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Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia
Universidade de São Paulo
ROGÉRIO LOESCH ZACARIOTTI
Avaliação reprodutiva e congelação de
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São Paulo
São Paulo
2008
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ROGÉRIO LOESCH ZACARIOTTI
Avaliação reprodutiva e
congelação de sêmen em serpentes
São Paulo
2008
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ROGÉRIO LOESCH ZACARIOTTI
Avaliação reprodutiva e
congelação de sêmen em serpentes
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Reprodução Animal da
Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Doutor em
Medicina Veterinária
Departamento:
Reprodução Animal
Área de Concentração:
Reprodução Animal
Orientador:
Prof. Dr. Marcelo Alcindo de Barros Vaz
Guimarães
São Paulo
2008
Inserir Ficha catalográfica
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Nome: ZACARIOTTI, Rogério Loesch
Título: Avaliação reprodutiva e congelação de sêmen em serpentes
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Reprodução Animal da
Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Doutor em
Medicina Veterinária
Data: ____/____/____
Banca Examinadora
Prof. Dr. _________________________ Instituição:__________________
Assinatura: ________________________ Julgamento: __________________
Prof. Dr. _________________________ Instituição:__________________
Assinatura: _________________________ Julgamento: _________________
Prof. Dr. _________________________ Instituição:__________________
Assinatura: _________________________ Julgamento: _________________
Prof. Dr. _________________________ Instituição:__________________
Assinatura: _________________________ Julgamento: _________________
Prof. Dr. _________________________ Instituição:__________________
Assinatura: _________________________ Julgamento: _________________
Aos grandes amores da minha vida:
Mirella e Isabella, vocês iluminam
o meu coração e me ensinam o que
é amar incondicionalmente.
Aos meus pais Pedro e Eliana,
que me amam de maneira
incondicional.
Aos meus queridos familiares
Ricardo, Cristina, Alberto,
Daniela e Pedro Paulo.
A minha segunda família Paulo,
Nanci, Fúlvio e Alzira.
“Planos são apenas boas
intenções, a não ser que sejam
imediatamente transformados em
trabalho duro.” (
Peter F. Drucker)
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Marcelo Alcindo de Barros Vaz Guimarães, pela orientação, amizade,
paciência, confiança e parceria.
À Dr
a
. Barbara Durrant, pela co-orientação, amizade, carinho e por ter me recebido
de braços abertos no Laboratório de Fisiologia Reprodutiva do CRES.
A Don Boyer, curador do Departamento de Herpetologia do Zoológico de San Diego,
pelo apoio incondicional neste trabalho e por ter me apresentado pessoalmente minha
primeira Tuatara.
A John Kinkaid do Departamento de Herpetologia do Zoológico de San Diego, pelo
auxílio nas colheitas de sêmen e por ter gentilmente cedido as fotos da dança-combate
entre dois machos de cascavel.
A J.P. Montagne e Jeff Lemm, do Laboratório de Ecologia Animal Aplicada do CRES,
por muito me ensinarem sobre a área de estudo e as espécies que nela vivem.
A Fred Bercovitch do Laboratório de Biologia Comportamental do CRES, pelo apoio
logístico na realização dos trabalhos de campo.
A todos os funcionários e estagiários do CRES, Zoológico de San Diego e Wild
Animal Park que auxiliaram direta ou indiretamente neste trabalho.
Aos amigos do coração que deixei em outro país: Bird Tom, Betty, Bear Tom, Nicole,
Dianne, Ali Cheng, Alice e Irene.
A Dr
a
. Mayra do Departamento de Reprodução Animal pelas importantes
contribuições dadas durante o Exame de Qualificação desta tese.
Aos amigos do Departamento de Reprodução Animal, Patrícia, Mariana, Sílvia,
Eduardo, Marcílio, Lílian, Manuela, Marco Antônio, Priscila e Rodrigo.
Ao Marcílio em especial, pela amizade, altruísmo e ajuda nas análises estatísticas e
discussões deste trabalho.
Aos funcionários do Departamento de Reprodução Animal, pela amizade e auxílio.
À Harumi pela amizade, paciência, auxílio e extrema competência que executa seu
trabalho.
Às funcionárias da Biblioteca da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo, pelo auxílio na revisão desta tese, e pela competência e
agilidade que executam seu trabalho.
Aos pesquisadores do Laboratório de Ecologia e Evolução Instituto Butantan Dr.
Otávio Marques, Dr. Ricardo Sawaya e Dr
a
. Selma Almeida-Santos, pela amizade, apoio e
ensinamentos.
Aos amigos do Laboratório de Ecologia e Evolução do Instituto Butantan, Rafael,
Rodrigo, Donizete, Fernanda, Lívia, Thaís, Letícia, Karina, Fausto, Murilo, Marília, Ana,
Cristian, pelos momentos felizes que proporcionam.
Ao Dr. Rodrigo Del Rio do Valle, pela amizade e compreensão nos momentos que
precisei me afastar do trabalho.
Aos amigos de São Joaquim da Barra, Cláudia, Thaís, Renata, Alex, Fernanda
Maria, Thalita, Taís, Bruna, Mário, Lígia, Fernanda T., Élsio, Michele, Flavinho, Paulo,
Adelmo, Joel e Degnaldo, pelo convívio e momentos felizes que vivemos.
Ao Dr. Euardo Bondan, Dr
a
. Anete Lallo e Prof
a
. Fátima Martins, da Universidade
Cruzeiro do Sul, pelo apoio e amizade.
À Heller Foundation e a Menard Family Foundation pela bolsa concedida nos
Estados Unidos.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPQ) pela bolsa concedida
no Brasil.
Enfim a todos que contribuíram para que esse trabalho acontecesse.
RESUMO
ZACARIOTTI, R. L. Avaliação reprodutiva e congelação de sêmen em
serpentes. [Reproductive evaluation and semen cryopreservation in snakes]. 2008.
98 f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária
e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
Os répteis compõem hoje uma classe com mais de 8.000 espécies e em razão das
restrições na importação desses animais, o risco na introdução de doenças exóticas,
o crescente número de espécies ameaçadas no mundo, entre outros, a reprodução
e a manutenção em cativeiro desses animais é muito importante. No Sul da
Califórnia, que é considerado um Hotspot para a biodiversidade, a Zoological Society
of San Diego mantém uma reserva ecológica com aproximadamente 400 hectares e
formada por vegetação tipo Chaparral, Coastal Sage Scrub e áreas cobertas por
cactos (Opuntia sp.). Durante o período de junho de 2005 a julho de 2006 foram
capturadas 96 cascavéis das espécies Crotalus ruber ruber, C. oreganus helleri e C.
mitchellii phyrrus, durante os trabalhos de campo pela procura visual limitada por
tempo. Foram realizadas avaliações morfológicas e reprodutivas em todas essas
serpentes capturadas. Nos machos realizou-se a colheita e avaliação de sêmen,
incluindo duas colorações específicas para avaliar integridade de membrana
espermática e do acrossoma. Nas fêmeas foi realizada a avaliação ultra-sonográfica
dos ovários, com mensuração e contagem de folículos, além do diagnóstico de
gestação. Para a C. ruber ruber, a serpente mais abundante neste estudo, foram
observadas fêmeas prenhes no verão e vitelogênicas na primavera, outono e
inverno. Apenas as fêmeas desta espécie com condição corporal boa ou muito boa
apresentaram-se vitelogênicas ou prenhes. Nos machos dentre as características
seminais avaliadas, não foi observada a diferença estatisticamente significante ao
longo das estações do ano. Em paralelo a este estudo, também foram testados
protocolos para a congelação de sêmen de serpentes, com a obtenção de
resultados promissores, discutidos em capítulo específico. As informações obtidas
neste estudo visam contribuir para a compreensão da biologia reprodutiva e
conservação das serpentes, em cativeiro ou vida-livre.
Palavras-chave: Conservação. Répteis. Sêmen. Espermatozóide. Folículos.
ABSTRACT
ZACARIOTTI, R. L. Avaliação reprodutiva e congelação de sêmen em
serpentes. [Reproductive evaluation and semen cryopreservation in snakes]. 2008.
98 f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária
e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2008.
There are more than 8,000 reptile species in world. Today´s restrictions to
importation of these species around world, the risk of introduction of exotic diseases,
the growing number of endangered reptiles, among other reasons, emphasize the
importance of reproduction in captivity and ex-situ conservation. South California is a
Hotspot for biodiversity and the Zoological Society of San Diego maintains a nature
preserve in Escondido City. In an area of about 400 hectares, composed by
vegetation types like Chaparral and Coastal Sage Scrub, it has been found the
greatest diversity of snake in region. Between May 2005 and July 2006, 96
rattlesnakes of species Crotalus ruber ruber, C. oreganus helleri and C. mitchellii
phyrrus were captured by active searching during field work. In the Laboratory of
Reproductive Physiology the snakes were measured, weighted, and marked the
captured snakes. We evaluated their body condition, collected and evaluated semen
from males and performed ultrasound exams in females. Snakes were released up to
24 hours after capture. The Crotalus ruber ruber studied initiated vitellogenesis in fall,
courtship and mating occurred in spring and gravid snake were observed in spring
and summer. Only females with a good or very good body condition were in
secondary vitellogenesis or gravid. There were no statistical differences in seminal
parameters among season in males of the Crotalus ruber ruber. Protocols to freeze
snake´s semen were tested in this study, with positive results that are discussed in
specific chapter. This study results contribute to understand of snake´s biology of
reproduction and in or ex-situ conservation.
Key words: Conservation. Reptiles. Semen. Spermatozoa. Follicles.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Ovário de serpente (Thamnophis sirtalis tetrataenia). As setas indicam
alguns dos folículos presentes no ovário ................................................. 27
Figura 2- Região cloacal de uma fêmea de cascavel (Crotalus r. ruber) onde
evidenciam-se as vaginas (setas brancas) e a papila genital (seta preta)
................................................................................................................ 27
Figura 3- Testículo (asterisco) e ducto deferente (seta) em um macho adulto de
cascavel (Crotalus ruber ruber) ............................................................... 28
Figura 4- Região cloacal dissecada em macho adulto de cascavel (Crotalus ruber),
evidenciando estruturas do trato reprodutor masculino: hemipênis
esquerdo exposto (asterisco branco) e direito retraído (asterisco preto),
papila genital (seta preta) e sulco genital (seta branca) .......................... 28
Figura 5- Macho adulto da Crotalus ruber ruber (macho 120) encontrado em área
com rochas .............................................................................................. 38
Figura 6- Mapa representando a distribuição geográfica (área em vermelho) da
Red Diamond Rattlesnake (Crotalus ruber ruber) (adaptado de IUCN,
2008). A estrela destaca a área onde ocorreu este estudo ..................... 38
Figura 7- Macho adulto da Crotalus oreganus helleri (macho 47) capturado em área
aberta com vegetação arbustiva .............................................................. 40
Figura 8- Dois machos de Crotalus oreganus helleri em dança-combate em
natureza (San Diego, CA, EUA) durante o verão. Foto: John Kinkaid
(03/07/2004) ............................................................................................ 40
Figura 9-
Mapa representando a distribuição geográfica (área em vermelho) da
Western Rattlesnake (Crotalus oreganus), incluindo a Southern Pacific
Rattlesnake (Crotalus oreganus helleri) uma das nove subespécies
descritas (adaptado de IUCN, 2008). A estrela destaca a área onde
ocorreu este estudo ................................................................................. 41
Figura 10- Macho adulto da Crotalus mitchellii phyrrus (macho 21) capturado em
área de encosta rochosa ......................................................................... 42
Figura 11- Mapa representando a distribuição geográfica (área em vermelho) da
Speckled Rattlesnake (Crotalus mitchellii), incluindo a Southwestern
Speckled Rattlesnake (Crotalus mitchellii phyrrus) uma das duas
subespécies conhecidas (adaptado de IUCN, 2008). A estrela destaca a
área onde ocorreu este estudo ................................................................ 42
Figura 12-
Foto aérea da área do Wild Animal Park, (Escondido, CA, EUA). As áreas
de Coastal Sage Scrub e Chaparral estão representadas em vermelho e
amarelo, respectivamente. A estrela indica a localização do CRES ....... 46
Figura 13- Formações vegetais encontradas na área da reserva ecológica
(Escondido, CA, EUA). A) Vegetação do tipo Chaparral com
predominância de cactos (Opuntia sp.). B) Vegetação do tipo Coastal
Sage Scrub. C) Rochas de granito em meio à vegetação tipo Chaparral ...
............................................................................................................. 47
Figura 14- Diferentes condições corporais observadas em cascavéis no estudo. A)
Exame de condição corporal em uma cascavel (Crotalus ruber ruber) B)
Condição corporal classe 3 ou muito boa em cascavel (Crotalus oreganus
helleri). C) Condição corporal classe 1 ou ruim em cascavel (Crotalus
ruber ruber) ............................................................................................. 50
Figura 15- Recipiente específico para congelação (5100 Cryo 1°, Nalgene, EUA)
utilizado no protocolo de congelamento 2 ............................................... 53
Figura 16- Representação gráfica da porcentagem relativa de machos e fêmeas de
Crotalus ruber ruber capturados em vida-livre no Sul da Califórnia,. nas
diferentes estações do ano. (a,b) letras diferentes representam diferença
estatisticamente significante (p<0,05) ..................................................... 61
Figura 17- Radiografia de uma fêmea adulta de Crotalus ruber ruber (fêmea 41)
capturada em vida-livre no Sul da Califórnia e que tinha ingerido um
coelho (Sylvilagus audubonii). As setas indicam o crânio e o fêmur da
presa ....................................................................................................... 63
Figura 18- Espermatozóide (seta branca) em meio a restos celulares, bactérias,
protozoários e urato. Fotomicrografia de amostra de sêmen de Crotalus
ruber ruber ao exame sob microscópio de luz e contraste de fase
(objetiva 40X) .......................................................................................... 69
Figura 19 -
Distribuição de fêmeas de Crotalus ruber ruber capturadas em vida-livre
no Sul da Califórnia, durante o período de maio de 2005 a junho de 2006,
nos diferentes estados reprodutivos: vitelogênica, não-vitelogênica e
prenhe – São Paulo - 2008 ...................................................................... 70
Figura 20-
Representação do maior folículo e prenhez (pontos sombreados) em
fêmeas de Crotalus ruber ruber capturadas em vida-livre no Sul da
Califórnia, durante o período de maio de 2005 a junho de 2006, com
diferentes condições corporais (Cc) ........................................................ 72
Figura 21- Fotomicrografias de amostras de sêmen de Crotalus ruber ruber coradas
com coloração Eosina/Nigrosina para avaliação de integridade de
membrana espermática. A) Amostra de sêmen diluída em Test-gema e
apresentando padrão normal de coloração. Espermatozóide com
membrana íntegra (n°1) e alterada (n°2) B) Amostra de sêmen diluída em
Test-gema com glicerol antes da congelação, apresentando padrão
anormal de coloração C) Amostra de sêmen diluída em Test-gema com
glicerol após a congelação, apresentando padrão anormal de coloração ...
