( PDF ) Avaliação da detecção da proteína NS1 no diagnóstico da infecção pelo vírus dengue-3 em comparação a outros métodos laboratoriais utilizados no diagnóstico da dengue

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

LUIZA ANTUNES DE CASTRO

Avaliação da detecção da proteína NS1 no diagnóstico da

infecção pelo vírus dengue-3 em comparação a outros

métodos laboratoriais utilizados no diagnóstico da dengue

Ribeirão Preto - SP

2008

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LUIZA ANTUNES DE CASTRO

Avaliação da detecção da proteína NS1 no diagnóstico da

infecção pelo vírus dengue-3 em comparação a outros

métodos laboratoriais utilizados no diagnóstico da dengue

Ribeirão Preto - SP

2008

Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São

Paulo, para obtenção do título de Mestre em Ciências.

Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada.

Opção: Bioagentes Patogênicos.

Orientador: Prof. Dr. Benedito Antônio Lopes da

Fonseca

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FICHA CATALOGRÁFICA

Castro, Luiza Antunes

Avaliação da detecção da proteína NS1 no diagnóstico da

infecção pelo vírus dengue-3 em comparação a outros métodos

laboratoriais utilizados no diagnóstico da dengue, São Paulo.

Ribeirão Preto, 2008.

p. 100 : il. ; 30cm

Dissertação de mestrado, apresentada à Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração:

Imunologia Básica e Aplicada, opção Bioagentes Patogênicos.

Orientador: Fonseca, Benedito Antônio Lopes.

1. Dengue. 2. NS1. 3.Diagnóstico. 4.ELISA. 5. RT-PCR

FOLHA DE APROVAÇÃO

Luiza Antunes de Castro

Avaliação da detecção da proteína NS1 no diagnóstico da infecção pelo vírus

dengue-3 em comparação a outros métodos laboratoriais utilizados no diagnóstico

da dengue

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, para

obtenção do título de Mestre em Ciências.

Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada

Aprovada em:

Banca examinadora

Prof. Dr. ____________________________________________________________

Instituição:_____________________ Assinatura:____________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________

Instituição:_____________________ Assinatura:____________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________

Instituição:_____________________ Assinatura:____________________________

Dedicatória

Aos meus pais, Murilo Machado de Castro e

Maria Beatriz Antunes de Castro,

pela educação, apoio, dedicação e contribuição,

sempre presentes de forma decisiva

em simplesmente todos os momentos.

Ao meu irmão, Rodrigo,

pelo apoio e carinho.

Ao meu amor Daniel,

com enorme admiração, e gratidão

por sua compreensão,

carinho, presença e incansável apoio

ao longo de todo o período de elaboração deste trabalho.

Parceria simplesmente indispensável!

Muito obrigada pela dedicação e paciência.

Amo vocês!!!

APOIO FINANCEIRO

FAPESP Proc. 06/58792-6,

FAPESP Proc. 2007/04326-7

Agradecimentos

Primeiramente a DEUS, por tudo!

Em especial ao Prof. Dr. Benedito Antônio Lopes da Fonseca, pela orientação,

grande paciência, companheirismo, apoio e por ter me proporcionado as condições para

desenvolver esse trabalho;

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pela

concessão da bolsa de mestrado e pelo suporte financeiro, sem o qual seria impossível a

realização desta pesquisa;

Aos membros da banca examinadora da minha dissertação: Prof. Dr. Luís Tadeu

Moraes Figueiredo e Prof. Dr. Marcos Boulos, pela atenção, discussão e sugestões que

enriqueceram este trabalho;

Ao Curso de pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada da FMRP – USP, na

pessoa de seus Professores e Funcionários pelos ensinamentos e pela convivência;

À secretária da pós-graduação Ana Cristine S. Ferreira, pela eficiência, pelo

permanente apoio, amizade e orientação durante todo o período do mestrado;

Ao Professor Sérgio Oliveira de Paula, meus agradecimentos especiais. Esteve

envolvido diretamente com a minha vinda, sempre atuando com sugestões, idéias e

otimismo;

Agradeço muito a Luzia Márcia e todas as funcionárias da vigilância epidemiológica,

Ângela e Rosana pelo apoio técnico e ajuda na coleta dos dados;

À técnica do laboratório, D. Maria Aparecida Mendes, pela amizade, disponibilidade e

organização em todas as etapas desse trabalho;

À Paula e Camila pela grande assistência e ajuda na condução dos experimentos e

nos momentos de risada;

Aos grandes colegas do Laboratório de Virologia Molecular: Alessandra, Cláudio,

Dani, Emiliana, Keny, Kleber, Maira, Mariana, Marcos, Nathália, Patrícia, Rafael, Teresa,

Renata pelo apoio, amizade e incentivo e também os vários momentos de descontração,

pessoinhas incríveis;

Aos grandes colegas Virologistas: Alberto, Liz, Juliana, Vanessa, Glauciane, Viviane,

Andréia, Veridiana, Alex, Lenny, Felipe, Luzia, Gelse, Alessandra, Regina, Laura, Aline,

Raquel, que de uma forma ou de outra contribuíram bastante, seja no trabalho, seja na

convivência diária do laboratório, seja em momentos de descontração pelas conversas,

festinhas, discussões, que renderam boas risadas;

Aos meus colegas de pós-graduação: Manuela, Gustavo, Janaína, Nalu, Breve,

Renato, Ana Cláudia, Aline, Luciano pela amizade, apoio e pela convivência;

Ao pessoal do Centro de Virologia, Soraya, Sueli, Paulo, Pavanelli, por toda força e

estando sempre dispostos a nos ajudar em tudo o que precisássemos;

Aos meus amigos de Viçosa, que sempre me ensinaram bastante, lições importantes

que carregarei por onde for;

A todos os pacientes que participaram da pesquisa, sem os quais esse trabalho não

seria possível;

A todos, que de forma direta ou indireta, contribuíram para a realização deste

trabalho.

O meu muito obrigada!

"Agrada-me mais a dúvida do que o saber".

Dante Alighieri

RESUMO

CASTRO, L. A. Avaliação da detecção da proteína NS1 no diagnóstico da infecção pelo

vírus dengue-3 em comparação a outros métodos laboratoriais utilizados no

diagnóstico da dengue. 2008. 100 f. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.

As infecções causadas pelos vírus dengue representam a principal arbovirose em

nível mundial e são da maior importância para o Brasil. A dengue apresenta uma ampla

variedade de sintomas clínicos desde infecção assintomática até doença grave, a dengue

hemorrágica ou síndrome do choque da dengue. O diagnóstico da dengue aplicado na rotina

requer que seja feita uma coleta de sangue na fase de convalescença, porém a experiência

mostra que muitos pacientes não retornam para fazer esta coleta. Por esta razão um bom

método de diagnóstico na fase aguda da doença é fundamental para a adoção de condutas

terapêuticas capazes de minimizar complicações e reduzir a mortalidade, além de ser muito

importante para o manejo clínico e epidemiológico da dengue em áreas onde múltiplos

Flavivirus são endêmicos, como é o caso do Brasil. Com o intuito de aperfeiçoar o

diagnóstico da dengue, durante a fase aguda da doença, foi avaliada neste estudo a

sensibilidade e especificidade da detecção da proteína NS1 comparando com a detecção do

vírus por RT-PCR, sorologia e isolamento viral em Ribeirão Preto. Foram avaliados 250

pacientes com suspeita clínica de dengue. Do total de pacientes estudados, em 81 (32,4%)

foi possível a detecção molecular do agente. No isolamento viral 34 amostras foram

positivas por IFI e 51 foram positivas utilizando a PCR, como método de detecção do vírus

dengue em sobrenadante do cultivo celular. A detecção de IgM ocorreu em 26% das

amostras analisadas. 36 amostras positivas para a RT-PCR foram IgM negativas por terem

sido colhidas em média apenas 2,1 dias após o início dos sintomas, e 22 amostras foram

positivas para IgM e negativas para o RT-PCR e isolamento viral. A detecção de IgG anti-

dengue ocorreu em 103 (41,2%) amostras. Destas 32 (31% - 32/103) foram tanto IgM

quanto IgG positivas, e das amostras que foram positivas somente para IgG, 12 (16,90% -

12/71) foram positivas também para o PCR. A sensibilidade do teste de NS1 quando

comparada à detecção de IgM anti-dengue ou resultado positivo de RT-PCR foi de 76,2% e

a especificidade de 96,5% O valor preditivo positivo neste caso foi de 94,1%, com um valor

preditivo negativo de 84,8%. Já quando foram consideradas apenas os resultados positivos

para IgM e positivos para o RT-PCR a sensibilidade do teste subiu para 95,1% e a

especificidade foi 77,9%. O valor preditivo positivo foi de 45,9%, com um valor preditivo

negativo de 98,9%. O teste de NS1 apresentou melhores resultados que as técnicas de

diagnóstico que podem ser usadas na fase aguda da doença (RT-PCR e isolamento viral),

além de ter tido uma menor queda na positividade quando comparada ao aumento nos dias

de sintomas em que a amostra foi coletada. Foi possível observar que o kit apresentou um

bom desempenho, sendo capaz de detectar a infecção por mais tempo que o RT-PCR e

logo no início dos sintomas. A técnica de detecção de NS1 viral representa uma importante

ferramenta diagnóstica em infecções por dengue, principalmente em áreas muito endêmicas

e onde a demanda é grande, possuindo uma alta especificidade e boa sensibilidade.

Palavras chaves: Dengue, NS1, ELISA, RT-PCR, diagnóstico virológico.

ABSTRACT

CASTRO, L. A. Evaluation of NS1 protein detection for dengue-3 diagnosis in

comparison to other laboratorial methods used in dengue diagnosis. 2008. 100 p.

Dissertation (Master) - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São

Paulo, Ribeirão Preto, 2008.

Dengue virus infection represents the main arboviral disease worldwide, and it is of

great importance to Brazil. Dengue encompasses a great spectrum of disease including

asymptomatic infection, dengue fever, and even the severe form dengue hemorrhagic fever

or dengue shock syndrome. Routine dengue diagnosis requires a sample collection in

convalescence phase, but the experience shows that many patients do not return to collect

this sample. For this reason a good diagnostic method of disease acute phase is

fundamental to a correct management of the patient, reduction of disease complications and

mortality rates, besides being very important to clinical and epidemiologic management in

areas where multiple Flavivirus are endemic, such as in Brazil. In order to improve dengue

diagnosis during acute phase of disease, this study evaluated the sensitivity and specificity of

NS1 detection compared to virus detection by RT-PCR, serology and viral isolation in

Ribeirão Preto. 250 samples of patients suspected of having dengue were evaluated. From

the total of evaluated patients, in 81 (32,4%) molecular detection of dengue-3 virus was

possible. By viral isolation 34 samples were positive by IFA and 51 positive by RT-PCR, on

culture cell supernatants. IgM detection occurred in 26% of the samples. 36 positive samples

to RT-PCR were negative for IgM detection because of collection day, mean of 2,1 days after

the beginning of disease symptoms, and 22 samples were positive for IgM and negative for

RT-PCR and viral isolation. Detection of anti-dengue IgG occurred in 103 (41,2%) samples.

From these 32 (31% - 32/103) were positive for IgM and IgG detection, and from the samples

positive only to IgG, 12 (16,90% - 12/71) were also positive to RT-PCR. NS1 test sensitivity

was 76,2% and specificity 96,5% when compared to IgM detection or RT-PCR positive

result. The positive predictive value in this case was 94,1% and the negative predictive value

was 84,8%. When only IgM detection and RT-PCR positive results were considered, test

sensitivity increased to 95,1% and specificity was 77,9%. The positive predictive value in this

case was 45,9% and the negative predictive value was 98,9%. NS1 test presented better

results than the diagnostic techniques usually used in acute phase of disease (RT-PCR and

viral isolation), and also had a smaller decrease in positivity when compared to the days in

which the samples were collected. The test presented a good performance, being able to

detect dengue virus infection longer than RT-PCR and shortly the after beginning of disease

symptoms. NS1 detection technique represents an important diagnostic tool in dengue

infections, mainly in highly endemic areas, having a good specificity and sensitivity.

Keywords: Dengue, NS1, ELISA, RT-PCR, viral diagnosis.

SUMÁRIO

I - INTRODUÇÃO................................................................................................................

1.1 – Histórico da dengue...................................................................................................

1.2 – Características do vírus da dengue............................................................................

1.3 – Aspectos epidemiológicos..........................................................................................

1.4 - Manifestações clínicas e achados laboratoriais..........................................................

1.5 - Diagnóstico da infecção por dengue...........................................................................

1.5.1 – Diagnostico Sorológico......................................................................................

1.5.2 – Isolamento Viral.................................................................................................

1.5.3 – Detecção Molecular..........................................................................................

1.5.4 – Detecção da NS1..............................................................................................

1.6 – Elementos envolvidos na patogênese........................................................................

1.7 – Tratamento, controle e prevenção.............................................................................

II - OBJETIVOS...................................................................................................................

III - MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................

3.1 – População de estudo..................................................................................................

3. 2 – Extração do RNA viral...............................................................................................

3.3 – One step RT-PCR para diagnóstico e sorotipagem dos vírus...................................

3.4 – Isolamento viral..........................................................................................................

3.5 – Ensaios de imunofluorescência indireta.....................................................................

3.6 – ELISA de captura para detecção de IgM anti-dengue...............................................

3.7 – ELISA indireto para detecção de IgG anti-dengue.....................................................

3.8 – PLATELIA DENGUE NS1 Ag KIT para detecção da proteína NS1...........................

3.9 – ELISA Pan-E Dengue Early para detecção da proteína NS1....................................

3.10 - Análises Estatísticas.................................................................................................

IV - RESULTADOS.............................................................................................................

4.1 – Amostras obtidas........................................................................................................

4.2 – One-step RT-PCR para detecção do vírus dengue...................................................

4.3 – Comparação das metodologias de diagnóstico molecular da dengue.......................

4.4 – Isolamento viral em cultura de células.......................................................................

4.5 – Diagnóstico sorológico por MAC-ELISA.....................................................................

4.6 – ELISA Indireto para detecção de IgG anti dengue.....................................................

4.7 – Detecção da NS1 pelo kit PAN-E Dengue Early ELISA (PanBio).............................

4.8 – Detecção da NS1 pelo kit PLATELIATM DENGUE NS1 AG Kit (Biorad).................

4.9 – Análise da sensibilidade e especificidade do teste de NS1.......................................

V - DISCUSSÃO.................................................................................................................

VI - CONCLUSÕES............................................................................................................

VII - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................

VIII - ANEXOS.....................................................................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS

ADE - Exacerbação imunológica dependente de anticorpos

CDC - Centers for Disease Control and Prevention

CSE - Centro Saúde Escola da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

DENV- 1 – Vírus dengue tipo 1

DENV- 2 – Vírus dengue tipo 2

DENV- 3 – Vírus dengue tipo 3

DENV- 4 – Vírus dengue tipo 4

DNA – Ácido dexoxiribonucléico

dNTPs – Deoxinucleotídeos

D.O. - Densidade Óptica

ELISA - Ensaio imunoenzimático/ Enzyme Linked lmmunosorbent Assay

FAPESP- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

FC - fixação do complemento

FD – Febre da dengue (Dengue clássica)

FHD – Febre hemorrágica do dengue

FITC - isotiocianato de fluoresceína

FMRP - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

IH - Inibição da hemaglutinação

HCFMRP-USP - Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-Universidade

de São Paulo

HLA - Antígenos leucocitários humanos

IgG - Imunoglobulina G

IgM - Imunoglobulina M

IFI - Imunofluorescência Indireta

IFN – Interferon

IL - Interleucina

MAbs - Anticorpos Monoclonais

MIAF- Mouse lmmuneascitic Fluid

NF-KB - Fator nuclear tipo kappa B

NS1 – Proteína não estrutural 1

OMS - Organização Mundial da Saúde

ORF - região de leitura aberta

PAF - Fator Ativador Plaquetário

pb – pares de base

PBS - Tampão Salina Fosfato

PCR – Reação em cadeia da polimerase

RT-PCR - Reação em cadeia da polimerase precedida por transcrição reversa

RNA – Ácido ribonucléico

SCD – Síndrome do choque da dengue

SFB – Soro fetal bovino

ssRNA - RNA fita simples

SVS - Secretaria de Vigilância em Saúde

TMB - 3,3', 5, 5' Tetrametil Benzidina

TN - teste de neutralização

TNF - Fator de Necrose Tumoral

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Reinfestação do Aedes aegypti nas Américas. Distribuição do A. aegypti na

Ámerica em 1930, 1970 e 2006. Fonte: (CDC), 2008a.................................................................

Figura 2: A. Fotomicrografia eletrônica de partículas virais do DENV-2 após 5 dias de

infecção em cultura de células (aumento de 345.000X). B. Representação esquemática da

morfologia dos vírus da Dengue. O segmento genômico de RNA é complexado com proteínas

do capsídeo (C em verde) constituindo o nucleocapsídeo, que é empacotado dentro de um

envelope lipídico que contém glicoproteínas virais, E (em amarelo) e M (em

rosa)..............................................................................................................................................

Figura 3: Representação esquemática da estrutura genômica e expressão do vírus

dengue. A. Estrutura do genoma e elementos do RNA viral. B. Processamento da poliproteína

e produtos de clivagem. O genoma de RNA senso positivo codifica para uma poliproteína que

quando clivada gera 10 proteínas: sendo 3 estruturais (C, M, e E) e 7 não estruturais (NS1,

NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, e NS5). Fonte: BURKE et al., 2001...........................................

Figura 4. Ciclo de multiplicação dos Flavivirus. Os vírus se ligam à superfície celular e entram

através de endocitose mediada por receptores. A acidificação da vesícula induz alterações

conformacionais nos vírus e a fusão de membranas, resultando no desmonte das partículas

virais. O genoma de RNA é liberado e codifica uma poliproteína que, ao ser direcionada para o

retículo endoplasmático (RE), é processada por proteases. A replicação do genoma ocorre

associada às membranas e a montagem das partículas ocorre na superfície do RE, onde as

proteínas estruturais e o RNA recém sintetizado brotam no lúmem do RE. As partículas são

transportadas através dos compartimentos do Complexo de Golgi (TGN) e clivadas por

proteases do hospedeiro. Virions maduros e partículas subvirais são então liberadas por

exocitose. (Mukhopadhyay et al, 2005)...............................................................................................

Figura 5. Mapa da distribuição mundial da dengue em 2005. Fonte: CDC, 2008a.................

Figura 6: Depois que uma pessoa é picada pelo mosquito, o vírus sofre um período de

incubação de 3 a 14 dias (em média 4 a 7 dias), depois do qual tem-se o inicio da febre

acompanhado dos sintomas. Durante este período de febre, os vírus circulam no sangue

periférico, e quando outro mosquito pica a pessoa doente no período virêmico, ele pode se

infectar e transmitir o vírus depois de um período de incubação extrínseco de 8 a 12 dias.........

Figura 7. Identificação dos produtos de RT-PCR para sorotipagem de Dengue por

eletroforese em gel de agarose a 2%. M: marcador de peso molecular de 100pb

(Invitrogen). Linha 1: ausência de Dengue em células C6/36 (controle negativo). Linha 2:

amplificação de controle positivo de RNA para DENV-3 (fragmento de 290pb). Linhas 3 à 5:

amostras positivas para DENV-3 (fragmento de 290pb). Linhas 6 e 7: amostras negativas para

DENV-3.......................................................................................................................................

Figura 8. Identificação dos produtos de RT-PCR para diagnóstico de Dengue por

eletroforese em gel de agarose a 2%. M: marcador de 100pb (Invitrogen). Linha 1: ausência

de Dengue em células C6/36 (controle negativo). Linha 2: amplificação de controle positivo de

RNA para DENV-3 (fragmento de 420pb). Linha 3: amostra obtida de suspeita de dengue

hemorrágica com óbito para Dengue. Linha 4: amostra positiva para

dengue........................................................................................................................................

Figura 9. Detecção, por microscopia de fluorescência, da presença do vírus DENV-3 em

células C6/36 infectadas. Quadro A: Imunofluorescência negativa para dengue (C6/36 não

infectada corada com azul de Evans 0,01%). Quadro B: controle positivo: C6/36 infectada

com estoque viral de D3 (H-87). Quadro C: controle negativo: C6/36 infectada com o soro de

paciente suspeito de dengue, porém sem o anticorpo primário (contra corada com azul de

Evans 0,01%). Quadro D: Imunofluorescência positiva para dengue, C6/36 infectada com o

soro de paciente de dengue hemorrágico que evoluiu para óbito (aumento de 400 X). Quadro

E: Ampliação da C6/36 infectada com o soro de paciente de dengue hemorrágico que evoluiu

para óbito, notar o citoplasma fortemente corado........................................................................

Figura 10. Placa de 96 poços mostrando a detecção de NS1 pelo kit PAN-E Dengue Early

ELISA (PanBio).............................................................................................................................

Figura 11. Placa de 96 poços mostrando a detecção de NS1 pelo kit Platelia (Biorad)..............

Figura 12. Diagrama representando a relação de positividade entre os testes de

diagnóstico para infecção pelos vírus dengue. Testes avaliados: ELISA para a detecção

da NS1, ELISA para a detecção de IgM anti-dengue e RT-PCR ou isolamento viral...................

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Casos Notificados de Dengue Clássica e Confirmados para Febre Hemorrágica

da Dengue e Óbitos, por Unidade Federada (UF) de Residência, Brasil,

2007..........................................................................................................................................

Tabela 2: Monitoramento viral por Unidade Federada, Brasil, 2007.........................................

Tabela 3: Oligonucleotídeos utilizados nas amplificações para detecção dos sorotipos

circulantes de Dengue...............................................................................................................

Tabela 4. Características epidemiológicas dos pacientes segundo a confirmação laboratorial

do diagnóstico de dengue..........................................................................................................

Tabela 5. Percentual de positividade da RT-PCR convencional segundo o dia de sintomas...

Tabela 6. Número de amostras de soro de pacientes com infecção primária e secundária de

dengue testadas positivas por cada método de diagnóstico.....................................................

Tabela 7. Número de amostras de soro de pacientes com infecção primária e secundária de

dengue testadas positivas por cada método de diagnóstico em relação à detecção de IgM

anti-dengue nas mesmas amostras...........................................................................................

Tabela 8 Número de amostras de soro de pacientes com infecção primária e secundária de

dengue testadas positivas por cada método de diagnóstico em relação à não detecção de

IgM anti-dengue nas mesmas amostras....................................................................................

Tabela 9. Número de amostras de soros positivas e negativas para dengue para cada teste

diagnóstico................................................................................................................................

Tabela 10. Sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo

negativo (VPN) e acurácia dos testes diagnósticos avaliados neste estudo.............................

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Distribuição percentual dos pacientes com confirmação laboratorial do

diagnóstico de dengue segundo a faixa etária...........................................................................

Gráfico 2. Número de amostras positivas e negativas pela RT-PCR em comparação com o

tempo, após o início dos sinais clínicos....................................................................................

Gráfico 3. Número de amostras positivas e negativas pela RT-PCR em comparação com o

tempo, após o início dos sinais clínicos.....................................................................................

Gráfico 4. Número de amostras positivas e negativas pelas metodologias de RT-PCR e

pelo isolamento viral em comparação com o tempo, após o início dos sinais clínicos..............

Gráfico 5. Sensibilidade da detecção da infecção pelo vírus dengue por dia após o início

dos sintomas clínicos em amostras IgM positivas. A porcentagem de amostras positivas por

cada método de detecção são plotados contra o número de dias após o início da febre.........

Gráfico 6. Sensibilidade da detecção da infecção pelo vírus dengue por dia após o início

dos sintomas clínicos em amostras RT-PCR positivas. A porcentagem de amostras

positivas por cada método de detecção são plotados contra o número de dias após o início

da febre......................................................................................................................................

Introdução

1. INTRODUÇÃO

A dengue é considerada a mais importante arbovirose humana da atualidade tanto

em termos de morbidade como mortalidade, afetando diretamente o campo da saúde

pública, e, além disto, as infecções causadas pelos vírus da dengue são as que assumem

maior importância em nosso país (FONSECA; FIGUEIREDO, 2005). A dengue é uma

doença febril aguda, que pode ser causada pela infecção com qualquer um dos quatro

sorotipos do vírus da dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4) e transmitida ao

homem por meio da picada da fêmea do mosquito Aedes aegypti, embora seja relatada a

transmissão por outras espécies do gênero. No Brasil, a dengue foi reintroduzida

definitivamente em 1986 e, desde então, espalhou-se por todo o território Brasileiro onde

ocorre de maneira endêmica em praticamente todos os estados. A dengue é notável por sua

ampla distribuição global em regiões tropicais e subtropicais e pelo grande número de

indivíduos afetados, cerca de 50 a 100 milhões de casos de dengue clássico e mais de

500.000 casos de dengue hemorrágica anualmente, com cerca de 2,5% de óbitos (WHO,

2005). Nos últimos vinte e cinco anos tem sido observado um aumento significativo na

atividade epidêmica, expansão da distribuição geográfica, transmissão contínua de vários

sorotipos e emergência da febre hemorrágica (FHD) em áreas onde a doença não era

prevalente.

1.1. Histórico da Dengue

Embora se suspeite que o vírus da dengue venha causando epidemias há vários

séculos, a primeira descrição detalhada da dengue foi feita por Benjamim Rush, em 1780,

durante um surto ocorrido na Filadélfia, EUA, que ficou conhecido como “escarlatina

reumática” (GUBLER, 1997). Em 1907, Ashburn e Craig caracterizaram o agente causador

da dengue como um microorganismo ultramicroscópico filtrável, e durante a Segunda

Guerra Mundial ocorreram importantes progressos no estudo da dengue (KIMURA; HOTTA,

1944; SABIN; SCHLESINGER, 1945; SABIN, 1952; FONSECA; FIGUEIREDO, 2005).

Introdução

Durante o século XVIIII a dengue era considerada uma doença esporádica, causando

epidemias a longos intervalos. Contudo após a Segunda Guerra, a co-circulação dos

múltiplos sorotipos dos vírus dengue, aliado ao subseqüente crescimento descontrolado das

cidades, fez emergir a epidemia da febre hemorrágica da dengue (FHD) como o maior

problema de saúde pública em muitos países do sudeste Asiático. O primeiro relato de

epidemia da FHD ocorreu em 1953 em Manila, nas Filipinas, onde em 1956 e 1960 foi

isolado pela primeira vez os sorotipos 3 e 4 a partir de amostras clínicas de pacientes com

quadro de FHD (HAMMON et al., 1960).

