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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
CENTRO POLITÉCNICO
SETOR DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
Expressão gênica diferencial em ostras Crassostrea gigas expostas a esgoto
doméstico não tratado
IGOR DIAS MEDEIROS
Curitiba – 2008
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i
IGOR DIAS MEDEIROS
EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM OSTRAS Crassostrea gigas
EXPOSTAS A ESGOTO DOMÉSTICO NÃO TRATADO
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Celular e
Molecular, Departamento de Biologia
Celular, Setor de Ciências Biológicas,
Universidade Federal do Paraná, como
requisito parcial à obtenção do título de
Doutor em Biologia Celular e Molecular.
Orientador: Afonso Celso Dias Bainy, Dr.
CURITIBA
2008
ii
À Simone, Natan e Matias,
pra sempre galera!
iii
Agradecimentos
Gostaria de agradecer a todas as pessoas que contribuíram para a
realização desse trabalho, em especial:
- ao Afonso, pela oportunidade, amizade e confiança depositada em mais essa
parceria. Muito obrigado pela orientação, mas principalmente, pelo exemplo!
- aos colegas de projeto, que tornaram possível a realização de cada uma das
etapas desta tese: Guilherme, Marília, Dani, Juliano, Fabrício, Nina e Thiago;
- ao demais companheiros do lab, em especial à Isabel, Juliana e Taíse, pela
iniciação em biomol, e também à Riso, Jacó, Karin, Ana Paula, Talita, Daniela,
por estarem sempre presentes. Aqui entra também o Alcir, Jeff e Trevisan,
afinal é um grupo só;
- ao pessoal do LMM, em especial ao Jaime, Cláudio e ao Jackson, pelo
fornecimento das ostras e todo o suporte nos experimentos de exposição em
aquários;
- à Escola do Mar do município de São José, SC, pelo suporte nos
experimentos de campo;
- à CASAN, pelo apoio na coleta e análise do esgoto, em especial ao Jairzinho,
Vanessa, Terezinha e Edmar;
- ao Lab de QMC do IO-USP, Sílvio, Márcia, Satie e Rosalinda, pelas análises
químicas;
- ao prof. Milton Ozório Moraes da FIOCRUZ, pela ajuda com o
seqüenciamento das amostras;
- aos professores, colegas e funcionários da pgbiocel, em especial profa.
Carolina e prof. Ciro, à Marlene e entre os colegas a Ana, Grazy, Henrique,
Rodrigo, Ticyana, Samanta, Fabíola, Alberto e Marcus. Abração especial pro
João Gabriel e pro Ciro Criminácio, esse é parceiro!!!
- ao pessoal do IBMP por todo o apoio, dedicação e convivência durante os
cursos de Biomol e de Genômica. Certamente não lembrarei de todos os
nomes, mas sintam-se agradecidos. Em especial vai meu abraço ao Stênio, ao
Marco e a Didi, vocês são sensacionais;
- ao CNPq pelos projetos que deram suporte a essa tese;
iv
- aos professores que compõem a banca, que se dispuseram a avaliar esse
trabalho bem como a apresentação, obrigado pelas sugestões e críticas,
Helena, Carolina, Stênio, Ciro e Pessati, muito obrigado;
- à Cristina, ao Ciro (de novo) e ao Adriano, pela hospedagem durante as
disciplinas;
- a toda galera do grupo Roda Livre, pelas rodas de capoeira na Vila Verde, em
especial ao Mestrando Mineiro e ao instrutor Dênis, pé dentro pé fora...
- à Ingrid e demais colegas que seguraram legal as minhas aulas em Floripa e
Tubarão durante as disciplinas obrigatórias em Curitiba;
- a minha grande família Salles, pelo suporte e auxílio durante esse período;
- a meu pai, minha mãe e meus irmãos, por me permitirem chegar até aqui com
condições de definir;
- à BR 101, pelos momentos de reflexão;
- a minha parceira Simone, que segurou legal a onda em Floripa várias vezes,
com duas crianças e sem carro para que eu ficasse de bacana estudando em
Curitiba, e aos meus filhos Natan e Matias, para quem eu dedico todo esse
trabalho realizado, sem vocês teria sido muito mais difícil! Eu amo vocês três e
espero que sejam tão felizes quanto eu sou por estar ao seu lado, obrigado!
v
Sumário
Pg.
_______________________________________________________________
Lista de Figuras.................................................................................................viii
Lista de Tabelas..................................................................................................x
Resumo..............................................................................................................xi
Abstract..............................................................................................................xii
1 Introdução................................................................................................1
2 Objetivos.................................................................................................10
3 Metodologia............................................................................................11
3.1 Ostra Crassostrea gigas.........................................................................11
3.2 Exposição ao esgoto doméstico.............................................................11
3.2.1 Coleta e aclimatação das ostras............................................................11
3.2.2 Coleta do esgoto....................................................................................12
3.2.3 Exposição nos aquários.........................................................................13
3.2.4 Exposição a locais contaminados por esgoto doméstico......................14
3.3 Análises químicas..................................................................................17
3.4 Análises moleculares.............................................................................19
3.4.1 Preparo da amostra...............................................................................19
3.4.2 Identificação dos genes diferencialmente expressos............................20
3.4.2.1 Extração RNA total......................................................................20
3.4.2.2 Purificação do RNA mensageiro.................................................21
3.4.2.3 Hibridização subtrativa supressiva..............................................21
3.4.2.4 Clonagem dos fragment. de cDNA diferencialm. expressos.. 24
vi
3.4.2.5 Purificação do plasmídeo............................................................24
3.4.2.6 Sequenciamento..........................................................................24
3.4.2.7 Análise das sequências...............................................................25
3.4.3 Análise dos genes diferencialmente expressos na exposição ao esgoto
em aquários......................................................................................................25
3.4.3.1 Extração do RNA total das brânquias de ostras.........................25
3.4.3.2 Síntese de cDNA das brânquias de ostras.................................25
3.4.3.3 Desenho dos iniciadores de DNA...............................................25
3.4.3.4 Padronização das condições de PCR.........................................27
3.4.3.5 Análise da expressão gênica RT-PCR semi-quantitativo..........28
3.4.3.6 Eletroforese em gel de agarose..................................................29
3.4.3.7 Densitometria..............................................................................29
3.4.4 Análise dos genes diferencialmente expressos na exposição ao esgoto
no ambiente......................................................................................................29
3.4.5 Análise Estatística dos dados................................................................29
4 Resultados.............................................................................................31
4.1 Índice de Condição das ostras..............................................................31
4.2 Análise do esgoto..................................................................................32
4.3 Fatores Abióticos e Análises Químicas.................................................32
4.4 Identificação dos genes diferencialmente expressos............................35
4.5 Análise da expressão gênica diferencial em aquários.........................39
4.6 Análise da expressão gênica diferencial in situ....................................42
5 Discussão.............................................................................................48
5.1 Fatores Abióticos e Análises Químicas................................................48
5.2 Análise da expressão gênica diferencial..............................................55
6 Conclusões...........................................................................................68
7 Referências Bibliográficas ...................................................................69
vii
8 Anexos..............................................................................................
8.1 Anexo I: Medeiros, I.D.; Siebert, M.N.; Toledo-
Silva, G.; Moraes, M.O.; Marques, M.R.F & Bainy, A.C.D. “Differential gene
expression in oyster exposed to sewage”. Marine environmental Research –
doi: 10.1016/j.marenvres.2008.02.048..............................................................73
8.2 Anexo II: Medeiros, I.D.; Siebert, M.N.; Toledo-
Silva, G.; Rodrigues, T.B.; Marques, M.R.F & Bainy, A.C.D. “Induced gene
expression in oyster Crassostrea gigas exposed to sewage”. Environmental
Toxicology and Pharmacolagy - doi:10.1016/j.etap.2008.05.004......................79
8.3 Anexo III: Toledo-Silva, G.; Siebert, M.N.; Medeiros, I.D.; Sincero,
T.C.M.; Moraes, M.O.; Goldstone,J.V. & Bainy, A.C.D. “Cloning a new
cytochrome P450 isoform (CYP356A1) from oyster Crassostrea gigas”. Marine
environmental Research - doi: 10.1016/j.marenvres.2008.02.010....................83
8.4 Anexo IV: Zanette, J.; Nunes, F.F.; Medeiros, I.D.; Siebert, M.N.; Matos,
J.J.; Lüchmann, K.H.; Melo, C.M.R. & Bainy, A.C.D. “Comparison of the
antioxidant defense system in Crassostrea rhizophorae and Crassostrea gigas
exposed to domestic sewage discharges”. Marine environmental Research -
doi: 0.1016/j.marenvres.2008.02.057................................................................92
8.5 Anexo V: Dafré, A.L.; Medeiros, I.D.; Müller, I.C.; Ventura, E.C. & Bainy,
A.C.D. “Antioxidant enzymes and thiol/disulfide status in the digestive gland of
the brown mussel Perna perna exposed to lead and paraquat”. Chemico-
Biological Interactions 149, 97 – 105. 2004.....................................................100
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: coleta do esgoto doméstico não tratado pelos técnicos em
saneamento da Companhia Catarinense de Água e Saneamento....................12
Figura 2: exposição das ostras Crassostrea gigas a 33% de esgoto doméstico
não tratado por 48h em aquários.......................................................................13
Figura 3: estrutura flutuante de PVC para exposição das ostras aos locais
contaminados por esgoto doméstico.................................................................14
Figura 4: vista parcial da Baía Norte da Ilha de Santa Catarina com os locais
de exposição do experimento in situ..................................................................16
Figura 5: ostra Crassostrea gigas com destaque para glândula digestiva,
gônadas, manto e brânquias.............................................................................17
Figura 6: esquema ilustrativo da hibridização subtrativa supressiva...............20
Figura 7: índice de condição das ostras utilizadas nos experimentos de
exposição ao esgoto.........................................................................................26
Figura 8: parâmetros físicos, químicos e microbiológicos da água dos locais 1,
2, 3 e 4 durante a exposição in situ...................................................................28
Figura 9: produtos de PCR da hibridização subtrativa supressiva em gel de
agarose 2% TAE1x............................................................................................31
Figura 10: placa de Petri com as colônias de células JM109 (Promega)
contendo os clones resultantes da hibridização subtrativa supressiva............32
Figura 11: padronização do número de ciclos das reações de RT-PCR para
análise da expressão gênica em brânquias de ostras expostas a esgoto em
aquários.............................................................................................................35
Figura 12: expressão dos genes CYP356A1, GSTO, MDR, FABP e ALAS em
ostras expostas a 33% de esgoto doméstico não tratado por 48h....................36
Figura 13: padronização do número de ciclos das reações de RT-PCR em
brânquias de ostras expostas a esgoto in situ...................................................38
Figura 14: expressão dos genes CYP356A1, GSTO, MDR, FABP e ALAS em
brânquias de ostras expostas a locais contaminados por esgoto por 14 dias...39
Figura 15: padronização do número de ciclos das reações de RT-PCR em
glândula digestiva de ostras expostas a esgoto in situ.....................................41
ix
Figura 16: expressão dos genes CYP356A1, GSTO, MDR, FABP e ALAS em
glândula digestiva de ostras expostas a locais contaminados por esgoto por 14
dias....................................................................................................................42
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: pares de iniciadores e tamanho esperado dos fragmentos gênicos
analisados em brânquias de ostras expostas a esgoto.....................................23
Tabela 2: condições das reações de PCR para análise da expressão gênica
em brânquias de ostras expostas a esgoto.......................................................24
Tabela 3: parâmetros químicos e microbiológicos do esgoto doméstico não
tratado...............................................................................................................27
Tabela 4: concentração de contaminantes orgânicos nas amostras de
sedimento dos locais de exposição do experimento in situ..............................29
Tabela 5: concentração dos contaminantes orgânicos nas ostras Crassostrea
gigas mantidas nos locais de exposição durante o experimento in situ..........30
Tabela 6: lista dos genes que tiveram sua expressão induzida pela exposição
ao esgoto, identificados pela hibridização subtrativa supressiva......................33
xi
RESUMO
O lançamento de esgoto doméstico em águas superficiais é a principal causa
de poluição dos ecossistemas aquáticos ao redor do mundo. O esgoto contém
contaminantes diversos como produtos de higiene pessoal, limpeza doméstica,
medicamentos humanos e veterinários, óleos e graxas, químicos diversos,
além de microorganismos patogênicos e nutrientes em excesso. O contato
destes compostos com a biota provoca alterações causando dano e ativando
os mecanismos de defesa. A análise da expressão de diferentes genes
simultaneamente em um organismo exposto à presença de um contaminante
pode auxiliar o entendimento dos mecanismos de toxicidade e defesa biológica,
além de contribuir como biomarcador de contaminação em programas de
monitoramento ambiental. No presente trabalho, após um período de 10 dias
de aclimatação, ostras adultas da espécie Crassostrea gigas (n=10) foram
expostas a 33% de esgoto doméstico não tratado por 48h, em aquários de 45L
sob condições controladas. Através da técnica de hibridização subtrativa
supressiva a expressão diferencial de genes em pool de brânquias de cinco
ostras macho foi investigada, sendo obtidos inicialmente 61 clones, dos quais
15 foram identificados. Cinco genes associados a mecanismos de
biotransformação de xenobióticos foram escolhidos para confirmação da
indução da expressão por RT-PCR semi-quantitativo, normalizado pela
expressão do gene da Actina. Esses genes são responsáveis por reações de
biotransformação de fase I (CYP356A1), fase II (GSTO), fase III (MDR),
transporte de ácidos graxos e compostos hidrofóbicos (FABP) e síntese do
grupo heme (ALAS). Todos os genes apresentaram maiores valores de
expressão (1,9, 3,3, 3,3, 43,6 e 2,9x para CYP356A1, GSTO, MDR, FABP e
ALAS, respectivamente) nas ostras expostas ao esgoto quando comparadas ao
grupo controle. Para verificar a aplicabilidade da análise em programas de
biomonitoramento in situ, as ostras foram transplantadas para locais referência
e contaminados por esgoto doméstico, assim permanecendo por 14 dias. A
análise da expressão gênica em brânquias e glândula digestiva das ostras
expostas in situ a esgoto doméstico não apresentou diferenças significativas
entre os grupos, provavelmente devido ao período de exposição, considerado
muito longo para análises moleculares.
xii
ABSTRACT
The mais cause of surface waters contamination around the world is untreated
sewage delivery. Sewage contains several kinds of contaminants like personal
care and house cleanning products, human and pet medicines, oils and other
chemicals besides patogenic microorganisms and nutrients in excess. The
contact of these contaminants with the organisms may cause harm and activate
defense mechanisms. The analysis of several genes in the same time in a
contaminant stressed organism may contribute to elucidate toxicity and
biological defense mechanisms and be usefull as a biomarker in environmental
monitoring programs. In this work, after a 10 days acclimatation period, adult
crassostrea gigas oysters (n=5) were exposed to 33% of untreated sewage for
48h, in 45L aquariums under controlled conditions. Differential gene expression
in pooled gills of male oysters were investigated through supressive subtractive
hibridization. From the sixty-one clones obtained 15 were iddentified. Five
genes associated with biotransformation of xenobiotics were submited to
semiquantitative RT-PCR normalized with actin to confirm the induction in gene
expression by sewage. These genes are responsable for fase I (CYP356A1),
fase II (GSTO) and fase III (MDR) of xenobiotics biotransformation, fatty acid
and hidrofobic compounds transport (FABP) and the heme group synthesis
(ALAS). All the analysed genes showed higher values of gene expression (1,9,
3,3, 3,3, 43,6 and 2,9x for CYP356A1, GSTO, MDR, FABP and ALAS,
respectively) in sewage exposed oysters compared to control group oysters. To
verify the applicability of this kind of analysis in biomonitoring programs, oysters
were transplanted to sewage contaminated and reference sites for 14 days.
Gene expression analysis in gills and digestive glands of in situ sewage
exposed oysters did not show significative differences between the groups,
probably because the exposition period was to long for molecular analysis.
1
1 Introdução
A contaminação dos ecossistemas pode afetar os animais expostos
causando efeitos adversos nos tecidos alvo e organismos como um todo,
podendo refletir na alteração da estrutura das populações e comunidades (Pina
et al., 2007). As alterações decorrentes da exposição aos contaminantes nos
organismos a nível molecular, bioquímico, fisiológico, histológico ou celular são
denominadas biomarcadores (Huggett et al, 1992). O uso de biomarcadores
em programas ambientais apresenta algumas vantagens sobre as análises
químicas, pois são técnicas mais baratas, que indicam biodisponibilidade,
expressam os efeitos tóxicos, podem auxiliar na elucidação dos mecanismos
de toxicidade dos xenobióticos e podem possibilitar a detecção de um
problema mais grave enquanto ainda há tempo para reverter uma situação
adversa (Walker et al., 2001).
