( PDF ) Bioengenharia de próteses vasculares xenogeneicas

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LEONARDO DA CUNHA BOLDRINI PEREIRA

BIOENGENHARIA DE PRÓTESES VASCULARES

XENOGENEICAS

T

RABALHO APRESENTADO AO

P

ROGRAMA

DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS

MORFOLÓGICAS DA UNIVERSIDADE

FEDERAL DO RIO DE JANEIRO, COMO PRÉ-

REQUISITO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE

MESTRE.

O

RIENTADORES

:

PROF. RADOVAN BOROJEVIC

PROFA. CHRISTINA MAEDA TAKIYA

LABORATÓRIO DE PROLIFERAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO CELULAR

L

ABORATÓRIO DE

P

ATOLOGIA

C

ELULAR

D

EPARTAMENTO DE

H

ISTOLOGIA E

E

MBRIOLOGIA

, UFRJ

DRE

:

104121663

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ROGRAMA DE

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RADUAÇÃO EM

C

IÊNCIAS

M

ORFOLÓGICAS

U

NIVERSIDADE

F

EDERAL DO

R

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J

ANEIRO

NOVEMBRO, 2006

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ii

BIOENGENHARIA DE PRÓTESES VASCULARES

XENOGENEICAS

Leonardo da Cunha Boldrini Pereira

Orientadores: Profª. Radovan Borojevic

Prof

a

. Christina Maeda Takiya

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Morfológicas, Instituto de Ciências Biomédicas, da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção

do título de Mestre em Ciências Morfológicas.

EXAMINADORES

Dr. José Mauro Granjeiro

Universidade Federal Fluminense

Dra. Verônica Maria Morandi da Silva

Universidade do Estado do Rio de Janeiro

Dr. Leonardo Rodrigues de Andrade

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Dr. Ana Maria Reis Ferreira

Universidade Federal Fluminense;

Suplente externa

Dra. Valéria de Melo Coelho

Universidade Federal do Rio de Janeiro;

Suplente interno

Dra. Márcia Cury El - Cheikh

Universidade Federal do Rio de Janeiro;

Revisora

Dr. Radovan Borojevic

Universidade Federal do Rio de Janeiro;

Orientador

Dra. Christina Maeda Takiya

Universidade Federal do Rio de Janeiro;

Orientadora

Dr. Vivaldo Moura Neto

Universidade Federal do Rio de Janeiro;

Coordenador do Curso de

Pós-Graduação em Ciências Morfológicas (PCM)

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iii

Pereira, Leonardo da Cunha Boldrini

Bioengenharia de próteses vasculares xenogeneicas / Leonardo

da Cunha Boldrini Pereira. – Rio de Janeiro: UFRJ / ICB, 2006.

ix, 107 f. : il. ; 31 cm

Orientadores: Radovan Borojevic e Christina Maeda Takiya

Dissertação (mestrado) –UFRJ / ICB/Ciências Morfológicas,

2006.

Referências bibliográficas: f. 76-91

1. Engenharia biomédica. 2. Prótese vascular. 3. M

atriz

extracelular. 4. Células endoteliais. 5. Miócitos de músculo liso. 6.

Técnicas de cultura de células. 7. Teste de materiais. 8. Ciências

Morfológicas -

Tese. I. Borojevic, Radovan. II. Takiya, Christina

Maeda. III. Universidade Federal do Rio de Jan

eiro, ICB, Ciências

Morfológicas. IV. Título.

iv

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar, agradeço ao nosso Pai Celestial, que reuniu para mim

todas as condições ideais para o desenvolvimento dessa dissertação: minha

família, meus amigos, um ótimo ambiente de trabalho e a certeza de que em

algum momento os experimentos iam começar a dar certo.... rs

Agradeço muito a meus pais e ao meu irmão por todo o apoio nos

bastidores durante o Mestrado. À minha madrinha Lélia e a vovó Amélia,

sempre atenciosas. Jamais me esquecerei da ajuda de vocês.

Aos professores Radovan Borojevic e Christina Takiya por todo o

aprendizado adquirido durante o mestrado. São exemplos valorosos que nunca

me esquecerei.

À Prof. Márcia Cury El-Cheikh, que me abrigou no laboratório na

graduação e que foi minha orientadora na iniciação científica. Agradeço por

todo o apoio, pelos conselhos e pela impecável revisão desta tese...

Aos grandes “amigosdopardal” e “normais-da-biomedicina”: Gaúcho,

Hamilton, prof. Cristiano, Fábio, Paulista, Neno, Anderson, Osama, Felipe,

Vovô, Fiocruz, Antônio, João Gesto, Tio João, Daniel Teddy, Maurício e

Jackson. Agradeço a todos vocês pelas dicas, exemplo profissional, pelos

momentos de descontração e as inesquecíveis viagens da galera.

A todos os integrantes do Laboratório de Proliferação e Diferenciação

Celular, em especial aos doutorandos Luciene López e André Marchiori, peças

fundamentais no desenvolvimento deste trabalho. Aos alunos Priscila Bezzera,

Ronaldo (Reginaldo) e Monike, todos do “grupo vascular” e que me ajudaram

diversas vezes.

Aos integrantes do Laboratório de Patologia Celular, e do Laboratório de

Interações Celulares nos Sistemas Endócrino e Reprodutor, que me adotaram

como novo membro e com quem muito tenho aprendido nos seminários

organizados pela Prof. Christina e pelo Prof. Luiz Eurico.

Aos membros do Departamento de Histologia e Embriologia.

A Eliene Oliveira e ao Prof. Mauro Pavão, do laboratório de Tecido

Conjuntivo.

A meus amigos em geral e aos irmãos DeMolays e Tios maçons, que

sempre se preocuparam e me apoiaram.

v

A todos aqueles que colaboraram de qualquer forma para o

desenvolvimento desta tese.

Ao Obina, ao Luizão e ao Juan, que garantiram o Bicampeonato da Copa

do Brasil do Mengão em cima do vasquinho da gama!!!

Ao CNPq.

Muito obrigado!!!

vi

RESUMO

As próteses vasculares de grande diâmetro são desenvolvidas com sucesso a

partir de polímeros tais como o Dacron e o e-pTFE. Entretanto, o

desenvolvimento de próteses vasculares de pequeno calibre (diâmetro interno

< 6mm) tem se tornado um desafio, devido as reações biológicas entre a

superfície do material e o sangue, bem como com o tecido subjacente, tais

como trombogenicidade aguda, hiperplasia intimal e formação de aneurismas.

O enxerto de veia autóloga requer a remoção de uma veia de outra parte do

corpo, quando viáveis. Os enxertos sintéticos demonstram riscos a longo prazo

e não são suscetíveis nas aplicações em vasos de pequeno calibre. Neste

trabalho, desenvolvemos uma prótese vascular biocompatível e

mecanicamente estável combinando células humanas e matrizes

acelularizadas xenogeneicas. Para isso, utilizamos técnicas de engenharia

tecidual para acelularizar aortas torácicas de porcos adultos, que foram

submetidas a tratamento com soluções hipertônicas, acompanhadas por

extensivas lavagens em salina. Os componentes de matriz extracelular

envolvidos no suporte mecânico e nas propriedades elásticas foram avaliados

antes e após o tratamento por técnicas bioquímicas e histológicas. Laminina e

fibronectina, principais constituintes da membrana basal, foram detectados por

imunofluorescência e imunoperoxidade, respectivamente. Nenhuma diferença

foi observada nos componentes de matriz extracelular como um todo. A única

redução foi observada bioquimicamente nos níveis de glicosaminoglicanos

(perda de 30% dos fragmentos tratados). Portanto, nossa metodologia resultou

num implante natural que mantém a composição matricial da artéria nativa. O

próximo passo foi a repopulação com células da parede vascular utilizando

células endoteliais e células musculares lisas obtidas de veia de cordão

umbilical. Elas foram semeadas nas faces luminal e adventicial,

respectivamente, e ambas as células foram capazes de repopular o enxerto.

Interessantemente, a prótese matricial também preservou nichos instrutivos –

células musculares lisas apresentaram diferentes comportamentos quando

plaqueadas nas faces adventicial e luminal. Deste modo, nossos resultados

indicam que estamos aptos a produzir uma prótese vascular com ótimas

condições de repopulação.

vii

ABSTRACT

Large-diameter vascular grafts have been successfully developed from

polymers such as Dacron or e-PTFE. However, it has been difficult to develop

small-caliber grafts (inner diameter < 6mm) because of biological reactions at

the blood-material and tissue-material interface, such as acute thrombogenicity,

intimal hyperplasia and formation of aneurisms. Autologous vein grafts require a

removal of a vein from another part of the body, when available. Synthetic grafts

pose long-term health risks and are not successful for small-diameter graft

applications. Here we develop a biocompatible and mechanically stable

vascular graft combining human cells and a xenogeneic acellular matrix by

tissue-engineering techniques: thoracic aortas of adult pigs were successfully

decellularized treating them with a gradient of hypertonic solutions, followed by

extensive washes in saline buffer. Components of extracellular matrix involved

with the mechanical support and elastic properties were evaluated, before and

after treatment, by biochemical and histochemical methods. Laminin and

fibronectin, major constituents of basement membrane, were detected by

immunofluorescence and immunohistochemical staining, respectively. No

differences were observed in either extracellular matrix components mentioned

by far. The only reduction was observed by biochemical analysis in the levels of

glycosaminoglycans (30% in the treated ones). Thus, our methodology resulted

in a natural scaffold that maintained the native vessel composition. The next

step was the repopulation with vascular wall cells. We used confluent

endothelium (HUVECs) and fully differentiated smooth muscle cells (VSMCs)

derived from human umbilical vein. They were seeded into the luminal and

adventitial sides, respectively, and both cells were able to repopulate the graft.

Interestingly, bioscaffold’s matrix molecules also preserved their instructive

clues — smooth muscle cells showed different behaviors when seeded in the

adventitial or in the luminal side of the xenograft. Our results indicate that we

were able to produce a vascular graft with optimal cell seeding characteristics.

viii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

MEC

– Matriz Extracelular

vWF

– Von Willebrand Factor (Fator de Von Willebrand)

VCAM

– Vascular Cell Adhesion Molecule

ICAM

– Intercellular Adhesion Molecule

IL – Interleukin

PDGF

– Platelet-Derived Growth Factor

FGF

– Fibroblast Growth Factor

CSF

– Colony Stimulating Factor

IFN - γ

γγ

γ −

Interferon gama

TGF -

β

ββ

β − Transforming Growth Factor Beta

LDL

- Low-density lipoprotein

MCP – 1

– Monocyte chemoattractant protein-1

M-CSF

– Macrophage Colony Stimulating Factor

e – PTFE – politetrafluoretileno expandido

PGA

- ácido poliglicólico

SDS

– dodecil sulfato de sódio

PBS

– solução salina fosfatada

EDTA

– ácido etilenodiaminotetraacético

DMEM – Meio eagle modificado por Dulbecco

PS

– Penicilina e estreptomicina

HE

– hematoxilina e eosina

GAGs

- glicosaminoglicanas

DAB

– diaminobenzidina

IgG – imunoglobulina

ix

HUVECs – Human Vein Endothelial Cells

VSMCs

- Vein Smooth Muscle Cells

SUMÁRIO

1) Introdução: ........................................................................................................4

1.1) Os vasos sanguíneos:.................................................................................. 4

1.2) Células da parede vascular: ......................................................................... 7

1.2.1 – Células endoteliais:............................................................................ 8

1.2.2 - Células musculares lisas e fibroblastos:.......................................... 9

1.3 - Doenças cardiovasculares:........................................................................ 10

1.4 – Técnicas de revascularização tecidual: ....................................................16

2) Objetivos:......................................................................................................... 28

- Geral:............................................................................................................... 28

- Objetivos específicos:...................................................................................... 28

3) Metodologia:.................................................................................................... 29

3.1 Captação das aortas ex vivo:....................................................................... 29

3.2 Acelularização de fragmentos de aorta:....................................................... 29

3.3 Investigação dos componentes dos fragmentos de aorta:........................... 30

3.3.1 Análise histológica: ............................................................................ 30

3.3.2: Análise imunohistoquímica: ............................................................. 31

3.4) Análise bioquímica:..................................................................................... 31

3.4.1 - Dosagem de hidroxiprolina (STEGMANN e STALDER, 1967):...... 31

3.4.2 – Dosagem de ácido urônico: ............................................................ 32

3.5) Obtenção de Células Endoteliais de Veia de Cordão Umbilical (HUVECs):33

3.6) Obtenção de Células Musculares Lisas de Veia de Cordão Umbilical

(VSMCs):........................................................................................................... 34

3.7) Repopulação dos fragmentos de aorta acelularizados:.............................. 35

3.8) Análise dos fragmentos repopulados:......................................................... 36

2

4) Resultados:...................................................................................................... 38

4.1 Análise histológica da aorta acelularizada:.................................................. 38

4.2 Análise bioquímica:...................................................................................... 39

4.3 Análise imunohistoquímica: ......................................................................... 40

4.4 Análise dos fragmentos acelularizados por microscopia eletrônica de

varredura: .......................................................................................................... 41

4.5 Repopulação dos fragmentos acelularizados: .............................................41

PRANCHA I – Morfologia dos fragmentos de aorta “ex vivo” e acelularizados.. 43

PRANCHA II – Morfologia dos fragmentos de aorta “ex vivo” e acelularizados.45

PRANCHA III – Morfologia dos fragmentos de aorta “ex vivo” e acelularizados 47

PRANCHA IV: Dosagem bioquímica .................................................................49

PRANCHA V – Imunohistoquímica de fragmentos de aorta “ex vivo” e

acelularizados.................................................................................................... 50

PRANCHA VI – Imunohistoquímica de fragmentos de aorta “ex vivo” e

acelularizados.................................................................................................... 52

PRANCHA VII – Imunofluorescência................................................................. 54

PRANCHA VIII: Microscopia eletrônica de varredura: repopulação com HUVECs

........................................................................................................................... 57

PRANCHA IX: Microscopia eletrônica de varredura: repopulação com HUVECs

.....................................................................................................................57

PRANCHA X: Microscopia eletrônica de varredura: repopulação com VSMCs. 59

PRANCHA XI: Análise histológica: repopulação com VSMCs........................... 61

3

PRANCHA XII: Microscopia eletrônica de varredura: plaqueamento de VSMCs

na face luminal de fragmentos de artérias acelularizadas................................. 63

5) Discussão:....................................................................................................... 65

6) Conclusões:..................................................................................................... 74

7) Perspectivas:................................................................................................... 75

8) Referências:..................................................................................................... 76

ANEXO I: REAGENTES E PREPARO DE SOLUÇÕES...................................... 92

ANEXO 2: PROTOCOLOS DE IMUNOPEROXIDASE E

IMUNOFLUORESCÊNCIA UTILIZADOS:.......................................................... 104

4

1) Introdução:

1.1) Os vasos sanguíneos:

A arquitetura geral e a composição celular dos vasos sanguíneos são as

mesmas em todo o sistema cardiovascular, separando-se as artérias e as veias.

