos

ou somente suas regiões conservadas (GONTIJO; MELO, 2004). Na era pós genômica,

vem ocorrendo a identificação e a caracterização de um número cada vez maior de

seqüências nucleotídicas potenciais de Leishmania para novos alvos de PCR. Isso contribui

para aumentar a versatilidade dessa técnica.

Vários sistemas de detecção baseados na PCR foram desenvolvidos (SCHALLIG;

OSKAM, 2002), e a busca de sua padronização é tida como um importante objetivo para os

programas de controle da leishmaniose (WHO, 2002a). Muitos trabalhos já demonstraram a

aplicabilidade da PCR para o diagnóstico da leishmaniose canina indicando ser esta uma

técnica mais sensível e específica do que os métodos tradicionais (MANNA, et al., 2004)

(REALE, et al., 1999), (SILVA, et al., 2001c), (STRAUSS-AYALI, et al., 2004).

Resultados diagnósticos mais precisos são obtidos quando a PCR é combinada com

outros métodos moleculares como a hibridização de sondas de DNA (HEADINGTON, et

al., 2002). Este foi o primeiro procedimento em biologia molecular a ser desenvolvido para

fins diagnósticos e hoje já se dispõe de diferentes sondas específicas tanto para seqüências

genéticas nucleares quanto para regiões do genoma mitocondrial de Leishmania

(DEGRAVE, et al, 1994). Foi demonstrado em alguns estudos que o uso de sondas de

kDNA permitiu a distinção entre os complexos L. braziliensis e L. mexicana. Junto a essas

pesquisas, percebeu-se que os minicírculos de kDNA contêm regiões com diferentes

especificidades taxonômicas. Com esta evidência, sugeriu-se que as seqüências de kDNA

vêm sofrendo diferentes taxas de divergência evolutiva. Esta característica pode ser útil

para diagnósticos na medida em que ela pode auxiliar a identificar e diferenciar com mais

segurança os subgêneros de Leishmania. Também foi relatado que as sondas de kDNA têm

um importante potencial para a realização de estudos de caráter epidemiológico (ROGERS;

WIRTH, 1987).

Para o processo de hibridização, as técnicas Dot-Blot e Southern Blot são

comumente utilizadas. A primeira consta da aplicação dos produtos de PCR desnaturados

em uma membrana, normalmente de nylon a qual recebe posteriormente as sondas

marcadas, por exemplo, com radioisótopos como o

P. Quanto ao Southern blot, as

amostras de DNA presentes num gel de agarose são desnaturadas. Em seguida, uma

membrana de nitrocelulose ou nylon é colocada e pressionada sobre o gel permitindo que o

DNA passe para ela por capilaridade. Após isso, o ácido nucléico é fixado e a membrana é

tratada com sondas marcadas complementares à seqüência alvo do DNA do parasita. Após

a auto-radiografia é feita a revelação e a verificação dos resultados. Estas técnicas têm se

mostrado adequadas para a detecção de fragmentos de DNA de Leishmania (BOZZA, et al,

1995), (SILVA, et al, 2004).

Neste trabalho a reação de PCR foi utilizada com iniciadores endereçados para a

região conservada dos minicírculos de kDNA (DEGRAVE, et al., 1994). Os produtos

amplificados foram hibridizados com sondas constituídas de minicírculos clonados de L.

chagasi e marcados com

2) JUSTIFICATIVA

O cão é considerado o principal reservatório de L. chagasi e fonte importante de

infecção para o vetor. Portanto, é fundamental que os cães sejam submetidos aos testes

diagnósticos rotineiros. O diagnóstico correto é muito importante para evitar a eliminação

de cães não infectados e para identificar devidamente os animais contaminados. Essa

medida se constitui em um dos fundamentos para o controle da LV.

As metodologias usualmente utilizadas para o diagnóstico da LV canina ainda

apresentam deficiências, de forma que ainda hoje permanece o desafio para obtenção de um

método sensível, específico, simples, rápido e de baixo custo.

Em relação à análise clínica, existe uma dificuldade recorrente relacionada ao fato

de muitos sinais da enfermidade no cão serem muito parecidos com os de outras doenças

infecciosas (GRIMALDI; TESH, 1993). Outro problema está no amplo espectro de sinais

clínicos apresentados pelos cães. Nesse caso, os animais vão de uma faixa de

aparentemente saudáveis (assintomáticos) até estágios severos da doença (sintomáticos),

perpassando por estágios intermediários com poucos sintomas (oligossintomáticos)

(GONTIJO; MELO, 2004).

Os exames parasitológicos baseados em microscopia e cultura de parasitas são

laboriosos, demorados, requerem formas invasivas de amostragem e apresentam

sensibilidade baixa ou muito variável (SILVA, et al., 2006). A baixa sensibilidade se deve à

ocorrência comum de animais assintomáticos e ao fato da distribuição dos parasitas ser

heterogênea num mesmo tecido (GONTIJO; MELO, 2004), (IKONOMOPOULOS, et al.,

2003), (REITHINGER, et al., 2003).

Os testes sorológicos de diagnóstico estão bem estabelecidos e são de uso mais

freqüente. No caso canino, os métodos comumente empregados são a RIFI e a técnica de

ELISA. Com a utilização de antígenos brutos, tais técnicas têm apresentado problemas

quanto à especificidade e reprodutibilidade. Melhores resultados têm sido apresentados a

partir da utilização de proteínas antigênicas purificadas e/ou recombinantes. No entanto,

sua obtenção é em muitas vezes demorada e requer procedimentos laboratoriais muito

sofisticados (TAVARES, FERNANDES; MELO, 2003). Tais métodos têm se mostrado

efetivos em detectar leishmaniose ativa, na qual grandes quantidades de anticorpos estão

presentes nos hospedeiros. No entanto, a eficiência pode diminuir quando essas técnicas são

utilizadas em regiões endêmicas onde é comum a existência de animais imunossuprimidos

(FISA, et al., 2001). Com isso, pode-se não detectar os baixos níveis de anticorpos

presentes nesses animais e resultados falsos negativos podem ocorrer o que subestima a

prevalência da infecção nos cães (SILVA, et al., 2001c).

Um resultado positivo de RIFI em um cão clinicamente suspeito assume grande

relevância. Por outro lado, um resultado negativo não exclui a possibilidade de infecção,

pois, além da possibilidade da imunossupressão, podem existir alguns animais capazes de

desenvolver imunidade celular predominante sobre a imunidade humoral (CABRAL, et al.,

1998; PINELLI, et al., 1994). Também é comum que muitos cães desenvolvam resposta

imunológica detectável somente algumas semanas depois da infecção (ANDRADE, 2000).

Logo, um teste sorológico feito dentro desse intervalo de tempo implica em falso negativo.

Existe ainda a possibilidade de ocorrência de reações cruzadas nos testes RIFI e ELISA

com outras enfermidades como doença de Chagas, erliquiose, rickettsiose e toxoplasmose

(BARBOSA DE DEUS, et al., 2002). Pelo fato desses exames se basearem na detecção de

anticorpos contra Leishmania, um outro problema surge para a monitoração sorológica de

cães vacinados para leishmaniose.

Recentemente foi desenvolvida uma vacina contra a leishmaniose canina que gera

níveis de proteção acima de 90%, (BORJA-CABRERA, et al., 2002; SILVA, et al., 2001b).

Esta foi licenciada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento e

industrializada (NOGUEIRA, et al., 2005), fato que vem tornando a vacinação uma prática

cada vez mais comum. O processo de imunização é realizado em três doses, com intervalo

de 21 dias entre elas, e a proteção é estabelecida somente após a terceira e última aplicação.

Porém, após a vacinação o cão pode apresentar reação positiva nos testes de sorologia, visto

que a vacina é produzida a partir de antígenos de Leishmania que vão estimular a produção

de anticorpos específicos no animal. Sendo assim, os métodos sorológicos de diagnóstico

regularmente utilizados podem fornecer resultados inconclusivos, pois permaneceria a

dúvida se o animal realmente estaria infectado ou se ele estaria apenas munido da proteção

humoral conferida pela vacina. Portanto, o monitoramento dos animais vacinados se

transformou em um desafio, pois as alternativas de diagnóstico disponíveis (biópsias de

linfonodo ou medula óssea para a identificação do parasito) são invasivas, dispendiosas,

mais complicadas e de difícil aceitação pelos proprietários dos animais, o que torna tais

procedimentos inadequados para levantamentos epidemiológicos.

Ainda hoje, existem poucos estudos sobre testes diagnósticos que discriminem

corretamente o cão vacinado do cão naturalmente infectado. Até o momento, não há

procedimentos de diagnóstico para uso em larga escala e que permitam esse discernimento.

Com isso, o desenvolvimento e a padronização de técnicas para o diagnóstico da LV em

cães imunizados tornam-se extremamente importantes.

