( PDF ) Caracterização morfológica do reparo de defeitos segmentares diafisários em ovelhas tratados com enxertos ósseos homólogos associados a células osteoprogenitoras autólogas

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas - PCM

Caracterização morfológica do reparo de defeitos

segmentares diafisários em ovelhas tratados com

enxertos ósseos homólogos associados a células

osteoprogenitoras autólogas

João Sergio Nobre dos Reis

Rio de Janeiro, 18 de dezembro de 2006.

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas - PCM

Caracterização morfológica do reparo de defeitos segmentares diafisários em

ovelhas tratados com enxertos ósseos homólogos associados a células

osteoprogenitoras autólogas

João Sergio Nobre dos Reis

Orientadores: Dra. Maria Eugênia Leite Duarte e Dr. Leonardo Rodrigues de Andrade

Departamento de Histologia e Embriologia

Instituto de Ciências Biomédicas

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Morfológicas da

Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte

dos requisitos necessários à obtenção de grau de

Mestre em Ciências Morfológicas

Rio de Janeiro, 18 de dezembro de 2006

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Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas - PCM

Caracterização morfológica do reparo de defeitos segmentares diafisários em ovelhas tratados com

enxertos ósseos homólogos associados a células osteoprogenitoras autólogas

João Sergio Nobre dos Reis

Orientador: Dra. Maria Eugênia Leite Duarte e Dr. Leonardo Rodrigues de Andrade

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Morfológicas da

Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessários à obtenção de grau de

Mestre em Ciências Morfológicas.

Aprovada por:

_____________________________________

Membro Prof. Marcos Farina de Souza

Depto de Histologia e Embriologia, UFRJ

______________________________________

Membro Prof. Ulysses Garcia Casado Lins

Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, UFRJ.

_______________________________________

Membro Prof. José Mauro Granjeiro

Universidade Federal Fluminense.

________________________________________

Revisor e Suplente Prof. Christina Maeda Takiya

Depto de Histologia e Embriologia, UFRJ.

Rio de Janeiro, 18 de dezembro de 2006.

Ficha Catalográfica

Reis, J. S. N.

Caracterização morfológica do reparo de defeitos segmentares diafisários em

ovelhas tratados com enxertos ósseos homólogos associados a células osteoprogenitoras

autólogas/ João Sergio Nobre dos Reis. – Rio de Janeiro: UFRJ, ICB, CCS, 2006.

xi; 78 f.; il.; 29,7 cm

Orientadores: Mª Eugênia Leite Duarte e Leonardo Rodrigues de Andrade

Dissertação de Mestrado. UFRJ / ICB / Programa de Pós-Graduação em Ciências

Morfológicas, 2006.

Referências Bibliográficas: f.

Apêndices:

1. Regeneração óssea. 2. Defeito segmentar. 3. Microscopia Eletrônica de

Varredura. 4. Densitometria. 5. Relação Ca/P. I. Mª Eugênia Leite Duarte e Leonardo

Rodrigues de Andrade. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Ciências

Biomédicas. III. Título.

Agradecimentos

Devo agradecimentos a muitas pessoas, mas me resta nesta tese uma única página, então

aqui estarão contemplados todos os colaboradores deste feito. E a estes devo meu mais sincero e

afetuoso MUITO OBRIGADO.

Aos meus PAIS: João e Alvarina, que nas adversidades sempre estiveram firmes ao meu

lado, sendo capazes de se privar de confortos em detrimento meu e de meu irmão, saibam que hoje

e sempre serão alvo de minha admiração e orgulho.

Aos meus parentes Aurora, José, Tereza, Francisco, Teresa, Gustavo pela cooperação e

compreensão, e por estarem próximos e firmes nas horas difíceis e nas árduas madrugadas.

À Carla que com amor e companheirismo em todas as horas tornou esta tarefa possível. E

mais, tornou a vida mais bela e lhe dá um significado mágico.

Aos meus amigos, aqui incluo todos, que desempenharam papel fundamental na

manutenção da homeostasia do meu bom humor durante todos estes anos, e apesar das dificuldades

ao longo do caminho chegamos, e juntos, que é o mais importante.

Aos meus queridos orientadores Mª Eugenia Leite Duarte e Leonardo Andrade, dupla que

inesgotavelmente me incentivou ao desfecho deste ciclo em minha vida. A vocês dedico este

trabalho e agradeço profundamente. Saibam que são tidos como verdadeiros amigos, estando

indubitavelmente inclusos no parágrafo acima.

A professora Christina Takiya, que com muita paciência desempenhou importante papel

na revisão desta tese.

Ao Prof. Radovan e a Antônio Martins Monteiro, que em 1998, acreditaram em meu

potencial e, através do BCRJ, proporcionaram minha entrada para este grupo de pesquisa.

Ao meu avô, Sergio Nobre, que mesmo longe, teve em mim um sonho realizado.

João Sergio Nobre dos Reis

Resumo

Caracterização morfológica do reparo de defeitos segmentares diafisários em ovelhas tratados

com enxertos ósseos homólogos associados a células osteoprogenitoras autólogas

João Sergio Nobre dos Reis;

Orientadores: Dra. Maria Eugênia Leite Duarte & Dr. Leonardo Rodrigues de Andrade

O processo de reparo de perdas ósseas críticas em ossos longos é o maior desafio da ortopedia, uma

vez que o tratamento mais indicado utiliza enxertos ósseos autólogos, que não estão disponíveis em

quantidades satisfatórias e causam morbidade do sítio doador. Como alternativa, enxertos

homólogos provenientes de banco de ossos estão disponíveis e vem sendo utilizados em cirurgias

reparadoras. As células estromais residentes na medula óssea têm sido utilizadas como fonte de

células osteoprogenitoras em processos de bioengenharia tecidual. Estas células foram obtidas da

medula óssea de ovelhas, expandidas in vitro para celularização de enxertos homólogos como

substitutos para perdas ósseas. O objetivo do presente estudo foi caracterizar morfologicamente o

processo de regeneração de lesões críticas segmentares após a implantação de enxerto homólogo

celularizado em modelo ovino, utilizando-se de análises densitométricas de radiografias,

microscopia eletrônica de varredura e microanálise de raios-X para semi-quantificação da razão

Ca/P de fragmentos ósseos removidos das ovelhas. Para tal, defeitos segmentares criados nas tíbias

de 4 ovelhas foram tratados com o constructo proposto. As análises foram realizadas em 6, 10, 14 e

18 semanas de pós-operatório. Observamos que a consolidação óssea nas interfaces das osteotomias

iniciou-se na 10ª semana, totalizando-se na 18ª. Nas 6ª e 10ª semanas, as médias das razões de Ca/P

nas regiões estudadas foram semelhantes a razão determinada para a fase fosfato de tri-cálcio; já nas

14ª e 18ª semanas, as médias se aproximaram da obtida para o controle ovino, estando esta próxima

do valor descrito para hidroxiapatita estequiométrica indicando o sucesso da consolidação. O

implante de enxerto ósseo homólogo celularizado com osteoprogenitores autólogos expandidos in

vitro parece ser um método viável para o tratamento de lesões segmentares diafisárias.

vii

Abstract

Morphological characterization of large bone defects repair in sheep tibia treated with homologous

bone loaded with autologous osteoprogenitor cells

João Sergio Nobre dos Reis

Advisors: Dra. Maria Eugênia Leite Duarte

Dr. Leonardo Rodrigues de Andrade

The repair process of large bone defects is the major challenge in orthopedics, once the chosen

treatment uses bone autografts that are not enough available and cause morbidities in donor sites.

As alternative, bone allografts from bone banks are available and have been used in orthopedic

surgeries. Bone marrow stromal cells have been used as osteoprogenitor cells source in tissue

engineering process. These cells were obtained from sheep bone marrow, proliferated in vitro and

loaded in bone allografts as bone substitute. The main of this work was to characterize

morphologically the regeneration of sheep large bone defects after implantation of cellularized

allografts using densitometric analyses of radiographs, scanning electron microscopy and X-rays

microanalyses to semi-quantification Ca/P from bone pieces removed from sheeps. Large bone

defects were created in 04 sheep tibiae and treated with cellularized allografts. The analyses were

realized at 6, 10, 14 and 18 weeks post-surgeries. It was observed that the healing at the osteotomies

interfaces started at 10

week, finishing at 18

. At 6

and 10

weeks, Ca/P means of studied

regions were similar to ratio determined to tri-calcium phosphates. Means ratio Ca/P at 14

and 18

were close to obtained from ovine control, and similar from stoichometric hydroxyapatite value,

indicating bone healing. The implantation of the allografts loaded with autologous osteoprogenitors

cells proliferated in vitro seems to be a viable method to repair large bone defects.

viii

Índice

1. INTRODUÇÃO

1.1. Tecido Ósseo

1.2. Ossificação

1.3. Medula óssea

1.3.1. Formação e características gerais

1.3.2. Estroma Medular

1.3.3. Célula-Tronco Mesenquimal

1.3.4. Origem dos Progenitores Mesenquimais

1.3.5. Plasticidade

1.3.6. Comprometimento Osteogênico

1.4. Reparo ósseo

1.4.1. Bioengenharia tecidual

1.4.2. Bioengenharia óssea

1.5. Enxertos ósseos: biológicos e sintéticos

1.5.1. Biológicos

1.5.2. Sintéticos

2. OBJETIVO GERAL

2.1. Objetivos Específicos

3. MATERIAIS & MÉTODOS

3.1. Descrição do Modelo Experimental

3.2. Isolamento e expansão de BMSCs

3.3. Procedimento cirúrgico

3.4. Acompanhamento Radiológico da Consolidação Óssea

3.5. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

3.6. Acompanhamento do Reparo por Análise Semi-quantitativa da Razão Ca/P

4. RESULTADOS

4.1. Isolamento e expansão de BMSCs

4.2. Acompanhamento Radiológico da Consolidação Óssea

4.3. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

4.4. Acompanhamento do Reparo por Análise Semi-quantitativa

da Razão Ca/P

5. DISCUSSÃO

6. CONCLUSÃO

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

LISTA DE TABELAS

Tabelas

Página

Tabela 1: Acompanhamento radiológico do processo de reparo dos defeitos

ósseos

Tabela 2: Resumo dos resultados do Acompanhamento Radiológico

Tabela 3: Valores de porcentagem atômica das análises semi-quantitativas dos

átomos detectados de dois grânulos mostrados nas figuras 16 A e B.

Tabela 4: Valores da média e desvio padrão da relação Ca e P

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura

Página

Figura 1: Imagens de microscopia óptica de contraste de fase de cultura de células

mesenquimais de medula óssea..

Figura 2: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 1 no dia 0 mostrando a região do

enxerto e osso adjacente

Figura 3: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 1 no dia 27 (04 semanas)

mostrando a região do enxerto e osso adjacente

Figura 4: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 1 no dia 55 (08 semanas)

mostrando a região do enxerto e osso adjacente

Figura 5: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 1 no dia 98 (14 semanas)

mostrando a região do enxerto e osso adjacente.

Figura 6: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 2 no dia 0 mostrando as regiões

do enxerto e osso adjacente.

Figura 7: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 2 no dia 34 (04 semanas)

mostrando as regiões do enxerto e osso adjacente

Figura 8: Imagem radiográfica da tí

ia da ovelha 2 no dia 63 (09 semanas)

mostrando as regiões do enxerto e osso adjacente.

Figura 9: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 2 no dia 108 mostrando (15

semanas) as regiões do enxerto e osso adjacente

Figura 10: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 2 no dia 126 mostrando as

regiões do enxerto e osso adjacente

Figura 11: Aspecto do osso hospedeiro observado ao MEV do animal sacrificado

após 6 semanas.

Figura 12: Imagens de MEV da região proximal de interface do enxerto e osso

hospedeiro após 6 semanas.

Figura 13: Imagens de MEV de um fragmento ósseo após 10 semanas de enxertia 44

Figura 14: Imagens de MEV de fragmento após 14 semanas de enxertia. 45

Figura 15: Imagens de MEV de fragmento ósseo removido após 18 semanas de

enxertia.

Figura 16: Aspecto das partículas formadas após maceração de fragmentos ósseos

e espectros de microanálise de raios-X originados de partículas indicadas pelas

cruzetas.

1. INTRODUÇÃO

O tratamento para reparo de perdas ósseas segmentares é um dos principais desafios da

bioengenharia óssea. Este trabalho tem por intuito a caracterização do processo de reparo ocorrido

após tratamento de defeitos diafisários com enxertos homólogos celularizados com células

osteoprogenitoras oriundas da medula óssea autóloga em ovelhas. O acompanhamento do pós-

operatório por microscopia eletrônica de varredura (MEV), radiografias e modificações elementares

da razão Ca e P contribuíram para gerar informações a cerca dos tempos de consolidação e

modificações na matriz óssea ocorridas durante o processo de reparo ósseo em ovelhas. Por utilizar

um modelo animal de grande porte, este estudo pode auxiliar na determinação de métodos de

estudos em seres humanos. A bioengenharia tem como foco principal a restauração dos

componentes orgânicos e inorgânicos da matriz óssea com manutenção de sua homeostasia

fisiológica. Para tal, muitas alternativas de enxertos, células, fatores de diferenciação e

principalmente suas combinações têm sido estudados.