Devido a exposição a altas pressões, as artérias têm parede mais espessa e

lúmen arredondado, até mesmo na ausência de fluxo sanguíneo. Além disso, a

elastina da artéria é mais organizada que a da veia correspondente. Em contraste,

o lúmen da veia é mais alargado, e a elastina na parede é distribuída de maneira

difusa. À medida que os vasos ficam menores a relação entre espessura da

parede e diâmetro da luz torna-se maior. As veias possuem diâmetro maior, luz

maior e paredes mais finas quando comparadas às artérias correspondentes

(FIGURA 1) (SCHOEN, 2006).

Figura 1: Corte histológico de uma artéria (A) e uma veia (V). Membranas elásticas são coradas em preto

(membrana elástica interna da artéria sinalizada pela seta). (Robbins e Cotran Bases Patológicas das

Doenças 7ª Edição, 2006)

5

Os constituintes básicos das paredes dos vasos sanguíneos são as células

endoteliais, as células musculares lisas, os fibroblastos e matriz extracelular

(MEC), incluindo elastina, colágeno e glicosaminoglicanos. As 3 camadas

concêntricas - íntima, média e adventícia – são melhor definidas nos vasos de

maior calibre, particularmente nas artérias (FIGURA 2) (SCHOEN, 2006) .

Nas artérias, a íntima consiste de uma simples camada de células endoteliais

que reveste a superfície interna do vaso e que repousa numa camada

subendotelial, que consiste de uma lâmina basal contendo fibras matriciais e

fibroblastos esparsos, sendo separada da camada média por uma membrana

elástica, denominada membrana elástica interna, que é o componente mais

externo da íntima. Esta lâmina, composta principalmente de elastina, possui

fenestras que permitem a difusão de substâncias para nutrir células situadas mais

profundamente na parede do vaso (GARTNER e HIATT, 2001).

A camada média é formada principalmente por camadas concêntricas de

células musculares lisas, organizadas helicoidalmente, às quais se agregam

quantidades variáveis de fibras elásticas, fibras reticulares (colágeno tipo III) e

proteoglicanas. As células musculares lisas são as responsáveis pela síntese

desses elementos de matriz extracelular. As camadas de células musculares da

média localizadas próximo ao lúmen recebem oxigênio e nutrientes diretamente

por difusão. Entretanto, a difusão é inadequada para as porções mais externas da

média em vasos de grande e médio calibre, de forma que essas áreas são

irrigadas por pequenas arteríolas denominadas vasa vasorum. A camada média é

separada da camada adventícia pela membrana elástica externa (GARTNER e

HIATT, 2001).

6

A camada adventícia é constituída principalmente de fibroblastos, fibras

colágenas do tipo I e fibras elásticas, orientadas longitudinalmente. Possui

também vasa vasorum e torna-se gradualmente contínua com o tecido conjuntivo

do órgão pelo qual o vaso sanguíneo está passando (GARTNER e HIATT, 2001).

Figura 2: Representação de um corte transversal de uma pequena artéria muscular. (Adaptado de Robbins e

Cotran, Bases Patológicas das Doenças, 7ª Edição, 2006)

Quanto ao tamanho e características estruturais, as artérias são divididas em

três tipos: (1) artérias elásticas ou de grande calibre, incluindo a aorta e os ramos

que se originam do arco aórtico (carótida comum e artérias subclávias), as artérias

ilíacas comum e o tronco pulmonar; (2) artérias musculares (exemplificadas pelas

artérias coronárias e renais) e (3) artérias de pequeno calibre (< 5 mm de

diâmetro) e arteríolas (< 0,1 mm de diâmetro), estas últimas localizadas

principalmente no interior dos tecidos e órgãos. Essas modificações estruturais

apresentam-se principalmente na camada média e na composição da MEC

(JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004)

Nas artérias elásticas, a média é rica em fibras elásticas, que são organizadas

por camadas de células musculares lisas. Os componentes elásticos da aorta

7

expandem durante a sístole. Durante as contrações na fase diastólica do ciclo

cardíaco, a elasticidade da parede vascular evita a diminuição do fluxo sanguíneo

no sistema vascular periférico.

Nas artérias musculares, a média é composta predominantemente por células

musculares lisas dispostas circularmente ou espiralmente face ao lúmen, podendo

conter mais de 40 camadas de fibras musculares lisas. Contém, ainda, quantidade

variável de fibras elásticas, fibras reticulares e proteoglicanas. Nas artérias

musculares e arteríolas, o fluxo e a pressão sanguínea são regulados pela

contração das células musculares lisas, diminuindo (vasoconstrição) ou

aumentando o tamanho do lúmen (vasodilatação). Essa variação na contração é

controlada em parte pelo sistema nervoso autônomo e também por fatores

químicos ou interações celulares locais. (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004;

GARTNER e HIATT, 2001).

Nas arteríolas, a camada subendotelial é muito delgada e nas de menor

diâmetro a lâmina elástica interna está ausente e a camada média geralmente é

composta por apenas uma ou duas camadas de células musculares lisas

circularmente organizadas. A camada adventícia é muito delgada (JUNQUEIRA e

CARNEIRO, 2004).

1.2) Células da parede vascular:

Os componentes celulares dos vasos sanguíneos são as células endoteliais,

as células musculares lisas e os fibroblastos, que têm importante papel na

patologia e biologia vascular.

8

1.2.1 – Células endoteliais:

As células endoteliais formam uma monocamada epitelial que reveste todo

o sistema vascular, chamada de endotélio. Sua integridade estrutural e

funcional é fundamental para a manutenção da homeostase da parede do

vaso e da função circulatória. As células endoteliais são células pavimentosas,

poligonais, que contêm numerosas vesículas pinocitóticas e que formam

complexos juncionais com suas vizinhas. São as únicas que contêm

corpúsculos de Weibel – Palade, estruturas delimitadas por membrana que

representam a organela de armazenamento do fator de von Willebrand (vWF).

São identificadas imunohistoquimicamente pelo anticorpo anti- vWF (também

denominado antígeno relacionado ao fator VIII) e outros antígenos endoteliais,

tais como o CD31, CD34, KDR e V-caderina (SCHOEN, 2006).

O endotélio vascular é um tecido multifuncional e versátil, que exibe

numerosas propriedades sintéticas e metabólicas. Suas principais

característica são (1) a atuação como membrana semipermeável, controlando

a transferência de moléculas entre o sangue e os vasos sanguíneos; (2)

mantém a interface sangue-tecido não trombogênica ao inibir a coagulação

sanguínea local a partir da síntese e secreção de prostaciclina,

trombomodulina e ativador de plasminogênio; (3) modula o tônus vascular e o

fluxo sanguíneo, a partir dos agentes vasoconstritores endotelina e enzima

conversora de angiotensina, e dos agentes vasodilatadores óxido nítrico e

prostacliclina; (4) metaboliza hormônios; (5) regula as reações imunológicas e

inflamatórias, em grande parte ao controlar as interações leucocitárias com a

9

parede do vaso a partir da expressão de moléculas de adesão VCAM-1

(molécula de adesão de célula vascular-1), ICAM (molécula de adesão

intercelular), E-selectina, P-selectina e síntese de citocinas tais como as

interleucinas IL-1 (interleucina-1), IL-6 e IL-8; (6) promove a oxidação das

lipoproteínas na parede das artérias; e (7) regula a proliferação de outros tipos

celulares, particularmente as células musculares lisas, sintetizando PDGF

(fator de crescimento derivado de plaquetas) e FGF (fator de crescimento de

fibroblastos) e CSF (fator estimulador de colônias) (SCHOEN, 2006).

1.2.2 - Células musculares lisas e fibroblastos:

Como elemento celular predominante da camada vascular média, as

células musculares lisas são as responsáveis pela vasoconstrição e dilatação

em resposta a um estímulo normal ou farmacológico. Sintetizam colágeno,

elastina e glicosaminoglicanos; e elaboram fatores de crescimento e citocinas.

Em resposta a uma lesão, elas migram para a íntima e proliferam. Portanto, as

células musculares lisas constituem um importante elemento não apenas do

processo de reparo vascular normal, como também de processos patológicos,

como a aterosclerose.

A atividade migratória e proliferativa dessas células é fisiologicamente

regulada por promotores e inibidores de crescimento. Os promotores incluem

o PDGF, o FGF (fator de crescimento de fibroblastos), e a IL-1. Os inibidores

incluem o heparan sulfato, o óxido nítrico, o IFN - γ (interferon gamma) e o

TGF-β (fator de crescimento transformante β) (SCHOEN, 2006).

10

Os fibroblastos são os componentes celulares da camada adventícia,

sendo os reponsáveis pela síntese e remodelamento tecidual desta camada

(SCHOEN, 2006).

1.3 - Doenças cardiovasculares:

De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde, as doenças

cardiovasculares são responsáveis por aproximadamente 14 milhões de

mortes no mundo (20% da taxa de mortalidade). Elas correspondem à

principal causa de morte nos países desenvolvidos e representam um

problema de saúde pública crescente nos países em desenvolvimento. Por

exemplo, nos Estados Unidos, as doenças cardiovasculares são as principais

causas de morte. A cada ano, mais de 570.000 procedimentos coronarianos

são feitos, criando uma importante demanda de próteses em patologias

vasculares periféricas.

Informações do DATASUS (banco de dados do Sistema Único de Saúde

da República Federativa do Brasil) demonstram que em 1998 ocorreram

133.685 óbitos por doença arterial coronariana. No Brasil, as doenças

cardiovasculares assumem a posição da principal causa mortis, sendo

responsáveis por um em cada quatro óbitos, ampliando-se como causa de

mortalidade de 25,2% para 32,6% no período de 1980 -1998 e, segundo as

projeções do Ministério da Saúde, estas doenças continuarão a ser a primeira

causa de morte no país. No Rio de Janeiro, as doenças cardiovasculares são

responsáveis por 33,4% dos óbitos (DATASUS 1998) e ocupam o terceiro

11

lugar entre as causas de internações, perfazendo cerca de 12% do total de

internações anuais no Brasil. No entanto, são as que mais custam ao país,

representando 17% do total de quatro bilhões de reais gastos anualmente pelo

SUS (Sistema Único de Saúde) (DATASUS 1998).

A lesão vascular estimula o crescimento das células musculares lisas ao

romper o equilíbrio fisiológico entre inibição e proliferação. A reconstituição da

parede vascular lesada, incluindo o endotélio, compreende uma resposta

fisiológica de cicatrização com a formação de uma neo-íntima, envolvendo: (1)

a migração das células musculares lisas da média para a íntima, (2) a

multiplicação subseqüente de células da íntima e (3) a síntese e deposição de

matriz extracelular (SCHOEN, 2006).

As lesões que provocam apenas perda endotelial focal, sem comprometer

a membrana basal e sem desnudamento quase sempre podem ser reparadas

através da migração e proliferação de células endoteliais vizinhas ou

progenitores endoteliais circulantes (RUMPOLD e cols, 2004).

A ocorrência de lesão mais extensa ou crônica das células da camada

média induz uma seqüência mais complexa de reparo. As células musculares

lisas que migram da média para a íntima perdem a sua capacidade de

contração, passam a se dividir e aumentam a síntese de moléculas de matriz

extracelular. Essas células podem retornar a um estado não proliferativo

quando a camada endotelial é restabelecida após lesão aguda ou quando

cessa a estimulação crônica (SCHOEN, 2006)

No caso de uma resposta de cicatrização exagerada, há o espessamento

da íntima, que pode causar estenose ou oclusão dos vasos sanguíneos

12

pequenos ou médios, e de enxertos vasculares. Este quadro contribui para o

desenvolvimento de muitos distúrbios vasculares clinicamente importantes e

bem conhecidos, em que o estímulo lesivo inicial varia de predominantemente

mecânico (restenose após angioplastia, por exemplo) a predominantemente

imunológico (arteriosclerose do transplante) ou a multifatorial (aterosclerose)

(LUSIS, 2000; SCHOEN, 2006; HANSSON e LIBBY, 2006).

Dentre essas patologias que levam a oclusão dos vasos sanguíneos, a

aterosclerose é a mais prevalente e clinicamente significativa, correspondendo

a mais de 50% da taxa de mortalidade nos países ocidentais.

Essa patologia se caracteriza por lesões da íntima, causadas por

ateromas ou placas fibrogordurosas, que fazem protrusão na luz e

enfraquecem a média subjacente. Afeta primariamente as artérias elásticas e

as artérias musculares de grande e médio calibres, começando quase sempre

na infância, tornando-se, entretanto, evidentes na meia-idade ou mais tarde,

quando as lesões arteriais precipitam lesão orgânica (LUSIS, 2000).

O evento inicial da aterosclerose consiste no acúmulo de LDL (lipoproteína

de baixa densidade) na matriz subendotelial. Esse acúmulo é maior quando os

níveis de LDL circulante estão aumentados. A retenção ocorre

preferencialmente nos sítios de turbilhonamento de fluxo, tais como bifurcações

ou curvaturas, onde a permeabilidade a macromoléculas, e a expressão de

lipoxigenases estão aumentadas. O LDL é endocitado por intermédio de um

receptor, na via de clatrina, e interage com proteoglicanos de matriz da

membrana basal subendotelial. Neste sítio, ele sofre oxidações, levando a

formação de LDL oxidado, que tem atividade pró-inflamatória: estimula as

13

células endoteliais a expressarem moléculas de adesão tais como o VCAM-1, o

ICAM-1 e a P-selectina a E-selectina, bem como os fatores MCP-1 (proteína

quimiotática de monócitos – 1) e M-CSF (fator estimulador de colônias

macrofágicas), resultando no recrutamento de monócitos e linfócitos T para a

parede vascular. Além disso, formas de LDL oxidado inibem produção de óxido

nítrico, mediador químico conhecido como potente vasodilatador (LUSIS, 2000;

HANSSON e LIBBY, 2006).