A técnica de PCR é uma alternativa atraente neste contexto. Como os animais

vacinados e não infectados não apresentam reação positiva na reação de PCR, esta se

apresenta como uma possível solução para o monitoramento dos cães imunizados. A

técnica é suficientemente sensível, específica e rápida para atender as necessidades dos

programas de controle.

A PCR vem a suprir algumas lacunas importantes presentes nos métodos

tradicionais de diagnóstico. Por exemplo, permite detectar, de maneira específica,

seqüências exclusivas do genoma do parasita sem necessidade de seu isolamento em

cultura. Isso representa mais rapidez para geração de resultados. A PCR vem sendo descrita

como um procedimento altamente sensível para a identificação do parasita. Dessa forma,

tem sido possível a detecção de infecção em cães antes da soroconversão (STRAUSS-

AYALI, et al., 2004) e em animais assintomáticos (ANDRADE, et al., 2006),

(LACHAUD, et al., 2002b).

Um dos exemplos de seqüências genéticas alvo para a amplificação por PCR são as

regiões conservadas de minicírculos de kDNA de Leishmania. Tais seqüências possuem

pelo menos 120 pares de base (pb) (FERNANDES, et al., 1996) e apresentam uma grande

vantagem: são abundantes, pois chegam a ocorrer até 10.000 cópias dos minicírculos por

célula. Isso aumenta a sensibilidade da técnica, pois cresce enormemente a chance

estatística de anelamento correto dos iniciadores ou primers nas seqüências de DNA alvo

permitindo um bom rendimento da reação.

Tem-se demonstrado a ocorrência de cães PCR positivos soronegativos (REALE, et

al., 1999), (SOLANO-GALLEGO, et al., 2001). A PCR também se revelou superior à RIFI

e à microscopia óptica no diagnóstico em cães independentemente dos órgãos utilizados

para retirada de amostras ou das manifestações clínicas presentes nesses animais

(ANDRADE, et al., 2006).

A sensibilidade e a especificidade do diagnóstico da leishmaniose por PCR podem

ser aumentadas com o uso complementar da hibridização com sondas de DNA marcadas,

especialmente com o

P (DEGRAVE, et al., 1994). Estudos mostram que com esse método

é possível reconhecer até 0,1pg do DNA alvo. De uma maneira geral, as técnicas de

marcação isotópica de DNA apresentam uma sensibilidade significativamente superior e

são mais baratas quando comparadas aos procedimentos convencionais (DAR; KHAN.

2004). Outra vantagem é a simplicidade da detecção do sinal emitido pela radiação. O

por exemplo, emite partículas β com energia máxima de 1,7 Mev (TURNER, 1995) o que

facilita a leitura dos resultados pela auto-radiografia. Como esse radioisótopo tem meia

vida curta de 14,7 dias, seu decaimento é breve o que minimiza o problema da disposição

do rejeito radioativo.

Um dos aspectos mais importantes da hibridização é que informações sobre o

agente etiológico podem ser obtidas nesta etapa. Com a utilização de sondas de DNA

específicas é possível identificar o sub-gênero do parasita e até mesmo a espécie, caso haja

disponibilidade de dados epidemiológicos. É importante lembrar ainda que a técnica de dot

blot oferece uma vantagem interessante para essa metodologia de diagnóstico como um

todo. Apenas uma membrana utilizada nesse procedimento pode receber muitas amostras

ao mesmo tempo, as quais são analisadas em uma única etapa. As sondas aplicadas podem

ser removidas após a hibridização e a membrana pode ser reutilizada várias vezes. Isso

permite uma economia de material e mais rapidez para a obtenção e interpretação de

resultados.

Para a realização da PCR não é necessária grande quantidade de material e

diferentes amostras clínicas podem ser utilizadas como fonte de DNA. São exemplos os

aspirados (esplênicos, de linfonodos e medula óssea), células de cultura, camada

leucocitária e sangue coletado em papel filtro (FISA, et al, 2001), (TAVARES,

FERNANDES; MELO, 2003).

A utilização de metodologias de amostragens não invasivas é relevante, pois pode

representar uma alternativa mais simples e não traumática para os animais. Isso certamente

diminui a resistência dos proprietários dos cães em permitir os exames.

Por isso, será avaliado neste trabalho um processo de amostragem pelo swab

conjuntival. Este método consta de um esfregaço das conjuntivas de cães mediante a

utilização de swabs. Essa estratégia está de acordo com a necessidade de se adotar métodos

mais fáceis, rápidos e não invasivos para obtenção de material para a reação de PCR.

Alguns autores utilizaram swabs para coleta de amostras em estudos de diagnóstico

molecular da leishmaniose.

Strauss-Ayali et al. (2004) utilizaram este método de amostragem para a

identificação de infecção por L. infantum em cães, utilizando-se a PCR. A positividade

obtida com esse procedimento foi maior quando comparada aos resultados referentes à PCR

realizada a partir de cultura e de aspirados esplênicos ou de linfonodo.

Num outro contexto, Mimori et al. (2002) utilizaram swabs para a coleta de

amostras a partir de lesões cutâneas para o diagnóstico da LC humana por PCR. Neste caso,

foi possível detectar a infecção em 15 pacientes num total de 16. Com isso, estes autores

consideraram o método de coleta por swabs mais indicado do que o uso de biópsias para o

diagnóstico da LC.

Esses estudos indicam que o método de esfregaços por swabs para o diagnóstico da

leishmaniose é promissor e deve, portanto, ser investigado de maneira mais ampla.

Vale ressaltar que a pesquisa de alternativas diagnósticas mais sensíveis e

específicas é prioritária para auxiliar a prevenção, vigilância e controle das leishmanioses.

O investimento em procedimentos de diagnóstico vem sendo apontado como necessário

para redução da morbidade e da mortalidade da LV, bem como para a diminuição dos

riscos de transmissão (ELKHOURY, 2005).

O presente projeto está diretamente inserido nesse contexto e tem como meta o

desenvolvimento de um método de diagnóstico mais simples e eficiente para a LV canina,

disponibilizando para a sociedade uma ferramenta importante para auxiliar no controle

dessa doença.

3) OBJETIVOS

3.1) Objetivo geral

Avaliar o swab conjuntival como método de coleta de amostra para o diagnóstico da

LV canina por PCR-hibridização.

3.2) Objetivos específicos

• Avaliar e padronizar diferentes métodos de extração de DNA a partir de swabs

contaminados artificialmente com células de L. chagasi;

• Baseado nos resultados anteriores, escolher as técnicas de purificação de DNA a serem

testadas em amostras obtidas pelo swab conjuntival

em cães soropositivos;

• Comparar os métodos de coleta utilizando-se swab conjuntival e sangue depositado em

papel filtro para o diagnóstico da LV canina por PCR-Hibridização;

• Comparar os métodos de coleta utilizando-se swab conjuntival e anel leucocitário para

o diagnóstico da LV canina por PCR-Hibridização;

• Determinar, entre os métodos testados, aqueles que se mostrarem mais adequados para

o diagnóstico para a LV canina por PCR-hibridização em cães soropositivos

sintomáticos.

4) MATERIAIS E MÉTODOS

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal

(CETEA) da Universidade Federal de Minas Gerais (n° de protocolo 198/2006) (ANEXO

B).

4.1) Teste de contaminação artificial de swabs com células de Leishmania chagasi

Promastigotas de L. chagasi, cepa MHOM/1973/BH46, foram cultivadas em meio

essencial mínimo (α MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino. Uma alíquota de

1,0 mL foi retirada e homogeneizada levemente no vórtex. Desse volume, foram utilizados

10 µL para a contagem dos parasitas em uma câmara de Neubauer (BOECO - Germany).

Em seguida, swabs estéreis manufaturados para isolamento de bactérias foram

contaminados em triplicata com os seguintes números de células: 10

, 10

, 50, 25, 10 e 1,0.

Para a extração de DNA dos swabs contaminados, três métodos diferentes foram

utilizados e comparados. São eles:

4.1.1) Extração de DNA por fenol-clorofórmio

Este método foi conduzido de acordo com Strauss-Ayali, et al. (2004) com

pequenas modificações. Uma mistura de 300 µL de proteinase K (250 µg.mL

-1

) e Triton X-

100 (1%) em tampão de lise (Tris 50 mM, NaCl 50 mM e EDTA 10 Mm [pH 8,0]) foi

adicionada a tubos eppendorf estéreis contendo as extremidades contaminadas

artificialmente dos swabs. Tais amostras foram incubadas por 2h a 56°C. A remoção dos

contaminantes foi realizada mediante três lavagens com 500 µL de fenol e clorofórmio -

álcool isoamílico (24:1) em tubos Phase Lock Gel Heavy. Nas duas primeiras lavagens,

foram utilizados 75% e 50% de fenol respectivamente e a última foi realizada com

clorofórmio – álcool isoamílico 100%. Após cada lavagem, as soluções foram

centrifugadas a 12.000g por 5 min. Em seguida, 50 µL de acetato de sódio 3M foram

adicionados em cada amostra. O DNA foi precipitado com um volume de isopropanol e foi

lavado com 250 µL de etanol 75%. Após centrifugação, a fase contendo DNA foi

suspendida em 30 µL de solução TE (Tris 10 mM e EDTA 1,0 mM [pH 8,0]) e armazenada

a 4°C até o momento de uso.