Nos anos oitenta começou uma segunda expansão de FHD pela Ásia, quando o Sri

Lanka, Índia e Ilhas Maldivas tiveram suas primeiras epidemias de FHD (GUBLER, 1997). A

atividade epidêmica causada pelos 4 sorotipos também se intensificou no Pacífico com

muitas epidemias de FHD em várias ilhas desta região (BARNES; ROSEN, 1974; CONDON

et al., 2000; NUEGOONPIPAT et al., 2004). Epidemias de FHD ainda não foram descritas

na África ou Oriente Médio, mas casos esporádicos clinicamente compatíveis com FHD

foram descritos em Moçambique, Djibouti, e Arábia Saudita (KANESA-THASAN et al., 1994;

CALISHER et al., 1981; RODIER et al., 1995).

A emergência da dengue e FHD como principal problema de saúde foi mais

dramático na América. No esforço para prevenção da febre amarela, começou-se uma forte

campanha que erradicou o A. Aegypti da maioria dos paises da América Central e do Sul

nos anos de 1940 e 1960 (PINHEIRO, 1989). Ocorreram apenas casos esporádicos de

dengue em algumas ilhas caribenhas durante este período. Porém com a interrupção do

programa e a diminuição dos esforços para controle do vetor, a partir de 1970 o mosquito

começou a reinfestar países que já haviam sido erradicados do vetor. Como resultado a

distribuição do A. aegypti em 2006 era bem maior do que antes do programa de erradicação

(Figura 1).

Introdução

Figura 1. Reinfestação do Aedes aegypti nas Américas. Distribuição do A. aegypti na Ámerica em

1930, 1970 e 2006. Fonte: (CDC), 2008a.

A expansão do A. aegypti nos anos 70 e 80 coincidiu com um aumento no número de

casos de dengue. Antes de 1977 apenas DENV-2 e DENV-3 estavam presentes na região,

porém a introdução de DENV-1 em 1977 e DENV-4 em 1981 provocou epidemias de FD em

toda a região (PAHO, 1979). Também em 1981, um novo genótipo de DENV-2 do Sudeste

asiático causou a primeira epidemia de FHD na América, em Cuba. Esse genótipo se

espalhou rapidamente por toda a região e causou surtos de FHD na Venezuela, Colômbia,

Brasil, Guiana Francesa, Suriname e Porto Rico (LEITMEYER et al., 1999; RICO-HESSE,

1990). Já o DENV-3 que esteve circulando entre os anos de 1963 e 1977 desapareceu da

região, sendo detectado somente em 1994 associado a uma epidemia de FD e FHD em

Nicarágua, e posteriormente notificado no Panamá, Costa Rica, EI Salvador, Guatemala, e

Honduras (GUZMAN et al., 1996). A introdução do DENV-3 no México em 1995 coincidiu

com o aumento de casos de DHF naquele país (FIGUEROA; RAMOS, 2000). Análises

genéticas das linhagens isoladas de DENV-3 demonstraram que o vírus provavelmente foi

introduzido na região a partir da Ásia, uma vez que era distinto dos DENV-3 isolados

anteriormente na América e similar aos que causaram epidemias de FHD no Sri Lanka e

Índia nos anos 80 (MESSER et al., 2002; 2003; GUZMAN et al., 1996).

A dengue atualmente é considerada endêmica na América, Sudeste asiático, Oeste

1930 1970 20061930 1970 2006

Introdução

do Pacífico, África, Mediterrâneo oriental, com maior carga nas três primeiras regiões. Ainda

que os quatro sorotipos de dengue sejam capazes de produzir casos de FHD, o DENV-2 e o

DENV-3 são mais frequentemente associados com a FHD (GUZMAN; KOURI, 2003;

OCAZIONEZ et al., 2006).

No Brasil, os primeiros relatos de dengue datam do século XIX. Entretanto, até a

segunda metade do século XX, sua importância foi ofuscada pela febre amarela urbana,

outra arbovirose transmitida pelo mesmo mosquito Aedes aegypti. As campanhas de

combate

febre amarela urbana, coordenadas por Emílio Ribas e Osvaldo Cruz entre 1903

e 1923, diminuíram no Brasil o mosquito transmissor. Após mais de 50 anos sem a ocorrência

de epidemias, a doença ressurgiu no Brasil em grande parte devido

desestruturação dos

programas de controle de vetores. O ressurgimento da dengue em nosso país ocorreu em

1981-1982, quando foi

registrada uma epidemia em Boa Vista (RR), com cerca de 11.000

casos, causada por DENV-1 e DENV-4 (FONSECA; FIGUEIREDO, 2005).

Na região sudeste, a primeira epidemia de grandes proporções foi ocasionada pelo

DENV-1 e ocorreu no biênio 86/87 na cidade do Rio de Janeiro, com cerca de 95.000 casos

notificados (SCHATZMAYR et al., 1986), se espalhando para as regiões Nordeste e Centro-

Oeste. Em 1990, a situação se agravou com a introdução do DENV-2, novamente pelo

estado do Rio de Janeiro, e, pela primeira vez no Brasil, registrou-se epidemia de dengue

com casos graves e óbitos. A partir desta data, com a disseminação e circulação de mais de

um sorotipo, vários outros estados passaram a ser acometidos por epidemias com casos

graves e óbitos (NOGUEIRA et aI., 1990; 1991; 1993; 1995; VASCONCELOS et aI., 1993).

Em 1998, foi documentado na cidade de Limeira - SP, um caso de dengue-3 importado da

Nicarágua (ROCCO et al., 2001). Após dois anos, o DENV-3 foi introduzido no estado do

Rio de Janeiro, isolado no município de Nova Iguaçu. Em dezembro de 2000, 91 casos

foram confirmados em três diferentes municípios do estado (FONSECA; FIGUEIREDO, 2005;

LOURENÇO-DE-OLIVEIRA et aI., 2002; NOGUEIRA et aI., 2001; MIAGOSTOVICH et aI.,

2002). Em 2002, DENV-3 produziu uma grande epidemia, inicialmente no Rio de Janeiro e

depois por todo o país (NOGUEIRA et al., 2005). A dengue disseminou-se de forma

Introdução

progressiva de modo que hoje se trata de uma doença endêmica associada a surtos e

epidemias intermitentes em quase todos os aglomerados urbanos do país. Notavelmente, o

DENV-4 foi isolado recentemente em Manaus após 25 anos sem detecção no Brasil. O vírus

foi detectado em amostras de três pacientes da região amazônica, e provavelmente, esta

ressurgência é resultado da proximidade desta região do Brasil com países endêmicos para

o DENV-4, como a Venezuela e Colômbia (FIGUEIREDO et al., 2008). Esses achados

enfatizam a necessidade de estudos epidemiológicos contínuos para a vigilância de

doenças emergentes e reemergentes.

1.2. Características do vírus da dengue

Os vírus da dengue pertencem à família Flaviviridae, gênero Flavivirus (WESTAWAY

et al., 1985), que agrupa cerca de 70 membros. Os DENV são classificados em 4 sorotipos

distintos, denominados DENV-1, DENV-2, DENV-3, e DENV-4; com base em diferentes

características antigênicas observadas entre as amostras isoladas (SABIN, 1952;

SCHERER, 1968). Estes vírus apresentam a mesma epidemiologia e causam doença com

manifestações clínicas semelhantes em humanos, sendo que a imunidade adquirida após

infecção com cada um dos sorotipos é duradoura e mediada principalmente por anticorpos

neutralizantes. Embora haja uma forte reação sorológica cruzada entre estes vírus in vitro,

os anticorpos gerados contra um sorotipo não protegem o indivíduo contra infecções

secundárias por outros sorotipos.

As partículas virais apresentam simetria icosaédrica, com aproximadamente 45-

55nm de diâmetro, constituídas por um core de ribonucleoproteínas circundado por uma

bicamada lipídica (MURPHY, 1980). O envelope viral é composto por duas proteínas,

proteína E e proteína M e o nucleocapsídeo consiste da proteína C associada ao RNA viral

(Figura 2).

Introdução

Figura 2: A. Fotomicrografia eletrônica de partículas do DENV-2 após 5 dias de infecção em cultura de

células (aumento de 345.000X). B. Representação esquemática da morfologia dos vírus da Dengue.

O segmento genômico de RNA é complexado com proteínas do capsídeo (C em verde) constituindo o

nucleocapsídeo, que é empacotado dentro de um envelope lipídico que contém glicoproteínas virais, E

(em amarelo) e M (em rosa).

O genoma viral consiste de um RNA de fita simples, polaridade positiva, com

aproximadamente 11 kilobases (Kb) e peso molecular aproximado de 3.3x10

daltons. O

RNA viral apresenta uma estrutura cap m

GpppA na extremidade 5` para início da tradução

e não apresenta cauda de poli(A) na extremidade 3´ (WENGLER; WENGLER, 1981;

BRINTON et al., 1986; BRINTON; DISPOSITO, 1988). O vírus apresenta apenas uma longa

região de leitura aberta (ORF), desta forma, a tradução do genoma resulta na síntese de

uma única poliproteína precursora que é processada cotraducionalmente por proteases

virais e celulares. A região próxima a extremidade 5´ do genoma codifica 3 proteínas

estruturais [capsídeo (C), membrana (M, que é expressa como um precursor glicosilado

prM) e envelope (E)]. Sete proteínas não-estruturais que são essenciais para a replicação

do vírus são codificadas pelo restante do genoma – NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e

NS5 (CHAMBERS et al., 1990). Nas extremidades 5' e 3' existem regiões não codificadoras

com aproximadamente 100 e 450 nucleotídios, respectivamente (Figura 3). Estas regiões

possuem seqüências conservadas e estruturas secundárias de RNA que direcionam os

processos de amplificação genômica, tradução e empacotamento viral (BURKE et al., 2001).

Introdução

Figura 3: Representação esquemática da estrutura genômica e expressão do vírus dengue. A.

Estrutura do genoma e elementos do RNA viral. B. Processamento da poliproteína e produtos de

clivagem. O genoma de RNA senso positivo codifica para uma poliproteína que quando clivada gera 10

proteínas: sendo 3 estruturais (C, M, e E) e 7 não estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, e

NS5). Fonte: BURKE et al., 2001.

Dentre as proteínas estruturais, a glicoproteína E do envelope desempenha um

papel dominante na geração de anticorpos neutralizantes e indução da resposta imune

(REY, 2003), além de apresentar o sitio de ligação ao receptor celular e ser responsável

pela fusão do vírus à célula hospedeira. A proteína prM é parte dos virions imaturos e sua

clivagem proteolítica, por uma protease celular na rede trans golgi, é crucial na morfogênese

do vírus, coincidindo com a liberação de virions maduros (BURKE et al., 2001). A proteína C

apresenta muitos resíduos básicos concentrados nas extremidades N e C-terminal que,

provavelmente, atuam de forma cooperativa quanto à ligação específica ao RNA genômico,

favorecendo a formação do nucleocapsídeo. A região central da proteína C possui um

domínio hidrofóbico que atua na membrana celular e, também, poderia ter participação na

montagem do virion (BURKE et al., 2001).

Dentre as sete proteínas não-estruturais, apenas algumas tiveram seus papéis

totalmente esclarecidos. A glicoproteína NS1, com cerca de 430 aminoácidos, é detectada na

superfície celular, e também secretada para o espaço extracelular (FLAMAND et al., 1999),

Introdução

parece participar da fase precoce de replicação viral, além de estar relacionada

virulência

(HENCHAL; PUTNAK, 1990), sendo capaz de induzir a formação de anticorpos fixadores de

complemento. A função específica dela na replicação viral ainda não foi elucidada, ainda

que esteja envolvida na morfogênese viral. Algumas mutações nesta proteína afetam a

virulência da partícula viral. Além de ser possível relacionar níveis elevados de NS1

circulante, encontrados durante o início da infecção, com o desenvolvimento da FHD

(LIBRATY et al., 2002). A proteína NS2 é dividida nas porções NS2a e NS2b, sendo esta

última, portadora de atividade proteolítica. A proteína NS3 é altamente conservada entre os

flavivírus. A comparação de seqüências nucleotídicas e análises bioquímicas sugerem que

ela é trifuncional, com atividade de protease, helicase, nucleosídeo trifosfatase (NTPase) e

RNA trifosfatase, fazendo parte, portanto, da maquinaria de replicação do RNA viral

(BARTELMA;

PADMANABHAN, 2002). A proteína NS4 é clivada nas porções NS4a e NS4b e

ambas, juntamente com NS2a e NS2b, associam-se à membrana da célula infectada durante o

processo de maturação viral (CHAMBERS et al., 1990). A proteína NS5 é uma das mais

conservadas entre os flavivírus e parece ter atividade RNA polimerase dependente de RNA

devido à presença de uma região altamente conservada que é característica deste tipo de

enzima nos vírus de RNA fita positiva. Além de apresentar homologia também com

metiltransferases envolvidas na formação do cap 5’ em RNAs, o que indica que esta

proteína poderia participar da metilação do cap na extremidade 5’do RNA viral (BROOKS et

al., 2002; JOHANSSON et al., 2001).

Embora os mecanismos iniciais de infecção das células hospedeiras pelo vírus não

sejam totalmente conhecidos, evidências sugerem que a infecção ocorra pelo mecanismo de

endocitose, mediado por proteínas do envelope viral e receptores presentes na membrana

plasmática. Após a penetração na célula, o ambiente ácido dos endossomos induz uma

trimerização irreversível da proteína E que promove a fusão das membranas viral e celular.

Após esta fusão, o nucleocapsídeo é liberado no citoplasma, a proteína do capsídeo e o RNA

se separam e a transcrição e replicação do genoma se iniciam. A replicação do genoma ocorre

junto às membranas intracelulares. Nesta etapa, a proteína C, recém sintetizada, se junta às

Introdução

cópias do RNA genômico na face citosólica da membrana do retículo endoplasmático e brota

através dela, adquirindo uma bicamada lipídica. Esta membrana, também contém a

glicoproteína E e a proteína precursora prM. A partícula viral imatura segue através de vias

secretoras, onde uma protease semelhante à furina cliva a proteína prM já nos compartimentos

trans do complexo de Golgi, gerando a proteína M. Esta clivagem gera partículas maduras e

infecciosas, que são então liberadas da célula por exocitose (KUHN et al., 2002;

MUKHOPADHYAY et al., 2005; MODIS et al., 2003; CLYDE, et al., 2006) (Figura 4).

Figura 4. Ciclo de multiplicação dos Flavivirus. Os vírus se ligam à superfície celular e entram através

de endocitose mediada por receptores. A acidificação da vesícula induz alterações conformacionais nos

vírus e a fusão de membranas, resultando no desmonte das partículas virais. O genoma de RNA é

liberado e codifica uma poliproteína que, ao ser direcionada para o retículo endoplasmático (RE), é

processada por proteases. A replicação do genoma ocorre associada às membranas e a montagem das

partículas ocorre na superfície do RE, onde as proteínas estruturais e o RNA recém sintetizado brotam

no lúmem do RE. As partículas são transportadas através dos compartimentos do Complexo de Golgi

(TGN) e clivadas por proteases do hospedeiro. Virions maduros e partículas subvirais são então

liberadas por exocitose. (Mukhopadhyay et al., 2005).

Introdução

Ainda não está totalmente esclarecida qual é a principal célula infectada pelos vírus

dengue. Alguns estudos propõem que a replicação primária do vírus ocorra em células que

apresentam receptor Fc, da linhagem monocítica/macrofágica (SYDOW et al., 2000; WU et

al., 2000). Os receptores de membrana, aos quais se ligam o vírus dengue na fase inicial da

infecção, também são desconhecidos, apesar de haver evidências de que o heparan sulfato

é participante ativo nesta fase da infecção. Alguns trabalhos apontam que o primeiro alvo do

vírus da dengue seriam células dendríticas presentes na pele. Ao ser introduzido na pele do

hospedeiro pela picada do mosquito, o vírus infecta tanto células de Langherhans, como

células dermais e interticiais. Estas células são mais permissivas a infecção que monócitos e

macrófagos (WU et al, 2000; PALUCKA, 2000). Recentemente, estudos envolvendo a

fenotipagem de células sanguíneas periféricas em pacientes infectados com o vírus da dengue,

têm demonstrado que os monócitos seriam as principais células infectadas no sangue

periférico (DURBIN et al., 2008; KOU et al., 2008).

Além das células dendríticas, estudos in vitro sugerem que o vírus da dengue infecte

ainda uma grande variedade de células humanas, tais como: hepatócitos, linfócitos B e T,

células endoteliais e fibroblastos. Condizente com estas observações, espécimes obtidos de

pacientes com FHD/SCD, e analisados por imunohistoquímica e imunofluorescência, revelam a

presença de antígenos virais em muitos tecidos, incluindo fígado, baço, linfonodos, timo, rins,

pulmões, pele e, principalmente, células fagocíticas mononucleares (JESSIE et al., 2004). No

entanto, a presença de antígenos num determinado tipo celular não implica que ela seja

permissiva a infecção viral, já que estes antígenos podem ter sido fagocitados. Estas questões

foram recentemente elucidadas através da técnica de hibridação in situ, que permite a precisa

localização do RNA viral em tecidos infectados. Os resultados confirmam que nem todas as

células portadoras de antígenos virais apresentam o RNA viral (JESSIE et al., 2004).

1.3. Aspectos epidemiológicos

Nos últimos 25 anos, as infecções pelo vírus da dengue têm alcançado proporções

globais, com um grande aumento na freqüência e intensidade de epidemias associadas a

Introdução

síndromes clínicas mais graves (GUBLER, 1998, 2002; GUBLER; CLARK, 1995). Estima-se

a ocorrência de 100 milhões de casos de dengue ao ano em todo o planeta, e que cerca de

3 bilhões de pessoas encontram-se em risco eminente de serem infectadas (GUZMAN;

KOURI, 2002) (Figura 5). Dentro desta estimativa, cerca de 500.000 casos evoluem para

FHD, em sua maioria em crianças. Dentre estes casos, 20.000 resultam em óbitos, podendo

este número ser até duas vezes maior dependendo da região. Sem o tratamento adequado,

que consiste basicamente na reposição de fluidos e repouso, e sem diagnóstico precoce e

internação dos pacientes, o óbito em casos de dengue hemorrágica pode exceder até 20%.

Entretanto, quando os pacientes são devidamente tratados e diagnosticados este percentual

pode ser reduzido a percentuais inferiores a 1 % (GIBBONS; VAUGHN, 2002; MACKENZIE

et al.,

2004; CDC, 2008b).

Figura 5. Mapa da distribuição mundial da dengue em 2005. Fonte: CDC, 2008a.

A doença é transmitida por mosquitos do gênero Aedes. Nas Américas o Aedes

aegypti é o único transmissor do vírus dengue com importância epidemiológica. Trata-se de

uma espécie originária da África subsaariana de onde se dispersou para o resto do mundo a

partir do século XVII. Durante a sua evolução, houve um processo de adaptação ao

ambiente domiciliar e peridomiciliar, passando a reproduzir-se em depósitos artificiais de

água limpa e parada. Outra espécie, Aedes albopictus, originária das selvas asiáticas,

recentemente foi introduzida nas Américas, incluindo o Brasil. Entretanto, por razões

Introdução

desconhecidas, sua importância epidemiológica como transmissor da dengue tem se

restringido apenas ao continente asiático (RODHAIN; ROSEN, 1997). A transmissão da

doença, de forma simplificada, envolve a ingestão de sangue virêmico por fêmeas do

mosquito Aedes aegypti após picarem indivíduos contaminados, seguida da passagem do

vírus para um segundo hospedeiro humano susceptível. É necessário, no entanto, um

período de incubação no vetor de 8-10 dias (período de incubação extrínseco) para que

ocorra a replicação e disseminação viral antes que o vírus possa ser encontrado na saliva

dos mosquitos podendo então ser transmitido a um novo hospedeiro humano (MONATH,

1994) (Figura 6). A presença do mosquito Aedes aegypti em quase todos os países tropicais

e subtropicais, torna um terço da população mundial em risco de adquirir a infecção

(STEPHENSON, 2005).

Figura 6: Depois que uma pessoa é picada pelo mosquito, o vírus sofre um período de incubação de

3 a 14 dias (em média 4 a 7 dias), depois do qual tem-se o inicio da febre acompanhado dos

sintomas. Durante este período de febre, os vírus circulam no sangue periférico, e quando outro

mosquito pica a pessoa doente no período virêmico, ele pode se infectar e transmitir o vírus depois de

um período de incubação extrínseco de 8 a 12 dias.

Ainda hoje, primatas africanos e asiáticos são reservatórios naturais dos vírus dengue.

No entanto, com a ampla distribuição geográfica de mosquitos do gênero Aedes,

especialmente em áreas urbanas, os vírus dengue são hoje completamente adaptados a

humanos e perderam a necessidade de um ciclo zoonótico, para se manter. Esta manutenção

do vírus, especialmente durante os ciclos interepidêmicos, é atribuída ao seu principal vetor

urbano, que está totalmente adaptado a humanos (MACKENZIE et al., 2004).

Viremia

DIAS

0 5 12 16 20 24 28

Doença

Viremia

incubação

0 5 8 12 16 20 24 28

Ser humano # 1 Ser humano # 2

Mosquito pica/

adquire o vírus

Mosquito pica

transmite o vírus

Período

extrínseco

incubação

Período

intrínseco

Viremia

DIAS

0 5 12 16 20 24 28

Doença

Viremia

incubação

0 5 8 12 16 20 24 28

Ser humano # 1 Ser humano # 2

Mosquito pica/

adquire o vírus

Mosquito pica

transmite o vírus

Período

extrínseco

incubação

Período

intrínseco

Introdução

As razões para a ressurgência de epidemias de dengue clássica e dengue

hemorrágica estão relacionadas à elevada infestação domiciliar pelo Aedes aegypti, à

reprodução exacerbada do mosquito em climas quentes e úmidos, à presença de diferentes

sorotipos de dengue e infecções secundárias, ao modelo de estocagem de água nas casas,

ao aumento da densidade populacional e ao grande movimento de pessoas em direção às

áreas urbanas (TEIXEIRA et al., 2005; CHATURVEDI et al., 2005). Estes fatores estão

relacionados ao grande crescimento populacional e a urbanização não planejada resultando

desta forma em baixa qualidade das moradias e saneamento básico ineficiente. Outros

fatores também podem ter contribuído como as viagens de avião, a migração, a

deterioração dos programas de saúde nos países em desenvolvimento e a falta de controle

dos mosquitos transmissores (GUZMAN; KOURI, 2002). Além disso, a microevolução do

vírus dengue pode ter contribuído para a expansão de cepas mais virulentas pelo mundo.

De fato, há evidências de que genótipos mais virulentos do vírus estão substituindo os

genótipos menos virulentos, o que pode explicar a emergência global das infecções de

dengue (MALAVIGE et al., 2004).

No Brasil, os números também são preocupantes. Segundo dados recentes da

Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS) do Ministério da Saúde, foram registrados no ano

de 2006, 345.922 casos de dengue, dos quais 76% ocorreram entre os meses de janeiro a

maio, e no ano de 2007 foram notificados 559.954 casos de dengue, dos quais 79%

ocorreram nos cinco primeiros meses do ano, confirmando a manutenção de um padrão de

sazonalidade da dengue no Brasil, que acompanha a estação chuvosa (verão). Em 2006,

foram confirmados 628 casos de febre hemorrágica e a ocorrência de 67 óbitos. No ano de

2007 foram registrados 1.541 casos de febre hemorrágica e a ocorrência de 158 óbitos

(Tabela 1), com uma taxa de letalidade para FHD de 10,2% (Informe Epidemiológico da

Dengue, Janeiro a Dezembro de 2007). Em 2008 está ocorrendo uma explosão de casos de

dengue no estado do Rio de Janeiro, com um espantoso aumento no número de casos de

FHD. No período de janeiro a abril de 2008, a SVS já registrou 230.829 casos, com a

ocorrência de 130 óbitos (Informe Epidemiológico da Dengue, Janeiro a Abril de 2008).

Introdução

O aumento no número absoluto de casos em 2007 foi diretamente influenciado pelo

incremento da transmissão nos Estados de Mato Grosso do Sul, Paraná, São Paulo, Rio de

Janeiro e Pernambuco. Em função da circulação de três sorotipos do vírus da dengue, o

número de casos de FHD e a taxa de letalidade vêm aumentando no país. Em 2002, com a

introdução do DEN-3, foi registrado o maior pico epidêmico da doença no Brasil e a taxa de

letalidade foi duas vezes maior, revelando uma maior gravidade na ocorrência da doença.

Em 2007, 86% dos casos de FHD estavam concentrados nos Estados do Ceará, Rio de

Janeiro, Maranhão, Pernambuco, Amazonas, Mato Grosso do Sul, Piauí, Goiás, Alagoas,

Paraíba e Rio Grande do Norte. Em relação aos óbitos por FHD, 64% aconteceram nesses

estados (Tabela 1).

Tabela 1: Casos Notificados de Dengue Clássica e Confirmados para Febre Hemorrágica da Dengue

e Óbitos, por Unidade Federada (UF) de Residência, Brasil, 2007

(1)

Introdução

O monitoramento da circulação viral demonstra que o sorotipo DENV-3 continua

predominando no país, representando 77% das amostras isoladas em 2007 e 66% em 2008.

Entretanto, observa-se também, um percentual crescente de isolamentos do sorotipo DENV-

2, 20% em 2007 e 31% agora em 2008, sendo este sorotipo predominante nos Estados de

Alagoas, Amapá, Ceará, Maranhão, Piauí e Roraima em 2007 (Tabela 2), e em 2008

predominante nos Estados do Ceará (89%) e Rio de Janeiro (69%).