As características ideais de um biomarcador são especificidade química
e biológica, sensibilidade, clareza de interpretação, tempo curto de
manifestação e permanência da resposta, associação aos níveis mais elevados
de organização biológica e aplicabilidade às condições de campo (Huggett et
al, 1992). Além disso, devem permitir a distinção entre a variabilidade natural e
o estresse induzido pela contaminação e ter significância toxicológica, ou seja,
é desejado que a resposta esteja relacionada ao impacto do contaminante
sobre o organismo (Pina et al., 2007).
Dentro dessa perspectiva, vários parâmetros têm sido analisados nos
diferentes níveis de organização biológica. As análises fisiológicas representam
a interface entre a parte toxicológica e a ecológica, formando a base para as
alterações do organismo como um todo, que por sua vez irão refletir nas
características das populações (Munkittrick e van der Kraak., 1999). Penã e
Pocsidio (2007) observaram redução na taxa de alimentação e crescimento do
gastrópode Pomacea canniculata após dez dias de exposição a cobre,
enquanto Andersen e colaboradores (2006) mostraram que a exposição a
longo prazo ao desregulador endócrino etinilestradiol afeta a reprodução de
uma espécie de peixe. Ao nível citológico e histológico Castro e colaboradores
(2004) encontraram os menores valores de estabilidade lisossomal em
2
hemócitos de mexilhões de regiões contaminadas com elementos metálicos.
Akaishi e colaboradores (2007) observaram aumento da atividade fagocítica,
na capacidade de resistir a patógenos e lesões histopatológicas nas brânquias
de mexilhões expostos a esgoto doméstico não tratado por 14 dias. A nível
bioquímico um aumento na atividade da enzima Glutationa S-transferase e na
quantidade de citocromo P450 foi registrado em mexilhões expostos a
diclorofenol (Petushok et al., 2002) e Almeida e colaboradores (2003)
detectaram uma redução nos níveis de serotonina e dopamina em mexilhões
expostos a chumbo e cádmio.
Enquanto as análises bioquímicas historicamente tem sido realizadas
através da atividade enzimática ou dos níveis de proteína, o desenvolvimento
da biologia molecular criou condições para o surgimento de um novo grupo de
biomarcadores, baseados na análise da transcrição de genes relacionados ao
estresse, os chamados biomarcadores de expressão gênica (Pina et al., 2007).
De um modo geral, a presença de um contaminante atua como um
efetor que ativa um sensor ou receptor celular, que por sua vez interage com
uma sequência específica de DNA no núcleo promovendo a transcrição de
algum gene. O produto da transcrição é o RNA mensageiro (RNAm), que é
processado e enviado ao citoplasma para que o ribossomo sintetize a proteína
correspondente. A proteína, por sua vez, constitui a base molecular da
resposta biológica à presença do efetor (Pina et al., 2007). Assim a expressão
gênica representa o primeiro nível de interação entre um agente estressor e o
genoma, que, através da síntese de proteínas dirige a resposta do organismo
às mudanças externas (Brulle et al., 2008). Embora essa norma possa
apresentar algumas variações, a quantidade de proteína sintetizada costuma
refletir a quantidade de RNAm, que por sua vez depende da indução da
transcrição por um receptor que foi ativado pela presença de um efetor em
concentração suficiente.
Dessa forma a análise da expressão gênica permite diagnosticar a
existência de estresse em uma população e analisar esta resposta ao estresse
além de contribuir para a elucidação dos mecanismos de regulação da
expressão destes genes em resposta a doenças e estímulos ambientais (Ju et
al., 2006; Brulle et al., 2008). Finne e colaboradores (2007) afirmaram que
3
através do perfil de expressão gênica pode-se monitorar vários biomarcadores
clássicos simultaneamente além de ser possível identificar outros novos.
De acordo com Maggioli e colaboradores (2006) um crescente número
de estudos tem demonstrado que a expressão diferencial de genes pode ser
utilizada na análise toxicológica preditiva, auxiliando na identificação da classe
de toxicidade de determinado composto. Essa abordagem toxicogenômica
pode ajudar a reduzir custos e acelerar os processos de testes de novas
drogas, pois alterações na expressão dos genes mediadas por toxinas podem
ser detectadas antes que a química clínica, histopatologia ou observações
clínicas possam sugerir um efeito tóxico.
As ferramentas genômicas estão sendo empregadas também na análise
ecotoxicológica, onde tem por objetivo esclarecer os efeitos moleculares e
celulares dos contaminantes através das alterações na expressão gênica dos
organismos. Esse ramo da ciência, chamado de ecotoxicogenômica, tem
crescido substancialmente nos últimos anos, principalmente devido aos
esforços de seqüenciamento do genoma de algumas espécies de peixe como
Danio rerio e Oryzias latipes (Hoffmann et al., 2006). A decodificação completa
do genoma de vários animais seguida da identificação de todos os transcritos e
proteínas correspondentes, deverá proporcionar o entendimento de como a
expressão dos genes está relacionada com seu status fisiológico e patológico
(Chatterjee-Kishore e Whitley, 2004). O sequenciamento completo do genoma
de um organismo permite o conhecimento detalhado de sua biologia e constitui
uma poderosa ferramenta de análise para os pesquisadores (Saavedra &
Bachère, 2006). Entretanto a genômica dispõe de várias outras abordagens
que permitem analisar o comportamento de múltiplos genes em situações
específicas.
Dentre as ferramentas empregadas na análise genômica as
hibridizações com oligonucleotídeos ou cDNA – (arrays -micro e macro) são
muito utilizadas quando se tem conhecimento do genoma do organismo. Os
microarrays são basicamente uma lâmina de vidro de microscopia onde
milhares de oligonucleotídeos são impressos em um sistema cartesiano (em
forma de grade). DNA ou RNAm de duas diferentes populações de células são
marcados com material fluorescente e hibridizados com o DNA impresso na
4
lâmina. A imagem dos pontos fluorescentes é então digitalizada para análise
quantitativa da fluorescência. Através da análise dos arrays é possível
descobrir quais genes foram induzidos ou reprimidos em uma determinada
população de células comparada à outra (François et al., 2003). Dessa forma
os arrays comparam, por exemplo, a abundância relativa de RNAm hibridizado
a certo cDNA de duas amostras em um clone impresso na lâmina (Hsu et al
2006). A principal vantagem dos arrays é fornecer uma “fotografia” da atividade
transcricional de milhares de genes simultaneamente (Francois et al., 2003).
Por outro lado um fator que tem limitado sua utilização é a pequena
disponibilidade de genomas seqüenciados, principalmente quando não se trata
de um organismo modelo. Hoffmann e colaboradores (2006) aplicaram o
método para analisar a interferência de desreguladores endócrinos sobre a
expressão gênica em peixes e encontraram um grupo de genes sob forte
influência, porém com identidade desconhecida. Outro fator limitante é o custo
dessa tecnologia, que ainda é alto e normalmente torna as repetições muito
caras, reduzindo a quantidade de dados disponíveis (Lettieri et al., 2006).
Já nos chamados sistemas abertos (quando não se tem conhecimento
prévio do genoma do organismo) as técnicas mais comumente utilizadas são o
differential display e a hibridização supressiva subtrativa (Bultelle et al., 2002).
A estratégia geral utilizada na técnica de differential display é isolar duas
populações de RNAm, sintetizar o cDNA a partir de cada uma delas e analisar
o resultado em eletroforese. A partir da comparação direta dos géis, os
fragmentos diferencialmente expressos são reamplificados e clonados para
estudos posteriores. Liao e Freedman (2002) destacam que as vantagens
desta técnica são a pequena quantidade de material inicial, simplicidade e
sensibilidade do método, comparação lado a lado de várias amostras e rápida
identificação e confirmação dos resultados. Por outro lado essa técnica
apresenta muitos resultados falso-positivos, que teriam que ser eliminados
aumentando o número de repetições ou complementando o método com
alguma forma de hibridização de ácidos nucléicos (Bultelle et al, 2002).
A hibridização subtrativa supressiva é caracterizada por amplificar
exponencialmente os transcritos diferencialmente expressos em um PCR
supressivo, após realizar dupla subtração dos transcritos comuns a duas
5
populações de cDNA (Figura 6). Em um primeiro momento duas populações de
RNAm são reversamente transcritas à cDNA. Uma das populações de cDNA é
denominada driver, enquanto a outra, que se quer investigar, é chamada tester.
A amostra tester é subdividida em duas e cada uma delas recebe um
oligonucleotídeo adaptador diferente na extremidade 5´. Cada subpopulação do
tester é então submetida à hibridização em separado com o driver. Os
fragmentos gênicos comuns formarão moléculas híbridas enquanto os
fragmentos diferencialmente expressos contendo o adaptador não hibridizam.
As duas amostras são então misturadas e uma nova quantidade de cDNA
driver é adicionado para uma segunda hibridização, porém sem desnaturação.
Nesse momento os fragmentos diferencialmente expressos contendo os
diferentes adaptadores hibridizam. O produto desta hibridização é submetido a
um PCR supressivo em que apenas os genes presentes na amostra tester são
amplificados (Figura 6). Nessa reação de PCR os adaptadores desenvolvidos
pela Clontech no kit PCR Select cDNA Subtraction favorecem a amplificação
dos transcritos diferencialmente expressos enquanto a amplificação
inespecífica é suprimida.
Esse método foi utilizado para identificar genes que possam estar
envolvidos na defesa contra microorganismos em camarões (He et al., 2004),
tolerância a temperatura em ostras (Huvet et al., 2004), exposição a
contaminantes em peixes (Baldwin et al., 2005) e outras situações de estresse
em diferentes organismos. He e colaboradores (2004) afirmam que a
hibridização subtrativa supressiva é um dos métodos mais poderosos para
identificação de genes diferencialmente expressos. Investigando a resposta de
hemócitos de camarões à contaminação microbiana eles identificaram 25
genes de relevância imunológica, dos quais cinco, escolhidos para confirmação
do resultado, tiveram a indução da expressão confirmada por virtual northern
blot e RT-PCR semiquantitativo. Por outro lado, Huvet e colaboradores (2004)
obtiveram 376 clones, dos quais apenas 150 apresentaram indução da
expressão confirmada por blot, enquanto 226 (60%) foram considerados falso
positivos ou genes que não tiveram sua expressão alterada pelo tratamento.
Os estudos ecotoxicológicos que avaliam ambientes marinhos e
estuarinos muitas vezes utilizam moluscos bivalves como organismos
6
sentinela. Esses animais são sésseis e de fácil manuseio, representando bem
o local de amostragem e são filtradores, bioacumulando contaminantes
dispersos na água enquanto se alimentam do fitoplâncton. Esse fato aliado à
importância econômica do cultivo de bivalves na aqüicultura e a sua
importância na manutenção dos ecossistemas tem incentivado o
desenvolvimento da genômica dos bivalves (Saavedra e Bachere, 2006).
A ostra Crassostrea gigas apresenta ampla distribuição geográfica e é a
segunda espécie mais cultivada comercialmente ao redor do mundo. No Brasil
a ostra C.gigas é a espécie mais cultivada e Santa Catarina é o principal
estado produtor de ostras no país com uma produção de 3152,4 ton. em 2006
e 1155,8 ton. em 2007 (http://www.pmf.sc.gov.br/fenaostra).
A capital do estado, Florianópolis, é uma cidade turística que fica
localizada na Ilha de Santa Catarina, local de prática intensa de aqüicultura e
que sedia anualmente a Fenaostra, evento turístico que envolve gastronomia e
atividades artísticas e culturais para divulgação da ostreicultura.
A exploração do turismo em Florianópolis tem seu ponto máximo na
temporada de verão, quando a população da cidade aumenta em quase 100%
atingindo a capacidade máxima de acomodação nos hotéis e pousadas da Ilha
(http://www.pmf.sc.gov.br/turismo). Um fator preocupante associado ao
aumento do número de pessoas é o incremento na produção de esgoto
doméstico aliado a necessidade de estrutura adequada para a coleta,
tratamento e lançamento desses efluentes. O lançamento de esgoto doméstico
em águas superficiais é a principal causa de poluição dos ecossistemas
marinhos e estuarinos ao redor do mundo (Walker et al., 2001). Dentro desse
contexto, as cidades brasileiras carecem de sistemas apropriados para lidar
com seus efluentes e os mesmos muitas vezes são lançados sem tratamento
diretamente nos ecossistemas (Abessa et al., 2005). Os parâmetros
considerados poluentes e que normalmente são monitorados nas estações de
tratamento de esgoto são a demanda bioquímica de oxigênio (DBO), sólidos
suspensos (SS), nitrogênio total, nitrito, nitrato e amônia, fósforo orgânico e
inorgânico e microrganismos patogênicos, mas análises de metais e
contaminantes orgânicos diversos podem também estar presentes (Cameron et
7
al., 2003). Já nos ecossistemas a análise normalmente empregada que reflete
a qualidade de água é a microbiológica.
A resolução nº 357 do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA
357) que dispõe sobre a classificação dos corpos d’água e estabelece
condições e padrões para o lançamento de efluentes, define coliformes
termotolerantes como: “bactérias gram-negativas, em forma de bacilos,
oxidasenegativas, caracterizadas pela atividade da enzima B - galactosidase.
Podem crescer em meios contendo agentes tenso-ativos e fermentar a lactose
nas temperaturas de 44º - 45ºC, com produção de ácido, gás e aldeído. Além
de estarem presentes em fezes humanas e de animais homeotérmicos,
ocorrem em solos, plantas ou outras matrizes ambientais que não tenham sido
contaminados por material fecal”. Conforme afirma a própria resolução, a
presença de coliformes não é exclusiva de matéria fecal, sendo que os
mesmos já foram detectados em amostras de solo, madeira e cascas de
madeira de indústria de papel e celulose em setores que não tem contato com
esgoto (Gauthier e Archibald, 2001). A comparação dos dados de
contaminação por coliformes com freqüência é dificultada pelo fato dos
pesquisadores utilizarem métodos diferentes (Hench et al, 2003; Gauthier &
Archibald, 2001). Por outro lado as estações de tratamento normalmente
apresentam sucesso na redução do número de coliformes presentes no esgoto,
por vezes atingindo 99% de eficiência (Hench et al , 2003).
Além do alto teor de matéria orgânica e da presença de patógenos, o
esgoto apresenta contaminantes utilizados em grande quantidade no cotidiano,
tais como produtos de higiene pessoal e limpeza doméstica, medicamentos
humanos e veterinários, surfactantes e resíduos de surfactantes e aditivos
industriais. Esses contaminantes não precisam ser persistentes no ecossistema
para causar efeitos negativos, visto que são introduzidos continuamente no
ambiente (Petrovic et al., 2003). Outro grupo de contaminantes presentes no
esgoto são os chamados desreguladores endócrinos. Contaminantes com
estrutura química similar a dos hormônios esteróides que interferem
principalmente no eixo hipotálamo-hipófise-gônadas causando alterações no
desenvolvimento e falência reprodutiva, principalmente em organismos
aquáticos (Leusch et al., 2006). Alguns pesticidas, químicos industriais,
8
derivados de plástico e produtos de limpeza doméstica estão entre os
compostos que se ligam ao receptor de estrógeno induzindo a síntese de
vitelogenina em organismos macho (Tilton et al., 2002). Além desses, o
hormônio sintético etinilestradiol é prescrito como contraceptivo oral para
milhões de mulheres todos os anos. Sua afinidade pelo receptor de estrógeno
é maior do que o hormônio natural 17 – B-estradiol. Uma classe de compostos
lipofílicos, e desse modo sujeitos à biomagnificação e que estão associados a
uma série de desordens crônicas, principalmente reprodutivas, são as bifenilas
policloradas (BPCs) (Canesi et al, 2003). BPCs são compostos que
apresentam alta estabilidade química e térmica, miscibilidade com compostos
orgânicos, alta constante dielétrica e baixo custo. Estas propriedades fizeram
com que tivessem uma ampla aplicação comercial sendo utilizados como
fluidos dielétricos de transformadores e capacitores, fluidos hidráulicos,
lubrificantes, plásticos, retentores de calor e chama, além de transformá-lo em
um dos principais contaminantes dos oceanos e estuários nos últimos 50 anos
(Kenish, 1997). A produção de BPCs nos Estados Unidos iniciou em 1929 e foi
interrompida em 1977 e no Brasil está proibida desde 1981, pela portaria
interministerial n
0
19 de 29/01/81, entretanto a utilização de equipamentos que
contenham BPC está autorizada até sua substituição por outro livre do
composto. A composição do esgoto pode incluir ainda outros compostos
clorados como os inseticidas dicloro-difenil-tricloroetanos (DDTs), compostos
derivados de óleos e graxas como os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos
(HPAs) e derivados de detergentes como os alquilbenzenos lineares (ABLs).
