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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO MARANHÃO
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
CONDIÇÕES HIGIÊNICO SANITÁRIAS DO LEITE IN NATURA e
PASTEURIZADO TIPO C PROVENIENTES DA BACIA LEITEIRA
DO MÉDIO MEARIM – MA
Viramy Marques de Almeida
São Luís – MA
Curso de Medicina Veterinária - UEMA
2008
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Viramy Marques de Almeida
CONDIÇÕES HIGIÊNICO SANITÁRIAS DO LEITE IN NATURA e
PASTEURIZADO TIPO C PROVENIENTES DA BACIA LEITEIRA
DO MÉDIO MEARIM – MA
Dissertação apresentada como requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área: Sanidade Animal
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Francisca Neide
Costa
São Luís – MA
Curso de Medicina Veterinária - UEMA
2008
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1
Almeida, Viramy Marques de
Condições higiênico-sanitárias do leite in natura e pasteurizado
tipo C provenientes da bacia leiteira do médio Mearim-MA
/ Viram
y
Marques de Almeida. – São Luís, 2008.
56 p.
Dissertação (Mestrado) – Curso em Ciências Veterinárias,
Universidade Estadual do Maranhão, 2008.
Orientadora: Profa.Dra. Francisca Neide Costa
1. Leite 2. coliformes, mesófilos 3.Listeria spp I. Titulo
CDU: 614.31:637.12/.133.3(812)
2
Dissertação de mestrado e aprovada em ____________de____________de
2008 pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:
___________________________________
Prof
a
. Dr
a
.Francisca Neide Costa
Orientadora
___________________________________
Prof
a
. Dr
a
Adenilde Ribeiro Nascimento
1° Membro
___________________________________
Prof
a
. Dr
a
Maria Inez Santos Silva
2° Membro
3
DEDICATÓRIA
Dedico essa pesquisa ao
maior amor da minha
vida, Yuram, pela minha
ausência nos momentos
solicitados.
4
AGRADECIMENTOS
A DEUS, por iluminar meu caminho e me fortalecer diante das dificuldades.
À minha orientadora, Prof
a
. Dr
a
.Francisca Neide Costa, que confiou na minha
capacidade.
À Profª Msc. Lúcia Maria Coelho Alves, pelo apoio e importantes contribuições
no desenvolvimento deste trabalho.
Aos meus pais, Pedro e Maria, por me ensinarem que integridade e verdade
são fundamentais na vida.
A minha família, em especial as minhas irmãs Viraneide, Rosimar, Doralina e
Creuza, pela certeza que estão felizes com mais uma conquista minha.
À Itaan Santos, que sempre me apoiou e me ajudou com carinho, amor e
dedicação.
Aos Professores, Msc. Ruben Rodrigues Ferro e Msc. Joana Rita Mualem, que
propiciaram um ambiente de trabalho favorável e facilitador de minha jornada.
Ao Francisco Guimarães, que na condição de Secretário de Agricultura do
município de Bacabal foi fundamental para a realização da pesquisa.
Aos colegas de mestrado, Manoel, Hailton, Nordman, Radmés, Keila, Cínara,
em especial Edithe, Sonália e Nivia.
Às amigas do CETECMA, Luciana, Ilna e Janaina, pelo carinho e incentivo e
Heloisa Guimarães pela amizade e auxilio no uso da língua estrangeira.
Às estagiárias e técnicas do laboratório, em especial Nancylene e Daniela pelo
estimulo e ajuda prestada.
À FAPEMA pelo apoio financeiro.
À Universidade Estadual do Maranhão em especial a coordenação do curso de
mestrado em Ciências Veterinária.
A todos aqueles que, de alguma forma, me ajudaram com carinho e apoio no
desenvolvimento desse trabalho.
5
A mente que se abre a
uma nova idéia jamais
voltará ao seu tamanho
original
Albert Einstein
6
CONDIÇÕES HIGIÊNICO - SANITÁRIAS DO LEITE IN NATURA e
PASTEURIZADO TIPO C PROVENIENTES DA BACIA LEITEIRA DO MÉDIO
MEARIM – MA
Autora: Viramy Marques de Almeida
Orientadora: Prof
a
. Dr
a
. Francisca Neide Costa
RESUMO
Com o objetivo de avaliar as condições higiênico-sanitárias do leite in
natura e pasteurizado tipo “C”, provenientes da bacia leiteira do Médio
Mearim-MA, foram analisadas 60 amostras de leite, sendo 30 de leite in
natura e 30 de leite pasteurizado tipo C, determinando-se o Número
Mais Provável (NPM) de coliformes totais e a 45°C, enumeração de
bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas e pesquisa de Listeria spp.
Os resultados mostraram que das 30 amostras analisadas de leite tipo
C, 29 (96,66%) e 27 (90%), respectivamente estavam fora do padrão
microbiológico para coliformes totais e a 45°C. As 30 amostras de leite in
natura analisadas apresentaram valores que variaram de 150 a > 1.200
NMP/mL e < 3 a 1.100 NMP/mL para coliformes totais e a 45°C,
respectivamente. Na contagem de bactérias aeróbias mesófilas, no leite
tipo C, todas as amostras estavam dentro dos padrões recomendados
pela legislação vigente, quanto ao leite in natura os valores encontrados
variaram de 2,8 x 10
3
a x 2,2 x 10
5
UFC/mL. As contagens de
psicrotróficos variaram de 5,2 x 10
3
a 2 x 10
5
UFC para o leite in natura e
1,5 x10
2
a 2,5 x 10
4
UFC/mL para leite tipo C. Foi observado a presença
de Listeria spp. em três (10%) das 30 amostras de leite in natura
analisadas e ausência deste microrganismo nas amostras de leite tipo C.
Diante dos resultados obtidos conclui-se que o leite in natura e
pasteurizado tipo C produzido na bacia leiteira do Médio Mearim – MA
apresenta condições higiênico-sanitárias insatisfatórias, indicando sério
risco à saúde pública.
Palavras–Chave: Condições higiênico-sanitárias, leite in natura, leite
pasteurizado tipo C, coliformes, mesófilos, Listeria spp.
________________________________
1
Dissertação de Mestrado em Ciências Veterinárias – Sanidade Animal, Curso de Medicina
Veterinária da Universidade Estadual do Maranhão, MA, (56p.) maio, 2008.
7
HYGIENIC SANITARY CONDITIONS OF “IN NATURA’’ AND PASTEURIZED
TYPE C MILK OBTAINED FROM MÉDIO – MEARIN
MILK BASIN – MA
Author: Viramy Marques de Almeida
1
Adviser: Profa. Dra. Francisca Neide Costa
ABSTRACT
With the aim to evaluate the hygienic sanitary conditions of ‘in natura’ and
pasteurized type C milk, obtained from Médio – Mearin milk basin – MA, sixty
(60) milk samples were analyzed, thirty (30) of them consisted of ‘in natura’ milk
and the others consisted of pasteurized type C, establishing the most probable
number (MPN) of total coliforms and coliforms at 45°C, enumeration of aerobic
mesophilic bacteria, psychrotrophic bacteria and Listeria spp. The results
demonstrated that from the 30 milk samples of type C milk, 29 (96,66%) and 27
(90%) were out of the microbiological patterns to total coliforms and coliforms at
45º C, respectively. The 30 ‘in natura’ milk samples analyzed showed values
that varied from 150 MPN to > 1.200 MPN and < 3 MPN to 1.100 MPN to total
coliforms and to coliforms at 45º c, respectively. The aerobic mesophilic count
of all samples of type C milk were in accordance with the patterns established
by the legislation, as to “in natura’ milk samples, the values founded varied from
2,8 x 10³ cfu to 2,2 x 10
5
cfu. The psychrotrophic count varied from 5,2 x 10 ³
cfu to 2 x 10
5
cfu type C milk. The presence of Listeria spp. was observed in
three (10%) of the ’in natura’ milk samples analyzed and the absence of this
microorganism in type C milk samples. It follows that, considering the results
obtained, ‘in natura’ and pasteurized milk produced in Médio – Mearin milk
basin – MA show unsatisfactory hygienic sanitary conditions, indicating serious
hazard to public health.
