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Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
‘‘Estudo da associação de complexos nitrosilos de rutênio
liberadores de NO com o agente fotossensibilizador Zinco
ftalocianina ZnPC em sistemas de liberação utilizados na
Terapia Fotodinâmica’’
Daniela Silva Maranho
Dissertação apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da
USP, como parte das exigências para a obtenção
do título de Mestre em Ciências, Área: Química
RIBEIRÃO PRETO -SP
2008
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Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
‘‘Estudo da associação de complexos nitrosilos de rutênio
liberadores de NO com o agente fotossensibilizador Zinco
ftalocianina ZnPC em sistemas de liberação utilizados na
Terapia Fotodinâmica’’
Daniela Silva Maranho
Orientador: Prof. Dr. Antonio Claudio Tedesco
Dissertação apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da
USP, como parte das exigências para a obtenção
do título de Mestre em Ciências, Área: Química
RIBEIRÃO PRETO -SP
2008
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca Central do Campus Administrativo
de Ribeirão Preto / USP
Maranho, Daniela Silva
Estudo da associação de complexos nitrosilos de rutênio
liberadores de NO com o agente fotossensibilizador
Zinco ftalocianina ZnPC em sistemas de liberação
utilizados na Terapia Fotodinâmica.
96 p. : il. ; 30cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de
Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP – Área
de concentração: Química.
Orientador: Tedesco, Antônio Cláudio.
1. Terapia Fotodinâmica. 2. óxido nítrico. 3. complexo
nitrosilo de rutênio. 4. neoplasias.
4
Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Folha de Aprovação
Membros da Comissão Julgadora da Dissertação de Mestrado de Daniela Silva Maranho,
apresentada ao Departamento de Química, da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto, __/__/__.
Comissão Julgadora:
____________________________________________
(Nome/Instituição)
____________________________________________
(Nome/Instituição)
____________________________________________
(Nome/Instituição)
5
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho à minha família.
Primeiramente à Deisy Silva Maranho, minha mãe, grande mulher que com seu amor e alegria
sempre me motivou. Seu apoio incondicional e imensurável me deu a força necessária para
encarar todos os desafios, para assim, conseguir alcançar tudo que desejei.
Ao meu pai querido, Alcides Maranho, com seu carinho e amor sempre me guiou pelo
caminho do bem. Homem sereno, exemplo de honestidade, seu caráter singular foi a base da
minha formação moral.
Aos meus irmãos queridos:
Dinho, uma pessoa muito especial que com toda sua sensibilidade me mostrou que o que
importa nessa vida é ser feliz! Um cuidado único comigo, meu ídolo!
Ana Deisy com sua ternura sempre foi a certeza de encontrar em casa o carinho mais sincero.
Du, através de sua escolha, me mostrou que não há barreiras para alcançarmos nossos sonhos,
tudo é possível!
À minha querida avó Zica, com seus 98 anos, ainda reza por mim e confia nas minhas
conquistas.
Obrigada pela confiança e por tanto amor...
6
AGRADECIMENTOS
A Deus,
por tudo que tenho, por ser meu descanso e a certeza da minha felicidade. Com a ajuda dos
anjos e santos, consigo me manter firme e confiante.
“Tudo posso naquele que me fortalece!”(Fl 4,13)
7
AGRADECIMENTOS
Principalmente ao Prof. Dr. Antonio Claudio Tedesco, por ter confiado no meu
crescimento na pesquisa. Obrigada pela paciência, pelo apoio, carinho, pelos momentos de
descontração, mas principalmente pelos grandes ensinamentos.
Ao professor Prof. Dr. Roberto Santana da Silva, pelo fármaco cedido, pelas
sugestões, pelo apoio e principalmente pela forma carinhosa que sempre me recebeu.
À professora Prof
a
. Dr
a
. Lusiane Maria Bendhack, pelo apoio e pela grande
disponibilidade em todos os momentos em que precisei.
À professora Dr
a
. Renata Galvão de Lima, pela enorme ajuda, amizade e pelas horas
de alegria.
A José Honorato Ferreira Neto, uma pessoa essencial para minha felicidade. Obrigada
por confiar em mim e por resgatar em mim a vontade de conquistar meu espaço. Ao seu lado
sou muito feliz porque o amo e por causa do seu amor sou completa. Obrigada por tudo! Que
o nosso amor sempre contribua para nosso crescimento profissional e para nossa vida juntos.
Amo você!
Graças a este trabalho, conquistei amigas valiosas e eternas:
À minha amiga tão querida Paty, a melhor pessoa desse mundo. Não tenho palavras
para dizer tudo que já fez por mim, serei eternamente grata por tê-la como companheira. A
certeza de ter seu ombro amigo, me ajudou a enfrentar os mais diversos problemas. Valeu
doida!
À minha amiga Alessandra, a alegria em pessoa, obrigada por tantos conselhos, cafés
terapias e festas. É um exemplo de vida para mim!
A todo o grupo de Fotoquímica e Fotobiologia, por sempre me ajudarem. À Dani
Manfrim, pelos ensinamentos e pela amizade. A Fernando Lucas Primo pela enorme
disponibilidade em me socorrer e, nesta última etapa do trabalho, tive a oportunidade de
reconhecê-lo como um grande amigo. Ângelo, Gilson, e Paula, obrigada pela amizade e pela
8
ótima convivência. Marcilene, Paloma, Gisele, Andreza, Carol, Dani Zancanela, Nathália,
todos os alunos da iniciação, obrigada pelo apoio e amizade.
À minha querida Olímpica, o socorro imediato! Não apenas como técnica do
laboratório, mas uma amiga única. Obrigada pelos conselhos e por sempre estar ao meu lado.
Às minhas amigonas Nati, Tati, Carol, Carolzinha, Cíntia, Flavitcha e Fernandinha que
sempre estão a postos para o que der e vier, adoro vocês! Ao povo do “saia justa”, aos que
faltaram citar, Val, os Jotas, obrigada por este instante particular do nosso dia!
Às minhas grandes amigas Ana Lúcia e Alessandra pelo carinho e amizade desde a
infância.
À Djuly (in memorian) pela fidelidade e pelo amor. A saudade é infinita!
Às minhas cunhadas e sobrinhos, tios e tias, principalmente meus padrinhos Néia e
Délio e também minha madrinha Mai por sempre torcerem pelas minhas conquistas.
À Bernadete e ao Major pelo carinho com que me acolhem em sua casa todos os dias.
Ao meu primeiro professor de Química, José Dirceu, pela consideração que sempre
demonstrou por mim.
Às minhas companheiras de casa, Jordana e Cássia, pela ajuda diária e amizade.
Ao pessoal da Secretaria do Departamento, da Secretaria de Pós-Graduação, em
especial a Lâmia, pela enorme paciência e cooperação.
À Capes, CNPq, pelos auxílios financeiros, sem os quais o trabalho não seria
realizado.
9
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................... x
ABSTRACT ...............................................................................................................xi
I. INTRODUÇÃO .......................................................................................................1
I.1 Câncer ................................................................................................................. 1
I.2. Terapia Fotodinâmica ......................................................................................... 2
I.3. Mecanismos Fotoquímicos e Fotofísicos da TFD ................................................5
I.4. Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinâmica .............................. 9
I.5. Compostos nitrosilos de rutênio............................................................................12
I.6. Sistemas de liberação de fármacos........................................................................15
II. OBJETIVOS.............................................................................................................18
III. PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................... 19
III.1 Materiais ......................................................................................................... 19
III.2 Preparações ..................................................................................................... 20
III.3 Aparelhagem................................................................................................... 22
III.4 Métodos .......................................................................................................... 25
III.4.1. Estudos espectroscópicos no estado estacionário da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogêneo................................................................ 25
III.4.2 Preparação da ZnPC, do complexo de rutênio e da associação dos dois
fármacos em meio lipossomal.................................................................................26
III.4.3 Caracterização do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partículas............................................................................................................. 27
III.4.4 Estudos espectroscópicos no estado estacionário da Zinco ftalocianina, do
complexo Ru-tpy e da associação dos dois fármacos em meio lipossomal ........... 28
III.4.5 Estudos de supressão de fluorescência da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal.................................................................................... 29
Dissertação de Mestrado – D.S. Maranho
III.4.6 Determinação do rendimento quântico de fluorescência (Φ
f
) da Zinco ftalocianina
e de sua associação ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal.............................. 30
III.4.7 Medidas de fluorescência resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto ............................................................................................ 31
III.4.8 Estudos dos estados excitados tripletes por fotólise por pulso de laser
............................................................................................................................ 31
III.4.9 Determinação do rendimento quântico de produção de oxigênio singlete (Φ
∆
)
............................................................................................................................ 32
III.4.10 Estudos de detecção de NO gerado por fotólise de pulso a laser em
675 nm................................................................................................................ 33
III.4.11 Estudos in vitro........................................................................................... 37
III.4.11.1 Crescimento e manutenção da cultura de células da linhagem neoplásica de
melanoma de rato (B-16 F10).............................................................................. 37
III.4.11.2 Controle da integridade da membrana celular....................................... 38
III.4.11.3 Determinação da Toxicidade da ZnPC, do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausência de luz. ................................................................... 40
II.4.11.4 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto ................................................................................................. 41
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................42
IV.1 Estudos Fotofísicos ......................................................................................... 43
IV. 1.1 Estudos espectroscópicos no estado estacionário da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogêneo e lipossomal ...................................... 43
IV.1.2 Caracterização do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partículas
............................................................................................................................ 48
IV. 1.3 Estudos espectroscópicos no estado estacionário da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal................................................................................. 50
Dissertação de Mestrado – D.S. Maranho
IV.1.4 Estudos de supressão de fluorescência da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal....................................................................................... 52
IV.1.5 Determinação do rendimento quântico de fluorescência (Φ
f
) da ZnPC e de sua
associação ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal........................................... 56
IV.1.6 Medidas de fluorescência resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associação ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal. ............................... 60
IV.1.7 Estudos dos estados tripletes por fotólise por pulso de laser...................... 63
IV.1.8 Determinação do rendimento quântico de produção de oxigênio singlete
(Φ
∆
) .................................................................................................................... 68
IV. 1.9 Estudos de detecção de NO gerado por fotólise de pulso a laser em
675 nm................................................................................................................ 70
III.2 Estudos in vitro ............................................................................................... 75
III.2.1 Determinação da Toxicidade da ZnPC, do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausência de luz. ................................................................... 75
IV.2.2 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto................................................................................................................... 77
V. CONCLUSÕES .................................................................................................... 80
VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................... 82
Dissertação de Mestrado – D.S. Maranho
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Princípio básico da terapia fotodinâmica (TFD) ------------------ 5
Figura 2
Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilização -- 7
Figura 3
Estrutura química das metalo ftalocianinas.-------- -------------- 11
Figura 4
Fórmula estrutural do complexo [Ru(NH.NH)(tpy)NO]
3+
(Ru-
tpy) --
15
Figura 5
Representação esquemática de uma vesícula unilamelar
mostrando interações com diferentes substâncias -----------------
16
Figura 6
Figura esquemática da preparação dos lipossomas --------------- 27
Figura 7
Aparato montado em capela para geração de óxido nítrico
gasoso -------------------------------------------------------------------
34
Figura 8
Medida do NO liberado através do NO-meter (acima) e da
fibra do Laser (abaixo) -----------------------------------------------
36
Figura 9
Espectro de absorção da ZnPC (5,0 µmol.L
-1
) em etanol -------
44
Figura 10
Espectro de absorção do complexo Ru-tpy 50 µmolL
-1
em
tampão fosfato, pH= 7,4 ----------------------------------------------
45
Figura 11
Espectro de emissão de fluorescência (excitação fixa em 610
nm) da ZnPC (5,0 µmolL
-1
) em etanol -----------------------------
46
Figura 12
Espectro de absorção em meio lipossomal da ZnPC (−), do
complexo Ru-tpy (−) e dos dois compostos associados (−) -----
47
Figura 13
Espectro de emissão de fluorescência da ZnPC (−)e associada
ao complexo Ru-tpy (−) em meio lipossomal ---------------------
51
Figura 14
Efeitos da supressão na emissão de fluorescência da ZnPC
(5,0 µmolL
-1
) conforme adição do complexo Ru-tpy em meio
lipossomal, na faixa de concentração crescente (0 a 50,0
µmolL
-1
) ----------------------------------------------------------------
52
Figura 15
Gráfico de Stern-Volmer para a supressão da fluorescência da
ZnPC conforme adição do complexo Ru-
tpy
(R
2
= 0,982964, Y = 1,0448 + 5793,4 X) --------------------------
53
Figura 16
Voltanograma cíclico do complexo Ru-tpy (1,0 mmolL
-
1
) em
10 molL
-1
de tampão fosfato (pH 7.4). (As setas indicam o
começo e a direção). O inserto é o cronoamperograma de
liberação do NO controlada pelo potencial de eletrólise em -0.2
V vs Ag/AgCl da solução do complexo Ru-tpy -------------------
55
Dissertação de Mestrado – D.S. Maranho
Figura 17
Curva de decaimento e ajuste exponencial para o
fotossensibilizador ZnPC (5,0 µmolL
-1
) associado ao complexo
Ru-tpy (50,0 µmolL
-1
) em lipossoma. O Inserto abaixo da
figura representa o resíduo médio -----------------------------------
61
Figura 18
Espectro de absorção do transiente obtido através do método
de fotólise por pulso de laser da ZnPC (5,0 µmolL
-1
) associada
ao complexo Ru-tpy (50,0 µmolL
-1
) em meio lipossomal após
excitação por pulso de laser em 355 nm, mostrando a absorção
máxima do triplete centrada no comprimento de onda de 480
nm e o fotobranqueamento do estado fundamental centrado a
aproximadamente 380 nm e 580 nm. A curva de decaimento
dos transientes no máximo da absorção triplete em 480 está
mostrada no inserto ---------------------------------------------------
66
Figura 19
Espectro de absorção da ZnPC 5,0 µmolL
-1
incorporadas em
lipossomas sob irradiação do laser em 675 nm, na faixa total de
energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s ----
71
Figura 20
Espectro de absorção da ZnPC 5,0 µmolL
-1
e do complexo Ru-
tpy (50,0 µmol.L
-1
) incorporados em lipossomas sob irradiação
do laser em 675 nm, na faixa total de energia de 0 J a 60 J num
intervalo de tempo de 0 s a 150 s ------------------------------------
72
Figura 21
Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o
complexo Ru-tpy sob irradiação do laser em 675 nm ------------
73
Figura 22
Porcentagem de células B16-F10 vivas após 3 horas de
incubação com as formulações lipossomais estudadas. 1=
lipossoma vazio, 2 = Ru-tpy 0,5 mmolL
-1
em lipossoma, 3 =
ZnPC 5,0 µmolL
-1
em lipossoma e 4 = ZnPC /Ru-tpy (5,0
µmolL
-1
/0,5 mmolL
-1
) no sistema lipossomal. --------------------
76
Figura 23
Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para células
B16-F10. 1 = ZnPC 1 µmolL
-1
em lipossoma; 2 = ZnPC/Ru-
tpy (1µmolL
-1
/50 µmolL
-1
) no sistema lipossomal; 3 =
ZnPC/Ru-tpy (5 µmolL
-1
/50 µmolL
-1
) no sistema lipossomal. -
----------------------------------------------------------------------------
78
Dissertação de Mestrado – D.S. Maranho
LISTA DE TABELAS
Tabela I
Tamanho das partículas ------------------------------- 50
Tabela II
Rendimentos Quânticos de Fluorescência (Φ
f
) ----
59
Tabela III
Tempos de vida de fluorescência (τ
s
), Amplitude
relativa (A) para o fotossensibilizador ZnPC em meio
homogêneo, meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy ------------------------------------------------------------
62
Tabela IV
Tempos de vida dos estados excitados tripletes
(τ
t
), Amplitude relativa (A) para o fotossensibilizador
ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-
tpy ----------------------------------------------------------------
67
Tabela V
Valores de rendimento quântico de produção do
oxigênio singlete ------------------------------------------------
69
Tabela VI
Viabilidade celular após a incubação por 3 horas
com as formulações lipossomais estudadas -----------------
77
Dissertação de Mestrado – D.S. Maranho
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
ZnPC Zinco ftalocianina
Ru-tpy Complexo nitrosilo de rutênio
EROs Espécies reativas de oxigênio
ERONs Espécies reativas de nitrogênio
NO Óxido nítrico
TFD Terapia fotodinâmica
HpD Hematoporfirina
FS Fotossensibilizador
1
O
2
Oxigênio singlete
•
OH
Radical hidroxila
•
O
2
−
Ânion radical superóxido
H
2
O
2
Peróxido de hidrogênio
S
0
Estado fundamental
S
n
Estado excitado singlete superior
S
1
Estado excitado singlete
T
1
Estado excitado triplete
0
F Fotossensibilizador no estado fundamental
1
F Fotossensibilizador no estado singlete
3
F Fotossensibilizador no estado triplete
S Substrato biológico
3
O
2
Oxigênio molecular
S-OOH Peróxidos
NO
+
Íon nitrosônio
NO
-
Ânion nitróxido
Dissertação de Mestrado – D.S. Maranho
O
2
Gás oxigênio
CO Monóxido de carbono
[Ru(NH.NH)(tpy)NO]
3+
Complexo nitrosilo de rutênio
DPPC
DL-α-dopalmitoil fosfatidilcolina
SRE Sistema do retículo endotelial
LLC Lipossomas de longo tempo de circulação
PEG Polietileno glicol
DMF Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfóxido
ε
Coeficiente de absortividade molar
I
f0
Intensidade de fluorescência na ausência do supressor
I
f
Intensidade de fluorescência na presença do supressor
kq Constante de supressão
τ
0
Tempo de vida do fluoróforo na ausência do supressor
[Q] Concentração do supressor
Ksv Constante de Stern-Volmer
Φ
f
Rendimento quântico de fluorescência
Φ
∆
Rendimento quântico de oxigênio singlete
τ
∆
Tempo de vida de oxigênio singlete
Φ
NO
Rendimento quântico de liberação de NO
MTT 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-brometo difenil tetrazolium
τ
s
Tempo de vida de fluorescência
A Amplitude relativa
T
1
*
Estado triplete excitado
τ
t
Tempo de vida dos estados tripletes
1
ZnPC Zinco ftalocianina no estado singlete
0
ZnPC
Zinco ftalocianina no estado fundamental
3
ZnPC Zinco ftalocianina no estado triplete
ISC Cruzamento intersistema
Dissertação de Mestrado – D.S. Maranho
RESUMO
Neste trabalho, propusemos a utilização do fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) associado ao complexo nitrosilo de rutênio (Ru-tpy) por meio de lipossomas de longo
tempo de circulação (LLC), com o objetivo de analisar o efeito sinérgico das espécies reativas
de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERONs) geradas, respectivamente
pelos mesmos, atuando sobre uma linhagem celular neoplásica.