O recrutamento de células inflamatórias e o acúmulo de lipídios leva à

formação da estria lipídica, com o espessamento da parede da artéria na

direção abluminal, para acomodar a expansão da íntima. Se as condições

inflamatórias e as condições de fatores de risco, tais como a hiperlipidemia,

persistirem, a estria lipídica pode crescer, e proteinases secretadas pelos

leucócitos ativados podem degradar a MEC, enquanto citocinas inflamatórias,

tais como o interferon gama podem limitar a síntese de novo colágeno. Estas

mudanças tornam a placa fibrosa mais frágil, tornando-a suscetível à ruptura.

Quando a placa sofre ruptura, o sangue entra em contato com o fator tecidual

nos coágulos de plaqueta. O contato de plaquetas ativadas por trombina

geradas da cascata de coagulação com a íntima, levam a formação do trombo.

Se o trombo oclui o vaso de maneira persistente, pode resultar a lesão

isquêmica de orgãos (LIBBY, 2002; SCHOEN, 2006; HANSSON e LIBBY,

2006).

O trombo pode eventualmente ser absorvido ou sofrer trombólise

terapêutica. Entretanto, a resposta regenerativa desencadeada pela trombina

14

durante a coagulação sanguínea pode estimular a proliferação de células

musculares lisas. PDGF secretado por plaquetas ativadas estimula a migração

dessas células. TGF secretado pelas plaquetas ativadas estimula a produção

intersticial de colágeno. O aumento da migração, proliferação e síntese de MEC

pelas células musculares lisas tornam a placa fibrosa mais espessa e causa

expansão da íntima, agora para o lado luminal, levando a constrição do lúmen

(LUSIS, 2000; LIBBY, 2002). Lesões estenóticas produzidas pelo crescimento

da placa fibrosa pode restringir o fluxo, particularmente sob situações de

demanda cardíaca aumentada, levando a isquemia. A isquemia, por sua vez,

leva a necrose tecidual eminente. Sendo assim, medidas que permitam a

melhora da perfusão e conseqüente salvamento tecidual devem ser executadas

(LUSIS, 2000; LIBBY, 2002).

Dentre os fatores predisponentes para a aterosclerose pode-se citar:

- Predisposição genética: o indivíduo cujos pais ou irmãos tenham

morrido de doença cardíaca apresenta uma maior chance de ter doenças do

coração (ASSMANN e cols, 1999).

- Sexo: os homens possuem duas ou três vezes mais chances de

desenvolver doenças cardiovasculares do que as mulheres, isso se

considerarmos indivíduos da mesma idade e hábitos. Após a menopausa a

mulher perde a proteção hormonal (estrógeno) e passa a ter as mesmas

chances de um homem com a mesma idade e com os mesmos hábitos, de

desenvolver a aterosclerose (NATHAN e CHAUDHURI, 1997). O estrogênio

aumenta os níveis de HDL e diminui os níveis de LDL no sangue, além de

15

previnir a modificação oxidativa do LDL no espaço subendotelial. Além disso,

ele atua diretamente sobre as células endoteliais e musculares lisas,

diminuindo a expressão de moléculas de adesão leucocitárias e de citocinas

envolvidas na migração dos monócitos para o espaço subendotelial.

- Idade - A faixa etária de maior risco para o desenvolvimento da

aterosclerose é entre os 40 e 50 anos.

- Tabagismo: Aqueles que fumam apresentam cerca de 3 a 5 vezes mais

chances de desenvolver aterosclerose. Mesmo parando de fumar, o indivíduo

ainda mantém por algum tempo essa chance elevada. Fatores como tempo ou

quantidade de cigarros determinam a aceleração ou não desse processo

(CULLEN e ASSMANN, 1999).

- Hipertensão arterial: A pressão alta não tratada predispõe o indivíduo

às doenças cardiovasculares em geral, pois essa situação sobrecarrega a

atividade do coração e dos vasos sangüíneos (LUFT, 1998; CULLEN e

ASSMANN, 1999).

- Hiperlipidemias: Denominação ampla e genérica para as situações

onde há aumento de colesterol, triglicérides ou de ambos. Essas substâncias

se depositam nas paredes das artérias formando as placas de ateromas. (HU

e cols, 1999; ASSMANN e cols, 1999).

- Diabetes: Aumenta as chances de se desenvolver aterosclerose e outras

doenças cardiovasculares (ASSMANN e cols, 1999).

- Obesidade: Predispõe o indivíduo às doenças cardiovasculares, além de

sobrecarregar o organismo como um todo, principalmente o coração. Está

16

associada à hipertensão, à hiperlipidemia e ao sedentarismo (ASSMANN e

cols, 1999).

- Sedentarismo: A atividade física rotineira e contínua ajuda a evitar as

doenças cardiovasculares, bem como ajuda a diminuir o peso e o colesterol.

(CULLEN e ASSMANN, 1999)

- Ansiedade / estresse: dados experimentais e clínicos demonstraram que

o estresse, bem como a qualidade de vida e relacionamentos do indivíduo estão

relacionados ao maior risco de se desenvolver aterosclerose (KAPLAN e

MANUCK, 1999).

1.4 – Técnicas de revascularização tecidual:

Existem diversas técnicas para as revascularizações, como a simples

retirada de placas de ateroma que ocluem os vasos arteriais

(endarterectomias), ou com a interposição de enxertos entre artérias doadoras

de fluxo normal para artérias receptoras (ou de deságüe) que se encontram

pérvias, porém sem fluxo suficiente. A técnica de endarterectomia é limitada

para os casos em que as oclusões ou estenoses acometem pequenas

extensões de determinados vasos. A técnica de revascularização com enxertos

é a mais utilizada, recriando a circulação por uma nova rota, em que longas

obstruções podem ser interpostas com relativa facilidade técnica e excelentes

resultados (Da GAMA e cols, 1992).

Os enxertos para as revascularizações podem ser sintéticos ou biológicos.

Os enxertos biológicos podem ser autólogos (onde o receptor é o próprio

17

doador), alogeneicos ou homólogos (entre indivíduos da mesma espécie) e

xenogeneicos ou heterólogos (entre espécies diferentes) (ISENBERG e cols,

2006).

Diversos autores utilizando modelos experimentais e em humanos

demonstraram e contribuíram com a solidificação do ideal da revascularização.

Existem relatos de substituições arteriais desde 1896, por JABOULAY, com

auto-enxertos arteriais em cães, prevendo o futuro desta prática. Em 1912,

CARREL foi contemplado com o prêmio Nobel em Medicina em reconhecimento

aos seus trabalhos em suturas vasculares e transplantes de vasos sanguíneos

e órgãos (revisado por DENTE e FELICIANO, 2005). Em 1950, GROSS relatou

15 enxertos arteriais homólogos usados em anomalias congênitas da aorta. A

partir de então, diversos hospitais americanos passaram a desenvolver bancos

de artérias removidas de indivíduos jovens falecidos. Em 1951, SCHAFER e

DUBOST publicaram trabalhos mostrando as primeiras ressecções de

aneurismas da aorta abdominal com enxertos homólogos. Devido a dificuldade

de obtenção de enxertos com dimensões ideais e estocagem esta abordagem

foi abandonada ao longo dos anos. Além disso, também foi descrita a

ocorrência de trombose relacionada a resposta imunológica contra esses

implantes (revisado por CERVANTES, 2003).

A revolução nesta área ocorreu em 1952 quando VOORHEES e

colaboradores empregaram com sucesso o Vynion N (material plástico) na

reconstrução aórtica de cães. Problemas relacionados à manipulação deste

material foram superados com a utilização de próteses de náilon por

18

EDWARDS e TAPP em 1955. DOUGLAS e colaboradores (1956), relataram o

uso experimental de um enxerto de carótida bovina obtido após digestão

enzimática para a eliminação celular. O seguimento implantado demonstrou

grande incidência de degeneração aneurismática e infecção, provavelmente

devido à destruição da matriz extracelular no processo de acelularização. Em

1975 foi relatada a primeira aplicação clínica de uma nova prótese de teflon,

resultante da expansão deste material, o e-PTFE (politetrafluoretileno

expandido). Este polímero é um dos principais materiais utilizados atualmente

na substituição de vasos de grande calibre (CAMPBELL e cols, 1975).

Para o desenvolvimento de próteses vasculares funcionais, alguns critérios

têm sido propostos: (1) eles devem ser biocompatíveis, ou seja, não-

trombogênicos, não-imunogênicos e resistentes a infecção; (2) devem se

apresentar como uma matriz onde o endotélio se apresente confluente,

quiescente e não ativado. (3) Deve induzir também uma resposta regenerativa

que não resulte em inflamação, hiperplasia ou formação de cápsula fibrosa e (4)

se integrar ao tecido subjacente de forma a funcionar de maneira idêntica a um

vaso autólogo do paciente (ISENBERG e cols, 2006).

Próteses devem possuir também propriedades mecânicas apropriadas, que

incluem complacência fisiológica, a habilidade de suportar o stress gerado pelo

fluxo sanguíneo por longo prazo (resistência, elasticidade e durabilidade ao

ponto cirúrgico e contração vascular) e não promover a formação de aneurisma.

Além disso, devem possuir permeabilidade a água, solutos e serem aptos a

promover a migração celular. Devem exibir propriedades fisiológicas, tais como

19

respostas a vasoconstrição e vasodilatação. Finalmente devem ser de fácil

manipulação e ótima suturabilidade, ou seja, viáveis do ponto de vista cirúrgico

(ISENBERG e cols, 2006).

Todos os substitutos, independentemente da composição e estrutura,

provocam respostas complexas, porém previsíveis. Reações de superfície

sangue-biomaterial começam imediatamente após o reestabelecimento da

circulação. As respostas celulares e humorais a materiais sintéticos incluem a

deposição de proteínas plasmáticas e plaquetas, a adesão de neutrófilos e

monócitos e a migração de células endoteliais e de células musculares lisas.

(XUE e GREISLER, 2000).

Para a melhoria da razão de patência dos substitutos arteriais, ou seja, a

manutenção da perfusão sanguínea, nos sistemas venosos e arteriais de

pequeno calibre, as seguintes abordagens tem sido propostas: (1) modificação

da superfície de contato para se evitar a trombogenicidade dos enxertos

sintéticos; (2) desenvolvimento de próteses absorvíveis; (3) endotelização da

superfície de contato do enxerto com o sangue, e (4) desenvolvimento de

substitutos vasculares a partir de tecidos acelularizados (SCHMIDT e BAIER,

2000; XUE e GREISLER, 2000; ISENBERG e cols, 2006).

Com relação a primeira abordagem, a modificação mais simples é aquela

que envolve a cobertura do enxerto com um polímero inerte. A primeira

molécula testada foi o carbono, devido a sua carga negativa e natureza

hidrofóbica (BLOOM e cols, 1964). Porém estudos clínicos não demonstraram

diferenças na razão de patência entre pacientes tratados com enxertos de e-

20

PTFE e e-PTFE impregnado com carbono para cirurgias distais e abaixo do

joelho após 12 meses de implantação (BACOURT, 1997).

Em 1995, um grupo desenvolveu uma prótese de 3 camadas, consistindo

de Dacron

®

na camada mais externa (para promover a incorporação com o

tecido adjacente), poliuretano na camada média (para abrigar células

musculares lisas) e um co-polímero de 2-hidroxietil metacrilato e estireno

cobrindo a camada interna (para estabelecer uma interface não trombogênica

com o sangue). Essas próteses, com um diâmetro interno de 3 mm, foram

implantadas nas artérias carótidas de cães e permaneceram patentes por mais

de 1 ano (NOJIRI e cols, 1995). Não houve formação de trombos nem

hiperplasia intimal, porém a aplicação dessa prótese num vaso sanguíneo de

fluxo intenso e num local onde próteses vasculares normalmente tem alta razão

de patência foi uma crítica a esse trabalho.

A impregnação da superfície prostética com proteínas também é utilizada e

os compostos mais usados são a albumina, a gelatina, o colágeno e a heparina

(KANG e cols, 1997; BOS e cols, 1998; MOHAMED e cols, 1998; PARK e cols,

1998). Todos demonstraram eficácia a curto prazo, porém o desgaste do filme

protéico com o restabelecimento do fluxo sanguíneo limita o uso dessas

próteses por alguns meses. O uso de cola de fibrina para se evitar a perda

desses componentes foi testada, porém sua atividade trombogênica limita

também a utilização dessa abordagem a longo prazo (GOSSELIN e cols, 1995).

Vários polímeros biodegradáveis vem sendo investigados nas aplicações de

engenharia tecidual vascular. A idéia básica de todas essas abordagens é a

21

semear as células numa prótese biodegradável que suporta crescimento

tecidual e remodelamento. Nas condições consideradas ideais, o polímero deve

ser absorvido vagarosamente em cultura ou após a implantação, de forma que

seja substituído pelo tecido gerado pelas células. Esses polímeros são

vantajosos devido a sua microestrutura, propriedades mecânicas e razões de

absorção que podem ser controladas via composição química de modo a

realçar o crescimento tecidual e remodelamento. Essas propriedades

mecânicas são essenciais para que as células produzam quantidades

significativas de matriz extracelular (XUE e GREISLER, 2000).

O ácido poliglicólico (PGA) tem sido o polímero mais utilizado nesse tipo de

abordagem (KIM e cols, 1998; ZUND e cols, 1998). Entretanto, PGA é

degradado em tempo inadequado, o que pode levar ao enfraquecimento

prematuro dos tecidos antes de as células terem tempo de remodelar a prótese.

Para resolver essa questão, vários outros polímeros tem sido utilizados co-

polimerizados a PGA, tais como o ácido poli-L-láctico, PHA, PHB e

polietilenoglicol (ISENBERG e cols, 2006).

WATANABE e colaboradores (2001) utilizaram uma matriz composta de

PGA, policaprolactona e ácido poliláctico semeados com uma população de

células derivadas das veias femorais de um cachorro. A matriz foi mantida em

cultura por 7 dias, sendo implantada após esse tempo na veia cava inferior do

mesmo cão. A matriz polimérica foi completamente degradada em 3 meses, e o

enxerto permaneceu patente por mais de 13 meses, sem notificação de

dilatação ou estenose. O mesmo grupo realizou a primeira aplicação clínica de

22

sucesso utilizando o mesmo polímero para reparo de uma artéria pulmonar

ocluída de um menino de 4 anos de idade. Após 7 meses, o enxerto não

apresentou sinais de estenose ou formação de aneurisma (SHIN’OKA e cols,

2001). Essa prótese foi implantada numa circulação pulmonar de baixa pressão

(20 – 30 mm Hg durante a sístole), porém ensaios utilizando esses implantes

em vasos periféricos e com maior pressão ainda precisam ser avaliados.

