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Universidade de São Paulo
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada
Grupo de Imunogenética Molecular
Análise da Expressão Gênica Promíscua no Timo de Camundongos DBA-1/J e DBA-2/J
Durante a Imunização com Colágeno: Modelo de Susceptibilidade/Resistência a Artrite
Reumatóide
Dissertação de Mestrado
Paula Barbim Donate
Ribeirão Preto
2008
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Paula Barbim Donate
Análise da Expressão Gênica Promíscua no Timo de Camundongos DBA-1/J e DBA-2/J
Durante a Imunização com Colágeno: Modelo de Susceptibilidade/Resistência a Artrite
Reumatóide
Dissertação apresentada à Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade São Paulo para
obtenção do Título de Mestre em
Ciência; área de Concentração:
Imunologia Básica e Aplicada.
Orientador: Prof. Dr. Geraldo Aleixo da Silva Passos
C0-orientador: Prof.Dr. Fernando de Queiróz Cunha
Ribeirão Preto
2008
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DONATE, Paula B.
Análise da Expressão Gênica Promíscua no Timo de Camundongos DBA-1/J e DBA-2/J
Durante a Imunização com Colágeno: Modelo de Susceptibilidade/Resistência a Artrite
Reumatóide
103p.30cm
Dissertação de mestrado apresentada a Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
USP, Área de Concentração em Imunologia Básica e Aplicada.
Orientador: Passos, Geraldo Aleixo da Silva
Apoio e suporte financeiro
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Imunogenética Molecular, localizado no
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) – USP
com o apoio financeiro das seguintes entidades e instituições:
- Fundação de Amparo à Pesquisa de Estado de São Paulo (FAPESP) por meio da Bolsa
de Mestrado Proc. 05/57474-8 e Auxílio à Pesquisa Proc. 06/54788-4.
- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP - USP
DEDICO ESTE TRABALHO...
Às pessoas que mais amo na minha vida:
Especialmente a minha mãe, que é minha força, sempre esteve ao meu lado em todos os
momentos, e sempre confiou, acreditou e me apoiou incondicionalmente em minhas
conquistas, em todas as fases da minha vida. Ela é a razão de eu estar onde estou. Você
sempre foi mais que uma mãe para mim. Obrigada por tudo!!! Te amo muito!!!
As minhas irmãs, pela compreensão e apoio;
Meu namorado Anderson, por todo carinho, amor, paciência e companheirismo durante
todo o trajeto de desenvolvimento deste trabalho. Obrigada por ser esta pessoa
maravilhosa e ser parte da minha vida. Te amo fofitinho!!!!!!
Agradecimentos
Agradeço a todos que de alguma forma, seja ela direta ou indiretamente, me ajudaram
para que este trabalho pudesse ser concluído.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Geraldo Aleixo da Silva Passos, pela orientação e
dedicação durante o desenvolvimento deste trabalho, e por seu exemplo de
profissionalismo e seriedade que contribuíram e continuam a contribuir para meu
crescimento profissional. Muito Obrigada!!!
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Fernando de Queiróz Cunha, que me acompanha desde
a iniciação científica, pela confiança, pelos ensinamentos e apoio durante estes anos, e
por disponibilizar o laboratório para que este trabalho pudesse ser desenvolvido. Quero
agradecer também a todo laboratório de inflamação e dor, por toda ajuda,
disponibilidade e amizade.
Ao departamento de Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto (FMRP) pela dedicação, destacando o laboratório do Prof. Dr. João
Santana pelo auxílio na utilização do FACs, e especialmente a Ana por todo carinho e
paciência, sem ela o departamento não seria o mesmo!
Ao laboratório de Citogenética e Mutagênese pela ajuda, e por disponibilizar o
laboratório sempre que necessário.
Ao departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos,
especialmente ao Prof. Dr. Klauss Hartfelder, e ao departamento de Fisiologia da
Faculdade de Odontologia, especialmente a Profa. Maria José Alves da Rocha que
gentilmente me auxiliaram respectivamente na utilização do microscópio confocal e o
criostato.
Ao departamento de Genética, em particular, ao laboratório de Imunogenética
Molecular, onde foi realizado este trabalho.
Aos meus grandes amigos do grupo de Imunogenética Molecular, pela convivência
extremamente agradável, pelos ensinamentos, colaborações e pelas alegrias que
marcaram estes anos. Vocês são muito especiais!!!
“A ciência humana de maneira nenhuma nega
a existência de Deus. Quando considero
quantas e quão maravilhosas coisas o homem
compreende, pesquisa e consegue realizar,
então reconheço claramente que o espírito
humano é obra de Deus, e a mais notável”.
Galilei Galilei
Sumário
RESUMO......................................................................................................................................ii
ABSTRACT.................................................................................................................................iii
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................................2
1.1 Auto-imunidade....................................................................................................... 2
1.2 Artrite reumatóide ................................................................................................... 7
1.3 Caracterização do timo............................................................................................ 9
1.4 Caracterização da expressão promíscua no timo................................................... 16
1.5 Papel regulador do gene Aire................................................................................ 19
1.6 Análise do transcriptoma....................................................................................... 20
1.6.1 Conceito de transcriptoma .................................................................... 20
1.6.2 Métodos de análise do transcriptoma.................................................... 21
1.7 A utilização de RNA interferente (RNAi anti-Aire) na pesquisa em
imunologia................................................................................................................ 24
2 HIPÓTESE DO TRABALHO...............................................................................................27
3 OBJETIVOS ...........................................................................................................................28
4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................................30
4.1 Linhagem de camundongos DBA-1/J e DBA-2/J ................................................. 30
4.2 Indução de artrite reumatóide por imunização com colágeno............................... 30
4.3 Separação de células epiteliais tímicas (TECs)..................................................... 30
4.4 Extração de RNA total .......................................................................................... 31
4.5 Quantificação e Eletroforese de Amostras de RNA Total..................................... 32
4.6 Cultura de timo adulto (ATOC) ............................................................................ 32
4.7 Tratamento de ATOC com RNAi anti-Aire.......................................................... 33
4.8 Avaliação de apoptose e necrose em ATOC por citometria de fluxo ................... 34
4.9 Reações de RT- PCRs (transcrição reversa seguida de PCR) ............................... 35
4.10 Preparação de cDNA microarrays em lâminas de vidro....................................... 37
4.10.1 Biblioteca de cDNAs murinos .............................................................. 37
4.10.2 Amplificação de cDNA para a confecção de microarrays...................37
4.10.3 Purificação dos produtos de PCR.......................................................... 38
4.10.4 Confecção das lâminas de microarrays................................................39
4.10.5 Delineamento das hibridações em microarrays....................................39
4.10.6 Marcação das sondas complexas de cDNA com fluorocromos Cy3
e Cy5...... ............................................................................................................ 41
4.10.7 Hibridação das lâminas de microarrays................................................47
4.10.8 Aquisição de Imagens de microarrays..................................................47
4.10.9 Quantificação e normalização dos dados de microarrays.....................47
4.10.10 Nomenclatura dos genes ....................................................................... 52
4.11 Análise da expressão gênica promíscua no timo................................................... 53
5 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL................................................................................55
6 RESULTADOS .......................................................................................................................57
6.1 Avaliação da integridade das amostras de RNA ................................................... 57
6.2 Avaliação da expressão do gene Aire e de TRAs no estroma tímico.................... 58
6.3 Avaliação da viabilidade de ATOC....................................................................... 59
6.4 Determinação da seqüência de RNAi anti-Aire para ensaio em ATOC................ 61
6.5 Análise do silenciamento do gene Aire pela técnica de RNAi.............................. 65
6.6 Marcação com sonda fluorescente e obtenção de imagens ................................... 66
6.7 Análise dos genes diferencialmente expressos por agrupamento hierárquico,
e da significância estatística do padrão de expressão ............................................... 68
6.8 Determinação da expressão gênica promíscua (PGE) no Timo ............................ 71
7 DISCUSSÃO ...........................................................................................................................76
7.1 Expressão de TRAs no estroma tímico ................................................................. 76
7.2 Avaliação do silenciamento do gene Aire............................................................. 79
7.3 Expressão Gênica Promíscua do Timo.................................................................. 80
8 CONCLUSÕES.......................................................................................................................85
9 REFERÊNCIAS......................................................................................................................87
ANEXO
Lista de Figuras
Figura 1 Fatores envolvidos no desenvolvimento de doenças auto-imunes ..................................3
Figura 2 Mapas esquemáticos dos loci do MHC humano e de camundongos...............................4
Figura 3 Resíduos polimórficos de uma molécula MHC...............................................................5
Figura 4 Morfologia do timo........................................................................................................10
Figura 5 Estrutura do timo ...........................................................................................................11
Figura 6 Estrutura e função do timo.............................................................................................13
Figura 7 Caracterização da PGE ..................................................................................................17
Figura 8 Marcação fluorescente de microarrays..........................................................................23
Figura 9 Delineamento dos experimentos com microarrays.......................................................41
Figura 10 Preparação da fita simples de cDNA incorporada com amino alil ..............................45
Figura 11 Preparação do cDNA marcado com CyDye.................................................................46
Figura 12 “Pipeline” utilizado na análise de dados de microarrays em lâminas de vidro...........49
Figura 13 Gráfico do SAM ..........................................................................................................52
Figura 14 Integridade das amostras de RNA ...............................................................................57
Figura 15 Avaliação da expressão dos genes: β-actina, CD3e, Aire, Ins-1, Ins-2, Gad67 e
Pró-colágeno II estroma tímico....................................................................................................58
Figura 16 Avaliação da viabilidade em ATOC por citometria de fluxo ......................................60
Figura 17 Avaliação da expressão dos genes HPRT e Aire de RNAi anti-Aire ..........................62
Figura 18 Seqüência selecionado de RNAi anti-Aire ..................................................................62
Figura 19 Microscopia confocal...................................................................................................64
Figura 20 Avaliação da expressão do gene Aire em amostras de estroma tímico de ATOC.......65
Figura 21 Hibridações de microarray com sondas fluorescentes ................................................67
Figura 22 Comparação dos perfis de expressão gênica entre os animais das linhagens DBA-
1/J e DBA-2/J...............................................................................................................................69
Figura 23 Comparação dos perfis de expressão gênica de ATOC tratada e não-tratada com
RNAi anti-Aire em animais da linhagem DBA-2/J ....................................................................70
Figura 24 Gráfico ilustrativo do Symatlas ...................................................................................72
Figura 25 Representação da expressão gênica específica de tecidos e órgãos em timo de
camundongo DBA........................................................................................................................73
Figura 26 Representação da expressão gênica específica de tecidos e órgãos em timo de
camundongo DBA-2/J, durante o tratamento com RNAi anti-Aire.............................................74
Lista de tabelas
Tabela 1 Primers utilizados na amplicação por PCR, para avaliação da PGE.............................36
Tabela 2 Genes diferencialmente expressos (160) de acordo com o programa SAM em amostra
de estroma tímico comparando as linhagens DBA-1/J e DBA-2/J .....................................Anexo I
Tabela 3 Genes diferencialmente expressos (26) acordo com o programa SAM em ATOC de
animais da linhagen DBA-2/J, tratados com RNAi anti-Aire.............................................Anexo I
Lista de abreviaturas
AIRE: Autoimmune regulator
APS-1: Síndrome poliglandular auto-imune tipo I
ATOC : Adult Thymus Organ Culture
CD: Células dendríticas
cDNA: DNA complementar
cTEC: Células epiteliais corticais tímicas
DEPC: Dietil pirocarbonato
dNTP: Desoxirribonucleotídeo trifosfatado
FDR: False Discovery rate
MHC: Complexo principal de histocompatibilidade
MOPS: 3-(N-Morpholino) propanesulfonic acid
MMP: Metaloproteinases
RNAm: RNA mensageiro
mTEC: Células epiteliais medulares tímicas
pb: pares de base
PCR: Polymerase chain reaction
PGE: Promiscuous gene expression
RNAi: RNA interferente
SAM: Significance analysis of microarrays
SOURCE: Stanford online universal resource for clones and ESTs
TCR: Receptor de células T
TEC: Células epiteliais tímica
TRAs: Antígenos tecido-relacionados
UV: Ultra violeta
RESUMO E ABSTRACT
Resumo
ii
Resumo
A artrite reumatóide é uma doença auto-imune sistêmica de etilogia
desconhecida, que acomete preferencialmente o sistema locomotor (articulações).
Caracterizada por um intenso processo inflamatório na sinóvia, diversas citocinas e
mediadores inflamatórios estão envolvidos, podendo causar destruição óssea e articular.
A artrite induzida por colágeno é um modelo animal amplamente utilizado por suas
características fisiopatológicas muito similares à doença em humanos. A linhagem de
camundongos DBA-1/J desenvolve a doença após imunização e booster com colágeno
do tipo II, enquanto que a linhagem DBA-2/J se mostra refratária. Isso confere um
sistema modelo de susceptibilidade/resistência à artrite, que pode ser estudado em
diferentes abordagens. O fenômeno de expressão gênica promíscua no timo (PGE), foi
caracterizado recentemente como a capacidade das células epiteliais tímicas,
especialmente as medulares (mTECs), de apresentar antígenos ectópicos tecido-
específicos aos timócitos durante seu processo de seleção intra-tímica. Assim a PGE
tem sido diretamente relacionada à tolerância central, ou seja, aos mecanismos de
discriminação do próprio-não-próprio, estabelecendo uma ligação com o complexo e
ainda não muito bem entendido processo de auto-imunidade. Estima-se que o pool de
genes promíscuos representa 5-10% de todos os genes funcionais conhecidos, e a
maioria, se não todos, os órgãos parenquimais. Grande parte destes genes parece estar
sob influência de um controlador transcricional chamado Aire (autoimmune regulator).
O gene Aire é expresso principalmente em células mTEC, e foi, no presente trabalho,
alvo de inibição utilizando-se a técnica de RNA interferente (RNAi anti-Aire) em
ATOC (Adult Thymus Organ Culture). Com o intuito de se avaliar o comportamento da
PGE no modelo de susceptibilidade/resistência à artrite, foi utilizado a tecnologia de
cDNA microarrays, que incluiu os programas de bioinformática, SAM (Significance
Analysis of Microarrays) e Cluster e TreeView, e o banco de dados Symatlas para
análise dos dados. Os resultados mostraram que a susceptibilidade a AR característica
da linhagem DBA-1/J, pode ocorrer devido às alterações da PGE, caracterizadas pela
redução da expressão de genes de antígenos relacionados a tecidos (TRAs) no timo,
incluindo aqueles do sistema locomotor. Isto poderia afetar o processo de seleção
negativa implicado num aumento de linfócitos auto-reativos na periferia. Além disto,
houve um descontrole da PGE após silenciamento parcial do transcrito do gene Aire em
ATOC utilizando-se a técnica de RNAi (RNA interferente).
Abstract
iii
Abstract
Analysis of Promiscuous Gene Expression in the Thymus of DBA-1/J and DBA-2/J Mice
During Imunization with Collagen: A model-system to study susceptibility/resistance to
Reumatoid Arthritis
Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease of unknown etiology,
whose clinical expression predominates in the locomotory system (joins). Characterized
by an intense inflammatory synovitis, many cytokines and inflammatory mediators are
involved causing articular and bone destruction. Collagen-induced arthritis is an animal
model widely studied due to its similarities to human disease. The DBA-1/J mouse
strain develops arthritis after immunization process and booster with Type II collagen,
and the DBA-2/J strain is refractory to the disease induction. This offers an useful
susceptibility/resistance model-system to study RA. The promiscuous gene expression
(PGE) phenomenon in the thymus was recently characterized by the capacity of thymic
epithelial cells (TECs), specially the medullary TECs, to present ectopic tissue-related
antigens (TRAs) to thymocytes during the selective process. PGE is associated to the
central tolerance process and self-non-self discrimination, establishing a link with the
complex and not yet well understood autoimmunity process. The pool of genes
promiscuously expressed is estimated to include up to 5-10% of all currently known
genes, and represent most, if not all, parenchymal tissues. A subset of promiscuously
expressed genes seems to be controlled by a transcriptional regulator called Aire
(autoimmune regulator). The Aire gene is expressed specially in mTECs, and in the
present study it was downregulated by RNA interference (RNAi) in ATOC (Adult
Thymus Organ Culture). To evaluate the possible association between PGE and
susceptibility/resistance model to RA, we used the cDNA microarrays technology,
which includes bioinformatics programs as SAM (Significance Analysis of
Microarrays), Cluster e TreeView, and the data bank Symatlas database for PGE
determinations. The results show that alterations in PGE can be associated to disease
susceptibility to the RA in DBA-1/J strain, characterized by a reduction in TRA gene
expression in the thymus including those genes coding for the locomotory system
antigens. This might affect the negative selection and consequently increase auto-
reactive T cells in the periphery. Also, the PGE representation was affected after the
partial silencing of Aire transcripts in ATOC using RNAi technique.
INTRODUÇÃO
Introdução
2
1) Introdução
1.1)Auto-imunidade
A auto-imunidade é um fenômeno caracterizado pelo estado de sensibilidade do
sistema imunológico a antígenos autólogos, podendo acarretar uma doença auto-imune
quando o mesmo responde causando lesão celular e tecidual. A possibilidade do sistema
imunológico de reagir contra esses antígenos e causar danos podem ser reconhecidos no
termo utilizado pelo Imunologista Paul Ehrlich, horror autotoxicus, do início da década
de 1900 (ABBAS & LITCHMAN, 2005).
