( PDF ) ESTUDO DE BIOEQUIVALÊNCIA DA CLOZAPINA EM PACIENTES PSICÓTICOS NO ESTADO DE EQUILÍBRIO COM VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO ALTERNATIVO

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE MEDICINA

MESTRADO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

MARGARETH DE OLIVEIRA TIMOTEO

ESTUDO DE BIOEQUIVALÊNCIA DA CLOZAPINA

EM PACIENTES PSICÓTICOS NO ESTADO DE

EQUILÍBRIO

NITERÓI

2008

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MARGARETH DE OLIVEIRA TIMOTEO

ESTUDO DE BIOEQUIVALÊNCIA DA CLOZAPINA EM PACIENTES PSICÓTICOS

NO ESTADO DE EQUILÍBRIO

Dissertação submetida ao Curso de

Pós-Graduação da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal

Fluminense como parte dos requisitos

necessários à obtenção do Grau de

Mestre em Ciências Médicas. Área de

concentração: Ciências Médicas.

Orientador: Prof. Dr. LUIZ QUERINO DE ARAUJO CALDAS

Co-orientador: Prof. Dr. GILBERTO PEREZ CARDOSO

Niterói

2008

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FICHA CATALOGRÁFICA

T585

imóteo, Margareth de Oliveira

Estudo de bioequivalência da clozapina em pacientes

psicóticos no estado de equilíbrio / Margareth de Oliveira

imóteo. – Niterói: [s.n.], 2008.

114 f., 30 cm.

Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) – Universidade

Federal Fluminense, 2008.

1. Esquizofrenia. 2. Equivalência Terapêutica. 3. Clozapina-

administração e dosagem. 4. Agentes Antipsicóticos. 5.

Interpretação Estatística de Dados. I. Título

CDD 616.154

MARGARETH DE OLIVEIRA TIMOTEO

ESTUDO DE BIOEQUIVALÊNCIA DA CLOZAPINA EM PACIENTES PSICÓTICOS

NO ESTADO DE EQUILÍBRIO

Dissertação submetida ao Curso de

Pós-Graduação da Faculdade de

Medicina da Universidade Federal

Fluminense como parte dos requisitos

necessários à obtenção do Grau de

Mestre em Ciências Médicas. Área de

concentração: Ciências Médicas.

Aprovada em: 03/12/2008

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________________

Prof. Dr. Luiz Querino de Araújo Caldas - Orientador

UFF

_______________________________________________________

Prof. Dr. Beni Olej

UFF

_______________________________________________________

Prof. Dr. Leandro Machado Rocha

UFF

____________________________________________________

Profa. Dra. Rita de Cássia Elias Estrela Marins

INCA

_________________________________________________

Profa. Dra. Silvana Ramos Farias Moreno - suplente

UFF

______________________________________________________

Prof. Dr. Severo de Paoli - suplente

UFRN

Niterói

2008

Dedico aos pacientes esquizofrênicos,

isolados do convívio “normal”, aos excluídos, cuja

mente está aberta a um mundo particular, rico,

cheio de nuances, desconhecido para a maioria de

nós. Com alguns pude perceber a riqueza interior e

com outros, o completo abandono.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Jesus, Mestre dos mestres, em cuja fonte procuro beber e tornar-me

um ser melhor, por abrir minha mente e meu coração, tornando-me capaz de perceber

em cada indivíduo a Sua presença.

A meus pais, exemplos de vida, dignidade e coragem, pela alegria constante,

pelas preces contínuas e apoio, compartilhando cada vitória com a simplicidade dos

que amam verdadeiramente.

A meus filhos, Rafael, Gabriela e Isabella, a Marcelo, meu marido, a D. Arlette,

sogra amiga, o agradecimento pela vibração, pelo constante apoio e por suas

presenças em minha vida.

A minha família mineira, típica, generosa, alegre, acompanhando cada passo

desse meu caminhar como se fosse a coisa mais importante do mundo.

Ao meu orientador, prof. Luiz Querino de Araújo Caldas, por muito antes desse

mestrado, pela acolhida, pela confiança, pela amizade e, durante o trabalho, pela

presença incentivadora, pelo conhecimento, pelo entendimento silencioso e paciência,

quando alguns momentos particulares difíceis se apresentaram.

Ao prof. Gilberto Perez Cardoso, meu co-orientador, pelo incentivo, atenção

e interesse no andamento desse trabalho.

Ao prof. Beni Olej, incentivador sempre, ético, pelo discernimento, pela

capacidade de ouvir e orientar, de ser um oásis quando tudo parece inóspito.

Ao prof. Guillermo Velarde, pela infinita colaboração na parte estatística e pelas

aulas sempre alegres.

Ao prof. Mauro Vitor Mendlowicz, pelo seu olhar humano e ético ao tratar cada

paciente desse estudo.

À Dra. Silvana Moreno, pela orientação no planejamento da dissertação, pelas

dicas e pelo olhar crítico, sempre importante.

Aos professores do curso de Pós-Graduação em Ciências Médicas da

Universidade Federal Fluminense, pelos ensinamentos, dedicação e estímulo.

Aos queridos amigos farmacêuticos, colaboradores, Felipe Gomes, Jorge Rigo, e

Marcos Sousa, que abraçaram a tarefa diária do laboratório analítico com dedicação,

seriedade, com os quais pude trocar experiências importantes no desenvolvimento do

trabalho e sem os quais seria quase impossível chegarmos a esse momento.

Ao amigo farmacêutico Augusto, pela ajuda na confecção dos gráficos desse

trabalho e pela disponibilidade de ajuda sempre.

Ao Djalma, auxiliar dedicado, cujos cuidados na manutenção do laboratório, com

sua capacidade de organizar, minimizar os problemas, foi de suma importância para a

execução das análises.

À Fátima, incansável na tarefa de ajudar a solucionar os problemas que

apareciam durante os períodos de confinamento dos pacientes, sempre sorridente e

disposta.

A empresa Meizler, pela cessão dos medicamentos, padrões de referência e pelo

apoio analítico.

Aos colegas do curso de Pós-graduação, pela amizade e incentivo.

Aos amigos, queridos, que sempre torcem pelo nosso sucesso.

A todos os profissionais da Clínica EGO, pela colaboração e apoio.

Aos profissionais do Centro de Pesquisa Clínica, por facilitarem algumas tarefas

do dia a dia.

A todos que direta ou indiretamente colaboraram com esse trabalho, um sincero

agradecimento.

"Esse olhar que se voltava sobre ela [loucura] era então um olhar

fascinado, no sentido de que o homem contemplava nessa figura tão

estranha uma bestialidade que era a sua própria e que ele reconhecia

de um modo confuso, como infinitamente próxima e infinitamente

afastada; essa existência que uma monstruosidade delirante tornava

desumana e colocava no ponto mais distante do mundo era

secretamente aquela que ele sentia em si mesmo".

(FOUCAULT, 1995)

RESUMO

INTRODUÇÃO: Clozapina é um derivado dibenzodiazepínico, tricíclico, com potentes

propriedades antipsicóticas. Tem baixa afinidade por receptores D2 e, por isso, não

produz significativa síndrome extrapiramidal, típica dos principais fármacos nessa

categoria, sendo então, considerado como um neuroléptico atípico. É eficaz em

pacientes esquizofrênicos refratários ou intolerantes à terapêutica antipsicótica clássica.

OBJETIVOS: Comparar a biodisponibilidade de comprimidos de Clozapina em plasma

de pacientes psiquiátricos estáveis, tendo como referência 100mg de Leponex®,

Novartis Pharma AG, Suiça, e como teste, 100mg de Zolapin®, Synthon BV –

Holanda, através de método analítico alternativo, para determinar a bioequivalência

entre as formulações. O estudo foi realizado sob condições reais, em pacientes

psiquiátricos masculinos, estáveis, virgens de tratamento com Clozapina, com desenho

experimental randomizado, cruzado, duplo-cego, em duas seqüências, com múltiplas

doses do medicamento de referência e do medicamento em teste.MÉTODOS: Os

pacientes receberam 100 mg da formulação referência ou da formulação teste, duas

vezes ao dia, por 10 dias. No 10º dia de cada fase do estudo, amostras de sangue de

cada paciente foram coletadas às 0 h (antes da administração do medicamento), às

0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3.5, 4, 5, 6, 8, 10 e 12 h após a administração da medicação.

O plasma de cada amostra coletada foi separado e armazenado a -20 °C até o ensaio

analítico. A concentração plasmática da Clozapina foi determinada por cromatografia

líquida de alta eficiência (HPLC). Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados a

partir da concentração plasmática versus tempo obtidas pelo método analítico proposto.

A bioequivalência entre as duas formulações foi avaliada pelo cálculo individual das

concentrações plasmáticas máximas (C

max

) e da comparação das áreas sob a curva

(ASC

0-12h

) obtidas no ensaio. RESULTADOS: Todos os pacientes toleraram bem as

duas formulações de Clozapina. Nenhum efeito adverso sério foi relatado. Todos os

parâmetros farmacocinéticos calculados no presente estudo foram bastante

semelhantes quando comparados teste e referência. O intervalo de confiança 90%

para as médias geométricas das razões de lnC

max

(0.9677 – 0.9937) e lnASC

0-12h

(0.9811 – 1.0029) estava dentro do intervalo de bioequivalência (0.80 a 1.25) segundo

orientações da ANVISA e aceito pelos padrões regulatórios internacionais.

CONCLUSÃO: Os resultados demonstraram que a formulação Teste (Zolapin®) foi

bioequivalente à formulação Referência (Leponex ®), quando administrada por via oral

em pacientes esquizofrênicos, ambos em termos da taxa e extensão da absorção,

podendo ser intercambiável.

Palavras-chave: Clozapina, bioequivalência, biodisponiblidade relativa, estado de

equilíbrio.

ABSTRACT

INTRODUCTION:Clozapine is a dibenzodiazepine derivative, tricyclic, with potent

antipsychotic properties. The drug has low affinity for D2 receptors and therefore, it does

not produce significant typical extrapyramidal syndrome amongst the usual drugs of that

category. It is known as an atypical neuroleptic. Clozapine has been effective in

schizophrenic patients refractory or intolerant to classical antipsychotic therapy.

PURPOSE: To compare the relative bioavailability of two Clozapine formulations - 100

mg tablet Leponex from Novartis Pharma AG, Stein, Switzerland - as a Reference

formulation and 100 mg tablet Zolapin® from Synthon BV – Nijmegen – Holand - as a

Test formulation, through alternative analytical method to assess the bioequivalence

between both formulations. The present study was conducted under actual living

conditions of schizophrenic male patients, virgins of clozapine therapy, using a steady-

state, multiple-dose of both drugs, randomized crossover study design. METHODS: The

subjects received 100 mg twice a day of either the Reference formulation or the Test

formulation for 10 days. At day- 10 of each study phase, blood samples were collected

at 0 h (prior drug administration), 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 5, 6, 8, 10 and

12 h after drug administration. Plasma was separated and stored at -20°C until assay

performed. The plasma concentration of Clozapine was determined by high performance

liquid chromatography (HPLC). Pharmacokinetic parameters were calculated from the

observed plasma-concentration time profiles using a short-cut chemical extraction. The

bioequivalence between the two formulations was assessed by calculating individual

peak plasma concentrations (C

max

) and the area under the concentration-time curve

(AUC

0-12 h

) ratios. RESULTS: All subjects were well tolerated both Clozapine

formulations. No serious adverse effects were reported. All of the pharmacokinetic

parameters calculated in the present study were quite similar either for the Test or the

Reference formulation. The 90% confident interval for both the means ratio lnC

max

(0.9677 – 0.9937) and lnAUC

0-12h

(0.9811 – 1.0029) were within the guidelines range

of bioequivalence (0.80 to 1.25) accepted by international regulatory standards.

CONCLUSION: The result demonstrated that the Test formulation (Zolapin®), was

bioequivalent to the Reference formulation (Leponex®), when orally administered in

schizophrenic patients, both in terms of the rate and extent of absorption, and must be

exchangeable..

Keywords: Clozapine. Bioequivalence. Bioavailability. Steady-state.

SUMÁRIO

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

RESUMO

ABSTRACT

Página

1 INTRODUÇÃO 21

1.1 ESQUIZOFRENIA 22

1.1.1 Sintomas Positivos e Negativos 22

1.1.1.1 Sintomas positivos 22

1.1.1.2 Sintomas negativos 23

1.2 ANTIPSICÓTICOS 24

1.2.1 Antipsicóticos convencionais 24

1.2.1.1 Estrutura química da Clorpromazina 25

1.2.1.2 Estrutura química do Haloperidol 26

1.2.2 Antipsicóticos atípicos 26

1.2.2.1 Clozapina – primeiros estudos 26

1.2.2.1.1 Clozapina – farmacocinética e estrutura química 27

1.2.2.1.2 Clozapina – ação clínica 28

1.2.2.1.3 Clozapina no Brasil 29

1.3 MEDICAMENTOS GENÉRICOS 30

1.3.1 Bioequivalência e Biodisponibilidade 30

1.3.1.1 Bioequivalência 30

1.3.1.2 Biodisponibilidade 31

2 OBJETIVOS 32

3 JUSTIFICATIVA 33

4 MATERIAIS E MÉTODOS 34

Página

4.1 TIPO DE ESTUDO 34

4.2 POPULAÇÃO DO ESTUDO 34

4.3 LOCAL DA PESQUISA 35

5 ETAPA CLÍNICA 37

5.1 EXAMES LABORATORIAIS 37

5.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO 37

5.3 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO 38

5.4 PARTICIPANTES INCLUÍDOS 39

5.5 ESQUEMA DE ADMINISTRAÇÃO DOS MEDICAMENTOS 39

5.5.1 Fase I – Período de entrada 39

5.5.2 Fase II – Fase de estabilização 40

5.5.3 Fase III – Cruzamento 40

5.6 ESQUEMA DO DESENHO DO ESTUDO 41

5.7 CASOS DE RETIRADA DE VOLUNTÁRIOS (“drop outs”) 42

5.8 MEDICAMENTOS UTILIZADOS NO ESTUDO 42

5.9 CONFINAMENTO DOS PACIENTES E ADMINISTRAÇÃO DOS

MEDICAMENTOS 43

5.9.1 Período de “washout” 43

5.9.2 Alimentação e jejum 44

5.9.3 Cronograma de coleta e manuseio de amostras sanguíneas 44

5.9.3.1 Coleta das amostras sanguíneas 44

5.9.3.2 Manuseio das amostras sanguíneas 45

6 ETAPA ANALÍTICA 46

6.1 CONCEITOS E PARÂMETROS DA VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO 46

6.1.1 Matriz utilizada 46

6.1.2 Conceituação dos parâmetros validados 47

6.2 VALIDAÇÃO 49

6.2.1 Linearidade – preparação da curva de calibração 49

6.2.2 Seletividade 49

Página

6.2.3 Precisão 50

6.2.4 Exatidão 51

6.2.5 Estabilidade 51

6.2.5.1 Estabilidade em ciclos de congelamento 52

e descongelamento – curta duração

6.2.5.2 Estabilidade em temperatura ambiente – 52

curta duração

6.2.5.3 Estabilidade de longa duração 52

6.2.6 Recuperação 53

6.3 MÉTODO BIOANALÍTICO 53

6.3.1 Método analítico aplicado 54

6.3.1.1 Extração em fase sólida 54

6.3.2 Marcha analítica 55

7 ETAPA ESTATÍSTICA 57

7.1 PRINCIPAIS MEDIDAS FARMACOCINÉTICAS 57

7.1.1 ASC – Área sob a curva 58

7.1.1.1 Cálculo da ASC 58

7.1.2 Cmax e Tmax – concentração máxima do fármaco 59

e tempo para ocorrer Cmax

7.2 VARIÁVEIS AVALIADAS 59

7.3 APRESENTAÇÃO DE DADOS E ESTATÍSTICA DESCRITIVA 60

8 RESULTADOS 62

8.1 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO 62

8.1.1 Linearidade - curva de calibração 62

8.1.2 Seletividade 64

8.1.2.1 Cromatograma no limite de quantificação – 64

verificando interferentes

8.1.2.2 Tabela de plasmas do teste de seletividade 65

8.1.2.3 Cromatogramas obtidos no teste de seletividade 66

Página

8.1.2.4 Cromatograma de plasma lipêmico 70

8.1.2.5 Cromatograma de plasma hemolisado 71

8.1.3 Precisão intra-dia – Repetitividade 72

8.1.3.1 CQB – controle de qualidade de baixa concentração 72

8.1.3.2 CQM – controle de qualidade de média concentração 73

8.1.3.3 CQA – controle de qualidade de alta concentração 74

8.1.4 Precisão inter-lotes – Reprodutividade 75

8.1.5 Exatidão 76

8.1.5.1 Exatidão intra-dia para CQB 76

8.1.5.2 Exatidão intra-dia para CQM 77

8.1.5.3 Exatidão intra-dia para CQA 78

8.1.5.4 Exatidão inter-lotes 79

8.1.6 Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento 80

8.1.6.1 Estabilidade de curta duração 80

8.1.6.2 Estabilidade de alta duração 81

8.1.7 Estabilidade de curta duração em temperatura ambiente 82

8.1.8 Recuperação 83

8.2 GRÁFICOS GERADOS APÓS ANÁLISES DOS PLASMAS DE PACIENTES 84

8.2.1 Gráfico da concentração/tempo 84

8.2.2 Gráficos de pacientes do estudo 85

8.3 ESTATÍSTICA 89

8.3.1 Comparação das medidas de Tmax e Cmax 89

8.3.2 Análise descritiva das medidas farmacocinéticas 91

8.3.3 Análise descritiva das concentrações plasmáticas 92

por fármaco

8.3.3.1 Fármaco A 92

8.3.3.2 Fármaco B 93

8.3.4 Histogramas de frequência de Cmax 94

8.3.4.1 Fármaco A 94

Página

8.3.4.2 Fármaco B 95

8.3.5 Tabela e gráficos de probabilidade normal 96

após transformação por logaritmo

8.3.5.1 Comparação de ln Cmax e ASC 96

8.3.5.2 Fármaco A – log Cmax 97

8.3.5.3 Fármaco B – log Cmax 98

8.3.6 Bioequivalência para Cmax 99

8.3.7 Bioequivalência para ASC (t_k) 99

8.3.8 Bioequivalência para ASC(∞) 100

9 DISCUSSÃO 101

10 CONCLUSÃO 106

REFERÊNCIAS 107

OBRAS CITADAS 107

OBRAS CONSULTADAS 110

ANEXO I 112

ANEXO II 113

GLOSSÁRIO 114

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Página

FIGURA 1

FIGURA 2

FIGURA 3

FIGURA 4

FIGURA 5

FIGURA 6

Estrutura química da Clorpromazina.