............................................................................................................. 79
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Fatores que compõem o ciclo reprodutivo de machos e fêmeas de
serpentes - São Paulo – 2008...............................................................30
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Relação das espécies de cascavéis e protocolos para diluição e
congelação de sêmen testados no experimento II – São Paulo -2008 .....
............................................................................................................. 54
Tabela 2- Relação de espécies de cascavel capturadas na reserva ecológica da
Zoological Society of San Diego em Escondido (CA, EUA), durante o
período de abril de 2005 a julho de 2006 - São Paulo - 2008 .............. 59
Tabela 3- Parâmetros morfológicos (média ± EPM) de machos e fêmeas de
Crotalus ruber ruber capturados em vida-livre no Sul da Califórnia,
durante o período de maio de 2005 a junho de 2006 - São Paulo –
2008 ..................................................................................................... 63
Tabela 4- Parâmetros morfológicos (média ± EPM) de machos de Crotalus ruber
ruber capturados em vida-livre no Sul da Califórnia, ao longo das
estações do ano - São Paulo – 2008 ................................................... 64
Tabela 5- Parâmetros morfológicos (média ± EPM) de fêmeas adultas de Crotalus
ruber ruber capturadas em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o
período de maio de 2005 a junho de 2006, segundo a estação do ano -
São Paulo - 2008 .................................................................................. 65
Tabela 6- Resultados (média ± EPM) dos parâmetros morfológicos em relação à
condição corporal de fêmeas adultas de Crotalus ruber ruber
capturadas em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período de
maio de 2005 a junho de 2006 - São Paulo - 2008 .............................. 66
Tabela 7- Resultados (média ± EPM) dos parâmetros índice de massa corpórea
em relação à condição corporal de machos adultos de Crotalus ruber
ruber capturados em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período
de maio de 2005 a junho de 2006 - São Paulo – 2008 ........................ 66
Tabela 8-
Parâmetros seminais (média ± EPM) de machos adultos de Crotalus
ruber ruber capturados em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o
período de maio de 2005 a junho de 2006, segundo as estações do
ano - São Paulo - 2008 ........................................................................ 68
Tabela 9- Condição corporal, estação que ocorreu a captura e parâmetros
morfológicos estudados em Crotalus oreganus helleri capturados em
vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período de maio de 2005 a
junho de 2006 - São Paulo - 2008 ........................................................ 73
Tabela 10-
Parâmetros seminais estudados em Crotalus oreganus helleri,
representando um macho adulto de cativeiro (macho 8) e cinco
capturados em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período de
maio de 2005 a junho de 2006 - São Paulo - 2008 .............................. 74
Tabela 11- Diâmetro do maior folículo observado em fêmeas de Crotalus oreganus
helleri capturadas em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período
de maio de 2005 a junho de 2006- São Paulo - 2008 .......................... 74
Tabela 12- Condição corporal, estação que ocorreu a captura e parâmetros
morfológicos estudados em Crotalus mitchellii phyrrus capturados em
vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período de maio de 2005 a
junho de 2006 - São Paulo - 2008 ........................................................ 76
Tabela 13- Parâmetros seminais estudados em Crotalus mitchellii phyrrus,
representando um macho adulto mantido em cativeiro (macho 7) e
cinco capturados em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período
de maio de 2005 a junho de 2006 - São Paulo - 2008 ......................... 76
Tabela 14- Diâmetro do maior folículo observado em fêmeas de Crotalus mitchellii
phyrrus capturadas em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o
período de maio de 2005 a junho de 2006 - São Paulo - 2008 ............ 77
Tabela 15- Protocolos utilizados na congelação de sêmen em diferentes indivíduos
de diferentes espécies de cascavéis. Sendo os resultados de
motilidade e vigor (0-100% / 0-5) apresentados em T0 (avaliação inicial
da amostra), T1 (amostra + diluidor), T2 (amostra + diluidor +
crioprotetor), T3A (avaliação pós-descongelamento), T3B (avaliação
pós )T3C (avaliação pós ) - São Paulo - 2008Erro! Indicador não
definido.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 21
2 OBJETIVOS ................................................................................................... 24
3 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 26
3.1 ANATOMIA DO APARELHO REPRODUTOR DAS SERPENTES ................. 26
3.2 ESPERMATOGÊNESE E MORFOLOGIA ESPERMÁTICA DAS SERPENTES
........................................................................................................................ 29
3.3 BIOLOGIA REPRODUTIVA DAS SERPENTES ............................................ 30
3.4 REPRODUÇÃO ASSISTIDA EM RÉPTEIS .................................................... 31
3.4.1 Colheita e avaliação de sêmen ....................................................................... 32
3.4.2 Congelação e resfriamento de sêmen ............................................................ 34
3.4.3 Avaliação ultra-sonográfica do trato reprodutivo ............................................. 34
3.5 INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL .......................................................................... 36
3.6 BIOLOGIA DAS SERPENTES ESTUDADAS ................................................ 37
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 454
4.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 45
4.2 ÁREA DO ESTUDO ........................................................................................ 46
4.2.1 Colheita de dados ........................................................................................... 48
4.2.2 Trabalho de campo ......................................................................................... 48
4.2.3 Trabalho de laboratório ................................................................................... 48
4.2.4 Avaliação reprodutiva dos machos ................................................................. 51
4.2.5 Avaliação reprodutiva das fêmeas .................................................................. 51
4.3 EXPERIMENTO II: CONGELAÇÃO DE SÊMEN EM CASCAVÉIS ................................... 52
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................ 56
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO: AVALIAÇÕES REPRODUTIVAS E DE
CONDIÇÃO CORPORAL DAS SERPENTES ESTUDADAS ........................ 59
5.1 ANIMAIS ......................................................................................................... 59
5.2 AVALIAÇÃO REPRODUTIVA E DE CONDIÇÃO CORPORAL EM CROTALUS
RUBER RUBER
................................................................................................... 60
5.2.1 Biologia reprodutiva da Crotalus ruber ruber .................................................. 61
5.2.2 Avaliação de parâmetros morfológicos da Crotalus ruber ruber ..................... 62
5.2.3 Avaliação da condição corporal e índice de massa corpóreo da Crotalus ruber
ruber ............................................................................................................... 65
5.2.4 Avaliação reprodutiva dos machos de Crotalus ruber ruber ........................... 67
5.2.5 Avaliação reprodutiva das fêmeas de Crotalus ruber ruber ............................ 70
5.3 AVALIAÇÃO REPRODUTIVA E DE CONDIÇÃO CORPORAL EM MACHOS E
FÊMEAS DE CROTALUS OREGANUS HELLERI .................................................... 73
5.4 AVALIAÇÃO REPRODUTIVA E DE CONDIÇÃO CORPORAL EM MACHOS E
FÊMEAS DE CROTALUS MITCHELLII PHYRRUS ................................................... 75
5.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO DO EXPERIMENTO II: CONGELAÇÃO DE
SÊMEN ........................................................................................................... 78
7
7
C
C
O
O
N
N
C
C
L
L
U
U
S
S
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REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 85
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O
O
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Ç
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81
1 INTRODUÇÃO
O crescente interesse mundial pelos répteis em diversas áreas da ciência
possibilita, cada vez mais, estudos sobre taxonomia, fisiologia, comportamento,
história natural, patologia, farmacologia, toxicologia, anestesiologia, semiologia, etc.
Os répteis compõem uma classe com 8.734 espécies (UETZ, 2008), uma
diversidade maior que a dos anfíbios e até mesmo dos mamíferos. Essas espécies
têm evoluído nos mais diferentes ambientes desde desertos, florestas tropicais,
oceanos até zonas temperadas próximas ao círculo ártico. Assim, a diversidade de
adaptações a esses ambientes criou uma diversidade fisiológica e morfológica muito
grande (FITCH, H. S., 1970), e generalizar constatações feitas em uma espécie para
uma ordem ou mesmo toda a classe Reptilia pode levar a grandes erros.
Existem alguns exemplos interessantes da variabilidade nos aspectos
reprodutivos dentro de um mesmo gênero ou até espécie de serpente. No gênero
Helicops (cobra d´água) existem variações entre as espécies quanto ao modo de
reprodução ovípara ou vivípara (DE AGUIAR; DI-BERNARDO, 2005; SALE-NUNES,
2006). Na espécie Liophis miliaris (cobra d´água) a ocorrência de sazonalidade na
reprodução varia ao longo das porções sul e norte da Mata Atlântica em sua área de
ocorrência (PIZZATTO; MARQUES, 2006). O gênero Micrurus (corais verdadeiras)
pode apresentar, de acordo com a espécie, grandes diferenças na estratégia
reprodutiva com comportamento de disputa entre machos (dança-combate) e
dimorfismo sexual quanto ao tamanho (Micrurus frontalis) ou ausência de disputas e
dimorfismo (Micrurus corallinus) (MARQUES et al., 2006). Assim, se apenas uma
espécie fosse estudada, ou estudada apenas em parte de sua área de ocorrência
poderia generalizar-se de forma errônea informações sobre a reprodução em uma
família, gênero ou mesmo espécie de serpente.
Hoje as restrições na importação de répteis, o risco na introdução de doenças
exóticas à fauna, o crescente número de espécies ameaçadas no mundo, o
interesse no estudo de venenos animais, entre outros, tornam a reprodução e a
manutenção em cativeiro desses animais muito importante (MENGDEN et al., 1980;
ALBERTS et al., 1998; GIBBONS, J. WHITFIELD et al., 2000; TOURMENTE et al.,
2007;). No entanto, a ausência de cópulas ou problemas com a concepção, em parte
devido ao desconhecimento ou dificuldade em mimetizar as condições ambientais
22
necessárias para essas espécies, tornam a reprodução em cativeiro limitada (ROSS;
MARZEC, 1990).
A inseminação artificial e a transferência de embriões revolucionaram a
criação de animais domésticos, sendo que estas técnicas fazem parte de uma série
de estratégias para incrementar a reprodução e a formação de bancos de
germoplasma de animais silvestres (WILDT, 1989), e vários autores consideram a
inseminação artificial como uma das ferramentas que podem melhorar o
desempenho reprodutivo dos répteis em cativeiro (MENGDEN et al., 1980; PLATZ et
al., 1980; QUINN et al., 1989; LANGLADA et al., 1994; FAHRIG et al., 2007;
MATTSON et al., 2007).
No entanto, os maiores obstáculos para o sucesso na reprodução de animais
selvagens em cativeiro são o desconhecimento de informações básicas sobre essas
espécies, incluindo a biologia reprodutiva (SWANSON, 2006). A reprodução
assistida de répteis por sua vez, ainda é muito pouco explorada na literatura
científica mundial, apesar de técnicas como a colheita e avaliação de sêmen,
congelamento de sêmen, inseminação artificial, entre outras recentemente
publicadas (TOURMENTE, M. et al., 2006; MATTSON et al., 2007; ZACARIOTTI et
al., 2007; SAHATRAKUL et al., 2008).
Assim esse estudo visa preencher algumas dessas lacunas de conhecimento
com o estudo de aspectos relacionados à reprodução das serpentes.
23
2
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2 OBJETIVOS
Os objetivos deste estudo são:
1) Realizar a avaliação reprodutiva de machos de serpentes pela colheita de sêmen
e estabelecer valores de referência de espermograma nas espécies de cascavéis
estudadas;
2) Realizar a avaliação reprodutiva de fêmeas de serpentes pela ultra-sonografia dos
ovários e detecção de prenhez nas espécies de cascavéis estudadas;
3) Desenvolver um método prático para avaliação da condição corporal e
correlacioná-la com estado reprodutivo da serpente;
4) Desenvolver e testar protocolos para resfriamento e congelação de sêmen em
serpentes.
25
3
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26
3 REVISÃO DE LITERATURA
O texto a seguir apresenta a revisão de literatura deste estudo.
3.1 ANATOMIA DO APARELHO REPRODUTOR DAS SERPENTES
Os ovários (Figura 1) são difusos e localizados próximos aos ovidutos. Os
ovidutos por sua vez, são duas estruturas alongadas que estão ligadas às vaginas
(Figura 2), e recebem os ovos após a ovulação e fecundação (ALMEIDA-SANTOS,
2005). Algumas espécies de serpentes (Tantilla sp.) apresentam dois ovários e um
único oviduto (GREENE, 1997). As funções do oviduto são a produção de albúmen,
produção da casca, placentação, estocagem de espermatozóides, entre outros
(ALMEIDA-SANTOS, 2005).
Um aspecto interessante é a capacidade mitótica das oogônias na serpente
adulta, à semelhança do que ocorre com a espermatogônia nos mamíferos
(ROTHCHILD, 2003).
O testículo (Figura 3) é uma massa ovóide composta por túbulos seminíferos,
células intersticiais e vasos sanguíneos; envolvido por tecido conjuntivo (túnica
própria) e estão localizados na cavidade celomática onde, geralmente, o direito é
mais cranial que o esquerdo em serpentes (DENARDO, 1996). Os ductos deferentes
(Figura 3) ligam os testículos à papila genital na cloaca, próximo à base do pênis,
onde existe o sulco espermático, já que répteis não possuem uretra peniana
(VASSE, 1994). A porção mais distal dos ductos deferentes, diferenciada em
algumas espécies, é denominada ampola e tem função relacionada ao
armazenamento de espermatozóides no macho (SEVER, 2004). Na cloaca, a papila
genital dos machos é o fim de uma via comum aos tratos genital (ductos deferentes)
e urinário (rins) (OLIVEIRA et al., 2004).
Os machos dos lagartos e das serpentes possuem inúmeras características
que não são observadas em outros répteis (LANCE, 2003), como por exemplo, o
27
órgão copulatório (hemipênis) que é duplo, sendo que apenas um dos pares é usado
durante a cópula (FOX, 1977) (Figura 4).
Figura 1- Ovário de serpente (Thamnophis sirtalis tetrataenia). As setas indicam
alguns dos folículos presentes no ovário
Figura 2- Região cloacal de uma fêmea de cascavel (Crotalus r. ruber) onde
evidenciam-se as vaginas (setas brancas) e a papila genital (seta preta)
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29
3.2 ESPERMATOGÊNESE E MORFOLOGIA ESPERMÁTICA DAS
SERPENTES
A espermatogênese para algumas espécies de serpentes na América do Norte
parece estar extremamente condicionada à elevação da temperatura e não a
alterações do fotoperíodo. Em estudo sobre o controle ambiental da
espermatogênese de Crotalus viridis foi constatada o início da espermatogênese
apenas com a elevação da temperatura (ALDRIDGE, 1975) e em outro estudo com a
espécie Arizona elegans a espermatogênese foi iniciada com a elevação da
temperatura e ausência total da luz (ALDRIDGE, 1979).