Como citado anteriormente, o endotélio realiza várias funções fisiológicas,

entre elas a tromboresistência. HERRING e colaboradores (1978) foram os

primeiros a semear a superfície de uma prótese vascular com células

endoteliais. A presença de uma camada confluente de células endoteliais

previne o desenvolvimento de hiperplasia intimal oriunda da agregação de

plaquetas, que liberam fatores bioativos responsáveis pela migração,

proliferação e produção de matriz extracelular pelas células musculares lisas.

Além disso o endotélio confluente e quiescente é antitrombogênicos e controla

a proliferação das células musculares lisas (WISSINK, 1999; SCHOEN, 2006).

Além disso, os enxertos ideais devem possuir um endotélio confluente e

capaz de resistir ao stress causado pelo fluxo sanguíneo. Como as próteses de

HERRING apresentaram problemas relacionados a descamação das células

endoteliais, vários estudos foram realizados de modo a promover a adesão e

manutenção das células endoteliais semeadas (JARREL e WILLIANS, 1991).

Com relação a adesão e retenção, é descrito que as células endoteliais

aderem pobremente a próteses sintéticas (XUE e GREISLER, 2000). Muitas

proteínas adesivas, tais como fibronectina, colágeno, fibrina, laminina e

23

peptídios contendo a sequência RGD (arginina – glicina – asparagina) tem sido

aplicados para melhorar a eficiência do cultivo das células (SCHNEIDER e cols,

1992; VOHRA e cols, 1991). O condicionamento das próteses semeadas com

um endotélio confluente submetidas a “shear stress” antes da implantação

promove a reorganização do citoesqueleto das células endoteliais e também

melhora a razão de retenção celular submetida ao fluxo sanguíneo (OTT e

BALLERMANN, 1995).

As propriedades intrínsecas das próteses sintéticas também afetam a

adesão celular. Células endoteliais semeadas em Dacron

®

apresentam adesão

maior e mais rápida que e-PTFE quando cobertas com o mesmo tipo de

molécula (SUGAWARA e cols, 1997; VOHRA e cols, 1991). Isto se deve ao fato

de e-PTFE ser carregado negativamente, assim como as células endoteliais

(SUGAWARA e cols, 1997).

Ainda assim, o principal problema da utilização de próteses sintéticas é o

fato de as células endoteliais geralmente se apresentarem ativadas devido aos

diferentes processos de manipulação e a exposição crônica a um

microambiente não fisiológico (SAPIENZA e cols, 1998).

Células endoteliais ativadas produzem uma variedade de pró-coagulantes,

tais como o fator de von Willebrand, o inibidor de ativador de plasminogênio,

trombospondina e colágeno. Altos níveis de PDGF e bFGF também tem sido

detectados nas células endoteliais cultivadas, estimulando a migração e

proliferação de células musculares lisas e o desenvolvimento de hiperplasia

intimal (SAPIENZA e cols, 1998).

24

O primeiro ensaio envolvendo estruturas vasculares totalmente biológicas in

vitro sem a participação de polímeros sintéticos foi realizado por WEINBERG e

BELL (1986). Eles construíram um modelo de vaso sanguíneo contendo 3

camadas utilizando uma matriz de colágeno bovino para receber as células

endoteliais, células musculares lisas e fibroblastos. Trabalhos similares também

foram realizados por outros grupos (L’HEUREUX e cols, 1993; ZIEGLER e

NEREM, 1994). Entretanto esses modelos não alcançam a força mecânica

necessária para um implante, devido principalmente à matriz extracelular se

encontrar de maneira desorganizada (XUE e GREISLER, 2000).

Como alternativa, L’HEUREUX e colaboradores (1998) ao invés de

utilizarem componentes de matriz extracelular exógenos, geraram um vaso,

obtido exclusivamente do cultivo de células vasculares num microambiente bem

definido: a matriz extracelular foi produzida, de forma semelhante às veias

naturais. Células musculares lisas foram cultivadas in vitro na presença de

polímero como arcabouço, para formar uma camada de células e matriz

extracelular, cuja síntese foi estimulada pela presença de ácido ascórbico no

meio de cultura. Então essa camada era enrolada em volta de um suporte

tubular para mimetizar uma “camada média”. De maneira similar, uma camada

contendo fibroblastos e matriz extracelular também foi produzida e enrolada

sobre a “camada média” para fornecer a adventícia (L’HEUREUX e cols, 1998).

Após algum tempo, o suporte tubular foi removido e as células endoteliais foram

semeadas na superfície luminal. Este vaso construído exibiu uma força de

rompimento acima de 2000 mm Hg. As células musculares lisas apresentaram

25

orientações longitudinais e circunferenciais, além do marcador de diferenciação

desmina, normalmente perdido quando as células musculares lisas encontram-

se em cultura. Esses vasos também foram responsivos a agonistas vasoativos

e fibras de colágeno e elastina organizadas também estavam presentes na

matriz extracelular. Entretanto, em estudos a curto prazo, após a implantação

do vaso em artérias femorais caninas, infiltração sanguínea intramural foi

detectada (L’HEUREUX e cols 1998).

Recentemente, SWARTZ e colaboradores (2005) obtiveram resultados

similares. Neste trabalho a matriz utilizada para a confecção das próteses

vasculares foi originada de fibrina obtida de ovelhas.

Para se resolver a questão das propriedades mecânicas e

biocompatibilidade, tecidos acelularizados se apresentam como materiais

promissores para confecção de próteses vasculares (SCHMIDT e BAIER,

2000). Esses tecidos podem ser de origem vascular ou não, como por exemplo

a submucosa intestinal. O processo de acelularização normalmente é

acompanhado pelo tratamento dos tecidos com uma combinação de fixadores e

detergentes (Triton-X e SDS [dodecil sulfato de sódio]), enzimas e tampões,

com o objetivo de se preservar a matriz tecidual contra uma degradação

excessiva, redução da antigenicidade e esterilização (SCHMIDT e BAIER,

2000).

Entre os fixadores mais utilizados se encontra o glutaraldeído. Próteses

heterólogas ou xenogeneicas tratadas com este fixador tem apresentado

patência superior às próteses sintéticas. Entretanto, problemas relacionados a

26

calcificação, endotelização e degradação do material, com a conseqüente

dilatação e formação de aneurismas, torna a eficiência desse tipo de

abordagem baixa comparada aos vasos autólogos (SCHMIDT e BAIER, 2000).

Dentre as outras substâncias com potencial para preservação da estrutura

matricial, o glicerol tem sido descrito como uma boa alternativa (FERRANS e

cols, 1991; HOFFMAN e cols, 1992; RALSTON e cols, 1997; MAROSTICA,

2001).

Em 1997, GOSH e colaboradores estabeleceram o glicerol como o melhor

método para preservação da estrutura dérmica para fragmentos cadavéricos de

pele, bem como esterilização e acelularização do fragmento, com incubações

sucessivas e em concentrações crescentes. VAN BAARE e colaboradores

(1998) relataram que altas concentrações de glicerol preservam a integridade e

estrutura dos tecidos porque a água dos tecidos é removida sem alteração da

composição iônica intracelular. Acrescenta ainda que o glicerol reduz a

antigenicidade da pele de cadáver preservada por este agente, além de possuir

propriedade viral e bactericida.

Além disso, os procedimentos enzimáticos associados com os detergentes

citados anteriormente, geralmente removem proteoglicanos. Embora os

mecanismos ainda não estejam completamente elucidados, os proteoglicanos

demonstram possuir um papel significativo inibindo o processo de calcificação

(SCHMIDT e BAIER, 2000).

JORGE – HERRERO e colaboradores (1991) sugeriram a hipótese de que

os procedimentos extensivos de acelularização removem proteoglicanos,

27

resultando na perda de interações colágeno – proteoglicanos, o que gera uma

matriz porosa onde os sais de cálcio são depositados. Além disso, a adição de

proteoglicanos exógenos (tais como o condroitin sulfato e o heparan sulfato) a

tecidos pré-fixados com glutaraldeído apresentaram calcificação atenuada

(NIMNI e cols, 1987).

Desta forma nossa abordagem experimental de acelularização de artérias

de porco se baseia nos protocolos descritos por RALSTON e cols (1997) e

MAROSTICA (2001) utilizados para acelularização de derme cadavérica.

Nesses trabalhos as glicoproteínas de matriz extracelular bem como os

proteoglicanos foram preservados. Sendo assim, o protocolo que fora utilizado

para obtenção de derme acelular poderia também ser utilizado na tentativa de

se obter vasos sanguíneos acelularizados, que apresentam-se hoje em dia

como os mais promissores candidatos a biomateriais para confecção de

.próteses vasculares.

28

2) Objetivos:

- Geral:

O objetivo principal do trabalho foi adaptar o protocolo de acelularização de derme

cadavérica humana utilizando glicerol para utilização em artérias de porco,

caracterizarindo suas moléculas estruturais e citotoxicidade, de modo a torná-las

promissores candidatas a próteses vasculares.

- Objetivos específicos:

- Estabelecer o procedimento técnico para a obtenção de artérias acelularizadas,

de modo a preservar as estruturas matriciais.

- Avaliar morfologicamente os componentes matriciais dos fragmentos

acelularizados através de colorações histológicas e imunohistoquímica.

- Analisar a interação entre as células endoteliais e musculares lisas humanas

sobre os fragmentos acelularizados xenogeneicos.

29

3) Metodologia:

3.1 Captação das aortas ex vivo:

As aortas utilizadas no estudo foram obtidas de porcos de aproximadamente

100 kg do Abatedouro Frigoheleno, localizado no município de Itaperuna-RJ. Elas

foram dissecadas e armazenadas numa garrafa contendo meio de cultura DMEM

(Dulbecco’s Modified Eagle Medium - SIGMA) suplementado com antibióticos

(penicilina, streptomicina e anfotericina) (conforme ANEXO 1) por, no máximo, 24

horas e a 4º C até serem transportadas para o laboratório. Possuíam

aproximadamente 10 cm de comprimento x 8 mm de diâmetro.

Logo após foram retirados os restos musculares e de gordura das artérias,

seguindo-se o armazenamento do material em nitrogênio líquido.

3.2 Acelularização de fragmentos de aorta:

Seguiu-se um protocolo adaptado a partir do método descrito por RALSTON e

colaboradores (1997) e MAROSTICA (2001). As artérias foram descongeladas e

mantidas a 37º C. Fragmentos de aorta contendo aproximadamente 1 cm

2

foram

incubados em PBS-EDTA suplementado com antibióticos (conforme ANEXO 1) em

estufa seca a 37ºC por 1 hora. As artérias foram lavadas por três vezes em PBS, e

incubadas em NaCl 1M por 15 horas. A partir desta etapa, as artérias foram

imersas em gradientes crescentes de glicerol (50, 85 e 100%)(conforme ANEXO 1),

permanecendo 24 horas em cada uma dessas soluções.

30

Após a última incubação, o excesso de glicerol foi retirado com o auxílio de

papéis de filtro, até secagem completa. Foram submetidos posteriormente à

esterilização por óxido de etileno. Seguiu-se então reidratação dos fragmentos em

PBS com várias trocas da solução por pelo menos 6 horas e incubação com NaCl

1M por 15 horas. Após esses procedimentos, as amostras foram tomadas para

análise histológica para confirmar a acelularidade e armazenadas em PBS

suplementado com antibióticos (conforme ANEXO 1), a 4º C, até serem utilizados.

Foram colhidas também amostras para cortes congelados e para microscopia

eletrônica de varredura.

3.3 Investigação dos componentes dos fragmentos de aorta:

3.3.1 Análise histológica:

Amostras de aorta ex vivo e acelularizadas foram fixadas em formol a 10%

tamponado, permanecendo 24 horas no fixador. Foram então desidratadas em

gradientes crescentes de etanol e xilol e impregnadas com parafina. Cortes na

espessura de 5 μm foram obtidos e coradas pelos protocolos estabelecidos de

Hematoxilina-Eosina, Orceína de Unna-Tanzer para visualização das fibras

elásticas, Picrossírius para visualização de colágeno, PAS para evidenciar

glicoproteínas neutras e Azul de Alciano (pH 2,5 e 1,0) para verificação de

proteoglicanas e glicosaminoglicanas ácidas e sulfatadas (preparo de reagentes e

metodologia conforme ANEXO 1).

31

3.3.2: Análise imunohistoquímica:

Para imunolocalização de Fibronectina, foram utilizados cortes de 5 μm de

espessura das amostras parafinadas. Para análise de laminina, condroitin sulfato e

elastina foram utilizados amostras imersas em resina sintética (OCT Tissue – Tek,

Miles, EUA) resfriados em freezer e armazenados em nitrogênio líquido. Foram

utilizados cortes obtidos em criostato na espessura de 5 μm. As características dos

anticorpos se encontram na TABELA 1, localizada no ANEXO 2.

Os anticorpos para elastina, fibronectina e condroitin sulfato demonstraram

reagir bem nas reações de imunoperoxidase. Na análise utilizando-se anticorpo

específico para laminina, foi necessário utilizar a técnica de imunofluorescência,

uma vez que nas reações de peroxidase o anticorpo não demonstrou

funcionalidade. Nos controles negativos as amostras não foram incubadas com o

anticorpo primário ou foram incubadas com o soro da espécie animal dos

anticorpos primários. A metodologia das reações de imunoperoxidase e

imunofluorescência encontram-se no ANEXO 2.

3.4) Análise bioquímica:

3.4.1 - Dosagem de hidroxiprolina (STEGMANN e STALDER, 1967):

A hidroxiprolina é um aminoácido encontrado somente em proteínas colágenas.