1.1. Tecido Ósseo

O tecido ósseo possui propriedades mecânicas de resistência a forças de tração e

compressão. As principais funções estão relacionadas à proteção de outros tecidos, sustentação e

deslocamento do organismo. Funciona como uma espécie de alavanca transmitindo as forças

geradas pela contração do tecido muscular para a movimentação do indivíduo. A característica de

rigidez do osso é resultado da interação entre os componentes orgânicos da matriz extracelular

(MEC) produzidos pelas células residentes e de minerais depositados nesta matriz. O principal

mineral encontrado no osso é um complexo de fosfato de cálcio chamado carbonato hidroxiapatita

(HA), que é depositado principalmente sobre e entre as fibrilas de colágeno tipo I (GARTNER &

HIATT, 2001)

No tecido ósseo, destacam-se os seguintes tipos celulares:

• Osteoblastos: são células que pertencem a uma linhagem de células chamadas

osteoblásticas, na qual estão as progenitoras de origem mesodérmica, as células jovens pré-

diferenciadas e osteoblastos maduros. Estas células possuem forma cubóide com prolongamentos,

citoplasma basófilo, núcleo excêntrico com nucléolo proeminente e retículo endoplasmático

granular (REG) e aparelho de Golgi (AG) bem desenvolvidos (WAGNER & KARSENTY, 2001,

CARVALHO & COLLARES-BUZATTO, 2005). Elas sintetizam a parte orgânica da matriz óssea,

composta principalmente por colágeno tipo I, glicoproteínas e proteoglicanas. Sintetizam ainda

fatores de crescimento específicos, prostaglandinas, colagenases e fosfatase alcalina. Também

concentram fosfato de cálcio, participando da mineralização da matriz. Possuem sistema de

comunicação intercelular através de junções comunicantes antes de serem completamente

enclausuradas pela matriz calcificada. Alguns osteoblastos ao fim na formação óssea tornam-se

inativos e revestem as superfícies ósseas, formando as células de revestimento ósseo (bone lining

cells) que formam uma barreira que protege o tecido ósseo de fluido de tecidos adjacentes (endósteo

e periósteo).

• Osteócitos: células mais numerosas e diferenciadas do osso, localizadas em

cavidades ou lacunas dentro da matriz mineralizada. Destas lacunas formam-se canalículos

ocupados por prolongamentos citoplasmáticos dos osteócitos, que se unem com outros, havendo

entre eles junções do tipo comunicantes, permitindo a difusão de nutrientes e gases entre as células

e o espaço extracelular. Os osteócitos sofrem modificações estruturais como diminuição da basofilia

citoplasmática, do retículo endoplasmático rugoso e do Aparelho de Golgi. São incapazes de se

dividirem, mas possuem papel fundamental na manutenção da integridade da matriz óssea;

• Osteoclastos: células gigantes multinucleadas, derivadas de progenitores

mononucleares das linhagens dos monócitos e macrófagos da medula óssea, e que participam dos

processos de absorção, manutenção, remodelação e renovação do tecido ósseo. Os osteoclastos são

encontrados sobre as superfícies ósseas ocupando escavações rasas (lacunas de Howship) e através

de ação enzimática desmineralizam a matriz óssea, promovendo a reabsorção. Seu marcador

específico é a fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAP), mas metaloproteinases de matriz como a

MMP9 são expressas anteriormente a TRAP em precursores destinados ao fenótipo osteoclástico

(GREENFIELD et al., 1999, CARVALHO & COLLARES-BUZATTO, 2005).

O tecido ósseo pode ser ainda classificado em esponjoso ou compacto de acordo com a sua

estrutura macroscópica e em atendimento a condições fisiológicas distintas. Essas variedades

apresentam os mesmos tipos de celulares e moléculas da matriz, diferindo entre si na organização

destes elementos.

O tecido ósseo esponjoso ou trabecular apresenta espaços medulares amplos e é formado

por várias trabéculas ósseas que conferem o aspecto poroso ao tecido e preenchido com tecido

conjuntivo (medula óssea) e vasos sanguíneos. O tecido ósseo compacto ou cortical praticamente

não apresenta espaços medulares, no entanto, apresenta abundante quantidade de material

calcificado onde fibras colágenas orientadas em lamelas estão dispostas em torno de um vaso

sanguíneo (canal de Havers), que se comunicam transversalmente com outros vasos (canais de

Volkmann). Por ser uma estrutura inervada e irrigada, os ossos apresentam grande sensibilidade e

capacidade de regeneração. Externamente, os ossos são revestidos por uma membrana fibrosa - o

periósteo - que tem a função de nutrir o osso e promover o crescimento em espessura.

Sob o ponto de vista anatômico, os ossos são subdivididos em ossos longos, ossos curtos e

chatos. Os ossos longos têm a forma de cilindro, no qual podemos distinguir uma parte

intermediária – a diáfise –, e duas extremidades denominadas epífises. A porção periférica da

diáfise é formada por osso compacto, que reveste um canal interno denominado de canal medular,

que é ocupado pela medula óssea e por trabéculas de osso esponjoso. O fêmur e a tíbia são

exemplos de ossos longos. Os ossos curtos são aqueles que nenhuma das três dimensões prevalece,

como ocorre nos ossos do carpo e do tarso. Geralmente, são formados por osso esponjoso revestido

superficialmente por uma camada de osso compacto. Os ossos chatos são aqueles em que

predominam duas dimensões e que possuem, portanto, o aspecto de uma lâmina. São formados por

tecido compacto no meio do qual, encontra-se uma camada de tecido esponjoso. Exemplos de ossos

chatos são os ossos da calota craniana.

1.2. Ossificação

O esqueleto é formado por dois processos de ossificação distintos: a ossificação endocondral

e a intramembranosa.

A formação óssea ou ossificação intramembranosa é responsável pela formação de alguns

ossos da face e do crânio. Forma-se diretamente da condensação de células mesenquimais que se

diferenciam em células osteoprogenitoras e depois em osteoblastos, que secretam matriz óssea na

forma de espículas ou trabéculas ainda não totalmente ossificada (osteóide), e que

posteriormente, se transforma em osso maduro (XIAN et al., 2004; KIERSZENBAUM, 2004).

A formação óssea ou ossificação endocondral é responsável pela formação da maior parte

dos ossos do esqueleto, inclusive aqueles que irão abrigar a medula óssea, como os ossos longos

e a crista ilíaca, onde células mesenquimais condensadas se diferenciam em condrócitos, gerando

um molde de cartilagem não vascularizado que servirá de suporte estrutural para o

desenvolvimento ósseo. O molde cartilaginoso formado durante o desenvolvimento embrionário

inicialmente é envolvido por uma membrana – o pericôndrio – que contêm preferencialmente

precursores condrogênicos em condições de baixas tensões de oxigênio, que são gradativamente

substituídos por precursores osteogênicos vindos de vasos que invadem a cartilagem, e que

iniciam a deposição de matriz óssea. A matriz óssea secretada envolve toda a região central do

molde cartilaginoso, formando um colar ósseo que impede a difusão de nutrientes para os

condrócitos do molde. Estes se degeneram formando grandes lacunas entre a matriz calcificada,

dando origem às concavidades que irão abrigar a medula óssea (TREPCZIK, no prelo;

GARTNER & HIATT, 2001). A partir desse momento do desenvolvimento ocorre a invasão

vascular da cavidade medular recém formada. Essa invasão é mediada pela ação de osteoclastos

no colar ósseo, permitindo a formação de espaços por onde os capilares irão penetrar na futura

cavidade. A invasão vascular permite que as células hematopoéticas, incluindo os progenitores

hematopoiéticos, tenham acesso à medula e iniciem o processo de povoamento. A quebra na

integridade do colar ósseo também permite a entrada de células osteoprogenitoras provenientes

do periósteo que irão terminar o processo de formação óssea dentro da cavidade medular,

substituindo a cartilagem calcificada por osso esponjoso (KIERSZENBAUM, 2004).

1.3. Medula óssea

A medula óssea é um órgão que tem como principal função a manutenção da hematopoiese

na vida pós-natal. Esse processo inclui a formação e maturação das células da linhagem

hematopoética, bem como sua disponibilização através da circulação para o organismo. Esse órgão

aparece na fase final do desenvolvimento embrionário entre o quinto e o sétimo mês de vida intra-

uterina e permanece durante toda a vida adulta (KIERSZENBAUM, 2004).

1.3.1. Formação e características gerais

A medula óssea é formada por um tecido conectivo intensamente vascularizado que se

encontra nas cavidades da maior parte dos ossos do esqueleto, preenchendo os interstícios situados

entre as trabéculas ósseas. A interface entre o tecido ósseo e a medula óssea é feita por uma camada

de células osteoblásticas (osteoblastos e células osteoprogenitoras) denominada endósteo que

recobre o osso e garante um grau de separação física entre os dois tecidos, e é tida como nicho de

células tranco hematopóieticas (GARTNER & HIATT, 2001; YIN & LI, 2006).

A medula óssea pode ser classificada em medula óssea vermelha, quando é povoada

majoritariamente por populações celulares da linhagem hematopoética, principalmente hemácias,

ou medula óssea amarela quando prevalecem as células adiposas. Na infância a medula óssea é

predominantemente vermelha, e durante a maturidade, em alguns locais, ela vai sendo

gradativamente substituída por adipócitos, se tornando amarela e deixando de exercer a função

hematopoética (GARTNER & HIATT, 2001). Devido a essas modificações durante a idade adulta,

a medula óssea vermelha se localiza nas cavidades de apenas alguns ossos, dentre eles estão a

clavícula, as vértebras, o esterno, ossos da pélvis e do quadril e as extremidades dos ossos longos

dos membros (KIERSZENBAUM, 2004).

A organização vascular da medula óssea é de extrema importância para a manutenção da sua

função biológica. A rede vascular da medula deriva de artérias nutridoras que vão da superfície

externa do osso até a cavidade medular, onde se ramificam formando redes de capilares

denominados de sinusóides. Esses capilares apresentam interrupções na integridade de sua parede

vascular que permite a entrada e a saída direta de células e moléculas. (GARTNER & HIATT,

2001). A medula óssea pós-natal de mamíferos adultos é considerada tradicionalmente como um

órgão composto por dois compartimentos específicos, que tem suas raízes em sistemas troncos

distintos. Esses compartimentos são representados pelo tecido hematopoético e pelo estroma

medular de suporte. Ambos são compostos por diversas linhagens celulares provenientes dos

sistemas troncos denominados hematopoético e estromal ou mesenquimal, respectivamente

(BIANCO et al., 2001a; SHORT et al., 2003). O sistema hematopoiético gera as linhagens

mielóide, linfóide e eritróide através da proliferação e diferenciação de células-tronco

hematopoéticas denominadas Hematopoetic Stem Cells – HSCs. O sistema estromal gera o estroma

medular, composto de diversos tipos celulares (células reticulares ou estromais, osteoblastos,

células osteoprogenitoras, adipócitos, células endoteliais entre outros), através da diferenciação de

células progenitoras mesenquimais denominadas Mesenchymal Stem Cells – MSCs ou Bone

Marrow Stromal Stem Cells – BMSSCs ou Skeletal Stem Cells – SSCs ou Bone Marrow Stem Cells

– BMSCs (PROCKOP, 1997; DEANS et al., 2000; BIANCO et al., 2001a; CAPLAN & BRUDER.,

2001; DENNIS et al., 2002; SHORT et al., 2003).

Estes dois sistemas e seus compartimentos coexistem em um mesmo ambiente, a cavidade

medular, interagindo ao longo de seu desenvolvimento (DEXTER, 1982; BENTLEY, 1982).

Estudos demonstraram que a função do estroma medular era de sustentação da hematopoiese. Essa

função se processa através da formação de um microambiente específico, gerado pela capacidade do

estroma de formar nichos que garantem o suporte estrutural e funcional necessário para a

manutenção e diferenciação das HSCs e sua progênie nas diversas linhagens hematopoéticas

(DEANS et al., 2000; BIANCO et al., 2001a; DENNIS et al., 2002). Entretanto, esse sistema

passou a assumir um outro papel, quando FRIEDENSTEIN et al. (1966 e 1974) e OWEN (1988)

demonstraram sua capacidade de gerar tecidos não-hematopoiéticos.

A partir dessas observações, foi proposto um modelo baseado em uma analogia com o

sistema hematopoético, onde surgiu o conceito de que esses tecidos conjuntivos derivariam de um

ancestral comum, semelhante ao que ocorre com as células da linhagem hematopoética. Este

ancestral teria a capacidade de permanecer na medula óssea pós-natal de organismos adultos,

através da auto-renovação. Posteriormente, essa capacidade foi atribuída à existência de

progenitores-tronco do tecido esquelético ou progenitores mesenquimais presentes no estroma

medular. Isso levou ao reconhecimento de elementos celulares com características “tronco”

presentes na população estromal, e conseqüentemente do estroma como uma fonte dessas células.

Estes achados transformaram a medula óssea no único órgão adulto capaz de abrigar dois sistemas-

tronco que cooperam funcionalmente (BIANCO et al., 2000 e 2001a; DEANS et al., 2000).

1.3.2. Estroma Medular

O estabelecimento do estroma medular é um evento que acontece durante a formação da

cavidade medular. Ele tem sua origem na invasão vascular que se localiza temporalmente antes do

início do estabelecimento da hematopoiese, e depois da formação do colar ósseo. Nesse intervalo de

tempo, os vasos sanguíneos penetram na cavidade medular em formação pela corrosão do colar

ósseo, evento este mediado pela ação de osteoclastos. Este processo leva para o interior da cavidade

medular células osteogênicas que se comprometeram previamente no periósteo. Essas células,

inicialmente, vêm acopladas aos capilares e são denominadas de células perivasculares ou pericitos.

A seguir passam a povoar a cavidade medular dando origem a um estroma primitivo que prolifera

ativamente para preencher o espaço medular, nesse momento ainda não hematopoético (BIANCO et

al., 2000).

O desenvolvimento dos sinusóides dentro da cavidade medular permite o povoamento do

ambiente extra-vascular com células hematopoéticas e seus progenitores. A interação das células

hematopoéticas com o estroma primitivo faz com que as células do estroma percam a sua alta

capacidade proliferativa e se tornem quiescentes. Esse processo gera um rearranjo das células

estromais, que formam uma rede tridimensional que se estende dos espaços extra-vasculares até as

superfícies ósseas. Dentro dessa rede tridimensional, as células hematopoéticas recém chegadas se

acomodam e interagem com o estroma, permitindo o estabelecimento da hematopoiese e tornando a

medula ativa sob o ponto de vista hematopoético. Nesse momento está estabelecida uma

continuidade física e biológica entre o osso e a medula óssea mediada pelo estroma (BIANCO et

al., 2000).