Key – words: Hygienic sanitary conditions, “in natura” milk , pasteurized type C
milk, coliforms, mesophiles, Listeria spp
1
Master degree thesis in Veterinary Sciences – Animal Sanity, Veterinarian Medicine Course of
Universidade Estadual does Maranhão , MA (56p.), maio, 2008.
8
LISTA DE TABELAS
pág.
Tabela 1 - Número mais provável de coliformes totais e a 45°C e
percentual de amostras de leite tipo C fora dos padrões da legislação
vigente, Médio Mearim-MA,
2008.................................................................................................
31
Tabela 2 - Número mais provável de coliformes totais e a 45°C no leite in
natura, Médio Mearim-MA,
2008..........................................................................
33
Tabela 3 - Valores mínimos, máximos e médios das contagens de
microrganismos aeróbios mesófilos e psicrotróficos em amostras de leite
pasteurizado tipo C, Médio Mearim-MA,
2008.....................................................
34
Tabela 4 - Valores mínimos, máximos e médios das contagens de
microrganismos aeróbios mesófilos e psicrotróficos em amostras de leite
in natura, Médio Mearim-MA,
2008..........................................................................
35
9
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 1 - Sistema reagente de ensaio visual de imunoprecipitação (VIP)
na detecção da Listeria spp.........................................................................
29
Figura 2 -Freqüência de presença e ausência de Listeria spp em 30
amostras de leite in natura, Médio Mearim-MA,
2008.............................................................................................................
37
10
LISTA DE SIGLAS
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC - Association of Official Analytical Chemists.
BGBL- Caldo Verde Brilhante Bile, 2% de lactose
FAO - Food and Agriculture Organization
ICMSF - International Commission on Microbiological Specifications for Foods
IDF - International Dairy Federation
NMP - Número Mais Provável
PCA- Plate Count Agar
PCC – Pontos Críticos de Controle
UFC/mL - Unidade Formadora de Colônia por mililitro
UFC – Unidade Formadora de Colônia
VIP – Sistema Visual de Imunoprecipitação
11
SUMÁRIO
pág.
1 INTRODUÇÃO..............................................................................................................
12
2 REVISÃO DE LITERATURA........................................................................................
14
3 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................
26
3.1 Área de estudo e colheita das amostras.................................................................... 26
3.2 Determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais e coliformes a
45°C..................................................................................................................................
26
3.3 Contagem de bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas...................................... 27
3.4 Pesquisa de Listeria spp............................................................................................ 27
3.5 Análise Estatística...................................................................................................... 30
4 REULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................................
31
5 CONCLUSÕES.............................................................................................................
39
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS..........................................................................................
40
REFERÊNCIAS.................................................................................................................
41
APÊNDICE..........................................................................................................................
54
12
1 INTRODUÇÃO
A cadeia produtiva do leite no Brasil caracteriza-se como de singular
importância sob os aspectos social e econômico. A atividade leiteira está
presente em todo território nacional e desenvolve-se em aproximadamente 1,1
milhões de propriedades agrícolas, gerando cerca de 3 milhões de empregos
diretos, somente na atividade primária (MARTINS, 2004).
A produção de leite no Nordeste, em quase todos os estados, tem
uma trajetória tradicionalmente instável, crescente nos anos de chuva regular e
decrescente nas secas. Como fatores agravantes, devem-se considerar: o
baixo nível tecnológico adotado na maioria dos estabelecimentos leiteiros, o
padrão genético inferior de considerável percentual do rebanho e a baixa
qualidade do leite produzido (NOBRE, 1998).
A bacia leiteira do Médio Mearim - MA produz em média 15.000 litros
de leite dia, sendo que esta produção é obtida em pequenas propriedades,
distribuída em diversas concentrações, totalmente desarticulada com a média
da produção diária de 50 litros de leite, sendo expressiva a intermediação e a
venda de leite in natura não resfriado (PORRO; MESQUITA; SANTOS, 2004).
Do ponto de vista biológico, o leite pode ser considerado um dos
alimentos mais completos por apresentar, entre outras características, alto teor
de proteínas e sais minerais. Porém, o leite devido à sua riqueza nutritiva,
constitui um excelente meio de cultura para o desenvolvimento de
microrganismos, sendo veículo de transmissão de importantes zoonoses para o
ser humano (CATÃO & CEBALLOS, 2001).
No Brasil, de modo geral, o leite é obtido sob condições higiênicas
sanitárias deficientes, e em conseqüência, apresenta elevado número de
microrganismos, o que constitui um risco à saúde da população, principalmente
quando consumido sem tratamento térmico (CERQUEIRA & LEITE, 1995). Em
relação ao leite e seus derivados, os cuidados higiênicos para evitar a
13
contaminação devem ser iniciados desde a ordenha até a obtenção do produto
final (RIEDEL, 1992).
O leite pode proporcionar o desenvolvimento de três importantes
grupos de bactérias: os mesófilos, os psicrotróficos e os coliformes (ZOCCHE
et al., 2002). Os microrganismos aeróbios mesófilos são todos aqueles
capazes de crescerem em temperaturas de 35-37ºC em condições de
aerobiose, e sua presença em altas contagens é indicativa de procedimento
higiênico inadequado na produção, no beneficiamento ou na conservação
(FRANCO & LANDGRAF, 1996). Os psicrotróficos são termolábeis, porém
suas enzimas são resistentes ao tratamento térmico, sendo responsáveis por
alterações que reduzem a qualidade dos produtos lácteos (CUNHA &
BRANDÃO, 2000). Os coliformes são grupos ou espécies de microrganismos
que, quando presentes no alimento, indicam contaminação fecal, com provável
presença de patógenos e condições sanitárias inadequadas do alimento
(FRANCO & LANDGRAF, 1996).
Atualmente, diferentes estudos têm evidenciado elevados índices de
amostras de leite in natura e pasteurizado tipo C fora dos padrões
microbiológicos estabelecidos, inclusive contaminados por bactérias do gênero
Listeria spp. com predominância da espécie L. monocytogenes, patogênica ao
ser humano e a diversos animais, sendo sua distribuição ambiental favorecida
pela capacidade de se desenvolver entre 0°C e 44°C (CATÃO & CEBALLOS,
2001).
Entre as patologias veiculadas por alimentos, a listeriose é
considerada uma das mais importantes devido principalmente a sua
agressividade, caracteriza–se como uma infecção severa, causando um
conjunto de alterações patológicas, tais como, septicemia, infecção cervical ou
intra-uterina, capazes de resultar em abortos ou partos prematuros
(BATISTON, 2006).
Os neonatos, as gestantes, os indivíduos na faixa etária acima de 60
anos e os imunossuprimidos, são preferencialmente atingidos. O índice de
14
mortalidade nesses casos pode variar de 20 a 30% (ROCOURT, 1999 apud
RYSER & DONNELLY, 2001).
A L. monocytogenes é considerada um contaminante ambiental,
cujos meios de transmissão primários para o ser humano são os alimentos
contaminados durante a produção e processamento. Produtos lácteos são
particularmente susceptíveis à contaminação por este patógeno, uma vez que
as condições de produção (animais e ambiente de ordenha), armazenamento
(baixas temperaturas) e beneficiamento são ideais para a sua multiplicação e
sobrevivência (KOZAC et al., 1996; JAY, 2005).
Devido a ampla distribuição no ambiente e presença no trato
intestinal de vários animais, esse patógeno pode contaminar o leite e
derivados, carnes, aves e vegetais. Os surtos descritos na literatura estão na
maioria das vezes associados ao leite e ao queijo tipo mexicano (GILBERT,
1995).
Assim, considerando-se a importância socioeconômica do leite para
a região e à saúde humana esse trabalho objetivou avaliar as condições
higiênico-sanitárias do leite in natura e pasteurizado tipo C, provenientes da
bacia leiteira do Médio Mearim – MA, determinando-se o Número Mais
Provável (NMP) de coliformes totais e coliformes a 45°C, quantificando
bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas e pesquisando – se Listeria spp.