O poder destrutivo e a complexidade do sistema imunológico necessitam da
presença de sofisticados mecanismos que regulem sua atividade. A defesa imunológica
é obtida a partir da integração de dois sistemas complementares: a resposta imune inata
e a adaptativa. Defeitos na resposta adaptativa tem sido o principal foco de pesquisas
para doenças auto-imunes (GREGERSEN et al, 2006). A discriminação próprio-não-
próprio e a regulação da auto-imunidade têm surgido como um problema central na
imunologia moderna. Atualmente há pelo menos quarenta doenças auto-imunes
conhecidas, ou que, presumivelmente estão incluídas nesta categoria, sendo que uma em
cada trinta pessoas é afetada por algum tipo de desordem auto-imune (JACOBSON et
al, 1997; HALLERT et al 2004; KOBELT et al 2006).
Doenças auto-imunes resultam da interação de três componentes: genético,
ambiental e regulação imunológica (ERMANN et al 2002) (Figura 1).
Um aspecto característico das doenças auto-imunes é a seleção de um tipo celular
simples, órgão ou tecido por uma determinada população de células T auto-reativas ou
células B. A classificação mais comum referente às doenças auto-imunes baseia-se nos
mecanismos imunológicos que levam à auto-imunidade e aos diferentes tipos de
antígenos envolvidos neste processo. As respostas imunes contra antígenos amplamente
disseminados e a formação de complexos auto-imunes resultam tipicamente em doenças
sistêmicas. Em contraste respostas auto-imunes contra antígenos com distribuições
tissulares restritas provocam lesões órgão-específicas ou tecido-específicas.
Introdução
3
Figura 1. Fatores envolvidos no desenvolvimento de doenças auto-imunes. O meio ambiente é
capaz de induzir auto-imunidade em indivíduos geneticamente susceptíveis sob condições de
desrregulação imunológica.
Fatores de risco genético
Desde os mais antigos estudos de pacientes com desordens auto-imunes, sabe-se
que algumas destas doenças aparecem em famílias, o que sugere uma susceptibilidade
genética (ORTONNE, 1999; KUKREJA & MACLAREN, 1999). Estudos
epidemiológicos têm demonstrado que fatores genéticos são determinantes na
predisposição a uma doença auto-imune. Genes de susceptibilidade para a auto-
imunidade podem atuar determinando o tecido e a especificidade da doença, através do
direcionamento da resposta para auto-antígenos particulares. Devido a sua
complexidade, essas doenças envolvem muitos genes, porém apenas uma parte deles,
envolvidos em mecanismos patogênicos, são atualmente conhecidos.
Um cluster gênico que se destaca em definir a susceptibilidade genética a
doenças auto-imunes e apresenta loci gênicos altamente polimórficos é aquele que
codifica para as moléculas do Complexo principal de histocompatibilidade (MHC -
Major histocompatibility gene complex). O MHC foi descoberto como um locus que
determinava o resultado de transplantes de órgãos entre indivíduos diferentes. Os loci
das classes I e II codificam grupos de proteínas estruturalmente distintas, porém
homólogas (Figura 2), sendo as moléculas MHC da classe I reconhecidas pelas células
T CD8
+
, enquanto as moléculas da classe II pelas células T CD4
+
.
Doença
auto-imune
Ambiente
Regulação
imunológica
Genes
Introdução
4
Figura 2. Mapas esquemáticos dos loci do MHC humano e de camundongos. Os tamanhos dos
genes e das seqüências intervenientes não estão em escala. O locus MHC III se refere aos genes
que codificam moléculas diferentes das moléculas que apresentam peptídeos; esse termo não é
usado normalmente.
As moléculas do MHC humano são chamadas de antígeno leucocitário
humano (HLA) e são equivalentes às moléculas chamadas de histocompatibilidade-2
(H2) no camundongo. Hoje se sabe que essas moléculas são essenciais para o
funcionamento normal da resposta adaptativa devido ao seu papel na apresentação de
antígenos para as células T. Sua diversidade excede o de qualquer outra família de
proteínas, o que confere as diferenças individuais de respostas imunológicas. Essas
moléculas possuem algumas características estruturais comuns, que são críticas para que
desempenhem seu papel, e são elas: uma fenda extracelular que liga os peptídeos,
seguida de um par de domínios semelhantes ao de imunoglobulinas, e está ancorada a
membrana celular por meio de domínios trans-membrana e citoplasmáticos (ABBAS &
LITCHMAN, 2005) (Figura 3). Uma associação entre os produtos MHC e doenças
auto-imunes tem sido descrita a mais de 20 anos.
Introdução
5
Figura 3. Resíduos polimórficos de uma molécula MHC. Os resíduos polimórficos das
moléculas MHC das classes I e II (exibidos como círculos vermelhos) estão localizados nas
fendas de ligação de peptídeos nas α-hélices em torno de cada fenda. Na molécula da classe II
aqui exibida (HLA-DR) praticamente todo polimorfismo se encontra na cadeia β. Entretanto,
outras moléculas mostram graus variáveis de polimorfismo na cadeia α e geralmente muito mais
na cadeia β.
Fatores de risco ambiental
Agentes ambientais podem causar a auto-imunidade, mas apenas quando
associados a fatores genéticos. Desta forma, ambos afetam a susceptibilidade à auto-
imunidade em três níveis: a reatividade total do sistema imune, o antígeno específico e
sua apresentação, e o tecido alvo (MARRACK et al, 2001). Os fatores ambientais
ganharam importância após a análise de que gêmeos idênticos apresentavam diferenças
quanto à predisposição genética a doenças auto-imunes. Esses fatores referem-se
principalmente à exposição do organismo a agentes patogênicos, que podem resultar em
reação cruzada, sendo então responsáveis pela ativação de linfócitos T auto-reativos
encontrados normalmente na periferia. Na maior parte destas doenças, o microrganismo
infeccioso não está presente nas lesões auto-imunes, não sendo detectável à medida que
se desenvolve a auto-imunidade. Portanto, as lesões não se devem ao próprio agente
Introdução
6
infeccioso, mas resultam das respostas imunes do hospedeiro. Muitos estudos têm
sido realizados nesta área, pois em muitas doenças auto-imunes a etiologia permanece
desconhecida (ABBAS & LITCHMAN, 2005; ERMANN et al 2002).
Outros fatores que podem ser citados quanto ao envolvimento no processo de
auto-imunidade são: alterações anatômicas, como inflamação, lesão isquêmica ou
trauma, que podem levar a exposição de antígenos próprios que normalmente ficam
ocultos, e influências hormonais (ABBAS & LITCHMAN, 2005).
Tolerância e auto-imunidade
Uma das propriedades mais notáveis do sistema imunológico é a capacidade de
distinguir antígenos próprios de antígenos estranhos, não respondendo em condições
normais aos antígenos próprios, determinando uma tolerância imunológica que impede
este ataque. Durante uma resposta auto-imune esta distinção é perdida resultando em
inflamação e destruição tecidual.
Essa tolerância imunológica é estabelecida em dois níveis, sendo que
inicialmente ocorre o desenvolvimento da tolerância central, e posteriormente observa-
se o processo de tolerância periférica. Muitas das doenças auto-imunes parecem ser
resultados de falha na tolerância central, que envolve o processo de seleção tímica dos
linfócitos, onde diferenças quantitativas de expressão de antígenos e/ou a resposta dos
linfócitos a eles podem afetar esse mecanismo, culminando com reações descontroladas
na periferia.
A resposta imune específica e a resposta auto-imune envolvem uma série de
eventos imunológicos e foi verificado que os mesmos elementos participam destas
respostas: um antígeno (ou auto-antígeno), resposta por interação de famílias ou sub-
grupos de células, incluindo células apresentadoras de antígeno, linfócitos T e B,
moléculas mensageiras, citocinas, quimiocinas e seus receptores, além de moléculas de
sinalização e co-estimulatórias nas superfícies celulares. Um aspecto de grande
importância envolve falhas na expressão de moléculas co-estimulatórias por outras
células, no momento da interação com os linfócitos T, fundamentais para os processos
de sinalização e ativação (ABBAS & LITCHMAN, 2005; LISTON et al 2005).
Introdução
7
1.2) Artrite reumatóide
A artrite reumatóide (AR) é uma doença inflamatória crônica sistêmica, de
etiologia ainda desconhecida, que apresenta uma ampla distribuição mundial e acomete
todos os grupos étnicos, estimando-se que atinja aproximadamente 1,5% da população
dos Estados Unidos. As mulheres são afetadas cerca de três vezes mais em relação aos
homens, e apesar da doença atingir qualquer idade, sua incidência aumenta em
indivíduos idosos (DANIEL J.MCCARTY,1989). Caracterizada por um intenso
processo inflamatório na sinóvia, deposição de fibrina, hiperplasia de células sinoviais,
infiltrados mononucleares, formação de pannus e eventual anquilose em uma ou mais
articulações, as pequenas articulações de mãos e pés são preferencialmente afetadas
(KOOPMAN et al 2001). A produção exacerbada de citocinas e mediadores
inflamatórios, entre eles interleucinas 1 e 6 (IL-1, IL-6), TNF-α, metaloproteinases
(MMP) relacionadas à manutenção da matriz extracelular, resultam em destruição de
cartilagem e ossos (AREND et al 2001; KOTZIN et al 1998; YAMAMURA et al 2001;
FELDMANN et al 1996). Tipicamente, pacientes com AR exibem manifestações
sistêmicas, como produção de auto-anticorpos denominados fatores reumatóides;
nódulos reumatóides, a lesão cutânea mais comum; vasculite, uma complicação que
pode afetar muitos órgãos vitais causada por uma endoartrite obliterativa; entre outros
(MUSTILA et al 2000; GORONZY et al 1995).
A contribuição genética da AR pode ser evidenciada pela associação da doença a
alguns dos produtos gênicos provenientes de certas classes de MHC de classe II, mais
precisamente, a molécula HLA-DR. O conjunto de alelos do MHC presentes em cada
cromossomo é chamado de haplótipo MHC, e pacientes que são homozigotos
apresentam um maior número de manifestações extra-articulares, incluindo uma maior
destruição articular quando comparados aqueles que apresentam apenas um alelo
(LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKING, 1999). A relação entre esses produtos e a
doença parece estar associada à epítopos específicos na região da fenda, fenômeno
chamado de “epítopo compartilhado” (GREGERSEN et al 1987)
.
Entre os leucócitos recrutados para as articulações, as células T, particularmente
as TCD4
+
auxiliares, apresentam um papel central no desenvolvimento da doença. Isso
pode ser evidenciado pelo alto número dessas células ativadas na circulação periférica
de pacientes, bem como sua abundância na sinóvia.
Introdução
8
Na AR essa resposta celular apresenta uma tendência ao padrão TH1,
caracterizado pela liberação das citocinas pró-inflamatórias descritas acima
(LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKING, 1999). Experimentos murinos demonstraram
que células TCD4
+
auxiliares naive podem se diferenciar em quatro diferentes tipos de
células T, chamadas TH1, TH2, TH17 e Treg. Essas células são induzidas a se
comprometer a uma linhagem particular baseadas no tipo de estimulação, concentração
de antígeno, co-estimulação e citocinas encontrados no meio (CONSTANT et al 1997).
As células TH17 descobertas recentemente como um novo padrão de células T,
secretoras de interleucina 17 (IL-17), têm sido relacionadas a muitos processos
inflamatórios (FOSSIEZ et al 1996). Muitas pesquisas têm evidenciado o papel da IL-
17 na patogênese da AR, devido aos elevados níveis desta citocina encontrado na
sinóvia (MIOSSEC et al 2003; KOTAKE et al 1999; HWANG et al 2005), que devido
ao seu papel pró-inflamatório, patologicamente pode ativar e aumentar os mecanismos
de injúria tecidual descritas previamente. Em particular a IL-17 up-regula e/ou atua de
forma sinérgica com mediadores inflamatórios locais como IL-6, IL-1β e TNF-α, óxido
nítrico, bem como promove destruição da matriz extracelular através da estimulação e
produção de MMP, e inibição dos componentes de reparo (CHABAUD et al 1998,
2000; KATZ et al 2001; LEGRAND et al 2001; LUBBERTS et al 2000; JOVANOVIC
et al 2000, 2001; CHEVREL et al 2002).
Como grande parte das doenças auto-imunes, muitas das evidências encontradas
são referentes à utilização de modelos animais. A artrite induzida por colágeno (CIA –
Collagen-induced arthritis) foi relatada pela primeira vez por Trentham e colaboradores,
que observaram a doença em ratos após uma injeção intradérmica de colágeno do tipo II
somado a adjuvante completo de Freud. Estudos posteriores demonstraram que uma
patologia similar poderia ser induzida em primatas e linhagens de camundongo
susceptíveis. Esse modelo tem sido amplamente utilizado por apresentar características
similares a AR, como deposição de fibrina, hiperplasia de células sinoviais, infiltração
mononuclear, formação de pannus, destruição óssea e cartilaginosa, presença de fatores
reumatóides e manifestações sistêmicas (HOLMDAHL et al 1989; SVENSSON et al
1998; BURKHARDT et al 1991; TERATO et al 1992), além da susceptibilidade
claramente associada à expressão de genes específicos de MHC de classe II.
Camundongos, como o DBA-1/J, que apresentam o haplótipo H-2
q
são susceptíveis a
doença (WOOLEY et al 1981; BRUNSBERG et al 1994), o que já não ocorre com
Introdução
9
outras linhagens, entre elas a DBA-2/J, que se mostra resistente mesmo quando exposta
ao mesmo tratamento.
A CIA representa uma doença imunológica multifacetada que envolve células T,
B, além das células inflamatórias que infiltram as articulações. Muitos estudos
relacionam células TCD4
+
auto-reativas para o colágeno II como principais mediadoras
da indução de artrite. A habilidade de indução de uma artrite crônica com a utilização de
colágeno indica que pelo menos alguns desses linfócitos auto-reativos são produtos de
uma falha de deleção tímica, ou do processo de tolerância periférica (HOLMDAHL et
al 1990; WOOLEY et al 1981; SEKI et al 1988). Isso pode ser comprovado através de
trabalhos que demonstram prevenção da doença através da depleção dessas células auto-
reativas (ZHANG et al 2002), a partir do qual podemos então concluir que falhas nos
processos de tolerância central são pontos importantes a serem estudados.
1.3) Caracterização do timo
A primeira descrição do timo foi feita pelo italiano Jacopo Berengario,
no século 15. É um órgão linfóide primário formado por dois lobos (direito e esquerdo),
sendo ambos divididos em múltiplos lóbulos por septos fibrosos. Anatomicamente, cada
lóbulo é composto de uma região cortical mais externa, e uma região medular mais
interna (Figura 4).
O timo deriva de invaginações do ectoderma no pescoço e tórax do embrião em
desenvolvimento que formam estruturas chamadas de arcos branquiais (ABBAS &
LITCHMAN, 2005). Situado na região do mediastino anterior, é o local onde os
precursores de células T, chamados de timócitos, sofrem maturação e adquirem sua
competência funcional podendo assim exercer sua função na periferia. Este órgão tem
um suprimento vascular abundante e vasos linfáticos eferentes que drenam para os
linfonodos do mediastino (VAN EWIJK et al 1991; GRAY et al 2002; ABBAS &
LITCHMAN, 2005).
No camundongo o timo inicialmente se desenvolve a partir da terceira bolsa
faringeal, por volta dos dias 10-11 do período embrionário, período que possibilita a
detecção morfológica de um epitélio rudimentar (MANLEY et al 2000).
Introdução
10
Figura 4. Morfologia do timo. Microscopia óptica de um lobo do timo mostrando o córtex e a
medula. As células coradas de azul são células T em desenvolvimento chamadas timócitos.
Recentemente surgiram evidências da presença de um segundo timo, chamado
cervical, em algumas linhagens de camundongos, que se desenvolve após o
nascimento, tendo o mesmo tamanho de um linfonodo (GRZEGORZ et al 2006).
Essa
descoberta pode mudar todo nosso conhecimento a cerca deste órgão, porém muitos
estudos ainda deverão ser realizados a fim de se chegar a conclusões definitivas.
É bem estabelecido que o fator transcricional FoxN1 tem um papel essencial no
desenvolvimento tímico, bem como na formação de um microambiente epitelial
funcional (NEHLS et al 1996; BLACKBURN et al 1996; BOEHM et al 2003). Com
relação à origem desse epitélio, estudos histológicos e diversas evidências sugerem que
todas as células epiteliais tímicas são originárias da endoderme (MANLEY et al 2003;
GORDON et al 2004). Células epiteliais maduras no timo adulto podem ser
caracterizadas por expressão diferencial de queratinas, e divididas em células epiteliais
tímicas medulares (mTECs – medullary thymic epithelial cells), que são
predominantemente K5
+
K8
-
, e células epiteliais tímicas corticais (cTECs - cortical
thymic epithelial cells), K5
-
K8
+
. No início do desenvolvimento tímico essas células são
duplo-positivas para os marcadores de queratinas citados acima, o que sugeriu além da
origem, também um precursor comum (GILL et al 2002; BENNETT et al 2002; KLUG
et al 2002). Apesar de evidências encontradas em estudos de timos embrionários, não há
evidências da existência destes precursores no timo adulto.
Introdução
11
Os progenitores linfóides entram no timo adulto pela junção córtico-
medular e então migram para a região subcapsular antes, porém, retornando pelo córtex
em direção a medula (ANDERSON & JENKINSON, 2001). Uma vez que os timócitos
entram no timo, seu contato com o estroma tímico; composto essencialmente de células
epiteliais (TECs), fibroblastos reticulares, células dendríticas e macrófagos derivados da
medula óssea, além de estruturas conhecidas como corpúsculos de Hassal, localizados
especificamente na medula tímica e composto de espirais compactas de células
epiteliais remanescentes de células em degeneração (VAN EWIJK et al 1991; GRAY et
al 2002) (Figura 5); guia sua maturação. Isso ocorre mesmo durante os estágios de
desenvolvimento tímico mostrando que o microambiente é capaz de promover a
maturação de timócitos e simultaneamente dar continuidade ao seu próprio programa de
desenvolvimento. Esse processo ocorre devido à presença de mediadores importantes
como a interleucina 7 (IL-7) e os ligantes Notch (ZAMISCH et al 2005; HARMAN et
al 2005).