Tabela 2: Monitoramento viral por Unidade Federada, Brasil, 2007

(1)

Ribeirão Preto-SP documentou sua primeira epidemia de dengue entre novembro de

1990 e março de 1991, com o isolamento do DENV-1 e a confirmação de 2.305 casos

(Prefeitura Municipal de Ribeirão Preto; RODRIGUES et al., 2002). Entre 1992 a 2000 a

incidência da doença manteve-se baixa, com confirmação de casos durante todos os anos,

Introdução

variando de 4 a 317. Em 2001 a incidência da doença voltou a subir, quando o município

confirmou 3.190 casos da doença, com isolamento dos sorotipos 1 e 2. Neste mesmo ano

foi notificado na cidade o primeiro caso de FHD, importado do município de Igarapava-SP.

No ano de 2002 foi isolado o sorotipo 3 pela primeira vez, de um caso importado. Em 2003,

o DENV-3 foi novamente isolado e neste mesmo ano 8 casos foram classificados como FHD

(Prefeitura Municipal de Ribeirão Preto). Em 2004 e 2005 o número de casos permaneceu

baixo, até que em 2006 a cidade de Ribeirão Preto vivenciou sua maior epidemia de dengue

até o momento, com notificação de 6.438 casos (Centro de Vigilância Epidemiológica do

Estado de São Paulo). Em 2007 houve uma redução no número de casos, quando foram

notificados 2.690 casos e em 2008 houve outra redução, tendo sido notificados 701 casos

até o início do mês de maio (Dados da Vigilância Epidemiológica de Ribeirão Preto).

Apesar do grande impacto da dengue, não somente na área da saúde como também

na área econômica, ainda não existe um tratamento específico para estas infecções virais.

Os cuidados com os pacientes baseiam-se no tratamento de suporte aos sintomas

observados, como descanso, antipiréticos e analgésicos. Aspirina e outros salicilatos devem

ser evitados devido à diminuição da contagem de plaquetas e possivelmente sua função. Na

forma hemorrágica é importante a reposição de fluídos e eletrólitos, monitorada com testes

simples de laboratório como o hematócrito. Se o tratamento for adequado, o índice de

fatalidade nos casos de febre hemorrágica cai para menos de 1% (WHO, 2005). Por isso é

de extrema importância a detecção precoce da infecção, de modo a facilitar o seguimento

do paciente, diferenciando mais rapidamente a dengue clássica da hemorrágica.

1.4. Manifestações clínicas e achados laboratoriais

A infecção com os vírus dengue causa um amplo espectro de manifestações clínicas

que variam desde uma doença assintomática a quadros hemorrágicos e de choque

hipovolêmico. Após um período de incubação de 4 a 8 dias iniciam-se os sintomas, sendo a

sintomatologia mais característica febre, dor de cabeça e “rash” cutâneo (WHO, 1997).

A forma clássica da dengue ou febre da dengue (FD), forma mais comumente

Introdução

encontrada da doença, apresenta-se como uma enfermidade aguda febril que perdura por

aproximadamente 4 a 5 dias. A doença começa abruptamente, com febre elevada associada

a sintomas inespecíficos, como dor retro-orbitária, cefaléia de grau variável, erupção

maculopapular, mialgia, artralgia, dor abdominal, náuseas, vômitos, anorexia e fraqueza

(AHMED, 2001; NARAYANAN, 2002). A febre pode ser bifásica, com duração de 2 a 7 dias,

variando de 38,8° C a 40,5° C. A presença de manifestações hemorrágicas, tais como,

epistaxe, petéquias e gengivorragia podem ser observadas, mas em geral são leves e sem

repercussões hemodinâmicas (FONSECA; FIGUEIREDO, 2005).

Nos pacientes com dengue clássica, a neutropenia com linfocitose relativa é um

achado bastante comum. A presença de trombocitopenia é freqüente (GUBLER, 1998). A

elevação de enzimas hepáticas ocorre em grande parte dos casos e geralmente

moderada, mas em alguns pacientes o acometimento do fígado pode ser grave, levando a

uma hepatite severa e conseqüente morte (SENEVIRATNE et al., 2006; SOUZA et al.,

2004). A fase aguda da doença dura de 3 - 7 dias, mas a fase de convalescença pode ser

prolongada por semanas, podendo estar associada com prostração e depressão,

especialmente em adultos (RIGAU-PÉREZ et aI., 1998; GUBLER, 1998). Apesar de

haverem poucas complicações, a febre da dengue é responsável por grandes perdas

econômicas por acometer uma grande parcela da população economicamente ativa

(HENCHAL; PUTNAK, 1990).

A forma grave da doença (FHD/SCD) e a dengue clássica são diferentes espectros

de apresentação da doença, mas clinicamente indistinguíveis nos primeiros 3 a 7 dias de

evolução. Ambas apresentam-se como uma doença febril aguda, acompanhada de uma

grande variedade de sintomas inespecíficos já descritos anteriormente. Após este período

inicial, os pacientes podem entrar em uma fase de recuperação ou desenvolver

características específicas da FHD. O grande diferencial não é a presença de fenômeno

hemorrágico (como o próprio nome da doença sugere e que pode ocorrer nas formas

clássica e hemorrágica), mas sim o aumento da permeabilidade vascular e o conseqüente

extravasamento de líquidos para o interstício. Quando o diagnóstico não é feito rapidamente

Introdução

e, portanto a intervenção clínica não é adequada, alguns pacientes com FHD podem sofrer

um colapso circulatório, caracterizando a síndrome do choque do dengue (SCD)

(BADYOPADHYAY et al., 2006).

Geralmente os sinais e sintomas típicos da FHD iniciam-se durante o período de

defervescência, podendo ocorrer 24 horas antes ou após a diminuição da febre. O

desconforto epigástrico, a dor abdominal, as náuseas e vômitos são comuns. As

manifestações hemorrágicas não são obrigatórias. As mais comuns são as petéquias,

localizadas predominantemente nas extremidades, mas encontradas também no tronco e

outras partes do corpo. Púrpuras podem surgir em várias regiões, mas são mais freqüentes

em locais de punção venosa. Geralmente os sangramentos gastrintestinais ocorrem nos

pacientes mais graves, às vezes antecedendo o choque circulatório (GUBLER, 1998). A

taquicardia e a hipotensão são marcadores importantes do início do extravasamento capilar.

Em casos mais graves, os pacientes podem apresentar pele fria, pegajosa e o pulso torna-

se fraco e rápido. Alguns indivíduos podem apresentar um quadro de letargia seguido de

agitação, rapidamente evoluindo para o choque. Frequentemente os pacientes apresentam

uma dor abdominal aguda, logo antes do desenvolvimento da falência circulatória, sendo

este sintoma um sinal de alerta para os médicos (MALAVIGE et al., 2004; GUBLER, 1998).

Nos quadros menos graves, a recuperação pode ocorrer espontaneamente ou após

a administração oral ou endovenosa de líquidos. Já nos pacientes com choque estabelecido

o manejo deve ser precoce e a reposição volêmica abundante. A duração do choque é

geralmente curta, mas nos indivíduos não tratados de maneira adequada o óbito pode

ocorrer dentro de 8 a 24 horas. Uma vez restabelecido o controle hemodinâmico, a

recuperação ocorre em 2 a 3 dias (GUBLER, 1998).

As alterações laboratoriais típicas da FHD e da SCD incluem a trombocitopenia e a

hemoconcentração. Esta última pode ser mascarada nos casos em que a reposição

volêmica é feita de forma rápida e abundante, ou quando há fenômeno hemorrágico

importante. Assim como na forma clássica da doença, a leucopenia e a elevação das

transaminases são freqüentes. O extravasamento capilar pode ser evidenciado não somente

Introdução

pela hemoconcentração, mas também por ascite, derrame pleural e hipoproteinemia

(KALAYANAROOJ et al., 1997). O sistema de coagulação e fribrinólise podem ser ativados

durante a infecção, sendo demonstrado pelo aumento dos produtos da degradação da

fibrina e o prolongamento dos tempos de tromboplastina parcial e protrombina,

principalmente nos casos mais graves (MAIRUHU et al., 2003). Nos indivíduos em choque

prolongado é comum o desenvolvimento de uremia, hiponatremia, e acidose metabólica

(MALAVIGE et al., 2004).

Estudos realizados na Tailândia, entre as décadas de 50 e 60, estabeleceram os

padrões da doença e serviram de referência para que a Organização Mundial da Saúde

definisse critérios para diagnosticar e tratar a FHD. Em 1974, em um encontro do Comitê

Técnico da OMS realizado em Manila (Filipinas), foi formulada a primeira classificação da

doença. Desde então, pequenas modificações foram realizadas, mas os critérios de

definição e classificação dos casos permanecem os mesmos (BADYOPADHYAY et al.,

2006). A FHD pode ser classificada de acordo com a gravidade dos sintomas apresentados,

variando de moderada (graus I e II) a severa (graus

III

e IV). O grau I é caracterizado apenas

pela presença de prova do laço positiva como manifestação hemorrágica; no grau II há

sangramento espontâneo. No grau III o paciente já apresenta sinais de colapso circulatório e

no IV há o estabelecimento de choque profundo, com pressão e pulso indetectáveis

(GUZMAN; KOURI, 2002; WHO, 1997).

Algumas manifestações menos comuns da dengue foram relatadas. Alterações

neurológicas têm sido descritas com uma maior freqüência nos últimos anos, incluindo

polineuropatias, mononeuropatias e síndrome de Guillain Barret (SOLOMON et al., 2000;

FERREIRA et al., 2005). A encefalopatia ocorre em 0,5% nos pacientes com FHD e vários

fatores podem contribuir para seu desenvolvimento, entre eles a disfunção hepática, a baixa

perfusão, o edema cerebral e a encefalite por dengue (MALAVIGE et al., 2004). Em áreas

endêmicas, o diagnóstico de dengue deve ser incluído entre as possibilidades durante a

investigação de encefalites (SOLOMON et al., 2000). A miocardite aguda reversível também

tem sido identificada em indivíduos infectados. É possível evidenciar alterações

Introdução

eletrocardiográficas e da contratilidade miocárdica global, porém sem necrose do tecido

miocárdico (MALAVIGE et al., 2004).

Para fins de vigilância epidemiológica e notificação, no Brasil define-se um caso

suspeito de dengue clássica como todo aquele que ocorre em paciente proveniente de área

endêmica ou infestada por mosquito transmissor, com doença febril aguda de no máximo 7

dias de evolução, acompanhada de pelo menos dois dos seguintes sintomas: cefaléia, dor

retro-orbitrária, mialgia, artralgia, prostração e exantema. Já a definição de caso suspeito de

febre hemorrágica do dengue (FHD) inclui a ocorrência de trombocitopenia e manifestações

hemorrágicas, variando desde prova do laço positiva até fenômenos mais graves como

hematêmese, melena e outros. A ocorrência de pacientes com manifestações hemorrágicas

ou não, acrescidas de sinais e sintomas de choque circulatório (diminuição ou ausência de

pressão arterial, pulso arterial fino e rápido ou ausente, pele fria e úmida, agitação), leva à

suspeita de síndrome de choque do dengue (SCD) (Ministério da Saúde, 2007).

1.5. Diagnóstico da infecção por dengue

Como os sintomas da dengue são muito semelhantes àqueles presentes em outros

quadros febris agudos, a existência de testes laboratoriais específicos é essencial para a

confirmação de casos suspeitos. Atualmente estão disponíveis diferentes métodos, incluindo

técnicas de isolamento viral, de detecção de antígenos ou RNA viral em soro, plasma ou

tecidos, e, detecção de anticorpos séricos específicos.

1.5.1. Diagnóstico sorológico

Durante anos a técnica mais utilizada no diagnóstico da dengue foi a inibição da

hemaglutinação (IH). O exame apresenta boa sensibilidade e a grande vantagem de ser

capaz de detectar anticorpos por anos após a infecção, o que o tornou bastante útil em

estudos soroepidemiológicos. Em infecções primárias os anticorpos de fase aguda são

detectados entre o quarto e sexto dia de doença, e habitualmente seus títulos estão abaixo

Introdução

de 1: 10. Os títulos de anticorpos em amostras na fase de convalescença geralmente estão

abaixo de 1:640 nas infecções primárias. Nos pacientes com infecções secundárias os

títulos destes anticorpos específicos são detectados precocemente e aumentam

rapidamente durante os primeiros dias de infecção. Títulos iguais ou maiores que 1: 1280

obtidos de amostras coletadas durante a fase aguda da doença ou durante os primeiros dias

de convalescença são indicativos de infecção secundária. A grande limitação da

IH é a

obtenção de amostras de soro pareadas, além

baixa especificidade, principalmente em

áreas onde há circulação de outros flavivírus, e o fato do exame não permitir a identificação

do sorotipo responsável pela infecção em curso (DE PAULA et al., 2004).

Os métodos imunoenzimáticos (ELISA) são os mais utilizados para o diagnóstico das

infecções por dengue. Possuem uma alta sensibilidade e podem detectar tanto anticorpos

do tipo IgM ou IgG e também antígenos. A detecção de anticorpos do tipo IgM por ELISA

tomou-se a principal ferramenta diagnóstica de infecções por dengue. A produção dos

anticorpos do tipo IgM varia entre os pacientes, mas na maioria dos casos é detectada a

partir de cinco dias após o início dos sintomas (GUBLER, 1998; DE PAULA et al., 2004).

Atualmente, diferentes tipos de ELISA estão disponíveis, entre eles o ElA-ICC

(FIGUEIREDO et al., 1989), ELISA de captura (MAC-ELISA), ultramicroELISA de captura,

dot-ELISA e IgM AuBioDOT de captura (GUBLER, 1998; DE PAULA et al., 2004). Soro,

sangue em filtro de papel e até mesmo saliva tem sido úteis na identificação de anticorpos

do tipo IgM se as amostras forem coletadas no período adequado (pelo menos 5 dias após o

início dos sintomas). Os ensaios imunoenzimáticos têm a vantagem de possibilitar o

diagnóstico sem a necessidade de coleta de amostras pareadas. A técnica mais aplicada é

o MAC-ELISA. A presença de anticorpos do tipo IgM específicos contra a dengue sugere

infecção recente, mas não é capaz de determinar o sorotipo devido à grande reatividade

cruzada dos anticorpos, observada mesmo em infecções primárias (GUBLER, 1998;

GUZMAN; KOURI, 2004). Devido à associação entre a infecção seqüencial com diferentes

sorotipos e FHD/SCD, é importante distinguir uma infecção primária de uma infecção

secundária, e isto é possível por meio da detecção ou não de IgG. A vantagem do

Introdução

diagnóstico de dengue pela detecção de IgM ser realizado com somente uma amostra é

contraposta à dificuldade de se obter a amostra de soro do paciente na fase de

convalescença, pois nem sempre eles retornam ao posto de saúde para fazer o exame,

além da demora para liberação do resultado, ultrapassando uma semana após o início dos

sintomas.

Existem ainda outros métodos sorológicos disponíveis, como a fixação do

complemento (FC) e o teste de neutralização (TN), mas devido a maior complexidade e

difícil realização tornaram-se pouco utilizados rotineiramente (GUBLER, 1998; DE PAULA et

al., 2004), embora o TN seja o teste sorológico mais específico para o vírus dengue,

podendo identificar o sorotipo infectante.

1.5.2. Isolamento viral

O isolamento viral realizado a partir de amostra clínica (soro, plasma, etc.) é o

método confirmatório definitivo e considerado como padrão para o diagnóstico da dengue.

Quatro sistemas de isolamento foram desenvolvidos: inoculação intracerebral em

camundongos neonatos, uso de cultura de células de mamíferos, inoculação intratoráxica

em mosquitos adultos, e uso de cultura de células de mosquito (GUBLER, 1998). A

inoculação intracerebral em camundongos é o método menos sensível para o isolamento

viral e a inoculação intratoráxica em mosquitos o mais sensível. Entretanto, linhagens

celulares contínuas de Toxorhynchites amboinensis (TRA-284), Aedes albopictus (C6/36), e

Aedes pseudoscutellaris (AP-61) são mais freqüentemente utilizadas para isolamento do

vírus (KUNO et al., 1985). A confirmação do isolamento viral é feita através de

imunofluorescência indireta com anticorpos policlonais ou monoclonais tipo-específicos

(FONSECA; FIGUEIREDO, 2005). A grande limitação é que as técnicas de isolamento viral

são relativamente laboriosas e demoradas, levando de 7 a 14 dias para a liberação de um

resultado final e exigem laboratórios bem equipados, tomando seu uso mais restrito

(GUBLER, 1998; GUZMAN; KOURI, 2004). Além disso, um diagnóstico retrospectivo de

infecção por dengue, dado fundamental para fins de inquérito epidemiológico, não pode ser

Introdução

feito já que o sucesso no isolamento viral requer que a amostra clínica tenha sido coletada

durante o período de viremia, ou seja, nos primeiros cinco dias de sintomatologia.

1.5.3. Detecção molecular

Nos últimos anos, técnicas de biologia molecular vêm sendo amplamente utilizadas

para fins de pesquisa e diagnóstico. A reação em cadeia da polimerase precedida por

transcrição reversa (RT-PCR) vem tendo aplicação cada vez mais freqüente devido a sua

elevada sensibilidade e especificidade, além de rapidez e relativa simplicidade. Esta técnica

possibilita também a determinação do sorotipo infectante, tomando-se uma ferramenta muito

útil em investigações epidemiológicas e no planejamento de estratégias de controle da

doença (DE PAULA et al., 2002; DE PAULA et al., 2004; LANCIOTTI et al., 1992).

Diferentes tipos de espécimes clínicos podem ser analisados e, além disso, quantidade

mínima de material é suficiente para o processamento. A RT-PCR tem sido ainda,

ferramenta básica para estudos mais específicos e detalhados do genoma de vírus dengue,

como estudos de seqüenciamento, filogenia e epidemiologia molecular (FULOP et al., 1993;

DEUBEL, 1997; BATISTA et al., 2001). A hibridação de ácidos nucléicos é uma técnica

sensível que pode ser aplicada em análises diretas ou retrospectivas utilizando amostras

fixadas (MONATH et al., 1989, GUZMAN; KOURI, 1996). Recentemente foram descritas

também RT-PCR em tempo real para diagnóstico do dengue (SHU et al., 2003; GOMES-

RUIZ et al., 2006; CHIEN et al., 2006). Esta técnica é mais rápida que a RT-PCR

convencional, além de se utilizar de sondas fluorogênicas que aumentam a especificidade

de reação e permitem avaliar a carga viral. Apesar da atual maior disponibilidade de kits

comerciais, a RT-PCR, especialmente a RT-PCR em tempo real, ainda é pouco utilizada

para investigação de casos suspeitos fora dos centros de pesquisa e universidades devido

ao alto custo para o uso rotineiro nos serviços de saúde, especialmente em países como o

Brasil (GOMES-RUIZ et al., 2006).

A detecção do ácido nucléico tipicamente fornece um diagnóstico mais sensível e

rápido que o método tradicional de isolamento do vírus. Quando a PCR é realizada em fases

Introdução

da doença onde já existem grandes quantidades de anticorpos neutralizantes em circulação,

a sensibilidade do teste diminui, mas ainda pode-se encontrar material genético do vírus,

mesmo após o término do período de viremia (FIGUEIREDO et al., 1997; DE PAULA et al.,

2002).

1.5.4. Detecção da NS1

Apesar de vários kits comerciais de MAC-ELISA estarem disponíveis no mercado,

estes não podem ser utilizados para diagnóstico inicial, porque a IgM não se torna

detectável até 5 a 10 dias depois do aparecimento da febre em casos de infecção primária,

e até 4 a 5 dias depois do aparecimento da doença em infecções secundárias (WHO, 1997).

O diagnóstico molecular, como a RT-PCR, é mais precoce que a sorologia, porém é um

método caro que requer técnicos experientes e equipamentos de laboratório especializados.

Como alternativa, a detecção de antígenos virais tem sido proposta, e mais recentemente

tem ganhado atenção a detecção da proteína NS1 (ALCON et al., 2002; KORAKA et al.,

2003; YOUNG et al., 2000).

Esta proteína foi identificada como uma glicoproteína altamente conservada

expressa tanto na forma associada a membranas como na forma secretada. Ela apresenta

não apenas determinantes grupo-específicos como também tipo-específicos e tem sido

reconhecida como um importante imunógeno em infecções por dengue (FALCONAR et al.,

1990; HENCHAL et al., 1987); além de estar presente em altas concentrações no soro de

pacientes infectados com o vírus durante a fase clínica inicial da doença (ALCON et al.,

2002). Young et al. (2000) foram os primeiros a desenvolver um ELISA de captura para

detecção de NS1 no soro de pacientes infectados com dengue, durante o estágio febril

agudo da doença. E a partir de então, estudos envolvendo a detecção de NS1 no soro de

pacientes vêm tentando correlacionar ou predizer o desenvolvimento da forma grave da

doença ou servir como um ensaio suplementar para o diagnóstico de dengue na fase aguda

(KORAKA et al., 2003; XU et al., 2006; CHUANSUMRIT et al., 2008). Foram desenvolvidos

dois kits de diagnóstico baseados em imunoensaio enzimático para detecção do antígeno

Introdução

NS1 no soro humano que estão sendo comercializados, o kit Platelia Dengue NS1 Ag kit

(Bio-Rad Laboratories, Marnes La Coquette, France) e o kit Pan-E dengue early ELISA da

PanBio.

1.6. Elementos envolvidos na patogênese da dengue

A causa responsável pelo desenvolvimento das formas graves da doença têm sido

temas de diversos trabalhos nos últimos 50 anos. Os fatores determinantes envolvidos na

gênese da alteração da permeabilidade capilar ainda não são totalmente esclarecidos e,

portanto, a patogênese das infecções por dengue e o aparente envolvimento da resposta

imune, tanto na proteção como no desenvolvimento da doença ainda não estão bem

definidos. Diversas hipóteses já foram propostas para explicar a patogênese da infecção por

dengue, mas até hoje nenhuma é capaz de, isoladamente, esclarecer todos os mecanismos

envolvidos.

A hipótese de maior aceitação refere-se a um fenômeno da resposta imunológica

exacerbada dependente de anticorpos

(antibody-dependent enhancement -

ADE),

fenômeno comum a outras infecções virais (HALSTEAD, 1988; TAKEDA; ENNIS, 1990). Neste

modelo acredita-se que anticorpos adquiridos em infecções prévias por um determinado

sorotipo viral não seriam capazes de neutralizar o sorotipo responsável pela infecção atual.

Estes anticorpos se ligariam a outros epítopos do sorotipo responsável pela infecção atual,

comuns aos quatro sorotipos virais, mas não o neutralizaria, formando então complexos vírus-

anticorpos. Estes complexos se ligam com maior facilidade a células monocíticas humanas por

meio da interação com receptores de imunoglobulinas (Fc), e, consequentemente, infectam as

mesmas com uma maior eficiência (HALSTEAD, 1988; ROTHMAN, 2004).

Nos últimos anos têm sido publicados estudos que suportam o envolvimento do

sistema imune na patogênese das formas mais graves da infecção pelo vírus dengue

(BETHELL et al.,1998; HOBER et al., 1993; MONGKOLSAPAYA et al., 2003; WELSH;

ROTHMAN, 2004). Foi sugerido que citocinas e mediadores químicos como Fator de

Introdução

Necrose Tumoral (TNF), Interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-6, interferon- (INF-), Fator Ativador

Plaquetario (PAF), C3a, C5a e histamina, produzidos pelos linfócitos ativados e/ou

monócitos infectados estão envolvidos nos mecanismos imunopatogênicos que induzem o

aumento da permeabilidade vascular observada em pacientes com dengue hemorrágico

(BETHELL et al., 1998; HOBER et al., 1993). ROTHMAN & ENNIS (1999) propuseram um

modelo de imunopatogênese baseado nessas observações, em que a infecção de células

mononucleares pelos vírus dengue seria aumentada pelo fenômeno de ADE, facilitando

assim a síntese de INF- por linfócitos T CD4

vírus-específicos resultando na expressão de

um maior número de receptores Fc na superfície destas células. Quanto maior o número de

monócitos/macrófagos infectados, maior ativação de linfócitos T e, portanto níveis maiores

de citocinas e médiadores químicos. O efeito sinérgico dessas proteínas induz aumento da

permeabilidade vascular, extravasamento plasmático e disfunção do sistema de coagulação

conduzindo a hemorragias. É notável, contudo, que este cenário inflamatório não difere

significativamente do que acontece em muitas outras infecções virais (BIELEFELDT-

OHMANN, 1995; BIELEFELDT-OHMANN, 1997), que não progridem para formas

hemorrágicas, sugerindo que outros fatores podem estar envolvidos.

Outra hipótese para as diferentes formas de infecção pelo dengue seria que a

infecção poderia estar correlacionada com a virulência do vírus. Por exemplo, a epidemia de

1981 em Cuba, quando os primeiros casos de FHD ocorreram na região, coincidiu com a

introdução de um novo genótipo de DENV-2 do sudeste asiático (RICCO-HESSE et al.,

1997). Epidemias subseqüentes de FHD na América do Sul também coincidiram com o

aparecimento do genótipo asiático (RICCO-HESSE et al., 1997). Em contraste, no Peru,

nenhuma evidência de FHD foi encontrada durante uma epidemia causada por DENV-2,

cinco anos após uma epidemia de DENV-1, embora a taxa de infecção secundária tenha

sido em torno de 60,5% (WATTS et al., 1999). A ausência de FHD nesta população foi

atribuída à origem americana do DENV-2 que causou a epidemia (WHITE, 1999). Estudos

realizados na Tailândia mostraram que a carga viral no sangue periférico é maior em

Introdução

pacientes que desenvolvem FHD em comparação aos que desenvolvem FD (VAUGHN et

al., 2000). Estes e outros achados sugerem que fatores de virulência viral poderiam ter

papel essencial na patogênese da FHD/SCD (BHAMARAPRAVATI, 1997; LEITMEYER et

al., 1999, BIELEFELDT-OHMANN, 1997).

A magnitude da resposta imune pelos linfócitos T também já foi correlacionada à

severidade da doença (ZIVNA et al., 2002, LOKE et al., 2002), e, diferentes haplótipos do

antígeno leucocitário humano (HLA) foram correlacionados tanto com o aumento quanto

com a diminuição da susceptibilidade para FHD. Em um estudo de tipagem molecular de

HLA em pacientes com FHD no Vietnam foi encontrado que o polimorfismo no loci de HLA

de classe I está associado à susceptibilidade da FHD, mas polimorfismos nos genes do

HLA-DRB1 ou do TNF não estão (LOKE et al., 2002). Em outro estudo foi observado que

uma variação na seqüência promotora do gene que codifica a molécula CD209, uma

integrina de células dendríticas, também conhecida como DC-SIGN1 e que atua como

receptor para o vírus dengue, poderia estar relacionada à gravidade da doença

(SAKUNTABHAI et al., 2005).