15
2 REVISÃO DE LITERATURA
Atualmente, o Brasil apesar da produtividade do rebanho leiteiro ser
baixa possui uma posição importante no que se refere à produção de leite,
ocupando o sexto lugar no “ranking” mundial. A cadeia produtiva do leite é uma
das importantes do complexo agroindustrial brasileiro. Movimenta anualmente
cerca de US$ 10 bilhões e emprega três milhões de pessoas, das quais mais
de um milhão são produtores com produção de 20 bilhões de litros de leite ano
e possuindo um dos maiores rebanhos do mundo (ZOCCAL, 2006).
A produção de leite brasileira tem bastante variação entre os
Estados no que se refere à produção e a produtividade (quantidade total /
número de animais). Os maiores produtores são Minas Gerais e Goiás, que
ficam apenas em sexto e oitavo lugar em produtividade, respectivamente,
enquanto Rio Grande do Sul que é o terceiro maior produtor é o primeiro em
produtividade, provando que medidas de controle da produção e da sanidade
são fundamentais nessa atividade (NERO, 2005).
A região Meio – Norte, que compreende os Estados do Piauí e
Maranhão, vem apresentando nos últimos anos um grande potencial para o
desenvolvimento da pecuária leiteira. Na última década a produção de leite no
estado do Piauí apresentou um crescimento de 40%, representando uma taxa
anual de crescimento em torno de 6%. No Maranhão o crescimento foi de
aproximadamente de 25%, com crescimento de 3% ao ano. Os dois estados e
em especial o Maranhão estão menos expostos às instabilidades climáticas
periódicas existentes no Nordeste (ZOCCAL, 2006).
No Brasil, vários fatores contribuem para a baixa produção dos
animais em lactação: manejo inadequado, nutrição deficiente, pouca ou
nenhuma seleção genética, pouco controle de sanidade animal e
principalmente a alta ocorrência de mastites subclínicas, que raramente são
diagnosticadas ou controladas (FONSECA & SANTOS, 2001).
16
A produção de leite no Brasil é caracterizada por pequenos a médios
produtores, com produção média diária de 50 a 100 litros. Essas propriedades
geralmente são conduzidas por famílias, que utilizam a atividade leiteira como
a principal fonte de renda. Em alguns casos ocorre pouco investimento na
produção, gerando pouca produtividade e baixa qualidade do produto final,
uma vez que, poucos produtores têm acesso à tecnologia e assistência técnica
adequada. Todos esses fatores refletem na qualidade do leite, sendo possível
verificar com relativa freqüência que propriedades com maior produção leiteira,
quando comparadas àquelas com menor produção, produzem leite de melhor
qualidade (TKAEZ et al., 2004).
O controle higiênico-sanitário dos rebanhos e da ordenha é
fundamental para garantir a composição ideal do leite e reduzir o risco de
transmissão de agentes de doenças. O leite ordenhado destinado ao consumo
humano, particularmente para crianças e idosos não deve apresentar
microrganismos em quantidade ou qualidade capazes de representar agravos à
Saúde (GERMANO, 2008).
Diversos microrganismos patogênicos podem ser veiculados pelo
leite, destacando-se Mycobacterium tuberculosis, Brucella spp., L.
monocytogenes, Salmonella spp., Staphylococcus aureus e Escherichia coli
(ROBISON, 1990; RIEDEL, 1992). Além dos patogênicos, os microrganismos
deteriorantes presentes no leite podem causar alterações químicas, tais como
a degradação de gorduras, de proteínas e de carboidratos, tornando-o
impróprio para o consumo e industrialização (TAMANINI et al., 2007).
O controle microbiológico em amostras de leite é realizado,
principalmente, através da pesquisa de microrganismos indicadores que,
quando presentes, podem fornecer informações sobre as condições sanitárias
da produção, do processamento, ou armazenamento, assim como possível
presença de patógenos e estimativa da vida de prateleira do produto. Os
principais grupos de microrganismos indicadores da qualidade do leite são os
coliformes, as bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas (FRANCO &
LANDGRAF, 1996).
17
O grupo dos coliformes totais inclui as bactérias na forma de
bastonetes Gram negativos, não esporogênicos, aeróbios ou anaeróbios
facultativos, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48
horas a 35°C. O grupo inclui cerca de 20 espécies, dentre as quais encontram-
se tanto bactérias originárias do trato gastrointestinal de humanos e outros
animais de sangue quente, como também diversos gêneros e espécies de
bactérias não entéricas, como Serratia e Aeromononas. Sua presença em
alimentos processados é considerada indicação de contaminação pós-
sanitização ou pós-processo, principalmente no caso da pasteurização,
evidenciando práticas de higiene e santitização aquém dos padrões requeridos
para o processamento do leite (ZOCCHE et al., 2002).
Os coliformes fecais ou termotolerantes por sua vez, constituem um
subgrupo dos coliformes totais cujo habitat natural é o trato intestinal dos
animais homeotérmicos e que, do ponto de vista sanitário, funcionam como
indicadores capazes de evidenciar maior probabilidade de que o alimento tenha
tido contato com material de origem fecal, caracterizado ainda pela capacidade
de fermentarem a lactose, produzindo ácido e gás quando incubados a 44,5°C
por 24h (SILVA & JUNQUEIRA, 1997 apud. ZOCCHE et al., 2002).
Os mesófilos constituem um grupo importante de bactérias por
incluir a maioria dos microrganismos acidificantes e principalmente pela
termorresistência apresentada por vários gêneros (JAY, 1994). Segundo o
International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF,
1980 apud ZOCCHE, 2002), mesófilos são microrganismos capazes de se
multiplicar em temperaturas ótimas na faixa de 30 a 45°C. Esse grupo de
bactérias podem ser termodúricos, resistindo à pasteurização (FONSECA &
SANTOS, 2000). Dependendo da quantidade, estes microrganismos podem ser
indicadores de má qualidade higiênica dos alimentos, utensílios e mãos de
manipuladores. Pode também está relacionado com a presença de
microrganismos patogênicos, tais como: Micrococcus, Staphylococcus,
Streptococcus faecalis, Pseudomonas, Alcaligenes, grupo Coliforme e
Leveduras (SILVA JR., 1995).
18
Outro grupo de microrganismo que deve ser mencionado são os
psicrotróficos por serem importante em produtos conservados ou armazenados
em condições de refrigeração por períodos longos. A contagem de bactérias
psicrotróficas avalia o grau de deteriorização de alimentos refrigerados ou
daqueles submetidos a tratamento térmico (SILVEIRA; SAKUMA; DUARTE
1998).
De acordo com as normas da International Dairy Federation (IDF),
os psicrotróficos foram definidos como sendo os microrganismos que podem
crescer a 7°C, independente da temperatura ótima de crescimento (COLLINS,
1981). São termolábeis, porém suas enzimas são resistentes ao tratamento
térmico, sendo responsáveis pelo desenvolvimento de “off flavor” de leite
pasteurizado, cheiro, coagulação sabor desagradáveis de derivados e pela
eficiência de determinados processos de fabricação, como a perda de
rendimento e redução da qualidade dos produtos lácteos (CUNHA &
BRANDÃO, 2000 ; ADAMS & MOSS, 2000).
Na microbiologia de alimentos vem sendo também estudada, nos
últimos anos, a presença de Listeria spp. com predominância da espécie L.
monocytogenes, assim como a diversidade de espécies do gênero (CATÃO &
CEBALLOS, 2001).
A Listeria spp. é um microrganismo que está amplamente
disseminado na natureza (ubiqüidade microbiológica). É um organismo
anaeróbio facultativo e tem a tendência a se dispor em paliçada, fato
evidenciado em esfregaços comuns (PICCHI; RAMOS; SOUZA, 1999).
A diferença entre as espécies baseia-se em testes de fermentação
de carboidratos, produção de hemólise em ágar sangue, incluindo o teste
Camp, e o teste de patogenicidade em camundongos (SEELINGER & JONES,
1975 apud SNEATH, 1986).
O gênero Listeria possui seis espécies reconhecidas: L.
monocytogenes, L. ivanovii; L. innocua; L. seeligeri, L. welshimeri e L. grayi. ,
19
destacando-se, porém a L. monocytogenes como a única envolvida em surtos
relacionados à ingestão de alimentos. Enfoque foi dado a esta bactéria após
surtos de doenças ocorridos na América do Norte e Europa, durante os anos
de 1980 a 1990, sendo reconhecida como um importante e emergente
patógeno de doenças veiculadas por alimentos (FARBER; PETERKIN, 1991;
McLAUCHLIN, 1997).