Estrutura química do Haloperidol.

Estrutura química da Clozapina.

Esquema do desenho do estudo.

Estrutura química da Clozapina e da Dothiepina

Esquema da marcha analítica.

FIGURA 7

FIGURA 8

FIGURA 9

FIGURA 10

FIGURA 11

FIGURA 12

FIGURA 13

FIGURA 14

Curva de calibração

Cromatograma de amostra de plasma com Clozapina

e padrão interno (dothiepina).

Cromatograma de amostra de plasma normal,

branco, sem interferentes.

Cromatograma de amostra de plasma normal,

branco, sem interferentes.

Cromatograma de amostra de plasma normal,

branco, sem interferentes.

Cromatograma de amostra de plasma normal,

branco, sem interferentes.

Cromatograma obtido de plasma de paciente com

altos índices de gordura no sangue - com padrão

interno (dothiepina).

Cromatograma obtido de plasma hemolisado

com padrão interno (dothiepina).

FIGURA 15

FIGURA 16

FIGURA 17

FIGURA 18

FIGURA 19

FIGURA 20

FIGURA 21

FIGURA 22

FIGURA 23

FIGURA 24

Média dos dados da concentração de Clozapina no

plasma de 24 pacientes, após administração dos

fármacos A e B.

Gráfico obtido com dados de plasma de paciente

após os dois confinamentos e administração do

fármaco A e fármaco B.

Gráfico obtido com dados de plasma de paciente

após os dois confinamentos e administração do

fármaco A e fármaco B.

Gráfico obtido com dados de plasma de paciente

após os dois confinamentos e administração do

fármaco A e fármaco B

Gráfico obtido com dados de plasma de paciente

após os dois confinamentos e administração do

fármaco A e fármaco B.

Tempo (h) em que ocorreu concentração máxima de

Clozapina no plasma por paciente (N=24)

Histograma de freqüências de Cmax para o fármaco

A, dados originais.

Histograma de freqüências de Cmax para o fármaco

B dados originais

Gráfico de probabilidade normal para Cmax do

fármaco A, dados transformados

Gráfico de probabilidade normal para Cmax do

fármaco B, dados transformados

Página

LISTA DE TABELAS

Página

TABELA 1 Dados de 3 curvas de resposta (ou analíticas)

para determinação da dados de 3 curvas de

resposta (ou curva de calibração) onde foram

plotados os pontos para determinação da

linearidade.

TABELA 2

TABELA 3

TABELA 4

TABELA 5

TABELA 6

TABELA 7

TABELA 8

TABELA 9

TABELA 10

Relação dos plasmas utilizados para o Teste de

seletividade.

Coeficiente de variação (%) de 3 lotes de Plasma

fortificados com 40ng/mL de Clozapina, com 5

replicatas cada, para avaliação do parâmetro

Precisão.

Coeficiente de variação (%) de 3 lotes de Plasma

fortificados com 1800 ng/mL de Clozapina, com 5

replicatas cada, para avaliação do parâmetro

Precisão.

Coeficiente de variação (%) de 3 lotes de Plasma

fortificados com 3200 ng/mL de Clozapina, com 5

replicatas cada, para avaliação do parâmetro

Precisão.

Coeficiente de variação (%) das médias dos

controles CQB, CQM e CQA de 3 lotes de

Clozapina, para avaliação da reprodutividade.

Exatidão (%) das médias de 3 lotes de Clozapina do

controle CQB.

Exatidão (%) das médias de 3 lotes de Clozapina do

controle CQM.

Exatidão (%) das médias de 3 lotes de Clozapina do

controle CQA.

Exatidão (%) das médias de 3 lotes de Clozapina

nos controles CQB, CQM e CQA.

Página

TABELA 11

TABELA 12

TABELA 13

TABELA 14

TABELA 15

TABELA 16

Estabilidade de curta duração – amostras de

diferentes níveis de concentração de Clozapina

submetidas a três ciclos de congelamento /

descongelamento e após, são analisadas e

comparadas com preparações recentes, para

avaliação da estabilidade da Clozapina .

Estabilidade de alta duração – preparações

congeladas a – 20º C por 6 meses são

comparadas com amostras recentes para

avaliação da estabilidade da Clozapina.

Estabilidade em temperatura ambiente -

preparações de diferentes níveis de concentração

de Clozapina são analisadas após ficarem

6 horas em temperatura ambiente e comparadas

com preparações recentes para avaliação da

estabilidade da Clozapina.

Recuperação - médias de 3 lotes de Clozapina nos

controles CQB, CQM e CQA.

Tempo em que ocorreu a concentração máxima de

Clozapina nos 24 pacientes do estudo (n=24)

comparando fármaco A e fármaco B.

Estatísticas das medidas farmacocinéticas do

fármaco A.

TABELA 17

TABELA 18

TABELA 19

TABELA 20

Estatísticas das medidas farmacocinéticas do

fármaco B.

Estatísticas das concentrações plasmáticas (ng/ml)

ao longo do tempo do fármaco A em 24 pacientes

(n=24).

Estatísticas das concentrações plasmáticas (ng/ml)

ao longo do tempo do fármaco B em 24 pacientes

(n=24).

Comparação das médias dos logaritmos de Cmax e

logaritmos de ASC da Clozapina em 24 pacientes

(n=24) após a administração dos fármacos A e B.

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ANOVA - análise de variância

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária.

ASC – área sob a curva

ASC∝ - área sob a curva até a eliminação completa do fármaco

ASCtk – área sob a curva até o último tempo de coleta

CEP - Comitê de Ética em Pesquisa

max

– concentração plasmática máxima

min

– concentração plasmática mínima

CNS/MS– Conselho Nacional de Saúde do Ministério da Saúde

EA – evento adverso

ECG – eletrocardiograma

FDA – Food and Drug Administration - Agência de Administração de Alimentos e

Medicamentos (EUA)

FRC – formulário de registro de caso

HIV – vírus da imunodeficiência humana

HPLC- aparelho de cromatografia líquida de alta pressão

– ácido fosfórico ou ortofosfórico

IC – intervalo de confiança

ICH - conferência internacional de harmonização

L - litro

µL – microlitro

LQ – limite de quantificação

mg – miligramas

mM – milimol

ng – nanograma

POP – procedimento operacional padrão

RE – Resolução específica

rpm – rotações por minuto

SD – desvio padrão

SNVS – Sistema Nacional de Vigilância Sanitária

SPE - extração em fase sólida

TCLE – termo de consentimento livre e esclarecido

Tmax – tempo para atingir a concentração plasmática máxima

UV – ultra-violeta

VIS – visível

1 INTRODUÇÃO

Uma das primeiras referências a problemas mentais de que se tem notícia

está na Bíblia. No Livro dos Juízes do Velho Testamento, há a descrição de

patologias psiquiátricas muito semelhantes às doenças diagnosticadas hoje.

É um problema bem antigo e inerente à espécie humana. Esse atributo do

homem parece ser conseqüência do aperfeiçoamento do nosso sistema nervoso, do

desenvolvimento acentuado do nosso cérebro que, às vezes, se desorganiza.

Embora as doenças mentais fossem conhecidas desde a Antigüidade e haja

na medicina greco-romana e do Oriente descrições pormenorizadas do que era

mania, do que era melancolia e existissem até hipóteses de que a melancolia, por

exemplo, era provocada por falta de melhor oxigenação do cérebro, por acúmulo

de bile negra no sistema nervoso, os recursos terapêuticos eficazes só surgiram no

século XX.

Nos séculos XVII e XVIII, porém, parece que o aumento do número de

portadores de doenças mentais começou a tomar proporções surpreendentes.

Talvez antes disso, o fato de a população estar distribuída de forma mais ou

menos homogênea pela cidade e pelo campo, diluísse a magnitude do problema. O

processo de urbanização fez com que portadores de doenças psiquiátricas graves

se concentrassem nas cidades. Sem dúvida, muitos passaram a perturbar a ordem

pública, foram presos e, com certeza, eliminados por nossos antepassados menos

lúcidos e esclarecidos a respeito do assunto.

Não se pode esquecer de que, durante muito tempo, as doenças psiquiátricas

eram consideradas sinal de bruxaria, de influência do demônio (GENTIL, 2008).

1.1 ESQUIZOFRENIA

A esquizofrenia é uma patologia do sistema nervoso central (SNC) que incide

sobre 1-2% da população mundial, e é responsável por 25% das internações

psiquiátricas.

Sua distribuição independe de sexo, idade, raça e nível sócio-econômico,

representando enorme desafio à neurociência. (MENEGATTI, 2004).

1.1.1 Sintomas Positivos e Negativos

Pacientes com esquizofrenia apresentam frequentemente sintomas psicóticos

positivos e negativos. Essa divisão tem por finalidade dizer de maneira objetiva o

estado do paciente.

Tendo como ponto de referência a normalidade, os sintomas positivos são aqueles

que não deveriam estar presentes, como as alucinações, e os negativos aqueles

que deveriam estar presentes mas estão ausentes, como o estado de ânimo, a

capacidade de planejamento e execução, por exemplo. (CHAVES, 1993).

1.1.1.1 Sintomas positivos

Alucinações – as mais comuns nos esquizofrênicos são as auditivas. O paciente

geralmente ouve vozes depreciativas que o humilham, xingam, ordenam atos que os

pacientes reprovam, ameaçam, conversam entre si falando mal do próprio paciente.

Delírios – Os delírios mais comuns na esquizofrenia são os persecutórios. São as

idéias falsas que os pacientes têm de que estão sendo perseguidos, que querem

matá-lo ou fazer-lhe algum mal.

Perturbações do Pensamento – Há vários tipos de perturbações do pensamento e o

diagnóstico tem que ser preciso porque a conduta é distinta entre o esquizofrênico

que apresenta esse sintoma e um paciente com confusão mental, que pode ser uma

emergência neurológica.

Alteração da sensação do eu – Assim como os delírios, esses sintomas são

diferentes de qualquer coisa que possamos experimentar, exceto em estados

mentais patológicos. Os pacientes com essas alterações dizem que não são elas

mesmas, que uma outra entidade apoderou-se de seu corpo e que já não é ela

mesma, ou simplesmente que não existe, que seu corpo não existe.

1.1.1.2 Sintomas negativos

Falta de motivação e apatia – Esse estado é muito comum, praticamente uma

unanimidade nos pacientes depois que as crises com sintomas positivos cessaram.

O paciente não tem vontade de fazer nada, fica deitado ou vendo TV o tempo todo,

freqüentemente a única coisa que faz é fumar, comer e dormir. Descuida-se da

higiene e aparência pessoal. Os pacientes apáticos não se interessam por nada,

nem pelo que costumavam gostar.

Embotamento afetivo – As emoções não são sentidas como antes. Normalmente

uma pessoa se alegra ou se entristece com coisas boas ou ruins respectivamente.

Esses pacientes são incapazes de sentir como antes.

Isolamento social – O isolamento é praticamente uma conseqüência dos sintomas

acima. Uma pessoa que não consegue sentir nem se interessar por nada, cujos

pensamentos estão prejudicados e não consegue diferenciar bem o mundo real do

irreal não consegue viver normalmente na sociedade.

Os sintomas negativos não devem ser confundidos com depressão. A

depressão é tratável e costuma responder às medicações, já os sintomas negativos

da esquizofrenia não melhoram com nenhum tipo de antipsicótico. (SEEMAN, 2002).

1.2 ANTIPSICÓTICOS

Os antipsicóticos ou neurolépticos são medicamentos inibidores das funções

psicomotoras, a qual pode encontrar-se aumentada em estados, como por exemplo,

de excitação e de agitação.

Esses fármacos foram inicialmente denominados “neurolépticos”, não devido aos

seus efeitos terapêuticos, mas sim devido aos seus efeitos colaterais de “natureza

neurológica”, os efeitos extrapiramidais.(OLIVEIRA, 2000).

Paralelamente eles atenuam também os distúrbios neuro-psíquicos chamados de

psicóticos, tais como os delírios e as alucinações. São substâncias químicas

sintéticas, capazes de atuar seletivamente nas células nervosas que regulam os

processos psíquicos no ser humano e a conduta em animais.

Por serem substâncias lipossolúveis, os neurolépticos têm facilitada sua

absorção e penetração no Sistema Nervoso Central.

O uso contínuo dos antipsicóticos resulta num acúmulo progressivo no

organismo, até que o nível se estabilize depois de alguns dias. O equilíbrio ideal

seria atingir uma situação onde a quantidade absorvida seja igual à excretada. Neste

momento ocorre o chamado equilíbrio plasmático.

1.2.1 Antipsicóticos convencionais

São fármacos empregados na terapia da esquizofrenia, que apresentam

como principais efeitos colaterais os sintomas extrapiramidais e Parkinsonianos. Os

antipsicóticos clássicos mais usados são: Clorpromazina (Amplictil®) e Haloperidol

(Haldol®).

Cerca de 60 a 80% dos pacientes com esquizofrenia podem melhorar com

antipsicóticos convencionais (Clorpromazina (Fig. 1) e Haloperidol) (Fig. 2).

Apesar disso, um percentual expressivo destes pacientes (20 a 40%) não

respondem a doses elevadas destes antipsicóticos, mesmo quando combinados a

outras formas de tratamento psicológico e social. Estes pacientes são chamados

“refratários” ou “resistentes”. (MERCOLINI et al, 2007).

Para serem considerados “refratários” (e assim, elegíveis para o tratamento

com Clozapina) é necessário não ter obtido resposta satisfatória em dois

tratamentos com antipsicóticos (típicos ou atípicos) em doses adequadas, por um

período de 6 semanas cada.

Este grupo de pacientes apresenta alta taxa de morbi-mortalidade, que se

traduz num elevado custo social e familiar.

1.2.1.1 Estrutura química da Clorpromazina

A clorpromazina pertence ao grupo das fenotiazinas, que são constituídas

por uma estrutura química de 3 anéis do tipo benzeno, sendo que o anel do meio

contém enxofre e nitrogênio. A fórmula molecular é C

ClS. Quimicamente é a

3-(2-cloro-10H-fenotiazina-10-yl)-N,N-dimetil-propan-1-amina.

FIGURA 1 - estrutura química da Clorpromazina

Nome comercial: Amplictil®

1.2.1.2 Estrutura química do Haloperidol

Faz parte do grupo das butirofenonas e se caracteriza quimicamente pela

presença do radical 1-fenil-1-butano. A fórmula molecular é C

ClFNO

quimicamente é

1-butanona,4-[4-(4-clorofenil)-4-hidroxi-1-piperidinil]1-(4-fluorofenil)

(GOODMAN & GILMAN, 2001).

