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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA – UESB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE
DOS FRUTOS DA Terminalia catappa Linn
ANDRÉIA ALVES DE PAULA
ITAPETINGA
BAHIA - BRASIL
2008
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ANDRÉIA ALVES DE PAULA
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL
ANTIOXIDANTE DOS FRUTOS DA Terminalia catappa Linn
Dissertação apresentada à Universidade Estadual do
Sudoeste da Bahia, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação de Mestrado em
Engenharia de Alimentos, para obtenção do título de
“Mestre”.
Orientador:
Profª Drª Alexilda Oliveira de Souza
Co-orientador:
Prof. Dr. Genebaldo Sales Nunes
ITAPETINGA
BAHIA - BRASIL
2008
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634.53
P346c
Paula, Andréia Alves de.
Caracterização físico-química e avaliação do potencial antioxidante dos
frutos da Terminalia catappa Linn../ Andréia Alves de Paula. – Itapetinga:
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, 2008.
91p.
Dissertação do Programa de Pós-Graduação “Strictu Senso” do Curso de
Mestrado em Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual do Sudoeste
da Bahia. Sob a orientação da Prof
a
. DSc. Alexilda Oliveira de Souza e co-
orientação do Prof. DSc Genebaldo Sales Nunes.
1. Terminalia catappa Linn – Atividade antioxidante. 2. Amendoeira-da-
praia – Utilização – Frutos. 3. Castanheira – Usos – Medicina popular. I.
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - Programa de Pós-Graduação
em Engenharia de Alimentos. II. Souza, Alexilda Oliveira de. III. Nunes,
Genebaldo Sales. IV. Título.
CDD(21): 634.53
Catalogação na Fonte:
Cláudia Aparecida de Souza – CRB 1014-5ª Região
Bibliotecária – UESB – Campus de Itapetinga-BA
Índice Sistemático para desdobramentos por assunto:
1. Terminalia catappa Linn – Atividade antioxidante
2. Amendoeira-da-praia – Utilização
3. Castanheira – Usos
4. Nutrição humana – Frutos – Amêndoas
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA – UESB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS
Campus de Itapetinga-BA
TERMO DE APROVAÇÃO
Título: Caracterização físico-química e avaliação do potencial antioxidante dos
frutos da Terminalia catappa Linn
Autor: Andréia Alves de Paula
Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em
Engenharia de Alimentos, pela Banca Examinadora:
__________________________________________
Profª. Drª. Alexilda Oliveira de Souza – UESB
Presidente
__________________________________________
Prof. Dr
a
. Rosenira Serpa da Cruz - UESC
__________________________________________
Profª. Drª. Simone Andrade Gualberto – UESB
Data da defesa: 08/08/2008
UESB - Campus Juvino Oliveira, Praça Primavera n
o
40 – Telefone: (77) 3261-8629
Fax: (77) 3261-8701 – Itapetinga – BA – CEP: 45.700-000 – E-mail: [email protected]
Dedico este trabalho à minha grande e eterna amiga, Deborah Oliveira
Aguilar (in memorian), aos meus pais e à minha amada família que sempre me
apoiaram nas minhas realizações.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida.
À Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, pela oportunidade de realizar
este curso.
À FAPESB pelo suporte financeiro.
À professora Alexilda Oliveira de Souza, pela orientação, pelo apoio, pela
amizade e pela compreensão nos momentos difíceis.
Ao professor Genebaldo Sales Nunes, que gentilmente permitiu que eu
pudesse contribuir com seu projeto de pesquisa, por sua amizade e suas sugestões
oportunas.
À professora Simone A. Gualberto, pelo apoio, incentivo, companheirismo,
pelas sugestões e por abrir as portas para o treinamento realizado na Universidade de
Salamanca, Salamanca, Espanha.
À Rosenira Serpa da Cruz, pela disponibilidade em contribuir com a minha
formação, através de sugestões e correções e por disponibilizar o laboratório de
pesquisa em biocombustível da UESC, em Ilhéus – BA.
À professora
Mara Lucia Pereira Albuquerque por ceder o espaço para
realização desse trabalho.
Aos professores Marcondes Viana, Ronan Batista, Paulo Bonomo, Carmen
Rech, José Rech, Aureliano José Vieira Pires e demais colegas professores, pela
disponibilidade, pelas críticas, sugestões e conselhos, que muito contribuíram para o
enriquecimento deste trabalho.
Aos professores
Julian C. Rivas Gonzalo, Mª. Ángeles Castro González e Dr.
José Mª Miguel del Corral Santana,
a José Joaquin Pérez Alonso e a todos da
Faculdade de Farmácia da Universidade de Salamanca.
Ao Dr. André M. Amorim, curador do Herbário André Maurício Vieira de
Carvalho, do CEPEC, localizado em Ilhéus – BA, pela disponibilidade em identificar
a espécie.
Aos alunos de iniciação científica Wilson Rodrigues, Davi Fogaça e Francisco
Júnior, sem a ajuda dos quais a realização deste trabalho não se tornaria possível. Aos
demais colegas, que ajudaram a realizar algumas análises: Aristides, Newton, Lara
Covre e Fernanda.
Um agradecimento especial à Alana Lemos, pela troca de informações, pelo
auxílio em algumas análises, incentivo, apoio nas horas difíceis, pela disponibilidade e
acima de tudo bom humor e amizade.
A toda comunidade da UESB que de uma forma direta ou indireta contribuiu
na realização deste trabalho, com incentivos, votos de sucesso, sugestões, amizade,
companheirismo e pela compreensão na minha ausência em tempo dispensado por
mim na elaboração do mesmo.
Um agradecimento especial aos meus pais, por sempre me incentivarem a
estudar e por construírem a base da minha educação e valores, me proporcionando
alcançar esta vitória.
A todos aqueles que porventura não tenham sido citados, mas que com certeza
contribuíram de forma importante para a realização deste trabalho.
RESUMO
PAULA, A. A. de Caracterização físico-química e avaliação do potencial
antioxidante dos frutos da Terminalia catappa Linn. Itapetinga-BA: UESB, 2008.
91p. (Dissertação - Mestrado em Engenharia de Alimentos).*
Caracterizações físicas e químicas dos frutos da Terminalia catappa Linn
(Combretaceae).coletados na cidade de Itapetinga-BA, foram realizadas. Foram
determinados os seguintes parâmetros: umidade, cinzas, minerais, lipídios, fibras,
proteínas, carboidratos, sólidos solúveis totais (
o
Brix), acidez total e pH, os quais
indicaram um potencial de aplicação nutricional e tecnológico da polpa e sementes
desta espécie. O extrato etanólico da polpa exibiu um alto teor de compostos fenólicos
totais (2319.0 ± 249.0 mg/100 g em equivalentes de ácido gálico), determinado pelo
método Folin-Ciocalteau, os quais devem ser os principais componentes ativos
responsáveis pelas suas propriedades antioxidantes. Perfis cromatográficos dos
extratos, usando HPLC/MS, indicaram, principalmente, a presença de antocianinas e
flavonóis. A atividade antioxidante foi avaliada por meio do sistema β-caroteno/ácido
linoléico e pelo método de seqüestro de radicais livres (DPPH•, 2,2-difenil-1-
picrilhidrazila), expressos como %I (porcentagem de inibição da oxidação relativa ao
controle) e %SRL (porcentagem de seqüestro de radicais livres), respectivamente. Os
valores médios obtidos, %I = 93.0 ± 5.3 % e %SRL = 93.5 ± 0.8%, foram semelhantes
aos obtidos com o padrão BHA.
Palavras-chaves: Terminalia catappa; amêndoa tropical, atividade antioxidante,
compostos fenólicos.
_________________________
*Orientador: Alexilda Oliveira de Souza, D.Sc., UESB e Co-orientador: Genebaldo
Sales Nunes, D.Sc., UESB.
ABSTRACT
PAULA, A. A. de Physicochemical characterization and antioxidant potential
evaluation of Terminalia catappa Linn fruits. Itapetinga-BA: UESB, 2008. 91p.
(Thesis – Mastership in Food Engineering).*
Physical and chemical characterizations of fruits from Terminalia catappa Linn
(Combretaceae), collected in Itapetinga-BA, were examined. The follow parameters
were determined: humidity, minerals, lipids, fibers, proteins, carbohydrates, total
soluble sugar (
o
Brix), total acidity and pH, which indicated nutrition and technologic
potential applications of pulp and seeds of that species. The ethanolic extract of pulp
showed a high total phenolic content (2319 ± 249,0 mg/100 g in gallic acid
equivalents), obtained according to the Folin-Ciocalteau method, which might be the
main active compounds responsible for the antioxidant properties of the extract.
HPLC/MS analysis of the extract indicated, mainly, the presence of anthocyanins and
flavonols. Antioxidant activity was evaluated by β-carotene/linoleic acid method and
free radical scavenging assay (DPPH•, 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), expressed as
%I (percent inhibition relative to the control) and %FRS (percent free radical
scavenging), respectively. The mean values obtained, %I = 93,0 ± 5,3 % e %FRS =
93,5 ± 0,8%, were similar to that observed to the standard BHA.
Keywords: Terminalia catappa, tropical almond, antioxidant activity, phenolic
compounds.
_________________________
*Adviser: Alexilda Oliveira de Souza, D.Sc., UESB and Co-advise: Genebaldo Sales
Nunes, D.Sc., UESB.
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figura.1.1 - Árvores e folhas da espécie Teminalia catappa (Itapetinga-BA).. 21
Figura 1.2 - Partes do fruto da Terminalia catappa (amêndoa-da-praia). ......... 23
Figura 1.3 – Punicalina e punicalagina.............................................................. 25
Figura 1.4 - Amêndoas inteiras e despolpadas (caroços)................................... 28
CAPÍTULO 2
Figura 2.1 - Catecol, guaiacol e floroglucinol .................................................. 46
Figura 2.2 - Ácidos fenólicos derivados do ácido benzóico.............................. 46
Figura 2.3 - Ácidos p-hidroxicinâmicos ............................................................ 47
Figura 2.4 - Ácido caféico e ácido clorogênico ................................................ 47
Figura 2.5 - 2-fenilbenzopirona, núcleo dos flavonóides .................................. 48
Figura 2.6 - Principais grupos estruturais de flavonóides.................................. 49
Figura 2.7 - Antocianinas .................................................................................. 50
Figura 2.8 - Formas estruturais de antocianinas em equilíbrio em meio
aquoso............................................................................................................. 51
Figura 2.9 - Unidades estruturais de taninos hidrolisáveis ................................ 52
Figura 2.10 - Ligações m-depsídicas entre as unidades de ácido gálico para
formar taninos gálicos .................................................................................... 52
Figura 2.11 - Elagitaninos.................................................................................. 53
Figura 2.12 - Proantocianidinas......................................................................... 54
Fiugra 2.13 - Curva analítica de ácido gálico .................................................... 59
Figura 2.14 - Cromatograma das principais antocianinas detectadas................ 61
Figura 2.15 - Flavonóis detectados no extrato etanólico da polpa..................... 62
Figura 2.16 - Cromatograma das principais antocianinas detectadas................ 62
CAPÍTULO 3
Figura 3.1 - Principais antioxidantes usados em alimentos............................... 71
Figura 3.2 - Radical livre 2,2-difenil-1-pricrilidrazil (DPPH•) ......................... 74
Figura 3.3 - Mecanismos de reação entre radicais livres e fenóis ..................... 75
Figura 3.4 - Atividade antioxidante do extrato e do BHA em diferentes
concentrações. ................................................................................................ 80
Figura 3.5 - Descoramento do β-caroteno na presença de diferentes
concentrações de extrato e na ausência (controle).......................................... 81
Figura 3.6 - Porcentagem de seqüestro de radicais livres DPPH (% SRL) das
soluções do extrato etanólico da polpa da T. catappa e do BHA, em
diferentes concentrações................................................................................. 82
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 1.1 - Principais aspectos estudados sobre a T. catappa, descritos na
literatura.......................................................................................................... 26
Tabela 1.2 - Composição centesimal e de fibras da polpa e da castanha dos
frutos da Teminalia catappa coletados em Itapetinga-BA ............................. 33
Tabela 1.3 - Composição centesimal de frutas .................................................. 33
Tabela 1.4 - Composição centesimal da noz e da castanha-do-pará.................. 34
Tabela 1.5 - Valores de pH e acidez para a polpa e as castanhas da T.
catappa frescas ............................................................................................... 37
Tabela 1.6 - Teores médios de elementos minerais.......................................... 39
CAPÍTULO 2
Tabela 2.1- Condições utilizadas na obtenção do perfil cromatográfico das
antocianinas .................................................................................................... 57
Tabela 2.2 - Condições utilizadas na obtenção do perfil cromatográfico dos
flavonóis ......................................................................................................... 58
Tabela 2.3 - Teor de compostos fenólicos totais em frutos tropicais expressos
em mg de ácido gálico / 100 g de frutos (extratos do jambolão e polpas
congeladas comercializadas, reconstituídas) .................................................. 60
Tabela 2.4 - Teores de polifenóis totais das frações das uvas expressos em
mg de ácido gálico/ 100 g da fração em base seca ......................................... 60
LISTA DE SÍMBOLOS
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
BHA Butil hidroxi anisol
BHT Butil hidroxi tolueno
HPLC High performance liquid chromatography
Cromatografia líquida de alta eficiência
DPPH 2,2-difenil-1-pricrilidrazil
FB Fibra bruta
FD Fibra dietética
FDA Fibra em detergente ácido
FDN Fibra em detergente neutro
FRX Fluorescência de raios-X
% I Porcentagem de inibição da oxidação
SRL Seqüestro de radicais livres
SST Sólidos solúveis totais
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO................................................................................................. 19
CAPÍTULO 1 - CARACATERIZAÇÕES FÍSICAS E QUÍMICAS DOS
FRUTOS DA ESPÉCIE Terminalia catappa Linn ...................................... 21
1 REVISÃO DE LITERATURA....................................................................... 21
1.1 Considerações gerais sobre a Terminalia catappa L. .................................. 21
1.2 Atividades biológicas da Terminalia catappa L.......................................... 24
2 OBJETIVOS................................................................................................... 27
2.1 Objetivo geral .............................................................................................. 27
2.2 Objetivos específicos................................................................................... 27
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 28
3.1 Coleta dos frutos.......................................................................................... 28
3.2 Caracterizações físicas e químicas da polpa e das sementes ....................... 28
3.2.1 Medida do pH ........................................................................................... 29
3.2.2 Determinação da acidez titulável.............................................................. 29
3.2.3 Sólidos solúveis totais (°Brix) da polpa................................................... 29
3.2.4 Determinação da umidade ........................................................................ 30
3.2.5 Determinação do teor de cinzas................................................................ 30
3.2.6 Determinação da composição de minerais................................................ 30
3.2.7 Determinação do teor de lipídios.............................................................. 30
3.2.8 Determinação do teor de fibras................................................................. 31
3.2.9 Determinação do teor de proteína bruta.................................................... 31
3.2.10 Determinação do teor de carboidratos .................................................... 32
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 33
4.1 Composição centesimal ............................................................................... 33
4.2 Teor de fibras............................................................................................... 35
4.3 Acidez total e pH ......................................................................................... 36
4.4 Teor de sólidos solúveis totais da polpa ...................................................... 37
4.5 Composição de minerais.............................................................................. 38
5 CONCLUSÃO................................................................................................ 40
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 41
CAPÍTULO 2 - EXTRAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO DE FENÓIS TOTAIS E
IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DA POLPA DOS
FRUTOS DA Terminalia catappa Linn ........................................................ 45
1 REVISÃO DE LITERATURA....................................................................... 45
1.1 Compostos fenólicos.................................................................................... 45
1.2 Estrutura e classificação dos compostos fenólicos ...................................... 46
1.2.1 Fenóis simples .......................................................................................... 46
1.2.2 Ácidos fenólicos ....................................................................................... 46
1.2.3 Flavonóides............................................................................................... 48
1.2.4 Taninos ..................................................................................................... 51
2 OBJETIVOS................................................................................................... 55
2.1 Objetivo geral .............................................................................................. 55
2.2 Objetivos específicos................................................................................... 55
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 56
3.1 Obtenção dos extratos da polpa ................................................................... 56
3.2 Determinação de fenóis totais...................................................................... 56
3.3 Determinação do perfil cromatográfico das amostras utilizando HPLC
acoplado a espectrometria de massas ............................................................. 57
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 59
4.1 Teor de compostos fenólicos totais.............................................................. 59
4.2 Perfil cromatográfico das amostras.............................................................. 61
5 CONCLUSÃO................................................................................................ 63
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 64
CAPÍTULO 3 - AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN
VITRO DO EXTRATO ETANÓLICO DA POLPA Terminalia catappa
Linn ................................................................................................................ 67
1 REVISÃO DE LITERATURA....................................................................... 67
1.1 Oxidação e saúde......................................................................................... 67
1.2 Antioxidantes naturalmente presentes em alimentos................................... 68
1.3 Mecanismo da oxidação de lipídios............................................................. 69
1.4 Antioxidantes como aditivos ....................................................................... 70
1.5 Análises da capacidade antioxidante in vitro............................................... 73
2 OBJETIVOS................................................................................................... 77
2.1 Objetivo geral .............................................................................................. 77
2.2 Objetivos específicos................................................................................... 77
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 78
3.1 Determinação da atividade antioxidante...................................................... 78
3.2 Seqüestro de radicais livres 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH)............... 79
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 80
4.1 Inibição da oxidação.................................................................................... 80
4.2 Seqüestro de radicais livres DPPH .............................................................. 82
5 CONCLUSÃO................................................................................................ 84
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 85
CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................ 89
PERSPECTIVAS............................................................................................... 91
INTRODUÇÃO GERAL
A Terminalia catappa Linn (Combretaceae) cresce em regiões tropicais e
subtropicais ao longo do mundo, particularmente localizadas em áreas costeiras. Suas
árvores são bastante conhecidas pela vasta sombra que proporcionam ao longo das
praias ensolaradas de toda a costa brasileira. Essa espécie é nativa da Ásia e foi
introduzida no Brasil como árvore ornamental, sendo comum o consumo de seus
frutos por crianças.