Os ABLs são utilizados na formulação de detergentes por apresentarem baixo
teor de subprodutos insolúveis e maior rendimento, aumentando a solubilidade
do tensoativo e melhorando seu poder de detergência. A estrutura é um dos
fatores que afetam a biodegradação do composto e a relação entre os
isômeros internos e externos dos ABLs fornece informações sobre o tempo de
existência do efluente. Os isômeros externos são aqueles em que o grupo
fenila está mais próximo do átomo de carbono terminal da cadeia alquílica e os
isômeros internos são aqueles em que o grupo fenila está mais distante.
(Penteado et al, 2006).Com o aumento populacional e a escassez de água
potável são cada vez mais comuns as iniciativas para armazenar e reutilizar
9
água. A captação de água para abastecimento da população por vezes ocorre
em locais onde à montante existe um lançamento de esgoto tratado.
Stackelberg e colaboradores (2004) detectaram a presença de 40
contaminantes orgânicos como tetrahidronaftaleno (fragrância), bisfenol A
(fungicida, anti-chama), cafeína (estimulante), carbamazepina (anticonvulsivo)
e cotinina (metabólito da nicotina) em reservatório de água potável reutilizada.
O tratamento primário de efluentes tem por finalidade remover sólidos em
suspensão e compostos que aumentem as demandas química e bioquímica de
oxigênio. O tratamento avançado tem por finalidade remover constituintes
inorgânicos dissolvidos tais como fosfato. Dessa forma as estações de
tratamento de esgoto doméstico não são concebidas com a finalidade de
eliminar contaminantes orgânicos que normalmente estão presentes em níveis
traço, sendo comum a presença desses elementos no esgoto mesmo após o
tratamento.
Florianópolis conta atualmente com cinco estações de tratamento de
esgoto em funcionamento, duas em implantação e outra planejada. Atualmente
os cultivos de moluscos ocupam cerca de 25% da área disponível para
aquicultura. A possibilidade de incremento das duas atividades deve ser
trabalhada com planejamento para que um possível conflito seja evitado.
Nesse sentido o desenvolvimento de ferramentas de análise sensíveis e
capazes de contribuir com programas de fiscalização e gerenciamento da
qualidade dos organismos se faz necessário.
O objetivo deste trabalho é identificar genes que possam ser utilizados
como biomarcadores de contaminação por esgoto doméstico em programas de
monitoramento e gerenciamento ambiental.
10
2
Objetivos
2.1 Geral
Identificar genes diferencialmente expressos em ostras Crassostrea
gigas expostas a esgoto doméstico não tratado, que possam servir como
biomarcadores de contaminação em programas de gerenciamento ambiental.
2.2 Específicos
- identificar, clonar e sequenciar genes que tenham a expressão induzida
quando as ostras são expostas a esgoto doméstico não tratado;
- depositar as seqüências dos fragmentos gênicos identificados no
banco mundial de genes (Genebank);
- desenhar iniciadores de DNA para alguns dos genes identificados e
avaliar a expressão dos genes individualmente, em ostras expostas a esgoto
não tratado em aquários;
- verificar a aplicabilidade dos genes identificados como biomarcadores
através de experimento in situ de exposição das ostras a locais contaminados
por esgoto doméstico.
11
3 Material e Métodos
3.1 Ostra Crassostrea gigas
Reino Animalia
Filo Mollusca
Classe Bivalvia
Ordem Ostreoida
Família Ostreidae
Espécie Crassostrea gigas
A ostra Crassostrea gigas (Thunberg, 1793) apresenta concha sólida,
extremamente enrugada e laminada. A forma da concha varia muito com o
ambiente e a cor é geralmente esbranquiçada por fora e branca por dentro.
Apresenta um único músculo adutor que pode ser escuro, mas nunca púrpura
ou preto, característica que a difere da espécie Crassostrea virginica.
Apresenta fase larval planctônica que se desloca pela coluna d´água à procura
do substrato ideal para fixação. Prefere substratos firmes e usualmente se fixa
sobre rochas ou conchas de outras ostras em profundidades que variam de 5 a
40m. É uma espécie cosmopolita tendo ocorrência registrada no Japão, Koréia,
Sibéria, Estados Unidos, Canadá e Austrália. Atualmente foi introduzida em
outros países e é uma das espécies mais cultivadas no mundo.
3.2 Exposição ao esgoto doméstico
3.2.1 Coleta e aclimatação das ostras
Ostras adultas (7,6 – 12,9 cm) foram coletadas no cultivo do Laboratório
de Moluscos Marinhos (LMM) da UFSC, localizado na praia de Sambaqui, e
transportadas em caixas plásticas sem água para a unidade do LMM da Barra
da Lagoa. Os animais foram acondicionados dentro do laboratório em dois
aquários plásticos de 45L contendo água marinha filtrada (UV) com salinidade
25psu, temperatura ambiente e aeração constante por 10 dias. Em um primeiro
momento foram colocadas 10 ostras em cada aquário para garantir um número
suficiente de animais de um único sexo. Apenas os organismos macho foram
utilizados para evitar diferenças na expressão gênica relacionadas ao sexo.
12
Durante esse período as ostras foram alimentadas uma vez ao dia com 12 x
10
4
céls/mL de microalgas (Chaetoceros militrans e Skeletonema sp) e a água
foi trocada diariamente.
3.2.2 Coleta do esgoto
O esgoto não tratado foi coletado na Estação Insular de Tratamento de
Efluentes da Companhia Catarinense de Águas e Saneamento (CASAN), no
centro de Florianópolis (Figura 1). As coletas ocorreram sempre no meio da
manhã e o esgoto foi coletado na calha Parshall logo após a remoção dos
sólidos por gradeamento, ao chegar na estação. Após a coleta o material foi
transportado para o LMM em container de plástico escuro (50L) e permaneceu
em uma sala com ar condicionado durante as 48 horas de exposição. A data
das coletas foi agendada para coincidir com as coletas regulares realizadas
pelos técnicos da CASAN para análise dos parâmetros físicos químicos e
microbiológicos do esgoto afluente.
13
Figura 1: A – Coleta do esgoto doméstico não tratado pelos técnicos em
saneamento da Companhia Catarinense de Água e Saneamento (CASAN); B –
Vista parcial da Estação de Tratamento de Esgoto Insular da CASAN,
Florianópolis, SC.
3.2.3 Exposição nos aquários
Após o período de aclimatação um dos aquários recebeu 33% de esgoto
não tratado enquanto o outro aquário recebeu apenas água marinha diluída
com água doce na mesma proporção do esgoto, para manter a salinidade
constante em 25psu (Figura 2). A solução de esgoto e a água marinha foram
trocadas diariamente durante a exposição. Durante esse período, as ostras
foram observadas por inspeção visual para verificar se estavam abrindo as
valvas para respiração e/ou alimentação.
A
B
14
Figura 2: Exposição das ostras Crassostra gigas a 33% de esgoto
doméstico não tratado por 48h em aquários de 45L (n=10).
3.2.4 Exposição a locais contaminados por esgoto doméstico
Para expor as ostras Crassostrea gigas ao local contaminado por esgoto
doméstico in situ foi desenvolvida uma estrutura flutuante de PVC (Figura 3 A,
D e E). Foram colocadas 20 ostras por estrutura, acondicionadas na parte
central confeccionada com tela de nylon. A estrutura continha também uma
placa indicativa com os dados de identificação do experimento, projeto e
contato dos pesquisadores (Figura 3B). As estruturas foram colocadas nos
pontos de amostragem com auxílio de poitas de concreto e cabos de nylon.
15
Figura 3: A – Estrutura flutuante de PVC para exposição das ostras aos
locais contaminados; B – Placa de identificação com os dados do experimento;
C – Montagem da estrutura com as ostras; D – Estrutura flutuando em um dos
pontos amostrais; E – Recuperação da estrutura com as ostras no ponto
poluído; F – Malha plástica com as ostras com destaque para uma alça plástica
de aromatizante de vaso sanitário.
Foram definidos 4 locais de exposição afastando-se da foz do Rio
Bücheller adentrando na Baía Norte da Ilha de Santa Catarina, SC (Figura 4).
Os locais 1, 2, 3 e 4 estão distantes 15, 400, 1500 e 4500m respectivamente da
foz do Rio Bücheller. A escolha destes locais se baseou em um estudo anterior
realizado devido a uma parceria entre a Escola do Mar do município de São
José, SC, e o Centro Federal de Educação Tecnológica (CEFET-SC) que
realizou análises periódicas no local (Projeto Baía Limpa - monitoramento de
parâmetros físicos, químicos e microbiológicos). Este estudo confirmou a
B
A
C
D
E
F
16
existência de um gradiente de contaminação por coliformes totais e fecais entre
estes locais. Nesse trabalho as ostras permaneceram nos locais amostrais por
14 dias (31/08 – 14/09/2006). Ao final do experimento as estruturas foram
recuperadas e transferidas para o laboratório para preparo da amostra.
Enquanto permaneceram no laboratório os animais ficaram em aquários com
água marinha de cada local de exposição. Para analisar a presença de
contaminantes orgânicos nas ostras e no sedimento foram congeladas 3 ostras
a -20ºC e foi coletada uma amostra de sedimento por ponto amostral com
pegador tipo “van Veen”.
No início, durante e ao final da exposição foram analisados os
parâmetros físico e químicos (temperatura, oxigênio dissolvido, pH, salinidade
e turbidez) da água marinha dos locais de exposição e foram coletadas
amostras de água para análise de DBO
5
, NH
4
, NO
2
, PO
3
e coliformes fecais. A
coleta e a análise das amostras de água obtida nos locais de exposição foram
realizadas segundo técnicas do STANDARD METHODS FOR THE
EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER APHA-AWWA-WPCF, 20
a
edição.
17
Figura 4: Vista parcial da Baía Norte da ilha de Santa Catarina. SJ1 –
Local 1 (Foz do Rio Bücheller); SJ2 – Local 2; SJ3 – Local 3 (cultivo de
moluscos); SJ4 – Local 4 (Pedra das Tipitingas – local referência); Trapiche –
Escola do Mar, São José, SC.
3.3 Análises Químicas
A análise dos contaminantes orgânicos presentes nas ostras (n=10 por
local amostral) e no sedimento dos locais de exposição do experimento in situ
foram realizadas em colaboração com o Laboratório de Química Orgânica
Marinha do Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo (IO-USP).
Os tecidos congelados da Crassostrea gigas foram secos durante 72
horas em liofilizador Thermo Savant – modulyo D. Em seguida, as amostras
foram maceradas e homogeneizadas em almofariz com pistilo e armazenadas
em frascos de vidro previamente limpos com solvente.
O procedimento metodológico descrito a seguir foi baseado em MacLeod
e colaboradores (1986) com algumas modificações. Um grama de cada uma
das amostras foi extraído com n-hexano e diclorometano 50% (v/v) em soxhlet
durante 8 horas. Foram utilizados solventes com grau de pureza “para análise
de resíduos orgânicos” (J. T. Baker, Estados Unidos). Antes da extração foram
18
adicionados 100 μL dos padrões internos (surrogate) com diferentes
concentrações no branco e em cada uma das amostras. Para os
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) foram adicionados naftaleno-d
8
,
acenafteno-d
10
, fenantreno-d
10
, criseno-d
12
e perileno-d
12
(5 ng μL
-1
); para os
bifenilos policlorados (BPCs) e pesticidas organoclorados foram utilizados o
PCB-103 e PCB-198 (1 ng μL
-1
); o padrão interno dos alquilbenzeno lineares
(ABLs) foi o dodecil alquilbenzeno (1C
12
LAB, 5 ng μL
-1
).
O extrato evaporado foi submetido a uma coluna cromatográfica contendo
8 gramas de sílica gel sobre 16 gramas de alumina (ambas da Merck) 5%
desativadas com água pré-extraída e 1 grama de sulfato de sódio da J. T.
Baker no topo. A eluição foi feita com 80 mL de uma mistura de n-hexano e
diclorometano (50%). Para purificação complementar, o eluato foi concentrado
a 0,5 mL e injetado no cromatógrafo a líquido de alto desempenho (HPLC) da
Perkin Elmer equipado com duas colunas de exclusão (permeação em gel). A
fase móvel utilizada foi o diclorometano. O eluato foi concentrado novamente e
foram adicionados os padrões internos cromatográficos (octacloronaftaleno
para HPAs, TCMX para BPCs e pesticidas e 1C
19
LAB para os ABLs). O volume
final foi de 1 mL.
Uma alíquota do extrato final foi injetada no cromatógrafo a gás equipado
com detector de captura de elétrons (GC-ECD) da Agilent Technologies para
análise de pesticidas organoclorados. Os demais grupos de compostos (HPAs,
BPCs e ABLs) foram analisados no cromatógrafo a gás equipado com
espectrômetro de massas (GC-MS) 6890/5973N da Agilent Technologies.
As temperaturas do injetor e detector do GC-ECD foram de 280
o
C e
300
o
C, respectivamente. O gás de arraste foi o hidrogênio ultrapuro e o gás
auxiliar foi o nitrogênio. A coluna cromatográfica era de 30 metros de
comprimento, diâmetro interno de 0,25 mm e espessura do filme de 5%
fenilmetilsiloxana de 0,5 μm da marca J&W Scientific. A rampa de temperatura
utilizada foi: início a 70
o
C por 1 minuto, aumento a uma taxa de 40
o
C até 170
o
C
e a 1,5
o
C até 240
o
C, permanecendo nesta temperatura por 2 minutos, e
aumentando novamente a 15
o
C até 300
o
C permanecendo isotérmico por 5
minutos.
19
As temperaturas do GC-MS foram de 280
o
C, 280
o
C e 300
o
C no injetor,
na interface e na fonte de íons, respectivamente. A coluna cromatográfica
utilizada foi da J&W Scientific com 30 metros de comprimento, 0,25 mm de
diâmetro interno e 0,25 μm de espessura de filme de 5% fenilmetilsiloxana. O
modo de aquisição foi o SIM (monitoramento seletivo de íons). A rampa de
temperatura para BPCs foi: início a 75
o
C durante 3 minutos, aumento a uma
taxa de 15
o
C até 150
o
C e a 2
o
C até 260
o
C e a 20
o
C até 300
o
C
permanecendo constante durante 1 minuto. A rampa para os HPAs e ABLs
teve início em 40
o
C com aumento a taxa de 20
o
C até 60
o
C e a 5
o
C min
-1
até
290
o
C onde permaneceu por 5 minutos e aumento a 10
o
C até 300
o
C onde
permaneceu constante durante 10 minutos.
A identificação dos pesticidas, HPAs, BPCs e ABLs foi feita por
comparação dos tempos de retenção com padrões de referência da
Accustandard, EUA. Os compostos analisados no GC-MS também foram
identificados também através do espectro de massa. A quantificação foi feita
por razões entre os surrogates e os compostos de interesse, baseada nas
curvas analíticas montadas com pelo menos 05 concentrações diferentes de
cada grupo de compostos.
3.4 Análises Moleculares
3.4.1 Preparo da amostra
Após as exposições foi realizada a biometria das ostras e estas foram
mortas por rompimento do músculo adutor (Figura 5). A biometria permite
calcular o Índice de Condição (I.C.), obtido pela razão entre o peso da carne e
o peso da concha multiplicado por 100 ((PCarne/PConcha)*100)(Domingos et
al, 2007). As brânquias foram dissecadas e armazenadas em solução para
preservação do RNA (RNAlater – Ambion) e o sexo foi identificado por
microscopia das gônadas. Apenas os animais machos foram utilizados nos
experimentos. Além das brânquias, a glândula digestiva também foi dissecada
no experimento in situ.
20
Figura 5: Ostra Crassostrea gigas com destaque para glândula digestiva
(GD); gônadas (G); músculo adutor (M) e brânquias (B).
3.4.2 Identificação dos genes diferencialmente expressos
3.4.2.1 Extração RNA total
As brânquias das ostras foram lavadas duas vezes com 1 mL de tampão
TE (10mM Tris-HCl; 1mM EDTA pH 8,0) seguido de centrifugação a 2000g por
2 minutos a 4º C, para remoção do muco e fitoplâncton. Esse procedimento
não foi realizado com as amostras de glândula digestiva.
A extração do RNA total das brânquias e glândula digestiva foi realizada
em homogeneizador do tipo Potter com um reagente comercial a base de
etanol e tiocianato de guanidina (TRIzol - Invitrogen) seguindo as instruções do
fabricante com poucas modificações (proporção 200mg tecido / 1 mL de Trizol;
30 minutos de incubação após a homogeneização). Nessa primeira etapa foi
extraído RNA total de uma amostra do grupo controle (pool 3 animais; 1g de
tecido) e uma amostra do grupo exposto (pool 3 animais; 1g de tecido).