A espermatogênese em serpentes é classificada em: Estágio 1 - túbulos
seminíferos com presença predominante de espermatogônias e espermatócitos
primários, e alguns espermatócitos secundários e espermátides; Estágio 2 –
surgimento dos primeiros espermatozóides na luz dos túbulos seminíferos; Estágio 3
- grande quantidade de espermatozóides na luz dos túbulos seminíferos, e
diminuição do número de espermatócitos secundários e espermátides; Estágio 4 -
diminuição do número de espermatozóides, presença de apenas espermatogônias e
espermatócitos primários; Estágio 5 - ausência de espermatozóides e uma ou duas
camadas de espermatogônias ou espermatócitos primários (TSAI; TU, 2000).
A morfologia do espermatozóide das serpentes observada sob ultra-estrutura
é basicamente composta de forma filiforme, acrossoma em forma de cone e cabeça
alongada, distinção entre medula e cortex acrossomal, presença de perfuratorium no
espaço sub-acrossomal, peça intermediária extremamente longa (sinapomorfia das
serpentes) e envolvida por um sistema de multi-membranas, estruturas chamadas
de corpos densos (possível transformação mitocondrial) ao longo da peça
intermediária e presença de dois centríolos (proximal e distal) ao invés de um, como
observado em mamíferos (AUSTIN, 1965; HAMILTON; FAWCETT, 1968;
JAMIESON; KOELER, 1994; OLIVER et al., 1996; TOURMENTE et al., 2006).
30
3.3 BIOLOGIA REPRODUTIVA DAS SERPENTES
O início de todo o processo para que a reprodução aconteça é a aquisição de
energia (alimentação) de ambos os sexos. O custo energético para a reprodução é
elevado nas fêmeas (ALDRIDGE; DUVALL, 2002; AUBRET et al., 2002; BONNET,
XAVIER et al., 2002; SHINE, 2003) devido à mobilização das reservas de gordura
para a vitelogênese (SANTOS; LLORENTE, 2004), e embora este custo não esteja
claro para os machos, alguns autores relatam que pode ser tão elevado quanto nas
fêmeas (OLSSON et al., 1997; SHINE; MASON, 2005).
O ciclo vitelogênico no ovário é basicamente dividido em vitelogênese
primária (folículos pequenos, arredondados e transparentes) e vitelogênese
secundária (folículos maiores, arredondados ou ovais e variando de coloração
branca a amarelada). O crescimento folicular durante a vitelogênese primária ocorre
principalmente devido ao acúmulo de água no interior do folículo, enquanto que a
vitelogênese secundária é a fase de maior crescimento folicular devido à deposição
de vitelo (lipoproteínas) no interior do folículo (DENARDO, 1996; SANTOS;
LLORENTE, 2004). A vitelogênese secundária pode ou não estar associada à
cópula em serpentes (MEDONÇA; CREWS, 1990; ALDRIDGE; DUVALL, 2002;
TAYLOR; DENARDO, 2005).
No quadro 1 podemos observar os fatores que compõem o ciclo reprodutivo
das serpentes (ALDRIDGE; DUVALL, 2002).
Macho Fêmea
Aquisição de energia Aquisição de energia
Espermatogênese Vitelogênese
Desenvolvimento de características
sexuais secundárias
Sinalização do estro (ferormônios)
Corte e cópula
Comportamento de busca por cópulas Ovulação
Dança-combate entre machos Fertilização
Corte e cópula Gestação
Parto
Cuidados parentais
Quadro 1 Fatores que compõem o ciclo reprodutivo de machos e fêmeas de
serpentes - São Paulo - 2008
A
31
Outro processo da fisiologia reprodutiva de inúmeras espécies de serpentes é
a estocagem de espermatozóides, como parte da sua estratégia reprodutiva,
separando por até alguns anos os eventos cópula e fecundação (ALDRIDGE;
DUVALL, 2002; ALMEIDA-SANTOS et al., 2004; YAMANOUYE et al., 2004;
SIEGEL; SEVER, 2006).
A partir da fecundação, o desenvolvimento embrionário acontecerá no útero
ou no ovo (ambiente externo), pois as serpentes possuem dois modos de
reprodução: a viviparidade e a oviparidade. As espécies ovíparas põem ovos e a
maior parte do desenvolvimento embrionário ocorre no ambiente, enquanto as
vivíparas retêm os embriões no útero até o final da gestação com o parto
(DENARDO, 1996; BLACKBURN, 2006). O vitelo acumulado pela fêmea durante a
vitelogênese secundária no ovo servirá de substrato e energia para o crescimento
embrionário, seja no ovo ou no útero da serpente (THOMPSON; SPEAKE, 2002).
Uma estratégia reprodutiva utilizada por várias espécies de serpentes é a
estocagem de espermatozóides, que varia de alguns meses até alguns anos
(ALDRIDGE, 2002; ALDRIDGE; DUVALL, 2002; ALMEIDA-SANTOS. et al., 2004;
ALMEIDA-SANTOS, 2005). Recentemente foi proposto que uma série de peptidases
poderiam estar envolvidas na sobrevida destes espermatozóides por tanto tempo
(MARINHO et al., 2008).
A estocagem de espermatozóides parece ocorrer no oviduto com a contração
da parede muscular uterina em formato de espiral, levando à formação de
compartimentos preenchidos com espermatozóides (YAMANOUYE et al., 2004;
SIEGEL; SEVER, 2006).
3.4 REPRODUÇÃO ASSISTIDA EM RÉPTEIS
A reprodução assistida em répteis, existente na literatura científica, consiste
basicamente da inseminação artificial aliada às técnicas de colheita, avaliação e
congelação de sêmen e avaliação por ultra-sonografia dos ovários nas fêmeas.
Esses temas serão apresentados ao longo desta revisão de literatura.
32
3.4.1 Colheita e avaliação de sêmen
Existem alguns relatos descrevendo técnicas de colheita de sêmen em
répteis, uma importante etapa a ser desenvolvida antes da inseminação artificial.
Larsen e Cardeilhac (1984) realizaram a colheita de sêmen post-mortem em
Alligator mississippiensis (aligátores) através da compressão dos ductos deferentes
em um tubo de colheita. Platz et al. (1980) realizaram a colheita de sêmen utilizando
a eletroejaculação com sucesso em alguns testudinos: Chelonia mydas (tartaruga-
verde), Geochelone elephantopus (tartaruga-de-Galápagos) e Pseudemys scripta
elegans (tigre d’água americano). Os testudinos de menor tamanho foram contidos
manualmente enquanto os de maior porte eram suspensos com o auxílio de cintas
sob o plastrão dos animais não permitindo o contado dos membros com o chão.
Após massagem manual no interior da cloaca, estimulando a exposição do pênis, o
transdutor do eletro-ejaculador era introduzido no reto do animal. Eram aplicados
estímulos elétricos semelhantes às técnicas usadas em mamíferos selvagens e o
sêmen que percorria o sulco ejaculatório era colhido em um tubo de ensaio (WOOD
et al., 1982).
Sêmen foi obtido pela primeira vez em serpentes através da compressão do
terço final do corpo do animal, no entanto, era comum a contaminação das amostras
por fezes e urato (FITCH, H., 1960). Mengden et al. (1980) descreveram uma técnica
para a colheita de sêmen em serpentes contidas fisicamente realizando massagens
digitais na região ventral do terço final do animal e colhendo o sêmen, quase sem
contaminação, diretamente da cloaca com o auxilio de uma seringa. As espécies
utilizadas foram: Elaphe subocularis (Ratsnake), E. obsoleta (Ratsnake), Epicrates
inornatus (Rainbow boa), Eunectes notaeus (sucuri-amarela), Python anchietae
(píton-de-angola), P. timoriensis (píton-do-timor), Bitis gabonica (víbora-do-gabão) e
Notechis scutatus (cobra-tigre). Quinn (1989) descreveu a colheita de sêmen com
auxílio da eletroejaculação, seguida de massagens digitais na região ventral de
Thamnophis marcianus (Checkered garter snake), mas a contaminação por fezes e
uratos era comum. Sêmen foi colhido em Boa constrictor occidentalis (jibóia
argentina) através do método proposto por Mengden et al. (1980) (TOURMENTE et
al., 2007).
33
Zacariotti et al. (2007) realizaram a colheita de sêmen em cascavéis utilizando
a técnica descrita por Mengden et. al, mas modificada com uso de anestésico local.
A lidocaína 1% na dose de 15 mg/Kg era aplicada em quatro diferentes pontos ao
redor da cloaca, permitindo o relaxamento da mesma e a exposição da papila
genital, o que favorece um maior controle sobre o procedimento para evitar
contaminação. Após as massagens, o sêmen era colhido com auxílio de uma
seringa de 1 ml.
Outro método descrito para serpentes consiste na eutanásia dos machos,
retirada dos ductos deferentes e colheita do sêmen (LANGLADA et al., 1994;
TOURMENTE et al., 2006; TOURMENTE et al., 2008), porém este método não é
indicado, pois implica na morte do indivíduo.
Não existem até o momento na literatura científica relatos de colheita de
sêmen em lagartos, apenas descrições da morfologia espermática ou da
espermatogênese, utilizando técnicas de histologia e microscopia eletrônica. As
avaliações são realizadas após a remoção e fixação de estruturas como testículos e
dutos deferentes. No entanto, existe um projeto em andamento na Nova Zelândia
para o desenvolvimento de tais técnicas em lagartos (BELL, 2008).
O passo seguinte é a avaliação do espermograma, muito importante para
avaliar o potencial de um macho específico em um programa de reprodução, seja
essa natural ou assistida, além de gerar informações para o conhecimento de
parâmetros normais para a espécie. No entanto, existem poucos parâmetros de
espermograma publicados para répteis (MENGDEN et al., 1980; LARSEN;
CARDEILHAC, 1984; SAMOUR, 1986; LANGLADA et al., 1994; TOURMENTE et al.,
2006; ZACARIOTTI; DURRANT, 2006; MATTSON et al., 2007; TOURMENTE. et al.,
2007; ZACARIOTTI et al., 2007; SAHATRAKUL et al., 2008).
Freqüentemente o sêmen é diluído antes da avaliação, especialmente em
serpentes devido à sua alta concentração. Os meios usados para a cultura de
células M199 e Ham´s F-10 têm mostrado bons resultados para a diluição inicial e
avaliação do sêmen em diversas espécies.
Uma avaliação rápida da concentração aparente auxilia na escolha da
proporção de diluição da amostra e estudos realizados com serpentes
demonstraram que uma diluição ao redor de 1:500 mostrou-se adequada para a
avaliação da motilidade e vigor espermático, bem como da morfologia do
34
espermatozóide (MATTSON et al., 2007; TOURMENTE et al., 2007;; ZACARIOTTI
et al., 2007).
É importante ressaltar que os répteis são animais ectotérmicos, assim o uso
de placas ou platinas aquecedoras para a manutenção de equipamentos e amostras
a uma temperatura mais elevada que o ambiente desnecessário e temperaturas
entre 25 e 27°C utilizadas com sucesso (FAHRIG et al., 2007; TOURMENTE et al.,
2007; ZACARIOTTI et al., 2007).
Adicionalmente às avaliações citadas, colorações específicas podem ser
realizadas para tornar a caracterização da amostra mais completa. Atualmente a
coloração simples de acrossoma e de peça intermediária utilizando a
Diaminobenzidina (DAB) estão validadas apenas para cascavel (INNOCENTI et al.,
2006), mas podem ser usadas em outras espécies em caráter experimental.
3.4.2 Congelação e resfriamento de sêmen
A literatura científica contempla muito pouco sobre técnicas para o
congelamento ou o resfriamento de sêmen em répteis, e os diluidores citados são
TEST-gema, Ham´s F 10, água de coco e um diluidor a base de leite (MENGDEN et
al., 1980; LARSEN; CARDEILHAC, 1984; FAHRIG et al., 2007; MATTSON et al.,
2007). Apenas as publicações mais recentes (FAHRIG et al., 2007; MATTSON et al.,
2007) possuem descrições detalhadas sobre os protocolos, embora contemplem
apenas o resfriamento do sêmen
3.4.3 Avaliação ultra-sonográfica do trato reprodutivo
A história natural e biologia reprodutiva dos répteis é o foco de inúmeros
estudos há pelo menos seis décadas, no entanto a eutanásia dos animais para os
estudos é muito comum, não permitindo repetidas avaliações de um mesmo
35
indivíduo (GILMAN; WOLF, 2007). Portanto, a ultra-sonografria é uma ferramenta
muito importante no estudo da biologia reprodutiva nos répteis permitindo a repetida
avaliação de um mesmo indivíduo (TAYLOR; DENARDO, 2005; GILMAN; WOLF,
2007) ou mesmo no diagnóstico de enfermidades do trato reprodutivo de répteis
(SCHUMACHER, 2001; RIVERA, 2008).
A ultra-sonografia tem sido empregada na avaliação reprodutiva de testudinos
(TODD R. ROBECK, 1990), lagartos (MORRIS et al., 1996; BRETT D. GARTRELL,
2002; MARTÍNEZ-TORRES et al., 2006; GILMAN; WOLF, 2007), serpentes (SMITH,
C. R. et al., 1989; TAYLOR; DENARDO, 2005; BETKOWSKY et al., 2006;
ZACARIOTTI; DURRANT, 2006), e crocodilianos (TUCKER; LIMPUS, 1997;
COUTINHO; CAMPOS, 2005), com o objetivo de mensurar e contar folículos ou
detectar a presença de ovos ou embriões.
Transdutores de 7,5 a 12 MHz são úteis na maioria dos répteis de pequeno e
médio porte, enquanto transdutores entre 2,5 a 5 MHz são necessários naqueles de
maior porte (TODD R. ROBECK, 1990; COUTINHO; CAMPOS, 2005; BETKOWSKY
et al., 2006; ZACARIOTTI; DURRANT, 2006; RIVERA, 2008).
Alguns autores relatam que a visualização do corpo lúteo em répteis é difícil
ao exame ultra-sonográfico (TAYLOR; DENARDO, 2005; MARTÍNEZ-TORRES et
al., 2006).
O diâmetro dos folículos ovarianos varia de acordo com a fase reprodutiva e o
tamanho do réptil. Em cascavéis (Crotalus atrox) folículos menores do que seis mm
são classificados como não-vitelogênicos e os maiores que dez mm como
vitelogênicos (TAYLOR; DENARDO, 2005; BETKOWSKY et al., 2006), enquanto em
outras espécies (Tantilla sp.) folículos maiores do que 5 mm já são considerados
vitelogênicos (SANTOS-COSTA et al., 2006).
Estudos descritivos mais profundos sobre a morfologia dos ovários durante
diferentes fases do ciclo reprodutivo dos répteis, com utilização da ultra-sonografia,
são necessários para auxiliar na determinação do melhor momento para a
inseminação artificial.
36
3.5 INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL
A inseminação artificial foi realizada, com algum sucesso, apenas em
Thamnophis marcianus (Checkered garter snake) (QUINN et al., 1989), Crotalus
durissus terrificus (cascavel) (LANGLADA et al., 1994), Elaphe guttata (Corn snake)
(MATTSON et al., 2007) e sem sucesso em Python anchietae (Píton de angola)
(MENGDEN et al., 1980). É importante ressaltar que nos casos citados
anteriormente, a inseminação artificial tem gerado ninhadas reduzidas em
comparação com aquelas produzidas naturalmente através de cópula.