Na Ásia, tradicionalmente as folhas da T. catappa são submetidas à extração em
água quente e usadas como bebida medicinal popular (chá) no tratamento de diversas
doenças. O fruto (amêndoa-da-praia), por sua vez, possui polpa e sementes
comestíveis, embora raramente aproveitadas.
Várias pesquisas têm sido realizadas sobre as propriedades biológicas dessa
espécie na saúde humana, tendo sido descritas várias atividades como antiinflamatória,
antitumoral, antiviral e antidiabética. Os estudos indicam que essas propriedades estão
associadas à atividade antioxidante apresentada por extratos dessa planta. Além disso,
seus frutos apresentam um teor elevado de ácido ascórbico, da ordem de 100 mg por
100 g de tecido. No entanto, essa espécie ainda não tem uma ampla aplicação
terapêutica ou nutricional. Poucos estudos têm sido realizados no país na tentativa de
isolar e caracterizar os principais componentes das folhas e frutos da T. catappa. Isto
seria de grande interesse, uma vez que o cultivo da espécie em diferentes países pode
fazer variar consideravelmente o teor de seus princípios ativos e influenciar no
espectro de ações que ela pode apresentar.
A presença taninos e outros compostos fenólicos nas folhas da T. catappa revela
que elas podem servir como fontes de antioxidantes naturais. No entanto, pouco se
sabe com relação à atividade antioxidante dos extratos dos seus frutos. Antioxidantes
são de grande interesse para a indústria de alimentos, uma vez que são essenciais para
evitar reações deteriorativas, além da importância que têm no combate dos radicais
livres, espécies importantes no processo de desenvolvimento de doenças.
Considerando que restrições são impostas ao uso de antioxidantes sintéticos, como o
BHA e o BHT, largamente empregados em alimentos, devido à toxicidade apresentada
por estes compostos, há um interesse crescente no uso de antioxidantes naturais,
obtidos de fontes alternativas.
Considerando os aspectos destacados, neste trabalho avaliou-se a composição
química, o teor e a identificação de compostos fenólicos e a atividade antioxidante dos
frutos da T. catappa com a finalidade de avaliar o potencial dessa espécie como uma
alternativa nutricional de baixo custo.
19
A dissertação foi organizada em três capítulos, no primeiro destacou-se a
composição química dos frutos, no segundo apresentou-se a quantificação e
identificação dos compostos fenólicos presentes no extrato da polpa do fruto e no
terceiro avaliou-se o poder antioxidante desse extrato.
20
CAPÍTULO 1
CARACTERIZAÇÕES FÍSICAS E QUÍMICAS DOS FRUTOS
DA Terminalia catappa Linn COLETADOS EM ITAPETINGA - BA
1. REVISÃO DE LITERATURA
1.1. Considerações gerais sobre a Teminalia catappa L.
A Terminalia catappa Linn (da família Combretaceae) cresce em regiões
tropicais e subtropicais, particularmente localizadas em áreas costeiras. Essa espécie é
nativa de áreas próximas a regiões costeiras do Oceano Índico, na Ásia tropical e da
região que compreende várias ilhas a oeste do Oceano Pacífico, como Malásia,
Indonésia e ilhas da região da Melanésia. Como conseqüência da migração humana
essa árvore foi introduzida e naturalizada, principalmente próximo ao litoral, em
muitos países tropicais do mundo, incluindo o Brasil. Suas árvores (Figura 1.1) são
bastante conhecidas pela vasta sombra que proporcionam ao longo das praias da costa
brasileira (Francis, 1989; Lin, 1992; Thomson e Evans, 2006).
Figura 1.1 – Árvores e folhas da espécie Teminalia catappa (Itapetinga – BA)
Amendoeira-da-praia, amendoeira-da-índia e amendoeira tropical são algumas
das denominações dadas à referida árvore (Francis, 1989; Tassara, 1996; Thomson e
Evans, 2006). No Brasil é ainda conhecida como castanhola, chapéu-de-sol, guarda-
sol (Michaelis 2000), sete copas, castanheira-da-praia entre outras denominações, em
diferentes regiões do país.
21
A amendoeira-da-praia é uma árvore popular que fornece sombra ao longo dos
trópicos (Gonzáles-Mendoza et al., 2006; Thomson e Evans, 2006), possuindo uma
copa ampla e bonita, com folhas que dão aspecto ornamental. Parte dessa aparência
ornamental se deve às cores das folhas que se tornam púrpuras ou amarelas antes do
desfolhamento anual. Mesmo sendo comumente encontrada em áreas urbanas
litorâneas, essa espécie é adaptável a diferentes solos, incluindo os inférteis e arenosos
(Thomson e Evans, 2006).
A T. catappa tem sido tradicionalmente muito importante para as
comunidades costeiras do Oceano Pacífico, provendo uma extensa gama de produtos e
serviços. Nessas regiões ela é largamente plantada para sombra, ornamentação e
produção de castanhas comestíveis. Sua madeira é utilizada para confecção de
utensílios e objetos decorativos em geral, móveis e construções de interiores. Além
disso, seu sistema de raízes desempenha um papel vital na estabilização do litoral
(Thomson e Evans, 2006).
Tradicionalmente as folhas da T. catappa são submetidas à extração em água
quente para o preparo de bebida (chá) (Peterson e Johnson, 1978). Essas folhas têm
sido usadas como fontes medicinais populares para diarréia e como antitérmico, na
Índia, Filipinas e Malásia. Em Taiwan, têm sido aplicadas para prevenir hepatomas e
no tratamento da hepatite. Estudos recentes mostram que a T. catappa apresenta,
também, propriedades antioxidantes e antiinflamatórias (Lin, 1992; Lin et al., 1997;
Chen et al., 2000).
As árvores perdem suas folhas uma ou duas vezes ao ano durante os períodos
secos, florescem e frutificam anualmente, mas, em muitas áreas como no Havaí, Fiji e
Tonga, frutificam e florescem continuamente ao longo do ano (Thomson e Evans,
2006). O fruto tem formato ovóide, de aproximadamente 5 a 7 cm, inicialmente verde,
tornando-se arroxeado quando maduro. A Figura 1.2 ilustra as partes dessa fruta, que é
constituída por uma pele externa (exocarpo), pela polpa (mesocarpo) e, em seu
interior, por um caroço duro (endocarpo), contendo a semente comestível, de sabor
doce muito agradável ao paladar, que é revestida por uma película (Thomson e Evans,
2006; Vareschi, 1979 citado por González-Mendoza et al., 2006).
Segundo os dicionários Michaelis (2000) e Ferreira et al. (1993), o termo
amêndoa pode ser dado aos frutos provenientes de muitas árvores que produzem
sementes oleaginosas, incluindo a espécie T. cattapa. Esse termo também pode
designar o caroço que contém a semente ou qualquer semente contida em caroço.
Segundo esses dicionários, os termos noz e castanha também podem dar nome a esses
frutos. A palavra castanha é usada neste trabalho para designar a semente oleaginosa
comestível desse fruto.
22
semente
(
castanha
)
caro
ç
o
pele externa
polpa
Figura 1.2 – Partes do fruto da Terminalia catappa (amêndoa-da-praia)
As amêndoas-da-praia possuem polpa comestível, embora raramente
aproveitada, talvez por ser muitas vezes fibrosa e não muito saborosa. Às vezes as
crianças consomem a polpa de certos tipos de frutas mais agradáveis. Além disso, nas
Filipinas, um tipo de vinho é produzido a partir da fermentação dos frutos maduros
(Tassara, 1996; Thomson e Evans, 2006).
As castanhas são importantes fontes alimentares em algumas regiões da Ásia,
enquanto em outras, são raramente consumidas ou consumidas apenas por crianças. A
dificuldade de extrair a semente, a qualidade comestível variável e a ausência de
variedades com sementes maiores podem explicar a não utilização das castanhas em
muitos locais (Thomson e Evans, 2006).
Amêndoas com sementes maiores e caroços mais macios foram selecionadas,
preferencialmente propagadas e mantidas em algumas áreas da Melanésia. Nessa
região existem pequenas plantações desses tipos selecionados para a produção de
castanhas, que são vendidas em alguns mercados locais e constituem uma importante
fonte de alimentação e de renda (Thomson e Evans, 2006).
Quantidades significativas de frutas são produzidas de 3 a 5 anos após a
plantação, com frutificações regulares de uma a duas vezes ao ano. A produção de
sementes das castanhas é estimada em 5 kg por árvore, por ano e pode ser o dobro a
partir de estirpes geneticamente selecionadas e cultivadas em lugares de alta
qualidade. Os principais obstáculos para a comercialização da castanha em algumas
regiões do Pacífico, na Ásia, são o baixo conteúdo de semente, a falta de tecnologias
de armazenamento comercial nas próprias fazendas, que permitam processamento nas
23
vilas, e os altos custos de transporte das sementes para unidades processadoras
centrais (Thomson e Evans, 2006).
1.2. Atividades biológicas da Teminalia catappa L.
A T. catappa é comumente usada na medicina popular no Taiwan para o
tratamento de doenças associadas ao estômago (Lin e Kan, 1990). Tradicionalmente,
somente as folhas caídas são usadas na preparação de infusões para bebida, pelo fato
das folhas verdes apresentarem um sabor muito adstringente, devido à presença de alto
teor de taninos (Peterson e Johnson, 1978).
Essa espécie tem sido objeto de estudo de muitos pesquisadores asiáticos, em
especial na China, Japão e Taiwan. Muitos trabalhos se referem aos estudos
fitoquímicos, através dos quais se realizam extrações com diferentes solventes, a partir
de várias partes da planta, para posterior avaliação das atividades biológicas dos
extratos ou dos compostos majoritários isolados dos mesmos, para algum tipo de
atividade específica (Chen et al., 2000; Fan et al., 2004; Ko et al., 2002; Lin, 1992;
Lin et al., 1997; Lin et al., 1998; Lin e Hsu, 1999; Lin et al., 1999; Lin, Hsu e Lin,
2001; Lin et al., 2001; Liu et al., 1996; Nagappa et al., 2003; Ratnasooriya e
Dharmasiri, 2000; Ratnasooriya et al., 2002; Tang et al.; Vrushabendra Swamy et al.,
2006).
Várias atividades biológicas já foram descritas para a planta, como
antioxidante (Chyau et al., 2002; Chyau et al., 2006; Lin, Hsu e Lin, 2001; Ko et al.,
2002), antiinflamatória (Fan et al., 2004), antitumoral (Chen et al., 2000; Liu et al.,
1996), antiviral (Tanaka, et al., 1986) e antidiabética (Nagappa et al., 2003).
Essas atividades foram atribuídas, principalmente, à presença de compostos
fenólicos, sendo que alguns compostos já foram isolados e caracterizados. Os taninos
hidrolisáveis são os principais compostos associados à atividade antioxidante (Chen et
al., 2000), sendo a punicalina e a punicalagina (Figura 1.3) os compostos mais
abundantes, encontrados nas folhas, associados a este tipo de ação. Além destes,
outros compostos fenólicos menos abundantes têm sido isolados e associados à
atividade antioxidante da T. catappa, como também ácidos benzóicos e cumáricos e
seus derivados (Chyau et al., 2006). A punicalina e a punicalagina também têm sido
associadas à atividade antitumoral (Chen, et al., 2000) e antiviral (Tanaka et al., 1986),
o que pode ser uma conseqüência da atividade antioxidante destes compostos. A
atividade antiinflamatória tem sido associada à presença de ácidos triterpênicos,
principalmente o ácido ursólico e seu derivado (Fan et al., 2004). A atividade
antidiabética também já foi descrita para os taninos, mas existem estudos que a
associam à presença de β-caroteno (Nagappa et al., 2003).
24
Figura 1.3 – Punicalina (1) e punicalagina (2)
A respeito de uma avaliação mais ampla do conteúdo nutricional da planta, só
foram encontradas referências deste tipo de estudos para as sementes (Oliveira et al.,
2000).
Nesse contexto, na Tabela 1.1 estão destacados os principais aspectos
estudados a respeito da T. catappa, na qual se descrevem os compostos ativos já
isolados de diferentes partes da planta e suas atividades biológicas. Verifica-se que os
extratos obtidos a partir das folhas são os mais estudados, entretanto poucos estudos
foram descritos sobre os frutos.
No Brasil, poucos trabalhos sobre a planta foram descritos, embora a mesma
esteja vastamente distribuída em todo o país, inclusive na região do sudoeste baiano.
Diante do exposto, a proposta deste trabalho é realizar um estudo mais
detalhado a respeito da polpa e das sementes da T. catappa, para ampliar as
informações acerca das suas propriedades físico-químicas.
25
Tabela 1.1 – Principais aspectos estudados sobre a T. catappa, descritos na literatura
Parte
Estudada
Extrato(s) Atividade
Biológica/Nutricional
Compostos
Descritos
Análise
Cromatográfica
Referência
Sementes Aquoso Tolerância para uso
nutricional
- - Oliveira et
al., 2000
Suspensão a 1%
em metil celulose
Inibidor de ejaculação
precoce
Alcalóides - Ratnasooriya
et al., 2000
Folhas Aquoso Proteção contra
genotoxicidade em
cultura de células de
ovário de hamster
(atividade
antimutagênica)
Punicalagina - Chen et al.,
2000
Aquoso Anticlastogênica
(antitumoral)
Punicalina e
punicalagina
- Liu et al.,
1996
CO
2
(supercrítico) Aroma, antioxidante 18 identificados:
fitol, terpenos,
aldeídos e outros
compostos
simples.
CG/MS e
Olfatometria
Mau et al.,
2003
Óleo essencial Antioxidante Wang et al.,
2000
• Pentano
• Diclorometano
• Acetato Etila
• Metanol
Antioxidante - - Chyau et al.,
2002
Aquoso Antioxidante Ácidos cumáricos,
benzóicos e outros
(banco de dados)
CG/MS Chyau et al.,
2006
- Antioxidante Punicalagina e
punicalina.
- Lin, Hsu e
Lin, 2001
Etanólico Fração clorofórmica
com mais ação
antiinflamatória
Triterpenos: ácido
ursólico e outros
- Fan et al.,
2004
• Metanólico
• Aquoso
• Etéreo
Antidiarréico - - Vrushabendra
Swamy,
2006
- Hepatoprotetora Punicalina e
punicalagina
- Lin et al.,
1998 ;
Lin et al.,
2001
clorofórmico Hepatoprotetora - - Tang et al.,
2006
aquoso Hepatoprotetora Lin et al.,
1997
- Antiinflamatória Punicalina e
punicalagina
- Lin et al.,
1999
aquoso Antinociceptivo
(antiinflamatória,
antipirético e
analgésico)
- - Ratnasooriya
, 2002
Taninos
hidrolisáveis
(Terflavinas A e
B, tergalagina,
tercataína)
Tanaka et al.,
1986
Folhas e
sementes
CO
2
(supercrítico) Antioxidante esqualeno CG, HPLC Ko et al.,
2002
• Eter de
petróleo
• Metanol
• Aquoso
Todos os 3 extratos com
atividade antidiabética
Taninos - Nagappa et
al., 2003
Nutricional Ácido ascórbico Keshinro et
al., 1985
Frutos
Taninos Lin, 1992
Cascas Acetona – água
(8:2)
- 19 isolados:
catapanina A,
outros taninos, ác.
fenólicos e
flavonóis
- Lin e Hsu,
1999
26
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Caracterizar, por meio de parâmetros físicos e químicos, as amostras da polpa
e das sementes da T. catappa a partir de frutos coletados na cidade de Itapetinga – BA.