Figura 5. Esquema representativo da estrutura do timo e de todos os seus componentes
celulares. (Extraído e modificado de Human Embriology -
http://www.embryology.ch/anglais/qblood/lymphat03.html).
Introdução
12
Além da maturação de timócitos, essa interação com o estroma é de fundamental
importância também na organização do microambiente tímico, modelo chamado de
”crosstalk tímico” (VAN EWIJK et al 1999; VAN EWIJK et al 1994; GERMERAARD
et al 2003; VAN EWIJK et al 2000).
O processo de maturação dos linfócitos consiste numa complexa seqüência de
eventos biológicos, compreendendo a proliferação das linhagens celulares precursoras, a
expressão diferencial de proteínas de membrana, rearranjos gênicos do receptor de
antígeno, a seleção do repertório de linfócitos maduros, e conseqüente morte celular
programada dos linfócitos não selecionados e finalmente a migração celular. Durante
cada um desses estágios, as células sofrem significativas mudanças celulares e genéticas
(ABBAS & LITCHMAN, 2005). Na região cortical é possível encontrar uma grande
densidade de timócitos imaturos e cTECs fornecendo o microambiente necessário para
o processo de seleção positiva, que promove a sobrevivência e expansão de timócitos
restritos ao MHC próprio; enquanto que a região medular é caracterizada por grande
quantidade de células T já maduras e mTECs, local de ocorrência do evento de seleção
negativa, responsável pela eliminação dos timócitos capazes de reconhecerem peptídeos
próprios com grande avidez (ABBAS & LITCHMAN, 2005).
Os timócitos imaturos corticais recém-chegados ao timo contêm os genes de
seus receptores (TCRs-T cell receptor) na configuração germinativa e, portanto, ainda
não expressam o TCR, CD3, as cadeias ζ e os co-receptores CD4 e CD8. Essas células
são chamadas de timócitos duplo-negativos (DN) e se submetem a múltiplos ciclos de
proliferação e de progresso, aproximadamente 5% do total de timócitos, com discretos
passos de maturação distinguidos pela expressão de marcadores de superfície celular
CD44
high
CD25
-
(DN1), CD44
high
CD25
+
(DN2), CD44
low
CD25
+
(DN3), e
CD44
low
CD25
-
(DN4). As proteínas do complexo recombinase (Rag-1 e Rag-2) são
expressas pela primeira vez nesse estágio, e os rearranjos V(D)J se iniciam. Durante a
transição da fase DN para duplo-positiva CD4
+
CD8
+
(DP), aproximadamente 85% dos
timócitos se redistribuem à região cortical (RAMIALISON et al., 2002). O rearranjo
dos genes da cadeia α e a expressão do heterodímero TCR αβ ocorrem na população
CD4
+
CD8
+
, exatamente antes ou durante a migração dos timócitos do córtex para a
medula (Figura 6).
Introdução
13
Figura 6. Estrutura e função do timo. Dividido em duas regiões, córtex e medula, povoados por
diferentes subtipos celulares epiteliais tímicos (TECs). Nos adultos, os precursores de células T
entram no timo pela junção cortico-medular, e começam então um programa altamente
complexo de diferenciação, o qual está ligado à migração através do estroma tímico. Os
subtipos diferentes de timócitos são encontrados conseqüentemente em regiões espacialmente
restritas do timo. O córtex tímico foi separado em quatro regiões: Região 1, junção cortico-
medular, local de entrada dos precursores de células T; Região 2, células diferenciadas em DN2
as quais se submetem a expansão clonal proliferativa; Região 3, inicia-se os rearranjos V(D)J
dos genes TRs em células no estágio DN3; Região 4, transição de DN para o estado de DP
(CD4+CD8+). Células DP migram do córtex para a medula tímica, onde se diferenciam em
simples positivas (SP CD4+ ou CD8+). A seleção positiva ocorre no córtex entre as TECs
corticais (cTECs), e a seleção negativa ocorre principalmente na medula, entre as TECs
medulares (mTECs) e células dendríticas (DCs). Células SP que completaram o programa de
diferenciação saem da medula tímica em direção a periferia. [Extraído e modificado de
Blackburn & Manley, 2004].
Introdução
14
A recombinação V(D)J dos receptores de células T é um evento molecular
essencial na maturação destas células. É um processo de recombinação sítio específica
da molécula de DNA que só ocorre nos estágios inicias de desenvolvimento dos
linfócitos T e B. A geração de grande diversidade nas regiões variáveis do receptor de
antígeno de linfócitos T é crucial para que os organismos possam reconhecer e
responder contra, virtualmente, todo e qualquer antígeno estranho. As primeiras células
que expressam os TCRs estão no córtex tímico, e essa expressão é baixa em comparação
com a célula T madura. Em virtude da expressão de seus complexos TCR completos, as
células duplo-positivas podem responder ao antígeno e ficam sujeitas à seleção positiva e
negativa. A maioria das células DP, as quais constituem cerca de 80% daquela população,
morre por negligência porque não reconhecem moléculas disponíveis de MHC expressas
por células estromais tímicas (ABBAS & LITCHMAN, 2005; SAVINO, 2006).
As células que passam com sucesso pelos processos de seleção amadurecem em
células T CD4+ ou CD8+ e são chamadas de timócitos simples positivos (SP), e
compreendem aproximadamente 10% dos timócitos no timo (Ramialison et al., 2002).
Assim, os estágios de maturação das células T podem ser rapidamente distinguidos pela
análise da expressão das moléculas CD4 e CD8. Essa maturação fenotípica é acompanhada
da maturação funcional (ABBAS & LITCHMAN, 2005).
Finalmente, os timócitos maduros com positividade única (células T CD4 e CD8
restritas ao MHC) entram na medula do timo e deixam esse órgão pelos vasos
sanguíneos para colonizar os tecidos linfóides periféricos (HAKS et al., 1998). Apenas
15% dos timócitos que vivem no timo nesta fase vão formar a maioria do repertório de
células T periféricas (SAVINO, 2006).
Um aspecto importante para se entender os mecanismos por trás do
processo de seleção está no reconhecimento das células envolvidas no processo. No
timo, as TECs, juntamente com as células dendríticas derivadas da medula óssea,
expressam moléculas de MHC das classes I e II. Estudos das moléculas de expressão
em TECs demonstraram um grupo bastante heterogêneo, principalmente no que se
refere à sub-população de mTECs. De maneira geral elas se caracterizam por serem
EpCAM
+
, MHC-II
+
, e CD45
-
, e são ótimas apresentadoras de antígeno (GRAY et al
2002, 2006). As células epiteliais tímicas são os componentes celulares principais do
microambiente tímico, e influenciam diferentes aspectos da diferenciação dos timócitos:
Introdução
15
vias de interações célula-célula e secreções de fatores solúveis, tais como os hormônios
tímicos timulina (thymulin), timopoetina (thymopoietin) e timosina- α1 (thymosin-α1)
(SAVINO, 2006).
Dados recentes mostram que o hormônio do crescimento (GH) modula
pleiotropicamente funções tímicas como, por exemplo, aumenta a proliferação de
timócitos e de células epiteliais tímicas (SAVINO, 2007).
Um complexo linfoepitelial localizado corticalmente no timo, as células “nurse”
tímicas (TNC), são estruturas multicelulares linfoepiteliais formadas por uma célula
epitelial tímica (TEC) que abriga 20-200 timócitos, carregando primeiramente o
fenótipo duplo-positivo CD4/CD8, embora timócitos imaturos duplo negativos, bem
como, células maduras simples positivas também possam ser encontradas. TNCs criam
provavelmente um microambiente especial para a diferenciação e/ou proliferação dos
timócitos, com timócitos sendo expostos aos antígenos do complexo principal de
histocompatibilidade (MHC) e aos hormônios tímicos. Tal diferenciação ocorre em
paralelo com a migração da célula dentro e fora do complexo (SAVINO, 2006).
O mesênquima tímico, derivado da crista neural, também pode ser capaz de
influenciar diretamente o desenvolvimento dos precursores de células T CD4
-
8
-
por
apresentação de fatores de crescimento solúveis sobre componentes da matriz
extracelular (ECM). Além de influenciar o desenvolvimento das células epiteliais
tímicas imaturas, e assim ter um papel direto no estabelecimento do microambiente
tímico (JENKINSON et al., 2003).
O processo de seleção e a maturação do repertório de células T são de grande
importância, pois induzem a tolerância dessas células ao que é próprio. A aquisição
dessa tolerância é dependente da interação entre receptor de célula T (TCR-T-cell
receptor) e ligantes peptídeos-MHC próprios. Logo a diversidade de antígenos próprios
acessível a esse repertório no timo é quem vai determinar a extensão e especificidade
dessas células (KLEIN et al 2000).
Introdução
16
1.4) Caracterização da expressão promíscua no timo
A área de tolerância central tem sido recentemente revisada, e um acúmulo de
evidências mostram a expressão de antígenos-tecido específicos (TRAs – Tissue-related
antigens) no timo, e sua participação na seleção do repertório de células T. A interação
entre células estromais e linfóides dentro do microambiente tímico é um fator crítico
para formar a correta especificidade antigênica do repertório de células T, assim como
para capacitá-lo a responder à apresentação de antígenos estranhos pelas moléculas de
MHC e não responder a antígenos próprios (BARTHLOTT et al., 2006).
À expressão de TRAs é uma propriedade fisiológica das TECs, particularmente
de uma subpopulação de mTECs que expressa altas concentrações de MHC-II na
membrana, sendo é um fenômeno conhecido como Expressão Gênica Promíscua (PGE)
(DERBINSKI et al 2001; GOTTER et al 2004).
Apesar de inicialmente se suspeitar que essa “promiscuidade” se referia apenas a
antígenos de reações imunológicas autodestrutivas, trabalhos demonstraram que esse
pool de genes é muito mais amplo (KYEWSKI et al 2002). Através de análise gênica
utilizando-se técnicas de arrays, os genes relacionados à PGE não são dependentes de
sexo ou período embrionário, assim antígenos fetais continuam a ser expresso;
antígenos específicos de um determinado sexo são expressos pelo outro; além de se
encontrar expressão de antígenos abundantes na circulação, como exemplo a proteína
do complemento C5 (MATZINGER et al 1994; VOLKMANN et al 1997). Esse pool de
genes representa a maioria, senão todos os órgãos parênquimais, e é estimado que inclua
cerca de 5-10% de todos os genes conhecidos, persistindo enquanto as células T
passarem pelo timo, inclusive após o processo de involução (KYEWSKI et al 2004;
DERBINSKI et al 2001) (Figura 7). A involução alométrica do timo inicia-se pouco
antes do nascimento e a involução absoluta ocorre na puberdade, entretanto o timo
adulto continua a receber células precursoras, vindas da medula óssea e a lançar células
colonizadoras das áreas T periféricas (BODEY et al., 1997). Esse fenômeno é
conhecido e freqüentemente associado à idade, sendo caracterizado pela substituição do
estroma tímico por tecido adiposo (ENCARNACION et al 2005). Portanto neste
processo há uma perda considerável de TECs, e conseqüente redução do processo de
seleção. Diversos esforços têm sido realizados para melhor se entender esse processo,
na tentativa de reverter esse quadro, e recuperar o repertório de células T perdido, por
Introdução
17
exemplo, por pacientes imunossuprimidos. Em camundongos o stress, processos de
imunização, além de imunodeficiência e o fator idade são responsáveis por um processo
de involução acentuado do órgão, que inclusive dificulta a sua localização (KUPER et
al 1995).
Figura 7. Diversos tecidos são representados pela expressão promíscua nas células medulares
epiteliais tímicas (mTECs). Genes expressos em mTECs de camundongo, comparados as TECs
corticais utilizando-se análise por chip, são relacionados aos tecidos de acordo com sua
expressão predominante obtidas de bancos de dados públicos GNF Gene Expression Atlas e
Swissprot somados a literatura.Cerca de um quarto dos genes expressos por todas as mTECs
podem ser classificados como tecido-específicos e são apresentados no gráfico. A fração de
genes tecido-específicos é provavelmente superestimada dado os baixos níveis de expressão nas
mTECs, e a sensibilidade limitada da técnica de array. (Extraído de Kyewski & Derbinski,
2004).
Intestino
Placenta
Próstata
Músculo esquelético
Útero
Bexiga
Embrião
Olho
Tecido Gorduroso
Vesícula biliar
Oócito/zigoto
Paratireóide
Cérebro
Fígado
Outros
Epiderme
Tireóide
Glândula mamária
Rim
Leucócitos
Coração
Língua
Estômago
Testículos
Glândula salivar
Pâncreas
Pulmão
Eritrócitos
Cordão umbilical
Medula óssea
Endotélio
Ameloblastos
Placenta
Próstata
Músculo esquelético
Útero
Bexiga
Embrião
Olho
Tecido Gorduroso
Vesícula biliar
Oócito / zigoto
Paratireóide
Intestino
Placenta
Próstata
Músculo esquelético
Útero
Bexiga
Embrião
Olho
Tecido Gorduroso
Vesícula biliar
Oócito/zigoto
Paratireóide
Cérebro
Fígado
Outros
Epiderme
Tireóide
Glândula mamária
Rim
Leucócitos
Coração
Língua
Estômago
Testículos
Glândula salivar
Pâncreas
Pulmão
Eritrócitos
Cordão umbilical
Medula óssea
Endotélio
Ameloblastos
Placenta
Próstata
Músculo esquelético
Útero
Bexiga
Embrião
Olho
Tecido Gorduroso
Vesícula biliar
Oócito / zigoto
Paratireóide
Placenta
Próstata
Músculo esquelético
Útero
Bexiga
Embrião
Olho
Tecido Gorduroso
Vesícula biliar
Oócito / zigoto
Paratireóide
Introdução
18
Vários modelos foram desenvolvidos para explicar o comprometimento das
TECs em expressar antígenos de outros tecidos. O mais aceito é chamado modelo
alternativo terminal de diferenciação e propõem que a expressão de TRAs seria uma
propriedade autônoma dessas células, onde o processo terminal de maturação em cTECs
ou mTECs levaria a um “relaxamento” dos controles de expressão gênica, que
permitiriam então a expressão de antígenos de outros tecidos de forma arbitrária. Esse
modelo sugere então que a PGE é parte do programa de diferenciação, principalmente
das mTECs, sub-população responsável pela expressão da maior diversidade desses
antígenos (KYEWSKI et al 2004). Somado a isso, as TECs formam um epitélio
estratificado similar ao da pele (BOEHM et al 2003; ALONSO et al 2003; BOOTH et
al 2000), que está em continuo processo de renovação (turnover). Esse processo ocorre
continuamente em um período de três a quatro semanas, e juntamente com o processo
que envolve as células dendríticas, que leva cerca de duas semanas, demonstram um
compartimento altamente dinâmico, que não altera o espectro de antígenos expressos
(KAMATH et al 2002).
Entretanto o ponto mais importante é a relação entre PGE e o processo de
tolerância. Duas propostas tentam explicar a indução de tolerância na população de
células T. A primeira delas sugere que após a entrada no timo, os timócitos são capazes
de “varrer” as células estromais por muitos dias o que faria com que essas células
fossem capazes de encontrar cerca de 20% de todas as mTECs, e isso já seria suficiente
para que elas entrassem em contato com todo o pool de genes expressos
promiscuamente (KLEIN et al 2000; SCOLLAY et al 1995). Essa proposta seria
favorecida pela localização dessas células na região cortico-medular, e pela expressão
de citocinas (AVICHEZER et al 2003; KLEIN et al 2001; BLEUL et al 2000;
ANNUNZIATO et al 2001; KWAN et al 2004). A segunda proposta por sua vez,
propõe que os TRAs poderiam ser secretados e capturados por células apresentadoras de
antígeno vizinhas, principalmente células dendríticas, que apresentariam esses antígenos
de maneira cruzada aos timócitos. Esse mecanismo seria capaz aumentar a
disponibilidade de TRAs expressos no timo, bem como a eficácia do encontro com os
timócitos (ZHANG et al 2003). Apesar da possibilidade de ocorrência de ambas as
propostas, estudos deverão ser realizados para obtenção de informações conclusivas,
porém fica evidenciada a alta probabilidade do encontro dos timócitos com os TRAs.
Introdução
19
1.5) Papel regulador do gene Aire
A descoberta do gene AIRE (autoimmune regulator) foi possibilitada com o
estudo de pacientes que possuíam uma doença autossômica recessiva rara conhecida
como Síndrome poliglandular auto-imune tipo I (APS-1). Pacientes com o gene mutado
desenvolvem uma doença auto-imune espontânea que afeta primariamente órgãos
endócrinos como tireóide, adrenais, ovários, entre outros (PERHEENTUPA et al 2002).
Caracterizada por uma herança monogenética recessiva, essa síndrome estimulou
buscas que culminaram com o mapeamento e posição clonal de um gene denominado
AIRE (No authors listed 1997; NAGAMINE et al 1997). O gene, localizado no
cromossomo 21q22.3, codifica uma proteína de 545 aminoácidos expressa
principalmente no timo, e em menor extensão nos linfonodos, além de ter sido
encontrado em alguns outros tecidos (BLECHSCHMIDT et al 2000; ZUKLYS et al
1983; ANDERSON et al 2002; HALONEN et al 2001; ADAMSON et al 2004). No
timo, estudos demonstraram que sua presença é restrita as mTECs e células dendríticas
(ANDERSON et al 2002; GOTTER et al 2004), e revelam que sua função está
relacionada ao controle da transcrição de um grande número de TRAs (ANDERSON et
al 2002, 2005). Uma parte dos transcritos de TRAs, porém parecem ser independentes
da expressão de Aire (DERBINSKI et al 2005), e este gene também regula positiva e
negativamente a transcrição de uma gama de genes nas TECs, que não codificam para
TRAs. O significado deste controle no timo foi observado em estudos com animais
Aire-knockout, onde a ausência desse gene promove o aparecimento de auto-anticorpos,
especialmente para o olho e o estômago (DEVOSS et al 2006; GAVANESCU et al
2007), sendo suficiente para causar auto-imunidade. A partir destes resultados
estabeleceu-se uma relação deste controle e o fenômeno de tolerância, que poderia estar
interferindo no processo de deleção clonal, levando a um escape de linfócitos T auto-
reativos (ANDERSON et al 2005; LISTON et al 2003, 2004).