As células do estroma medular interagem por meio de moléculas de superfície e citocinas

com a célula tronco hematopoética e a sua progênie induzindo a modulação da quiescência, auto-

renovação e comprometimento das HSCs; e da proliferação, maturação e apoptose das células

hematopoéticas maduras. Esta população estromal é considerada o componente não-hematopoético

da medula capaz de modular e sustentar a hematopoiese (DENNIS et al., 2002).

O estroma da medula óssea é composto por uma população celular heterogênea. Deste

fazem parte na sua maioria as células reticulares ou estromais que formam uma rede tridimensional

que garante o suporte hematopoético, e células ósseas e seus progenitores osteogênicos que mantém

a dinâmica óssea da cavidade medular através de seu constante remodelamento. Entretanto, outras

populações também estão presentes, como os adipócitos, em maior número principalmente nas

regiões da medula óssea amarela; as células endoteliais e pericitos presentes nos sinusóises e

capilares que compõem a rede vascular da medula; células maduras da linhagem hematopoiética e

um pequeno número de progenitores multipotentes (DEANS et al., 2000; SHORT et al., 2003).

A função biológica de suporte hematopoético e a organização tridimensional do ambiente

medular são dependentes da MEC e de moléculas regulatórias apropriadas que promovem as

interações célula-célula e célula-MEC (SHORT et al., 2003). O estroma expressa um grande

número de receptores importantes e constituintes da MEC que permitem a adesão das células

hematopoéticas. O suporte da hematopoiese in vitro envolve moléculas produzidas pelo estroma,

como os fatores de crescimento G-CSF, GM-CSF, M-CSF, c-Kit, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-

14, IL-15, SCF, FLK-2 e FIF. Moléculas de adesão como ALCAM, ICAM-1, 2 e 3, L-selectina,

ICAM, VCAM e HCAM, além de moléculas que compõe a matriz extracelular como colágeno tipo

I e IV, fibronectina, laminina, integrina β4 e vitronectina β (PROCKOP, 1997; DEANS et al.,

2000).

As células estromais podem ser isoladas da medula pós-natal devido a sua capacidade de

aderir em cultura (FRIEDENSTEIN et al., 1968). A maioria das células aderentes é do tipo

fibroblastóide que tendem a se agrupar em mini-colônias contendo de 2 a 5 células, formando as

“Unidades Formadoras de Colônias Fibroblásticas” ou CFU-fs. Essas células apresentam potencial

clonogênico e não são fagocíticas. Em geral, essas colônias permanecem dormentes por 2 a 4 dias e

depois começam a proliferar rapidamente. A proliferação das CFU-fs pode ser estimulada por

fatores de crescimento e citocinas como PDGF, EGF, TGFβ, IL-1, FGF, entre outros, tornando

possível a expansão in vitro dessas colônias por aproximadamente 25 passagens (PROCKOP, 1997;

BIANCO et al., 2001a).

1.3.3. Célula-Tronco Mesenquimal

As células-tronco são células capazes de proliferar indefinidamente, se auto-renovando e

gerando pelo menos um tipo celular totalmente diferenciado (HERZOG et al., 2003). Dentro desse

contexto, existem diversos subtipos de células-tronco no organismo, que são capazes de gerar

progenitores com potencial de diferenciação cada vez mais restrito. Algumas células-tronco

apresentam caráter multipotencial maior do que outras. O zigoto e as células-tronco embrionárias

detêm uma capacidade pluripotente mais abrangente em relação às células-tronco hematopoéticas e

as células-tronco mesenquimais, que são células-tronco pós-natais (CAPLAN & BRUDER., 2001;

HERZOG et al., 2003).

FRIEDENSTEIN e PETRAKOVA (1966) foram os primeiros pesquisadores a relatarem a

existência de um sistema de células-tronco mesenquimais não-hematopoiéticas na medula óssea. As

células-tronco mesenquimais são de origem mesodérmica que retém a capacidade de gerar diversas

linhagens de células pertencentes a outros tipos do tecido conjuntivo em indivíduos adultos. Dentre

elas estão fibroblastos, osteoblastos, adipócitos, condrócitos, células estromais, células musculares

lisas, dentre outras (DENNIS et al., 2002; JIANG et al., 2002). Esse caráter multipotente é

encontrado em cerca de 1/3 das células que aderem inicialmente em cultura formando colônias

(DEANS et al., 2000). A demonstração da capacidade das CFU-Fs de se diferenciarem em diversos

fenótipos apoiou experimentalmente à hipótese da existência de uma pequena população de células-

tronco mesenquimais, dentro da população estromal, capaz de alimentar as múltiplas linhagens que

compões o sistema estromal (BIANCO et al., 1999).

Originalmente, esse sistema tronco foi idealizado por analogia com o sistema tronco

hematopoético. Entretanto, o sistema tronco estromal apresenta diferenças marcantes na sua lógica

organizacional em relação a sua hierarquia e fisiologia. Por constituírem uma população celular

com sobrevida finita, essas células não devem ser consideradas células-tronco, mas sim

progenitores mesenquimais (BIANCO et al., 1999).

A capacidade multipotencial do estroma pode ser comprovada in vitro através de ensaios

clonais, onde as linhagens derivadas das CFU-Fs podem gerar um amplo espectro de linhagens

conjuntivas totalmente diferenciadas, mediante a utilização em sistemas in vitro de indutores

específicos para cada linhagem (BIANCO et al., 2000). A dexametazona, o β-glicerolfosfato e o

ácido ascórbico são indutores da linhagem osteogênica, por outro lado, a dexametazona, o

isobutilmetilxantina e a indometacina são indutores da linhagem adipocítica, e o TGF-β é indutor da

linhagem condrocítica (MALAVAL et al., 1994; JOHNSTONE et al., 1998; COELHO et al., 2000

a e b; DENNIS et al., 2002).

As BMSCs podem ser expandidas por até 40 gerações sem perder sua multipotencialidade,

inclusive após criopreservação. Entretanto, com o passar do tempo, as taxas de crescimento

decrescem devido ao seu tempo de vida finito em cultura (PROCKOP 1997; DEANS et al., 2000).

As BMSCs obtidas a partir da expansão das CFU-Fs são populações bastante heterogêneas.

Até agora ainda não foram identificadas características fenotípicas (morfológicas ou moleculares)

que permitam o isolamento de uma CFU-f com potencial amplo ou restrito (BIANCO et al., 2000).

A ausência de marcadores capazes de identificar os progenitores estromais que apresentam maior

capacidade proliferativa e maior espectro de diferenciação, isto é, a célula mais próxima da célula-

tronco mesenquimal e a pequena quantidade desses progenitores in vivo dificultam o conhecimento

acerca da sua localização precisa na medula (SHORT et al., 2003).

Essas dificuldades em estabelecer um marcador que possa permitir o isolamento dos

progenitores mesenquimais da medula óssea de forma mais precisa e específica, dificultando o

estudo dessas células e de suas aplicações potenciais. Por isso, na última década os esforços foram

direcionados para o isolamento de populações clonais cada vez mais homogêneas. Inicialmente

foram desenvolvidos protocolos para o isolamento de populações descendentes de uma única célula,

que expressassem pequenas quantidades de marcadores ósseos como a fosfatase alcalina, para

garantir que os progenitores isolados estivessem em um estágio ainda precoce de comprometimento

(GRONTHOS et al., 1999). Posteriormente, esses estudos levaram à identificação de alguns

marcadores que, ainda, não são capazes de identificar seguramente a célula-tronco mesenquimal

(PROCKOP 1997; BIANCO et al., 2000; CAPLAN et al., 2001).

1.3.4. Origem dos Progenitores Mesenquimais

O surgimento do estroma a partir da invasão vascular durante a formação da cavidade

medular levou à hipótese de que os progenitores mesenquimais estariam associados à rede capilar

como células perivasculares (BIANCO et al., 2000).

Na medula óssea adulta, a rede vascular é composta de uma camada de células endoteliais e

uma camada sub-endotelial de pericitos. Na porção venosa, essas células sub-endoteliais são células

denominadas reticulares adventíciais, que apresentam prolongamentos para nichos hematopoéticos

e expressam marcadores osteogênicos como a enzima fosfatase alcalina (BANFI et al., 2002).

Também foi descrito que fatores como o fator de crescimento epidérmico (EGF) e o fator de

crescimento derivado de plaquetas β (PDGFβ), conhecidos por estimularem a proliferação das

BMSCs vindas da expansão das CFU-fs e dos pericitos durante a angiogênese, são fundamentais

para a progressão da formação óssea e da cavidade medular. Portanto, as semelhanças demonstradas

com relação à localização perivascular, à resposta a fatores de crescimento e à expressão de

marcadores osteogênicos suportaram experimentalmente a idéia de que as células perivasculares

(pericitos), células reticulares adventiciais e progenitores mesenquimais multipotentes presentes no

estroma, sejam a mesma célula. Sua origem nos tecidos pós-natais está, de fato, vinculada à

formação vascular (BIANCO et al., 1999; DEANS et al., 2000; BIANCO et al., 2001a; SHORT et

al., 2003).

Estudos direcionados à determinação de marcadores específicos para o isolamento dos

progenitores mesenquimais multipotentes levaram à descoberta da origem e localização dessas

células no organismo (PROCKOP, 1997).

O anticorpo monoclonal STRO1 reage com um antígeno de superfície ainda não

identificado, expresso por uma pequena sub-população de células estromais com capacidade

multipotencial bastante abrangente. Ele tem sido utilizado para a obtenção da população de

progenitores mesenquimais multipotentes na população estromal, separando-as da população de

células hematopoéticas (SIMMONS et al., 1991), garantindo o isolamento de uma população

purificada de células estromais (GRONTHOS et al., 1994). Esse anticorpo apresenta reatividade in

vivo na região perivascular, co-localizando com marcadores moleculares característicos do

endotélio. Essa co-localização demonstrou que as células adventiciais (pericito) também expressam

o antígeno reconhecido pelo STRO1, sendo, portanto, mais uma evidência de que as células

progenitoras estromais multipotentes são os pericitos, e que seu nicho na medula é a região

perivascular (BIANCO et al., 2001).

Entretanto, algumas CFU-fs isoladas a partir de células positivas para STRO1 apresentam

reatividade para a isoforma α da actina de músculo liso (αSMA) (PELED et al., 1991), e expressam

genes máster para as linhagens ósseas, condrocítica e adipocítica, demonstrando que essas colônias

já apresentam certo grau de comprometimento e que estão hierarquicamente abaixo de um

progenitor mesenquimal ainda não comprometido (GRONTHOS et al., 2003).

1.3.5. Plasticidade

A plasticidade é o fenômeno atribuído à capacidade que uma célula comprometida com um

determinado fenótipo tem para cruzar barreiras de linhagem, e adotar o padrão de expressão

molecular e fenotípico funcional de outras linhagens (HERZOG et al., 2003).

O comprometimento e a diferenciação são usualmente vistos como irreversíveis e

unidirecionais, levando a fenótipos maduros no final de uma via de diferenciação. Esse conceito se

baseia na organização de um sistema de linhagens múltiplas, descendendo de uma única célula-

tronco, como o que ocorre no sistema hematopoético (HIITMAN et al., 2003). Entretanto, células

totalmente diferenciadas presentes no estroma podem adotar fenótipos alternativos de outras células

do sistema estromal in vitro e in vivo. Essa característica das células estromais reflete a plasticidade

do sistema estromal, fazendo com que o comprometimento e a diferenciação dos precursores

possam ser reversíveis, mesmo em células totalmente diferenciadas (BIANCO et al., 2001a).

Dessa forma, tanto os progenitores mesenquimais presentes no estroma, como as células

estromais (BMSCs), se encontram hierarquicamente abaixo de uma célula tronco não diferenciada,

e podem ser simultaneamente diferenciáveis e multipotentes. As células reticulares são exemplos do

fenômeno de plasticidade, porque são capazes de acumular gordura e de se transformarem em

adipócitos, como também de expressar o fenótipo osteogênico se transformando em osteoblastos

(BERESFORD et al., 1992; PROCKOP, 1997; BIANCO et al., 2000; 2001a). Essas modificações

são possíveis nas células dos tecidos conectivos provavelmente para garantir suas funções durante o

desenvolvimento e durante o crescimento pós-natal. De certa forma, constituem adaptações do

organismo para manter a dinâmica e funcionalidade do órgão ou tecido em questão (BIANCO et al.,

2000).

Diferentes modelos foram propostos para explicar o potencial e plasticidade do sistema

estromal, de acordo com diferentes concepções. O modelo hierárquico, análogo ao sistema

hematopoético, foi desenvolvido baseado no potencial de diferenciação dos progenitores observado

in vitro, ou seja, sua capacidade multipotente. Entretanto, devido às muitas diferenças demonstradas

entre o sistema estromal e o hematopoético, principalmente àquelas referentes à reversibilidade

fenotípica, um outro modelo foi proposto baseado na plasticidade observada nas células das

linhagens mesenquimais (DENNIS et al., 2002).

Esse modelo é definido pela repressão e indução de genes máster associados ao

comprometimento com diversas linhagens celulares. Ele parte da idéia de que os progenitores

mesenquimais podem ser caracterizados por um padrão de expressão molecular pertencente ao

potencial de diferenciação mesenquimal. Esse padrão de expressão molecular é definido durante o

desenvolvimento, gerando uma coleção de progenitores com diferentes padrões possíveis de

ativação de genes. Esses eventos não seguem uma via definida para uma linhagem, e mesmo que o

grupo de genes que levem à diferenciação de uma linhagem específica seja ativado, não implica na

perda do potencial dessa célula em se diferenciar e gerar outros fenótipos. Com isso, muitos

caminhos são possíveis para levar um progenitor a um comprometimento específico. Além disso,

após o comprometimento inicial, modificações no padrão de expressão molecular dessas células

podem ser induzidas por fatores externos locais como citocinas, hormônios e moléculas de adesão.