FIGURA 2 - estrutura química do Haloperidol

Nome comercial: Haldol®

1.2.2 Antipsicóticos atípicos

Substâncias que apresentam efeitos terapêuticos em doses que não induzem

efeitos extrapiramidais são classificados como antipsicóticos atípicos. Os principais

antipsicóticos são: quetiapina, remoxipride, clozapina, olanzapina, ziprasidona e

amisulprida.

1.2.2.1 Clozapina – primeiros estudos

Antipsicótico atípico de referência, a Clozapina foi testada clinicamente na

década de 60, na Europa.

Infelizmente, observou-se que produzia granulocitopenia ou agranulocitose

em taxa muito mais elevada (1% a 2%) do que aquela observada nos antipsicóticos

convencionais. Isso levou à sua retirada do mercado (OLIVEIRA, 2000).

Em 1988, Kane e colaboradores realizaram um estudo multicêntrico que

testou o uso da Clozapina versus Clorpromazina em pacientes com esquizofrenia,

resistentes ao tratamento convencional. O estudo mostrou que a Clozapina além de

ter uma eficácia superior à Clorpromazina, era bem tolerada pelos pacientes que não

toleravam outros antipsicóticos. Ao contrário dos demais fármacos, a Clozapina

atenuava os sintomas positivos sem ocasionar efeitos extrapiramidais. Além disso,

apresentava eficácia contra os sintomas negativos da esquizofrenia. Um perfil

absolutamente “atípico” para um antipsicótico.

Assim, substâncias que, como a Clozapina, apresentam efeito terapêutico em

doses que não induzem efeitos extrapiramidais, são classificados como

“antipsicóticos atípicos”, em contraposição aos “antipsicóticos típicos” ou

“neurolépticos”.

Com base nesses dados, em 1990, o (FDA) – Food and Drug Administration –

nos EUA, aprovou o uso da Clozapina em pacientes com esquizofrenia refratária,

mas com a condição de que houvesse uma monitorização sangüínea para evitar a

agranulocitose.

1.2.2.1.1 Clozapina – farmacocinética e estrutura química

Clozapina é um derivado dibenzodiazepínico, tricíclico (Fig. 3) com potentes

propriedades antipsicóticas. (JANN, 1991; TARSY, 2002). Quimicamente é o 8-cloro-

11-(4-metil-1-piperazinil)-5H-dibenzo[b,e][1,4] diazepina.

O composto tem baixa afinidade por receptores D2 e, portanto, não produz

significativa síndrome extrapiramidal, típica dos principais fármacos nessa

categoria.

Por isso é considerado como um neuroléptico atípico (GUITTON, 1999; NAHEED,

2001).

FIGURA 3 - estrutura química da Clozapina

Nome comercial: Leponex®

Vários estudos (FISCHER, 1992; NAHEED, 2001) mostram que a Clozapina

tem afinidade significativa para receptores sub-tipo D

, predominantemente corticais,

mas também mantém uma grande afinidade para outros receptores de dopamina.

A afinidade por receptores serotonina 5HT

também contribui para a baixa

incidência de efeitos extrapiramidais e discinesia tardia (BARNES, 1998; BASSITT,

1998).

Clozapina atua como antagonista de receptores adrenérgicos, colinérgicos, e

histaminérgicos e também serotoninérgicos (JANN, 1991; SEEMAN, 2002;

MERCOLINI et al., 2007).

1.2.2.1.2 Clozapina – ação clínica

Clinicamente, a Clozapina produz sedação rápida e acentuada e exerce

potente efeito antipsicótico. Observa-se melhora clínica relevante em cerca de um

terço dos pacientes nas primeiras seis semanas de tratamento e em 30 a 50% dos

pacientes nos quais se mantém o tratamento por até 12 meses.

Ocorre ainda melhora em alguns aspectos de alterações cognitivas e redução

na ocorrência de tentativas de suicídio.

Embora a Clozapina seja eficaz em pacientes esquizofrênicos refratários ou

intolerantes à terapêutica antipsicótica clássica (LLORCA, 2004) e também com uma

boa recuperação, durante a terapia em alguns pacientes com psicose crónica, uma

elevada incidência de agranulocitose (CHANDRASEKARAN, 2008) induzida pelo

agente (1-2% dos doentes) tem restringido o seu uso na prática psiquiátrica mais

abrangente.

Outros efeitos hematológicos incluem leucopenia, neutropenia e eosinofilia

(OLIVEIRA, 2000; TASSANEEVAKUL et al., 2005).

Assim, a Clozapina é normalmente escolhida para pacientes que não

respondem aos neurolépticos típicos ou para aqueles que venham a sofrer de

graves efeitos secundários, tais como síndrome extrapiramidal, usando a mesma

medicação clássica (BARNES, 1998; OLIVEIRA, 2000).

Após a administração oral, a Clozapina é rapidamente absorvida. Há um

extenso metabolismo de primeira passagem e apenas 27 a 50% da dose atinge a

circulação sistêmica inalterada. A Clozapina é metabolizada em vários metabólitos,

mas apenas a norclozapina (desmetilclozapina) é terapeuticamente ativa (NAHEED,

2001).

O tempo de aparecimento da concentração plasmática máxima da Clozapina

após uma única dose oral (75 ou 100 mg) é aproximadamente 90 minutos; sua meia-

vida de eliminação é de 4 a 12 horas (média de 8 horas) e o volume de distribuição é

de 1,6L/Kg (TASSANEEVAKUL et al., 2005).

1.2.2.1.3 Clozapina no Brasil

A Clozapina começou a ser testada no Brasil em estudos abertos a partir de

1970 e foi lançada comercialmente em agosto de 1992 (CHAVES et al, 1993).

Desde então, foi comercializada na forma de medicamento de referência e

como similar, porém sem estudos de biodisponibilidade/bioequivalência que

pudessem caracterizar o medicamento genérico.

1.3 MEDICAMENTOS GENÉRICOS

A introdução de medicamentos genéricos e similares e a realização de

estudos de biodisponibilidade e bioequivalência, de forma rotineira no Brasil, iniciou-

se após a promulgação da chamada Lei dos Genéricos (No. 9787/99).

Baseada em princípios aceitos internacionalmente, esta lei tem permitido a

introdução no mercado de medicamentos seguros, testados, que podem ser

intercambiados com os medicamentos inovadores, e com um expressivo impacto

positivo no preço para o consumidor, particularmente daqueles que são portadores

de doenças crônicas, necessitando a utilização de medicação de forma contínua

(MAKELA, 2003).

1.3.1 Bioequivalência e Biodisponibilidade

1.3.1.1 Bioequivalência

A bioequivalência entre medicamentos administrados pela mesma via

extravascular pode ser avaliada pela comparação dos parâmetros farmacocinéticos

relacionados à biodisponibilidade, ou seja, à quantidade absorvida e à velocidade do

processo de absorção.

Comparam-se dois produtos, administrados por via extravascular, sendo um

deles o referência, geralmente designado como tal pela autoridade regulatória,

que no Brasil é a Agência Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA (ANVISA,

2003; WEIGMANN, 1992; LIU, 2001).

Deste modo, considera-se que dois medicamentos são bioequivalentes

quando apresentam equivalência farmacêutica (mesma forma farmacêutica e

quantidade do mesmo princípio ativo) e, ao serem administrados na mesma dose

molar, nas mesmas condições experimentais, não apresentam diferenças

estatisticamente significativas em relação á biodisponibilidade.

Do ponto de vista prático, formulações bioequivalentes podem ser

intercambiáveis, com o mesmo perfil de eficácia e segurança.

1.3.1.2 Biodisponibilidade

Considera-se biodisponibilidade como a taxa e a extensão na qual uma

molécula ativa é absorvida e torna-se disponível no sítio de ação do fármaco.

Considerando-se que a quantidade de fármaco contida no fluido biológico

está em equilíbrio com o sítio de ação, a biodisponibilidade é determinada através

da medida da concentração do princípio ativo da droga em sangue total, soro ou

outro fluido biológico apropriado, em função do tempo (ROSLAND, 2007;

MERCOLINI, 2007).

Os principais parâmetros farmacocinéticos utilizados para a avaliação da

biodisponibilidade são: o pico de concentração máxima (Cmax); o tempo para

ocorrer o pico (Tmax) e a área sob a curva (ASC).

O estudo atual foi realizado para comparar os perfis farmacocinéticos e para

avaliar a bioequivalência das duas formulações de Clozapina em 24 pacientes

esquizofrênicos sob circunstâncias controladas.(GOLDEN, 2008; GUITTON, 1997;

AVENOSO, 1998).

A formulação do comprimido de Clozapina do teste (Zolapin® – Meizler – 100

mg) foi comparada com a formulação do comprimido de Clozapina da referência

(Leponex® – Novartis – 100 mg), usando um estudo de estado estacionário, com

múltiplas doses, randomizado, cruzado.

2 OBJETIVOS

Determinar a possível bioequivalência de dois medicamentos cujo princípio

ativo é a Clozapina, comparando a formulação do medicamento de referência

(Leponex®, Novartis), com o medicamento teste (Zolapin®, Meizler), de acordo com

os parâmetros farmacocinéticos testados através da medida da concentração da

Clozapina em função do tempo.

Validar um método analítico alternativo – contemplando os parâmetros do

Guia para Validação de Método Analítico e Bioanalítico da RE 899 de 29/05/03 da

ANVISA.

Avaliar as características da biodisponibilidade da formulação de Clozapina

em comprimidos de 100mg, através do método analítico alternativo validado,

utilizando plasma obtido de pacientes psiquiátricos selecionados.

3 JUSTIFICATIVA

O presente estudo oferece uma alternativa analítica para avaliação da

Clozapina, cujo método de análise apresenta elementos que o diferenciam de

outros publicados.

A validação de um método analítico alternativo dá aos laboratórios analíticos

uma liberdade na escolha do método, de acordo com a disponibilidade de materiais,

reagentes, equipamentos, aparelhos, etc.

Por se tratar de um medicamento, cuja determinação da biodisponibilidade

exige que se trabalhe com pacientes e não com voluntários saudáveis, o protocolo

da etapa clínica é diferente dos protocolos usuais e traz para a nossa realidade, um

diferencial importante nos estudos de bioequivalência e biodisponibilidade.

Em geral, e particularmente no caso da Clozapina, que é um medicamento

de preço relativamente alto para os padrões brasileiros, não sendo distribuído na

rede pública, a opção de uso de um medicamento genérico tem um impacto positivo

sobre os custos do tratamento, sendo importante para a adesão e benefícios

esperados.

Uma vez aprovada como formulação genérica, torna-se intercambiável

com o medicamento referência.

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 TIPO DE ESTUDO

Trata-se de estudo com desenho experimental randomizado, cruzado, duplo-

cego em pacientes psiquiátricos estáveis, virgens de tratamento com Clozapina, em

duas seqüências, com múltiplas doses do medicamento de referência (Leponex®,

Novartis) e do medicamento em teste (Zolapin®, Meizler), comparando a

bioequivalência entre ambos, em comprimidos de 100 mg.

Como todo estudo de bioequivalência, o presente estudo foi realizado em três

etapas: etapa clínica, etapa analítica e etapa estatística .

e III – cruzamento

4.2 POPULAÇÃO DE ESTUDO

Estudos anteriores de bioequivalência com a Clozapina, realizados com

voluntários sadios, ocasionaram efeitos adversos sérios, como hipotensão,

bradicardia, síncope e assistolia (CHAVES et al, 1993). Por este motivo, o FDA

publicou em 2003 um guia para estudos de bioequivalência com Clozapina, a ser

conduzido em pacientes psiquiátricos. O presente projeto teve sua metodologia

baseada nesta recomendação do FDA (FDA, 2003).

Foram selecionados 36 pacientes, do sexo masculino, distribuídos em 2

grupos de 18 (n=18), portadores de distúrbio psiquiátrico compatível com grau leve

a moderado de desordem esquizofrênica refratária, regularmente internados na

Clínica Psiquiátrica Ego, de Itaboraí, Rio de Janeiro.

Todos os pacientes e seus responsáveis foram informados sobre a natureza

do estudo e tiveram todas as dúvidas esclarecidas. O Termo de Consentimento Livre

e Esclarecido foi obtido dos pacientes ou de seus responsáveis antes de qualquer

procedimento. O mesmo foi revisado, datado e assinado pelo paciente ou seu

responsável, por um membro da equipe do estudo e mais duas testemunhas,

sendo uma cópia fornecida ao participante e o original foi mantido nos registros

médicos do paciente.

Os pacientes, virgens de tratamento com Clozapina e tratados com

antipsicóticos típicos, tinham idades entre 27 a 52 anos (média de 40.6 ± 7.6); peso

corporal entre 71.7 e 95.0 Kg (média de 82.43 ± 12.4) e IMC (índice de massa

corporal) entre 18 e 34.

Entretanto, somente vinte e quatro (n=24) pacientes completaram todas as

etapas do estudo, devido a problemas técnicos de coleta de amostras sanguíneas

em alguns, cuja quantidade não foi suficiente para guardar amostras de contra-

prova, e em alguns casos, devido ao uso concomitante de outros medicamentos,

na clínica EGO, que poderiam interferir na biodisponibilidade da Clozapina.

4.3 LOCAL DA PESQUISA

O estudo foi realizado no Centro de Pesquisa Clínica da Universidade Federal

Fluminense, cadastrado e aprovado pela ANVISA para a realização de estudos

clínicos controlados nas etapas clínica, analítica e estatística.

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Geral de

Bonsucesso, no Rio de Janeiro sob o número 06/04.

As Diretrizes de Qualidade e o Manual de Procedimentos Operacionais

Padrão do Centro de Pesquisa foram analisados, aprovados e cadastrados pela

ANVISA e estavam de acordo com as Boas Práticas Clínicas e Laboratoriais,

segundo a Resolução 196/96 do CNS/MS e ICH.

As consultas de avaliação foram realizadas nas dependências da Clínica

Psiquiátrica EGO, em Itaboraí, Rio de Janeiro, com a equipe médica local, sob a

supervisão de médico psiquiatra signatário do Protocolo do Estudo.

Os pacientes, após terem sido avaliados pela supervisão clínica da Clínica

EGO (anamnese e exame físico), quando considerados aptos, eram encaminhados

em grupo para as salas de atendimento e internação do Centro de Pesquisa Clínica

durante o período de colheita de amostras, de acordo com o Protocolo de Pesquisa.

5 ETAPA CLINICA

5.1 EXAMES LABORATORIAIS

Os exames laboratoriais de admissão, assim como os exames durante e

após o estudo, foram realizados por laboratório credenciado e certificado –

Laboratório Bronstein Medicina Diagnostica - aprovado pela ANVISA.

A avaliação laboratorial utilizou hemograma completo, ECG de 12

derivações, bioquímica sanguínea (dosagens de glicose, uréia, creatinina, ácido

úrico, sódio, potássio, CPK, triglicerídeos, colesterol total, TGO, TGP, GGT), exame

de urina. Tipo I, conforme previsto na Portaria 116/MS/SNVS, de 08/08/1996.

5.2 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO

• Pacientes psiquiátricos internados que sofriam de psicose crônica (por

exemplo, esquizofrenia) e virgens de tratamento com Clozapina ;

• Idade entre 18 e 59 anos;

• Estar fisicamente saudável determinado através de exame físico (inclusive

ECG e sinais vitais), história médica e hematologia de rotina e testes

bioquímicos, feitos durante a seleção;

• Vontade do responsável de envolver paciente no exame físico pré-estudo e

investigações de laboratório pré – e pós – estudo;

• Habilidade do responsável em compreender e vontade para assinar o Termo

de Consentimento Informada, Livre e Esclarecido – TCLE - após a informação

ter sido disponibilizada verbalmente e por escrito.

5.3 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO

• Histórico de reações alérgicas a outro psicotrópico quimicamente relacionado

com a Clozapina;

• Concomitância de desordens neurológicas ou psiquiátricas primárias,

incluindo desordem orgânica mental, discinesia tardia severa ou doença de

Parkinson idiopática;

• Leucograma abaixo de 3.500 céls/ml ou neutrófilos abaixo de 2.000 céls/ml;

• Histórico de granulocitopenia ou desordens mieloproliferativas;

• Hipotensão ortostática significativa, definida como queda de 30 mmHg ou

mais na pressão sistólica e/ou 20 mmHg ou mais na diastólica, ao se levantar;

• Condição médica ou cirúrgica que possa interferir com a absorção,

metabolismo, ou excreção de Clozapina;

• Histórico de epilepsia ou risco de convulsões;

• Uso concomitante de outras drogas capazes de deprimir a hematopoiese;

• Testes positivos para abuso de drogas ou álcool na triagem ou em condições

basais;

• História de dependência de álcool ou drogas no período de 6 meses antes do

início do estudo;

• Expectativa de falha na adesão ao esquema de medicação;

• Prova positiva para antígeno de HIV, infecção ativa por Hepatite B.