Ao final da extração as amostras foram ressuspendidas em 100 uL de
água para biologia molecular.
Após a extração, a concentração e a pureza do RNA foram checadas em
espectrofotômetro a 260nm e pela razão da absorbância 260/280nm,
respectivamente. A integridade do RNA foi analisada por eletroforese em gel de
agarose 1% formaldeído 5% em tampão MOPS 1x corado com brometo de
etídio e observado sob luz ultravioleta.
G
M
B
GD
21
3.4.2.2 Purificação do RNA mensageiro
O RNAmensageiro foi isolado com o kit comercial Oligotex mRNA Midi
kit (Qiagen). Esse kit utiliza contas de látex contendo oligonucleotídeos de
timina (oligo-dT) que hibridizam com a cauda poli-A dos RNA mensageiros
presentes na amostra, sendo que os demais tipos de RNA não são capturados.
O procedimento foi realizado com 1mg de RNA total dos grupos controle
e exposto (foi necessário juntar amostras de 2 extrações de RNA total de cada
grupo para obter a quantidade necessária), totalmente de acordo com as
instruções do fabricante do kit. O RNAm foi concentrado com a adição de 0,1
vol. de NaAc pH 5,2 e 2,5 vol. de isopropanol, incubado a -20
o
C por 1h. Após a
incubação a amostra foi centrifugada a 14.000g/20min/4
o
C e lavada 2 vezes
com etanol 80%. O pellet foi ressuspendido em água. Para obter a quantidade
de RNAm necessária para a hibridização subtrativa foram reunidas amostras
de duas extrações de cada grupo. A concentração e pureza do RNAm foram
avaliadas conforme descrito acima.
3.4.2.3 Hibridização subtrativa supressiva
A partir de 2 ug de RNAm das brânquias das ostras dos grupos controle
e exposto ao esgoto foi realizada a hibridização subtrativa após a síntese do
cDNA, com o kit PCR Select cDNA Subtraction Kit (Clontech). Este kit permite
a hibridização dos fragmentos de cDNA comuns aos dois grupos (controle e
exposto), enquanto os fragmentos diferencialmente expressos são amplificados
por reações de PCR ao final do procedimento.
O processo da hibridização subtrativa começou com a síntese de cDNA
a partir de mRNA, e subseqüente digestão desse material pela enzima de
restrição Hae III. Uma das populações de cDNA, denominada de tester e cujos
genes diferencialmente expressos foram amplificados, foi dividida em dois
grupos e a cada um desses grupos foi ligado um oligonucleotídeo adaptador
específico na extremidade 5’ (Figura 1). Após a ligação dos adaptadores,
adicionou-se a cada uma das porções de tester determinada quantidade do
outro grupo de fragmentos, denominada de driver, para que ocorresse a
hibridização dos fragmentos comuns aos dois grupos (desnaturação 98ºC/90s;
hibridização 8h/68ºC). A seguir realizou-se uma segunda hibridização, unindo
as duas porções do tester e adicionando-se novamente o driver (20h/68ºC),
22
porém sem prévia desnaturação. Essa hibridização originou moléculas
contendo os dois adaptadores diferentes (hibridização dos tester entre si), que
representam os genes diferencialmente expressos (presentes apenas na
amostra tester) e que foram então amplificados pelo PCR supressivo. As
amostras dos animais expostos ao esgoto compuseram o grupo tester, de
modo que foram analisados os genes diferencialmente expressos nesse grupo
(genes cuja expressão foi induzida após a exposição ao esgoto).
Para realização da reação de PCR supressivo as extremidades
complementares aos adaptadores foram preenchidas através da incubação da
reação a 75º C por 5 minutos, criando pontos de ancoragem para os
iniciadores de DNA. Nessa reação as moléculas com sequências
complementares nas duas extremidades apresentam forte tendência a
hibridizar consigo mesmas formando uma alça, ao invés de anelar com os
iniciadores da reação. Quando ocasionalmente um iniciador consegue anelar e
é estendido, a molécula formada também contém sequências complementares
nas extremidades e é suprimida. Assim somente os cDNAs com diferentes
adaptadores nas duas extremidades foram amplificados exponencialmente
nessa reação. A segunda reação, denominada nested PCR, foi realizada para
reduzir ainda mais o background, enriquecendo os transcritos diferencialmente
expressos e fazendo com que transcritos diferentes que variavam em
abundância na amostra original de RNAm apresentem-se em proporções
aproximadamente iguais.
23
Figura 6: Esquema ilustrativo da hibridização subtrativa supressiva
(adaptado de Clontech PCR-Select
TM
cDNA Subtraction Kit User Manual).
1ª Hibridização (mistura o grupo
driver com cada um dos grupos
tester em separado).
Genes comuns aos dois grupos.
Genes presentes apenas no
grupo exposto.
2ª Hibridização (mistura os 2
grupos tester e adiciona mais do
grupo driver).
Adição de primers e amplificação
por PCR.
Ausência de amplifi
cação das
Tester – Adp 1 Tester – Adp 2
Driver
24
3.4.2.4 Clonagem dos fragmentos de cDNA diferencialmente
expressos
Os produtos de PCR diferencialmente expressos foram purificados pelo
kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) e ligados em
vetores pGEM-T
®
Easy (Promega) para transformação das células
competentes JM-109, através de choque térmico. Estas células são
recomendadas pelo fabricante por serem compatíveis com o sistema de
identificação colorimétrica de eficiência da transformação.
Após a transformação, 200µl da solução contento as bactérias
transformadas foram aplicados em placa contendo ágar 35g/L (LB Agar-
Sigma), ampicilina (100mM), IPTG 0,5mM e X-Gal 50mM e deixadas a 37º C
por 18 horas para crescimento de colônias.
Ao final do procedimento, as colônias de bactérias que possuíam o
plasmídeo com o inserto apresentaram cor branca. Todas as colônias brancas
foram transferidas separadamente para tubos de ensaio contendo meio de
cultura líquido 20g/L (LB Broth - Sigma) durante 18 horas a 37ºC em agitação
constante para amplificação da concentração de cDNA.
3.4.2.5 Purificação do plasmídeo
A purificação do plasmídeo foi feita a partir de 3 mL do meio líquido
contendo a colônia utilizando o kit Perfectprep
®
Plasmid Mini (Eppendorf) de
acordo com as instruções do fabricante.
A concentração do material purificado foi checada em espectrofotômetro
a 280 nm e a inserção do plasmídeo foi conferida através de eletroforese em
gel de agarose 1,2% após a digestão do plasmídeo pela enzima ECO RI.
3.4.2.6 Sequenciamento
Os fragmentos de cDNA diferencialmente expressos e purificados foram
encaminhados para sequenciamento no Laboratório de Hanseníase
(FIOCRUZ) em colaboração com o Dr. Milton Ozório de Moraes. Para o
sequenciamento foi utilizado um sequenciador ABI3730 de 48 capilares
(Applied Biosystems). O seqüenciamento foi realizado com o kit ABI Prism Big
25
Dye Terminator Cycle Sequencing kit (PE Applied Biosystems). A manipulação
das seqüências foi realizada com o programa para Edição de Seqüências
Bioedit (HALL, 1999).
3.4.2.7 Análise das seqüências
As seqüências obtidas foram comparadas com o banco de dados
disponíveis no banco de genes. A análise dos dados foi realizada com o
programa tBLASTn (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
).
3.4.3 Análise dos genes diferencialmente expressos na exposição ao
esgoto em aquários
3.4.3.1 Extração RNA total das brânquias de ostras
O RNA total das brânquias de 5 ostras macho dos grupos controle e
exposto foram extraídos individualmente, conforme descrito acima e tiveram
sua pureza e integridade verificadas em espectrofotômetro (3.4.2.1).
3.4.3.2 Síntese de cDNA das brânquias de ostras
A síntese do cDNA foi realizada com o kit Omniscript
TM
Reverse
Transcriptase (Qiagen) a partir de 2μg de RNA total acrescido de dNTP 5mM;
oligo-(dT)15 (Promega) 1μM; inibidor de RNase 10U., transcriptase reversa
omniscript 4U. As amostras foram incubadas por 60 minutos a 37
o
C e
posteriormente armazenadas a -20
o
C. A concentração e a pureza do cDNA
foram checadas em espectrofotômetro a 260nm e pela razão da absorbância
260/280nm, respectivamente.
3.4.3.3 Desenho dos iniciadores de DNA
Para confirmação da indução da expressão gênica nas ostras expostas
ao esgoto foram desenhados iniciadores de DNA com o software Primer3
(Rozen & Skaletsky, 2000) para 5 dos genes identificados (Tabela I). Esses
genes estão envolvidos em mecanismos de biotransformação de fases I, II e III
(Citocromo P450 - CYP 356A1; Glutationa S-transferase classe ômega - GSTO
e proteína de resistência a múltiplas drogas - MDR), ligação e transporte de
ácidos graxos e compostos hidrofóbicos (FABP) e síntese do grupo heme
26
(ALAS). Além desses desenhou-se iniciadores também para o gene constitutivo
gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH).
27
Tabela 1: Pares de iniciadores e tamanho esperado dos fragmentos gênicos
analisados nas brânquias de Crassostrea gigas expostas a esgoto doméstico
não tratado.
Gene Iniciadores
Expected
size (bp)
CYP356A1
sense: 5´CCA GAA GAA TTT GAC CCA CTT CG 3´
antisense: 5´TTT GTA ATC GGA CGG AAG CTC TAC 3´
249
GSTO
sense: 5´GGT GTA TCC CGA TAA CAA GCT GAC 3´
antisense: 5´CTG AGG GTC CAG TCG ACA TTT TT 3´
362
MDR
sense: 5´GGC AGT CAT GTT CTT TGC CTA TG 3´
antisense: 5´GCA GCC ATT GGA CAT TTA GAT CCT 3´
443
FABP
sense: 5´ GTT TGA GGG AAA CTG GGA ATG C 3´
antisense: 5´ TCC GTC GGA ATA TGT CAG TTT AGC 3´
255
ALAS
sense: 5´AGA CCT CAC ACT CAT CCG GAC AGA CAG 3´
antisense: 5´ CTT CAC TAC CAG TCT CCT CCC ACC AC 3´
427
GAPDH
sense: 5´ ACT CCA AAG ACC AGA ACA TCG T 3´
antisense: 5´CAA AGC TGT CGG AAA GGT TAT C 3´
275
3.4.3.4 Padronização das condições de PCR
As reações de amplificação foram realizadas utilizando-se o kit de PCR
da empresa Biosystems (Biosystems Comercial, Importadora, Exportadora de
Equipamentos de Laboratório Ltda) e continham Tampão PCR 1x, Taq
Biossystems (1U), dNTPmix (10mM cada dNTP), MgCl
2
(2mM), iniciadores
sense e antisense (10µM) e 1,2 µg de cDNA.
Os pares de iniciadores utilizados nas reações de PCR foram testados
em ensaio preliminar para otimizar as condições de amplificação do cDNA e
estabelecer o número de ciclos ideais para cada reação, visando analisar a
expressão de cDNA em sua fase exponencial de amplificação.
Definido o número de ciclos para cada gene, foi realizado um PCR semi-
quantitativo com o cDNA das brânquias de ostras macho dos grupos controle e
exposto (n=5).
28
Ao iniciar as análises moleculares das amostras de ostras expostas a
esgoto no ambiente, o kit de PCR foi substituído pelo da empresa Biotools
(Biotechnological & Medical Laboratories-SA, Espanha). As condições da
reação de PCR foram mantidas, entretanto foi realizada nova padronização do
número de ciclos para cada gene analisado.
3.4.3.5 Análise da expressão gênica por RT-PCR semi-quantitativo
As reações de RT-PCR foram realizadas em um termociclador TGradient
(Biometra) conforme descrito na Tabela 2.
Tabela 2: condições das reações de RT-PCR para análise da expressão
gênica em brânquias de Crassostrea gigas expostas a esgoto doméstico não
tratado.
Gene PCR
CYP356A1
2 min. 94
o
C; 25 ciclos de 94
o
C por
15s, 51
o
C por 45s e 72
o
C por 60s.
GSTO
20 ciclos de 94
o
C por 30s, 52
o
C por
45s e 72
o
C por 60s.
MDR
2 min. 94
o
C; 32 ciclos de 94
o
C por
30s, 52
o
C por 45s e 72
o
C por 60s.
FABP
2 min. 94
o
C; 5 ciclos de 94
o
C por 15s
diminuíndo 2
o
C da temperatura de
anelamento por ciclo, iniciando em 60
o
C, 72
o
C por 30s; 18 ciclos de 94
o
C
por 15s, 51
o
C por 45s e 72
o
C por
30s.
ALAS
26 ciclos de 94
o
C por 30s, 58
o
C por
30s e 72
o
C por 30s.
GAPDH
2 min. 94
o
C; 27 ciclos de 94
o
C por
15s, 49
o
C por 45s e 72
o
C por 60s.
29
3.4.3.6 Eletroforese em gel de agarose
Os produtos das reações de PCR foram analisados em gel de agarose
1,2%/TAE 1X, corado com brometo de etídeo (0,7µg/ml). Foram aplicados 10µl
de cada amostra com o tampão 6X azul/laranja (Promega). Após a eletroforese
o gel foi visualizado e fotografado em luz U/V para realizar a densitometria.
3.4.3.7 Densitometria
A intensidade das bandas com o material amplificado dos genes
CYP356A1, GSTO, MDR, ALAS e FABP foi analisada por densitometria com o
software GelQuant. Para normalização da expressão dos genes supracitados
foi utilizada a expressão do gene GAPDH, que não apresentou variação entre
os grupos.
3.4.4 Análise dos genes diferencialmente expressos na exposição ao
esgoto no ambiente
Cinco ostras macho mantidas por 14 dias em cada local de exposição
(Figura 4) foram separadas para extração do RNA total e síntese do cDNA
conforme descrito nos itens 3.4.2.1 e 3.4.3.2. A expressão dos genes
CYP356A1, GST, MDR, FABP e ALAS foi analisada por PCR semi-quantitativo
com iniciadores específicos nas mesmas condições descritas no item 3.4.3.5,
entretanto o gene normalizador utilizado foi o da Actina (ACT: 94ºC por 2 min.;
25 ciclos de 94ºC/15s, 61ºC/45s e 72ºC/30s). O produto da reação de PCR foi
analisado em eletroforese em gel de agarose e submetido à densitometria
conforme já descrito (3.4.3.6 e 3.4.3.7).
3.4.5 Análise Estatística dos dados
Os dados obtidos pela densitometria dos fragmentos amplificados nos
experimentos de RT-PCR semiquantitativo da exposição em aquários foram
comparados estatisticamente pelo teste t de Student utilizando-se um p<0,02.
Para a comparação entre os grupos dos diferentes locais amostrais no
experimento de campo foi utilizado o teste de análise de variância de uma via,
30
uma vez que os dados apresentaram distribuição normal pelo teste de
Kolmogorov-Smirnoff.
31
4 Resultados
4.1 Índice de Condição das ostras (I.C.)
A partir da biometria dos organismos analisados nos experimentos foi
calculado o índice de condição, que expressa a relação percentual entre o peso
úmido da carne e o peso da concha (Figura 7).
controle exposto
0
100
200
300
400
SSH e RT-PCR AQ
Índice de condição (I.C.)
RT-PCR Ambiente
ponto 1 ponto 2 ponto 3 ponto 4
0
10
20
30
40
50
60
70
Índice de condição (I.C.)
Figura 7: Índice de condição ((peso da carne/peso da concha)*100) das
ostras utilizadas nos dois experimentos de exposição ao esgoto. A –
hibridização subtrativa supressiva e análise da expressão gênica em aquários
(n=10 em cada grupo); B – análise da expressão gênica no ambiente (n=5 em
cada grupo). Média e desvio padrão.
Nenhuma diferença estatisticamente significante entre os grupos
amostrais nos experimentos realizados foi observada. Nos experimentos de
hibridização subtrativa supressiva e análise da expressão gênica por RT-PCR
semi-quantitativo, ambos realizados em aquários, as ostras apresentaram os
A
B
32
valores mais altos de índice de condição (CONT. 291.3%; EXP. 366,1%)
(Figura 7 A). Essas ostras apresentaram um comprimento médio de 9,7cm. As
ostras transplantadas para locais contaminados por esgoto tinham um
comprimento médio de 7,7cm e apresentaram Índice de Condição menor (entre
57,6% e 46,6%) (Figura 7B).
4.2 Análise do esgoto
O esgoto coletado na Estação de Tratamento Insular da CASAN
apresentava coloração cinza claro e odor oleoso desagradável. A Tabela 3
apresenta os valores das análises químicas e microbiológicas da coleta que foi
realizada nas primeiras horas da manhã.
Tabela 3: Parâmetros químicos e microbiológicos do esgoto doméstico não
tratado.