Sua presença em um tecido é indicativo da presença de proteínas do tipo

32

colágeno. Para determinar a concentração deste aminoácido em fragmentos de

aorta ex vivo e acelularizadas, aproximadamente 30 mg (peso seco) de cada

amostra ( n=2) foram hidrolisados por 18 horas, com HCl 6N, à 107º C. O ácido foi

removido por evaporação e o material hidrolisado foi ressuspendido em 200 μL de

tampão de reação (5% de ácido cítrico monoidratado, 1,2% de ácido acético, 12%

de acetato de sódio triidratado, 3,4% de hidróxido de sódio, pH 6.0), diluído 1:10,

no momento do uso. Fora utilizados, então, 25 μl de cada solução, completando-se

o volume para 200 μl. As soluções foram então incubadas com solução de

cloramina-T por 20 minutos, à temperatura ambiente. Ao produto da reação foi

adicionado 1mL da solução aldeído/ácido perclórico, permanecendo por 15 minutos

à 60 ºC. As amostras foram lidas a uma absorbância de 570 nm e a concentração

de hidroxiprolina foi estimada, tendo como base uma curva padrão de 4-

hidroxiprolina (5 – 25 μ g).

3.4.2 – Dosagem de ácido urônico:

Para determinar a concentração de ácido urônico em fragmentos de aorta ex

vivo e acelularizadas, aproximadamente 2 g (peso seco) de cada amostra foram

ressuspendidos em 20 mL de tampão acetato de sódio 0,1M (pH 5,5), contendo

100 mg de papaína, EDTA 5 mM e cisteína 5 mM e incubadas a 60 ºC por 24

horas. A solução foi centrifugada (2000 g por 10 minutos em temperatura

ambiente). Mais 100 mg de papaína em 20 mL do mesmo tampão, contendo EDTA

5 mM e cisteína 5 mM foram adicionados ao precipitado. A mistura foi então

33

incubada por mais 24 horas. Os sobrenadantes das duas extrações foram

misturados e os GAGs precipitados com uma solução de cloreto de cetilpiridina

(0.5% concentração final), adição de 2 volumes de etanol 95% e mantidas a 4ºC

por 24 h. O precipitado formado foi coletado por centrifugação (2000 g por 10

minutos a temperatura ambiente), secos por resfriamento e dissolvidos em 2 mL de

água destilada.

A quantidade de GAGs nas amostras foi estimada pelo conteúdo de ácido

urônico, utilizando a reação com carbazol (BITTER e MUIR, 1962): alíquotas (25

μL) de cada fração foram submetidas a tratamento com ácido sulfúrico, contendo

borato 0,1%, a 100ºC. Após resfriamento, foi adicionada solução de carbazol (0,2%

em etanol absoluto), seguindo nova incubação a 100 ºC. A absorbância foi então

medida a 525 nm e a concentração de ácido urônico foi estimada, tendo como base

uma curva padrão de ácido urônico (5 – 20 μ g).

3.5) Obtenção de Células Endoteliais de Veia de Cordão Umbilical

(HUVECs):

O protocolo de obtenção de HUVEC é baseado no método estabelecido por

JAFFE e colaboradores em 1973. Os cordões umbilicais foram coletados de

placentas obtidas de partos naturais de mães saudáveis, com seu consentimento

prévio e aprovação do CONEP (Comissão de Ética em Pesquisa) da PROMATRE,

maternidade localizada no município do Rio de Janeiro.

Ele foi desenvolvido em nosso laboratório de forma que fragmentos de cordão

umbilical de 20 cm de comprimento foram coletados em PBS com penicilina (100

34

U/ml), estreptomicina (0,1 mg/ml) e anfotericina (2,5 μg/ml) e transportados no gelo

até seu processamento no laboratório. Em um fluxo laminar, os cordões coletados

foram trabalhados individualmente da seguinte forma: externamente, o excesso de

sangue é retirado com auxílio de uma gaze estéril e transferidos para uma placa de

petri. As pontas do cordão são cortadas e em cada extremidade da veia

introduzimos uma cânula feita de aço inox. Esta é fixada com o auxílio de fio dental.

Uma vez que seringas podem ser conectadas a estas cânulas, lava - se o interior

da veia com PBS, gentilmente. A seguir coloca – se colagenase IA 0,1%, deixando

por 12 minutos à 37º C (banho-maria). Após este tempo, perfunde - se pela veia 20

mL de meio 199 suplementado com 20% de SFB e coleta - se as células em tubos

de 50 mL. A suspensão celular foi centrifugada a 2000 g por 5 minutos e o pellet de

células foi ressuspenso em 3 mL de meio 199 suplementado com 20% de SFB e

antibióticos acima descritos (ver ANEXO 1) e colocadas em garrafas de cultura de

25 cm

2

. O cultivo é feito à 37º C em uma atmosfera com 5% de CO

2

. As culturas

são caracterizadas de acordo com a morfologia típica "cobblestone" e pela

presença do fator de von Willebrand detectado por imunofluorescência.

(BOTTENTUIT e cols, dados não publicados)

3.6) Obtenção de Células Musculares Lisas de Veia de Cordão

Umbilical (VSMCs):

O protocolo de obtenção de VSMCs é baseado também no método

estabelecido por JAFFE e colaboradores em 1973. Neste caso, após a obtenção

das HUVECs, o cordão é suavemente mastigado ao longo do seu comprimento

35

com o auxílio de uma pinça hemostática. Em seguida uma solução de colagenase

IA 0,2% é injetada dentro da veia. Após 15 minutos à 37 ºC (banho-maria),

perfundimos pela veia 20mL de meio DMEM suplementado com 20% de SFB e

coletamos as células em tubos de 50 mL. A suspensão celular foi centrifugada a

2000 g por 5 minutos e o pellet de células foi ressuspenso em 3 mL de meio DMEM

suplementado com 20% de SFB e antibióticos acima descritos (ver ANEXO 1) e

colocadas em garrafas de cultura de 25cm

2

. O cultivo é feito à 37 ºC em uma

atmosfera com 5 % de CO

2

. Inicialmente, as culturas obtidas ainda apresentam

uma pequena população de células endoteliais. Entretanto, nas passagens

seguintes estas células foram perdidas, restando culturas homogêneas de músculo

liso vascular. As culturas foram caracterizadas de acordo com a morfologia típica

de hills and valeys e pela presença de alfa-actina de músculo liso, detectada por

imunofluorescência.(BOTTENTUIT e cols, dados não publicados).

3.7) Repopulação dos fragmentos de aorta acelularizados:

Para o estudo da interação entre células endoteliais e células musculares lisas

humanas sobre as artérias aorta de porco acelularizadas, fragmentos de

aproximadamente 1 cm

2

foram cortados utilizando-se bisturis e foram colocados

em placas de 24 poços. Tais fragmentos foram incubados com soro fetal bovino

não diluído por 24 horas antes da aplicação das células.

Os fragmentos acelularizados foram repopulados seguindo-se três categorias:

na primeira, as HUVECs foram plaqueadas sobre a face do fragmento que

36

corresponderia ao lúmen vascular; na segunda categoria, VSMCs foram

plaqueadas na face correpondente à camada adventícia; na terceira, VSMCs foram

plaqueadas na face luminal.

Tanto as células endoteliais (HUVECs) como as células musculares lisas

(VSMCs) foram obtidas a partir da tripsinização de culturas confluentes, que eram

mantidas a 37ºC e atmosfera contendo 5% de CO

2.

O processo de tripsinização

consiste na lavagem inicial das culturas com PBS por duas vezes para a retirada

de proteínas de soro fetal bovino remanescentes do meio de cultura suplementado.

Segue-se, então, incubação com tripsina 0,125 %, dissociação da monocamada, e

acréscimo de meio de cultura suplementado com soro fetal bovino. As proteínas do

soro inativam a tripsina e seguiu-se a homogeneização dos grumos celulares, de

modo a se obter as células individualizadas.

Nos três casos foi plaqueada sobre os fragmentos arteriais uma suspensão

celular contendo 1 x 10

4

células / cm

2

. As culturas foram visualizadas em 5, 10 e 20

dias, sendo mantidas em meio de cultura suplementado a 20% com soro fetal

bovino e antibióticos (conforme ANEXO 1), a 37ºC e 5 % de CO

2

. Para HUVECs, o

meio de cultura utilizado foi 199, e para VSMCs, DMEM.

3.8) Análise dos fragmentos repopulados:

As amostras repopuladas com HUVECs e VMSCs foram fixadas em solução de

Karnovisky, lavadas por 3 vezes de 10 minutos em tampão cacodilato de Sódio 0,1

M / Sacarose 0,2 M e pós-fixadas em tetróxido de ósmio 1% em tampão

Cacodilato de sódio por 1 hora. Foram então lavadas por 3 vezes de 10 minutos

37

em tampão cacodilato de Sódio 0,1 M / Sacarose 0,2 M e desidratados em banhos

seriados de etanol a 30, 50, 70, 80, 90% e absoluto. Seguiu-se então o processo

de ponto crítico, a metalização em ouro e a visualização no Microscópio Eletrônico

de Varredura JEOL 5310, LEO ZEISS – DSM 940 A, sendo as imagens capturadas

através do programa SEM – AFORE.

Amostras de matrizes repopuladas com VSMCs também foram fixadas em

formalina neutra 10% tamponada, sendo tratadas mediante o mesmo procedimento

descrito anteriormente para parafinização e coloração por hematoxilina e eosina.

38

4) Resultados:

4.1 Análise histológica da aorta acelularizada:

Na análise histológica dos fragmentos corados por HE, observa-se uma

completa ausência de células na íntima, na camada média e na adventícia dos

fragmentos de aorta submetidos ao processo de acelularização (PRANCHA I –

FIGURAS A e B; C e D). Observar os núcleos em azul nos fragmentos íntegros

e a ausência de coloração nos fragmentos acelularizados . Nestes últimos, notar

também o espaçamento e desarranjo das fibras matriciais devido a ausência de

células.

Na coloração de Unna-Tanzer verificou-se a preservação de fibras do

sistema elástico, na cor marrom. (PRANCHA II – FIGURAS A e B). Na coloração

de picrossírius a preservação das fibras de colágeno, em vermelho, foi

evidenciada (PRANCHA II – FIGURAS C e D). Dessa forma, observou-se que

nosso processo de acelularização conserva as fibras mais importantes para a

manutenção da estrutura arterial, característica indispensável para a

complacência de um implante.

A análise dos polissacarídeos também foi feita e a coloração por PAS

revelou a manutenção dessas moléculas em comparação com a aorta ex vivo

(PRANCHA III – FIGURAS A e B). Da mesma forma, a coloração com azul de

alciano revelou que os proteoglicanos sulfatados (pH = 1,0) e não sulfatados (pH

= 2,5) também permanecem presentes nos fragmentos acelularizados, apesar

39

das intensas lavagens a que são submetidos (PRANCHA III – FIGURAS C e D,

e E e F, respectivamente). Na coloração de pH = 2,5, foi possível analisar a

presença de células no fragmento de artérias íntegras, cujos núcleos estão

corados em vermelho (FIGURA C), ao contrário do material acelularizado

(FIGURA D). O Nuclear Fast Red não cora no pH = 1,0. Por este motivo não

evidenciamos a presença de células nos fragmentos íntegros nessa coloração

(FIGURA E) (PRANCHA III).

4.2 Análise bioquímica:

A dosagem quantitativa de hidroxiprolina segundo o protocolo estabelecido

por STEGMANN e STALDER (1967) revelou que a metodologia de

acelularização utilizado por nosso grupo mantêm o mesmo conteúdo de fibras

colágenas que fora dosado antes do início do protocolo. Dessa forma, não

apenas a disposição, evidenciada pela coloração de Picrossírius (PRANCHA II –

FIGURAS E e F) mas também a quantidade de colágeno é mantida no material

acelularizado (PRANCHA IV – FIGURA A).

Com relação ao teor de glicosaminoglicanos, a dosagem de ácido urônico

revelou, em nosso experimento preliminar, uma queda de aproximadamente 30

% da quantidade de GAGs comparado aos fragmentos não submetidos ao

processo de acelularização. Isso provavelmente ocorre pelo fato das GAGs

serem solúveis em água. Como citado na metodologia, durante o processo de

acelularização os fragmentos foram submetidos a sucessivas lavagens, porém

40

essa diminuição não foi evidente neste primeiro ensaio avaliado (PRANCHA IV –

FIGURA B).

4.3 Análise imunohistoquímica:

Assim como nos fragmentos de aorta ex vivo, foi detectada imunoreatividade

nos fragmentos acelularizados para as proteínas matriciais elastina (PRANCHA

V, A e B) e fibronectina (PRANCHA VI, A e B) e para o glicosaminoglicano

condroitin sulfato (PRANCHA V, C e D). Essas moléculas foram reveladas por

imunoperoxidase, e são observadas pela cor marrom. Os controles negativos

respectivos para os fragmentos ex vivo e acelularizados são representados

pelas figuras G e H (PRANCHAS V e VI – FIGURAS E e F; C e D,

respectivamente).

Na PRANCHA VII observa-se imunorreatividade para laminina, que foi

detectada por imunofluorescência (FIGURAS A e B). A imunoreatividade é

demonstrada pelas regiões com a cor “verde-maçã’), representação

característica para anticorpos conjugados a fluoresceína. (PRANCHA VII –

FIGURA B).

Observar o “background” da camada média (verde escuro) e a auto-

fluorescência da elastina (em vermelho), onde podemos destacar a lâmina

elástica interna, a partir da coloração com Azul de Evans.

41

4.4 Análise dos fragmentos acelularizados por microscopia

eletrônica de varredura:

Os fragmentos acelularizados demonstraram apenas a manutenção das

fibras matriciais, não exibindo células endoteliais ou células musculares lisas

aderidas (PRANCHA VIII – FIGURAS B e D), confirmando as análises

observadas pelas colorações de HE, PAS e azul de alciano (PRANCHA I –

FIGURAS A e B; PRANCHA II – FIGURAS A a F).

4.5 Repopulação dos fragmentos acelularizados:

Uma vez que nos ensaios citados anteriormente ficou constatada a

manutenção de moléculas matriciais e que em trabalhos publicados

anteriormente utilizando somente próteses acelularizadas a formação de

trombose é iminente, a repopulação dos fragmentos de artéria acelularizadas é

necessária para a completa reconstituição da íntima. Dessa forma, foi realizado

um ensaio funcional in vitro de endotelização e repopulação com células

musculares lisas, de forma a avaliar a citotoxidade dos fragmentos submetidos a

acelularização.