A proteína codificada pelo gene Aire mostra muitas das características
encontradas nos fatores de transcrição, compartilhando muitos domínios com os
conhecidos controladores transcricionais, além de sua localização nuclear observada em
TECs (HEINO et al 2000; AKIYOSHI et al 2004). Um exemplo é o domínio SAND,
homólogo a domínios de ligação de DNA da família SP100 (BOTTOMLEY et al 200;
ISAAC et al 2006), e motivos PHD (BIENZ et al 2006). Apesar de o Aire ser retratado
Introdução
20
de forma similar, alguns pontos o distingue dos fatores transcricionais convencionais,
pois seu efeito é parcial e parte dos TRAs não é afetado por ele. Além disso, há
dificuldades em prever um local de ligação que ocorra em milhares de promotores, além
de sua especificidade, na qual já foi demonstrada a ausência de alguns aminoácidos
importantes para ligação ao DNA (GIBSON et al 1998; PUROHIT et al 2005; KUMAR
et al 2001). Recentemente dados ainda não publicados mostraram diferenças nos sítios
promotores dos TRAs, quando comparados aos genes expressos do próprio tecido.
Pesquisas demonstraram que os genes afetados pelo Aire se encontram clusterizados
(JOHNNIDIS et al 2005), e o efeito sobre esses genes tendem a ser heterogêneo, o que
descarta uma explicação simplista do modo de ação desta proteína. Alguns estudos
propõem o Aire como um modificador transcricional epigenético, que seria capaz de
modificar outros fatores nucleares, aumentando sua ação, ou mesmo promovendo sua
degradação (UCHIDA et al 2004). Apesar da grande quantidade de estudos, os dados se
mostram ainda muito controversos, o que deixa claro a importância de pesquisas acerca
desta importante proteína.
1.6) Análise do transcriptoma
1.6.1 Conceito de transcriptoma
Em analogia ao termo genoma o qual se refere ao conjunto de genes de uma
determinada espécie, criou-se o termo transcriptoma para se referir ao conjunto de
RNAs, ou seja, os transcritos de uma célula num dado momento de seu ciclo. Como são
os RNAm os responsáveis pela codificação da síntese de proteínas e, portanto, os mais
importantes no estudo da expressão do genoma, geralmente entende-se que o
transcriptoma é o conjunto dos RNAm. Mas é oportuno lembrar que tanto os RNAs
transportadores (RNAt) e os RNAs ribossômicos (RNAr) devem ser incluídos no
conceito do transcriptoma apesar de não serem codificadores de proteínas.
Recentemente foram incluídos os microRNAs no conceito de transcriptoma por
representarem uma classe distinta de RNAs que controlam a expressão gênica ao nível da
síntese e/ou degradação dos RNAm (SEVIGNANI et al., 2006).
Introdução
21
Durante todo o processo de diferenciação celular e tecidual, um conjunto
diversificado de proteínas é mobilizado como resultado da expressão diferencial dos
respectivos genes. Portanto, pode-se dizer que durante o desenvolvimento o primeiro
ponto de controle molecular é a expressão gênica ao nível do conjunto de RNAm,
definido como transcriptoma. Sabe-se hoje que o transcriptoma das células e tecidos é
reflexo da razão entre a biossíntese de RNAm (transcrição) e sua degradação, muitas
vezes causada pelos microRNAs (SEVIGNANI et al., 2006).
Além disso, o transcriptoma é variável entre os diferentes tipos de células,
tecidos e órgãos de um dado indivíduo, sendo que as próprias condições fisiológicas
normais, como as diferentes fases do ciclo celular, ou patológica, como por exemplo,
infecções ou neoplasias, influenciam no chamado perfil do transcriptoma (PASSOS et
al., 2000).
A comparação da expressão gênica por mensuração dos níveis de RNAm de células
em condições normais e patológicas está resultando em diagnósticos por “fingerprints” o
que poderá ajudar a identificar disfunções moleculares com maior precisão, para uma
posterior intervenção terapêutica (XIANG & CHEN, 2000).
1.6.2 Métodos de análise do transcriptoma
Cópias de RNAm na forma de DNA (DNA complementar ou simplesmente cDNA)
clonadas em vetores plasmidiais de E.coli e o sequenciamento a partir da extremidade 3´-
OH, perfazendo 0,3 a1,5 kb, confere ao que chamamos de “Expressed Sequence Tags”
(ESTs) ou em português, Etiqueta de Seqüência Expressa. As ESTs proporcionaram um
avanço significativo na decifração do genoma funcional humano, de camundongos e outros
organismos.
Mais recentemente o Brasil deu uma contribuição importante no sequenciamento
de cDNAs pela tecnologia das seqüências ORESTES (Open-Reading Frame ETSs)
(DIAS NETO et al., 2000). Tais seqüências correspondem a porções mais internas em
direção à extremidade 5´dos RNAm, o que fez os pesquisadores conhecerem mais sobre
a estrutura do transcriptoma humano.
Um grande progresso tem ocorrido nos últimos anos na caracterização de clones
Introdução
22
de cDNA de humanos, camundongos e outros organismos-modelo. Os clones de cDNA
e suas seqüências formam a base para a técnica de arranjos em membranas de alta
densidade (microarrays) para a análise de expressão gênica em grande escala
(DUGGAN et al., 1999; LIPSHUTZ et al., 1999).
Várias técnicas para a análise do transcriptoma analisando expressão de mRNA
estão disponíveis atualmente como SAGE (análise em série da expressão gênica, do
inglês Serial Analysis of Gene Expression) (YE et al., 2002). Muitos métodos
tradicionais de clonagem diferencial têm sido empregados de maneira bem sucedida, a
fim de se isolar genes únicos associados a doenças. Entretanto essas técnicas
apresentam limitações para estudos em doenças multigênicas como aquelas relacionadas
à auto-imunidade.
A utilização de cDNA microarrays, com a sua habilidade em determinar o padrão
de expressão de milhares de genes simultaneamente, obtendo assinaturas moleculares do
estado de ativação celular, é uma das ferramentas mais apropriada para o estudo em
questão. É amplamente reconhecido que a expressão de vários genes é coordenada espacial
e temporalmente, e que essa coordenação é alterada durante o desenvolvimento e a
progressão de uma doença. Análises por microarrays fornecem informações valiosas acerca
da patologia de doenças, progressão e resposta a tratamentos abrangendo qualquer
compartimento celular, sendo ainda capaz de permitir o aumento de diagnósticos e
abordagens terapêuticas para doenças auto-imunes. Aliando-se a disponibilidade das
bibliotecas de cDNA com a robótica de alta precisão na deposição de pequenas amostras
em superfícies sólidas, tornou-se possível a preparação dos arrays (arranjos) de clones de
cDNA, produtos de PCR (reação de polimerização em cadeia) e oligonucleotídeos em
membranas de nylon ou em lâminas de vidro (PASSOS et al., 2000).
As sondas utilizadas nas hibridações com os microarrays (sondas de cDNA
derivadas das amostras de RNA em estudo) podem ser marcadas com radioatividade
(
33
P) quando utiliza-se como plataforma membranas de nylon ou com fluorocromos
(Cy3 e Cy5) quando utiliza-se lâminas de vidro (Figura 8).
Como definiu Jordan (1998), as seqüências de cDNA fixadas no microarray são
chamadas de alvo e o RNA extraído das células (cDNAs marcados) chamado de sonda. E
neste trabalho, seguiremos esta definição, mas sabemos que vários laboratórios definem as
seqüências depositadas no array como sondas.
Introdução
23
Figura 8. Ilustração dos métodos de marcação de sondas complexas de cDNA para
microarrays. A) Método fluorescente usando Cy3 e Cy5 e lâmina de vidro e B) Método
radioativo usando
33
P e membranas de náilon. (Extraído e modificado do livro Mutagênese
Ambiental: Sakamoto-Hojo et al., 2003).
Introdução
24
Tudo isso vêm sendo aprimorado a partir do advento do seqüenciamento
associado ao desenvolvimento de técnicas de bioinformática, que disponibiliza
seqüências completas de genomas inteiros, permitindo assim um maior número de
investigações, aprimorando nossos conhecimentos a respeito dessas patologias
(MOSER et al 2004). Essa tecnologia vem sendo amplamente utilizada para estudos
clínicos como em estudos de leucemia, que mostra a possibilidade das células serem
divididas em subtipos agudos mielóides ou linfoblásticos a partir do perfil de transcritos
de RNA mensageiro (GOLUB et al 1999); estabelecimento de diferentes padrões de
assinatura relacionados ao perfil da doença, além de fornecer importantes informações
na expressão de clusters de genes particulares, como genes anti-apoptóticos em
linfomas de células B (ALIZADEH et al 2000); utilização da tecnologia para análise de
transcritos de tecidos complexos como porções do cérebro humano para estudo de
esclerose múltipla (LOCK et al 2002); receptor CXCR4 em artrite (RUS et al 2002), e
expressão de genes relacionados ao IFN e membros da família TNF em modelos de
esclerose (CROWE et al 2003), entre muitos outros.
Nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa tem se dedicado a estudos de
genômica funcional aplicada a imunologia, campo referido como imunogenômica. A
base tecnológica é o emprego de cDNA microarrays no estudo de doenças auto-imunes
como a artrite reumatóide (OLIVEIRA et al 2007; JUNTA, submetido),
desenvolvimento ontogenético do timo de camundongos isogênicos (MAGALHAES et
al 2006), e timo fetal em cultura (SOUSA et al 2006), além de estudos com câncer,
modelos de artrite e diabetes, e mais recentemente estudos envolvendo células tronco
hematopoiéticas, e bioinformática (SILVA et al 2007).
1.7) A utilização de RNA interferente (RNAi anti-AIRE) na pesquisa em
imunologia
O fenômeno de RNA interferente (RNAi ) foi primeiramente observado no final
da década de 1980, representando atualmente uma técnica potente no silenciamento da
expressão de genes por meio da degradação de seu RNA mensageiro (RNAm)
(CAPLEN et al, 2004; LEUNG et al, 2005; SHANKAR et al, 2005). O processo
envolve diversas etapas, do qual fazem parte a clivagem de um RNA dupla-fita em
Introdução
25
porções menores de 21-28 nucleotídeos por uma enzima RNase-III denominada Dicer.
As fitas simples de RNAi geradas pela degradação, são incorporadas a um
complexo multiprotéico chamado RISC (RNA-inducing silencing complex), que serve
como base para o reconhecimento do RNAm complementar alvo, que por sua vez é
degradado por uma enzima Slicer do complexo, uma proteína posteriormente
reconhecida e denominada Argonauta-2. O RNAi exibe uma eficácia de longo alcance,
pelo fato de estar protegido pelo complexo RISC, sendo então preservado facilitando
assim a degradação de RNAs mensageiros em subseqüentes reações endonucleolíticas.
Diversos pequenos tipos de RNAs dupla-fita artificiais têm sido inseridos em
uma grande variedade de células e organismos diferentes, sendo, portanto a técnica de
RNAi anti-Aire amplamente utilizada como um método para o silenciamento de genes
específicos. Assim, essa tecnologia apresenta um vasto potencial como ferramenta para
determinar funções de genes, e como forma de terapia para patologias caracterizadas
por expressão aberrante de proteínas celulares, como doenças infecciosas, desordens
genéticas, neoplasias e disfunções imunológicas.
A imunologia é um campo de pesquisa muito vasto, e muitas descobertas têm
sido realizadas com o advento e amplo uso da tecnologia de RNAi. Essa técnica tem
sido aplicada tanto para estudos na imunidade inata, quanto adaptativa, e tem se focado
na função de genes críticos, importantes sinais de vias de transdução, desenvolvimento
e diferenciação celular, e mecanismos iniciadores e efetores das respostas imunes. Essa
tecnologia, além da compreensão de desordens do sistema imunológico, tem também
contribuído para o entendimento dos mecanismos pelo qual patógenos são capazes de
invadir o hospedeiro, e a informação adquirida destes estudos sugerem que a técnica
poderá ser utilizada para regulação do sistema imune no cenário clínico.
Especificamente, o potencial das aplicações médicas com essa tecnologia inclui o
aprimoramento das respostas contra patógenos, tumores, tratamentos de doenças auto-
imunes e alérgicas, além de uma possível minimização das rejeições contra enxertos
(CHIH-PING et al, 2007).
No presente trabalho estudou-se o efeito da inativação do transcrito do gene Aire
diretamente no timo de camundongos DBA-2/J para se observar quais genes
codificadores de antígenos TRAs estão sob seu controle.
HIPÓTESES E OBJETIVOS
Hipótese e objetivos
27
2) Hipótese do trabalho
Considerando que: a) a auto-imunidade envolve o reconhecimento de auto-
antígenos, b) a apresentação destes auto-antígenos é dependente da expressão
promíscua (PGE) pelas células epiteliais corticais tímicas (mTECs) e c) que parte da
PGE é controlada pelo gene Aire, formulamos as seguintes hipóteses:
1) No sistema-modelo de indução de artrite reumatóide (AR), a PGE no timo de
camundongos da linhagem DBA-1/J (susceptível a AR) é diferente de
camundongos da linhagem DBA-2/J (resistente a AR);
2) O gene Aire controla parte da PGE na linhagem DBA-2.
Hipótese e objetivos
28
3) Objetivos
Objetivo amplo: Comparar a expressão gênica promíscua de genes de TRAs no timo das
linhagens DBA-1/J e DBA-2/J e avaliar o efeito da inativação do transcrito do gene
Aire na PGE exibida pela linhagem DBA-2/J.
Objetivos específicos:
1. Avaliar a expressão gênica diferencial de TRAs (expressão gênica promíscua)
no estroma do timo das linhagens DBA-1/J e DBA-2/J durante a imunização
com colágeno e transição do estado pré auto imune Æ auto imune (DBA-1/J)
usando a tecnologia dos cDNA microarrays.
2.
Avaliar e comparar os níveis de expressão do gene Aire no estroma do timo das
linhagens DBA-1/J e DBA-2/J usando a técnica de RT-PCR.
3.
Avaliar quais genes tem seu padrão de expressão alterado após a inativação do
transcrito do gene Aire usando o sistema de RNA interferente in vitro em ATOC
(linhagem DBA-2/J).
MATERIAL E MÉTODOS
Material e métodos
30
4) Material e métodos
4.1) Linhagem de camundongos DBA-1/J e DBA-2/J
A linhagem DBA-1/J, que representa a linhagem susceptível a indução de artrite
reumatóide, foi adquirida junto ao biotério de camundongos isogênicos da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, enquanto a DBA-2/J, linhagem que por sua vez se mostra
resistente a indução da doença, é proveniente do biotério da Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP). Os animais foram transferidos para o Laboratório no
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP, e
mantidos e câmara isoladora “Alesco”, com entrada de ar filtrado (filtro de 0,45 µ),
temperatura constante de 25
o
C, ciclo de iluminação de 12 horas, água e ração ad
libitum.
4.2) Indução de artrite reumatóide por imunização com colágeno
Animais de ambas as linhagens (DBA-1/J e DBA-2/J) receberam uma injeção
intradérmica na base da cauda de 200µg de colágeno do tipo II bovino (CII Sigma)
emulsificados em 0,1ml de PBS/adjuvante completo de Freund (1:1 CFA) (Difco). Os
camundongos controle falso-imunizados receberam o mesmo tratamento, porém sem
administração de colágeno.
4.3) Separação de células epiteliais tímicas (TECs)
Os animais de ambas as linhagens (DBA-1/J e DBA-2/J) foram sacrificados por
deslocamento cervical, conforme normas do Comitê de Ética, e os timos retirados
cirurgicamente.
Foram coletados de dois a três timos para cada amostra, e, portanto foi
utilizado um pool de timos, os quais foram cortados, visando romper a cápsula que
envolve o órgão, com o auxílio de uma tesoura, no interior de um béquer contendo 40
ml de meio de cultura Dulbecco`s Modified Eagle`s (DMEM) e HAM F-10
(Invitrogen). Com auxílio de uma pulga magnética os timos sofreram uma agitação por
Material e métodos
31
cerca de 30 minutos (GRAY et al, 2002). Após esse tempo os fragmentos foram
retirados e lavados em EDTA 0,5M e posteriormente passaram pelo processo de
extração de RNA total.
4.4) Extração de RNA total
As amostras de RNA total foram extraídas de cada amostra de timo depletada de
timócitos, recém removidos e ATOC, tanto de animais imunizados quanto dos controles
utilizando-se Trizol ® Reagent (Invitrogen).