5.4 PARTICIPANTES INCLUÍDOS

Na primeira etapa do estudo, participaram 36 pacientes psiquiátricos, do sexo

masculino, recrutados e incluídos, por encaminhamento pelo psiquiatra assistente,

após avaliação clínico-laboratorial e assinatura de Termo de Consentimento

Informado, por parte do seu responsável legal, (ou do paciente, quando considerado

apto), segundo os procedimentos operacionais do Centro de Pesquisa Clínica da

UFF.

Devido a problemas com medicação, 2 pacientes foram excluídos ainda na

primeira etapa do estudo e 34 dos pacientes randomizados completaram a Etapa

Clínica, dos quais 24 foram incluídos nas Etapas Analítica e Estatística, pois nestes

não houveram desvios dos critérios estabelecidos.

5.5 ESQUEMA DE ADMINISTRAÇÃO DOS MEDICAMENTOS

A administração dos medicamentos seguiu o seguinte esquema:

5.5.1 Fase I – Período de entrada:

Os 36 voluntários, virgens de tratamento com Clozapina, receberam doses

crescentes do medicamento de referência (Leponex®),

Para o fracionamento, foram usados os medicamentos de referência

Leponex® de 25 mg e de 100 mg, cujas análises físico-químicas foram realizadas no

Laboratório Universitário Rodolpho Albino – LURA, da UFF.

A adesão ao medicamento foi garantida pela equipe médica e multidisciplinar

da clínica EGO.

A seguir o esquema de administração do medicamento nessa fase:

Dias 1 : 12,5mg a cada 12 horas;

Dias 2 e 3: 25mg a cada 12 horas;

Dias 4: 50mg pela manhã e 75mg à noite;

Dias 5 e 6: 75mg a cada 12 horas;

Dias 7: 100mg a cada 12 horas.

5.5.2 Fase II – Fase de Estabilização:

Após a fase de entrada, os pacientes estabilizados considerados aptos para o

estudo (34 pacientes) eram randomizados em dois grupos (A e B), recebendo

100mg a cada 12 horas do medicamento de referência ou do teste.

Esta fase durou 10 dias (do dia 8 ao dia 17). Ao final deste período, os

pacientes foram confinados no Centro de Pesquisa Clínica da UFF, onde tiveram

colhidas as amostras de sangue para análise.

5.5.3 Fase III – Cruzamento:

Os dois grupos de pacientes (A e B) eram cruzados em relação ao tipo de

medicamento recebido, (Fig. 4), continuando com 100mg a cada 12 horas, por mais

10 dias (dias 18 a 27).

Ao final deste período, ocorria novo confinamento para coleta de amostras

para análise.

Após as 3 fases da etapa clínica, de acordo com a avaliação do Psiquiatra

Assistente, os pacientes continuaram a receber a dose de 100mg a cada 12 horas,

ou tiveram sua dose ajustada para outra clinicamente mais efetiva, neste caso, do

medicamento de referência.

5.6 ESQUEMA DO DESENHO DO ESTUDO

Medicamento referência x Medicamento em estudo

Fase I – entrada (n=36)

(dias 1 a 7) medicamento referência

“drop outs”

(n=2)

(n=34)

Medicamento referência Medicamento teste

Fase II- estabilização Grupo I Grupo II

(dias 8 a 17) (n=17) (n=17)

Medicamento referência Medicamento teste

Fase III – cruzamento Grupo II Grupo I

(dias 18 a 27) (n=17) (n=17)

FIGURA 4 – esquema do desenho do estudo

--------------------

“Drop outs” é uma expressão em inglês que significa abandono, retirada do estudo.

5.7 CASOS DE RETIRADA DE VOLUNTÁRIOS (“Drop outs”)

Um voluntário foi excluído logo ao início do estudo, quando constatou-se a

ocorrência de plaquetopenia prévia ao início da medicação de estudo. Este

voluntário foi encaminhado e tratado no Serviço de Hematologia do Hospital

Universitário Antonio Pedro.

Um segundo voluntário foi retirado por apresentar neutropenia (contagem de

neutrófilos abaixo de 2000 céls/ml), conforme critério de exclusão do Protocolo. Após

ter a medicação suspensa ainda na fase de entrada, utilizando o medicamento de

referência (Leponex®), seu acompanhamento posterior demonstrou recuperação

satisfatória dos níveis de neutrófilos. Neste caso, considerou-se o evento como

resultante da administração da droga de estudo.

5.8 MEDICAMENTOS UTILIZADOS NO ESTUDO

O medicamento teste foi oferecido pelo patrocinador enquanto que o produto

de referência foi comprado no mercado farmacêutico.

Medicamento referência – comprimido de Clozapina de 100 mg, nome

comercial Leponex®, da fabricante Novartis, lote ZO 007, prazo de validade maio de

2007, e o medicamento teste, Zolapin®, comprimido de 100 mg de Clozapina da

fabricante Meizler, lote 04H13GAC, expirando a validade em agosto de 2007.

As análises de equivalência farmacêutica foram realizadas pelo Laboratório

Universitário Rodolpho Albino, da UFF, e os laudos encaminhados ao Centro de

Pesquisa Clínica e anexados ao estudo.

Por ocasião do término dos ensaios, foi quebrado o código duplo-cego,

constatando-se que o medicamento A= teste, ou seja, Zolapin® e o medicamento

B= referência, isto é, o Leponex®.

5.9 CONFINAMENTO DOS PACIENTES E ADMINISTRAÇÃO DOS MEDICAMENTOS

Os pacientes selecionados do estudo foram admitidos no Centro de Pesquisa

Clinica, da Universidade Federal Fluminense, localizado no 4

. andar do Hospital

Universitário Antonio Pedro, as 07:00 horas da manhã, e estavam acompanhados

da equipe de saúde da Clínica EGO.

Na admissão, eram imediatamente examinados individualmente pela equipe

médica, os sinais vitais eram aferidos entre 13 e 14 horas e recebiam a alta médica

às 20 horas, após novo exame clínico.

Todos os pacientes admitidos já haviam sido incluídos na dosagem

terapêutica normal de Clozapina (Fase I – Estabilização), permanecendo na mesma

dose por um período 10 dias para o cruzamento do estudo nas semanas seguintes.

A dose diária de 200 mg (dividida em duas de 100mg) foi igual para cada

grupo testado. Os pacientes receberam o produto pertinente (de acordo com a Lista

de Randomização – Anexo I) às 08:00 e as 20:00h, ingerido com 120 ml de água

filtrada .

5.9.1 Período de “washout”

Considerando o tipo de desenho experimental realizado, não houve período

de “washout”

entre os dois tratamentos (teste e referência). Após o primeiro

confinamento, os grupos de pacientes foram cruzados e começaram imediatamente

a utilizar o outro medicamento, por dez dias, até o segundo período de

confinamento.

--------------------

“wash out” significa período de eliminação, que é definido como um intervalo de tempo

suficientemente grande entre dois períodos de tratamentos para que o efeito residual de uma

formulação administrada num período seja eliminado das unidades experimentais até o próximo

período (ANVISA, 2003)

5.9.2 Alimentação e Jejum

Durante as etapas de entrada e estabilização, os voluntários tiveram dieta

livre, conforme a rotina da Clínica EGO.

Nos dias de confinamento, após jejum de 12 horas, iniciou-se a coleta de

amostras. O medicamento foi administrado com 120ml de água.

Durante a estadia no Centro de Pesquisa os pacientes receberam

alimentação conforme esquema dietético (Anexo II) preconizado por nutricionista da

equipe.

5.9.3 Cronograma de coleta e manuseio de amostras sanguíneas

No décimo dia de cada período de estabilização, os pacientes eram

transportados para o Centro de Pesquisa Clínica, no 4º andar do Hospital

Universitário Antônio Pedro, onde permaneceram por 12 horas, sob supervisão

médica e psiquiátrica e para a coleta de amostras para análise.

5.9.3.1 Coleta das amostras sanguíneas

Amostras de sangue venoso (10 mL) eram coletadas através de cateter

venoso individual de demora do tipo “butterfly” durante todo o período do ensaio

(i.e.12 horas).

Quando havia formação de coágulo no catéter antes das 12 h previstas, este

era removido ou substituído. Se o catéter fosse removido, as amostras de sangue

subseqüentes eram coletadas através de venopunctura. Poucas foram estas

ocorrências.

Registrou-se individualmente em cada Formulário de Registro de Caso –

FRC, o tempo real de coleta de sangue.

As amostras de sangue foram coletadas às 0 h (antes da administração do

medicamento) e às 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3.5, 4, 5, 6, 8, 10 e 12 h após a

administração da medicação.

5.9.3.2 Manuseio das amostras sanguíneas

Nos próximos 30 minutos pós-coleta, fazia-se a centrifugação do sangue a

1200g, em temperatura ambiente (25

.C), por 10 minutos; o sobrenadante de cada

amostra era então dividido em 2 alíquotas e transferido a tubos de plástico

identificados.

Todos os tubos possuíam etiquetas com a seguinte informação: nº. do estudo,

analito, dia e hora, número do paciente, número da amostra e período de

tratamento.

As amostras de plasma eram armazenadas adequadamente em condições

suficientes para manter as amostras em um estado congelado em um freezer a –

20ºC, nas dependências do Laboratório Analítico até à realização dos ensaios

analíticos.

A concentração plasmática da Clozapina foi determinada por cromatografia

líquida de alta eficiência (HPLC PerkinElmer series 200) com detector UV-VIS a 245

nm.

6 ETAPA ANALÍTICA

6.1 CONCEITOS E PARÂMETROS DA VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO

O processo de validação é essencial para definir se uma metodologia

desenvolvida está completamente adequada aos objetivos a que se destina, a fim de

se obter resultados confiáveis que possam ser satisfatoriamente interpretados.

De acordo com as normas de estudos de bioequivalência estabelecidas pela

ANVISA, para a validação de método bioanalítico, devem ser determinados os

seguintes parâmetros: linearidade, limite de quantificação, seletividade, exatidão,

precisão (repetitividade e reprodutibilidade) e estabilidade de curta e longa duração

(ANVISA - RE Nº 899). A recuperação é determinada na pré-validação.

6.1.1 Matriz utilizada

Em estudos bioanalíticos utiliza-se uma matriz biológica que vem a ser um

material individualizado de origem biológica que pode ser amostrado e processado

de maneira reprodutiva. Podem ser usados sangue, plasma, urina, saliva, etc.

A matriz utilizada para validação do método analítico em nosso estudo foi

plasma humano obtido de voluntários no HUAP e do Laboratório Bronstein.

6.1.2 Conceituação dos parâmetros validados

Os conceitos a seguir são os constantes do Manual de Boas Práticas em

Biodisponibilidade/ bioequivalência da Agência Nacional de Vigilância Sanitária –

ANVISA, do ano de 2002.

Analito é um composto químico específico que é mensurado o qual pode ser um

fármaco intacto, biomolécula ou seu derivado, metabólito e ou produto de

degradação em uma matriz biológica.

Branco: é uma amostra de matriz biológica na qual nenhum analito foi adicionado e

é utilizada para nortear a seletividade e especificidade do método analítico.

Seletividade é a habilidade do método analítico de diferenciar e quantificar o analito

na presença de outros constituintes da amostra e se refere diretamente à resposta

para um simples analito.

Limite de Quantificação - LQ - é a menor quantidade de um analito na amostra que

pode ser quantitativamente determinada com aceitável precisão e exatidão. Também

conhecido como Limite Inferior de Quantificação.

A linearidade de uma metodologia analítica é a capacidade de demonstrar que os

resultados obtidos são proporcionais à concentração do analito dentro de um

intervalo especificado. O critério mínimo de aceitação do coeficiente de correlação

linear (R

) deve ser igual ou superior a 0,98.

Estabilidade - a avaliação da estabilidade das soluções utilizadas no método

analítico é de suma importância, já que uma degradação do analito ou dos

constituintes da matriz durante a estocagem ou análise da amostra podem afetar a

exatidão dos resultados.

A ANVISA

estabelece ensaios envolvendo ciclos de congelamento e de

descongelamento, em períodos de curta e longa duração, além de verificar também

a estabilidade do(s) analito(s) em soluções padrão.

Precisão é um parâmetro que descreve a proximidade de medidas individuais de um

analito quando o procedimento do método proposto é aplicado repetidamente a

múltiplas alíquotas de um único volume de matriz biológica fortificada com analito e

padrão interno.

A precisão de métodos analíticos é uma medida de erro aleatório e é definida

como concordância entre várias medidas da mesma amostra, sendo expressa como

percentual do coeficiente de variação (CV%) dessas medidas.

Para a validação de métodos em um único laboratório, duas etapas são

relevantes para esse parâmetro: precisão intra-ensaio ou repetibilidade, que

descreve as variações observadas durante uma única corrida analítica e, precisão

inter-ensaios ou reprodutibilidade que descreve o grau de variações, obtida por

meio de alteração de condições, como mudança de analista, reagentes ou

equipamento, ou utilização do método durante várias semanas ou meses,

observadas em diferentes corridas analíticas (PASCHOAL et al., 2008).

Seguem os critérios que o Manual de Boas Práticas em biodisponibilidade e

bioequivalência da ANVISA (2003, p.66) indicam para avaliar a precisão e que foi

seguido em nosso trabalho:

“A precisão deve ser medida usando um mínimo de cinco determinações

por concentração. Um mínimo de três concentrações pertinente a toda faixa

de estudo é recomendado.

A precisão determinada a cada nível de concentração não deve exceder

15% em coeficiente de variação (CV) exceto no limite mínimo de

quantificação, o qual não deve desviar mais de 20% em CV.

A precisão é posteriormente subdividida em precisão ou repetitividade

dentro da corrida ou intra lote, que fornece a precisão durante uma única

corrida analítica, e precisão ou reprodutividade entre corridas ou inter

loteque mede a precisão ao longo do tempo, podendo envolver diferentes

analistas, equipamentos, reagentes e laboratórios

.”

Exatidão de um método analítico descreve a proximidade da média dos resultados

obtidos em um teste com o valor real (concentração) do analito.

Recuperação é a quantidade do analito obtida após o processo de separação. A

quantificação é comparada com a concentração nominal de um padrão adicionada à

matriz biológica antes do processo de separação. A recuperação indica a eficiência

da extração de um processo analítico.

6.2 VALIDAÇÃO

6.2.1 Linearidade – preparação da curva de calibração

No nosso estudo a linearidade foi avaliada através da construção de uma

curva de calibração, com os seguintes parâmetros:

Branco: amostra de plasma branco sem padrão interno, aplicando o procedimento

do método analítico proposto.

Amostra zero: amostra de plasma branco com padrão interno passando pelo

procedimento do método analítico proposto.

Amostras não-zero: amostras de plasmas brancos fortificados com analito em

diferentes concentrações e padrão interno, passando pelo procedimento do método

analítico proposto.

6.2.2 Seletividade

Substâncias potencialmente interferentes numa matriz biológica incluem

componentes endógenos da matriz, metabólitos, produtos de decomposição, e

durante o estudo, medicação tomada concomitantemente e outros possíveis

interferentes.

O “Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos” da ANVISA

recomenda que para a seletividade, análises de amostras “branco”, da matriz

plasma, devem ser obtidas de pelos menos seis fontes:

04 plasmas normais; 01 plasma lipêmico; 01 plasma hemolisado (Tab. 2).

Qualquer amostra “branca” com interferência significativa no tempo de

retenção do analito ou do padrão interno deve ser rejeitada (Fig. 8 a 13).

A seletividade deve ser assegurada no limite de quantificação (LQ), que é a

menor concentração medida com precisão e exatidão aceitáveis. A resposta de

picos interferentes no tempo de retenção do analito deve ser inferior a 20% da

resposta do LQ.

6.2.3 Precisão

Foram preparadas amostras de plasmas fortificados com analito em 3 níveis:

Controle de Qualidade de Alta concentração - CQA (3200 ng/mL), Controle de

Qualidade de Média concentração - CQM (1800 ng/mL) e Controle de Qualidade de

Baixa concentração - CQB (40 ng/mL) ,suficientes para 5 extrações em cada nível.

Foram retiradas 5 alíquotas de cada concentração e aplicado o procedimento

de extração do método proposto.

A precisão foi determinada em cada nível de concentração através do

coeficiente de variação (CV). A precisão assim obtida corresponde à precisão intra-

dia, ou seja, repetitividade avaliada dentro de uma mesma corrida analítica (Tab. 3, 4

e 5).