Foram estudadas as propriedades fotofísicas e fotoquímicas do sistema misto
ZnPC/Ru-tpy, empregando-se técnicas de espectroscopia no estado estacionário e resolvido
no tempo. Com isto, foi possível determinar importantes parâmetros que elucidaram seu perfil
fotodinâmico, confirmando sua viabilidade para aplicação em estudos in vitro e in vivo.
Estes estudos também indicaram uma possível interação entre a ZnPC e o complexo
Ru-tpy, através do mecanismo de transferência de elétron do fotossensibilizador para o
complexo de rutênio, desta forma liberando o óxido nítrico (NO).
Realizamos os estudos em meio biológico, utilizando a linhagem neoplásica B16-F10,
avaliando a toxicidade dos sistemas lipossomais na ausência e na presença de luz.
Os nossos resultados demonstraram que o sistema misto ZnPC/Ru-tpy em meio
lipossomal, apresenta propriedades fotofísicas e fotobiológicas úteis, gerando as espécies
reativas (EROs e ERONs), atuando sinergicamente pela Terapia Fotodinâmica (TFD).
Dissertação de Mestrado – D.S. Maranho Resumo
ABSTRACT
We proposed in this work the use of photosensitizer Zinc phthalocyanine (ZnPC)
associated with the nitrosyl ruthenium complex (Ru-tpy) in long circulation liposomes
(“stealth liposome”), with the aim of analyzing the synergistic effects of the reactive of
oxygen species (EROs) and reactive of nitrogen species (ERONs) generated, acting on the
neoplastic cell line.
The photophysical and photochemical properties of the mix system ZnPC/Ru-tpy were
studied being used spectroscopic techniques in the stationary state and resolved in the time.
With these studies were possible to determine important parameters that elucidated its
photodynamic profile, confirming the viability for application in studies in vitro and in vivo.
These studies also indicated the possible interaction between ZnPC and the complex
Ru-tpy through the electron transfer process from the photosensitizer to the nitrosyl ruthenium
complex which leads to release nitric oxide (NO).
We accomplished the biological studies using the neoplastic cell line B16-F10,
evaluating the toxicity of the liposomes in the absence and presence of light.
Our results demonstrated that the system ZnPC/Ru-tpy in the “stealth liposome”
presents useful photophysical and photobiological properties, generating the species reactives
(EROs and ERONs) to work synergically for the Photodynamic Therapy (PDT).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Abstract
I. INTRODUÇÃO
I.1 Câncer
“Câncer” é o termo comum dado a qualquer tumor maligno ou neoplasia. É uma
doença caracterizada pelo crescimento desordenado de células, que sofreram mutações
genéticas, invadindo e destruindo os tecidos adjacentes, podendo espalhar-se (metástase) para
outras regiões do corpo. Quase todos os tumores são causados por anomalias no material
genético das células normais. Estas anomalias podem ser causadas por fatores desencadeantes,
como a exposição excessiva à radiação ultravioleta (câncer de pele), a infecção por certos
vírus (câncer no colo do útero, alguns linfomas), tabagismo (câncer no pulmão, na laringe), o
alcoolismo (câncer no estômago, no pâncreas), entre outros.
A Organização Mundial de Saúde apontou em 2005, a morte de 35 milhões de pessoas
por doenças crônicas no mundo, sendo que aproximadamente 7,6 milhões ou 21,7%
correspondam às neoplasias. No Brasil, as estimativas segundo o Instituto Nacional do Câncer
para o ano de 2008 e válidas também para o ano de 2009 apontam que ocorrerão 467 mil
casos novos de cânceres. O câncer de pele do tipo não-melanoma será o mais incidente na
população brasileira, seguido pelos tumores na próstata e no pulmão para o sexo masculino e
o câncer de mama e de colo de útero para o sexo feminino.
Diante deste cenário, fica clara a necessidade de investimentos no desenvolvimento de
novas terapias para o tratamento do câncer bem como na pesquisa de sistemas, que permitam
a detecção precoce e assistência aos pacientes.
Os tratamentos clássicos adotados contra o câncer são realizados através da cirurgia,
radioterapia, quimioterapia ou transplante de medula óssea, sendo em muitos casos,
necessário combinar essas modalidades. No entanto, esses tratamentos convencionais
apresentam inúmeras desvantagens, como por exemplo, a desfiguração do paciente,
resultando em prejuízos à sua auto-estima, inúmeros efeitos colaterais (quimioterapia e
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
radioterapia), além de uma perspectiva de cura nem sempre eficaz (Sharman , Allen e Van
Lier, 1999)
Em virtude disso, tratamentos alternativos têm sido desenvolvidos, dentre os quais se
destaca a Terapia Fotodinâmica (TFD), que por sua vez é uma técnica pouco invasiva e que
pode ser aplicada repetidamente no mesmo local, além de apresentar mínimos efeitos
colaterais (Pandey, 1992; Kübler, 2005).Assim, o FDA (U.S. Food and Drug Administration)
a reconheceu como uma terapia eficaz para o tratamento de várias doenças, em especial o
câncer.
I.2. Terapia Fotodinâmica
A utilização da luz como agente modulador da resposta biológica dos organismos
vivos é conhecida há muito tempo. Seu uso como agente terapêutico remonta a 3000 AC,
quando os egípcios usaram-na para tratar vitiligo através de uma combinação de plantas
ingeridas pelo paciente e sua exposição à luz solar. O sucesso do tratamento baseava-se no
desenvolvimento, no organismo, de uma reação fotoquímica mediada pelos psoralenos
presentes nas plantas (Spikes e Bommer, 1993).
No entanto, foi somente em meados de 1900 que Oscar Raab relatou que a
combinação de baixas concentrações de certos compostos coloridos (usualmente chamados de
corantes, ex. eosina e acridina), na presença de luz, poderia rapidamente induzir a destruição
de protozoários e paramécios.
Após Raab, as primeiras experiências visando a aplicação dos efeitos fotodinâmicos
no tratamento de tumores em humanos foram realizadas em 1903 por Tappeiner e Jesionek,
que empregaram uma solução aquosa de eosina como um fotossensibilizador para tratar o
câncer de pele, observando-se uma redução na massa tumoral após o tratamento.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
No período de 1960 a 1967, Lipson e colaboradores (Lipson e Baldes, 1960),
investigaram o acúmulo preferencial de um derivado hematoporfirínico (Photofrin
I, HpD)
em tumores, utilizando camundongos e ratos e observaram que a incidência da luz
proporcionou a regressão da doença. Subseqüentemente, Lipson obteve sucesso no tratamento
de uma mulher que possuía câncer de mama usando HpD e irradiação seletiva do tumor com
luz visível, marcando assim o início da TFD como terapia clínica para câncer (Simplício ,
Maionchi e Hioka, 2002).
Nos anos 70, Dougherty et al (Dougherty, 1978; Dougherty, 1984; Dougherty, 1985)
demonstraram que o HpD, em combinação com luz vermelha, poderia erradicar
completamente o crescimento de tumores de mama em ratos. Diante deste resultado, a
purificação do HpD realizado por Dougherty levou à produção do Photofrin II
, que foi
aplicado em vários testes de cânceres de bexiga e pele, sendo a primeira droga aprovada pelo
FDA para uso em humano, conduzindo às pesquisas modernas de TFD.
No Brasil, a técnica da TFD vem sendo estudada desde 1995 pelo grupo de Pesquisa
em Fotobiologia e Fotomedicina da FFCLRP-USP, no estudo de novos sistemas de liberação
de fármacos e fotossensibilizadores aplicados à TFD (Macaroff et al., 2005; Primo, Bentley e
Tedesco, 2008; Rotta , Lunardi e Tedesco, 2003; Simioni et al., 2008). O procedimento da
TFD vem sendo aplicado em estudos clínicos desde 1999 pela equipe do Dr. Guilherme
Cestari Filho, com a implementação desta técnica no Hospital Amaral de Carvalho em Jaú-
SP, onde pacientes com câncer nas cordas vocais, estômago, garganta e pulmão vêm sendo
tratados. Além das aplicações clínicas, têm sido realizadas pesquisas científicas para o
desenvolvimento de novas fontes de luz laser.
Em 2000, no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto-USP, foram iniciados tratamentos de doenças de pele utilizando TFD, com a
participação de um grupo composto por farmacêuticos, químicos, médicos e físicos (Souza et
al., 2005; Tedesco, Rotta e Lunardi, 2003; Turchiello et al., 2003).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
A Terapia Fotodinâmica (TFD) consiste na administração sistêmica ou tópica de
certos agentes fotossensibilizadores, que após se localizarem preferencialmente nos tecidos
neoplásicos são ativados pela luz (em comprimento de onda apropriado) e na presença de
oxigênio molecular, levam a produção de oxigênio singlete (
1
O
2
) e radicais livres (ex.
espécies reativas de oxigênio
•
O
2
-
e
•
OH, denominadas
EROs) que são tóxicos para as células
(Figura 1).
.
Figura 1 - Princípio básico da terapia fotodinâmica (TFD).
O fármaco fotossensibilizador ou a luz, isolados, não apresentam toxicidade para o
organismo. Entretanto, a combinação dos dois agentes em presença de oxigênio induz a morte
das células tumorais (Mironov et al., 2003).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
I.3. Mecanismos Fotoquímicos e Fotofísicos da TFD
A luz utilizada na TFD deve ser de um comprimento de onda adequado, capaz de ser
absorvida pelo fármaco fotossensibilizador (FS).
A faixa espectral em que esta absorção
ocorre, deve estar situada preferencialmente na região entre 600 e 850 nm, conhecida como
“janela terapêutica”, onde a transparência do tecido biológico é elevada, e a absorção desta
irradiação por moléculas endógenas do sistema biológico é praticamente nula. A penetração da
luz nos tecidos é mais efetiva na região de 630 nm (cerca de 2-3 mm) e na região de 700-800
nm (cerca de 5-6 mm) (Dougherty e Macdonald, 2001; Bonett e Martinez, 2001).
Desta maneira, a irradiação do tumor leva a absorção da luz pelo fármaco
fotossensibilizador previamente incorporado, levando as moléculas a um estado eletrônico de
maior energia e, na presença de oxigênio molecular (presente no meio), desencadeia vários
processos fotofísicos, levando a produção de espécies reativas excitadas que acabam por
induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (
1
O
2
,
•
O
2
−
,
•
OH, H
2
O
2
) definidas como
EROs. Estas espécies atacam centros específicos dentro dos sistemas celulares,
desencadeando assim a morte de tais tecidos por um processo de apoptose ou necrose celular
(De Rosa e Crutchley, 2002; Bonnett e Berenbaum, 1989).
No diagrama de Jablonski (Figura 2), estão representados os processos fotofísicos e
fotoquímicos, que um fotossensibilizador pode sofrer após a absorção de radiação visível.
O fármaco fotossensibilizador no estado fundamental (S
0
), após absorver um fóton de
luz, é excitado a um estado eletrônico de maior energia (S
n
), decaindo rapidamente por
processos não radiativos ao mais baixo estado singlete (S
1
). A seguir, dá origem ao estado
excitado triplete de menor energia (T
1
) por um processo de interconversão, o mesmo via
cruzamento intersistema (Sharman, Allen e Van Lier, 1999; Foote, 1991a; De Rosa e
Crutchley, 2002). Este decaimento energético é fundamental para a terapia fotodinâmica. A
substância fotossensível localizada no estado triplete excitado, apresenta um tempo de vida
maior do que no estado singlete excitado (Sharman, Allen e van Lier, 2000). Dessa forma o
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
fotossensibilizador no estado T
1
pode interagir fotoquimicamente com moléculas de
oxigênio, ou biomoléculas localizadas próximas a região irradiada, gerando espécies
citotóxicas produzidas durante a TFD (Van Nostrum, 2004; Oleinick, Morris e Belichenko,
2002; Gorman et al., 2004).
Figura 2: Digrama de Jablonski para o processo de fotossensibilização
Os processos de fotossensibilização podem ser explicados através de dois
mecanismos distintos (Sharman , Allen e Van Lier, 1999; Foote, 1991a):
- Mecanismo Tipo I: envolve a abstração de um átomo de hidrogênio ou reações de
transferência de elétrons entre o fotossensibilizador no estado excitado triplete e diferentes
macromoléculas biológicas, levando à formação de radicais livres e/ou íons radicais. Poucos
materiais biológicos apresentam facilidade de fotorredução (por exemplo, quinonas e
citoquinas) em processos nos quais temos a oxidação do fotossensibilizador a cátion radical-π
e o substrato é reduzido. A espécie reduzida pode transferir um elétron ao oxigênio molecular
presente no meio formando espécies reativas de oxigênio como peróxidos, ânion superóxido,
etc. Este mecanismo de fotossensibilização é esquematizado abaixo:
- Reação redox com biomoléculas, produção de superóxido, etc.
0
F →
1
F →
3
F
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
3
F + S → F
+ •
+ S
− •
(transferência de elétrons)
S
− •
. +
3
O
2
→ S + O
2
− •
→ HO
•
+ HO
•
Onde
0
F,
1
F,
3
F é o FS no estado fundamental, singlete e triplete, respectivamente e S é o
substrato.
- Mecanismo Tipo II: ocorre a transferência de energia para o oxigênio molecular com
formação do oxigênio singlete (
1
O
2
). O oxigênio singlete é uma espécie altamente reativa que
oxida vários substratos biológicos. Acredita-se que o oxigênio singlete seja o principal
mediador dos danos fotodinâmicos nos sistemas biológicos, pois reage rapidamente e
indiscriminadamente com os mais variados materiais biológicos eletrofílicos, como lipídios
insaturados, proteínas, ácidos nucléicos, etc, sendo apontado como o principal responsável
pela inativação da célula tumoral. Este mecanismo é esquematizado abaixo:
- Mediado por oxigênio singlete. Por exemplo, a peroxidação lipídica.
0
F →
1
F →
3
F
3
F +
3
O
2
→
0
F +
1
O
2
(transferência de energia)
1
O
2
+ S → S-OOH (peróxidos, etc)
Onde
0
F,
1
F,
3
F é o FS no estado fundamental, singlete e triplete, respectivamente e S é o
substrato.
Embora boa parte dos estudos envolvendo a TFD se basearem na utilização do
oxigênio singlete como espécie reativa (Yamamoto, Nagano e Okura, 2003; Kochevar,
Lambert e Lynch, 1996; DePaoli, DePaoli e Borissevitch, 2002), tem sido grande a procura
por outras espécies úteis, como radicais livres derivados dos corantes utilizados, outras
espécies radicalares independentes de oxigênio (Niziolek, Korytowski e Girotti, 2003), como
por exemplo as espécies reativas de nitrogênio (Rotta, Lunardi e Tedesco, 2003; Oliveira et
al., 2007; de Lima, R. G., 2006).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
I.4. Os fotossensibilizadores utilizados na Terapia Fotodinâmica
Os fotossensibilizadores podem ser definidos como substâncias capazes de
absorverem a luz e transferirem esta energia absorvida para moléculas de oxigênio molecular
gerando EROs, bem como causarem danos biológicos. Estes compostos devem possuir certas
características, bem como possuir propriedades fotofísicas favoráveis como: baixa toxicidade
no escuro, fotossensibilidade não prolongada, alta afinidade e penetração preferencial nos
tecidos tumorais em relação aos tecidos normais (o que, em geral, acontece com o aumento de
hidrofobicidade do FS). Além destas características, é interessante que o FS seja anfifílico, ou
seja, solúvel em meio fisiológico, mas que contenha também uma matriz hidrofóbica,
permitindo a sua permeação na membrana celular.