No ensaio utilizando HUVECs, foi demonstrado, num período de até 20 dias,

que as células endoteliais foram capazes de aderir e proliferar. Além disso, elas

foram capazes de se associarem umas as outras, buscando a confluência, que é

uma propriedade é primordial para o sucesso de uma prótese vascular, onde a

camada intimal deve se apresentar lisa, sem rugosidades, de modo a não

42

promover adesão de debris celulares ou agregação plaquetária (PRANCHA VIII

– FIGURAS A, C, E e F; PRANCHA IX FIGURAS A a F).

Utilizando-se VSMCs plaqueadas na face adventicial, as células também

foram capazes de aderir, proliferar e buscar a formação de uma camada

confluente (PRANCHA X – FIGURAS A a H). Mais do que isso, mostraram-se

aptas a migrar em direção a camada média (PRANCHA XI – FIGURAS B e C).

Esses resultados demonstram que nosso composto acelularizado não

apenas conserva as moléculas matriciais, bem como está apto a promover a

migração celular necessária para repopulação da camada média após a

implantação do enxerto.

No ensaio utilizando-se VSMCs plaqueadas na face luminal, as células

musculares lisas não mantiveram a mesma aderência apresentada pelas

VSMCs plaqueadas na face adventícia ao longo dos 20 dias de cultura. Com 15

dias de cultura bordas soltas já eram visualizadas, característica comum de

monocamadas crescendo num microambiente cujo as células não possuam

afinidade (PRANCHA XII). Esse resultado preliminar sugere que nosso

composto acelularizado mantém informações de nicho celular, de modo a

promover a manutenção de uma monocamada aderente de células endoteliais e

musculares lisas por 20 dias apenas sobre as lâminas basais das camadas

íntima e média, respectivamente.

43

PRANCHA I – Morfologia dos fragmentos de aorta “ex vivo” e

acelularizados:

FIGURA A: Fragmento de aorta ex vivo corado com HE. O endotélio se mostra

presente na face luminal (asterísticos), sendo evidente a presença de fibras

musculares lisas na camada média (setas)(objetiva de 40 x). Barra negra

representativa de 25 μm válida para todas as fotos.

FIGURA B: Fragmento de aorta acelularizado corado com HE. Observar a

ausência de células endoteliais na íntima e de células musculares na camada

média. Notar a manutenção da disposição das fibras matriciais (coradas em

rosa) e o espaçamento observado pela ausência de células (setas) (objetiva de

40 x). Barra negra representativa de 25 μm válida para todas as fotos.

FIGURA C: Fragmento de aorta ex vivo corado com HE. Imagem representativa

das camadas média (m) e adventícia (a). A adventícia demonstra ser uma

camada muito mais delgada que a camada média. Observas a presença de

células, evidenciadas pela coloração com hematoxilina (núcleos em azul).

FIGURA D: Fragmento de aorta acelularizado corado com HE. Imagem

representativa das camadas média (m) e adventícia (a). Notar a manutenção da

disposição das fibras matriciais (coradas em rosa) e o espaçamento observado

pela ausência de células (setas) na camada média. A adventícia encontra-se

mais espaçada com a ausência das células (objetiva de 40 x).

44

A

*

*

*

B

*

m

a

m

C

a

a

m

m

D

45

PRANCHA II – Morfologia dos fragmentos de aorta “ex vivo” e

acelularizados:

FIGURA A: Aorta ex vivo, corada com Orceína de Unna Tanzer, para

evidenciar as fibras elásticas presentes na lâmina elástica interna (asterísticos)

e na camada média, em marrom (setas) (objetiva de 40 x). Barra negra

representativa de 25 μm válida para todas as fotos.

FIGURA B: Aorta acelularizada, corada com Orceína de Unna Tanzer. Notar a

manutenção das fibras elásticas – em marrom. Observar a manutenção da

lâmina elástica interna (asterísticos) e das fibras elásticas (setas) (objetiva de

40 x). Barra negra representativa de 25 μm válida para todas as fotos.

FIGURA C: Aorta ex vivo corada com Picrossírius, evidenciando as fibras

colágenas, em vermelho, presentes na camada média (objetiva de 40 x).

FIGURA D: Aorta acelularizada corada com Picrossírius. Notar a manutenção

das fibras colágenas, em vermelho, comparando-se com o fragmento não

submetido a tratamento (FIGURA E) (objetiva de 40 x).

46

*

*

*

*

*

*

B

A

C D

47

PRANCHA III – Morfologia dos fragmentos de aorta “ex vivo” e

acelularizados:

FIGURA A: Fragmento de aorta normal. Coloração de PAS, para evidenciar

glicoproteínas (em roxo), principalmente membrana basal. Núcleos celulares

corados com Hematoxilina, em azul (setas) (objetiva de 40 x). Barra negra

representativa de 25 μm válida para todas as fotos.

FIGURA B: Fragmento de aorta acelularizado. Coloração por PAS. Observar a

manutenção da membrana basal, em roxo, mesmo após o processo de

acelularização. Observar a ausência de coloração com hematoxilina. (objetiva

de 40 x). Barra negra representativa de 25 μm válida para todas as fotos.

FIGURA C: Aorta ex vivo. Coloração com Azul de Alciano (pH 2,5), para

evidenciar glicosaminoglicanos – em azul. Os cortes foram contracorados com

Nuclear Fast Red, para localização das células (em vermelho)(objetiva de 40 x).

FIGURA D: Aorta acelularizada. Coloração com Azul de Alciano (pH 2,5).

Observar a manutenção dos glicosaminoglicanos, mesmo após as sucessivas

lavagens do processo de acelularização. Notar também a ausência de

coloração dos núcleos celulares com Nuclear Fast red (objetiva de 40 x).

FIGURA E: Aorta ex vivo. Coloração com Azul de Alciano (pH 1,0), para

evidenciar apenas os glicosaminoglicanos sulfatados (objetiva de 40 x).

FIGURA F: Aorta acelularizada. Coloração com Azul de Alciano (pH 1,0), para

evidenciar apenas os glicosaminoglicanos sulfatados (objetiva de 40 x).

48

A B

D

C

E F

49

PRANCHA IV: Dosagem bioquímica

Dosagem de HO-Pro

0,000

5,000

10,000

15,000

20,000

25,000

30,000

Controle Acelular

ug HO-Pro/mg Peso seco

A

Dosagem de Ácido Urônico

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

Controle Acelular

mg Ác. Urônico/g Peso Seco

B

FIGURA A: Dosagem de hidroxi-prolina entre fragmentos de aorta íntegros e

acelularizados. Não houve diferença significativa no conteúdo de colágeno nas

dosagens realizadas antes e após o processo de acelularização. (n = 2) p =

0,822505481 – Teste t de Student.

FIGURA B: Dosagem de ácido urônico. O conteúdo de glicosaminoglicanos

totais após o processo de acelularização foi de aproximadamente 70% do

conteúdo correspondente medido do fragmento de aorta ex vivo. Não há teste

estatísco, pois trata-se de um experimento preliminar.

50

PRANCHA V – Imunohistoquímica de fragmentos de aorta “ex

vivo” e acelularizados

Figuras A e B: Imunomarcação para elastina em corte congelado de aorta ex

vivo (A) e aorta acelularizada (B). Reatividade em marrom das fibras elásticas.

Observar os núcleos em azul contracorados com hematoxilina (objetiva de 40

x). Barra negra representativa de 25 μm válida para todas as fotos.

Figuras C e D: Imunomarcação para condroitin sulfato em corte congelado de

aorta normal (E) e aorta acelularizada (F) Reatividade em marrom. Observar os

núcleos em azul contracorados com hematoxilina (200 x e objetiva de 40 x,

respectivamente).

Figuras E e F: Controles negativos de cortes obtidos de artéria normal (G) e

acelularizada (H) (objetiva de 40 x).

51

A

B

C

D

E F

52

PRANCHA VI – Imunohistoquímica de fragmentos de aorta “ex

vivo” e acelularizados

Figuras A e B: Imunomarcação para fibronectina em corte parafinado de aorta

normal (C) e aorta acelularizada (D) Marcação em marrom. Observar os

núcleos em azul contracorados com hematoxilina e maior intensidade de

marcação na camada subendotelial (objetiva de 40 x). Barra negra

representativa de 25 μm válida para todas as fotos.

Figuras C e D: Controles negativos de cortes obtidos de artéria normal (G) e

acelularizada (H) (objetiva de 40 x).

53

C D

A

B

54

PRANCHA VII – Imunofluorescência

A

B

Figura A: Aorta ex vivo. Anticorpo contra laminina, apresentando reatividade

nas camadas luminal e média (cor verde-maçã – setas) (FITC-objetiva de 40 x).

Barra branca representativa de 25 μm.

Figura B: Aorta acelularizada. Imunoreatividade também pronunciada nas

camadas luminal e média (verde-maçã – setas) Verificar também a integridade

da camada elástica interna (visualizada em vermelho devido a coloração com

azul de Evans). A elastina possui autoflurorescência intrínseca.

55

PRANCHA VIII: Microscopia eletrônica de varredura:

repopulação dos fragmentos arteriais acelularizados com

HUVECs

FIGURAS A, C, E e F: Repopulação com HUVECs da matriz arterial

acelularizada, com 5 dias de cultivo. Visão global do composto acelularizado

repopulado (A). Observar as áreas com sinal maior de eletronsecundário,

devido a presença de células (setas) e áreas com menor sinal, representativas

de matriz acelularizada (asterísticos) (50 x). Em (C) observamos as células

endoteliais aderidas (setas) sobre a matriz arterial acelularizada (asterísticos)

(200x). Em (E) e (F) podemos observar, num maior aumento, os contatos

adesivos entre as células endoteliais (setas) e parte da matriz ainda não

repopulada (asterísticos) (750 x e 1.500 x, respectivamente).

FIGURAS B e D: Aorta submetida ao processo de acelularização. Observar a

manutenção das fibras matriciais e completa ausência de células (camada

íntima) (aumento de 1.000 e 15.000 x, respectivamente).

56

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

57

PRANCHA IX: Microscopia eletrônica de varredura: repopulação

com HUVECs

*

FIGURAS A, C e E: Repopulação com HUVECs da matriz arterial acelularizada,

com 10 dias de cultivo. Visão global (A) das artérias acelularizadas semeadas com

células endoteliais humanas, representadas pelas com sinal maior de

eletronsecundário (setas). Matriz não repopulada representada pelas áreas de

menor sinal (50 x). Em maior aumento podemos observar células endoteliais

aderidas (setas) e matriz acelularizada ainda não repopulada (asterísticos)

(FIGURAS C e E) (350 x e 750 x respectivamente).

FIGURAS B, D e F: Repopulação com HUVECs da matriz arterial acelularizada,

com 20 dias de cultivo. Visão global (B) das artérias acelularizadas semeadas com

células endoteliais humanas, representadas pelas áreas com sinal maior de

eletronsecundário (setas). Nas áreas claras, matriz não recoberta pela

monocamada de células (asterísticos) (50 x). Observar em (D) células aderidas

com 20 dias de cultivo (150 x). Em (F) observamos junções entre as células

endoteliais semeadas (setas).

*

58

*

*

*

*

*

*

*

*

*

59

PRANCHA X: Microscopia eletrônica de varredura: repopulação

com VSMCs.

FIGURAS A a H: Plaqueamento de VSMCs sobre camada adventícia de um

fragmento de artéria acelularizado. As células musculares lisas foram capazes

de aderir e formar uma camada confluente com até 20 dias de cultura. Observar

as células musculares lisas aderidas (setas) e matriz arterial ainda não

repopulada (asterísticos). (A e B – 5 dias de cultura);(C e D – 10 dias); (D e E –

15 dias); (G e H – 20 dias).

60

A B

C D

E F

G H

*

*

*

*

*

*

61

PRANCHA XI – Análise histológica: plaqueamento de VSMCs

FIGURA A: Aorta acelularizada corada com HE. Análise das camadas média

(m) e adventícia (a), demonstrando completa ausência de células no material

submetido a tratamento (pela coloração por hematoxilina nos núcleos). (objetiva

de 40 x)

FIGURAS B e C: Aorta acelularizada repopulada com VSMCs sobre a camada

adventícia. Observar a migração das células musculares lisas em direção a

camada média (setas), com até 20 dias de cultura. HE, objetiva de 40 x.

62

a

a

m

m

A

m

C

B

63

PRANCHA XII: Microscopia eletrônica de varredura:

plaqueamento de VSMCs na face luminal de fragmentos de

artérias acelularizadas

Análise da interação entre células musculares lisas e matriz arterial

acelularizada: plaqueamento sobre face luminal dos fragmentos. Até 10 dias de

cultura podemos observar a adesão das células semeadas sobre a matriz

(FIGURA A – 5 dias e FIGURA B – 10 dias). A partir de 15 dias de cultura (C)

a monocamada de células demonstrou não possuir aderência sobre a matriz

arterial, característica observada também com 20 dias de cultura. É evidente a

formação de dobras na monocamada de células, característica que é comum na

interação de células plaqueadas sobre uma camada não adesiva (D).

64

A

C

A

B

D

C

B

D

65

5) Discussão:

O desenvolvimento de uma prótese vascular de pequeno calibre permanece

elusivo. Embora a utilização de veia safena autóloga continue sendo a melhor

opção, muitos pacientes não possuem veia de boa qualidade ou já fizeram o

enxerto numa patologia anterior. Deste modo, a procura por próteses alternativas

tornou-se necessária. A utilização de materiais sintéticos, tais como o Dacron

®

e o

e-PTFE, que demonstram ter altas razões de patência em aplicações para vasos

de grande calibre, torna-se inviável na substituição de vasos de pequeno calibre

por formar trombos com poucas semanas de operação (XUE e GREISLER, 2000).

Vasos sanguíneos xenogeneicos acelularizados demonstram ser promissores

candidatos ao desenvolvimento de próteses vasculares de pequeno calibre

(CONKLIN e cols, 2002).

Na tentativa de avançar nos estudos relativos ao desenvolvimento de

próteses vasculares com perspectivas de uso clínico, realizamos um estudo de

caracterização de xenotransplantes acelularizados obtidos de porco. Para

definirmos esse composto como satisfatório, consideramos três pontos principais:

1) facilidade de obtenção do material; 2) metodologia de acelularização utilizando

método químico e não enzimático, de forma a preservar as moléculas matriciais;

3) obtenção de um composto apto a promover adesão, proliferação e interação

das células semeadas em condições de cultura.