Além disto, foi obtida a precisão inter-lotes, a qual avalia a reprodutibilidade

entre corridas analíticas. A Reprodutividade foi aplicada sobre as medidas da

Repetitividade (Tab. 6).

Aceita-se como reprodutível o CV das médias dos lotes de CQB, CQM e CQA

inferior a 15%.

6.2.4 Exatidão

A ANVISA recomenda que a exatidão deve ser determinada pela repetição

de análises de amostras contendo concentrações conhecidas do analito.

No nosso estudo usamos cinco determinações por concentração,

contemplando a faixa linear da curva analítica, com três níveis de concentração:

CQB, CQM e CQA (Tab. 7, 8, 9 e 10).

O valor médio deve estar igual ou maior que 85% do valor real, exceto no

limite de quantificação, no qual não deve estar abaixo de 80%.

Após calcularmos a média da concentração de Clozapina em cada lote de

cada concentração, aplicamos a seguinte fórmula:

% Exatidão = Média dos valores obtidos x 100%

Valor esperado

6.2.5 Estabilidade

Os estudos prévios de estabilidade em matrizes biológicas são essenciais

para fornecer os parâmetros de adequabilidade do método em amostras

envelhecidas e condições de armazenamento das amostras para os estudos

analíticos da bioequivalência.

Tais estudos permitem a confiabilidade necessária ao método, pois os

resultados a serem fornecidos não correrão risco de serem rejeitados por erros de

metodologia, quando a amostra é submetida a processo de envelhecimento

(ANVISA, 2003),

6.2.5.1 Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento – curta

duração

A estabilidade de congelamento e descongelamento foi determinada

armazenando amostras em 3 diferentes níveis de concentração (CQA, CQM e CQB)

no freezer (-20

C) seguida de descongelamento natural à temperatura ambiente.

Após 3 ciclos de congelamento e descongelamento (congelamento por 24

horas), as amostras foram extraídas e, posteriormente, injetadas no sistema

cromatográfico. Os resultados obtidos foram comparados com amostras recém

preparadas nas mesmas concentrações (Tab. 11).

6.2.5.2 Estabilidade em temperatura ambiente – curta duração

A estabilidade de curta duração foi avaliada preparando-se 3 replicatas de

cada tipo de amostra em 3 diferentes níveis de concentração (CQA, CQM e CQB) e

mantendo-as em temperatura ambiente por 6 horas.

Após este tempo, as amostras foram extraídas e injetadas no sistema

cromatográfico. A concentração final foi comparada com a concentração obtida de

amostras recém preparadas (Tab. 13).

6.2.5.3 Estabilidade de Longa Duração

A estabilidade em longo prazo foi avaliada com amostras nos níveis baixo,

médio e alto de concentrações mantidas em freezer (-20

C) por 6 meses.

Após esse tempo, 3 replicatas das amostras de nível de concentração baixo

(CQB), médio (CQM) e alto (CQA) foram extraídas e injetadas no sistema

cromatográfico. A concentração final foi comparada com a concentração obtida de

amostras recém preparadas (Tab. 12).

6.2.6 Recuperação

A recuperação foi avaliada em 3 níveis de concentração, CQA, CQM e CQB

com 3 replicatas de cada e executando o método proposto. A seguir, o teor medido

do componente adicionado foi dividido pelo valor efetivamente adicionado e

multiplicado por 100, obtendo-se assim a percentagem de recuperação.

6.3 MÉTODO BIOANALÍTICO

O método para análise quantitativa de Clozapina no plasma contendo a

substância de referência ou teste e respectivos controles de qualidade (com padrão

de referência e padrão interno) foi desenvolvido para ser executado por

cromatografia líquida de alta performance (HPLC), com extração em fase sólida.

As amostras obtidas na etapa clínica foram armazenadas até o

processamento analítico, segundo procedimento operacional padrão.

A etapa analítica foi executada no Laboratório Analítico do Centro de

Pesquisa Clínica do Hospital Universitário Antônio Pedro, da UFF, no 2º andar do

prédio da Emergência.

O padrão interno – PI - utilizado foi a Dothiepina, cuja estrutura química é

bastante semelhante à Clozapina, conforme mostra a figura 5, abaixo:

Dothiepina – PI Clozapina

FIGURA 5 – estrutura química da dothiepina e da clozapina

As dosagens foram feitas por HPLC (Perkin-Elmer Series 200), com detector

UV-VIS (Perkin Elmer) capaz de detectar Clozapina a partir de 0.005 µg/mL com

limite de quantificação de 19,53 nanogramas/mL.

6.3.1 Método analítico aplicado

Inicialmente, o plasma foi aquecido a 37°C em banho-maria Quimis®,

sendo colocado em tubos de polipropileno, agitados por 10 min em vórtice Quimis®,

seguido por centrifugação em centrífuga EL-3878 por 1 minuto a 3000 rpm.

Na sequência, 0,5 mL de amostra de plasma foram transferidos para tubos

Eppendorf e 100μL do padrão interno (Dothiepina 23,6 mg/mL) foram adicionados e

misturados por alguns instantes.

Após esse período, 1 mL de tampão fosfato H

(50 mM) pH ajustado para

10,0 com solução de NaOH (4 M)] foi acrescentado e misturado suavemente.

6.3.1.1 Extração em fase sólida

As amostras de plasma preparadas foram pré-tratadas por meio de extração

em fase sólida (SPE) com set-Pak®, Vac, Waters®, cartuchos (microcolunas) de

100 mg tC18, que foram previamente equilibrados com 1 mL de metanol e 0,3 mL de

tampão fosfato, sob vácuo suave.

A seguir, as amostras de plasma preparadas, (2 x 0,7 mL), foram carregadas

para os cartuchos de extração sob vácuo suave. Em seguida, as microcolunas foram

lavadas com 0,5 mL de tampão fosfato e 2 x 0,75 mL de uma mistura de metanol e

água(1:1), sempre sob vácuo.

Os analitos foram eluídos com 0,3 mL de uma mistura de fase móvel e

acetonitrila (6:4) também sob vácuo suave e 20 μL dessa eluição foram injetados

para o sistema de HPLC.

A detecção em UV foi feita a 245 nm e gerou cromatogramas para cada

amostra injetada.

No estudo foram gerados aproximadamente 1200 cromatogramas, cujos

dados foram transformados em gráficos, sendo substrato para o estudo estatístico.

Uma amostragem desses gráficos encontra-se nesse trabalho (Fig. 14 a 18).

6.3.2 Marcha analítica

A marcha sistemática tem os parâmetros resumidos a seguir:

Fase móvel: ácido o-fosfórico ( 10 mM): acetonitrila ( 7:3) + Trietilamina ( 4 mL/L )

+ N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina ( 2 mL/L) + H

( 85%)

Sistema: isocrático

Fluxo: 1,0 mL/min

Coluna: M-N Licrospher RP 18e-125 x 3 mm

Comprimento de Onda: 245nm

Loop: 20 µL

Temp. de trabalho: 22º C

Tempo corrida: 7,5 min

A Figura 6 mostra o esquema da marcha analítica:

Descongelar amostra plasmática (b.m. 37º C)

vórtex e centrifugar 1 min

aliquotar plasma ( 0,5 mL)

0,1 mL Padrão Interno (Dothiepina 23,6 mg/L) – vórtex

adicionar tampão fosfato (1 mL) - vórtex

extração fase sólida em colunas C18 ( sistema SEP-PAK, Vac, Waters)

amostragem plasma ( 2 x 0,7 mL ) ( vácuo )

lavagem c/ tampão fosfato + metano/água ( vácuo )

eluição ( mistura fase móvel + acetonitrila – 6:4 ) ( vácuo )

injetar 20 µL no HPLC

cromatogramas - detecção em UV ( 245 nm )

FIGURA 6 – esquema da marcha analítica

7 ETAPA ESTATÍSTICA

Quando um fármaco é administrado no organismo, ele geralmente atravessa

as fases de absorção, distribuição, metabolização, e finalmente, eliminação.

Dessa forma, a biodisponibilidade é geralmente determinada pelas medidas

farmacocinéticas, ou seja, aquelas que se relacionam com a quantidade de fármaco

absorvido e com a velocidade do processo de absorção.

Essas medidas podem ser obtidas a partir de resultados da quantificação do

fármaco em líquidos biológicos. No nosso estudo, a matriz utilizada foi o plasma,

após administração extravascular com dose múltipla.

Um estudo de bioequivalência refere-se basicamente à comparação das

principais medidas farmacocinéticas observadas no experimento, relativas aos

produtos a serem testados.

7.1 PRINCIPAIS MEDIDAS FARMACOCINÉTICAS

As medidas farmacocinéticas avaliadas na bioequivalência derivam diretamente

da curva de concentração do medicamento ao longo do tempo.

São elas: a área sob a curva de concentração versus tempo (ASC), a

concentração máxima observada (Cmax), e o tempo no qual essa concentração foi

alcançada (Tmax).

7.1.1 ASC – Área sob a curva

A primeira e mais importante medida avaliada é a área sob a curva de

concentração plasmática do fármaco (ASC) versus tempo, freqüentemente utilizada

para medir a extensão da absorção, ou o montante total da substância absorvida

pelo organismo, após administração de dose única de um medicamento.

A determinação da bioequivalência entre dois medicamentos resulta da

comparação das ASCs obtidas no experimento.

Através de sua representação matemática observa-se que esta medida é

diretamente proporcional à quantidade de fármaco efetivamente absorvido e

disponível para ser distribuído no organismo, ou seja, sua velocidade de eliminação

total a partir do volume de distribuição em velocidade constante.

7.1.1.1 Cálculo da ASC

Em geral, o cálculo da ASC do tempo zero até o tempo da última coleta (t k )

utiliza o método do trapezóide que consiste na soma das áreas dos trapézios

determinados pelos tempos de coleta e respectivas concentrações.

Por exemplo, C

, C

,..., C

, são as concentrações obtidas em um

experimento para os tempos de coleta 0, t, t

, ..., t

, respectivamente.

A área sob a curva de concentração versus tempo (ASC) pode também ser

extrapolada e calculada do tempo zero até o tempo relativo à completa eliminação

do fármaco, citada na literatura como a área sob a curva do tempo zero a infinito.

A porção adicional é expressa por uma relação entre a última concentração

medida C

e a constante de velocidade de eliminação do fármaco K

A constante de eliminação é calculada para cada voluntário como o

coeficiente de inclinação da reta de regressão ajustada nos 4 a 6 últimos valores de

concentração transformados em log 10 , multiplicada por -2,303.

De acordo com a legislação vigente no Brasil, a área sob a curva do tempo

zero ao tempo tk, deve ser igual ou superior a 80% da área sob a curva de zero a

infinito.

7.1.2 Cmax e Tmax – concentração máxima do fármaco e tempo para ocorrer

Cmax

Cmax é a medida que representa a maior concentração do fármaco

observada e é diretamente proporcional ao montante total de droga absorvido pelo

organismo.

Tmax é o tempo de coleta no qual foi observada a ocorrência de Cmax e

relaciona-se com a velocidade de absorção do fármaco.

A determinação da bioequivalência entre dois medicamentos, inclui também a

comparação das medidas de Cmax e Tmax obtidas no experimento para cada uma

das formulações (medicamentos teste e referência).

7.2 VARIÁVEIS AVALIADAS

Para comparar a taxa e extensão de absorção de Clozapina depois de

administração dos 2 produtos (referência/teste), foram calculadas as variáveis

farmacocinéticas listadas abaixo, considerando-se administração de 100mg das

drogas (referência/teste) com intervalos de 12 horas entre si, a partir da

estabilização da concentração sérica do agente, para cada paciente e produto,

usando os intervalos de amostragem descritos anteriormente (relativos ao momento

da administração do medicamento) :

• Concentração Máxima estabilizada (Cmax, est);

• Concentração Mínima estabilizada (Cmin,est);

• Tempo da Concentração Máxima (TCmax);

• Área sob a Curva (ASC) na concentração Plasmática estabilizada (ASC, est,

normal ou logaritmicamente tranformada).

As variáveis dose-dependentes Cmax,est, Cmin,est e ASC,est foram

normalizadas para uma dose de 100 mg de Clozapina, de 12 em 12 horas, durante

7 dias. As variáveis normalizadas foram chamadas de Cmax,est,norma,

Cmin,est,norma e de ASC,est,norma.

A variável ASC,est,norma foi considerada a medida primária da extensão de

absorção (biodisponibilidade) de Clozapina.

7.3 APRESENTAÇÃO DE DADOS E ESTATÍSTICA DESCRITIVA

As concentrações plasmáticas individuais de Clozapina, assim como os

intervalos de amostragem para cada medicamento foram tabulados para cada

paciente, no respectivo tempo de coleta, bem como a estatística descritiva para cada

produto no respectivo tempo de amostragem (Tab 14 e Fig.19).

A concentração plasmática de Clozapina versus os perfis individuais de tempo

para cada paciente e produto, assim como a concentração plasmática média de

Clozapina versus o perfil de tempo médio são apresentados graficamente para cada

produto (Fig. 14 a 18).

Foram tabulados os valores plasmáticos das variáveis farmacocinéticas

individuais de Clozapina por cada paciente e produto, com a estatística descritiva por

produto (Tab. 15 a 18).

Foram plotados pontos (Scatterplot) do medicamento de referência versus o

produto teste com base nas variáveis farmacocinéticas Cmax,est,trans,

Cmin,est,trans, T max, e ASC,est,trans, que são apresentados graficamente log-

transformadas (Tab. 19).

A bioequivalência entre os produtos reflete-se nos pontos justapostos à linha da

unidade (Fig. 22 e 23).

As relações entre as variáveis farmacocinéticas Cmax,est,trans, Cmin,est,trans,

Tmax e ASC,est,trans, foram usadas para comparar os resultados obtidos com o

medicamento teste em relação ao de referência .

Foram usadas a análise de variância (ANOVA) com sequência, paciente

(sequência), por produto e no período do ensaio após a transformação logarítmica

dos dados.

Os pontos foram estimados e os intervalos de confiança a 95% calculados para a

razão média de teste/referência dessas variáveis são apresentados.

A bioequivalência do produto teste e a do medicamento de referência foi

avaliada com base no intervalo de confiança de 95%

para variável primária

ASC,est,norm, em relação ao escopo de bioequivalência convencional de 80% a

125% transformadas logaritmicamente para o intervalo –0,2231 a +0,2231, conforme

Manual da ANVISA (2003).

--------------------------

Para efeito de comparação com artigos publicados sobre o tema, foram realizados ajustes de

cálculo, com intervalos de confiança de 90%.

8 RESULTADOS

A seguir apresentamos os resultados obtidos em nosso estudo.

Os primeiros são da validação do método analítico, com os dados obtidos no

Laboratório Analítico do Centro de Pesquisa Clínica contemplando os parâmetros

descritos anteriormente.

Depois apresentamos os resultados obtidos com a aplicação do método

analítico proposto e validado, no plasma dos pacientes, após a etapa clínica, que

resultou em cromatogramas e tabelas para avaliação da bioequivalência entre os

medicamentos avaliados.

8.1 VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO

8.1.1 Linearidade - curva de calibração

. Foi construída a curva de calibração com seis concentrações de Clozapina na

faixa de 19 ng/mL a 4000ng/mL, conforme mostra a figura 7, a seguir.

FIGURA 7 – Curva de Calibração - média de três curvas de validação.

Cada ponto representa a média de 6 determinações.

TABELA 1 - dados de 3 curvas de resposta (ou analíticas) para determinação da

curva de calibração onde foram plotados os pontos para determinação

da linearidade - Niterói - 2005

1ª curva

Área Cloz.

(uV.s)

Conc.

Clozapina

ng/ml

2ª curva

ÁreaCloz.

(uV.s)

Conc.

Clozapina

ng/ml

3ª curva

Área Cloz.

(uV.s)

Conc.

Clozapina

ng/ml

100125,58 3840,00 103245,93 3905,80 103171,53 3902,99

101705,70 3847,53 102943,83 3894,37 108173,25 4092,20

48535,11 1836,09 45306,14 1713,93 49415,87 1869,41

48347,45 1828,99 45913,58 1736,91 52536,85 1987,47

24451,31 924,99 20978,54 793,62 23179,99 876,90

22360,73 845,91 22096,56 835,91 23717,42 897,23

12768,37 483,03 10792,76 408,29 12575,36 475,73

12178,27 460,70 12158,00 459,94 10948,31 414,18

2545,08 96,28 2475,75 93,66 2199,95 83,22

2541,85 96,16 2299,96 87,01 2111,02 79,86

565,40 21,39 585,66 22,16 511,69 19,36

544,21 20,59 601,35 22,75 555,34 21,01

y = 26,379x + 27,391

= 1

15000

30000

45000

60000

75000

90000

105000

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000

Concentração Clozapina ng/mL

Área da Clozapina (

V.s)

8.1.2 Seletividade

8.1.2.1 Cromatograma no limite de quantificação – verificando interferentes.

No nosso estudo o limite de quantificação – LQ foi de 19.53 ng/mL

tempo (h)

CLZ= Clozapina IS= padrão interno ( Dothiepina )

Eixo X= tempo (h) de corrida e eixo y= sinal do aparelho com saída dos picos

FIGURA 8– cromatograma de amostra de plasma com Clozapina e padrão interno

(dothiepina

)

Resultado:

nenhum pico interferente no tempo de retenção do analito (Clozapina)

maior que 20% do limite de quantificação e nenhum pico interferente no tempo de

retenção do PI (Dothiepina) maior que 5% da concentração utilizada.