DQO
(mg/L)
DBO
5
(mg/L)
Alcalinidade
(mg CaCO
3
)
Cloretos
(mgCl
-
/L)
Coliformes
totais (NMP)
Coliformes
fecais
(NMP)
335
218,4
210,4
57,5
2,9x10
9
3,6x10
8
4.3 Fatores Abióticos e Análises Químicas
Durante o experimento in situ foram coletadas amostras de água
superficial no início, após 7 dias e após 14 dias de exposição para a realização
das análises físicas, químicas e microbiológicas. Os resultados de turbidez,
coliformes fecais, nitrogênio amoniacal, nitrito e fosfato são mais altos no local
contaminado e apresentam os maiores valores na última coleta. Já o oxigênio
dissolvido e a salinidade apresentam os menores valores nesse local com uma
queda na coleta do último dia (Figura 8).
33
Turbidez
3
1/0
8
0
6/09 14/0
9
0
10
20
30
40
50
60
70
Lc 1
Lc 2
Lc 3
Lc 4
UNT
Coliformes fecais
3
1/0
8
0
6/0
9
1
4/0
9
0
10000
20000
30000
Lc 1
Lc 2
Lc 3
Lc 4
NMP
OD
3
1/0
8
0
6/0
9
14/0
9
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Lc 1
Lc 2
Lc 3
Lc 4
CONAMA357>6,00mg/L
Oxigênio Dissolvido
(mg.L-1)
Salinidade
3
1/0
8
0
6/0
9
14/0
9
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
Lc 1
Lc 2
Lc 3
Lc 4
ppt
Temperatura
3
1/0
8
0
6/0
9
14/0
9
15
16
17
18
19
20
21
22
Lc 1
Lc 2
Lc 3
Lc 4
Temperatura (
o
C)
pH
3
1/0
8
0
6/0
9
14/0
9
7.0
7.5
8.0
8.5
Lc 1
Lc 2
Lc 3
Lc 4
N-NH4
3
1/0
8
0
6/0
9
14/0
9
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Lc 1
Lc 2
Lc 3
Lc 4
CONAMA357<0,40mg/L
mg.L-1
NO
2
3
1/0
8
0
6/0
9
14/0
9
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
Lc 1
Lc 2
Lc 3
Lc 4
mg.L
-1
P-PO3
3
1/0
8
0
6/0
9
1
4/0
9
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
Lc 1
Lc 2
Lc 3
Lc 4
mg.L-1
DBO
5
3
1/0
8
0
6/0
9
1
4/0
9
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Lc 1
Lc 2
Lc 3
Lc 4
mg.L
-1
O
2
Figura 8. Parâmetros físicos e químicos na água dos locais 1, 2, 3 e 4
durante a exposição in situ.
34
Também foi observado um gradiente de contaminação desde o local 1
até o 4, identificado pelos teores de coliformes fecais na água (Figura 8), alquil
benzenos lineares (ABLs) e dicloro-difenil-tricloroetanos (DDTs) no sedimento
(Tabela 4) e hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), bifenilas
policloradas (BPCs), ABLs e DDTs nas ostras mantidas nestes locais (Tabela
5). A relação entre os isômeros internos e externos dos ABLs variou entre 0,3 e
0,8 no sedimento e 0,79 e 2,11 nas ostras.
Tabela 4: Concentração de contaminantes orgânicos nas amostras de
sedimento dos locais de exposição do experimento in situ.
Local 1 Local 2 Local 3 Local 4
HPAs totais (ng/g ps) 93,76 73,48 127,81 92,46
BPCs totais (ng/g ps) - 3,79 - -
ABLs (ng/g ps) 628 609,7 464,7 313,8
ABLs (I/E) 0,8 0,4 0,5 0,3
Esteróis totais (ug/g ps) 13,40 20,33 - 0,07
Coprostanol (ug/g ps) 5,40 1,00 - -
Colesterol (ug/g ps) 2,95 13,94 - 0,07
Colestanol (ug/g ps) 1,47 0,92 - -
DDTs (ng/g ps) 1,08 0,37 0,37 0,16
(-) abaixo do limite de detecção.
Importante ressaltar que o local 4, considerado como referência,
apresentou níveis baixos de HPAs e ABLs no sedimento (Tabela 4) e HPAs,
BPCs e ABLs nas ostras (Tabela 5). Além disso, as ostras analisadas no tempo
zero, provenientes do cultivo do LMM em Sambaqui, também apresentaram
concentrações detectáveis de HPAs, BPCs, ABLs e DDTs (Tabela 5).
35
Tabela 5: Concentração dos contaminantes orgânicos nas ostras Crassostrea
gigas mantidas nos locais de exposição durante o experimento in situ
Tempo Zero Local 1 Local 2 Local 3 Local 4
HPAs totais (ng/g ps) 100 335 117 97 100
BPCs totais (ng/g ps) 9,05 44,70 17,7 23,5 23,4
ABLs (ng/g ps) 132 965 236 210 178
ABLs (I/E) 0,88 2,11 1,05 0,79 0,87
DDTs (ng/g ps) 3,40 7 - - -
(n=3) (-) abaixo do limite de detecção.
4.4 Identificação dos genes diferencialmente expressos
A partir de 1g de brânquia de Crassostrea gigas (pool de 3 animais) foi
possível extrair entre 934,46 e 968,69 ug de RNA total apresentando uma
razão 260/280 entre 1,90 e 1,96. A purificação do RNAm resultou em 6,04 e 8,9
ug de RNAm para os grupos controle e exposto, respectivamente, porém com
concentrações de 0,18 e 0,12 ug/uL, muito baixas para a realização da
hibridização subtrativa supressiva (HSS). Dessa forma realizou-se a
concentração e precipitação das amostras resultando em 11,42 e 6,05 ug com
concentrações de 0,81 e 0,67 ug/uL para os grupos controle e exposto,
quantidades e concentrações suficientes para realizar a HSS.
O produto do primeiro e do último PCR da HSS, contendo os genes que
tiveram sua expressão induzida pela exposição ao esgoto, bem como da
amostra não subtraída e os controles do Kit podem ser visualizados na Figura
9. É possível observar as bandas na posição 5, indicando a presença dos
fragmentos gênicos na amostra do último PCR do método, após as duas
hibridizações subtrativas.
36
Figura 9: Produtos de PCR da hibridização subtrativa supressiva em gel
de agarose 2% TAE 1X. 1. Marcador de peso molecular ФX 174DNA/HaeIII; 2.
Produto do primeiro PCR após a hibridização subtrativa supressiva das ostras
expostas ao esgoto (subtração forward); 3. Produto do primeiro PCR de
músculo esquelético humano (controle do kit); 4. Amostra não subtraída da
hibridização das ostras expostas ao esgoto; 5. Produto do Nested PCR das
ostras expostas ao esgoto; 6.Produto do Nested PCR de músculo esquelético
humano. 7. Marcador de peso molecular de 1kb.
O produto da HSS foi clonado em células JM109 ligados ao plasmídeo
pGEM-T Easy (Promega) e o resultado da transformação pode ser observado
na Figura 10. A placa mostra um bom número de colônias sendo várias delas
com o plasmídeo contendo o inserto (colônias brancas).
37
Figura 10: Placa de Petri com as colônias de células JM109 (Promega)
contendo os clones resultantes da hibridização subtrativa supressiva. Colônias
brancas – células com plasmídeo; colônias azuis – células sem plasmídeo.
Após extração do plasmídeo e verificação da presença do inserto por
digestão com EcoRI, foi realizada a reação de PCR para o seqüenciamento
dos fragmentos. Foram obtidos 61 clones, dos quais 15 foram identificados. A
tabela 6 apresenta os genes que tiveram sua expressão induzida nas
brânquias das ostras expostas ao esgoto doméstico. Os dados mostram que
diferentes vias do metabolismo das ostras foram alteradas pela exposição ao
esgoto. Genes associados à síntese protéica, metabolismo aeróbico e
transporte de solutos tiveram sua expressão aumentada quando as ostras
foram expostas ao contaminante. Os genes associados à biotransformação de
xenobióticos, como o citocromo P450 subfamília CYP356A1, glutationaS-
transferase classe ômega (GSTO) e proteína de resistência a múltiplas drogas
(MDR) também tiveram sua expressão aumentada. Um dos clones mais
redundantes foi o da proteína ligante de ácidos graxos (FABP), família de
proteínas citosólicas que ligam não covalentemente ligantes hidrofóbicos,
principalmente ácidos graxos. Esses quatro genes, acrescidos do gene
aminolevulinato sintase (ALAS), responsável por catalisar o primeiro passo na
via de síntese do grupo heme, foram selecionados para confirmação da
38
indução de sua expressão em brânquias de ostras após exposição ao esgoto
doméstico não tratado
Tabela 6: Lista dos genes que tiveram sua expressão induzida pela exposição
ao esgoto, identificados pela hibridização subtrativa supressiva.
Homólogo(proteínaouDNA) Evalue
Acessono
Genebank*
Tamanho*
Espéciecomparada
Acessoao
Genebank**
Tamanho**
CitocromoP4503561A 3e‐24
EF645271
413pb Squalusacanthias AAB34256 509aa
GlutationaS‐transferaseclasseômega 4e‐22 ‐ 506pb Crassostreagigas CAD89618 243aa
Proteínaderesistênciaamultidrogas 1e‐52
EU073425
565pb Gallusgallus
XP_418636
1307aa
SimilaraproteínaAcilCoAOxidase 1e‐38
EU108716
628pb Daniorerio
AAH83524
660aa
IsoformaAdaOxidasealternativa 1e‐91
EU108720
877pb
A
canthamoeba
castellanii
ABB04277
370aa
5‐Aminolevulinatosintase 1e‐51
EU073062
540pb Sepiaofficinal
i
s
AAD20808
603aa
ProteínaS2dasubunidaderibossomal40S 2e‐23
EU108718
188pb Ictaluruspunctatus
AAK95183
277aa
SimilaraproteínaribossomalL18a 1e‐20
EU108719
208pb Branchiostoma
belcheri
AAN52374
176aa
SimilaraAsparaginiltRNAsintetase 2e‐94
EU108715
548pb Drosophila
melanogaster
NP_609948
558aa
Proteínaligantedeácidosgraxos 1e‐09
EU069496
391pb Caenorhabditis
elegans
NP_491928
136aa
Similaraocarreadordesolutodafamília27 1e‐08
EU108714
218pb Canisfamiliaris
XP_531894
913aa
Motivoalfaestérilcomdomínio8 3e‐36
EU108712
548pb Musmusculus
NP_080559
478aa
SimilaràproteínaPHD
f
inge
r
5e‐33
EU108713
577pb Canisfamiliaris
XP_867023
1955aa
SimilaràproteínaC8orf1(hT41) 1e‐42
EU108711
578pb Pantroglodytes
XP_528185
549aa
GenehomólogodafamíliaRAS 1e‐12
EU108717
172pb Rattusnovergicus
AAH61760
205aa
* número de acesso e tamanho das sequências depositadas pelo nosso grupo de pesquisa
para Crassostrea gigas; ** número de acesso e tamanho da sequência da espécie mais
próxima.
39
4.5 Análise da expressão gênica diferencial em aquários
Para confirmação da indução da expressão pela exposição ao esgoto,
foram escolhidos os genes associados à biotransformação de fase I
(CYP356A1), fase II (GSTO) e fase III (MDR), ligação e transporte de ácidos
graxos e compostos lipofílicos (FABP) e síntese do grupo heme (ALAS). Para
normalização da expressão desses genes foi utilizado o gene GAPDH. Com o
software Primer3 foram desenhados iniciadores para a amplificação das cópias
destes genes (Tabela 1).
Após o desenho dos iniciadores foi realizada a padronização das
condições de PCR com as curvas de ciclos, de modo a identificar a região
exponencial das curvas. Foram realizadas curvas de ciclos para os 5 genes
investigados e para o gene normalizador (Figura 11).
40
Figura 11: Padronização do número de ciclos para identificação da fase
exponencial em que foram realizadas as reações de RT-PCR em brânquias de
Crassostrea gigas nos experimentos de exposição ao esgoto em aquários. A -
CYP356A1, 25 ciclos; B – GSTO, 20 ciclos; C – MDR, 32 ciclos; D – FABP, 18
ciclos; E – ALAS, 26 ciclos e F – GAPDH, 27 ciclos.
A
B
C D
E
F
25
20
32
18
26
27
41
O número de ciclos da reação de PCR definido para cada gene foi: 25
ciclos para CYP356A1; 20 ciclos para GSTO; 32 ciclos para MDR; 18 ciclos
para FABP; 26 ciclos para ALAS e 27 ciclos para GAPDH (Figura 11).
Uma vez determinadas as condições ideais das reações de PCR, a
interferência da exposição das ostras a 33% de esgoto doméstico não tratado
por 48h foi investigada por RT-PCR semiquantitativo com iniciadores
específicos para os genes CYP356A1; GSTO; MDR; FABP e ALAS,
normalizados pela expressão do gene GAPDH (Figura 12).
CYP356A1 GSTO MDR FABP ALAS
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Controle
Exposto
*
*
*
*
*
níveis de RNAm (u.a.)
Figura 12: Expressão dos genes do Citocromo P450 (CYP356A1), Glutationa
S-transferase classe ômega (GSTO), Proteína de resistência a múltiplas drogas
(MDR), Proteína ligante de ácidos graxos (FABP) e Amilolevulinato sintase
(ALAS) em brânquias de Crassostrea gigas expostas a esgoto doméstico não
tratado diluído 33% por 48h. As reações de RT-PCR semi-quantitativo foram
42
realizadas com a mesma quantidade de cDNA (1,2 ug) obtido a partir do RNA
total extraído das brânquias. O gene Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
(GAPDH) foi usado como normalizador. (a) eletroforese em gel de agarose dos
produtos das reações de RT-PCR. Grupo controle (não exposto) (n=4) e grupo
exposto (n=5). (b) quantidade de transcritos de CYP356A1, GSTO, MDR, FABP
e ALAS em relação aos transcritos de GAPDH. Valores representam média +
desvio padrão de 4 animais no grupo controle e 5 no grupo exposto. * indica
diferença estatisticamente significante (p<0,02).
A quantidade de transcritos nas amostras de brânquias de ostras
expostas as esgoto doméstico foi significativamente maior do que nas ostras do
grupo controle para todos os genes analisados (Figura 12 A e B). Os níveis de
expressão foram 1,9; 3,3; 3,3; 43,6 e 2,9 vezes maiores no grupo exposto do
que no grupo controle para CYP356A1, GSTO, MDR, FABP e ALAS
respectivamente.
4.6 Análise da expressão gênica diferencial in situ
Ao iniciar as reações de PCR para analisar a expressão gênica nas
amostras de campo foi necessário realizar uma nova padronização do número
de ciclos de forma a comparar a expressão dos genes na sua fase exponencial
de amplificação. Este procedimento foi realizado para as amostras de
brânquias e de glândula digestiva das ostras (Figuras 13 e 15).
43
Figura 13: Curva do número de ciclos para identificação da fase
exponencial em que foram realizadas as reações de RT-PCR em brânquias de
Crassostrea gigas nos experimentos de exposição ao esgoto in situ. A -
CYP356A1 29 ciclos, B – GSTO 24 ciclos, C – MDR 29 ciclos, D – FABP 30
ciclos, E – ALAS 28 ciclos e F – Actina 25 ciclos.
E
F
C D
A
B
25
28
30
29
24
29
44
GSTO
MDR
FABP
ALAS
ACT
Local 1
Local 2 Local 3 Local 4
CYP 356A1
Figura 14: Expressão dos genes citocromo P450 (CYP356A1), proteína
ligante de ácidos graxos (FABP), glutationa S-transferase classe omega
(GSTO), proteína de resistência a múltiplas drogas (MDR) e aminolevulinato
sintase (ALAS) por PCR semi-quantitativo em brânquias de ostras (n=5) dos
locais 1, 2, 3 e 4. O gene da actina (ACT) foi empregado como normalizador. A
– gel de agarose 1,2% TAE 1x; B – densitometria do resultado da eletroforese.
l
oc
al
1
l
oc
a
l
2
l
oc
al
3
local 4
0
1
2
GSTO / ACT
(unidades arbitrárias)
l
o
ca
l
1
local
2
local
3
loca
l
4
0.0
0.5
1.0
1.5
CYP 356A1 / ACT
(unidades arbitrárias)
lo
c
al 1
local 2
l
oca
l
3
lo
c
al
4
0
1
1
2
2
3
ALAS / ACT
(unidades arbitrárias)
loca
l
1
l
o
ca
l
2
l
oc
a
l
3
l
oc
a
l
4
0
1
2
FABP / ACT
(unidades arbitrárias)
l
oca
l
1
l
ocal
2
l
ocal
3
local 4
0
1
2
MDR / ACT
(unidades arbitrárias)
B
A
45
Nenhuma alteração na expressão destes genes na brânquia das ostras
expostas por 15 dias nos diferentes locais de exposição foi observada (Figura
14). Além da alta variabilidade existente dentro de cada grupo o gene
normalizador não apresentou expressão consistente em todos os organismos
dos diferentes grupos. Resultados semelhantes foram obtidos na glândula
digestiva (Figura 16). As ostras mantidas no local 1 apresentaram uma maior
quantidade de transcritos dos genes CYP356A1, GST, MDR, FABP, ALAS, e
também do gene normalizador (ACT) (Figura 16 A).