2.2. Objetivos Específicos
- Determinar a composição centesimal da polpa e das sementes, a partir da
determinação dos teores de umidade, carboidratos, proteínas, lipídios, cinzas e fibras.
- Caracterizar a polpa e as sementes quanto à acidez total titulável e ao pH.
- Avaliar o teor de sólidos solúveis totais da polpa.
- Determinar a composição e o teor de minerais da polpa e sementes.
27
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Coleta dos frutos
Os frutos da Terminalia catappa Linn (amêndoas) foram coletados de três
árvores distintas localizadas no clube da AABB e no Estádio Municipal Primaverão,
na cidade de Itapetinga – BA, em março de 2008. A Amostra testemunho da espécie
foi incorporada ao acervo do Herbário André Maurício Vieira de Carvalho, do
CEPEC, em Ilhéus – BA, sob o Nº de registro 122.935 e identificada pelo curador do
herbário Dr. André M. Amorim. Foram selecionadas amêndoas no estágio de
maturação em que são consumidas (coloração arroxeada), uma vez que não existem
estudos sobre padrões dos estágios de maturação da mesma. Após lavagem em água
destilada e secagem manual dos frutos, eles foram despolpados, sem a eliminação da
casca, no laboratório de Química Analítica da Universidade Estadual do Sudoeste da
Bahia (UESB), na cidade de Itapetinga (Figura 1.4).
Figura 1.4 – Amêndoas inteiras e despolpadas (caroços).
3.2. Caracterizações físicas e químicas da polpa e das sementes
Para as caracterizações físicas e químicas, os frutos da T. catappa foram
submetidos a análises dos teores de umidade, cinzas, lipídios, fibras, proteínas e
sólidos solúveis totais (SST - ºBrix). Os frutos também foram caracterizados quanto à
composição e teor de minerais, à acidez e ao pH.
As análises de umidade, acidez e pH foram realizadas a partir dos furtos
frescos e parte da polpa fresca foi separada para ser submetida à extração em etanol e
para a análise de SST.
Da outra parte dos frutos, a polpa e os caroços foram submetidos à pré-
secagem em estufa de circulação forçada de ar à temperatura de 55 ± 5ºC durante 18
horas, quando o material apresentou peso constante e a polpa, consistência quebradiça.
Posteriormente, a polpa foi moída em moinho, da marca Marconi e as sementes foram
retiradas dos caroços em pedaços pequenos. As amostras pré-secas foram
28
acondicionadas em frascos de vidro hermeticamente fechados e identificados e
submetidas às demais análises (Rech et al., 2006). Todas as análises foram realizadas
em triplicatas.
3.2.1. Medida do pH
Para as análises de pH pesou-se 1,5 g de cada amostra fresca e adicionou-se
aproximadamente 10 mL de água destilada. O material foi macerado, filtrado e a
solução sobrenadante foi transferida para um balão volumétrico de 100 mL. Em
seguida, adicionou-se mais 10 mL de água destilada em cada amostra e deixou-se em
repouso por um período de 15 min. O procedimento foi repetido sucessivamente até
que a água se tornasse clara. Então, o volume do balão foi completado com água
destilada.
As medidas de pH foram realizadas nos filtrados obtidos, utilizando-se
pHmetro marca GEHAKA, modelo W3B.
3.2.2. Determinação da acidez titulável
A acidez total das sementes foi determinada por titrimetria, utilizando-se
fenolftaleína como indicador ácido-base. Para a determinação da acidez da polpa
utilizou-se o método de titulação potenciométrica, uma vez que a amostra é colorida e
sua cor prejudica a visualização do ponto final.
As soluções aquosas obtidas a partir das sementes para a análise de pH (100
mL) foram transferidas para erlenmeyers de 250 mL, posteriormente, adicionou-se
fenolftaleína e titulou-se com solução de NaOH 0,0929 M (Instituto Adolfo Lutz,
1985). Para a análise da polpa, cada amostra (100 mL) obtida anteriormente foi
colocada em béquer sob agitação magnética e utilizou-se o pHmetro para acompanhar
a variação do pH ao longo da titulação. O ponto de viragem foi estabelecido como pH
= 8,1 (Cecchi, 2007), uma vez que a constituição química de um alimento é complexa,
existindo diversos compostos com diferentes pontos de equilíbrio ácido-base.
3.2.3. Sólidos solúveis totais (ºBrix) da polpa
As leituras do grau Brix do suco integral da polpa de cada amostra (1 a 2
gotas) foram feitas por refratometria, utilizando-se o refratômetro portátil da marca
QUIMIS. O aparelho foi calibrado à temperatura ambiente com água destilada e
procedeu-se às leituras das amostras (Instituto Adolfo Lutz, 1985).
29
3.2.4. Determinação da umidade
A determinação do teor de umidade foi conduzida de acordo com metodologia
apresentada por Rech et al. (2006), com modificações.
Pesou-se 3 g da amostra fresca em pesa-filtro, previamente aquecido em estufa
a 105 ºC por uma hora, resfriado em dessecador até a temperatura ambiente e pesado.
A polpa e as castanhas frescas foram submetidas à pré-secagem em estufa de
circulação forçada de ar à temperatura de 55 ± 5ºC durante 18 horas, quando o
material apresentou peso constante e a polpa, consistência quebradiça.
A secagem definitiva foi realizada após a etapa da pré-secagem, descrita
anteriormente, em estufa de secagem a 105ºC por um período de três horas. As
amostras secas foram retiradas da estufa, colocadas em um dessecador para esfriar,
durante uma hora. Pesou-se, anotando todos os pesos em uma ficha. Repetiu-se as
operações de aquecimento por uma hora e resfriamento até que as amostras
apresentassem peso constante.
3.2.5. Determinação do teor de cinzas
A determinação do teor de cinzas foi realizada segundo metodologia descrita
em Rech et al. (2006), com modificações.
Pesou-se 2 g da amostra pré-seca em cadinho de porcelana previamente
aquecido em mufla a 550 ºC durante 15 minutos, resfriado em dessecador até a
temperatura ambiente e pesado. A amostra foi incinerada em mufla a 550 ºC por 4
horas, até a obtenção de cinza clara. Depois, o material foi colocado em dessecador
para esfriar durante aproximadamente três horas (até temperatura ambiente) e pesado.
3.2.6. Determinação da composição de minerais
Os minerais foram quantificados por fluorescência de raios-X (FRX), no
Centro de Tecnologia do Gás-CTGAS localizado na cidade de Natal-RN. De acordo
com o principio da técnica, o analisador irradia raios-X na amostra e o sistema detecta
os sinais de fluorescência gerados. O tubo de raios-X utilizado foi de ródio e a
atmosfera de trabalho foi de hélio. A energia de excitação utilizada foi de 50 keV e
detector operando a -176
o
C. A amostra foi colocada em uma cubeta coberta por um
filme de polipropileno de 5 μm de espessura. O equipamento utilizado foi o Shimadzu
modelo EDX-720.
3.2.7. Determinação do teor de lipídios
O teor de lipídios foi determinado de acordo com a metodologia descrita em
Rech et al. (2006), com modificações. Pesou-se 1 g de amostra pré-seca em papel
30
filtro e fez-se um envelope com o mesmo. A amostra foi colocada no extrator tipo
Soxhlet a 105 ºC, cujo balão foi previamente aquecido por uma hora, resfriado em
dessecador até a temperatura ambiente e pesado. Colocou-se éter etílico P. A.
suficiente para cobrir a amostra. O tempo total de extração foi de 5 horas para as
amostras da polpa e 7 horas para as sementes. Após esse processo, o solvente foi
evaporado, o balão com o extrato foi colocado em estufa a 105 ºC durante 12 horas,
resfriado em dessecador até a temperatura ambiente e pesado.
3.2.8. Determinação do teor de fibras
A partir das amostras desengorduradas na etapa anterior, foram realizadas as
análises de fibra detergente neutra (FDN) e fibra detergente ácida (FDA), conforme
metodologia descrita em Rech et al. (2006). Utilizou-se aparelho digestor de fibras da
ANKOM e saquinhos específicos para acondicionar as amostras (Filter Bags for Fiber
Analysis – F57 da marca ANKOM).
As análises de FDN e FDA foram realizadas seqüencialmente. Primeiramente,
pesaram-se os saquinhos identificados e posteriormente as amostras restantes da
análise anterior juntamente com os saquinhos, que, em seguida, foram selados. As
amostras foram colocadas no aparelho, programado para 1h e 15 min a 100°C, e
cobertas com a solução em detergente neutro (FDN), preparada conforme descrito em
Silva e Queiroz (2002). Após este período, a solução foi descartada e as amostras
foram lavadas três vezes com água destilada em ebulição durante 5 min. Os saquinhos
contendo as amostras foram retirados, o excesso de água removido e os mesmos foram
colocados em estufa a 105 °C por um período de 15 horas. Após a secagem, as
amostras foram colocadas em dessecador para esfriar e pesadas em seguida.
A análise de FDA foi realizada logo após, a partir das mesmas amostras,
através de procedimento semelhante ao anterior, utilizando-se solução digestora ácida
(20g de brometo-cetil-trimetilamônio em 1 L de solução de H
2
SO
4
1 N) ao invés da
solução de FDN.
3.2.9. Determinação do teor de proteína bruta
Utilizou-se o processo Semimicro Kjeldahl, segundo Silva e Queiroz (2002),
com modificações. Colocou-se 200 mg de amostra pré-seca em tubo de digestão. Em
seguida adicionou-se aproximadamente 2 g da mistura catalítica (10 partes de sulfato
de potássio) e 5 mL de H
2
SO
4
. Iniciou-se a digestão à temperatura moderada,
aumentando-se gradualmente até a temperatura máxima de 400°C. A amostra foi
retirada 30 minutos após se tornar uma solução de coloração azul esverdeada clara. O
processo de digestão foi de aproximadamente 3 horas. Após esfriar, adicionou-se uma
31
pequena porção de água destilada (cerca de 20 mL) e misturou-se. O tubo digestor foi
colocado em destilador de nitrogênio Tecnal (TE 036/1) e adicionou-se cerca de 25
mL de solução de NaOH a 50%. Adicionou-se em erlenmeyer (125 mL) 10 mL de
solução de ácido bórico a 4% com solução indicadora mista de vermelho-de-metila e
verde-de-bromocresol. O erlenmeyer foi adaptado ao destilador para o recebimento da
amônia, mantendo-se o terminal do condensador mergulhado na solução receptora até
que toda a amônia fosse liberada. O volume do destilado foi de aproximadamente 75
mL e a cor da solução mudou de rosa para verde. Titulou-se com HCl 0,0216 N até a
mudança de coloração verde para rosa.
3.2.10. Determinação do teor de carboidratos
O teor de carboidratos foi obtido pelo cálculo de diferença das outras frações
analisadas (umidade, cinza, extrato etéreo e proteína) (Gondim, 2005).
32
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Composição centesimal
Os resultados obtidos para a composição química centesimal da polpa da T.
catappa (Tabela 1.2) apresentam valores próximos aos descritos para algumas frutas
tipicamente consumidas no Brasil (Tabela 1.3). O conteúdo de cinzas (1,06 ± 0,13 %)
é aproximadamente 50% maior que a média dos valores apresentados por estas frutas
(0,45%).
Tabela 1.2 – Composição centesimal da polpa e da castanha dos frutos da T. catappa
coletados em Itapetinga-BA (g /100 g de amostra)
Amostras
Polpa
Castanha Castanha seca
Umidade
82,67 ± 4,06 23,88 ± 0,39 4,66 ±0,52
Lipídios 0,35 ± 0,09 42,13 ± 6,05 52,72 ± 7,19
Proteínas 0,85 ± 0,30 19,27 ± 1,45 24,14 ± 0,98
Cinzas 1,06± 0,13 3,06 ± 0,45 3,83± 0,55
Carboidratos 15,08 ± 3,85 11,67 ± 5,45 14,65 ± 6,95
FDN 4,78 ± 1,84 10,91 ± 6,29 13,71 ± 8,02
Fibras
FDA 4,11 ± 1,70
5,71 ± 4,17 7,18 ± 5,31
Os valores são expressos em média ± desvio-padrão.
Tabela 1.3 – Composição centesimal de frutas (g /100 g de parte comestível)
Fruta Umidade Proteína Lipídios Carboidrato Fibra
alimentar
Cinzas
Abacaxi
86,3 0,9 0,1 12,3 1,0 0,4
Acerola
90,5 0,9 0,2 8,0 1,5 0,4
Banana prata
71,9 1,3 0,1 26,0 2,0 0,8
Goiaba vermelha
85,0 1,1 0,4 13,0 6,2 0,5
Maçã Fuji
84,3 0,3 traços 15,2 1,3 0,2
Mamão Papaia
88,6 0,5 0,1 10,4 1,0 0,4
Manga Haden
82,3 0,4 0,3 16,7 1,6 0,4
Maracujá
82,9 2,0 2,1 12,3 1,1 0,8
Uva Rubi
86,1 0,6 0,2 12,7 0,9 0,5
Fonte: Tabela brasileira de composição de alimentos / NEPA-UNICAMP, 2006.
Os resultados da composição centesimal das sementes secas estudadas (Tabela
1.2) apresentam valores dentro da faixa daqueles descritos por Oliveira et al. (2000) e
González-Mendoza et al. (2005) para as castanhas da T. catappa, com relação aos
teores de umidade, lipídios e carboidratos. O teor médio de umidade (4,66 ± 0,52 %)
está abaixo daquele apresentado pelas castanhas estudadas do Ceará (7,70 ± 0,19 %) e
o conteúdo de cinzas (3,83 ± 0,55 %) é maior (2,4 ± 0,06 %). Isto pode ser explicado
por condições de secagem diferentes, as quais não são apresentadas no referido
33
trabalho (Oliveira et al., 2000). Quanto ao teor médio de proteínas (24,14 ± 0,98 %),
este se apresenta menor que o valor obtido por Oliveira et al. (2000) (29,4 ± 1,12 %) e
consideravelmente maior que os valores obtidos para as sementes estudadas em
diferentes regiões da Venezuela (14,01± 1,68 a 16,32 ± 1,03) (González-Mendoza et
al., 2005).
Comparando os resultados obtidos com os valores apresentados para a noz e
castanha-do-pará cruas (Tabela 1.4), a semente in natura da T catappa apresenta um
valor médio de umidade bem maior (23,88 ± 0,39 %) e um menor conteúdo de lipídios
(42,13 ± 6,05 %). A castanha seca apresenta teor de umidade (4,66 ± 0,52 %) próximo
aos valores da noz e da castanha-do-pará cruas, logo a sua composição centesimal
pode ser comparada à composição dessas. Assim, a castanha seca estudada apresenta
valores médios de lipídios (52,72 ± 7,19 %), cinzas (3,83± 0,55%) e carboidratos
(14,65 ± 6,95 %) dentro da faixa de valores apresentados na Tabela 1.4. Já o conteúdo
de proteínas é consideravelmente maior (24,14 ± 0,98 %), o que revela o potencial
nutricional da mesma.
Tabela 1.4 – Composição centesimal da noz e da castanha-do-pará
(g/ 100 g de parte comestível)
Umidade Proteína Lipídios Carboidrato Fibra
alimentar
Cinzas
Castanha
-do-Pará
3,5 14,5 63,5 15,1 7,9 3,4
Noz
6,2 14,0 59,4 18,4 7,2 2,1
Fonte: Tabela brasileira de composição de alimentos / NEPA-UNICAMP, 2006.
Essa avaliação da constituição química básica dos frutos da espécie T. catappa
é de grande importância, uma vez que ainda existem poucos estudos publicados sobre
a composição química e nutricional desses frutos (Ángel et al., 2003; Christian e
Ukhun, 2006; González-Mendoza et al., 2005; Oliveira et al., 2000). Este estudo
também é importante do ponto de vista da grande variação das características
morfológicas, sensoriais e da variabilidade genética dessa espécie ao longo das
diferentes regiões do Brasil e do mundo (Thomson e Evans, 2006). Portanto se torna
necessário a investigação da composição química destes frutos ao longo dessas
diversas regiões.
A polpa da amêndoa-da-praia é comestível, porém não é amplamente
consumida, sendo este fato ainda desconhecido por muitas pessoas. A composição
centesimal de um alimento nos dá informações básicas sobre o potencial nutricional
do mesmo, mas se torna necessário uma avaliação completa dos aspectos nutricionais,
34
como composição de vitaminas, perfil de ácidos graxos, constituintes protéicos, além
de fatores antinutricionais e outros.
Além disso, a composição centesimal de um alimento fornece informações
básicas sobre o seu potencial de utilização tecnológica. A proporção entre os
constituintes analisados influencia o comportamento do alimento nos diversos tipos de
processamento, como, por exemplo, o rendimento do produto e os tipos de alterações
químicas sofridas.