4.1.2) Purificação de DNA genômico - Wizard

(Promega)

O DNA foi extraído a partir de outro conjunto de swabs contaminados com L.

chagasi utilizando-se o kit de extração Wizard

para cultura celular conforme as instruções

do fabricante. Primeiramente, as extremidades contaminadas dos swabs foram separadas e

acondicionadas em tubos eppendorf estéreis, onde receberam 600 µL de solução de lise

nuclear. As amostras receberam 3,0 µL de RNAse e posteriormente foram incubadas a

37°C por 15 min. Estas receberam 200 µL de solução de precipitação protéica, foram

homogeneizadas em vórtex e mantidas em gelo por 5 min. As amostras foram então

centrifugadas a 14.000g por 8,0 min. O sobrenadante foi transferido para novos tubos onde

recebeu 600 µL de isopropanol. Nova centrifugação foi realizada a 14.000g por 1,0 min e o

sobrenadante foi descartado. O precipitado foi lavado com 600 µL de etanol 70% e

centrifugado a 14.000g por 1,0 min. Em seguida, removeu-se a fase líquida, secou-se o

precipitado a 56°C por 15 min e finalmente foram adicionados 100 µL de solução de

reidratação. O produto final foi então mantido a 4°C até o momento de uso.

4.1.3) Extração de DNA por fervura

Numa terceira forma de extração, as extremidades contaminadas dos swabs foram

removidas e colocadas em tubos eppendorf estéreis de 1,5 mL onde receberam 300 µL de

água deionizada autoclavada. O material foi fervido a 100°C em bloco seco por 15 min e

posteriormente centrifugado a 14.000g por 5 min. O sobrenadante foi coletado e

armazenado em tubos eppendorf estéreis a 0°C até sua utilização para a PCR.

O processo experimental da avaliação da sensibilidade a partir de swabs

contaminados artificialmente está resumido na FIG. 3.

4.2) Cães

Foram utilizados 46 cães soropositivos para a reação de ELISA, RIFI e fixação de

complemento neste estudo. Os animais foram cedidos pelo Centro de Controle de Zoonoses

de Belo Horizonte, Minas Gerais. Os cães foram avaliados clinicamente e classificados

segundo Mancianti, et al. (1988). Segundo esta classificação, os animais podem ser:

assintomáticos nos quais há ausência de sintomas, oligossintomáticos caracterizados pela

apresentação de adenopatia linfóide e/ou discreta perda de peso e/ou pêlo opaco e, por fim,

sintomáticos em que deve haver todos ou alguns dos sintomas severos típicos da LV como

hepatoesplenomegalia, onicogrifose, emagrecimento acentuado, queda de pêlo localizada

ou generalizada, conjuntivite, anorexia e úlceras na pele.

Os animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos, 1 e 2, cada qual com 23

indivíduos. Em cada grupo, os animais foram classificados quanto ao sexo e à

sintomatologia (TAB 1 e 2).

Figura 3: Avaliação da sensibilidade a partir da contaminação artificial de swabs com células de L.

chagasi.

Contaminação artificial de

swabs com L. chagasi

Extração de DNA

Fenol-clorofórmio Fervura Wizard®

PCR - hibridização a partir

do DNA purificado

Escolha dos métodos a serem utilizados nas amostras

obtidas por esfregaço das conjuntivas de cães

soropositivos

Tabela 1: Classificação dos cães do grupo 1.

Cão Sintomatologia Sexo

1 S F

S M

3 S M

4 S F

5 S M

6 S F

7 O M

8 S M

9 O M

S F

11 S M

12 S M

13 S F

14 S F

15 S M

16 S M

17 S F

18 S F

19 S M

20 S F

21 S M

22 S M

23 O F

S: sintomático; O: oligossintomático;

M: macho; F: fêmea;

Tabela 2: Classificação dos cães do grupo 2.

Cão Sintomatologia Sexo

1 S F

2 S F

3 S F

4 O M

5 S F

6 S F

7 S F

8 S F

9 S M

10 S M

11 S F

12 S M

13 S F

14 S F

15 O F

16 S M

17 S F

18 S F

19 S M

20 S F

21 S M

22 S M

23 S F

S: sintomático; O: oligossintomático;

M: macho; F: fêmea;

Dez cães saudáveis soronegativos provenientes de região não endêmica serviram como

controles negativos.

4.3) Coleta de amostras

Após o exame clínico, amostras foram coletadas da conjuntiva inferior de ambos os

olhos de todos os cães, utilizando-se para o esfregaço, swabs estéreis manufaturados para

isolamento de bactérias (FIG 4). As extremidades contaminadas dos swabs foram separadas

e acondicionadas em tubos eppendorf estéreis de 1,5 mL. Estes foram armazenados a -20°C

até o momento de uso.

Para amostragem sangüínea foram colhidos cerca de 2,7 mL de sangue de cada cão

por meio de punção venosa sendo o material imediatamente acondicionado e

homogeneizado em tubos com EDTA. De cada tubo, foi retirada uma alíquota de 30 µL,

que foi transferida para papel filtro (Dialab®), o qual foi deixado secar a temperatura

ambiente e depois foi armazenado a –20°C até sua utilização. Para a obtenção do anel

leucocitário, 1,0 mL do sangue restante foi utilizado. Os tubos foram mantidos no gelo até o

processamento do sangue.

4.4) Extração de DNA das amostras caninas

Métodos distintos de extração de DNA foram utilizados a partir das amostras

provenientes dos esfregaços de conjuntiva dos cães do grupo 1 e 2.

Figura 4: Coleta de amostra pelo método de swab conjuntival.

4.4.1) Extração de DNA dos swabs

As amostras obtidas do grupo 1 foram submetidas ao processo de extração de DNA

por fenol-clorofórmio (item 4.1.1). No grupo 2, foi utilizado o método da fervura (item

4.1.3). Estes procedimentos de extração de DNA foram escolhidos de acordo com os

resultados obtidos do experimento de contaminação artificial de swabs com L. chagasi.

4.4.2) Tratamento dos papéis filtros contaminados com sangue

Os papéis filtros contaminados com sangue canino foram processados da mesma

maneira em ambos os grupos.

Para o processamento, discos de 3,0 mm de diâmetro foram retirados de cada cartão

utilizando-se punches estéreis. Estes foram transferidos para tubos eppendorf estéreis de 1,5

mL a fim de se remover contaminantes. Para isso, 200 µL de reagente de purificação

(Dialab®) foram adicionados a cada amostra, as quais permaneceram 20 min a temperatura

ambiente. Posteriormente o material foi submetido a mais duas lavagens com 200 µL do

mesmo reagente. Finalmente, os discos de papel foram lavados duas vezes com 200 µL de

solução TE (Tris 10 mM e EDTA 1,0 mM [pH 8,0]). Após cada lavagem, as soluções

foram descartadas e o papel filtro tratado foi armazenado a -20°C até sua utilização. Para a

reação de PCR utilizou-se diretamente o disco de papel tratado.

4.4.3) Extração de DNA do anel leucocitário

Esta extração foi realizada utilizando-se o kit para purificação de DNA genômico

Wizard

(Promega) para ambos os grupos. A 1,0 mL de sangue foram adicionados e

homogeneizados 3,0 mL de solução de lise celular. Essa mistura foi incubada por 10 min a

temperatura ambiente para lise de hemácias e centrifugada a 2.000g por 10 min. O

sobrenadante foi descartado e o anel de células brancas foi suspendido utilizando-se o

vórtex. Adicionaram-se 1,0 mL de solução de lise nuclear e 5,0 µL de RNAse em cada

amostra e estas foram incubadas a 37°C por 15 min. Em seguida, foram adicionados 330

µL da solução de precipitação protéica, a mistura foi homogeneizada e depois centrifugada

a 2.000g por 10 min. O sobrenadante foi transferido para tubos com 1,0 mL de isopropanol

e a solução, homogeneizada e centrifugada a 2.000g por 1,0 min. O sobrenadante obtido foi

descartado e o precipitado foi lavado com 1,0 mL de etanol 70% , sendo posteriormente

centrifugado a 2.000g por 1,0 min. O sobrenadante foi mais uma vez descartado, o

precipitado foi deixado secar a 56°C por 15 min e foi finalmente suspendido em 150 µL de

solução de reidratação. O produto final foi mantido a 4°C até sua utilização.