Em resumo, todos os mecanismos citados até aqui parecem contribuir para o

agravamento da doença. Especula-se, com base nestas observações, que os mecanismos

patogênicos da doença englobem uma teoria conciliatória de múltipla causalidade, na qual

se incluem os vários fatores de risco relacionados à epidemiologia (dentre esta, imunidade

de grupo, intervalo de tempo entre as infecções por diferentes sorotipos), ao indivíduo

(idade, sexo, raça, mecanismos genéticos, presença de anticorpos por infecções prévias e

intensidade da resposta) e por fim ao vírus (virulência, sorotipos e genótipos envolvidos em

cada epidemia e mutações genômicas). Todos estes fatores contribuiriam então, em maior

ou menor grau, para o agravamento da doença (GUZMAN et al., 2002). Porém a grande

variabilidade de fatores de risco e a possibilidade de inúmeras combinações entre eles em

diferentes cenários em que a doença ocorre, dificultam a identificação de quais mecanismos

tem real relevância na fisiopatologia da doença.

Introdução

1.7. Tratamento, controle e prevenção

A expansão das áreas acometidas pela dengue em regiões tropicais e subtropicais

tornou a adoção de práticas de controle e prevenção da doença uma medida obrigatória

para os órgãos de saúde internacionais e países afetados. Infelizmente, os recursos

disponíveis são limitados e a implementação da maioria das medidas depende de uma

participação ativa de diferentes setores da sociedade (GUZMAN & KOURI, 2003; TAUIL,

2002). Apesar dos avanços técnicos referentes à produção de vacinas contra a dengue,

existem vários fatores que dificultam a disponibilização de uma vacina que seja ao mesmo

tempo eficaz e segura. As lacunas existentes no conhecimento da fisiopatologia da doença

e a ausência de um modelo animal adequado são alguns dos obstáculos encontrados. O

provável papel da presença de anticorpos sub-neutralizantes e linfócÍtos T de baixa

afinidade na fisiopatologia da FHD torna mandatória a produção de uma vacina tetravalente,

que proporcione imunidade contra os quatro sorotipos do vírus dengue (CHATURVEDI et.

al., 2005).

O controle do vetor representa, portanto, a única opção para a redução do número

de indivíduos acometidos. A eliminação do mosquito adulto geralmente é pouco efetiva,

exceto quando o uso de inseticidas é feito dentro das casas (GUBLER, 1998). Com isso, o

combate à proliferação do vetor depende principalmente da eliminação das larvas e de seus

respectivos reservatórios. Atualmente, as grandes e médias cidades do Brasil enfrentam

limitações no programa de eliminação de criadouros do mosquito. Entre os obstáculos

encontrados estão a falta de práticas de fiscalização de pontos estratégicos (borracharias,

cemitérios, depósitos de ferro velho, terrenos baldios não cuidados) e a dificuldade de

acesso aos domicílios pelos servidores públicos, tanto pela escassez de recursos humanos

e financeiros, quanto pela falta de cooperação e envolvimento da população (TAUIL, 2002).

Por ser uma doença aguda, de rápida evolução e sem uma terapia específica, a

redução das complicações, e conseqüentemente da mortalidade, dependem da realização

de suspeita diagnóstica precoce e manejo correto do paciente. A instituição de hidratação

vigorosa e em tempo adequado é a principal medida terapêutica. Nos casos mais graves,

Introdução

quando o choque já se estabeleceu e as provas de coagulação estão alteradas, a correção

dos distúrbios metabólicos e hemodinâmicos e a assistência médica em ambiente de terapia

intensiva tomam-se necessárias (WILLS et. al., 2005).

Em síntese, apesar da grande quantidade de informação já produzida sobre a

dengue, o conhecimento disponível até o momento ainda não permite um entendimento

completo da fisiopatologia da doença. O espectro e a gravidade das manifestações são

bastante amplos, podendo variar de acordo com uma grande quantidade de fatores,

incluindo o sorotipo envolvido e as características da população estudada. O diagnóstico

precoce ou a realização de uma suspeita diagnóstica acurada são fundamentais para a

adoção de condutas terapêuticas capazes de minimizar complicações e reduzir a

mortalidade. A confirmação laboratorial rápida de casos suspeitos de dengue também

facilita a prevenção e controle das epidemias de dengue, sendo muito importante para o

manejo clínico e epidemiológico em áreas onde múltiplos Flavivirus são endêmicos, como é

o caso do Brasil. Contudo, a velocidade e acurácia do diagnóstico devem ser balanceadas

pelo custo do teste e disponibilidade, especialmente em países em desenvolvimento.

Avaliamos a aplicabilidade de uma nova ferramenta para diagnóstico da infecção de

dengue, baseada em um imunoensaio enzimático para detecção do antígeno NS1 no soro

humano no sistema único de saúde.

Objetivos

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Avaliar a detecção de NS1 viral no soro de pacientes com suspeita clínica de dengue

como um método para realização do diagnóstico da dengue na sua fase aguda e comparar

com a detecção do vírus por RT-PCR, sorologia e isolamento viral, visando fornecer

subsídios para que os profissionais de saúde possam atuar de forma mais rápida e eficaz no

que tange ao tratamento da doença.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Realizar ensaios de ELISA para a detecção de NS1;

2. Isolar o vírus de amostras clínicas suspeitas de dengue;

3. Realizar a sorotipagem do vírus infectante por meio de RT-PCR;

4. Comparar diferentes métodos de RT-PCR para detecção do vírus;

5. Realizar ensaios de ELISA para a detecção de IgM e IgG anti-dengue;

6. Comparar a sensibilidade e especificidade de todos os métodos diagnósticos

empregados.

Materiais e Métodos

3. MATERIAIS E MÉTODOS

O presente trabalho foi conduzido no Laboratório de Virologia Molecular (LVM), do

Centro de Pesquisa em Virologia da FMRP-USP, onde foram realizados todos os ensaios de

biologia molecular, experimentos de virologia clássica e desenvolvidos os testes sorológicos.

3.1. População de estudo

Foram estudadas amostras de pacientes notificados pelas unidades básicas de

saúde da rede pública de Ribeirão Preto como suspeitos de dengue, na fase aguda da

doença, entre 1 a 7 dias após o aparecimento de febre. A definição de caso suspeito de

dengue ficou a critério do médico atendente nas unidades básicas de saúde e incluía febre,

mal-estar, dor retro-orbitária, dor no corpo, entre outros. A seleção dos pacientes foi

realizada entre abril de 2007 a final de abril de 2008.

Os pacientes participantes deste estudo procuravam o Pronto Atendimento (PA) do

CSE (localizado em uma região de alta incidência de dengue na cidade de Ribeirão Preto-

SP), e o PA e Enfermaria de Moléstias Infecciosas e Tropicais do Hospital das Clínicas de

Ribeirão Preto (HC-FMRP-USP). Este estudo foi executado com o consentimento do Comitê

de Ética em Pesquisa do HC-FMRP-USP, tendo obtido a aprovação deste comitê (Processo

HCRP nº 12603/2006), conforme parecer emitido em 25/12/2006 (ANEXO A) e também

aprovação pela Diretoria Acadêmica de Ensino e Pesquisa do CSE (ANEXO B) e financiado

pela Fundação de Amparo

Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). Todos os

pacientes incluídos no projeto de pesquisa foram informados adequadamente sobre os

objetivos do trabalho, tendo a opção de não participarem da amostragem, e foram incluídos

no projeto via consentimento pós-informação, por escrito (ANEXO C).

O sangue utilizado foi colhido em tubo sem anticoagulante. O sangue foi submetido a

uma centrifugação de 2600 rpm por 6 minutos para obtenção do soro. O soro obtido foi

utilizado no isolamento viral, na extração do RNA viral, detecção de NS1 e anticorpos

específicos para os sorotipos de dengue, bem como para a determinação da presença de

anticorpos IgG em soros de fase aguda, o que indica estarmos frente a uma infecção

Materiais e Métodos

secundária. O soro foi aliquotado e mantido a -70C até o momento do uso.

3.2. Extração do RNA viral

A extração do RNA viral foi realizada utilizando-se o kit QIAamp



Viral RNA

(QIAGEN



, California, USA) de acordo com as recomendações do fabricante. Este método

permite o isolamento de moléculas de RNA viral com mais de 200 nucleotídeos de extensão,

utilizando uma membrana de sílica-gel de alta afinidade. Inicialmente, 140µL de soro de

cada paciente foram adicionados a 560µL de solução de lise contendo carreador de RNA

(tampão AVL). Após a homogeneização em vórtex por 15 segundos, a mistura foi incubada

por 10 minutos a temperatura ambiente. Após essa etapa de lise foram adicionados 560µL

de etanol absoluto e o material foi transferido para a coluna de sílica-gel com alta afinidade

para RNA e submetida a uma centrifugação de 6.000 g por 1 minuto. O tubo coletor foi

descartado e foram realizadas duas lavagens subseqüentes da coluna com 500µL das

soluções AW1 e AW2, com centrifugação, respectivamente, de 6.000 x g por 1 minuto e

20.000 x g por 3 minutos. Terminada a lavagem, o RNA que ficou ligado à membrana foi

eluído da coluna por meio da adição de 60µL da solução tampão AVE com uma

centrifugação de 6000 x g por 3 minutos, e então o RNA foi estocado a -70C, para posterior

utilização nas reações de PCR.

3.3. One-step RT-PCR para diagnóstico e sorotipagem dos vírus

A detecção da infecção por dengue das amostras obtidas foi realizada utilizado o Kit

QIAGEN



OneStep RT-PCR (QIAGEN



, California, USA) que é composto de reagentes que

permitem uma alta eficiência e sensibilidade da RT-PCR. Essa sensibilidade é devida à

mistura das enzimas Ominiscript e Sensiscript, desenhadas para a transcrição reversa de

quantidades de RNA acima de 50ng e abaixo de 50ng, respectivamente. Além disso, possui

HotStartTaq DNA Polimerase, que elimina a formação de dímeros de oligonucleotídeos. A

presença de material genético dos vírus foi determinada utilizando a metodologia descrita

Materiais e Métodos

por Lanciotti et al. (1992). Nesta RT-PCR foram utilizados 5 oligonucleotídeos: um

oligonucleotideo 5´ destinado a uma região do gene do capsídeo conservada para os quatro

sorotipos e outros quatro oligonucleotídeos 3´, cada um complementar às seqüências

específicas a cada sorotipo. A distinção dos sorotipos foi possível, pois a amplificação do

material genético referente a cada sorotipo produziu fragmentos com diferentes tamanhos

de pares de bases nucleotídicas (Tabela 3).

Tabela 3: Oligonucleotídeos utilizados nas amplificações para detecção dos sorotipos circulantes

de Dengue.

Oligonucleotídeos

Seqüência

Especificidade

Tamanho do

fragmento

esperado (pb)

5´ TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG 3’

DENV (sense)

TS1

5’ CGTCTCAGTGATCCGGGGG 3’

DENV -1 (anti-sense)

482 (D1 e TS1)

TS2

5’ CGCCACAAGGGCCATGAACAG 3’

DENV - 2 (anti-sense)

119 (D1 e TS2)

TS3

5’ TAACATCATCATGAGACAGAGC 3’

DENV - 3 (anti-sense)

290 (D1 e TS3)

TS4

5’ CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA 3’

DENV - 4 (anti-sense)

392 (D1 e TS4)

A amplificação dos fragmentos foi conduzida em um termociclador “GeneAmp PCR

System 9700” (Applied Biosystems). Para o preparo da reação de volume final de 25L

foram utilizados 5µl do RNA amostral, 5µl da solução tampão 5X One-Step RT-PCR (Tris·Cl,

KCl, (NH

)

, 12.5 mM MgCl

, DTT; pH 8.7), 1µl de dNTPs (10mM), 1µl de cada

oligonuleotídeo (20 pmol), 0,5µl da mistura de enzimas (QIAGEN One-Step RT-PCR

Enzyme Mix). A reação de amplificação foi processada utilizando um programa de 50ºC por

30 minutos e 95ºC por 15 minutos para a transcrição reversa, seguido por 40 ciclos de 95ºC

por 1 minuto, 55ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto. A etapa final de extensão foi de 10 min

a 72

C. As amostras amplificadas foram armazenadas a -20°C ou analisadas

imediatamente.

Para confirmação da infecção viral e avaliação do emprego de outra metodologia

para diagnóstico da dengue por RT-PCR foram utilizados os oligonuleotídeos descritos

anteriormente por Henchal (1991), AD3 [5' CTGATTTCCAT(A,C,G,T)CC(A,G)TA 3'] e AD4

[5' GA(C,T)ATGGG(A,C,G,T)TA(C,T)TGGATAGA 3']. A reação de RT-PCR foi preparada

Materiais e Métodos

como descrito anteriormente, e a reação de amplificação foi feita a 50ºC por 30 minutos e

95ºC por 15 minutos para a transcrição reversa, seguidos de 35 ciclos a 95ºC por 1 minuto,

55ºC por 1 minuto, 72ºC por 1minuto e uma extensão final de 10 minutos a 72ºC.

Para a visualização dos amplicons, 10l do produto da amplificação com 2l de

tampão de corrida foi submetido à eletroforese horizontal (100 V/60 minutos) em gel de

agarose 2,0% (Invitrogen, New York, USA), em tampão borato TBE 1X (TrisHCl 50mM

pH8,3, Ácido bórico 45mM, EDTA 0,5mM pH8,0) e corado com brometo de etídio 0,4g/mL

(SIGMA, Munich, Germany). Posteriormente, os géis foram visualizados à luz ultravioleta e

analisados utilizando o equipamento “Kodak Eletrophoresis Documentation and Analysis

System 120 (Kodak).

3.4. Isolamento viral

O isolamento viral foi realizado em cultura de C6/36. Placas de cultura celular de 24

poços (Corning Incorporated, Corning, NY, USA) foram semeadas com células C6/36 e

crescidas a 28ºC em meio L-15 (Gibco BRL, USA) modificado, suplementado com 10% de

soro bovino fetal (SBF), 10% triptose fosfato e antibióticos (penicilina 100U/mL,

estreptomicina 1mg/mL). Após a formação de uma monocamada celular com mais de 90%

de confluência, a monocamada de células foi inoculada com 6µl dos soros de pacientes

suspeitos de dengue diluídos em 144µl de L-15 com 2% de antibióticos e as placas foram

então mantidas sob agitação por 1 hora para adsorção dos vírus. Após a infecção foi

adicionado 1mL de meio L-15 com 2% de SBF e 1% de antibióticos em cada poço e a

cultura mantida a 28ºC por sete dias. Após este período foram feitos ensaios de

imunofluorescência indireta das células plaqueadas e também extração de RNA e detecção

da infecção pela RT-PCR a partir do sobrenadante da cultura clarificado para se determinar

quais poços eram positivos para o isolamento do vírus. Posteriormente foi adicionado ao

restante do sobrenadante 10% de SBF para o mesmo ser estocado a -70ºC.

Materiais e Métodos

3.5. Ensaios de imunofluorescência indireta

A monocamada celular foi utilizada para realização do teste de imunofluorescência

indireta para também se determinar a presença da infecção viral na cultura. Para a

preparação das lâminas para imunofluorescência, a monocamada celular foi lavada duas

vezes com 1mL de PBS, o sedimento celular foi ressuspenso e a concentração de células

foi ajustada em microscópio óptico comum (aumento de 100X) em aproximadamente 100

células por campo. Em cada demarcação da lâmina de imunofluorescência foram aplicados

15μL da suspensão celular. Posteriormente, as células aderidas às lâminas foram fixadas

com acetona PA gelada por 15 minutos. As lâminas foram secas a temperatura ambiente.

Logo após, foram adicionados 20µl de MIAF purificado (fluído ascítico de camundongos

imunizados contra os vírus do dengue tipo 3) diluído 1:100 em PBS com 3% de SBF nas

demarcações. As lâminas foram incubadas em câmara úmida a 37ºC por 30 minutos,

lavadas duas vezes em PBS por 5 minutos e secas a temperatura ambiente.

Posteriormente, as lâminas foram incubadas com 20µl do conjugado anti-IgG de

camundongo marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Sigma, USA), diluído 1:100

em PBS com azul de Evans (1:20.000), por 30 minutos, à temperatura ambiente em câmara

úmida. Após duas lavagens em PBS as lâminas foram montadas com glicerina tamponada e

observadas em microscópico de imunofluorescência para determinar a presença ou não de

fluorescência característica, indicando positividade da amostra.

3.6. ELISA de captura para detecção de IgM anti-dengue

Esta técnica foi realizada utilizando uma placa de teste comercializada pela PanBio

(Austrália), seguindo as instruções dos fabricante. Em resumo, os soros, o controle positivo,

o negativo e o calibrador foram diluídos 1/100 em diluente de soro. O antígeno foi diluído

1/2500 em tubo de 15mL utilizando o diluente de antígeno e incubado com um volume igual

de anticorpo monoclonal (Mab) secundário marcado com peroxidase por cerca de 60

minutos à temperatura ambiente. Foram adicionados então 100L de soro diluído na placa e

Materiais e Métodos

após 60 minutos de incubação a 37ºC a placa foi lavada seis vezes e a solução de

antígenos previamente preparada com os anticorpos secundários foi adicionada aos orifícios

e incubada por 1 hora a 37ºC. Após incubação e lavagem, foi adicionado o substrato TMB

(tetrametilbenzidina) que evidencia os soros positivos pelo desenvolvimento de uma cor azul

resultante da ação da peroxidase no substrato. A reação foi parada adicionando-se 100L

de solução de parada (Ácido fosfórico 1M). A coloração foi analisada através da leitura das

microplacas em espectrofotômetro, a um comprimento de onda de 450 nm e filtro de

referência 620nm. Todo soro com um valor índex maior que 1,1 foi considerado positivo,

entre 0,9 e 1,1 indeterminado e menores que 0,9 negativo.

Valor de cut-off = densidade óptica média da triplicata do calibrador X fator de calibração

Valor índex = densidade óptica da amostra (soro)

“cut-off”

3.7. ELISA indireto para detecção de IgG anti-dengue

O ELISA indireto para detecção de IgG anti-dengue (PanBio, Austrália) foi realizado

para se determinar a presença de níveis elevados de IgG anti-dengue em pacientes com

suspeita clínica da doença para determinar a presença de infecção secundária. Os testes

foram realizados de acordo com as recomendações do fabricante. Em resumo, 100L das

amostras, controles e calibradores diluídos 1:100 (10L das amostras e controles em

1000L de diluente do soro) foram dispensados nos poços. A placa foi coberta e incubada

durante 60 minutos a 37ºC. Após este período a placa foi lavada seis vezes com solução de

lavagem e 100L do anticorpo monoclonal secundário anti-IgG humana foi adicionado em

cada poço e incubado por 1 hora a 37ºC. Após a incubação a placa foi lavada seis vezes

com a solução de lavagem e 100L de TMB foram adicionados em cada poço que evidencia

os soros positivos pelo desenvolvimento de uma cor azul resultante da ação da peroxidase

no substrato. A placa foi incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente e logo em

Materiais e Métodos

seguida foram adicionados 100L ácido fosfórico 1M na mesma seqüência e contagem de

tempo da adição de TMB. A coloração foi analisada através da leitura das microplacas em

espectrofotômetro, a um comprimento de onda de 450 nm e filtro de referência 620nm. Todo

soro com um valor índex maior que 1,1 foi considerado positivo, entre 0,9 e 1,1

indeterminado e menores que 0,9 negativo. O valor de cut-off e valor index foram calculados

da mesma maneira descrita para o MAC-ELISA.

3.8. PLATELIA DENGUE NS1 Ag KIT para detecção da proteína NS1

O kit comercial Platelia Dengue NS1 Ag Kit (BioRad, França) corresponde a um

ensaio imunoenzimático sanduíche de um passo realizado em microplaca de 96 poços para

detecção do antígeno viral NS1 no soro humano ou plasma. Ele faz uso de anticorpos

murinos monoclonais (MAb) para captura e detecção desta proteína. Se o antígeno NS1

está presente na amostra, um complexo-imune MAb-NS1-MAb/Peroxidase será formado. Os

testes foram realizados com os soros dos pacientes e controles de acordo com as

recomendações do fabricante. Rapidamente, 50 L das amostras de fase aguda e controles

foram adicionadas simultaneamente com 50 L do diluente e 100 L de conjugado diluído e

incubadas por 90 minutos a 37ºC em microplacas já sensibilizadas com os anticorpos

monoclonais anti-NS1. Depois de seis lavagens, 160L de substrato foi adicionado em cada

poço e incubado por 30 minutos à temperatura ambiente. A presença dos imunocomplexos

foi detectada avaliando o desenvolvimento da cor azul e em seguida reação enzimática foi

parada adicionando 100L 1N de H

. A coloração foi analisada através da leitura das

microplacas em espectrofotômetro, a um comprimento de onda de 450 nm e filtro de

referência 620nm. Todo soro com um valor índex maior que 1 foi considerado positivo, entre

0,5 e 1 indeterminado e menores que 0,5, negativo.

Valor de cut-off = densidade óptica média da duplicata do calibrador

Valor índex = densidade óptica da amostra (soro)

Valor de “cut-off”

Materiais e Métodos

3.9. ELISA Pan-E Dengue Early para detecção da proteína NS1

O kit PAN-E Dengue Early ELISA (PanBio) é um teste de captura de antígeno NS1

do vírus dengue e tem como finalidade a detecção qualitativa do antígeno NS1 no soro. Os

testes foram realizados a partir dos soros de fase aguda dos pacientes com suspeita clínica

de dengue e controles, de acordo com as recomendações do fabricante. Em resumo, 100L

das amostras, controles e calibradores diluídos 1:10 (15L das amostras e controles em

135L de diluente do soro) foram dispensados nos poços. A placa foi coberta e incubada

durante 30 minutos a 37ºC. Em seguida a mesma foi lavada seis vezes com solução de

lavagem e 100L de anti-NS1 MAb conjugada a HRP foram adicionados em cada poço. A

placa foi novamente coberta e incubada durante 1 hora a 37ºC. Após este período a placa

foi lavada seis vezes com a solução de lavagem e 100L de TMB foram adicionados em

cada poço. A placa foi incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente e após a

formação da coloração azul, 100L de solução de parada foi adicionada em todas as

cavidades seguindo a mesma seqüência e contagem de tempo da adição de TMB. A

coloração foi analisada através da leitura das microplacas em espectrofotômetro, a um

comprimento de onda de 450 nm e filtro de referência 620nm. Todo soro com um valor índex

maior que 1,1 foi considerado positivo, entre 0,9 e 1,1 indeterminado e menores que 0,9,

negativo. O valor de cut-off e valor index foram calculados da mesma maneira descrita para

o MAC-ELISA.

3.10. Análise Estatística

Os dados foram analisados utilizando bioestatística. A avaliação da diferença entre

os diferentes grupos foi feita pelo teste de 

(CHERNICK; FRIIS, 2006). Os valores de

sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos foram calculados como

descrito por Gaddis; Gaddis (1990).

Resultados

4. RESULTADOS

4.1. Amostras obtidas

Durante o período de estudo, entre abril de 2007 a maio de 2008, foram avaliados

258 pacientes com suspeita clínica de dengue e destes, 250 foram incluídos no estudo. Oito

indivíduos foram excluídos da análise: 2 por possuírem outras amostras clínicas que não o

soro (líquor) e 6 por não terem sido notificados no CSE, portanto não dispusemos de seus

dados clínicos. Destas, 247 amostras foram de pacientes com quadro clínico sugestivo de

dengue clássica e 3 de pacientes com quadro clínico sugestivo de dengue hemorrágica,

sendo que destes últimos um evoluiu para óbito. Os pacientes compareceram ao Pronto

Atendimento do CSE entre 0 a 8 dias após o início dos sintomas, em média 2,1 dias.

Entre os 250 pacientes com suspeita clínica de dengue, 105 (42%) tiveram

confirmação laboratorial do diagnóstico através da detecção de anticorpos específicos do

tipo IgM e/ou da detecção de material genético do vírus pela RT-PCR (pacientes com

dengue). Os demais 145 pacientes que não apresentaram nenhum dos testes diagnósticos

específicos para dengue positivos foram considerados não portadores da doença (pacientes

sem dengue). A distribuição em relação ao sexo, idade e os sintomas foram bastante

semelhantes entre os grupos de pacientes com e sem confirmação laboratorial do

diagnóstico de dengue (Tabela 4). A maior parte dos pacientes com confirmação

laboratorial do diagnóstico de dengue tinha entre 21 a 40 anos de idade (Gráfico 1).

Tabela 4. Características epidemiológicas dos pacientes segundo a confirmação laboratorial do

diagnóstico de dengue.

Características

Com dengue

Sem dengue

Idade (em anos)

35, 04 (± 14,04)

30, 08 (± 13,01)

Sexo masculino

58,09%

49,96%

Sexo feminino

41,90%

51,03%

Resultados

Gráfico 1. Distribuição percentual dos 105 pacientes com confirmação laboratorial do diagnóstico de

dengue segundo a faixa etária.

4.2. One-step RT-PCR para detecção do vírus dengue

Soros dos 250 pacientes incluídos no estudo foram submetidos à pesquisa de

material genético do vírus dengue pela RT-PCR. A detecção do RNA viral foi possível em 81

pacientes, sendo 41 deles IgM positivos e 40 IgM negativos. Os soros submetidos à

metodologia de RT-PCR foram colhidos entre 0 a 8 dias (em média 2,1 dias) após o início

dos sintomas. Considerando-se todas as amostras IgM positivas (65 amostras) obtidas no

estudo, o percentual de positividade da RT-PCR foi de 63,07% quando a data de coleta não

foi levada em consideração. Com relação ao percentual de positividade, conforme

demonstrado na Tabela 5, entre as 55 (55/65) amostras IgM positivas colhidas até o quinto

dia de sintomas, o percentual de positividade pela RT-PCR foi de 70%, enquanto que

somente 30% foram positivas entre 6 e 8 dias após o início dos sintomas clínicos. O maior

percentual de positividade ocorreu no início dos sintomas (dia 0), e o maior número de

amostras positivas foi encontrado no segundo dia (Gráfico 2 e Tabela 5).

