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FABIANA APARECIDA CAVALCANTE SILVA
ESTUDO MOLECULAR E BIOQUÍMICO DE CULTIVARES DE ALGODÃO EM
RESPOSTA A Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides A.S. Costa
RECIFE
FEVEREIRO – 2008
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ii
FABIANA APARECIDA CAVALCANTE SILVA
ESTUDO MOLECULAR E BIOQUÍMICO DE CULTIVARES DE ALGODÃO EM
RESPOSTA A Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides A.S. Costa
RECIFE
FEVEREIRO – 2008
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-
Graduação em Agronomia
(Melhoramento Genético de Plantas)
da Universidade Federal Rural de
Pernambuc
o, como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Mestre.
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iii
ESTUDO MOLECULAR E BIOQUÍMICO DE CULTIVARES DE ALGODÃO EM
RESPOSTA A Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides A.S. Costa
FABIANA APARECIDA CAVALCANTE SILVA
COMITÊ DE ORIENTAÇÃO:
Prof. Dr. Péricles de Albuquerque Melo Filho, DEPA, UFRPE.
Prof. Dr. Reginaldo de Carvalho, Dep. Biologia, UFRPE
Dra. Roseane Cavalcanti dos Santos, EMBRAPA Algodão- PB.
RECIFE
FEVEREIRO – 2008
iv
ESTUDO MOLECULAR E BIOQUÍMICO DE CULTIVARES DE ALGODÃO EM
RESPOSTA A Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides A.S. Costa
Dissertação defendida e aprovada em: 26 de Fevereiro de 2008
ORIENTADOR:
_______________________________________________
Prof. Dr. Péricles de Albuquerque Melo Filho
Professor Associado – Departamento de Agronomia/UFRPE
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________
Dra. Márcia Vanusa da Silva
Professora do Departamento de Bioquímica - UFPE
_______________________________________________
Dra. Lilia Gomes Willadino
Professora do Departamento de Biologia - UFRPE
_______________________________________________
Dra. Rejane Jurema Mansur Custódio Nogueira
Professora do Departamento de Botânica - UFRPE
RECIFE
FEVEREIRO – 2008
v
O segredo de fazer cada coisa da vida ficar bem feito é o equilíbrio em tudo que
fazemos.
Não devemos ser covardes, nem audaciosos, mas corajosos
Não devemos ser avarentos, nem extravagantes, mas generosos
Não devemos ser geniais nem ignorantes, mas estudiosos.
Aristóteles (384-322 a.c)
vi
DEDICATÓRIA
À Deus, responsável por todas as
coisas, pela sua presença
constante trazendo-
me paz e
confiança para enfrentar os
obstáculos....
Aos meus pais, Francisco de Assis
e Maria Aparecida pel
o carinho,
incentivo e dedicação que me
permitiram chegar até aqui e
continuar...
vii
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal Rural de Pernambuco e a Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), por possibilitarem a
realização deste trabalho e concessão da bolsa.
Aos meus irmãos Francisco Fábio, Fabíola Maria, Fabilson André e
Fabiânderson Felipe pelos momentos de descontração e incentivo.
Ao professor Dr. Péricles de Albuquerque Melo Filho pelos ensinamentos,
estímulos dados, exemplo de profissionalismo e amizade.
A Dra. Roseane Cavalcanti dos Santos pelo apoio, amizade e ensinamentos
profissionais e pessoais compartilhados ao longo desses quatro anos.
À professora Dra. Maria de Mascena (Mana), chefe do Laboratório de
Genética, Bioquímica e Sequenciamento de DNA, por todo carinho, incentivo e
apoio.
A todo corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Melhoramento
Genético de Plantas em especial ao professor Dr. Gerson Quirino pelo grande
exemplo de profissionalismo, respeito e simplicidade.
A todos os colegas do curso de Pós-Graduação em Melhoramento Genético
de Plantas pelo companheirismo e ensinamentos adquiridos com a convivência, em
especial Daniel Jordão e Elizabeth Amélia.
A todos do laboratório de Fisiologia Vegetal (UFRPE) na pessoa da
professora Dra. Rejane Jurema Mansur, em especial a toda ajuda do Dr. André
Azevedo Neto.
Aos professores Dr. Manoel Adrião (Lab. Genética Animal – UFRPE), Dra.
Raquel Coimbra (Dep. Pesca – UFRPE), Dra. Vilma Loreto (Lab. Genoma – UFRPE)
e Dra. Márcia Vanuza (Lab. Bioquimica – UFPE), Dra. Luiza Bastos (Lab. Genoma –
IPA) e respectivos alunos, pelos ensinamentos, colaborações, incentivos e amizade.
Aos amigos Cláusio Melo e Vladimir Silveira pelo carinho, paciência,
companheirismo, momentos de descontração e eterna amizade.
A todos os estagiários do Laboratório de Genética, Bioquímica e
Sequenciamento de DNA (Genoma) da UFRPE pela convivência. Em especial aos
amigos Karla, Janaina, Isabel e Ebenézer
As amigas Manuela Granja e Elizabeth Amélia, pela grande ajuda para
realização do presente trabalho, desde a implantação do experimento na casa de
vegetação, todas as dificuldades encontradas, os obstáculos superados e momentos
viii
de descontração.
À Eric e Rinaldo, do laboratório de Pós-colheita, Departamento de
Fitopatologia (UFRPE), pelo auxilio e ensinamentos nos experimentos bioquímicos.
À Ivanildo, Léo, Omar e Lucas pelo auxílio nos experimentos na casa de
vegetação e no laboratório, e em especial a Seu Ivaldo que, além da ajuda, sempre
nos proporcionou momentos de reflexão com sábias palavras e experiência de vida
de forma simples e sincera.
À meus amigos de todos os momentos, alegres ou não, Tatiana, Lucas,
Diogo, Sergio Rodrigo, Robson, Denise, Vivian, Ingrid, Mariana e Layana.
Aos funcionários da UFRPE Seu Narciso e Joana pela simpatia e
prestatividade em todos os momentos.
À todos os amigos que contribuíram, de forma direta e indireta, para a
realização deste trabalho pela ajuda, incentivo e compreensão.
MUITO OBRIGADA !!!
ix
SUMÁRIO
Pág.
ÍNDICE DE TABELAS ix
ÍNDICE DE FIGURAS x
RESUMO xii
ABSTRACT xiv
CAPÍTULO I – INTRODUÇÃO GERAL 17
Referências Bibliográficas 30
CAPÍTULO II –. Avaliação Bioquímica de Cultivares de Algodão em
Resposta a Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides A.S.
Costa 36
Resumo 37
Abstract 38
Introdução 39
Material e Métodos 41
Resultados e Discussão 44
Agradecimentos 49
Referências Bibliográficas 50
CAPÍTULO III - Identification of differentially expressed transcripts in cotton
varieties infected with Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides
63
Abstract 64
Introduction 65
Material and Methods 67
Results 70
Discussion 71
Acknowledgments 74
References 75
CONCLUSÕES GERAIS 86
ANEXOS 88
Normas aos autores: Revista Fitopatologia Brasileira (Capítulo II) 89
Normas aos autores: European Journal Of Plant Pathology (Capítulo III) 101
x
ÍNDICE DE TABELAS
Pág.
CAPÍTULO I
Tabela 1. Grau de importância das principais doenças que infectam a
cultura do algodoeiro no Brasil 19
CAPÍTULO II
Tabela 1. Média das cultivares de algodão quanto ao teor de prolina, em
três períodos de avaliação, quando submetidas a infecção com o fungo
da ramulose 60
Tabela 2. Média das cultivares de algodão quanto ao teor de catalase,
em três períodos de avaliação, quando submetidas a infecção com o
fungo da ramulose 61
CAPÍTULO III
Table 1. Differentially expressed transcripts obtained with RAPD primers
in cotton cultivars submitted to ramulosis.
81
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
CAPÍTULO I
Figura 1. Detalhes da planta de algodão apresentando sintomas de
ramulose nas folhas (A e B) e haste (C e D)
21
Figura 2. Resumo esquemático dos processos metabólicos envolvidos
no mecanismo de defesa das plantas ao ataque de patógenos
24
CAPÍTULO II
Figura 1. Sintomas de ramulose em cultivares de algodão. Cultivar BRS
Antares: (A) Folha, (B) Haste; Cultivar BRS Cedro: (C) Folha, (D) Haste 55
Figura 2. Teores de prolina (µmol/g de MF) em diferentes cultivares de
algodão sob os tratamento controle e inoculado, aos 3, 15 e 30 dias após
a inoculação.* Diferença estatística pelo teste Duncan a 5% de
probabilidade
56
Figura 3. Teores das enzimas oxidativas peroxidase (U/mL) (A) e
catalase (U/mL) (B) em diferentes cultivares de algodão sob os
tratamento controle e inoculado, aos 3, 15 e 30 dias após a inoculação. *
Diferença estatística pelo teste Duncan a 5% de probabilidade 57
Figura 4. Teores de carboidratos (µmol/g de MF) em diferentes cultivares
de algodão sob os tratamento controle e inoculado, aos 3, 15 e 30 dias
após a inoculação. * Diferença estatística pelo teste Duncan a 5% de
probabilidade
58
xii
Figura 5. Teores de proteínas (µmol/g de MF) em diferentes cultivares de
algodão sob os tratamento controle e inoculado, aos 3, 15 e 30 dias após
a inoculação. * Diferença estatística pelo teste Duncan a 5% de
probabilidade
59
CAPÍTULO III
Figure 1. Differentially displayed bands in RT-PCR of total RNA extracted
from inoculated and control cotton cultivars using follows primers: OPH
03 (A), OPP 06 (B), OPV 10 (C), OPG 05 (D). AC- BRS Antares-control,
AI- BRS Antares-inoculated, PCCNPA Precoce I-control, PI- CNPA
Precoce I-inoculated. Marker: Ladder plus 1Kb (Invitrogen).
Arrows: down regulation, up regulation, actived
82
Figure 2. Differentially displayed bands in RT-PCR of total RNA extracted
from inoculated and control cotton cultivars using follows primers: OPE
18 (A), OPL 03 (B), OPA 4 (C), OPW 13 (D). AC- BRS Antares-control,
AI- BRS Antares-inoculated, PCCNPA Precoce I-control, PI- CNPA
Precoce I-inoculated. Marker: Ladder plus 1Kb (Invitrogen).
Arrows: down regulation, up regulation, actived 83
Figure 3. Result of BLAST alignment between tV10-200bp and GmChl 3
gene (AB181949.1) that codifies to Chlorophyllase III, in soybean
(Glycine max L.).
84
Figure 4. Dot-blot analysis in inoculated and control cotton cultivars for
identification of a specific transcript related to disease resistance. AC-
BRS Antares, control, AI- BRS Antares, inoculated, PC- CNPA Precoce I,
control, PI- CNPA Precoce I, inoculated. Dai- days after inoculation. 85
xiii
RESUMO
O algodão é uma cultura de grande importância mundial cuja produção é afetada por
diversos fatores bióticos e abióticos. Dentre os bióticos destacam-se os estresses
provocados pelo ataque de insetos e fitopatógenos, cujo controle é bastante difícil
devido à variabilidade destes organismos e, conseqüente, a capacidade adaptativa.
Entre os fitopatógenos, os fungos são os que causam mais danos ao algodoeiro,
destacando-se o Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides A.S. Costa,
causador da ramulose, doença caracterizada pelo nanismo e super-brotamento dos
ramos, que afeta o desenvolvimento das maçãs e o número de capulhos. A principal
forma de disseminação é via sementes contaminadas e o modo de controle mais
efetivo é por meio de fungicidas químicos ou de cultivares resistentes que são
obtidas por meio de exaustivos testes conduzidos em campo e casa de vegetação. A
utilização de ferramentas bioquímicas e moleculares que auxiliem na identificação
de genótipos resistentes nos programas de melhoramento são de grande relevância
uma vez que, além da confiabilidade, reduz os custos de seleção nos processos de
desenvolvimento de novas cultivares. No presente trabalho procedeu-se a um
estudo bioquímico e molecular em cultivares de algodão submetido à infecção com o
fungo da ramulose, visando identificar marcadores associados ao processo de
resistência. No primeiro ensaio, avaliaram-se descritores bioquímicos em quatro
cultivares de algodão infectado com o fungo causador da ramulose. As plantas
foram inoculadas aos 20 dias após o cultivo, recebendo uma concentração fúngica
de 1 x 10
6
conídios/mL. As avaliações ocorreram aos 3, 15 e 30 dias após a
inoculação. Observou-se que os teores de prolina, peroxidase e catalase foram
bastante expressivos na cultivar resistente BRS Antares apresentando resposta
rápida logo aos 3 dias após a inoculação. Os teores de prolina e catalase foram
indicados como ferramentas úteis para identificação de cultivares resistentes a
ramulose nos trabalhos de seleção na cultura do algodão. No segundo ensaio
buscou-se identificar transcritos diferencialmente expressos em plantas de algodão
submetidas a infecção com o fungo da ramulose. Duas cultivares antagônicas em
relação à resistência a esta doença foram utilizadas, BRS Antares e CNPA Precoce
I, respectivamente, resistente e susceptível. Dez oligonucleotídeos RAPD foram
utilizados nas reações de RT-PCR a uma temperatura de anelamento de 35 ºC.
Após análise dos padrões de banda nas plantas controle e inoculada foram
xiv
identificados doze transcritos sub-regulados, treze super-regulados e dez ativados.
Uma banda de aproximadamente 200 pb obtida com o oligonucleotídeo V10 na
cultivar resistente foi seqüenciada e a apresentou homologia de 86 % com o gene
GmChl 3 que codifica para enzima clorofilase III em soja. Esta enzima apresenta
grande importância para as células vegetais submetidas a danos oxidativos uma vez
que reduz estes estragos além de modular diferentes vias de defesa. Os dados
obtidos no presente trabalho são de grande aplicabilidade em estudos de resposta
do algodão ao ataque de patógenos além de oferecer informações relevantes para
os programas de melhoramento da cultura.
Palavras-chave: Ramulose, doença do algodão, marcadores
xv
ABSTRACT
Cotton is a crop of considerable importance worldwide, the production of which is
affected by diverse biotic and abiotic factors. Stress caused by insect attacks and
phytopathogens stand out among the biotic factors, the control of which is
significantly hindered due the variability of these organisms and their consequent
capacity for adaptation. Fungi are the phytopathogens that most cause damage to
cotton plants, especially Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides A.S.
Costa, a ramulosis-causing disease characterized by dwarfism and an over-budding
of the branches, affecting the development of the buds and number of bolls. The
main form of dissemination is through contaminated seeds and the most effect
method of control is by means of chemical fungicides or resistant varieties which are
obtained after exhaustive tests conducted in fieldwork and greenhouses. The use of
biochemical and molecular tools that assist in the identification of resistant genotypes
in improvement programs is of considerable importance, as they offer reliability and
reduce selection costs in the development process of new varieties. In the present
study, a biochemical/molecular study was carried out on cotton varieties submitted to
infection with the ramulosis fungus with the aim of identifying markers associated to
the resistance process. In the first assay, biochemical descriptors were assessed in
four infected cotton varieties. The plants were inoculated 20 days after cultivation,
receiving a fungal concentration of 1 x 10
6
conidias/mL. Evaluations occurred at 3, 15
and 30 days following inoculation. Proline, peroxidase and catalase levels were quite
expressive in the resistant BRS Antares cultivar, exhibiting a rapid response at 3
days after inoculation. Proline and catalase levels are indicated as useful tools for the
identification of ramulosis-resistant varieties in cotton crop selection studies. The
second assay sought to identify differentially expressed transcripts in cotton plants
submitted to infection with the ramulosis fungus. Two varieties with opposing traits
regarding resistance to this disease were used: BRS Antares and CNPA Precoce I,
respectively resistant and susceptible. Ten RAPD oligonucleotides were used in the
RT-PCR reactions at an annealing temperature of 35 ºC. Following an analysis of the
band patterns in the control and inoculated plants, 12 down-regulated transcripts, 13
overregulated transcripts and ten activated transcripts were identified. A band of
approximately 200 bp, obtained with the V10 oligonucleotide, was sequenced and
exhibited 86% homology with the GmChl
3 gene, which codifies for the
xvi
chlorophyllase III enzyme in soybean. This enzyme has considerable importance for
vegetal cells submitted to oxidative damage, as it reduces this damage and
modulates different defense pathways. The data obtained in the present study are
applicable to studies on cotton plant responses to pathogen attacks and offers
relevant information for crop improvement programs.