0.7

0.9

1.9

4.8

8.20

10.77

13.34

15.91

0.0

0.5

1.0

1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

CLZ

8.1.2.2 Tabela de plasmas do teste de seletividade

A Tabela 2 mostra relação dos plasmas obtidos e suas respectivas fontes

para avaliação do parâmetro seletividade.

O plasma é considerado branco quando padrão e padrão interno estão

ausentes, apresentando apenas os interferentes endógenos.

O plasma branco normal é obtido de voluntário sadio, após centrifugação de sangue

coletado em tubos contendo anticoagulante.

O plasma lipêmico é obtido da mesma maneira, porém, após refeição rica em

gorduras, ou de pacientes com taxas de lipídios acima dos limites de normalidade.

Plasmas hemolisados se referem a plasmas que sofreram hemólise.

Foram analisados 4 plasmas de voluntários normais, um lipêmico e um

hemolisado.

TABELA 2 -

relação dos plasmas utilizados para o teste de seletividade

Voluntário Descrição Fonte Identificação

Plasma humano Normal

Centro de Pesquisa Clínica

(HUAP)

1259433/4

Plasma humano Normal

Centro de Pesquisa Clínica

(HUAP)

1257669/7

Plasma humano Normal

Centro de Pesquisa Clínica

(HUAP)

1308798/3

Plasma humano Normal

Centro de Pesquisa Clínica

(HUAP)

1306253/0

Plasma humano

Hemolisado

Laboratórios Bronsten S.I.

Plasma Humano

Lipêmico

Laboratórios Bronsten M-206445

S.I. = sem identificação

8.1.2.3 Cromatogramas obtidos no teste de seletividade

As Figuras 9 a 14 mostram os cromatogramas obtidos no teste de

seletividade.

- 0.82

- 1.07

5.63

10.77

15.91

21.05

26.19

31.33

Eixo X= tempo (h) de corrida e eixo y= sinal do aparelho com saída dos picos

Plasma branco normal (voluntário I)

FIGURA 9 – cromatograma de amostra de plasma normal, branco, sem interferentes

Resultado: não apareceram interferentes no tempo normal de saída do analito e do

padrão interno.

5.63

8.20

10.77

13.34

15.91

18.48

21.05

Eixo X= tempo (h) de corrida e eixo y= sinal do aparelho com saída dos picos

Plasma branco normal (voluntário II)

FIGURA 10 – cromatograma de amostra de plasma normal, branco, sem interferentes

Resultado: não apareceram interferentes no tempo normal de saída do analito e do

padrão interno.

5.63

8.20

10.77

13.34

15.91

18.48

21.05

23.62

Eixo X= tempo (h) de corrida e eixo y= sinal do aparelho com saída dos picos

Plasma branco normal (voluntário III)

FIGURA 11 – cromatograma de amostra de plasma normal, branco, sem interferentes

Resultado: não apareceram interferentes no tempo normal de saída do analito e do

padrão interno.

5.63

8.20

10.77

13.34

15.91

18.48

21.05

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

Eixo X= tempo (h) de corrida e eixo y= sinal do aparelho com saída dos picos

Plasma branco normal (voluntário IV)

FIGURA12 – cromatograma de amostra de plasma normal, branco, sem interferentes

Resultado: não apareceram interferentes no tempo normal de saída do analito e do

padrão interno.

8.1.2.4 Cromatograma de plasma lipêmico

5.63

10.77

15.91

21.05

26.19

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

Eixo X= tempo (h) de corrida e eixo y= sinal do aparelho com saída dos picos

FIGURA 13 -

Cromatograma obtido de plasma de paciente com altos índices de

gordura no sangue - com padrão interno (dothiepina)

Resultado: não se observaram interferentes em nenhum momento da corrida nem

no tempo de retenção do padrão interno.

Dothiepina

8.1.2.5 Cromatograma de plasma hemolisado

5.63

10.77

15.91

21.05

26.19

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

FIGURA 14 - Cromatograma obtido de plasma hemolisado com padrão interno

(dothiepina)

Resultado: não se observaram interferentes no tempo de retenção do padrão

interno.

Dothiepina

8.1.3 Precisão intra-dia – Repetitividade

8.1.3.1 CQB – controle de qualidade de baixa concentração

Os dados obtidos após a aplicação do método bioanalítico proposto para

determinação do parâmetro Precisão ( repetitividade) são mostrados na Tabela 3.

O valor nominal do controle de qualidade de baixa concentração é de 40 ng/mL.

TABELA 3 - coeficiente de variação (%) de 3 lotes de plasma fortificados com

40ng/mL de Clozapina, com 5 replicatas cada, para avaliação do

parâmetro Precisão.

Precisão Intra-dia

Código amostra Concentração de Clozapina (ng/mL)

Lote 1 Lote 2 Lote 3

48.34 42.37 42.68

42.98 47.41 37.66

CQB

39.90 39.52 39.81

43.64 38.98 44.64

49.79 47.00 43.94

MÉDIA

44.93 43.056 41.75

4.06 4.00 2.94

CV(%)

9.036 9.29

7.04

DP= Desvio padrão

CV= Coeficiente de variação

Resultado

: a precisão determinada ao nível de concentração de 40 ng/mL (CQB)

foi abaixo de 15% em coeficiente de variação.

8.1.3.2 CQM – controle de qualidade de média concentração

Os dados obtidos após a aplicação do método bioanalítico proposto para

determinação do parâmetro Precisão ( repetitividade) são mostrados na Tabela 4.

O valor nominal do controle de qualidade de média concentração é de 1800 ng/ml

TABELA

4 - coeficiente de variação (%) de 3 lotes de plasma fortificados com

1800ng/mL de Clozapina, com 5 replicatas cada, para avaliação do

parâmetro Precisão.

Precisão Intra-dia

Código amostra

Concentração de Clozapina (ng/mL)

Lote 1 Lote 2 Lote 3

2065.38

1697.62 1985.39

1971.02 1657.39 2082.17

CQM

2110.88 2019.31 1750.28

2009.82 1804.24 1674.46

1961.44 1686.55 1871.52

MÉDIA

2023.71

1773.02 1872.76

63.6 148.46 166.48

CV(%)

3.14 8.37 8.89

DP= Desvio padrão

CV= Coeficiente de variação

Resultado: a precisão determinada ao nível de concentração de 1800 ng/mL (CQM)

foi abaixo de 15% em coeficiente de variação.

8.1.3.3 CQA – controle de qualidade de alta concentração

Os dados obtidos após a aplicação do método bioanalítico proposto para

determinação do parâmetro Precisão ( repetitividade) são mostrados na Tabela 5.

O valor nominal do controle de qualidade de alta concentração é de 3200 ng/mL.

TABELA 5

- coeficiente de variação (%) de 3 lotes de plasma fortificados com

3200ng/mL de Clozapina, com 5 replicatas cada, para avaliação do

parâmetro Precisão.

Precisão Intra-dia

Código amostra Concentração de Clozapina (ng/mL)

Lote 1 Lote 2 Lote 3

3584.13

3098.63 2926.46

3205.12 3539.57 2653.41

CQA

3942.90 3360.57 2977.18

3733.40 2926.49 2818.41

3242.88 3419.30 2682.27

MÉDIA

3541.69 3268.91 2811.55

317.05 250.26 143.53

CV(%)

8.95 7.66 5.10

DP = desvio padrão

CV = Coeficiente de Variância

Resultado: a precisão determinada ao nível de concentração de 3200 ng/mL (CQA)

foi abaixo de 15% em coeficiente de variação.

8.1.4 Precisão inter-lotes – Reprodutividade

Os dados obtidos após os cálculos das médias dos controles CQB, CQM e

CQA do parâmetro Precisão ( repetitividade), são mostrados na Tabela 6.

TABELA 6

- coeficiente de variação (%) das médias dos controles CQB, CQM e CQA

de 3 lotes de Clozapina, para avaliação da reprodutividade.

Precisão Inter-lotes ( 3 Lotes )

Concentração de Clozapina (ng / mL)

Lotes Avaliados CQB CQM CQA

44.93 2023.71 3541.69

43.06 1773.02 3268.91

41.75 1872.76 2811.55

Média

43.24 1889.83 3207.38

DP 1.6 126.21 368.94

CV(%) 3.7 6.68 11.5

DP = desvio padrão

CV = Coeficiente de Variância

Resultado: o coeficiente de variação das médias dos lotes de CQB, CQM e CQA foi

inferior a 15%, atendendo as normas da ANVISA.

8.1.5 Exatidão

Sendo a exatidão a proximidade da média dos resultados obtidos em um teste

com o valor real (concentração) do analito, esse parâmetro deve apresentar valores

compreendidos dentro de mais ou menos 15% do valor nominal para cada faixa de

concentração avaliada.

8.1.5.1 Exatidão intra-dia para CQB

A Tabela 7 mostra os resultados dos cálculos para avaliação da exatidão na

faixa de concentração de 40 ng/mL (CQB).

TABELA 7 - Exatidão (%) das médias de 3 lotes de Clozapina do controle CQB.

Exatidão Intra-dia

Código amostra Concentração de Clozapina (ng/mL)

Lote 1 Lote 2 Lote 3

48.34 42.37 42.68

42.98 47.41 37.66

CQB

39.90 39.52 39.81

43.64 38.98 44.64

49.79 47.00 43.94

MÉDIA

44.93 43.06 41.75

EXATIDÃO (%)

112.33 107.64 103.75

Resultado: o valor médio dos lotes avaliados foi maior que 85% do valor real, dentro

dos valores esperados para esse parâmetro validado.

8.1.5.2 Exatidão intra-dia para CQM

A Tabela 8 mostra os resultados dos cálculos para avaliação da exatidão na

faixa de concentração de 1800 ng/mL (CQM).

TABELA 8 - Exatidão (%) das médias de 3 lotes de Clozapina do controle CQM

Exatidão Intra-dia

Código amostra

Concentração de Clozapina (ng/mL)

Lote 1 Lote 2 Lote 3

2065,38 1697,62 1985,39

1971,02 1657,39 2082,17

CQM

2110,88 2019,31 1750,28

2009,82 1804,24 1674,46

1961,44 1686,55 1871,52

MÉDIA

2023.71

1773.02 1872.76

EXATIDÃO (%)

113.17 98.50 104.04

Resultado: o valor médio dos lotes avaliados foi maior que 85% do valor real, dentro

dos valores esperados para esse parâmetro validado.

8.1.5.3 Exatidão intra-dia para CQA

A Tabela 9 mostra os resultados dos cálculos para avaliação da exatidão na faixa

de concentração de 3200 ng/mL (CQA).

TABELA 9 - Exatidão (%) das médias de 3 lotes de Clozapina do controle CQA

Exatidão Intra-dia

Código amostra

Concentração de Clozapina (ng/mL)

Lote 1 Lote 2 Lote 3

3584.13

3098.63 2926.46

3205.12 3539.57 2653.41

CQA

3942.90 3360.57 2977.18

3733.40 2926.49 2818.41

3242.88 3419.30 2682.27

MÉDIA

3541.69 3268.91 2811.55

EXATIDÃO (%)

110.68 102.15 87.86

Resultado: o valor médio dos lotes avaliados foi maior que 85% do valor real, dentro

dos valores esperados para esse parâmetro validado.

8.1.5.4 Exatidão inter- lotes

A Tabela 10 mostra os resultados dos cálculos para avaliação da exatidão entre as

médias de 3 lotes de concentrações de 40, 1800 e 3200 ng/mL: CQB, CQM e CQA,

respectivamente.

TABELA 10 - Exatidão (%) das médias de 3 lotes de Clozapina nos controles CQB,

CQM e CQA.

Exatidão Inter-lotes ( 3 lotes )

Concentração média de Clozapina (ng / mL)

Lotes Avaliados CQB CQM CQA

112.36 113.17 110.68

107.64 98.50 102.15

103.75 104.04 87.86

Média

107.92 105.24 100.23

DP 4.29 7.41 11.53

CV(%) 3.97 7.04 11.50

Resultado: o valor médio dos lotes avaliados foi maior que 85% do valor real, dentro

dos valores esperados para esse parâmetro validado.

8.1.6 Estabilidade em ciclos de congelamento e descongelamento

8.1.6.1 Estabilidade de curta duração

TABELA 11-

estabilidade de curta duração – amostras de diferentes níveis de

concentração de Clozapina são submetidas a três ciclos de

congelamento/descongelamento e após, são analisadas e

comparadas com preparações recentes, para avaliação da

estabilidade da Clozapina – Laboratório Analítico – LA – 2005.

Amostra testada

Concentração de Clozapina(ng/mL)

Analito Preparação Recente

Preparação após 3 ciclos de

Congelamento/

descongelamento

CQB CQM CQA CQB CQM CQA

43,64 1985,39 3098,63 41,05 2023,74 3231,45

Clozapina

42,98 2082,17 3539,57 39,7 1883,45 3005,64

39,9 1750,28 3360,57 38,8 1799,25 2855,47

Média 42,17 1939,28 3332,92 39,85 1902,14 3030,85

Desvio Padrão

1,99 170,68 221,76 1,13 113,4 189,25

CV (%)

4,73 8,8 6,65 2,84 5,96 6,24

Resultado: os resultados comparativos mostram adequabilidade do método

em amostras submetidas a condições extremas de armazenamento, por curto

período.

8.1.6.2 Estabilidade de alta duração

TABELA 12 -

estabilidade de alta duração – preparações congeladas a – 20º C por 6

meses são comparadas com amostras recentes para avaliação da

estabilidade da Clozapina – LA – 2005.

Amostra testada

Concentração de Clozapina(ng/mL)

Analito Preparação Recente

Injeção da preparação após 6

meses em temperatura– 20º C

CQB CQM CQA CQB CQM CQA

44,93 2023,71 3541,69 39,22 1774,55 2998,33

Clozapina

43,06 1773,02 3268,91 38,44 1765,23 2876,45

41,75 1872,56 2811,55 40,06 1654,23 2810,88

Média 43,24 1889,76 3207,38 39,24 1731,33 2895,22

Desvio Padrão

1,60 95,53 369,23 0,81 66,94 95,12

CV (%)

3,69 5,05 11,5 2,06 3,86 3,28

Resultado: os resultados comparativos mostram adequabilidade do método em

amostras envelhecidas e submetidas a condições extremas de armazenamento.

8.1.7 Estabilidade de curta duração em temperatura ambiente

TABELA 13 -

estabilidade em temperatura ambiente - preparações de diferentes

níveis de concentração de Clozapina são analisadas após ficarem

6 horas em temperatura ambiente e comparadas com preparações

recentes para avaliação da estabilidade da Clozapina – Laboratório

Analítico - LA – 2005

Amostra Testada

Concentração de Clozapina(ng/mL)

Analito

Preparação Recente

Preparação após 6 horas

em temperatura ambiente

CQB CQM CQA CQB CQM CQA

42,68

2065,38 2926,46 42,66 1880,25 3235,47

Clozapina

37,66 1971,02 2977,18 40,88 1975,23 3017,25

39,81 1804,24 2818,41 39,95 2080 2956,38

Média 40,05 1946,88 2907,35 41,16 1978,49 3069,7

Desvio Padrão

2,52 132,23 81,09 1,38 99,91 146,75

CV (%) 6,29 6,79 2,78 3,34 5,05 4,78

Resultado: os resultados comparativos mostram que não houve degradação

relevante entre o tempo de coleta da amostra, sua preparação e análise, em

condições de temperatura ambiente.

8.1.8 Recuperação

TABELA 14

- Recuperação - médias de 3 lotes de Clozapina nos controles CQB,

CQM e CQA.

Recuperação Clozapina

% em cada nível de concentração

Lotes Avaliados CQB CQM CQA

86.80 89.40 93.80

-2

91.50 88.30 94.80

97.00 86.20 95,10

Média % Recuperação 91.80 87.90 94.60

Resultado

: a quantidade de analito recuperada nos lotes avaliados foi consistente,

demonstrando que o método é reprodutível e confiável.