Resultados

Gráfico 2. Número de amostras positivas e negativas pela RT-PCR em comparação com o tempo,

após o início dos sinais clínicos.

Tabela 5. Percentual de positividade da RT-PCR convencional segundo o dia de sintomas.

Dias de sintomas

Número de

amostras testadas

Número de

amostras positivas

Percentual

positividade

100%

61,5%

75%

66,6%

50%

100%

33,3%

50%

Resultados

Em 36 das 40 amostras IgM negativas que foram positivas quando submetidas a

RT-PCR, não foi feita a segunda coleta de soro, e portanto o ELISA para detecção de IgM

foi feito antes do sexto dia, ainda na fase aguda.

O único sorotipo encontrado foi o sorotipo 3 (Figura 7). Este fato sugere que durante

os anos de 2007 e 2008 apenas DENV-3 estava circulando na região de Ribeirão Preto. Foi

possível encontrar resultados positivos para o vírus dengue até 7 dias após o início dos

sintomas.

Figura 7. Identificação dos produtos de RT-PCR para sorotipagem de Dengue por eletroforese

em gel de agarose a 2%. M: marcador de peso molecular de 100pb (Invitrogen). Linha 1: ausência

de Dengue em células C6/36 (controle negativo). Linha 2: amplificação de controle positivo de RNA

para DENV-3 (fragmento de 290pb). Linhas 3 à 5: amostras positivas para DENV-3 (fragmento de

290pb). Linhas 6 e 7: amostras negativas para DENV-3.

4.3. Comparação das metodologias de diagnóstico molecular da dengue

Utilizamos duas metodologias diferentes de RT-PCR para detecção dos vírus nas

amostras obtidas. Foi utilizada a metodologia descrita por Lanciotti com algumas

modificações, que já fornece o sorotipo infectante e também a metodologia descrita por

Henchal (1991) com modificações. Os produtos amplificados pela metodologia de Lanciotti

foram mostrados na figura 8. Os oligonucleotídeos AD3 e AD4, descritos por Henchal

M 1 2 3 4 5 6 7

300pb

290 pb

Resultados

(1991), que flanqueiam uma região da NS1, foram utilizados para confirmar o diagnóstico,

resultando em fragmentos 420pb. Todos estes amplicons foram analisados por eletroforese

em gel de agarose 2% (Figura 8).

Figura 8. Identificação dos produtos de RT-PCR para diagnóstico de Dengue por eletroforese

em gel de agarose a 2%. M: marcador de 100pb (Invitrogen). Linha 1: ausência de Dengue em

células C6/36 (controle negativo). Linha 2: amplificação de controle positivo de RNA para DENV-3

(fragmento de 420pb). Linha 3: amostra obtida de suspeita de dengue hemorrágica com óbito para

Dengue. Linha 4: amostra positiva para dengue.

A análise das 250 amostras de casos suspeitos de dengue, confirmadas

sorologicamente por detecção de IgM, indicou que a taxa da detecção do vírus pelo

procedimento de Lanciotti foi 63,07% (41/65) em uma situação endêmica, maior que o

procedimento descrito por Henchal (56,92%, 37/65), porém não houve diferença estatística

(teste 

, p<0.05). A partir de 185 amostras IgM negativas, foram obtidas 40 positivas pela

metodologia de Lanciotti e 32 amostras positivas pela metodologia de Henchal. Entretanto

dentre estas amostras IgM negativas, apenas 62 foram colhidas após sete dias do início dos

sintomas, o que provavelmente contribuiu para o resultado negativo de IgM, pois em muitas

amostras provavelmente ainda não teria ocorrido a soroconversão nos pacientes.

M 1 2 3 4

400pb

420 pb

Resultados

Considerando-se apenas as amostras IgM negativas que foram analisadas após os sete

dias do início dos sintomas, foi possível observar uma positividade de 9,6% (6/62) pelo

procedimento Lanciotti e 4,83% (3/62) pelo de Henchal.

A porcentagem de amostras com níveis de vírus da dengue detectáveis por cada

método de acordo com o dia do início dos sintomas é mostrada no Gráfico 3. Durante os

primeiros três dias da doença, a sensibilidade de detecção do vírus pelo procedimento de

Henchal foi similar ao de Lanciotti, porém a sensibilidade do método de Henchal diminuiu

mais com o tempo do que o método de Lanciotti (exceção para o quinto dia quando foi

coletada somente uma amostra).

Gráfico 3. Número de amostras positivas e negativas pela RT-PCR em comparação com o tempo,

após o início dos sinais clínicos.

4.4. Isolamento viral em cultura de células

Das 250 amostras de pacientes suspeitos de dengue analisadas, apenas 34 foram

consideradas positivas no isolamento utilizando a imunofluorescência indireta (IFI) realizada

no sétimo dia após a inoculação do soro (Figura 9). As amostras foram colhidas em média

2,1 dias após o início dos sintomas.

Resultados

Além da imunofluorescência, foi realizada a PCR do cultivo celular de todas as

amostras submetidas ao isolamento viral, na tentativa de detectar RNA viral, oriundo de uma

suposta replicação do vírus nas células C6/36. Das 250 amostras submetidas ao isolamento

viral, 51 foram positivas utilizando a PCR, como método de detecção do vírus dengue em

cultivo celular. Considerando-se todas as amostras positivas pelo isolamento viral, tanto pela

detecção por IFI como por RT-PCR, quatro não haviam sido consideradas positivas na RT-

PCR realizada diretamente em amostras clínicas.

A análise estatística da sensibilidade da detecção do vírus por isolamento viral em

dias após o início dos sintomas, revelou uma dependência significativa da data da coleta

das amostras em relação ao início dos sintomas (teste 

, p<0.05). Durante os três primeiros

dias da doença a sensibilidade da detecção por isolamento viral foi em torno de 60,8% pelo

RT-PCR do sobrenadante da cultura e 45,60% pela IFI e, após o quarto dia, a sensibilidade

caiu para 5,6% pelo RT-PCR e não foi possível detectar a infecção viral por meio da IFI. Em

contraste, a sensibilidade dos procedimentos de detecção do vírus direto do soro por RT-

PCR continuou acima de 50%, embora declinando com o tempo (Gráfico 4).

Gráfico 4. Número de amostras positivas e negativas pelas metodologias de RT-PCR e pelo

isolamento viral em comparação com o tempo, após o início dos sinais clínicos.

Resultados

Figura 9. Detecção, por microscopia de fluorescência, da presença do vírus DENV-3 em células

C6/36 infectadas. Quadro A: Imunofluorescência negativa para dengue (C6/36 não infectada corada

com azul de Evans 0,01%). Quadro B: controle positivo: C6/36 infectada com estoque viral de DENV-

3 (H-87). Quadro C: controle negativo: C6/36 infectada com o soro de paciente suspeito de dengue,

porém sem o anticorpo primário (contra corada com azul de Evans 0,01%). Quadro D:

Imunofluorescência positiva para dengue, C6/36 infectada com o soro de paciente com dengue

hemorrágico que evoluiu para óbito (aumento de 400 X). Quadro E: Ampliação da C6/36 infectada

com o soro de paciente com dengue hemorrágico que evoluiu para óbito, notar o citoplasma

fortemente corado.

Resultados

4.5. Diagnóstico sorológico por MAC-ELISA

Das 7.425 amostras suspeitas de dengue em Ribeirão Preto encaminhadas ao

Instituto Adolfo Lutz para detecção de IgM anti-dengue durante o período deste estudo,

2.266 amostras (30,5%) foram IgM positivas para dengue, enquanto que das 250 amostras

analisadas em nosso laboratório, 65 (26%) foram IgM positivas.

Nas amostras analisadas, 40 foram IgM negativas devido ao fato de terem sido

colhidas em média apenas 2,1 dias após o início dos sintomas, embora tenham tido

resultado positivo por RT-PCR e isolamento viral, e em 12 (30% - 12/40) destas foi possível

detectar a presença de IgG anti-dengue. Além disso, 22 amostras foram positivas para IgM

e negativas pela RT-PCR e isolamento viral, e em média estas amostras foram colhidas 4,1

dias após o início dos sintomas.

4.6. ELISA Indireto para detecção de IgG anti dengue

Em relação as 250 amostras suspeitas de dengue analisadas, 103 (41,2%) foram

IgG positivas. Sendo que 32 (31% - 32/103) amostras foram tanto IgM quanto IgG positivas

para dengue. Das amostras que foram positivas somente para IgG, 12 (16,90% - 12/71)

foram positivas também pela PCR, podendo indicar que nestes pacientes a produção de IgM

foi muito baixa e pouco duradoura, podendo sugerir que na verdade eram derivadas de

pacientes com infecção secundária por dengue. Quando foram analisadas as amostras

positivas tanto para IgM quanto IgG anti-dengue, 23 (71,87% - 23/32) foram positivas para

IgG até o quarto dia após o início dos sintomas, e portanto estas foram consideradas

também como oriundas de pacientes com infecções secundárias.

Das 75 amostras IgG positivas de pacientes que apresentavam dados clínicos a

respeito de prévias infecções por dengue, 25,33% (19/75) dos pacientes relataram terem

tido dengue antes, os outros 77,7% (56/75) dos pacientes relataram nunca terem tido

dengue. Destes pacientes que relataram que não terem tido dengue, 33 (58,92% - 33/56)

haviam sido vacinados para febre amarela enquanto que 24 (42,85% - 24/56) não foram

vacinados, e não houve diferença estatística entre estes grupos (teste 

, p<0.05).

Resultados

Foi possível observar uma prevalência cumulativa de infecção por dengue,

independente do sorotipo viral, em Ribeirão Preto de 23,6% (59/250).

4.7. Detecção da NS1 pelo kit PAN-E Dengue Early ELISA (PanBio)

Neste estudo 184 soros de pacientes suspeitos de dengue foram utilizados para

avaliar a sensibilidade e especificidade do PAN-E Dengue Early ELISA (PanBio). Não foram

avaliadas as outras 66 amostras devido a problemas no lote do kit. Durante a leitura da

primeira placa, quase todas as amostras foram positivas para a detecção de NS1 (76% -

70/92), sendo que destas, apenas 32 (34% - 32/92) eram de fato positivas pelo PCR e

isolamento viral e 9 (9,7% - 9/92) eram positivas para a detecção de IgM anti-dengue e

negativas pelo RT-PCR.

Na segunda placa (Figura 10) foram avaliados 92 soros e o antígeno viral foi

detectado em 19 (20,6%) e todas as amostras positivas para NS1 eram amostras de dengue

confirmadas por PCR ou isolamento. Amostras negativas para o PCR ou isolamento e

positivas para NS1 não foram detectadas. Porém 12 amostras (4,8%) positivas para o RT-

PCR foram negativas para a detecção de NS1. Além disto, seis amostras (6,5%) foram

positivas para detecção de NS1 em amostras IgM positivas e negativas para detecção do

genoma viral por RT-PCR. Analisando somente os resultados da segunda placa, foi

observado que o teste apresentou uma sensibilidade de 61,2% (19/31) comparando com a

detecção do antígeno viral por RT-PCR, sendo necessária a repetição das amostras

avaliadas no lote problemático e a análise de um maior número de amostras para a

avaliação e validação deste teste.

Resultados

Figura 10. Placa de 96 poços mostrando a detecção de NS1 pelo kit PAN-E Dengue Early ELISA

(PanBio).

4.8. Detecção da NS1 pelo kit PLATELIA

DENGUE NS1 AG Kit (Biorad)

Nesta análise, 250 amostras séricas de pacientes suspeitos de dengue foram

utilizadas para avaliar a sensibilidade e especificidade do PLATELIA

DENGUE NS1 AG Kit

(Biorad) (Figura 11).

Figura 11. Placa de 96 poços mostrando a detecção de NS1 pelo kit Platelia (Biorad).

C -

C +

Calibradores

Amostras

C-

C+

Calibradores

Amostras

Resultados

O desempenho geral do kit PLATELIA

DENGUE NS1 AG Kit (Biorad) em relação

ao isolamento viral e detecção molecular em cada categoria são mostrados na Tabela 6. O

antígeno viral foi detectado em 71 de 85 amostras de dengue positivas pela RT-PCR ou

isolamento, e 15 amostras que haviam sido negativas para o PCR ou isolamento. O teste

apresentou uma positividade de 83,5% (71/85), e esta positividade foi maior em infecções

primárias (89,65%, 52/58) que em infecções secundárias (70,37%, 19/27). Portanto houve

diferença estatística na taxa de detecção do Kit NS1 entre pacientes com infecções

primárias de dengue e infecções secundárias (teste 

, p<0.05).

Tabela 6. Número de amostras de soro de pacientes com infecção primária e secundária de dengue

testadas positivas por cada método de diagnóstico.

Método Diagnóstico

Número de amostras testadas positivas

Infecção primária

(Platelia)

Infecção secundária

(Platelia)

Total (Platelia)

Isolamento viral

2 (0)

4 (0)

RT-PCR

18 (14)

14 (10)

32 (24)

Isolamento viral + RT-PCR

38 (38)

11 (9)

49 (47)

Total

58 (52)

27 (19)

85 (71)

Comparativamente, o isolamento viral forneceu uma taxa de isolamento positivo de

62,35% (53/85), com uma taxa de isolamento de 68,96% (40/58) e 48,1% (13/27) para

infecções primárias e secundárias respectivamente. O isolamento viral também foi

significativamente maior em infecções primárias que secundárias (teste 

, p<0.05). A

detecção molecular do RNA viral por RT-PCR forneceu uma positividade 92,29% (81/85)

com uma taxa de detecção positiva de 96,55% (56/58) e 92,59% (25/27) para infecções

primárias e secundárias respectivamente. Não houve diferença estatística na taxa de

detecção molecular entre as infecções primárias e secundárias (teste 

, p<0.05).

Das 85 amostras séricas de pacientes com confirmação de infecção por dengue pela

detecção do vírus, a taxa de positividade para IgM foi 51,76% (44/85) com uma taxa de

detecção positiva de 51,72% (30/58) e 51,85% (14/27) para infecções primárias e

Resultados

secundárias respectivamente. Não houve diferença estatística entre a detecção de IgM em

infecções secundárias e primárias (teste 

, p<0.05). O desempenho do teste de NS1 em

respeito ao isolamento do vírus e detecção molecular da dengue na presença e ausência de

IgM anti-dengue é mostrado nas tabelas 7 e 8. Foi observada uma taxa de detecção positiva

pelo Platelia de 86,36% (38/44) na presença de IgM anti-dengue e 78,04% (32/41) na

ausência de IgM anti-dengue. Não houve correlação entre a taxa de detecção positiva de

NS1 com respeito à detecção positiva de IgM.

Tabela 7. Número de amostras de soro de pacientes com infecção primária e secundária de dengue

testadas positivas por cada método de diagnóstico em relação à detecção de IgM anti-dengue nas

mesmas amostras.

Método Diagnóstico

Número de amostras testadas positivas

Infecção primária

(Patelia)

Infecção secundária

(Platelia)

Total (Platelia)

Isolamento viral

2 (0)

4 (0)

RT-PCR

7 (7)

6 (6)

13 (13)

Isolamento viral + RT-PCR

20 (20)

7 (5)

27 (25)

Total

29 (27)

15 (11)

44 (38)

Tabela 8. Número de amostras de soro de pacientes com infecção primária e secundária de dengue

testadas positivas por cada método de diagnóstico em relação à não detecção de IgM anti-dengue

nas mesmas amostras.

Método Diagnóstico

Número de amostras testadas positivas

Infecção primária

(Patelia)

Infecção secundária

(Platelia)

Total (Platelia)

Isolamento viral

0 (0)

1 (0)

RT-PCR

11 (7)

8 (4)

19 (11)

Isolamento viral + RT-PCR

17 (17)

4 (4)

21 (21)

Total

28 (24)

13 (8)

41 (32)

Analisando o percentual de positividade de todas as metodologias de diagnóstico

aplicadas neste estudo, e correlacionando-o com o início dos sintomas, foi possível observar

Resultados

que nas amostras IgM positivas, a detecção de NS1 foi similar à detecção molecular e

superior à detecção pelo isolamento viral, sendo melhor que a RT-PCR a partir do terceiro

dia após o início dos sintomas. A detecção pelo isolamento viral apresentou queda no

percentual de positividade a partir do segundo dia do início dos sintomas, a RT-PCR

apresentou uma queda mais lenta a partir do terceiro dia (exceção feita, novamente, ao dia

cinco em que foi coletada somente uma amostra, e esta foi positiva tanto pela RT-PCR,

como NS1 e IgM), e a detecção de NS1 começou a apresentar queda somente a partir do

sétimo dia (Gráfico 5).

Gráfico 5. Sensibilidade da detecção da infecção pelo vírus dengue por dia após o início dos

sintomas clínicos em amostras IgM positivas. A porcentagem de amostras positivas por cada método

de detecção são plotados contra o número de dias após o início da febre.

Considerando-se que cerca de 50 amostras IgM negativas foram colhidas na fase

aguda da doença, e os pacientes não retornaram na fase de convalescença, é possível que

nosso estudo tenha muitos resultados negativos para IgM em que os pacientes na verdade

são positivos para a infecção por dengue, o que dificulta a análise da eficiência e

especificidade da detecção viral tanto por RT-PCR e NS1. Analisando, portanto, o

Resultados

percentual de positividade de todas a amostras positivas para IgM e correlacionando-o com

o dia das coletas das amostras, foi possível observar um aumento da positividade da

detecção de IgM nas amostras, enquanto que a detecção de NS1 manteve-se mais

constante durante os diferentes dias de coleta (Gráfico 6).

Gráfico 6. Sensibilidade da detecção da infecção pelo vírus dengue por dia após o início dos

sintomas clínicos em amostras RT-PCR positivas. A porcentagem de amostras positivas por cada

método de detecção são plotados contra o número de dias após o início da febre.

4.9. Análise da sensibilidade e especificidade do teste de NS1

Para avaliação da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo do

teste de NS1, os resultados encontrados para as amostras testadas para NS1 foram

comparados aos resultados encontrados pelos outros testes. Na tabela 9 é possível

observar o número de amostras positivas e negativas encontradas para cada teste

diagnóstico empregado neste estudo. No diagrama da Figura 12 pode ser observado o

número de amostras positivas encontradas para um único teste e o número de amostras

positivas que foram comuns aos diferentes métodos analisados.

Resultados

Tabela 9. Número de amostras de soros positivas e negativas para dengue para cada teste

diagnóstico.

Técnica empregada para diagnóstico

Positivos

Negativos

Isolamento viral

195

RT-PCR

169

IgM

185

NS1 (Platelia)

165

Comparações:

Isolamento viral e RT-PCR

201

Isolamento viral ou RT-PCR

163

RT-PCR e IgM

209

RT-PCR ou IgM

105

145

RT-PCR e NS1 (Platelia)

180

RT-PCR ou NS1 (Platelia)

154

IgM e NS1 (Platelia)

201

IgM ou NS1 (Platelia)

101

149

Figura 12. Diagrama representando a relação de positividade entre os testes de diagnóstico

para infecção pelos vírus dengue. Testes avaliados: ELISA para a detecção da NS1, ELISA para a

detecção de IgM anti-dengue e RT-PCR ou isolamento viral.

Resultados

A sensibilidade do teste de NS1 quando comparada à detecção de IgM anti-dengue

ou resultado positivo de RT-PCR foi de 78,2% e a especificidade de 89,6% O valor preditivo

positivo neste caso foi de 80%, com um valor preditivo negativo de 88,5%. Já quando são

considerados apenas os resultados positivos para IgM e positivos para o RT-PCR a

sensibilidade do teste sobe para 91, 8% e a especificidade fica em torno de 80%. O valor

preditivo positivo é de 52,9%, com um valor preditivo negativo de 97,6%. Quando a

sensibilidade do teste de NS1 é comparada somente a valores positivos para IgM é

encontrada uma sensibilidade de 75,4% e uma especificidade de 80,8%. O valor preditivo

positivo é somente 57,6% e o valor preditivo negativo é 79,2%. Outra comparação que pode

ser feita é com relação apenas aos resultados positivos de RT-PCR, onde é encontrada uma

sensibilidade de 86,4% e especificidade de 91,1%. O valor preditivo positivo é somente

82,3% e o valor preditivo negativo é 93,3% (Tabela 10).

Tabela 10. Sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP), valor preditivo negativo (VPN)

e acurácia dos testes diagnósticos avaliados neste estudo.

Teste/ referência

Sensibilidade

Especificidade

VPP

VPN

Acurácia

NS1/Isolamento viral

85,4

94,0

81,0

95,6

92,0

NS1/RT-PCR

86,4

91,1

82,3

93,3

89,6

NS1/IgM

75,4

80,8

57,6

90,3

79,2

RT-PCR/IgM

63,0

78,3

50,6

85,8

74,4

Isolamento viral/IgM

49,2

87,6

58,1

83,0

77,6

NS1/RT-PCR e isolamento

91,8

80,0

52,9

97,6

82,4

NS1/RT-PCR ou isolamento

78,2

89,6

80,0

88,5

85,6

IgM/ RT-PCR e isolamento

57,1

81,6

43,1

88,6

76,8

IgM/ RT-PCR ou isolamento

51,7

87,7

69,2

77,3

75,2

NS1/IgM e RT-PCR

95,1

77,9

45,9

98,8

80,8

NS1/IgM ou RT-PCR

76,2

96,5

94,1

84,8

88,0

Resultados

Quando comparamos a sensibilidade do teste de NS1 com a sensibilidade da RT-

PCR em amostras IgM positivas, podemos observar que o teste de NS1 mostrou-se mais

sensível que a RT-PCR para diagnóstico de dengue em amostras suspeitas de fase aguda.

O teste de NS1 apresentou uma sensibilidade de 75,4% enquanto que a RT-PCR

apresentou uma sensibilidade de apenas 63%. Além disso, a especificidade do teste de NS1

também foi um pouco maior que a da RT-PCR (80,8% contra 78,3%), além de apresentar

maiores valores preditivos positivo e negativo e acurácia que a RT-PCR (Tabela 10).

Utilizando uma estratégia diagnóstica combinando o teste de NS1, para amostras de

soro de pacientes suspeitos de dengue coletadas até 6 dias após o início dos sintomas, e, o

MAC-ELISA, para amostras coletadas na fase de convalescença, poderiam ser

diagnosticados 40,4% (101/250) das infecções pelo vírus da dengue. Já utilizando a RT-

PCR combinada com a detecção de IgM poderiam ser diagnosticados 42% (105/250) dos

casos suspeitos de dengue. Porém considerando-se que o teste de NS1 apresentou uma

especificidade maior que a RT-PCR, além de apresentar também um menor custo e maior

simplicidade de execução, seria bastante interessante a inclusão deste teste para

diagnóstico rotineiro de dengue nos laboratórios especializados em diagnóstico do sistema

público de saúde.

Discussão

5. DISCUSSÃO

A dengue é a doença mais importante causada por um Flavivirus no mundo. A

infecção pelos vírus dengue desencadeia diferentes síndromes clínicas, incluindo doença

febril indiferenciada, dengue clássica e febre hemorrágica do dengue/síndrome do choque

do dengue. Anualmente ocorrem cerca de 50 a 100 milhões de casos de dengue clássica e

mais de 500.000 casos de dengue hemorrágica (WHO, 2005) e mais de 100 países são

considerados endêmicos para a transmissão de dengue. Os sinais e sintomas da doença

podem sobrepor-se àqueles encontrados em outras doenças febris agudas, tornando seu

diagnóstico baseado apenas em critérios clínicos pouco confiáveis, uma vez que não é

capaz de diferenciar a dengue de outras infecções. Ao contrário da natureza limitada de

expressão da doença encontrada em outras infecções virais não-específicas, a infecção por

dengue pode resultar em febre hemorrágica a partir de uma manifestação amena em

poucos dias. Pelo fato desta doença apresentar o potencial para uma rápida expansão,

atenção especial é requerida para sua vigilância, prevenção e controle. Um teste que

ajudasse a diagnosticar a doença e também predizer se um caso clássico da doença

poderia se transformar em grave logo no início da infecção é objetivo de vários

pesquisadores nesta área.

O diagnóstico preciso e eficiente da dengue é de extrema importância para o

tratamento clínico do paciente, além de fornecer assistência para a vigilância, auxílio em

estudos envolvendo a patogênese da doença e em pesquisas com vacinas. O diagnóstico

também é muito importante para a confirmação de caso e diferenciar a dengue de outras

doenças, como a leptospirose, rubéola, outras infecções por flavivírus, e também para o

acompanhamento clínico e avaliação de pacientes com doença grave (GUZMAN; KOURI,

2004; VORNDAM; KUNO, 1997). Em conjunto com a vigilância clínica e epidemiológica, a

detecção precoce da circulação de dengue fornece informações precisas às autoridades de

saúde pública a respeito da data, localização, sorotipo viral e gravidade da doença durante

as epidemias de dengue (PAHO, 1994; GUZMAN et al., 1990; USUKU et al., 2001).

Discussão

O diagnóstico da doença na fase aguda é bastante complicado pela dificuldade de

isolamento viral e devido aos aspectos técnicos com relação à detecção do genoma viral,

como a necessidade de laboratórios especializados, além de ser possível detectar o vírus

apenas nos primeiros dias de sintomas. A relativa demora no desenvolvimento de anticorpos

específicos contra estes vírus faz com que o teste sorológico seja pouco útil no diagnóstico

precoce, causando uma demora muito grande na realização do diagnóstico (De PAULA et

al., 2004). Kits comerciais mais baratos, com sensibilidade e especificidade adequada, e que

sejam capazes de diagnosticar a doença durante a fase aguda ainda não foram

desenvolvidos. Deste modo, avaliamos uma nova técnica diagnóstica para estes vírus que

pode ser aplicada na fase aguda da doença, a detecção da proteína NS1, uma proteína não-

estrutural produzida e secretada durante a replicação viral.