Após a obtenção das células, estas foram suspensas em 200 µL de solução salina
0,9% estéril e em seguida foi adicionado 1mL de Trizol ® Reagent (Invitrogen). Com o
auxílio de pipetador procurou-se dissociar os fragmentos do tecido ainda restantes. As
amostras assim homogeneizadas foram incubadas durante 5 minutos a temperatura
ambiente para dissociação nucleoprotéica. Em seguida, foram adicionados 200 µL de
clorofórmio, seguindo-se por agitação em Vórtex durante 15 segundos e posterior
incubação por mais 3 minutos a temperatura ambiente. Após esse período, as amostras
foram centrifugadas por 15 minutos a 12000xg a 4°C, recolhendo-se a fase aquosa
sobrenadante e transferindo-a para um novo tubo. Para a precipitação do RNA foi
adicionado ao sobrenadante 3X o volume do sobrenadante com isopropanol gelado, cuja
mistura permaneceu a -20°C durante 18 horas. O RNA total foi coletado por
centrifugação a 12000xg a 4°C durante 15 minutos, e o precipitado foi lavado com 1000
µL de etanol 70 %. O precipitado de RNA foi coletado após centrifugação a 7500xg a
4ºC durante 5 minutos, e após secagem em tubo aberto, foi dissolvido em 10 a 15 µL de
H
2
O milliQ estéril.
A fim de prevenir a contaminação por ribonucleases no isolamento e manuseio
do RNA, a vidraria, espátulas, pinças e “pulgas magnéticas” utilizadas foram
autoclavadas; e todo material plástico, além de serem novos, foram autoclavados para o
manuseio que foi realizado com luvas de látex sem talco.
Material e métodos
32
4.5) Quantificação e Eletroforese de Amostras de RNA Total
Da solução de RNA total, 3µl foram retirados, e então diluídos 100X a fim de
serem submetidos a dosagens em espectrofotômetro usando luz ultravioleta
(GENEQUANT – AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH). As dosagens tiveram
como base a seguinte estimativa: 1U de A
260
= 40 µg RNA/ml. O grau de pureza do
RNA foi calculado pela razão entre as absorbâncias; A
260
/A
280
~ 2,0 indicando que a
preparação estava livre de proteínas e A
220
/A
260
~ 0,7, indicando estar livre de fenol.
A qualidade das preparações de RNA foi avaliada por meio de eletroforese em
gel de agarose sob condições denaturantes. Um volume total de 70 mL de agarose
fundida foi misturado a 20 mL de formaldeído 37% e 22 mL de tampão de migração
MOPS 5X (20,6g de MOPS dissolvidos em 800 mL de acetato de sódio 50mM, pH 7,0
ajustado com NaOH 2N e adicionado 10 mL de EDTA 0,5M pH 8,0; volume final
ajustado para 1000 mL). Durante o tempo de solidificação do gel, as amostras de RNA
foram denaturadas na seguinte mistura: 4,5 µL de solução de RNA (cerca de 3 µg
RNA); 2,0 µL de tampão MOPS 5X; 3,5 µL de formaldeído 37% (Merck, Alemanha),
10,0 µL de formamida, e 1,0 µL de brometo de etídeo diluído 3:1 (solução estoque
10mg/mL). A mistura foi então incubada por 15 minutos em banho a 65°C. Após esse
tempo, o tubo foi colocado imediatamente no gelo, e adicionou-se e 2,0 µL de dye
loading solution (1/10 do volume). Após eletroforese a 80V durante 90 minutos as
bandas de RNAr 28S, 18S e 5S foram visualizadas em transluminador UV e
fotografadas.
4.6)
Cultura de timo adulto (ATOC)
Os timos dos animais da linhagem DBA-2/J foram removidos, cortados e
transferidos para filtros de policarbonato Millipore 0,45µm colocados sobre um bloco
de grids de plástico, mantidos em placas de cultura (24 poços) contendo 3,0 mL de meio
Dulbecco`s Modified Eagle`s (DMEM) e HAM F-10 (Invitrogen), adicionados 20% de
soro bovino fetal, estreptomicina (100µg/mL), penicilina (250U/Ml), gentamicina
(10µg/Ml) e bicarbonato de sódio (1,2g/L). Os órgãos foram cultivados a 37ºC em
atmosfera de 5% de CO
2
(WHALEN et al, 1999).
Material e métodos
33
4.7)Tratamento de ATOC com RNAi anti-Aire
Para realização dos ensaios de RNAi anti-Aire utilizou-se o TriFECTa
TM
Dicer-
Substrate RNAi anti-Aire anti-Aire Kit, que contém:
Três seqüências específicas de RNA duplo fita para o RNA mensageiro
alvo – Aire (2nmoles cada).
Um controle de transfecção marcado com Cy3
TM
DS (1nmole).
Um controle negativo universal (DS Scrambled Neg), que corresponde a
uma seqüência de RNA dupla fita que é ausente no genoma de humanos,
camundongos e ratos (1nmole).
Um controle positivo (HPRT-S1 DS Positive Control), cujo alvo é o gene
da hipoxantina guanina fosforibosiltransferase 1 - HPRT, e é comum
entre humanos, camundongos e ratos.
Um tampão (Rnase-free Duplex Buffer – 100mM KAc/30Mm HEPES Ph
7.5, 2mL).
Lipofectamina, responsável pela formação de complexos com o RNAi
anti-AIRE anti-AIRE, o que permite sua entrada na células.
Em cada seqüência específica de 2nmoles foram adicionados 100µl de tampão, e
em cada seqüência de 1nmole foram adicionados 50µl, todas com uma concentração
final de 20µM. Posteriormente as seqüências foram aquecidas a 94ºC por 2 minutos
para formação das duplas fitas, e finalmente estocados a -20ºC.
Para escolha da seqüência de RNAi anti-Aire mais eficaz para o silenciamento,
foram utilizadas culturas de linhagens celulares de mTECs de camundongos C57BL/6, e
a eficiência foi verificada por reações de RT-PCR, citada abaixo. Entretanto para o
controle da transfecção, e determinação da melhor concentração, foi utilizado o próprio
timo.
O órgão foi inicialmente tratado com RNAi marcado com Cy3 e colocado em
um tampão de congelamento (TBS – Tissue Freezing Medium
TM
, Triangle Biomedical
Sciences, Durham, N.C) no interior de uma forma e estocado a -80ºC. Após o
congelamento foram feitos cortes, no escuro, em criostato (Microtome Cryostat HM
Material e métodos
34
505E) de 20µm, para se evitar ruptura do tecido e consequentemente das camadas
celulares, e colocados em uma lâmina, para posterior avaliação por microscópio
confocal (Leica TCS – SP2), localizado no Departamento de Biologia Celular e
Molecular e Bioagentes Patogênicos.
Para os ensaios com RNAi anti-Aire, a seqüência 5’
GGAUUCUCUUUAAGG 3’ e 5’ UUGUAGUCCUUAAAG 3’ foi utilizada, pois
demonstrou maior eficiência quanto ao processo de silenciamento do gene Aire. A
concentração de 50µM foi determinada, e assim um total de 27µl de solução; sendo
20µl de meio MEM filtrado, 6µl de RNAi anti-Aire anti-Aire, e 1µl de
lipofectamina; permanecia 10 minutos em repouso a temperatura ambiente para
formação dos complexos, e posteriormente colocada em contato com o órgão com o
auxílio de uma micropipeta.
4.8) Avaliação de apoptose e necrose em ATOC por citometria de fluxo
Os timos removidos dos animais da linhagem DBA-2/J foram transferidos em
placas de cultura (12 poços), contendo 1ml de colagenase II, 100U/ml de meio de
cultura Dulbecco`s Modified Eagle`s (DMEM) por 30 minutos. Após esse tempo, os
timos foram então macerados em uma rede de nylon com o auxílio de um embolo de
seringa, e a suspensão de células foi então quantificada por meio do aparelho Coulter. A
quantidade de 1x10
6
/tubo células foi utilizada para o ensaio. Posteriormente as células
foram lavadas em 3ml de PBS 1X, e o botão de células obtido após centrifugação a
400g, por 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado, e a seguir foram
adicionados 100µl/tubo de tampão de Annexin Binding Buffer diluído 1:10 em PBS, e
1µl de cada marcador, anexina V e iodeto de propídeo (PI) provenientes do
ApoScreen
TM
Annexin V-FITC KIT (Birmengham, AL35260 USA). As amostras foram
incubadas por 15 minutos a temperatura ambiente, e posteriormente adicionado 50µl de
PBS para leitura no citômetro.
Material e métodos
35
4.9) Reações de RT- PCRs (transcrição reversa seguida de PCR)
As reações de transcrição reversa foram realizadas com 2 µg de RNA total, 1µL
de oligo(dT) e 1 µL de DNTP mix 10nM em um volume final de 20 µL, segundo
instruções do fabricante. As amostras permaneceram a 65°C durante 5 minutos e depois
foram colocadas imediatamente no gelo e foi dado um spin para que se evitasse a
evaporação da amostra após a abertura do tubo. Em seguida, acrescentou-se 4µL de
buffer 5x first-strand, 2µL de dTT e 1µL de RNAsin e deixou-se por 2 minutos a 42°C.
Adicionou-se 1µL de enzima Superscript II RNase H Reverse Transcriptase (Invitrogen
Corporation, Carlsbad, CA, USA) e a reação permaneceu por 50 minutos a 42°C,
completando a reação após 15 minutos a 72°C.
Para a posterior PCR semiquantitativa foram feitas diluições (1:1 a 1:256) de
cada amostra de cDNA (molde) e primers específicos localizados em éxons diferentes
para evitar uma possível amplificação de DNA genômico contaminante. As reações de
PCR foram preparadas em um volume final de 25 µL, contendo 0,10 µM de cada
primer, solução de dNTPs (10 mM), KCl 50 mM; Tris pH 8.0, 10 mM; MgCl
2
1,5 M, e
Taq DNA polimerase (5U/µL). O protocolo de amplificação difere de acordo com a
temperatura para cada um dos primers utilizando-se um aparelho Master Cycler
Gradiente (Eppendorf).
Para a análise dos produtos gênicos amplificados, uma alíquota de 10 µL desta
solução foram misturados com 2µl de loading buffer e separados por eletroforese em gel
de agarose 1,5% contendo brometo de etídio. A corrida eletroforética procedeu-se a 80
V durante 2 horas. Foi usado como marcador de pesos moleculares o ∅X174 RF
DNA/Hae III . As bandas foram visualizadas por iluminação UV de um transiluminador
e o gel fotografado usando uma câmera digital. Os pares de oligonucleotídeos utilizados
estão descritos nas tabelas 1, e foram obtidos através do Software Primer 3
(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi).
Material e métodos
36
Tabela 1. Primers utilizados na amplicação por PCR, para avaliação da PGE
.
Primer Seqüência (sense e anti-sense
respectivamente)
Temperatura de
anelamento
Aire
5´ CATCCTGGATTTCTGGAGGA 3’ e
5’ GCTCTTTGAGGCCAGAGTTG 3’.
57ºC
CD3e 5´ GATGCGGTGGAACACTTTCT 3´ e
5´ ACTGTCCTCGACTTCCGAGA 3´
57ºC
Pró-colágeno II 5´ GCCAAGACCTGAAACTCTGC 3´ e
5´ GCCATAGCTGAAGTGGAAGC 3´
57ºC
Gad67 5´ TGCAACCTCCTCGAACGCGG 3´ e
5´ CCAGGATCTGCTCCAGAGAC 3´
60ºC
Ins-1 5´ CAGCCCTTAGTGACCAGC 3´ e
5´ TCTCCAGCTGGTAGAGGG 3´
60ºC
Ins-2 5´ CAGCCCTAAGTGATCCGC 3´ e
5´ TCTCCAGCTGGTAGAGGG 3´
61ºC
Β-actina 5´ ATGGATGACGATATCGCT 3´ e
5´ ATGAGGTAGTCTGTCAGG 3´
60ºC
Material e métodos
37
4.10) Preparação de cDNA
microarrays
em lâminas de vidro
4.10.1)
Biblioteca de cDNAs murinos
Nosso laboratório mantém uma biblioteca de cDNA murino (Biblioteca
MTB IMAGE), com cerca de 9.000 clones de timo provenientes do “IMAGE
Consortium” (http://image.llnv.gov). São clones com seqüências “expressed
sequence tags” (EST), cujos tamanhos moleculares variam de 500 a 1.500 pb, e
está totalmente caracterizada, cujos clones estão seqüenciados e catalogados.
Os clones estão identificados com seus respectivos “accession numbers” (Acc)
no GenBank, Clone ID, o nome do gene e a posição de cada clone nas placas de
384 poços em planilhas do programa Excel® Microsoft. Conservamos esta
biblioteca em E. coli e placas de microtitulação (384 poços) a -80°C (material
gentilmente cedido pela Dra. Catherine Nguyen, do INSERM-TAGC ERM 206,
Marseille, França).
4.10.2) Amplificação de cDNA para a confecção de
microarrays
Os clones de E. coli da biblioteca de cDNA IMAGE murina, repicados
em placas de 384 poços contendo meio de cultura 2X LB + ampicilina foram
incubados durante 16 horas, na proporção de 5 µl da cultura original diluídos
em 45 µl de meio de cultura 2X LB (volume final em cada poço: 50 µl). A
seguir uma alíquota de 8µl da cultura foi transferida para outra placa de 384
poços, contendo 72 µl de água deionizada estéril, e esta placa incubada a 95
o
C
por 10 minutos para lise das células. Após centrifugação a 4000xg por 5
minutos foi retirado 10µl do sobrenadante e adicionado a 40µl de um mix para
PCR contendo tampão da reação de PCR (10X), solução de dNTP (2mM),
primers com seqüências consenso aos três vetores presentes na biblioteca
(10µM), primer LBP 1S (5´tgtggattgtgagcggataa3´) e primer 1AS
(5´gggttgaattagcggaacg3´), Taq Polimerase (5U/µl) e água deionizada estéril
q.s.p 50 µl. O programa para amplificação dos insertos teve como base aquele
descrito por Menossi et al., 2000: 5 minutos a 94°C, seguidos de 30 ciclos
Material e métodos
38
(94°C, por 30 segundos; 55°C por 30 segundos, 72°C por 2 minutos), seguida
por uma extensão final de 7 minutos a 72°C e 5 minutos a 4 °C. Foi realizada
em um aparelho termociclador “Mastercycler Gradient” (Eppendorf), em placas
de PCR seladas com adesivo laminado para evitar evaporação. Cerca de 2
amplificações PCR de cada clone foram realizadas, sempre totalizando 50µl de
volume.
A avaliação da qualidade dos produtos amplificados pela PCR foi feita
em gel de agarose 1%, em tampão TAE 1X (Tris-acetato 0,04 M, EDTA 0,001
M) contendo brometo de etídio (10mg/ml) a 80V, durante 15 min. A
visualização das bandas foi realizada utilizando transluminador U.V. e
fotografados em Polaroid.
4.10.3) Purificação dos produtos de PCR
Para obtenção de uma eficiente fixação dos insertos de cDNA
amplificados nas lâminas de vidro é necessária a remoção de nucleotídeos não
incorporados e primers da reação de PCR (HEDGE et al. 2000). Utilizamos a
purificação dos produtos de PCR por precipitação com etanol.
Os produtos de PCR (50 µl) foram transferidos para placas de cultivo
com fundo em “U” e foram adicionados 10 µl de acetato de sódio 3M pH 4,8
em cada poço de uma placa de 96 poços. Em seguida, os produtos das duas PCR
foram agrupados, totalizando 100 µl, que foram transferidos para esta mesma
placa. Após a adição de 100 µl de etanol absoluto, as placas foram incubadas
por 16 horas (overnight) a –20
o
C. Após este tempo, as placas foram
centrifugadas a 4000xg por 60 min. a 2-8°C. O sobrenadante foi desprezado e o
pellet foi ressuspenso em 100 µl de etanol 70%. As placas foram novamente
centrifugadas a 4000xg por 30 min a 2-8°C. O sobrenadante foi novamente
desprezado e a placa secou à temperatura ambiente overnight. Após a placa
seca, o pellet foi ressuspenso em 50 µl de água deionizada autoclavada.
Uma alíquota de 5 µl destes produtos foi aplicada em gel de agarose 1%
contendo brometo de etídeo, visualizado em transluminador U.V. e fotografado
em Polaroid para avaliar a qualidade dos produtos amplificados.
Material e métodos
39
As placas foram secas em forno a 42°C e adicionou-se 27 µl de solução
de espotagem (DMSO 50% - dimetil sulfóxido) por poço da placa. Em seguida,
estas placas foram levadas ao freezer – 20°C e os produtos foram congelados e
descongelados por 3 vezes para uma melhor dissolução do DNA concentrado.
Posteriormente, os clones foram passados para as placas do robô, e estocadas a
4°C até a deposição dos produtos de PCR em membranas de náilon Hybond N
+
(GE Healthcare) ou em lâminas de vidro.
4.10.4) Confecção das lâminas de
microarrays
Amostras de produtos de PCR purificados foram preparadas para deposição em
lâminas de vidro adicionando-se mesmo volume (1:1) de Reagente D (GE Healthcare) e
transferidas para microplacas de 384 poços (Genetix). Por meio de um robô Array
Spotter III (Amersham Molecular Dynamics) as amostras foram depositadas por um
conjunto de 12 canetas que deposita um volume de 0,9 nl da amostra baseada na ação de
capilaridade em superfície de lâminas de vidro (Corning ® - UltraGaps 40015). Após a
deposição de cada conjunto de amostras as canetas foram lavadas automaticamente em
uma estação de lavagem que utiliza sucessivamente água purificada (18 megohm/cm),
etanol absoluto (Merck), solução 0,2 M de KOH e água novamente. As canetas foram
secas com nitrogênio 5.0 analítico antes das próximas amostras serem carregadas. A
câmara de deposição das amostras em lâminas do robô Array Spotter III possui
temperatura e umidade controladas. A umidade relativa de deposição das amostras foi
de~55% e a temperatura foi de ~25°C. Além disso, este robô está instalado numa sala
especial com ar limpo (sala limpa classe 10.000). Após a deposição e secagem de todas
as amostras nas lâminas, o DNA foi fixado por “cross-linking” por meio de irradiação
ultravioleta a 500 mJ de energia (Hoefer UV Crosslinker).