O agente etiológico da maioria dos casos de listeriose em humanos
é a L. monocytogenes, bacilo Gram-positivo, pequeno, curto, de 0,4-0,5 µm de
diâmetro e 0,5-2 µm de comprimento, com extremidades arredondadas, que
podem apresentar forma cocóide ou filamentosas, em culturas com 2-3 dias
(FARBER & PETERKIN, 1991; PHAN-THANH; MAHOUIN; ALIGÉ, 2000),
podendo ser observados isolados ou em cadeias curtas (RYSER & DONNELL,
2001). Assemelha-se a cocos em culturas velhas e perde a habilidade em reter
corantes de Gram, o que leva frequentemente a erros de identificação
(SEELINGER & JONES, 1975 apud SNEATH, 1986). Consequentemente, os
membros do gênero Listeria tem sido algumas vezes classificados como
Corynebacterium spp., Haemophilus influenza, Pneumococus, Estreptococos
ou Estafilococos (RYSER & DONNELL, 2001).
É um microrganismo desprovido de cápsula, não formador de
esporos (LOGUERCIO, 2001). L. monocytogenes multiplica–se tanto em
aerobiose ou anaerobiose, mas prefere ambientes microaerofílicos
(ROUCOURT, 1999 apud RYSER & DONNELL, 2001).
L. monocytogenes é um patógeno psicrotrófico que se multiplica
geralmente em temperaturas que variam de -0,4°C a 50°C, com multiplicação
ótima entre 30 e 37°C (DONNELL, 2001). Cresce bem em temperaturas de
refrigeração de 4 a 5°C. Tem como características peculiares à relativa
resistência térmica e capacidade de multiplicação em temperatura de
refrigeração. Possui flagelos peritríquios os quais dão aos microrganismos a
característica de motilidade (PICCHI; RAMOS; SOUZA, 1999). Estudos com L.
monocytogenes tem demonstrado que o patógeno multiplica-se em valores de
20
pH que variam de 4,4 a 9,6 com pH ótimo de crescimento 7,0 (SCHUCHAT;
SWAMINATHAN; BROME, 1991).
Person & Martem (1980) sugeriram que L. monocytogenes pode
infectar o ser humano e outros animais pelas vias: oral, ocular, cutânea e
respiratória. O trato intestinal é o local de entrada para L. monocytogenes no
organismo por meio das células epiteliais no ápice das microvilosidades,
difundindo - se não só pelo interior da célula, como também de uma célula para
outra. Na fase seguinte, são ingeridas por macrófagos e protegidas dos
leucócitos polimorfos nucleares (FRANCO & LANDGRAF, 1996).
Kayal et al. (1999) descobriram que a listeriosina O, secretada por L.
monocytogenes, é um potente estimulador inflamatório induzindo as células
endoteliais durante o processo infeccioso. A listeriosina O, é considerada,
como um dos fatores de virulência das espécies do gênero Listeria, liberando a
célula bacteriana do macrófago e desencadeando a lise da membrana
fagocítica destas células, ou seja, uma vez dentro da célula do hospedeiro a
bactéria pode ter acesso ao citoplasma, devido à ação do poro formado por
esta citolisina (GREIFFENBERG et al., 1997; SAMPATHKUMAR & XAVIER,
1999).
Em humanos, as manifestações associadas à L. monocytogenes
incluem: meningoencefalite, sintomas de gripe, baixo grau de septicemia no
período pré-natal, síndrome de mononucleoses, septicemia em adultos,
pneumonia, endocardites, abscessos localizados, lesões cutâneas papular ou
pustular, conjuntivites, uretrites e ocorrência de abortos. Também pode causar
danos cerebrais e retardamento mental (PERSON & MARTH, 1980).
Os indivíduos preferencialmente atingidos são os neonatos, as
gestantes, os idosos e os imunossuprimidos. O índice de mortalidade nesses
casos pode variar de 20 a 30% (RAINALDI; LUCIANI; PICCONI, 1991;
McLAUCHLIN, 1997). Os autores Ojeniyi; Wegener e Jersen (1996)
ressaltaram que a L. monocytogenes é um patógeno oportunista de intoxicação
21
alimentar que pode infectar a todos, sendo que as manifestações da doença
são mais comuns em pessoas com o sistema imunológico comprometido.
As mulheres grávidas pertencem a um grupo de alto risco, uma vez
que a infecção pode ser transmitida para o feto e causar aborto, natimorto ou
parto prematuro. As gestantes geralmente não apresentam sintomatologia
característica, podendo ocorrer em alguns casos sintomas semelhantes a um
resfriado, com febre, mialgia e cefaléia (RAINALDI; LUCIANI; PICCONI, 1991).
Nos indivíduos imunossuprimidos ou idosos, geralmente pode
ocorrer meningite ou meningoencefalite, devido ao tropismo do microrganismo
pelo sistema nervoso central. Os casos de meningite apresentaram letalidade
de 43,8%. Para alguns autores esta mortalidade resulta do fato de que
indivíduos com sistema imunológico comprometido são mais suscetíveis a
estas doenças (PERSON & MARTH, 1980; DAVIES et al., 1984; TWEDT et al.,
1994). Também tem sido relatada a forma gastroentérica, em decorrência do
consumo de alimentos contaminados (DALTON et al., 1997).
A incidência de listeriose em gestantes varia de acordo com relatos,
de 4,7 a 30 casos/100.000 nascimentos. Em pacientes transplantados, este
valor sobe para 200 casos/100.000; pacientes com câncer, 13 casos/100.000;
indivíduos com mais 65 anos, 1,4 casos/100.000 e indivíduos aidéticos a
incidência varia de 52 a 115 casos/100.000, considerando-se o conjunto de
indivíduos citados, em torno de 30% pode apresentar seqüelas. A taxa de
portadores assintomáticos é de 5%, variando de 1 a 10% (DAVIES et al., 1984;
TWEDT et al., 1994).
A listeriose tem sido descrita em outras espécies domésticas e
espécies silvestres, incluindo roedores. Aborto é bem comum em ruminantes,
mas também pode ocorrer em outras espécies. Nos bovinos o abortamento,
geralmente ocorre no terço final da gestação, após o sétimo mês de gestação,
e em torno da 12ª semana, nos ovinos. Nos eqüinos, a listeriose septicêmica é
a mais freqüente com sinais de febre, cólica leve, cansaço, depressão,
anorexia, icterícia e hemoglobinúria (GERMANO, 2008).
22
A L. monocytogenes é importante para a saúde pública devido o fato
da mesma causar uma severa infecção em seres humanos e nos animais
caracterizada por meningite, septicemia ou aborto. Na Europa e nos EUA
diversos surtos de listeriose foram atribuídos ao consumo de leite pasteurizado
e derivados (FARBER & PETERKIN, 1991), vegetais crus e queijos de alta
umidade (TOBIA; MENGONI; PELION, 1997).
Estima-se que nos EUA, baseado nos casos de listeriose
diagnosticadas, exista uma incidência anual de 1600 casos, com
aproximadamente 400 óbitos, o que evidencia a L. Monocytogenes como um
dos cinco patógenos que mais causam óbitos nos EUA, sendo responsável por
28% do total de óbitos causados por doenças de origem alimentar (SHANK et
al., 1996; MEAD et al., 1999).
Estudos epidemiológicos têm indicado uma diminuição da incidência
de listeriose humana em alguns países e o aumento do número de casos em
outros. Isso pode ser devido ao aumento de detecções e interesse nas
pesquisas desse patógeno ou pode ser decorrente de uma real modificação na
prevalência da L. monocytogenes no ambiente e alimentos e
consequentemente maior freqüência de exposição humana (TAPPERO et al.,
1995).
A quantidade de bactérias mínima infectante para causar a listeriose
ainda não foi estabelecida, mas acredita - se que se fosse baixa, maior número
de casos seriam relatados frente aos casos observados. Porém, segundo a
Food and Agriculture Organization (FAO, 1999) a partir da análise de alimentos
envolvidos em surtos e casos esporádicos de listeriose, evidenciou-se que
tanto contagens elevadas (acima de 10
3
UFC/g) quanto contagens baixas
(inferiores a 10
2
UFC/g) de L. monocytogenes poderiam causar quadro de
toxinfecção alimentar. Nos casos de veiculação por leite, considera-se que é
necessária uma quantidade ligeiramente superior a mil células da bactéria para
que haja a invasão do epitélio gastrintestinal (GERMANO, 2008).