Larsen e Cardeilhac (1984) realizaram sem sucesso a inseminação artificial
em Alligator mississippiensis (jacaré americano) e até o momento não foram
descritos na literatura científica procedimentos para a inseminação artificial em
lagartos ou quelônios.
Nas técnicas de inseminação descritas os autores utilizaram sêmen fresco,
depositando-o no oviduto das fêmeas. Assim a localização da entrada nos ovidutos
dentro da cloaca é muito importante. A grande maioria dos répteis possui dois
ovidutos, mas estes podem ter aberturas individuais (testudinos e crocodilianos) ou
duplas (lagartos e serpentes) na cloaca. Assim durante o procedimento de
inseminação é importante certificar se os dois ovidutos estão sendo inseminados
(LANGLADA et al., 1994; MATTSON et al., 2007).
As técnicas de inseminação descritas usam uma sonda, flexível ou rígida,
com diâmetro adequado ao tamanho da fêmea, já que o oviduto é bastante delgado,
acoplada a uma seringa contendo o sêmen. A determinação do momento da
inseminação em répteis ainda não está definida e os pesquisadores utilizam como
referência o período que normalmente corresponderia à fase de cópula para a
espécie (LANGLADA et al., 1994; MATTSON et al., 2007).
A reprodução de répteis, natural ou assistida, representa um grande desafio,
com raras exceções. O pequeno sucesso obtido com uso das técnicas de
reprodução assistida aplicadas se deve em grande parte a escassez de informações
sobre fisiologia reprodutiva dos répteis. Por exemplo, ainda não se sabe até que
ponto o estímulo da cópula é importante na indução de ovulação ou vitelogênese de
inúmeras espécies (MENDONÇA; CREW, 1990).
37
Apesar das limitações, cada vez mais surgem estudos utilizando répteis como
modelos experimentais e futuramente a reprodução assistida será uma realidade
para esses animais como é para diversas espécies.
3.6 BIOLOGIA DAS SERPENTES ESTUDADAS
Atualmente existem 3.149 espécies de serpentes no mundo (UETZ, 2008)
sendo que as cascavéis do gênero Crotalus são compostas por 31 espécies, a maior
parte nativa dos Estados Unidos e México. Neste trabalho foram estudados aspectos
da reprodução de três dessas espécies: Crotalus ruber ruber (Red diamond
rattlesnake) Crotalus oreganus helleri (Southern pacific rattlesnake) e Crotalus
mitchelli phyrrus (Speckled rattlesnake). O texto a seguir apresenta uma breve
descrição sobre a biologia de cada uma dessas espécies:
A Crotalus ruber ruber é conhecida como Red diamond rattlesnake por
apresentar uma coloração geral avermelhada (Figura 5) e o adulto tem um
comprimento total que varia entre 760 e 1650 mm (KLAUBER, 1982).
A C. r. ruber alimenta-se principalmente de pequenos mamíferos (roedores e
coelhos), lagartos e eventualmente aves. Apesar da densidade de presas afetar a
dinâmica populacional de C. r. ruber, locais para fêmeas prenhes se abrigarem e as
serpentes hibernarem são fatores mais limitantes (KEENLYNE, 1972).
Essa espécie alterna o período de atividade entre diurna nos períodos mais
frios do ano e noturna nas estações mais quentes. Klauber (1972) sugere após 16
anos de estudos na região de San Diego, que a C. ruber pode ser ativa durante o
ano todo, com o pico da atividade nos meses de corte e cópula entre abril e maio
(primavera), com o nascimento de filhote (três a 20 filhotes) durante o verão.
A C. r. ruber ocorre ao Sul da Califórnia e em toda Baja California no México
(Figura 6), onde é encontrada em áreas rochosas com densa vegetação arbustiva,
áreas de deserto e cactos, áreas cultivadas e mesmo ninho de roedores (KLAUBER,
1982; BROWN et al., 2005; IUCN, 2008).
38
Figura 5- Macho adulto da Crotalus ruber ruber (macho 120) encontrado em área
com rochas
Figura 6- Mapa representando a distribuição geográfica (área em vermelho) da Red
Diamond Rattlesnake (Crotalus ruber ruber) (adaptado de IUCN, 2008). A estrela
destaca a área onde ocorreu este estudo
39
A IUCN (2008) lista o estado de conservação desta espécie como Least
concern ou “pouco preocupante” devido a ampla distribuição geográfica e grande
número de sub-populações na natureza. No entanto, o Estado da Califórnia lista
essa espécie como Species of Special Concern ou espécie que merece uma
“preocupação especial”, pois essas populações estão em declínio com a destruição
do hábitat costeiro pela ocupação humana.
Outra espécie estudada é a Crotalus oreganus helleri (Figura 7) que
apresenta um comprimento variando entre 760 e 1370 mm. Possui hábitos
alimentares similares às outras espécies descritas, além de anfíbios, insetos e
eventualmente outras serpentes. É importante ressaltar que existe a variação
ontogenética na dieta desta espécie, sendo que os filhotes se alimentam
principalmente de lagartos e os adultos de roedores (LABONTE, 2005).
Durante as estações mais frias pode ser encontrada durante o dia
aquecendo-se ao sol e mesmo sobre arbustos em áreas de vegetação mais densa.
Nas estações mais quentes, essa serpente é mais ativa durante o período noturno
como as outras espécies citadas. Essa espécie parece apresentar dois picos de
atividade, durante a primavera e no outono (DUGAN; HAYES, 2005). A literatura
apresenta de maneira controversa a fase de cópula para C. oreganus helleri na
primavera e/ou verão, com dança-combate entre machos durante a primavera e o
verão (Figura 8) (ALDRIDGE, 2002; ALDRIDGE; DUVALL, 2002).
Aldridge (2002) demonstrou que Crotalus viridis viridis (espécie
filogeneticamente próxima) apresenta a hipertrofia do segmento sexual renal apenas
durante o verão, enquanto a C. oreganus helleri tem essa hipertrofia durante o verão
e provavelmente no inverno e na primavera. Como a hipertrofia do segmento sexual
está associada à elevação dos níveis de testosterona (JOHNSON et al., 1982;
SCHUETT, GORDON W. et al., 1997), esse fato pode explicar a observação de
cópulas na primavera e verão em C. oreganus helleri.
Essa subespécie ocorre do sul da Califórnia até a porção central da Baja
California (Figura 9), onde habita desde a costa até regiões de floresta de pinheiros
nas montanhas, sobrevivendo inclusive em áreas degradadas.
40
Figura 7- Macho adulto da Crotalus oreganus helleri (macho 47) capturado em área
aberta com vegetação arbustiva
Figura 8- Dois machos de Crotalus oreganus helleri em dança-combate em
natureza (San Diego, CA, EUA) durante o verão. Foto: John Kinkaid
(03/07/2004)
41
Figura 9- Mapa representando a distribuição geográfica (área em vermelho) da Western
Rattlesnake (Crotalus oreganus), incluindo a Southern Pacific Rattlesnake
(Crotalus oreganus helleri) uma das nove subespécies descritas (adaptado de
IUCN, 2008). A estrela destaca a área onde ocorreu este estudo
A última espécie estudada é a Crotalus mitchellii phyrrus, que apresenta uma
coloração bem variada desde alaranjado, rósea até cinza (Figura 10). Essa espécie
tem um comprimento que varia de 580 a 762 mm, porém existe o relato de um
indivíduo com 1320 mm. Alimenta-se de pequenos mamíferos, lagartos e
eventualmente aves, como as outras espécies.
Parece ser a espécie mais especializada em hábitat rochosos das três
espécies descritas neste estudo, sendo às vezes encontrada em áreas com
vegetação arbustiva e suculenta e raramente próxima à costa litorânea (KLAUBER,
1982). Cópulas são descritas na primavera e nascimento de filhotes (3 a 11 filhotes)
no fim do verão (ALDRIDGE; DUVALL, 2002).
A IUCN (2008) estima uma população aproximada de 100.000 C. mitchellii
(duas subespécies) distribuídas em inúmeras populações ao longo da sua área de
ocorrência (Figura 11), e classifica seu estado de conservação como Least Concern.
42
Figura 10- Macho adulto da Crotalus mitchellii phyrrus (macho 21) capturado em área de
encosta rochosa
Figura 11- Mapa representando a distribuição geográfica (área em vermelho) da Speckled
Rattlesnake (Crotalus mitchellii), incluindo a Southwestern Speckled Rattlesnake
(Crotalus mitchellii phyrrus) uma das duas subespécies conhecidas (adaptado de
IUCN, 2008). A estrela destaca a área onde ocorreu este estudo
43
Apesar de nenhuma das espécies de cascavéis citadas nesta revisão estarem
ameaçadas de extinção (IUCN, 2008), a conservação de suas populações é muito
importante, especialmente nas espécies de ampla distribuição, mas com populações
isoladas. Um estudo recente demonstrou ser mais importante para a conservação a
manutenção da variabilidade genética de diferentes populações de C. ruber, C.
mitchelli, C. tigris e C. cerastes em sua área de ocorrência nos desertos, do que
basear-se unicamente nas suas subespécies (DOUGLAS et al., 2006).
44
4
4
M
M
A
A
T
T
E
E
R
R
I
I
A
A
L
L
E
E
M
M
É
É
T
T
O
O
D
D
O
O
S
S
45
4 MATERIAL E MÉTODOS
A seguir estão descritos os materiais e métodos utilizados no experimento I:
Avaliação reprodutiva de serpentes de vida livre do Sul da Califórnia e experimento
II: Congelação de sêmen em serpentes.
4.1 INTRODUÇÃO
Esse estudo foi desenvolvido pela parceria entre a Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo e a Zoological Society of San
Diego (ZSSD), localizada na Califórnia (CA), Estados Unidos.
A ZSSD foi fundada em 1916 pelo Dr. Harry Wegeforth, sendo inicialmente
composta pelo Zoológico de San Diego. Em 1969, a ZSSD assinou um acordo com a
Prefeitura de San Diego para administrar uma reserva ecológica de 1.800 acres na
região do San Pasqual Valley, na Cidade de Escondido (CA), onde mais tarde foi
construído o parque safári conhecido como Wild Animal Park (WAP). Em 2004 foram
inauguradas as novas instalações do centro de pesquisas Conservation and
Research for Endangered Species (CRES), conhecido como o maior do mundo
localizado em um zoológico (MCKEEVER, 2005).
O CRES possui a maior parte da sua infra-estrutura de 4.645 m² destinada às
pesquisas científicas nas áreas de Ecologia Animal, Ecologia Vegetal, Biologia
Comportamental, Genética, Patologia Animal e Fisiologia Reprodutiva, voltadas
principalmente para a conservação de espécies ameaçadas de todo o mundo.
Em parceria com a Dr
a
. Barbara Durrant, chefe da Divisão de Fisiologia
Reprodutiva do CRES foi desenvolvido um estudo sobre aspectos reprodutivos das
serpentes nativas da reserva ecológica adjacente ao CRES.
46
4.2 ÁREA DO ESTUDO
A reserva ecológica mantida pela ZSSD tem grande importância para a
conservação da biodiversidade. Esta área é parte dos 24,7% remanescentes da
Província Florística da Califórnia, que é considerada um Hotspot pela International
Union for Conservation of Nature and Natural Resources, isto é, uma região de alta
biodiversidade, alto endemismo e sob alto grau de ameaça (MITTERMEIER et al.,
2004). No Brasil, a Mata Atlântica e o Cerrado são exemplos de Hotspot pela IUCN
(IUCN, 2008). Além disso, durante estudo realizado previamente pelo Laboratório de
Ecologia Animal do CRES, nessa área foi encontrada a maior diversidade de
serpentes do Sul da Califórnia, totalizando 16 espécies (ALBERTS, 2002).
A reserva ecológica tem uma área aproximada de 1.000 acres (Figura 12),
composta por formações vegetais do tipo Coastal Sage Scrub (Figura 13 B) e
Chaparral (Figura 13 A e 13 C), características do Sul da Califórnia.
O clima é do tipo Mediterrâneo caracterizado por verões extremamente
quentes e secos e invernos frios e úmidos.
Figura 12- Foto aérea da área do Wild Animal Park, (Escondido, CA, EUA). As áreas de
Coastal Sage Scrub e Chaparral estão representadas em vermelho e amarelo,
respectivamente. A estrela indica a localização do CRES
47
Figura 13- Formações vegetais encontradas na área da reserva ecológica (Escondido,
CA, EUA). A) Vegetação do tipo Chaparral com predominância de cactos
(Opuntia sp.). B) Vegetação do tipo Coastal Sage Scrub. C) Rochas de granito
em meio à vegetação tipo Chaparral
B
A
C
48
4.2.1 Colheita de dados
A seguir serão descritas as metodologias utilizadas para colheita de dados nos
trabalhos de campo e laboratório.
4.2.2 Trabalho de campo
No período de abril de 2005 a agosto 2006 foram realizadas
aproximadamente 1.500 horas de busca ativa por serpentes pelo método de Procura
Visual Limitada por Tempo (PVLT). A PVLT consiste no deslocamento a pé,
lentamente, à procura de serpentes em todos os microambientes visualmente
acessíveis (SAWAYA, 2003). Algumas serpentes também foram capturadas por
terceiros (tratadores e guardas do WAP).
As serpentes localizadas foram capturadas com auxílio da mão, gancho e
pinção (Gentle Giant snake tong
®
, Midwest
®
, EUA) e acondicionadas em caixas
plásticas transparentes. As coordenadas geográficas foram registradas com auxílio
de GPS (eTrex
®
, Garmin
®
, EUA), para a posterior soltura no mesmo local da
captura. As serpentes foram levadas ao laboratório para as avaliações e mantidas
nas mesmas caixas plásticas até a soltura que ocorria no máximo 24 horas após a
captura.
Embora este estudo não tenha sido delineado para colheita de parâmetros
ecológicos, algumas informações obtidas serão apresentadas nos resultados e
discussão.
4.2.3 Trabalho de laboratório
As serpentes capturadas foram transportadas ao laboratório de Fisiologia
Reprodutiva do CRES, para a colheita de dados e amostras.
49
Após a pesagem em balança digital com precisão de 5 gramas (SC-2010
Baby Scale, Midwest
®
, EUA), as serpentes foram contidas fisicamente com auxílio
de tubo plástico e gancho. Dados morfológicos como comprimentos rostro-cloacal
(CRC) e total (CT) foram obtidos com auxílio de fita métrica e estão expressos em
centímetros.
Foi proposta a avaliação subjetiva da condição corporal (Figura 14) das
serpentes, segundo as classes:
Classe 1- Musculatura axial bem desenvolvida e costelas dificilmente
palpáveis;
Classe 2- Musculatura axial desenvolvida e costelas facilmente palpáveis;
Classe 3- Musculatura axial pouco desenvolvida, vértebras e costelas
facilmente palpáveis.