A escolha de vasos sanguíneos obtidos de porcos se deve ao fato de ser

um material de fácil obtenção. Diversos trabalhos demonstram que a utilização

desse material acelularizado obtido de suínos não sofre rejeição imunológica em

66

outros modelos animais (KAUSHAL e cols, 2001; CONKLIN e cols, 2002). Além

disso, no Brasil não existem bancos de vasos sanguíneos semelhantes ao

existentes na Europa, sendo necessária a procura por outra fonte de enxerto

(BUZZI e cols, 2005).

Várias técnicas têm sido utilizadas para a obtenção de vasos sanguíneos

acelularizados (SCHMIDT e BAIER, 2000; SCHANER e cols, 2004). Nos métodos

utilizando fixadores, tais como o glutaraldeído, têm sido verificado a ocorrência de

calcificações, assim como a alta incidência de aneurismas após dois anos de sua

implantação (ROSENBERG e cols, 1976; DALE e LEWIS, 1976 SCHMIDT e

BAIER, 2000). Nas abordagens que utilizam detergentes e enzimas, a degradação

das moléculas de matriz extracelular descritas, ocasionam o processo de

calcificação, levando também à conseqüente falência das próteses (SCHMIDT e

BAIER, 2000; BUJÁN e cols, 2004).

Foi escolhida a técnica utilizando glicerol uma vez que, segundo vários

autores, é a que melhor preserva as glicoproteínas matriciais (GHOSH e cols,

1997; MAROSTICA, 2001). Além disso, alguns autores consideram que o glicerol

parece ter uma ação anti-microbiana, por promover a desidratação lenta do tecido,

base para uma ação bactericida e anti-viral (MARSHALL e cols, 1995; VAN

BAARE e cols, 1998).

Assim como em outros trabalhos utilizando-se outras metodologias de

acelularização de vasos sanguíneos (KAUSHAL, 2001; SCHANER e cols, 2004

CHO e cols, 2005 b) pudemos confirmar, com o uso dessa técnica, que há uma

preservação de componentes matriciais. Em nosso estudo observamos que

colágenos, fibras do sistema elástico, fibronectina, laminina e componentes da

67

membrana basal mostravam reatividade para as colorações especiais e

imunohistoquímica, sugerindo, portanto, uma preservação da estrutura química

dessas moléculas.

Quanto a função, o colágeno é o principal componente responsável pela

força tensora arterial, enquanto a elastina participa na distensibilidade e na

elasticidade dos vasos sanguíneos. Os glicosaminoglicanos têm importante papel

ao evitar a calcificação. A extração sucessiva dessas moléculas dá origem a uma

matriz porosa onde os sais de cálcio são depositados (BUJÁN e cols, 2004).

Tratando-se do desenvolvimento de uma prótese vascular, nosso trabalho foi o

priemeiro a demonstrar a análise quantitativa de matrizes teciduais submetidas ao

processo de acelularização. A dosagem de hidroxi-prolina demonstrou que as

artérias submetidas ao processo de acelularização possuem a mesma quantidade

de colágeno que as amostras ex vivo. Nossa metodologia demonstrou a perda de

30 % do conteúdo total de glicosaminoglicanos após as sucessivas lavagens

decorrentes do processo de acelularização. A análise deste material num ensaio

in vivo deve ser avaliada na formação ou não de calcificação, de forma a se

verificar se a perda desse percentual é prejudicial ou não no desenvolvimento de

uma prótese vascular.

Trabalhos iniciais envolvendo próteses alogeneicas ou xenogeneicas

apenas acelularizadas demonstram não ser patentes pelo mesmo motivo que as

próteses sintéticas de pequeno calibre: formação de trombose com poucas

semanas após a implantação. Tal fato foi atribuído a ausência de uma camada

luminal coberta por células endoteliais, conhecidas por secretar substâncias anti-

trombogênicas. Além disso, a superfície de um implante acelularizado apresenta

68

rugosidades comparáveis aos materiais sintéticos, sujeitos a agregação

plaquetária ou de debris celulares (WISSINK, 1999) VER FIGURA 3.

B

A

C

Figura 3: Microscopia eletrônica de varredura de uma prótese de (A) Dacron

(Cooley knitted Dacron, Meadox Medicals, Oakland, NJ, 100 ×) and (B) e- PTFE

(Gore-Tex, Gore & Associates, Flagstaff, AZ, 500 ×) Retirado de WISSINK, 1999.

(C) Aorta de porco acelularizada (1000 X).

Desta forma, o recobrimento das próteses vasculares com células

endoteliais é um reconhecido método para melhorar a compatibilidade sanguínea

de implantes. O endotélio é descrito como a superfície natural perfeitamente

compatível com o sangue, secretando várias moléculas bioativas que afetam a

69

adesão e a agregação plaquetária, a coagulação sanguínea e fibrinólise. Além do

mais, a expressão de fatores tais como o fator tecidual e heparan sulfato regulam

a interação com componentes sanguíneos. Portanto, a função endotelial

diretamente afeta o balanço de homeostasia e trombogênese no sistema

cardiovascular (SCHOEN, 2006). Uma vez criada uma camada de células

endoteliais linear na superfície de uma prótese vascular, implantes com

características superficiais não trombogênicas similares poderiam ser obtidos.

C

Para isso, a presença de moléculas matriciais adesivas, tais como a

fibronectina e laminina, bem como a manutenção das moléculas de membrana

basal são importantes fatores encontrados em nossas próteses que podem

promover a adesão e manutenção das células endoteliais. Como demonstrado em

nossos resultados, tanto as células endoteliais como as células musculares lisas

foram capazes de aderir e proliferar com até 20 dias de cultura. Esses resultados

são comparáveis às repopulações de próteses acelularizadas utilizando-se outras

metodologias (KAUSHAL, 2001; CHO e cols, 2005 b). Mais do que isso, as células

musculares lisas foram capazes de migrar em direção a camada média,

demonstrando que nosso material é apto a promover a migração e proliferação

deste importante tipo celular, responsável pela força circunferencial das artérias.

Além disso, nossas próteses demonstraram manter informações de

microambiente: as células musculares lisas não foram capazes de aderir e formar

uma camada confluente quando plaqueadas no lado luminal da artéria. Pode ser

sugerido que a célula muscular lisa não aderiu ao nosso material acelularizado por

ter sido plaqueada diretamente sobre uma superfície não adesiva para ela, ou

seja, uma superfície composta da membrana basal endotelial (colágeno IV,

70

laminina e heparan sulfato). Porém, a análise por microscopia eletrônica de

transmissão ou microscopia confocal deve ser realizada, de modo a avaliar a

interação das células com o material acelularizado a partir de integrinas e outras

moléculas de adesão, além de fibronectina e laminina.

A endotelização é uma etapa indispensável na confecção de uma prótese

vascular patente por longa duração (KAUSHAL e COLS, 2001; CHO e cols (b),

2005). A partir disto, e almejando o trabalho clínico, é importante discutir as fontes

celulares para possível repopulação dessas próteses vasculares. A obtenção de

células endoteliais diferenciadas a partir de vasos autólogos (DICHEK e cols,

1989; FLUGELMAN e cols, 1992) bem como a diferenciação de células

progenitoras endoteliais obtidas de medula óssea ou sangue periférico (KAUSHAL

e cols, 2001; RAFII e LYDEN, 2003; HILL e cols, 2003; HUR e cols, 2004; CHO e

cols, 2005 (b)) têm sido pesquisadas e serão determinantes na continuação deste

trabalho, cujo objetivo final será a confecção de próteses vasculares patentes por

longa duração.

Dentre os vasos autólogos candidatos a fonte celular, pode-se citar as veias

safena e braquial. São veias de fácil dissecção, de fácil compensação numa

eventual ausência e possuem quantidade de células suficientes para obtenção de

uma cultura de células. Ambas poderiam ser submetidas aos protocolos

estabelecidos por JAFFE e colaboradores (1973) para a obtenção de células

endoteliais e musculares lisas. As células poderiam se expandidas em cultura,

congeladas e armazenadas até haver a necessidade da repopulação de uma

prótese vascular.

71

Já a proposta envolvendo a utilização de células diferenciadas a partir de

progenitores de medula óssea tem como principal vantagem o maior número de

células que se pode obter em comparação com a proposta de veias autólogas. É

importante ressaltar que nem todos os pacientes possuem veias num bom estado

de conservação ou possuem veias que já possuem um endotélio ativado pelas

diversos fatores que levam a aterosclerose. Há ainda os pacientes que já

utilizaram as veias citadas anteriormente numa outra cirurgia.

Deste modo, o investimento em modelos utilizando medula óssea se dá

pelo fato desse sítio tecidual manter tanto progenitores endoteliais, quanto os

progenitores mesenquimais. Estes últimos podem dar origem tanto a células

musculares lisas quanto a células endoteliais, entre outros, quando submetidas a

condições de cultivo específicas para cada fenótipo celular (KAUSHAL e cols,

2001; COSSU e BIANCO, 2003; ASAHARA e KAWAMOTO, 2004; CHO e cols (b),

2005).

Além disso, possíveis próteses repopuladas devem ser testadas em

ensaios biomecânicos, que irão avaliar importantes variáveis, tais como a

resistência ao ponto cirúrgico, a distensibilidade, a complacência e a resistência

do endotélio ao fluxo sanguíneo. Esta última variável, conhecida como “shear

stress”, tem sido descrita como fator primordial na orientação de células

endoteliais semeadas em próteses vasculares e também está sendo relacionado a

aumento de razão de patência dessas próteses (STEPP e cols, 2001;

RADEMACHER e cols, 2001, OTT e BALLERMANN, 1995). Além disso as células

endoteliais submetidas a “shear stress” secretam fatores antitrombogênicos, tais

como o fator ativador de plasminogênio (YANG e cols, 2006).

72

Assim, a perspectiva de nosso primeiro ensaio experimental in vivo

envolverá o uso de artérias ilíacas de porcos. O diâmetro interno destes vasos não

ultrapassam 5 mm e segmentos de até 10 cm de comprimentos podem ser

dissecados e processados conforme a metodologia de acelularização descrita

neste trabalho. A repopulação se daria com células autólogas já diferenciadas

obtidas de veia braquial ou com células derivadas da fração mononuclear da

medula óssea.

A utilização de células endoteliais e musculares lisas de vasos autólogos é

um dos métodos descritos para a repopulação de próteses vasculares, sendo uma

abordagem experimental estudada por diversos grupos (OPITZ e cols, 2004;

LAFLAMME e cols, 2005; HIBINO e cols, 2005). Já ASAHARA e colaboradores

(1999) demonstraram que células progenitoras endoteliais derivam da medula

óssea, contribuindo para a neovascularização num modelo de transplante de

medula. A partir disto, vários grupos utlizaram células de medula óssea para o

desenvolvimento de próteses vasculares (MATSUMURA e cols, 2003; CHO e cols

(a), 2004; HIBINO e cols, 2005; CHO e cols (b), 2005, SHIN`OKA e cols, 2005).

Esses trabalhos demonstraram que células obtidas de medula óssea possuem

plasticidade para diferenciação em fenótipo endotelial ou células musculares lisas.

Quando semeadas numa matriz que suporte adesão, proliferação e migração

celular, demonstram que a medula óssea constitui uma promissora fonte celular

para o desenvolvimento de próteses vasculares quando não for possível obter

vasos autólogos dos pacientes (MATSUMURA e cols, 2003; HIBINO e cols, 2005;

CHO e cols (a), 2004; CHO e cols (b), 2005, SHI`OKA e cols, 2005).

73

As ovelhas são reconhecidos modelos experimentais para o estudo de

próteses vasculares (KAUSHAL e cols, 2001). A prótese seria implantada na

carótida, cuja biomecânica mimetiza as condições de um vaso de pequeno calibre

humano. Com o ensaio in vivo poderemos avaliar a interação da prótese contra o

hospedeiro, a razão de patência, a incorporação da prótese ao tecido adjacente, a

possível migração de células perivasculares e o possível remodelamento matricial

de nossa prótese, visto que o objetivo final desse estudo será vasos praticamente

idênticos a artérias sadias. Além disso, nosso material poderia ser utilizado

também como possíveis fístulas de hemodiálise, de forma a melhorar o

desempenho apresentado pelas fístulas de e-PTFE, que tem durabilidade

variando apenas entre 3 e 5 anos (PITTA e cols, 2003).

74

6) Conclusões:

- O processo utilizado para preparação da artéria acelularizada utilizando-se

glicerol é eficiente no tocante a acelularização das artérias e manutenção da

arquitetura e organização da matriz extracelular.

- Nossa metodologia conservou os componentes matriciais de maneira qualitativa

e quantitativa. Além disso, importantes moléculas envolvidas na adesão e

migração celular, tais como a fibronectina e laminina também foram mantidas.

- HUVECs e VSMCs foram aptas a aderir, proliferar e formar uma camada

confluente em até 20 dias de cultura, demonstrando que nosso protocolo de

acelularização não tornou nossa prótese citotóxica. Além disso as VSMCs foram

capazes de migrar da camada adventícia para a camada média, demonstrando

que nossa prótese é também apta a ser repopulada por células autólogas do vaso

no qual seria implantado como possível enxerto.

75

7) Perspectivas:

- Acelularização de artérias ilíaca e femural de porcos, para estudos em

vasos de pequeno calibre.

- Teste de hemólise e agregação plaquetária para qualificação do produto.

- Microscopia eletrônica de transmissão para avaliação da disposição das

fibras matriciais e da presença de integrinas mediando a adesão celular à

prótese.

- Estabelecimento de protocolo de obtenção de células endoteliais

diferenciadas a partir de veia jugular e veia braquial de ovelhas para

repopulação da prótese.

- Estabelecimento de protocolo para obtenção de células endoteliais e

células de músculo liso a partir de células mononucleares de medula óssea,

para repopulação da prótese.

- Estabeler protocolo de repopulação da prótese acelularizada e manutenção

da mesma num bioreator.

- Análise de propriedades biomecânicas e cultura dinâmica em bioreator

- Aplicação das próteses repopuladas em seguimentos arteriais de ovelhas,

num ensaio in vivo.

- Avaliação clínica e histológica da interação prótese – hospedeiro.

76

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92

ANEXO I: REAGENTES E PREPARO DE SOLUÇÕES

A) Tampão Fosfato Salina (Phosphate Buffered Saline) – PBS

NaCl 8,00 g

KCl 0,40 g

NaHPO

4

.12H

2

O 12,0 g

KH

2

PO

4

0,15 g

Na

2

SO

4

0,1g

Glicose 1,1 g

Vermelho Fenol 0,0025 g

Água Tridestilada qsp 1000 mL

O pH foi acertado para 7,4 com NaOH 1 M ou HCl 1 M . A solução era aferida em

balão volumétrico, esterilizada por filtração em sistema Millipore de filtração

conectado a uma bomba de vácuo com membrana esterilizante de 0,22 µm e

estocada a 4ºC.