Key -words: Ramulosis, cotton disease, markers
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
17
Capítulo I
INTRODUÇÃO GERAL
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
18
INTRODUÇÃO GERAL
1- Aspectos gerais do algodoeiro
O algodão é uma angiosperma da classe das dicotiledôneas, pertencente à
ordem Malvales, família Malvaceae, subtribo Hibisceas, gênero Gossypium. Possui
elevada importância econômica e social sendo cultivada em mais de 100 países do
mundo. Na China e Índia é cultivado em uma área de mais de cinco milhões de
hectares onde emprega cerca de 70 pessoas por hectare (BELTRÃO, 2006).
Na literatura são citadas apenas quatro espécies de algodão comerciais
dentro do gênero Gossypium (G. hirsutum L., G. barbadense L., G. arboreum L. e G.
herbaceum L.) o qual compreende 50 espécies (CARVALHO e CHIAVEGATO,
1999). Essas espécies foram domesticadas independentemente, entretanto, o local
de origem não é conhecido havendo apenas centros de diversidade: México (18
espécies), África e Arábia (14 espécies) e Austrália (17 espécies) (BRUBAKER et al.
1999). Baseando-se na seqüência de DNA analisada via marcadores ITS das
espécies existentes há indícios de que o gênero surgiu cerca de 10 a 20 milhões de
anos (SEELANAN et al., 1997).
Dentre as espécies do gênero, 45 são diplóides (26 cromossomos) e cinco
tetraplóides (52 cromossomos). Ao todo ocorrem oito genomas sendo sete
diplóides (A – B – C – D – E – F – G) e um tetraplóide (K), baseado na similaridade
cromossômica (STEWART, 1995). Dentre as autotetraplóides existem apenas duas
cultivadas: G. hirsutum L. e G. barbadense L., onde esta última apresenta grande
interesse comercial em países como Sudão, Peru e Estados Unidos, por possuir
fibra longa e de alta qualidade. A espécie G. hirsutum L. var. latifolium Hutch, que
compreende o algodoeiro herbáceo, também conhecido como anual, apresenta
genoma AADD ( CIA e FUZZATO, 1999). Dentre as diplóides destacam-se G.
arboreum e G. herbaceum.
A espécie G. hirsutum L. var. latifolium Hutch, a mais cultivada mundialmente,
apresenta grande capacidade adaptativa a diferentes ambientes, devido a grande
variabilidades de seus acessos (MAUNEY, 1984; OOSTERHUIS, 1999). As flores do
algodoeiro são hermafroditas, porém a planta é classificada como parcialmente
autógama ou de reprodução mista por possuir taxas de cruzamento natural variável
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
19
de acordo com o genótipo e o ambiente, em especial na presença de insetos (FREE,
1993).
Economicamente, o algodão é uma das principais commodities nacional. No
cenário mundial, essa cultura contribui com cerca de 90% da produção de fibras
(CIA e FUZZATO, 1999). No Brasil a produção situa-se em 3.850.952 toneladas
colocando-o em posição de destaque na exportação mundial de fibras. Os estados
de Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás e Bahia são os maiores produtores com
52% da produção nacional de algodão herbáceo em caroço (IBGE, 2008).
Diversos problemas de ordem fitossanitária têm afetado a cultura do
algodoeiro no Brasil. Entre eles destacam-se os provocados pela ação de fungos,
vírus, bactérias e nematóides. Na Tabela 1 encontra-se o grau de importância das
principais doenças que infectam o algodoeiro. Dentre elas, percebe-se que
Ramulose, Mosaico das nervuras, Mancha angular e Manchas foliares são
consideradas as mais importantes (CHIAVEGATO, 2001).
Tabela 1. Grau de importância das principais doenças que infectam a cultura do
algodoeiro no Brasil
Sul/Sudeste Centro-Oeste Norte Nordeste
Doenças
PR SP MG GO MS MT RO PA Outros Total
Murcha do Fusarium
4 5 3 3 2 1 - - - 18
Murcha do Verticilium
3 3 1 1 1 1 - - X 10
Ramulose
3 3 4 5 4 5 5 5 X 34
Mancha angular
4 3 3 3 3 3 3 3 X 25
Manchas foliares
3 2 2 3 3 4 3 3 X 23
Mosaico das nervuras
4 5 5 5 5 5 X X X 29
Viroses
- X X X X X - - X -
Murchamento
avermelhado
4 5 3 3 3 3 - - - 21
Nematóides
4 5 4 3 3 2 - - - 21
Podridão das maças
X X X X X X - - X -
Mofo branco - - - - - - - - X -
Fonte: Chiavegato (2001), modificado de Cia e Fuzatto (1999). Escala de notas:
1= sem importância; 2= pequena importância; 3= Medianamente importante,
necessitando de precauções e estudos; 4= importante, demandando medidas de
controle; 5= muito importante, inviabilizando a cultura se não houver controle;
(X)= presença constatada e (-) sem informações.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
20
2- Ramulose do algodoeiro
Os fungos do gênero Colletotrichum são coleomicetos (anamórficos) e
causam grandes danos em lavouras nas regiões tropicais, subtropicais e
temperadas em todo mundo. Este gênero de fitopatógenos compreende cerca de
125 espécies que são responsáveis por uma diversidade de doenças como
antracnose, podridão de pedúnculo, varicela em manga, abacate e mamão, entre
outras (BAILEY e JEGER, 1992). Seu ciclo de vida apresenta um estádio sexual,
responsável pela variabilidade genética, e um assexual onde ocorre o processo
dispersivo do microrganismo (WHARTON e DÉGUEZ-URIBEONDO, 2004). Em
continuidade a um evento infeccioso este grupo de fungos necessita diretamente do
desenvolvimento de apressórios para realizar a penetração na planta, que ocorre via
estomatal (PERFECT et al., 1999).
Em algodão, C. gossypii South var. cephalosporioides A.S. Costa infecta as
folhas, os pecíolos e o colmo provocando nanismo e superbrotamento dos ramos o
que prejudica a formação de maçãs e, conseqüentemente, o rendimento do algodão
(MEHTA et al., 2005). Em condições ideais esta doença pode causar perdas na
produção em ate 60 % (FREIRE, 2007).
O inicio da infecção é caracterizado pela ocorrência de manchas necróticas
circulares nas folhas jovens com reentrâncias e de aspecto estrelado, cujo centro
normalmente se torna quebradiço quando se localizam no pecíolo e nas nervuras
(enrugamento da superfície foliar) (Figura 1). A necrose do meristema apical
estimula o desenvolvimento de brotos laterais, para onde é direcionada a produção
de assimilados da planta, levando ao superbrotamento e aspecto envassourado,
além de pequeno porte e redução do número de capulhos (CIA e SALGADO, 1997).
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
21
Figura 1. Detalhes da planta de algodão apresentando sintomas de
ramulose nas folhas (A) e haste (B).
Disseminação da ramulose
A disseminação do fungo causador da ramulose é diretamente influenciada
pelas variações ambientais, em especial a temperatura e a umidade relativa do ar.
De acordo com Tanaka (1995) em ambientes com temperaturas elevadas, há uma
redução na viabilidade dos esporos, diminuição na formação de lesões, assim como
redução na progressão da doença. Entretanto, ainda de acordo com este autor, em
ambientes com baixas temperaturas no solo durante o período de germinação,
ocorre uma maior incidência de tombamento de plântulas, em pré e pós-emergência.
A ramulose apresenta como principal modo de disseminação as sementes
mas, outra via de disseminação é pelo solo contaminado. Por qualquer uma delas, o
inóculo primário, encontrando ambiente favorável e hospedeiro suscetível
estabelece focos iniciais de infecção. Estes, com o progresso da doença, darão
origem a focos secundários que pode levam geralmente a um quadro epidemiológico
(TANAKA e MENTEN, 1992; TALAMINI et al., 2004).
2.1. Respostas bioquímicas e moleculares ao estresse
Durante o ciclo de vida, as plantas são continuamente expostas a estresses
bióticos e abióticos, desenvolvendo mecanismos de interação com tais eventos. O
estresse biótico inclui relações de simbiose, patogenecidade e herbivoria entre
diferentes organismos e plantas. Ao longo do tempo, as plantas desenvolveram
estratégias naturais de defesa contra os estresses bióticos e estas se baseiam em
A
B
C
D
A
B
D
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
22
dois modos principais: 1 - resistência não-hospedeira e 2 - resistência gene-a-gene
(RESENDE,SALGADO e CHAVES, 2003; THORDAL-CHRISTENSEN et al., 1997).
A não-hospedeira é aquela em que todos os indivíduos de uma espécie de
planta apresentam resistência a todos os membros de uma determinada espécie de
patógeno (raça-específica) (THORDAL-CHRISTENSEN et al., 1997). Este tipo de
resistência é classificado em dois tipos: Tipo I, caracterizada pela não ocorrência de
morte celular e tipo II, onde ocorre resposta hipersensitiva (morte celular
programada). A resistência gene-a-gene ocorre devido à presença de um gene de
resistência, dominante na planta (gene R) e um gene de avirulência dominante no
patógeno (gene Avr). O mecanismo de interações que ocorre ao longo do evento de
estresse biótico é classificado em Incompatíveis (patógeno avirulento e hospedeiro
resistente) e Compatível (patógeno virulento e hospedeiro susceptível). O evento da
resistência das plantas a determinados patógenos está inserido neste contexto. Na
incompatível, o mecanismo de defesa é ativado, ocasionando a resistência,
enquanto que nas compatíveis não ocorre a ativação ou esta se dá tardiamente
(RESENDE,SALGADO e CHAVES, 2003).
Vários eventos se sucedem após reconhecimento de um patógeno como
avirulento, desencadeando na planta várias reações bioquímicas de defesa que leva
à produção dos chamados intermediários reativos de oxigênio (IRO), conhecidos
como ‘Reactive Oxygen Intermediates’ (ROI) ou ‘Reactive Oxygen Species’ (ROS),
ou ainda ‘Espécies Ativas de Oxigênio’ (EAO’s) (TORRES e DANGL, 2005). Em
seguida ocorre a resposta hipersensitiva (RH) com morte celular programada (MCP),
e resposta sistêmica adquirida (SAR) (GOZZO, 2003).
Os IROS são produzidos naturalmente no citoplasma e em organelas
(cloroplastos, mitocôndrias e peroxissomas) como metabólitos secundários formados
na fotossíntese e respiração (APEL e HIRT, 2004). Entretanto após o
reconhecimento de um patógeno pela planta, são excessivamente produzidas
(TORRES e DANGL, 2005). Este processo consiste na retirada seqüencial de
elétrons do oxigênio molecular (O
2
), onde o primeiro elétron gera o ânion superóxido
(
.
O
2
-
) e o radical hidroperoxil (.HO
2
-
); e a remoção do segundo e terceiro elétrons, o
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e o radical hidroxil(
.
OH), respectivamente (MORI e
SCHROEDER, 2004). O fenômeno de produção de H
2
O
2
, juntamente com a
produção do íon superóxido (O
2
), é conhecido como “Explosão oxidativa” e foi citada
pela primeira vez como uma resposta imediata de defesa da batata infectada com
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
23
Phytophtora infestans (DUKE, 1983).
Apesar da importância da explosão oxidativa no processo de defesa das
plantas contra patógenos, este processo causa danos nos tecidos vegetais sendo
necessário a ação de agente antioxidantes que podem ser agrupados em três
classes: 1) lipossolúveis, associados com membranas (ex. a-tocoferol e b-caroteno),
2) hidrossolúveis (ex. glutationa e ascorbato), e 3) com atividade enzimática. Dentre
as enzimas envolvidas neste processo destacam-se: superóxido dismutase (SOD),
peroxidase (POX), ascorbato peroxidase (APX), catalase (CAT), glutationa
peroxidase e glutationa redutase (GR). A atividade destas enzimas antioxidantes
pode ser intensificada como resposta a fatores de estresse ambiental, como
temperaturas extremas (QUEIROZ et al., 1998), déficit hídrico (SCANDALIOS,
1993), altos níveis de ozônio na atmosfera (BLACK et al., 2000), metais pesados
(VITÓRIA et al., 2001), bem como a fatores bióticos como ataque de patógenos de
modo geral (LAMB e DIXON, 1997).
A chamada Resposta Hipersensitiva pode ser definida como um mecanismo
de resistência local caracterizando-se pela morte (MCP- Morte celular programada)
de células vizinhas ao local de penetração do patógeno na planta. Este
comportamento visa isolar a infecção evitando sua disseminação pelos tecidos
vegetais. A RH atua diretamente nos processos fisiológicos da planta de varias
formas, por exemplo: um rápido incremento nos teores de agente antioxidantes,
perda de íons potássio (K+) e ganho de íons hidrogênio (H+) pelas células, a
destruição de compartimentos e o espessamento das paredes celulares e da
cutícula (fina camada sobre a epiderme do caule e das folhas (VAN DOORN e
WOLTERING, 2005).
A SAR (Systemic acquired response) é uma resposta de defesa duradoura
mediada pelo acúmulo endógeno de ácido salicílico que induz resistência em locais
da planta distantes daquele onde ocorreu a tentativa de infecção, não só contra o
patógeno que lhe deu origem, mas mesmo a patógenos não relacionados. Esta
resposta está relacionada a superexpressão de vários genes que codificam para
proteínas de defesa, as PR-Proteínas (pathogenesis related - proteínas relacionadas
à patogênese) (DURRANT e DONG, 2004). Dentre elas estão as quitinases, α-1,3-
glucanases, proteínas semelhantes à thaumatin, inibidores de proteinases,
endoproteinases, peroxidases, proteínas semelhantes à ribonuclease, tioninas ou
defensinas, oxalato oxidase, proteínas semelhantes à oxalato-oxidase e outras
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
24
proteínas cujas funções biológicas são ainda desconhecidas (VAN LOON e STRIEN,
1999; CHRISTENSEN et al., 2002).
Em continuidade ao processo de defesa das plantas, após reconhecimento do
patógeno, ocorre a síntese de barreiras físicas (papilas), aumento da lignificação da
parede celular e a síntese de compostos fenólicos secundários de defesa, dentre os
quais se destaca as fitoalexinas que são enzimas tóxicas associadas com o
metabolismo secundário como exemplo, a fenilalanina amônia-liase (FAL) e a
chalcona isomerase (WEN et al., 2005; SOYLU, 2006). Uma síntese desses
processos pode ser observada na Figura 2.
Figura 2. Resumo esquemático dos processos metabólicos envolvidos no
mecanismo de defesa das plantas ao ataque de patógenos (TORRES, JONES e
DANGL, 2006).
Na literatura, alguns estudos tem sido conduzidos visando investigar o papel
de metabolitos primários e secundários nos processos de defesa de plantas ao
patógeno. Nojosa et al, (2003) investigaram compostos fenólicos e enzimas
oxidativas em clones de Theobroma cacau resistentes e susceptíveis a Crinipellis
perniciosa. Os autores observaram que os teores de fenóis solúveis totais
aumentaram nos clones resistentes bem como a atividade da peroxidase. No clone
susceptível ocorreu um aumento da polifenoloxidase. Estudo semelhante foi
realizado por Ndoumou, Ndzomo e Djocgoue (1996), que investigaram
Reconhecimento de
um patógeno como
avirulento
Produção dos
Intermediários Reativos
de oxigênio - IROs
Resposta hipersensitiva (RH) com
morte celular programada (MCP)
Resposta sistêmica adquirida (SAR)
PR-Proteínas
Síntese de barreiras físicas
(papilas), aumento da
lignificação da parede celular
e síntese de Fitoalexinas
Explosão
Oxidativa
Síntese de compostos
bioquímicos que buscam
eliminar os
ROS (Ex:
POX, CAT, SOD...)