Neste estudo foram avaliados 250 pacientes com suspeita clínica de dengue. A

confirmação sorológica por MAC-ELISA ocorreu em apenas 26% dos casos. Nos mesmos

períodos de 2007 e 2008, o Município de Ribeirão Preto-SP notificou 7.425 casos suspeitos

da doença, com confirmação sorológica por MAC-ELISA em 30% dos casos (Dados da

Vigilância Epidemiológica de Ribeirão Preto). Comparando-se os dados de 2007 com 2008,

foi observado em 2007 uma maior positividade para dengue em relação à 2008, 47,18% e

30,9% respectivamente (Dados da Vigilância Epidemiológica de Ribeirão Preto) e 42% em

2007 e 24,4% em 2008 utilizando dados analisados no presente estudo, mostrando que de

fato neste ano houve uma redução na transmissão da doença em Ribeirão Preto. Pelo fato

da dengue ser uma doença de sintomas variados e frequentemente inespecíficos, é

esperado que o número de casos suspeitos seja bastante superior ao número de casos

confirmados. Além disso, a realização da suspeita clínica e conseqüente notificação aos

órgãos de saúde são essenciais para que medidas de controle sejam planejadas e

implementadas. O elevado índice de suspeita diagnóstica sugere que os profissionais de

saúde do município estavam atentos à possibilidade da ocorrência de uma epidemia.

A maioria dos pacientes com confirmação laboratorial diagnóstica de dengue tinha

entre 21 e 40 anos de idade, fato já descrito em Ribeirão Preto (Prefeitura Municipal de

Discussão

Ribeirão Preto; NASCIMENTO, 2007). Porém, é importante destacar que este estudo foi

conduzido em uma unidade de atendimento voltada principalmente para pacientes adultos,

com isto, mesmo que houvesse uma maior incidência em crianças, estes indivíduos,

provavelmente, não seriam encaminhados para inclusão no trabalho. No Brasil, estudos

mostram que os casos de dengue, incluindo os de FHD, predominam em adultos jovens

(SIQUEIRA et al., 2005; MONTENEGRO et al., 2006; NUNES-ARAUJO et al., 2003),

embora existam evidências de que isto esteja mudando. O predomínio de casos de dengue

entre adultos ocorre também em outros países latino-americanos, como Cuba e Porto Rico,

diferindo do que atualmente é visto no Sudeste Asiático, onde habitualmente os casos mais

graves são documentados em crianças (HALSTEAD, 2006). No presente estudo não foi

possível analisar a incidência de dengue hemorrágica em diferentes faixas etárias, uma vez

que apenas 3 dos 105 pacientes com confirmação laboratorial do diagnóstico de dengue

preencheram os critérios de FHD. Os 3 casos de FHD ocorreram em pacientes com 24 a 30

anos de idade.

Neste estudo duas metodologias diferentes de RT-PCR foram utilizadas para a

detecção do RNA viral nas amostras analisadas. A sensibilidade de detecção do vírus da

dengue pelo procedimento de Henchal foi similar a aquela de Lanciotti nos primeiros dias de

infecção, porém com o aumento no número de dias a partir do início dos sintomas, ocorreu

uma pequena queda de sensibilidade no método de Henchal. Em outro trabalho, onde foram

comparadas quatro metodologias diferentes de detecção viral por RT-PCR, todas realizadas

da maneira descrita inicialmente por seus autores, também foi observado que a metodologia

de Henchal foi menos sensível que a de Lanciotti (RAENGSAKULRACH et al., 2002).

Utilizando-se oligonucleotídeos previamente descritos por Lanciotti (1994) foi possível

detectar o RNA viral em 63,07% das amostras IgM positivas. Estudos anteriores mostram

um nível de positividade de 22,6% (De PAULA et al., 2002) e 42,5% (NASCIMENTO, 2007)

em amostras IgM positivas colhidas durante surtos de dengue. Porém quando são

consideradas somente as amostras obtidas logo nos primeiros dias de infecção, como era

Discussão

de se esperar, esta positividade para a RT-PCR é aumentada (De PAULA et al., 2002;

CHAN et al., 1994).

A RT-PCR que se utilizou de oligonucleotídeos previamente descritos por Lanciotti

(1994) permitiu a especificação do sorotipo infectante, tendo sido observado tantos nas

amostras analisadas de 2007 como nas de 2008 que o único sorotipo circulante foi o

sorotipo 3. Até o ano de 2001, apenas os sorotipos 1 e 2 haviam sido identificados como

causas de infecção pelo vírus dengue em pacientes na cidade de Ribeirão Preto. Desde o

primeiro isolamento do sorotipo 3 em amostras clínicas do município, em 2002, este tem

sido o único sorotipo identificado em pacientes infectados (Prefeitura Municipal de Ribeirão

Preto). Desde a introdução do sorotipo 3 no continente americano, em 1994, e

posteriormente no Brasil, em 2000, houve uma grande preocupação por parte das

autoridades de saúde quanto à possibilidade de aumento no número de casos de FHD em

populações sabidamente já expostas aos sorotipos 1 e 2. De fato, o Brasil vivenciou, em

2002, a maior epidemia de dengue já documentada até hoje, com 794.129 casos da doença,

2.714 casos de FHD/SCD e 150 mortes (SIQUEIRA et al., 2005). Outro problema que

poderia vir a ocorrer seria a reintrodução do sorotipo 2 em regiões em que há mais de 4

anos apenas ocorre circulação de outros sorotipos (GUZMAN; KOURI, 2008), fato que

ocorreu na cidade do Rio de Janeiro este ano, que apresentava circulação do sorotipo 3 e

onde o sorotipo 2 foi reintroduzido. Portanto, se o sorotipo 2 voltar em 2009, desta vez em

toda a região sudeste, um grande aumento no número de casos de FHD seria esperado.

Somente dois dos 3 casos de FHD avaliados neste trabalho apresentaram evolução para

cura, e a elevada taxa de letalidade nos casos de FHD no Brasil vem chamando cada vez

mais atenção. Entre os anos de 1998 e 2002 esta taxa foi de 5,4%, superior às taxas de

0,5% a 3,5% observadas em países asiáticos (MALAVIGE et al., 2004; SIQUEIRA et al.,

2005). Em 2006, foi registrado um aumento de 36% nos casos de FHD e 49% no número de

óbitos quando comparado com 2005, já em 2007 foi observado um aumento de 145% nos

casos de FHD e 135% nos óbitos em comparação com 2006 (Secretaria de Vigilância em

Saúde, 2008). Estas estatísticas reforçam a importância de um diagnóstico rápido, para o

Discussão

reconhecimento de casos suspeitos e identificação precoce de possíveis sinais de alerta,

proporcionando assim a adoção de medidas terapêuticas adequadas que poderiam reduzir a

letalidade.

Considerando-se o diagnóstico por isolamento viral, foi observada uma positividade

de apenas 32,3% utilizando como método revelador o ensaio de imunofluorescência indireta

e 46,15% quando foi realizada a RT-PCR do sobrenadante do cultivo celular. Houve uma

dependência significativa da positividade com a precocidade da coleta das amostras em

relação ao início dos sintomas. Comparando-se a positividade do isolamento viral com a

positividade da RT-PCR realizada diretamente do soro, pode ser observado que a primeira é

bastante inferior que a segunda (32,3% e 63,0%). Alguns trabalhos mostram que a

positividade por isolamento viral é realmente inferior à positividade por RT-PCR (De PAULA

et al., 2002; GOMES-RUIZ et al., 2006; KUMARASAMY et al., 2007b). Mostrando que o

isolamento viral em cultura de células realmente não é sensível ou rápido o bastante para

ser aplicado na rotina como método diagnóstico. Porém a sua importância não pode ser

menosprezada uma vez que é de extrema importância para a detecção do tipo viral

circulante.

Analisando-se o diagnóstico sorológico pela detecção de IgM anti-dengue foi

possível observar que das 250 amostras avaliadas neste estudo, 65 foram IgM positivas

pelo MAC-ELISA e destas, apenas 41 (41/65) foram positivas pela detecção do genoma viral

pela RT-PCR. Considerando-se as amostras IgM negativas, 40 foram positivas para

detecção do genoma viral por RT-PCR. Estas amostras foram avaliadas tanto para a RT-

PCR como para o MAC-ELISA em média apenas 2,1 dias após o início dos sintomas, uma

vez que não houve a coleta na fase de convalescença. Este é um grave entrave da

detecção da infecção viral por MAC-ELISA, pois devido à dinâmica de produção de IgM anti-

dengue (INNIS et al., 1989), somente depois do sexto dia após o início dos sintomas que

93% a 99% dos casos apresentam níveis de IgM detectáveis (GUZMAN; KOURI, 2004), e

poucos pacientes retornam ao posto para realizar esta coleta. Devido a este fato, em

Discussão

regiões onde a vigilância epidemiológica não é eficiente, os casos suspeitos de dengue

nunca são confirmados.

A detecção de IgG anti-dengue nas amostras suspeitas de dengue foi bastante alta,

41,2% da amostras analisadas foram IgG positivas. Destas, 31% foram tanto IgM quanto

IgG positivas para dengue, e quando a detecção de IgG ocorreu até o quarto dia após o

início dos sintomas, estas amostras foram consideradas como derivadas de pacientes com

infecções secundárias. Das amostras que foram positivas somente para IgG, 12 (12/71)

foram positivas também para o PCR, e também foram consideradas como infecção

secundária de dengue. Foi possível observar um elevado número de pacientes que foram

IgG positivos relatando não terem tido infecções prévias de dengue (77,7%), e esta

positividade não foi reatividade cruzada com outro Flavivirus, uma vez que não houve

correlação com a vacinação de febre amarela. Foi possível observar também uma

prevalência de infecção por dengue independente do sorotipo viral em Ribeirão Preto de

23,6% (59/250). Esta prevalência pode ser considerada alta para uma cidade de interior.

Estudos incluindo estimativas de prevalência e do número de infecções realizados em

cidades de maior porte apresentam prevalência em torno de 25% a 56% (FIGUEIREDO et

al., 1990; VASCONCELOS et al., 1998; 1999). Já a prevalência de dengue em cidades de

interior gira em torno de 10% a 17% (VASCONCELOS et al., 2000).

A detecção da proteína NS1 como uma nova ferramenta diagnóstica para dengue

tem sido avaliada e considerada como uma alternativa no diagnóstico rápido da doença (XU

et al., 2006; DUSSART et al., 2006; LAPPHRA et al., 2008). A NS1 é uma glicoproteína

solúvel detectada em pacientes com dengue na fase aguda da doença (FALCONAR, 1997;

FLAMAND et al., 1999). Esta glicoproteína é bastante conservada entre os quatro sorotipos

do vírus e os níveis circulantes de NS1 mostraram se correlacionar com o desenvolvimento

da FHD (DUSSART et al., 2006; LIBRATY et al., 2002; YOUNG et al., 2000). A NS1 foi

encontrada em cerca de 83% dos pacientes com infecção por dengue entre o primeiro dia

até o décimo-oitavo dia após o início dos sintomas (ALCON et al., 2002; XU et al., 2006).

Discussão

Inicialmente dois kits comerciais para a detecção de NS1 seriam analisados neste

estudo, o PAN-E Dengue Early ELISA (PanBio) e PLATELIA

DENGUE NS1 AG Kit

(Biorad), porém devido a problemas no kit da Panbio os dados gerados por este kit não

foram levados em consideração. Portanto, a avaliação da detecção de NS1 nas amostras

suspeitas de dengue foi feita utilizando somente o kit comercializado pela Biorad.

A detecção de NS1 ocorreu em 71 de 85 amostras de dengue confirmadas por RT-

PCR ou isolamento, e em 14 amostras que haviam sido negativas para o PCR ou

isolamento viral. O teste apresentou, portanto uma positividade de 83,5% (71/85) quando

comparado à detecção por RT-PCR. Nesta análise foi encontrada uma sensibilidade de

86,4% e especificidade de 91,1%. O valor preditivo positivo foi 82,3% e o valor preditivo

negativo foi 93,3%. Kumarasamy (2007b) analisando a detecção de NS1 em amostras

positivas por RT-PCR ou isolamento viral observou uma sensibilidade de 93,4% e

especificidade de 100%. O valor preditivo positivo foi 100% e o valor preditivo negativo foi

98.9%. Esta diferença observada pode ser devida ao fato de termos avaliado as amostras

durante um surto epidêmico da doença, analisando todas as amostras que são obtidas

normalmente por um posto de saúde, independente da data da coleta, enquanto que neste

outro estudo foram avaliadas amostras já estocadas e colhidas apenas durante a fase

aguda da doença.

Tem sido relatado que a eficiência do teste de NS1 poderia variar dependendo da

infecção pelo vírus da dengue ser primária ou secundária (BLACKSELL et al., 2008;

KUMARASAMY et al., 2007a). Na infecção secundária pelo vírus dengue, os títulos de IgG e

IgM aumentam de forma mais rápida e são mais altos que em infecções primárias

(VAUGHN et al., 1997). O altos títulos de IgG e IgM anti-dengue encontrados nos soros de

pacientes provenientes de infecção secundária poderiam resultar na formação de imuno-

complexos de NS1 com estes anticorpos. Em um estudo foi possível observar correlação

inversa entre a sensibilidade na detecção de NS1 e títulos de IgM anti-dengue, e a

dissociação destes imuno-complexos, de fato, melhorou a detecção de NS1 nas amostras

dos soros, principalmente em infecções secundárias, aumentando a sensibilidade de 27%

Discussão

para 78% (KORAKA et al., 2003). No presente estudo foi possível observar que o teste de

NS1 apresentou uma positividade significativamente maior em infecções primárias (89,65%,

52/58) que em infecções secundárias (70,37%, 19/27). Kumarasamy (2007) observou uma

positividade de 97,3% (179/184) em infecções primárias e 70% (20/29) em infecções

secundárias, e Blacksell (2008) observou uma positividade também maior para infecções

primárias (75%, 3/4) que secundárias (60%, 20/33). Em outro estudo onde foi analisado um

maior número de pacientes com FHD foi observado que as taxas de positividade para NS1

foram maiores para pacientes com FD do que pacientes com FHD, mas não houve diferença

estatística (CHUANSUMRIT et al., 2008). Contudo pacientes com FHD originária de

infecção primária tiveram taxas significativamente maiores que pacientes com FHD

originária de infecção secundária (88,2% contra 41,4% no quinto dia após o início dos

sintomas) (CHUANSUMRIT et al., 2008). Porém outros estudos demonstraram não haver

relação entre a positividade e ao status da infecção, embora tenha sido possível

correlacionar maiores níveis de IgM e IgG anti-dengue em soros que foram falso-negativos

para o teste de NS1, uma vez que a dissociação dos imuno-complexos de NS1 por

tratamento ácido aumentou a sensibilidade do teste de 63,2% para 72% (LAPPHRA et al.,

2008).

Comparativamente, neste estudo, o isolamento viral também apresentou uma taxa

de isolamento significativamente maior em infecções primárias do que secundárias. Já na

detecção molecular do RNA viral por RT-PCR não foi observada diferença estatística entre

as infecções primárias e secundárias.

Analisando o desempenho do teste de NS1 com relação ao isolamento do vírus e

detecção molecular da dengue na presença e ausência de IgM anti-dengue, foi observada

uma taxa de detecção positiva pelo Platelia de 86,36% (38/44) na presença de IgM anti-

dengue e 78,04% (32/41) na ausência de IgM anti-dengue. Não houve correlação entre a

taxa de detecção positiva de NS1 com respeito à detecção positiva de IgM devido ao fato de

muitas amostras IgM negativas terem sido colhidas durante a fase aguda da doença, fato

comum no Brasil e que dificulta a bastante o diagnóstico da dengue.

Discussão

Analisando, portanto, o percentual de positividade para IgM e correlacionando-o com

o dia de coletas das amostras, foi possível observar um aumento da positividade da

detecção de IgM nas amostras, enquanto que a detecção de NS1 manteve-se constante

durante os diferentes dias de coleta. Este fato foi também observado quando se analisou o

percentual de positividade das metodologias de diagnóstico aplicadas na fase aguda da

doença em amostras IgM positivas ao longo do tempo. A taxa de detecção pela NS1 foi

similar à detecção molecular e superior à detecção pelo isolamento viral durante o início dos

sintomas. A detecção pelo isolamento viral apresentou queda no percentual de positividade

já a partir do segundo dia do início dos sintomas, a RT-PCR apresentou uma queda mais

lenta a partir do terceiro dia, e a detecção de NS1 começou a apresentar queda somente a

partir do sétimo dia, fato também observado em outros trabalhos (DUSSART et. al., 2006;

XU et al., 2006). No presente estudo foi possível detectar a NS1 a partir do dia 0 até o

sétimo dia após o início dos sintomas. Alcon (2002) reportou que a proteína NS1 pode ser

detectada do primeiro dia após o início dos sintomas até o nono dia, e os níveis de detecção

da NS1 variaram de 0,04 a 2 µg/mL em amostras de fase aguda (0 à 7 dias após o início

dos sintomas), e durante a fase de convalescença (oitavo dia em diante) foi em torno de

0,04 µg/mL, em infecções primárias. Já em infecções secundárias os níveis de NS1

variaram de 0,01 a 2 µg/mL na fase aguda, e, não foi detectada na fase de convalescença

(ALCON et al., 2002). Shu (2002) detectou NS1 no soro de paciente a partir do primeiro dia

após o início dos sintomas clínicos até o oitavo dia. Porém outro estudo mostrou que a

proteína NS1 poderia ser detectada até o décimo oitavo dia após o início dos sintomas,

embora neste estudo só tenha trabalhado com infecções pelo sorotipo 1 (XU et al., 2006).

A sensibilidade da detecção de NS1 tem apresentado variações entre os diferentes

sorotipos de dengue (DUSSART et al., 2006; BLACKSELL et al., 2008). Dussart (2006)

observou uma sensibilidade na detecção de NS1 para DENV-1 de 90,5%, para DENV-2 de

88,1%, 87,9% para DENV-3 e 89,7% para DENV-4. Já Blacksell (2008) observou uma

sensibilidade do teste de NS1 de 77,8% para a detecção de DENV-1, 60% para DENV-2,

0% para DENV-3 e 66,7% para DENV-4. O presente trabalho mostra que na verdade o teste

Discussão

de NS1 é bastante sensível na detecção de DENV-3, uma vez que apenas analisamos

amostras infectadas com este sorotipo, que é o sorotipo circulante na região neste

momento, e que obtivemos uma sensibilidade de 86,4% utilizando a RT-PCR como

referência.

Dussart et al. (2006) observaram uma sensibilidade na detecção do antígeno NS1

em relação às amostras positivas para RT-PCR de 85%, e de 94,1% em amostras positivas

para isolamento viral. No presente trabalho foi possível observar uma sensibilidade de

detecção de NS1 de 85,4% para amostras positivas pela RT-PCR, e de 86,4% para

amostras positivas para o isolamento viral. Os valores obtidos no presente trabalho foram

similares aos encontrados anteriormente, porém a taxa de detecção de NS1 em relação ao

isolamento viral foi mais baixa em nosso estudo. Obtivemos uma especificidade bastante

alta, 91,1% em relação às amostras positivas para a RT-PCR e 94% em relação às

amostras positivas para o isolamento viral.

Kumarasamy et al. (2007a) observaram uma sensibilidade de 93,4% para o teste de

NS1, em relação à detecção por RT-PCR ou isolamento viral, uma especificidade de 100%,

um valor preditivo positivo de 100% e um valor preditivo negativo de 98,9%. No presente

estudo foi possível observar uma sensibilidade de 78,2% para a detecção de NS1 em

amostras positivas pela RT-PCR ou isolamento viral, uma especificidade de 89,6%, uma

valor preditivo positivo de 80% e um valor preditivo negativo de 88,5%. Provavelmente

obtivemos valores mais baixos que o estudo anterior devido ao fato deste ter utilizado

amostras já estocadas para o grupo de pacientes com dengue e como controle doadores de

sangue, não tendo utilizado o teste de NS1 durante uma situação epidêmica.

Lapphra et al. (2008) encontraram uma sensibilidade do teste de NS1 de 63,2% e

especificidade de 98,4%, quando comparado à detecção de IgM e resultado positivo pela

RT-PCR. Já no presente estudo foi observada uma sensibilidade de 95,12% e uma

especificidade de 77,9%. Obtivemos uma menor especificidade provavelmente devido às

amostras negativas para IgM coletadas durante a fase aguda da doença, que foram

positivas para o teste de NS1. Obtivemos uma maior sensibilidade, apesar do nosso estudo

Discussão

também ter sido realizado com amostras de pacientes não-estocadas, demonstrando que

numa situação real, o teste apresentaria uma excelente sensibilidade.

Comparando-se os resultados obtidos com o teste de NS1 com os resultados da RT-

PCR em amostras IgM positivas, é possível observar que o teste de NS1 apresentou

sensibilidade e especificidade maiores que a RT-PCR, sensibilidade de 75,4% contra 63% e

especificidade de 80,8% contra 78,3%. Considerando-se também os valores preditivos

positivos e negativos pode-se observar o mesmo. O teste de NS1 apresentou VPP de 57,6%

contra 50,6% da RT-PCR, e VPN de 90,3% contra 85,8%. Os valores preditivos positivos

foram baixos para os dois testes devido às amostras negativas para IgM coletadas durante a

fase aguda da doença. A acurácia do teste de NS1 foi de 79,2% e a da RT-PCR de 74,4%,

demonstrando que o teste de NS1 apresenta melhores resultados que a RT-PCR para

diagnóstico de dengue. O teste de NS1 também apresentou melhores resultados que a

detecção de IgM anti-dengue em amostras positivas por RT-PCR e/ou isolamento viral.

Apesar da menor sensibilidade, principalmente em amostras colhidas após os

primeiros dias de sintomas, a RT-PCR oferece a vantagem de um diagnóstico rápido,

possibilitando ainda a identificação do sorotipo infectante. Porém os custos deste método

são muito elevados e de difícil aplicação na rede pública, além do alto grau de variabilidade

observado nos resultados que ocorre entre os laboratórios, o que sugere que ainda é

requerido mais trabalho para que seja atingida uma padronização da técnica no diagnóstico

da dengue (Dengue Diagnostics, WHO/TDR, 2004). O diagnóstico por IgM apresenta um

custo relativamente barato, porém a obtenção da amostra na fase de convalescença

ocasiona uma grande demora no diagnóstico (o paciente fica sabendo que teve dengue

quando não apresenta mais os sintomas clínicos da doença) e pode ocorrer reatividade

cruzada neste teste, principalmente em regiões endêmicas para mais de um Flavivirus.

As especificações da OMS para um teste ideal no diagnóstico clínico da dengue

(Dengue Diagnostics, WHO/TDR, 2004) têm como prioridades principais a determinação

precoce da presença da infecção durante a fase aguda; distinguir entre dengue e outros

flavivírus; ser barato e ser fácil de ser utilizado em todos os níveis do sistema de saúde; e

Discussão

como prioridades secundárias: continuar positivo depois do terceiro dia de sintomas (para

pacientes que demoram mais para procurar as unidades de saúde e à variações para o

início do sintomas clínicos); se possível fornecer um marcador para o desenvolvimento das

formas graves da dengue; distinguir entre infecções primárias e secundárias; distinguir os

sorotipos; ser estável a temperaturas mais altas, para que possa ser utilizado em unidades

que não apresentem refrigeração.

O teste de NS1 atende a todas as prioridades principais, e algumas das secundárias.

As grandes vantagens do teste de NS1 encontradas neste trabalho é que a detecção desta

proteína no soro dos pacientes ocorre por mais tempo que a detecção por RT-PCR, além de

ser um método mais barato. Além disso, estudos mostram que a proteína NS1 é altamente

conservada em todos os sorotipos de dengue, não dando reação cruzada com o vírus da

encefalite japonesa ou febre amarela, outros Flavivirus que podem dar reação cruzada com

a dengue quando o diagnóstico é feito utilizando sorologia (YOUNG et al., 2000). Além da

NS1 não ter sido detectada em pacientes positivos para febre amarela (DUSSART et al.,

2006).

Não foi possível avaliar a proteína NS1 como um marcador da forma grave da

dengue logo no começo da infecção, porque o número de pacientes com a forma grave da

doença (FHD/SCD) foi bastante baixo, além do teste de NS1 não ser quantitativo. Porém

outro estudo com números maiores de pacientes suspeitos de dengue hemorrágica também

não encontrou correlação da gravidade da doença com a detecção de NS1 (LAPPHRA et

al., 2008). No entanto, já foi demonstrado que o nível de NS1 presente no plasma se

correlacionou com a viremia e foi significativamente mais alto em pacientes com FHD do

que com FD, dentro de 2 dias após o início dos sintomas (LIBRATY et al., 2002).

Este é o primeiro trabalho no Brasil que avaliou prospectivamente o desempenho

deste teste no diagnóstico da dengue. A análise da sensibilidade, especificidade, valores

preditivos positivos e negativos mostram que este teste poderia entrar como rotina na

detecção viral no sistema público de saúde, visando fornecer o diagnóstico mais rápido da

dengue, o que auxiliaria no manejo da doença no Brasil, além de sua aplicação ser muito

Discussão

importante para que o diagnóstico da doença seja feito mesmo quando o paciente não

retorna pra fazer a segunda coleta, uma vez que o diagnóstico por RT-PCR que também é

feito logo no início dos sintomas apresenta um custo elevado. A aplicação deste teste como

rotina para laboratórios que já executam o diagnóstico da dengue não apresentaria grandes

aumentos nos custos, uma vez que usa os mesmos instrumentos que o MAC-ELISA, que é

o teste normalmente utilizado na rotina dos laboratórios responsáveis pelo diagnóstico de

dengue no Brasil.

Conclusões

6. CONCLUSÕES

Diante dos resultados apresentados pelo presente trabalho pode-se concluir que:

 O diagnóstico por isolamento viral apresentou a menor sensibilidade diagnóstica e

houve uma dependência significativa da positividade com precocidade da coleta das

amostras em relação ao início dos sintomas;

 A detecção de IgG foi bastante alta, 41,2%. Foi possível observar um elevado

número de pacientes que foram IgG positivos que relataram não terem tido dengue

antes e uma elevada prevalência de dengue em Ribeirão Preto;

 Analisando o percentual de positividade foi possível observar que a detecção de NS1

manteve-se constante durante os diferentes dias de coleta, tendo sido superior à

detecção pelo isolamento viral e IgM durante o início dos sintomas, e após o terceiro

dia foi superior a detecção do vírus por RT-PCR;

 Comparando-se os resultados obtidos com o teste de NS1 com os resultados da

RT-PCR em amostras IgM positivas, é possível observar que o teste de NS1

apresentou sensibilidade e especificidade maiores que a RT-PCR. Considerando-se

também os valores preditivos positivos e negativos pode-se observar o mesmo. A

acurácia do teste de NS1 foi de 79,2% e a da RT-PCR de 74,4%, demonstrando que

o teste de NS1 apresenta melhores resultados que a RT-PCR para diagnóstico de

dengue.