Esses fatores podem regular a troca de linhagens entre células já diferenciadas. Logo, para a

indução de um progenitor mesenquimal é necessário um conjunto de fatores que envolvem

majoritariamente a indução e repressão de genes máster, assim como os estímulos externos

encontrados no ambiente aonde a célula vai se localizar (DENNIS et al., 2002).

1.3.6. Comprometimento Osteogênico

A idéia do comprometimento osteogênico do estroma medular é baseada na explicação de

sua origem, que leva em consideração o seu estabelecimento dentro da cavidade medular a partir da

proliferação de progenitores provenientes do periósteo. Esse conceito é reforçado pela expressão do

fator de transcrição Cbfa1 nas células que compõe o estroma medular (BIANCO et al., 2000).

O Cbfa1 (core binding factor 1) é o fator de transcrição principal que controla a osteogênese

tanto na formação óssea endocondral como intramembranosa. Ele age promovendo a diferenciação

de células mesenquimais em osteoblastos, e sua conseqüente maturação, assim como promove a

maturação dos condrócitos hipertróficos (KOMORI, 2000; CROMBRUGGHE et al., 2001).

Existem evidências de que as células mesenquimais presentes no tecido ósseo se originem

de um precursor comum mesenquimal e que durante o desenvolvimento embrionário esses

progenitores assumam fenótipos diferenciados. Esse processo ocorre através do comprometimento

desses progenitores mediado pela expressão de genes máster que direcionam a diferenciação para as

linhagens específicas (DUCY et al., 1997; KOMORI et al., 1997). O gene Cbfa1 passou a ser

considerado um gene máster ao ser estabelecido que, em animais knock-out homozigotos para esse

gene, não apresentavam ossificação endocondral nem intramembranosa (DUCY et al., 1997;

KOMORI et al., 1997). Além disso, a indução da expressão do gene Cbfa1 em células não

osteogênicas foi suficiente para induzir a osteogênese nessas células (DENNIS et al., 2002).

Como o fator de transcrição Cbfa1 é um gene máster para a linhagem óssea, expresso pelas

células do estroma, foi sugerido que as células do estroma (BMSCs) retinham a expressão desse

gene, possivelmente como um legado de sua origem osteogênica. Por este motivo, estas células

apresentam um default osteogênico podendo, portanto, ser consideradas progenitores osteogênicos

pós-natais (BIANCO et al., 2000).

1.4. Reparo ósseo

O reparo ósseo, como o observado nas fraturas, ocorre em três fases seqüenciais,

relacionadas entre si: inflamação, reparo e remodelação, que culminam com a restituição da

estrutura original do osso. Muitos fatores de crescimento e proteínas estão envolvidos neste

processo. Dentre eles, o TGF−β desempenha papel importante no metabolismo do osso, regulando a

diferenciação e a proliferação das células mesenquimais em condroblastos, osteoblastos e

osteoclastos (ALSBERG et al., 2002).

Além dos fatores de crescimento e da ação local das citocinas, o reparo ósseo depende ainda

da capacidade de diferenciação e do funcionamento dos elementos celulares. A capacidade

funcional das células, avaliada pela sua capacidade de depositar MEC, e o padrão de organização da

matriz depositada vão interferir diretamente na qualidade e na velocidade do reparo ósseo. A

utilização de matrizes de origem sintética ou biológica capazes de organizar a deposição e a

remodelação da matriz nos sítios de reparo ósseo, constitui um dos fundamentos da bioengenharia

tecidual. No contexto ortopédico, a bioengenharia tecidual contribui para o reparo de defeitos

ósseos, ao procurar mimetizar o processo biológico. Este objetivo pode ser atingido suprindo a lesão

com uma fonte extra de células, de fatores indutores do crescimento e de diferenciação e de

matrizes biocompatíveis que servirão de suporte para a migração e proliferação celular (ALSBERG

et al., 2002; SHIN et al., 2003).

1.4.1. Bioengenharia tecidual

A bioengenharia tecidual é caracterizada pelo desenvolvimento de tecidos funcionais através

da utilização de células com capacidade orgão-específicas, associadas in vitro a suportes e fatores

indutores de crescimento (REDDI, 1994; HARDOUIN et al., 2000; ROSE e OREFFO, 2002). Com

o avanço nas descobertas do uso das células progenitoras como componente biológico capaz de

gerar e guiar o desenvolvimento de estruturas teciduais viáveis é cada vez maior a diversidade de

tecidos que podem ser desenvolvidos através da bioengenharia. Dentre esses tecidos estão os

epiteliais, os esqueléticos, cartilaginosos, ósseos (ALSBERG et al., 2002; BIANCO et al., 2001b;

SHIN et al., 2003).

As aplicações clínicas das células-tronco e progenitores multipotentes de linhagens

específicas, iniciou com experimentos utilizando os progenitores hematopoiéticos isolados da

medula óssea transplantados para animais totalmente irradiados, sem a capacidade de regenerar o

tecido hematopoético. Esses experimentos foram muito bem sucedidos levando a mais estudos, que

identificaram e permitiram o isolamento das HSCs adultas. Essas descobertas tornaram a

hematopoiese um modelo para o transplante de progenitores celulares (WEISSMAN, 2000).

As descobertas posteriores de outros progenitores adultos teciduais ou progenitores mais

amplos como os progenitores mesenquimais encontrados na medula, trouxeram grandes

perspectivas quanto às suas possíveis aplicações clínicas. Inicialmente, as pesquisas foram

direcionadas para terapias celulares que envolvem reparos em áreas danificadas. Entretanto, o

desenvolvimento dessas terapias está levando aos primeiros passos para o desenvolvimento da

bioengenharia tecidual voltada para a reconstrução de tecidos e futuramente órgãos, seja in vitro ou

in vivo (BIANCO et al., 2000; BANFI et al., 2000). Essas células também têm sido alvo de estudos

de grupos associados a terapias genéticas, onde elas são cogitadas como potenciais vetores.

1.4.2. Bioengenharia óssea

A reconstrução de tecidos esqueléticos seja in vitro ou in vivo requer um arcabouço

tridimensional capaz de mimetizar a estrutura tecidual existente na matriz do tecido que se pretende

recuperar (RIMINUCCI et al., 2003). No caso de reconstruções ósseas, a hidroxiapatita sintética

por ser o mineral que mimetiza a composição natural óssea, é amplamente utilizada como

alternativa para tratamento de defeitos ósseos (MARCACCI et al., 1999). Entretanto, quando

recoberta com células mesenquimais autólogas, adquire uma grande vantagem, uma vez que essas

células apresentam potencial para se diferenciarem nos diversos fenótipos da linhagem esquelética.

Além disso, essas células promovem um ambiente apropriado para a formação de uma rede vascular

(neoangiogênese) essencial para o desenvolvimento e crescimento de um tecido (BIANCO et al.,

2001b).

De forma simplificada, a idéia de reconstrução óssea seria feita a partir da obtenção das

células mesenquimais isoladas da medula óssea expandidas em cultura e utilizadas para a

celularização in vitro de um arcabouço ou suporte de hidroxiapatita sintética ou de fragmento ósseo

natural desvitalizado, finalizando pela implantação dessas construções no local a ser reparado

(BIANCO et al., 2001b).

Os pontos críticos na definição de protocolos em bioengenharia tecidual com utilização de

células autólogas são a fonte e o grau de diferenciação destas células. Na maioria dos casos, células

terminalmente diferenciadas, obtidas de tecidos adultos possuem capacidade muito limitada de

proliferação, o que impõe sérias limitações para sua expansão em cultura e seu uso em

bioengenharia. A limitação da quantidade de células pode ser contornada cultivando-se populações

indiferenciadas que, por definição, têm uma alta capacidade proliferativa. A diferenciação destas

células pode ser obtida in vitro pela mudança das condições de cultura após expansão ou in vivo,

como uma ocorrência natural no “novo” ambiente fisiológico no local de implantação

(CANCEDDA, 2003).

Um segundo ponto a ser definido na bioengenharia tecidual é o tipo de matriz ou scaffold

que será utilizado como suporte transitório do reparo. Diversas matrizes foram desenvolvidas e

testadas para carrear células e/ou fatores de crescimento para o reparo tecidual. A matriz, além de

carrear as células para o local da lesão, também funciona como um molde estrutural que preenche o

local lesado. A matriz ideal deve ser não-imunogênica (inerte), atóxica, biocompatível,

biodegradável e de fácil obtenção (HUTMACHER, 2000).

A matriz deve também mimetizar a MEC do ambiente onde o reparo ósseo é desejado, não

funcionando apenas como um suporte mecânico, mas também uma fonte de “informação” para as

células ali presentes. O material deve integrar-se facilmente ao osso adjacente, favorecer a neo-

formação óssea, possuir arquitetura que permita rápida vascularização após implantado e, por fim, a

matriz deve ser reabsorvida em fina sintonia com a neo-formação óssea (SHIN et al., 2003).

1.5. Enxertos ósseos: biológicos e sintéticos

1.5.1. Biológicos

Existem evidências da utilização de substitutos ósseos e dentários desde a pré-história. A

prática de cremar os cadáveres, comum em muitas das antigas sociedades, limita muito a

identificação dos materiais utilizados nesta época. Achados arqueológicos dos séculos V e IV A.C.

até os séculos I e II D.C. mostram que os materiais usados para substituir dentes ausentes, incluíam

os dentes bovinos, os escudos, os corais, o marfim (presa do elefante), a madeira, os dentes

humanos, e os metais como ouro ou a prata (RING, 1985).

Segundo MUSCOLO (1998), os enxertos ósseos biológicos podem ser classificados em

vascularizados ou frescos (com células viáveis) ou não vascularizados ou preservados (sem células

viáveis). Em relação à origem do tecido, os enxertos podem ser autólogos (do mesmo indivíduo),

homólogos (de indivíduos da mesma espécie, mas geneticamente diferentes) ou xenólogos (de

espécies diferentes). Os enxertos ósseos podem ainda ser classificados, quanto ao tipo de tecido, em

esponjoso, cortical, estrutural ou não estrutural.

Os enxertos autólogos são retirados geralmente da crista ilíaca do próprio paciente. São

enxertos considerados biologicamente ideais, pois possuem uma matrix osteocondutora, proteínas

osteoindutoras e células osteogênicas que fazem com que a osteointegração seja rápida e eficaz. As

desvantagens da utilização deste tipo de enxerto são: a quantidade limitada de osso que pode ser

obtido da área doadora por vezes insuficiente para correção de grandes perdas ósseas, e o índice de

complicações decorrentes da sua extração, que pode variar de 8,6 % a 20,6 % (YOUNGER, 1989;

FINKEMEIER, 2002).

Os enxertos ósseos homólogos foram introduzidos no início do século passado por LEXER

(1925) para a reconstrução de falhas ósseas provenientes de ressecção de tumores, geralmente em

pacientes pouco ativos e com pequena expectativa de vida. Recentemente, a utilização de enxertos

homólogos se expandiu para o tratamento de perdas ósseas decorrentes de traumas extensos, de

anomalias congênitas e, mais freqüentemente, osteólise secundária ao afrouxamento asséptico de

componentes de artroplastias (MUSCOLO 1998).

1.5.2. Sintéticos

Recentemente, os materiais sintéticos de uso experimental e comercial para reparo e

substituição óssea incluem os metais e suas ligas, polímeros, matrizes de fosfato de cálcio

[Ca

(PO

)

], vidros bioativos e compósitos de diversos polímeros (MANO et al., 2004).

Estudo mostrou semelhança dos espectros de difração de raios-X da dentina e do osso,

indicando que a fase mineral ou inorgânica do osso e dentina são constituídas basicamente por HA -

(PO

)

(OH)

(POSNER, 1954). Os resultados de estudos que utilizaram a combinação de

análises químicas, ou estruturais por difração de raios-X, absorção de infravermelho, microscopia

eletrônica de transmissão concluíram que o componente mineral do osso consiste de somente uma

fase, descrita como carbonato de HA com a fórmula aproximada: (X

)

(PO

HPO

)

(OH)

Nesta composição, a razão molar Ca/P dos ossos animais varia em torno de 1,67 (razão molar

estequiométrica para HA) em função da espécie, idade e do tipo de osso (LEGEROS, 2002).

As HAs coralinas disponíveis comercialmente são preparadas por conversão hidrotermal do

coral, que consiste predominantemente de CaCO

na forma de calcita em HA, na presença de

fosfato de amônio a 260°C e 15.000 psi de pressão (ROY, 1974).

X representando Ca, Mg, Na, Fl.

As apatitas derivadas de osso bovino comercialmente disponíveis são de 3 tipos: (1) com

matriz orgânica e não sinterizada; (2) sem matriz orgânica e não sinterizada; ou (3) sem matrix

orgânica e sinterizada. A matriz óssea não sinterizada consiste em pequenos cristais de carbonato

hidroxiapatita, enquanto a matriz sinterizada em temperaturas acima de 1000°C é composta por

cristais maiores de apatita sem CO

. (KIM, 2003)

Os biomateriais sintéticos de Ca

(PO

)

comercialmente disponíveis são classificados como

hidroxiapatita; apatita não sinterizada Ca

(10-x)

(HPO

)

(PO

)

(6-x)

(OH)

; beta-tricálcio fosfato (β-

TCP), Ca

(PO

)

; e fosfato de cálcio bifásico, mistura de HA e β-TCP (KIM, 2003).