23
Vale ressaltar, que a L. monocytogenes tem grande capacidade de
formar biofilme. Este fato torna ainda mais preocupante a presença desse
microrganismo na indústria de alimentos. A maior importância da L.
monocytogenes para a indústria de alimentos talvez seja o fato dela poder
sobreviver e se multiplicar em temperaturas de refrigeração, constituindo-se
num obstáculo para a maioria dos patógenos. Esse é um dado relevante
principalmente para os alimentos refrigerados prontos para o consumo em caso
de serem insuficientemente processados e/ou contaminados após o
processamento (MCCARTHY, 1997).
Os países apresentam condutas diferentes com relação aos limites
toleráveis de L. monocytogenes por grama de alimento. Os Estados Unidos da
América estabeleceram a chamada “Tolerância Zero”, onde não é permitida a
presença do patógeno em 25g de qualquer tipo de alimento (SHANK et al.,
1996). No Brasil, a RDC n° 12 de 02 de janeiro de 2001 da Agência Nacional
de Vigilância Sanitária determina a ausência em 25g de vários tipos de queijo.
Quanto ao leite, não há exigência legal à pesquisa do referido patógeno nas
legislações vigentes no Brasil.
Considerando a importância do leite sob os aspectos nutricionais,
econômicos, sociais e de saúde pública, a qualidade do mesmo tem merecido
a atenção de pesquisadores no Brasil e no mundo. Vários trabalhos realizados
com diferentes tipos de leite têm evidenciado no Brasil, elevados índices de
amostras fora dos padrões legais (ZOCCHE, 2002).
Nader Filho et al. (1996) ao avaliarem a qualidade microbiológica
quanto ao número mais provável de coliformes totais e fecais em amostras de
leite pasteurizado tipos B e C coletados de usinas de beneficiamento, no
Estado de São Paulo, subordinadas ao Serviço de Inspeção Federal,
observaram que 18,75% e 41,25%, respectivamente, estavam em desacordo
com os padrões estabelecidos pela legislação vigente.
Santos et al. (1999) ao analisarem 511 amostras de leites tipo A, B e
C comercializados em São José do Rio Preto/SP encontraram 25% de
24
amostras contaminadas por microrganismos mesófilos e/ou coliformes totais
e/ou coliformes fecais acima do tolerado.
Dezen & Santos (1998), analisando 88 amostras de leite
pasteurizado tipo C comercializado no estado de Sergipe, observaram que
74,24% das amostras analisadas estavam em desacordo com os padrões
estabelecidos pelo Ministério da Saúde para microrganismos mesófilos e/ou
coliformes totais e/ou coliformes fecais.
Hoffman; Cruz; Vinturim (1999), na cidade de São José do Rio
Preto-SP, Gonçalves & Franco (1998) no Rio de Janeiro-RJ e Martins &
Albuquerque (1999) em Fortaleza-CE, analisando várias marcas de leite tipo C
estimaram índices de 57%, 63% e 60% respectivamente de contaminação por
microrganismos mesófilos, coliformes totais e coliformes fecais acima dos
padrões mínimos estabelecidos pela legislação vigente.
Catão & Ceballos (2001) analisando 45 amostras de leite cru e 30 de
leite pasteurizado tipo C oriundas de propriedades leiteiras e laticínios do
estado da Paraíba-PB, constataram elevada incidência de coliformes totais e
coliformes a 45º no leite cru, evidenciando alta contaminação da matéria prima.
Todas as amostras de leite pasteurizado tipo C analisadas antes da adoção de
procedimentos de higienização apresentaram-se fora dos padrões para
coliformes totais e coliformes a 45º. Após melhorias na higienização, houve
uma significativa redução da contaminação do leite tipo C com valores fora dos
padrões de 22,2% e 44, 4% respectivamente de coliformes totais e coliformes a
45ºC.
Costa; Ferreira; Alves (2002) verificando as condições higiênicas
sanitárias do leite pasteurizado tipo C produzido e comercializado na cidade de
Imperatriz – MA evidenciaram que 27% estavam fora dos padrões para
coliformes totais e 18% para coliformes fecais e mesófilos.
Leite et al. (2002) observaram que em 65% das amostras analisadas
de leite tipo C, comercializadas em Salvador-BA, apresentaram contaminações
25
por coliformes totais com valores variando de 4 a 2.400 NMP/mL, dentre as
quais 55% encontravam-se em desacordo com os padrões estabelecidos pelo
Ministério da Saúde. A contagem de bactérias aeróbias mesófilas variou entre
1,4 x 10
2
a 2,2 x 10
6
UFC/mL, das quais, apenas uma amostra estava fora do
valor limite aceitável.
Mendes et al. (2005) em Alfenas-MG e Tamanini et al. (2007) no
Paraná evidenciaram 3,3% e 3,7%, respectivamente de amostras fora do
padrão para mesófilos em leite tipo C. Vale ressaltar que nenhuma das
amostras estavam fora dos padrões para coliformes totais e coliformes a 45ºC.
Moraes et al. (2005) estudando a qualidade microbiológica de leite
cru produzido em cinco municípios do estado do Rio Grande do Sul,
evidenciaram a presença de coliformes totais em todas as propriedades. Em
oito foram encontradas coliformes fecais. Entre as dozes propriedades testadas
quanto ao número de bactérias mesófilas, três estavam dentro dos padrões
exigidos pela legislação. A contagem de bactérias psicrotróficas foi superior ou
igual a 4 log. UFC mL
-1
.
Os autores Zocche et al. (2002) consideraram que contagens de
bactérias psicrotróficas acima de 4 log. UFC mL
-1
poderiam influenciar na
qualidade do leite devido à ação de enzimas lipoliticas e proteolíticas
produzidas pelos microrganismos e que permanecem ativas mesmos após o
tratamento térmico. As bactérias psicrotróficas presentes no leite, após
pasteurização são provavelmente termotolerantes comuns no leite que
poderiam afetar o produto se o tempo de refrigeração e prateleira fosse
superior aos estabelecidos pela legislação ou se utilizado na fabricação de
outros produtos ou derivados que tenham um tempo de prateleira ou
maturação prolongado.
No Brasil, vem sendo registrada também nos últimos anos a
presença de Listeria spp. em leite e derivados. Moura; Destro; Franco (1993) e
Catão & Ceballos (2001) no Estado de São Paulo-SP, analisando amostras de
leite cru e pasteurizado tipo C, evidenciaram a presença de Listeria spp. em 28
26
(12,7%) e 33 (73,3%) em amostra de leite cru e em 9 (30%) e 2 (0,2%) no leite
pasteurizado tipo C, respectivamente.
Sousa; Lima; Sousa (2000) em João Pessoa-PB e Ramos e Costa
(2003) em Manaus, evidenciaram a presença de Listeria spp. em 15 (50%) e 2
(3,4%) amostras de queijo de massa crua respectivamente. Duarte et al. (2005)
em Pernambuco e Sousa et al. (2006) na cidade de Fortaleza-CE isolaram
Listeria sp. em 15% e 17,1% em amostras de queijo coalho artesanal
respectivamente. Vieira et al. (2001), ao analisarem 50 amostras de queijo
minas frescal, comercializadas em Araguaina - TO, encontraram a presença de
Listeria spp. em 62% das amostras. A presença de Listeria spp. vem sendo
evidenciada também em locais de processamento de leite e derivados, Silva et
al. (2003) ao analisarem 218 amostras ao longo da linha de produção
identificaram 13 amostras positivas para Listeria. spp.
27
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Área de estudo e colheita das amostras
No período de setembro de 2007 a fevereiro de 2008, foram colhidas
e analisadas 30 amostras de leite in natura, em um posto de captação e 30 de
leite pasteurizado tipo C, em um posto de distribuição da Secretaria de Saúde,
localizados no município de Bacabal - MA.