Além da condição corporal, também foi calculado o índice de massa corpórea
segundo a fórmula: (comprimento rostro-cloacal)
3
/ massa (BEYER, 1987).
Após a sexagem pela exposição dos hemipênis, os machos e fêmeas eram
submetidos à avaliação reprodutiva. Nos machos foi colhido sêmen para avaliação e
os experimentos de congelação, enquanto as fêmeas eram submetidas ao exame de
ultra-sonografia para avaliação dos ovários e detecção de prenhez.
Ao final dos procedimentos as serpentes eram marcadas com numeração no
guizo (Figura 7) e soltas no mesmo local em que foram capturadas.
É importante salientar que todos os procedimentos deste projeto foram
aprovados pelas Comissões de ética e experimentação animal da ZSSD (IACUC) e
da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.
Em todas as avaliações preocupou-se em não superar 20 minutos de
procedimento com os animais sob contenção. Durante todas as avaliações a maioria
das serpentes mostrou-se relaxada e nenhum efeito negativo importante foi
constatado, sendo inclusive observado o comportamento de corte em natureza no
dia seguinte à soltura de indivíduos manejados no projeto.
50
Figura 14- Diferentes condições corporais observadas em cascavéis no estudo. A) Exame
de condição corporal em uma cascavel (Crotalus ruber ruber) B) Condição
corporal classe 3 ou muito boa em cascavel (Crotalus oreganus helleri). C)
Condição corporal classe 1 ou ruim em cascavel (Crotalus ruber ruber)
C
B
A
51
4.2.4 Avaliação reprodutiva dos machos
Para a avaliação reprodutiva dos machos foi colhido sêmen por massagens
ventrais e uso da anestesia local (ZACARIOTTI et al., 2007).
O sêmen colhido foi avaliado quanto aos seguintes aspectos:
- Volume: estimado com auxílio de micropipeta automática de volume variável
(Eppendorf, EUA).
- Motilidade e Vigor: para avaliação do vigor e da motilidade, o sêmen foi
previamente diluído (1/500) em meio de cultura de células (Ham´s – F10, Sigma,
EUA), devido à sua alta concentração. As amostras foram avaliadas em microscópio
de luz, sob aumento de 100 vezes. A motilidade foi determinada pela porcentagem
(%) de espermatozóides móveis na amostra. O vigor foi determinado numa escala
de 0 a 5 (0= ausência de motilidade, 1= ausência de motilidade progressiva, 2=
motilidade progressiva lenta, 3= movimentos laterais da cabeça do espermatozóide
acompanhados de motilidade progressiva lenta, 4= motilidade progressiva rápida, 5=
motilidade progressiva muito rápida), segundo os critérios descritos por Zacariotti
(2007).
- Integridade acrossomal: avaliada pela coloração simples de acrossoma proposta
por Pope et al. (1991) e validada por Innocenti et al. (2006).
- Integridade membrana celular: avaliada pela coloração eosina-nigrosina.
Em virtude do pequeno volume das amostras colhidas (0,5 a 13 µL) e o
aproveitamento das amostras na realização dos experimentos de congelação de
sêmen, não foi possível avaliar concentração ou morfologia espermática das
amostras.
4.2.5 Avaliação reprodutiva das fêmeas
As fêmeas já contidas fisicamente em tubo plástico foram submetidas ao
exame de ultra-som para avaliação dos ovários ou gestação (TAYLOR; DENARDO,
52
2005), submergindo o terço final do corpo da serpente em água. Informações sobre
número de folículos, diâmetro do menor e maior folículo, bem como a ocorrência de
gestação e número de filhotes foram registradas para as fêmeas avaliadas.
4.3 EXPERIMENTO II: CONGELAÇÃO DE SÊMEN EM CASCAVÉIS
Foram colhidas amostras de sêmen de diferentes espécies de cascavel para
os testes de congelação durante o experimento I e também post-mortem de
serpentes mantidas em cativeiro no Zoológico de San Diego. As colheitas de sêmen
post-mortem foram realizadas segundo descrito por Langlada (1994).
Em conseqüência da inexistência de protocolos bem definidos para a
congelação de sêmen de serpentes, foram realizados testes para resfriamento e
congelação de sêmen de diferentes espécies de cascavel com o principal objetivo de
desenvolver um protocolo.
Assim sendo, as amostras foram divididas aleatoriamente e testadas frente a
diferentes diluidores, crioprotetores em diferentes concentrações e diferentes
protocolos de congelação.
Os dois diluidores seminais utilizados foram Test-gema e diluidor Lake’s
(anexo 1) segundo as formulações disponíveis em literatura (LAKE, 1960; LAKE;
RAVIE, 1984; POPE et al., 1989).
As amostras foram resfriadas a partir da temperatura ambiente até 4ºC em
geladeira já misturadas à fração A dos diluidores testados. Simultaneamente a
fração B (diluidor + crioprotetor) também foi resfriada também até 4ºC (velocidade de
resfriamento 0,7ºC/min), e após atingir essa temperatura, ambas as frações foram
misturadas na proporção 1:1 e aguardou-se 20 minutos antes de iniciar o protocolo
de congelação. O tempo de 20 minutos para o equilíbrio do diluidor com crioprotetor
e a amostra resfriada foi pré-estabelecido de acordo com os padrões de congelação
de sêmen utilizados na rotina do Laboratório de Fisiologia Reprodutiva do CRES.
Os protocolos de congelação utilizados estão descritos a seguir:
53
- Protocolo 1 (pellet): consistia no gotejamento da amostra em nitrogênio líquido,
ocorrendo a congelação imediata e a formação de pellets.
- Protocolo 2 (1ºC/min): consistia na utilização de um recipiente específico para
congelação (5100 Cryo 1°) (Figura 15), contendo álcool isopropílico e um suporte
para as amostras. O recipiente foi resfriado até 4ºC junto com as amostras já
diluídas nas frações A e B em refrigerador comum. Após o resfriamento das
amostras, este foi colocado em freezer a -80ºC permitindo a congelação em
velocidade aproximada de 1ºC/min até -80ºC. Após um período de 4 horas as
amostras foram armazenadas em nitrogênio líquido (-196ºC).
Figura 15- Recipiente específico para congelação (5100 Cryo 1°, Nalgene, EUA) utilizado
no protocolo de congelamento 2
- Protocolo 3 e 4 (máquina de congelação): as amostras, após atingirem 4ºC, foram
colocadas em máquina de congelação (CryoMed Inc., Mt. Clemens, Michigan, EUA)
e submetidas a dois diferentes programas (1.1 e 2.1), descritos abaixo:
Protocolo 3 (CryoMed 1.1)
a) Manter a 4ºC por 10 minutos
b) Resfriar amostra a 1ºC/min até -4ºC
c) Resfriar câmara a 40ºC/min até -40ºC
d) Resfriar câmara a 20ºC/min até -13ºC
e) Resfriar amostra a 1ºC/min até -20ºC
f) Resfriar câmara a 50ºC/min até -80ºC
g) Manter à -80ºC por 10 minutos
h) Colocar amostra em nitrogênio líquido
54
Protocolo 4 (CryoMed 2.1)
a) Manter a 4ºC por 10 minutos
b) Resfriar amostra a 1ºC/min até -8ºC
c) Manter à -8ºC por 2 minutos
d) Resfriar amostra a 3ºC/min até -16ºC
e) Resfriar amostra a 5ºC/min até -80ºC
f) Colocar amostra em nitrogênio líquido
Após a congelação aguardou-se pelo menos 10 dias antes de descongelar e
avaliar a amostra.
Na Tabela a seguir (Tabela 1) estão apresentadas as espécies de serpentes
estudadas e os protocolos para congelação propostos no experimento II.
Tabela 1- Relação das espécies de cascavéis e protocolos para diluição e
congelação de sêmen testados no experimento II – São Paulo -2008
ID Espécie Procedência Colheita Diluidor Crioprotetor [crioprotetor] PC
25 C. adamanteus CAT Massagem Test G. Glicerol 8% 3
25 C. adamanteus CAT Massagem
Test G.
Glicerol 16% 3
20 C. cerastes NAT Post-mortem
Test G.
DMA 18% 2
36 C. durissus CAT Post-mortem
Test G.
Glicerol 4% 3
36 C. durissus CAT Post-mortem
Test G.
Glicerol 8% 3
73 C. mitchellii CAT Post-mortem
Test G.
Glicerol 8% 3
73 C. mitchellii CAT Post-mortem
Test G.
Glicerol 10% 3
9 C. ruber CAT Massagem Lake´s DMSO 4% 2
9 C. ruber CAT Massagem Lake´s DMSO 4% 1
9 C. ruber CAT Massagem Lake´s DMSO 2% 1
9 C. ruber CAT Massagem Lake´s DMSO 2% 2
6 C. ruber NAT Massagem Lake´s DMSO 2% 1
6 C. ruber NAT Massagem Lake´s DMSO 4% 1
122 C. ruber NAT Massagem
Test G.
Glicerol 10% 4
122 C. ruber NAT Massagem
Test G.
Glicerol 8% 4
122 C. ruber NAT Massagem
Test G.
Glicerol 8% 3
122 C. ruber NAT Massagem
Test G.
Glicerol 10% 3
42 C. ruber NAT Massagem
Test G.
Glicerol 4% 3
42 C. ruber NAT Massagem
Test G.
Glicerol 8% 3
ID= identificação da serpente; Test G.= diluidor Test-gema; DMA= dimetilacetamida; DMSO=
dimetilsulfóxido; [crioprotetor]= concentração do crioprotetor; PC= protocolo de congelação;
55
As concentrações dos crioprotetores DMA (18%) e dimetilsulfóxido (DMSO 2
e 4%) testadas nos protocolos de congelação foram estabelecidas a partir do valor
médio das concentrações destes diluidores na congelação de sêmen de aves
(BLANCO et al., 2000; SAMOUR, 2004; BLESBOIS et al., 2005). A DMA
(dimetilacetamida) e o DMSO (dimetilsulfóxido) têm sido amplamente utilizados
como alternativas ao glicerol, que comprovadamente reduz a fertilidade em aves
(SAMOUR, J. H., 2004).
As concentrações de glicerol (4, 8, 10 e 16%) foram estabelecidas a partir de
estudos pilotos e dos protocolos utilizados na rotina do Laboratório de Fisiologia
Reprodutiva do CRES.
As amostras de sêmen foram aleatoriamente descongeladas segundo os
protocolos:
Protocolo 1
a) Descongelação em banho-maria a 25°C e avaliação
Protocolo 2
a) Descongelação em banho-maria a 25°C
b) Centrifugação a 3.000 RPM por dez minutos após a adição de diluidor
Test-gema na proporção 1:1 (amostra:diluidor)
c) Remoção do sobrenadante e ressuspensão do sedimento em diluidor
Test-gema para avaliação
Protocolo 3
a) Descongelação em banho-maria a 25°C
b) Centrifugação a 3.000 RPM por dez minutos após a adição de meio de
cultura de células M199 na proporção 1:1 (amostra:diluidor)
c) Remoção do sobrenadante e ressuspensão do sedimento em meio de
cultura de células M199 para avaliação
56
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram analisados através do programa SAS System for Windows
(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 2000).
Utilizando o aplicativo Guided Data Analysis, as variáveis contínuas foram
testadas quanto à normalidade dos resíduos e homogeneidade das variâncias. Caso
não obedecessem a estas premissas, os dados foram transformados (logarítmo na
base 10 - Log
10
X; Raiz quadrada - RQ X; Quadrado - X
2
) e se a normalidade não
fosse obtida empregava-se então, o procedimento NPAR1WAY de análise de
variância não paramétrica.
Para descrição dos resultados, foram empregados os erros padrões e as
médias (média ± erro padrão da média) e os níveis de significância (p) dos dados.
As variáveis dicotômicas foram avaliadas e comparadas pelo teste Qui-
quadrado ou pelo teste exato de Fisher quando a freqüência esperada era 5 ou
menos.
O nível de significância utilizado para rejeitar H0 (hipótese de nulidade) foi de
5%, isto é, para um nível de significância menor que 0,05, considerou-se que
ocorreram diferenças estatísticas entre as variáveis classificatórias (estação do ano
e ECC) para uma determinada variável resposta. A análise paramétrica foi realizada
através do teste t de Student e do teste LSD de comparação de médias para a
avaliação do dimorfismo sexual e para o restante das análises, respectivcamente. A
análise não paramétrica foi realizada através do PROC NPAR1WAY de análise de
variância não paramétrica. Nestes casos utilizou-se o nível de significância do teste
Wilcoxon comparando-se os tratamentos dois a dois.
Para os machos, na avaliação do efeito das estações do ano, as variáveis
resposta comprimento rostro-cloacal (CRC), comprimento total (CT), massa,
integridade acrossomal (IA) e integridade de membrana espermática (IM)
obedeceram às premissas, não sendo necessária qualquer transformação. As
variáveis volume seminal, motilidade e vigor espermáticos não obedeceram às
premissas, não sendo possível transformá-las.
57
Para as fêmeas, na análise do efeito das estações de ano, as variáveis
resposta massa, CRC e condição corporal obedeceram às premissas não sendo
necessária qualquer transformação. As variáveis resposta CT e diâmetro do maior
folículo (DMF) obedeceram às premissas após a transformação dos seus dados para
1/CT e logaritmo na base 10, respectivamente.
Na avaliação do efeito da condição corporal nas fêmeas, as variáveis
resposta massa e CRC obedeceram às premissas não sendo necessária qualquer
transformação. As variáveis resposta CT e DMF obedeceram às premissas após a
transformação dos seus dados para 1/CT e logaritmo na base 10, respectivamente.
Para a avaliação do dimorfismo sexual, as variáveis CRC e CT obedeceram
às premissas após a transformação dos seus dados para o quadrado de seus
valores. Já, a variável resposta massa obedeceu às premissas não sendo
necessária qualquer transformação. Também para esta análise, a variável DI não
obedeceu às premissas, não sendo possível transformá-la.
As variáveis resposta foram submetidas à análise de correlação de Pearson e
Spearman para variáveis paramétricas e não paramétricas, respectivamente.
58
5
5
R
R
E
E
S
S
U
U
L
L
T
T
A
A
D
D
O
O
S
S
E
E
D
D
I
I
S
S
C
C
U
U
S
S
S
S
Ã
Ã
O
O
59
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO: AVALIAÇÕES REPRODUTIVAS E
DE CONDIÇÃO CORPORAL DAS SERPENTES ESTUDADAS
Os dados aqui apresentados são inéditos e auxiliarão a compor o banco de
dados sobre parâmetros reprodutivos das espécies estudadas e na compreensão da
biologia reprodutiva das serpentes.
5.1 ANIMAIS
O esforço amostral no trabalho de campo foi de aproximadamente 3.000 horas-
homem, com uma média aproximada de 31 horas-homem por cascavel encontrada.
Foram capturadas 96 cascavéis das três diferentes espécies (Crotalus ruber ruber,
C. oreganus helleri e C. mitchellii phyrrus) as quais ocorrem na área deste estudo
(Tabela 2).