8.2

GRÁFICOS GERADOS APÓS ANÁLISES DOS PLASMAS DE PACIENTES

8.2.1 – Gráfico da concentração/tempo

A figura 15 mostra um gráfico da média da concentração de Clozapina nos 24

pacientes, comparando-se os fármacos A e B.

Mean clozapine concentration-time

100

200

300

400

500

600

700

02468101214

Time ( h )

Plasma concentration (ng/mL)

Plasma conc. Drug A

Plasma conc. Drug B

FIGURA 15 -

média dos dados da concentração de Clozapina no plasma de 24

pacientes, após administração dos fármacos A e B

8.2.2 Gráficos de pacientes do estudo

As figuras 16 a 19 representam uma amostragem dos gráficos gerados a

partir dos cromatogramas dos pacientes.

Estudo Clozapina (FS-05)

200

400

600

800

1000

1200

-1,00 1,00 3,00 5,00 7,00 9,00 11,00 13,00 15,00 17,00 19,00 21,00 23,00 25,00

Tempo (hora)

Conc. ( ng/ml) Clozapina

Pac. 05 -FS 1ª Sem.

Pac. 05-FS 2ª Sem.

FIGURA 16 -

gráfico obtido com dados de plasma de paciente após os dois

confinamentos e administração do fármaco A e fármaco B

--------------------

O uso de cores identifica o primeiro e o segundo confinamentos. O fármaco correspondente é

verificado pela Lista de Randomização.

Estudo Clozapina (IM-01)

200

400

600

800

1000

1200

0,00 2,50 5,00 7,50 10,00 12,50 15,00 17,50 20,00 22,50 25,00

Tempo (hora)

Conc. ( ng/ml) Clozapina

IM-01 1ª Sem. IM-01 2ª Sem.

FIGURA 17 -

gráfico obtido com dados de plasma de paciente após os dois

confinamentos e administração do fármaco A e fármaco B.

Estudo Clozapina (ALS- 08)

200

400

600

800

1000

1200

-1,00 1,00 3,00 5,00 7,00 9,00 11,00 13,00 15,00 17,00 19,00 21,00 23,00 25,00

Tempo (hora)

Conc. ( ng/ml) Clozapina

ALS-08 1ª Sem. ALS- 8 2ª Sem.

FIGURA 18 -

gráfico obtido com dados de plasma de paciente após os dois

confinamentos e administração do fármaco A e fármaco B.

Estudo Clozapina (JFO- 11)

200

400

600

800

1000

1200

-1,00 1,00 3,00 5,00 7,00 9,00 11,00 13,00 15,00 17,00 19,00 21,00 23,00 25,00

Tempo (hora)

Conc. ( ng/ml) Clozapina

JFO 2ª Sem. JFO 1ª Sem.

FIGURA 19 –

gráfico obtido com dados de plasma de paciente após os dois

confinamentos e administração do fármaco A e fármaco B.

8.3

ESTATÍSTICA

8.3.1 Comparação das medidas de Cmax e Tmax.

TABELA 15 - tempo em que ocorreu a concentração máxima de Clozapina nos 24

pacientes do estudo (n=24) comparando fármaco A e fármaco B.

Fármaco A

Fármaco B

Tempo(h)

1.0

1.5

2.0 2.5 3.0

Paciente

1.0

1.5

2.0 2.5 3.0

842,3

537,6

465,6

572,8

287,7

392,7

799,2

901,4

286,9

280,6

246,5

447,9

550,3

899,7

573,1

474,9

1168

1107

317,1

448,6

1244

1301

425

537

508,4

735,4

447

690,4

574,6

586,1

604

579,4

558,6

573,8

498,4

417,7

1001

1103

788,1

929,1

1285

1079

381

407,9

701,2

948,1

449,4

610,4

FIGURA 20 - Tempo (h) em que ocorreu concentração máxima de Clozapina no

plasma por paciente (N=24)

Tmáx Fárm. A e B

0,5

1,5

2,5

3,5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

Pacientes

Tempo (h)

Fárm. A

Fárm. B

8.3.2 Análise descritiva das medidas farmacocinéticas

TABELA 16 - Estatística das medidas farmacocinéticas do fármaco A.

Medidas farmacocinéticas Média Mediana Desvio

padrão

Mínimo Máximo

Tmax 1.83 1.50 0.65 1.0 3.0

Cmax 627.66 554.48 304.63 246.50 1284.82

Ke 0.08 0.08 0.03 0.04 0.14

1/2

4.15 3.69 1.60 2.14 7.54

ASCtk 4273.50 3500.57 2549.19 1312.04 11040.16

ASC(∞) 7865.94 5331.03 6009.99 2520.50 24081.06

TABELA 17 - Estatística das medidas farmacocinéticas do fármaco B.

Medidas farmacocinéticas Média Mediana Desvio

padrão

Mínimo Máximo

Tmax 1.81 1.50 0.59 1.0 3.0

Cmax 690.07 582.74 276.63 280.61 1301.36

Ke 0.08 0.08 0.03 0.03 0.14

1/2

4.07 3.73 1.68 2.19 8.96

ASCtk 4430.25 2740.11 2379.69 1392.72 10146.08

ASC(∞) 7412.84 4168.23 4471.64 2922.75 19118.47

8.3.3 Análise descritiva das concentrações plasmáticas por fármaco

8.3.3.1 Fármaco A

TABELA 18 - estatística das concentrações plasmáticas (ng/ml) ao longo do tempo

do fármaco A em 24 pacientes (n=24)

Tempo

(h)

Média Mediana Desvio

padrão

Mínimo Máximo

0.0

291.861 216.902 225.369 82.452 941.308

0.25*

322.257 259.524 231.373 92.832 987.643

0.5**

397.983 314.306 267.348 119.710 1.085.641

1.0

490.918 418.540 280.395 159.081 1.229.719

1.5**

540.215 449.047 270.534 243.001 1.167.662

2.0

535.705 393.739 334.957 148.537 1.284.817

2.5**

510.844 444.153 317.671 142.008 1.277.917

3.0

498.040 454.923 296.928 134.560 1.177.644

3.5**

444.071 367.221 270.708 126.519 1.095.158

4.0

418.091 423.911 246.966 119.004 1.044.895

5.0

371.626 294.238 228.173 100.055 988.456

6.0

331.434 259.506 198.671 99.393 890.549

8.0

291.633 241.771 187.688 96.598 811.009

10.0

252.103 199.352 175.297 70.209 708.860

12.0

228.376 186.697 157.689 70.111 625.881

* (= 15 minutos)

** ( 0.5 = 30 minutos)

8.3.3.2 Fármaco B

TABELA 19 - estatística das concentrações plasmáticas (ng/ml) ao longo

do tempo do fármaco B em 24 pacientes (n=24).

Tempo Média Mediana Desvio

padrão

Mínimo Máximo

0.0

294.082 214.304 225.747 68.691 1.116.786

0.25*

321.353 286.767 230.081 72.635 1.142.601

0.5**

398.768 341.005 241.048 98.942 1.158.443

1.0

536.009 502.198 266.196 161.483 1.193.237

1.5**

609.685 553.214 272.117 280.607 1.277.468

2.0

584.511 471.243 289.482 225.840 1.301.361

2.5**

557.428 453.843 285.261 192.735 1.138.664

3.0

527.458 456.762 258.197 161.794 1.028.160

3.5**

471.302 396.309 246.925 138.111 1.026.322

4.0

422.683 329.696 234.693 12.042 971.024

5.0

381.751 287.469 217.117 101.141 882.915

6.0

343.171 258.953 202.644 91.207 770.112

8.0

295.105 212.465 185.066 86.941 683.217

10.0

256.832 196.014 155.329 83.218 641.413

12.0

217.516 160.911 135.059 79.533 534.325

* (= 15 minutos)

** ( 0.5 = 30 minutos)

8.3.4 Histogramas de frequência de Cmax

8.3.4.1 Fármaco A

Os histogramas sugerem que os dados originais de Cmax para ambos

fármacos não têm distribuição normal o que é confirmado pelo teste de Kolmogorov-

Smirnov, cujos resultados aparecem a seguir.

dados: Cmax. em Clozapina - farmaco A

ks = 0.1977, p-valor = 0.0161

hipótese alternativa: frequência não apresenta a distribuição normal com

parâmetros estimados.

0 210 420 630 840 1050 1260 1470

Cmax.A

p-valor = 0.0161

FIGURA 21 - Histograma de freqüências de Cmax para o fármaco A, dados originais.

8.3.4.2 Fármaco B

dados: Cmax. em Clozapina – farmaco B

ks = 0.1967, p-valor = 0.0171

hipótese alternativa: frequência não apresenta distribuição normal com parâmetros

estimados.

0 210 420 630 840 1050 1260 1470

Cmax.B

p-valor= 0,0171

FIGURA 22 - Histograma de freqüências de Cmax para o fármaco B, dados originais.

8.3.5 Tabela e gráficos de probabilidade normal após transformação por

logaritmo.

Considerando o logaritmo natural dos valores originais de Cmax para ambos

fármacos, obtém-se a confirmação da normalidade, como pode ser evidenciado nos

gráficos de distribuição normal correspondentes e nos resultados do teste de

Kolmogorov-Smirnov para composição da normalidade para os fármacos A e B.

8.3.5.1 Comparação de ln Cmax e ASC

TABELA 20 -

comparação das médias dos logaritmos de Cmax e logaritmos de ASC

da Clozapina em 24 pacientes (n=24) após a administração dos

fármacos A e B. LA - 2005

Mean 6.3364 6.4607 0.9807 8.2007 8.2672 0.9920

SD 0.4670 0.3998 0.0391 0.5771 0.5160 0.0327

90% IC

6.1796 – 6.4932 6.3265 – 6.5949 0.9677 – 0.9937 8.0069 – 8.3945 8.094 – 8.4404 0.9811 – 1.0029

Ln ( Cmax) Ln ASC (t_k)

Pacientes A B A/B Fármaco A Fármaco B A/B

6.7361

6.1433

5.6620

6.6835

5.6591

5.5074

6.3105

6.3510

7.1145

5.7592

7.1260

6.0521

6.2313

6.1026

6.3537

6.4035

6.3255

6.2113

6.9090

6.6696

7.1584

5.9428

6.5527

6.1079

6.2870

6.3505

5.9731

6.8039

5.6370

6.1046

6.8021

6.1631

7.0090

6.1062

7.1712

6.2860

6.6004

6.5372

6.3734

6.3620

6.3524

6.0348

7.0059

6.8342

6.9840

6.0109

6.8544

6.4140

1.0714

0.9673

0.9479

0.9823

1.0039

0.9022

0.9277

1.0305

1.0152

0.9432

0.9937

0.9628

0.9441

0.9335

0.9969

1.0065

0.9958

1.0292

0.9862

0.9759

1.0250

0.9887

0.9560

0.9523

8.6842

8.4020

7.6826

8.6620

7.3603

7.1793

8.3550

8.4407

8.9092

7.4685

9.1860

7.7022

8.0203

7.6330

8.2075

8.1116

8.0663

8.0244

8.8481

8.5884

9.3093

7.5994

8.5373

7.8402

8.3070

8.4919

7.8919

8.8548

7.2390

7.7071

8.4840

8.0381

9.0728

7.9236

9.2248

7.7963

8.5199

8.0220

7.7570

8.1118

8.0943

8.0217

8.8253

8.5252

9.0888

7.6023

8.7040

8.1096

1.0454

0.9894

0.9735

0.9782

1.0167

0.9315

0.9848

1.0501

0.9819

0.9426

0.9958

0.9879

0.9413

0.9515

1.0580

0.9965

1.0002

1.0026

1.0074

1.0242

0.9996

0.9808

0.9667

8.3.5.2 Fármaco A – log Cmax

dados: log.Cmax.em Clozapina - farmaco A

ks = 0.1102, p-valor = 0.653

hipótese alternativa: frequência apresenta a distribuição normal com parâmetros

estimados (após teste de Kolmogorov-Smirnov)

2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0 3.1

log.Cmax.A.

-2

-1

Normal Distribution

p-valor= 0.653

FIGURA 23 - Gráfico de probabilidade normal para Cmax do fármaco A, dados

transformados.

8.3.5.3 Fármaco B – log Cmax

dados: log.Cmax em Clozapina - farmaco B

ks = 0.1367, p-valor = 0.288

hipótese alternativa: frequência possui a distribuição normal com parâmetros

estimados (após teste de Kolmogorov-Smirnov).

2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0 3.1

log.Cmax.B.

-2

-1

Normal Distribution

p-valor= 0.288

FIGURA 24 - Gráfico de probabilidade normal para Cmax do fármaco B, dados

transformados.

8.3.6 Bioequivalência para Cmax

O fármaco referência neste estudo foi desconhecido para a análise estatística,

porém, para o intervalo de diferença de médias dos dados transformados tem-se:

-μ

= -0.0540 IC(95%)= -0.0996 até -0.0084

-μ

= 0.0540 IC(95%)= 0.0084 até 0.0996

Estes intervalos encontram-se contidos dentro dos limites de -0.2231 até

0.2231 definidos no Manual de Boas Práticas em Biodisponibilidade/Bioequivalência

de medicamentos, indicando bioequivalência de Cmax.

8.3.7 Bioequivalência para ASC(t_k)

Todos os cálculos anteriores foram feitos para ASC(t_k), assim como para

ASC (∞). Para ASC (t_k), os dados finais estão abaixo.

O fármaco referência neste estudo foi desconhecido para a análise

estatística, porém, para o intervalo de diferença de médias dos dados transformados

tem-se:

-μ

=-0.0288715 IC(95%)=-0.1670069 até 0.1092639

-μ

=0.0288715 IC(95%)=-0.1092639 até 0.1670069

Estes intervalos encontram-se contidos dentro dos limites de -0.2231 até

0.2231 definidos no Manual de Boas Práticas em Biodisponibilidade/Bioequivalência

de medicamentos, indicando bioequivalência para ASC(t_k).

100

8.3.8 Bioequivalência para ASC(∞)

O fármaco referência neste estudo é desconhecido para a análise estatística,

porém, para o intervalo de diferença de médias dos dados transformados tem-se:

-μ

=-0.0114419 IC(95%)=-0.1678198 até 0.144936

-μ

=0.0114419 IC(95%)=-0.144936 até 0.1678198

Estes intervalos encontram-se contidos dentro dos limites de -0.2231 até

0.2231 definidos no Manual de Boas Práticas em Biodisponibilidade/Bioequivalência

de medicamentos, indicando bioequivalência para ASC(∞).

101

9 DISCUSSÃO

A Clorpromazina, o principal representante dos fármacos fenotiazínicos, foi

introduzida na década de 50 para o tratamento da esquizofrenia. Foi a primeira

substância a tratar efetivamente dos sintomas positivos da doença, diminuindo o

tempo médio de hospitalização dos pacientes e as recidivas de internações.

Entretanto, de acordo com alguns estudos, 5 a 25% dos pacientes que

usaram esses derivados mostraram-se refratários ao tratamento, enquanto 5 a 10%,

intolerantes ao mesmo (MENEGATTI, 2003). Além disso, a Clorpromazina, assim

como outros antipsicóticos que foram desenvolvidos mais tarde, como o Haloperidol,

não melhora os efeitos negativos da esquizofrenia, assim como produz efeitos

colaterais importantes como sintomas Parkinsonianos (tremor, rigidez e bradicinesia)

e efeitos extrapiramidais. Podem também causar hiperprolactinemia.

Assim, na pesquisa de melhores agentes antipsicóticos, foi desenvolvida a

Clozapina, na década de 60, que tem muitas vantagens sobre os fármacos

antecessores. Ela atua sobre os sintomas positivos e também sobre os negativos,

produz poucos efeitos extrapiramidais e baixa incidência de hiperprolactinemia, mas

principalmente, previne surtos psicóticos em pacientes refratários aos antipsicóticos

clássicos.

Por considerarmos que a Clozapina veio a preencher uma lacuna no

tratamento da esquizofrenia, entendemos que ela deva estar disponível como

alternativa de tratamento nos hospitais públicos no Brasil. Por ser um fármaco de

preço elevado para os padrões brasileiros, os estudos de bioequivalência trazem

uma possibilidade do seu uso como medicamento genérico, aliando baixo custo e

102

confiabilidade (JOHN, 2001; HEALY, 2005; MAKELA, 2003; LAM, 2001; LEWIS,

2006).

A Lei dos Genéricos no Brasil (no. 9787/99) foi muito importante por

possibilitar a introdução de medicamentos genéricos e similares e a realização de

estudos de biodisponibilidade e bioequivalência, de forma rotineira no Brasil. Os

estudos de bioequivalência, além de se basearem em princípios harmonizados

internacionalmente, fornecem ao mercado medicamentos seguros, testados e

intercambiáveis, mas principalmente têm um expressivo impacto positivo no preço

para o consumidor.