 O teste de NS1 também apresentou melhores resultados que a detecção de IgM

anti-dengue em amostras positivas para a RT-PCR e/ou isolamento viral.

Referências Bibliográficas

AHMED, F. U.; MAHMOOD, C. B.; SHARMA, J. D. HOQUE, S. M.; ZAMAN, R. AND HASAN, M.

S. Dengue and Dengue Haemorrhagic Fever in Children During the 2000 Outbreak in Chittagong,

Bangladesh. Dengue Bulletin. 25, 2001.

ALCON, S.; TALARMIN, A.; DEBRUYNE, M.; FALCONAR, A.; DEUBEL, V.; FLAMAND, M.

Enzyme-linked immunosorbent assay specific to dengue virus type 1 nonstructural protein NS1

reveals circulation of the antigen in the blood during the acute phase of disease in patients

experiencing primary or secondary infections. J. Clin. Microbiol. 40:376–381, 2002.

ASHBURN, P. M.; CRAIG, C. F. Experimental investigations regarding the etiology of dengue. J.

Infect. Dis. 4:440-75, 1907.

BADYOPADHYAY, S.; LUM, L. C.; KROEGER, A. Classifying dengue: a review of the difficultis in

using the WHO case classification for dengue haemorrhagic fever. Trop. Med. Int. Health

11:1238-1255, 2006.

BARNES, W.J.; ROSEN, L. Fatal hemorrhagic disease and shock associated with primary

dengue infection on a Pacific island. Am. J. Trop. Med. Hyg. 23 (3):495-506, 1974.

BARTELMA, G.; PADMANABHAN, R. Expression, purification, and characterization of the RNA

5'-triphosphatase activity of dengue virus type 2 nonstructural protein 3. Virology, 299 (1):122-

132, 2002.

BATISTA, W. C.; KASHIMA, S.; MARQUES, A. C.; FIGUEIREDO, L. T. M. Phylogenetic analysis

of Brazilian Flavivirus using nucleotide sequences of parts of NS5 gene and 3'non-coding

regions. Virus Res. 75: 35-42, 2001.

BLACKSELL, S. D.; MAMMEN, M. P.; THONGPASEUTH, S.; GIBBONS, R. V.; JARMAN, R. G.;

JENJAROEN, K.; NISALAK, A.; PHETSOUVANH, R.; NEWTON, P. N.; DAY, N. P. Evaluation of

the Panbio dengue virus nonstructural 1 antigen detection and immunoglobulin M antibody

enzyme-linked immunosorbent assays for the diagnosis of acute dengue infections in Laos.

Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 60(1):43-9, 2008.

BETHELL, D.B., FLOBBE, K., CAO, X.T., DAY, N.P., PHAM, T.P., BUURMAN, W.A., CARDOSA,

M.J., WHITE, N.J., KWIATKOWSKI, D. Pathophysiologic and prognostic role of cytokines in

dengue hemorrhagic fever. J. Infect. Dis. 177(3): 778-782. 1998.

Referências Bibliográficas

BHAMARAPRAVATI N., Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever, In: Gubler D.J., Kuno G.

(Eds.), CAB International, New York, pp. 115–132, 1997.

BIELEFELDT-OHMANN, H. Cytokines in Animal Health and Disease, In: Myers M.J., Murtaugh

M.P. (Eds.), Marcel Dekker, Inc, New York, pp. 291–332, 1995.

BIELEFELDT-OHMANN, H. Pathogenesis of dengue virus diseases: missing pieces in the jigsaw,

Trends. Microbiol. 5:409–413, 1997.

BRINTON, M. A. Replication of flavivirus. In: S. Schlesinger & M. Schlesinger (eds). The

Togaviridae and Flaviviridae, New York, Plenum Press, pp. 327-365, 1986.

BRINTON, M.; DISPOSITO, J. H. Sequenced and secondary structure analysis of the 5´-terminal

region of flavivirus genome RNA. Virology, 162:290-299, 1988.

BROOKS, A. J.; JOHANSSON, M.; JOHN, A. V.; XU, Y.; JANS, D. A.; VASUDEVAN, S. G. The

interdomain region of dengue NS5 protein that binds to the viral helicase NS3 contains

independently functional importin beta 1 and importin alpha/beta-recognized nuclear localization

signals. J. Biol. Chem. 277(39):36399-407, 2002.

BURKE, D. S.; MONATH, T. P. FLAVIVIRUSES. In: KNIPE, D. M.; HOWLEY, D. E.; GRIFFIN, S.

R.; LAMB, A.; MARTIN, M. A.; ROIZMAN, B.; STRAUS, S. E. eds. Field’s Virology, 4th ed.

Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; pp. 1043–1125, 2001.

CALISHER, C. H.; NUTI, M.; LAZUICK, J. S.; FERRARI, J. D.; KAPPUS, K. D. Dengue in the

Seychelles. Bull. World Health Organ. 59(4):619-22, 1981.

CDC, Dengue: Clinical and Public Health Aspects Table of Contents. Disponível em

<http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/dengue/slideset/set1/viii/slide03.htm>. Acesso em 17 mai

2008a.

CDC, Dengue Fever. Disponível em <http://www.cdc.gov/NCIDOD/DVBID/dengue/>. Acesso em

17 mai 2008b.

CHAMBERS, T. J.; HAHN, C. S.; GALLER, R.; RICE, C. M. Flavivirus genome organization,

expression, and replication. Annu. Rev. Microbiol. 44: 649–688, 1990.

Referências Bibliográficas

CHAN, Y. C.; KAUTNER, I. M. & LAM, S. K. The influence of antibody levels in dengue diagnosis

by polymerase chain reaction. J. Virol. Methods. 49: 315-322, 1994.

CHATURVEDI, U. C.; SHRIVASTAVA, R.; NAGAR, R. Dengue vaccines: Problems & prospects.

Indian J. Med. Res. 121:639-652, 2005.

CHERNICK, M. R.; FRIIS, R. H. Introductory Biostatistics for the Health Sciences. Published by

John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey. 406p. 2003.

CHIEN, L. J.; LIAO, T. L.; SHU, P. Y. ; HUANG, J. H.; GUBLER, D. J. AND CHANG, G. J.

Development of real-time reverse transcriptase PCR assays to detect and serotype dengue

viruses. J. Clin. Microbiol. 44:1295-1304, 2006.

CHUANSUMRIT, A.; CHAIYARATANA, W.; PONGTHANAPISITH,V.; TANGNARARATCHAKIT,

K.; LERTWONGRATH, S.; YOKSAN, S. The Use of Dengue Nonstructural Protein 1 Antigen for

the Early Diagnosis During the Febrile Stage in Patients With Dengue Infection. Pediatr. Infect.

Dis. J. 27: 43–48, 2008.

CLYDE, K.; KYLE, J. L.; HARRIS, E. Recent Advances in Deciphering Viral and Host

Determinants of Dengue Virus Replication and Pathogenesis. J. Virol. 80 (23): 11418-11431,

2006.

CONDON, R.; TALEO, G.; STEWART, T.; SWEENEY, T.; KIEDRZYNSKI, T. Dengue

surveillance in the Pacific Islands. Pac. Health Dialog. 7(2):122-6, 2000.

Dengue Diagnostics: Proceedings of an International Workshop, 4.6 October 2004, WHO/TDR

Geneva, Switzerland (TDR/IRM/DIAG/DEN/05.1). Dengue Bulletin 29: 220-227, 2005.

DE PAULA, S.O.; FONSECA, B.A.L. Dengue: a review of the laboratory tests a clinician must

know to achieve a correct diagnosis. Braz. J. Infect. Dis. 8: 390-398, 2004.

DE PAULA, S. O.; PIRES NETO, R. J.; CORREA, J. A.; ASSUMPÇÃO, S. R.; COSTA, M. L.;

LIMA, D. M.; FONSECA, B. A. L. The use of reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-

PCR) for the rapid detection and identification of dengue virus in an endemic region: a validation

study. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 96:266-269, 2002.

Referências Bibliográficas

DEUBEL, V. The contribution of molecular techniques to the diagnosis of dengue infection. In DJ

Gubler & G Kuno (eds), Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever, Cab International, Cambridge,

p. 335-366. 1997.

DURBIN, A. P., VARGAS, M. J., Wanionek, K., HAMMOND, S. N. GORDON, A., ROCHA, C.,

BALMASEDA, A., HARRIS, E, Phenotyping of peripheral blood mononuclear cells during acute

dengue illness demonstrates infection and increased activation of monocytes in severe cases

compared to classic dengue fever. Virology, 376: 429–435, 2008.

DUSSART, P.; LABEAU, B.; LAGATHU, G.; LOUIS, P.; NUNES, M. R.; RODRIGUES, S. G.;

STORCK-HERRMANN, C.; CESAIRE, R.; MORVAN, J.; FLAMAND, M.; BARIL, L. Evaluation of

an enzyme immunoassay for detection of dengue virus NS1 antigen in human serum. Clin.

Vaccine. Immunol. 13:1185–1189, 2006.

FALCONAR, A. K. The dengue virus nonstructural-1 protein (NS1) generates antibodies to

common epitopes on human blood clotting, integrin/adhesin proteins and binds to human

endothelial cells: potential implications in haemorrhagic fever pathogenesis. Arch. Virol.142:

897–916, 1997.

FALCONAR, A. K.; & YOUNG, P. R. Immunoaffinity purification of native dimer forms of the

flavivirus non-structural glycoprotein, NS1. J. Virol. Methods. 30:323–332, 1990.

FERREIRA, M. L.; CAVALCANTI, C. G.; COELHO, C. A.; MESQUITA, S. D. Manifestações

neurológicas de dengue: estudo de 41 casos. Arq. Neuropsiquiatr. 63: 488-493, 2005.

FIGUEIREDO, R. M. P.; NAVECA, F. G.; BASTOS, M. S.; MELO, M. N.; VIANA, S. S.;

MOURÃO, M. P. G.; COSTA, C. A.; FARIAS, I. P. Dengue Virus Type 4, Manaus, Brazil.

Emerging Infectious Diseases, 14(4): 667-669, 2008.

FIGUEIREDO, L. T. M.; BATISTA, W. C.; IGARASHI, A. Detection and identification of dengue

virus isolates from Brazil by a simplified reverse transcription polymerase chain reaction (RT-

PCR) method. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, 39: 79-83, 1997.

FIGUEIREDO, L. T. M.; SIMOES, M. C.; CAVALCANTE, S. M. Enzyme immunoassay for the

detection of dengue IgG and IgM antibodies using infected mosquito cells as antigen. Trans. R.

Soc. Trop. Med. Hyg. 83: 702-707, 1989.

Referências Bibliográficas

FIGUEIREDO, L. T. M.; CAVALCANTE, S. M. B.; SIMÕES, M. C. A dengue serologic survey of

school children in Rio de Janeiro, Brazil, 1986 and 1987. Bulletin of Pan American Health

Organization 24:217-225, 1990.

FIGUEROA, R.; RAMOS, C. Dengue virus (serotype 3) circulation in endemic countries and its

reappearance in America. Arch. Med. Res. 31: 429–430, 2000.

FLAMAND, M.; MEGRET, F.; MATHIEU, M.; LEPAULT, J.; REY, F. A.; DEUBEL, V. Dengue

virus type 1 nonstructural glycoprotein NS1 is secreted from mammalian cells as a soluble

hexamer in a glycosylation-dependent fashion. J. Virol. 73:6104–6110, 1999.

FONSECA, B. A. L., FIGUEIREDO, L. T. M. Dengue. Em "Tratado de Infectologia". Livraria

Atheneu, São Paulo. Editores: Ricardo Veronesi e Roberto Foccacia, 343-356, 2005.

FULOP, L.; BARRETT, A. D. T.; PHILLPOTTS, R.; MARTIN, K.; LESLIE, D. & TITBALL, R. W.

Rapid identification of flaviviruses based on conserved NS5 gene sequences. Journal of

Virological Methods 44, 179 188, 1993.

GADDIS, G.M.; GADDIS, M. L: Introduction to Biostatistics: Part 3, sensitivity, specificity,

predictive value, and hypothesis testing. Ann. Emerg. Med. 19:591-597, 1990.

GIBBONS, R. V. & VAUGHN, D. W. Dengue: an escalating problem. Bmj, 324 (7353):1563-6.

2002.

GOMES-RUIZ, A.C.; NASCIMENTO, R.T.; DE PAULA, S.O.; FONSECA B. A. L. SYBR green

and TaqMan real-time PCR assays are equivalent for the diagnosis of dengue virus type 3

infections. J. Med. Virol. 78: 760–763, 2006.

GUBLER, D. J. Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clin Microbiol Rev, 11(3): 480-96,

1998.

GUBLER, D. J. Dengue and dengue hemorrhagic fever: its history and resurgence as a global

public health problem. In: GUBLER, D.; KUNO, G. editors. Dengue and Dengue Hemorrhagic

Fever: CAB International; 1-22, 1997.

GUBLER, D. J. Epidemic dengue/dengue hemorrhagic fever as a public health, social and

economic problem in the 21st century. Trends in Microbiology. 10 (2): 100-103, 2002.

Referências Bibliográficas

GUBLER, D. J.; CLARK, G. G. Dengue/dengue hemorrhagic fever: the emergence of a global

health problem. Emerg. Infect. Dis. 1:55-57, 1995.

GUZMAN, M. G.; KOURI, G. Advances in dengue diagnosis. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3(6):

621–627, 1996.

GUZMAN, M. G.; KOURI, G. Dengue: an update. Lancet Infect. Dis. 2:33-42, 2002.

GUZMAN, M. G; KOURI, G. Dengue and dengue hemorrhagic fever in the Americas: lessons and

challenges. J. Clin. Virol. 27: 1-13, 2003.

GUZMAN, M.G.; KOURI, G. Dengue diagnosis, advances and challenges. Int. J. Infect. Dis. 8:

69-80, 2004.

GUZMAN, M. G. ; KOURI, G. P.; BRAVO, J. ; SOLER, M. ; VAZQUEZ, S. ; MORIER, L. Dengue

hemorrhagic fever in Cuba, 1981: a retrospective seroepidemiologic study. Am. J. Trop. Med.

Hyg. 42:179–84, 1990.

GUZMAN, M.G.; KOURI, G. Dengue haemorrhagic fever integral hypothesis : confirming

observations, 1987 – 2007. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and

Hygiene. 102: 522-523, 2008.

GUZMAN, M. G.; ROSARIO, D.; MUNE, M.; ALVAREZ, M.; RODRIGUEZ, R.; KOURI, G. Genetic

relatedness of the dengue 3 virus isolated in the outbreak of dengue hemorrhagic fever in

Nicaragua, 1994. Rev. Cubana Med. Trop. 48(2):114-7, 1996.

HALSTEAD, S. B. Pathogenesis of dengue: challenges to molecular biology. Science, 239: 476-

481, 1988.

HALSTEAD, S. B. Dengue in the Americas and Southeast Asia: Do they differ? Rev. Panam.

Salud. Publica. 6:407–15, 2006.

HAMMON, W. M.; RUDNICK, A.; SATHER, G.; ROGERS, K. D.; MORSE, L. J. New hemorrhagic

fevers of children in the Philippines and Thailand. Trans. Assoc. Am. Physicians, 73:140-155,

1960.

HENCHAL, E. A. & PUTNAK, J. R. The dengue viruses. Clin. Microbiol. Rev., 3 (4): 376-96,

1990.

Referências Bibliográficas

HENCHAL, E. A.; HENCHAL, L. S. & THAISOMBOONSUK. B. K. Topological mapping of unique

epitopes on the dengue-2 virus NS1 protein using monoclonal antibodies. J. Gen. Virol. 68:845–

851, 1987.

HENCHAL, E. A.; POLO, S. I.; VORNDAM, V.; YAEMSIRI, C.; INNIS, B.I.; HOKE, C.H.

Sensitivity and specificity of a universal primer set for the rapid diagnosis of dengue virus

infections by polymerase chain reaction and nucleic acid hybridization. Am. J. Trop. Med. Hyg.

45(4): 418–428, 1991.

HOBER, D.; POLI, L..; ROBLIN, B.; GESTAS, P.; CHUNGUE, E.; GRANIC, G.; IMBERT, P.;

PECARERE, J.L.; VERGEZ-PASCAL, R.; WATTRE, P.; MANIEZ-MONTREUIL, M. Serum levels of

tumor necrosis factor- (TNF-), interleukin-6 (IL-6) and interleukin-1 (IL-1) in dengue-infected

patients. Am. J. Trop. Med. Hyg., 48(3):324-331, 1993.

INNIS, B. L.; NISALAK, A.; NIMMANNITYA, S.; KUSALERDCHARIYA, S.; CHONGSWASDI, V.;

SUNTAYAKORN, S.; PUTTISRI, P.; & HOKE, C. H. An enzyme linked immunosorbent assay to

characterize dengue infections where dengue and Japanese encephalitis co-circulate. Am. J.

Trop. Med. Hyg. 40: 418–427, 1989.

JESSIE, K.; FONG, M. Y., DEVI, S.; LAM, S. K. ; WONG, K. T. Localization of dengue virus in

naturally infected human tissues, by immunohistochemistry and in situ hybridization. J. Infect.

Dis. 189 (8):1411-8, 2004.

JOHANSSON, M.; BROOKS, A. J.; JANS, D. A.; VASUDEVAN, S. G. A small region of the

dengue virus-encoded RNA-dependent RNA polymerase, NS5, confers interaction with both the

nuclear transport receptor importin-beta and the viral helicase, NS3. J. Gen. Virol. 82(Pt 4):735-

45, 2001.

KALAYANAROOJ, S.; VAUGHN, D. W.; NIMMANNITYA, S.; GREEN, S.; SUNTAYAKORN, S.;

KUNENTRASAI, N.; VIRAMITRACHAI, W.; RATANACHU-EKE, S.; KIATPOLPOJ, S.; INNIS, B.

L.; ROTHMAN, A. L.; NISALAK, A.; ENNIS, F. A. Early clinical and laboratory indicators of acute

dengue illness. J. Infect. Dis. 176:313-321, 1997.

KANESA-THASAN, N.; IACONO-CONNORS, L.; MAGILL, A.; SMOAK, B.; VAUGHN, D.;

DUBOIS, D.; BURROUS, J.; HOKE, C. Dengue serotypes 2 and 3 in US forces in Somalia.

Lancet, 343(8898):678, 1994.

Referências Bibliográficas

KIMURA, R.; HOTTA, S. Studies on Dengue fever (VI). On the inoculation of dengue virus into

mice. (In Japanese). Nippon Igaku, 3379: 629-633, 1944.

KORAKA, P.; BURGHOORN-MAAS, C. P.; FALCONAR, A.; SETIATI, T. E.; DJAMIATUM, K.;

GROEN, J. & OSTERHAUS, A. D. Detection of immune-complex-dissociated nonstructural-1

antigen in patients with acute dengue virus infections. J. Clin. Microbiol. 41:4154–4159, 2003.

KOU, Z.; QUINN, M.; CHEN, H.; RODRIGO, S. I.; ROSE, R. C.; SCHLESINGER, J. J.; JIN, X.

Monocytes, but not T or B cells, are the principal target cells for dengue virus (DV) infection

among human peripheral blood mononuclear cells. Journal of Medical Virology. 80:134–146,

2008.

KUHN, R. J.; ZHANG, W.; ROSSMANN, M. G.; PLETNEV, S. V.; CORVER, J.; LENCHES, E.;

JONES, C. T.; MUKHOPADHYAY, S.; CHIPMAN, P. R.; STRAUSS, E. G.; BAKER, T. S.;

STRAUSS, J. H. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation,

and fusion. Cell, 108 (5): 717-25. 2002.

KUMARASAMY, V.; ABDUL WAHAB, A. H. A,; CHUAB, S. K.; HASSAN, Z. A.; CHEMA, Y. K.;

MOHAMADA, M.; CHUAA, K. B. Evaluation of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA

for laboratory diagnosis of acute dengue virus infection. J. Virol. Methods, 140: 75–79, 2007a.

KUMARASAMY, V.; CHUA, S. K.; HASSAN, Z.; WAHAB, A. H. A.; CHEM, Y. K.; MOHAMAD, M.;

CHUA, K. B. Evaluating the sensitivity of a commercial dengue NS1 antigencapture ELISA for

early diagnosis of acute dengue virus infection. Singapore Med. J. 48 (7) : 669, 2007b.

KUNO, G.; GUBLER, D.J. AND SANTIAGO DE WEIL, N. Antigen capture ELISA for the

identification of dengue viruses. J. Virol. Methods. 12: 93–103, 1985.

LANCIOTTI, R. S.; CALISHER, C. H.; GUBLER, D. J.; CHANG, G. J. AND VORNDAM, A.V.

Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse

transcriptase-polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 30(3): 545–551, 1992.

LAPPHRAA, K.; SANGCHARASWICHAIA, A.; CHOKEPHAIBULKITA, K.; TIENGRIMA, S.;

PIRIYAKARNSAKULA, W.; CHAKORNA, T.; YOKSANB, S.; WATTANAMONGKOLSILA, L.;

THAMLIKITKULA, V. Evaluation of an NS1 antigen detection for diagnosis of acute dengue

infection in patients with acute febrile illness. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease

60: 387–391, 2008.

Referências Bibliográficas

LEITMEYER, K. C.; VAUGHN, D. W.; WATTS, D. M.; SALAS, R.; VILLALOBOS, D. E.;

CHACON, I.; RAMOS, C.; RICO-HESSE, R. Dengue virus structural differences that correlate

with pathogenesis. J. Virol. 73: 4738–4747, 1999.

LIBRATY, D. H.; YOUNG, P. R.; PICKERING, D.; ENDY, T. P.; KALAYANAROOJ, S.; GREEN,

S, VAUGHN, D. W.; NISALAK, A.; ENNIS, F. A.; ROTHMAN, A. L. High circulating levels of the

dengue virus nonstructural protein NS1 early in dengue illness correlate with the development of

dengue hemorrhagic fever. J. Infect. Dis. 186(8):1165-8, 2002.

LOKE, H.; BETHELL, D.; PHUONG C. X.; DAY, N.; WHITE, N.; FARRAR, J.; HILL, A.

Susceptibility to dengue hemorrhagic fever in vietnam: evidence of an association with variation

in the vitamin D receptor and Fc gamma receptor IIa genes. Am. J. Trop. Med. Hyg. 67:102–6,

2002.

LOURENÇO-DE-OLIVEIRA, R., N. A. HONORIO, CASTRO, M. G.; SCHATZMAYR, H. G.;

MIAGOSTOVICH, M. P.; ALVES, J. C. R.; SILVA, W. C.; LEITE, P. J.; NOGUEIRA, R. M. R.

Dengue virus type 3 isolation from Aedes aegypti in the municipality of Nova Iguacu, State of Rio

de Janeiro. Mem Inst Oswaldo Cruz. 97(6): 799-800, 2002.

MACKENZIE, J. S.; GUBLER, D. J.; PETERSEN, L. R. Emerging flaviviruses: the spread and

resurgence of Japanese encephalitis, West Nile and dengue viruses. Nat. Med. 10 (12): S98-109,

2004.

MAIRUHU, A. T.; MAC GILLAVRY, M. R.; SETIATI, T. E.; SOEMANTRI, A.; TEN CATE, H.;

BRANDJES, D. P.; VAN GORP, E. C. Is clinical outcome of dengue virus infections influenced by

coagulation and fibrinolysis? A critical review of the evidence. Lancet Infect. Dis. 3:33-41, 2003.

MALAVIGE, G. N.; FERNANDO, S.; FERNANDO, D. J.; SENEVIRATNE, S.L. Dengue viral

infections. Postgrad. Med. J. 80: 588-601, 2004.

MESSER, W. B.; VITARANA, U. T.; SIVANANTHAN, K.; ELVTIGALA, J.; PREETHIMALA, L. D.;

RAMESH, R.; WITHANA, N.; GUBLER, D. J.; DE SILVA, A.M. Epidemiology of dengue in Sri

Lanka before and after the emergence of epidemic dengue hemorrhagic fever. Am. J. Trop.

Med. Hyg.;66(6):765-73. 2002.

MESSER, W.B.; GUBLER, D. J.; HARRIS, E.; SIVANANTHAN, K.; DE SILVA, A. M. Emergence

and global spread of a dengue serotype 3, subtype III virus. Emerg. Infect. Dis.;9(7):800-9.

2003.

Referências Bibliográficas

Ministério da Saúde. Dengue: diagnóstico e manejo clínico – Adulto e Criança / Ministério da

Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde, Diretoria Técnica de Gestão. – 3. ed. – Brasília :

Ministério da Saúde, 2007. 28 p.

MIAGOSTOVICH, M. P.; DOS SANTOS, F. B.; DE SIMONE, T. S.; COSTA, E. V.; FILIPPIS, A.

M.; SCHATZMAYR, H. G.; NOGUEIRA, R. M. Genetic characterization of dengue virus type 3

isolates in the State of Rio de Janeiro, 2001. Braz J Med Biol Res, 35 (8): 869-72. 2002.

MODIS, Y., S. OGATA, ET AL. A ligand-binding pocket in the dengue virus envelope

glycoprotein. Proc. Natl. Acad. Sci. 100 (12): 6986-91, 2003.

MONGKOLSAPAYA, J.; DEJNIRATTISAI, W.; XU, X. N.; VASANAWATHANA, S.;

TANGTHAWORNCHAIKUL, N.; CHAIRUNSRI, A.; SAWASDIVORN, S.; DUANGCHINDA, T.;

DONG, T.; ROWLAND-JONES, S.; YENCHITSOMANUS, P. T.; MCMICHAEL, A.; MALASIT, P.;

SCREATON, G. Original antigenic sin and apoptosis in the pathogenesis of dengue hemorrhagic

fever. Nat. Med. 9 (7): 921–927. 2003.