O grande avanço da TFD teve início com a descoberta da primeira geração de
fotossensibilizadores derivados de hematoporfirina (HpD). O primeiro composto aprovado
pela Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizado clinicamente foi o Photofrin
,
um derivado da hematoporfirina que apresenta outros variantes comerciais (Photosan
,
Photogem
, Photocarcinorin
e Haematodrex
) (Nyman e Hynninen, 2004; Brown , Brown e
Walker, 2004). Estes FS de primeira geração são eficientes, entretanto não absorvem bem a
luz na região do vermelho do espectro eletromagnético (acima de 650 nm), dentro da
“janela terapêutica” e os mesmos ainda possuem baixa seletividade na sua incorporação e
retenção pelos tecidos tumorais
Dentro da segunda geração de moléculas fotossensibilizadoras merecem destaque
alguns compostos potencialmente ativos, como as clorinas e as ftalocianinas que têm sido
muito estudados nos últimos anos (Oliveira et al., 2005; Nunes, S. M., 1999). Comparados
com os derivados de hematoporfirina (HpD) e sua versão comercial Fotofrin
, esta segunda
geração de fotossensibilizadores realmente exibe uma melhor atividade fotodinâmica. As
ftalocianinas foram consideradas como ótimos agentes fotossensibilizadores para a TFD
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
devido a sua baixa toxicidade, uma alta capacidade de se acumular seletivamente no tecido
tumoral e um alto coeficiente de absortividade molar na região do vermelho do espectro
(comprimento de ondas maiores que 650 nm) (Sibata, Tedesco e Marchetti, 2004; Oliveira et
al., 2005; Nunes, Sguilla e Tedesco, 2004).
A estrutura das ftalocianinas (Owens et al., 1998) mimetizam as porfirinas em seu
macrociclo central, que consiste de uma unidade cíclica tetrapirrólica (Figura 3). Contudo, nas
ftalocianinas, as subunidades pirrólicas são unidas por átomos de nitrogênio, enquanto nas
porfirinas as subunidades são unidas através de pontes de metileno. Além disso, nas
ftalocianinas, a conjugação do macrociclo é estendida por anéis benzênicos sobre quatro
unidades pirrólicas, resultando em uma forte banda de absorção na região de 650 a 670 nm.
Figura 3: Estrutura química das metalo ftalocianinas.
A complexação das ftalocianinas com íons metálicos diamagnéticos, tais como Zn
2+
,
Al
3+
e Ga
3+
dão origem a complexos de ftalocianinas com alto rendimento quântico do estado
excitado triplete (φ
T
> 0,4) e com tempos de vida longos (Darwent et al., 1982).
Conseqüentemente, pode-se esperar que estes complexos exibam atividades fotoquímicas e
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
fotodinâmicas. Entre as metalo ftalocianinas, o complexo de Zn (II) apresenta as propriedades
fotofísicas mais favoráveis para a aplicação na TFD (Oliveira, D. M., 2006; Nunes, S. M.,
1999; Allen, Sharman e Van Lier, 2001).
Além disso, a Zinco ftalocianina (ZnPC) é promissora para uso na TFD, devido a sua
elevada seletividade pelo alvo tumoral e sua geração eficiente de oxigênio singlete altamente
citotóxico ao alvo biológico (Rotta, Lunardi e Tedesco, 2003; Oliveira, D. M., 2006; Lunardi
, Rotta e Tedesco, 2003).
O interesse pela combinação de diferentes espécies reativas, de fotossensibilizadores
ou até mesmo a combinação de terapias tem sido crescente. Este conceito de sinergismo na
TDF já vem sendo trabalhado, por exemplo, na utilização de terapias conjuntas, como a
Hipertermia e a TFD (Oliveira et al., 2006), a Eletroquimioterapia e TFD (Sersa et al., 2008)
ou através do uso combinado de fármacos fotossensibilizadores, que atuam por diferentes
mecanismos, com localização biológica diferentes, como por exemplo as porfirinas e
ftalocianinas com propriedades quelantes (Lunardi e Tedesco, 2005).
Podemos também combinar diferentes moléculas de fotossensibilizadores em uma
mesma estrutura que podem agir como fotossensibilizadores clássicos e ao mesmo tempo
induzir mudanças na homeostase iônica celular usando, por exemplo, a ZnPC associada ao
quelante Ca
2+
(Lunardi, Rotta e Tedesco, 2007). Além disso, há porfirinas e ftalocianinas
associadas a moléculas de éteres de coroa que podem atuar diretamente na homeostase de Na
+
K
+
, induzindo mudanças diretas no potencial de membrana, que promovem a morte celular
(Pelegrino et al., 2005).
Dentro deste contexto de sinergismo, a proposta apresentada neste trabalho foi a de
associar o fotossensibilizador ZnPC, ao complexo nitrosilo de rutênio
[Ru(NH.NH)(tpy)NO]
3+
, doador de NO, através do uso de um sistema de liberação de
fármaco adequado, com o objetivo de analisar o efeito conjunto das espécies reativas de
oxigênio (EROs) e as espécies reativas de nitrogênio, (ERONs) atuando sobre a linhagem de
célula neoplásica (Barbugli, P. A., 2007; de Lima, R. G., 2006; Oliveira, D. M., 2006).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
I.5 Compostos nitrosilos de rutênio
O óxido nítrico, NO, é a única molécula endógena conhecida, que reúne as
propriedades de neurotransmissor, de mediador constitutivo e indutível e de agente
citotóxico. Possui ação reguladora da pressão sangüínea, atua no sistema imunológico e nas
atividades do cérebro, fígado, pâncreas, útero e pulmões (Cullota e Koshland Junior, 1992;
Feldman , Griffith e Stuehr, 1993; Ignarro, 2000; Richter-Addo e Legzdins, 1992; Wink et
al., 1993).
A molécula de NO é uma das moléculas classificadas como mensageiro em vários
processos biológicos. Nessa função, o NO não depende de transportadores específicos, nem
de canais de passagem intracelulares. Ele se difunde pela célula, com facilidade, tanto em
meio hidrofílico como em meio lipofílico. Sua ação fisiológica depende muito mais de suas
propriedades físico-químicas do que de sua conformação espacial (Feldman , Griffith e
Stuehr, 1993).
Atribuem-se as ações bioquímicas do óxido nítrico à diversidade de suas espécies, ou
seja, a espécie NO
+
(íon nitrosônio), que é formada pela retirada do elétron desemparelhado
no orbital π*, e a espécie NO
-
(ânion nitróxido), que é formada pela adição de um elétron ao
orbital. O ânion nitróxido é isoeletrônico ao gás oxigênio (O
2
) e pode existir no estado
singlete de maior energia ou no estado triplete, de menor energia. O íon nitrosônio é
isoeletrônico ao monóxido de carbono (CO) e reage rapidamente com água e outros
nucleófilos (Wink et al., 1993).
Diante da variedade de condições no meio intracelular, como tipo de célula alvo,
concentração de NO e a presença de outras espécies radicalar, o NO atua em carcinogênese,
progressão tumoral e na terapia do câncer (Chiang et al., 2005; Weller, 2003). Sabe-se que a
apoptose ou morte celular programada é caracterizada por uma série de alterações celulares
morfológicas e bioquímicas. Um mau funcionamento deste processo contribui para a
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
patogênese de diversas doenças (Miller e Marx, 1998). O NO é um potente modulador da
homeostase operacional de célula, prevenindo ou induzindo a apoptose. Esta ação é modulada
por interações diretas e indiretas sendo dose-dependentes e tipo celular específicas. Em
algumas células o NO pode promover a apoptose, enquanto que em outras o NO pode inibir o
processo de morte celular programada (Chung et al., 2001).
Devido à extrema instabilidade das moléculas de NO em meio biológico e seu curto
tempo de meia vida (aproximadamente 5s), torna-se difícil o estudo de seus efeitos
fisiológicos. Assim, existe um grande interesse em compostos químicos que possam servir de
pró-drogas para a liberação controlada do NO nos sistemas biológicos (Works et al., 2002;
Ignarro, 2000).
É de interesse para os ensaios clínicos, o estudo envolvendo complexos metálicos que
possam agir como doadores de NO em um organismo biológico, haja vista a possibilidade de
se controlar a liberação do óxido nítrico por reações fotoquímicas e/ou redutimétricas.
Metalo-drogas, cujo centro metálico é o rutênio, possuem boa aplicação clínica,
principalmente pela baixa toxicidade apresentada pelo metal. Isto se deve, em parte, à
semelhança das propriedades físico-químicas deste metal com as do ferro. O organismo
consegue proteger-se dos efeitos causados por um excesso de ferro através do aumento da
produção de proteínas captadoras de íons ferro, como a transferrina e a albumina. Alguns
autores acreditam que o mecanismo de proteção contra a toxicidade do rutênio seria igual ao
do ferro (Allardyce e Dyson, 2001).
O complexo metálico doador de NO utilizado nesse projeto foi o
[Ru(NH.NH)(tpy)NO]
3+
, designado ao longo do trabalho por Ru-tpy. Sua estrutura está
apresentada na figura 4. Este complexo foi sintetizado pelo grupo do Prof. Roberto Santana da
Silva, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP-USP), com o qual
desenvolvemos trabalhos de colaboração.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
[Ru(terpy)(L)NO
+
]
3+
HN
HN
COOH
NH.NHq
Ru
II
L
N
N
N
NO
+
L
L=
Figura 4: Fórmula estrutural do complexo [Ru(NH.NH)(tpy)NO]
3+
(Ru-tpy).
I.6 Sistemas de liberação de fármacos
A solubilidade dos fotossensibilizadores é um fator essencial para seu uso no
tratamento de neoplasias utilizando a TFD. Um dos desafios dos nossos estudos é vencer a
baixa seletividade do tumor e a baixa solubilidade em água de muitos compostos, determinada
quase sempre pela sua natureza hidrofóbica. Portanto sua administração intravenosa torna-se
uma tarefa difícil.
Dessa forma, vários sistemas de liberação de fármacos têm sido desenvolvidos para
modificar as propriedades fisico-químicas, farmacocinéticas e biológicas dos
fotossensibilizadores (Konan, Gurny e Allémann, 2002; Primo, Bentley e Tedesco, 2008;
Renno e Miller, 2001). Além disso, esta estratégia viabiliza a associação dos
fotossensibilizadores com outros compostos úteis para TFD, tornando possível a utilização de
sistemas sinérgicos (Primo et al., 2008; Pelegrino et al., 2005; Oliveira et al., 2005; Macaroff
et al., 2005).
Dentre os sistemas de liberação em estudo, destacam-se os lipossomas, os eritrócitos
resselados isolados do sangue, as nanopartículas biodegradáveis, as microesferas protéicas e
poliméricas entre outros sistemas (Chen, Pogue e Hasan, 2005; Lovcinsky et al., 1999; Primo
, Bentley e Tedesco, 2008; Simioni et al., 2007).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
Os lipossomas são estruturas vesiculares coloidais formados por bicamadas
fosfolipídicas. São formadas em água pela agregação de moléculas anfifílicas (como por
exemplo, as molécula de DL-α-dipalmitoil fosfatidilcolina – DPPC) e o Colesterol em
bicamadas que se fecham, resultando em um compartimento interno aquoso) conforme
mostrado na figura 5.
Figura 5: Representação esquemática de uma vesícula unilamelar mostrando interações com
diferentes substâncias.
Estes sistemas podem solubilizar fármacos lipofílicos (na bicamada lipídica), que de
outra forma seriam difíceis de serem administrados intravenosamente, podem prolongar o
tempo de ação do fármaco, liberando este lentamente no corpo. Deste modo são endocitados
ou fagocitados por células, abrindo novas oportunidades para fármacos que dependem da
administração lipossomal (Hoebeke, 1995). Podem também incorporar substâncias
hidrofílicas (dentro do compartimento interno aquoso).
Os lipossomas e outros veículos de liberação de fármacos, quando são administrados
via intravenosa, tendem a ser rapidamente fagocitados por macrófagos em vários tecidos do
sistema do retículo endotelial (SRE), com acúmulo preferencial no fígado e no baço. Este
processo de remoção pode ocorrer, primeiramente pela opsonização dos lipossomas, realizado
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
pelas opsoninas, que são elementos do soro sanguíneo que se ligam às partículas estranhas e
promovem a fagocitose, seguida da endocitose do lipossoma marcado pelo macrófago
(Woodle e Lasic, 1992).
Com base nas considerações apresentadas, existe a necessidade de que o sistema de
liberação, contendo o fármaco, circule na corrente sanguínea por um tempo mais longo
visando uma seletividade deste fármaco em um tecido alvo específico. Surgiram então os
chamados lipossomas de longo tempo de circulação (LLC) ou lipossomas furtivos (stealth)
(Allen, Hansen e Rutledge, 1989), nos quais a bicamada lipídica contém glicolipídios ou, mais
recentemente, lipídios conjugados como polietilenoglicol (PEG) (Nunes, Sguilla e Tedesco,
2004). Desta forma, estes sistemas são capazes de escapar do sistema imunológico e
permanecer estável por um tempo mais prolongado na corrente sangüínea, dirigindo-os assim
a outros sítios no organismo.
Portanto, a idéia de utilizar compostos fotossensíveis que são capazes de liberar
diferentes espécies reativas, associados em um mesmo sistema de liberação, abre um amplo
campo de ação dentro da TFD, tornando a idéia da TFD sinérgica cada vez mais promissora.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Introdução
II. OBJETIVOS
O objetivo principal deste trabalho foi analisar do ponto de vista fotofísico,
fotoquímico e fotobiológico os efeitos da associação de dois compostos fotoativos (ZnPC e
Ru-tpy), em sistemas de veiculação do tipo lipossomas de longo tempo de circulação (LLC) de
modo que esta ação sinérgica viesse a maximizar a ação fotodinâmica dos mesmos.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Objetivos
III. PARTE EXPERIMENTAL
III.1 Materiais
Os materiais comerciais listados a seguir foram utilizados sem tratamento prévio: DL-
α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), (Sigma Chemical Company), Colesterol (Avanti Polar
Lipids), polietilenoglicol (PEG) (Avanti Polar Lipids), Zinco ftalocianina (Aldrich). O
complexo Ru-tpy utilizado neste trabalho foi sintetizado e gentilmente cedido pelo grupo de
pesquisa do Profº. Drº. Roberto Santana da Silva (FCFRP-USP) com o qual desenvolvemos
trabalhos de colaboração.
Todas as soluções aquosas foram preparadas com água ultra pura, obtida através de
filtragem sequencial com colunas de troca iônica em um sistemas E-Pure da Barnestead D
3750, com filtragem final em membrana de 0,2 µm de diâmetro, pressão máxima de operação
em 50 % psi (3,4 Kg/cm
2
) e resistividade de 18 mΩ.
As soluções tampão fosfato (pH 7,4) 10 mmolL
-1
, utilizadas nas preparações
lipossomais e nos demais experimentos, foram preparadas pela mistura de diferentes volumes
de soluções de fosfato monobásico de sódio 0,01 molL
-1
(Sigma) e fosfato dibásico de sódio
0,01 molL
-1
(Sigma) preparados em água ultrapura.
Os solventes de grau analítico relacionados a seguir foram utilizados sem tratamento
prévio: dimetilformamida-DMF (Sigma), dimetilsulfóxido-DMSO (Sigma), etanol (Merck),
isopropanol (Merck).
Os estudos envolvendo cultura de células utilizaram os seguintes materiais: meio de
cultura RPMI 1640 (Gibco BRL), antibiótico (Penicilina/Streptomicina-Gibco BRL), glicose
(Sigma), bicarbonato de sódio (NaHCO
3
, Nuclear), soro fetal bovino (Gibco BRL), tampão
Hank´s (Gibco BRL), 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-brometo difenil tetrazolium (MTT, Sigma),
corante azul de tripan (Gibco BRL), tripsina-EDTA (Gibco BRL).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
Estes estudos foram realizados com a linhagem neoplásica de melanoma de rato B-16
F10, adquirida junto a American Type Culture Colletion (ATCC). Esse tipo de célula
neoplásica, é obtido originalmente de ratos C57BL/6JD/D. A indução deste tipo de neoplasma
(melanoma cutâneo) é feita pela injeção de metilcolantreno na cavidade toráxica de ratos. A
remoção do fluido presente nesta cavidade é feita após dois dias, e a subseqüente transfusão
para outros animais garante a proliferação deste tipo de células.
A solução de soro bovino fetal foi pré-aquecida a 56°C, para inativação das enzimas.
Em seguida, foi estocada em frascos de 150 mL e conservados no freezer a -20°C. O soro
bovino fetal apresenta em sua composição básica: insulina, hormônios e vários outros fatores,
indispensáveis ao crescimento celular.