4.5) PCR

O método de PCR para amplificação da região conservada dos minicírculos de

kDNA de Leishmania foi previamente descrito (DEGRAVE et al., 1994). Para sua

realização, 1,0 µL de cada amostra com DNA purificado foi adicionado a 24 µL de uma

solução contendo 2,5 µL de desoxinucleotídeos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) a

1,0 mM, 0,2 nmol de cada oligonucleotídeo iniciador [5’–

(G/C)(G/C)(C/G)CC(A/C)CTAT(A/T)TTACACAACCCC-3’ e

5’GGGGAGGGGCGTTCTGCGAA-3’], 2,5 unidades da DNA polimerase AmpliTaq

Gold

(Applied Biosystems), 2,5 µL de solução tampão (Tris-HCl 50 mM, [pH 8,3], KCl

50 mM), 1,5 µL de MgCl

a 1,5 mM e um volume complementar de água deionizada

autoclavada. O mesmo foi feito para os controles negativos sem, no entanto, acrescentar

DNA. Para os controles positivos, foi adicionado 1,0 µL de solução contendo DNA

genômico purificado de L. chagasi, cepa MHOM/1973/BH46, na concentração de 1,0

ng.µL

-1

. As condições para a reação foram: 95°C por 15 min para a desnaturação inicial,

seguindo-se 30 ciclos de amplificação (30 segundos a 94

C, 30 segundos a 50

C e 30

segundos a 72

C). Foi feito ainda um passo para a extensão final a 72°C por 10 min. Depois

disso o sistema permaneceu a 4°C. O termociclador (Perkin Elmer®) foi programado para

delinear todos essas etapas nas temperaturas e tempos determinados. As diferentes etapas

da reação de PCR foram realizadas em laboratórios diferentes para evitar a contaminação

por amplicons.

4.6) Eletroforese em gel de agarose

Para analisar os produtos de PCR, 5,0 µL de tampão de amostra (Tris 10 mM,

EDTA 10 mM, azul de bromofenol 0,005% m/v e glicerol 10% v/v) foram acrescentados a

10 µL da amostra e em seguida foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2%,

com brometo de etídio, numa diferença de potencial de 90V. Um marcador de peso

molecular com fragmentos múltiplos de 25 pb foi utilizado e a corrida foi realizada em

tampão TBE 1X.

4.7) Dot Blot

Um total de 10 µL dos produtos de PCR foram aquecidos a 100°C por 5,0 min e

resfriados em gelo. A eles foram acrescentados 11 µL de solução desnaturante (NaOH 0,4

M, EDTA 25 mM [pH 8,0]). Em seguida, as amostras foram aplicadas sob vácuo a uma

membrana de nylon utilizando-se o aparelho Bio Dot (Hybri-dot manifold -BRL®). Cada

poço recebeu mais 100 µL da solução desnaturante e o aparelho foi submetido novamente

ao vácuo. A membrana foi lavada com SSC 2X (NaCl 0,3 M, citrato de sódio, 0,3 mM),

deixada secar sobre papel filtro e submetida a luz ultravioleta no aparelho Stratalinker para

fixação do DNA com energia de 0,12 J por centímetro quadrado.

4.8) Hibridização

Foram utilizados como sondas mini-círculos clonados de Leishmania (Leishmania)

chagasi. Estes foram marcados com

P[α]dCTP utilizando-se o método dos iniciadores

aleatórios (Invitrogen®). As condições de hibridização foram previamente descritas por

Andrade et al. (2001). A membrana de nylon, contendo as amostras, foi pré-incubada a

C por 30 min em solução de leite desnatado 0,5%, sulfato dodecil de sódio (SDS) 1% e

SSC 2X. A solução foi trocada utilizando-se um volume suficiente apenas para cobrir a

membrana. As sondas marcadas foram adicionadas à solução, após terem sido previamente

aquecidas por 3 min a 100

C. As membranas foram incubadas por 14h a 58

C com agitação

e depois lavadas em solução SSC 0,5X, SDS 0,5% a 65

C por 30 min. A membrana foi

deixada secar a temperatura ambiente. Ao final, ela foi exposta ao cassete BAS 2325

(Fujifilm®) por 2h. A imagem foi obtida através do analisador de imagem Bio-Imaging

Analyzer (Fujifilm®).

4.9) Análise estatística

Para análise estatística dos resultados, foi utilizado o Teste Exato de Fisher com

nível de significância de 5%. Este procedimento foi aplicado separadamente nos grupos 1 e

2. Dentro de cada grupo, os diferentes tratamentos foram confrontados dois a dois. Assim,

foi verificado se houve ou não diferença significativa entre os resultados obtidos dos

tratamentos utilizados. Todas as análises matemáticas foram processadas pelo programa

EPI INFO® 6.

Todo o processo experimental envolvendo os cães de ambos os grupos está

sumarizado na FIG. 5.

Figura 5: Processo de análise das amostras caninas para diagnóstico da leishmaniose por PCR-

hibridização.

46 cães

soropositivos

Grupo 1

(23 cães)

Grupo 2

(23 cães)

Coleta de amostras:

• Esfregaço das conjuntivas com swabs estéreis;

• Retirada de 2,7 mL sangue por punção venosa;

• Transferência de 30µL de sangue para papel filtro.

Métodos de extração de DNA:

1) Swabs: fenol-clorofórmio;

2) 1,0 mL de sangue: preparação

e processamento do anel

leucocitário – protocolo

Wizard®;

3) Sangue em papel filtro:

protocolo Dialab®.

Métodos de extração de DNA:

1) Swabs: fervura;

2) 1,0 mL de sangue: preparação

e processamento do anel

leucocitário – protocolo

Wizard®;

3) Sangue em papel filtro:

protocolo Dialab®.

PCR e

Hibridização a partir

do DNA purificado

Análise

estatística

5) RESULTADOS

5.1) Contaminação artificial de swabs

Neste experimento avaliou-se a sensibilidade dos ensaios de PCR e hibridização

utilizando-se diferentes métodos de extração de DNA a partir de swabs contaminados com

números conhecidos de células de L. chagasi. Buscou-se determinar o número mínimo de

células necessário para se obter um resultado positivo.

Resultados positivos para a reação de PCR foram obtidos para todas as quantidades

de parasitas em todos os procedimentos de extração de DNA testados, exceto para 10 e 1,0

células referentes ao método da fervura e 1,0 célula referente à extração pelo kit Wizard®

(TAB. 3).

Em seguida, os produtos de PCR foram submetidos à hibridização com sondas

marcadas com

P. As sondas consistiam de mini-círculos clonados de kDNA de L.

chagasi. A hibridização foi utilizada para confirmar os resultados e aumentar a

sensibilidade de detecção. Nesse caso, todos os resultados positivos da PCR foram

confirmados. Resultados positivos adicionais foram obtidos na faixa de 1,0 parasita para a

extração pelo protocolo Wizard® e na faixa de 10 parasitas para o processo da fervura,

segundo análise do resultado de dot blot (FIG. 6).

Tabela 3: Resultados da PCR para os swabs contaminados artificialmente com L. chagasi.

(+): positivo; (-): negativo.

++++++

Fenol

clorofórmio

+++++Wizard®

++++Fervura

1,010255010

Número de parasitas

Método de

extração de

DNA

++++++

Fenol

clorofórmio

+++++Wizard®

++++Fervura

1,010255010

Número de parasitas

Método de

extração de

DNA

Figura 6: Resultado de dot blot referente aos produtos de PCR obtidos dos

swabs contaminados artificialmente com L. chagasi.

Foram utilizados de 10

até 1,0 promastigota por swab. Os produtos de PCR

foram hibridizados com sondas de kDNA de

L. chagasi marcadas com

P. (+):

controle positivo de

L. chagasi (-): Controle negativo sem DNA. A) Extração

de DNA por fervura. B) Extração de DNA - kit Wizard®. C) Extração de DNA

por fenol-clorofórmio.

(+) (-)

50 25 10 1

(+) (-)

50 25 10 1

5.2) Cães do grupo 1

5.2.1) PCR e hibridização para os swabs

Para os cães do grupo 1, o método de fenol-clorofórmio foi utilizado para

purificação do DNA proveniente dos swabs conjuntivais. Foram obtidas positividades para

PCR de 73,9% para a conjuntiva direita, 60,9% para a esquerda e 73,9% combinando

ambas as conjuntivas. Após a hibridização, as freqüências de resultados positivos foram:

73,9% para conjuntiva direita, 91,3% para a esquerda e 91,3% para as duas conjuntivas

combinadas. Os resultados observados para cada cão são mostrados na TAB. 4.

A FIG. 7 corresponde a um gel de agarose representativo para o grupo 1 no qual são

mostrados resultados positivos da PCR para a conjuntiva direita dos cães identificados

pelos números de 9 a 16. A positividade foi comprovada pela correspondência das bandas

amplificadas com a banda de 120 pb obtida do padrão positivo, que por sua vez,

corresponde ao tamanho esperado da seqüência conservada do minicírculo de kDNA alvo

da amplificação.