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
25
clones de Theobroma cacau com diferentes níveis de susceptibilidade a
Phytophthora megakaraya. Neste caso os autores constataram que as variações dos
compostos bioquímicos, carboidratos, aminoácidos e fenóis, foram genótipo-
dependentes
Junqueira, Bedendo e Pascholati (2004) inocularam fitoplasma em plantas de
milho resistentes e susceptíveis e verificaram alterações nos níveis nas proteínas,
compostos fenólicos, clorofila total e açúcares 10 dias após a inoculação. Exceto
quanto aos teores de clorofila que foram reduzidos, os demais compostos
aumentaram na cv. susceptível quando comparado a cv. resistente em resposta ao
estresse. A redução da clorofila foi explicada como uma interferência do
microorganismo no metabolismo deste composto.
Estas barreiras químicas, resultantes do metabolismo secundários dos
vegetais, são um dos mecanismos de defesas ao ataque de patógenos e
compreendem diversos compostos como glicosídeos cianogênicos e fenólicos,
fenóis, alcalóides, fototoxinas e enzimas oxidativas. Alguns autores afirmam que os
açúcares presentes nos tecidos de plantas influenciam diretamente na
susceptibilidade a doenças retardando ou acelerando o desenvolvimento do
patógeno (HORSFALL e DIMOND, 1957). Patil et al., (1985) demonstraram que os
açúcares nos tecidos hospedeiros incrementam a severidade da doença (LUKENS,
1970), enquanto que outros autores afirmam que reduzem o desenvolvimento
fúngico, podendo ainda ter pouco ou nenhum efeito neste sentido (GIBBS e
WILCOXSON, 1972).
A prolina é um outro composto bastante estudado na resposta das plantas a
estresses. O acúmulo deste composto em células vegetais tem sido largamente
citado como uma resposta a estresse abióticos como seca e salinidade sendo
considerada um mecanismo de ajuste osmótico resultante do aumento na via de
glutamato ou da ornitina (DELAUNEY e VERMA, 1993). Outros autores sugerem
outras funções para o acúmulo de prolina, como: estabilizador de estruturas sub-
celulares (SCHOBERT e TSCHESCHE, 1978); seqüestrador de radicais livres
(SARADHI et al., 1995); depósito de energia (HARE E CRESS, 1997); componente
da cascata de sinalização molecular do estresse (WERNER e FINKELSTEIN, 1995)
e constituinte principal de proteínas da parede celular de plantas (NANJO et al.,
1999). Alguns estudos envolvendo estresse biótico de plantas têm demonstrado
também o papel da prolina nas resposta a infecção (FABRO, et al, 2004; CHEN e
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
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DICKMAN, 2005).
Fabro et al. (2004) submeteram plantas de Arabidopsis thaliana submetida à
infecção com duas raças de Pseudomonas syringae pv. tomato e verificaram
elevação nos teores de prolina nos períodos de 12 e 24 h após a inoculação. Este
comportamento foi associado a uma resposta hipersensitiva das plantas ao
patógeno.
As enzimas oxidativas são também consideradas marcadores bioquímicos
característicos de estresse bióticos. As peroxidases (POX) são enzimas presentes
em células animais, vegetais e de microorganismos ocorrendo em diversas
estruturas celulares como núcleo, membranas e organelas (HOAGLAND, 1990). São
consideradas hemeproteinas de oxiduredutase com alta especificidade de aceptora
de hidrogênio (ALFENAS et al., 1991). As POX atuam na catálise da oxidação e
biossíntese de lignina, gerando H
2
O
2
, a partir de NADH, na oxidação de compostos
fenólicos e na inibição do crescimento através da oxidação do ácido indol-3-acético
(HOAGLAND, 1990).
As catalases (CATs) são oxidurredutases e ocorrem em plantas, animais e
microrganismos aeróbios (SCANDALIOS, 1993). De acordo com Frugoli et al.,
(1996) podem ser encontradas nas mitocôndrias, peroxissomos, glioxissomas e no
citoplasma. Assim como as peroxidases, são importantes catalizadores e, como
agente regulador dos níveis de H
2
O
2
, sua atividade refere-se a converter H
2
O
2
em
H
2
O e O
2
. Esta classe de enzimas utilizam o peróxido de hidrogênio como agente
oxidador de toxinas incluindo compostos fenólicos, álcoois, fomaldeídos e ácido
fórmico (RICE-EVANS et al,. 1996), removem H
2
O
2
dos peroxissomos foliares,
devido a oxidação do glicolato na fotorrespiração em plantas C3, e atuam nos
glioxissomos e mitocôndrias combatendo H
2
O
2
produzidos no processo de β-
oxidacao dos ácidos graxos e na cadeia transportadora de elétrons (FRUGOLI et al.,
1996; PIMENTEL, 1998). De acordo com Léon et al. (1995) as catalases têm papel
fundamental na defesa antioxidante e na transdução de sinais em resposta a
estresses ambientais. Estas parecem ser sensíveis à fotoinativação, principalmente
em condições de baixa temperatura causando uma drástica inibição da fotossíntese
(ELSTNER e OSSWALD, 1994).
Radwan et al., (2007) analisaram folhas de uma cultivar de Curcubita pepo
infectadas com o vírus do mosaico amarelo (ZYMV-Zucchini yellow mosaic virus) e
verificaram aumento de atividade de peroxidase em resposta a infecção viral.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
27
Luhová et al., (2006) estudaram a atividade das enzimas catalase, peroxidase,
amino-oxidase e fosfatase ácida em duas cvs. de pimenta, resistentes e sensíveis a
Fusarium oxysporum e F. solani ao longo de 28 dias após a inoculação. Verificaram
que apenas a fosfatase ácida variou em sua atividade por volta dos oito dias,
aumentando nas raízes após infecção e diminuindo nas hastes. Para catalase e
peroxidase ocorreu incremento nos teores logo aos 4 dias após a inoculação e uma
queda a partir dos 12 dias para CAT e aos 28 dias para POX.
Considerando os aspectos moleculares das interações planta-patógenos
sabe-se que em uma reação incompatível os genes responsáveis pela resistência
raça-específica (genes R) agem de forma isolada em relação ao genótipo do
patógeno (raça fisiológica), de acordo com a teoria gene-a-gene de Flor (1955). Este
autor afirma que para cada gene que condiciona uma reação de resistência no
hospedeiro, existe um gene complementar no patógeno que condiciona a
avirulência. Desta forma, de acordo com Staskawicz et al., (1995), em decorrência
da evolução nestas interações, ocorre uma variabilidade de genes R em indivíduos
diferentes de uma mesma espécie hospedeira e uma correspondente variabilidade
de genes de avirulência em diferentes raças do patógeno
De acordo com Faleiro et al., (2003), o entendimento desta diversidade de
genes R e da disposição destes genes no genoma são de fundamental importância
para estudo da evolução gênica e para auxiliar programas de melhoramento de
plantas que visem resistência a doenças. Para Yulong et al., (2006), a resistência
como um todo é controlada por duas classes de genes: R, genes de resistência e
DR, genes de resposta a defesa. Estudos têm demonstrado que a maior parte dos
genes de resistência de plantas até então isolados pertenciam à classe de
nucleotídeos (NBS) na região N-terminal que apresenta "motivos conservados” e
uma região muito variável com repetições ricas em leucina (LRR) no C-terminal
(KOBE e DEISENHOFER, 1994). Rossi et al., (1998) mostraram que os genes desta
classe conferem resistência a diversos patógenos incluindo vírus, bactérias, fungos
e nematóides.
Diversos grupos de pesquisa desenvolveram oligonucleotídeos degenerados
para regiões NBS buscando amplificar regiões de interesse no genoma das plantas.
A partir destes experimentos desenvolveram o grupo de marcadores denominados
RGAs (Resistance Gene Analogs) que são genes de resistência conhecidos por
estarem geneticamente ligados a locos de genes de resistência ou parte dos
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
28
mesmos (MADSEN et al., 2003).
Varias respostas moleculares ocorrem em decorrência ao ataque de
patógenos como descrito por Takahashi et al., (1990). Este grupo construiu cinco
bibliotecas de cana-de-açúcar inoculadas com Glomus clarum, sendo quatro de
cDNA e uma subtrativa. Os autores identificaram 386 genes, que após
sequenciamento, codificaram para produtos com funções diversas como recepção
de moléculas sinais, transporte de íons, transdução de sinais e regulação da
transcrição.
Em algodão são relatados trabalhos que buscam identificar e caracterizar
genes expressos em resposta ao ataque de patógenos. Dowd, Wilson e McFadden
(2004) utilizando a técnica de microarrays em larga escala analisou as alterações
nas expressão gênica em tecidos de raízes e hipocótilo de algodão inoculado com
Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Os autores observaram respostas mais
expressivas no hipocótilo, com expressão de genes relacionados a patogênese e a
biossíntese de gossipol e ligninas.
Um estudo de transcriptona da interação algodão- Xanthomonas campestris
pv. Malvacearum foi realizado por Patil et al., (2005) que utilizaram uma biblioteca de
cDNA para identificar genes de resistência expresso em folhas inoculadas com esta
bactéria. Para realização deste trabalho os autores utilizaram um acesso resistente
de algodão que apresentou uma resposta hipersensitiva a infecção. Os resultados
obtidos foram bastante promissores uma vez que cerca de 98% dos genes
apresentaram comportamento super-regulado em relação ao controle e, destes, 63%
apresentaram similaridade com genes associados a defesa de plantas. Genes
codificadores de diversas funções foram observadas como síntese protéica,
metabolismo secundário, sinalização, morte celular programada, proteínas
relacionadas à patogênese ou semelhantes à retrotransponsons.
Recentemente vários estudos têm sido desenvolvidos visando elucidar as
respostas bioquímicas e moleculares da planta quando submetidas à infecção. Em
alguns deles tem sido demonstrado o papel de certos elementos do metabolismo
primário e secundário nos processos envolvendo a resistência da planta ao
patógeno. Isso é relevante considerando-se a perspectiva de aplicabilidade de tais
descritores para auxiliar nos exaustivos trabalhos de seleção de genótipos
resistentes nos trabalhos de melhoramento.
O presente trabalho teve por objetivo proceder a um estudo molecular e
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
29
bioquímico em cultivares de algodão submetido à infecção com o fungo causador da
ramulose visando identificar marcadores envolvidos no processo de resposta da
planta à resistência.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
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Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
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Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
36
Capítulo II
Avaliação bioquímica em cultivares de algodão em resposta a
Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides A.S. Costa
A ser submetido na Revista Fitopatologia Brasileira
(ISSN 0100-4158)
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
37
Avaliação Bioquímica em Cultivares de Algodão em Resposta a Colletotrichum gossypii South
var. cephalosporioides A.S. Costa
Fabiana A.C. Silva
1
, Roseane C. dos Santos
2
, Péricles A. Melo Filho
1
.
1
Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Rua Dom Manoel de
Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife-PE, e-mail: fabiana.acs@gmail.com; pericle[email protected];
2
Embrapa Algodão, CP 174, 58107-720, Campina Grande-PB, e-mail:[email protected]brapa.br
Autor para correspondência: Péricles A. Melo Filho (pericles@depa.ufrpe.br)
SILVA, F.A.C., SANTOS, R.C., MELO-FILHO, P.A. Avaliação Bioquímica de Cultivares de
Algodão em Resposta a Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides A.S. Costa.
RESUMO
Cinco descritores bioquímicos foram avaliados em plantas de algodão infectadas com o fungo
causador da ramulose visando detectar diferenças nos compostos associados à infecção. Foram
utilizados quatro genótipos de algodão com diferentes níveis de resistência a doença: BRS Antares
(Resistente), BRS Cedro (Medianamente Resistente), BRS 187 8H (Medianamente Susceptível) e
CNPA Precoce I (Susceptível). O experimento foi conduzido em casa de vegetação no departamento
de Agronomia da UFRPE. As sementes foram semeadas em vasos plásticos e, 20 dias após a
emergência, foram inoculadas com uma suspensão de Colletotrichum gossypii South var.
cephalosporioides A.S. Costa na concentração de 1 x 10
6
conídios/mL. O tratamento controle
recebeu água destilada autoclavada. Folhas foram coletadas após 3, 15 e 30 dias após a inoculação e,
em seguida, utilizadas nas análises de prolina livre, catalase, peroxidase, carboidratos solúveis e
proteínas totais. Verificou-se que os teores de prolina livre, peroxidase e catalase foram
discriminadores na identificação de plantas infectadas. Estes descritores apresentaram rápida
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
38
resposta nos primeiros momentos após a infecção das plantas, sendo mais expressivo na cv.
Resistente BRS Antares. A determinação dos teores de prolina livre e catalase podem ser utilizadas
como ferramentas auxiliares na identificação de cultivares resistentes à ramulose nos programas de
melhoramento da cultura do algodão.
Palavras-chave: Doença do algodão, enzima, metabólitos, ramulose.
Biochemical evaluation of cotton varieties in response to Colletotrichum gossypii South
var. cephalosporioides A.S. Costa
ABSTRACT
Five biochemical descriptors were assessed in cotton plants infected with a ramulosis-causing fungus
in order to detect differences in the compounds associated to the infection. Four cotton genotypes
with different degrees of resistance to the disease were used: BRS Antares (resistant), BRS Cedro
(medianly resistant), BRS 187 8H (medianly susceptible) and CNPA Precoce I (susceptible). The
experiment was conducted in a greenhouse in the Agronomy Department of the Universidade
Federal Rural de Pernambuco (Brazil). Seeds were sown in plastic pots and inoculated 20 days after
emergence with a Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides A.S. Costa suspension at a
concentration of 1 x 10
6
conidia/mL. The control treatment received autoclaved distilled water.
Leaves were collected at 3, 15 and 30 days after inoculation and used in the analyses of free proline,
catalase, peroxidase, soluble carbohydrates and total proteins. Proline, peroxidase and catalase levels
were found to be discriminators in the identification of infected plants. These descriptors exhibited a
rapid response soon after infection and were more expressive in the resistant BRS Antares variety.
The determination of free proline and catalase levels can be used in the identification of ramulosis-
resistant varieties in cotton crop improvement programs.
Keywords: Cotton disease, enzyme, metabolites, ramulosis.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
39
INTRODUÇÃO
O algodão herbáceo (Gossypium hirsutum L. var. latifolium Hurtch) é uma malvácea
originária das Américas que se expandiu para várias regiões do mundo, sendo considerada uma
cultura de alto aproveitamento industrial devido à sua fibra, que por ser natural, tem elevado valor de
mercado. O Brasil é dos maiores produtores mundiais de algodão, com uma safra superior a 3,5
milhões de toneladas de algodão em caroço (IBGE, 2008).
A lavoura algodoeira é mais concentrada nas regiões dos cerrados do centro-oeste e baiano,
onde o manejo é quase que totalmente mecanizado, o que eleva significativamente o custo de
produção. No aspecto agronômico, os principais custos envolvem as despesas para controle de
plantas invasoras, pragas e doenças, que chegam a orçar entre 30 e 40% do custo total (Freire, 2007).
As doenças, especialmente as de origem fúngica, estão entre os principais fatores
responsáveis pela queda de produção da cultura. A ramulose, causada pelo fungo Colletotrichum
gossypii var. cephalosporioides A.S. Costa, é uma das mais prejudiciais, podendo provocar perdas
de até 60% da produção quando encontra condições satisfatórias ao seu desenvolvimento (Freire,
2007). Sua ocorrência está diretamente ligada à associação de fatores ambientais favoráveis, além da
utilização de variedades com baixa resistência e, com sementes, muitas vezes, infectadas pelo fungo
(Tanaka & Menten, 1992).
Este fungo infecta as folhas, os pecíolos e o colmo provocando nanismo e superbrotamento
dos ramos o que prejudica a formação de maçãs e, conseqüentemente, o rendimento do algodão
(Mehta et al., 2005) e apresenta como principal modo de disseminação as sementes mas, outra modo
é via solo contaminado (Talamini & Stadnik, 2004).
As plantas superiores desenvolveram mecanismos de defesa contra perturbações a quem são
submetidas ao longo do seu ciclo de visa. Algumas delas desengatilham mecanismos oxidativos
buscando eliminar e/ou melhor se adaptar ao agente causador da perturbação, seja ele abiótico ou
biótico. Muitos desses estresses levam à formação de radicais livres, que são altamente prejudiciais
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
40
aos sistemas biológicos por causarem oxidação dos tecidos que podem, inclusive, levar a planta à
morte (Mahalingam & Fedoroff, 2003).