Além destes materiais encontram-se à disposição, diferentes solventes orgânicos, bem
como outros sais inorgânicos, comumente utilizados em laboratório.
III.2 Preparações
As soluções de tampão fosfato (pH 7,4) 10 mmolL
-1
foram rotineiramente
preparadas pela mistura de diferentes volumes de soluções de fosfato de sódio monobásico 10
mmolL
-1
e fosfato de sódio dibásico 10 mmolL
-1
em água ultrapura.
As soluções estoques de ZnPC foram preparadas em uma mistura de DMSO/DMF
(1:1) e as soluções estoques do complexo Ru-tpy foram preparadas em tampão fosfato pH 7,4,
as duas soluções foram armazenadas por um período não superior a duas semanas, na
ausência de luz a - 20
o
C.
As concentrações foram determinadas espectrofotométricamente, utilizando-se os
coeficientes de extinção molar em 670 nm: ε = 2,3 x 10
5
molL
-1
cm
-1
em DMSO/DMF para a
Zinco ftalocianina (ZnPC) e em 358 nm ε = 2,45 x 10
4
molL
-1
cm
-1
para o complexo Ru-tpy.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
Todas as formulações lipossomais de DPPC foram preparadas pelo método de
injeção, conforme descritos na seção Métodos III.4.2 e armazenadas na ausência total de luz a
temperatura ambiente, por até 10 dias.
As soluções de tampão Hank´s (contendo antibiótico, sem bicarbonato de sódio e
fenol) foram rotineiramente preparadas pela diluição 10 vezes em água ultrapura, seguida de
filtração com membrana estéril de poro de 0,22 µm.
A solução de azul de tripan utilizada para determinar a viabilidade celular através
da contagem de células foi preparada na concentração de 0,4%, utilizando-se tampão Hank’s
como solvente (pH 7,2). Posteriormente, a solução final foi filtrada, através de uma membrana
de poro de 0,22 µm, e em seguida, aliquotada.
A solução de tripsina 0,25% utilizada no processo de replicagem celular para
desprender as células aderidas do tipo B-16 F10 das placas de cultura foi preparada diluindo a
solução estoque 10 vezes concentrada em tampão fosfato estéril com pH=7,4.
O meio de cultura RPMI 1640, utilizado no crescimento e manutenção das culturas
neoplásicas de melanoma de rato B-16 F10, contém 2,0 mmolL
-1
de L-glutamina e
adicionamos 2,0 g de bicarbonato de sódio e 2,4 g de Hepes para sua preparação.
Após a preparação de cada meio, antes da adição da solução de soro bovino fetal, o
pH foi ajustado para 7,4, sendo a mistura filtrada para sua esterelização com filtro estéril de
0,22 µm, em capela de fluxo laminar e recolhido em frasco estéril.
Antes da sua utilização, este meio foi enriquecido com 10 % de solução de soro
bovino fetal, 1 mL de antibiótico/antimicótico, denominado meio completo.
III.3 Aparelhagem
Nas preparações lipossomais feitas pelo método de injeção em meio orgânico utilizam
uma bomba de injeção peristáltica da World Precision Instruments (WPI) (modelo SP 100i).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
Nos estudos espectrofotométricos, foram realizadas as medidas de intensidade de
absorção em um espectrofotômetro de absorção modelos U-3000 da Hitachi; e os espectros de
emissão de fluorescência foram registrados em dois espectrofluorímetros, Jobin Yvon/
Fluorolog 3 da Spex, modelo FL3 e F-4500 da Hitachi, usando celas de quartzo de 1 cm de
caminho óptico.
Para as medidas de decaimento de fluorescência foi utilizado o método de contagem
simples de fótons. O sistema utilizado para excitação consiste de um conjunto de lasers. No
início do processo, um laser de diodos, com dois feixes emitindo em 809 nm, cada qual com
24 W de potência, bombeia um laser de estado sólido (Nd:YVO
4
- Millenia Xs - Spectra
Physics) que emite em 1064 nm. O feixe passa então, por um cristal dobrador de freqüências e
o feixe final, com potência podendo chegar a 10 W e comprimento de onda igual a 532 nm,
bombeia um laser de titânio-safira (Tsunami - Spectra Physics); o cristal de titânio-safira gera
pulsos de laser (com largura de 5 ps) em uma banda que vai de 840 até 1080 nm, com
freqüência máxima de repetição dos pulsos igual a 82 MHz. Um filtro bi-refringente seleciona
o comprimento de onda desejado. Após o selecionador de pulsos, o feixe passa por um
gerador de segundos e terceiros harmônicos, cujos comprimentos de onda do feixe na saída
estão na faixa utilizada para excitação de nossas amostras, que vai de 280 até 330 nm. O sinal
detectado como pulso de excitação, chamado IRF (instrument response function), tem largura
total a meia altura de 60 ps. Este estudo foi realizado com o auxílio do Laboratório de
Biofísica Molecular da FFCLRP/USP, o qual é coordenado pelo Profº Dr. Amando Siuiti Ito.
A fonte de irradiação utilizada nos experimentos de determinação do espectro de
absorção do transiente e do tempo de vida do triplete dos fármacos estudados, foi um sistema
laser Nd-YAG da Continuum, modelo SURELITE I-10. Para o agente fotossensibilizador
ZnPC e para o complexo de rutênio em estudo, foi utilizado como fonte de excitação, o
terceiro harmônico do laser Nd-YAG (355 nm). A energia média utilizada foi da ordem de 30
mJ/cm
2
, através de uma fenda de 8,0 mm de diâmetro. A uma distância de 10,0 cm da fenda
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
do laser, foi posicionado um suporte termostatizável para celas com agitação magnética
(Hellmam CUV-O-Stir).
A intensidade de luz foi determinada e o conjunto de pulsos por um "Power meter"
Field Master da Coherent (Santa Clara, CA), usando-se uma cabeça de detecção LM-30 V.
Nos estudos envolvendo a detecção do espectro de absorção de transiente, na faixa de
300 a 800 nm, adotou-se como procedimento o registro ponto a ponto, em intervalos de 10 nm
após a excitação (λ
exc
=355 nm) com laser de Nd-YAG. Os sinais dos transientes gerados
foram detectados por fotomultiplicadora da Hamamatsu modelo R928P e transferidos para um
osciloscópio digital da Tektronix modelo TDS 340A, sendo consecutivamente transferidos
para um microcomputador e analisados com o auxílio do software Gem fornecido pela
Edinburgh Analytical Instruments (Livingston, UK). Para a obtenção do tempo de vida do
estado excitado triplete no comprimento de onda máximo de absorção do triplete foi feita uma
média de 10 pulsos de laser.
O terceiro harmônico do laser Nd-YAG também foi utilizado como fonte de excitação
nos estudos de produção de oxigênio singlete pela ZnPC. O sinal de emissão de
fosforescência do oxigênio singlete foi identificado em 1270 nm, utilizando-se um
fotodetector de germânio da North Coast Scientific Corporation, modelo 823A
Nos experimentos de fotólise e ensaios biológicos de fototoxicidade em célula,
utilizou-se o sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech, no comprimento de onda de
emissão em 675 nm acoplado a uma fibra óptica operando no máximo de potência de 200 mJ.
A liberação fotoinduzida de NO gasoso foi detectada diretamente por um sensor
amperométrico amiNO-700, desenvolvido pela Innovative Intruments, Inc. (NOmeter). Este
sensor é formado por um eletrodo envolto por uma membrana semipermeável e tem
sensibilidade na faixa de 50 nAmpére a 50 µAmpére, com tempo de resposta relativamente
curto, compatível com o sistema pulsado de irradiação proposto.
Nos estudos do tamanho das partículas foi utilizado o equipamento Zetasizer Nano
system ZS da Malvern-UK, o qual possui um laser de He-Ne de 4 mW que opera no
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
comprimento de onda de 633 nm, permitindo realizar medidas não invasivas por “backscatter
optics” (NIBS), e possui a capacidade de determinar tamanho de partículas no intervalo de 2
nm a 3 µm. As medidas foram realizadas num ângulo de detecção de 173º e a posição da
medida na cubeta foi automaticamente determinada pelo software do equipamento. O
equipamento realiza em média 12 determinações para cada análise.
Os trabalhos em cultura de células da linhagem B-16 F10 foram realizados em capela
de fluxo laminar, modelo A152 da Veco, esterilizada com luz germicida e fluxo contínuo de
ar. Foram também utilizados os seguintes aparelhos nos estudos de cultura e crescimento
celular: microscópio invertido Axiovert 40 CFL da Zeiss (para análise de forma, tamanho e
crescimento de cultura), centrífuga da CentriBio, autoclave modelo AB-42 da Phoenix,
banhos termostatizáveis Fischer Scientific, modelo 801 e espectrofotômetro para leitura de
microplacas (ELISA) modelo Versa Max da Molecular Device.
Além destes equipamentos foram utilizados: balança eletrônica Libror (modelo AEL
200), sistema vortex Genie 2, ultrason Branson (modelo 2210), pH-metro (modelo accument
®
50 da Fisher Scientific).
III.4 Métodos
III.4.1. Estudos espectroscópicos no estado estacionário da Zinco ftalocianina e do
complexo Ru-tpy em meio homogêneo
A investigação das propriedades espectroscópicas no estado estacionário da ZnPC e do
complexo Ru-tpy em meio homogêneo foi baseada em medidas diretas dos espectros de
absorção e de emissão de fluorescência.
Os estudos espectroscópicos no estado estacionário da ZnPC foram realizados em
meio orgânico (etanol) e, do complexo de rutênio foram realizados em tampão fosfato pH 7,4.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
Os espectros de absorção foram registrados em uma cela de absorção de 1 cm de
caminho óptico, utilizando como referência os meios em estudo na ausência dos fármacos. Os
espectros de absorção foram então registrados de maneira a cobrir uma faixa espectral de 300
a 800 nm.
Com base na análise dos dados espectrais de absorção, foi determinado a seguir, o
espectro de emissão de fluorescência da ZnPC, utilizando-se os comprimentos de onda de
excitação máxima deste para excitação das amostras. Os espectros de emissão de
fluorescência foram registrados dentro da faixa específica 630 a 750 nm, com excitação fixa
em 610 nm.
III.4.2 Preparação Zinco ftalocianina, do complexo Ru-tpy e da associação dos dois
fármacos em meio lipossomal
Os compostos em estudo foram incorporados aos lipossomas de longo tempo de
circulação (LLC) de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), preparados pelo método pelo
método de injeção conforme descrito por Nunes e colaboradores (Nunes, Sguilla e Tedesco,
2004).
Uma solução etanólica de 0,360 mL contendo 2,07 mg de DPPC (0,525 mmolL
-1
),
0,27 mg de colesterol (0,14 mmolL
-1
) e um volume adequado de corante para se obter uma
concentração final 5,0 µmolL
-1
da ZnPC. Foram injetadas por uma bomba peristáltica com
velocidade de adição controlada sobre uma solução 35 µmolL
-1
de PEG 2000 em tampão
fosfato pH 7,4 armazenada em uma jaqueta termostatizada (volume final de 5,0 mL). A
solução tampão estava contida em um recipiente cilíndrico de 2,0 cm de diâmetro e a injeção
foi realizada à aproximadamente 2,5 cm abaixo da superfície líquida, a uma temperatura de
57
o
C sob agitação magnética na ausência de luz e com uma velocidade de 1,0 µL/s (360
µL/h).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
Os lipossomas contendo o complexo Ry-tpy foram preparados pelo mesmo
procedimento descrito acima, sendo o complexo de rutênio adicionado junto a solução tampão
nas concentrações de 50 x 10
-6
molL
-1
e 5 x 10
-3
molL
-1
, antes da adição do lipídeo.
Após cada preparação lipossomal foi registrado o espectro de absorção dos fármacos
associados ao sistema lipossomal, a fim de se verificar a eficiência da incorporação e a
ausência de formação de agregados superiores. A concentração da ZnPC e do complexo de
rutênio foram calculadas a partir de seus coeficientes de absortividade molar .
Figura 6: Figura esquemática da preparação dos lipossomas.
III.4.3 Caracterização do sistema lipossomal misto por medidas de tamanho de
partículas.
Realizamos o estudo do tamanho das partículas lipossomais formadas com o intuito de
averiguar a viabilidade destas preparações quanto a homogeneidade no tamanho das partículas
formadas e influências de agentes formadores deste sistema (ZnPC, complexo Ru-tpy, DPPC,
colesterol e PEG) em suas propriedades físico-químicas.
Utilizamos como ferramenta de análise as técnicas de espalhamento de luz, para
determinação do tamanho das partículas coloidais, e medidas de intensidade de emissão de
fluorescência, para os sistemas com presença do agente fotossensibilizador Zinco ftalocianina
(ZnPC) e do complexo Ru-tpy.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
As amostras foram diluídas em água mili-Q (proporção 1:10) e submetidas a medidas
de espalhamento dinâmico de luz, utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK). Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
óptico e as medições foram feitas à temperatura ambiente (25ºC). O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW, operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
medições não invasivas por “backscatter optics” (NIBS). As medições foram feitas num
ângulo de detecção de 173º e a posição da medição na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento. O equipamento realiza em média 12
determinações para cada análise. Neste experimento, o equipamento utiliza um laser
modulado e mede o deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partículas e realiza em
média vinte e duas medidas para cada amostra analisada.
III.4.4 Estudos espectroscópicos no estado estacionário da Zinco ftalocianina, do
complexo Ru-tpy e da associação dos dois fármacos em meio lipossomal
As propriedades espectroscópicas no estado estacionário da ZnPC, do complexo Ru-
tpy
e da associação dos dois fármacos em meio lipossomal foram estudadas baseadas em
medidas diretas dos espectros de absorção e de emissão de fluorescência. Os espectros de
absoção foram registrados de 200 a 800 nm e os espectros de emissão de fluorescência
fotoestacionária, foram registrados na faixa de 630 a 750 nm, com excitação fixa em 610 nm,
em cela de quartzo de 1 cm de caminho óptico.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
III.4.5 Estudos de supressão de fluorescência da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy no sistema lipossomal.
A supressão da fluorescência emitida pela ZnPC incorporada aos lipossomas foi
estudada usando o complexo Ry-tpy como agente supressor.
O estudo espectroscópico de supressão de fluorescência no estado estacionário do
fotossensibilizador ZnPC foi realizado na concentração fixa de 5,0 µmolL
-1
. Para o complexo
Ru-tpy a concentração final foi definida até 50 µmolL
-1
.
A emissão de fluorescência foi obtida por excitação da amostra em comprimento de
onda fixo de 610 nm.
Em celas de fluorescência de quartzo com caminho óptico de 1,0 cm foram colocados
2,0 mL do lipossoma de ZnPC. Após termostatizar à 37
o
C foram feitas as medidas de
intensidade de emissão de fluorescência inicial na ausência do supressor. A cada medida
foram adicionadas alíquotas crescentes de uma solução estoque do supressor (Ru-tpy),
tomando o cuidado de manter o volume constante e a concentração máxima de 50 µmolL
-1
.
Estas soluções foram agitadas e termostatizadas à 37
o
C e em seguida foram realizadas as
medidas de intensidade de emissão de fluorescênca na presença do supressor.
Os dados obtidos a partir dos experimentos no estado estacionário foram analisados
inicialmente pela equação 1 de Stern-Volmer:
I
f0
/I
f
= 1 + kq τ
0
= 1 + Ksv [Q] (equação 1)
Onde: I
f0
e
I
f
são as intensidades de fluorescência na ausência e presença do supressor
respectivamente, kq é a constante de velocidade de supressão, τ
0
é o tempo de vida do
fluoróforo na ausência do supressor, [Q] é a concentração do supressor e Ksv = kq τ
0
é a
constante de supressão de Stern-Volmer (Lehrer, 1971).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
Os gráficos de Stern-Volmer foram construídos a partir das intensidades de
fluorescência relativas, e os valores das constantes de supressão de Stern-Volmer, Ksv, foram
obtidos utilizando-se o método de ajuste linear de acordo com a equação 1.
III.4.6 Determinação do rendimento quântico de fluorescência (Φ
ΦΦ
Φ
f
) da Zinco ftalocianina
e de sua associação ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal.
A determinação do rendimento quântico de fluorescência para o FS estudado neste
trabalho nos diferentes meios e na ausência e na presença do complexo Ru-tpy, foi realizada
através do método relativo, utilizando-se a ZnPC, em etanol, como padrão, conforme
formalismo descrito por Demas e Crosby, 1971 (Demas e Crosby, 1971).
em que φ é rendimento quântico, Área é a integral sobre a banda de emissão e n é o índice de
refração do solvente.
Uma solução de ZnPC em meio orgânico, utilizada como padrão (Φ
f
= 0,28) foi
inicialmente preparada de modo a obter uma absorbância constante na faixa de 0,1 (no
comprimento de onda de excitação). As soluções contendo a ZnPC em etanol, incorporada aos
lipossomas de longo tempo de circulação (LLC) e associada ao complexo Ru-tpy em meio
lipossomal também foram preparadas por diluições infinitas, para obter absorbâncias da
ordem de 0,1 (no comprimento de onda de excitação), de modo a minimizar o efeito de filtro
interno. A seguir, foi traçado o espectro de emissão de fluorescência corrigido em cada
ambiente estudado, sendo determinada a área sob as curvas no intervalo de 630 a 750 nm.