As amostras de leite pasteurizado tipo C eram provenientes dos
municípios de Pedreiras, Bacabal, Vitorino Freire, Igarapé Grande e São Luiz
Gonzaga, transportadas em caminhão tanque refrigerado até o local de
pasteurização, no município de Itapecuru-Mirim-MA e distribuído para as
microrregiões do Médio Mearim e Itapecuru-Mirim-MA.
Após a colheita, as amostras foram acondicionadas em isopor
contendo bolsas de gelo reciclável e transportadas ao Laboratório de
Microbiologia de Alimentos e Água da Universidade Estadual do Maranhão,
onde foram realizadas análises para coliformes totais e a 45°C, bactérias
aeróbias mesófilas e psicrotróficas, segundo as metodologias recomendadas
pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento - MAPA (BRASIL,
1993). Para a pesquisa de Listeria spp. foi utilizado o método preconizado pela
Association of Official Analytical Chemists – AOAC (2002), utilizando-se o Kit
Visual Immunoprecipitate Assay (VIP- Listeria), conforme as especificações do
fabricante.
3.2 Determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes totais
e a 45°C
Para a determinação do Número Mais Provável de coliformes totais e
a 45°C foi utilizado a técnica dos tubos múltiplos que consiste em transferir
alíquotas de 1 mL de cada diluição para uma série de três tubos de ensaio.
28
Para coliformes totais as alíquotas foram transferidas para tubos contendo
Caldo Verde Brilhante Bile Lactose 2% (BGBL), incubados, a 35 ºC, durante 24
a 48 horas. Quanto aos coliformes a 45°C a partir dos tubos positivos para
coliformes totais, foram transferidos alíquotas para tubos contendo Caldo
Escherichia coli (EC) e, em seguida, a série de tubos foi incubada em banho-
maria a 44,5 °C por 24 - 48 horas, considerando-se positivas as amostras com
produção de gás nos tubos de fermentação. Para o cálculo do número mais
provável (NMP) de coliformes totais e a 45°C utilizou-se a tabela de Hoskins
(SILVA; JUNQUEIRA; SILVEIRA, 2001).
3.3 Contagem de bactérias aeróbias mesófilas e psicrotróficas
Para contagem de bactérias aeróbias mesófilas foram preparadas
diluições decimais (10
-1
a 10
-3
) de cada amostra de leite em água peptonada
tamponada estéril. Alíquotas de 1,0 mL das diluições decimais foram semeadas
em duplicata, pela técnica de “pour-plate”, em ágar-padrão (PCA). A seguir as
placas foram homogeneizadas e após solidificação do meio, as mesmas foram
incubadas, a 35 ºC, por 24 a 48 horas. Para a contagem de bactérias
psicotróficas foi realizado o mesmo procedimento dos mesófilos, entretanto as
placas foram incubadas a temperatura de 25°C por um período de até 72
horas. Após o período de incubação as colônias foram contadas e os
resultados expressos em unidades formadoras de colônias (UFC), por mililitro
de leite, multiplicando-se o resultado obtido pelo fator de diluição (BRASIL,
1993).
3.4 Pesquisa de Listeria spp
Para a pesquisa de Listeria spp. uma alíquota de 25 mL de cada
amostra foi adicionada a 225 mL de Caldo Fraser modificado com Cloreto de
Lítio 8M, incubado a 30°C por 28 horas (enriquecimento seletivo primário).
29
Após a incubação, alíquotas de 1 mL foram transferidas para tubos contendo 9
mL de Caldo de Enriquecimento Listeria Buffer (BLEB) e incubados por 24
horas a 30°C (Enriquecimento seletivo secundário). Após incubação transferiu
– se 1 mL de BLEB para um tubo de ensaio e em seguida foi inativado a 100°C
por 5 minutos com a finalidade de liberar o antígeno somático. Após
resfriamento em temperatura ambiente, transferiu - se uma alíquota de 0,1 mL
para o círculo da unidade VIP. Após 10 minutos, observou-se a presença de
uma linha de cor cinza na cavidade de resultado do sistema reagente, a qual
indica a presença de antígenos flagelares de Listeria spp, e, portanto,
considerado como resultado positivo (Figura 1). A ausência da linha cinza
indica resultado negativo. As amostras positivas foram inoculadass por
inundação de superfície (0,1mL e encubadas a 37ºC por 24 a 48 horas), em
placas contendo Agar cloreto de lítio feniletanol moxalactam seletivo para
Listeria spp.
0, 1 mL da amostra no circulo do dispositivo A amostra flui da esquerda para a direita
passando pela zona indicada. Se
estiverem presente na amostra os
antígenos formam um complexo antígeno/
anticorpo
O fluxo continua até a zona de detecção. Após
alguns minutos à temperatura ambiente uma linha
se forma na janela teste (positivo)
O fluxo segue até a zona de controle
positivo do teste. Uma outra linha se
formará indicando a finalização do teste.
Figura 1 – Sistema reagente de ensaio visual de imunoprecipitação (VIP) na
detecção da Listeria spp. (Adaptado da Association of Official
Analytical Chemists - AOAC, 2002).
30
3.5 Análise Estatística
Os dados obtidos foram analisados, segundo o programa Bioestata
3.0 de domínio público. Os resultados das variáveis qualitativas foram
expressos em porcentagem (%) e das quantitativas em valores mínimos,
máximos e médios.
31
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Estão representados nas TABELAS 1, 2, 3, 4 e na FIGURA 2 os
valores das análises microbiológicas do leite pasteurizado tipo C e in natura
proveniente da bacia leiteira do Médio Mearim - MA.
Os resultados demonstram que as contagens de coliformes totais no
geral foram altas (Tabela 1), onde pode-se observar que das 30 amostras de
leite pasteurizado tipo C analisadas, 29 (96,66%) estavam em desacordo com
os padrões estabelecidos pelo Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento , com valores variando de 4 a > 1.100 NMP/mL, com média de
359 NMP/mL. Quanto aos coliformes a 45°C, obteve-se um resultado de 27
(90%) de amostras fora dos padrões, com valores que variaram de < 3,0
(ausência) a > 1.100 NMP/mL com média de 223 NMP/mL.
Tabela 1 – Número mais provável de coliformes totais e a 45°C e percentual de
amostras de leite pasteurizado tipo C fora dos padrões da legislação
vigente*, Médio Mearim - MA, 2008.
Valores
Amostras fora do
padrão*
Microrganismos
Mínimo Máximo Média N° %
NMP de coliformes
totais
4 > 1.100 359 29 96,66
NMP de coliformes
a 45°C
< 3,0 > 1.100 223 27 90,00
*Instrução Normativa n° 51 de 18/08/2002 do Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento – MAPA (BRASIL, 2002).
Pelos dados apresentados na Tabela 1, verificou-se um alto
percentual de amostras de leite pasteurizado tipo C contaminados por
coliformes, visto que 96,66 e 90% das amostras estavam inadequadas para o
consumo, indicando um risco em potencial para a saúde da população, pois a
32
presença de coliformes totais e a 45°C no alimento indica o nível de
contaminação que o mesmo agregou e uma possível contaminação de origem
fecal assim como eventual ocorrência de enteropatógenos.
O elevado percentual de amostras de leite pasteurizado
contaminados por coliformes indica prováveis falhas na pasteurização e/ou
contaminação pós-pasteurização, esta última pode ser atribuída à deficiência
na limpeza e sanificação dos equipamentos ou à qualidade da água utilizada
nos procedimentos de limpeza e enxágüe, assim como condições inadequadas
de temperatura na conservação do leite, pós processamento. Resultados
semelhantes foram obtidos por Catão & Ceballos (2001) na Paraíba, onde 30
amostras de leite pasteurizado tipo C, analisadas antes da adoção de
procedimentos de higienização apresentaram-se fora dos padrões estabelecido
para coliformes totais e a 45°C.