Tabela 2- Relação de espécies de cascavel capturadas na reserva ecológica da
Zoological Society of San Diego em Escondido (CA, EUA), durante o
período de abril de 2005 a julho de 2006 - São Paulo - 2008
Espécie N= (machos.fêmeas) Nome comum (inglês)
Crotalus ruber ruber
78 (47.31)
Red Diamond rattlesnake
Crotalus oreganus helleri
10 (8.2)
Southern Pacific rattlesnake
Crotalus mitchellii phyrrus
8 (5.3)
Speckled rattlesnake
Como pode ser observado na tabela acima (Tabela 2), a Crotalus ruber ruber
mostrou-se a mais abundante dentre a três espécies de cascavel, correspondendo a
81% das serpentes capturadas.
Essa área é formada predominantemente por Coastal Sage Scrub, Chaparral
e cactos (Figura 13), hábitat que favorece a C. ruber ruber , enquanto a C. oreganus
helleri usa primariamente campos de gramíneas não nativas e vegetação ripariana,
pouco freqüentes na área (DUGAN; HAYES, 2005). Já a C. mitchellii phyrrus utiliza
áreas de difícil acesso com predominância de rochas (KLAUBER, 1982), o que
diminuiu a eficiência de localização e captura desta espécie.
60
Foram capturados mais machos do que fêmeas (60.36) durante o período do
estudo. Em estudo sobre a ecologia da Crotalus ruber ruber na mesma área, Brown
et al. (2005) constataram áreas de uso de 2,80 ha e 0,88 ha para machos e fêmeas,
respectivamente, com deslocamento anual de 1,38 km para machos e 0,77 km para
fêmeas. Assim sendo, os machos percorrem distâncias maiores e por mais tempo do
que as fêmeas, o que provavelmente aumenta as chances de serem encontrados e
capturados.
Essa diferença na ecologia espacial entre os sexos também é citada na
literatura para outras espécies de cascavéis da América do Norte (BROWN et al.,
2005; SMITH et al., 2005; WALDRON et al., 2006; PARKER; ANDERSON, 2007),
mas não foi observada na cascavel (Crotalus durissus) no Brasil (TOZETTI;
MARTINS, 2005).
5.2 AVALIAÇÃO REPRODUTIVA E DE CONDIÇÃO CORPORAL EM
Crotalus ruber ruber
As serpentes de Crotalus ruber ruber foram encontradas em hábitats com
vegetação arbustiva (Coastal Sage Scrub e Chaparral), áreas com rochas e cactos
(Opuntia sp.), dentro de ninho de rato (Neotoma sp.) ou mesmo atravessando
estradas de terra, as quais dão acesso ao local desse estudo.
Foram capturados um total de 78 indivíduos da Crotalus ruber ruber na área
de estudo. Também foram inclusos três machos provenientes de vida livre de
regiões próximas à área estudada, recebidos pelo Departamento de Herpetologia da
ZSSD e um macho mantido em cativeiro no Zoológico de San Diego, totalizando 82
serpentes adultas.
O grande número de serpentes desta espécie permitiu a análise estatística
dos dados considerando o sexo e a estação do ano. Além disso, os resultados
obtidos nas avaliações reprodutivas de machos e fêmeas são discutidos em
capítulos separados.
61
5.2.1 Biologia reprodutiva da Crotalus ruber ruber
Analisando-se os dados referentes à porcentagem de machos e fêmeas
capturados ao longo das estações (Figura 16), foi encontrada diferença
estatisticamente significante (p=0,0163) apenas entre a primavera e o verão. Na
primavera, 75% (24/32) das serpentes encontradas eram machos, enquanto no
verão a situação se inverteu, pois 64% (12/19) das serpentes capturadas eram
fêmeas.
Figura 16- Representação gráfica da porcentagem relativa de machos e fêmeas de
Crotalus ruber ruber capturados em vida-livre no Sul da Califórnia,. nas
diferentes estações do ano. (a,b) letras diferentes representam diferença
estatisticamente significante (p<0,05)
A predominância de machos encontrados na primavera está provavelmente
relacionada ao aumento da atividade destes em função do comportamento de busca
pelas fêmeas para cópula (KLAUBER, 1982; DUVALL; SCHUETT, 1997;
ALDRIDGE; DUVALL, 2002; TAYLOR; DENARDO, 2005; CARDWELL, 2008).
Vários autores (GIBSON; KINGSBURY, 2005; KINGSBURY et al., 2005;
PRIVAL, 2005) relatam que fêmeas prenhes de cascavéis utilizam ambientes mais
abertos e com menor cobertura de vegetação para favorecer a termorregulação,
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Primavera Verão Outono Inverno
Porcentagem de serpentes capturadas (%)
Machos Fêmeas
a
a,b
b
a,b
62
deixando-as mais expostas. Esse fato pode ter contribuído para o encontro de mais
fêmeas no verão, sendo que 33% (4/12) das fêmeas capturadas estavam prenhes.
Durante a tarde de 5 de março de 2006 (primavera) foi observada a corte
entre o macho 98 e a fêmea 94 próximos a um arbusto e a aproximadamente 2
metros de distância foi encontrado o macho 97. Durante a captura os machos
imediatamente assumiram uma posição enrodilhada e desferiram botes, enquanto a
fêmea tentou escapar por entre os arbustos. A observação deste comportamento de
corte, reforça os dados já existentes na literatura, descrevendo a primavera como a
fase de corte e cópula para Crotalus ruber ruber (KLAUBER, 1982; ALDRIDGE;
DUVALL, 2002; BROWN et al., 2005).
Aldrige e Duvall (2002) propõem a hipótese de que o estro em viperídeos da
América do Norte está condicionado à vitelogênese secundária e eliminação de
ferormônios através da pele, tornando a fêmea atrativa aos machos. Entretanto,
Taylor e DeNardo (2005) verificaram em Crotalus atrox várias cópulas de fêmeas
não vitelogênicas e com baixos níveis de estradiol, contrariando a hipótese anterior.
Durante a avaliação reprodutiva, a fêmea 94 foi classificada como vitelogênica
(folículos ovarianos entre 4 e 15 mm de diâmetro) corroborando a hipótese de
Aldridge e Duvall (2002), no entanto, uma única corte observada não é suficiente
para compreender a relação entre vitelogênese secundária, corte e cópula em
Crotalus ruber.
5.2.2 Avaliação de parâmetros morfológicos da Crotalus ruber ruber
Na avaliação morfológica e da condição corporal a fêmea 41 não foi incluída,
em virtude da massa superestimada pela presença de conteúdo alimentar, muito
provavelmente um coelho (Sylvilagus audubonii) (Figura 17), uma das presas
descritas para esta espécie (KLAUBER, 1982; RUBIO, 1998; IUCN, 2008).
63
Figura 17- Radiografia de uma fêmea adulta de Crotalus ruber ruber (fêmea 41)
capturada em vida-livre no Sul da Califórnia e que tinha ingerido um coelho
(Sylvilagus audubonii). As setas indicam o crânio e o fêmur da presa
A análise dos parâmetros morfológicos de massa, comprimento rostro-cloacal,
comprimento total e índice de massa corpórea da C. ruber ruber demonstrou haver
diferenças estatisticamente significantes entre machos e fêmeas (tabela 2).
Tabela 3- Parâmetros morfológicos (média ± EPM) de machos e fêmeas de
Crotalus ruber ruber capturados em vida-livre no Sul da Califórnia,
durante o período de maio de 2005 a junho de 2006 - São Paulo – 2008
Machos (n=51) Fêmeas (n=30) p
Massa (g)
989.256 ± 56.75
a
477,45 ± 51,76
b
<0,0001
CRC (cm)
108.28 ± 2.12
a
92.40 ± 2.71
b
<0,0001
CT (cm)
116.27 ± 2.27
a
96.84 ± 2.72
b
<0,0001
CRC= comprimento rostro-cloacal; CT= comprimento total; (a,b) Letras diferentes em uma mesma
variável significam diferença estatisticamente significante (p<0,05)
Essas diferenças indicam o dimorfismo sexual quanto ao tamanho dos
adultos, sendo machos maiores do que fêmeas. Este fato já está descrito na
64
literatura para diversas espécies de cascavéis (GIBBONS, 1972; SHINE, 1994;
BEAUPRE, S. et al., 1998).
Na estratégia reprodutiva de várias espécies de cascavéis (Crotalus) existe a
disputa entre os machos (danças-combate), que provavelmente favorece o
dimorfismo sexual pela seleção natural de machos maiores (GIBBONS, 1972;
SHINE, 1978; SHINE, 1993; , 1994; DUVALL; BEAUPRE, 1998). Porém, alguns
autores sugerem que diferenças nas taxas metabólicas de machos e fêmeas
poderiam ser um dos fatores envolvidos no dimorfismo sexual dessas serpentes
(BEAUPRE; DUVALL, 1998).
A análise dos parâmetros morfológicos de machos em relação às estações do
ano revelou que as variáveis CRC, CT e massa possuem diferenças
estatisticamente significantes entre verão e outono (Tabela 3). Sendo que os
machos encontrados no outono são maiores (mais pesados e compridos) do que os
encontrados no verão.
Tabela 4- Parâmetros morfológicos (média ± EPM) de machos de Crotalus ruber
ruber capturados em vida-livre no Sul da Califórnia, ao longo das
estações do ano - São Paulo – 2008
Primavera (n=24) Verão (n=7) Outono (n=8) Inverno (n=12)
CRC
109,35 ± 1,83
a,
b
100,5 ± 7,75
b
117,37 ± 3,87
a
108,6 ± 4,54
a,
b
CT
117,41 ± 1,97
a,
b
107,93 ± 8,34
b
125,94 ± 3,96
a
116,75 ± 4,84
a,
b
Massa
1000,35 ± 65,94
a,
b
746,66 ± 303,39
b
1175,43 ± 82,66
a
996 ± 134,05
a,
b
CRC= comprimento rostro-cloacal; CT= comprimento total; (a,b) Letras diferentes em uma mesma
variável significam diferença estatisticamente significante (p<0,05)
Para as fêmeas, a análise das variáveis CRC e CT em relação às estações do
ano não demonstrou diferenças estatisticamente significantes (Tabela 4). No
entanto, foi detectada diferença significante da variável massa, entre o outono e a
primavera/verão. Sendo que no outono as fêmeas encontradas eram mais pesadas
do que nas estações primavera e verão, que não diferiram entre si. Não houve
diferença significante da variável massa no inverno em relação às outras estações.
65
Tabela 5- Parâmetros morfológicos (média ± EPM) de fêmeas adultas de Crotalus
ruber ruber capturadas em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o
período de maio de 2005 a junho de 2006, segundo a estação do ano -
São Paulo - 2008
Primavera (n=7) Verão (n=12) Outono (n=7) Inverno (n=4)
CRC
88,67 ± 5,41
a
87,71 ± 3,92
a
101,16 ± 3,26
a
99,75 ± 2,78
a
CT
115,50 ± 23,72
a
92,43 ± 4,14
a
106,42 ± 3,37
a
104,87 ± 2,68
a
Massa
363,83 ± 83,24
a
405,71 ± 72,07
a
766,66 ± 103,26
b
510,00 ± 46,00
a,b
CRC= comprimento rostro-cloacal; CT= comprimento total (a,b) Letras diferentes em uma mesma
variável significam diferença estatisticamente significante (P<0,05)
As análises demonstraram que machos e fêmeas encontrados no outono, em
geral são maiores do que os observados nas outras estações. Como demonstrado
por Figueroa (2006) em estudo sobre a ecologia da Crotalus oreganus helleri, os
maiores indivíduos permaneciam por mais tempo ativos durante o outono, enquanto
os menores se recolhiam aos abrigos de hibernação para a chegada do inverno.
Fato semelhante pode ter ocorrido com a Crotalus ruber ruber na área estudada,
levando à captura de indivíduos maiores no outono.
5.2.3 Avaliação da condição corporal e índice de massa corpóreo da
Crotalus ruber ruber
As tabelas (Tabela 5 e 6) a seguir apresentam os resultados obtidos (média ±
EPM) para os parâmetros morfológicos de acordo com a condição corporal de
machos e fêmeas de Crotalus ruber ruber.
66
Tabela 6- Resultados (média ± EPM) dos parâmetros morfológicos em relação à
condição corporal de fêmeas adultas de Crotalus ruber ruber capturadas em
vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período de maio de 2005 a junho de
2006 - São Paulo - 2008
Cc 1
(n=6)
Cc 2
(n=21)
Cc 3
(n=3)
Massa (g)
453.33 ± 50.57
a
432.80 ± 62.39
a
823.33 ± 190.12
b
CRC (cm)
98.66 ± 2.52
a
89.77 ± 3.68
a
98.83 ± 3.61
a
CT (cm)
103.75 ± 2.49
a
208.20 ± 70.81
a
103.83 ± 3.59
a
IMC
2566.11 ± 170.58
a
1835.60 ± 83.62
b
1442.46 ± 162.24
b
CRC= comprimento rostro-cloacal; CT=comprimento total; IMC= índice de massa corpórea; (a,b)
Letras diferentes em uma mesma variável significam diferença estatisticamente significante (P<0,05)
A análise estatística do efeito da condição corporal (parâmetro subjetivo de
avaliação) sobre o índice de massa corpórea (parâmetro objetivo de avaliação)
revelou diferença estatisticamente significante (tabela 5) entre as fêmeas com
condição corporal 1 (ruim) em relação às com condição corporal 2 (boa) e 3 (muito
boa), que não diferiram entre si. Essa diferença valida, em parte, os critérios
subjetivos de avaliação da condição corporal, pois foi demonstrado que as fêmeas
com condição corporal 1 apresentam o menor índice de massa corpórea dentre
todas.
Com relação aos outros parâmetros morfológicos, apenas a massa das
fêmeas com condição corporal 3 foi significante (p<0,05) maior do que as outras
classes de condição corporal, que não diferiram entre si.
Tabela 7- Resultados (média ± EPM) dos parâmetros índice de massa corpórea
em relação à condição corporal de machos adultos de Crotalus ruber
ruber capturados em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período
de maio de 2005 a junho de 2006 - São Paulo – 2008
Cc 1
(n=10)
Cc 2
(n=39)
Cc 3
(n=3)
Massa (g)
1285.56 ± 65.06
a
883.94 ± 61.77
a
1215.00 ± 445.00
a
CRC (cm)
114.00 ± 2.86
a
105.96 ± 2.61
a
117.00 ± 6.00
a
CT (cm)
122.25 ± 3.06
a
113.76 ± 2.80
a
126.00 ± 6.00
a
IMC
1539,11 ± 51,05
a
1769,97 ± 43,73
a
1814,84 ± 429,32
a
CRC= comprimento rostro-cloacal; CT=comprimento total; IMC= índice de massa corpórea; (a,b)
Letras diferentes em uma mesma variável significam diferença estatisticamente significante (P<0,05)
Embora tenha sido observada diferença estatisticamente significante entre as
fêmeas de diferentes categorias de condição corporal (tabela 5), o mesmo não foi
67
observado nos machos, pois nenhum dos parâmetros morfológicos analisados
sofreu o efeito da condição corporal.