III.4.7 Medidas de fluorescência resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
para o sistema misto
Os tempos de vida de fluorescência da ZnPC (5,0 µmolL
-1
) incorporada aos
lipossomas e da sua associação com o complexo de rutênio em meio lipossomal, foram
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
obtidas pela técnica de contagem simples de fótons. O comprimento de onda de excitação e de
emissão utilizado para a ZnPC foi de 633 nm e 680 nm, respectivamente. Para cada medida de
decaimento foram coletadas em média 10.000 contagens. As curvas de decaimento de
fluorescência foram analisadas, utilizando-se o software operacional do próprio instrumento,
com ajuste exponencial, os quais foram validados através do valor mínimo na função chi-
quadrado (χ
2
).
III.4.8 Estudos dos estados excitados tripletes por fotólise por pulso de laser
Os estados excitados tripletes do fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e da
associação dos dois fármacos em meio lipossomal foram estudados e gerados por fotólise por
pulso de laser. As soluções de trabalho foram preparadas de maneira semelhante àquelas
descritas anteriormente na concentração fixa de 5,0 µmolL
-1
para o fotossensibilizador ZnPC
e 50,0 µmolL
-1
para o complexo Ru-tpy .
Utilizou-se como fonte de excitação o terceiro harmônico (355 nm) do laser pulsado
de Nd-YAG, como descrito anteriormente na seção III.3.
O comprimento de onda utilizado para monitoramento da absorção máxima do
transiente gerado e para a determinação do tempo de vida do estado excitado triplete do
mesmo foi de 480 nm.
O espectro de absorção do transiente foi registrado ponto a ponto, em intervalos de
10,0 nm na faixa de comprimento de onda de 300 a 800 nm, onde se utilizaram disparos
ajustados na razão de 3 disparos seqüenciais para cada intervalo de 10 nm, com excitação do
laser em 355 nm.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
III.4.9 Determinação do rendimento quântico de produção de oxigênio singlete (Φ
ΦΦ
Φ
∆
∆∆
∆
)
Inicialmente, analisou-se a eficiência quântica de geração de
1
O
2
para a Zinco
ftalocianina em meio orgânico (etanol). As soluções possuíam a mesma intensidade de
absorção em 355 nm (Abs = 0,3), sendo as mesmas saturadas por degaseamento com oxigênio
por 30 minutos. Uma solução de feoforbide-a, com as mesmas características das soluções
que continham as amostras, foi utilizada como amostra padrão (Φ
∆
= 0,59) (Arbogast et al.,
1991). Na detecção do φ
∆
utilizou-se o método fotofísico, que consiste no monitoramento da
intensidade de emissão de fosforescência do
1
O
2
em 1270 nm , empregando-se o sistema
resolvido no tempo (E.A.I. – LP 900, pulsado com um laser Nd:YAG a 355 nm, com um
detector de germânio da North Coast Scientific Corporation, modelo 823 A), item III.3. A
potência do laser de Nd:YAG utilizado na detecção do φ
∆
produzido pelo fotossensibilizador
ZnPC e da associação dos dois fármacos em meio lipossomal foi de 30 mJ por pulso. A
intensidade máxima de fosforescência no tempo t = 0 foi determinada pelo método relativo
com base na equação 2, conforme descrito por Arbogast 1991 (Arbogast et al., 1991).
∆
∆
∆∆
Φ=Φ
τ
τ
Ref
Ref
Ref
I
I
**
(Equação 2)
na qual I
ref
é a intensidade de emissão de fosforescência do
1
O
2
produzido pelo composto
padrão, I é a intensidade de emissão de fosforescência do
1
O
2
produzido pela amostra, Φ
∆ref
é
o rendimento quântico de produção de
1
O
2
produzido pela referência, τ
∆ref
é o tempo de vida
do
1
O
2
produzido pela referência e τ
∆
é o tempo de vida do
1
O
2
produzido pela amostra.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
III.4.10 Estudos de detecção de NO gerado por fotólise de pulso a laser em 675 nm.
A liberação fotoinduzida de NO gasoso foi detectada pelo sensor amperométrico
amiNO – 700, o NOmeter. Sua calibração foi realizada através de uma solução aquosa padrão
de NO gasoso (Kudo et al., 1997). Em uma quantidade de 10 mL de tampão, borbulhou-se
argônio por 30 min a fim de remover todo o oxigênio presente no meio. O gás NO foi gerado
por uma solução de ácido nítrico 50%, na qual mergulharam-se pedaços de cobre metálico
(Cu
0
) (Equação 3). Antes de borbulhar a solução padrão, o gás passou por uma solução de
KOH, para remover possíveis traços de NO
2
presentes na mistura gasosa. Esse aparato foi
construído em uma capela (Figura 7).
3Cu
(s)
+ 8H
+
(aq.)
+ 8NO
3
-
(aq.)
→ 2NO
(g)
+ 3Cu
2+
(aq.)
+ 6NO
3
-
(aq.)
+ 4H
2
O
(l)
(Equação 3)
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
Figura 7: Aparato montado em capela para geração de óxido nítrico gasoso.
O óxido nítrico gasoso foi borbulhado por 1 hora. Tempo suficiente para saturar a
solução aquosa. A concentração da solução aquosa de NO foi determinada por titulometria,
conforme Mori e Bertotti 2000 (Mori e Bertotti, 2000), para o qual encontrou-se um valor 2,1
× 10
-3
molL
-1
. Assim, a partir dessa solução padrão de concentração conhecida de NO gasoso,
calibrou-se o aparelho. Acoplou-se o NOmeter a um frasco lavador contendo 10 mL de
tampão, após borbulhar argônio por 30 min, ajustou-se o aparelho para o zero. Este tampão
deve apresentar o mesmo pH do tampão que será utilizado para dissolver o composto no
momento da fotólise. A seguir gerou-se uma concentração conhecida de NO na solução de
análise pela adição de um volume específico da solução padrão de NO. Após alguns
segundos, quando o valor da corrente de NO na solução permaneceu constante, adicionou-se
uma nova quantidade da mesma solução padrão. O aumento observado de corrente mostrou-
se proporcional à concentração de NO adicionado.
Com relação à utilização do NOmeter, alguns cuidados devem ser considerados, pois a
membrana do eletrodo tem um certo tempo de vida e deve ser trocada periodicamente. Para
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
cada membrana é necessária uma nova calibração. É importante que a calibração seja feita no
mesmo pH em que será realizado o experimento de fotólise. A resposta amperométrica do
eletrodo depende da concentração hidrogeniônica do meio.
Nos experimentos de fotólise, houve um acompanhamento da variação
espectroscópica na região UV-visível e outro com registro amperométrico in situ da liberação
de NO gasoso (NOmeter). Para os dois tipos, os experimentos foram realizados em triplicata.
Para a realização do experimento de fotólise com acompanhamento da variação do
espectro na região do UV-visível, preparou-se a amostra do complexo Ru-tpy associado a
Zinco ftalocianina em meio lipossomal. Foi obtido um espectro UV-visível inicial, antes da
irradiação. A seguir a amostra foi irradiada durante certo tempo e foi realizado um novo
espectro na região do UV-visível. Esse procedimento foi repetido até que não houvesse mais
variação no espectro da amostra.
A fotólise com acompanhamento in situ da liberação de NO gasoso foi realizada pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta a ser irradiada. Como ilustra a figura 8 abaixo.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
Figura 8: Medida do NO liberado através do NO-meter (acima) e da fibra do Laser (abaixo).
O cálculo de rendimento quântico de NO (φ
NO
) foi realizado com base nos resultados
obtidos em cada pico do cronoamperograma, no qual foi calculado um valor de concentração
de NO liberado. Com o valor da intensidade da luz incidente (I
s
) fornecida, calculou-se pela
Equação 4 o rendimento quântico φ
t
para cada irradiação. Esses valores foram plotados em
um gráfico em função do tempo. O valor extrapolado para tempo zero por regressão linear foi
admitido como sendo o do rendimento quântico de liberação de NO (φ
NO
). Isso foi feito com
o intuito de minimizar o efeito de fotólises secundárias. Ou seja, a partir de certo tempo de
irradiação pode ocorrer fotodegradação dos produtos, e o rendimento quântico calculado
passa a não corresponder à reação de interesse.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
)101(tI
n
abs
s
L
t
−
−××
=φ
(Equação 4)
n
L
= número de moles de NO liberados pela reação fotoquímica;
I
s
= intensidade da luz incidente;
t = tempo de fotólise (s);
1 - 10
-abs
= quantidade de luz absorvida pela amostra, onde abs é o valor da
absorbância da amostra no comprimento de onda de irradiação.
III.4.11 Estudos in vitro
III.4.11.1 Crescimento e manutenção da cultura de células da linhagem neoplásica de
melanoma de rato (B-16 F10)
Para a manutenção e crescimento das células B-16 F10 são necessários vários
cuidados, como o descongelamento e a preparação do meio de cultura das mesmas.
As matrizes de células B-16 F10 (0,5 x 10
6
células/mL) estocadas em nitrogênio
líquido foram descongeladas a 37°C e adicionadas a um frasco de cultura (Corning, estéril, de
75 cm
2
) contendo 10,0 mL do meio completo (RPMI 1640). O frasco de cultura foi colocado
em uma incubadora a 37°C com 5,0 % de CO
2
durante 48 horas.
Após este período, realizou-se a primeira repicagem de células. Como as células
crescem aderidas no frasco celular, foi necessária a utilização de uma solução de tripsina
0,05% para soltá-las, sendo necessário o contato com esta solução por aproximadamente 60
segundos. Assim, o meio contendo as células foi adicionado em um tubo cônico do tipo
Falcon e centrifugado a 25 °C com rotação constante de 5000 rpm durante 5 minutos. O
sobrenadante foi descartado e o sedimento suspenso com 10 mL de meio completo; as células
foram, então, distribuídas em dois frascos de culturas celulares novos de 75 cm
2
.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
A troca de meio destas células foi realizada sempre que necessário, em média a cada
dois dias. Quando o número médio de células atingiu 1,5 x 10
6
células/mL, ou uma nova
subcultura de células (0,5 x 10
6
células/mL) foi preparada ou as mesmas foram isoladas e
congeladas.
No processo de congelamento, as células foram lavadas com o meio RPMI e
posteriormente congeladas em tubos criogênicos, contendo uma solução composta de soro
fetal bovino e DMSO (90/10) numa proporção final de 4:1.
III.4.11.2 Controle da integridade da membrana celular
Quando se trabalha com cultura de células, costuma-se analisar a integridade da
membrana celular como controle de viabilidade em função do crescimento. Este controle foi
feito também para avaliar o número médio de células presente na cultura bem como, para
avaliar o número de células com rompimento de membrana plasmática. Este teste utiliza o
corante azul de tripan e é chamado teste de exclusão do azul de tripan.
Assim, com base no número total de células contadas tem-se uma amostragem
estatística de toda a cultura celular. Este teste foi aplicado rotineiramente para controle do
crescimento e viabilidade das culturas celulares (Gareth, 1996; Freshney, 1986).
Sendo assim, em um tubo de 1,5 mL foram colocados 180 µL de tampão Hank's, 180
µL de solução de azul de tripan (0,4 % m/v) e 20 µL da suspensão de células. A mistura foi
agitada, e após dois minutos com a ajuda da câmara de Neubauer, fez-se a contagem das
mesmas e calculou-se a viabilidade celular.
Um outro método para avaliar a atividade celular, é o método que se baseia no uso do
corante (3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-brometo difenil tetrazolium), conhecido como teste do
MTT. Este ensaio é apropriado para se determinar espectrofotometricamente o número total
de células como função da atividade mitocondrial intacta, ou seja, células vivas.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
O método do MTT é simples, confiável e reprodutível. Soluções de MTT dissolvidas
em meio de cultura ou em soluções salinas, balanceadas na ausência de indicador vermelho de
fenol, são de cor amarelada. A dehidrogenase mitocondrial das células viáveis atuam sobre o
anel tetrazolium, produzindo cristais de formazan de cor púrpura, os quais são insolúveis em
solução aquosa. Os cristais são então dissolvidos em isopropanol acidificado. O produto
obtido é monitorado espectrofotometricamente em 560 e 690 nm. Um aumento ou diminuição
no número de células resulta em uma mudança concomitante na quantidade do formazan
formado, indicando assim o grau de citotoxicidade (Vistica et al., 1991; Mosmann, 1983).
O método do MTT de monitoramento da citotoxicidade in vitro é bem estabelecido
para o uso com placas de poços múltiplos. Para melhores resultados, devem ser empregadas
sempre as células na sua fase logarítmica de crescimento e o número final de células não deve
exceder 1,0 x 10
6
células/mL. Cada teste deve incluir um controle contendo meio completo na
ausência do fármaco em estudo.
Inicialmente, as células B-16 F10 foram removidas da incubadora, sendo levadas à
capela de fluxo laminar e distribuídas nas placas de poços múltiplos (96 poços). A estas
células foi adicionada uma solução de MTT 1,0 mg/mL. A cultura foi conduzida à incubadora
por 4 horas. Após o período de incubação, as células foram removidas da estufa de CO
2
e os
cristais de formazan resultantes foram dissolvidos pela adição de isopropanol.
O teste é finalizado através de medidas espectrofotométricas da absorbância no
comprimento de onda de 560 nm, descontando-se a absorbância de fundo a 690 nm
(Freshney, 1986). Estas medidas foram obtidas por um sistema de leitura de microplacas
(ELISA) da Molecular Device modelo Versa Max.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
III.4.11.3 Determinação da Toxicidade da ZnPC, do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausência de luz.
Uma suspensão de 0,5 x 10
6
células/mL da linhagem B-16 F10 foi preparada
inicialmente. As células foram então incubadas em placas de petri (60 mm x 15 mm), com
meio completo. Após as células atingirem confluência (de 24 a 48 horas), o meio foi retirado
e as células foram lavadas com 5 mL de tampão Hank´s. Logo em seguida a retirada do
tampão foram adicionadas as soluções em estudo para serem testadas em um meio específico
contendo 3% de soro fetal bovino no volume final de 3mL. Depois de 3 horas de incubação
das células, as soluções foram retiradas, lavadas novamente com tampão Hank´s e soltas com
a solução de tripsina 0,25%. Estas suspensões de células foram, então, transferidas para um
tubo falcon e centrifugadas a 1000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante foi retirado e as células
foram suspensas com os seus respectivos meios. As suspensões foram, em seguida,
transferidas para as placas de poços múltiplos (96 poços) com 200 µL por poço de meio
completo. Depois de 24 horas o meio foi retirado, as células foram lavadas com 200 µL de
tampão Hank's e foram adicionados 50 µL da solução de MTT 1 mg/mL. As células foram
incubadas por mais 4 horas e 150 µL de isopropanol foram acrescentados para completa
solubilização do formazan.
II.4.11.4 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema
lipossomal misto
Nos estudos de fototoxicidade, foi avaliado o efeito da luz sobre as culturas celulares
(células B-16 F10) incubadas com o sistema lipossomal, variando a concentração da Zinco
ftalocianina de 1 e 5 µmolL
-1
e a concentração fixa de 50 µmolL
-1
para o complexo de
rutênio. Então analisamos o efeito da concentração da ZnPC sob a concentração fixa do
complexo de rutênio. Neste experimento, as células com aproximadamente 1 x 10
6
células/mL
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
foram incubadas por um intervalo de tempo de 3 horas a 37
o
C em uma estufa de CO
2
. Os
sistemas lipossomais foram retirados e adicionou-se tampão Hank´s nas placas de Petri.
A cultura celular foi submetida à intensidade de irradiação de 0,5 J/cm
2
obtido do
sistema laser de diodo Eagle da Quantum Tech, no comprimento de onda de emissão em 675
nm acoplado a uma fibra óptica, operando no máximo de 300 mW de potência.
Após a irradiação, tampão Hank´s foi removido, as células foram transferidas para as
placas de multipoços com meio RPMI completo e levadas à estufa de CO
2
por um período de
24 horas. Após este intervalo, foi realizado o ensaio de viabilidade com MTT para a avaliação
da viabilidade celular.
Os dados encontrados através do teste de MTT foram analisados utilizando o
programa Excel Microsoft 2003 e as análises estatísticas foram realizadas no programa Prism
3.0, através dos testes de análise de variância (One-way Anova) sendo aplicado o pós-teste
Newman-Keuls.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Parte Experimental
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Este trabalho se baseia nos estudos para a utilização sinérgica das espécies
reativas de oxigênio (EROs) e das espécies reativas de nitrogênio (ERONs) geradas pelo
emprego de um agente fotossensibilizador clássico (a ZnPC) e de um complexo nitrosilo de
rutênio Ru-tpy capaz de potencializar a ação da Terapia Fotodinâmica no tratamento de
células neoplásicas.