Estudos anteriores de bioequivalência da Clozapina (POKORNY, 1994) feitos

com voluntários hígidos, conforme padrão habitual para este tipo de estudo,

causaram efeitos adversos graves, tais como hipotensão, bradicardia, síncope e

assistolia. Por este motivo, a versão mais recente do US-FDA (CDER, 2003)

recomenda que os estudos de bioequivalência da Clozapina devam ser realizados

apenas em pacientes psiquiátricos, o que introduz uma metodologia diferente da

habitual para a etapa clínica.

Assim, o presente estudo seguiu as orientações dos recentes Guias para

Estudos de Bioequivalência da US-FDA e da ANVISA-Brasil (ANVISA, 2003; CDER,

2003) utilizando um desenho experimental de múltiplas doses, duplo-cego, cruzado,

em pacientes esquizofrênicos estáveis, em estado de equilíbrio, que receberam

doses de 100 mg de Clozapina com intervalo de 12 h, conforme terapia usual.

Esse tipo de estudo foi pioneiro na Universidade Federal Fluminense e é

também no Brasil, pois até o último acesso ao site da ANVISA, não há referência a

Clozapina genérica. Além de todo o aparato necessário para uma pesquisa clínica,

nesse estudo em particular em que os envolvidos não são voluntários saudáveis e

sim pacientes esquizofrênicos, os obstáculos transpostos foram enormes,

representando um desafio para toda a equipe.

Destaque-se a sensibilidade normalmente exacerbada nesse tipo de paciente

sendo necessária toda uma logística, desde a adesão dos familiares, entrevistas

103

para esclarecimento das vantagens do tratamento, até o deslocamento da equipe de

apoio da Clínica Psiquiátrica EGO com os pacientes para as dependências do

Centro de Pesquisa Clínica e as coletas sanguíneas feitas antes dos períodos de

internação. Por esse motivo, consideramos que a dinâmica na execução das etapas

do estudo foi inovadora propiciando assim uma logística diferenciada para outros

trabalho do gênero.

O método de validação analítica proposto seguiu o “Guia para Validação de

Métodos Analíticos e Bioanalíticos” (ANVISA, RE nº 899, de 29/05/2003) e, para

tanto, foram estimados os parâmetros: linearidade, limite de quantificação,

seletividade, exatidão, precisão (repetitividade e reprodutibilidade) e estabilidade de

curta e longa duração. Foi utilizada uma alternativa à metodologia descrita na

literatura e que revelou-se relativamente simples e de boa execução.

Os resultados dos testes foram comparáveis a outros trabalhos de avaliação

da Clozapina no plasma em termos de parâmetros avaliados (MERCOLINI, 2006) e

apresentou mais resultados de validação do que o estudo de bioequivalência em

pacientes esquizofrênicos de um grupo da Khon Kaen University, na Tailândia

(TASSANEEYAKUL, 2005).

Os resultados mostraram que o método é seletivo (Fig. 8 a 14 e Tab. 2), tem

repetitividade e reprodutividade (Tab. 3 a 6), apresentou exatidão (Tab. 7 a 10) e

mostrou-se estável em baixas temperaturas tanto em curto como longo prazo (Tab.

11 a 13). As curvas de calibração demonstraram uma resposta adequada do

cromatógrafo em relação às concentrações conhecidas das amostras injetadas

(Tab.1 e Fig. 7). A robustez foi avaliada na pré-validação, quando alteramos

levemente o pH da fase móvel, a velocidade do fluxo e a relação percentual dos

componentes da fase móvel e os resultados se mantiveram estáveis.

Essa metodologia analítica alternativa traz uma perspectiva de trabalho

diferenciado para o Laboratório, que passa a ter uma maior agilidade em ensaios

bioanalíticos, e enriquece a possibilidade de escolha de métodos de trabalho.

104

Sabe-se que, muito breve, as dosagens de medicamentos, principalmente os

controlados, deverão ser individualizadas, através dos avançados estudos de

farmacogenética, assim como os estudos farmacocinéticos que auxiliarão o

acompanhamento e monitoramento de drogas como a Clozapina para determinar a

dosagem ótima para cada indivíduo. O ensaio por HPLC para a determinação da

clozapina pode ser aplicável a estudos farmacocinéticos e monitorização terapêutica

(BUUR-RASMUSSEN, 1999).

Quanto aos efeitos colaterais mais importantes da Clozapina, ao longo dos

últimos dez anos, vários relatos demonstraram claramente que a neutropenia e

agranulocitose podem ser facilmente prevenidas por meio de estrita vigilância

hematológica (LLORCA , 2004; CHANDRASEKARAN , 2008; LAMBERTENGHI,

2000). O uso de clozapina com doses superiores a 600 mg diários devem seguir

recomendações publicadas, para minimizar o risco de convulsões (BUUR-

RASMUSSEN, 1999; BARDAKOU et al, 2008).

Observamos também no nosso estudo uma grande variabilidade nos

parâmetros farmacocinéticos da Clozapina, de indivíduo para indivíduo. Comparando

com artigos de outros autores (TASSANEEYAKUL, 2005) e com outros estudos

(MERCOLINI, 2007; BUUR-RASMUSSEN, 1999), consideramos que essa

variabilidade das concentrações plasmáticas da Clozapina se deve às diferenças

interindividuais na biodisponibilidade (absorção/eliminação), como também a

fatores como idade, tabagismo, alimentação e uso simultâneo de outros

medicamentos.

Os citocromos P450 metabolizam uma variedade de compostos lipofílicos de

origem endógena, como colesterol, hormônios esteróides e ácidos graxos, bem

como compostos de origem exógena, como drogas, aditivos de alimentos, fumo,

pesticidas e produtos químicos que penetram no organismo pelas formas

alimentares, inalação ou absorção pela pele. Os citocromos P450 são abundantes no

fígado e sua atividade depende de fatores genéticos, constitucionais e influências

ambientais. Quatro enzimas P450 são importantes para a psicofarmacologia clínica:

CYP1A2, CYP2C19, CYP2D6 e CYP3A4.

105

O CYP1A2 é uma das maiores frações P450 do fígado, mais ou menos 15%

do total. É a maior enzima envolvida no metabolismo de várias drogas antipsicóticas

(e.g. Clozapina) e sua indução estimulada pelo fumo, hidrocarbonetos aromáticos,

componentes de vegetais crus e inibida por outras drogas (FISCHER, 1992). O fato

da Clozapina ser metabolizada pela altamente variável enzima CYP1A2, talvez seja

o fator mais importante na variabilidade encontrada.

Quanto ao uso da Clozapina em outras doenças, alguns estudos mostram

que algumas psicoses são induzidas por quimioterapia no tratamento da doença de

Parkinson. Vários agentes antipsicóticos atípicos, entre eles a Clozapina, têm-se

mostrado eficaz em reduzir sintomas psicóticos na doença de Parkinson

(ALEXOPOULOS, 2004; ZAHODNE, 2008; FERNANDEZ , 2003). Essas outras

aplicações do fármaco nos permitem avaliar que mais formulações genéricas

deverão estar disponíveis para um tipo de usuário que não somente o

esquizofrênico, aumentando em muito o leque de opções para diferentes pacientes.

Finalmente, queremos lembrar que embora a faixa de variação da

biodisponibilidade para medicamentos genéricos entre 80 e 125% seja um consenso

internacional, acreditamos que os critérios para os estudos de bioequivalência e

biodisponibilidade devam ter um refinamento maior, pois 25% de um total pode

representar uma impregnação perigosa e provoca uma não adesão de alguns

médicos aos medicamentos genéricos, assim como 20% abaixo pode resultar em

subdoses comprometedoras na terapêutica de drogas psicoativas. Genéricos

poderão ter sua prescrição reduzida pelo medo de efeitos ou respostas indesejáveis,

pela falta ou pelo excesso.

Em função dessas reflexões pretendemos continuar nossas investigações em termos

de estudos que avaliem o impacto de diferentes excipientes, que podem interferir na

biodisponiblidade dos medicamentos para que possam de fato ser bioequivalentes.

106

10 CONCLUSÃO

O método analítico opcional foi validado contemplando os parâmetros

preconizados pela ANVISA.

O método analítico opcional foi considerado satisfatório em termos de

execução e dinâmica laboratorial, mostrando-se efetivo na avaliação da

biodisponibilidade da Clozapina em plasma.

A clozapina teste (Zolapin®, Meizler) foi considerada bioequivalente ao

medicamento referência (Leponex®, Novartis), no intervalo de confiança de 95%.

107

REFERÊNCIAS

OBRAS CITADAS

ALEXOPOULOS G.S.Streim J, Carpenter D, Docherty JP,Expert Consensus Panel

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patients. J Clin Psychiatry. 2004;65 Suppl 2:5-99; PubMed

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Práticas em Biodisponibilidade/ Bioequivalência. 2003.

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tardive dyskinesia. Int Clin Psychopharmacol. 1998;13 Suppl 3:S49-57. [PubMed]

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CHANDRASEKARAN, P. K. Agranulocytosis monitoring with Clozapine patients: to

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Parkinson’s disease: safety considerations. Drug Saf. 2003:26(9):643-595 [PubMed]

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110

OBRAS CONSULTADAS

ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR 6023:2002 - Informação e

documentação – Referências – Elaboração. Rio de Janeiro, 2002. 24 p.

______. NBR 6024:2003 - Informação e documentação – Numeração progressiva

das seções de um documento escrito – Apresentação. Rio de Janeiro, 2003. 3p.

______. NBR 6027:2003 - Informação e documentação – Sumário – Apresentação.

Rio de Janeiro, 2003. 2p.

______. NBR 6028:2003 - Informação e documentação – Resumo – Apresentação.

Rio de Janeiro, 2003. 2p.

______. NBR 6029:2006 - Apresentação e Informação - Livros e folhetos -

Disponível em: <http http://blog.tera-rocker.com/arquivos/pdf/normas_abnt/6029>.

Acesso em 22.09.2008. Rio de Janeiro, 2006. 10p.

______. NBR 10520:2002 - Informação e documentação – Citações em

documentos – Apresentação. Rio de Janeiro, 2002. 7p.

______. NBR 14724:2005 - Informação e documentação – Trabalhos acadêmicos

– Apresentação. Rio de Janeiro, 2005. 13p.

BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Legislação

em Vigilância Sanitária. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/e-legis/>, 2008.

BURTIS, C. A.; ASWOOD, E. R. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry. 5ª ed.

Philadelphia: W. B. Saunders Company, 2001. 1091p.

FOUCAULT Michel, História da Loucura, 1995.

GOODMAN & GILMAN. The Pharmacological Basics of Therapeutics. 10th ed. New

York:: McGraw-Hill, 2001. 2182p.

IBGE. Normas de apresentação tabular. 3. ed. Rio de Janeiro, 1993. 61 p.

THE UNITED STATES PHARMACOPEIA . 26ª ed. 2003. 2921p.

UNIVERSIDADE CATÓLICA DE BRASÍLIA. Manual para apresentação de

monografias, dissertações e teses da Universidade Católica de Brasília. 2. ed.

Brasília: Universa, 2004. Disponível em:

<http://www.biblioteca.ucb.br/ManualUCB.pdf>. Acesso em 12 set. 2008.

111

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE. Apresentação de trabalhos

monográficos de conclusão de curso. 9. ed. Rev. Ampl. por Estela dos Santos

Abreu e José Carlos Abreu Teixeira. Niterói: EdUFF, 2007.

PROGRAMAS ESTATÍSTICOS UTILIZADOS:

Bioestat 3.0

Excel

112

ANEXOS

ANEXO I LISTA DE RANDOMIZAÇÃO

Número do

Paciente no

estudo

Iniciais do

Paciente

Amostragem

randomizada

1ª internação

Amostragem

randomizada

2ª internação

01 SC A B

02 VN A B

03 RA B A

04 PR B A

05 FS B A

06 JF A B

07 MCR B A

08 JN A B

09 UPC B A

10 ABC A B

11 GA A B

12 IM B A

13 ER A B

14 JCOS B A

15 JCCB A B

16 MRP B A

17 VG B A

18 JBLO A B

19 ALS A B

20 EP B A

21 RCQ A B

22 JFO B A

23 JCS A B

24 AG B A

25 RPA A B

26 GMH A B

27 BCES B A

28 EF B A

29 DLL A B

30 SB A B

31 JMV B A

32 IM A B

33 JFF B A

34 JJ B A

113

ANEXO II PLANO DIETÉTICO

REFEIÇÕES

DESJEJUM QUANTIDADE EQUIVALENTE A

Leite Integral 1 copo americano 180 ml 180 mL

Açúcar 4 colheres chá de 5 g 20 g

Pão Francês 1 unidade comercial 50 g

Queijo Prato ou Minas 1 fatia fina 15 g

Manteiga 1 colher chá nivelada 5 g

COLAÇÃO QUANTIDADE EQUIVALENTE A

Suco Industrializado 1 copo americano 180 mL

1 Fruta 1 unidade 100 g

ALMOÇO QUANTIDADE EQUIVALENTE A

Arroz 5 colheres sopa 125 g

Feijão 2 conchas 200 g

Frango ou Carne de Boi 1 bife grande 100 g

Macarrão 3 colheres sopa 75 g

Legumes 3 colheres de sopa 90 g

Verduras 3 colheres de sopa 90 g

Sobremesa 1 fatia doce em pasta 25 g

Suco Industrializado 1 copo americano 180 ml 180 mL

LANCHE QUANTIDADE EQUIVALENTE A

Leite Integral 1 copo americano 180 ml 180 mL

1 Pão Francês 1 unidade 50 g

Açúcar 4 colheres chá 5 g 20 g

Manteiga 1 colher chá nivelada 5 g

JANTAR QUANTIDADE EQUIVALENTE A

Arroz 5 colheres sopa 125 g

Feijão 2 conchas 200 g

Frango ou Carne de Boi 1 bife grande 100 g

Macarrão 3 colheres sopa 75 g

Legumes 3 colheres de sopa 90 g

Verduras 3 colheres de sopa 90 g

Suco Industrializado 1 copo americano l 180 mL

114

GLOSSÁRIO

Acatisia: (G. a-, privação de + kathisis, assento) neurose caracterizada por

uma incapacidade de permanecer em posição sentada; inquietação motora

e sensação de tremor muscular.

Agranulocitose: condição aguda caracterizada por pronunciada leucopenia,

acompanhada de grande redução no número de leucócitos polimorfonucleares.

Antipsicóticos atípicos: fármacos empregados na terapêutica da esquizofrenia,

que apresentam baixos níveis de efeitos extrapiramidais e sintomas Parkinsonianos.

Antipsicóticos clássicos: fármacos empregados na terapia da esquizofrenia, que

apresentam como principais efeitos colaterais os sintomas extrapiramidais e

Parkinsonianos.

Bradicinesia: (bradys, lento + kinesis, movimento) extrema lentidão de movimento.

Discinesia tardia: dificuldade em realizar movimentos voluntários.

Distonia: distúrbio da tensão, da tonicidade ou tônus; modificação patológica das

ações musculares que mantêm o homem em equilíbrio na posição em pé.

Efeitos extrapiramidais (catalepsia): (G. katalepsis, convulsão, kata, para baixo +

lepsis, convulsão) estado mórbido, aliado à autohipnose ou à histeria, em que há

rigidez dos membros, os quais podem ser colocados em várias posições, nelas se

mantendo durante certo tempo.

Esquizofrenia: (G. schizõ- dividir ou clivar + G. phren- mente) termo cunhado por

Bleuler, que veio substituir a denominação demência precoce; o tipo mais comum

de psicose, caracterizado por um distúrbio nos processos de raciocínio, tais como

ilusões e alucinações e extenso retraimento do interesse do indivíduo em relação a

outras pessoas e ao mundo exterior, assim como à introversão em si mesmo.

Hiperprolactinemia: produção exacerbada de prolactina, um hormônio protéico da

pituitária anterior que estimula a secreção de leite e crescimento das mamas

durante o período de lactação. A secreção exacerbada de prolactina deve-se ao

bloqueio excessivo de receptores dopaminérgicos do sub-tipo D2 no lobo anterior

da hipófise.

Leucócitos polimorfonucleares: (leuko- + G. kutos, célula) são as células brancas do

sangue, abrangendo os basófilos, eosinófilos e neutrófilos, principalmente este

último.

Leucopenia: diminuição dos glóbulos brancos do sangue.

Sintomas Parkinsonianos: sintomas que mimetizam o comportamento de pacientes

acometidos pela doença de Parkinson, associado à hipoatividade dopaminérgica na

via nigro-striatal.

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