MONATH, T.P. Dengue: The risk to developed and developing countries. Proc. Natl. Acad. Sci.

91: 2395-2400, 1994.

MONATH, T. P.; BALLINGER, M. E.; MILLER, B.R. AND SALAUN, J.J. Detection of yellow fever

viral RNA by nucleic acid hybridization and viral antigen by immunocytochemistry in fixed human

liver. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 40: 663–668, 1989.

MONTENEGRO, D.; LACERDA, H. R.; LIRA, T. M.; OLIVEIRA, D. S.; LIMA, A. A.; GUIMARÃES,

M. J.; VASCONCELOS, P. G. Aspectos clínicos e epidemiológicos da epidemia de dengue no

Recife, PE, em 2002. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 39: 9-13, 2006.

MUKHOPADHYAY, S.; KUHN, R. J.; ROSSMANN, M. G. A structural perspective of the flavivirus

life cycle. Nat Rev Microbiol, 3 (1): 13-22. 2005.

MURPHY, F. A. (1980). Togavirus morphology and morphogenesis. In The Togaviruses : Biology,

Structure, Replication, pp. 214±316. Edited by R. W. Schlesinger. New York: Academic Press.

NASCIMENTO, R. T. Análise clínica e laboratorial de casos suspeitos de dengue e

correlação da gravidade destes casos com níveis séricos de citocinas circulantes e carga

viral do vírus dengue. 2007.109 f. Dissertação (Mestrado em Medicina) – Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007.

Referências Bibliográficas

NARAYANAN, M.; ARAVIND, M. A.; THILOTHAMMMAL, N.; PREMA, R.; SARGUNAM, C. S. R.;

RAMAMURTY, N. Dengue fever epidemic in Chennai – A study of clinical profile and outcome.

Indian Pediatr. 39: 1027-33, 2002.

NOGUEIRA, R. M., M. P. MIAGOSTOVICH, LAMPE, E.; SCHATZMAYR, H.G. Isolation of

dengue virus type 2 in Rio de Janeiro. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 85 (2): 253. 1990.

NOGUEIRA, R. M., S. M. ZAGNER, MARTINS, I. S.; LAMPE, E.; MIAGOSTOVICH, M. P.;

SCHATZMAYR, H. G. Dengue haemorrhagic fever/dengue shock syndrome (DHF/DSS) caused

by serotype 2 in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, 86 (2): 269. 1991.

NOGUEIRA, R. M.; MIAGOSTOVICH, M. P.; LAMPE, E.; SOUZA, R. W.; ZAGNE, S. M.;

SCHATZMAYR, H. G. Dengue epidemic in the stage of Rio de Janeiro, Brazil, 1990-1: co-

circulation of dengue 1 and dengue 2 serotypes. Epidemiol Infect, 111(1): 163-70. 1993.

NOGUEIRA, R. M.; MIAGOSTOVICH, M. P.; SCHATZMAYR, H. G.; MORAES, G. C.;

CARDOSO, M. A.; FERREIRA, J.; CERQUEIRA, V.; PEREIRA, M. Dengue type 2 outbreak in the

south of the state of Bahia, Brazil: laboratorial and epidemiological studies. Rev Inst Med Trop

São Paulo. 37(6):507–10. 1995.

NOGUEIRA, R. M.; SCHATZMAYR, H. G.; DE FILIPPIS, A. M.; DOS SANTOS, F. B.; DA

CUNHA, R. V.; COELHO, J. O.; DE SOUZA, L. J.; GUIMARÃES, F. R.; DE ARAÚJO, E. S.; DE

SIMONE, T. S.; BARAN, M.; TEIXEIRA, G.; MIAGOSTOVICH, M. P. Dengue virus type 3 in

Brazil, 2002. Emerg Infect Dis. 11:1376–81. 2005.

NOGUEIRA, R. M., MIAGOSTOVICH, M. P.; DE FILIPPIS, A.M.; PEREIRA, M.A.;

SCHATZMAYR, H. G. Dengue virus type 3 in Rio de Janeiro, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz,

96 (7): 925-6. 2001.

NUEGOONPIPAT, A.; BERLIOZ-ARTHAUD, A.; CHOW, V.; ENDY, T.; LOWRY, K.; MAI LE, Q.;

NINH, T. U.; PYKE, A.; REID, M.; REYNES, J. M.; SU YUN, S. T.; THU, H.M.; WONG, S. S.;

HOLMES, E. C.; AASKOV, J. Sustained transmission of dengue virus type 1 in the Pacific due to

repeated introductions of different Asian strains. Virology;329(2):505-12. 2004.

NUNES-ARAUJO, F. R.; FERREIRA, M. S.; NISHIOKA, S. D. Dengue fever in Brazilian adults

and children: assessment of clinical findings and their validity for diagnosis. Ann. Trop. Med.

Parasitol. 97: 415-419, 2003.

Referências Bibliográficas

OCAZIONEZ, R. E.; CORTES, F. M.; VILLAR, L. A.; GOMEZ, S. Y. Temporal distribution of

dengue virus serotypes in Colombian endemic area and dengue incidence. Reintroduction of

dengue-3 associated to mild febrile illness and primary infection. Mem. Inst. Oswaldo Cruz.

101:725–31, 2006.

PAHO. Dengue in the Caribbean, 1977. Proceedings of a Workshop held in Montego Bay,

Jamaica, 8-11 May, 1978. PAHO Scientific Publication 375. 1979.

PAHO - Pan American Health Organization 1994. Dengue and dengue hemorrhagic fever in the

Americas: Guidelines for prevention and control. (Cient. Pub. n. 548), 98 pp.

PALUCKA, A. K. Dengue Virus and Dendritic Cells. Nat. Med. 6:748-749, 2000.

PINHEIRO, F. P. Dengue in the Americas, 1980-1987. Epidemiol. Bull. 10: 1, 1989.

Prefeitura Municipal de Ribeirão Preto. Secretaria Municipal de Saúde. Departamento de

Vigilância em Saúde e Planejamento. Plano Municipal de Contigência para epidemias de febre

hemorrágica da dengue (FHD). Disponível em

<http://www.ribeiraopreto.sp.gov.br/ssaude/vigilancia/vigep/dengue/i16planocont.pdf>. Acesso

em 20 mai. 2008.

RAENGSAKULRACH, B.; NISALAK, A.; MANEEKARN, N.; YENCHITSOMANUS, P. T.;

LIMSOMWONG, C.; JAIRUNGSRI, A.; THIRAWUTH, V.; GREEN, S.; KALAYANAROOJ, S.;

SUNTAYAKORN, S.; SITTISOMBUT, N.; MALASIT, P.; VAUGHN, D. Comparison of four reverse

transcription-polymerase chain reaction procedures for the detection of dengue virus in clinical

specimens. Journal of Virological Methods 105: 219–232, 2002.

REY, F. A. Dengue virus envelope glycoprotein structure: new insight into its interactions during

viral entry. Proc. Natl. Acad. Sci. 100(12): 6899-901, 2003.

RICO-HESSE, R. Molecular evolution and distribution of dengue viruses type 1 and 2 in nature.

Virology 174(2):479-93, 1990.

RICCO-HESSE, R.; HARRISON, L.; SALAS, R.; TOWAR, D.; NISSALAK, A.; RAMOS, C.;

BOSHELL, J.; DE MESA, M. R.; NOGUEIRA, R.; TRAVASSOS DA ROSA, A. Origins of dengue

type 2 viruses associated with increased pathogenicity in the Americas. Virology 230: 244–251,

1997.

Referências Bibliográficas

RIGAU-PÉREZ, J. G. ; CLARK, G. G. ; GUBLER, D. J. ; REITER, P.; SANDERS, E. J.;

VORNDAM, A. V. Dengue and dengue haemorrhagic fever. Lancet, 352 (9132): 971-7, 1998.

ROCCO, I. M., KAVAKAMA, B. B.; SANTOS, C. L. First isolation of dengue 3 in Brazil from an

imported case. Rev Inst Med Trop Sao Paulo, 43 (1): 55-7. 2001.

RODIER, G. R.; PARRA, J. P.; KAMIL, M.; CHAKIB, S. O.; COPE, S. E. Recurrence and

emergence of infectious diseases in Djibouti city. Bull. World. Health. Organ. 73(6):755-9, 1995.

RODHAIN, F.; ROSEN, L. Chapter 3. Mosquito vectors and dengue virus-vector relationships. In:

Gubler D, Kuno G, editors. Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever: CAB International; 1997. p.

1-22.

RODRIGUES, E. M. S.; DAL-FABRO, A. L.; SALOMAO, R.; FERREIRA, I. B.; ROCCO, I. M.;

FONSECA, B. A. L. Epidemiologia da infecção pela dengue em Ribeirão Preto, SP, Brasil. Rev.

Saude Pública 36:160-165, 2002.

ROTHMAN, A. L. Dengue: defining protective versus pathologic immunity. J. Clin. Invest. 113(7):

946–951, 2004.

ROTHMAN A. L., ENNIS F.A. Immunopathogenesis of Dengue Hemorrhagic Fever. Virology,

257(1-6): 1-6. 1999.

SABIN, A. B.; SCHLESINGER, M. C. Production of immunity to dengue vírus with vírus modified

by propagation in mice. Science, 101:640-642, 1945.

SABIN, A. B. Research on dengue during World War II. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1(1):30-50,

1952.

SAKUNTABHAI, A.; TURBPAIBOON, C.; CASADÉMONT, I.; CHUANSUMRIT, A.; LOWHNOO,

T.; KAJASTE-RUDNITSKI, A.; KALAYANAROOJ, S. M.; TANGNARARATCHAKIT, K.;

TANGTHAWORNCHAIKUL, N.; VASANAWATHANA, S.; CHAIYARATANA, W.;

YENCHITSOMANUS, P. T.; SURIYAPHOL, P.; AVIRUTNAN, P.; CHOKEPHAIBULKIT, K.;

MATSUDA, F.; YOKSAN, S.; JACOB, Y.; LATHROP, G. M.; MALASIT, P.; DESPRÈS, P.;

JULIER, C. A variant in the CD209 promoter is associated with severity of dengue disease. Nat.

Genet. 37: 507–513, 2005.

Referências Bibliográficas

SCHATZMAYR, H. G.; NOGUEIRA, R. M.; TRAVASSOS DA ROSA, A. P. An outbreak of dengue

virus at Rio de Janeiro--1986. Mem Inst Oswaldo Cruz, 81 (2): 245-6, 1986.

SCHERER, W.F. The complexity of arbovirus nomenclature: a proposal to simplify it. Am. J.

Epidemiology 88: 145-146, 1968.

Secretaria de Vigilância em Saúde. Informe Epidemiológico da Dengue, Janeiro a Abril de 2008.

Disponível em: <http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/boletim_dengue_maio2008.pdf>.

Acesso em: 03 mai. 2008.

Secretaria de Vigilância em Saúde. Informe Epidemiológico da Dengue, Janeiro a Dezembro de

2007.Disponível em <http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/boletim_dengue_010208.pdf>.

Acesso em: 03 mai. 2008.

SENEVIRATNE, S. L.; MALAVIGE, G. N.; DE SILVA, H. J. Pathogenesis of liver involvement

during dengue viral infections. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 100: 608-614, 2006.

SIQUEIRA, J. B. J.; TURCHI MARTELLI, C. M.; EVALIM COELHO, G.; DA ROCHA SIMPLICIO,

A. C.; HATCH, D. L. Dengue and dengue hemorrhagic fever, Brazil, 1981–2002. Emerg. Infect.

Dis. 11: 48–53, 2005.

SHU, P. Y.; CHANG, S. F.; KUO, Y. C.; YUEH, Y. Y.; CHIEN, L. J.; SUE, C. L.; LIN, T. H.. AND

HUANG, J. H. Development of group- and serotype-specific one-step SYBR Green I-based real-

time reverse transcription-PCR assay for dengue virus. J. Clin. Microbiol. 41: 2408-2416, 2003.

SOLOMON, T.; DUNG, N. M.; VAUGHN, D. W.; KNEEN, R.; THAO, L. T.; RAENGSAKULRACH,

B.; LOAN, H. T.; DAY, N. P.; FARRAR, J.; MYINT, K. S.; WARRELL, M. J.; JAMES, W. S.;

NISALAK, A.; WHITE, N. J. Neurological manifestations of dengue infection. Lancet. 335:1053-

1059, 2000.

SOUZA, L. J.; ALVES, J. G,; NOGUEIRA, R. M.; GICOVATE, N. C.; BASTOS, D. A.; SIQUEIRA,

E. W.; SOUTO FILHO, J. T.; CEZARIO, T. A.; SOARES, C. E.; CARNEIRO, R.C.

Aminotransferase changes and acute hepatitis in patients with dengue fever: analysis of 1,585

cases. Braz. J. Infect. Dis. 8:156-164, 2004.

STEPHENSON, J.R. Understanding dengue pathogenesis: implications for vaccine design. Bull.

World Health Organ. 83(4):308-14, 2005.

Referências Bibliográficas

SYDOW, F. F. VON.; SANTIAGO, M. A.; NEVES-SOUZA, P. C.; CERQUEIRA, D. I. S.;

GOUVEA, A. S.; LAVATORI, M. F. H., BERTHO, A. L., KUBELKA, C. F. Comparison of Dengue

Infection in Human Mononuclear Leukocytes with Mosquito C6/36 and Mammalian Vero Cells

Using Flow Cytometry to Detect Virus Antigen. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95(4): 483-489, 2000.

TAKEDA, A.; ENNIS, F. A. FcR-mediated enhancement of HIV-1 infection by antibody. AIDS

Res. Hum. Retroviruses, 6: 999-1004. 1990.

TAUIL, P. L. Aspectos críticos do controle de dengue no Brasil. Cad. Saúde Pública. 18: 867-

871, 2002.

TEIXEIRA, M. G.; COSTA, M. C. N.; BARRETO, M. L.; MOTA, E. Dengue and dengue

hemorrhagic fever epidemics in Brazil: what research is needed based on trends, surveillance,

and control experiences? Cad. Saúde Pública, 21: 307-1315, 2005.

USUKU, S.; CASTILLO, L.; SUGIMOTO, C.; NOGUCHI, Y.; YOGO, Y.; KOBAYASHI, N.

Phylogenetic analysis of dengue-3 viruses prevalent in Guatemala during 1996-1998. Arch.

Virol. 146: 1381-1390, 2001.

VASCONCELOS, P. F.; E. S. TRAVASSOS DA ROSA, TRAVASSOS DA ROSA, J. F.; DE

FREITAS, R. B.; DÉGALLIER, N.; RODRIGUES, S. G.; TRAVASSOS DA ROSA, A. P. Outbreak

of classical fever of dengue caused by serotype 2 in Araguaiana, Tocantins, Brazil. Rev Inst Med

Trop Sao Paulo, v.35, n.2, Mar-Apr, p.141-8. 1993.

VASCONCELOS, P. F. C, LIMA, J. W. O.; TRAVASSOS DA ROSA, A. P. A.; TIMBÓ, M. J.;

TRAVASSOS DA ROSA, E. S.; LIMA, H. R.; RODRIGUES, S. G.; TRAVASSOS DA ROSA, J. F.

S. Epidemia de dengue em Fortaleza, Ceará: inquérito soro epidemiológico aleatório. Revista de

Saúde Pública. 32:447-454, 1998.

VASCONCELOS, P. F. C.; LIMA, J. W. O.; RAPOSO, M. L.; RODRIGUES, S. G.; TRAVASSOS

DA ROSA, J. F. S.; AMORIM, S. M. C.; TRAVASSOS DA ROSA, E. S.; MOURA, C. M. P.;

FONSECA, N.; TRAVASSOS DA ROSA, A. P. A. Inquérito soro-epidemiológico na Ilha de São

Luís durante epidemia de dengue no Maranhão. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina

Tropical. 32:171-179, 1999.

VASCONCELOS, P. F C.; MOTA, K.; STRAATMANN, A.; SANTOS-TORRES, S.; TRAVASSOS

DA ROSA, A. P. A. E NETO, J. T. Epidemia de dengue em Ipupiara e Prado, Bahia. Inquérito

Referências Bibliográficas

soro-epidemiológico. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 33(1):61-67,

2000.

VAUGHN, D. W.; GREEN, S.; KALAYANAROOJ, S.; INNIS, B. L.; NIMMANNITYA, S.;

SUNTAYAKORN, S.; ENDY, T. P.; RAENGSAKULRACH, B.; ROTHMAN, A. L.; ENNIS, F. A.;

NISALAK, A. Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with

disease severity. J. Infect. Dis. 181:2–9, 2000.

VAUGHN, D. W.; GREEN, S.; KALAYANAROOJ, S.; INNIS, B. L.; NIMMANNITYA, S.;

SUNTAYAKORN, S.; ROTHMAN, A. L.; ENNIS, F. A.; NISALAK, A. Dengue in the early febrile

phase: viremia and antibody responses. J. Infect. Dis. 176:322–330, 1997.

VORNDAM V.; KUNO, G. Laboratory diagnosis of dengue virus infections. In: D.J. Gubler and G.

Kuno, Editors, Dengue and dengue hemorrhagic fever, CAB International, London (1997), pp.

313–334.

WATTS, D. M.; PORTER, K. R.; PUTVATANA, P.; VASQUEZ, B.; CALAMPA, C.; HAYES, C. G.;

HALSTEAD, S. B. Failure of secondary infection with American genotype dengue 2 to cause

dengue hemorrhagic fever. Lancet 354: 1431–1434, 1999.

WELSH, R. M .; ROTHMAN, A. L. Dengue immune response: low affinity, high febrility. Nature

Medicine. 9: 820 – 822, 2003.

WENGLER, G.; WENGLER, G. Terminal sequences of the genome and replication form RNA of

the flavivirus West Nile virus; absence of poly(A) and possible role in RNA replication. Virology

113: 544-594, 1981.

WESTAWAY, E. G.; BRINTON, M. A.; GAIDAMOVICH, S. Y.; HORZINEK, M. C.; IGARASHI, A.;

KAARIAINEN, L.; LVOV, D. K.; PORTERFIELD, J. E.; RUSSELL, P. K.; TRENT, D. W.

Flaviviridae. Intervirology 24: 183-192, 1985.

WHITE, N. J. Variation in virulence of dengue virus. Lancet 354: 1401–1402, 1999.

WHO. Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment and control. Geneva: World Health

Organization; p. 12–23, 1997.

Referências Bibliográficas

WHO. Dengue, dengue haemorrhagic fever and dengue shock syndrome in the context of the

Integrated Management of Childhood Illness. Geneva, World Health Organization

(WHO/FCH/CAH/05.13), 2005.

WILLS, B. A.; NGUYEN, M. D.; HA, T. L.; DONG, T. H.; TRAN, T. N.; LE, T. T.; TRAN, V. D.;

NGUYEN, T. H.; NGUYEN, V. C.; STEPNIEWSKA, K.; WHITE, N. J.; FARRAR, J. J. Comparison

of three fluid solutions for resuscitation in dengue shock syndrome. N. Engl. J. Med. 353:877-89,

2005.

WU, S. J.; GROUARD-VOGEL, G.; SUN, W.; MASCOLA, J. R.; BRACHTEL, E.; PUTVATANA,

R.; LOUDER, M. K.; FILGUEIRA, L.; MAROVICH, M. A.; WONG, H. K.; BLAUVELT, A.;

MURPHY, G. S.; ROBB, M. L.; INNES, B. L.; BIRX, D. L.; HAYES, C. G. & FRANKEL, S. S.

Human skin Langerhans cells are targets of dengue virus infection. Nature Medicine, 6 (7): 816-

820, 2000.

XU, H.; DI, B.; PAN, Y. X.; QIU, L. W.; WANG, Y. D.; HAOW HE, L. J.; YUEN, K. Y.; CHE, X. Y.

Serotype 1-specific monoclonal antibody-based antigen capture immunoassay for detection of

circulating nonstructural protein NS1: implications for early diagnosis and serotyping of dengue

virus infections. J. Clin. Microbiol. 44:2872–2878, 2006.

YOUNG, P. R.; HILDITCH, P. A.; BLETCHLY, C. AND HALLORAN. W. An antigen capture

enzyme-linked immunosorbent assay reveals high levels of the dengue virus protein NS1 in the

sera of infected patients. J. Clin. Microbiol. 38:1053–1057, 2000.

ZIVNA, I.; GREEN, S.; VAUGHN, D. W.; KALAYANAROOJ, S.; STEPHENS, H. A.;

CHANDANAYINGYONG, D.; NISALAK, A.; ENNIS, F. A.; ROTHMAN, A.L. T cell responses to an

HLA-B*07-restricted epitope on the dengue NS3 protein correlate with disease severity, J.

Immunol. 168: 5959–5965, 2002.

Anexos

8. ANEXOS

ANEXO A – Parecer do comitê de ética em pesquisa do HC.

Anexos

ANEXO B – Parecer da diretoria acadêmica do CSE.

Anexos

ANEXO C – Termo de consentimento apresentado aos pacientes participantes deste

estudo.

HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA

DE RIBEIRÃO PRETO DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

CEP. 14048-900

RIBEIRÃO PRETO - S.P.

B R A S I L

CAMPUS UNIVERSITÁRIO - MONTE ALEGRE

FONE: 602-1000 - FAX (016) 633-1144

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Convidamos o senhor(a) a participar do nosso estudo sobre Dengue.

Nome do Estudo:

ESTUDO DA IMUNOPATOGÊNESE E ASPECTOS VIRAIS ENVOLVIDOS NAS

DIFERENTES MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA DENGUE

Pesquisadores responsáveis: Benedito Antônio Lopes da Fonseca

Luiza Antunes de Castro

Telefones para contato 0xx16 3602-4508 (laboratório)

0xx16 3602-3251

ESCLARECIMENTOS AO SUJEITO DA PESQUISA

A Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, visando estudar o vírus da Dengue, está

executando pesquisa em pacientes com manifestações da doença. O vírus do Dengue é

transmitido pela picada de pernilongo contaminado e a pessoa picada pode passar a ter febre alta,

dor de cabeça, dor nos olhos, nos músculos, nas juntas e podem aparecer manchas vermelhas

pelo corpo. A pessoa fica com falta de apetite e sente muita fraqueza, sem vontade para nada.

Estes são os principais sintomas da dengue comum, mas existe uma outra, mais grave, que é a

dengue hemorrágica. Os sintomas iniciais são os mesmos da dengue comum. A diferença é que,

quando a febre acaba, começam a surgir sangramentos, a pressão cai, dando origem à tontura, os

lábios ficam roxos e a pessoa, além de sentir fortes dores no abdômen, alterna sonolência com

agitação. A dengue hemorrágica é muito perigosa se a pessoa não procurar um hospital para ser

atendido e, pode levar à morte. Com este estudo pretendemos entender melhor como este

micróbio se comporta e quais são as alterações que ele causa no sangue e no corpo das pessoas.

Estas informações poderão ajudar no desenvolvimento de remédios e tratamentos adequados

para curar a doença mais facilmente. Além disso, este estudo pretende identificar se existe algum

fator hereditário (que é herdado dos pais para os filhos) que faça com que determinadas pessoas

Anexos

tenham a doença mais grave (tenham sintomas mais fortes) que outras. Caso o senhor(a)

concorde em participar desta pesquisa, serão coletados 20mL do seu sangue com uma picada no

braço. Daremos preferência para coletar o sangue no mesmo momento em que o seu médico

também precisar do seu sangue para os exames de acompanhamento do tratamento. Os

desconfortos relacionados com esta pesquisa estão associados com a picada da agulha para

retirar o sangue e o tempo que será gasto para realizar as perguntas sobre a sua doença. Os

benefícios estão relacionados com a possível melhora do entendimento das causas da doença,

favorecendo um melhor tratamento para o Sr./Sra., ou ainda, para todos os pacientes com a

doença.

Gostaríamos de esclarecer que a sua participação no estudo é voluntária e caso o

senhor(a) deseje abandonar o estudo, não haverá qualquer tipo de constrangimento, bem como

em nada mudará o seu acompanhamento neste hospital. Vale lembrar que em qualquer fase da

pesquisa, sua identidade será sempre mantida em sigilo.

abaixo assinado, tendo sido devidamente esclarecido sobre todas as condições que constam do

documento “ESCLARECIMENTOS AO SUJEITO DA PESQUISA”, de que trata o Projeto de Pesquisa

intitulado “ESTUDO DA IMUNOPATOGÊNESE E ASPECTOS VIRAIS ENVOLVIDOS NAS

DIFERENTES MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS DA DENGUE” que tem como pesquisador responsável

a Srta. Luiza Antunes de Castro, especialmente no que diz respeito ao objetivo da pesquisa, aos

procedimentos a que serei submetido, aos riscos e aos benefícios, à forma de ressarcimento no caso

de eventuais despesas, bem como a forma de indenização por danos decorrentes da pesquisa,

declaro que tenho pleno conhecimento dos direitos e das condições que me foram assegurados, a

seguir relacionados:

1. A garantia de receber resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento de qualquer dúvida a

respeito dos procedimentos, riscos, benefícios e de outras situações relacionadas com a

pesquisa.

2. A liberdade de retirar o meu consentimento e deixar de participar do estudo, a qualquer

momento, sem que isso traga prejuízo à continuidade do meu tratamento.

3. A segurança de que não serei identificado e que será mantido o caráter confidencial da

informação relacionada a minha privacidade.

4. O compromisso de que me será prestada informação atualizada durante o estudo, ainda que

esta possa afetar a minha vontade de continuar dele participando.

5. O compromisso de que serei devidamente acompanhado e assistido durante todo o período

de minha participação no projeto, bem como de que será garantida a continuidade do meu

tratamento, após a conclusão dos trabalhos da pesquisa.

6. O ressarcimento de eventuais despesas decorrentes da minha participação no projeto será

absorvido pelo orçamento da pesquisa, não cabendo ao Hospital das Clínicas de Ribeirão

Preto, qualquer responsabilidade quanto ao referido pagamento.

Anexos

100

7. Como já mencionado, o único desconforto está relacionado com a picada da agulha para

retirada do sangue, nenhum procedimento extra que possa causar algum dano será aplicado.

Declaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que me foram apresentadas e

que, livremente, manifesto a minha vontade em participar do referido projeto.

______________________________________________

Assinatura do Paciente

______________________________________________

Assinatura do Pesquisador

Ribeirão Preto, de de .

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