Esses resultados podem sugerir que a classificação da condição corporal não
demonstra diferenças reais entre os machos. Porém, aponta uma diferença no índice
de massa corpórea, principalmente, de fêmeas com condição corporal ruim em
relação às outras.
A condição corporal da fêmea é muito importante para a reprodução nas
serpentes, pois a vitelogênese e a gestação representam um alto custo energético
para elas (SHINE, 1980; OLSSON et al., 1997; TAYLOR et al., 2005). Tem sido
demonstrado na literatura, que fêmeas com uma condição corporal ruim apresentam
menores níveis de estradiol e não conseguem reproduzir (BONNET et al., 1994;
BONNET, 1996; TAYLOR et al., 2005).
Assim sendo, o estabelecimento de um critério para definir a condição
corporal em fêmeas de serpentes pode ser uma ferramenta importante no manejo
reprodutivo de inúmeras espécies em cativeiro.
5.2.4 Avaliação reprodutiva dos machos de Crotalus ruber ruber
Durante o período do experimento de maio/2005 a julho/2006 foram
capturados 48 machos de Crotalus ruber ruber, além dos machos adicionais já
citados. Foram obtidas amostras de sêmen em 90% (47/52) dos machos, o que
demonstra a grande eficiência da técnica.
Analisando os parâmetros seminais ao longo das estações, foi verificado que
o volume seminal, motilidade e vigor espermáticos, integridade acrossomal e de
membrana espermática não apresentaram diferença estatisticamente significante
(P<0,05) entre as estações do ano (Tabela 8) ou de acordo com a condição corporal
dos machos.
68
Tabela 8- Parâmetros seminais (média ± EPM) de machos adultos de Crotalus
ruber ruber capturados em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o
período de maio de 2005 a junho de 2006, segundo as estações do ano
- São Paulo - 2008
Primavera (n=23) Verão (n=7) Outono (n=7) Inverno (n=10)
Volume (µL)
1,83 ± 0,90
a
1,971 ± 0,87
a
0,36 ± 0,27
a
2,53 ± 1,33
a
Motilidade (%)
68,14 ± 3,17
a
46,75 ± 16,07
a
42,60 ± 17,55
a
42,60 ± 17,55
a
Vigor
2,28 ± 0,16
a
1,25 ± 0,63
a
1,60 ± 0,68
a
1,60 ± 0,67
a
IA (%)
96,44 ± 1,12
a
92,66 ± 5,04
a
96,50 ± 0,50
a
95,00 ± 0,70
a
IM (%)
56,33 ± 6,57
a
81,25 ± 6,25
a
80,66 ± 3,53
a
73,20 ± 9,25
a
IA= integridade acrossomal; IM= integridade de membrana espermática (a,b) Letras diferentes em
uma mesma variável significam diferença estatisticamente significante (P<0,05)
Em cascavéis (Crotalus), os espermatozóides podem permanecer
armazenados nos ductos deferentes antes da cópula por até dois anos (ALDRIDGE,
2002), o que pressupõe uma alta capacidade de manutenção da viabilidade durante
esse período. A não observação de variações nos parâmetros seminais estudados
pode ser em decorrência desta estabilidade, o que não permitiu a detecção de
variações ao longo das estações.
É importante mencionar que apenas durante a primavera foram observadas
amostras contaminadas (50% das amostras) (Figura 19). Essa contaminação
examinada ao microscópio de luz apresentava grande quantidade de bactérias,
protozoários, resto celular, cristais de urato e um possuíam um aspecto mucoso. A
presença da contaminação foi uma surpresa, pois era esperado que durante a
primavera (fase de cópula) seriam obtidos os maiores volumes seminais e melhores
índices de qualidade espermática dentre os parâmetros estudados. Em estudo
semelhante com Crotalus durissus no Brasil não foi encontrado este tipo de
contaminação (ZACARIOTTI et al., 2007).
Em decorrência da escassez de informações sobre a análise de sêmen em
serpentes, não foi encontrada explicação plausível para este fato.
69
Figura 18- Espermatozóide (seta branca) em meio a restos celulares, bactérias,
protozoários e urato. Fotomicrografia de amostra de sêmen de Crotalus ruber
ruber ao exame sob microscópio de luz e contraste de fase (objetiva 40X)
Foi encontrada correlação negativa e de fraca intensidade entre motilidade
espermática e os parâmetros morfológicos comprimento rostro-cloacal (p= 0,0390,
r=-0,37888), comprimento total (p= 0,0269, r= -0,40384;) e massa (p= 0,0469, r= -
0,38566), ou seja, quanto maior a serpente menor foi a motilidade espermática
observada e vice-versa.
Essa correlação negativa pode estar relacionada ao comportamento
reprodutivo e sistema poligínico de acasalamento dessa espécie (RIVAS;
BURGHARDT, 2005), no qual um macho disputa as fêmeas com outros machos e
tenta copular com o maior número possível de fêmeas. Apesar dos maiores machos
terem provavelmente mais oportunidades de cópula, o estresse e desgaste físico
envolvidos neste comportamento poderiam ser deletérios à qualidade seminal.
Também foi encontrada correlação negativa e de média intensidade entre
integridade de membrana espermática e volume seminal (p= 0,0175; r= -0,51253),
ou seja, quanto maior o volume seminal menor foi a integridade de membrana
espermática observada e vice-versa.
Um maior volume de sêmen pode gerar um acúmulo maior de metabólitos e
espécies reativas de oxigênio (ROS), tornando o espermatozóide mais suscetível à
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71
O padrão observado da vitelogênese secundária iniciando em outono,
ovulação e cópulas na primavera e gestação durante parte da primavera e no verão
também foi descrito por outros autores para as cascavéis da América do Norte
(ALDRIDGE, 2002; TAYLOR; DENARDO, 2005), o que corrobora nossos dados e a
utilização da ultra-sonografia como ferramenta no estudo da biologia reprodutiva das
serpentes.
A cascavel na América do Sul (Crotalus durissus), mais especificamente no
Brasil, apresenta um padrão semelhante de vitelogênese secundária iniciando-se no
outono e ovulação na primavera, porém com cópulas ocorrendo no outono
(ALMEIDA-SANTOS et al., 2004; ALMEIDA-SANTOS et al., 2004; YAMANOUYE et
al., 2004; ALMEIDA-SANTOS, 2005).
Quando comparamos os ciclos reprodutivos das cascavéis das Américas do
Norte e do Sul, observamos diferentes estratégias. Essas estratégias tem sido
motivo de inúmeras publicações na literatura (SCHUETT, G. W., 1992; ALDRIDGE,
1993; SCHUETT et al., 1997; ALDRIDGE, 2002; ALDRIDGE; DUVALL, 2002;
PIZZATTO; MARQUES, 2002; ALMEIDA-SANTOS et al., 2004; ALMEIDA-SANTOS,
et al., 2004; TAYLOR; DENARDO, 2005).
Apesar do padrão de vitelogênese secundária iniciando no outono, com
ovulação ocorrendo na primavera ser semelhante entre essas espécies de cascavel,
a fase de cópula representa uma importante diferença. Na América do Norte a
cascavel copula na primavera, sendo o macho quem armazena os espermatozóides
durante o inverno, enquanto na América do Sul, as cópulas ocorrem no outono e é a
fêmea quem armazena os espermatozóides durante o inverno, pois a ovulação só
ocorre na primavera.
Quando analisado o diâmetro do maior folículo associado à condição corporal
da fêmea (Figura 20), não foram observadas fêmeas em vitelogênese secundária
(DMF> 10 mm) ou mesmo prenhes, que apresentassem condição corporal ruim
(classe 1).
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73
5.3 AVALIAÇÃO REPRODUTIVA E DE CONDIÇÃO CORPORAL EM
MACHOS E FÊMEAS DE Crotalus oreganus helleri
Foram capturados dez indivíduos da espécie Crotalus oreganus helleri
(Tabela 7) em diferentes locais como cruzando estradas, em meio à vegetação
arbustiva, ninho de roedor (Neotoma sp.), áreas com rochas e inclusive um indivíduo
no pátio externo das instalações do CRES (macho 89).
Em virtude do pequeno número de indivíduos e à grande variabilidade
individual, os dados não serão discutidos estatisticamente ou segundo possíveis
variações sazonais e de condição corporal.
De acordo com os dados apresentados na tabela 7, apenas um indivíduo
(macho 72) apresentou uma condição corporal ruim. Os outros indivíduos
apresentaram uma condição corporal boa ou muito boa, mesmo durante o inverno.
No entanto, como citado, o pequeno número de indivíduos não permite estabelecer
uma relação entre estado reprodutivo, estação do ano e condição corporal.
Tabela 9- Condição corporal, estação que ocorreu a captura e parâmetros
morfológicos estudados em Crotalus oreganus helleri capturados em
vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período de maio de 2005 a
junho de 2006 - São Paulo - 2008
Sexo Cc Estação Massa (g) CRC (cm) CT (cm)
Macho 1 3 Verão 1130 105 113
Macho 37 3 Outono 200 59 63,5
Macho 47 3 Outono 470 87 93
Macho 49 3 Inverno 220 63 68,5
Macho 72 1 Inverno 580 94 102
Macho 89 2 Primavera 340 79 85
Macho 134 3 Verão 780 101 109
Macho 142 3 Verão 460 80 87
Fêmea 93 2 Primavera 100 49 52,3
Fêmea 108 3 Primavera 40 38 40,5
Cc= condição corporal; CRC= comprimento rostro-cloacal; CT= comprimento total
Todos os machos foram submetidos à colheita de sêmen obtendo-se os
resultados representados na tabela 8. Em adição ao estudo das serpentes em vida-
livre foi colhido sêmen de um macho adulto mantido em cativeiro no Zoológico de
San Diego (macho 8) durante o verão e o outono.
74
Tabela 10- Parâmetros seminais estudados em Crotalus oreganus helleri,
representando um macho adulto de cativeiro (macho 8) e cinco
capturados em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período de
maio de 2005 a junho de 2006 - São Paulo - 2008
Identificação Estação Vol (µL) Mot (%) Vigor AI (%) MEI (%)
1
Verão
<0.5 87 2 57 91
8
(1)
Outono
- - - - -
8
(2)
Verão
23,3 1 0 98 69
37
Outono
5 81 1 100 88,5
47
Outono
5 79 2 98,5 88
49
Inverno
<0.5 69 2 98,5 88,5
72
(3)
Inverno
<0.5 9 1 - 30
89
(4)
Primavera
<0.5 - - - -
134
Verão
60 50 2 86 58
142
Verão
6 84 2 99
87
Vol= volume de sêmen; Mot= motilidade; AI= acrossoma íntegro; MEI= membrana espermática
íntegra; (1) Não foi obtida amostra de sêmen (2) Aproximadamente 20µl do volume de sêmen era
plasma seminal (3) Não foi possível realizar a coloração para integridade acrossomal devido ao
pequeno volume da amostra (4) Não foram encontrados espermatozóides na amostra.
Apesar do pequeno número de animais representarem mais as variações nos
indivíduos do que na espécie, a obtenção de amostras de sêmen de C. oreganus
helleri em praticamente todas as estações (Tabela 8), pode ser corroborada por
Aldridge (2002), quando demonstrou através da histologia que C. oreganus helleri
apresenta espermatozóides nos ductos deferentes durante o ano todo.
Um estudo futuro com um número maior de indivíduos e que contemple
também a testosterona sérica poderá ajudar a esclarecer a papel de danças-
combate observadas em primavera e verão, com cópulas apenas no verão.
Na Tabela a seguir estão listadas os resultados das avaliações reprodutivas
de duas fêmeas avaliadas de Crotalus oreganus helleri (Tabela 9):
Tabela 11- Diâmetro do maior folículo observado em fêmeas de Crotalus oreganus
helleri capturadas em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período
de maio de 2005 a junho de 2006- São Paulo - 2008
Identificação Estação DMF (mm)
Massa (g) CRC (cm) CT (cm)
Fêmea 93 Primavera 2 100 49 52,3
Fêmea 108* Primavera - 40 38 40,5
(*) Não foram observados folículos nos ovários; DMF= diâmetro do maior folículo.
A fêmea 108 é muito provavelmente jovem (massa=40g, CRC=38 cm), o que
explica a ausência de folículos nos ovários. Enquanto a fêmea 93 apesar de ser
adulta e da condição corporal favorável não foram observados folículos em
75
vitelogênese secundária (DMF superior a 10 mm). Como já citado anteriormente, a
literatura aponta o verão, como início da vitelogênese secundária nesta espécie
(ALDRIDGE; DUVALL, 2002; GARTENER, 2003) e é provável que esta fêmea em
questão estivesse recuperando sua condição corporal após reproduzir no ano
anterior.
Não foram observadas fêmeas vitelogênicas ou prenhes nesta espécie.
5.4 AVALIAÇÃO REPRODUTIVA E DE CONDIÇÃO CORPORAL EM
MACHOS E FÊMEAS DE Crotalus mitchellii phyrrus
Todos os indivíduos de Crotalus mitchellii phyrrus foram encontrados em
áreas de rochas, entre frestas ou próximo a grandes blocos de granito, como
descrito na literatura (KLAUBER, 1982; GREENBERG, 2005). O difícil acesso ao
hábitat em que vivem dificultou o encontro e a captura dessa espécie. Foram
encontrados dez indivíduos, porém apenas oito foram capturados (Tabela 10).
Em virtude do pequeno número de indivíduos e à grande variabilidade
individual, os dados não serão discutidos estatisticamente ou segundo possíveis
variações sazonais e de condição corporal.
Durante a primavera foram capturados 50% (4/8) dos indivíduos de Crotalus
mitchellii phyrrus (Tabela 10). Essa estação corresponde à fase de corte e cópula
desta espécie (KLAUBER, 1982; ALDRIDGE; DUVALL, 2002; GARTENER, 2003) e
provavelmente ao período de maior atividade dessa espécie, o que facilitaria seu
encontro.
Apenas um macho (macho 113) apresentou uma condição corporal ruim
(tabela 10), os outros indivíduos apresentaram uma condição boa ou muito boa,
mesmo durante o inverno. Como já explicado anteriormente, não serão discutidas a
relação entre estado reprodutivo, estação do ano e condição corporal nesta espécie.
76
Tabela 12- Condição corporal, estação que ocorreu a captura e parâmetros
morfológicos estudados em Crotalus mitchellii phyrrus capturados em
vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período de maio de 2005 a
junho de 2006 - São Paulo - 2008
Sexo Cc Estação Massa (g) CRC (cm) CT (cm)
Macho 21 2 Verão 280 77 83,5
Macho 50 3 Inverno 660 90 97
Macho 53 3 Inverno 890 103 110
Macho 99 3 Primavera 820 96 102,5
Macho 113 1 Primavera 370 88 97
Fêmea 96 2 Primavera 40 37 39
Fêmea 100 3 Primavera 50 38 40
Fêmea 137 3 Verão 340 74 78
Cc= condição corporal; CRC= comprimento rostro-cloacal; CT= comprimento total
Todos os machos foram considerados adultos e submetidos à colheita de
sêmen obtendo-se os resultados representados n tabela 11. Em adição ao estudo
com as serpentes de vida-livre, foi colhido sêmen durante o verão e o outono, de um
macho adulto mantido em cativeiro no Zoológico de San Diego (macho 7).