Valores elevados de coliformes totais e a 45°C também foram
evidenciados por outros autores que analisaram leite tipo C tanto na região
Nordeste como nas outras regiões do país. Hoffman; Cruz & Vinturim. (1995),
na cidade de São José do Rio Preto-SP, Dezen & Santos (1998) no estado de
Sergipe, Gonçalves & Franco (1998) no Rio de Janeiro-RJ, Martins &
Albuquerque (1999) em Fortaleza-CE, Catão & Cebalhos (2001) na Paraíba e
Leite et al. (2002) em Salvador-BA, analisando várias marcas de leite tipo C
verificaram percentuais de 57%, 74,4%, 63%, 60%, 50% e 65%,
respectivamente de contaminação por coliformes totais e coliformes a 45°C
acima dos padrões mínimos estabelecidos pela legislação vigente. Freitas;
Oliveira & Galindo (2005) evidenciaram em Belém-PA, que 66,60% das
amostras estavam fora dos padrões para coliformes totais.
Ainda em relação ao leite tipo C, o percentual de contaminação por
coliformes totais e a 45°C foi superior ao percentual evidenciado por Costa;
Ferreira; Alves (2002) que verificando as condições higiênicas sanitárias do
leite pasteurizado tipo C produzido e comercializado na cidade de Imperatriz –
MA, evidenciaram que das 44 amostras analisadas, 27% estavam fora dos
padrões para coliformes totais e 18% para coliformes a 45°C. Nader Filho et al.
33
(1996), no Estado de São Paulo, Pereira et al. (2006), em Ponta Grossa -
Paraná e Tamanini et al. (2007), na região norte do Paraná, evidenciaram 18%;
11,25%; 23,3%; 35% e 30% ,17% respectivamente para coliformes totais e a
coliformes a 45°C acima do tolerado.
Quanto às amostras de leite in natura verifica-se na Tabela 2, que o
número mais provável de coliformes totais variou de 150 a >1.100 NMP/mL,
com valor médio de 1.007 NMP/mL e para coliformes a 45°C de <3,0 a >1.100
NML/mL e valor médio de 722 NMP/mL. Estes resultados indicam a qualidade
insatisfatória do leite in natura, o que pode estar associado ao manejo
inadequado e higiene precária da ordenha, além das falhas na manipulação do
leite e dos utensílios que entram em contato com este produto e ao controle
ineficiente da temperatura no tanque de resfriamento. Ressalta-se que não há
uma legislação que determine as quantidades de coliformes totais e a 45°C em
leite in natura.
Tabela 2 – Número mais provável de coliformes totais e a 45°C no leite in
natura, Médio Mearim - MA, 2008.
Valores
Microrganismo
Mínimo Máximo Média
NMP de Coliformes
totais
150 > 1.100 1.007
NMP de Coliformes a
45°C
< 3,0 > 1.100 722
Estes dados indicam a necessidade de orientar os produtores
quanto à importância de melhorar as características higiênico-sanitarias do leite
in natura, principalmente quanto aos elevados percentuais de coliformes totais
e a 45°C, encontrados no leite pasteurizado tipo C e in natura, face aos
potenciais riscos sanitários para a saúde do consumidor, podendo contribuir
para ocorrência de intoxicações e infecções de origem alimentar.
34
Quanto aos mesófilos (Tabela 3), as contagens nas 30 amostras de
leite pasteurizado tipo C variaram de 2,0 x 10
2
a 3,8 x 10
4
, portanto dentro do
limite estabelecido pela Instrução Normativa n° 51 de 18/08/2002 do Ministério
da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA (BRASIL, 2002) que
preconiza para leite tipo C o limite máximo de 3,0 x 10
5
UFC/mL. Este resultado
foi similar aos relatados por Leite Júnior; Torrano & Gelli (2000), em João
Pessoa - PB e Oliveira (2005) em Piracicaba-SP, que não evidenciaram
nenhuma amostra fora do padrão para mesófilos. No entanto Garrido et al.
(2001) em Ribeirão Preto-SP, Zooche et al. (2002) na região oeste do Paraná,
Freitas; Oliveira; Galindo (2005) em Belém-PA e Tamanini et al. (2007) na
região norte do Paraná, relataram resultados variando de < 1 x 101UFC/mL a
107 UFC/mL, com percentual de 0,8%; 16,66%; 41,90% e 3,3 %,
respectivamente acima do estabelecido pela legislação para o mesmo grupo de
microrganismos.
Tabela 3 – Valores mínimos, máximos e médios das contagens de
microrganismos aeróbios mesófilos e psicrotróficos em amostras de
pasteurizado tipo C, Médio Mearim - MA, 2008.
Leite Tipo C
Microrganismos
Mínimo Máximo Média
Mesófilos (UFC/mL) 2,0 x 10
2
3,8 x 10
4
7,2 x 10
3
Psicrotróficos (UFC/mL) 1,5 x 10
2
2 x 10
5
5,3 x 10
3
As contagens de mesófilos nas amostras leite in natura (Tabela 4)
variaram de 2,8 x 10
3
UFC/mL a 2 x 10
5
UFC/mL, com média de 2,2 x 10
5
UFC/mL, portanto, bem abaixo dos 6,23 x 10
6
,
4,11 x 10
6
e 2,5 x 10
6
UFC/mL,
evidenciados por Silva et al. (2000), no Estado de Minas Gerais, Vieira; Veiga;
Freitas (2003) em Castanhal - PA e Oliveira (2005) Piracicaba-SP,
respectivamente. Porém, embora os resultados sejam aceitáveis quando
comparados com outras regiões, há uma necessidade de sensibilização junto
35
aos produtores, visando melhorar as características higiênico-sanitárias do
leite.
Tabela 4 – Valores mínimos, máximos e médios das contagens de
microrganismos aeróbios mesófilos e psicrotróficos em amostras de
leite in natura, Médio Mearim - MA, 2008.
Leite in natura
Microrganismos
Mínimo Máximo Média
Mesófilos (UFC/mL) 2,8 x 10
3
2 x 10
5
2,2 x 10
5
Psicrotróficos (UFC/mL) 5,2 x 10
3
2 x 10
5
1,10 x 10
5
Os resultados expressos nas Tabelas 3 e 4 demonstram ainda que
as contagens de psicrotróficos variaram de 1,5 x10
2
a 2,5 x 10
4
UFC/mL
para
leite pasteurizado tipo C e 5,2 x 10
3
a 2 x 10
5
UFC/mL para o leite in natura ,
entretanto não há padrão estabelecido na legislação vigente para este grupo de
microrganismo, contudo de acordo com Adams & Moss (2000) as bactérias
psicrotróficas na quantidade de 1,0 x 10
4
UFC/mL podem produzir enzimas
termoestáveis responsáveis pelo odor e sabor desagradáveis e coagulação do
produto, diminuindo a vida útil do mesmo.
Segundo Moraes et al. (2005) as bactérias psicrotróficas presentes
no leite pasteurizado são provavelmente bactérias termotolerantes comuns no
leite, que podem afetar o produto se o tempo de refrigeração e prateleira for
superior aos estabelecidos pela legislação ou se utilizado na fabricação de
outros produtos derivados que tenham um tempo de prateleira ou maturação
prolongado. Vale ressaltar que leite com valores elevados de bactérias
psicrotróficas, constitui um risco para o consumidor não somente pela
deterioração da matéria prima, mas principalmente pela presença de alguns
gêneros de bactérias psicrotróficas como as Pseudomonas e a Listeria.
Quanto à pesquisa de Listeria spp. não foi observado a presença da
mesma em nenhuma das amostras analisadas de leite pasteurizado tipo C. Os
resultados encontrados foram semelhantes aos observados por Destro;
36
Serrano; Kabuki (1991) em Campinas-SP e Padilha et al. (2001) em Recife-PE.
Tais resultados corroboram com a posição dos pesquisadores de listeriose de
origem alimentar da Organização Mundial de Saúde (GERMANO, 2008), que
consideram a pasteurização um tratamento eficiente para redução da Listeria
no leite. No entanto, os achados do presente estudo foram divergentes dos
evidenciados por Catão & Ceballos (2001), na Paraíba, onde foi observada a
presença da Listeria spp. em 30% das amostras de leite pasteurizado,
indicando que a pasteurização não foi eficiente, ou que houve recontaminação
ou, ainda que ocorreram ambos os fenômenos.