4.2. Teor de fibras
A polpa das amêndoas apresentou um conteúdo médio de fibras (4,78 ± 1,84
% para FDN e 4,11 ± 1,70 % para FDA) superior aos valores apresentados pela
maioria das frutas na Tabela 1.3, que variam entre 0,9 % e 2,0 %. Já as sementes
apresentaram teores de fibras bem maiores, de 10,91 ± 6,29 % e 13,71 ± 8,02 %, para
FDN nas castanhas cruas e secas, respectivamente. Esses dados estão dentro da faixa
de valores apresentados para noz e castanha-do-pará destacados na Tabela 1.4.
A solução detergente neutra é usada para dissolver substâncias facilmente
digeridas, como a pectina e o conteúdo celular da planta (proteínas, açúcares e
lipídios), deixando um resíduo fibroso, a Fibra em Detergente Neutro (FDN). Esta é a
parte da amostra constituída, basicamente, de celulose, hemicelulose e lignina, que são
os principais componentes da parede celular, além de proteínas danificadas pelo calor,
a maior parte das proteínas da parede celular, amido e minerais insolúveis em
detergente neutro (Van Soest, 1965 citado por Silva e Queiroz, 2002).
A Fibra em Detergente Ácido (FDA) é a parte da amostra constituída, em sua
quase totalidade, de celulose e lignina, além de proteínas danificadas pelo calor, a
menor parte das proteínas da parede celular, parte da pectina e minerais insolúveis em
detergente ácido. A fração celulose representa a maior parte da FDA (Cecchi, 2007;
Van Soest, 1967 citado por Silva e Queiroz, 2002).
A Fibra Bruta (FB) corresponde ao resíduo obtido da planta após extrações
sucessivas com solventes ácido e base diluídos (Cecchi, 2007; DeVries, acessado em
julho de 2008). O método tradicional de determinação da FB considera uma porção da
proteína da planta, sendo que partes da lignina e da hemicelulose que a constituem são
solubilizadas e o resultado é então subestimado (Cecchi, 2007; Silva e Queiroz, 2002).
Logo, esse método clássico não inclui muitos componentes que normalmente são
associados com atividades fisiológicas desempenhadas pelas fibras (DeVries, acessado
em julho de 2008).
O termo “Fibra Dietética” (FD), que evoluiu com o desenvolvimento da
ciência, é atualmente empregado para designar o material vegetal constituído
35
basicamente da parede celular, além de polissacarídios, lignina e substâncias
associadas que não necessariamente são originárias da parede celular, que são
resistentes à hidrólise enzimática da digestão humana. Atualmente já se sabe que não
somente a fibra oriunda da parede celular, mas também aquela não proveniente da
mesma tem ações fisiológicas importantes, atribuídas às fibras em geral. (DeVries,
acessado em julho de 2008; Trowell, 1976).
Vários são os métodos analíticos que têm como objetivo a determinação do
conteúdo das fibras alimentares da dieta humana. Estes métodos foram desenvolvidos,
aperfeiçoados e modificados ao longo do tempo, de forma a obter resultados próximos
ao conteúdo vegetal não digerível pelo homem, mas que desempenha papel
fundamental na sua saúde. Ao mesmo tempo, observa-se uma evolução no
conhecimento da constituição química e da função fisiológica da Fibra Dietética.
Assim, a ciência se esforça para aproximar a metodologia analítica ao sistema
digestivo humano.
Neste sentido, o método usado no presente trabalho não constitui um estudo
detalhado da composição da fibra das amêndoas, mas possui vantagens em relação à
metodologia tradicional de determinação da Fibra Bruta. Isto porque na análise de
FDN e FDA considera-se diferentes compostos, além de incluir a hemicelulose e a
lignina, importantes constituintes das fibras.
A presença de fibra alimentar nos alimentos é de grande interesse na área da
saúde, já que estudos epidemiológicos indicaram uma relação inversa entre a ingestão
de fibras e algumas formas de câncer, problemas cardiovasculares, diverticulite,
apendicite, cálculos biliares, varizes, diabetes e hemorróidas (DeVries, acessado em
julho de 2008).
Uma maior ingestão de fibras aumenta a suavidade fecal, o seu volume, a
capacidade orgânica de reter água e reduz o tempo do trânsito intestinal, aumentando,
dessa forma, a remoção de materiais estagnados ou potencialmente prejudiciais do
intestino (DeVries, acessado em julho de 2008).
4.3. Acidez total e pH
Na Tabela 1.5 estão apresentados os resultados de acidez e pH para a polpa e
as castanhas estudadas. A acidez foi expressa em mEq /100 g de amostra, uma vez que
os ácidos orgânicos encontram-se presentes nas frutas em misturas complexas
(Chitarra e Chitarra, 2005) e não se tem dados do principal ácido constituinte da
amêndoa tropical.
36
Tabela 1.5 – Valores de pH e acidez para a polpa e as castanhas da T. catappa frescas
% Acidez
Amostras
pH
( mEq /100 g)
Polpa 4,37 ± 0,52 7,94 ± 4,41
Castanhas
6,86 ± 0,19 3,44 ± 0,49
Os valores são expressos em média ± desvio-padrão
Os ácidos orgânicos presentes nos tecidos vegetais podem se encontrar nas
formas livre ou esterificada. Os ácidos fracos livres, na presença de seus sais de
potássio, apresentam pequena variação no pH em função do equilíbrio estabelecido no
sistema. Na célula, esses ácidos encontram-se associados com seus sais de potássio e
constituem sistemas tampões. A capacidade tampão de alguns sucos permite que
ocorram grandes variações na acidez titulável, sem variações apreciáveis no pH.
Contudo, numa faixa de concentração de ácidos entre 2,5 e 0,5 %, o pH aumenta com
a redução da acidez, sendo utilizado como indicativo dessa variação. Uma pequena
variação nos valores de pH é bem detectável nos testes organolépticos (Chitarra e
Chitarra, 2005).
4.4. Teor de sólidos solúveis totais da polpa
A polpa apresentou um teor médio de sólidos solúveis totais (SST) de 12,96 ±
0,52 °Brix, que está entre os valores mínimos descritos para frutas como ameixa, uva,
cereja e outras (Chitarra e Chitarra, 2005).
O teor de sólidos solúveis representa o total de todos os sólidos dissolvidos na
água, começando com açúcares, sais, proteínas, ácidos entre outros (Moraes, 2006).
São constituídos principalmente por açúcares, variando com a espécie, a forma de
cultivo, o estágio de maturação e o clima, com valores médios entre 8% e 14%
(Chitarra e Chitarra, 2005).
Dentre os diversos componentes da fruta, os SST (°Brix) desempenham um
papel primordial para a sua qualidade, devido à influência nas propriedades
termofísicas, químicas e biológicas da fruta. Na indústria, a análise do ºBrix tem
grande importância, no controle dos ingredientes a serem adicionados ao produto e na
qualidade final deste. A determinação do °Brix é utilizada, por exemplo, na produção
de doces, sucos, polpas e bebidas em geral (Costa et al., 2004). As matérias-primas
serão tanto melhores para a industrialização quanto maiores forem os seus teores de
SST (Chitarra e Chitarra, 2005).
37
O teor de SST é expresso em grau Brix (°Brix) ou % em volume, que é a
quantidade em gramas, de SST existentes em 100 mL de solução (suco) (Chitarra e
Chitarra, 2005).
A relação sólidos solúveis/acidez titulável é uma das formas mais utilizadas de
avaliação do sabor de frutos, sendo mais representativa que a medida isolada de
açúcares ou da acidez. Essa relação proporciona uma boa idéia do equilíbrio entre
esses dois componentes (Chitarra e Chitarra, 2005).
Além disso, a medida de °Brix pode ser usada como índice de maturação de
frutos juntamente com outros parâmetros. Em relação à amêndoa-da-praia, não foram
encontrados na literatura estudos referentes à pós-colheita. Assim, os resultados
obtidos no presente estudo podem variar caso haja uma definição e padronização do
estádio de maturação ideal para o consumo desses frutos.
4.5. Composição de minerais
A Tabela 1.6 ilustra os teores dos elementos minerais encontrados na castanha
e na polpa obtidas dos frutos secos da T.Catappa colhidos de duas diferentes árvores.
Os minerais desempenham diversos papéis essenciais no organismo, tanto na
sua forma iônica em soluções nos fluidos corporais, quanto como constituintes de
compostos essenciais. Eles também atuam como cofatores enzimáticos, sendo,
portanto, requeridos em quantidades que dependem da fase de crescimento, das
condições fisiológicas (gravidez, lactação) do estado nutricional e da saúde (Krause e
Mahan, 1991). Além disso, regulam o equilíbrio ácido-base, a pressão osmótica, a
atividade muscular e nervosa, facilitam a transferência de compostos essenciais
através das membranas e, em alguns casos, fazem parte dos elementos constituintes
dos tecidos do organismo (Shils et al. 1994).
Os elementos minerais reconhecidos como essenciais são comumente
divididos em macrominerais ou minerais principais, que o organismo humano
necessita em maior quantidade (cálcio, fósforo, potássio, sódio, cloro, magnésio,
enxofre) e os minerais traços (microminerais), que são necessários em doses diárias
bem pequenas (ferro, cobre, cobalto, manganês, zinco, iodo, flúor, molibdênio,
selênio, cromo, silício). A importância de sua inclusão na dieta tem sido amplamente
discutida em textos sobre nutrição (Sgabieri, 1987). Os macrominerais são necessários
em quantidades de 100 mg ou mais por dia e os microminerais, embora em menor
quantidade (miligramas ou microgramas por dia), são também importantes para o
organismo humano.
A partir dos resultados obtidos, verificou-se a presença dos elementos
minerais K, Ca, S, P, Si, Cu, Fe, Zn, Rb e Mg tanto na polpa quanto na castanha do
38
fruto da T.catappa. Tanto a polpa como as castanhas são ricas em macrominerais,
exceto o Na, que não foi encontrado em ambas e o Cl que não foi encontrado na
castanha. Entre os microminerais, verificou-se a presença de Fe, Cu, Zn, Si. O Mn foi
encontrado somente na castanha.
A polpa dos frutos analisados mostrou-se uma boa fonte de potássio, duas
vezes mais que na castanha. Já os elementos Ca, S, P, Si e Mg foram encontrados em
maior quantidade na castanha com valores 2, 10, 10, 7 e 4 vezes maiores que na polpa,
respectivamente. Não foram observadas grandes variações nos teores de Cu, Fe, Rb e
Zn encontrados na polpa e castanha. Notou-se a presença de Br na polpa e de Ni na
castanha.
Tabela 1.6 – Teores médios de elementos minerais
Minerais Teores de Elementos Minerais (%)
Polpa Castanha seca*
K
34,0 ± 4,36
Ca 8,9 ± 0,69
S 0,3 ± 0,01
P 0,2 ± 0,02
Cu 0,4 ± 0,16
Si 0,3 ± 0,05
Fe 0,1 ± 0,03
Rb 0,1 ± 0,04
Mg 0,7 ± 0,06
Zn 0,2 ± 0,02
Mn 0,0 ± 0,00
Ni 0,0 ± 0,00
Br 0,3 ± 0,11
Cl
7,9 ± 3,50
15,0 ± 0,30
20,9 ± 0,85
3,3 ± 0,62
3,1 ± 0,04
0,5 ± 0,11
2,2 ± 0,46
0,4 ± 0,09
0,1 ± 0,01
3,3 ± 0,32
0,5 ± 0,06
0,4 ± 0,07
0,4 ± 0,03
0,0 ± 0,00
0,0 ± 0,00
Os valores são expressos em média ± desvio-padrão.
*Análises realizada após pré-secagem das amostras até 4,66 ±0,52 % de umidade.
39
5. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos no presente trabalho apontam para o potencial
nutricional e tecnológico da polpa e das sementes da espécie T. catappa. A busca por
fontes alimentícias alternativas e pela utilização de espécies disponíveis em níveis
locais tem impulsionado pesquisas com o objetivo de traçar o perfil nutritivo dessas
amêndoas. Estudos regionalizados, de modo a explorar espécies acessíveis e muitas
vezes subutilizadas, são de grande relevância.
Assim como outras castanhas, normalmente comercializadas e bastante
apreciadas em todo o mundo, as castanhas da amendoira-da-praia são ricas em
lipídios, proteínas, minerais e fibras, além de bastante saborosas.
Diante desses resultados, podemos concluir que o fruto da T. catappa pode vir
a se constituir numa alternativa promissora para o enriquecimento nutricional de dietas
para populações com baixo poder aquisitivo, amenizando dessa forma, a carência em
relação aos nutrientes que fazem parte da composição química dessas espécies.
40
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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44
CAPÍTULO 2
EXTRAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO DE FENÓIS TOTAIS E IDENTIFICAÇÃO
DE COMPOSTOS FENÓLICOS DA POLPA DOS FRUTOS
DA Terminalia catappa Linn
1. REVISÃO DE LITERATURA
1.1. Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos têm sido tópicos de pesquisas extensivas nos últimos
anos devido aos efeitos benéficos que proporcionam à saúde, como a ação
anticarcinogênica, anti-úlcera, anti-trombótica, anti-inflamatória, anti-alergênica,
moduladora do sistema imunológico, antimicrobiana, vasodilatadora e analgésica.
Os referidos compostos fazem parte de um grande e diversificado grupo de
metabólitos secundários de plantas, essenciais para seu crescimento e reprodução.
Além disso, eles atuam como agentes antipatogênicos e contribuem com a
pigmentação. Em alimentos, são responsáveis pela cor, adstringência, aroma e
estabilidade oxidativa. As principais fontes destes compostos são frutas cítricas, como
limão, laranja e tangerina, além de outras frutas como cereja, uva, ameixa, pêra, maçã
e mamão, sendo encontrados em maiores quantidades na polpa, que no suco da fruta.
Pimenta verde, brócolis, repolho roxo, cebola, alho e tomate também são excelentes
fontes destes compostos (Ângelo e Jorge, 2007).
Do ponto de vista químico, os compostos fenólicos podem ser definidos como
substâncias que possuem no mínimo um anel aromático em sua estrutura, com uma ou
mais hidroxilas como grupos funcionais. Estes grupos podem ser substituídos por
ésteres, ésteres metílicos e glicosídeos. Possuem estrutura química heterogênea e com
isso, são multifuncionais. Existem cerca de cinco mil fenóis, dentre eles, destacam-se
os flavonóides, ácidos fenólicos, fenóis simples, cumarinas, taninos, ligninas e
tocoferóis (Naczk e Shahidi, 2004).
Os compostos fenólicos englobam desde moléculas simples até moléculas
com alto grau de polimerização. Estão presentes nos vegetais nas formas livres ou
conjugadas, ligados a açúcares (glicosídeos) e proteínas (Naczk e Shahidi, 2004).
Atualmente, este grupo de substâncias é de grande interesse, tanto nutricional,
por sua contribuição na manutenção da saúde humana, como do ponto de vista
tecnológico. Em alimentos, eles desempenham uma série de funções, como prevenção
da oxidação de lipídios e proteção de vitaminas e enzimas, além de influenciar nas
45
qualidades sensoriais (cor, sabor, aroma) e na qualidade nutricional de produtos
frescos e processados (Naranjo, 2006).
1.2. Estrutura e classificação dos compostos fenólicos
1.2.1. Fenóis simples
Os fenóis simples, como o catecol, o guaiacol e o floroglucinol (Figura 2.1)
são pouco freqüentes na natureza, com exceção dos derivados quinônicos hidroxilados
presentes em algumas famílias (Rosáceas, Ericáceas e outras) geralmente na forma de
glicosídeos (Fresno, 1999).
OH
OH
OHOH
OH
OH
OCH
3
(a) (b) (c)
Figura 2.1 - (a) Catecol, (b) guaiacol, (c) floroglucinol (Fresno, 1999)
1.2.2. Ácidos fenólicos
Este grupo engloba todos os compostos orgânicos que têm pelo menos uma
função carboxílica e um grupo hidroxila fenólico, no entanto, na prática esta
denominação fica reservada aos derivados do ácido benzóico e do ácido cinâmico
(Fresno, 1999).
(i) ácidos fenólicos derivados do ácido benzóico
Estes compostos se encontram amplamente distribuídos no reino vegetal, tanto
em gimnospermas como nas angiospermas, podendo ser encontrados livres ou
combinados na forma de heterosídeos ou ésteres (Figura 2.2) (Fresno, 1999).
COOH
OH
R
2
R
1
R
1
R
2
H H ácido p-
hidroxibenzóico
OH H ácido protocatético
OCH
3
H ácido vanílico
OH OH ácido gálico
OCH
3
OCH
3
ácido siríngico
Figura 2.2 – Ácidos fenólicos derivados do ácido benzóico (Fresno, 1999)
46
Alguns desses, como o ácido gálico e seu dímero o ácido elágico,
desempenham um importante papel na constituição dos taninos hidrolisáveis (Fresno,
1999).