Tabela 13- Parâmetros seminais estudados em Crotalus mitchellii phyrrus,
representando um macho adulto mantido em cativeiro (macho 7) e
cinco capturados em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o período
de maio de 2005 a junho de 2006 - São Paulo - 2008
Identificação Estação Vol (µL) Mot (%) Vigor AI (%) MEI (%)
Macho 7 Verão <0,5 37 2 56 (
1
)
Macho 7* Outono - - - - -
Macho 21 Verão <0,5 0 0 15 2
Macho 50* Inverno - - - - -
Macho 53* Inverno - - - - -
Macho 99* Primavera - - - - -
Macho 113 Primavera 10 76 2 95,5 87,5
Vol= volume de sêmen; Mot= motilidade; AI= acrossoma íntegro; MEI= membrana espermática
íntegra; (*) Não foram obtidas amostras de sêmen (¹) Devido ao pequeno volume e à concentração
muito baixa não foi possível realizar este teste.
Ao contrário da maior parte das cascavéis da América do Norte, a
espermatogênese em C. mitchellii se inicia na primavera (GARTENER, 2003), o que
poderia explicar a ausência de sêmen nos animais estudados, durante outono e
inverno
Na Tabela a seguir estão listadas as informações sobre as avaliações
reprodutivas das três fêmeas estudadas (Tabela 13):
77
Tabela 14- Diâmetro do maior folículo observado em fêmeas de Crotalus mitchellii
phyrrus capturadas em vida-livre no Sul da Califórnia, durante o
período de maio de 2005 a junho de 2006 - São Paulo - 2008
Identificação Estação DMF (mm)
Massa (g) CRC (cm) CT (cm)
Fêmea 96*
Primavera -
40 37 39
Fêmea 100*
Primavera -
50 38 40
Fêmea 137
Verão 9 mm
340 74 78
(*) Não foram observados folículos nos ovários; DMF= diâmetro do maior folículo.
Vários autores (ALDRIDGE; DUVALL, 2002; GARTENER, 2003) citam a
vitelogênese secundária iniciando no fim do verão / início do outono em cascavéis
na América do Norte. É provável que a fêmea 137, avaliada no verão, iniciasse a
vitelogênese secundária no outono, já que o diâmetro do maior folículo aproximava-
se de 10 mm. As fêmeas 96 e 100 eram muito provavelmente jovens, em virtude do
seu tamanho pequeno (Tabela 10) e ausência de folículos ovarianos, apesar da
estação e condição corporal favoráveis.
78
5.5 RESULTADOS E DISCUSSÃO DO EXPERIMENTO II:
CONGELAÇÃO DE SÊMEN
Os testes de congelação de sêmen foram realizados com amostras de sete
indivíduos de cinco diferentes espécies de cascavéis (Crotalus adamanteus, C.
cerastes, C. durissus, C. mitchellii e C. ruber), provenientes da natureza e de
cativeiro (Tabela 13). Em decorrência da variedade de espécies associada ao
pequeno número de repetições dos vários protocolos testados nos indivíduos,
potencializando as variações individuais, os resultados não serão discutidos
estatisticamente.
Durante as avaliações pré e pós-descongelação foram avaliados os
parâmetros de motilidade, vigor, integridade acrossomal e integridade de membrana
espermática como descrito no material e métodos (capítulo 4). No entanto, a
influência dos crioprotetores sobre permeabilidade de membrana espermática e
acrossomal alterou as colorações utilizadas e gerou padrões inconsistentes de
avaliação (Figura 21) que não possibilitaram o uso desses dados.
Celeghini (2005) destacou as inúmeras alterações que os crioprotetores
causam nas colorações espermáticas, em decorrência das alterações provocadas na
membrana espermáticas, o que dificultou a avaliação de sêmen bovino após a
descongelação.
79
Figura 21- Fotomicrografias de amostras de sêmen de Crotalus ruber ruber coradas com
coloração Eosina/Nigrosina para avaliação de integridade de membrana
espermática. A) Amostra de sêmen diluída em Test-gema e apresentando
padrão normal de coloração. Espermatozóide com membrana íntegra (n°1) e
alterada (n°2) B) Amostra de sêmen diluída em Test-gema com glicerol antes
da congelação, apresentando padrões anormais de coloração C) Amostra de
sêmen diluída em Test-gema com glicerol após a congelação, apresentando
padrões anormais de coloração
B
C
A
1
2
80
Tabela 155- Protocolos utilizados na congelação de sêmen em diferentes indivíduos de diferentes espécies de cascavéis. Sendo
os resultados de motilidade e vigor (0-100% / 0-5) apresentados em T0 (avaliação inicial da amostra), T1 (amostra +
diluidor), T2 (amostra + diluidor + crioprotetor), T3A (avaliação pós-descongelamento), T3B (avaliação pós-
descongelamento procotlo)T3C (avaliação pós ) - São Paulo - 2008
ID Espécie Procedência
Colheita Diluidor
Crioprotetor [crioprotetor] PC T0 T1 T2 T3A T3B T3C
25 C. adamanteus CAT Massagem Test G. Glicerol 8% 3 34% / 2
90% / 3
93% / 3
0 0 0
25 C. adamanteus CAT Massagem
Test G.
Glicerol 16% 3 34% / 2
90% / 3
15% / 3
1% / 1 22% / 1 42% / 2
20 C. cerastes NAT Post-mortem
Test G.
DMA 18% 2 65% / 2
59% / 2
10% / 1
0 0 0
36 C. durissus CAT Post-mortem
Test G.
Glicerol 4% 3 69% / 2
63% / 3
63% / 3
0 0 0
36 C. durissus CAT Post-mortem
Test G.
Glicerol 8% 3 69% / 2
63% / 3
71% / 2
12% / 1
0 3% / 1
73 C. mitchellii CAT Post-mortem
Test G.
Glicerol 8% 3 15% / 1
88% / 4
84% / 1
0 0 3% / 1
73 C. mitchellii CAT Post-mortem
Test G.
Glicerol 10% 3 15% / 1
88% / 4
92% / 1
0 0 0
9 C. ruber CAT Massagem Lake´s DMSO 4% 2 52% / 3
57% / 3
41% / 2
0 0 0
9 C. ruber CAT Massagem Lake´s DMSO 4% 1 52% / 3
57% / 3
41% / 2
0 0 0
9 C. ruber CAT Massagem Lake´s DMSO 2% 1 52% / 3
57% / 3
50% / 2
0 0 0
9 C. ruber CAT Massagem Lake´s DMSO 2% 2 52% / 3
57% / 3
50% / 2
0 0 0
6 C. ruber NAT Massagem Lake´s DMSO 2% 1 63% / 1
60% / 1
35% / 1
0 0 0
6 C. ruber NAT Massagem Lake´s DMSO 4% 1 63% / 1
60% / 1
36% / 1
0 0 0
122 C. ruber NAT Massagem
Test G.
Glicerol 10% 4 70% / 3
75% / 3
76% / 3
3% / 1 8% / 1 15% / 1
122 C. ruber NAT Massagem
Test G.
Glicerol 8% 4 70% / 3
75% / 3
76% / 3
0 1% / 1 7% / 1
122 C. ruber NAT Massagem
Test G.
Glicerol 8% 3 70% / 3
75% / 3
76% / 3
1% / 1 1% / 1 1% / 2
122 C. ruber NAT Massagem
Test G.
Glicerol 10% 3 70% / 3
75% / 3
76% / 3
1% / 1 0 1% / 1
42 C. ruber NAT Massagem
Test G.
Glicerol 4% 3 69% / 2
80% / 3
70% / 3
1% / 1 0,5% / 1 0,5% / 1
42 C. ruber NAT Massagem
Test G.
Glicerol 8% 3 69% / 2
80% / 3
70% / 3
21% / 1
24% / 1 48% / 1
ID= identificação da serpente; Test G.= diluidor Test-gema; DMA= dimetilacetamida; DMSO= dimetilsulfóxido; PC= protocolo de congelação;
81
Comparando-se os resultados de motilidade e vigor espermáticos após a
adição dos diluidores Lake´s e Test-gema, em geral esses parâmetros tiveram um
aumento mais acentuado após com o diluidor Test-gema (Tabela 13). Publicações
recentes demonstram resultados melhores com a utilização do diluidor Test-gema
em serpentes, inclusive na inseminação com sêmen fresco e refrigerado (FAHRIG et
al., 2007; MATTSON et al., 2007).
Pode-se constatar que a adição da fração B do diluidor Test-gema com
crioprotetor dimetilacetamida (DMA) 18% causou uma importante diminuição da
motilidade e vigor espermáticos no sêmen de C. cerastes (Tabela 13). Por ser um
composto inflamável, altamente tóxico e que aparentemente causou um efeito
negativo sobre a motilidade e vigor espermáticos da amostra, o DMA foi logo
descartado nos testes posteriores. Recentemente foi demonstrado que o DMA reduz
a viabilidade espermática em algumas espécies de aves, provavelmente em
decorrência de alterações significativas na membrana espermática (BLANCO et al.,
2008). As amostras congeladas utilizando-se com os protocolos com o crioprotetor
dimetilsulfóxido (DMSO) nas concentrações de 2 e 4% não apresentaram qualquer
motilidade pós-descongelamento (Tabela 13).
Ambos os protocolos utilizando DMA e DMSO como crioprotetores aliados
aos protocolos 1 e 2 de congelação não apresentaram resultados satisfatórios.
Como não era possível em um curto espaço de tempo e com poucas amostras para
os testes definir quais fatores afetavam o sucesso da congelação do sêmen,
crioprotetor e/ou concentração ou protocolo de congelação (1 e 2), estes protocolos
foram descartados logo no início dos experimentos. O que não significa que não
possam gerar bons resultados e serem utilizados, após estudos mais detalhados, em
futuros protocolos para a congelação de sêmen de serpentes.
Assim sendo, foram priorizados os testes com os protocolos envolvendo o
diluidor Test-gema e o crioprotetor glicerol.
Os protocolos utilizando o protocolo de congelação 3 mais o diluidor Test-
gema com glicerol nas concentrações de 8 e 16%, foram os que apresentaram os
melhores resultados de motilidade para C. ruber e C. adamanteus, respectivamente
(Tabela 13). No entanto, o vigor espermático das amostras após a descongelação
não foi satisfatório (vigor variou entre 1 e 2).
Durante o processo de congelação, o espermatozóide pode sofrer crio-injúrias
com a formação descontrolada de cristais de gelo, que rompem a membrana celular
82
e estruturas importantes do citoesqueleto, prejudicando sua fisiologia normal e,
portanto, a motilidade (HOLT, 2000).
Como comparação, os benefícios da congelação do sêmen de aves silvestres
ainda são muito limitados, mesmo após décadas de estudos desenvolvidos em aves
de produção, e muito provavelmente em razão das grandes perdas de viabilidade
espermática após a descongelação (BLANCO et al., 2008). Em relação aos
mamíferos, com exceção de bovinos, os mamíferos domésticos ainda enfrentam
muitos desafios no desenvolvimento de um protocolo de congelação de sêmen
satisfatório (BAILEY et al., 2000).
No entanto, os poucos resultados positivos alcançados ressaltam a
importância da continuidade desta linha de pesquisa para o desenvolvimento de
protocolos, que possibilitem congelar o sêmen de serpentes como ferramenta para a
conservação de espécies ameaçadas. Ainda, a utilização da microscopia eletrônica
aliada ao desenvolvimento de colorações (fluorescentes ou não) que auxiliem na
avaliação do espermatozóide é fundamental para orientar o desenvolvimento desses
protocolos, pois apenas os parâmetros de motilidade e vigor não são suficientes.
83
7
7
C
C
O
O
N
N
C
C
L
L
U
U
S
S
Õ
Õ
E
E
S
S
84
7 CONCLUSÕES
As conclusões deste estudo são:
• As técnicas de avaliação reprodutiva pela colheita de sêmen e ultra-
sonografia dos ovários mostraram-se eficientes no estudo da biologia
reprodutiva de serpentes.
• A espécie Crotalus ruber ruber apresentou dimorfismo sexual quanto ao
tamanho das serpentes.
• A proposta de classificação de condição corporal mostrou-se uma ferramenta
que pode ser aplicada na avaliação das fêmeas de Crotalus ruber ruber em
associação com os diferentes estados reprodutivos.
• As fêmeas de Crotalus ruber ruber apresentam a vitelogênese ao longo do
outono, inverno e primavera. Fêmeas prenhes são encontradas apenas na
primavera e no verão.
• Os machos de Crotalus ruber ruber não apresentam variações significativas
dos parâmetros seminais estudados ao longo das estações do ano.
• O congelamento de sêmen de serpentes ainda não é uma alternativa viável,
porém os resultados positivos demonstram que essas técnicas poderão ser
uma realidade no futuro próximo.
• Este estudo contribui com a conservação das serpentes, apresentando dados
inéditos provindos das avaliações reprodutivas realizadas e técnicas
inovadoras para o estudo da biologia reprodutiva desses animais.
85
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98
Anexo 1
Diluidor Test-Gema (q.s.p. 500 ml)
Reagente Quantidade
Tes (Sigma, T-1375) 24,15 g.
Trizma-base (Sigma, T-1503) 5,8 g.
Dextrose (Sigma, G-8270) 1,0 g.
Pen-Strep (Gibco, 15140-015) 10 ml
1- Adicionar os ingredientes a 475 ml de água destilada estéril e homogeneizar a
solução.
2- Checar a osmolaridade e adicionar água destilada estéril para ajustar a
osmolaridade entre 320 e 327 mOsm.
3- Checar o pH e necessário ajustar o pH com NaOH, HCl ou Tes. O pH
desejado é 7,2.
4- Adicionar 20% de gema de ovo clarificada*.
(*) Clarificar a gema de ovo através de centrifugação (750-900 G por 15 minutos),
utilizar o sobrenadante.
Diluidor Lake´s (q.s.p. 100 ml)
Reagente Quantidade
Ácido glutâmico 1,92 g.
Frutose 0,80 g.
Acetato de magnésio (4H
2
O) 0,08 g.
Acetato de potássio (anidro) 0,50 g
Poli-vinil pirrolidona (PVP) 0,30 g
1- Adicionar os ingredientes a 90 ml de água destilada estéril e homogeneizar a
solução.
2- Checar a osmolaridade e adicionar água destilada estéril para ajustar a
osmolaridade para 300 miliosmóis
3- Checar o pH e se necessário ajustá-lo com NaOH ou HCl. O pH desejado é
7,0.
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