A bioengenharia ortopédica por ser uma nova área de investigação, constitui um campo

ainda pouco explorado. Vários aspectos relacionados com o tipo de matriz, se biológica ou sintética;

resposta biológica induzida; possível potencial osteoindutor, osteocondutor e de osteointegração e

características mecânicas, ainda precisam ser investigadas. Por outro lado, os protocolos de

obtenção, isolamento e expansão celulares também não estão plenamente definidos, devendo ser

investigados mais detalhadamente.

Neste estudo propomos um protocolo, no contexto da bioengenharia tecidual, que visa

potencializar e acelerar o reparo ósseo através da introdução de células mesenquimais autólogas em

enxertos ósseos homólogos em modelo de ovelha. A partir da análise dos resultados pretendemos

avaliar os benefícios da aplicação desta forma de tratamento na prática ortopédica.

2. OBJETIVO GERAL

Caracterizar a regeneração de lesão crítica segmentar artificial após a implantação de

enxerto heterólogo com células autólogas de medula óssea em modelo de ovelha.

2.1. Objetivos Específicos

- Isolar e proliferar in vitro células estromais de medula de ossos longos de ovelhas,

- Usar a lesão crítica segmentar em tíbia de ovelhas como modelo de estudo de regeneração

óssea utilizando-se enxerto homólogo como carreador de células osteoprogenitoras autólogas de

medula óssea ao longo de 126 dias.

- Caracterizar morfologicamente o processo de reparo ósseo ocorrido após enxertia de osso

homólogo celularizado com BMSCs utilizando a microscopia eletrônica de varredura.

- Utilizar a densitometria de tons de cinza (distribuição dos valores de pixels) de imagens

radiográficas obtidas das regiões de enxertia em períodos determinados como parâmetro para

acompanhamento da regeneração óssea.

- Verificar a relação dos elementos Cálcio e Fósforo em fragmentos ósseos isolados das

regiões de interface entre o enxerto e o osso do hospedeiro, e como parâmetro da regeneração óssea.

3. MATERIAIS & MÉTODOS

3.1. Descrição do Modelo Experimental

O modelo animal utilizado neste trabalho foi de ovinos provenientes da Fazenda da

Faculdade de Veterinária da USP, com aprovação do Comitê de Ética para Pesquisa Animal da

Universidade de São Paulo – USP. Primeiramente, duas ovelhas adultas foram sacrificadas e

fragmentos cilindricos da diáfise tibial foram obtidos e utilizados como fonte doadora para os

enxertos corticais. Fragmentos de osso esponjoso foram retirados das epífises da tíbia e fêmur e

foram utilizados como fonte doadora dos enxertos ósseos homólogos esponjosos. Após lavagem

com solução de NaCl 0,9% e remoção de residuos de sangue e outros tecidos, os enxertos corticais

foram perfurados com broca de aço inox de 3,2 mm de diâmetro ao longo de sua superfície com

intervalos de 5 mm. Este procedimento foi realizado com o objetivo de favorecer a difusão de

moléculas importantes envolvidas na regeneração óssea. Em seguida, os enxertos foram irradiados

com raios γ (25 kGray), transportados em gelo seco e mantidos congelados a -80°C, descongelados

em solução salina no momento do uso.

Para o desenho experimental, foram utilizadas 4 ovelhas adultas de 2 anos de idade que

foram submetidos em centro cirúrgico a uma ressecção unilateral de 30 mm de comprimento na

região da diáfise da tíbia esquerda, gerando um defeito ósseo segmentar. No local do defeito

artificial, foi inserido um enxerto cilíndrico de osso cortical preenchido com osso esponjoso, ambos

homólogos, adicionados com células autólogas isoladas do estroma da medula óssea.

3.2. Isolamento e expansão de BMSCs

Três a quatro semanas antes da enxertia, foram obtidos aspirados da crista ilíaca dos animais

em estudo. As ovelhas foram anestesiadas e 5 mL de medula óssea foi aspirado com uma agulha

Jamshidi (15 gauge) em seringa de 10 mL previamente tratada com heparina (1000 UI/mL). Foram

obtidos 30 mL de aspirado, que foram imediatamente transportados a 4°C até o Laboratório de

Proliferação e Diferenciação Celular (UFRJ) para procedimento de isolamento e expansão de

BMSCs.

Os aspirados de medula foram lavados (2 vezes) em meio de cultura “Dulbecco Modified

Eagle Medium” (DMEM), filtrados em peneira tipo “cell strainer” de 40/150 µm de poro para

remoção de fragmentos ósseos, e as células obtidas foram quantificadas por contagem em câmara

de Neubauer com solução hemolítica de Turkey. Em seguida, as células foram centrifugadas e

ressuspensas em DMEM suplementado com 10 % de soro fetal bovino (SFB), e adicionado de

penicilina (100 IU/mL) e estreptomicina (100 µg/mL). As células foram plaqueadas na densidade de

1 x 10

células em garrafas de cultura de 150 cm

, e finalmente incubadas a 37°C em atmosfera

úmida contendo 95 % de ar e 5 % CO

. A primeira troca de meio foi realizada após 24 h e depois,

por duas trocas por semana. As culturas foram monitoradas nos períodos de 7, 14 e 21 dias através

de imagens digitais (1024 X 1024 pixels de resolução) adquiridas em microscópio óptico com

iluminação por contraste de fase (Zeiss Axioplan). Ao atingirem a confluência, as culturas foram

tratadas com tripsina (0,05 %) e EDTA (0,01 %) e replaqueadas em garrafas de 150 cm² num total

de 6x10

células. As BMSCs foram expandidas por no máximo 2 passagens, com períodos de 21

dias, ressuspensas em 3 mL de DMEM suplementado com 20 % SFB, penicilina (100 IU/mL) e

estreptomicina (100 µg/mL) e transferidas para criotubos, que foram transportados a 4°C para o

centro cirúrgico da Faculdade de Veterinárias da USP. Na sala de cirurgia, antes do uso, a

suspensão foi homogeneizada suavemente, aspirada para uma seringa de 1 mL e injetada através

das perfurações feitas na cortical do enxerto.

3.3. Procedimento cirúrgico

O membro esquerdo traseiro foi lavado, e a área da incisão assepticamente preparada para a

cirurgia. Sob anestesia geral, 6 pinos metálicos foram inseridos paralelamente da posição lateral

para a medial, 3 pinos na porção proximal e 3 na porção distal da tíbia. Foi realizada uma incisão

medial no meio da diáfise tibial, e um cilindro de osso com 30 mm de comprimento, entre os pinos

proximais e distais, foi removido criando um defeito ósseo onde o enxerto cilíndrico de osso

cortical preenchido com osso esponjoso foi inserido e celularizado com 1,4 x 10

– 1 x 10

BMSCs

autólogas expandidas in vitro.

O periósteo adjacente foi então cuidadosamente fechado antes da sutura da pele. A

estabilidade mecânica foi obtida com o uso de fixadores externos posicionados de acordo com as

técnicas de rotina em osteossíntese. Os curativos foram refeitos diariamente e nenhuma restrição de

carga foi imposta aos animais. Foram administrados antibióticos por 7 dias e cetoprofeno (500

mg/dia) por dois dias. Após uma semana em curral individualizado, as ovelhas foram reintegradas

as suas atividades normais e monitoradas duas vezes ao dia.

Os animais foram sacrificados respectivamente após 6, 10, 14 e 18 semanas de pós-

operatório, por injeção intravenosa letal de KCl sob anestesia com fenobarbitúrico. A resposta

regenerativa foi avaliada por imagens radiográficas , microscopia eletrônica de varredura e por

microanálise de raios-X nas 6ª, 10ª 14ª e 18ª semanas após cirurgia.

3.4. Acompanhamento Radiológico da Consolidação Óssea

O processo de regeneração da lesão crítica criada através de osteotomia em tíbias foi

estudado por meio de filmes radiográficos realizados durante o período experimental até o dia do

sacrifício das ovelhas. Esta análise foi realizada nas duas ovelhas sacrificadas com os maiores

tempos (14 e 18 semanas respectivamente) para que fosse possível acompanhar o processo de

consolidação, por um período mais longo (Tabela1). Foram feitas imagens radiográficas da região

que recebeu o enxerto, sendo que as condições de aquisição do aparelho foram às mesmas para

todos os períodos escolhidos.

Tabela 1: Acompanhamento radiológico do processo de

reparo dos defeitos ósseos.

Acompanhamento Radiológico

ANIMAL

SEMANAS

(aproximadas)

DIAS

Ovelha 1

0 0

Ovelha 1

4 27

Ovelha 1

8 55

Ovelha 1

14 98

Ovelha 2

0 0

Ovelha 2

4 34

Ovelha 2

9 63

Ovelha 2

15 108

Ovelha 2

18 126

As radiografias obtidas das duas ovelhas foram digitalizadas na resolução de 512 x 512

pixels e transformadas em tons de cinza para estudo da distribuição de valores de pixels por método

densitométrico. A região de interesse, contendo o defeito ósseo com o enxerto, foi recortada da

imagem total. Este método tem como objetivo acompanhar as modificações na distribuição dos

valores de pixels da região da cortical do osso do hospedeiro e o enxerto. Utilizou-se o programa

Image Java (NIH) para estudo da densitometria, onde foram traçadas linhas no sentido da região

correspondente ao osso cortical hospedeiro para o enxerto. O resultado está expresso através de um

gráfico em linha que mostra os valores de pixels (gray values) no eixo das coordenadas e o valor em

pixels ou centímetros da região analisada no eixo das abscissas, indicada por setas nas figuras.

Através do gráfico em linha é possível determinar as variações de densidade óssea no sentido da

análise.

3.5. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Após o sacrifício das ovelhas nos períodos acima citados, o sitio de enxertia foi

cirurgicamente retirado. As amostras foram cuidadosamente retiradas das regiões de interesse

(enxerto cortical, enxerto esponjoso e interface do enxerto com osso hospedeiro) lavadas com soro

fisiológico e imediatamente imersas em solução de 2,5 % glutaraldeído em tampão cacodilato de

sódio 0,1 M (pH 7,2) por 2 horas, foram, então, lavadas 2 vezes com tampão cacodilato de sódio

0,1M (pH 7,2) por 10 minutos, desidratadas em banhos seriados de etanol e secas em aparelho de

ponto crítico. Os fragmentos foram afixados em suportes de alumínio, com fita condutora de

carbono, e metalizados com uma fina camada de ouro, e observados no Microscópio Eletrônico de

Varredura Jeol 5310, operado a 15 kV. As imagens digitalizadas foram obtidas com a resolução de

1024 x 768 pixels, usando o modo de varredura lenta e distância de trabalho de 10 mm.

3.6. Acompanhamento do Reparo por Análise Semi-quantitativa da Razão Ca/P

Após sacrifício das ovelhas, fragmentos ósseos foram obtidos das áreas da interface e da

cortical do enxerto, foram lavados com soro fisiológico estéril, secos em estufa a 60° por 2 dias, e

posteriormente macerados com auxílio de grau e pistilo. Este material foi depositado sobre fita

condutora de carbono aderida sobre suportes de alumínio utilizados para MEV.

A partir do pó obtido, foi realizada a determinação semiquantitativa da razão Ca/P por

Espectroscopia por Energia Dispersiva (EDS), analisando as partículas com cerca ou menores que

10 µm das diferentes regiões de interesse (n=5). Para tal, foi utilizado microscópio eletrônico de

varredura Jeol JSM 6460 equipado com sistema analítico Noran, com aquisição dos fótons de raios-

x por 100 segundos para integrar o espectro, na faixa de energia de 0 – 10 keV, a 30 kV. A relação

atômica entre os átomos de interesse (Ca e P) foi obtida com os resultados das concentrações

atômicas gerados pelo software.

4. RESULTADOS

4.1. Isolamento e expansão de BMSCs

Após aspiração da medula óssea das ovelhas, as células mesenquimais foram purificadas

como descritas na metodologia e cultivadas por 7, 14 e 21 dias, sob condições controladas de

umidade e temperatura. Pode-se observar que após 7 dias em cultura, as células possuíam aspecto

fibroblastóide típico de culturas de células mesenquimais e que não recobriram totalmente a

superfície das garrafas (fig. 1A). Em 14 dias, as células mantiveram seu aspecto morfológico

característico, mas não atingiram a confluência (fig. 1B), fato que ocorreu no período de 21 dias

(fig. 1C).

Figuras 1: Imagens de microscopia de tons de cinza de contraste de fase de cultura de células

mesenquimais de medula óssea.

A: Cultura de 7 dias - células espraiadas com fenótipo fibroblastóide característico. B: Cultura de 13

dias - as células mantiveram as características da semana anterior, porém em maior densidade. C:

Aos 21 dias as culturas atingiam a semi-confluência. Barra = 20 µm.

4.2. Acompanhamento Radiológico da Consolidação Óssea

Nas duas ovelhas analisadas no pós-operatório (dia 0), a cortical do enxerto apresentou

densidade de tons de cinza (valores de cinza ou de pixel) similar a cortical do osso hospedeiro,

sendo que a região da fenda (gap) foi evidenciada pela diminuição acentuada dos valores de cinza

(figs. 2 e 6). Na ovelha 1, observa-se no detalhe da radiografia geral um desalinhamento do enxerto

A B

com o osso hospedeiro na região de osteotomia distal (fig. 2A,); na ovelha 2 nota-se um bom

alinhamento em ambas osteotomias (fig.6).

Aproximadamente 04 semanas após a cirurgia, os perfis densitométricos do enxerto

homólogo e do osso hospedeiro se apresentam similares na ovelha 1 (fig. 3), porém, na ovelha 2

observa-se uma redução da densidade do enxerto homólogo em relação ao osso hospedeiro (fig. 7).

Em ambas as ovelhas, o espaço representado pelas gaps nas interfaces do enxerto com o osso

hospedeiro tem larguras diferentes (figs. 3 e 7). Na ovelha 1, observou-se que no 27º dia houve o

início da formação do calo ósseo na região proximal da tíbia em relação ao enxerto (fig. 3).