É importante ressaltar que os controles negativos e positivos de todas as reações de

PCR realizadas neste trabalho apresentaram o padrão esperado. Assim, não houve qualquer

amplificação nos controles negativos e os controles positivos apresentaram a banda

esperada de 120 pb o que indica não ter havido nem contaminação nem inibição das

reações.

Os resultados da hibridização foram visualizados na imagem que é mostrada na

FIG. 8. Nesse caso, 21 resultados positivos foram detectados para a conjuntiva esquerda e

17 para a direita.

Tabela 4: Resultados da PCR e hibridização para swabs conjuntivais* dos cães do grupo 1.

Cão

Conjuntiva direita Conjuntiva esquerda

PCR Hibridização PCR Hibridização

1 + + + +

+ + + +

3 + + - +

4 - - - -

5 + + - +

6 + + + +

7 + + + +

8 - - - +

9 + + + +

+ + + +

11 + + + +

12 + + - +

13 + + + +

14 + + + +

15 + + + +

16 + + + +

17 + + + +

18 + + + +

19 + + + +

20 - - - -

21 - - - +

22 - - - +

23 - - - +

*O DNA foi isolado pelo método fenol-clorofórmio.

Positividade da PCR para as duas oculares combinadas: 73,9%.

Positividade da hibridização para as duas oculares combinadas: 91,3%.

(+): positivo; (-): negativo.

Figura 7: Gel de agarose dos produtos de PCR referentes aos swabs conjuntivais da ocular direita

(D) dos cães do grupo 1.

Neste grupo (1) a extração de DNA foi realizada pelo método do fenol-clorofórmio. PM: padrão

de peso molecular - 25pb. CN: controle negativo sem DNA. CP: controle positivo para

L. chagasi

(MHOM/1973/BH46). D9-D16: Amostras de cães.

PM CN CP D9 D10 D11 D12 D13 D14 D15 D16

(pb)

100

125

Figura 8: Resultado de

dot blot com produtos de PCR referentes aos swabs conjuntivais dos cães

do grupo 1.

Os produtos de PCR foram hibridizados com sondas de minicírculos clonados de kDNA de

chagasi

marcadas com

P. (+): Controle positivo: L. chagasi (MHOM/1973/BH46). (-): Controle

negativo sem DNA. CE: Conjuntiva esquerda. CD: Conjuntiva direita. 1-23: Amostras de cães.

5.2.2) PCR e hibridização para anel leucocitário

A partir da camada leucocitária (

buffy coat) dos cães do grupo 1, foram obtidas

positividades de 13% e 21,7% para a PCR e hibridização respectivamente. Os resultados

para cada cão são mostrados na TAB. 5.

Na FIG. 9 é mostrado um gel de agarose com resultados de PCR para os primeiros 8

cães analisados no grupo 1. Neste gel, o cão de número 6 apresentou resultado positivo.

O resultado geral da hibridização desses produtos de PCR pode ser visualizado na

FIG. 10. No total, cinco resultados positivos foram obtidos.

5.2.3) PCR e hibridização para sangue em papel filtro

Os resultados obtidos, a partir dos papéis filtros contaminados com sangue dos cães

do grupo 1, foram de 8,7% e 30,4% respectivamente para PCR e hibridização. Os

resultados para cada cão são descritos na TAB. 6.

Um gel de agarose representativo correspondente a parte do grupo 1 é mostrado na

FIG. 11. Nesse caso, foi verificada uma amplificação positiva (amostra 10).

Após a hibridização dos produtos de PCR, sete resultados positivos foram obtidos

(FIG. 12).

Tabela 5: Resultados da PCR e hibridização para anel leucocitário dos cães do grupo 1.

Cão PCR Hibridização

1 - -

2 - -

3 - -

4 - -

5 - -

6 + +

7 - +

8 - -

9 - -

10 - +

11 - -

12 - -

13 - -

14 - -

15 + +

16 + +

17 - -

18 - -

19 - -

20 - -

21 - -

22 - -

23 - -

(+): positivo; (-): negativo.

Figura 9: Gel de agarose dos produtos de PCR referentes ao anel leucocitário de cães do grupo

PM: padrão de peso molecular - 25pb. CN: controle negativo sem DNA. CP: controle positivo

para

L. chagasi (MHOM/1973/BH46). 1-8: amostras de cães.

PM CN CP 1 2 3 4 5 6 7 8

(pb)

125

100

PM CN CP 1 2 3 4 5 6 7 8

(pb)

125

100

Figura 10: Resultado de dot blot com os produtos de PCR de anel leucocitário dos cães do

grupo 1.

Os produtos de PCR foram hibridizados com sondas de minicírculos clonados de kDNA de

L. chagasi marcadas com

P. (+): Controle positivo para L. chagasi (MHOM/1973/BH46).

(-): Controle negativo sem DNA. 1-23: Amostras de cães.

Tabela 6: Resultados da PCR e hibridização para papel

filtro contaminado com sangue dos cães do grupo 1.

Cão PCR Hibridização

1 - +

2 - +

3 - +

4 - -

5 - -

6 + +

7 - -

8 - -

9 - -

10 + +

11 - -

12 - +

13 - -

14 - -

15 - +

16 - -

17 - -

18 - -

19 - -

20 - -

21 - -

22 - -

23 - -

(+): positivo; (-): negativo.

Figura 11: Gel de agarose dos produtos de PCR referentes aos papéis filtros contaminados com

sangue de cães do grupo 1.

PM: padrão de peso molecular

- 25pb. CN: controle negativo sem DNA. CP: controle positivo para L.

chagasi (

MHOM/1973/BH46). 9-16: amostras de cães.

PMCNCP910111213141516

125

(pb)

Erro!

Figura 12: Resultado de dot blot com produtos de PCR obtidos a partir de papéis filtros

contaminados com sangue dos cães do grupo 1.

Os produtos de PCR foram hibridizados com sondas de minicírculos de kDNA de

L. chagasi

marcadas com

P. (+): Controle positivo para L. chagasi (MHOM/1973/BH46). (-): Controle

negativo sem DNA. 1-23: Amostras de cães.

5.3) Cães do grupo 2

5.3.1) PCR e hibridização para os swabs conjuntivais

O método da fervura foi utilizado para isolar o DNA das amostras obtidas pelo

swab

conjuntival dos cães do grupo 2. A partir desse tratamento, foram obtidas positividades para

PCR de 43,5% somente para a conjuntiva direita, 47,8% para a esquerda e 52,2%

combinando-se ambas as conjuntivas. Após a hibridização, foram observadas positividades

de 52,2% para a conjuntiva direita, 56,5% para a esquerda e 65,2% para as duas conjuntivas

combinadas. Os resultados de todos os indivíduos do grupo 2 são representados na TAB. 7.

A FIG. 13 apresenta um gel de agarose representativo para o grupo 2. Neste gel,

foram obtidos resultados positivos de PCR para os cães identificados por E9, E11 e E16.

No procedimento de hibridização, foram detectados 13 resultados positivos para a

conjuntiva esquerda e 12 para a direita conforme o resultado de

dot blot apresentado na

FIG. 14.

5.3.2) PCR e hibridização para anel leucocitário

No grupo 2, as positividades obtidas para PCR e hibridização a partir de anel

leucocitário foram 30,4% e 34,8% respectivamente. Os resultados para cada cão são

mostrados na TAB. 8.

Um gel de agarose representativo é mostrado na FIG. 15. Para as amostras

correspondentes aos cães de número 3, 5 e 7 foram obtidos resultados positivos para PCR.

Após à hibridização, foram observados 8 resultados positivos conforme a imagem

apresentada na FIG. 16.

Tabela 7: Resultados da PCR e hibridização para os swabs conjuntivais* dos cães do grupo 2.

Cão

Conjuntiva direita Conjuntiva esquerda

PCR Hibridização PCR Hibridização

1 - + + +

- - - -

3 + + + +

4 - - - -

5 + + + +

6 + + + +

7 + + + +

8 + + + +

9 + + + +

+ + - -

11 - - + +

12 - - - -

13 - + - -

14 - - - -

15 - - - -

16 + + + +

17 - - - -

18 - - - +

19 + + + +

20 - - - +

21 - - - -

22 + + + +

23 - - - -

*O DNA foi isolado pelo procedimento da fervura.

Positividade da PCR para as duas oculares combinadas: 52,2%.

Positividade da hibridização para as duas oculares combinadas:: 65,2%.

(+): positivo; (-): negativo

Figura 13: Gel de agarose dos produtos de PCR referentes aos

swabs conjuntivais da ocular

esquerda (E) de cães do grupo 2.

A extração de DNA foi realizada por fervura. PM: padrão de peso molecular - 25pb. CN: controle

negativo sem DNA. CP: controle positivo com DNA para

L. chagasi (MHOM/1973/BH46). E9-

E16: amostras de cães.

PM CN CP E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16

(pb)

125

100

PM CN CP E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16

(pb)

125

100

Figura 14: Resultado de

dot blot com produtos de PCR referentes aos swabs conjuntivais dos cães

do grupo 2.