(ii) ácidos fenólicos derivados do ácido cinâmico
Alguns destes compostos estão presentes praticamente em todos os vegetais
como os ácidos p-cumárico, caféico, ferúlico e sinápico (figura 2.3). Outros, por outro
lado, como o ácido o-cumárico, por exemplo, estão menos distribuídos na natureza.
(Fresno, 1999).
OH
COOH
R
2
R
1
R
1
R
2
H H ácido p-cumárico
OH H ácido caféico
OCH
3
H ácido ferúlico
OCH
3
OCH
3
ácido sinápico
Figura 2.3 – Ácidos p-hidroxicinâmicos (Fresno, 1999)
Normalmente aparecem na forma de ésteres de álcoois alifáticos ou do ácido
quínico. Também podem estar esterificados a açúcares (geralmente a glicose) e grupos
hidroxilas de alguns metabólitos secundários, como flavonóides, antocianosídeos,
saponosídeos, etc. Podem, igualmente, estar na forma de amidas derivadas da
tiramina, putrescina entre outras (Fresno, 1999).
O ácido caféico é comumente encontrado em muitas frutas, vegetais,
condimentos e bebidas. O ácido clorogênico (éster do ácido caféico e ácido quínico) é
o composto fenólico majoritário do café e foi isolado de folhas e frutos de plantas. O
ácido ferúlico é encontrado nas folhas e sementes de muitas plantas incluindo trigo
integral, aveia, café, maçãs, amendoim, e ananases (Simpson, 2006).
(a) (b)
Figura 2. 4 - Ácido caféico (a) e ácido clorogênico (b)
47
1.2.3. Flavonóides
Os flavonóides constituem o grupo de compostos fenólicos mais importante e
abundante das plantas (Harborne e Williams, 2000). Nos vegetais estes compostos
atuam na formação de pigmentos, na proteção à radiação ultravioleta, na defesa contra
patógenos, na proteção contra danos oxidativos e no controle da ação de hormônios
como as auxinas (Fresno, 1999; Naranjo, 2006). Encontram-se amplamente
distribuídos em frutas e vegetais comestíveis, assim como em seus produtos derivados,
como vinho, cerveja, sucos e outros (Naranjo, 2006).
Esses compostos estão amplamente distribuídos em todo o reino vegetal,
constituindo a maioria dos pigmentos amarelos (flavonas, flavonóis, chalconas,
auronas, flavanonas), roxos e azuis (antocianinas) de flores e de alguns frutos. São
particularmente abundantes nas plantas vasculares. Destacam-se as famílias
Asteraceae, Rutaceae, Fabaceae, Umbelliferae, Lamiaceae, entre outras, pelo conteúdo
e diversidade estruturais de flavonóides existentes nelas. Salvo algumas exceções, as
antocianinas estão presentes em todas as angiospermas; nas gimnospermas são
característicos os biflavonóides (formas dímeras, com freqüência, de flavonas e
flavanonas) em Cycadales e Coniferales (com exceção de Pinnaceae) (Fresno, 1999).
Do ponto de vista químico, os flavonóides são fenóis que possuem uma
estrutura básica do tipo diaril-propano (Ar-C
3
-Ar), constituída por um anel benzênico
condensado a uma γ-pirona (ou seus derivados) substituída na posição 2 ou 3 por um
radical fenil, conforme representado na Figura 2.5. Em sua maioria, esses compostos
encontram-se unidos a um açúcar (Fresno, 1999).
O
O
1
2
3
4
5
6
7
8
1'
2'
3'
4'
5'
6'
Figura 2.5 – 2-fenilbenzopirona, núcleo dos flavonóides
Dependendo do grau de oxidação do anel pirânico central os flavonóides
podem diferenciar-se em vários tipos (Figura 2.6) (Fresno, 1999):
a) 2(3)-fenilbenzopirona: flavonas, flavonóis, flavanonas, isoflavonas,
chalconas (com anel pirânico aberto) e auronas (homólogos de flavonas com
heterociclo pentagonal).
b) 2-fenilbenzopirano: 3-flavanóis (catequinas), 3,4-flavanodióis
(leucoantocianinas).
c) 2-fenilbenzopirilo (cátion flavílio): antocianinas
48
A presença de grupos hidroxilas é freqüente nas posições 3, 5, 7, 3’, 4’, 5’;
que podem estar livres, eterificados por metanol ou unidos a açúcares (L-raminose, D-
glicose, D-galactose, L-arabinose ou outros) constituindo, em sua maioria, O-
heterosídeos. Podem encontrar-se também como C-heterosídeos, sendo que neste caso
a ligação se estabelece entre o carbono anomérico do açúcar e o C
6
ou C
8
da genina. É
freqüente a acilação das hidroxilas do açúcar; sendo que nos antocianosídeos se
realiza, sobretudo, na série dos 3,5-diosídeos (Fresno, 1999). Os flavonóides também
se encontram na forma de polímeros com diferentes graus de polimerização (Aoki et
al., 2000).
Figura 2.6 – Principais grupos estruturais de flavonóides
As antocianinas formam um dos grupos de pigmentos mais amplamente
distribuído no reino vegetal. Estes compostos são responsáveis por uma larga faixa de
cores da maioria dos vegetais comestíveis, incluindo azul, roxa, violeta, magenta,
vermelha e alaranjada (Fennema, 1996; Malien-Aubert et al., 2001).
Estruturalmente, esses pigmentos são glicosídeos de poliidroxi e/ou
polimetoxi derivados do íon flavílio. Todos possuem o mesmo esqueleto básico
hidroxilado nas posições 3, 5 e 7 e diferem entre si no número e posição de hidroxilas
e/ou grupos metoxi presentes, nos tipos, números e posições dos açúcares na molécula
e nos tipos e números de ácidos alifáticos ou aromáticos ligados aos açúcares da
molécula (Fennema, 1996; Malacrida e Motta, 2006; Naranjo, 2006), como ilustrado
49
na Figura 2.7. Os açúcares mais comuns são glicose, galactose, arabinose, xilose,
raminose e di- ou trissacarídeos homogêneos ou heterogêneos formados da
combinação destes. Estes se unem à aglicona (antocianidina) através de uma ligação
do tipo éter entre o seu carbono anomérico e, na maioria das vezes, o C3; podendo se
ligar também aos carbonos 5 e 7 do anel flavílico (Fennema, 1996; Kuskoski et al.,
2006; Naranjo, 2006).
O
OH
OH
R1
OH
R2
O
O
OH
CH
2
OH
OH
OH
1
2
6
8
3
4
5
7
A
B
+
Aglicona
(Estrutura do anel B)
Substituição glicosídica
(nas posições 3 e 5)
Acilação
(esterificação das hidroxilas do
açúcar)
R
1
R
2
H H pelargonidina D-glicose Ácidos cinâmicos
OH H cianidina D-galactose p-cumárico
OH OH delfinidina D-xilose ferrúlico
OCH
3
H peonidina L-ramnose caféico
OCH
3
OH petunidina L-arabinose
OCH
3
OCH
3
malvidina rutinose Ácidos alifáticos
soforose acético
sambubiose malônico
gentiobiose succínico
Figura 2.7 – Antocianinas
Em condições levemente ácidas (pH entre 4 e 6), que é como se encontram
nos vacúolos celulares, as antocianidinas se apresentam como uma mistura de quatro
espécies denominadas base quinoidal, cátion flavílio, pseudobase carbinol e chalcona,
que coexistem em equilíbrio a uma temperatura de 25ºC (Figura 2.8.) A proporção de
cada uma destas formas dependerá do pH. Quando este aumenta, a quantidade da base
quinoidal aumenta, a pH neutro predomina a forma aniônica da base quinoidal, de
coloração azulada, enquanto que em condições mais ácidas (pH < 2,0) predomina o
cátion flavílio de cor vermelha. Este último é um híbrido de ressonância, no qual a
carga positiva está deslocalizada por todo o heterociclo aromático, originando um
cátion oxônio, no qual a maior densidade de carga positiva se localiza nos carbonos 2
e 4 (Francis, 2000; Naranjo, 2006).
50
1.2.4. Taninos
Os taninos são amplamente distribuídos na natureza. São encontrados em
muitas plantas medicinais, produtos alimentícios e bebidas e sua aplicação na indústria
do couro e outras como de corantes e adesivos são de grande utilidade para o homem
(Fresno, 1999).
Figura 2.8 – Formas estruturais de antocianinas em equilíbrio em meio aquoso
Esses compostos estão relacionados a diversos efeitos fisiológicos, como sua
propriedade de se ligar a proteínas, muito importante no processamento de alimentos;
capacidade de reduzir a pressão sanguínea, acelerar a coagulação sanguínea, diminuir
o nível de lipídios no soro e modular respostas imunológicas (imunomoduladores). Em
vinhos, eles têm potencial atividade antioxidante, associada à sua atuação em
lipoproteínas de baixa densidade (LDL), cujas formas oxidadas podem desencadear
doenças coronarianas. A quantidade e o tipo de taninos são críticos para estes efeitos.
(Millic e Stojanovic, 1972; Reed, 1995; Teissedre et al., 1996).
Os taninos são compostos fenólicos hidrossolúveis, de massa molar
compreendida entre 500 e 5000, que apresentam, além das reações clássicas dos
fenóis, a propriedade de precipitar os alcalóides, a gelatina e outras proteínas. Após o
conhecimento da estrutura química de muitos taninos, este termo começou a ser
substituído por outros, como polifenóis, proantocianidinas e poliésteres de ácido
gálico (Fresno, 1999).
51
Nos vegetais superiores se distinguem dois grupos de taninos diferentes por
sua estrutura e por sua origem biossintética: taninos hidrolisáveis e taninos
condensados. Os taninos hidrolisáveis são poliésteres de um açúcar, geralmente
glicose, ou de um poliol e um número variável de ácidos fenólicos. São hidrolisáveis
por ácidos, álcalis e enzimas (Fresno, 1999).
Segundo a natureza do ácido unido à glicose ou ao poliol têm-se distinguido
classicamente dois tipos de taninos hidrolisáveis: taninos gálicos, quando o ácido
fenólico é o ácido gálico (ácido 3,4,5-trihidroxibenzóico) e os impropiamente
chamados taninos elágicos, quando o ácido fenólico é o hexahidroxidifênico e seus
derivados de oxidação (Figura 2.9) (Fresno, 1999).
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
OH
COOH
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
Ácido gálico Ácido hexahidroxidifênico Ácido elágico
Figura 2.9 – Unidades estruturais de taninos hidrolisáveis (Fonte: Fresno, 1999)
Os taninos gálicos ou galotaninos incrementam seu grau de condensação por
esterificação entre unidades de ácido gálico para produzir cadeias das chamadas
unidades depsídicas. Estes taninos têm a estrutura β-penta-O-galoil-D-glicose, às quais
se unem entre uma e cinco unidades galoil. Estas unidades estão distribuídas sobre
essas espécies nas posições C-2, C-3 e C-4 e as uniões depsídicas se estabelecem entre
a carboxila de um ácido gálico e a hidroxila em meta ou para em relação à carboxila
do outro (Figura 2.10) (Fresno, 1999).
O
OG
OG
OG
OG
O
O
OG
O
OG
OG
OG
O
OG
OG
O
OG
OG
G
O
G
G
O
G
G
O
G
O
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
OGG
2
3
4
Taninos gálicos
Figura 2.10 – Ligações m-depsídicas entre as unidades de ácido gálico para formar
taninos gálicos (Fonte: Fresno, 1999)
52
Estes depsídeos têm sido isolados de plantas de várias famílias, entre elas,
Combretaceae (Fresno, 1999).
Para formação dos elagitaninos, os acoplamentos oxidativos mais freqüentes
implicam nos resíduos galoil em C-2/C-3 e C-4/C-6 de uma pentagaloilglicose. São
exemplos deste tipo a telimagrandina I e II com acoplamento oxidativo C-4/C-6
(Figura 2.11). Mais raramente o acoplamento oxidativo ocorre entre os grupos galoil
em C-2/C-4 ou C-3-C-6 da glicose (Fresno, 1999).
O
OG
OG
OG
OG
OG
O
R
OG
O
OG
OH
OH
O
O
O
OH
OH
OH
OH
Pentagaloilglicose
Telimagrandina I R = OH
Telimagrandina II R = (beta)-OG
4
6
3
5
2
1
Figura 2.11 – Elagitaninos (Fonte: Fresno, 1999)
Elagitaninos mais complexos, oligômeros e polímeros, com massa molar
compreendida entre 2000 e 5000, podem se formar pelo acoplamento oxidativo
intermolecular entre elagitaninos monômeros. Essa união se estabelece por ligação C-
O entre o ácido hexahidroxidifênico de um e um ácido gálico do outro. A distribuição
dos oligômeros é mais limitada e se encontra em espécies de Rosaceae, Fagaceae,
Betulaceae, Combretaceae, Cornaceae, Tamariceae, Nyssaceae, Hamamelidaceae e
Theaceae (Fresno, 1999).
Os taninos condensados ou proantocianidinas são oligômeros e polímeros
flavânicos (Figura 2.12). São constituídos por unidades de flavan-3-óis ou catequinas
unidas entre si por ligações C-C. Diferenciam-se dos taninos hidrolisáveis pelo fato de
suas moléculas serem mais resistentes à ruptura, e a sua estrutura estar relacionada
com os flavonóides. O nome proantocianidina deriva do fato de que por aquecimento
com ácidos esses compostos dão origem a antocianidinas e se denominam
procianidinas, prodelfinidinas e propelargonidinas, etc., conforme a antocianidina
resultante seja cianidina, delfinidina ou pelargonidina.
As proantocianidinas estão associadas à adstringência que muitas frutas
comestíveis apresentam antes da maturação (Martinez-Valverde et al., 2000). As
reações químicas que são a base dessa adstringência consistem na formação de
complexos entre os taninos condensados e proteínas da saliva. O grau de
53
polimerização dos taninos influencia na sensação de adstringência e amargor, de
forma que os trímeros e dímeros apresentam maior adstringência que os monômeros,
enquanto que o amargor diminui com o aumento do tamanho da molécula (Peleg et al.,
1999).
OOH
OH
OH
OH
OH
R
O
OH
OH
OH
OH
OH
R
O
OH
OH
OH
OH
OH
R
O
OH
OH
OH
OH
OH
R
O
OH
OH
OH
OH
OH
R
(n)
Polímeros de procianidina (R=H) e prodelfinidina (R=OH)
Figura 2.12 – Proantocianidinas (Fonte: Fresno, 1999)
Desde 1985 tem-se isolado de plantas superiores vários representantes de uma
nova categoria de taninos, taninos complexos ou taninos mistos, que fazem mais
imprecisa a fronteira entre os taninos hidrolisáveis e os condensados. São taninos
elágicos modificados, que resultam da adição de um derivado de 2-fenil-cromano em
uma molécula de éster de ácido hexahidroxidifênico e glicose. Ou seja, têm-se
encontrado estruturas intermediárias entre as duas categorias clássicas de taninos.
Assim, a complexidade das estruturas atualmente conhecidas torna mais imprecisa a
tradicional classificação de taninos em hidrolisáveis e condensados e tem modificado
o conceito antigo de taninos (Fresno, 1999).
54
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Estudar a composição de fenóis em amostras da polpa das amêndoas da
Terminalia catappa Linn.
2.2 Objetivos Específicos
- Obter o extrato etanólico a partir da polpa.
- Identificar os compostos fenólicos do extrato etanólico por HPLC.
- Quantificar o teor de compostos fenólicos totais no extrato obtido.
55
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Obtenção do extrato da polpa
Após lavagem em água destilada e secagem manual dos frutos, a polpa foi
separada da semente juntamente com a casca. Os extratos foram preparados
utilizando-se aproximadamente 130 g da polpa fresca picada em pequenos pedaços. A
extração foi realizada em erlenmeyer (500 mL) protegido da luz e tampado, à
temperatura ambiente, através da imersão do material em etanol P.A. Foram realizadas
sucessivas extrações, até que o solvente se tornasse bem claro, de modo a garantir a
extração máxima dos compostos de interesse para as análises posteriores. O tempo
total de extração foi de 6 a 9 horas, com um gasto de 600 a 1000 mL de solvente.
Após a extração, o extrato foi filtrado.
Em seguida, o extrato foi submetido à evaporação do solvente, em evaporador
rotativo, sob vácuo, a 50°C até eliminação completa do álcool. Depois esse material
foi submetido a um processo de liofilização a pressão de 0,180 mBar e – 59 °C em
liofilizador da marca LABCONCO, uma vez que a polpa da amêndoa possui um alto
teor de água.
O extrato bruto obtido foi utilizado para a realização das análises que se
seguem.