4.10.5) Delineamento das hibridações em
microarrays
Uma escolha chave em um projeto que envolve a tecnologia de microarray é
utilizar comparações que podem ser diretas ou indiretas isto é, estabelecer comparações
dentro ou entre as lâminas. Não existe um delineamento experimental ideal para todas
as situações, ou seja, diferentes desenhos experimentais são necessários para contextos
experimentais diferentes. Qualquer que seja o tipo de desenho utilizado será requerido o
Material e métodos
40
mesmo número de hibridações, e a decisão sobre o tipo de delineamento deve
considerar a pergunta do trabalho.
O pool de RNA derivado de linhagens celulares é a amostra de referência mais
utilizada atualmente. Para fornecer a cobertura ótima dos genes depositados na lâmina,
as amostras de referência são freqüentemente constituídas de diferentes linhagens
celulares oriundas de vários tecidos. Como neste trabalho escolheu-se o uso de RNA de
referência, segue algumas considerações:
Ensaios de co-hibridação diferencial usando microarrays medem a expressão
gênica relativa de amostras emparelhadas e de uma amostra referência, sendo que o
poder da análise de microarray vem da identificação de padrões informativos de
expressão de um gene através das experiências múltiplas. O cumprimento destes
objetivos é facilitado usando uma amostra de referência comum para todos os
experimentos que forneça uma medida da expressão base para cada gene, permitindo a
normalização e a comparação de experimentos independentes.
Um vasto número de linhagens celulares pode não melhorar necessariamente a
representatividade total dos genes depositados no array, pois algumas linhagens
celulares expressam significativamente mais genes do que outras e, nem todas as
linhagens expressam todos os genes em níveis semelhantes. Misturar RNA de muitas
linhagens celulares pode diluir os transcritos raros de modo que a sua representação no
“pool” final do RNA corre o risco de ficar abaixo do limite detectável (YANG et al.
2002).
O delineamento das hibridações de microarrays consistiu em marcar o pool de
referência, constituído de timos de camundongo C57BL/6, com fluorocromo Cy5 e
combiná-los numa mesma lâmina com amostras de RNA (cDNA) marcados com Cy3
(Figura 9).
Material e métodos
41
4.10.6) Marcação das sondas complexas de cDNA com fluorocromos Cy3 e Cy5
Amostras de RNA foram convertidas a cDNA e marcadas utilizando o
Kit CyScribe Post-Labelling (GE Healthcare) que envolve a preparação e
adequação do cDNA em dois passos. No primeiro passo ocorre a síntese da
primeira fita de cDNA com a incorporação de nucleotídeos amino- alil dUTP
modificados, com posterior degradação da cadeia de RNAm e purificação do
cDNA para remoção de nucleotídeos livres e oligômeros (Figura 10).
a) Preparação da primeira fita de cDNA por incorporação de AAdUTP
Em um tubo Eppendorf de 1,5 µl imerso em gelo picado foram
adicionados 10 µg de RNA total, 1 µl de primers randômicos, 3 µl de oligo (dT)
e 0,5 µl de controle denominado “spike mix” para o Universal ScoreCard em
um volume total de 11 µl (Proporção de 2 µl de spike mix para cada 1 µg de
RNA marcado). A reação foi cuidadosamente montada e incubada a 70°C por 5
minutos, sendo posteriormente resfriada a 4°C durante 5 minutos. A extensão
Figura 9. Delineamento dos experimentos com microarrays. Foi utilizado RNA total (cDNA total)
de timo de camundongo adulto C57BL/6 como RNA de referência (marcado com Cy3). As
amostras de timo experimental foram marcados com Cy5.
RNA de Timos de camundongos
adultos C57BL/6
RNA de Estroma depletado de
Timócitos de camundongos
adultos DBA-1/J e DBA-2/J
Pool de referência marcado com Cy5.
Sonda de cDNA marcado com Cy3.
Material e métodos
42
da cadeia de cDNA foi realizada utilizando 4 µl de tampão 5X CyScript , 2 µl
de DDT 0,1 M, 1µl de nucleotídeo “mix”, 1µl de AA-dUTP (a quantidade de um
tubo contendo AA-dUTP liofilizado foi ressuspensa em 30 µl de água livre de
nucleases e mantido a -20°C por no máximo 30 dias), 1 µl de transcriptase
reversa CyScript, em um volume final de reação de 20 µl. A reação foi incubada
a 42°C por 1,5 hora. Procedemos à degradação do RNAm adicionando 2 µl de
NaOH 25M com incubação a 37°C durante 15 minutos, posteriormente foi
adicionado 20 µl de HEPES 2M.
b) Purificação do cDNA com colunas de purificação CyScribe GFX
Para cada amostra de cDNA com volume entre 20 a 100 µl foram
adicionados 500µl de solução “capture buffer” em uma coluna de purificação
GFX colocada dentro de um tubo coletor. O produto de cDNA marcado com
aminoalil não purificado foi adicionado à coluna e misturado 5 vezes. A
centrifugação foi feita a 13800 xg por 30 segundos. A coluna foi retirada e o
líquido contido no tubo coletor foi descartado. A coluna foi novamente
colocada no tubo coletor e foram adicionados 600µl de etanol 80%. A
centrifugação foi feita a 13800 xg por 30 segundos. A coluna foi retirada e o
líquido contido no tubo coletor foi descartado. Esta lavagem foi repetida mais
duas vezes. Uma nova centrifugação foi feita a 13800 xg por 10 segundos. para
retirada do excesso de etanol 80% da amostra. O tubo coletor foi descartado e a
coluna contendo o cDNA foi colocada em um tubo de 1,5 µl. Foi adicionada a
coluna 60 µl de bicarbonato de sódio 0,1 M pH 9,0 e incubado durante 5
minutos. O material foi centrifugado a 13800 xg por 1 minuto.
No segundo passo, o cDNA é marcado com formas reativas de ésteres
NHS Cy3 e Cy5 que se ligam aos nucleotídeos modificados e após um processo
de purificação para eliminação dos CyDye não incorporados a sonda está pronta
para hibridação (Figura 11).
Material e métodos
43
c)Incorporação de Cy3 e Cy5
A amostra de cDNA marcada com aminoalil purificado foi adicionada a
um tubo com a alíquota de CyDye NHS éster e ressuspendida várias vezes. O
material foi centrifugado a 13800 xg por 1 minuto e incubado, no escuro,
durante 1 hora. Posteriormente, foi adicionado 15 µl de hidroxilamina 4M
seguida de incubação no escuro, durante 15 min a temperatura ambiente.
d)Purificação do cDNA marcado com CyDye com colunas de purificação CyScribe
GFX
Para cada amostra de cDNA com volume entre 20 a 100 µl foram
adicionados 500 µl de solução “capture buffer” em uma coluna de purificação
GFX colocada dentro de um tubo coletor. O produto de cDNA marcado com
CyDye não purificado foi adicionado à coluna e misturado 5 vezes. A
centrifugação foi feita a 13800 xg por 30 segundos. A coluna foi retirada e o
líquido contido no tubo coletor foi descartado. A coluna foi novamente
colocada no tubo coletor e foram adicionados 600 µl da solução “wash buffer”.
A centrifugação foi feita a 13800 xg por 30 segundos. A coluna foi retirada e o
líquido contido no tubo coletor foi descartado. Esta lavagem foi repetida mais
duas vezes. Uma nova centrifugação foi feita a 13800 xg por 10 segundos para
retirada do excesso da solução “wash buffer” da amostra. O tubo coletor foi
descartado e a coluna contendo o cDNA foi colocada em um tubo de 1,5 µl. Foi
adicionado a coluna 60 µl da solução “elution buffer” pré-aquecido à 65°C e
incubado durante 5 minutos. O material foi centrifugado a 13800 xg por 1
minuto.
e)Quantificação do CyDye incorporado no cDNA
Após a purificação foi feita a monitoração de incorporação dos fluorocromos por
meio de leitura em espectrômetro (Ultrospec 2100, GE Healthcare) em comprimento de
onda a 550 nm para Cy3 e 650 nm para o Cy5 usando amostras diluídas 100X. A
quantidade de Cy3 ou Cy5 incorporados no cDNA pode ser calculada através do seu
Material e métodos
44
coeficiente de extinção molar 150 000 l mol
–1
cm
-1
para Cy3 e 250 000 l mol
–1
cm
-1
para Cy5. As proporções de Cy3 e Cy5 incorporados no cDNA foram calculados pela
fórmula: (A)/E x Z x fator de diluição x 10
12
, onde:
A= absorbância de Cy3 a 550 nm ou Cy5 a 650 nm
E= coeficiente de extinção para Cy3 ou Cy5 x 10
-6
Z= volume (µl) da sonda após purificação
Para hibridações com os dois fluorocromos foram adicionados os cDNA
marcado com Cy3 e Cy5 em um tubo de microcentrífuga protegido da luz. A solução de
cDNA foi concentrada no aparelho “Speed Vacum”. A seguir o cDNA foi dissolvido
em 6 µl de água livre de nuclease e desnaturado a 95°C por 2 min. A solução foi
imediatamente resfriada no gelo por 30 seg. A essa reação adicionamos 1,5 µl de A
80
(1mg/ml) e incubamos a 75 °C por 45 min, estando assim pronta para o processo de
hibridação.
Material e métodos
45
Figura 10. Preparação da fita simples de cDNA incorporada com amino alil com o kit “CyScribe Post
Labelling”(GE Healthcare).
RNA Total
Anelamento do RNA
Oligo (dT) primer
random nonamers
Anelamento da fita simples de cDNA incorporada com
amino alil (AA-dUTP) com o RNA
Nucleotídeos, AA-dUTP,
Tampão da Reação, Enzima
Anelamento
Síntese de cDNA
Degradação do RNAm
Tratamento alcalino (2,5 M NaOH)
Neutralização (2 M HEPES)
Fita simples de cDNA incorporada com amino alil
livre de nucleotídeos e oligômeros
Purificação do cDNA
Purificação com colunas
CyScribe GFX
Fita Simples de cDNA marcada e incorporada com
Amino Alil Purificada
Material e métodos
46
Acoplamento do cDNA com
CyDye-NHS ester
Purificação do cDNA marcado com
CyDye
Fita simples de cDNA incorporada com amino-alil
purificada
CyDye-NHS ester
Hidroxilamina
cDNA incorporado com CyDye e
CyDye não incorporado
Colunas de purificação CyScribe
GFX
cDNA marcado com CyDye purificado
Hibridação com os microarrays
Figura 11. Preparação do cDNA marcado com CyDye com o kit “CyScribe Post Labelling” (GE
Healthcare).
Material e métodos
47
4.10.7) Hibridação das lâminas de
microarrays
As lâminas de microarrays foram hibridadas utilizando um processador
automático, “Lucidea Automated Slide Processor”–ASP (GE Healthcare) que permite a
hibridação e lavagens em câmaras independentes (12 lâminas por vez). Este aparelho
inclui um software que automatiza a injeção de amostras líquidas e soluções de lavagens
ou ar dentro das câmaras e possui parâmetros de controle de temperatura e velocidade
de injeção e circulação destas soluções no interior das mesmas.
As lâminas foram hibridadas por 15 horas a 42°C. As condições de lavagens
foram: 1XSSC/0,2%SDS (2 x 20 seg. à temperatura ambiente); 0,1X SSC/0,2% SDS (2
x 20 seg. à temperatura ambiente); 0,1X SSC (2 x 20 seg. à temperatura ambiente). A
última lavagem das lâminas foi feita com isopropanol, sendo em seguida aquecidas a
42°C, e novamente lavada com isopropanol. Após as lavagens as lâminas foram
aquecidas a 60°C para secagem. As lâminas estavam prontas para serem “lidas” em
aparelho “scanner” a laser.
4.10.8) Aquisição de Imagens de
microarrays
As lâminas foram lidas num aparelho Generation III “Array Scanner” (GE
Healthcare) com lasers de 532nm para o Cy3 (verde) e 633 nm para o Cy5 (vermelho).
A leitura da lâmina gera dois arquivos com imagens separadas com os pontos em preto
para os dois canais (Cy3 e Cy5) e uma terceira imagem, agora colorida, sobrepondo
Cy3 e Cy5 visualizadas usando o software ImageQuant (GE Healthcare).
4.10.9) Quantificação e normalização dos dados de
microarrays
Após obtenção das imagens seguiu-se à análise realizada em duas etapas.
Inicialmente, os dados contidos nas imagens foram transformados em dados
numéricos, utilizando o programa Spotfinder (http://www.tigr.org/software). Esse
programa, além de transformar as informações das imagens em valores numéricos,
também analisa a qualidade dos pontos e calcula o "background". Dois parâmetros
foram considerados para o controle de qualidade neste programa: os pontos de boa
Material e métodos
48
qualidade apresentam valores superiores e/ou igual a 1 valor "backgrounds" mais 1
valor desvio padrão.
Em seguida, estes dados foram normalizados. A normalização retira os erros
experimentais sistemáticos por balancear a intensidade dos dois fluorocromos. Esses
erros podem ocorrer devido à diferença de incorporação dos corantes, efeitos espaciais
na lâmina e diferenças durante a aquisição das imagens nos dois canais. Para esses
ajustes, utilizou-se a plataforma R (www.r-project.org), com o pacote AROMA
(http://www.maths.lth.se/help/R/aroma/), que retém as funções necessárias para a
normalização dos dados de microarrays. Portanto, após a retirada do background pelo
programa Spotfinder, os dados foram importados para o ambiente R e transformados
para o formato de dados “M versus A”, onde M é igual a log2(R/G) e A é igual a
1/2·log2(R·G). Em seguida, os métodos de normalização “print-tip Lowess” e “absolute
median deviation (MAD) re-scaling” foram aplicados respectivamente. O primeiro
método aplica uma regressão linear nos dados, para corrigir erros espaciais que possam
ter sido gerados durante os experimentos. O segundo re-escalona as razões de log para
cada microarray, de maneira que cada slide adquire a mesma distribuição dos dados, de
acordo com a MAD, capaz de estimar com robustez a variância de uma amostra. Na
Figura 12, observamos o fluxograma do “pipeline” desenvolvida para análise dos dados.
Material e métodos
49
Quantificação das imagens
Armazenamento dos dados em tabelas de texto
tabuladas
Filtragem do background + 2X o desvio padrão
Filtragem dos valores negativos e zeros
Transformação dos dados para o formato MA
Normalização intra-lâminas (print-tip lowess) e
ntr
-l
â
m
i
n
a
s
(e
sc
a
l
o
n
a
m
e
nt
o
pe
l
a
M
A
D
)
Criação dos gráficos diagnósticos para cada passo
de filtragem, normalização e análise
Filtragem pela razão do valor
mediano do ponto (spot)
Filtragem dos spots utilizados como controles
(Scorecard)
Filtragem pelo tamanho dos spots
Criação de modelo linear de análise
Análise da expressão gênica diferencial pela
e
st
a
tíst
i
c
a
b
aye
s
ia
n
a
e
m
p
ír
i
c
a
(e
st
a
tíst
i
c
a
B
)
KTH + BIOCONDUCTOR
Ambiente R
SPOTFINDER
AROMA
LIMMA
Figura 12. “Pipeline” utilizado na análise de dados de microarrays em lâminas de vidro.
Material e métodos
50
Utilizando o pacote LIMMA (Linear Models for Microarray Data)
(SMYTH et al, 2004)foi aplicado o método Bayesiano empírico para análise
estatística da expressão diferencial.
Posteriormente, o programa SAM (“Significance Analysis of Microarrays”) (TUSHER
et al. 2001) foi utilizado para a detecção dos genes diferencialmente expressos
(SMYTH et al, 2004). O programa SAM representa uma evolução dos softwares de
análise estatística para a tecnologia de microarrays e encontra-se disponível no endereço
(http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/). A análise baseia-se em uma série de testes-t
específicos para cada gene, que são adaptados para a detecção da expressão gênica
diferencial em larga escala. A partir da observação de que as flutuações casuais são
específicas para cada gene, o teste SAM é baseado na razão entre a diferença das médias
das situações, como por exemplo, pool de órgãos (Xc) e o timo (Xp), e o desvio padrão
de cada gene, calculados a partir de repetição experimental. A diferença relativa d(i) na
expressão gênica é então definida pela equação 1:
0
)(
)()(
)(
SiS
iXiX
id
cp
+
−
=
Onde Xp(i) e Xc(i) são definidos como níveis médios da expressão do gene nos estados
p (timo) e c (pool de órgãos), respectivamente. A dispersão gene-específica S(i) é o
desvio padrão de medidas repetidas de expressão, e a constante positiva So no
denominador da equação acima, servem para certificação de que a variância de d(i) é
independente da expressão gênica. Para a determinação de genes com mudanças
d(i) = diferença relativa
Xp(i) = níveis médios da expressão dos genes no
timo
Xc(i) = níveis médios da expressão dos genes no
pool de órgãos
S(i) = desvio padrão de medidas repetidas de
ex
p
ressão
[EQUAÇÃO 1]
Material e métodos
51
significativas na expressão, utilizou-se um gráfico de dispersão d(i), em relação à
diferença relativa esperada d
E.
(i). Para uma grande maioria de genes d(i) ≅ d
E.
(i), mas
alguns genes são representados por pontos distantes da linha d(i) ≅ d
E.
(i). As alterações
das expressões dos genes que se encontram a uma distância maior do que o limiar (∆) é
então considerado significante (Figura 13).
O limiar (∆) determina dois cortes horizontais, ou seja, o menor valor de d(i)
indica que o gene seja considerado significantemente induzido (hiperexpresso), e o
valor menos negativo de d(i) indica que o gene está significantemente reprimido
(hipoexpresso).