46
Figura 15: Curva do número de ciclos para identificação da fase
exponencial em que foram realizadas as reações de RT-PCR em glândula
digestiva de Crassostrea gigas nos experimentos de exposição ao esgoto in
situ. A - CYP356A1 34 ciclos, B – GSTO 30 ciclos, C – MDR 34 ciclos, D –
FABP 30 ciclos, E – ALAS 30 ciclos e F – Actina 25 ciclos.
25
30
30
34
30
34
E
F
C D
A
B
47
Figura 16: Expressão dos genes citocromo P450 (CYP356A1), proteína
ligante de ácidos graxos (FABP), glutationa S-transferase classe omega
(GSTO), proteína de resistência a múltiplas drogas (MDR) e aminolevulinato
sintase (ALAS) por PCR semi-quantitativo em glândula digestiva de ostras
(n=5) dos pontos 1, 2, 3 and 4. O gene da actina (ACT) foi empregado como
normalizador. A – gel de agarose 1,2% TAE 1x; B – densitometria do resultado
da eletroforese.
local
1
l
oc
al
2
l
oc
a
l
3
loc
a
l
4
0.0
0.5
1.0
1.5
CYP356A1 / ACT
(unidades arbitrárias)
local
1
l
o
cal
2
l
o
cal
3
l
ocal 4
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
GSTO / ACT
(unidades arbitrárias)
l
oc
a
l
1
l
oc
al
2
l
oc
a
l
3
l
oc
al
4
0
1
2
MDR / ACT
(unidades arbitrárias)
l
oca
l
1
local 2
l
o
c
a
l
3
l
oca
l
4
0.0
0.5
1.0
1.5
FABP / ACT
(unidades arbitrárias)
loca
l
1
loca
l
2
loca
l
3
loca
l
4
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
ALAS / ACT
(unidades arbitrárias)
48
5 Discussão
5.1 Fatores Abióticos e Análises Químicas
A principal causa de contaminação crônica dos ecossistemas marinhos e
estuarinos ao redor do mundo é o lançamento de esgoto doméstico em águas
superficiais (Walker et al., 2001). A maioria das cidades não possui instalações
apropriadas para coleta, tratamento e lançamento dos seus efluentes e aquelas
em que as estações de tratamento estão presentes muitas vezes convivem
com problemas de sobrefluxo, com desvio do excedente para o ecossistema
sem o tratamento adequado (Eganhouse & Sherblom, 2001; Zabel et al., 2001).
No Brasil a situação é agravada pelo fato de importantes cidades litorâneas
como Fortaleza, Salvador, Belém, Vitória, Niterói e Rio de Janeiro lançarem
seus efluentes diretamente no mar através de emissários submarinos (Abessa
et al., 2005). A contaminação por esgoto é normalmente associada com a
presença de microorganismos patogênicos e/ou com o aumento da matéria
orgânica no ecossistema, sendo o mesmo inclusive citado como fonte de
nutrientes para o crescimento de vegetais em áreas de baixa densidade
populacional (Vaillant et al., 2003). Entretanto, nos aglomerados urbanos a
composição do esgoto reflete os hábitos de vida da população e com
freqüência novos tipos de contaminantes são criados e lançados no ambiente.
Petrovic e colaboradores (2003) chamam a atenção para uma classe de
contaminantes emergentes derivados de atividades cotidianas, que não
necessitam ser persistentes para causarem dano, visto que são continuamente
inseridos no ambiente. Entre esses compostos destacam-se os medicamentos
humanos e veterinários, produtos de higiene pessoal, limpeza doméstica,
surfactantes e resíduos de surfactantes, derivados de óleo e plástico e aditivos
industriais diversos. Muitos desses contaminantes atuam como desreguladores
endócrinos interferindo no eixo hipotálamo-hipófise-gônadas e podem
comprometer o sucesso reprodutivo de vertebrados aquáticos (Schlenk et al,
2002; Tilton et al., 2002). Uma vez que as estações de tratamento de efluentes
não são concebidas para eliminar essas classes de contaminantes, os mesmos
podem ser encontrados até mesmo em corpos de água que recebem efluentes
já tratados (Stackelberg et al., 2004). O controle dessa contaminação é
49
importante por questões ecológicas e de saúde pública, contudo enquanto a
avaliação de risco dos contaminantes orgânicos normalmente é baseada nas
concentrações detectadas através de métodos de química analítica e de
ensaios de toxicidade com compostos isolados, no ambiente a toxicidade do
esgoto é refletida pela somatória das respostas dos organismos às misturas
complexas de contaminantes (Wang et al., 2003).
Uma forma de se avaliar os efeitos destas misturas complexas é através
da análise dos mecanismos de resposta biológica que são ativados nos
organismos.
Neste trabalho, a amostra coletada na estação de tratamento Insular de
Florianópolis era composta de um esgoto doméstico não tratado, caracterizado
pelo odor oleoso e desagradável. A coloração cinza clara era característica de
um esgoto recente (Al Shammiri, 2004; Katsoyiannis e Samara, 2007). Os
valores elevados de coliformes e demanda química e bioquímica de oxigênio
estavam semelhantes aos descritos para esgoto doméstico não tratado em
outras regiões do planeta (Tabela 3) (Vaillant et al., 2003; Hench et al., 2003;
Marttinen et al., 2003).
As ostras utilizadas nos experimentos de exposição ao esgoto,
provenientes do cultivo experimental da UFSC (praia de Sambaqui,
Florianópolis) foram produzidas a partir de uma mesma larvicultura. Os
organismos do experimento em aquários estavam com um alto índice de
condição, pois apresentavam as gônadas preenchidas, o que facilitou a
identificação do sexo por microscopia (Figura 7A). O IC é normalmente
utilizado como indicador do estado de saúde dos organismos, podendo ser
afetado pela presença de contaminantes diversos, de modo que índices
semelhantes indicam estados de saúde similares (Domingos et al., 2007). Nos
experimentos de exposição ao esgoto doméstico em aquários e também no
experimento in situ o IC não variou significativamente entre os grupos,
mostrando a homogeneidade das amostras (Figura 7A e B). Outros trabalhos
com bivalves analisaram índices diferentes como o índice de condição corporal
(Body condition = peso / (comprimento)
3
* 100) (Quiroz et al., 2007) ou o índice
gônado-somático (peso da gônada / peso tecidos moles) (Yeats et al., 2008),
entretanto esses índices não se aplicam a C. gigas no primeiro caso devido à
50
forma irregular da concha, o que descaracteriza o comprimento como uma
medida padrão, e no segundo caso devido as gônadas se desenvolverem
sobre o corpo do animal, o que dificulta sua separação e dissecção.
A investigação da expressão gênica diferencial ocorreu inicialmente nas
brânquias por vários fatores. As brânquias de moluscos bivalves possuem uma
grande área superficial, são os primeiros órgãos a entrarem em contato com o
contaminante e apresentam um contato muito intenso com o meio, pois servem
para alimentação e respiração (Figura 5) (Contardo-Jara e Wiegan, 2008).
Além disso, trabalhos com biomarcadores detectaram alta atividade da GST,
hsp70 e MXR em brânquias de moluscos (Fitzpatrick et al, 2005; Piano et al,
2005; Smital et al, 2003). Outro órgão normalmente utilizado em análises de
biomarcadores e que também foi analisado nesse trabalho é a glândula
digestiva (Figura 5). Zanette e colaboradores (2008) encontraram aumento da
atividade da enzima G6PDH em glândula digestiva de C.gigas exposta a
esgoto doméstico não tratado enquanto outro trabalho analisou a peroxidação
lipídica em Elliption complanata exposto a cádmio e encontrou aumento nas
brânquias e diminuição na glândula digestiva (Gagné et al, 2008).
O experimento de exposição in situ a esgoto doméstico foi realizado em
local sabidamente contaminado. Os parâmetros físicos, químicos e
microbiológicos corroboram a presença da contaminação e indicam que a
distribuição dos contaminantes no ecossistema sofre forte influência dos
fatores abióticos. Na coleta do último dia de experimento foi registrado um
aumento nos valores de turbidez, NO
2
, NH
4
, PO
4
e DBO
5
no local 1, enquanto
que o oxigênio dissolvido e a salinidade diminuiram (Figura 8). Durante a
segunda semana de exposição não choveu e todas as coletas foram realizadas
com a maré enchente, condições que deveriam concentrar os contaminantes
na desembocadura do rio, enfatizando as diferenças do gradiente de
contaminação em relação aos outros locais analisados. Entretanto o vento
oeste presente no início e meio do período de exposição pode ter auxiliado a
dispersão superficial dos poluentes, o que não ocorreu ao final quando o vento
era nordeste. A coleta do último dia de experimento ocorreu com forte vento
nordeste aliado a maré enchente, o que pode ter contribuído para concentrar o
efluente próximo a desembocadura do Rio Bücheler sendo determinante para
51
as alterações dos parâmetros físicos, químicos e microbiológicos (Figura 8).
Nesse dia a concentração de oxigênio dissolvido foi bem inferior ao
determinado pela resolução do CONAMA (CONAMA 357) (Lc 1 = 3,76;
CON357 > 6,00 mg/L) e o nitrogênio amoniacal e coliformes termotolerantes
apresentaram valores que excedem bastante os limites máximos permitidos por
essa resolução para águas de classe I (destinada à recreação de contato
primário, proteção da comunidade aquática e aqüicultura) (NH
4
Lc 1 = 1,0;
CON357 < 0,40 mg/L; CFecais Lc 1 = 24.000/100mL; CON357 < 1000/100mL).
Essa resolução é ainda mais restritiva quanto à densidade de coliformes
termotolerantes permitida em áreas destinadas ao cultivo de moluscos bivalves
para consumo humano (média geométrica de 15 amostras superior a
43/100mL, com percentil 90% inferior a 88/100mL). Esse fato é preocupante,
pois no local 3 do experimento in situ há um cultivo de moluscos bivalves.
Nesse local foram detectadas concentrações de HAPs e ABLs no sedimento e
bioacumulação de BPCs e ABLs nas ostras (Tabelas 4 e 5). A concentração de
coliformes termotolerantes, por sua vez, oscilou de valores não detectáveis a
valores acima do permitido (Figura 8).
Alguns autores recomendam o uso de outros marcadores de água e
sedimento para evidenciarem o lançamento de esgotos e avaliarem a extensão
desta contaminação. Entre esses marcadores estão o coprostanol, metabólito
resultante da redução do colesterol pela microflora intestinal humana e os
alquilbenzeno lineares (ABLs), compostos formados durante a produção
industrial dos detergentes (Chaler et al., 2001). O coprostanol é relativamente
estável e bem preservado em condições anaeróbicas, constituindo um bom
indicador de contaminação a longo prazo por esgoto doméstico (Takada &
Eganhouse, 1998). Por apresentar baixa solubilidade em água normalmente se
associa ao material particulado sendo posteriormente depositado no
sedimento. Neste trabalho foi detectado um nível de 5,4 ug/g de coprostanol
no local 1, que também apresentou concentrações detectáveis de colestanol
(1,47 ug/g), estigmasterol (*0,57 ug/g) e B-sitosterol (*1,93 ug/g) (Tabela 4)
(*dados não apresentados). O colestanol é resultado da transformação do
coprostanol, mas também pode ser sintetizado por fitoplâncton. Já o
estigmasterol e o B-sitosterol são produzidos por plantas terrestres, porém são
52
os principais esteróides encontrados em óleos vegetais de uso doméstico,
estando, portanto, presentes no esgoto. Outros estudos realizados em áreas
contaminadas têm encontrado a presença de coprostanol de maneira
semelhante ao observado nesse trabalho. Em sedimentos da baía de
Guanabara (Rio de Janeiro) foram detectados níveis de coprostanol entre 0,33
e 40,0 ug/g (Carreira et al., 2004). No sedimento do Rio Mississipi as
concentrações variaram de 0,1 a 7,5 ug/g e os autores afirmam que
concentrações acima de 0,01 ug/g podem ser correlacionadas com a presença
de esgoto (Writer et al., 1995). Alguns índices que expressam as relações entre
o colesterol e seus metabólitos tem sido propostos por alguns autores para
analisar o grau de contaminação por esgoto. Grimalt e colaboradores (1990)
estabelecem que áreas poluídas apresentam relação coprostanol / coprostanol
+ colestanol (I) entre 0,07 e 1,0. Já se o sedimento apresentar uma relação
coprostanol / colestanol + colesterol (II) maior que 0,06 pode ser considerado
poluído (Writer et al, 1995). Mudge & Norris (1997) afirmam que quando as
concentrações de coprostanol ultrapassam as de colesterol (> 1; índice III) a
área é considerada poluída. O local 1 apresentou quase o dobro de coprostanol
em relação a colesterol (1,83), sendo considerado contaminado por esgoto
doméstico também pelos índices I e II. Com base nos dados de sedimento, o
local 2 pode ser considerado poluído apenas pelo índice II, pois apresentou a
maior concentração de colesterol, enquanto os locais 3 e 4 não podem ser
classificados como poluídos pois não apresentaram coprostanol e colestanol
em quantidades detectáveis, embora tenham sido encontrados níveis
significativos de coliformes fecais nesses locais (Figura 8).
Os alquil-benzenos lineares (ABLs) ocorrem como componentes traços
na formulação de detergentes e são introduzidos no esgoto a partir do uso de
detergentes domésticos e industriais (Eganhouse & Sherblom, 2001). Devido à
hidrofobicidade desses compostos, normalmente estão associados à matéria
orgânica particulada e consequentemente podem ser encontrados no
sedimento. Eganhouse e Sherblom (2001) encontraram ABLs associados à
matéria orgânica particulada em áreas com sobrefluxo de estações de
tratamento de esgoto. No sudoeste da Espanha foram detectados entre 293 e
1938 ng/g ps de ABLs totais no sedimento (Lara-Martin et al., 2008) enquanto
53
na Baía de Tóquio as concentrações observadas foram entre 1000 e 3000 ng/g
ps (Takada et al, 1992). Na Baía norte da Ilha de Santa Catarina os valores são
menores do que os citados acima, entretanto existe um gradiente de
contaminação de ABLs no sedimento sendo que o local contaminado apresenta
o dobro da concentração do local referência (Tabela 4). A detecção dessa
classe de contaminantes por si só caracteriza a presença de esgoto doméstico
na região e a presença de ABLs no sedimento corrobora os dados de
coliformes e esteróides, além dos parâmetros físicos e químicos (Figura 8;
Tabela 4). A relação entre os isômeros internos e externos (I/E) dos ABLs
reflete o tempo de existência do esgoto, pois os isômeros externos são
degradados mais rapidamente que os isômeros internos, de modo que o índice
aumenta com a biodegradação da contaminação. De acordo com a literatura
valores menores ou iguais a um (<1) são encontrados nos detergentes e em
efluentes pós-tratamento primário, enquanto esgoto armazenado em
laboratório ou que está há muito tempo no ambiente apresenta valores entre 2
e 6 (Eganhouse & Sherblom, 2001). As amostras de sedimento dos locais 1 a 4
apresentaram valores menores que um, caracterizando um esgoto
recentemente introduzido no ambiente (Tabela 4). Isso acontece também com
as ostras, com exceção do local 1 que apresenta I/E próximo a dois (Tabela 5).
Comparando-se os níveis de ABL nas ostras coletadas no tempo zero e após
14 dias de exposição no local 1, pode ser observado que houve uma
bioacumulação de cerca de 7,3 vezes. Estes níveis foram 5,4 vezes maiores do
que os dos animais mantidos no local 4 (Tabela 5). Os ABLs são compostos
persistentes (devido à hidrofobicidade) e dificilmente excretados.