3.2. Determinação de fenóis totais
A quantidade de compostos fenólicos totais nos extratos da polpa foi
determinada pelo método do reagente Folin-Ciocalteau, de acordo com metodologia
descrita em Usenik et al. (2008), com modificações. O extrato obtido da polpa foi
dissolvido em solução etanólica a 70% a uma concentração de 4 mg/mL. Tomou-se
uma alíquota de 100 μL da solução do extrato, adicionou-se 6 mL de água destilada e
500 μL do reagente Folin-Ciocalteau. Depois de aproximadamente 5 minutos à
temperatura ambiente, adicionou-se 1,5 mL de solução de carbonato de sódio a 20 %.
Agitou-se a mistura e após 30 min à 40°C a absorbância foi medida a 780 nm em
espectrofotômetro Shimadzu Mod UV-1240-mini. Utilizou-se como branco uma
solução contendo etanol a 70% e os demais reagentes na mesma proporção descrita
anteriormente, com exceção do extrato.
O teor de fenóis totais foi determinado por interpolação da absorbância das
amostras em uma curva analítica construída com soluções padrões de ácido gálico em
etanol P. A. (10 a 350 μg/mL). Os resultados foram expressos como mg em
equivalentes de ácido gálico por 100 g de extrato. As análises foram realizadas em
triplicata (Sousa et al., 2007).
56
3.3. Determinação do perfil cromatográfico das amostras utilizando HPLC
acoplado à espectrometria de massas
Essas análises foram realizadas no Depto. De Química Analítica, Nutrição e
Bromatologia da Universidade de Salamanca, Salamanca, Espanha.
Para a determinação do perfil cromatográfico dos extratos obtidos, utilizou-se
o sistema HPLC (Agilent Technologies 1100 series, Waldbronn, Germany)
constituído de uma bomba, um injetor de amostra e um detector de arranjo de diodos
(Diode-Array), utilizando-se a coluna Aqua (Phenomenex, Torrance, CA, USA),
coluna C18, 5 µm, 150 x 4,6 mm. A aquisição dos dados e controle do sistema foram
feitos com o programa ChemStation. Todas as separações foram conduzidas a 35°C.
As detecções com o arranjo de diodos foram realizadas nas seguintes condições:
leituras entre 200-600 nm, usando intervalos de leitura de 1 Hz e comprimentos de
onda de 5 nm (Alcalde-Eon et al., 2004).
Foram utilizados dois procedimentos para a detecção de compostos da classe
dos flavonóides: um para flavonóis e outro para antocianinas. As demais classes de
compostos fenólicos não puderam ser caracterizadas pelas técnicas utilizadas, devido à
ausência de tempo disponível para realizar os procedimentos adequados para sua
identificação.
Para a análise das antocianinas as amostras foram dissolvidas na fase móvel,
filtradas com filtro Dismic-13JP (0,50 μm, Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltd.,
Japan), injetadas diretamente na coluna do HPLC (100µL) e eluídas com um gradiente
constituído por uma solução aquosa de ácido trifluoracético (TFA) a 0,1 % (Solução
A) e acetonitrila (ACN) (Solução B), a uma vazão de 0,5 mL/min. Iniciou-se a eluição
com 90 % da Solução A e 10 % da Solução B, modificando-se as concentrações das
soluções de acordo com os valores indicados na Tabela 2.1 (Alcalde-Eon et al., 2004).
Tabela 2.1 – Condições utilizadas na obtenção do perfil cromatográfico
das antocianinas
Tempo (min.) % Solução A % Solução B
Vazão
(mL/min.)
Pressão Máxima
(Bar)
0 90 10 0,5 400
5 90 10 0,5 400
20 85 15 0,5 400
25 85 15 0,5 400
30 82 18 0,5 400
50 75 35 0,5 400
60 90 10 0,5 400
70 90 10 0,5 400
57
Para a análise dos flavonóis as amostras foram dissolvidas na fase móvel,
filtradas com filtro Dismic-13JP (0.50 μm, Advantec, Toyo Roshi Kaisha, Ltda.,
Japan), injetadas diretamente na coluna do HPLC (100µL) e eluídas com um gradiente
constituído por uma solução aquosa de ácido acético (HOAc) a 2,5 % (Solução A) e
acetonitrila (ACN) (Solução B), a uma vazão de 0,5 mL/min. Iniciou-se a eluição com
90% da Solução A e 10% da Solução B, modificando-se as concentrações das
soluções de acordo com os valores indicados na Tabela 2.2 (Alcalde-Eon et al., 2004).
Tabela 2.2 – Condições utilizadas na obtenção do perfil cromatográfico dos flavonóis
Tempo (min.) % Solução A % Solução B
Vazão
(mL/min.)
Pressão Máxima
(Bar)
0 90 10 0,5 400
50 70 30 0,5 400
55 50 50 0,5 400
60 50 50 0,5 400
65 90 10 0,5 400
70 90 10 0,5 400
A saída da célula de fluxo do detector de diodos foi conectada diretamente ao
espectrômetro de massas (Finnigan LCQ, San José, CA, USA), equipado com uma
fonte de ionização a pressão atmosférica do tipo electrospray (AP-ESI).
Para as antocianinas as análises foram realizadas em modo positivo, usando
uma voltagem de ionização de 4,5 KV. A temperatura do capilar foi de 195ºC.
Utilizou-se o nitrogênio como gás de arraste e auxiliar, com vazões de 1,2 e 0,6 L/min,
respectivamente. Os espectros foram registrados entre 155 e 1500 m/z (relação
massa/carga). O aparelho foi programado para realizar uma série de três varreduras
consecutivas:
1. Full MS,
2. MS2 do íon majoritário no full MS e
3. MS3 do íon majoritário no MS2.
A energia de colisão normalizada foi de 45%, usando hélio como gás de
colisão.
Para os flavonóis as análises foram realizadas em modo negativo, usando uma
voltagem de ionização de 2,5 KV. A temperatura do capilar foi de 175 ºC. Utilizou-se
o nitrogênio como gás de arraste e auxiliar, com vazões de 1,2 e 0,6 L/min,
respectivamente. Os espectros foram registrados entre 230 e 1500 m/z. O aparelho foi
programado para realizar uma série de três varreduras consecutivas, conforme descrito
anteriormente (Alcalde-Eon et al., 2004).
58
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Teor de compostos fenólicos totais
A análise do teor de compostos fenólicos totais foi realizada
espectrofotometricamente de acordo com o método de Folin-Ciocalteu, utilizando
ácido gálico como padrão. A Figura 2.13 ilustra a curva analítica de ácido gálico
obtida com a finalidade de determinar o teor de fenólicos totais no extrato da polpa da
T. catappa.
Os compostos fenólicos são capazes de atuarem como agentes redutores e
junto com outros compostos antioxidantes presentes na dieta têm a capacidade de
proteger o organismo contra o estresse oxidativo e doenças associadas. A partir de
vários estudos que têm sido realizados, verificou-se que os compostos fenólicos
apresentam ação antiinflamatória, antitrombogênica, antitumorais, antivirais e
antiosteoporótica. Além de prevenir doenças degenerativas como aquelas de origem
cardiovascular.
O teor de compostos fenólicos totais encontrados no extrato etanólico da polpa
dos frutos da T. catappa foi de 2319,0 ± 249,0 mg/100g em equivalentes de ácido
gálico. Este resultado é muito superior aos resultados obtidos em frutos tropicais
(Kuskoski, et al., 2006) considerados como boas fontes dessas substâncias (Tabela
2.3). Esse resultado indica que a polpa desse fruto tem potencialidade para prevenir
doenças oriundas do estresse oxidativo entre outras, como destacado anteriormente.
y = 0,0015x + 0,0143
R
2
= 0,9959
0,000
0,050
0,100
0,150
0,200
0,250
0,300
0,350
0,400
0,450
0,500
0 100 200 300 400
Concentração μg/mL
Abs a 780 n
m
Figura 2.13 – Curva analítica de ácido gálico
59
Tabela 2.3 – Teor de compostos fenólicos totais em frutos tropicais expressos
em mg de ácido gálico/100g de frutos
(extratos do jambolão e de polpas congeladas comercializadas, reconstituídas)
Fruta
Compostos
Fenólicos Totais
Jambolão EtOH 229,6 ± 13,6
Jambolão MetOH 194,7 ± 3,5
Polpa de amora 118,9 ± 2,1
Polpa de uva 117,1 ± 0,6
Polpa de açaí 136,8 ± 0,4
Polpa de morango 132,1 ± 3,8
Polpa de acerola 580,1 ± 4,6
Polpa de abacaxi 21,7 ± 4,5
Polpa de manga 544,9 ± 7,3
Polpa de graviola 84,3 ± 5,8
Polpa de cupuaçu 20,5 ± 3,0
Polpa de maracujá 20,0 ± 2,6
Polpa de goiaba 83,0 ± 1,3
Valores expressos em média ± desvio-padrão.
(Fonte: Kuskoski et al., 2006)
O estudo realizado por Da Silva (2003) mostra a diferença entre os teores de
polifenóis totais das frações (casca, polpa e semente) das uvas Riesling Itálico e
Cabernet Sauvignon (Tabela 2.4). Os altos teores encontrados para a casca,
aproximadamente 10 vezes maior que para a polpa, pode explicar o alto valor obtido
no presente trabalho para o extrato etanólico dos frutos da T. catappa, uma vez que o
mesmo foi obtido a partir da polpa juntamente com a casca.
Tabela 2.4 – Teores de polifenóis totais das frações das uvas
expressos em mg de ácido gálico/100 g da fração em base seca
Frações e vinhos Polifenóis totais (mg/100g)
Casca
1458,71 ± 116,20
Polpa
168,62 ± 2,91
Riesling Itálico
Semente
5097,59 ± 79,08
Casca
2670,39 ± 336,92
Polpa
216,62 ± 3,64
Cabernet
Sauvignon
Semente
5120,22 ± 41,65
Os teores de polifenóis estão expressos em média ± desvio-padrão. (Fonte: Da Silva, 2003)
60
4.2. Perfil cromatográfico das amostras
A identificação de todos compostos feitos neste trabalho foi realizada em
colaboração com a Faculdade de Farmácia da Universidad de Salamanca, Espanha, no
Departamento de Química Analítica, Nutrición y Bromatología, sob coordenação do
professor Julián C. Rivas-Gonzálo e com a participação ativa do senhor José Joaquín
Pérez Alonso, que realizou todas as análises e fez a interpretação dos espectros de
massas, usando como referência uma base de dados criada no próprio Departamento, a
partir da identificação de compostos fenólicos analisados em vários anos de trabalhos
realizados pelo grupo (Pallauf et al., 2008; Silva et al., 2007; González-Paramás et al.,
2006).
Os cromatogramas de todas as amostras analisadas foram semelhantes para
cada procedimento realizado e as interpretações dos espectros de massas de alguns
picos característicos detectados nos mesmos ajudaram a confirmar a presença dos
seguintes compostos nas amostras:
(i) Com relação às antocianinas foram detectados principalmente os seguintes
compostos: 3-Glucosídeo da Delfinidina, 3-Glucosídeo da Cianidina, 3-Glucosídeo da
Pelargonidina, 3-Glucosídeo da Peonidina e 3-Glucosídeo da Malvidina (Figura 2.7),
comumente encontrados em frutos e vegetais e um derivado da Vitisina. Observa-se
no cromatograma representado abaixo (Figura 2.14), a presença de outros picos que
ainda não foram identificados, entretanto análises dos espectros de massas
correspondentes estão sendo feitas para caracterizar outros compostos.
mi
n
0 5 10 15 20 25 30 35 40
mAU
0
50
100
150
200
DAD1 A, Sig=505,4 Ref=off (JJOAQUIN\BALANTO.D)
4.181
7.574
14.772
18.104
21.412
24.401
26.151
27.413
42.941
Glucosídeo de
Delfinidina
(1)
Glucosídeo de
Cianidina
(2)
Glucosídeo de
Peonidina
(4)
Glucosídeo de
Pelargonidina
(3)
Derivado da
Vitisina
Glucosídeo da
Malvidina
(5)
Figura 2.14 – Cromatograma das principais antocianinas detectadas
61
(ii) Com relação aos flavonóis foram detectados principalmente os seguintes
compostos: glucosídeo da Miricetina; glucosídeo da Isoharmnetina, rutinosídeo da
quercetina (Figura 2.15).
Flavonóis
R R1 R2 R3
Glucosídeo
da miricetina
açúcar OH OH OH
Glucosídeo
da isoharmnetina
açúcar OCH
3
OH H
Rutinosídeo
da quercetina
açúcar OH OH H
O
OR
OH
OH
O
R1
R2
R3
Figura 2.15 – Flavonóis detectados no extrato etanólico da polpa
(iii) Observou-se também a presença do Ácido Elágico e de Elagitaninos (Figura 2.9).
No cromatograma representado na Figura 2.15 aparecem outros picos que
ainda não foram identificados e que também estão sendo analisados.
Figura 2.16 – Cromatograma dos principais flavonóis detectados
Os perfis cromatográficos obtidos a partir do extrato etanólico da polpa dos
frutos da T. catappa indicaram a presença de compostos fenólicos do grupo dos
flavonóides (antocianinas e flavonóis), ácidos fenólicos e taninos.
mi
n
0 10 20 30 40 50 60
mAU
-10
0
10
20
30
40
DAD1 A, Sig=350,4 Ref=off (JJOAQUIN\BAL2.D)
4.260
4.525
4.915
5.202
5.611
6.684
7.380
8.053
8.783
10.632
12.212
14.036
15.020
15.840
18.480
19.031
25.204
26.187
28.404
29.912
32.628
38.681
45.164
47.601
59.957
60.656
Rutinosídeo da Quercetina (8)
Ácido Elágico
Elagitaninos
Glucosídeo da Miricetina (6)
Glucosídeo da Isorhamnetina (7)
62
5. CONCLUSÃO
Considerando os efeitos benéficos que os compostos fenólicos exercem sobre
a saúde humana, os resultados obtidos no presente trabalho indicam que a T. catappa
pode atuar como uma boa fonte natural desses compostos.
Como essa espécie não é explorada para fins alimentícios, a divulgação dos
resultados destacados é muito importante para a valorização de seus frutos como uma
alternativa alimentar de baixo custo.
É também de grande importância identificar outros compostos fenólicos além
dos descritos, diante da capacidade de atuarem como antioxidantes naturais e da
contribuição que podem dar à saúde humana.
63
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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65
66
CAPÍTULO 3
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE IN VITRO DO EXTRATO
ETANÓLICO DA POLPA DA Terminalia catappa Linn
1. REVISÃO DA LITERATURA
1.1 Oxidação e saúde
A oxidação é essencial para a obtenção de energia para o desenvolvimento dos
processos biológicos em organismos vivos. No entanto, radicais livres e outras
espécies reativas de oxigênio, que são continuamente produzidas nesses processos
vitais, resulta em morte celular e danos em tecidos (Halliwell e Gutteridge, 1999
citado por Chyau et al., 2002). Os seres humanos e outros seres aeróbios só podem
tolerar o oxigênio porque, ao mesmo tempo em que foram desenvolvendo cadeias de
transporte de elétrons e outros sistemas enzimáticos para usá-lo, defesas antioxidantes
para proteger contra os efeitos tóxicos do O
2
evoluíam em paralelo (Aruoma et al.,
1991).
O oxigênio está presente na atmosfera como um birradical triplete estável
(
3
O
2
). Uma vez inalado, ele sofre um processo gradual de redução até ser
metabolizado em água. Neste processo, uma pequena quantidade de intermediários
reativos, como o radical superóxido (•O
2
-
), radical hidroxil (•OH) e peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) são formados. Esses radicais livres e espécies reativas,
coletivamente denominadas espécies reativas de oxigênio, podem facilmente iniciar a
peroxidação dos lipídios componentes das membranas celulares, resultando na
acumulação de peróxidos de lipídios. Os produtos dessa oxidação e outros de
oxidações secundárias são altamente reativos; eles reagem com substratos biológicos
como proteínas, aminas e ácidos desoxirribonucléico (DNA). Estes processos resultam
no desenvolvimento de algumas doenças degenerativas como aterosclerose, diabetes e
cirrose, e podem ter uma contribuição significativa para o envelhecimento humano e o
risco do câncer (Halliwell e Gutteridge, 1999 citado por Chyau et al., 2002; Sato et al.,
1996).
Sistemas biológicos ou químicos geradores de •O
2
-
podem danificar muitas
biomoléculas. É geralmente aceito que grande parte da toxicidade do •O
2
-
e do H
2
O
2
nos organismos vivos é devido à conversão de ambos em •OH e em complexos
iônicos reativos de oxigênio-radical-metal. A formação de •OH é catalisada por metais
de transição. Os íons de titânio, cobre, ferro, cobalto e níquel são catalisadores
67
potenciais da formação desses radicais. Esta capacidade catalítica dos íons metálicos
sugere que a disponibilidade de íons de ferro e cobre livres no corpo humano deve ser
cuidadosamente controlada (Aruoma et al., 1991).