Os produtos de PCR foram hibridizados com sondas de minicírculos de kDNA de

L. chagasi

marcadas com

P. (+): Controle positivo para L. chagasi (MHOM/1973/BH46). (-): Controle

negativo sem DNA. CE: Conjuntiva ocular esquerda. CD: Conjuntiva ocular direita. 1-23: Amostras

de cães.

Tabela 8: Resultados da PCR e hibridização para anel

leucocitário dos cães do grupo 2.

Cão PCR Hibridização

1 - -

2 - -

3 + +

4 - -

5 + +

6 - -

7 + +

8 - +

9 - -

10 + +

11 + +

12 - -

13 - -

14 - -

15 - -

16 - -

17 - -

18 - -

19 + +

20 - -

21 - -

22 + +

23 - -

(+): positivo; (-): negativo.

Figura 15: Gel de agarose dos produtos de PCR referentes ao anel leucocitário de cães do grupo 2.

PM: padrão de peso molecular - 25pb. CN: controle negativo sem DNA. CP: controle positivo para

L. chagasi (MHOM/1973/BH46). 1-8: amostras de cães.

PM CN CP 1 2 3 4 5 6 7 8

125

(pb)

100

PM CN CP 1 2 3 4 5 6 7 8

125

(pb)

100

Figura 16: Resultado de dot blot com produtos de PCR de anel leucocitário dos cães do grupo 2.

Os produtos de PCR foram hibridizados com sondas de minicírculos clonados de kDNA de

chagasi

marcadas com

P. (+): Controle positivo para L. chagasi (MHOM/1973/BH46). (-):

Controle negativo sem DNA. 1-23: Amostras de cães.

5.3.3) PCR e hibridização para sangue em papel filtro

A partir das amostras de sangue em papel filtro para os cães do grupo 2, foram

obtidas positividades de 17,4% e 43,5% respectivamente para PCR e hibridização. Os

resultados para cada cão são descritos na TAB 9.

Um gel de agarose representativo é mostrado na FIG. 17. Nele, foram detectados

quatro resultados positivos de PCR correspondentes aos cães identificados pelos números

3, 5, 7 e 8.

Após a hibridização, dez resultados positivos foram observados de acordo com a

imagem que está representada na FIG. 18.

5.4) Síntese dos resultados referentes aos cães dos grupos 1 e 2

Os resultados da PCR seguida de hibridização referentes às conjuntivas esquerda e

direita de cada grupo foram mostrados na FIG 19. A combinação dos resultados de ambas

as conjuntivas aumentou sensibilidade do método. Os resultados gerais tanto de PCR

quanto da PCR seguida de hibridização para todas as amostras clínicas dos cães dos dois

grupos são sumarizados na FIG. 20.

Tabela 9: Resultados da PCR e hibridização para papel

filtro contaminado com sangue dos cães do grupo 2.

Cão PCR Hibridização

1 - -

2 - +

3 + +

4 - -

5 + +

6 - -

7 + +

8 + +

9 - +

10 - -

11 - -

12 - +

13 - +

14 - +

15 - -

16 - -

17 - -

18 - -

19 - -

20 - -

21 - -

22 - +

23 - -

(+): positivo; (-): negativo.

Figura 17: Gel de agarose dos produtos de PCR referentes aos papéis filtros contaminados com

sangue dos cães do grupo 2.

PM: padrão de peso molecular - 25pb. CN: controle negativo sem DNA. CP: controle positivo para

L. chagai (MHOM/1973/BH46). 1-8: Amostras de cães.

PM CN CP 1 2 3 4 5 6 7 8

(pb)

125

PM CN CP 1 2 3 4 5 6 7 8

(pb)

125

Figura 18: Resultado de dot blot com produtos de PCR obtidos a partir de papéis filtros

contaminados com sangue dos cães do grupo 2.

Os produtos de PCR foram hibridizados com sondas de minicírculos clonados de kDNA de

chagasi

marcadas com

P. (+): Controle positivo para L. chagasi (MHOM/1973/BH46). (-):

Controle negativo sem DNA. 1-23: Amostras de cães.

Figura 19: Porcentagem de positividade da PCR seguida de hibridização para os

swabs

conjuntivais das oculares direita e esquerda dos cães de ambos os grupos.

Os números acima das barras indicam a porcentagem de positividade obtida. CD: conjuntiva direita:

CE: conjuntiva esquerda. Grupo 1: extração realizada pelo método do fenol-clorofórmio, Grupo 2:

extração realizada pela fervura.

73,9

52,2

56,5

91,3

65,2

91,3

100

Grupo 1 Grupo 2

Positividade (%)

CD CE CD + CE

Figura 20: Porcentagem de positividade para a PCR e PCR seguida de hibridização para as

amostras clínicas dos cães de ambos os grupos.

Os números acima das barras indicam a porcentagem da positividade obtida. SC:

swab conjuntival;

AL: anel leucocitário; PF: papel filtro. Grupo 1: extração realizada pelo método do fenol-

clorofórmio a partir de SC. Grupo 2: extração realizada pela fervura a partir de SC.

73,9

8,7

52,2

30,4

17,4

91,3

21,7

30,4

65,2

34,8

43,5

100

SC AL PF SC AL PF

Grupo 1 Grupo 2

Positividade (%)

PCR Hibridização

Todos os animais do grupo controle foram submetidos aos mesmos tratamentos

adotados para os cães dos grupos 1 e 2 e apresentaram resultados negativos para todos os

testes feitos.

5.5) Análise estatística

O Teste Exato de Fisher foi utilizado neste trabalho para a análise estatística. De

acordo com os critérios desse teste, os métodos ou tratamentos adotados para obtenção de

amostras dos cães foram analisados dois a dois dentro de cada grupo (SIEGEL;

CASTELLAN, 2006). Dessa forma, foi averiguado se houve ou não diferença estatística

significativa entre os resultados finais após a hibridização provenientes de cada tratamento.

5.5.1) Grupo 1

De acordo com os dados disponíveis e a análise estatística empregada, houve

diferença estatisticamente significativa entre os resultados positivos oriundos dos

tratamentos envolvendo

swabs e anel leucocitário (p<0,05) (TAB. 10).

A partir da análise dos resultados provenientes dos métodos envolvendo

swabs e

sangue em papel filtro, chegou-se à conclusão de que ambos diferem entre si. Assim, o total

de resultados positivos oriundos do tratamento com

swabs foi estatisticamente distinto do

total de resultados positivos referentes ao tratamento com sangue em papel filtro (p<0,05)

(TAB. 11). Por fim, não houve diferença estatística significativa entre os resultados

positivos dos tratamentos envolvendo anel leucocitário e sangue em papel filtro. (TAB. 12).

Tabela 10: Análise estatística das positividades da PCR seguida de hibridização referentes aos

tratamentos envolvendo

swabs e anel leucocitário para cães do grupo 1.

Tratamento

Resultados da hibridização

Total

(+) (-)

Swabs

(fenol-clorofórmio)

2 23

Anel leucocitário

18 23

Total

26 20 46

a,b

Letras diferentes numa mesma coluna demonstram diferença estatística

significativa para p<0,05 pelo Teste Exato de Fisher.

Tabela 11: Análise estatística das positividades da PCR seguida de hibridização referentes aos

tratamentos envolvendo

swabs e papel filtro contaminado com sangue para cães do grupo 1.

Tratamento

Resultados da hibridização

Total

(+) (-)

Swabs

(fenol-clorofórmio)

2 23

Sangue em papel filtro

16 23

Total

28 18 46

a,b

Letras diferentes numa mesma coluna demonstram diferença estatística

significativa para p<0,05 pelo Teste Exato de Fisher.

Tabela 12: Análise estatística das positividades da PCR seguida de hibridização referentes aos

tratamentos envolvendo anel leucocitário e papel filtro contaminado com sangue para cães do grupo

Tratamento

Resultados da hibridização

Total

(+) (-)

Anel leucocitário

18 23

Sangue em papel filtro

16 23

Total

12 34 46

Letras iguais numa mesma coluna demonstram equivalência para p<0,05 pelo

Teste Exato de Fisher.

5.5.2) Grupo 2

A primeira análise estatística para o grupo 2 foi feita com base nos tratamentos

envolvendo

swabs e anel leucocitário. A partir do confronto entre os dados obtidos destes

procedimentos, houve diferença estatística significativa entre as positividades de cada um

deles (p<0,05) (TAB. 13).

Para os dados referentes aos tratamentos com

swabs e sangue em papel filtro, não

houve diferença estatisticamente significativa entre os resultados positivos observados para

cada um deles. (TAB. 14).

O mesmo tipo de inferência foi obtido em relação aos tratamentos com anel

leucocitário e sangue em papel filtro. Assim, houve igualdade entre os resultados positivos

oriundos desses dois tipos de amostra não ocorrendo diferença estatisticamente significativa

entre eles (TAB. 15).