Além destes compostos foram analisados também os níveis de
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), bifenilas policloradas (BPCs) e
pesticidas organoclorados (DDTs). O somatório dos 36 HPAs analisados pode
ser observado nas tabelas 4 e 5. As concentrações encontradas no sedimento
dos quatro locais de exposição estiveram menores do que aquelas descritas
por Notar e colaboradores (2001) como contaminado (<500ng/g) ou até mesmo
moderadamente contaminado (250 – 500ng/g). Por outro lado as
concentrações de HPAs analisadas nas ostras do local 1 apresentaram níveis
destes contaminantes 3,3 vezes maiores do que as ostras mantidas nos locais
54
3 e 4, e também daquelas analisadas no tempo zero. Estes resultados mostram
claramente que houve bioacumulação em níveis significativos de HPAs nos
animais em apenas 14 dias de exposição. A relação HPAs leves / HPAs
pesados indica que esses contaminantes do sedimento têm origem
principalmente a partir da queima de combustíveis fósseis (HPAs 4 – 6 anéis;
13 – 90,7 ng/g) e não tanto a partir de óleos ou petróleo (HPAs 2 – 3 anéis; 5,3
– 39,3 ng/g), o que sugere que sua origem tem relação com os efluentes
domésticos e não com o tráfego de embarcações no local.
Embora as concentrações de BPCs tenham sido encontradas em níveis
detectáveis apenas no sedimento do local 3 da baía norte (Tabela 4), estas
foram similares às encontradas por Castro-Jimenez e colaboradores (2008) em
uma lagoa costeira do Mediterrâneo e segundo esses autores os valores são
característicos de áreas urbanas moderadamente impactadas. Já nas ostras
houve bioacumulação também dos BPCs (Tabela 5). Uma vez que a
concentração nas ostras do local 1 é 5 vezes maior do que nas ostras
analisadas no tempo zero e que esses contaminantes apresentam alta
afinidade pela matéria particulada e portanto deveriam estar no sedimento,
suspeita-se tratar de uma contaminação recente. Canesi e colaboradores
(2003) averiguaram que 10ug/ml de BPC inibem a atividade fagocítica dos
hemócitos de Mytilus galloprovincialis além de reduzir drasticamente a
estabilidade das membranas dos lisossomos. Embora as concentrações
detectadas nas ostras sejam baixas os resultados sugerem investigação mais
profunda visto tratar-se de um produto tóxico, persistente e que tem sua
produção e comercialização banida por lei.
Souza e colaboradores (2008) encontraram concentrações de DDT em
sedimentos da Baía de Guanabara (Rio de Janeiro) de 1,9 a 3,7 maiores do
que no reservatório de Guapimirim (10,61 ng/g ps), considerado região
referência. Já no estuário de Santos e São Vicente os níveis de DDT no
sedimento variaram de 0,10 a 15,6 ng/g ps, sendo que dois locais não
apresentaram concentração detectável (Bícego et al., 2006). Tomando de base
os valores da Baía de Guanabara as concentrações observadas no sedimento
da baía norte são razoavelmente baixas, entretanto o sistema estuarino de
Santos e São Vicente também é uma região altamente contaminada e
55
apresentou valores similares aos deste estudo em algumas regiões. Além disso
a presença dos maiores valores no local 1 na baía norte mostra um gradiente e
indica contaminação por organoclorados nesse local (Tabela 4). Os níveis de
DDT em ostras do Golfo do México variaram de 257 a 450 ng/g ps nos anos 60
e entre 11 a 18 ng/g ps no final dos anos 70 (Kenish, 1997). As ostras do local
1 apresentaram 7 ng/g ps de DDTs após o período de exposição (Tabela 5).
Comparando-se estes valores com os animais do tempo zero foi observado
uma bioacumulação de 2 vezes. Curiosamente as ostras que permaneceram
nos locais 3 e 4 apresentaram níveis não detectáveis de DDTs, enquanto as
ostras analisadas no início do experimento (tempo zero) mostraram uma
pequena concentração desse composto (Tabela 5). Esse fato sugere a
necessidade de uma investigação mais aprofundada, visto que esses
organismos são provenientes do cultivo experimental do LMM da UFSC, bem
como de um estudo sobre depuração desse contaminante.
O conjunto de dados apresentado permite afirmar que o local 1, situado
junto à foz do rio Bücheller, é impactado por esgoto doméstico, visto que
apresenta maiores concentrações de compostos nitrogenados e fosfatados,
maior DBO
5
e níveis bem elevados de coliformes fecais; menor concentração
de oxigênio dissolvido e maior turbidez (Figura 8); ABLs, organoclorados e
esteróides no sedimento (Tabela 4). Além disso, as ostras mantidas nesse local
durante 14 dias bioacumularam HPAs, BPCs, ABLs e DDTs (Tabela 5).
5.2 Análise da expressão gênica diferencial
O objetivo principal deste trabalho foi o de identificar genes cuja
expressão diferencial em ostras frente à exposição ao esgoto pudesse ser
utilizada como biomarcador em programas de monitoramento. Para atingir tal
meta, inicialmente, foi realizada uma exposição durante 48h de ostras a uma
amostra de esgoto doméstico não tratado diluído na proporção de 33% (Figura
2). A definição da concentração de esgoto utilizada neste experimento foi
estabelecida em função desta ser a concentração máxima possível para que se
pudesse manter a salinidade em 25psu. Experimentos anteriores com
biomarcadores bioquímicos demonstraram que a espécie Crassostrea
56
rhizophorae responde melhor à exposição a óleo diesel nesta salinidade (Silva
et al., 2005). O método escolhido foi a hibridização subtrativa supressiva
(HSS), método que é caracterizado por enriquecer transcritos diferencialmente
expressos presentes em baixo número de cópias, que poderiam ser
mascarados pelos transcritos mais abundantes (Pardinas et al., 1998). Muitos
autores tem utilizado esse método para analisar genes diferencialmente
expressos frente a variadas situações de estresse (Boutet et al, 2004; He et al,
2004; Baldwin et al, 2005; Dios et al, 2007; Hansen et al, 2007). A principal
vantagem deste método é o PCR supressivo, realizado depois da dupla rodada
de hibridizações subtrativas, onde grande quantidade do cDNA driver é
adicionado ao cDNA tester e submetido a hibridização por longos períodos (8h
1ª hibridiz.; 20h 2ª hibridiz.) (Figura 6). A amplificação final por reação de PCR
com iniciadores para os adaptadores presentes apenas nas amostras tester
permite a identificação dos fragmentos gênicos presentes apenas nesse grupo
e diminui a amplificação inespecífica (Figura 9). Além disso, o efeito supressivo
elimina a maioria dos fragmentos pequenos permitindo a amplificação de
moléculas a partir de um certo tamanho, o que aumenta a confiabilidade dos
resultados durante a comparação das sequências com o banco de genes.
Embora alguns autores argumentem que o método está sujeito a muitos
resultados falso-positivos, a combinação da hibridização subtrativa com o PCR
supressivo possibilita reduzir esse número a menos de 2% (Boultelle et al,
2002).
Utilizando o cDNA proveniente das ostras do grupo controle como driver
e do grupo exposto como tester foram obtidos 61 clones considerados como
tendo a expressão induzida pela exposição, dos quais 15 foram identificados
(Tabela 6). Entre esses, estão presentes genes relacionados a diferentes
aspectos do metabolismo como maquinaria traducional, metabolismo aeróbico,
família de transportadores e proteínas nucleares, além de genes responsáveis
por mecanismos de biotransformação de xenobióticos.
Um dos genes identificados que foi ativado após a exposição ao esgoto
pertence a Asparaginil – tRNAsintetase (Tabela 6). A enzima Asparaginil-
tRNAsintetase, uma aminoacil-tRNAsintetase (ARS) de classe IIb, é
responsável pela ligação do aminoácido asparagina a seu respectivo tRNA,
57
através do acoplamento do grupo aminoacil à hidroxila 3´do tRNA (Park et al.,
2005). De acordo com Park e colaboradores (2005), as ARS e as proteínas
multi-funcionais de interação à ARS (AIMPs), estão associadas a uma
variedade de funções além de seu papel na maquinaria de tradução. Entre
essas funções destaca-se a transcrição, tradução, splicing, inflamação,
angiogênese e apoptose (ARS) além de atuar como regulador da proliferação
celular e no reparo de DNA (AIMPs). Assim, a indução desta ARS poderia
estar relacionada a um aumento na síntese protéica em geral ou a alguma das
funções citadas acima. Corroborando a primeira hipótese, a expressão dos
genes das proteínas ribossomais L18a e S2 também foi induzida na brânquia
das ostras expostas a esgoto doméstico (Tabela 6). Enquanto a proteína S2
auxilia a estabilização da estrutura terciária da subunidade menor (small) do
ribossomo a proteína L18a está associada à subunidade maior (large). De
maneira similar, Boutet e colaboradores (2004) observaram C. gigas expostas
a hidrocarbonetos uma indução na expressão do gene de outra ARS, a Arginil-
tRNAsintetase e de algumas proteínas ribossomais (Boutet et al, 2004).
O gene da proteína ligante de ácidos graxos (fatty acid binding protein –
FABP) foi um dos clones mais redundantes. Esta pertence a uma família de
proteínas transportadoras de baixo peso molecular (~14kDa) que se ligam não
covalentemente a moléculas hidrofóbicas, principalmente ácidos graxos
(Esteves & Ehrlich, 2005). A principal função destas proteínas é o transporte de
ácidos graxos da membrana plasmática para vários compartimentos celulares
(Hittel & Storey, 2001). Entretanto, o mecanismo de captação dos ácidos
graxos e transporte através do citoplasma ainda não foram completamente
elucidados (Esteves & Ehrlich, 2005). Em fígado de camundongos a FABP tem
sido proposta como limitante para a oxidação de ácidos graxos de cadeia longa
e para modulação do receptor ativado de proliferação peroxisomal α (PPARα),
um fator de transcrição que determina a capacidade de oxidação de ácidos
graxos (Erol et al., 2004). A expressão do gene da FABP, associado ao gene
do co-transportador de sódio e glicose (SGLT) responsável pela entrada de
glicose na célula, foi induzida em ostras de uma linhagem geneticamente
resistente ao fenômeno da mortalidade em massa de verão (Huvet et al.,
2004). De acordo com Velkov et al. (2005) existe forte evidência de que o sub-
58
tipo L-FABP, identificado originalmente no fígado de vertebrados, esteja
envolvido na mediação da absorção e metabolismo de xenobióticos. A FABP
transporta uma variedade de compostos hidrofóbicos além dos ácidos graxos,
desde moléculas endógenas como o grupo heme, ácidos biliares e
eicosanóides, até drogas exógenas e poluentes ambientais. Além disso, a alta
concentração de FABP em hepatócitos e enterócitos (~3-6% de todas as
proteínas citoplasmáticas) excede muito a concentração de ácidos graxos
disponíveis, o que sugere que a indução da expressão do gene FABP nas
ostras expostas ao esgoto (Figura 12) pode estar relacionada tanto à absorção
e metabolismo de xenobióticos diretamente, como a uma maior demanda
energética do metabolismo devido à situação de estresse químico enfrentado.
Enquanto a primeira hipótese pode ser corroborada pela indução dos
genes CYP356A1 (citocromo P450 isoforma 356A1), GSTO (glutationa S-
transferase classe ômega) e MDR (multi drug resistance – proteína de
resistênica a múltiplas drogas) (Tabela 6; Figura 12), proteínas responsáveis
pela biotransformação de fases I, II e III dos xenobióticos (Stegeman & Hahn,
1984; Sheehan et al, 2001; Bard, 2000), a última é reforçada pela indução de
cDNAs correspondentes a genes como o da enzima Acil Coenzima A Oxidase
e da Oxidase Alternativa (Tabela 6). A enzima Acil Coenzima A Oxidase está
envolvida no primeiro passo da β-oxidação dos ácidos graxos de cadeia muito
longa, que ocorre quase que exclusivamente nos peroxissomos e é
caracterizada pela geração de espécies reativas de oxigênio (Ngo et al., 2003).
A Oxidase Alternativa por sua vez é responsável pela transferência direta de
elétrons da ubiquinona para o oxigênio, na cadeia de elétrons mitocondrial,
gerando um sistema alternativo de transporte de elétrons que contribui menos
para a geração de ATP, mas está associado à geração de calor e à redução da
formação de espécies reativas de oxigênio (Tanton et al., 2003). Desse modo,
para atender uma maior demanda de energia metabólica necessária para
ativação dos mecanismos de biotransformação, os organismos expostos aos
contaminantes poderiam ativar a via da oxidação dos ácidos graxos de cadeia
muito longa nos peroxissomos, gerando uma maior quantidade de espécies
reativas de oxigênio. A via da Oxidase Alternativa na mitocôndria poderia ser
então ativada em resposta ao aumento no estresse oxidativo.
59
Uma das maiores e funcionalmente diversas famílias de proteínas é a
família de citocromos P450. As enzimas associadas ao P450 são relacionadas
com biotransformação de xenobióticos, síntese e degradação de hormônios,
estresse oxidativo e homeostase, entre outros processos (Stegeman & Hahn,
1984). São as principais e mais importantes enzimas oxidativas de
biotransformação de contaminantes lipofílicos em termos de versatilidade
catalítica (Guengerich, 1987). De acordo com Livingstone (1998) todos os
animais possuem um grupo de enzimas de biotransformação de xenobióticos
normalmente presente em níveis mais elevados no fígado ou órgão análogo. O
papel dessas enzimas é converter xenobióticos orgânicos lipossolúveis
hidrofóbicos em metabólitos hidrossolúveis excretáveis. As enzimas de fase I
são responsáveis por introduzir ou modificar um grupamento funcional no
xenobiótico, que poderá ser ligado a uma molécula polar maior por uma enzima
de conjugação de fase II. Boutet e colaboradores (2004) encontraram indução
da expressão de duas isoformas de P450 (CYP3A4 e CYP1A1-like) em C.
gigas expostas a hidrocarbonetos. A transcrição de CYP3A4 é induzida por
muitos compostos naturais e xenobióticos, enquanto CYP1A-like é um
biomarcador clássico de exposição a hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
(Hahn, 2002). Contrariamente, Schlenk e Buhler (1989) não detectaram CYP1A
em C. gigas. A isoforma clonada e identificada no presente trabalho (Tabela 6)
teve a sequência do fragmento de cDNA determinada e foi classificada como
uma isoforma pertencente a uma nova sub-família (CYP356A1) (Toledo-Silva
et al, 2008). A análise filogenética demonstra uma clara relação entre essa
isoforma e as subfamílias CYP1 e CYP17. O trabalho de Toledo-Silva e
colaboradores (2008) mostrou que a expressão de CYP356A1 foi mais elevada
no manto e na glândula digestiva. Uma vez que CYP17 exerce um papel
central no controle do metabolismo dos hormônios esteróides, regulando o
fluxo dos precursores de glicocorticóides e androgênios, a indução de
CYP356A1 observada nesse trabalho poderia estar associada à metabolização
de esteróides nas gônadas (manto) ou à biotransformação de xenobióticos na
glândula digestiva. Halm e colaboradores (2003) afirmam que o papel central
que o P450c17 exerce na produção de esteróides sexuais o caracteriza como
alvo potencial para compostos desreguladores endócrinos. A indução da
60
expressão de CYP356A1 foi acompanhada da indução do gene 5-
Aminolevulinato sintase (ALAS) (Figura 12), que codifica a enzima responsável
pelo passo limitante na rota de biossíntese do grupamento heme, presente nos
citocromos, hemoglobina, catalase e que regula a expressão de vários genes
em células eucariontes (Fujiware et al., 2006). A indução de ALAS poderia,
dessa forma, suprir uma demanda por grupamento heme causada pelo
aumento na síntese de P450.
As GSTs são enzimas de biotransformação de fase II responsáveis pela
conjugação de substratos lipofílicos com o tripeptídeo glutationa através da
transferência do grupo tiol. A classe ômega, entretanto, é responsável pela
redução do ácido dehidroascórbico e parece não ter relação funcional com as
outras classes de GST, sendo associada à resposta celular ao estresse
oxidativo (Board et al., 2000). A enzima atuaria como uma tiol-transferase
dependente de glutationa, removendo adutos S-tiol que algumas proteínas
formam com a glutationa e cisteína em resposta ao estresse oxidativo
(Sheehan et al., 2001). Além disso, essa isoforma regula os receptores
rianodina responsáveis pela homeostase do cálcio e participantes de vários
processos celulares cruciais. Existem evidências de que as GSTOs poderiam
proteger a célula da apoptose dependente do cálcio intracelular, através da
inibição dos receptores rianodina (Sheehan et al, 2001; Burg et al, 2006).
Boutet e colaboradores (2004) encontraram uma forte indução do gene GSTO
em ostras C. gigas expostas a hidrocarbonetos, enquanto o gene de outra
enzima de biotransformação de fase II, a sulfotransferase, foi reprimido.
Nossos resultados mostram uma indução na expressão da GSTO pela
exposição ao esgoto (Figura 12), que pode estar ocorrendo em resposta ao
estresse oxidativo gerado pela biotransformação dos xenobióticos.