Radicais livres de importância em organismos vivos incluem hidroxil (
•
OH),
superóxido (•O
2
-
), óxido nítrico (NO) e peroxil (ROO•). Peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
), oxigênio singlete (
1
O
2
) e ozônio (O
3
) não são radicais livres, mas podem
facilmente conduzir a reações com radicais livres em organismos vivos (Aruoma et al.,
1991).
A manutenção da homeostase do estado redox celular é feita por meio de
mecanismos que agem controlando a produção dos radicais livres, a sua eliminação ou
desativação e reparando os danos oxidativos. Existem dois mecanismos antioxidantes:
o enzimático e o não-enzimático ; ambos agem cooperativa e sinergisticamente para
manter o equilíbrio dos radicais livres no organismo (Ribeiro, 2006). Porém, a
formação de espécies reativas de oxigênio além da capacidade de antioxidantes para
removê-los leva à condição de "estresse oxidativo", podendo danificar células por uma
variedade de complexos mecanismos interrelacionados (Aruoma et al., 1991).
Além da produção fisiológica dos radicais livres de oxigênio e de nitrogênio, o
organismo humano está sujeito à ação de xenobióticos (fármacos, poluentes e
contaminantes químicos), os quais podem aumentar a produção de radicais livres
durante a sua biotransformação e, conseqüentemente, favorecer a instalação do
estresse oxidativo nos tecidos (Gonzalez, 2005).
1.2 Antioxidantes naturalmente presentes em alimentos
Os compostos antioxidantes presentes em alimentos desempenham um papel
importante como um fator de proteção da saúde. Grãos inteiros, frutas e legumes são
fontes primárias de antioxidantes de ocorrência natural. Antioxidantes alimentares de
origem vegetal como ácido ascórbico (vitamina C), tocoferóis (vitamina E),
carotenóides, e diversos compostos fenólicos têm sido reconhecidos como tendo
potencial de reduzir risco de doenças. A maioria dos compostos antioxidantes numa
dieta típica é derivada de fontes vegetais e pertencem a várias classes de compostos
com uma grande variedade de propriedades físicas e químicas (Prakash, 2001).
Além disso, na área de nutrição, íons como selênio, cobre, zinco, ferro e
manganês são freqüentemente incluídos no grupo de nutrientes antioxidantes, por
serem constituintes de enzimas envolvidas na proteção contra o estresse oxidativo
(Simpson, 2006).
68
1.3 Mecanismo da oxidação de lipídios
A oxidação de lipídios é uma das maiores causas de deterioração em
alimentos, sendo de grande interesse econômico para a indústria por levar ao
desenvolvimento de vários sabores e odores chamados de ranço (rancidez oxidativa)
em óleos comestíveis e no conteúdo lipídico de alimentos. É geralmente aceito que a
auto-oxidação, que é a reação com o oxigênio molecular via mecanismo auto-
catalítico, é a principal reação envolvida na deterioração oxidativa de lipídios. Essa
reação pode ainda diminuir a qualidade nutricional de um alimento e produzir
compostos potencialmente tóxicos (Fennema, 1996). Além disso, conforme exposto
anteriormente, a oxidação de lipídios em organismos vivos desempenha um
importante papel na saúde. Portanto, as etapas dessa reação serão apresentadas de
modo a ilustrar o mecanismo da auto-oxidação.
A auto-oxidação de lipídios ocorre por típicos mecanismos via radicais livres
e pode ser representada por um esquema simplificado de três etapas. O mecanismo é
iniciado pela remoção de hidrogênio de um ácido graxo (RH), com a formação de um
radical alquil (R•) e de radical hidrogênio (H•). Uma vez que a reação entre os ácidos
graxos e o oxigênio atmosférico é termodinamicamente difícil, a produção dos
primeiros radicais livres necessários para dar início à etapa de propagação deve ser
catalisada. Assim, o início da oxidação pode ocorrer pela decomposição de um
hidroperóxido, pela catálise por íons metálicos ou pela exposição à luz ou ao calor
(equação 1) (Araújo, 2004; Fennema, 1996; Simpson, 2006).
Depois da iniciação, a reação em cadeia se propaga pela retirada de átomos de
hidrogênio de outros ácidos graxos insaturados, formando novos radicais alquil. Os
radicais alquil formados, que são altamente reativos, reagem com o oxigênio
atmosférico (O
2
) produzindo radicais peroxil (ROO•) (equação 2), que por sua vez
retiram átomos de hidrogênio de outros ácidos graxos para produzir hidroperóxidos
(ROOH) e novos radicais alquil (equação 3). Assim, a seqüência de reações se repete
(Araújo, 2004; Fennema, 1996; Simpson, 2006).
Os hidroperóxidos são relativamente instáveis e se decompõem produzindo
uma grande variedade de compostos. Estes produtos podem sofrer posterior oxidação
e decomposição, contribuindo deste modo com grande quantidade e variedade de
radicais livres. A primeira etapa da decomposição do hidroperóxido é a cisão
homolítica da ligação oxigênio-oxigênio dando origem a um radical alcoxil (RO•) e
um radical hidroxil (•OH) (equação 4) (Fennema, 2006). Assim que a concentração de
radicais livres aumenta, eles começam a reagir entre si para formar dímeros de ácidos
graxos livres, aldeídos, álcoois, cetonas, ésteres, epóxidos, hidrocarbonetos e produtos
de condensação, que causam cheiro e sabor característicos chamados de ranço e
69
alteram a cor e a textura, caracterizando a etapa da terminação (equações 5, 6 e 7).
(Araújo, 2004; Fennema, 1996; Simpson, 2006).
Iniciação
RH R• + H• (equação 1)
(metais, luz, calor)
Propagação
R• + O
2
ROO• (equação 2)
ROO• + RH ROOH + R• (equação 3)
(equação 4)
Terminação
RO• + •OH
aldeídos, ácidos,
R• + R• álcoois, epóxidos, (equação 5)
R• + ROO• hidrocarbonetos, (equação 6)
ROO• + ROO• polímeros e outros. (equação 7)
1.4 Antioxidantes como aditivos
Antioxidantes são substâncias que podem retardar o início, ou diminuir a
velocidade da oxidação de materiais auto-oxidáveis. Muitos compostos naturais e
sintéticos, têm sido descritos por possuírem propriedades antioxidantes. A sua
utilização em alimentos, no entanto, é limitada a determinados requisitos,
principalmente em relação à sua segurança. Os principais antioxidantes solúveis em
lipídios usados em alimentos são fenóis mono ou poliidroxilados com vários
substituintes no anel aromático. Na figura 3.1 estão representadas as estruturas
químicas dos antioxidantes fenólicos permitidos pela legislação brasileira para alguns
tipos de alimentos (ANVISA, 2008). Para uma máxima eficiência, antioxidantes
primários são geralmente usados em combinação com outros antioxidantes fenólicos
ou com vários agentes seqüestrantes de metais (Fennema, 1996).
70
OH
C(CH
3
)
3
O(CH
3
)
O(CH
3
)
OH
C(CH
3
)
3
OH
C(CH
3
)
3
O(CH
3
)
(CH
3
)
3
C
OH
C(CH
3
)
3
OH
OH
OH
COOC
3
H
7
OH
O
OH
2-BHA 3-BHA BHT
Butil hidroxianisol Butil hidroxitolueno Galato de propila
TBHQ
Terc-butil hidroquinona
α-tocoferol
Figura 3.1 – Principais antioxidantes usados em alimentos (Fonte: Fennema, 1996).
Na ciência de alimentos, os antioxidantes têm um amplo espectro de atuação,
no qual se incluem componentes que previnem rancidez em óleos, assim como os
antioxidantes da dieta. Estes últimos compreendem “substâncias presentes em
alimentos que diminuem consideravelmente os efeitos adversos de espécies reativas,
como as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, no funcionamento fisiológico
normal em humanos” (definido pelo Institut of Medicine, EUA citado por Huang et
al., 2005).
Enquanto a auto-oxidação em uma matéria inanimada ocorre por reações
radicalares em cadeia, a oxidação em sistemas biológicos é mediada principalmente
por enzimas catalisadoras de reações de oxirredução. Não obstante, a auto-oxidação
não enzimática de lipídios via reação radicalar em cadeia ainda poderá ocorrer e levar
ao estresse oxidativo. Conseqüentemente, os antioxidantes biológicos incluem
antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos. Os antioxidantes da dieta, por sua vez,
incluem, geralmente, estes últimos em larga escala, ou seja, os inibidores da reação
radicalar em cadeia, os quelantes de metais, os inibidores de enzimas oxidativas e os
cofatores de enzimas antioxidantes (Huang et al., 2005).
A partir do mecanismo da auto-oxidação apresentado anteriormente, torna-se
claro que uma substância retarda a auto-oxidação se ela inibe a formação de radicais
livres na etapa de iniciação da reação (antioxidantes preventivos) ou se ela interrompe
a propagação da cadeia de radicais livres (antioxidantes de sacrifício). A etapa de
iniciação pode ser retardada pelo uso de decompositores de peróxido, agentes
71
quelantes de metais ou inibidores de oxigênio singlete. O ácido cítrico, o ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA), e polifosfatos são exemplos de antioxidantes
preventivos que complexam íons metálicos (Fennema, 1996; Huang et al., 2005;
Simpson, 2006).
A maioria dos estudos está focada no uso de aceptores de radicais livres, uma
vez que sistemas alimentares são complexos e é muito difícil eliminar traços de
peróxidos e metais iniciadores. Logo, apesar da diferença no mecanismo de atuação,
os inibidores da reação radicalar em cadeia é que normalmente são considerados como
antioxidantes e também os mais extensivamente estudados (Fennema, 1996; Huang et
al., 2005; Simpson, 2006).
Os antioxidantes (AH) inibem a reação em cadeia agindo como doadores de
hidrogênio ou aceptores de radicais livres, reagindo primeiramente com radicais
peroxil e não com radicais alquil (equação 8). O radical livre intermediário do
antioxidante (A•) forma produtos estáveis de reação com um ROO• ou é formado um
complexo entre o radical ROO• e o inibidor, seguido pela reação do complexo com
outro ROO• para formação de produtos estáveis. Portanto, uma molécula do inibidor
(AH) elimina dois radicais livres e, assim, a reação pode ser considerada como
ocorrendo em dois estágios (Fennema, 1996; Huang et al., 2005).
ROO• + AH ROOH + A• (equação 8)
Um bom inibidor da auto-oxidação reage mais rapidamente com os radicais
peroxil (equação 8), do que estes com os lipídios na etapa da propagação (equação 3)
(Huang et al., 2005). A eficiência de um antioxidante está relacionada a muitos
fatores, incluindo energia de ativação, constantes de velocidade, potencial de redução,
reatividade do antioxidante e solubilidade. Para as duas reações competidoras
apresentadas anteriormente, ou seja, a reação de inibição e a propagação da cadeia,
que são exotérmicas, a energia de ativação aumenta com o aumento da energia de
dissociação das ligações A-H e R-H. Desta forma, a eficiência do antioxidante
aumenta com a diminuição da força da ligação A-H. No entanto, o radical livre
resultante do antioxidante não deve iniciar a formação de novos radicais livres ou ser
objeto de uma oxidação rápida por uma reação em cadeia. Neste aspecto os
antioxidantes fenólicos ocupam uma posição favorecida. Eles são excelentes doadores
de hidrogênio ou elétron e, além disso, o radical intermediário formado é
relativamente estável devido ao efeito de deslocalização da ressonância e à ausência
de posições favoráveis ao ataque pelo oxigênio molecular (Fennema, 1996).
72
1.5 Análises da capacidade antioxidante in vitro
Devido à complexidade da composição dos alimentos, separar cada composto
antioxidante e estudá-lo individualmente é oneroso e ineficiente, não obstante às
possíveis interações sinergísticas entre os compostos antioxidantes em uma mistura
alimentar. Por isso, ter um método conveniente para a rápida quantificação da eficácia
antioxidante na prevenção de doenças é de grande interesse para os pesquisadores
(Huang et al., 2005).
Não é fácil se chegar a uma avaliação da capacidade antioxidante total através
de uma única reação química, assim, pode ser necessário avaliar um extrato em vários
sistemas modelos usando técnicas analíticas diferentes para tirar uma conclusão válida
a respeito da sua eficiência antioxidante. Além disso, a atividade antioxidante de
compostos fenólicos de plantas difere muito de acordo com as propriedades físicas e
químicas do sistema modelo no qual são avaliados (Wettasinghe e Shahidi, 1999).
Baseado nas reações químicas envolvidas, a maioria dos ensaios da
capacidade antioxidante pode ser de maneira geral dividida em duas categorias:
aqueles baseados em reações de transferência do átomo hidrogênio (TAH) e os que
são baseados em reações de transferência de um elétron (TE). As análises baseadas na
transferência de elétron envolvem uma reação redox em que o oxidante atua como um
indicador do ponto final da reação. A maioria das análises baseadas na transferência
de hidrogênio monitora velocidades de reações competitivas e a quantificação é obtida
a partir das curvas cinéticas. Esses métodos são compostos geralmente de um gerador
sintético de radical livre, um sistema modelo oxidável e um antioxidante. Ambos os
tipos de análises destinam-se a medir a captura de radical (ou oxidante), ao invés da
capacidade anitoxidante preventiva de uma amostra (Huang et al., 2005).
O primeiro método descrito abaixo se baseia em uma reação de transferência
do átomo de hidrogênio, enquanto o segundo, em uma reação transferência de
elétrons.
(i) Método da co-oxidação do β-caroteno e ácido linoléico
Este método foi desenvolvido por Marco (1968) e posteriormente modificado
por Miller (1971). Este método avalia a atividade de inibição de radicais livres gerados
durante a peroxidação do ácido linoléico. O método está fundamento em mediadas
espectrofotométricas da descoloração (oxidação) do β-caroteno, induzida pelos
produtos de degradação oxidativa do ácido linoléico (Marco, 1968; Miller 1971).
Durante o ensaio, a reação de oxidação do ácido graxo linoléico ocorre a 50ºC
e é promovida pela adição de O
2
ao meio, o que resulta na produção de radicais livres.
A descoloração (oxidação) do β-caroteno, que possui cor vermelha, é induzida pelos
73
produtos da degradação oxidativa do ácido linoléico. Além desses reagentes, a mistura
contém água e Tween 40 (polioxietileno-sorbitol monopalmitato), um agente
surfactante que atua promovendo a formação da emulsão aquosa, facilitando a
dispersão do gás (O
2
) e a posterior dissolução da solução do antioxidante polar ou do
solvente correspondente (amostra controle, sem o antioxidante). O progresso da auto-
oxidação é monitorado por medidas espectrofotométricas a 470 nm realizadas ao
longo do tempo e a eficiência do antioxidante é determinada pelo seu efeito na
diminuição da velocidade de descoloração do β-caroteno (Duarte, 2006; Marco, 1968;
Miller, 1971 e Preté, 2006). Portanto, o método avalia a capacidade de uma amostra
ou composto de inibir a oxidação de um substrato lipídico (Duarte, 2006).
Segundo Marco (1968), como o objetivo do método era avaliar e classificar os
antioxidantes, era desejado um tempo de reação razoavelmente longo, uma vez que
um tempo mais extenso acentuaria as diferenças entre antioxidantes bons e ruins. No
entanto, o procedimento deveria ser suficientemente rápido para completar uma série
de comparações. Miller (1971) sugeriu um período de monitoramento de 1 a 3 horas
de reação, até que o caroteno tenha sido descolorido.
(ii) Capacidade de “seqüestro” de radicais livres DPPH•
Este método baseia-se no descoramento de uma solução composta por radicais
estáveis 2,2-difenil-1-pricrilidrazil (DPPH•) de cor violeta, quando da adição de
substâncias que podem ceder um átomo de hidrogênio (Huang et al., 2005). A
estrutura do radical estável DPPH• é mostrada na figura 3.2. Sua solução alcoólica
apresenta máximo de absorção em 517 nm. A cor muda de violeta para amarelo
quando o radical é reduzido. O progresso da reação é, portanto, monitorado a partir
decréscimo na absorbância da mistura reativa (Aruoma et al., 1997; Huang et al.,
2005; Prakash, 2001; Sánchez-Moreno et al., 1998).
N N
O
2
N
O
2
N
NO
2
.
Figura 3.2 – Radical livre 2,2-difenil-1-pricrilidrazil (DPPH•)
(Fonte: Huang et al., 2005)
Esse método possui a vantagem de ser rápido e simples, o que o torna
facilmente reprodutível (Prakash, 2001).