Realizamos o estudo destes fármacos associados à veículos de liberação de origem
lipídica como os lipossomas. Neste trabalho, escolheu-se os lipossomas de longo tempo de
circulação (LLC), a base de DL-α-dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC) 0,525 mmolL
-1
e
polietileno glicol (PEG) preparados pelo método de injeção etanólica, conforme descrito na
seção III.4.2.
Sendo assim, foi realizada inicialmente, a caracterização espectroscópica do
sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy. Além deste estudo, foi realizada
a caracterização espectroscópica da ZnPC em meio orgânico (etanol) e do complexo Ru-tpy
em tampão fosfato, para efeito de comparação.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
IV.1 Estudos Fotofísicos
IV. 1.1 Estudos espectroscópicos no estado estacionário da Zinco ftalocianina (ZnPC) e
do complexo Ru-tpy em meio homogêneo e lipossomal
A escolha do fármaco fotossensibilizador adequado deve ser baseada sempre na
investigação preliminar dos parâmetros fotofísicos em solução homogênea e nos sistemas
micro-heterogêneos a serem utilizados em sua veiculação in vitro e in vivo. Tais sistemas são
importantes, pois aumentam a seletividade dos mesmos pelos tecidos tumorais, sendo este um
dos principais objetivos a serem atingidos nos estudos envolvendo a TFD. Estes estudos
mimetizam ao máximo os sistemas biológicos reais, oferecendo assim a possibilidade de se
controlar a biodistribuição e farmacocinética dos sistemas, quando administrados nos tecidos
tumorais e peritumorais.
Com base nas considerações apresentadas, na primeira etapa do trabalho, foram
realizados estudos espectroscópicos no estado fundamental (espectroscopia de absorção e de
emissão de fluorescência no estado estacionário) da ZnPC em etanol, do complexo Ru-tpy em
tampão fosfato e dos fármacos associados em meio lipossomal.
Nas Figuras 9 e 10, respectivamente estão apresentados os espectros de
absorção para a ZnPC (5,0 µmolL
-1
) em etanol e do complexo Ru-tpy em tampão fosfato
(50,0 µmolL
-1
).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Figura 9: Espectro de absorção da ZnPC (5,0 µmolL
-1
) em etanol.
O espectro de absorção da ZnPC (5,0 µmolL
-1
) em etanol revelou um máximo de
absorção na banda-Q do espectro em 666 nm. Esta banda está localizada dentro da janela
terapêutica (600-800 nm), região máxima de penetração tecidual, reforçando desta forma a
idéia de que este fármaco pode ser muito útil para os estudos in vivo futuros (Nunes, S. M. T.,
2003; Oliveira, D. M., 2006).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Figura 10: Espectro de absorção do complexo Ru-tpy 50 µmolL
-1
em tampão fosfato, pH=
7,4.
Já o perfil do espectro de absorção para o complexo Ru-tpy apresentou como
esperado, uma banda em 356 nm atribuída como sendo uma banda Transferência de Carga
Metal Ligante (TCML) do tipo d
π
(Ru
II
)→π*(bdqi-COOH,NO
+
). Observou também a banda
de TCML na região do visível (500 nm), devido à transição d
π
(Ru
II
)→π*(bdqi-COOH). Este
comportamento para o complexo nitrosilo de rutênio foi muito estudado (Oliveira et al., 2004;
de Lima et al., 2005), e está de acordo com a literatura (de Lima, R. G., 2006).
Utilizamos também a espectroscopia de fluorescência para a caracterização das
propriedades fotofísicas da Zinco ftalocianina (5,0 µmolL
-1
).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Figura 11: Espectro de emissão de fluorescência (excitação fixa em 610 nm) da ZnPC (5,0
µmolL
-1
) em etanol.
O espectro para a ZnPC sob excitação de 610 nm demonstra o máximo de emissão de
fluorescência 682 nm, coerente com dados já relatados na literatura (Tedesco, Rotta e
Lunardi, 2003; Oliveira et al., 2006).
No entanto, ao excitarmos o complexo Ru-tpy em dois comprimentos de onda
distintos, 355nm e 532 nm, não observamos uma emissão de fluorescência. Este
comportamento foi observado também para outros nitrosilos de rutênio como discutido por
Sauaia et al 2005 (Sauaia et al., 2005b) e Oliveira et al 2004 (Oliveira et al., 2004).
Os perfis espectrocópicos de absorbância e emissão de fluorescência para a associação
lipossomal da ZnPC com o complexo Ru-tpy foram também avaliados e discutidos a seguir.
Os sistemas lipossomais estudados são compostos de DPPC/ col/ PEG na
concentração de 11:6:0,7 (onde DPPC = dipalmitoil fosfatidilcolina, col = colesterol e PEG =
polietileno glicol).
A figura 12 mostra os espectros de absorção da ZnPC, do complexo Ru-tpy e da
associação dos dois compostos em meio lipossomal .
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Absorbância
800700600500400300
Comprimento de onda (nm)
Figura 12: Espectro de absorção em meio lipossomal da ZnPC (−), do complexo Ru-tpy (−) e
dos dois compostos associados (−).
Podemos observar que após a associação dos fármacos no sistema lipossomal, não
houve mudanças na posição dos comprimentos de onda de absorção e emissão máxima dos
fármacos estudados, nem tão pouco mudanças em seus perfis espectrais.
A espectroscopia de absorção dos fármacos associados no sistema lipossomal também
não revela a presença de dímeros ou agregados superiores para a faixa das concentrações
estudadas (para ZnPC 5,0 µmolL
-1
e para o complexo 50,0 µmolL
-1
). Um perfil espectral, com
bandas finas de absorção centradas em 670 nm para a Zinco ftalocianina e a banda pequena
em 356 nm e a banda larga em 500 nm para o complexo Ru-tpy, idêntico ao observado em
solução homogênea, confirma que não houve mudanças nas propriedades espectrais dos
mesmos após sua incorporação nesse sistema de liberação.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
IV.1.2 Caracterização do sistema lipossomal misto por medida do tamanho de partículas
Este estudo é realizado apenas para analisar o tamanho das partículas formadas,
determinando uma característica particular do sistema de veiculação preparado. A análise da
distribuição do tamanho da ZnPC, do complexo Ru-tpy e da associação dos dois compostos
em meio lipossomal, foi realizada no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da
FCFRP/USP da Profª Dª. Maria Vitória Lopes Badra Bentley, em um equipamento adquirido
junto ao grupo Multiusuário do qual fazemos parte.
A técnica do espalhamento de luz tem como objetivo auxiliar na caracterização dos
lipossomos, os quais devem apresentar dimensões nanométricas.
As amostras foram diluídas em água mili-Q (proporção 1:10) e submetidas a medidas
de espalhamento dinâmico de luz, utilizando-se o equipamento Zetasizer Nano System ZS
(Malvern-UK). Estas amostras foram colocadas em uma cela de quartzo de 1 cm de caminho
óptico e as medições foram feitas à temperatura ambiente (25ºC). O equipamento possui um
laser de He-Ne de 4 mW operando num comprimento de onda de 633 nm e realiza as
medições não invasivas por “backscatter optics” (NIBS). As medições foram feitas num
ângulo de detecção de 173º e a posição da medição na cubeta foi automaticamente
determinada pelo software do equipamento. O equipamento realiza em média 12
determinações para cada análise.
O tamanho das partículas foi medido pelo mesmo equipamento de espalhamento
dinâmico da luz. Neste experimento, o equipamento utiliza um laser modulado e mede o
deslocamento Doppler na luz espalhada pelas partículas e realiza em média vinte e duas
medidas para cada amostra analisada.
A técnica de determinação do tamanho a partir do diâmetro hidrodinâmico de
partículas por espalhamento de luz se baseia na análise do movimento Browniano de
partículas que é representado por uma função de correlação (G) com decaimento exponencial,
conforme descrito pela equação 5.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
(Equação 5)
Onde A, é a linha de base, B, é o intercepto para a função de correlação,
Γ
ΓΓ
Γ = Dq
2
, sendo D, o coeficiente de difusão translacional, q = (4 π n / λ
o
) sin (θ / 2), sendo n, o
índice de refração da solução, λ
λλ
λ
o
,
o comprimento de onda do laser, θ
θθ
θ, o ângulo da luz
espalhada e τ
ττ
τ, é o tempo em segundos gasto para se determinar a curva de correlação.
O tamanho médio é então calculado a partir da função de correlação, utilizando-se
vários algoritmos presentes no software do equipamento. Em nosso trabalho utilizamos o
algoritmo CONTIN, mais satisfatório para distribuições dentro do intervalo de tamanho
esperado.
A Tabela I sumariza os valores de tamanho das partículas encontrado nas amostras
analisadas.
(
)
(
)
[
]
τ
τ
Γ
−
+
=
2exp1 BAG
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Tabela I - Tamanho das partículas
Lipossoma Tamanho de partícula (nm)
Vazio 66
ZnPC 78
Ru-tpy 72
ZnPC/Ru-tpy 82
Os resultados obtidos demonstram um diâmetro médio de 74,5 nm para os lipossomas.
Entretanto, ocorre um aumento de tamanho no sistema lipossomal misto ZnPC/Ru-tpy. Este
efeito é esperado uma vez que deve se considerar a associação de duas moléculas no mesmo
sistema de liberação. Apesar disto, este sistema ainda apresenta um tamanho dentro da faixa
que permite uma interação celular e sua interiorização.
IV. 1.3 Estudos espectroscópicos no estado estacionário da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy em meio lipossomal
Nos estudos de emissão de fluorescência apresentados na figura 13, observa-se
somente uma diminuição da intensidade de emissão de fluorescência da ZnPC após sua
associação ao complexo.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
2.0x10
6
1.5
1.0
0.5
0.0
Intensidade de fluorescência
800780760740720700680660640
Comprimento de onda (nm)
Figura 13: Espectro de emissão de fluorescência da ZnPC (−)e associada ao complexo Ru-
tpy (−) em meio lipossomal.
Diante destes resultados, achamos interessante observar qual a interferência do
complexo de rutênio na emissão de fluorescência da ZnPC, analisando também o valor do
rendimento quântico de fluorescência do sistema lipossomal misto (ZnPC/Ru-tpy).
A redução na intensidade de fluorescência da ZnPC em meio lipossomal após a
associação com complexo Ru-tpy foi discutida considerando o efeito de supressão induzida
pelo complexo de rutênio.
Este comportamento obervado nos leva a pensar que embora a interação da ZnPC com
o complexo Ru-tpy não leve a mudanças drásticas no perfil e comportamento de absorção, o
mesmo afeta as propriedades do primeiro estado excitado da ZnPC, levando a uma redução do
tempo de vida da mesma.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
IV.1.4 Estudos de supressão de fluorescência da Zinco ftalocianina pelo complexo Ru-
tpy em meio lipossomal
A supressão da intensidade de fluorescência da ZnPC pelo complexo Ru-tpy
foi
monitorada pela medida da intensidade de fluorescência com excitação fixa em 610 nm em
função do aumento de concentração do complexo de rutênio na faixa de concentração (0 a
50,0 µmolL
-1
) (Figura 14).
Figura 14: Efeitos da supressão na emissão de fluorescência da ZnPC (5,0 µmolL
-1
)
conforme adição do complexo Ru-tpy em meio lipossomal, na faixa de concentração
crescente (0 a 50,0 µmolL
-1
).
Os dados obtidos à partir dos experimentos no estado estacionário foram analisados
inicialmente pela equação 1 de Stern-Volmer:
I
f0
/I
f
= 1 + kq τ
0
= 1 + Ksv [Q] (equação 1)
Onde: I
f0
e
I
f
são as intensidades de fluorescência na ausência e presença do supressor
respectivamente, kq é a constante de velocidade de supressão, τ
0
é o tempo de vida do
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
fluoróforo ZnPC na ausência do supressor, [Q] é a concentração do supressor e Ksv = kq τ
0
é
a constante de supressão de Stern-Volmer (Lehrer, 1971).
Os gráficos de Stern-Volmer foram construídos a partir das intensidades de
fluorescência relativas, e os valores das constantes de supressão de Stern-Volmer, Ksv, foram
obtidos utilizando-se o método de ajuste linear de acordo com a equação 1.
Figura 15: Gráfico de Stern-Volmer para a supressão da fluorescência da ZnPC conforme
adição do complexo Ru-tpy (R
2
= 0,982964).
A constante de Stern-Volmer obtida foi Ksv = 5793.4 mol
-1
L de acordo com ajuste
linear mostrado na figura 15. Com este valor conseguimos calcular a constante de supressão
kq deste sistema pela equação 1 mostrada acima.
O kq obtido foi de 1,9 x 10
12
mol
-1
L s
-1
sugerindo uma grande capacidade de supressão
da fluorescência da ZnPC pelo complexo de rutênio. Para efeito de comparação, calculamos o
kq do supressor AQS
-
(9,10-antraquinona-2-sulfonatada) utilizado nos experimentos de
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
supressão de fluorescência da ZnPC em suspensão lipossomal realizado anteriormente
(Nunes, S. M., 1999). O kq obtido por este supressor AQS
-
foi de 3,67 x 10
10
mol
-1
Ls
-1
.
Pela análise dos espectros de emissão de fluorescência da ZnPC no sistema lipossomal
misto mostrado acima e comparando os valores de kq calculados, observamos que o
complexo Ru-tpy possui uma elevada capacidade supressora sendo maior que o AQS
-
,
confirmando portanto, este efeito no sistema lipossomal proposto (ZnPC/Ru-tpy).
Este resultado pode ser melhor explicado considerando estudos eletroquímicos que
sugerem um possível processo de transferência de elétron da interação da ZnPC com o
complexo Ru-tpy. A Figura 16 apresenta um voltamograma cíclico do complexo Ru-tpy (1,0
mmolL
-1
) em tampão fosfato (10,0 mmolL
-1
) usando NaBF
4
(0,1 molL
-1
) como eletrólito
suporte. Podemos observar duas curvas catódicas reversíveis em -0.13 V e -0.60 V (vs
Ag/AgCl) atribuídas à redução do NO
0
/NO
+
e NO
0
/NO
-
respectivamente, estando de acordo
com a literatura (Sauaia et al., 2005a). A liberação de NO pelo complexo Ru-tpy foi também
comprovada pela detecção de NO in situ, quando uma solução aquosa do complexo Ru-tpy foi
submetida a um potencial de eletrólise de -0,20 V vs Ag/AgCl. O experimento foi realizado
sob atmosfera de argônio para minimizar reações secundárias, envolvendo o consumo de NO
livre. O sinal obtido pelo sensor foi observado quando a eletrólise foi iniciada e está
apresentado no inserto da Figura 16, indicando a presença de NO livre.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Figura 16: Voltanograma cíclico do complexo Ru-tpy (1,0 mmolL
-1
) em 10 molL
-1
de
tampão fosfato (pH 7.4). (As setas indicam o começo e a direção). O inserto é o
cronoamperograma de liberação do NO controlada pelo potencial de eletrólise em
-0.2 V vs Ag/AgCl da solução do complexo Ru-tpy.
Desta forma, o mecanismo de supressão do complexo Ru-tpy pode ter envolvido o
estado singlete excitado da ZnPC. Estima-se que energia da banda Q da ZnPC é de 1,81 eV.
Levando em consideração que o estado fundamental da ZnPC/ZnPC
+
tem um potencial de
oxidação de +0,80 V vs Ag/AgCl (Ma et al., 2007), foi estimado que a variação de potencial
para
1
ZnPC* foi -1,00 eV para o estado singlete. Para o complexo de rutênio
[Ru(NHNHq)(tpy)NO
+
]
3+
/[Ru(NHNHq)(tpy)NO
0
]
2+
seu potencial de redução é -0.13 V vs
Ag/AgCl. Desta forma a ZnPC * deve reduzir facilmente o NO, como descrito na equação 6.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
1
ZnPC* + [Ru(NH.NHq)(tpy)NO]
3+
→ ZnPC +[Ru(H
2
O)(NH.NHq)(tpy)]
2+
+ NO
0
(Equação 6)
Portanto, o mecanismo descrito de transferência de elétron é o principal responsável
pela interação do estado singlete excitado da ZnPC com o complexo Ru-tpy. Sabemos ainda
que a ZnPC pode atuar pelo mecanismo Tipo I e Tipo II e que a quantificação de oxigênio
singlete deste sistema reforça a idéia de que algum processo de energia está ocorrendo entre
3
ZnPC* e o oxigênio molecular do meio, liberando
1
O
2
.
IV.1.5 Determinação do rendimento quântico de fluorescência (Φ
ΦΦ
Φ
f
) da ZnPC e de sua
associação ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal
As medidas das propriedades de fluorescência de uma molécula (espectro de
fluorescência, espectro de excitação, rendimento quântico e tempo de vida de fluorescência)
são importantes para o entendimento da fotoquímica e fotofísica das espécies no estado
excitado singlete.