A porcentagem de genes identificados por mudanças aleatórias é chamada de
Freqüência de Descobertas Falsas (FDR), um método inicialmente idealizado por
(BENJAMINI & HOCHBERG, 1995) e definido como a proporção esperada de
rejeições falsas. O cálculo de FDR e o número de genes com mudanças significativas
estão intimamente relacionados com o limiar ∆. À medida que o valor de ∆ diminui, o
número de genes significantemente alterados aumenta à custa de um aumento de um
FDR. Essa determinação do nível de significância pelo limiar providencia cortes
assimétricos para genes induzidos e genes reprimidos. Essa assimetria é desejável, posto
que os genes induzidos e genes reprimidos podem se comportar de maneira diferente em
alguns experimentos. Ao utilizar o SAM, o usuário pode escolher o limiar ∆ mais
conveniente com base no nível de significância estimado pelo FDR e no número de
genes com os quais se pretende trabalhar.
O programa SAM estabelece automaticamente uma ligação entre o número de
acesso das seqüências utilizadas com as páginas de informações sobre o clone em
questão, situados no banco de dados S.O.U.R.C.E. (“Stanford Online Universal
Resource for Clones and ESTs”) (http://source.stanford.edu/cgi-
bin/source/sourceSearch). O S.O.U.R.C.E. compila informações de vários bancos de
dados públicos (UniGene, dbEST, Swiss-Prot, GeneMap99, RHdb, GeneCards e
LocusLink) e as disponibilizam de maneira a facilitar a identificação dos genes
diferencialmente expressos.
Material e métodos
52
SAM Plot
-15
-10
-5
0
5
10
15
-15 -10 -5 0 5 10
Ex pe c t e d
Observed
Significant: 104
Median # false significant: 50,24446
Delta 0,47270
Fold Change
Todas as informações citadas acima foram retiradas do trabalho de (TUSHER et
al. 2001), do manual do software SAM e de relatórios técnicos publicados na página de
Robert Tibshirani (http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM
).
4.10.10) Nomenclatura dos genes
Em função da dificuldade de se traduzir corretamente para o português o
nome de todos os genes citados neste trabalho, optou-se por utilizar o nome dos genes
em inglês, com a mesma grafia utilizada no arquivo do banco de dados da biblioteca
IMAGE.
Figura 13. Comparação entre a distância relativa observada d(i) e esperada dE(i).
GENES REPRIMIDOS
GENES INDUZIDOS
Material e métodos
53
4.11) Análise da expressão gênica promíscua no timo
Os agrupamentos gênicos gerados durante o processamento dos dados no
programa TIGR MEV foram analisados em termos de Expressão Gênica Promíscua
(PGE) para avaliar a representatividade dos órgãos e sistemas. A análise foi feita
utilizando o banco de dados GNF SymAtlas (http://symatlas.gnf.org/SymAtlas/) que
permite a visualização da expressividade de cada gene em um gráfico de barras
paralelas que apresenta 60 tecidos, que representam por sua vez 17 sistemas do
organismo. Visando a homogeneização dos dados optou-se por considerar como
tecidos representados por um determinado gene, apenas aqueles tecidos que obtiveram
expressividade superior à linha da mediana que se encontra presente em cada gráfico.
Após a organização dos dados em sistemas, gerou-se uma planilha contendo o número
de genes que caracterizavam cada sistema em particular e, posteriormente, gerou-se um
gráfico que passou a demonstrar a representatividade de cada sistema nos agrupamentos
definidos. Procurou-se ainda destacar a representatividade dos genes no sistema
locomotor em relação aos demais sistemas e ressaltar os genes que codificadores de
proteínas encontradas na matriz extracelular, condição de maior importância frente a
doença estudada.
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Delineamento experimental
55
5) Delineamento Experimental
5.1) Cultura, extração de RNA e utilização de RNAi anti-Aire
RT PCR
Aire
DBA-1/J e DBA-2/J
Timo
Células TEC
RNA Total
Sondas de cDNA
Hibridações com Microarrays
Análise dos dados
ATOC + RNAi anti-
Aire
DBA-2/J
RESULTADOS
Resultados
57
6) Resultados
6.1) Avaliação da integridade das amostras de RNA
As amostras de RNA total obtidas do estroma tímico, recém removidos e ATOC,
depletado de timócitos dos animais DBA-1/J e DBA-2/J, foram analisadas em relação à
sua integridade por eletroforese em gel de agarose desnaturante 1,5% (Figura 14). É
possível observar os rRNA 28S e 18S na proporção próxima de 2:1, comprovando,
assim, a integridade e a qualidade da preparação. Este é controle de qualidade
obrigatório e adotado para avaliar todas as preparações utilizadas neste trabalho.
Figura 14. Integridade das amostras de RNA. Eletroforese em gel de agarose sob
condições denaturantes 1,5% das preparações de RNA total (2µg) provenientes de
estroma tímico depletado de timócitos.
28S
18S
Resultados
58
6.2) Avaliação da expressão do gene Aire e de TRAs no estroma
tímico
Após a obtenção de cDNA provenientes das amostras de estroma tímico
dos animais de ambas as linhagens, foram realizados experimentos de PCR para
avaliação do gene Aire, cujo RNAm foi alvo do tratamento utilizando-se a
técnica de RNA interfente; o gene CD3e para verificação da contaminação de
timócitos nas amostras; o gene do pró-colágeno II, que codifica proteína
colágeno do tipo II apresentada como principal alvo da ação de linfócitos T na
periferia; e presença de alguns genes já descritos na literatura como TRAs,
entre eles: Ins-1, Ins-2 e Gad67, além do controle, que neste trabalho
corresponde ao gene da β-actina (Figura 15).
Β-actinaCD3e
Aire
Ins-1 Ins-2
Gad67
A
B
C
D
E
Pró-colágenoII
Figura 15. Avaliação da expressão dos genes: CD3e, β-actina, Aire, Ins-1, Ins-2, Gad67 e Pró-
colágeno II no estroma tímico. a) Estroma de DBA-1/J falso-imunizados; b) Estroma de DBA-
1/J imunizados; c) Estroma de DBA-2/J falso-imunizados; d) Estroma de DBA-2/J imunizados;
e) Timócitos (Resultado típico)
Resultados
59
6.3) Avaliação da viabilidade de ATOC
Para o ensaio de apoptose e necrose, com o objetivo de analisar a viabilidade da
técnica de ATOC nos animais da linhagem DBA-2/J foram realizados ensaios de
anexina V e PI. Os resultados foram obtidos por citometria de fluxo, nos tempos: 0, 6,
12, e 24 horas (Figura 16).
O tempo ideal para incorporação dos complexos pelas células e ação do RNAi
anti-Aire é de 24 a 48 horas. Entretanto, como pode ser observado na figura 16, já com
6 horas de cultura apenas 25% das células eram viáveis, e esses valores reduziram-se
drasticamente, atingindo 13% de viabilidade no tempo mínimo de ação do RNAi anti-
Aire, ou seja, 24 horas. As células epiteliais tímicas (TECs) são caracterizadas por uma
forte aderência entre elas, e delas com os timócitos. Assim fomos verificar a
possibilidade desta aderência estar prejudicando a entrada de nutrientes, levando grande
parte das células a morte. Para isto, o timo foi fragmentado, método já descrito por
Whalen et al (1999). Observando novamente a figura 16, é nítida a diferença de
viabilidade das células quando se compara os dados, pois as culturas de 6 e 12 horas dos
timos fragmentados, ainda mantêm valores muito próximos a 0 hora, caindo entretanto,
novamente de forma drástica após 24 horas de cultura. Apesar do tempo ideal para a
ação do RNAi anti-Aire de 24-48 horas, o tratamento foi realizado com 12 horas de
cultura, já que assim, o timo ainda apresentava cerca de 50% de viabilidade. Os
resultados foram avaliados por PCR.
Resultados
60
Figura 16. Autofluorescência das células de timo total, intacto e fragmentado, da linhagem
DBA-2/J, e marcação de Anexina V para ensaio de apoptose, e PI para necrose, nos tempos
de: 0, 6, 12, e 24 horas.
Resultados
61
6.4) Determinação da seqüência e concentração de RNAi anti-Aire para
ensaio em ATOC
Para realização dos ensaios de RNAi anti-Aire e determinação da seqüência que
melhor promoveu o silenciamento deste gene, utilizou-se uma linhagem de células
mTECs, de camundongo C57BL/6, o que possibilitou a escolha da seqüência de forma
rápida e eficiente. Como observado nas figura 17, utilizou-se as concentrações de 2.5, 5
e 10nM, recomendada pelo kit para ensaio em cultura, sendo possível determinar a
seqüência 1 como aquela que obteve o maior grau de silenciamento do gene Aire, e,
portanto escolhida para os passos posteriores.
Resultados
62
Figura 17. Eletroforese em gel de agarose de produtos de RT-PCR semiquantitativa para a
detecção do transcrito do gene Aire. PCRs realizadas com as seguintes amostras: mTEC na
ausência de RNA interferente e mTEC em presença das três diferentes seqüências de RNAi
anti-Aire, cada uma em três concentrações (2.5, 5.0 e 10.0 nM). * RNAi e concentração
escolhidos para a continuação dos experimentos. B = Controle negativo
Figura 18. Seqüência 1 do RNAi anti-Aire, utilizada nos experimentos de inibição do transcrito
do gene Aire em timos de camundongos DBA-2/J em cultura ATOC.
Resultados
63
Uma vez definida a melhor seqüência (Figura 18), determinou-se a concentração
ideal de RNAi anti-Aire para o silenciamento no timo.
Com a utilização de uma seqüência marcada com o fluorescente Cy3, os timos
de animais da linhagem DBA-2/J, foram congelados e posteriormente cortados com o
auxílio de um criostato, com espessura de 20µM, medida mínima na qual era possível se
evitar a ruptura tecidual e conseqüentemente das camadas celulares. Os cortes, feitos no
escuro para não prejudicar a marcação, foram depositados em lâminas de vidro para
posterior análise em microscopia confocal. A utilização desta técnica permitiu a
realização de cortes virtuais, facilitando a visualização da entrada do corante em
camadas únicas de células. Após observação dos resultados (Figura 19) determinou-se a
concentração de 50mM como ótima para os ensaios de RNAi anti-Aire em timo.
Resultados
64
Figura 19. Microscopia confocal. Microdissecção virtual de timo total de animais da
linhagem DBA-2/J, incorporados com RNAi anti-Aire marcado com Cy3, nas concentrações
de 10, 50, e 100nM.
Resultados
65
6.5) Análise do silenciamento do gene Aire pela técnica de RNAi
Para os ensaios de tratamento de timo de camundongos da linhagem DBA-2/J
com RNA interferente (RNAi) anti-Aire, os seguintes grupos de ATOC foram
utilizados: Meio de cultura MEM filtrado, MEM + Lipofectamina, MEM + controle
positivo, MEM + controle negativo, e MEM + RNAi anti-Aire. Os ATOCs foram
mantidos por 12 horas em estufa com CO
2
e umidade adequados. Posteriormente
realizou-se a extração de RNA total do estroma tímico de cada um dos grupos para
análise do silenciamento do gene AIRE por PCR (Figura 20).
Para visualização do silenciamento foram realizadas diluições seriadas de
cDNA, de 1:1 a 1:256. A partir da diluição de 1:256, é possível observar que os
respectivos controles ainda mantém a expressão do RNA mensageiro referente ao gene
AIRE, porém, na amostra tratada com RNAi sua expressão do gene Aire não foi mais
detectada (Figura 20). Partindo deste dado, foi considerado um silenciamento parcial, e
deu-se seqüência a análise do fenômeno de PGE utilizando-se a tecnologia dos
microarrays.
Figura 20. Avaliação da expressão do gene Aire em amostras de estroma tímico de ATOC
12 horas, de animais de DBA-2/J, na concentração de 50nM. O controle negativo
corresponde a um RNAi anti-Aire irrelevante, e o controle positivo é referente ao gene
HPRT.
Resultados
66
6.6) Marcação com sonda fluorescente e obtenção de imagens
Os microarrays foram preparados através da deposição na lâmina de vidro dos
produtos de PCR purificados, através do sistema robotizado Array Spotter Generation
III – Amersham Molecular Dynamics. O “design” do microarray foi baseado em spots
com diâmetro de 250µm e distância entre eles de 30µm. O Spotter Generation III pode
depositar até 4608 clones (em duplicata) em uma lâmina, que correspondem a 12 placas
de 384 clones. As condições de marcação estão todas completamente padronizadas em
nosso laboratório, e assim foram realizados todos os experimentos com as amostras
biológicas de estroma tímico de ambas as linhagens (DBA-1/J e DBA-2/J), e ATOC de
timos tratados com RNAi anti-Aire dos animais DBA-2/J. É importante ressaltar que foi
utilizado o pool de RNA de referência nas marcações, As imagens obtidas (Figura 21)
foram posteriormente analisadas.
Resultados
67
Figura 21. Imagem típica de cDNA microarray deste projeto, contendo 9000 pontos (4500
seqüências em duplicata) preparado em uma lâmina de vidro espelhada (Amersham tipo 7).
Hibridações com sondas fluorescentes (verde Cy3 = amostra e vermelha Cy5 = pool de
referência).
Resultados
68
6.7) Análise dos genes diferencialmente expressos por agrupamento
hierárquico, e da significância estatística do padrão de expressão
Os 4500 valores numéricos quantitativos já normalizados, representando o
conjunto de genes analisados, de cada uma das variáveis foram analisados pelo
programa de agrupamento hierárquico Cluster & TreeView. Como este programa só
analisa os valores que aparecem em, pelo menos, 80% dos experimentos, ocorre uma
redução no número de seqüências analisadas. Assim, para comparação entre os animais
das linhagens DBA-1/J e DBA-2/J foram obtidos dados de expressão de 160 seqüências
(Figura 22), e 27 seqüências entre o controle e o tratamento com RNAi anti-Aire em
timo de animais da linhagem DBA-2/J (Figura 23).
Os mesmos 4500 valores numéricos foram analisados pelo programa SAM
multiclass. Este tipo de análise nos permitiu apontar seqüências diferencialmente
expressas segundo um valor de exclusão, a partir do qual os genes são considerados
induzidos. Além disso, o programa SAM fornece o FDR, bem como o q value para cada
seqüência, o que nos orienta na escolha se seqüências com valores de expressão com
alta significância estatística (tabela 2 e 3 - Anexo I).
Resultados
69
Figura 22. Comparação dos perfis de expressão gênica entre os animais das linhagens DBA-1/J
e DBA-2/J. Matriz de expressão de 160 seqüências gênicas de estroma tímico, de animais
controles e testes de ambas as linhagens. A correlação de Pearson foi utilizada como medida de
similaridade. O vermelho indica indução da expressão, o verde repressão, e o preto ausência de
modulação. Cores mais claras representam maior intensidade na alteração da expressão. O cinza
indica ausência de valores.
Resultados
70
Figura 23. Comparação dos perfis de expressão gênica de ATOC tratada e não-tratada com
RNAi anti-Aire em animais da linhagem DBA-2/J. Matriz de expressão de 27 seqüências
gênicas de estroma tímico, de timos tratados e não-tratados com RNAi anti-Aire. A correlação
de Pearson foi utilizada como medida de similaridade. O vermelho indica indução da expressão,
o verde repressão, e o preto ausência de modulação. Cores mais claras representam maior
intensidade na alteração da expressão. O cinza indica ausência de valores.
Resultados
71
6.8) Determinação da expressão gênica promíscua (PGE) no Timo
A PGE foi analisada a partir dos genes diferencialmente expressos obtidos pelo
programa SAM e por agrupamento hierárquico dos animais de ambas as linhagens
(DBA-1/J e DBA-2/J), e de ATOC de animais DBA-2/J após tratamento com o RNAi
anti-Aire, por um programa denominado Symatlas. Esse programa tem como função
fornecer a expressão de um determinado gene em cerca de 60 tecidos diferentes, como
pode ser observado na Figura 24. Após a realização da análise de cada gene, foram
gerados gráficos que mostram as porcentagens referentes a representação de 18 sistemas
diferentes no timo de acordo com os clusters que caracteriza cada uma das linhagens, e
aquele que caracteriza a ação do tratamento com RNAi anti-Aire (Figuras 25 e 26).
Resultados
72
Figura 24. Gráfico ilustrativo gerado pelo banco de dados do Symatlas
(http://symatlas.gnf.org/SymAtlas
) mostrando a representação tecidual do gene Casp8, com os
nomes de cada tecido e/ou órgão.
Resultados
73
Figura 25. Representação da expressão gênica específica de tecidos e órgãos em timo de
camundongo DBA. Os genes significativamente induzidos dos 4500 analisados foram anotados
caracterizando a expressão promíscua, representando os antígenos tecido-relacionados ao timo.
A: Genes induzidos no estroma tímico de animais da linhagem DBA-1/J. B: Genes induzidos no
estroma tímico de animais da linhagem DBA-2/J.
A
B
Resultados
74
Figura 26. Representação da expressão gênica específica de tecidos e órgãos em timo de
camundongo DBA-2/J, durante o tratamento com RNAi anti-Aire. Os genes significativamente
induzidos dos 4500 analisados foram anotados caracterizando a expressão promíscua,
representando os antígenos tecido-relacionados ao timo.
DISCUSSÃO
Discussão
76
7) Discussão
7.1) Expressão de TRAs no estroma timo
O timo é um órgão complexo formado pelo estroma, o qual é dividido em
medula e córtex formados respectivamente pelas células epiteliais medulares (mTEC) e
epiteliais corticais (cTEC). Além destas, outros tipos celulares são ali encontrados
formando o microambiente tímico, que são as células dendríticas, os macrófagos, os
fibroblastos e as células endoteliais (VAN EWIJK et al, 1991 e GRAY et al, 2002).
Durante a fase em que o timo se encontra em plena atividade, ou seja, do nascimento a
puberdade, contribuindo com o repertório de células T, a proporção entre os timócitos e
estroma é alta (GRAY et al, 2006). Com o avanço da idade, este órgão passa por um
processo natural de involução, e esta proporção se altera.