Tabela 13: Análise estatística das positividades da PCR seguida de hibridização referentes aos

tratamentos envolvendo

swabs e anel leucocitário para cães do grupo 2.

Tratamento

Resultados da hibridização

Total

(+) (-)

Swabs (fervura)

8 23

Anel leucocitário

15 23

Total

23 23 46

a,b

Letras diferentes numa mesma coluna demonstram diferença estatística

significativa para p<0,05 pelo Teste Exato de Fisher.

Tabela 14: Análise estatística das positividades da PCR seguida de hibridização referentes aos

tratamentos envolvendo

swabs e papel filtro contaminado com sangue para cães do grupo 2.

Tratamento

Resultados da hibridização

Total

(+) (-)

Swabs (fervura)

8 23

Sangue em papel filtro

13 23

Total

25 21 46

Letras iguais numa mesma coluna demonstram equivalência para p<0,05 pelo

Teste Exato de Fisher.

Tabela 15: Análise estatística das positividades da PCR seguida de hibridização referentes aos

tratamentos envolvendo anel leucocitário e papel filtro contaminado com sangue para cães do grupo

Tratamento

Resultados da hibridização

Total

(+) (-)

Anel leucocitário

15 23

Sangue em papel filtro

13 23

Total

18 28 46

Letras iguais numa mesma coluna demonstram equivalência para p<0,05 pelo

Teste Exato de Fisher.

6) DISCUSSÃO

A PCR tem sido amplamente utilizada para o diagnóstico de várias doenças

infecciosas. Para as leishmanioses, tem sido particularmente recomendada devido às

limitações dos métodos convencionais (IKONOMOPOULOS,

et al., 2003; GOMES, et al.,

2006) e à necessidade da confirmação do parasita, o que justifica a utilização desta técnica.

A aplicação da PCR para o diagnóstico da LV canina é bastante promissora uma vez

que essa técnica permite a obtenção rápida de resultados e apresenta alta sensibilidade e

especificidade (ALVAR,

et al., 2004), (GOMES, et al., 2007). Existem diversos estudos

nos quais foram feitas comparações entre diferentes técnicas de diagnóstico para

leishmaniose e a PCR tem se destacado como um método que permite aumentar a

sensibilidade de detecção da LV canina superando as técnicas tradicionais.

Ashford

et al. (1995) compararam a PCR com sorologia (FAST-ELISA) no

diagnóstico da LV canina. Seus resultados mostraram que esse teste molecular foi mais

sensível e específico o que levou ao questionamento da utilização da sorologia para detectar

a infecção em cães. A PCR também se mostrou superior às técnicas de cultura e inoculação

em hamster, e foi apontada como uma melhor alternativa para diagnosticar a infecção por

Leishmania.

Berrahal

et al. (1996) investigaram a capacidade da PCR em identificar o parasita

em cães assintomáticos a partir de biópsias de conjuntiva e de pele. Para isso, compararam

esse teste molecular com procedimentos tradicionais de diagnóstico sorológico. Seus

resultados mostraram que a maioria dos cães avaliados estava contaminada e a PCR foi

mais sensível na detecção de animais infectados assintomáticos do que os testes sorológicos

investigados nesse estudo.

Roura; Sanchez e Ferrer, (1999) também mostraram ser a PCR um método

altamente sensível e específico para o diagnóstico da LV canina. Neste caso, foram

utilizadas amostras de medula óssea para o teste. Estes autores confirmaram inclusive a

permanência de infecção em cães após seis meses de tratamento o que corrobora o

potencial da PCR para monitoração de animais infectados.

Moreira

et al. (2007) também obtiveram bons resultados para PCR num estudo

comparativo que incluiu procedimentos parasitológicos, imunológicos e sorológicos na

detecção de

Leishmania em cães. A partir dos resultados obtidos, esses autores cogitaram a

possibilidade de que a PCR possa ser adotada como um padrão ouro para o diagnóstico da

LV canina.

Para a amplificação do DNA do parasita, foram utilizados neste trabalho,

primers

endereçados para a região conservada dos minicírculos de kDNA. A reação é positiva para

todas as espécies do gênero

Leishmania. A hibridização dos produtos de PCR com sondas

de minicírculos clonados de

L. chagasi marcadas com

P foi adotada para aumentar a

sensibilidade e a especificidade do teste. Degrave,

et al. (1994) destacam a importância do

uso complementar da hibridização uma vez que essa técnica confirma os resultados da PCR

e permite a identificação do subgênero.

Silva,

et al. (2001c) mostraram que a associação da PCR com a hibridização com

sondas marcadas com

P é altamente sensível para o diagnóstico da LV canina. Nesse

caso, foi demonstrado que a combinação dessas técnicas permitiu um aumento na

sensibilidade do teste sendo possível inclusive detectar infecção em cães negativos por

sorologia.

Inicialmente, neste trabalho, foi avaliada a sensibilidade de detecção da PCR e

hibridização a partir de

swabs contaminados artificialmente com diferentes números de

células promastigotas de

L. chagasi. Diferentes métodos de extração de DNA foram

testados e, dentre eles, o procedimento de fenol-clorofórmio apresentou a melhor eficiência,

permitindo a detecção de até 1,0 parasita na reação de PCR. Esta sensibilidade leva a crer

que a combinação da PCR com a técnica de fenol-clorofórmio possa ser uma boa opção

para testes de diagnóstico baseados na utilização de

swab.

O processo complementar de hibridização confirmou os resultados da PCR e

incrementou a sensibilidade do teste permitindo a obtenção de mais dois resultados

positivos: 10 parasitas para o método de fervura e 1,0 célula para o kit Wizard® (FIG. 6).

Com isso, foi possível um aumento de até 10 vezes na sensibilidade o que reitera a

relevância da hibridização em experimentos de detecção de DNA de

Leishmania.

Com base nesses resultados, os métodos de fenol-clorofórmio e de fervura foram

escolhidos para serem testados nas amostras colhidas por

swab conjuntival em cães

soropositivos. A alta sensibilidade do primeiro procedimento e a praticidade do segundo

foram levados em consideração para essa escolha.

Os cães utilizados nesse estudo apresentaram sintomas clínicos sugestivos para LV

além de positividade para os testes de RIFI, ELISA e fixação de complemento. Segundo

Dietze (2005), um resultado positivo de RIFI em um cão clinicamente suspeito assume

grande relevância e praticamente confirma o diagnóstico do calazar. Esse critério foi então

utilizado na seleção dos cães.

A partir dos resultados obtidos do experimento desenvolvido com estes animais,

comprovou-se novamente um aumento da sensibilidade de detecção com o uso

complementar da hibridização o que está em concordância com o teste de contaminação

artificial de

swabs. A hibridização garantiu também a especificidade do teste. Para todas as

amostras clínicas dos cães de ambos os grupos, a combinação da hibridização com a PCR

apresentou positividades superiores aos resultados obtidos apenas com o ensaio de PCR

(FIG. 20). Uma outra vantagem oferecida pela hibridização é sua capacidade de

discriminação entre os subgêneros de Leishmania, uma vez que as sondas de minicírculos

clonadas utilizadas neste método são subgênero específicas (DEGRAVE

et al., 1994). Este

dado associado com informações epidemiológicas locais permite identificar a espécie

Leishmania envolvida. Isso se torna especialmente importante nos estudos em áreas nas

quais ocorrem simultaneamente espécies pertencentes aos subgêneros

Viannia e

Leishmania, como em Belo Horizonte, onde cães já foram encontrados infectados também

com

Leishmania (Viannia) braziliensis (ANDRADE, et al., 2006).

De todos os métodos adotados para coleta de amostras dos cães soropositivos do

grupo 1, a técnica de

swab conjuntival permitiu melhor desempenho. A partir dela, obteve-

se a positividade mais alta para PCR e para a hibridização: 73,9% e 91,3% respectivamente.

Neste grupo, o processo de extração de DNA utilizado foi o de fenol-clorofórmio e sua

maior eficiência obtida no estudo com os cães foi coerente com o experimento de

contaminação artificial de

swabs. A positividade da PCR seguida de hibridização obtida do

tratamento com

swabs conjuntivais foi superior em 69,6% e em 60,9% àquelas obtidas do

anel leucocitário e de sangue em papel filtro respectivamente. Com a análise estatística

realizada a partir desses dados, verificou-se que esses desvios foram altamente

significativos com p<0,01.

Outros trabalhos também demonstraram resultados significativos para o diagnóstico

molecular da LV canina utilizando, porém, processos invasivos de amostragem. Reale,

al. (1999) evidenciaram uma alta sensibilidade e especificidade da PCR realizada a partir

de aspirados de linfonodo e comprovaram que o teste de RIFI forneceu resultados falsos

negativos para cães. Manna,

et al. (2004) obtiveram um resultado similar ao demonstrarem

que a PCR realizada a partir de amostras de sangue, pele e linfonodo foi mais sensível do

que a técnica de RIFI.