Agentes antioxidantes, principalmente enzimas, são a forma encontrada por vários vegetais
para tentar reverter ou diminuir os estragos causados por estes radicais. Estas enzimas, além de
outros agentes como fenóis e compostos derivados, são agrupados entre os chamados metabólitos
secundários das plantas e, dependendo do estímulo, podem ser acumulados ou eliminados em
resposta ao estresse (Foyer & Noctor, 2005; Soylu, 2006).
De acordo com Bindschedler et al., (2002) a síntese de alguns compostos pelas plantas
infectadas tem importante função na resistência ao organismo invasor. Alguns trabalhos demonstram
que estas alterações metabólicas têm importante papel na inibição do estabelecimento ou
crescimento dos patógenos (Dai et al., 1996; Campos et al 2004; Omokolo et al 2002). Dai et al.
(1996) investigaram alterações de compostos bioquímicos em cotilédones de duas cultivares de
algodão resistente e susceptível a Xanthomonas campestris pv. malvacearum, e detectaram altos
níveis de flavonóides 10 h após a inoculação, sendo este acúmulo associado a uma resposta
hipersensitiva do cotilédone do algodão ao fungo. Nas plantas resistentes houve atividade de
peroxidase e terpenóides após 4 h e 48 h da inoculação, respectivamente.
Campos et al (2004), estudando resistência à antracnose em quatro cultivares de feijoeiro
inoculadas com o fungo Colletotrichum lindemuthiamum observaram, após três dias, um grande
incremento na atividade das enzimas polifenoloxidase e peroxidase nas cultivares mais resistentes
correlacionando esta enzima com uma resposta sistêmica da planta ao ataque do patógeno. Omokolo
et al (2002) estudando a resposta de nove clones de Theobroma cacao L. à infecção por
Phytophthora megakarya constatou uma relação negativa entre o desenvolvimento das lesões e os
teores de aminoácidos e carboidratos no córtex vegetal considerando este resultado como genótipo-
dependentes, ou seja, entre clones foi possível observar um acúmulo variável destes compostos.
Scarpari et al., (2005) analisou o comportamento de diversos compostos bioquímicos em Theobroma
cacao L. inoculada com Crinipellis perniciosa desde a implantação do patógeno até o
desenvolvimento da doença. Estes autores constataram alterações nos níveis de açúcares solúveis,
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
41
alcalóides, taninos, clorofilas a e b, dentre outros, e concluíram que as alterações bioquímicas nos
tecidos infectados estão diretamente relacionadas à síntese de etileno pela planta.
Com o objetivo de analisar a atividade de alguns metabólitos primários e secundários em
plantas de algodão infectadas com o fungo Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides, realizou-
se o presente trabalho.
MATERIAL DE MÉTODOS
Material biológico e condições experimentais
Utilizou-se quatro cultivares de algodão desenvolvidas pela Embrapa Algodão com
diferentes níveis de resistência a ramulose. São elas: BRS Antares (Resistente) (Metha et al, 2005;
Zandoná et al, 2006), BRS Cedro (Medianamente Resistente), BRS 187 8H (Medianamente
Susceptível) e CNPA Precoce I (Susceptível) (Freire, Morello & Farias, 2007; Suassuna & Coutinho,
2007; Zandoná et al, 2006). O experimento foi conduzido na casa de vegetação do Departamento de
Agronomia da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) nos meses de Julho e Agosto de
2007.
As sementes foram deslintadas e cultivadas em vasos plásticos de 5 Kg (50 cm de diâmetro)
contendo solo esterilizado e fertilizado de acordo com as necessidades da cultura. Aos 20 dias após a
emergência as plântulas foram inoculadas com aspersor manual com uma solução de C. gossypii var.
cephalosporioides, cedido pela micoteca do Departamento de Agronomia da UFRPE, na
concentração de 1 x 10
6
conidios/mL em água destilada. Os tratamentos constaram de controle, onde
as plantas receberam apenas água destilada autoclavada, e infectado, onde as plantas receberam 1
mL da suspensão fúngica nas folhas do terço inferior. Após a inoculação, as plântulas foram
submetidas à câmara úmida por 72 h e, a seguir, realizou-se a primeira coleta de folhas para os testes
bioquímicos. As coletas seguintes foram feitas aos 15 e 30 dias após a inoculação (dai). O
delineamento utilizado foi inteiramente casualizado com seis repetições.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
42
Análises bioquímicas
Os extratos enzimáticos foram obtidos a partir da maceração de 1g de folhas frescas em
tampão fosfato (Fosfato monobásico 100 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7.0). O macerado foi filtrado em
tecido, centrifugado a 14.000 rpm a 4 ºC por 15 mim e o sobrenadante transferido para novos tubos e
conservados a -80ºC para posterior utilização (Campos et al., 2004). Os ensaios em branco foram
realizados utilizando-se apenas tampão fosfato sem a presença dos extratos enzimáticos. Todas as
análises foram realizadas por meio de espectrofotometria, utilizando-se espectofotômetro marca
Fenton.
Carboidratos solúveis.
Para este composto orgânico empregou-se o método Fenol-sulfúrico (Dubois et al., 1956)
com modificações. Resumidamente, para cada amostra de 20 µL do extrato enzimático, adicionou-se
480 µL de tampão Fosfato, 500 µL de Fenol 5% e 2,5 mL de ácido sulfúrico concentrado seguindo-
se de rápida agitação em vortex. A leitura das amostras foi feita a 490 nm e a curva padrão foi
preparada com
D-glicose 0,01 % (p/v) e utilizada para comparação com as absorbâncias
obtidas. Os resultados foram expressos em
µmol de carboidratos solúveis /g de matéria fresca.
Proteínas totais
Para esta análise as amostras foram diluídas 20X. Para tanto tomou-se uma alíquota de 20
µL e 480 µL de tampão fosfato seguindo-se de agitação. Em tubos de ensaio de 15 mL depositou-se
100 µL de cada amostra diluída juntamente com 1 mL do Reagente de Bradford (Bradford, 1976).
Após 15 min procederam-se as leituras a 595 nm. As absorbâncias obtidas foram comparadas com a
curva padrão (solução estoque de
albumina bovina - 1 mg/mL) e
os dados expressos µmol de
proteínas totais /g de matéria fresca.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
43
Prolina livre
Para análise deste iminoácido adicionou-se 1,0 mL do extrato enzimático em tubos de ensaio de 15
mL rosqueáveis contendo 1,0 mL de ninhidrina ácida e 1,0 mL de ácido acético glacial concentrado
(Bates, 1973). Os tubos foram acondicionados em banho-maria, a 100 °C, por 1 h. A reação foi
interrompida colocando-se os tubos em banho-maria a 2 °C. Em seguida, uma alíquota de 2,0 mL de
tolueno foi adicionada ao tubo sob agitação por 15 seg A fase aquosa superior (cromóforo + tolueno)
foi recuperada e submetida à leitura a 520 nm. Os valores obtidos foram comparados com a curva
padrão de prolina (0,0115g de prolina em um volume final de 100 mL com água deionizada) e os
resultados expressos em µmol de prolina /g de matéria fresca
Catalase
Para análise desta enzima pré-aqueceu-se previamente o tampão fosfato (1,39 mL) por 20
min a 30 ºC. A seguir, adicionou-se 50 µL do extrato e 60 µL de peróxido de hidrogênio (500 mM)
(Beers, 1952). Após agitacão em vortex realizaram-se duas leituras a 240 nm, sendo uma aos 15 seg
e outra aos 1 min e 15 seg. Para cálculo desta enzima utilizou-se a diferenças entre as medias. Uma
unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima que causou o aumento de 0,001
unidade de absorbância por minuto nas condições utilizadas no experimento.
Peroxidase
Nesta análise utilizou-se 1,5 g de folha macerada em nitrogênio liquido. Ao macerado
acrescentou-se 4 mL de solução tampão composta por acetato de sódio (0,1 mM/ pH 7,0) , ácido
acético glacial (0,1 M), EDTA (1 mM) e 1% (v/v) de polivinilpirrolidona (PVP). As amostras foram
centrifugadas a 14.000 rpm por 25 min (4ºC) e o sobrenadante transferido para novos tubos e
armazenado a -80ºC.
Para a quantificação desta enzima utilizou-se a metodologia descrita em Dann e Deverall
(2000). Ao tubo de ensaio adicionou-se 25 µL de guaiacol (0,02 M), 1,0 mL do tampão acetato (100
mM) e 250 µL de peróxido de hidrogênio (0,38 M). Após agitação a mistura foi utilizada como
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
44
padrão branco para leitura no espectrofotômetro. Adicionou-se então 25 µL do extrato enzimático e
registrou-se os valores da primeira leitura, sendo a segunda efetuada 2 minutos após.
A determinação da atividade foi feita medindo-se a variação de absorbância a 470 nm da
substância formada na reação enzimática (tetraguaiacol). Uma unidade de atividade foi definida
como a quantidade de enzima que causou o aumento de 0,001 unidade de absorbância por minuto
nas condições citadas anteriormente.
Análise Estatística
Os dados obtidos foram submetidos a análise estatística utilizando-se o programa SAEG 9.1
(Sistema para análises estatísticas, 2007) utilizando o teste F. As médias foram comparadas pelo
teste de Duncan a 5% de probabilidade. As figuras foram geradas no programa de Excel baseando-se
nas médias dos tratamentos em função dos períodos avaliados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As plantas inoculadas apresentaram sintomas cerca de 12 dias após a inoculação com o
patógeno. Fenotípicamente, todas as cultivares apresentaram sintomas típicos de ramulose nas folhas
e hastes, sendo menos acentuado nas cvs. Antares e Cedro (Figura 1) e mais expressivo na cv. CNPA
Precoce I.
Uma síntese do comportamento bioquímico das cultivares sadias e inoculadas encontram-se
nas Figuras 2 a 6. Observa-se que as taxas de prolina diferiram estatisticamente entre os tratamentos,
apresentando efeito linear ascendente nas cultivares inoculadas, com maior expressivamente a partir
dos 15 dias após a inoculação, atingindo uma média de 69,53 µmol/g aos 30 dai, o que representa
uma diferença de 360% em relação à média do controle (Tabela 1). A cultivar resistente BRS
Antares apresentou o maior teor de prolina, quando submetida ao fungo, com média de 40,83 µmol/g
aos 15 dias e 104, 32 µmol/g aos 30 dias (Figura 2), sendo superior ao controle em 167 e 567%,
respectivamente.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
45
Chen & Dickman (2005) reportaram que, após reconhecimento do patógeno pela planta
ocorre síntese de compostos anti-oxidantes que buscam diminuir os danos as células vegetais devido
a ação das Espécies Reativas a Oxigênio (ROS) sendo a prolina um desses antioxidantes. O aumento
da prolina observado na cv. BRS Antares pode ser justificado como um processo de defesa das
plantas contra o patógeno. Esse resultado é relevante porque torna a análise deste composto uma
ferramenta acessível para ser utilizada nos trabalhos de melhoramento, visando detectar plantas
resistentes a este fungo. Fabro et al. (2004) observaram resultados semelhantes em Arabidopsis
thaliana quando submeteram a planta à infecção por duas raças da bactéria Pseudomonas syringae
pv. tomato Estes autores observaram um acúmulo de prolina entre 12 e 24 h nas plantas inoculadas e
reportaram que a biossíntese deste iminoácido parece estar envolvida em uma resposta hipersensitiva
a estresse biótico.
O comportamento das cultivares quanto as enzimas oxidativas é apresentado nas Figuras 3 e
4. Para a peroxidase (POX), observa-se duas tendências com relação a sua expressão, uma
representada pelas cvs.BRS Antares e CNPA Precoce I e outra para BRS Cedro e BRS 187 8H. Nas
cvs. BRS Antares e CNPA Precoce I, a resposta da enzima foi observada logo aos 3 dias após a
inoculação, com produção de 25.907 U/mL e 14.080 U/mL, quando inoculadas, contra 3.840 U/mL e
2.743 U/mL no controle, respectivamente (Figura 3). Essa diferença corresponde a uma elevação de
674 nos teores desta enzima na BRS Antares e 573% na CNPA Precoce I. Para as cultivares BSR
Cedro e BRS 187 8H, o comportamento foi contrário, sendo de maior produção aos 30 dias, quando
as plantas inoculadas produziram 13.920 U/mL e 16.333 U/mL, contra 5.762 U/mL e 3.333 U/mL
nas controle, respectivamente.
De acordo com alguns autores, os principais eventos da infecção ocorre dentro das primeiras
24 horas (Shimoni et al, 1991; Nawar e Kuti, 2003; Honty et al, 2005). A explosão oxidativa tem
início cerca de 3 horas após a infecção sendo caracterizada pela produção de espécies reativas a
oxigênio (ROS), principalmente peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) (Martinez et al. 2000). Honty et al.
(2005) estudaram a atividade das enzimas peroxidase e polifenoloxidase em cultivares de pêra
sensíveis e resistentes a ação da bactéria Erwinia amylovora, às 2, 48 e 72 horas após a inoculação.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
46
Segundo esses autores as cultivares sensíveis e resistentes apresentaram aumento na atividade de
ambas as enzimas no segundo e terceiro dias após a inoculação, respectivamente. Na cv. resistente
este aumento continuou ao longo do desenvolvimento da doença, enquanto que na sensível houve
um decréscimo da POX. Os mesmos autores sugerem ainda que quanto maior o incremento de POX
mais efetivos são os mecanismos envolvidos no processo de defesa. Desta forma os altos teores aqui
encontrados na cv. BRS Antares atesta sua condição de resistente à ramulose sendo, portanto, um
relevante recurso genético a ser utilizado em trabalhos de melhoramento para transferência de
resistência a esta doença.
Há casos, contudo, em que plantas sensíveis ou tolerantes a doença apresentam um sistema
patógeno-hospedeiro incompatível. Neste caso, o mecanismo de defesa é desencadeado tardiamente,
podendo ainda não ocorrer, ocasionando a doença. (Resende, Salgado e Chaves, 2003). Isso pode ser
o caso das cvs. BRS Cedro e BRS 187 8H que apresentaram uma resposta tardia, cuja maior
produção de peroxidase, em relação ao controle, ocorreu aos 30 dias.
Vários autores têm demonstrado que a atividade da peroxidase está associada com a
resistência à doença em várias culturas. Shimoni et al (1991) estudando cultivares de milho
resistentes e susceptíveis a Exserohilum turcicum observou uma rápida produção de peroxidase nas
cultivares resistentes. Nas cvs. sensíveis houve uma resposta tardia evidenciada com o rápido
aparecimento da doença. Em fava, Nawar e Kuti (2003) observaram que após infecção com o fungo
Botrytis fabae, os níveis de peroxidase variaram entre as cultivares havendo grande incremento na
resistente e pouca diferença na susceptível em relação ao controle. Assim, os autores sugeriram esta
enzima POX como um descritor para seleção de variedades resistentes a Botrytis fabae.
Com relação à catalase verificou-que o comportamento foi similar para todas as cultivares
que apresentaram maior produção no início da infecção e forte queda a partir dos 15 daí (Tabela 2).
As cvs. BRS Antares e BRS Cedro apresentaram cerca de 4638 U/mL e 5600 U/mL nas plantas
controle aos 3 dai (Figura 3). Quando infectadas, os níveis foram elevados para 22.467 U/mL e
15,427 U/mL, correspondendo a um aumento de 384 % e 175 %, respectivamente. Nas cultivares
sensíveis essa variação foi de 374% para CNPA Precoce I e 454 % para CNPA 187 8H. Apesar
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
47
destes valores em termos relativos, os teores da enzima nas cultivares sensíveis foi menor. Esses
resultados corroboram com o que tem sido encontrado na literatura.
Em estudo realizado com dois genótipos de pimenta com diferentes níveis de resistência a
dois patógenos, Fusarium oxysporum e F. solani, Luhová et al (2006) analisaram a atividade de
enzimas oxidativas catalase e peroxidase e verificaram que a maior atividade ocorreu aos 4 dias
caindo por volta dos 12 dias após a infecção para CAT e aos 28 dai para POX. Quanto as demais
apenas houve variação em relação a fosfatase ácida que decresceu nas raízes e aumentou nas hastes
após a infecção.