O sistema MDR/MXR (multi xenobiotic resistance) é bem caracterizado
em mexilhões e foi descrito para a ostra C. gigas (Minier et al., 2002). O gene
MDR-1 de humanos codifica a glicoproteína-P (P-gp), proteína transmembrana
de 170kDa responsável pelo transporte ativo de drogas e xenobióticos para
fora do ambiente celular (Vaalburg et al., 2005). A P-gp faz parte da
superfamília de proteínas transmembrana transportadoras, conhecidas como
transportadores ABC (ATP-binding cassete). Muitos compostos servem como
61
substratos para a P-gp, sendo que a maioria deles tende a ser compostos
naturais moderadamente hidrofóbicos e planares, que podem ser substratos ou
metabólitos das enzimas de biotransformação (Bard, 2000). A ação conjunta da
P-gp e do citocromo P450 em organismos aquáticos foi revisada por Bard
(2000). Este estudo mostra que as isoformas CYP1A e CYP3A e a P-gp podem
apresentar uma co-indução ou uma redução inversa e que este comportamento
depende da espécie, tecido e sexo do organismo. Deste modo a P-gp e os
CYPs podem ter papel complementar na metabolização e transporte dos
xenobióticos, podendo atuar em conjunto ou não. Os resultados deste trabalho
mostram que tanto MDR quanto CYP356A1 tiveram sua expressão induzida
pela exposição ao esgoto doméstico não tratado nas brânquias de C. gigas
(Figura 12). Uma vez que os metabólitos do citocromo P450 podem servir de
substrato para a P-gp, sugere-se que essa co-indução esteja relacionada ao
aumento da biotransformação dos xenobióticos pelo CYP356A1 e posterior
transporte para fora da célula pela P-gp. Essa biotransformação de fase I gera
espécies reativas de oxigênio, o que por sua vez levaria a um aumento na
expressão do GSTO em resposta ao estresse oxidativo estabelecido.
A ativação de diferentes vias metabólicas em resposta aos
contaminantes do esgoto certamente envolve proteínas de sinalização, que por
sua vez dependem dos domínios de interação proteína-proteína e proteína-
ácido nucléico para funcionar.
O gene do motivo alfa estéril com domínio 8 (Sterile alfa motif – SAM),
que também aparece entre os que tiveram a expressão induzida (Tabela 6),
codifica os domínios SAM, que são responsáveis pela interação proteína-
proteína e conforme descrito recentemente também pela interação proteína-
RNA (Edwards et al, 2005). Os domínios SAM ocorrem em mais de 1000
proteínas em todos os eucariotos e algumas bactérias, estando presentes no
citosol e em todas as organelas celulares onde participam de processos
biológicos variados interagindo com proteínas responsáveis por repressão
traducional, apoptose, remodelamento da cromatina, sinalização pelo receptor
tirosina quinase e via ubiquitina proteossomo, entre outros (Kim & Bowie,
2003). A indução da expressão desse gene nas ostras expostas ao esgoto
pode estar associada a qualquer um desses processos, sendo que há
62
evidências sugerindo que os domínios SAM poderiam estar envolvidos também
na ligação aos lipídeos de membrana (Barrera et al., 2003). Outro motivo
estrutural associado com interação proteína-proteína induzido nas ostras
expostas ao esgoto é o PHD finger (Tabela 6). Este domínio está presente em
proteínas nucleares que interagem modificando a estrutura da cromatina e sua
similaridade com os domínios em anel tem sugerido também a participação dos
domínios PHD finger na mediação da ubiquitinação através da interação com a
ubiquitina-ligase (Bienz, 2006). Além destes genes, também foi induzida a
expressão dos genes similar à proteína C8orf1, associado à meiose e
maturação de gametas (Tauchi et al., 1999), similar ao carreador de solutos da
família 27 e o gene homólogo da família RAS (Tabela 6). Esse último gene
codifica uma proteína similar às Rho GTPases (Rho = Ras homologous), que
ligam ciclicamente à GTP alternando entre os estado ativo / GTP-ligado e
inativo / GDP-ligado (Ridley, 2001). Essas proteínas agem principalmente
sobre quinases que exercem papéis chave na modulação de uma ampla gama
de processos celulares como proliferação, apoptose, migração e polarização
celulares, transporte através das membranas, rearranjo do citoesqueleto e
regulação transcricional (Sallas-Vidal et al., 2005).
Entre os genes identificados como diferencialmente expressos após
exposição das ostras ao esgoto, cinco foram selecionados para confirmação da
indução da expressão por RT-PCR semi-quantitativo com iniciadores
específicos, em organismos individuais, com a finalidade de utilização como
biomarcadores. Esses genes são os responsáveis por mecanismos de
biotransformação de xenobióticos de fase I (CYP P450 356A1), fase II (GSTO)
e fase III (MDR), síntese do grupo heme (ALAS) e ligação e transporte de
ácidos graxos (FABP).
Todos os cinco genes analisados por RT-PCR semiquantitativo na
brânquia das ostras apresentaram um aumento significativo na sua expressão
após exposição ao esgoto não tratado em aquários (p<0,02) (Figura 12). Por
outro lado esse aumento não foi observado quando as ostras foram expostas in
situ durante 14 dias a um local contaminado por esgoto doméstico, quando foi
observada uma grande variabilidade individual dentro de cada grupo (Figuras
14 e 16). Uma típica célula de mamífero contém entre 10-30 pg de RNAtotal,
63
sendo que o RNAm corresponde a uma fração de 1-5% desse valor,
dependendo do estado fisiológico da célula. Essa fração pode conter cerca de
12.000 transcritos diferentes em uma única célula, alguns deles são mais
comuns enquanto outros estão presentes em baixo número de cópias,
representando aproximadamente 0,01% do pool de RNAm (Alberts et al.,
2002). Dessa forma a preservação e estabilização do RNA durante o
processamento da amostra é de fundamental importância, pois mudanças na
expressão gênica podem ocorrer devido à degradação específica e inespecífica
do RNA bem como à indução da transcrição. A princípio a variabilidade
observada no experimento de campo não está relacionada à estabilização do
RNAm, visto que todas as amostras foram imediatamente armazenadas em
solução para preservação de RNA (RNAlater). De acordo com o fabricante
durante o armazenamento do tecido nessa solução o RNA celular permanece
íntegro, mesmo em elevadas temperaturas, o que garante a confiabilidade dos
resultados da análise de expressão gênica (Oligotex Handbook - Qiagen). A
variabilidade observada dentro de um mesmo grupo no experimento de campo
deve estar relacionada a diferenças individuais e poderia ser eliminada com a
realização de pools de amostras ao invés da análise de cada organismo em
separado.
As principais diferenças entre os dois experimentos foram a
concentração de esgoto e o tempo de exposição. A indução da expressão de
um gene é seguida da transcrição do RNAm, que pode ocorrer dentro de
algumas horas, enquanto a síntese e maturação funcional da proteína pode
levar mais tempo (Pal & Mitra, 2005). No experimento em aquários as ostras
ficaram expostas ao esgoto por apenas 48h, enquanto no ambiente as mesmas
permaneceram em contato com a contaminação por 14 dias. A expressão dos
genes do receptor de estrógeno (ER), vitelogenina (Vtg) e proteína da zona
radiata (Zrp) foi analisada em peixes após injeção de nonilfenol (Yadetie et al.,
1999). Esse trabalho mostrou que os níveis máximos de RNAm relativos ao ER
foram obtidos após 2 dias, retornando aos níveis do controle no dia 7, sendo
esse aumento seguido pela indução da expressão dos genes Vtg e Zrp e
síntese das respectivas proteínas, também após 7 dias. Os autores sugerem
que o ER promova a síntese de outros fatores de transcrição ou modificações
64
na cromatina, que por sua vez teriam um efeito secundário induzindo a
expressão de genes como Vtg e Zrp. Tanguy e colaboradores (2005)
analisaram a expressão do gene da glutamina sintase (GSII) em C. gigas
expostas a pesticidas e hidrocarbonetos. Enquanto na exposição à 0,1% da
fração hidrossolúvel de combustível doméstico o aumento da quantidade de
RNAm do gene GCII ocorreu após 7 dias retornando aos níveis do controle
após 21 dias, quando expostas a 2g/L de glifosato ou a uma mistura de
atrazina (2g/L), diuron (0,5 g/L) e isoproturon (1 g/L) os níveis de RNAm
começam a aumentar somente após 14 dias permanecendo altos por até 30
dias. Já a expressão do gene aspartato aminotransferase (AST) em C. gigas
exposta aos mesmos hidrocarbonetos aumentou após 7 dias permanecendo
alta por até 21 dias, enquanto na exposição à hipóxia foi registrado aumento
após 7 dias retornando aos níveis basais depois de 14 dias (Boutet et al, 2005).
Todos esses dados mostram que há diferenças quanto ao tempo de resposta
na indução da expressão dos genes, mas pode-se observar um padrão geral
onde ocorre primeiro a transcrição do RNAm, seguido do aumento da
quantidade e atividade da proteína enquanto os níveis de RNAm retornam ao
basal. Resultados não publicados de nosso grupo mostraram que em C.
rhizophorae a expressão do gene da catalase foi induzida após 24h de
exposição ao local contaminado por esgoto, retornando aos níveis encontrados
no local referência após 48h, enquanto a atividade enzimática iniciou após 48h
e se manteve alta por 7 e 14 dias. Uma vez que os genes investigados
apresentaram um aumento significativo na sua expressão após 48h de
exposição ao esgoto em aquários, suspeita-se que após 14 dias no ambiente
contaminado os níveis de RNAm tenham voltado ao basal, enquanto as
proteínas já sintetizadas continuaram atuando.
Outro motivo para que a indução da expressão dos genes não tenha
sido detectada no experimento in situ é a concentração de contaminantes. No
experimento em aquários a quantidade de esgoto não tratado adicionado à
água marinha foi a máxima possível para que a salinidade não baixasse mais
que 25psu (33% de esgoto). Já no experimento in situ a concentração de
contaminantes certamente foi menor que 33%. Na análise de genes
biomarcadores em C.gigas expostas a contaminantes isolados a concentração
65
de xenobióticos adicionada geralmente é menor. Tanguy e colaboradores
(2005) analisaram a expressão do gene GSII em C. gigas após a adição de
0,1% de uma mistura de hidrocarbonetos, 2g/L de glifosato e atrazina, 1g/L de
isoproturon ou 0,5g/L de diuron. Já a expressão do gene AST em C. gigas foi
analisada após adição de 0,1% de uma mistura de hidrocarbonetos, 2ug/L de
glifosato e atrazina, 1 ug/L de isoproturon ou 0,5ug/L de diuron (Boutet et al,
2005). No experimento in situ as concentrações dos contaminantes na água
não foram determinadas, porém as análises químicas detectaram
bioacumulação de diferentes contaminantes orgânicos nas ostras que
permaneceram por 14 dias no local 1, comprovando a existência de
contaminação na água (Tabela 5). Essa fato sugere que a ausência de
diferenças na expressão dos genes no experimento in situ deve-se ao tempo
de exposição considerado longo para análises moleculares e não à baixa
concentração de contaminantes na água.
Os experimentos de exposição das ostras ao esgoto no laboratório e no
ambiente apresentaram resultados diferentes, pois foram realizados com
designs diferentes (concentração do contaminante e tempo de exposição). No
primeiro caso o objetivo foi expor as ostras a um estresse extremo para
identificar quais genes tem sua expressão induzida podendo ser utilizado como
biomarcador. Para tal finalidade a maior concentração possível de
contaminante foi utilizada, o que induziu a expressão diferencial de 61 genes,
15 dos quais foram identificados (Tabela 6). Nas mesmas condições
experimentais os cinco genes escolhidos para confirmação da indução
apresentaram resultados expressivos após as 48 horas de exposição (Figura
12). Já no experimento de campo, quando o objetivo foi o de investigar o
comportamento dos genes biomarcadores em uma situação real, sujeita a
interferência dos fatores abióticos, a concentração de esgoto na água
certamente foi menor além de estar sujeita a interferência da ação dos ventos,
correntes, temperatura, salinidade e demais variantes. Para tentar garantir uma
combinação de fatores ambientais que proporcionassem uma maior situação
de estresse no ambiente de estudo, optou-se por aumentar o período de
exposição para 14 dias. Embora os dados mostrem que essa combinação de
fatores realmente ocorreu no final da última semana (Figura 8), parece que
66
nesse momento as ostras já estavam com suas enzimas de biotransformação
sintetizadas. Esses resultados indicam que experimentos subseqüentes de
análise da expressão gênica devem ser realizados com um tempo de
exposição menor, conforme foi feito no experimento em aquários (Figuras 12,
14 e 16).
A correta interpretação dos resultados da expressão diferencial de
genes, por si só representa um desafio à estatística convencional, visto sofrer
interferência de vários fatores e usualmente dispor de poucas repetições nos
experimentos. Além disso, as análises de variância não consideram a interação
entre os genes, sendo um gene que não alcançou significância estatística na
diferença entre os grupos ainda pode ter importância preditiva, quando
acompanhado por alterações na expressão de outros genes (Maggioli et al,
2006). Os resultados analisados não avaliam diretamente a expressão gênica,
independentemente do método escolhido (microarray, Northern blot, SAGE ou
PCR em tempo real) o que é estimado é a abundância de RNAm, através da
intensidade de fluorescência, intensidade da banda ou Ct, e mesmo nesses
casos cada método apresenta suas limitações e tendências (Quackenbush,
2006). No presente trabalho um dos problemas enfrentados teve relação com o
gene constitutivo. Inicialmente o gene da actina (ACT) se apresentou como
diferencialmente expresso, tendo sua expressão induzida pela exposição ao
esgoto, e foi escolhido o gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH)
como constitutivo. Entretanto experimentos subseqüentes não confirmaram
essa indução da expressão do gene da actina, sendo o caso caracterizado
como falso positivo. Quando foi realizado o experimento de campo os
iniciadores desenhados para GAPDH não funcionaram e foi utilizado ACT
como normalizador, embora este tenha apresentado muita variação entre os
indivíduos de um mesmo grupo e entre os diferentes grupos, o que também
ocorreu com os demais genes investigados (Figuras 14 e 16). Rhodes e van
Beneden (1997) analisaram a expressão do gene da proteína ribossomal S9
em Mya arenaria e verificaram queda acentuada na expressão após o período
de desova em ambos os sexos, enquanto o gene da B-actina foi expresso em
níveis bem baixos, com um aparente aumento no período pós-desova. O gene
S9 apresentou também indução da expressão em células neoplásicas, o que
67
sugere um aumento na síntese protéica para dar suporte ao aumento do
número de células. A expressão dos genes S9 e B-actina foi normalizada pelo
gene do RNAribossomal 18S, que por sua vez também apresentou variação
entre os indivíduos. A escolha do gene constitutivo para normalizar a
expressão de outro gene que tenha sido alterado pelo tratamento, deve
priorizar genes que tenham mantido seu padrão de expressão
independentemente do estresse gerado. Dessa forma a procura de um bom
gene normalizador é por vezes dificultosa e normalmente opta-se pela actina
ou um gene de RNAribossomal. Entretanto os resultados desse trabalho
mostram que essa nem sempre é a melhor opção e que a escolha do gene
constitutivo deve ser realizada com cautela.
Esse trabalho mostrou que a técnica de hibridização subtrativa
supressiva é adequada para identificação de genes diferencialmente expressos
em situações de estresse, embora a aplicação destes genes como
biomarcadores necessite ser melhor investigada através de experimentos de
campo com menor tempo de exposição. Foi confirmada a existência de um
gradiente de contaminação a partir do local 1 em direção ao local 4 na Baía
Norte da Ilha de Santa Catarina e levantada uma suspeita de contaminação no
local referência e no cultivo do LMM, UFSC. Além disso, as ostras expostas ao
esgoto doméstico no ambiente bioacumularam HPAs, BPCs, ABLs e DDTs.
68
6 Conclusões
A partir dos resultados deste trabalho pode-se concluir que:
- a hibridização subtrativa supressiva é um método adequado para identificação
de genes diferencialmente expressos em duas populações de RNAm;
- a exposição das ostras a uma alta concentração de esgoto doméstico não
tratado induziu a expressão de genes associados a diferentes vias do
metabolismo;
- na presença dos contaminantes do esgoto a ostra Crassostrea gigas ativou os
mecanismos de biotransformação de xenobióticos;
- a desenbocadura do Rio Bücheller na Baía Norte da Ilha de Santa Catarina é
uma região contaminada por esgoto doméstico;
- ostras expostas a locais contaminados por esgoto bioacumularam ABLs,
BPCs, HAP e DDT;
- a utilização dos genes CYP356A1, GSTO, MDR, ALAS e FABP como
biomarcadores de contaminação por esgoto em C. gigas deve ser precedida
por investigação através de experimento no ambiente com um menor período
de exposição.
69
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