74
Radicais livres como ROO•, RO• e DPPH•, reagem com compostos fenólicos
(ArOH) através de dois mecanismos diferentes: (i) abstração direta de um átomo de
hidrogênio do fenol pelo radical livre X• (reações de transferência de um átomo de
hidrogênio) e (ii) processo de transferência de elétron do ArOH ou do seu ânion
fenóxido (ArO
−
) ao X• (reações de transferência de elétrons) (Figura 3.3). A
contribuição de um ou outro depende da natureza do solvente e/ou dos potenciais
redox das espécies envolvidas (Foti et al., 2004).
(
ii
)
(i)
Figura 3.3 – Mecanismos de reação entre radicais livres e fenóis (ArOH): (i) reações
de transferência de um átomo de hidrogênio e (ii) reações de transferência de elétrons.
(Fonte: Foti et al., 2004).
O radical DPPH é largamente utilizado para avaliar a atividade antioxidante
de compostos sintéticos e naturais usando-se metanol ou etanol como solvente. Os
solventes exercem uma forte influência na velocidade dessas reações. Uma vez que a
maioria das moléculas ArOH estão formando ligações de hidrogênio com os solventes
polares, essas espécies não reagem pelo mecanismo de transferência de um átomo de
hidrogênio. Assim, a velocidade da reação é dependente da força dessa ligação de
hidrogênio, da basicidade do solvente e acidez do ArOH. A velocidade desta reação
pode ser drasticamente aumentada ou diminuída pela presença de base e ácido,
respectivamente, no meio (Foti et al., 2004).
Em solventes apolares a constante de velocidade da reação entre ArOH e
ROO• é aproximadamente igual à da reação com o DPPH•, porém em solventes
polares pode ser “anormalmente” alta. Especialmente em álcoois essa reação pode não
ser representativa da taxa de abstração do átomo de H do ArOH por radicais livres.
Uma vez que, geralmente, radicais peroxil ROO• reagem com compostos fenólicos
por meio de um mecanismo que envolve a abstração de um átomo de hidrogênio, essa
atividade antioxidante não pode ser extrapolada de sua reatividade com DPPH• (Foti
et al., 2004).
75
Com base na análise da cinética da reação entre alguns fenóis e o DPPH• Foti
e colaboradores concluíram que a etapa determinante da velocidade consiste em um
rápido processo de transferência de elétron dos ânions fenóxidos para o radical DPPH•
A abstração do átomo de hidrogênio do composto fenólico neutro por esse radical
livre se torna uma etapa secundária, uma vez que ocorre muito lentamente nesses
solventes. Estes dois solventes alcoólicos têm constantes dielétricas relativamente
altas e assim suportam bem a ionização de ácidos de Bronsted e o mecanismo de
transferência de elétron (Foti et al., 2004).
Esses autores mostraram que apesar da presença do grupo ácido carboxílico
em fenóis derivados do ácido cinâmico, pequenas quantidades de ânions fenóxidos,
mas cineticamente significantes, são responsáveis pela velocidade das reações com o
DPPH, cujas velocidades decrescem com o aumento das concentrações desses
compostos.
76
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o potencial antioxidante do extrato etanólico da polpa da amêndoa
tropical a partir de frutos coletados na cidade de Itapetinga – BA.
2.2 Objetivos Específicos
- Determinar a atividade antioxidante in vitro do extrato etanólico da polpa em
diferentes concentrações, usando o sistema β-caroteno / ácido linoléico.
- Avaliar a capacidade de seqüestro de radicais livres do extrato em diferentes
concentrações, usando o radical estável DPPH.
77
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Determinação da atividade antioxidante
A atividade antioxidante foi determinada pelo monitoramento da co-oxidação
do β-caroteno e do ácido linoléico.
Inicialmente, 2 mg de β-caroteno foram dissolvidos em 20 mL de clorofórmio.
Para o preparo da emulsão, 3 mL dessa solução foram adicionados em balões de fundo
redondo (250 mL) contendo 40 mg de ácido linoléico e 400 mg de Tween 40. Após a
remoção do clorofórmio em evaporador rotativo a 50°C, adicionou-se 100mL de água
destilada, previamente aerada, por uma hora, tendo-se o cuidado de adicionar a água
lentamente, sendo que os 10 mL iniciais foram adicionados gota a gota, sob agitação
vigorosa até a formação de uma emulsão.
Para a análise espectrofotométrica, adicionou-se em cada tubo de ensaio 40 μL
da solução antioxidante (extrato ou padrão BHA) a ser avaliada ou do solvente
correspondente como controle e 3 mL da emulsão descrita anteriormente. As soluções
antioxidantes utilizadas foram o extrato da polpa dissolvidos em etanol 70% em
concentrações variando de 1 a 50 mg/mL e o padrão BHA nas mesmas concentrações
em etanol. As absorbâncias foram monitoradas a 470 nm em espectrofotômetro
(Shimadzu Mod UV–1240–mini) imediatamente após a adição da emulsão e em
intervalos de 15 min durante 120 min, tendo-se o cuidado de manter os tubos em
banho de água a 50°C. As leituras foram feitas contra um branco contendo a emulsão
sem a adição do β-caroteno. Todas as análises foram realizadas em triplicata (Emmons
e Peterson, 1999; Hammerschmidt e Pratt, 1978; Marco, 1968; Miller, 1971).
Os resultados foram expressos como porcentagem de inibição da oxidação
(%I), que foi calculada com base nos dados da taxa de degradação da amostra
contendo o antioxidante (D
a
) e da taxa de degradação do controle (D
c
), após os 120
min de oxidação, através das equações 9 e 10. Onde abs
0
é a absorvância no tempo
zero e abs
120
é a absorvância após 120 minutos de oxidação. (Emmons e Peterson,
1999):
)/ln(
1200
absabsD
=
(9)
100% ×
−
=
c
ac
D
DD
I
(10)
78
3.2 Seqüestro de radicais livres 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH)
Para a análise do seqüestro de radicais livres DPPH, primeiramente preparou-
se uma solução do extrato bruto em etanol 70% com concentração de 1 mg/mL. A
partir desta solução foram feitas diluições nas concentrações de 500, 250, 125, 50, 25,
10 e 5 µg/mL. Foram utilizadas como padrões soluções de BHA em etanol P.A. nas
mesmas concentrações (Mensor et al., 2001).
Para este ensaio, 4 mL de cada solução do extrato ou do padrão foram
misturados com 1 mL de solução metanólica 0,2 mM do radical DPPH. A mistura foi
agitada vigorosamente e mantida por 30 min no escuro à temperatura ambiente. Após
este período de reação, as leituras das absorbâncias foram realizadas em 517 nm
(Shimada et al., 1992). A amostra controle foi preparada com 4 mL do solvente
correspondente e 1 mL da solução de DPPH, sem adição do antioxidante. Para cada
amostra de extrato (5 – 500 μg/mL) foi feito um branco com 4 mL de solução de
extrato e 1 mL de metanol (Mensor et al., 2001). Todas as análises foram realizadas
em triplicata.
A porcentagem de seqüestro de radicais livres (% SRL) foi calculada através
da equação 11, correlacionando-se a absorbância de cada amostra ou do padrão (abs
a
)
com a absorbância da solução controle ao final da reação (abs
c
) (Duarte-Almeida et
al., 2006).
100% ×
−
=
c
ac
abs
absabs
SRL
(11)
79
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Inibição da oxidação
Na Figura 3.4 estão apresentados os resultados da avaliação da atividade
antioxidante, pelo sistema β-caroteno/ácido linoléico, em função da variação da
concentração de antioxidantes (extrato ou BHA). Os resultados são expressos em
porcentagem de inibição da oxidação relativa ao controle (%I). O extrato etanólico da
polpa da Terminalia catappa apresentou uma ótima atividade antioxidante (93,0 ± 5,3
%) a uma concentração de 10 mg/mL. Já o antioxidante padrão utilizado (BHA)
apresentou uma atividade de 94,3 ± 10,7 % a uma concentração de 1 mg/mL.
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
0 1020304050
Concentração (mg/mL)
% Inibição da oxidação
BHA
Ex t ra to
Figura 3.4 - Atividade antioxidante do extrato e do BHA em diferentes concentrações.
Cada valor é expresso como média ± desvio padrão (n = 3).
A Figura 3.5 ilustra o decaimento da absorbância a 470 nm com o tempo de
reação, para as diferentes concentrações do extrato e para o controle.
No estudo feito por Duarte-Almeida et al. (2006) foram testadas soluções
padrões dos antioxidantes sintéticos BHA e BHT, por serem amplamente utilizados na
indústria alimentícia. Foram utilizados também alguns antioxidantes naturalmente
presentes em frutas e vegetais, como a quercetina, o ácido gálico, o ácido ascórbico,
entre outros. Nesse estudo, os antioxidantes sintéticos apresentaram %I bem acima dos
antioxidantes naturais, enquanto que, das substâncias naturais, a quercetina apresentou
a maior %I. Segundo esses autores isso ocorre devido a quercetina ser um flavonol
com cinco hidroxilas fenólicas reativas, sendo que duas destas estão ligadas ao anel
que possui maior atividade redutora, apresentando estabilidade por ressonância. Os
autores também destacaram que a rutina possui uma estrutura semelhante à da
80
quercetina, mas com uma substituição glicosídica em uma das hidroxilas e apresenta
uma menor atividade, demonstrando a sensibilidade do método frente a pequenas
alterações na estrutura da molécula. Ainda nesse trabalho, o ácido ascórbico no
sistema β-caroteno/ácido linoléico apresentou atividade pró-oxidante, representada
pela porcentagem de inibição negativa.
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0 153045607590105120
Tempo ( min. )
Abs ( 470nm )
50 mg/mL
40 mg/mL
30 mg/mL
20 mg/mL
10 mg/mL
1 mg/mL
controle
Figura 3.5 - Descoramento do β-caroteno na presença de diferentes concentrações de
extrato e na ausência (controle).
Os dados quantitativos para % I são muito variáveis devido a diferenças nos
métodos de extração e análises disponíveis na literatura, não havendo equivalência
entre os mesmos, como também foi observado por Emmons e Peterson (1999).
Aliadas às diferenças analíticas, existem diferentes formas matemáticas de expressar a
atividade antioxidante, o que dificulta a comparação dos dados obtidos aos dados de
outros trabalhos (Duarte-Almeida et al., 2006; Emmons e Peterson, 1999;
Hammerschmidt e Pratt, 1978; Jardini e Marcini Filho, 2007; Velioglu et al., 1998).
Logo, as comparações quantitativas são feitas entre os dados de amostras submetidas
às mesmas condições de análises que um padrão antioxidante.
O padrão utilizado neste trabalho foi o BHA, por ser um antioxidante sintético
permitido pela legislação brasileira, largamente utilizado na indústria e que apresenta
uma alta eficiência antioxidante, como confirmado por Duarte-Almeida et. al. (2006).
81
4.2 Seqüestro de radicais livres DPPH - % SRL
Conforme abordado anteriormente, este método se baseia na transferência de
elétrons de um composto antioxidante para o radical livre DPPH•. Desta forma, o
método avalia o poder redutor do antioxidante.
Na Figura 3.6 estão apresentados os resultados da avaliação da capacidade
redutora de radicais livres DPPH em função da variação da concentração de
antioxidantes (extrato ou BHA). O extrato etanólico da polpa da Terminalia catappa
apresentou um ótimo poder redutor (93,5 ± 0,8 %) a uma concentração de 250 μg/mL.
Já o antioxidante padrão utilizado (BHA) apresentou 92,6 ± 0,0 % SRL e 94,9 ± 0,2 %
SRL, nas concentrações de 25 e 50 μg/mL respectivamente.
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
0 100 200 300 400 500
Concentração de antioxidante (μg/mL)
% SRL
BHA
Ex t rat o
Cada valor é expresso como média ± desvio padrão (n = 3).
Figura 3.6 – Porcentagem de seqüestro de radicais livres DPPH (% SRL) das soluções
do extrato etanólico da polpa da T. catappa e do BHA, em diferentes
concentrações.
Chyau et al. (2002) observaram valores ótimos de 92,5 a 95,7 % SRL dos
extratos metanólicos das folhas verdes, amarelas e vermelhas da T. catappa em
concentrações inferiores a 0,1 mg/mL. Já em Chyau et al. 2006, os extratos aquosos
das folhas verdes, amarelas e vermelhas apresentaram atividades SRL DPPH de 76%,
92,4 % e 65,5%, respectivamente, em concentrações de 50 mg/mL. Eles observaram
também que as atividades SRL da vitamina E e do BHA foram de 95,2 % e 95,5 %,
respectivamente, a 0,1 mg/mL. O resultado obtido no presente trabalho (94,9 % SRL)
para a solução padrão BHA entre 0,05 e 0,125 mg/mL de concentração está bem
próximo daqueles resultados.
82
Em estudo realizado por Duarte-Almeida et al. (2006), a quercetina e o ácido
clorogênico apresentaram maior porcentagem de seqüestro de radicais livres em
comparação aos padrões sintéticos BHA e BHT, sendo que este último apresentou o
menor valor. O ácido ascórbico apresentou uma atividade um pouco menor que o
BHA.
Os dados quantitativos para %SRL DPPH são muito variáveis e difíceis de
comparar devido a diferenças nos métodos de análises disponíveis na literatura, não
havendo equivalência entre os mesmos (Duarte-Almeida et al., 2006; Ekanayake1 et
al., 2004; Jayaprakasha et al., 2007; Melo et al., 2006; Oszmianski et al., 2007; Rahim
et al., 2008; Roesler, 2007).
83
5. CONCLUSÃO
A partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que o extrato etanólico da
polpa apresenta um bom potencial antioxidante, apresentando uma % I similar à do
BHA, porém a uma concentração 10 vezes maior. Esta grande diferença é aceitável,
uma vez que se trata de um extrato natural. O uso de aditivos sintéticos é mais restrito
na legislação brasileira, quando comparado a substâncias encontradas naturalmente em
alimentos ou a extratos naturais, sendo que em alguns casos estes são permitidos em
quantidade suficiente para obter-se o efeito tecnológico necessário (“quantum satis”),
sem a determinação de um limite máximo (ANVISA, 2008). A restrição ao uso de
alguns antioxidantes, como o BHA e BHT está relacionada à sua carcinogenicidade.
Quanto à análise utilizando-se os radicais DPPH, pode-se concluir que o
extrato etanólico da polpa apresentou uma excelente capacidade redutora, comparável
à do BHA em uma concentração 5 vezes maior que o mesmo.
84
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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87
88
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Grande parte da população brasileira apresenta vários problemas de má
nutrição, destacando-se carências de vitaminas e minerais, pois as principais refeições
são deficientes destes nutrientes. Os resultados obtidos, no presente trabalho,
indicaram que a T. catappa destacou-se por ser uma excelente fonte de lipídios,
proteínas, minerais e fibras, podendo ser utilizada em dietas que visem à
suplementação alimentar. Portanto, incentivar o seu consumo pode ajudar a aumentar
o valor nutritivo da dieta das populações carentes. Em razão da falta de informações,
as famílias de baixo poder aquisitivo não desfrutam dessa fonte natural de nutrientes.
Os frutos da T. catappa apresentaram em sua composição várias substâncias
que têm potencialidade para atuarem como agentes antioxidantes no organismo
humano, como os compostos fenólicos e os minerais cobre, zinco, selênio e manganês
que são constituintes de algumas enzimas relacionadas aos mecanismos antioxidantes.
Em função da complexidade da composição dos alimentos, em geral,
diferentes substâncias podem atuar sinergisticamente, por meio de diferentes
mecanismos, como espécies anioxidantes. A avaliação da capacidade antioxidante de
uma espécie, portanto, exige a utilização de técnicas analíticas diversas. Neste sentido,
no presente trabalho, foi possível avaliar que o extrato etanólico da polpa da espécie T.
catappa apresenta um elevado potencial nutritivo e antioxidante.
89
90
PERSPECTIVAS
1. Avaliação da capacidade antioxidante de extratos das sementes.
2. Condução de experimentos in vivo por meio de ensaios para o controle do
desenvolvimento de processos degenerativos e demais propriedades
funcionais atribuídas aos compostos com propriedades antioxidantes.
3. Utilização de extratos dos frutos como aditivos antioxidantes naturais em
substituição aos antioxidantes sintéticos.
4. Determinação do potencial de inibição do crescimento de microrganismos
que promovam a deterioração dos alimentos e afetam a saúde.
5. Avaliação da qualidade do óleo extraído da castanha.
6. Determinação do perfil de ácidos graxos presente no óleo.
7. Elaboração de produtos com maior valor agregado a partir da polpa e das
castanhas, como castanhas torradas e salgadas, barra de cereais, suco e
alimentos funcionais.
8. Estudo da pós-colheita desses frutos, das variações genética e de cultivo,
possibilitando plantações de tipos mais adequados para cada fim.
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