A catalase, em plantas, é uma importante enzima envolvida nos mecanismos de defesa
antioxidante em resposta as estresses fisiológicos e ambientais (Scandalios,1969). Juntamente com a
Superóxido dismutase, a catalase atua na detoxificação das células sob estresse oxidativo, ou seja,
busca reduzir os danos causados pela produção de ROS. A detoxificação é considerada como uma
importante linha de defesa das plantas exigindo uma ação rápida e eficaz, garantindo assim uma
maior sobrevida das células sob estresse principalmente nas mitocôndrias vegetais (Moller, 2001).
Para vários autores, os teores elevados desta enzima serve como indicador da resposta da planta à
infecção, sendo frequentemente mais elevado na planta resistente (Kuzniak & Sklodowska, 2005;
Luhová et al 2006).
Com relação aos teores de carboidratos (CHON) e proteínas (PT) verificou-se que, para o
primeiro, as cultivares de algodão apresentaram, basicamente, o mesmo comportamento com
exceção da BRS Cedro que diferiu em todos os períodos de avaliação nas plantas submetidas a
infecção (Figura 4). No geral, contudo, a media obtida nas cultivares foi de 63.9 µmol/g MF aos 3
dias de avaliação, 36.19 µmol/g aos 15 dias e 30.5 µmol/g aos 30 dias. Na cultivar BRS Cedro, esses
valores foram de 39.25 µmol/g, 19.55 µmol/g e 28.1 µmol/g aos 3, 15 e 30 dias nas plantas controle
e 50.17 µmol/g, 44.8 µmol/g e 40,21 µmol/g nas infectadas. Com base nestes resultados, verifica-se,
para as condições estudadas, a análise de carboidratos não parece ser um bom descritor para detecção
de plantas resistências.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
48
Em outros trabalhos encontrados na literatura, contudo há relatos de que a síntese de
carboidratos está diretamente associada ao mecanismo de defesa das plantas. De acordo com
Horsfall & Dimond (1957), a elevação nos níveis de carboidratos solúveis (“High sugar resistance”)
parece estar envolvida numa alteração do metabolismo primário visando uma defesa contra
patógenos. A síntese de açúcares, em plantas, está diretamente relacionada à regulação da expressão
gênica, e sua presença tende a reduzir a necessidade de fotossíntese, ou seja, reduz a síntese de
pigmentos (Ludewig et al., 1998). Este comportamento tem sido considerado uma resposta das
plantas a infecção. Uma importante correlação existe entre o modo de penetração dos fungos na
parede celular da planta e a síntese de carboidratos. Os hospedeiros resistentes respondem a esta
invasão sintetizando novos carboidratos principalmente celulose e calose. Esta deposição de açúcares
solúveis pode se prolongada por um longo período ate formas as chamadas papilas. Em indivíduos
susceptíveis esta deposição é normalmente escassa ou inexistente (Bell et al, 1981).
Com relação aos teores de proteínas totais verificou-se aumento em todas as cultivares até os
15 dias após a inoculação do fungo. A partir desde período houve um comportamento diferenciado
nas cultivares ocorrendo um aumento contínuo nas cvs. BRS Antares e CNPA Precoce 1 e um
decréscimo nas demais (Figura 5). Devido a esse comportamento diferenciado, e considerando-se o
perfil detectado na cv. resistente BRS Antares, com baixa expressividade nos teores produzidos nos
tratamentos controle e infectado, esses descritores, tal como visto nos carboidratos, foi pouco
responsivo na diferenciação de cultivares sensíveis ou resistentes à doença.
Embora se saiba que a geração de espécies reativas a oxigênio induzem modificação
covalente nas proteínas levando a chamada Oxidação protéica, que tem sido considerada com
importante marcador bioquímico do estresse oxidativo (Moller et al,. 2007), em plantas os efeitos
desta oxidação têm sido pouco estudados havendo apenas grandes esforços da explicação desses
fenômenos ocorridos em mitocôndrias.
Apesar de não ter sido encontrada relação direta quanto aos teores de carboidratos e de
proteínas totais na distinção das cultivares resistentes ou susceptíveis de algodão, os resultados
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
49
obtidos com a prolina e as enzimas peroxidase e catalase foram significantemente expressivos e
confirmam sua associação com a resposta de defesa da planta ao patógeno.
Em trabalhos convencionais de melhoramento de plantas geralmente todo procedimento é
baseado em descritores fenotípicos, obtidos por meio de submissão de plantas ao patógeno, onde são
analisadas várias plantas simultaneamente em condições naturais ou em casa de vegetação. A
possibilidade de seleção de genótipos resistentes por meio destes descritores bioquímicos confiáveis
abre perspectivas para auxiliar nos processos de seleção, apresentando ainda a vantagem de redução
de custo e de tempo na identificação de acessos resistentes.
Agradecimentos
Os autores agradecem à Universidade Federal Rural de Pernambuco pelo apoio institucional,
a Embrapa Algodão pelo apoio financeiro, a CAPES pela concessão da bolsa e ao Dr. André de
Azevedo Neto, do laboratório de Fisiologia Vegetal, pela colaboração nos procedimentos
experimentais.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
50
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Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
56
.
Figura 1. Sintomas de ramulose em cultivares de algodão. Cultivar BRS
Antares: (A) Folha, (B) Haste; Cultivar BRS Cedro: (C) Folha, (D) Haste
C
D
A
B
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57
Figura 2. Teores de prolina (µmol/g de MF) em diferentes cultivares de algodão sob os
tratamentos controle e inoculado, aos 3, 15 e 30 dias após a inoculação. * Diferença
estatística pelo teste Duncan a 5% de probabilidade
[ ]
[ ]
[ ]
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58
A
B
Figura 3.Teores das enzimas oxidativas peroxidase (U/mL) (A) e catalase (U/mL) (B) em
diferentes cultivares de algodão sob os tratamento controle e inoculado, aos 3, 15 e 30 dias
após a inoculação. * Diferença estatística pelo teste Duncan a 5% de probabilidade
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
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59
Figura 4. Teores de carboidratos (µmol/g de MF) em diferentes cultivares de algodão sob
os tratamento controle e inoculado, aos 3, 15 e 30 dias após a inoculação. * Diferença
estatística pelo teste Duncan a 5% de probabilidade
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
60
Figura 5. Teores de proteínas (µmol/g de MF) em diferentes cultivares de algodão sob os
tratamento controle e inoculado, aos 3, 15 e 30 dias após a inoculação. * Diferença estatística
pelo teste Duncan a 5% de probabilidade
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
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61
Tabela 1.
Média das cultivares de algodão quanto ao teor de prolina, em três períodos de
avaliação, quando submetidas a infecção com o fungo da ramulose
Período avaliado Prolina (µmol/g de MF)
Controle Inoculado
Diferença em relação ao
controle (%)
3 18,55B 24,07A 30
15 11,76B 31,63A 169
30 15,12B 69,53A 360
CV (%)
Média
F
P < 5%
26,28
28,44
135,62
0,00
Médias com a mesma letra não difere estatisticamente entre si pelo teste de Duncan a 5% de
probabilidade
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
62
Tabela 2.
Média das cultivares de algodão quanto ao teor de catalase, em três períodos
de avaliação, quando submetidas a infecção com o fungo da ramulose
Período avaliado
Catalase (U/mL)
Controle inoculado
Diferença em relação ao
controle (%)
3 3856,33 B 14750,00 A 283
15 1911,83 B 5400,00 A 182
30 1308,33 B 1260,00 A 96
CV (%)
Média
F
P < 5%
35,07
4747,75
134,98
Médias com a mesma letra não difere estatisticamente entre si pelo teste de Duncan a 5% de
probabilidade
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
63
Capítulo III
Identification of differentially expressed transcripts in cotton varieties
infected with Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides
Artigo submetido à Revista European Journal of Plant Pathology
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
64
Identification of differentially expressed transcripts in cotton varieties infected
with Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides
Fabiana Aparecida Cavalcante Silva
1
, Péricles de Albuquerque Melo Filho
1
, Carliane
Rebeca Coelho Silva
1
and Roseane Cavalcanti dos Santos
2,*
1
Agronomy Departament, Universidade Federal Rural de Pernambuco, UFRPE, Rua
Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, Recife-PE,
2
Embrapa Algodão,
Biotecnology Area, CP 174, Campina Grande, PB, * Author for correspondence
(Email: [email protected])
Abstract
Resistant and susceptible cotton cultivars - BRS Antares and CNPA Precoce I,
respectively – were infected with Colletotrichum gossypii var. cephalosporioides in
order to identify differentially expressed transcripts related to plant defense
mechanisms. Plants were sown in plastic containers in greenhouse and inoculation
took place at 20 days after sowing. Each treatment was sprayed with a fungal
suspension at 1 x 106 conidia/mL concentration and submitted to a humidity
chamber for 72 hours. Control plants were sprayed with distilled water. Young leaves
were colleted to total RNA extraction at 3 and 15 days after inoculation (dai). To
molecular procedures, 3dai leaves-RNA were used with ten pre-selected Operon
series-primers for the RT-PCR reactions, which were performed at 35 ºC annealing.
Eight of these primers exhibited patterns with polymorphic bands but just five were
selected for transcripts analysis. Differential expression was visualized in both
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
65
cultivars. At overall, 12 down regulation, 13 up regulation and 10 apparently actives
transcripts were registered. An apparently active transcript obtained from inoculated-
resistant BRS Antares, with c.a. 200 bp (tV10), exhibited 86% homology with the
GmChl 3 gene (AB181949.1) that codifies to Chlorophyllase III in soybean plants.
This enzyme is involved in protection processes of vegetal cells against oxidative
damage and modulates the activation of different defense pathways. Dot blot
analysis revealed that this transcript was also present in control plants and in infected
cv. CNPA Precoce I, but in basal and low expressions respectively. Over-expression
was confirmed in resistant cv. BRS Antares at 3 and 15 days after inoculation.
Key-words: biotic stress, disease, ramulosis, gene expression, Gossypium
Introduction
Plant diseases are important factors responsible for losses in crop production
at worldwide level. On large farms, such as cotton, a number of different pathogens
such as fungi, viruses, mycoplasmas, nematodes and bacteria cause severe crop
damage (Cia and Salgado, 1997). Ramulosis caused by the fungus Colletotrichum
gossypii var. cephalosporioides stands out among main fungal diseases in cotton
crop and, depending on the environmental conditions, can generate losses over than
60% in yield (Freire et al., 2007). The most effective control of this disease involves
combined actions, such as resistant cultivars, treatment of seeds and crop rotation.
In Brazil, although there are sources with a high degree of resistance to
ramulosis, cultivars are not produced on a commercial scale because they are not
attractive from an agronomic standpoint (Suassuna and Coutinho 2007). Therefore,
several strategies in Brazilian cotton improvement have been carried out in national
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
66
research companies aiming to incorporating the resistance traits in commercial
cultivars. The use of resistant genotypes is one of the most effective forms of
management in large farms due to the advantage of minimizing production costs,
especially with chemical products often used to control diseases.
Although plants have several genetic mechanisms involved in the defense
against phytopathogens, the response to invasion depends on the genetic makeup of
each variety and its interaction with the environment. Recently, researches have
focused on the identification of genes that codify for defense proteins (PR-Proteins).
Studies of this nature have increased knowledge on how plants protect themselves
against the progression of disease (Norman-Setterblad et al., 2000). The most well-
known of these proteins are enzymes such as phytoalexins, defensine (Penninckx et
al., 1996) and Chlorophyllases (Kariola et al, 2005). A number of researchers have
demonstrated the role of these enzymes in the defense mechanisms of plants
against phytopathogens. In cotton, Dubery and Slater (1997) reported a substantial
increase in Chitinase and β-1,3- glucanase when cotton plants were infected with the
fungus Verticillium dahliae. McFadden et al. (2001) obtained transcripts related to
phenylalanine-ammonia-lyase genes with this same pathosystem.
The identification of genes associated to these mechanisms is relevant to the
understanding of their functions and strategies and this information could be useful to
assist in the laborious selection processes often employed in the genetic cotton
improvement to resistance to disease. Several methodologies have been used in
molecular biology aiming to gene identification and prospecting. In this study we
report about identification of differentially expressed transcripts obtained in cotton
plants infected with ramulosis, by means of RAPD-PCR tools.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
67
Material and Methods
Planting and inoculation procedures
Cleaned and disinfected cotton seeds from ramulosis susceptible cv. CNPA
Precoce I and resistant cv. BRS Antares (Freire et al., 2007; Suassuna and
Coutinho, 2007) were cultivated in green house (Agronomy Dept., UFRPE), in 20 liter
plastic containers containing previously sterilized and fertilized Latosoil soil, during
middle winter, from July to August 2007. Plots were performed with 4 treatments:
BRS Antares-control, CNPA Precoce I-control, BRS Antares-infected and CNPA
Precoce I- infected. Each randomized treatment was performed with 10 containers
containing 5 plants. Average daily and nightly temperatures and relative humidity of
the air during the experiment were 29C, 20C and 83%, respectively. Irrigation by
aspersion was daily maintained according plant necessities.
At 25 days after sowing, when plants exhibited ca. four definitive leaves, they
were inoculated with a manual atomizer. The strain Cgc 287, from C. gossypii var.
cephalosporioides obtained with symptoms of the disease in Montvidéu, GO, Brazil,
was used to inoculation procedures. A concentration of 1.0 × 106 conidia mL-1 was
sprayed in plants from infected treatments. Control treatments were sprayed with
distilled water. After inoculation, all plants were placed on a humidity chamber for
72h.
RNA extraction and PCR assays
Young leaves (1g), located at apical, region were collected on ice from each
treatment for total RNA extraction, using Pure Link-Micro to Midi kit (Invitrogen). RNA
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
68
purity and concentration was analyzed in denaturant agarosis gel (1.2%) and
quantification was performed in a spectrophotometer (Fenton). Ten decamer RAPD
primers (Operon series) were pre-selected for the differential expression assays
(Table 1). The reverse transcription reactions were conducted in a Mastercycler
Gradiente Thermocycler using the M-MLV Reverse Transcriptase kit (Invitrogen).
Each reaction was performed in a final volume of 23 µL containing 10 µM of each
oligonucleotide, 10 mM of dNTP mix, 1 µg of RNA, 5X of the enzyme buffer, 0.1M of
DTT, 40 U of RNAguard (Invitrogen) and 20 U of M-MLV RT. The PCR reactions
were performed in a volume of 30 µl, containing 25 mM of MgCl2, 10 mM of dNTP
mix, 10 µM of each primer, 10X of the enzyme buffer, 5 µl of each cDNA and 0.5 U of
Taq DNA polymerase (Invitrogen). The conditions of amplification were: 1 denaturing
cycle (94 ºC/5 min), 35 denaturing cycles (94 ºC/15 seg), annealing (35 ºC/30 seg)
and extension (72 ºC/1 min) and a final extension cycle at 72 ºC/7 min. Amplification
products were run in agarosis gel (1.2%), stained with Sybr Gold (Invitrogen) and
photodocumented (Vilber Lourmat Photodocumentation).
Table 1
Purification of samples and cloning
Fragments obtained from transcripts apparently actives in inoculated plants
were isolated from the gel and selected bands were cut out. DNA was purified with
the SNAP kit (Invitrogen) and reamplified in 50 L PCR assays using the same
respective primers that generated the products. A 3 l aliquot (20 ng/L) of each
fragment was used for cloning in the pGEMT-Easy vector (Promega) and incubated
overnight at 4 oC. The clones were obtained from the Escherichia coli, One Top 10F´
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
69
cell (Invitrogen) and plasmid DNA (miniprep) was obtained with the Wizard kit
(Promega). The molecular procedures followed the recommendations of the
manufacturers.
DNA sequencing and homology searches
One aliquot of each miniprep (20 ng/L) was used for sequencing in the
Genetics, Biochemistry and DNA Sequencing Laboratory (Biology Dept., UFRPE),
using the LPA Dynamic Terminator kit for the MegaBASE sequencer (Amersham
Biosciences). The sequences were edited on the Chromas 2.3 Program (MFC
Application) and putative function was assigned by comparison with the
nonredundant nucleotide using the BlastN tool (Basic Local Alignment Search Tool)
from the National Center for Biotechnology Information-NCBI.