Andrade et al. (2006) investigaram a presença de Leishmania em cães por PCR a

partir de amostras de fígado, baço, linfonodo, medula óssea e pele. Esse teste molecular foi

considerado mais eficiente do que os procedimentos de microscopia óptica e sorologia

(RIFI). Esses autores discutem também que a PCR pode auxiliar a determinar a extensão de

infecções sub-clínicas em áreas endêmicas para a LV canina e fornecer uma melhor

estimativa do número de cães contaminados.

Por outro lado, Solano-Gallego

et al., (2001), demonstraram que a PCR realizada a

partir de biópsias de conjuntiva de cães foi mais sensível do que aquela realizada a partir da

utilização de amostras de medula óssea.

No grupo 2, a maior freqüência de resultados positivos tanto de PCR quanto de

hibridização foi também obtida pelo

swab conjuntival: 52,2 % e 65,2% respectivamente.

Nesse caso, o método de fervura foi utilizado para isolar o DNA. A positividade da

hibridização seguida de PCR obtida desse tratamento foi superior em 30,4% e 21,7% em

relação aos resultados referentes ao anel leucocitário e sangue em papel filtro

respectivamente.

No entanto, o resultado final referente ao esfregaço conjuntival neste grupo foi

estatisticamente distinto apenas em relação àquele proveniente do tratamento envolvendo

anel leucocitário (p<0,05). Quando a comparação foi feita entre o

swab conjuntival e o

tratamento de sangue em papel filtro, houve igualdade estatística entre os resultados. Esses

dados sinalizam que o processo de fervura para isolamento de DNA é mais limitado.

Porém, esse procedimento é de baixo custo, rápido e muito mais simples do que o método

de fenol-clorofórmio.

Lachaud,

et al. (2001) perceberam empiricamente que a realização da fervura de

amostras de sangue humano seguida da extração de DNA por fenol-clorofórmio aumentou

100

a sensibilidade de ensaios de PCR. Marques, et al. (2001), num estudo de diagnóstico da

leishmaniose cutânea por PCR, mostraram que o processo de fervura de papéis

impregnados com biópsias de pele foi eficiente para a extração de DNA. Os resultados de

PCR daí obtidos foram estatisticamente equivalentes àqueles resultantes de processos

enzimáticos mais laboriosos de purificação, o que levou esses autores a recomendarem a

utilização do processo de fervura para esse tipo de experimento.

É possível que o processo de extração de DNA por fervura possa oferecer melhores

resultados a partir de algumas modificações. Um exemplo seria o aumento da amostra de

DNA purificado para o ensaio de PCR, pois apenas 1,0µL de preparação de DNA foi

utilizado neste trabalho. Outra opção poderia ser a realização da

Nested PCR a partir da

qual os

amplicons gerados são novamente amplificados, aumentando a sensibilidade do

teste.

Foi observado neste estudo que, a partir da combinação dos resultados de ambas as

conjuntivas foi possível aumentar a sensibilidade do diagnóstico (FIG. 19). Por isso,

recomenda-se fortemente este procedimento. Strauss-Ayali

et al. (2004) também

observaram a importância dessa combinação uma vez que ela permitiu uma maior

sensibilidade.

O uso do

swab conjuntival apresenta importantes vantagens, pois é um método fácil

e rápido além de ser um procedimento não invasivo de amostragem. Isso é muito

importante para diminuir a resistência dos proprietários dos cães em permitir coleta de

amostras e a realização de exames. O material coletado por

swab conjuntival é também

facilmente armazenado e não necessita de cuidados mais laboriosos como ocorre com as

amostras de sangue. Isso pode ser útil para trabalhos de campo e estudos epidemiológicos

em maior escala.

101

Neste trabalho, os resultados obtidos a partir da técnica de swab conjuntival foram

comparados com aqueles referentes às amostras de sangue. O processo de coleta sangüínea

é considerado não invasivo quando comparado às formas tradicionais de amostragem

(LACHAUD,

et al., 2002b). Neste estudo, foram evitadas formas invasivas de coleta de

amostras como aspirados de linfonodo ou medula óssea.

Diferentes estudos envolvendo a utilização de sangue periférico para o diagnóstico

da LV canina por PCR têm apresentado resultados conflitantes. Alguns autores mostraram

boa sensibilidade a partir desse material (MANNA,

et al., 2004; LACHAUD, et al., 2002a).

Entretanto, outros trabalhos evidenciaram que o sangue canino não é uma boa fonte de

DNA de

Leishmania (REALE, et al., 1999; SILVA, et al., 2006), tendo sido relatados

problemas associados à extração de DNA, presença de inibidores (LACHAUD,

et al.,

2002b) e oscilação da positividade da PCR em função do tempo de infecção (STRAUSS-

AYALI,

et al., 2004).

As amostras de sangue utilizadas neste trabalho, anel leucocitário e papel filtro,

forneceram as menores positividades de PCR e hibridização. Esses resultados foram

significativamente diferentes daqueles obtidos do tratamento com

swab conjuntival no

grupo 1 (p<0,01). As positividades obtidas a partir de anel leucocitário foram

inesperadamente baixas apesar do uso de um kit comercial já padronizado para extração de

DNA. Nesse caso, as células mononucleares foram obtidas de 1,0 mL de sangue e

coagulações foram detectadas em algumas amostras apesar de elas terem sido

homogeneizadas e armazenadas em tubos com anticoagulante EDTA. Isso provavelmente

comprometeu a qualidade do sangue e do DNA daí purificado influenciando nos resultados

finais. Trinta por cento das amostras relativas ao anel leucocitário consideradas negativas

102

para PCR foram contaminadas artificialmente com DNA de Leishmania. Desse total, 25%

não foram amplificadas o que indicou presença de inibidores.

A ocorrência de bandas espúrias foi recorrente em todos os géis relativos às

amostras do anel leucocitário. Isso dificulta a interpretação dos resultados e leva a

conclusões errôneas se a análise for feita apenas pelo gel de agarose. Neste estudo, a

hibridização confirmou a ausência de DNA de

Leishmania em boa parte das amostras que

demonstraram resultado duvidoso no gel de agarose.

Lachaud

et al., (2002b) também evidenciaram o problema da ocorrência de bandas

inespecíficas provenientes de amostras de sangue canino. Por isso, recomendam o uso da

hibridização com sondas específicas para evitar interpretações equivocadas. Segundo estes

autores, a utilização de sangue canino forneceu resultados insatisfatórios e isso estaria

relacionado não somente à presença de inibidores, mas também ao pouco conhecimento

disponível sobre a dinâmica da parasitemia em cães infectados.

Os resultados deste trabalho indicaram que o

swab conjuntival associado com a

extração de DNA por fenol-clorofórmio, é uma ferramenta útil para o diagnóstico da LV

canina por PCR-hibridização para cães sintomáticos. Esta é uma técnica de amostragem

não invasiva e prática e apresentou alta sensibilidade. Esta metodologia possui um grande

potencial para auxiliar a sondagem de cães imunossuprimidos ou vacinados uma vez que os

testes sorológicos tradicionais não são indicados para estes casos.

Estudos adicionais são ainda necessários para explorar todo o potencial da técnica

swab conjuntival e um aspecto importante a ser avaliado é a sensibilidade dessa técnica

para cães assintomáticos. Uma boa sensibilidade para o diagnóstico em cães sem sintomas

tornaria o

swab conjuntival a primeira opção para o diagnóstico da LV canina por PCR-

hibridização.

103

7) CONCLUSÕES

104

Dentro do contexto experimental deste trabalho, conclui-se que:

¾ A técnica de fenol-clorofórmio se mostrou mais eficiente para purificar DNA a

partir de

swabs contaminados artificialmente com células de L. chagasi.

¾ A hibridização com sondas de minicírculos clonados de L. chagasi marcadas com

P aumentou a sensibilidade de detecção e garantiu a especificidade da técnica.

¾ O swab conjuntival associado com o método de fenol-clorofórmio para extração de

DNA apresentou os melhores resultados para o diagnóstico da LV canina por PCR -

hibridização em cães sintomáticos soropositivos.

¾ A extração de DNA por fervura a partir do swab conjuntival se mostrou mais

limitada, porém ainda é passível de melhoramentos e deve ser considerada pela sua

praticidade e baixo custo.

¾ A combinação da análise de ambas as conjuntivas dos cães é recomendada para

aumentar a sensibilidade da metodologia.

¾ As amostras clínicas de anel leucocitário e sangue em papel filtro não foram

adequadas para o diagnóstico da LV canina.

¾ O swab conjuntival associado com o método de extração de DNA por fenol-

clorofórmio é adequado para o diagnóstico molecular da LV canina em cães

sintomáticos.

105

8) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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113

ANEXOS

AXEXO A: Artigo publicado

114

115

116

117

118

119

120

ANEXO B: Aprovação do Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA-

UFMG).

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