Destacamos que normalmente a Listeria spp. está presente nos
alimentos em baixas concentrações e, frequentemente, a presença de
contagens elevadas de microrganismos competidores dificultam o isolamento
desse patógeno, pois, seu crescimento pode ser superado pelos contaminantes
o que pode ter ocorrido, uma vez que as amostras de leite pasteurizado tipo C
analisadas apresentaram porcentagem elevada de contaminação por
coliformes totais e a 45°C . Além disso, os processos físicos e químicos
empregados para destruí-la, também podem ter comprometido o isolamento da
mesma. Ressalta-se, ainda que a não detecção da Listeria spp no alimento
também está muitas vezes relacionadas a fatores de estresse celular e o
número inicial relativo de células.
Nas amostras leite in natura (Figura 2), os resultados obtidos
indicaram a presença de Listeria spp. em três (10%) das 30 amostras
analisadas, o que está em concordância com os achados de Moura; Destro;
Franco (1993), que investigando a incidência de Listeria spp. em 220 amostras
de leite cru em São Paulo, observaram 28 (12,7%) de amostras positivas e
abaixo dos 75% evidenciados por Catão & Ceballos (2001) na Paraíba.
Comparando-se os resultados desse estudo e os dos autores
citados, os dados sugerem que independente da região geográfica é freqüente
no Brasil a incidência de Listeria spp. em leite in natura. Esse panorama não é
exclusivo do Brasil, visto que a ocorrência de Listeria spp. também foi
registrada em outros paises, como Espanha, Suíça, Estados Unidos, Japão e
37
Canadá (DOMINGUEEZ-RODRIGUEZ et al., 1985; BREER & SCHOPFER
1988; LUND; ZOTTOLA; PUSCH, 1991; YOSHIDA; SATO; HIRAI, 1998;
DAVIDSON et al., 1999).
10%
90%
Presença
Ausência
Figura 2 – Freqüência de presença e ausência de Listeria spp. em 30 amostras
de leite in natura, Médio Mearim – MA,2008.
Estes resultados sugerem deficiências nas condições higiênicas
sanitárias da ordenha, no transporte ou em ambos configurando-se um risco à
entrada deste patógeno na cadeia produtiva do leite, sendo necessário,
portanto o controle rigoroso deste microrganismo pelo produtor, além de
medidas corretas de higienização nas plataformas de recepção do leite, e
sanitização eficiente dos equipamentos, bem como a implantação e
manutenção dos programas de controle de pontos críticos. O conjunto de
medidas devem ser orientadas para diminuir as chances de contaminação na
indústria pela Listeria spp.
É importante frisar ainda que, embora apenas Listeria
monocytogenes seja patogênica para o ser humano, todas as espécies de
Listeria apresentam um padrão de crescimento similar frente as diferentes
condições de cultivo (COELHO, 1998). Portanto, a presença de L. spp. em 10%
das amostras (Figura 2) pode indicar uma maior probabilidade de ocorrência de
L. monocytogenes, constituindo-se assim, num fator indicativo de risco com
relação à segurança alimentar, pois apesar de uma única célula de L..
38
monocytogenes provalvemente não ser suficiente para causar listeriose, sua
capacidade de multiplicação em condições de estocagem, mesmo sob
refrigeração, faz com que sua presença no alimento coloque em risco a saúde
dos consumidores mais susceptíveis (gestantes, crianças, idosos e
imunodeprimidos), principalmente se esse leite for consumido in natura.
Torna-se evidente que problemas sanitários têm ocorrido na
obtenção e conservação do leite in natura e pasteurizado tipo C, provenientes
da bacia leiteira do Médio Mearim - MA e, portanto, devem ser implantadas
medidas que possam identificar e corrigir falhas no processo de obtenção do
produto e maior rigor na fiscalização pelos órgãos competentes. Ressalta-se a
importância da implantação de um programa de qualidade do leite que garanta
um controle efetivo das condições higiênico-sanitárias na cadeia produtiva do
leite, obtendo-se de um produto de melhor qualidade para a população.
A qualidade insatisfatória do leite produzido no Brasil e os
evidenciados nesse estudo constituem um problema de saúde pública, onde
fatores de ordem social, econômica, climáticas e até mesmo culturais estão
envolvidos, e que não têm merecido atenção, apesar do importante papel
representado pelo leite, tanto na alimentação da população quanto para a
economia da região.
39
5 CONCLUSÕES
Nas condições que a pesquisa foi realizada e de acordo com os
resultados obtidos é possível concluir que:
• O leite in natura e pasteurizado tipo C produzido na bacia leiteira
do Médio Mearim – MA apresentam condições higiênico-
sanitárias insatisfatórias;
• O leite in natura apresenta qualidade higiênica insatisfatória e
sério risco à saúde pública face a presença do patógeno Listeria
spp.;
• O leite pasteurizado tipo C está fora dos padrões estabelecidos
pela legislação vigente, quanto à presença de coliformes totais e
a 45°C;
• Há necessidade de um estudo detalhado em toda cadeia
produtiva do leite com o intuito de se estabelecer os pontos
críticos de controle (PCCs).
40
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
• Há necessidade de implantação das boas práticas de produção
na cadeia produtiva do leite no Médio Mearim;
• A carência de mão-de-obra qualificada e a falta de treinamento
dos ordenhadores para obtenção higiênica do leite e orientações
técnicas quanto a sanidade do rebanho contribuem para que o
leite da região do Médio Mearim apresente qualidade
microbiológica insatisfatória;
• Necessita-se de melhorar e intensificar a fiscalização pelos
órgãos competentes e implantação de um programa que agregue
maior valor ao litro de leite produzido em função da qualidade do
produto.
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54
APÊNDICE
55
APÊNDICE A - Distribuição dos resultados obtidos após análises
microbiológicas em trinta (30) amostras de leite in natura, Médio
Mearim-MA, 2008.
Amostras
Coliformes
totais
Coliformes
a 45°C
Mesófilos Psicrotróficos
01 > 1.100 244 2000000
2000000
02 > 1.100 150 55000
173000
03 > 1.100 < 3.0 28000
98000
04 > 1.100 < 3.0 98000
76000
05 > 1.100 >1.100 156000 52000
06 > 1.100 >1.100 58000
59000
07 1.100 >1.100 46000
89000
08 > 1.100 >1.100 1200000
57000
09 1.100 30 144000
160000
10 1.100 30 189000
56000
11 > 1.100 >1.100 128000
88000
12 > 1.100 98 192000
80000
13 150 150 180000 105000
14 150 30 158000 180000
15 > 1.100 >1.100 102000 156000
16 1.100 >1.100 101000 167000
17 > 1.100 >1.100 98000 155000
18 > 1.100 >1.100 99000 194000
19 1.100 1.100 1332000 164000
20 1.100 1.100 78000 109000
21 1.100 1.100 115000 169000
22 1.100 >1.100 78000 132000
23 > 1.100 >1.100 152000 159000
24 1.100 1.100 1000000 132000
25 1.100 1.100 159000 172000
26 > 1.100 28 135000 198000
27 > 1.100 >1.100 153000 132000
28 210 28 135000 95000
29 > 1.100 >1.100 176000 151000
30 > 1.100 >1.100 179000 109000
56
APÊNDICE B - Distribuição dos resultados obtidos após análises
microbiológicas em trinta (30) amostras de leite pasteurizado tipo
C, Médio Mearim - MA, 2008
Amostras
Coliformes
Totais
Coliformes
a 45°C
Mesófilos Psicrotróficos
01 4,0 4.0 1050 150
01 43 43 1250
1.010
03 >1.100 > 1.100 19800
185,000
04 >1.100 > 1.100 29600
184,000
05 >1.100 > 1.100 27200
205,000
06 >1.100 > 1.100 32400
150,000
07 >1.100 > 1.100 38400
185,000
08 23 < 3,0 1080
1590
09 >1.100 23 1040
150,000
10 >1.100 23 2280
200,000
11 240 < 3,0 850
1880
12 43 < 3,0 840
680
13 43 < 3,0 1800
152,00
14 93 43 1200
140,00
15 23 23 1140
84,000
16 23 23 590
187,000
17 >1.100 43 2600
1890
18 93 23 2500
1920
19 23 43 20000
1800
20 23 23 1040
1200
21 23 23 880
104,000
22 23 23 800
200,000
23 23 23 300
1200
24 23 23 330
320
25 23 23 200
290
26 240 23 1100
1100
27 460 460 1040
1040
28 240 23 1580
15000
29 150 150 2200
15200
30 93 93 20800
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