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Dot-blot analysis
RNA total (15 µL) from inoculated and control samples obtained at 3 and 15
days after inoculation in both cultivars were analyzed by dot-blot according Jain et
al,. (2001). RNA samples were previously denatured under alkaline conditions and
then dot-blotted onto a nitrocellulose membrane (Hybond N, Amersham). Membrane
was double rinsed, first with 1 mL of denaturing solution (10 mM cold NaOH and
1mM EDTA) and after with 2X SSC, 0.1% SDS, both during 1 min at room
temperature. RNA was UV crosslinked using the HL-2000 Hybrilinker (UPV Lab
Products). After prehybridization (Sambrook et al., 1989), membrane was probed
with a 200 bp PCR product obtained from apparently active transcript in inoculated
cv. BRS Antares, with primer OPV10. Probe was labeled with biotin (BioNick labeling
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
70
System, Invitrogen). Hybridization was performed at 37 °C for 8 h. Then, membrane
was washed according protocol described in Sambrook et al., (1989). Coloration
reaction was performed in dark room, using 160 µL NBT (75 mg/mL)/ BCIP (50
mg/mL) substrates (Promega) in 10 mL of alkaline phospathase buffer.
Results
Polymorphic patterns were visualized in eight of the whole primers used but
differentially expressed transcripts were achieved in just five. Among them, 12 were
down regulated, 3 up regulated and 10 were apparently activated. Figures 1 and 2
display band patterns generated in both control and inoculated plant samples; the
highest number of apparently active transcripts was obtained in the resistant cv. BRS
Antares under infected condition. The OPV10 primer provided more expressive
results for this kind of transcripts (Table 1).
Figure 1 and 2
All apparently active transcripts were sequenced and just one (tV10, 200-bp,
Figure 1C) was related to the defense mechanism against biotic and abiotic stresses,
according results obtained from comparison of sequences using the BlastN tool from
NCBI gene bank. This sample aligned with the GmChl 1 gene (AB181947.1), which
codifies for the Chlorophyllase III in soybean (Glicine max), exhibiting 86% identity
(Figure 3). However, dot blot results showed that, in truth, tV10 is not an active
transcript, but an over-expressed one revealed in a resistant cv. BRS Antares at 3
and 15 days after inoculation (Figure 4). Basal and low expression was verified in
control plants and in susceptible inoculated-Precoce I, respectively.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
71
Figure 3
Figure 4
Discussion
Plants are able to respond to diverse forms of environmental adversity
depending on the type of stress to which they are submitted. One such response
involves an increase in the production of reactive oxygen species (ROS), such as O
2
-
and hydrogen peroxide (H
2
O
2
). These products are normally synthesized by plants
through respiratory and photosynthesis mechanisms in various organelles, principally
mitochondria and chloroplasts (Grene, 2002). The greater stock of ROS in plants is
found in the thylakoid membranes throughout the electron transport systems.
A number of studies have been carried out in the field of molecular biology
with the aim of identifying transcripts related to plant defense against biotic stress.
Using Suppression Subtractive Hybridization (SSH) on cotton plants, Zuo et al.,
(2005) obtained expressed sequences tags in plants infected with Verticillium
dahliae, from which 1165 clones were analyzed. After selection through reverse
northern blotting, it was observed that 131 expressed sequences tags were up
regulated and 16 were down regulated; 83 exhibited homology with 45 unique
sequences. The expressed sequence tags exhibited greater identity with the
enzymes involved in the oxidative mechanism that were strongly expressed during
infection. Dowd et al., (2004) found that, when infected with Fusarium oxysporum f.
sp. Vasinfectum, cotton plants exhibited changes in gene expression in the root
tissue and hypocotyls, identifying PR genes related to pathogenicity and genes linked
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
72
to the biosynthesis of gossypol and lignin, which are agents of the defense response
of the plant to the pathogen.
In the present study, the analysis of the band patterns obtained from the plants
infected with the ramulosis revealed differences regarding transcript expression
between the control and inoculated treatments. In some cases, there was a greater
intensity in bands in the control than in infected sample; these were denominated
down regulated. When a similar behavior took place in the inoculated plants, over
than in control ones, they were classified as up regulated. The purpose of this study,
however, was focused on the apparently active bands, observed in just infected
plants.
The result obtained with the tV10-200bp transcript, identified as
Chlorophyllase III in cv. BRS Antares is relevant as to biochemical and molecular
aspects regarding the metabolic pathways in which this enzyme is involved. As seen
in Figure 4, high expression of this enzyme was verified at 3 and 15 days after
inoculation just in a resistant cultivar. It suggests that the resistance process in this
cultivar moves forward by hours after infection taking in account the expression
verified in both samples. In literature, others secondary metabolites have showed this
behavior in the resistant cultivars. Silva (2008) submitted four cotton cultivars to C.
gossypii var. cephalosporioides and verified high expression of catalase, peroxidase
and proline in cv. BRS Antares during the first 15 days after inoculation and justifies
this behavior as one of the defense processes of cultivar against the fungus. This
results was also reported by others authors working with resistant cultivar from
several crops, as Arabidopsis thaliana infected with Pseudomonas syringae pv.
tomato (Fabro et al., 2004), Pyrus communis with Erwinia aymlovora (Honty et al.,
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
73
2005) and Pisum sativum with Fusarium oxysporum and F. solani (Luhová et al.,
2006).
Several events related to infection take place in the first 24 hours. Martinez et
al., (2000), point out that oxidative burst takes place 3 hours after infection and is
characterized by ROS production, mainly H
2
O
2
. According several authors, H
2
O
2
is a
key molecule in plant resistance to pathogenic microbes (Leon et al., 1995, Wu et al.,
1997, Alvarez et al., 1998).
In respect to Chlorophyllase, Takamiya et al., (2000) stated that this enzyme
(chlorophyll-chlorophyllido hydrolase; EC 3.1.1.14) is the first enzyme generated in
the degradation pathway of chlorophylls. Biotic and abiotic stresses are responsible
for causing damage to vegetal tissue, requiring a repair mechanism such as the
release of chlorophyll in the thylakoid membranes. However, when in excess, these
chlorophyll particles need to be quickly eliminated in order to avoid cell damage due
to their photodynamic action, that is, their capacity to generated singlet oxygen (-O
2
),
a type of oxygen reactive species (ROS). Failure in the removal of chlorophyll can
increase the production of ROS, the toxic effect of which could be lethal to the cells.
In Arabidopsis thaliana, Benedetti and Arruda (2002) observed that two genes
codified for Chlorophyllase: AtCLH1 and AtCLH2. The induction of these genes was
observed in response to the methyl-jasmonate resistance inductor. Thus,
Chlorophyllases are directly involved in the mechanism for avoiding damage due to
the accumulation of ROS. Kariola et al., (2004) observed that Chlorophyllase 1 (gene
AtCLH1) in Arabidopsis thaliana is quickly induced in tissue damaged by the
necrotrophic bacterium Erwinia carotovora or the fungus Alternaria brassicicola.
These authors demonstrated that, besides protecting from oxidative damage,
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
74
chlorophyllase also acts on vegetal tissue, modulating the activation of different
defense pathways.
The results from the present study broaden the perspective for further studies
on defense pathways of plants against pathogens. The transcript described here
exhibited 86% homology with the AtCLH3 gene that codifies for Chlorophyllase III in
soybean plants and may be used as a probe for selecting cotton lines with resistance
to ramulosis or for further studies aiming to elucidation of the routes where this
enzyme is involved in plant defense mechanisms. This gene, which in soybean is
about 1.2 kb, is also found in other crops, such as Nicotiana tabacum (EU294210.1),
Brassica oleraceae (AF337546), Arabidopsis thaliana (NM_123753) and Ginkgo
biloba (AY292526).
Acknowledgments
The authors are grateful to Embrapa Algodão for financial support and to CAPES for
the grant.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
75
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Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
79
List of Figures
Figure 1. Differentially displayed bands in RT-PCR of total RNA extracted from
inoculated and control cotton cultivars using follows primers: OPH 03 (A), OPP 06
(B), OPV 10 (C), OPG 05 (D). AC- BRS Antares-control, AI- BRS Antares-inoculated,
PCCNPA Precoce I-control, PI- CNPA Precoce I-inoculated. Marker: Ladder plus
1Kb (Invitrogen). Arrows: down regulation, up regulation, actived
Figure 2. Differentially displayed bands in RT-PCR of total RNA extracted from
inoculated and control cotton cultivars using follows primers: OPE 18 (A), OPL 03
(B), OPA 4 (C), OPW 13 (D). AC- BRS Antares-control, AI- BRS Antares-inoculated,
PCCNPA Precoce I-control, PI- CNPA Precoce I-inoculated. Marker: Ladder plus
1Kb (Invitrogen). Arrows: down regulation, up regulation, actived
Figure 3. Result of BLAST alignment between tV10-200bp and GmChl 3 gene
(AB181949.1) that codifies to Chlorophyllase III, in soybean (Glycine max L.).
Figure 4. Dot-blot analysis in inoculated and control cotton cultivars for identification
of a specific transcript related to disease resistance. AC- BRS Antares, control, AI-
BRS Antares, inoculated, PC- CNPA Precoce I, control, PI- CNPA Precoce I,
inoculated. Dai- days after inoculation.
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80
List of Table
Table 1. Differentially expressed transcripts obtained with RAPD primers in cotton
cultivars submitted to ramulosis.
Primers Sequence Transcripts
Down-
regulated
Up-
regulated
Active
OPA V10 GGACCTGCTG 4 0 5
OPA G05 CTGAGACGGA 3 2 2
OPA H03 AGACGTCCAC 2 1 1
OPA E18 GGACTGCAGA 2 0 1
OPA L03 CCAGCAGCTT 0 0 0
OPA P06 GTGGGCTGAC 1 0 1
OPA A04 AATCGGGCTG 0 0 0
OPA W13 CACAGCGACA 0 0 0
OPA G04 AGCGTGTCTG 0 0 0
OPA X11 GGAGCCTCAG 0 0 0
Total - 12 3 10
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81
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82
A
M AC AI PC PI
M AC AI PC PI
M AC
AI PC PI
C
D
B
M AC AI PC PI
1.0
0.85
1.0
0.85
1.0
0.85
1.0
0.85
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
83
dbj|AB181949.1| Glycine max GmChl 3 gene for Chlorophyllase 3,
complete cds. Length=1229.
Score = 102 bits (112) Expect = 5e-19
Identities = 76/88 (86% Gaps = 12/88 (13%)
dbj|AB181949.1|
24 TAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGG-CCGACGTCGCATGCTC----------CCGG 72
||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| ||||
V10-200p 5 TAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCACCGG 64
dbj|AB181949.1|
73 CCGCCATGGCGGCCGCGGG-ATTCGATT 99
||||||||||||||||||| ||||||||
V10-200p 65 CCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATT 92
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
84
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
86
CONCLUSÕES GERAIS
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
87
CONCLUSÕES GERAIS
Os teores de prolina e catalase devem ser utilizados como marcadores
bioquímicos para a seleção de genótipos de algodão resistentes a ramulose
Os compostos carboidratos solúveis e proteínas totais não devem ser
recomendados como marcadores bioquímicos para identificação de genótipos
de algodão resistentes a ramulose.
Transcritos diferencialmente expressos podem ser identificados por meio de
marcadores do tipo RAPD em plantas de algodão inoculadas com o fungo
Colletotrichum gossypii South var. cephalosporioides A.S. Costa.
O gene da clorofilase 3 pode se constituir em um marcador funcional para
seleção de plantas resistentes submetidas a estresse biótico.
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88
ANEXOS
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
89
INSTRUÇÕES AOS AUTORES - FITOPATOLOGIA BRASILEIRA
ISSN 0100-4158 versão impressa
ISSN 1678-4677 versão online
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Preparação de manuscritos
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Os manuscritos devem ser apresentados em três vias, original e duas cópias, digitados em
espaço duplo, com margens de 3 cm. As páginas devem ser numeradas e as linhas devem
ter numeração contínua, inclusive da página inicial. Recomenda-se a utilização da fonte
"Times New Roman", com tamanho de fonte 11. O texto deve ser escrito no tempo passado
do verbo na forma impessoal. O autor deve seguir seu próprio estilo, tendo em mente a
concisão e a clareza do texto. Para orientar-se em relação ao estilo e formato dos diversos
tipos de trabalhos, recomenda-se aos autores consultar fascículos recentes da revista e
levar em conta as orientações sobre cada seção do manuscrito que seguem.
Página inicial - Deve conter o título, nome
dos autores, endereço da instituição,
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90
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do trabalho. Em caso de trabalhos resultados de cursos de Pós-Graduação, a instituição e
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150 caracteres; é apresentado em letra inicial maiúscula e nomes científicos em itálico, sem
indicação das autoridades. Os autores devem lembrar que o título é a parte do trabalho que
é lido com mais freqüência e que recebe mais atenção.
Nomes dos autores - O primeiro e último nome dos autores devem ser apresentados por
extenso, abreviando para a primeira letra os nomes de família intermediários e pré-nomes,
mas não os nomes como Júnior, Filho, Neto.
Filiação institucional dos autores - Indicar, por extenso, o nome da instituição a que o
autor está filiado, por ordem de hierarquia crescente, como Departamento, Laboratório ou
Seção; unidade como Faculdade, Escola, Centro, Instituto ou Núcleo; instituição como
Universidade, Secretaria de Estado ou Empresa; seguido de CEP, cidade, Estado e
endereço de E-mail. Não usar abreviações do nome de instituições, nem traduzir seu nome.
Todos os elementos do mesmo endereço são separados por vírgula, entre endereços o
separador é o ponto-e-vírgula.
Referência do trabalho - Seguir as normas de referência bibliográfica.
Resumo - Deve condensar o conteúdo, expondo objetivos, indicar materiais e métodos, os
principais resultados e conclusões em não mais do que 250 palavras, tudo escrito em um
único parágrafo.
Palavras-chave adicionais - não devem repetir termos que se acham no título, podem ser
constituídos de frases curtas e não só de palavras e devem ser separadas por vírgula.
Abstract - Além de seguir as recomendações do resumo, não ultrapassando 250 palavras,
deve ser uma tradução próxima ao resumo. Não deverá ter termos abreviados, comuns na
linguagem local, como por exemplo, SP para São Paulo, ou NE para nordeste etc., pois será
lido por pessoas de outros países e será usado por serviços de indexação que dão
visibilidade para a produção científica nacional. É geralmente a parte que mais recebe
atenção.
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91
Additional Keywords - Representam a tradução das palavras-chave para a língua inglesa.
Introdução - Deve apresentar uma visão concisa do estado atual do conhecimento sobre o
assunto que o manuscrito aborda e enfatizar a relevância do estudo, sem constituir-se em
extensa revisão. Indica, na parte final, claramente os objetivos da pesquisa.
Material e Métodos - Esse item sempre deve conter informações suficientes para que
outros possam repetir o trabalho. Esta seção pode ser dividida por subtítulos, indicados em
negrito, em número parcimonioso. Métodos devem ser brevemente descritos, mesmo sendo
comuns ou já descritos em outros veículos de publicação, indicando a fonte. Métodos novos
ou modificados devem ser apresentados com detalhes, que garantam a reprodutibilidade da
pesquisa.
Resultados - Deve descrever, de modo conciso, a lógica da investigação e suas
descobertas. No texto, não se deve repetir, mas apenas fazer referência, aos dados
ilustrados em tabelas ou gráficos e figuras. A interpretação dos resultados pertence à
Discussão. A seção pode ter seções, indicadas por sub-títulos descritivos concisos e em
negrito. Uma análise estatística que evidencie a significância dos dados é, geralmente,
indispensável.
Discussão - Deve relacionar os resultados com trabalhos anteriores e interpretá-los. Pode
levantar hipóteses baseadas nos dados do trabalho relatado e pode repetir partes da
Introdução e recapitular aspectos essenciais da seção de Resultados. As seções Resultados
e Discussão podem ser combinadas e divididas em subseções, com subtítulos concisos e
descritivos. NÃO HÁ CONCLUSOES
Agradecimentos - Devem fazer referência a apoios recebidos de qualquer natureza, sejam
esses de natureza financeira, indicando o doador de bolsas, a procedência e código de
processo de recursos financeiros recebidos para execução de projetos, ou de natureza
intelectual, indicando infra-estrutura, materiais ou pessoas, especificando a contribuição
recebida.