Ao fim de 08 semanas na ovelha 1, as densidades do osso hospedeiro e do enxerto

homólogo permaneceram similares, sendo as regiões da gap e a presença do calo ósseo facilmente

identificadas (fig.4).

Na 9ª semana de pós-operatório da ovelha 2, a densidade óssea do enxerto homólogo e do

osso hospedeiro se apresentaram similares na região 2 analisada, diferentemente das interfaces 1 e 3

onde o enxerto homólogo apresentou menor densidade que o osso hospedeiro (fig.8). As gaps ainda

estavam visíveis.

Após o término da 14ª semana de pós-operatório da ovelha 1, na região 2 analisada, a

densidade óssea do enxerto homólogo e do osso hospedeiro se apresentaram semelhantes, sendo que

a região de gap observada no gráfico densitométrico se apresentava diminuída em sua largura

quando comparada com o período anterior (fig. 5). Nesta interface distal chamada de região 2, a

presença de calo ósseo contribuiu para a consolidação da gap, tornando difícil a visualização no

gráfico densitométrico da cortical do enxerto e do osso hospedeiro. Diferentemente da interface

proximal chamada região 1, onde a região da gap é bem pronunciada, mas possuindo densidades

similares do enxerto e do osso hospedeiro (fig. 5). Neste período, as perfurações feitas do enxerto

estavam menos evidentes do que nos períodos anteriores.

Após 15 semanas de pós-operatório da ovelha 2, na região 1 analisada, observa-se que a

densidade do enxerto é menor em relação ao osso hospedeiro adjacente, e nesta interface a gap não

foi detectada visualmente nem pela diferença dos valores de pixels (fig. 9). Diferentemente da

região 2 analisada, onde a diferença de densidade entre enxerto e osso hospedeiro adjacente não são

tão marcantes, foi possível se detectar gap no gráfico densitométrico pela variação dos tons de

cinza, apesar da mesma não ser visualizada (fig. 9).

Ao fim de 18 semanas de pós-operatório na ovelha 2, a densidade da região de enxertia e o

osso hospedeiro estavam similares, não sendo observadas regiões descontínuas (gaps) nas interfaces

(fig. 10). Neste período, as perfurações feitas no enxerto não foram observadas, fato que não

aconteceu nos períodos anteriores. Ao fim deste período, não foi possível a identificação do local

exato de enxertia, devido a total consolidação das osteotomias. A tabela 2 apresenta um resumo dos

resultados obtidos.

Acompanhamento Radiológico

ANIMAL

SEMANAS GAP

Calo Ósseo Consolidação

Ovelha1

0 +/+ - -/-

Ovelha1

4 +/+ + -/-

Ovelha1

8 +/+ + -/-

Ovelha1

14 +/+ + -/+

Ovelha 2

0 +/+ - -/-

Ovelha 2

4 +/+ - -/-

Ovelha 2

9 +/+ + +/-

Ovelha 2

15 -/+ + +/-

Ovelha 2

-/- +

+/+

.Tabela 2: Resumo dos resultados do Acompanhamento Radiológico.

Osteotomias : Proximal/Distal

- = Não evidenciado(a)

+ = Evidenciado(a)

Obs: Coluna de Consolidação

+/- =Consolidação Parcial

+/+ =Consolidação Total

Figuras 2: A: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 1 no dia 0 mostrando a região do

enxerto e osso adjacente. Setas 1 e 2 indicam as regiões e direções das análises densitométricas

partindo do hospedeiro em direção a cortical do enxerto, observa-se desalinhamento distal. B:

Gráfico densitométrico mostrando os valores de pixels na escala de cinza (Gray value) pela

distância em centímetros (Distance) da região mostrada na Seta 1. C: Gráfico densitométrico

referente a região indicada pela Seta 2. As Setas azuis indicam as regiões da gap, caracterizada pela

diminuição dos valores de cinza. As perfurações feitas no enxerto podem ser observadas (indicadas

na figura A por cabeças de seta verde).

0 1 2

Distance

(

)

0 1 2

Distance

(

)

Figuras 3: A: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 1 no dia 27 (04 semanas) mostrando a

região do enxerto e osso adjacente. Setas 1 e 2 indicam as regiões e direções das análises

densitométricas partindo do hospedeiro em direção a cortical do enxerto. Observa-se o inicio da

formação do “calo ósseo”, indicado pela seta vermelha. B: Gráfico densitométrico mostrando os

valores de pixels na escala de cinza (Gray value) pela distância em centímetros (Distance) da região

mostrada na Seta 1. C: Gráfico densitométrico referente a região indicada pela Seta 2. As Setas

azuis indicam as regiões das gaps, caracterizada pela diminuição dos valores de cinza. As

perfurações feitas no enxerto podem ser observadas (indicadas na figura A por cabeças de seta

verde).

0 1 2

Distance

(

)

0 1 2

Distance

(

)

Figuras 4: A: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 1 no dia 55 (08 semanas) mostrando a

região do enxerto e osso adjacente. Setas 1, 2 e 3 indicam as regiões e direções das análises

densitométricas partindo do hospedeiro em direção a cortical do enxerto, que apresentaram

densidades semelhantes. Seta vermelha indica região do calo ósseo. B: Gráfico densitométrico

mostrando os valores de pixels na escala de cinza (Gray value) pela distância em centímetros

(Distance) da região mostrada na Seta 1. C: Gráfico densitométrico referente a região indicada pela

Seta 2. D: Gráfico densitométrico referente a região indicada pela Seta 3. As setas azuis indicam as

regiões das gaps. As perfurações feitas no enxerto podem ser observadas (indicadas na figura A por

cabeças de seta verde).

0 1 2

Distance (cm)

0 1 2

Distance (cm)

0 1 2

Distance (cm)

Figuras 5: A: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 1 no dia 98 (14 semanas) mostrando a

região do enxerto e osso adjacente. Setas 1 e 2 indicam as regiões e direções das análises

densitométricas partindo do hospedeiro em direção a cortical do enxerto, que apresentaram

densidades semelhantes. Setas vermelhas indicam os locais dos calos ósseos. B: Gráfico

densitométrico mostrando os valores de pixels na escala de cinza (Gray value) pela distância em

centímetros (Distance) da região mostrada na Seta 1. C: Gráfico densitométrico referente a região

indicada pela Seta 2. As perfurações feitas no enxerto se fecharam neste período.

0 1 2

Distance (cm)

0 1 2

Distance (cm)

Figuras 6: A: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 2 no dia 0 mostrando as regiões do

enxerto e osso adjacente. Setas 1 e 2 indicam as regiões e direções das análises densitométricas

partindo do hospedeiro em direção a cortical do enxerto, observa-se bom alinhamento proximal e

distal. B: Gráfico densitométrico mostrando os valores de pixels na escala de cinza (Gray value)

pela distância em centímetros (Distance) da região mostrada na Seta 1. C: Gráfico densitométrico

referente a região indicada pela Seta 2. O enxerto e o osso adjacente apresentam densidades

similares nas regiões analisadas. As regiões das gaps estão bem pronunciadas, caracterizam-se pela

diminuição acentuada dos valores de cinza, estando indicadas nos gráficos pelas setas azuis. As

perfurações feitas no enxerto podem ser observadas (indicadas na figura A por cabeças de seta

verde).

0 1 2

Distance (cm)

0 1 2

Distance (cm)

Figuras 7: A: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 2 no dia 34 (04 semanas) mostrando

as regiões do enxerto e osso adjacente. Setas 1, 2 e 3 indicam as regiões e direções das análises

densitométricas partindo do hospedeiro em direção a cortical do enxerto. B: Gráfico densitométrico

mostrando os valores de pixels na escala de cinza (Gray value) pela distância em centímetros

(Distance) da região mostrada na Seta 1. C: Gráfico densitométrico referente a região indicada pela

Seta 2. D: Gráfico densitométrico referente a região indicada pela Seta 3. Os gráficos mostram que

o enxerto apresenta densidade inferior ao osso hospedeiro adjacente. As regiões das gaps estão

indicadas nos gráficos pelas setas azuis. As perfurações feitas no enxerto ainda podem ser

observadas. (indicadas na figura A por cabeças de seta verde).

0 1 2

Distance (cm)

0 1 2

Distance (cm)

0 1 2

Distance (cm)

Figuras 8: A: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 2 no dia 63 (09 semanas) mostrando

as regiões do enxerto e osso adjacente. Setas 1, 2 e 3 indicam as regiões e direções das análises

densitométricas partindo do hospedeiro em direção a cortical do enxerto. B: Gráfico densitométrico

mostrando os valores de pixels na escala de cinza (Gray value) pela distância em centímetros

(Distance) da região mostrada na Seta 1. C: Gráfico densitométrico referente a região indicada pela

Seta 2. D: Gráfico densitométrico referente a região indicada pela Seta 3. Os gráficos B e D

mostram que o enxerto apresenta densidade inferior ao osso hospedeiro adjacente, o que não se

repete em C, onde a densidade óssea é irregular. As regiões das gaps estão indicadas nos gráficos

pelas setas azuis. As perfurações feitas no enxerto podem ser observadas (indicadas na figura A por

cabeças de seta verde)

0 1 2

Distance (cm)

0 1 2

istance

(

)

0 1 2

istance

(

)

Figuras 9: A: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 2 no dia 108 mostrando (15 semanas)

as regiões do enxerto e osso adjacente. Setas 1 e 2 indicam as regiões e direções das análises

densitométricas partindo do hospedeiro em direção a cortical do enxerto. B: Gráfico densitométrico

mostrando os valores de pixels na escala de cinza (Gray value) pela distância em centímetros

(Distance) da região mostrada na Seta 1, onde não foi possível a indicação de uma região provável

de gap. C: Gráfico densitométrico referente à região indicada pela Seta 2. Os gráficos B e C

mostram que o enxerto apresenta densidade inferior ao osso hospedeiro adjacente. A região da gap

está indicada no gráfico C pela seta azul, apesar de não ser visível na figura A.

0 1 2

Distance (cm)

0 1 2

Distance (cm)

Figuras 10: A: Imagem radiográfica da tíbia da ovelha 2 no dia 126 mostrando as regiões do

enxerto e osso adjacente. Setas 1, 2 e 3 indicam as regiões e direções das análises densitométricas

partindo do hospedeiro em direção a cortical do enxerto. B: Gráfico densitométrico mostrando os

valores de pixels na escala de cinza (Gray value) pela distância em centímetros (Distance) da região

mostrada na Seta 1. C: Gráfico densitométrico da região indicada pela Seta 2, onde não foi possível

a indicação de uma região provável de gap. D: Gráfico densitométrico da região mostrada na Seta 3,

onde não foi possível a indicação de uma região provável de gap. Os gráficos B, C e D mostram

que a densidade da região de enxertia e o osso hospedeiro, estavam similares e não foram

observadas regiões de gaps nas interfaces. Ao fim do período de experimento, não foi possível a

distinção do local exato de enxertia, tão pouco do constructo enxertado.

0 1 2

Distance (cm)

0 1 2

Distance (cm)

0 1 2

Distance (cm)

4.3. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

A MEV foi utilizada para avaliação morfológica das modificações ocorridas no tecido ósseo

ao longo do período de reparo do defeito segmentar. O aspecto do osso hospedeiro normal foi

documentado nas regiões próximas ao defeito gerado na tíbia da ovelha sacrificada com 06

semanas. As figuras 11A e 11B mostram dois sistemas de Havers onde se observam a organização

das lamelas ósseas depositadas ao redor de um vaso sanguíneo. A figura 11C mostra canalículos se

dirigindo transversalmente para lamelas adjacentes. O tecido ósseo do osso hospedeiro se

caracterizou ainda pelo vasto sistema circulatório inserido no tecido calcificado (fig. 11D). Foram

observadas lacunas produzidas por osteócitos (fig. 11E), as quais possuíam várias perfurações onde

projeções citoplasmáticas se alongavam pelos canalículos em direção a outro osteócito ou na

direção de um vaso sanguíneo. Na figura 11F se observa um detalhe de uma lacuna sem o osteócito,

mostrando os canalículos produzidos pela célula.

Observações por MEV de fragmentos removidos da ovelha após 6 semanas de enxertia

mostraram que entre a região proximal do osso hospedeiro e o enxerto existia uma descontinuidade

do tecido entre os dois bordos (fig. 12A). A figura 12B mostra detalhe da interface onde se observa

superiormente a forma lamelar do osso hospedeiro e a estrutura desorganizada do enxerto. Na

região distal do osso do hospedeiro foi possível observar uma camada adjacente de tecido amorfo

pouco mineralizado e não lamelar na direção do enxerto, que foi removido (fig. 12C). A região

central do enxerto é formada por lamelas com numerosas lacunas produzidas pelos osteócitos (fig.

12D).

Após 10 semanas de enxertia, foi observada uma consolidação parcial entre o osso

hospedeiro lamelar mais compactado e o enxerto homólogo adjacente, evidenciado por tecido

amorfo com aspecto poroso (fig. 13A). A figura 13B mostra a região de interface, onde é possível

observar uma região de remodelação partindo do osso cortical do hospedeiro, e adjacente, um tecido

mais amorfo de aspecto mais elástico e menos compactado sendo formado na periferia. O tecido

neoformado adjacente ao osso do hospedeiro possuía camadas mais compactadas, com

possivelmente material já parcialmente calcificado, e também tecido mais amorfo em meio a

espaços vazios (fig. 13C). Neste tecido neoformado foi possível visualizar vasos sanguíneos

formados na região de deposição tecidual (fig. 13C). A figura 13D mostra outra região da interface

do osso hospedeiro e enxerto com osso neoformado de aspecto não compactado.