B) Soluções de glicerol 50 e 85 %:

B.1) Glicerol 50 %:

Glicerol 100 % 100 mL

PBS 100 mL

B.2) Glicerol 85 %:

93

Glicerol 100 % 170 mL

PBS 30 mL

C) Solução de Tripsina 0,125%/ EDTA 0,02%

Tripsina (SIGMA) 125 mg

EDTA 20 mg

BSS-CMF qsp 1000 mL

O pH da solução de BSS-CMF foi aferido para aproximadamente 12 para se

dissolver o EDTA e posteriormente acertado para 7,8 para se dissolver a tripsina.

O pH foi aferido para 7,4 com NaOH 1 M ou HCl 1 M. Então a solução foi

avolumada em balão volumétrico, esterilizada por filtração em sistema Millipore de

filtração conectado a uma bomba de vácuo com membrana esterilizante de 0,22

µm e estocada a 4

o

C.

D) Meio de Cultura Dulbecco’s (para estufa de CO

2

)

Meio Dulbecco’s (GIBCO) 10 g

NaHCO

3

2,2 g

HEPES (SIGMA) 2 g

Água Tridestilada qsp 1000 mL

94

O pH foi aferido para 7,4 com NaOH 1 M ou HCl 1 M. Então a solução foi aferida

em balão volumétrico, esterilizada por filtração em sistema Millipore de filtração

conectado a uma bomba de vácuo com membrana esterilizante de 0,22 µm e

estocada a 4

o

C.

E) Meio de Cultura 199:

Meio 199 (GIBCO) 12 g

HEPES (SIGMA) 2 g

NaHCO

3

3,7 g

Água Tridestilada qsp 1000 mL

F) Solução de PS (Penicilina/Estreptomicina) 100 X

Penicilina G Potássica ou

Penicilina G Sódica 1.000.000 UI

Sulfato de Estreptomicina 1 g

BSS-CMF qsp 1000 Ml

O pH era aferido para 7,4 com NaOH 1 M ou HCl 1 M. Então a solução era aferida

em balão volumétrico, esterilizada por filtração em sistema Millipore de filtração

conectado a uma bomba de vácuo com membrana esterilizante de 0,22 µm e

estocada a -20

o

C.

95

G): Meio de Cultura Dulbecco’s ou 199 Suplementados

Soro Fetal Bovino (CULTILAB) 10 mL

Solução de PS 100 X 1 mL

Meio Dulbecco’s ou 199 qsp 100 mL

O meio de cultura suplementado era esterilizado por filtração em sistema Millipore

de filtração conectado a uma bomba de vácuo com membrana esterilizante de

0,22 µm e estocado a 4

o

C.

H) Colagenase 1A (1 mg/mL)

Colagenase 1A (SIGMA) 100 mg

Meio DMEM qsp 100 mL

O pH era aferido para 7,4 com NaOH 1 M ou HCl 1 M . A solução era aferida em

balão volumétrico, esterilizada por filtração em sistema Millipore de filtração

conectado a uma bomba de vácuo com membrana esterilizante de 0,22 µm e

estocada a - 20ºC.

I) Solução de NaCl 1M:

NaCl 5,85 g

Água Tridestilada qsp 100 mL

96

A solução era aferida em balão volumétrico, esterilizada por filtração em sistema

Millipore de filtração conectado a uma bomba de vácuo com membrana

esterilizante de 0,22 µm e estocada a 4ºC.

J) Hematoxilina e eosina:

Soluções:

J.1) Hematoxilina de Harris:

Hematoxilina cristalizada......................................................................... 5 g

Álcool 95% ..........................................................................................50 mL

Sulfato de alumínio e amônio (alúmen amoniacal ou de potássio)..... 100 g

Água destilada............................................................................... 1000 mL

Ácido acético glacial.......................................................................... 20 mL

Óxido de mercúrio (vermelho).............................................................. 2,5 g

Dissolver a hematoxilina no álcool e o sulfato em água quente. Misturar as duas

soluções, ferver rapidamente e juntar o óxido de mercúrio, ferendo novamente a

solução até ela tornar-se de cor vermelho escuro. Esfriar rapidamente e adicionar

acético acético. Filtrar antes de usar.

J.2) Eosina Y 1%:

97

Eosina Y (amarela hidrossolúvel)......................................................... 0,5 g

Água destilada................................................................................... 10 mL

Álcool 95 %........................................................................................ 90 mL

Ácido acético..................................................................................... 1 gota

Dissolver a eosina em água destilada e depois juntar o álcool. Adicionar o ácido

acético.

J.3) Álcool Clorídrico 1%:

Álcool 100%....................................................................................... 99 mL

Ácido Clorídrico Concentrado............................................................... 1 mL

Método:

- Desparafinizar e hidratar os cortes;

- Hematoxilina de Harris por 10 minutos;

- Lavar em água corrente por 10 minutos;

- Diferenciar em álcool clorídrico de 5 a 10 segundos;

- Lavar em água corrente por 5 minutos para azular os cortes;

- Eosina por 2 minutos

- Lavar em água corrente por 5 minutos;

- Desidratar, clarificar e montar em Entellan.

98

Resultado: Citoplasma, fibras elásticas e colágenas em várias tonalidades de rosa

e núcleos em azul.

K) Orceína de Unna-Tanzer:

Soluções:

K.1) Orceína:

Orceína ....................................................................................................1 g

Etanol ...............................................................................................100 mL

Ácido Clorídrico concentrado ............................................................0,7 mL

K.2) Álcool Clorídrico

Álcool a 70% ......................................................................................99 mL

Ácido clorídrico..................................................................................... 1 mL

K.3) Ácido Pícrico Saturado

Dissolver 1,5 g de ácido pícrico em 100 mL de água destilada quente. Deixar esfriar

e filtrar no dia seguinte.

Método:

- Desparafinizar e hidratar os cortes histológicos;

- Pingar a solução de oxona - 20 minutos;

99

- Lavar bem em água corrente - 5 minutos

- Pingar solução de orceína – 30 minutos

- Diferenciar em álcool clorídrico;

- Lavar em água destilada;

- Contracorar com ácido pícrico saturado – 30 segundos;

- Lavar rapidamente em álcool absoluto;

- Desidratar, clarificar e montar.

Resultado: Fibras elásticas e oxitalânicas em vinho.

L) Picrossírius:

Soluções:

L.1) Ácido fosfomolíbdico 0,2%

L.2) Ácido Pícrico Saturado

Dissolver 1,5 g de ácido pícrico em 100 mL de água destilada quente. Deixar esfriar

e filtrar no dia seguinte.

L.3) Solução de Picrossírius

Sirius red F3 BA 0,2g

Solução saturada de ácido pícrico 200 mL

L.4) Ácido Clorídrico 0,01M

Método:

100

- Desparafinizar e hidratar os cortes histológicos;

- Colocar as lâminas na solução de ácido fosfomolíbdico por 1 minuto;

- Desprezar o ácido fosfomolíbdico;

- Colocar a solução de Picrossírius por 90 minutos e deixar em ambiente escuro;

- Lavar em ácido clorídrico 0,01M durante 2 minutos;

- Lavar em álcool 70% por 45 segundos;

- Desidratar, clarificar e montar.

Resultado: Colágeno em vermelho forte.

M) PAS:

Soluções:

M.1) Ácido Periódico 1%

M.2) Reagente de Schiff

- Dissolver 1 g de fucsina básica em 200 mL de água destilada quente;

- Levar a ebulição, e esfriar até 50ºC

- Filtrar e adicionar 20 mL de ácido clorídrico 1M

- Esfriar e adicionar 1 g de bissulfito de sódio (proteger da luz por 24h)

- Adicionar 5 g de carvão ativado, homogeneizar por 1 minuto

- Filtrar e armazenar em frasco escuro

101

M.3) Solução Sulfurosa

M.3.1 - Solução estoque:

Metabissulfito de sódio ou bissulfito de sódio anidro............................. 10 g

Água destilada................................................................................. 200 mL

Ácido clorídrico 1M............................................................................ 10 mL

M.3.2 - Solução uso (preparar na hora):

Solução estoque .................................................................................. 6 mL

Água destilada................................................................................. 114 mL

M.4) Hematoxilina de Harris

Método:

- Desparafinizar e hidratar os cortes histológicos;

- Pingar ácido periódico 1% - 15 minutos;

- Lavar rapidamente em água destilada;

- Pingar reagente de Schiff – 40 a 60 minutos;

- Lavar bem em água destilada – 15 minutos;

- Corar em Hematoxilina de Harris – 1 minuto;

- Água corrente por 5 minutos;

102

- Desidratar, clarificar e montar.

Resultado: glicoproteínas, principalmente membrana basal, aparecem na cor lilás.

N) Azul de alciano (pH 1.0 ou 2,5):

N.1) Solução pH 1,0:

Azul de alciano GX ..................................................................................1 g

Äcido clorídrico 0,1 M ......................................................................100 mL

N.2) Solução pH 2,5:

Azul de alciano GX ..................................................................................1 g

Ácido acétiico 3% ............................................................................100 mL

Método:

- Desparafinizar e hidratar os cortes histológicos

- Colocar as lâminas na solução de azul de alciano por 30 minutos

- Lavar em água destilada rapidamente

- Contracorar com vermelho neutro 0,5 % (esta etapa apenas para pH 2,5)

- Lavar rapidamente em água destilada

- Desidratar, clarificar e montar em Entellan.

103

Resultado: as glicosaminoglicanas (GAGs) ácidas são coradas ao pH de 2,5.

Somente as GAGs sulfatadas são coradas ao pH 1,0. Núcleos em vermelho.

104

ANEXO 2: PROTOCOLOS DE IMUNOPEROXIDASE E

IMUNOFLUORESCÊNCIA UTILIZADOS:

Imunoperoxidase:

Para as reações de imunoperoxidase, cortes parafinados ou congelados foram

submetidos aos seguintes procedimentos:

• Os cortes foram lavados 3 x em PBS por 10 minutos;

• Fixação em acetona gelada por 10 minutos, no freezer;

• Cortes lavados 3 x em PBS por 10 minutos

• Inibição de cargas utilizando cloreto de amônio 50 mM em PBS por 30

minutos

• Cortes lavados 3 x em PBS por 10 minutos

• Permeabilização tecidual com Triton – X 100 0,5% em PBS utilizando-se 2

tempos de 15 minutos

• Cortes lavados em PBS por 2 x de 5 minutos

• Incubação com soro normal de cabra 10% : PBS-BSA 10% (v/v) por uma

hora para bloqueio de ligação inespecífica dos anticorpos e incubação com o

anti-soro específico por 18 horas, em geladeira, diluídos em PBS-BSA 3% :

Soro normal de cabra 1%, a 4ºC, nas diluições apropriadas (TABELA 1,

mediante testes realizados previamente no laboratório).

• Deixar chegar a temperatura ambiente

105

• Cortes lavados com PBS – Tween 0,25 % por 2 x de 5 minutos

• Cortes lavados em água destilada

• Inibição da peroxidase endógena, incubando-se os cortes em Metanol :

Peróxido de hidrogênio 3% (v/v) por 15 minutos, no escuro

• Revelação com o kit LSAB avidina-biotina-peroxidase (LSAB, Dako, EUA),

que contém anticorpo secundário biotinilado e streptavidina peroxidase.

• Utilizou-se como cromógeno, a diaminobenzidina (DAB) – DAB liquid da

DAKO.

• Cortes lavados com PBS – Tween 0,25 % por 2 x de 5 minutos

• Cortes lavados em água destilada

• Cortes contra-corados com Hematoxilina de Harris diluída (1:3) por 5

minutos

• Diferenciação com água ácida

• Cortes lavados em água destilada

• Cortes desidratados, clarificados e montados em entellan.

• Como controle negativo utilizamos secções de tecido onde foi omitido o

anticorpo primário ou incubados com soro da espécie animal dos anticorpos

primários pré-imune.

106

IMUNOFLUORESCÊNCIA:

Para a análise das amostras por imunofluorescência, cortes congelados foram

submetidos aos seguintes procedimentos:

• Os cortes foram lavados 3 x em PBS por 10 minutos;

• Fixação em acetona gelada por 10 minutos, no freezer;

• Cortes lavados 3 x em PBS por 10 minutos

• Inibição de cargas utilizando cloreto de amônio 50 mM em PBS por 30

minutos

• Cortes lavados 3 x em PBS por 10 minutos

• Permeabilização tecidual com Triton – X 100 0,5% em PBS utilizando-se 2

tempos de 15 minutos

• Cortes lavados em PBS por 2 x de 5 minutos

• Incubação com soro normal de cabra 10% : PBS-BSA 10% (v/v) por uma

hora para bloqueio de ligação inespecífica dos anticorpos e incubação com o

anti-soro específico por 18 horas, em geladeira, diluídos em PBS-BSA 3% :

Soro normal de cabra 1%, a 4ºC, nas diluições apropriadas (TABELA 1,

mediante testes realizados previamente no laboratório).

• Deixar chegar a temperatura ambiente

• Cortes lavados com PBS – Tween 0,25 % por 2 x de 5 minutos

107

• Incubação do anticorpo primário conjugado ao fluorocromo (Anti-coelho –

FITC DAKO – diluição 1:30). A partir desta etapa, todas as demais

também foram realizadas ao abrigo da luz.

• Lavar com 3 vezes com PBS por 5 minutos

• Contracorar com DAPI por 5 minutos

• Lavar com PBS por 10 minutos

• Montar com n-propyl galato ou Vectashield

TABELA 1: anticorpos utilizados:

Especificidade Clone Isotipo Técnica Diluição Origem

Fibronectina

humano (A0245)

policlonal IgG coelho Parafina

peroxidase

1:50 Dako

EUA

Elastina humano

(MAB2503)

monoclonal IgG

camundongo

Congelado

peroxidase

1:300 Chemicon

EUA

Condroitin Sulfato

(C8035)

monoclonal IgG

camundongo

Congelado

Peroxidase

1:200 Sigma

EUA

Laminina humano

(L9393)

policlonal IgG

camundongo

Congelado

Fluorescência

1:100 Sigma

EUA

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