Referências Bibliográficas - Devem seguir as normas para citação no texto e na seção
própria. Normas para citação no texto: Souza & Silva (2005) ou (Souza & Silva, 2005 NÃO É
MAIUSCULA!!. Quando houver mais de dois autores, usar a forma reduzida a exemplo de
Souza et al NÃO É ITALICO (2005) ou (Souza et al., 2005). Referências a trabalhos dos
mesmos autores, no mesmo ano, devem ser diferenciadas no texto e na lista de referências
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92
por letras a, b, c, etc. como, por exemplo, Silva (1995 a, b) ou Silva et al. (1995a, b).
Na seção própria, as referências bibliográficas devem ser listadas em ordem alfabética do
sobrenome. Referências com dois ou mais autores devem ser listados na ordem
cronológica, depois de todos os trabalhos do primeiro autor. A referência deve incluir o nome
de todos os autores, o título, o nome do periódico por extenso, as páginas inicial e final. A
seguir, exemplos específicos.
Artígo
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CÂMARA, M.P.S. Taxonomy of Ophiosphaerella, Paraphaeosphaeria and Phaeosphaeria: a
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BHAT, M.G. Studies on inheritance of resistance to downy mildew Peronosclerospora sorghi
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Agricultural Science. 1981.
GIMENES-FERNANDES, N. Método de avaliação e herança da resistência a
Peronosclerospora sorghi (Weston & Uppal) C.G. Shaw em sorgo [Sorghum bicolor (L.)
Moench]. Tese de Livre Docência. Jaboticabal SP. Universidade Estadual Paulista. 1981.
Resumos e Abstracts em evento científico
FREITAS-ASTUA, J., LOCALI, E.C., ANTONIOLI, R.; ASTUA-MONGE, G., TARGON, M.L.P.
& MACHADO, M.A. Multiplex RT-PCR for the detection of the most important citrus viruses
in Brazil. Proceedings, X. International Congress of Citriculture, Agadir. 2004. p. 95.
BETTIOL, W., SILVA, H.S.A, GALVÃO, J.A.H. & FURLANI, P.R. Controle de oídio em cultivo
hidropônico de alface com leite de vaca. Resumos, 8ª. Reunião de Controle Biológico de
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PAWAR, M.N., FREDERIKSEN, R.A., MUGHOGHO, L.K. & BONDE, M.R. Survey of the
virulence of Peronosclerospora sorghi isolates from India, Ethiopia, Nigeria, Texas (USA),
Honduras, Brazil and Argentina. Phytopathology 75:1374. 1985. (Abstract)
LAU, D., BROMMONSCHENKEL, S.H., CARVALHO, E.C.S., LIMA, G.S.A. & ZERBINI
JUNIOR, F.M. Analysis of the Sw-5 mediated resistance response to tospovirus species.
Vírus: Reviews and Research 4:154. 1999. (Abstract)
LIMA, C.S., PFENNING, L.H., COSTA, S.S., CAMPOS, M. A. & LESLIE, J.F. Amplified
Length Polymorphisms Analysis of Fusarium species associated with mango malformation.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
94
Fitopatologia Brasileira 30(Supl.):74. 2005. (Resumo)
Trabalhos aceitos para publicação, mas ainda não publicados, podem ser citados como "no
prelo" na lista de referências. No momento da entrega da versão final do manuscrito, deve
ser apresentada a evidência de aceitação. Trabalhos ainda não aceitos podem ser citados
no texto, como resultados não publicados, citando as iniciais e o sobrenome de todos os
autores; entretanto, sua utilização não é recomendada; referências a "manuscritos
submetidos", relatórios; "mimeografados" e "manuscritos em preparação" não são
permitidas como não o são as citações de citações. Informações utilizadas proveniente de
"Comunicação Pessoal" devem ser comprovadas por carta das pessoas citadas.
Ilustrações: o tamanho da página impressa da revista é de 176 x 235 mm e o texto,
apresentado em duas colunas de 85 x 235 mm. A diagramação das fotos e gráficos deverá
ter essas dimensões por base. Procure calcular as eventuais reduções ou ampliações que
as figuras sofrerão tendo em mente essas dimensões. As ilustrações deverão seguir o
mesmo estilo; devem ser "emolduradas" por linhas simples e vir acompanhadas das
respectivas legendas e no verso identificadas com o nome dos autores. Os gráficos deverão
ser feitos em papel branco.
Tabelas - deverão ostentar um título conciso e serem auto-explicativas, sem referência ao
texto. Notas explicativas de rodapé devem ser curtas e indicadas preferentemente por
símbolos ou letras. As linhas horizontais só devem aparecer separando o cabeçalho da
tabela do título e do conteúdo da tabela, e uma ao final da tabela. A linha que separa o
cabeçalho do título deve ser dupla. Não incluir linhas verticais, nem mesmo no cabeçalho.
As linhas verticais que separam as colunas não devem aparecer, nem mesmo no cabeçalho.
Evite tabelas muito grandes e que apresentem colunas e/ou linhas sem dados. Devem ser
impressas em espaço duplo e em folha separada e numeradas na ordem em que são
citadas no texto.
Figuras - devem ser empregadas seletivamente para demonstrar pontos importantes e
específicos; devem levar em conta a clareza e a economia de espaço. As legendas devem
vir em folhas separadas e não devem repetir a seção de Métodos. Elas precisam ser
numeradas na ordem que aparecem no texto e partes de uma única figura devem ser
designadas (a), (b), etc. e etiquetadas como tal na figura. Não serão aceitas figuras que
dupliquem informações encontradas em tabela e / ou texto.
Desenhos - devem ter qualidade que permita a reprodução direta e serem apresentados em
tamanho duas vezes o tamanho em que aparecerão na página impressa. Podem ser
submetidos como: (a) desenho original de linhas em preto sobre papel branco; (b) fotografia
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
95
direta do original e (c) desenhos produzidos por programa de computador, impressos com
qualidade para reprodução direta. Não são aceitos gráficos e/ou desenhos excessivamente
elaborados, com desnecessária apresentação em três dimensões, quando se referirem a
duas variáveis. O tamanho dos símbolos e a espessura das linhas devem ser escolhidos,
tendo-se em mente a clareza e a proporção.
Fotografias - as fotos deverão ser em preto-e-branco, em resolução mínima de 300dpi,
apresentadas em formato JPEG e no tamanho aproximado em que aparecerão na revista.
Se houver várias fotos, procure montá-las formando um conjunto, igualando ao máximo
suas tonalidades; não deixe espaços em branco entre as fotos. No caso de micrografias,
indicar o aumento com uma barra, na própria foto. Numerar as fotos consecutivamente na
ordem em que elas aparecem no texto. Para reprodução de fotos coloridas, é cobrada dos
autores uma contribuição no valor de R$ 300,00 por página, cobrindo o custo de produção
do fotolito de separação de cores.
Reações sorológicas e padrões eletroforéticos - devem ser submetidos na forma de
fotografias de bom contraste, não sendo aceitáveis desenhos representativos.
Gráficos e imagens geradas digitais - devem ser gerados em programas compatíveis com
o sistema Windows, de preferência com "Corel Draw". Levar em conta as dimensões da
página da revista e considerar a proporcionalidade das figuras em relação ao tamanho das
letras, números e símbolos. Evite elaborar demais os gráficos, com um número excessivo de
linhas, barras ou símbolos.
PROCESSAMENTO DO MANUSCRITO
O Presidente da Comissão Editorial designará um Editor Associado para a análise de cada
manuscrito, após examiná-lo para assegurar-se que o tema tratado está de acordo com o
escopo da revista Fitopatologia Brasileira. No parecer de pré-análise, o Editor Associado
indicará dois ou três revisores ad hoc do manuscrito, recomendará sua devolução aos
autores para modificação de conteúdo ou formato, ou rejeitará o manuscrito na forma
apresentada. Sobre os trabalhos pré-selecionados, os revisores ad hoc apresentarão à
Comissão Editorial pareceres avaliando a originalidade e relevância do trabalho, adequação
da metodologia empregada e coerência em relação aos objetivos indicados, recomendando
ou não o manuscrito para publicação. Independente de seu julgamento, espera-se dos
revisores que apresentem sugestões para o aprimoramento do trabalho ou até mesmo
indicação de experimentos adicionais que devem ser feitos em apoio dos fatos relatados.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
96
Estes pareceres serão enviados pelo Presidente da Comissão Editorial ao Editor Associado
que os analisará e emitirá parecer conclusivo sobre o manuscrito, numa das seguintes
formas: (a) aceito sem modificações; (b) aceito com modificações ou (c) não aceito para
publicação. Por modificações entende-se: atualização bibliográfica, mudanças na
metodologia, realização de experimentos complementares etc. A aceitação com
modificações implica que o manuscrito precisa sofrer correções que podem ser feitas pelo
autor em não mais do que três meses do recebimento do manuscrito com as correções. Em
qualquer uma das hipóteses, o manuscrito é devolvido ao autor para conhecimento dos
pareceres, da opinião do Editor Associado e da decisão final do Presidente da Comissão
Editorial. No caso das hipóteses (a) e (b), o autor deve produzir uma versão final do
manuscrito, incorporando as sugestões, realizando as edições necessárias e promovendo
as reformulações indicadas. Duas cópias desta versão final devem ser enviadas à Comissão
Editorial, acompanhada de um CD ou disquete onde está gravada a versão corrigida do
manuscrito e os elementos gráficos, em arquivos separados. Manuscritos de trabalhos não
aceitos para publicação não serão devolvidos aos autores.
Utilização da versão gravada em CD ou disquete - as seguintes orientações devem ser
consideradas, quando a versão final for remetida. O CD ou disquete deve ser etiquetado,
indicando claramente o número de registro do manuscrito, nome do primeiro autor, bem
como o nome do arquivo. É da inteira responsabilidade do autor assegurar que a versão
gravada em disquete seja a reprodução exata da cópia em papel aceita para publicação.
Disquetes não serão devolvidos a não ser que isto seja solicitado pelo autor. É de inteira
responsabilidade do autor assegurar que a versão gravada seja a reprodução exata da
cópia em papel aceita para publicação. CD e disquetes não serão devolvidos a não ser que
seja solicitado pelo autor.
Prova Tipográfica - uma cópia da prova tipográfica do manuscrito será remetida para o
autor para correspondência, que deverá fazer as possíveis e necessárias correções e
devolvê-la em 48 horas. Correções extensivas do texto do manuscrito, cujo formato e
conteúdo já foram aprovados para publicação, não são aceitáveis. Alterações, adições,
deleções e edições implicarão em novo exame do manuscrito pela Comissão Editorial e
produção de outra prova tipográfica.. Erros e omissões presentes no texto da prova
tipográfica, corrigido e devolvido à Comissão Editorial, são de inteira responsabilidade do
autor.
Custos - uma taxa de tramitação de R$50,00 é devida para cada trabalho submetido para
publicação e deve ser remetida juntamente com o manuscrito. Esta taxa não será cobrada
dos autores das revisões.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
97
PADRONIZAÇÕES
Abreviações não convencionais devem ser evitadas e, em caso de serem usadas, devem
ser definidas na sua primeira aparição no texto. As abreviações convencionais serão
tratadas nos tópicos que seguem. Quantidades, unidades e símbolos, no sistema métrico,
devem seguir as normas internacionais; mantendo, sempre, um espaço entre um número e
a unidade, como no exemplo 37 oC. O nome de cultivares deverá vir entre apóstrofes ou
precedido pelo nome cultivar ou cv., a exemplo de 'Carioca', a cultivar Carioca ou a cv.
Carioca.
Nomes científicos de organismos devem ser escritos em itálico, após o nome comum do
organismo. Em sua primeira aparição no corpo principal do texto, no Resumo e no
"Abstract", o nome genérico e específico será citado por extenso. As citações subseqüentes
devem ser abreviadas no nível genérico (Ex. Sclerotium rolfsii Sacc. como S. rolfsii). A
autoridade do nome científico de seres vivos deve ser citada no corpo principal do texto, na
ocasião de sua primeira aparição. A citação será feita de acordo com as normas da
nomenclatura binomial latina, de acordo com autoridades internacionais, disponíveis em
páginas na internet; para plantas no The International Plant Names Index
(http://www.ipni.org/index.html), e para fungos no Index Fungorum
(http://www.speciesfungorum.org/Names/Names.asp).
Os nomes das espécies de vírus devem seguir as normas estabelecidas pelo ICTV
(International Comittee on Taxonomy of Viruses), de acordo com o Código Internacional de
Classificação e Nomenclatura publicado no 8º. Relatório do ICTV (2005). Nomes de
espécies são nomes científicos e, portanto, devem ser escritos em inglês, de forma análoga
aos nomes científicos de plantas e outros organismos vivos, escritos em latim. Nomes
científicos não são traduzidos, mas em casos nos quais o nome do vírus em português é
tradicionalmente utilizado, este pode aparecer na primeira citação, acrescentando-se, entre
parênteses, o nome em inglês em itálico, seguido da sigla definidos pelo ICTV. Por exemplo:
vírus do mosaico dourado do feijoeiro (Bean golden mosaic virus, BGMV); vírus da mancha
anelar do mamoeiro (Papaya ringspot virus, PRSV). A seguir, usar apenas o nome científico
em inglês ou a sigla para se referir ao vírus. Os nomes científicos e suas siglas podem ser
consultados no 8º. Relatório do ICTV, e no endereço www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/. Os
nomes das categorias taxonômicas como ordem, família, subfamília e gênero devem ser
escritos em itálico, com a primeira letra maiúscula, precedidos do termo da unidade
taxonômica. Exemplos: família Bunyaviridae, gênero Tospovirus. Na primeira citação de
uma espécie de vírus no texto, acrescentar o nome da família e/ou gênero. Exemplo: vírus
do mosaico comum do feijoeiro (Bean commom mosaic virus, BCMV, família Potyviridae,
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
98
gênero Potyvirus).
Peso molecular e Daltons - O uso correto do peso molecular de uma proteína é, por
exemplo, 54.000. O uso correto da massa molecular da mesma proteína e 54.000 Da ou 54
kDa.
Sistema métrico - Colocar todas as unidades no sistema métrico, usando L, mL, mL, µL.
Unidades de tempo - Quando antecedida de números, usar as unidades de tempo com as
seguintes abreviações: segundos (s), minutos (min) e horas (h).
Defensivos agrícolas - Utilizar apenas nomes técnicos e/ou princípios ativos. Não é
recomendável a menção de nomes comerciais de produtos ou de empresas que os
produzem e que sugira sua utilização. As fórmulas químicas devem ser escritas em uma
linha e obedecer à nomenclatura atualmente mais aceita."
CASOS OMISSOS
A orientação sobre situações não previstas nestas normas será dada pela Comissão
Editorial, no curso do exame de cada manuscrito submetido à publicação em Fitopatologia
Brasileira
Tipos de trabalhos
Fitopatologia Brasileira publica trabalhos originais em formato de Artigo, Comunicação,
Nota Fitopatológicas, Revisão (preparada por autores convidados) e Carta ao Editor,
conforme descrito abaixo. Todos os trabalhos serão avaliados preliminarmente pela
Comissão Editorial e por Editor Associado da área específica do manuscrito. Na pré-análise,
o trabalho pode ser aceito para revisão ou devolvido aos autores para modificação da forma.
Manuscritos aceitos para revisão serão submetidos à análise de, pelo menos, dois
consultores ad hoc, escolhidos dentre os especialistas da área do trabalho submetido,
sócios ou não da Sociedade Brasileira de Fitopatologia (SBF). A aceitação ou rejeição de
um trabalho será decidida pelo Editor Associado, baseado na avaliação dos pareceres dos
consultores ad hoc e da sua própria análise, em consonância com o Presidente da
Comissão Editorial. Revisão e Carta ao Editor serão objetos de análise do Presidente da
Comissão Editorial que os submeterá à análise de dois consultores, preferencialmente entre
os Editores Associados.