Observações morfológicas de fragmento removido após 14 semanas de enxertia mostraram

que existiam regiões completamente consolidadas (14A e B) e outras ainda em processo de

formação óssea (figs. 14C e D). A área de interface entre cortical do enxerto e cortical do osso

nativo já não era tão evidente como nos tempos anteriores, mas foi possível observar uma faixa de

consolidação entre ambas corticais com osso bem compactado (fig. 14B). Adjacente a cortical do

hospedeiro, era possível a observação de áreas onde estavam ocorrendo deposição de novas

camadas de tecido ósseo com fibrilas de colágeno mais espessas por estarem em processo de

calcificação (fig. 14C), sendo as fibras mais espessas unidas e organizadas por material fibrilar mais

fino (fig. 14D).

A MEV do fragmento removido após 18 semanas de enxertia, visualiza-se na figura 15A

região onde se localizava o enxerto, mas que com a consolidação óssea completa não foi possível

diferenciar os limites entre enxerto e osso nativo. O tecido ósseo possui aspecto compacto, mas não

de lamelas circunferenciais como no sistema haversiano mostrado na figuras 11A e 11B. Na região

do calo ósseo, foi observado deposição de tecido ósseo maduro, formado adjacente ao enxerto (fig.

15B). No maior aumento o tecido ósseo da região onde se localizava o enxerto mostrou ser

constituído por osso com aspecto esponjoso, com possível recomposição da medula óssea e da

vascularização (fig. 15C). A figura 15D mostra detalhe do tecido ósseo da região do calo ósseo

adjacente ao enxerto, também de aspecto esponjoso.

Figuras 11: Aspecto do osso hospedeiro observado ao MEV do animal sacrificado após 6

semanas. A e B: Dois sistemas de Havers onde se observam a organização das lamelas ósseas

depositadas ao redor do vaso sanguíneo. C: Detalhes dos canalículos se dirigindo às lamelas

adjacentes. D: Vasos sanguíneos inseridos no tecido calcificado. E: Fibras espessadas pela

calcificação. F: Detalhe de uma lacuna sem o osteócito com perfurações e canalículos.

D C

B A

Figura 12: Imagens de MEV da região proximal de interface do enxerto e osso hospedeiro

após 6 semanas. A: Imagem mostrando o aspecto geral da interface do enxerto (região inferior) com

osso hospedeiro (região superior). É observada uma descontinuidade entre as interfaces (*) B:

Detalhe da interface onde se observa superiormente a forma lamelar do osso hospedeiro e

inferiormente o enxerto, com aspecto desorganizado. C: Região distal do osso do hospedeiro com

camada adjacente de tecido amorfo em direção ao enxerto (ausente). D: Vista da região central do

enxerto mostrando a orientação das lamelas com numerosas lacunas de osteócitos (setas).

Figuras 13: MEV de um fragmento ósseo após 10 semanas de enxertia. A: Consolidação

parcial entre o osso cortical, lamelar mais compactado, do hospedeiro (C) e o enxerto homólogo

abaixo, evidenciado por tecido amorfo poroso (P). B: Vista da região de interface mostrando tecido

amorfo (A) com aspecto elástico semi-compactado sendo formado a partir do osso do hospedeiro.

C: Detalhe do tecido neoformado adjacente ao osso do hospedeiro com início de compactação das

camadas (C), e abaixo, espaços vazios e presença de tecido mais amorfo (A) e vaso sanguíneo (*).

D: Outra região da interface do osso hospedeiro e enxerto mostrando o aspecto do osso neoformado.

B A

Figuras 14: MEV de fragmento após 14 semanas de enxertia. A: Visão geral da interface

entre a cortical do enxerto (E) e a cortical do osso nativo (C). B: Detalhe mostrando uma área

completamente consolidada (seta) entre enxerto (E) e osso nativo (C). C: Área da interface onde se

vê deposição de novas camadas de tecido ósseo com fibrilas de colágeno mais espessas por estarem

calcificadas. D: Detalhe de uma região semelhante à figura 14C, mostrando as fibras mais espessas

unidas e organizadas por material fibrilar mais fino.

Figuras 15: MEV de fragmento ósseo removido após 18 semanas de enxertia. A: Região

onde se localizava o enxerto. Devido à consolidação óssea completa não foi possível diferenciar os

limites entre enxerto e osso nativo. O tecido ósseo possui aspecto compacto, mas não de lamelas

circunferenciais como no sistema haversiano mostrado na figuras 11A e 11B. B: Região do calo

ósseo maduro formado adjacente ao enxerto. C: Detalhe do tecido ósseo da região onde se

localizava o enxerto, mostrando osso com aspecto esponjoso com vasos neoformados (*). D:

Detalhe do tecido ósseo da região do calo adjacente ao enxerto com aspecto esponjoso.

4.4. Acompanhamento do Reparo por Análise Semi-quantitativa da Razão Ca/P

A análise elementar de partículas com dimensões próximas ou abaixo de 10 µm (figs. 16A e

B) depositadas sobre fita de carbono e analisadas por microanálise de raios-X em microscópio

eletrônico de varredura mostrou que a composição do material pulverizado era formada

principalmente pelos átomos carbono (C), oxigênio (O), magnésio (Mg), fósforo (P) e cálcio (Ca)

(figs. 16C e D).

A tabela 3 mostra os valores de porcentagem atômica das análises semi-quantitativas dos

átomos detectados de dois grânulos mostrados nas figuras 16A e 16B, e que foram utilizados para

cálculo da relação entre Ca e P. As porcentagens mais elevadas são dos átomos C e O, seguidos de

Ca, P e Mg. A soma dos valores da porcentagem atômica calculada pelo software é equivalente a

100 %.

A tabela 4 mostra os valores em média e desvio padrão da razão Ca e P de partículas obtidas

a partir da maceração de fragmentos ósseos das regiões da cortical e da interface da cortical do osso

do hospedeiro e da cortical do enxerto. O valor encontrado para o osso controle foi de 1,63 + 0,06.

Em relação a cortical do enxerto, foi verificada diferença significativa e tendência a aumento da

razão Ca/P ao longo do período de reparação óssea, iniciando em 06 semanas com média de 1,48 +

0,03, e em 18 semanas com média de 1,57 + 0,02. As análises da região de interface da cortical do

osso hospedeiro e da cortical do enxerto mostraram, como nas análises da cortical do enxerto, uma

tendência ao aumento da razão Ca/P, iniciando em 06 semanas com 1,43 + 0,05 e alcançando na 18º

semana 1,55 + 0,05.

Figuras 16: Aspecto das partículas formadas após maceração de fragmentos ósseos e

espectros de microanálise de raios-X originados de partículas indicadas pelas cruzetas. A: MEV do

material pulverizado da ovelha sacrificada após 6 semanas e espectro elementar equivalente,

mostrado na figura C, evidenciando principalmente a presença de Ca, P e Mg. B: MEV de

partículas de outro fragmento ósseo da ovelha sacrificada após 10 semanas. D: espectro de raios-X

da partícula da cruzeta, evidenciando principalmente Ca, P e Mg.

Tabela 3: Valores de porcentagem atômica das análises semi-quantitativas dos átomos

detectados de dois grânulos mostrados nas figuras 16 A e B, e que foram utilizados para cálculo da

relação entre Ca e P. Os resultados são gerados pelo software do sistema de detecção Noran

acoplado ao microscópio eletrônico de varredura Jeol 6460.

C-K O-K Mg-K P-K Ca-K

Espectro fig. 16C

55.36 36.66 0.44 3.15 4.38

C-K O-K Mg-K P-K Ca-K

Espectro fig. 16D

53.11 37.36 0.44 3.71 5.29

Tabela 4: Valores da média e desvio padrão da relação Ca e P de partículas geradas da

maceração de fragmentos ósseos das regiões da cortical e da interface da cortical do osso do

hospedeiro e da cortical do enxerto.

Cortical do Enxerto

Interface

Enxerto/Hospedeiro

Semanas Média DP Média DP

06 1,48 0,03 1,43 0,05

10 1,48 0,04 1,50 0,09

14 1,62 0,06 1,54 0,02

18 1,57 0,02 1,55 0,05

Controle Osso

Cortical

1,63 0,06

5. DISCUSSÃO

Atualmente, a escolha de implantes ósseos ideais permanece como grande desafio para

solução de problemas em cirurgias ortopédicas e maxilofaciais. Vários biomateriais, seja de origem

biológica ou sintética, estão sendo testados e/ou utilizados como materiais para consolidação de

segmentos diafisários, preenchimento de defeitos metafisários e reconstrução de ossos da face como

a mandíbula, dentre outros. Defeitos ósseos extensos provenientes de traumas, tumores,

remodelamento periprostético ou osteólise representam problemas clínicos comuns para os quais

existem poucas opções terapêuticas. Um grande número de requisitos deve ser suplantado para que

se tenha sucesso numa reparação ou consolidação óssea. Estes incluem a escolha do implante, fonte

de enxerto ósseo adequado, o local de implantação, biomecânica, métodos de fixação e condições

do paciente (idade, sexo, condições clínicas gerais, tabagismo, diabetes, etc.).

Na prática ortopédica atual, o padrão-ouro utilizado nas reconstituições ósseas é o enxerto

autólogo por ser osteogênico (neoformação óssea), osteoindutor (estimula células osteoprogenitoras

a se diferenciarem em células formadoras de osso), osteocondutor (fornece um arcabouço inerte na

qual o tecido ósseo pode se regenerar em osso, mesmo não possuindo capacidade de gerar osso

quando inserido em outros tecidos moles) (BEN-NISSAN, 2003). Não existem substitutos tão

eficazes quanto os enxertos autólogos, entretanto, alternativas sintéticas têm sido amplamente

estudadas. Enquanto os autólogos permanecem como o gold-standard, existem diversas situações

onde o suprimento de osso é limitado ou sua qualidade é inapropriada. A remoção de enxertos

autólogos ainda aumenta a morbidade do paciente, o tempo cirúrgico, a perda de volume sanguíneo,

o que se configura numa significante limitação operacional e clínica. As principais alternativas

terapêuticas seriam os enxertos homólogos proveniente de banco de ossos, como os simulados nesta

dissertação, mas geralmente quando inseridos isoladamente possuem pouca ou nenhuma

osteogenicidade, podem estimular o aumento da imunogenicidade e são reabsorvidos mais

rapidamente do que os autógenos, comprometendo a qualidade da consolidação (BEN-NISSAN,

2003). Na prática clínica, enxertos homólogos frescos são raramente usados por causa da

possibilidade de resposta imunológica indesejada, e risco de transmissão de doenças. Os enxertos

homólogos antes de serem inseridos são preparados através de congelamento em baixíssimas

temperaturas (nitrogênio líquido, -196

C), secos ou liofilizados (freeze-dried) e posteriormente

irradiados. Mesmo após este tratamento permanecem osteocondutivos, mas são considerados

fracamente osteoindutores quando inseridos em defeitos (BEN-NISSAN, 2003). Embora a

avaliação das propriedades osteocondutoras do enxerto homólogo após irradiação não tenha sido

objeto do nosso estudo, é provável que esta propriedade tenha sido reduzida pelo processamento a

que foi submetido o material utilizado na enxertia. Apesar desta possibilidade e, baseado na análise

ultra-estrutural, podemos sugerir que uma parte dos elementos matriciais específicos tenha

permanecido ativa no enxerto, dotando-o de algum grau de osteocondutividade permitindo a adesão

de células osteoprogenitoras.

Nosso trabalho procurou utilizar um dos métodos cirúrgicos atual de reparação de defeitos

ósseos com enxertos homólogos, aplicado em seres humanos, mas com a diferença da adição de

células mesenquimais de medula óssea, que são reconhecidamente osteoprogenitoras, e que

poderiam auxiliar e acelerar a neoformação óssea entre as interfaces do enxerto e da cortical do

hospedeiro. A inserção de células autólogas osteocompetentes possui vantagens como de não causar

rejeição tecidual e resposta imunológica inadequada, e iniciar a diferenciação imediata de células

fenotipicamente produtoras de matriz óssea para o início da consolidação do defeito. A

neoformação de osso requer, além da presença de um suporte osteocondutor, células

osteoprogenitoras que se diferenciem em osteoblastos maduros capazes de sintetizar matriz óssea

em sítios estratégicos de re-mineralização (DAVIES, 2000).

A utilização de biomateriais sintéticos como alternativa para enxertos autólogos e

homólogos para reparação de perdas ósseas extensas tem sido alvo de vários estudos que mostram

as modificações ou adaptações ocorridas no tecido hospedeiro durante o processo de regeneração

(LEGEROS, 1988; KOKUBO et al., 2000; KEATING et al., 2001; MOORE et al., 2001; ORBAN

et al., 2002). A utilização de biomateriais a base de fosfatos de cálcio pode se tornar, em médio

prazo, uma alternativa para estes enxertos atualmente utilizados, já que vários trabalhos têm

demonstrado sucesso na reparação de defeitos ósseos gerados artificialmente, por ser biocompatível

e pela ausência de resposta inflamatória (ORBAN et al., 2002).

Materiais que combinam colágeno com hidroxiapatita bovino e/ou porcino estão disponíveis

no mercado como substitutos ósseos (Bio-Oss Collagen

e Collagraft

). Podem ainda ser

enriquecidos com fatores de crescimento (BMPs e VEGF), plasma rico em plaquetas e células de

aspirado de medula, inseridos no local da fratura e acelerar a consolidação óssea. Mas, mesmo sem

relatos de transmissão de doenças, por serem de origem animal, estes não são unanimidade no meio

médico.

O acompanhamento radiográfico do reparo ósseo é uma prática ortopédica comum, porém esta

utiliza uma avaliação subjetiva da consolidação óssea. Utilizando ferramentas analíticas

encontradas em diversos softwares, como o Image Java, que estima valores de pixels na faixa de

cinzas, é possível avaliar com maior detalhe e precisão a evolução da consolidação de enxertos

ósseos posicionados em defeitos segmentares. O uso desta metodologia neste estudo, permitiu à

análise de radiografias convencionais de duas ovelhas escolhidas intencionalmente, para o

acompanhamento do processo de reparo ósseo por períodos mais longos atingindo 18 semanas.