A absorção de um fóton de luz por uma molécula no estado fundamental (So) promove
seus elétrons aos estados excitados singletes mais energéticos (Sn), de onde os mesmos
podem retornar para o estado fundamental por vários processos radiativos e não radiativos. A
razão entre os números de fótons emitidos a partir do estado excitado singlete por processo
radiativo (denominado fluorescência) e o número total de fótons absorvidos define um
parâmetro fotofísico denominado rendimento quântico de fluorescência (Φ
f
) (Turro, 1978).
O rendimento quântico de fluorescência (Φ
f
) pode ser definido como (Lakowicz,
1999):
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
volumede unidadepor tempode unidadepor absorvidos quanta de nº
volumede unidadepor tempode unidadepor tesfluorescen moléculas de ºn
=Φ
f
(Equação 7)
Esse parâmetro fotofísico nos fornece a relação entre a quantidade de moléculas que
efetivamente fluorescem (n
F
) em relação ao número total de moléculas que foram
eletronicamente excitadas (N
exc
),
exc
F
f
N
n
=Φ (Equação 8)
O número de moléculas excitadas é, em princípio, equivalente ao número de fótons
incidentes e absorvidos.
Nas medidas experimentais de Φ
f
é necessário que haja uma correção prévia do
espectro de emissão do material ou o uso de um padrão que apresente propriedades
semelhantes às da espécie em análise (o espectro de emissão da amostra deve apresentar a
mesma faixa do de emissão do padrão) (Demas;Crosby, 1971).
Os Φ
f
geralmente são determinados de forma relativa às propriedades previamente
definidas para um composto padrão (Demas;Crosby, 1971), conforme descrito na parte
experimental (seção III.4.6).
Uma vez que a TFD é altamente dependente da produção de oxigênio singlete (
1
O
2
), o
Φ
f
é uma propriedade fotofísica de grande importância para os FSs, uma vez que interfere
diretamente na desativação deste estado. Compostos altamente fluorescentes, usualmente são
pouco eficientes como agentes fotodinâmicos, uma vez que a desativação do estado singlete
excitado leva a baixa a produção de estados excitados tripletes formados pelo processo de
cruzamento intersistemas, o que resulta em baixos processos de transferência de energia entre
o estado excitado triplete e o oxigênio, produzindo
1
O
2
. Assim, os baixos valores de Φ
f
encontrados contribuem para a formação dos estados excitados tripletes e, portanto, a
produção o
1
O
2
.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Utilizamos como padrão uma solução de ZnPC em etanol (Φ
f
= 0,28) conforme
descrito por Oliveira, 2006 (Oliveira et al., 2006).
O método utilizado foi baseado no formalismo descrito por Eaton (Eaton, 1988b;
Eaton, 1988a), onde o rendimento quântico de uma amostra desconhecida é dado em relação a
um padrão, como demonstrado na Equação 9.
padrão
amostra
padrão
amostra
padrão
padrão
amostra
amostra
x
n
n
x
aAbsorbânci
aAbsorbânci
x
Area
Area
φφ
=
(Equação 9)
em que φ é rendimento quântico, Área é a integral sobre a banda de emissão e n é o índice de
refração do solvente (Demas;Crosby, 1971).
As absorbâncias no comprimento de onda de excitação foram mantidas em
aproximadamente 0,01, minimizando a influência da concentração que pode atuar como um
filtro interno. Todas as áreas sob os espectros de emissão foram determinadas a partir dos
espectros de fluorescência corrigidos. Houve o cuidado para que todas as condições
experimentais fossem idênticas como temperatura, equipamento, caminho óptico, etc.
A Tabela II a seguir demonstra os resultados:
Tabela II - Rendimentos Quânticos de Fluorescência (Φ
f
)
Amostra
Φ
ΦΦ
Φ
f
ZnPC em etanol
a
0,28
ZnPC em lipossoma
a
0,13
ZnPC/Ru-tpy
em
lipossoma
0,05
a: (Oliveira et al., 2006)
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Pode-se observar que o rendimento quântico de fluorescência do fotossensibilizador
ZnPC diminui após sua incorporação no sistema lipossomal, comparando esse resultado com
meio orgânico homogêneo (Oliveira et al., 2006). Esta diminuição se torna ainda maior,
quando a ZnPC está associada ao complexo Ru-tpy em lipossoma, observando-se uma
diminuição do rendimento quântico de fluorescência da ZnPC de 40% comparado com o valor
sem a associação. Este comportamento é confirmado no estudo de supressão da fluorescência
da ZnPC pelo complexo realizado anteriormente.
Um menor rendimento quântico de fluorescência pode implicar em um maior
rendimento quântico de produção de estado excitado triplete, de onde se originam os
processos de fotossensibilização responsáveis pela morte das células malignas.
No entanto, embora ainda mais baixos, os valores do Φ
f
encontrados permitem que o
sistema apresente fluorescência útil para fotodiagnóstico.
IV.1.6 Medidas de fluorescência resolvida no tempo para a ZnPC em meio lipossomal e
da sua associação ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal.
O tempo de vida de uma substância fluorescente representa o tempo médio que esta
molécula permanece no estado excitado antes de retornar ao estado fundamental. A natureza
precisa do decaimento de fluorescência pode revelar detalhes sobre as interações do
fluoróforo com o meio em que se encontra numa escala de tempo da ordem de nanosegundos.
Esta informação está contida no espectro de emissão resolvido no tempo. Estes estudos
complementam a caracterização do estado excitado singlete do fotossensibilizador associado
ao complexo de rutênio.
Dentre os métodos disponíveis para se medir os decaimentos de fluorescência, um dos
mais usados é o método de contagem simples de fótons. Neste método, a amostra é excitada
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
por um flash de luz e, em seguida, um sistema de detecção mede o tempo entre este pulso e a
chegada do primeiro fóton à fotomultiplicadora (Phillips e O'Connor, 1984).
O tempo de vida do estado excitado é derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescência ajustados, bem como os desvios e resíduos médios. Nas
curvas de decaimento de fluorescência, a intensidade de luz decresce com o tempo após a
remoção da luz de excitação. Para a ZnPC associada ao complexo de rutênio em meio
lipossomal foi obtida a curva de decaimento apresentadas na figura 17.
O comprimento de onda de excitação utilizado para a ZnPC nos meios estudados foi
de 633 nm, enquanto a emissão de fluorescência foi monitorada a 680 nm. Para cada medida
de decaimento foram coletadas em média 10.000 contagens.
O tempo de vida do estado excitado é derivado das curvas de decaimento que mostram
os decaimentos de fluorescência ajustados, bem como os desvios e resíduos médios. Nas
curvas de decaimento de fluorescência, a intensidade de luz decresce com o tempo após a
remoção da luz de excitação. A curva de decaimento obtida está apresentada na Figura 17.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Figura 17: Curva de decaimento e ajuste exponencial para o fotossensibilizador ZnPC (5,0
µmolL
-1
) associado ao complexo Ru-tpy (50,0 µmolL
-1
) em lipossoma. O Inserto abaixo da
figura representa o resíduo médio.
Os tempos de vida dos decaimentos estão sumarizados na Tabela III.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Tabela III - Tempos de vida de fluorescência (τ
s
), Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio homogêneo, meio lipossomal e associado ao complexo
Ru-tpy.
Sistemas
τ
ττ
τ
1
(ns)
A
1
τ
ττ
τ
2
(ns)
A
2
ZnPC em etanol
a
4,00 ± 0,02
100 - -
ZnPC em lipossoma
a
3,09 ± 0,06
47,2
0,94 ± 0,03
52,8
ZnPC/ Ru-tpy
3,19± 0,04
72,0
0,91 ± 0,02
28,0
a: (Oliveira et al., 2006)
Quando incorporado ao lipossoma, o decaimento cinético de fluorescência da ZnPC
apresenta uma cinética biexponencial. O decaimento biexponencial observado está
relacionado com a heterogeneidade do sistema lipossomal. Assim, os dois tempos de vida
encontrados para a ZnPC
em meio lipossomal,
são atribuídas as moléculas de ZnPC
localizadas em diferentes ambientes químicos, de acordo com Oliveira, 2006 (Oliveira et al.,
2006). Resultados similares têm sido relatados para muitos outros fotossensibilizadores, tais
como os derivados de fenotiazinas em diferentes meios microheterogêneos (Balasubramaniam
e Natarajan, 1997; Viswanathan e Natarajan, 1996). A presença do complexo Ru-tpy não
provocou alteração significativa no tempo de vida para a ZnPC em meio lipossomal,
apresentou também um segundo tempo de vida, permanecendo a cinética de decaimento do
tipo biexponencial. Houve mudança na população relativa de cada estado excitado, o que está
de acordo com o esperado considerando uma redistribuição do fotossensibilizador com a
adição de mais uma espécie.
Pode-se assim concluir que os decaimentos obtidos para a ZnPC dependem do meio
em que a mesma se encontra. Isto é confirmado pela diferença entre os tempos de vida obtidos
para o meio homogêneo (etanol).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Na seqüência dos estudos de caracterização dos estados excitados está o estudo do
comportamento do estado excitado triplete.
IV.1.7 Estudos dos estados tripletes por fotólise por pulso de laser
A ação fotodinâmica dos fotossensibilizadores (FS) nos sistemas biológicos envolve,
principalmente o primeiro estado excitado triplete (T
1
) do FS, que é formado pelo cruzamento
intersistema do estado excitado singlete de vida curta, inicialmente produzido pela absorção
da energia radiante. A fotossensibilização celular ocorre devido a reação desta espécie
excitada (T
1
*
) com o oxigênio molecular, usualmente presente no meio, gerando oxigênio
singlete (Spikes, 1986).
Entretanto, cabe ressaltar que a fototoxicidade das ftalocianinas não se limita apenas à
produção de oxigênio singlete (
1
O
2
) como espécies reativas de oxigênio. A absorção de
elétrons fotoinduzida por biomoléculas apropriadas levam a reações de transferência de
elétrons, ou abstração de hidrogênio de moléculas biológicas que resultam na produção de
radicais livres que podem atuar, simultaneamente com a produção de oxigênio singlete
(processo do Tipo II) (Viola et al., 1998)e também com a produção de outras espécies reativas
de oxigênio (EROs , processos do Tipo I). Isto faz deste fotossensibilizador especial atuando
na produção de mais de um tipo de espécies excitadas.
Segundo Rotta et al 2003 (Rotta, Lunardi e Tedesco, 2003),após a irradiação, a ZnPC
está no seu estado triplete e pelo processo de transferência de elétrons pode formar o ânion
radical ZnPC
·-
que pode sua vez doa seu elétron para o dióxido de hidrogênio produzindo
ânion radical superóxido (O
2
·-
). A fotossensibilização também pode gerar a formação radical
hidroxila (
·
OH) pela redução do peróxido de hidrogênio (Equações 10-14).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
ZnPC + h
ν
→
1
ZnPC →
3
ZnPC
Equação (10)
3
ZnPC
+ ZnPC → ZnPC
• −
+ ZnPC
•+
Equação (11)
ZnPC
• −
+ O
2
→ ZnPC
•+
+ O
2
• −
Equação (12)
O
2
• −
+ O
2
• −
+ 2H
+
→ H
2
O
2
+ O
2
Equação (13)
ZnPC
• −
+ H
2
O
2
→ ZnPC
+
•
OH + OH
-
Equação (14)
Dentre as técnicas resolvidas no tempo baseadas no monitoramento direto da absorção
ou emissão de um intermediário reacional de vida curta, a técnica de fotólise por pulso de
laser é uma das mais utilizadas (Oliveira et al., 2006; Pelegrino et al., 2005; Simioni et al.,
2008). Esta técnica é usada para gerar e estudar a reatividade dos mais diversos tipos de
transientes, oriundos de estados eletronicamente excitados.
Nesta técnica uma grande população de moléculas do estado fundamental é promovida
para os estados excitados singletes superiores por um pulso rápido de luz de alta intensidade.
Após o disparo do laser, as moléculas que se encontram no estado excitado singlete sofrem
cruzamento intersistema gerando o estado excitado triplete (T
1
*
).
A diferença básica entre os processos-envolvendo o estado excitado singlete e o estado
excitado triplete - é que no estado excitado triplete, as moléculas apresentam uma vida média
mais longa (da ordem de µs a ms), podendo interagir com outras espécies, ou retornar ao
estado fundamental por emissão de luz, por um processo conhecido como fosforescência. Em
solução homogênea, a probabilidade e a eficiência do processo de fotossensibilização
dependem de vários parâmetros fotofísicos, tais como o rendimento quântico do estado
excitado triplete e sua velocidade de decaimento, ou a transferência de energia para o
oxigênio molecular solubilizado no meio.
O espectro de absorção do transiente gerado por fotólise por pulso de laser não fornece
um valor absoluto para a absorbância; obtém-se na verdade, a diferença da absorção entre o
precursor e o transiente formado.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Assim, o espectro de absorção do transiente é dependente da concentração do
precursor na região onde este absorve, e um valor negativo encontrado para a diferença de
absorbância (∆DO) corresponde a formação de um intermediário com uma absortividade
menor que a do precursor, ou seja, o desaparecimento da absorção do espectro de partida no
estado estacionário.
Os estados excitados para a ZnPC no sistema lipossomal e associada ao complexo Ru-
tpy no sistema misto foram gerados e estudados por fotólise por pulso de laser como descrito
na sessão III.4.8. Os experimentos foram realizados na concentração de 5,0 µmolL
-1
para a
ZnPC e 50,0 µmolL
-1
para o complexo.
Os tempos de vida dos estados excitados tripletes (τ
T
) dos fármacos foram calculados
através da análise cinética das curvas de decaimento dos transientes no máximo da absorção
do estado excitado triplete (480 nm) usando-se um programa de ajuste do próprio aparelho
como mostrado na figura 18.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Figura 18: Espectro de absorção do transiente obtido através do método de fotólise por pulso
de laser da ZnPC (5,0 µmolL
-1
) associada ao complexo Ru-tpy (50,0 µmolL
-1
) em meio
lipossomal após excitação por pulso de laser em 355 nm, mostrando a absorção máxima do
triplete centrada no comprimento de onda de 480 nm e o fotobranqueamento do estado
fundamental centrado a aproximadamente 380 nm e 580 nm. A curva de decaimento dos
transientes no máximo da absorção triplete em 480 está mostrada no inserto.
Os tempos de vida obtidos estão mostrados na Tabela IV
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Tabela IV - Tempos de vida dos estados excitados tripletes (τ
t
), Amplitude relativa (A) para o
fotossensibilizador ZnPC em meio lipossomal e associado ao complexo Ru-tpy .
Sistemas
τ
ττ
τ
t
( µ
µµ
µs )
ZnPC em lipossoma 0,83
ZnPC/Ru-tpy 0,27
Os resultados obtidos através dos experimentos de fotólise por pulso de laser sugerem
que os sistemas analisados possuam diferentes tempos de vida. A diminuição no tempo de
vida para o sistema misto pode ser explicada pelo processo de supressão do estado excitado
singlete da ZnPC na presença do complexo Ru-tpy. Este resultado está de acordo com os
resultados de emissão de fluorescência para o sistema misto previamente descrito.
Embora, o valor encontrado do tempo de vida triplete para a ZnPC associada ao
complexo de rutênio no sistema lipossomal tenha sido menor, este tempo mostrou-se ser
suficiente para que os estados tripletes excitados produzidos reajam com o oxigênio molecular
presente no meio, produzindo oxigênio singlete ou outras espécies reativas de oxigênio
(EROs) e apresentar ainda uma atividade fotodinâmica como será mostrada nos estudos in
vitro.
IV.1.8 Determinação do rendimento quântico de produção de oxigênio singlete (Φ
ΦΦ
Φ
∆
∆∆
∆
)
A determinação deste parâmetro espectroscópico é muito importante, pois quantifica a
produção de uma das principais espécies reativas responsável pela destruição da célula
tumoral, o oxigênio singlete,
1
O
2
. Esta espécie em conjunto com outras espécies radicalares
promovem uma série de processos foto-oxidativos em sítios endógenos, situados tanto no
citoplasma celular quanto na estrutura da membrana fosfolipídica (lipídios, proteínas, etc),
desencadeando uma cascata de eventos de resposta celular tornando-se essencial para os
estudos fotoquímicos e fotofísicos, envolvendo fotossensibilizadores ativos no processo
fotodinâmico.
Assim, um grande número de investigações tem sido realizado em meio aquoso e
microheterogêneo (Oliveira et al., 2006; Spiller, 1998). Para a determinação do rendimento
quântico de oxigênio singlete (Φ
∆
) produzido pela ZnPC em meio homogêneo, lipossomal e
associada ao complexo Ru-tpy foi empregado o método fotofísico, que consiste na medida da
intensidade de luminescência na região do infravermelho (1270 nm) da espécie gerada. O Φ
∆
determinado através da intensidade do sinal de luminescência do oxigênio singlete pode ser
determinado pela Equação 2 (Spiller, 1998):
Φ
∆
= ( I / I
ref
) . Φ
∆ref
. ( τ
∆ref
/ τ
∆
) (Equação 2)
onde, I é a intensidade do sinal de luminescência, τ
∆
é o tempo de vida do oxigênio singlete e
o subscrito ref se refere à substância padrão.