Artigo - Relata um trabalho original completo em que a reprodutibilidade dos resultados está
claramente estabelecida. É recomendado aos autores que preparem seus manuscritos
considerando que eles deverão ter, aproximadamente, sete páginas impressas
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
99
(15-20 digitadas em espaço duplo), incluindo em torno de 30 referências bibliográficas,
quatro figuras e/ou gráficos e quatro tabelas. Conterá: Título, nome dos autores, filiação
institucional, data de aceitação, autor para correspondência, referência do trabalho, resumo,
de no máximo 250 palavras, palavras-chave, citação, abstract (com título em inglês),
Introdução, Material e Métodos, Resultados, Discussão, Agradecimentos (fazendo referência
a apoios recebidos de natureza financeira como bolsas, projetos etc. ou intelectual),
Referências Bibliográficas, Tabelas e Figuras. Os itens Resultados e Discussão podem ser
apresentados juntos ou em separado. Não faz parte do formato de FB uma seção de
Conclusões.
Comunicação - Relata resultados conclusivos e não dados preliminares. É um formato
alternativo para descrever, de forma mais concisa, resultados parciais de um trabalho mais
amplo, ou o relato de resultados conclusivos baseados em um menor volume de dados. O
texto completo não terá mais que cinco páginas impressas (12-15 digitadas em espaço
duplo) e não deverá ter mais que duas figuras/gráficos, uma tabela e não mais que 15
referências bibliográficas. A Comunicação conterá as informações das seções de um artigo,
mas não terá os títulos Introdução, Material e Métodos, Resultados e Discussão.
Nota Fitopatológica - Destina-se à divulgação rápida de informações como primeira
constatação numa região de doença já conhecida; ensaios de defensivos; descrição de
cultivares resistentes e registros importantes para a vigilância fitossanitária (quarentena). O
texto e figura ou tabela deverão estar contidos em uma página impressa, duas digitadas em
espaço duplo ou três, quando não tiver elementos ilustrativos como figura ou tabela. Deverá
conter, além dos elementos comuns do título e do texto, um curto Abstract ou Resumo
quando redigido em inglês. As referências bibliográficas devem ser incorporadas no texto,
de forma reduzida, incluindo apenas o primeiro autor, veículo de publicação, volume, página
inicial e ano.
Revisão - Apresentada por autores convidados para elaborar revisão sobre um assunto
relevante ou em grande evidência. Sua estrutura é mais livre do que a dos outros tipos de
trabalho e não tem limite definido de páginas, ilustrações e referências bibliográficas.
Carta ao e do editor - Tem como objetivo tratar, de forma menos formal, assunto técnico-
científico ou de outra natureza, de interesse da Sociedade Brasileira de Fitopatologia. Sua
publicação ficará a critério do Presidente da Comissão Editorial, ouvindo a Comissão
Editorial.
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100
Submeter um manuscrito
A Comissão Editorial solicita aos autores, que pretendem submeter um manuscrito, preparar
os documentos listados a seguir. A Comissão aceita o envio da documentação por E-mail.
•
Texto em três vias, digitado em espaço duplo, paginado e com numeração de linhas
contínua;
•
Disquete ou CD contendo o texto original e elementos gráficos como tabelas, figuras,
fotografias e microfotografias em arquivos separados;
•
Carta de encaminhamento com a anuência de todos os autores;
•
Cheque nominal ou comprovante de depósito referente à taxa de tramitação no valor
de R$ 50,00; Conta para depósito da taxa de tramitação: SBF, Banco do Brasil,
Agência 0364-6, cc. 36.981-0
•
Encaminhar para o endereço:
Fitopatologia Brasileira - Comissão Editorial
Universidade Federal de Lavras
Cx. Postal 3066
37200 000 Lavras MG
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101
INTRUÇÕES PARA AUTORES - EUROPEAN JOURNAL OF PLANT PATHOLOGY
Online Manuscript Submission
Springer now offers authors, editors and reviewers of European Journal of Plant
Pathology the option of using our fully web-enabled online manuscript submission and review
system. To keep the review time as short as possible (no postal delays!), we encourage
authors to submit manuscripts online to the journal‘s editorial office. Our online manuscript
submission and review system offers authors the option to track the progress of the review
process of manuscripts in real time. Manuscripts should be submitted to:
http://ejpp.edmgr.com
The online manuscript submission and review system for European Journal of Plant
Pathology offers easy and straightforward log-in and submission procedures. This system
supports a wide range of submission file formats: for manuscripts - Word, WordPerfect, RTF,
TXT and LaTex; for figures - TIFF, GIF, JPEG, EPS, PPT, and Postscript.
NOTE: By using the online manuscript submission and review system, it is NOT necessary
to submit the manuscript also in printout + disk. In case you encounter any difficulties while
submitting your manuscript on line, please get in touch with the responsible Editorial
Assistant by clicking on “CONTACT US” from the tool bar.
Electronic figures
Electronic versions of your figures must be supplied. For vector graphics, EPS is the
preferred format. For bitmapped graphics, TIFF is the preferred format. The following
resolutions are optimal: line figures - 600 - 1200 dpi; photographs - 300 dpi; screen dumps -
leave as is. Colour figures can be submitted in the RGB colour system. Font-related
problems can be avoided by using standard fonts such as Times Roman, Courier and
Helvetica.
Colour figures
Colour figures are free of charge. Please indicate at submission which figures should be
printed in colour.
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Language
We appreciate any efforts that you make to ensure that the language is corrected before
submission. This will greatly improve the legibility of your paper if English is not your first
language.
General
No page charges are applicable, but prospective authors should condense their text
as much as possible. The European Journal of Plant Pathology welcomes research papers,
review papers and short communications. Fifty offprints will be supplied free of charge.
Research papers describing original research should address biological problems.
They should contain a novel and well formulated hypothesis, a sound experimental
approach, results that confirm or reject the hypothesis and should offer novel insight into the
existing body of knowledge. Research papers should not exceed twenty pages of printed
text, including tables, figures and references (one page of printed text = approximately 600
words).
The Short communication format is intended for presentation of important
observations that can be clearly described in an abbreviated format. For example, molecular
data useful for typing pathogens or the first report of preliminary data would be suitable for
this section. Short descriptions of genes isolated from pathogens and pest organisms, and of
plant genes with a putative function in plant−pathogen interactions can also be presented in
the Short communication format. Short communications should contain firm data and will be
refereed. A short communication should have an abstract and should not exceed four printed
pages in total. There are no subheadings and a description of Materials and methods should
be integrated in the text. Authors who wish to submit a review should first contact the
Editorial Office or the Editor−in−Chief, since only Mini reviews on topical issues will be
considered for publication. Reviews should not exceed 12 pages of printed text, including
Tables, Figures, and References.
Papers already published or in press elsewhere will not be accepted. If any part of the
subject matter or experiments included in a manuscript submitted to the journal has been the
subject of any prior publication, this prior publication must be identified. Papers of restricted
local importance will not be accepted. Manuscripts should be written in standard English.
Manuscripts should be typed clearly, double−spaced throughout on with margins of 3−5 cm.
All pages (including the Tables, Figures, Legends and References) should be numbered
consecutively. As a guide for acceptable style please consult recent issues of the journal and
the Council of Biology Style Manual, 6th edition (1987), available from the American
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
103
Institute of Biological Sciences, 9650 Rockville Pike, Bethesda, MD 20814, USA. Failure to
comply with these instructions will delay consideration of the manuscript.
Authors are invited to submit the names of at least four suitable referees who would be
competent to provide a review of their paper; however the final choice of referees will be at
the discretion of the editor. The manuscript should be arranged in the following order:
Title Page
(page 1)
the title should be brief but informative.
the Author‘s full name (if more than one, use ’and‘ before the last name and indicate to whom
correspondence should be addressed).
Affiliation(s)/Address(es) should be complete, and should include a fax number and E−mail
address for correspondence.
Key words/Abstract/Abbreviations
(page 2)
Key words (a maximum of 6, in alphabetical order, suitable for indexing). Key words should
differ from words mentioned in the title. Abstract (brief and informative, not to exceed 250
words). No abbreviations should be used in the abstract. Abbreviations (arranged
alphabetically; only those which are not familiar and/or commonly used).
Main Text
The text must be developed under the following headings:
- Introduction
- Materials and methods
- Results
- Discussion
The relative importance of headings and subheadings should be clear.
The approximate location of Figures and Tables should be indicated in the margin.
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
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References
Authors are requested to limit the number of references listed in full scientific papers and
short communications to 35. This limit may be exceeded in review articles, or at the
discretion of the editor where the subject matter of a paper justifies more than the limit.
1. Journal article: Barlow, D. H. & Lehman, C. L. (1996). Advances in the psychosocial
treatment of anxiety disorders. Archives of General Psychiatry, 53, 727-735
2. Book chapter: Cutrona, C. E. & Russell, D. (1990). Type of social support and specific
stress: Towards a theory of optimum matching. (In I.G. Sarason, B. R. Sarason, & G. Pierce
(Eds.), Social support: An interactional view (pp. 341-366). New York: Wiley.)
3. Book, authored: Capland, G. (1964). Principles of preventive psychiatry. (New York: Basic
Books)
4. Book, edited: Felner, R. D., Jason, L. A., Moritsugu, J. N. & Farber, S. S. (Eds.) (1983).
Preventive psychology: Theory, research and practice. (New York: Pergamon Press)
5. Paper presented at a conference: Phelan, J. C., Link, B. G., Stueve, A. & Pescosolido, B.
A. (1996, November). Have public conceptions of mental health changed in the past half
century? Does it matter? (Paper presented at the 124th Annual Meeting of the American
Public Health Association, New York)
6. Patent:
Name and date of patent are optional
Norman, L. O. (1998) Lightning rods. US Patent 4,379,752, 9 Sept 1998
7. Dissertation:
Trent, J.W. (1975) Experimental acute renal failure. Dissertation, University of California
8. Published and In press articles with or without DOI:
8.1 In press
Wilson, M., et al. (2006). References. In: Wilson, Mm (ed) Style manual. Springer. (Berlin
Heidelberg New York: Springer) (in press)
8.2. Article by DOI (with page numbers)
Slifka, M. K.& Whitton, J. L. (2000). Clinical implications of dysregulated cytokine production.
Journal of Molecular Medicine 78,74–80. DOI 10.1007/s001090000086
8.3. Article by DOI (before issue publication with page numbers)
Slifka, M. K. & Whitton, J, L, (2000), Clinical implications of dysregulated cytokine production.
Journal of Molecular Medicine (in press). DOI 10.1007/s001090000086
8.4. Article in electronic journal by DOI (no paginated version)
Slifka, M. K.& Whitton, J. L. (2000). Clinical implications of dysregulated cytokine
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
105
production. Journal of Molecular Medicine. DOI 10.1007/s801090000086
9. Internet publication/Online document
9.1. Internet articles based on a print source
VandenBos, G., Knapp, S., & Doe, J. (2001). Role of reference elements in the selection of
resources by psychology undergraduates [Electronic version]. Journal of Bibliographic
Research, 5, 117-123.
VandenBos, G., Knapp, S., & Doe, J. (2001). Role of reference elements in the selection of
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9.3. Article in an Internet-only newsletter
Glueckauf, R. L., Whitton, J., Baxter, J., Kain, J., Vogelgesang, S., Hudson, M., et al. (1998,
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News,2(2). Retrieved from http://www.telehealth.net/subscribe/newslettr4a.html1
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early supervisory experience in supervisor performance. Journal of Applied Psychology, 78,
443-449. Retrieved October 23, 2000, from PsycARTICLES database
Figures
All photographs, graphs and diagrams should be referred to as a 'Figure' and they should be
numbered consecutively (1, 2, etc.). Multi-part figures ought to be labelled with lower case
letters (a, b, etc.). Please insert keys and scale bars directly in the figures. Relatively small
text and great variation in text sizes within figures should be avoided as figures are often
reduced in size. Figures may be sized to fit approximately within the column(s) of the
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
106
journal. Provide a detailed legend (without abbreviations) to each figure, refer to the figure in
the text and note its approximate location in the margin. Please place the legends in the
manuscript after the references.
Tables
Each table should be numbered consecutively (1, 2, etc.). In tables, footnotes are preferable
to long explanatory material in either the heading or body of the table. Such explanatory
footnotes, identified by superscript letters, should be placed immediately below the table.
Please provide a caption (without abbreviations) to each table, refer to the table in the text
and note its approximate location in the margin. Finally, please place the tables after the
figure legends in the manuscript.
Virus Nomenclature
ICTV approved guidelines should be used. ICTV uses italics for virus names when these are
approved Species in the Genus. Examples from the potyviridae: Papaya ringspot virus
(PRSV) as a Species in the Genus. Synonyms for Papaya ringspot virus, such as
Watermelon mosaic virus 1 are not written in italics. Tentative Species in the Genus, i.e.
Alstromeria streak virus (AlStV) are also not in italic.
Abbreviations and Units
SI units should be used, e.g: mg, g, km, m, cm, mm, ppm, cpm, Ci(Curie), l(litre), ml,
s(second), min(minute), h(hour), mol, m−3 , kg per ha or kg ha−1. The minus index form is
always to be used in Tables.
- Use mgl−1, not mg/l.
- If a non−standard abbreviation is to be used extensively, it should be defined in full on page
2 and follow the abstract.
Proofs
Proofs will be sent to the corresponding author by e−mail. Your response, with or without
corrections, should be sent within 72 hours.
Do‘s
1. Consistency. Be absolutely consistent and check the use of punctuation, abbreviations,
capitals and lower case in headings, spelling, etc. If possible, use the spelling checker on
your computer.
2. Special characters. If the ASCII character set or the character set(s) of your
wordprocessing package does not contain the special characters you need, key in a code
between angle brackets,
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão em... Silva, F.A.C.
107
3. and use this each and every time you want the character to appear. Make the code
self−explanatory.
Note: Always supply us with a list of the codes that you have used!
4. Headings. Start headings etc. flush left, with two space lines above (i.e. three Hard
Returns) and one space line below (two Hard Returns). Distinguish different levels of
headings and be consistent.
5. Paragraphs. Indent all paragraphs with a [TAB] code, and separate them from one another
with one Hard Return.
6. Block quotations should be indented with an [Indent] code and should have one space line
(i.e. two Hard Returns) above and below.
7. Equations. One−line equations without fractions can be typeset from the diskette when
they are keyed in as plain text. Other equations can not be used from the diskette: they will
be typeset manually from the hard copy.
8. References. Strictly follow the Instructions for Authors.
Don‘ts
1. Hyphenation. Do not hyphenate words at the end of a line. Use only one hyphen for words
such as ‘‘well−being‘‘, and ‘‘re−do‘‘ and use two hyphens for sequences of dates and years
such as ‘‘conference dates are 12−15 September, 1992‘‘, ‘‘age groups between 20−30 years
are welcome‘‘, and Page number indications in References, e.g. ‘‘pp. 240−243‘‘.
2. Hard Returns. Do not use Hard Returns except when absolutely necessary, such as at the
end of paragraphs, headings, etc. Otherwise, let the word wrap feature of your
wordprocessor do this work for you.
3. TAB feature and Spacebar. If you need more than one space between two items, e.g.
when you write in columns, always use the [TAB] feature of your wordprocessing package.
Use the spacebar only for separating words from one another. Do not use the spacebar to
format tables, for centering or laying out texts, or for any other form of line or page
formatting.
Springer Open Choice
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and Access to that article is granted to customers who have purchased a subscription),
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108
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86
FICHA CATALOGRÁFICA
CDD 633. 51
1. Ramulose
2. Doença
3. Algodão
4. Marcadores
I. Melo Filho, Péricles de Albuquerque
II. Título
S586e Silva, Fabiana Aparecida Cavalcante
Estudo molecular e bioquímico de cultivares de algodão
em resposta a Colletotrichum gossypii South var. cephalos
–
porivides A. S. Costa / Fabiana Aparecida Cavalcante S
ilva .
108 f. : il.
Orientador : Péricles de Albuquerque Melo Filho
Dissertação (Mestrado em Agronomia – Melhoramento
genético – Universidade Federal Rural de Pernambuco. De
–
partamento de Agronomia.
Inclui anexo e bibliografia.
Livros Grátis
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