Imediatamente após a cirurgia, as ovelhas foram avaliadas quanto ao alinhamento das corticais

dos enxertos em relação à cortical do hospedeiro. Com base nas radiografias obtidas, o enxerto

celularizado inserido no defeito da ovelha 1 não apresentou alinhamento adequado com o osso

cortical distal do hospedeiro. Já na ovelha 2, evidenciou-se alinhamento satisfatório do enxerto com

osso hospedeiro. As perfurações realizadas nos enxertos, para facilitar a troca de fluidos e

potencializar a invasão vascular, foram observadas claramente em ambas as ovelhas analisadas até

09 semanas pós-cirúrgica. Este procedimento de gerar orifícios em enxertos de osso cortical já tinha

sido testado com sucesso anteriormente em ovelhas (DELLOYE et al., 2002) e, neste modelo

experimental, favoreceu também a distribuição mais homogênea de células isoladas da medula com

a finalidade de acelerar o reparo ósseo. Com o início do processo de diferenciação, as células

aumentam a secreção de moléculas que integram a MEC, e em poucas semanas observa-se a

formação do calo ósseo na região da fratura, pela deposição de espículas de osso imaturo não-

orientadas. O osso imaturo é, então, remodelado em osso lamelar maduro. Em modelo murino,

verificou-se que a regeneração está completa em 6-8 semanas após o trauma, e não mais se

distingue os sítios de fratura, devido à atuação coordenada das células ósseas reabsorvendo e

secretando matriz óssea (DAVIES, 2000). Entretanto, estas células osteoprogenitoras nem sempre

estão presentes em quantidade suficiente no local do reparo ósseo, de forma que a utilização destas,

isoladas e expandidas a partir de aspirados de medula óssea, podem ser uma alternativa atraente

para a viabilização do reparo de grandes perdas ósseas em períodos mais curtos de tempo.

Trabalho recente mostrou que defeitos ósseos segmentares gerados no metatarso de ovelhas

adultas, tratados com enxertos homólogos e fixados internamente por meio de placa de baixa

compressão de 7 furos apresentaram bons resultados radiográficos por volta do 4º mês. (DONATI,

2005). LUCARELLI e colaboradores (2005) avaliaram radiograficamente o reparo de defeitos

segmentares no metatarso de ovinos enxertados com osso homólogo, fixados da mesma forma que o

trabalho anterior, porém submetidos previamente a celularização com células do estroma da medula

óssea expandidas in vitro e suplementados com plasma enriquecido em plaquetas (PRP). Ao final

de 4 meses, a consolidação foi completa em 5 das 6 ovelhas estudadas. Por outro lado, apenas 1

dentre 4 ovelhas do grupo controle, sem suplementação de PRP e osteoprogenitores, mostrou

consolidação. Estes resultados sugerem que a utilização da fração de células autólogas aderentes

oriundas da medula óssea e PRP pode resultar em significativa melhora na consolidação/integração

dos enxertos ósseos. Entretanto, ainda não está bem definida qual a parcela de contribuição

individual da celularização ou da suplementação com PRP. Outro ponto ainda indefinido é se a

celularização melhora a integração do enxerto em função do potencial angio ou osteogênico das

células adicionadas ao procedimento. Embora no nosso modelo não tenhamos utilizado fixação

interna, nossos resultados corroboram com os achados da literatura citada acima, uma vez que a

consolidação se deu por completa no período entre 115 e 126 dias, equivalente respectivamente a

3,8 – 4,2 meses de pós-operatório nas ovelhas celularizadas, quando comparadas com os resultados

obtidos por nosso grupo em análises histológicas e tomográficas, em ovelhas tratadas com enxertos

não celularizados e acompanhadas nos mesmos períodos que o nosso estudo (FERNANDES, et al.

2004).

Na ovelha 2, por volta da 15ª semana, o gráfico densitométrico da região 2 aponta uma

diminuta gap não evidente em análise visual, e a consolidação foi atingida na região 1 da

osteotomia proximal, que apresentou padrão de densidade inferior no enxerto em relação ao osso

hospedeiro (fig. 10). Este fenômeno pode estar vinculado à reabsorção do osso neoformado e/ou do

calo ósseo, gerando uma “frente de remodelação óssea” nesta região de interface com o osso

hospedeiro.

Ao fim do período de acompanhamento, por volta de 18 semanas, a consolidação do enxerto

se deu por completa, de forma que não mais se evidenciou gaps, além de não ser mais possível

precisar as regiões onde foram realizadas as osteotomias.

A análise morfológica realizada por MEV dos enxertos ósseos homólogos mostrou no

presente estudo que, em ovinos adultos, o processo de consolidação está completo após a 14ª

semana de enxertia do osso homólogo celularizado com osteoprogenitores oriundos da medula

óssea autóloga como indicado pelas radiografias. A consolidação na 18ª semana está ainda mais

avançada, sendo possível inclusive visualizar prováveis focos isolados de hematopoiese na zona de

reparo. Os eventos que ocorreram nesta região se caracterizaram por um processo gradativo de

reabsorção do osso esponjoso de preenchimento do enxerto, formação de novos vasos sanguíneos,

deposição de matriz orgânica e posterior mineralização desta.

A presença de tecido ósseo amorfo na interface do osso hospedeiro no inicio da 6ª semana sugere o

inicio do processo de reparo. A visualização de vasos na região da interface de osteotomia na 10ª

semana, além de ser um importante resultado deste estudo, indica neo-angiogênese favorecendo o

aporte de nutrientes e células contribuindo para o inicio do processo de consolidação, que foi

verificado na análise morfológica e radiográfica. Desta forma podemos sugerir que o uso

terapêutico de progenitores mesenquimais ao acelerar a neoformação de vasos permite que o

processo de consolidação ósseo seja acelerado. Estudos indicam que a celularização com

osteoprogenitores pode acelerar o processo de reparo de perdas ósseas críticas em ovinos (KON et

al., 2000.), e seres humanos (QUARTO et al., 2001). Enquanto estes dois estudos mostraram a

possibilidade de se associar, com certa eficácia clínica, biomateriais sintéticos com composição

mineral próxima da do osso normal e células osteoprogenitoras autólogas, no nosso caso a

associação de osso homólogo e células osteoprogenitoras resultou no reparo através de um tecido

com a composição mineral e a manutenção da Razão Ca/P em níveis fisiológicos.

A consolidação da interface hospedeiro/enxerto pôde ser documentada na 14ª semana, porém

em pontos focais, se tornando completa na 18ª semana, quando não mais foram detectáveis os

limites entre o enxerto e o osso do animal receptor. A ausência de material fibroso/amorfo em

conjunto com a consolidação indica que o enxerto atingiu seu objetivo clínico. Este período do

reparo ósseo se mostrou ricamente ilustrativo no que tange a morfologia da mineralização da matriz

orgânica durante o reparo ósseo. O aparecimento de novos vasos sanguíneos na região estudada

sustentou a hipótese de que o enxerto e/ou as células osteoprogenitoras implantadas serviram de

suporte à hematopoiese, uma vez que já foi demonstrado que as BMSCs heterólogas, quando

injetadas em camundongos com infarto agudo do miocárdio, são os precursores de cerca de 50%

das células endoteliais, responsáveis pela neovascularização da área atingida (ORLIC, 2002;

ORLIC et al., 2001a, 2001b, 2001c).

Os traumas ósseos com fraturas causam danos à rede vascular causando hemorragia no sítio

da fratura, resposta inflamatória local e sistêmica e ativação do sistema complemento, responsável

pela sinalização celular. O sangue extravasado dispara a cascata da coagulação cujas funções são o

controle da hemostase e a mediação da sinalização celular, especialmente através da liberação de

PDGF, TGF-beta e FGF. A degradação proteolítica da MEC adjacente ao trauma produz sinais

quimiotáticos que atraem monócitos e macrófagos que, quando ativados, liberam FGF e VEGF,

estimulando as células endoteliais a expressarem plasminogênio e pró-colagenase (DAVIES, 2000).

Os mecanismos de reparo ósseo e da remodelação são bem semelhantes, sendo que nas

fraturas existe a presença de coágulo devido à injúria. Para a remodelação, as células osteogênicas

são derivadas principalmente das células perivasculares, que migram para o sítio de remodelação.

Entretanto, em fraturas, a população de células osteogênicas é derivada da medula óssea (pericito

vascular, células do estroma, células tronco mesenquimais) e osteoblastos/pré-osteoblastos

principalmente originados no endósteo e periósteo que migram para o defeito (KON et al., 2000).

Após a retenção e a reabsorção do coágulo por macrófagos, as células osteoprogenitoras

migram para o sítio de reparo, diferenciando-se e tornando-se responsáveis pela secreção das

moléculas da matriz orgânica especialmente sialoproteína óssea, osteocalcina e osteopontina com

aumento simultâneo da atividade da fosfatase alcalina que caracteriza a deposição de osso jovem

neoformado. Este local se torna um sítio alvo de futura reabsorção por osteoclastos e simultânea

secreção de matriz óssea organizada por osteoblastos, rica em colágeno tipo I, caracterizando o

fenômeno de remodelação. Neste ponto, o colágeno secretado serve de molde para a mineralização

da matriz óssea, que ocorre de forma lenta e organizada dando origem ao osso lamelar (DAVIES,

2000).

A razão elementar Ca/P pode ser utilizada para acompanhamento das modificações da

porção mineral dos tecidos calcificados. A principal fase de fosfato de cálcio encontrada no osso é a

hidroxiapatita (HA, Ca

(PO

)

(OH)

) com relação Ca/P de 1,67; podendo também serem

encontradas outras fases como o fosfato de octa-cálcio (OCP, Ca

H(PO

)

OH) relação Ca/P de 4,

fosfato tri-cálcio (TCP, Ca

(PO

)

) relação Ca/P de 1,5, fosfato di-calcio diidratado (DCPD,

HPO

-2H

O) relação Ca/P de 2 e fosfato di-cálcio (DCP, Ca

) relação Ca/P de 1

(CLAPHAM et al., 1990). A HA é composta por placas de cristais nanométricos, e é mais bem

descrita como carbonato hidroxiapatita (CHA) com fórmula aproximada: (X

)

(PO

,CO

)

(OH)

(LEGEROS, 1988).

A importância da preservação da concentração mineral na matriz óssea pode ser

exemplificada em doenças ósseas como a “Osteogenesis Imperfecta” (OI). Nesta patologia, a razão

molar Ca/P do osso está alterada (1,67 em indivíduos saudáveis e cerca de 1,48 em portadores de

OI). Esta alteração mineral do osso é um dos fatores mais preponderantes, no aumento do índice de

fraturas nesta população de pacientes (CASSELA, 1995).

Apesar do pequeno universo das amostras, podemos sugerir que as modificações minerais da

razão Ca/P das regiões analisadas, possuem a tendência de se aproximar da razão obtida no controle

de osso cortical ovino durante o processo de reparo. Nas duas primeiras semanas, 6ª e 10ª, quando

foram analisadas as razões de Ca e P nas regiões da cortical do enxerto e na interface, os valores

médios obtidos foram semelhantes a razão determinada para a fase TCP de 1,5. Nas semanas

posteriores analisadas, 14ª e 18ª, as médias da razão se aproximaram da média obtida para o

controle. A razão obtida no controle de 1,63 se aproxima da razão estequiométrica da HA que é de

1,67, indicando que durante o processo de consolidação a fase mineral passa por modificações que

culminam no cristal maduro preponderante da matriz óssea. Diante destes resultados o método

semi-quantitativo empregado neste trabalho pode ser utilizado como ferramenta de avaliação das

modificações da matriz inorgânica.

A partir dos resultados obtidos nas analises morfológicas, radiográficas e elementares para

acompanhamento do reparo de defeitos segmentares diafisários tratados com enxerto homólogo

celularizado com osteoprogenitores autólogos, pudemos caracterizar que a consolidação total se dá

com 126 dias, e a razão Ca/P dos sítios de enxertia mostraram que a estratégia terapêutica que

utilizamos, de fato satisfaz as necessidades substitutivo-reparadoras das lesões diafisárias dos ossos

longos de ovelhas. Esta conclusão se sustenta no fato de que o reparo ocorreu através da formação

de uma matriz calcificada com características minerais semelhantes à matriz óssea biológica.

X representando Ca, Mg, Na, Fl.

6. CONCLUSÃO

1. O implante de enxerto ósseo homólogo celularizado com osteoprogenitores autólogos

expandidos in vitro pode ser indicado como método viável para o tratamento de lesões

segmentares diafisários.

2. O acompanhamento temporal do processo de consolidação óssea, através das análises

radiográficas, mostrou consolidação parcial a partir da 9ª semana e total na 18ª

semana.

3. As análises densitométricas dos valores de pixels das radiografias contribuíram para o

acompanhamento mais detalhado e preciso da consolidação do enxerto, já que na 15ª

semana a gap distal não foi visualizada porém detectada no gráfico densitométrico,

auxiliando o diagnóstico visual.

4. A MEV contribuiu para o acompanhamento morfológico da consolidação do enxerto ao

longo de 18 semanas de pós-operatório das 4 ovelhas analisadas nas regiões de

interface do enxerto homólogo com osso hospedeiro.

5. Nas 6ª e 10ª semanas, as médias das razões de Ca e P nas regiões da cortical do enxerto e

na interface, foram semelhantes a razão determinada para a fase TCP. Nas 14ª e 18ª

semanas, as médias se aproximaram da obtida para o controle.

6. A razão Ca/P do controle de osso cortical ovino obtida pelo método semi-quantitativo

através da microanálise de raios-X se aproxima da razão da Hidroxiapatita

estequiométrica

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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