Nos estudos de determinação da produção de oxigênio singlete, o composto utilizado
como padrão foi o feoforbide-a, pois este apresenta um alto rendimento quântico de oxigênio
singlete (Φ
∆
= 0,59).
Os tempos de vida do oxigênio singlete foram medidos pela transferência de energia
entre o estado excitado triplete do fotossensibilizador e o oxigênio molecular presente no
meio. Em todos os casos, a intensidade máxima de fosforescência no tempo t = 0 foi
determinada pela regressão exponencial e os tempos de vida de
1
O
2
foram determinados pelo
tratamento do ajuste da curva. Os valores dos rendimentos quânticos de produção do oxigênio
singlete produzidos pelo feoforbide-a e pela ZnPC associada ou não ao complexo Ru-tpy
estão apresentados na Tabela V.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Tabela V - Valores de rendimento quântico de produção do oxigênio singlete
Amostras
Φ
ΦΦ
Φ
∆
∆∆
∆
Feoforbide-a 0,59
ZnPC em etanol
a
0,65
ZnPC em lipossoma
a
0,23
ZnPC/Ru-tpy 0,16
a: (Oliveira et al., 2006)
De acordo com os dados na Tabela V, pode-se observar que o rendimento quântico de
oxigênio singlete produzido pela ZnPC em etanol foi maior do que para a ZnPC incorporada
aos lipossomas. Portanto, há uma diminuição do rendimento quântico de oxigênio singlete
produzido pela ZnPC quando incorporada aos lipossomas, devido ao fato de que com a
distribuição do fotossensibilizador no lipossoma, sua concentração local na bicamada lipídica
pode aumentar e, por conseguinte as colisões das moléculas do fotossensibilizador entre si,
levando a uma supressão das moléculas no estado excitado (Oliveira, D. M., 2006). Uma
outra explicação é que uma vez gerado dentro do lipossoma, o oxigênio singlete pode
rapidamente se difundir para outras regiões do sistema microheterogêneo e ser suprimido e
gerar espécies secundárias (Roslaniec et al., 2000).
Quando comparamos com os dados na literatura, podemos observar que o resultado
obtido pelo sistema lipossomal da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy também apresentou
uma diminuição no rendimento quântico de oxigênio singlete em relação ao rendimento
quântico apresentada pela ZnPC em meio lipossomal. Este resultado é bastante coerente com
os dados obtidos dos outros parâmetros fotofísicos como o Φ
f
, τ
s
e τ
T1
em que o sistema misto
(ZnPC/ Ru-tpy ) apresenta uma diminuição do valor quando o comparamos com os dados
obtidos para a ZnPC lipossomal, sendo esperado portanto, que o valor de Φ
∆
fosse menor. No
entanto, continua sendo suficiente para ativar os processos de oxidação útil para TFD.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
IV. 1.9 Estudos de detecção de NO gerado por fotólise de pulso a laser em 675 nm.
Os experimentos de fotólise por pulso de laser permitem a observação das mudanças
dos espectros de absorção que ocorre após à absorção da luz do pulso laser, no intuito, de
estudar a liberação de NO dentro do processo de excitação da ZnPC associada ao complexo
Ru-tpy pelo sistema misto em 675 nm.
Cabe ressaltar que estes estudos foram realizados nas condições usuais utilizadas nos
estudos in vitro ou in vivo, ou seja, excitou com um laser contínuo (CW) na região visível do
espectro eletromagnético.
Concomitantemente, acompanhou-se a liberação in situ de NO gasoso pelo
acoplamento do NOmeter na cubeta irradiada, como descrito na sessão III.4.10.
A variação espectral na região do UV-visível para o sistema durante a fotólise em 675
nm representadas nas figuras 19 e 20.
Pela Figura 19, podemos observar a diminuição da banda em 670 nm da Zinco
ftalocianina, como já era esperado, em conseqüência do seu processo de fotooxidação.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Figura 19: Espectro de absorção da ZnPC 5,0 µmolL
-1
incorporadas em lipossomas sob
irradiação do laser em 675 nm, na faixa total de energia de 0 J a 60 J num intervalo de tempo
de 0 s a 150 s.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Figura 20: Espectro de absorção da ZnPC 5,0 µmolL
-1
e do complexo Ru-tpy (50,0 µmol.L
-1
)
incorporados em lipossomas sob irradiação do laser em 675 nm, na faixa total de energia de 0
J a 60 J num intervalo de tempo de 0 s a 150 s.
No lipossoma contendo o sistema misto (ZnPC/Ru-tpy) na Figura 20, observamos
novamente a diminuição da banda em 670 nm da ZnPC e também a redução da banda TCML
(360 nm) do tipo d
π
(Ru
II
)→π*(NO) do complexo Ru-tpy em conseqüência da saída de NO
gasoso. Tais comportamentos espectroscópicos são justificáveis diante dos experimentos
realizados por Rotta et. al (Rotta, Lunardi e Tedesco, 2003), onde irradiou no comprimento de
onda de 355 nm o complexo de S-nitroso-N-acetilcisteína- Zinco ftalocianina (NacySNO-
ZnPC) em lipossoma e observou mudanças das bandas de absorção na região do ultra-violeta
em 300-350 nm e na região do visível em 500-600 nm, tendo comprovado a liberação de NO
gasoso. E de Lima 2006 (de Lima, R. G., 2006) também irradiou o complexo de rutênio
[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]
3+
em 355 nm utilizado neste trabalho, e observou a redução da banda
TCML (360 nm) do tipo d
π
(Ru
II
)→π*(NO) típica da liberação de NO pelo processo da
fotólise.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
A Figura 21 demonstra o cronoamperograma obtido pelo NOmeter para o sistema
misto ZnPC/Ru-tpy (5/50 µmolL
-1
) durante a fotólise em 675 nm, sendo cada pulso de 25s e
10J de potência.
Figura 21: Cronoamperograma para o lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy sob
irradiação do laser em 675 nm.
A concentração de NO gerado fotoquimicamente, a partir do lipossoma contendo a
mistura ZnPC/Ru-tpy, foi calculada pelos picos máximos obtidos pelo cronoamperograma
após a irradiação. A partir dos pontos coletados obtivemos a concentração média de NO
liberado de 0,27 µmolL
-1
.
Assumindo que a irradiação em 675 nm promove o processo de fotobranqueamento na
banda Q de transição π –π* do fotossensibilizador, no lipossoma contendo apenas a ZnPC
ocorreu uma diminuição de 85% desta banda num tempo total de 100 s de irradiação, de 10 J
de energia com dose 3,18 J/cm
2
. Já no lipossoma contendo a ZnPC e o complexo Ru-tpy
associados ocorre uma diminuição de 65% dessa banda. Os resultados demonstraram que a
excitação do lipossoma contendo a ZnPC e o complexo de rutênio associados pode liberar NO
e
1
O
2
usando luz visível, sendo este um sistema promissor para o uso na Terapia
Fotodinâmica.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
De acordo com os resultados fotofísicos e fotoquímicos, ressaltamos novamente o
possível mecanismo de interação entre a ZnPC e o complexo Ru-tpy, envolvendo a
transferência de elétron do estado singlete excitado da ZnPC (equação 16) para o complexo
Ru-tpy, liberando NO (equação 17). Desta forma, como já foi estabelecido que pode ocorrer
um processo de transferência de energia do estado excitado triplete da ZnPC para o oxigênio
molecular do meio, acarretaria assim na produção de oxigênio singlete (equação 18).
Estes resultados demonstram, que a ZnPC possa atuar efetivamente como uma
“antena” para o processo de transferência de elétron, necessário para que o complexo de
rutênio libere o NO (de Lima, R. G., 2006). Mostrando-nos uma situação, onde o complexo
nitrosilo de rutênio doador de NO, atue claramente como um pró-fármaco. Além disso,
considerando que a ZnPC, um fotossensibilizador clássico, possa agir no sistema pelos
mecanismos do tipo I e II para a produção de espécies reativas (Foote, 1991b), ocorre a
potencialização da atividade fotodinâmica pelo mecanismo de sinergismo (liberação de NO e
1
O
2
) como já descrito de outras moléculas fotossensibilizadoras (da Silva et al., 2007).
ZnPC + hν →
1
ZnPC (16)
1
ZnPC+[Ru(NH.NHq)(tpy)NO]
3+
→
0
ZnPC+[Ru(S)(NHNHq)(tpy)]
2+
+NO
0
(17)
1
ZnPC
(ISC)
→
3
ZnPC +
3
O
2
→
0
ZnPC +
1
O
2
(18)
S = solvente ; ISC= cruzamento inter sistema
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
III.2 Estudos in vitro
III.2.1 Determinação da Toxicidade da ZnPC, do complexo Ru-tpy e do sistema
lipossomal misto na ausência de luz.
Os testes de viabilidade celular para a ZnPC em lipossoma, para o complexo Ru-tpy
em lipossoma e para o sistema misto na ausência de estímulo luminoso, foram feitos para
linhagens de células B-16 F10 para verificarmos a toxicidade dos sistemas utilizados.
O tempo de incubação utilizado na avaliação da toxicidade celular foi de 3 horas, pois
é o tempo ideal considerando, que quando associarmos esse complexo ao fotossensibilizador
ZnPC devemos nos orientar pelo tempo de incubação determinado pelo composto mais
fotossensível sem causar morte celular no escuro. Neste caso nos orientamos pelo tempo de
incubação já determinando para a ZnPC lipossomal (Oliveira, D. M., 2006). Os resultados
foram analisados com base nos estudos de viabilidade celular pelo método do “MTT” (a
descrição detalhada desta metodologia foi apresentada na seção experimental, item III.2.2.
Os resultados obtidos na avaliação da toxicidade das células B16-F10 estão
apresentados na figura 22, na forma de gráfico de porcentagem da viabilidade celular em
função dos sistemas utilizados.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Figura 22: Porcentagem de células B16-F10 vivas após 3 horas de incubação com as
formulações lipossomais estudadas. 1= lipossoma vazio, 2 = Ru-tpy 0,5 mmolL
-1
em
lipossoma, 3 = ZnPC 5,0 µmolL
-1
em lipossoma e
4 = ZnPC /Ru-tpy (5,0 µmolL
-1
/0,5 mmolL
-1
) no sistema lipossomal. Significância estatística
das diferentes formulações foi determinada pelo teste de variância One-way ANOVA seguido
do pós-teste Newman-Keuls t-test para múltiplas comparações (*p> 0,05; **p< 0,05;
***p<0,01). Cada SEM representa o desvio padrão (± SD) para n = 3.
Os resultados mostraram um perfil de toxicidade apropriado para as amostras 1, 2 e 3,
com a viabilidade celular igual ou acima de 90%. Entretanto, para a combinação sinérgica da
ZnPC com 0,5 mmolL
-l
do complexo Ru-tpy mostrou uma toxicidade basal de cerca de 20%.
Estes dados encontram-se sumarizados na Tabela VI.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Tabela VI - Viabilidade celular após a incubação por 3 horas com as formulações
lipossomais estudadas
Lipossoma Viabilidade Celular (%)
ZnPC
(5,0 µmol.L
-1
)
93±1
Ru-tpy (0,5 mmol.L
-1
) 90±2
ZnPC (5,0 µmol.L
-1
)/ Ru-tpy
(0,5 mmol.L
-
77±1
Portanto, baseando-nos nestes resultados, a fim de minimizar este efeito de
toxicidade do sistema misto (ZnPC/Ru-tpy) decidimos realizar os estudos de fototoxicidade
utilizando uma concentração do complexo Ru-tpy 10 vezes menor, ou seja, 50,0 µmolL
-1
.
Sendo que esta concentração foi a utilizada em toda caracterização fotofísica e fotoquímica do
sistema sinérgico mostrada anteriormente.
IV.2.2 Estudo da fototoxicidade do sistema lipossomal da ZnPC e do sistema lipossomal
misto
Analisamos a seguir, a fototoxicidade para a ZnPC (1 µmolL
-1
) em lipossoma, e para
o sistema lipossomal misto, variando-se a concentração da ZnPC em 1,0 µmolL
-1
e
5,0 µmolL
-1
mantendo constante a concentração do complexo Ry-pty 50,0 µmolL
-1
. Estes
estudos foram realizados como descrito na sessão III.2.4 e na presença de luz com uma dose
de 0,5 J/cm
2
.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Figura 23: Toxicidade no excuro (A) e fototoxicidade (B) para células B16-F10.
1 = ZnPC 1 µmolL
-1
em lipossoma; 2 = ZnPC/Ru-tpy (1µmolL
-1
/50 µmolL
-1
) no sistema
lipossomal; 3 = ZnPC/Ru-tpy (5 µmolL
-1
/50 µmolL
-1
) no sistema lipossomal. Significância
estatística das diferentes formulações foi determinada pelo teste de variância One-way
ANOVA seguido do pós-teste Newman-Keuls t-test para múltiplas comparações (**p< 0,05,
*** p< 0,01), Cada SEM representa o desvio padrão (± SD) para n = 3.
Primeiramente na figura 23-A, pode-se observar nos estudos de toxicidade no escuro,
utilizando os sistemas lipossomais da ZnPC e o sistema misto, apresentaram uma viabilidade
celular acima de 90%, o que nos confirma que o sistema sinérgico (ZnPC/Ru-tpy) (5,0 µmolL
-
1
/50,0 µmolL
-1
) não apresentou toxicidade para linhagem neoplásica.
Na figura 23-B, pode-se observar que na presença de luz, o sistema lipossomal misto
(ZnPC/Ru-tpy) (5,0 µmolL
-1
/50,0 µmolL
-1
) mostrou uma alta capacidade em induzir morte
celular sob a irradiação de luz (quase 95%).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
Este efeito apenas confirma nossa hipótese de que o possível mecanismo de interação
da ZnPC com o complexo de rutênio leva a uma formulação, onde o efeito sinérgico das
espécies produzidas, induz a morte celular.
Estes resultados indicam claramente que esta linha de raciocínio permite uma melhor
ação da TFD, onde fármacos atuando sinergicamente produzindo espécies reativas de
oxigênio (EROs) e as espécies reativas de nitrogênio (ERONs), induzem in vitro uma
considerável morte celular após mínimas doses de luz pelo processo de fotossensibilização
(Tedesco, Rotta e Lunardi, 2003).
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Resultados e Discussão
V. CONCLUSÕES
Dentro da proposta do trabalho, podemos destacar as seguintes conclusões:
Pela análise das características espectroscópicas da ZnPC e do complexo de rutênio
Ru-tpy, pode-se observar que não houve mudança em seus perfis espectrais de absorção após
serem incorporados nos lipossomas. Houve, porém, houve uma redução no perfil
espectroscópico de emissão de fluorescência da ZnPC associada ao complexo de rutênio em
lipossoma, resultantes de um processo de supressão do primeiro estado excitado singlete da
ZnPC.
Os rendimentos quânticos de fluorescência (Φ
F
) da ZnPC e de sua associação ao
complexo Ru-tpy em meio lipossomal foram determinados, utilizando-se o método relativo a
um composto padrão (ZnPC em etanol, Φ
F
= 0,28). Pela análise dos dados pode-se observar
que houve a incorporação da ZnPC no lipossoma e sua associação ao complexo causaram
uma diminuição no valor do Φ
F.
Nos estudos dos estados excitados tripletes por fotólise, por pulso de laser, os
resultados obtidos mostraram tempos de vida diferentes, quando os comparamos aos dados da
literatura, estes tempos diferentes sugerem a formação de outras possíveis espécies reativas
pela associação do fotossensibilizador ZnPC com o complexo Ru-tpy em lipossoma.
Nos estudos de fotólise em 675 nm somente com a Zinco ftalocianina (ZnPC) em
meio lipossomal observou-se a diminuição de sua banda em 670 nm cerca de 85%, devido seu
processo de fotooxidação após a irradiação do laser. Tal efeito, também foi observado no
estudo da ZnPC associada ao complexo Ru-tpy em meio lipossomal, porém essa diminuição
foi de 65%, ocorrendo também a diminuição da banda TCML do tipo d
π
(Ru
II
)→π*(NO) do
complexo Ru-tpy. Este comportamento pode ser comprovado pela saída de NO gasoso
registrado no NOmeter.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Conclusões
Os estudos de citotoxicidade, utilizando-se as linhagens B-16 F10, mostraram que a
incubação destas células com o sistema misto ZnPC/Ru-tpy na concentração de 5,0 µmolL
-
1
/50,0 µmolL
-1
,
foi a melhor combinação encontrada para estes fármacos uma vez que
apresentaram uma viabilidade celular significativa . No entanto, sob ação da luz nestas
mesmas condições, pode-se observar uma alta atividade fotodinâmica com uma diminuição
bem significativa na viabilidade celular.
Portanto, a idéia de combinar dois compostos que trabalhem sinergicamente para a
produção das espécies reativas, EROs e ERONs, pela combinação da Zinco ftalocianina e do
complexo nitrosilo de rutênio, nos mostrou ser bem eficiente na destruição das células
neoplásicas.
Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Conclusões
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Dissertação de Mestrado – D. S. Maranho Referências Bibliográficas
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