Portanto, para o estudo da expressão gênica promíscua, propriedade do estroma
tímico (células TEC) que compõe o estroma, nos atentamos para este fenômeno e
estudou-se somente animais adultos jovens.
Entretanto, foi necessário aplicar um método de separação do estroma tímico. O
procedimento escolhido foi baseado no trabalho de GRAY, et al (2002), no qual o timo
é fragmentado e passa por um processo de agitação em meio de cultura celular
possibilitando a remoção dos timócitos da “malha” do estroma para o meio.
Como, infelizmente, este processo não é de todo eficiente, devido à alta
aderência do estroma com os timócitos, realizamos um monitoramento da presença
destas últimas em nossas preparações de estroma. Utilizamos para isto a detecção do
RNAm do receptor CD3e que é específico de linfócitos T por PCR.
Reconhece-se que a técnica utilizada para o estudo do estroma tímico não foi de
todo eficiente, devido a detecção de RNAm do gene CD3e nas amostras utilizadas,
comprovando assim a presença de linfócitos T (Figura 15); e que a obtenção de uma
amostra pura utilizando-se marcadores celulares específicos seria ideal. Entretanto, as
amostras apresentaram uma depleção de timócitos, já que muitos deles foram
encontrados no meio de cultura. Além disso, os genes são analisados utilizando-se uma
Discussão
77
ferramenta que possibilita a identificação da expressão de cada gene em diferentes
órgãos e tecidos, entre eles os linfócitos T e B. Assim, essa técnica permitiu a detecção
daqueles genes que estariam sendo expressos pelos linfócitos T no timo, e foi dada
continuidade ao estudo de expressão gênica promíscua (PGE).
O fenômeno da PGE, descrito como a capacidade das TECs de expressar
antígenos ectópicos vem sendo amplamente estudada, e grande parte desses antígenos
parecem estar sob a influência de um fator transcricional denominado Aire (do inglês
autoimmune regulator). A expressão deste gene foi observada em órgãos linfóides,
especialmente o timo, e em grande parte nas células epiteliais tímicas (TECs), fato este
que relacionou sua função ao fenômeno de PGE (ANDERSON et al, 2002 e 2005).
Portanto, a descrição da expressão do gene Aire em nossas amostras de estroma
tímico, tanto de animais controle como dos imunizados, representou uma base para
considerarmos que o fenômeno da PGE nas linhagens de camundongos estudadas
poderia estar sob o controle deste gene (Figura 15).
Entretanto, nem todos os antígenos expressos pelo timo estão sob controle do
gene Aire como por exemplo a proteína C-reativa e ácido glutâmico descarboxilase de
67kDa (Gad67) (DERBINSKI et al, 2005).
Alguns dos antígenos sabidamente considerados TRAs, estão bem descritos na
literatura em linhagens como C57BL/6, Balb-c, e na auto-imune NOD, que desenvolve
diabetes espontaneamente, ou seja, um modelo de auto-imunidade (DERBINSKI et al,
2001). Baseado nos trabalhos de Derbinski verificou-se a presença de alguns desses
antígenos, utilizando-se a técnica de PCR. Os genes de insulina 1 e 2 (Ins-1 e Ins-2) são
descritos como expressos pelas mTECs e controlados pelo gene Aire.
Observando a Figura 15, é possível notar a expressão do gene Ins-2 em todos os
diferentes grupos em estudo, ou seja, tanto nos controles quanto nos imunizados de
animais das linhagens DBA-1/J e DBA-2/J. Isso mostra que a expressão deste gene
parece não ser alterada pelo processo de auto-imunidade em um modelo de AR, nem
pela susceptibilidade a doença. Porém, com relação ao gene Ins-1 foi observado uma
expressão diferenciada, expressando mais nos grupos controle de ambas as linhagens,
quando comparados aos respectivos grupos imunizados. Isto sugere que seu padrão de
expressão está sendo alterado durante o processo de imunização.
Discussão
78
O gene Gad67 codifica um TRA, e é expresso também em mTECs, e apesar de
não estar sob o controle do gene Aire, também mostra uma expressão diferenciada,
expressando mais nos grupos controles de ambas as linhagens, e assim como o gene
Ins-1, sua expressão também está sendo alterada durante o processo de imunização que
leva a indução da AR (Figura 15).
Finalmente, no modelo de artrite induzida por colágeno (CIA), utilizado neste
trabalho, o desenvolvimento de artrite é atribuído grande parte a ação de linfócitos T
auto-reativos contra o colágeno de tipo II, uma proteína abundante nas articulações
(HOLMDAHL et al 1990; WOOLEY et al 1981; SEKI et al 1988).
Da mesma maneira como procedido para os auto antígenos acima mencionados,
investigamos a expressão do pró-colágeno II no estroma tímico, já que o colágeno II é
reconhecido como principal alvo das reações auto-imunes na AR. Como neste trabalho
tenta-se discutir o modelo de CIA no contexto da expressão promíscua de auto-
antígenos no timo, o resultado apresentado na Figura 15 passou a ser de especial
interesse. Na linhagem DBA-1/J que é susceptível a indução de AR, detectou-se
redução na expressão de RNAm de pró-colágeno II quando estes animais foram
imunizados. Já na linhagem DBA-2/J, refratária a AR, a expressão deste RNAm
continuou mesmo nos animais imunizados. Este resultado pode ser visualizado a partir a
diluição 1:4 da reação de PCR.
Consegue-se explicar este resultado no contexto da PGE: a redução da expressão
de RNAm de colágeno II no timo dos animais DBA-1/J imunizados poderá implicar na
redução da seleção negativa de linfócitos auto-reativos contra o colágeno II
possibilitando assim a reação auto-imune na periferia. Como na linhagem DBA-2/J a
expressão deste RNAm foi mantida tanto nos controles como nos imunizados, presume-
se que tenha havido seleção negativa dos ditos linfócitos auto-reativos, explicando
assim a refração desta linhagem a indução de AR.
Salienta-se que o fenômeno da PGE é avaliado a nível de transcrição de RNAm.
Reconhecemos que a comprovação da expressão do respectivo polipeptídeo na
superfície das células TEC muito enriqueceria este achado.
Discussão
79
7.2) Avaliação do silenciamento do gene Aire
A utilização de RNA interferente (RNAi) na pesquisa tem sido amplamente
difundida, pois a possibilidade de “silenciar” a expressão de genes pode levar a
aplicações na pesquisa básica como no seu uso (CHEN et al, 2003; STRILLACCI et al,
2006).
Neste trabalho, esta tecnologia foi útil para o estudo de um gene de grande
importância para o fenômeno de PGE, o gene Aire. Este gene, quando mutado é
responsável por uma rara síndrome humana, de caráter monogênico, a APS-1, em cuja
manifestação há doença auto- imune (FINNIISH-GERMAN 1997; NAGAMINE et al,
1997). Com a descoberta de que o gene AIRE é o responsável por esta síndrome, houve
muito interesse em saber seu papel no controle da PGE e conseqüentemente na
tolerância imunológica. A associação deste gene com o fenômeno da PGE surgiu após a
detecção de sua expressão nas mTECs, as quais expressam TRAs no timo.
Evidências obtidas com camundongo Aire knockout demonstraram que o gene
Aire é um fator transcricional, responsável pela regulação da expressão de grande parte
destes antígenos ectópicos, sendo, portanto de grande importância para os processos de
seleção de linfócitos T no timo (ZUKLYS et al, 2000; ANDERSON et al, 2002).
Inicialmente ensaiamos o silenciamento do gene Aire utilizando células mTEC
de C57Bl/6 em cultura (figuras 17) para depois passarmos para os testes com os timos
intactos de DBA-2/J em ATOC.
A seqüência de RNAi anti Aire utilizada neste trabalho (Figura 19) silenciou
parcialmente o gene em questão (figura 20). Entretanto, este silenciamento parcial foi
suficiente para desregular alguns genes que codificam possíveis TRAs no timo. O grupo
de genes discutidos mostra claramente um padrão de repressão no estroma tímico de
DBA-2/J tratado com RNAi anti-AIRE quando comparados ao controle (Figura 23).
Como abordado anteriormente, o significado do controle do gene Aire no timo
foi observado em estudos com animais Aire-knockout. A ausência deste gene promove o
aparecimento de auto-anticorpos, especialmente contra antígenos de olho e de estômago
(DEVOSS et al 2006; GAVANESCU et al 2007), sendo suficiente para causar auto-
imunidade.
Discussão
80
Os dados encontrados no presente trabalho corroboram com os autores supra
citados, pois o estroma tímico de DBA-2/J tratado com RNAi anti-Aire passou a
expressar menor número de genes associados a olho e sistema digestório, incluindo
estômago e, conseqüentemente, diminuindo a representação antigênica destes
órgãos.Quanto a representação de antígenos associados ao sistema locomotor, também
houve redução a níveis comparados com a linhagem DBA-1/J (Figura 26).
7.3) Expressão Gênica Promíscua do Timo
Os experimentos realizados em escala genômica objetivam avaliar os processos
biológicos como um todo, mas com precisão molecular. Usando a tecnologia dos cDNA
microarrays, a expressão dos mRNAs de milhares de genes pode ser mensurada
simultaneamente. O uso da bioinformática na análise da expressão gênica revela uma
profunda lógica molecular e biológica no entendimento da ativação e diferenciação
celulares. Genes que codificam componentes de um mesmo complexo multi-protéico
estão sob regulação coordenada. Esta regulação coordenada é também observada entre
genes que apresentam seus produtos funcionais participando de um mesmo processo
biológico (STAUDT & BROWN, 2000).
A tolerância ao próprio do repertório de células T é adquirido pela interação de
seus receptores aos peptídeos ligados ao MHC, por isso a diversidade de antígenos
expressos no timo é de grande importância.
A expressão de antígenos ectópicos no timo é chamada de expressão gênica
promíscua, sendo uma propriedade fisiológica característica principalmente das
chamadas mTECs, e parece ser a base da indução do processo de tolerância (KYEWSKI
et al, 2002). Assim abriram-se perspectivas para se determinar a modulação e a extensão
da PGE em duas diferentes linhagens de camundongo, a DBA-1/J que se mostra
susceptível à indução de AR, e a DBA-2/J, que ao contrário se mostra resistente a
doença, avaliando se essa susceptibilidade/resistência tem como base o fenômeno da
PGE.
A expressão gênica promíscua é identificada atualmente pela análise de dados de
microarray dos diferentes genes órgão-específicos representados no timo de
camundongo, usando informação combinada do banco de dados público GNF Gene
Discussão
81
Expression Atlas (http://symatlas.gnf.org/SymAtlas) (SU et al, 2004). Este banco de
dados mostra a expressão gênica de mais 60 tecidos/órgão do camundongo avaliada
com microarrays da Affymetrix (http://www.affymetrix.com) (Figura 24). A
informação dos dados inclui o acesso ao GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/), a localização cromossômica e a função
molecular/biológica de cada gene analisado.
No presente trabalho, consideraram-se somente os genes promíscuos cuja
expressão foi significativamente induzida no timo (como indicado pelo algoritmo do
programa SAM) e detectada em órgãos ou tecidos diferentes, além do timo, e cujos
níveis de expressão forma maiores que a expressão média com relação a todos os órgãos
restantes que aparecem no Atlas GNF. A extensão da representação do próprio inclui a
maioria, senão todos os tecidos e órgãos parenquimais, representando um fenômeno
complexo e envolve 5-10% de todos os genes conhecidos de camundongos e humanos.
Os diferentes pools de genes não são complementares, mas sim aditivos, isto é, não
existe associação aparente entre a função molecular/biológica respectiva dos genes nos
órgãos parenquimatosos, o que pôde ser observado em nossos resultados.
Assim, o projeto de microarrays e a estringência estatística usada no programa
SAM, permitiram a observação da manifestação da PGE na indução de auto-imunidade,
aqui representada pela artrite reumatóide, demonstrando diferentes perfis de indução
entre os animais da linhagem susceptível (DBA-1/J), comparados a linhagem resistente
(DBA-2/J). Além disso, as duas linhagens foram agrupadas separadamente no programa
Cluster & TreeView, e em conjunto esses dados já inferem claramente que a
susceptibilidade/resistência a doença tem como base eventos moleculares ocorridos no
timo ( Figura 22).
A artrite reumatóide é uma doença severa, cujas manifestações clínicas ocorrem
predominantemente nas articulações. É caracterizada por hiperplasia, angiogênese,
infiltrados mono e polinucleares, além de anquilose e intensa resposta inflamatória na
sinóvia, responsável por uma destruição da cartilagem e óssea irreversíveis, causando
muita dor, e levando a disfunção (LIPPINCOTT & WILKING, 1999). Partindo destas
informações realizou-se um estudo mais refinado da PGE no modelo de AR.
Como a doença atinge primaria e preferencialmente as articulações, foi-se
averiguar os genes cuja expressão foi detectada no sistema locomotor. A representação
Discussão
82
destes genes encontrados no estroma tímico de camundongos DBA-1/J, é menor quando
comparada a linhagem DBA-2/J. Além disso, dentro deste sistema, foram selecionados
os genes que codificam para proteínas localizadas na matriz extracelular, local de
ocorrência de muitos dos eventos característicos da doença.
Genes identificados como codificadores de TRAs do sistema locomotor no timo de
DBA-1/J.
Dentre os genes induzidos no estroma tímico da linhagem DBA-1/J (cluster
indicado pela barra em roxo, figura 22), os quais codificam proteínas encontradas na
matriz extracelular, foi possível destacar dois genes; o TNF-alpha (Tumor necrosis
factor), que codifica uma citocina pró-inflamatória, e o Tgfb-1 (Transforming growth
factor, beta 1), que codifica uma citocina anti-inflamatória. Em termos de
representação antigênica de órgãos e tecidos no timo, ambos foram associados ao
sistema locomotor.
Genes identificados como codificadores de TRAs do sistema locomotor no timo de
DBA-2/J.
Na linhagem DBA-2/J, resistente a indução de AR, encontrou-se maior número
de genes que codificam proteínas encontradas na matrix extracelular (cluster indicado
pela barra azul, figura 22). Os genes observados incluem o C3 (Complement
component 3), que codifica uma proteína central do sistema do complemento; o gene
Hcst (Hematopoietic cell signal transducer), que por sua vez, codifica uma proteína
chamada DAP10, classificada como uma molécula transmembrana adaptadora; o gene
Tnfrsf13b (Tumor necrosis factor receptor superfamily, member 13b) que codifica
uma proteína estimuladora de linfócitos B, membro da superfamília do TNF, chamada
BLyS; o gene Sdf2 (Stromal cell derived factor 2) codifica uma proteína secretora de
linhagens de células estromais de camundongo; e o gene Lamp1 (Lysosomal-
associated membrane protein 1), que codifica uma proteína lisossomal associada a
membrana.
Embora tenha sido mencionado as proteínas codificadas por cada um desses
genes de TRAs, é importante ressaltar que no presente trabalho não é focado suas
Discussão
83
respectivas funções biológicas e/ou moleculares, mas sim sua representação antigênica
no timo.
No contexto deste trabalho, os antígenos do sistema locomotor receberam maior
atenção por razões óbvias. Observou-se que no estroma tímico da linhagem DBA-1/J
houve expressão de menor número desses antígenos comparado com a linhagem DBA-
2/J. Levando em conta que a primeira linhagem é sensível a indução de AR, este achado
sugere que a menor diversidade de TRAs de sistema locomotor no timo poderá atenuar
a seleção negativa de linfócitos T auto-reativos, contribuindo assim com o processo de
auto-imunidade (Figura 25).
Além disso, a observação de que o RNAm de pró-colágeno II tem sua
transcrição diminuída no estroma tímico de animais DBA-1/J submetidos ao esquema
de imunização, reforçou ainda mais a sugestão apresentada (Figura 15).
Os resultados deste trabalho são importantes para um melhor entendimento dos
processos genético-moleculares que ocorrem no estroma tímico importantes para a
indução de tolerância imunológica central e em particular para o sistema-modelo de
indução de artrite reumatóide.
CONCLUSÕES
Conclusões
85
8) Conclusões
¾ Camundongos DBA-1/J e DBA-2/J apresentam diferenças no repertório de
genes de TRAs expressos no estroma tímico e, portanto, diferindo em seus
respectivos padrões de PGE.
¾ As diferenças encontradas envolvem expressão de genes de antígenos do sistema
locomotor.
¾ A expressão de RNAm de pró-colágeno II, principal antígeno alvo na AR, no
estroma tímico foi reduzida nos animais DBA-1/J imunizados.
¾ O gene Aire controla um conjunto de genes de TRAs incluindo aqueles
associados ao sistema locomotor, olho e sistema digestório, incluindo estômago.
REFERÊNCIAS
Referências
87
9) Referências
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1976–1983.
ANEXO I
Tabela 2. Genes diferencialmente expressos (160) e com significância estatística de acordo com
o programa SAM (FDR = 0,05 e delta = 0,162) em amostra de estroma tímico comparando as
linhagens DBA-1/J e DBA-2/J.
CloneID Símbolo dos genes Nomes dos genes
IMAGE:582859 Smarcd2 SWI/SNF related, matrix
associated, actin dependent
regulator of chromatin,
subfamily d, member 2
IMAGE:640659 Srpk2 Serine/arginine-rich protein
specific kinase 2
IMAGE:640027 Data not found
IMAGE:2645608 Il6 Interleukin 6
IMAGE:639922 Birc6 Baculoviral IAP repeat-
containing 6
IMAGE:582879 Data not found
IMAGE:583528 Ccdc98 Coiled-coil domain
containing 98
IMAGE:583529 Data not found
IMAGE:576828 Ccl6 Chemokine (C-C motif)
ligand 6
IMAGE:638872 Wdr26 WD repeat domain 26
IMAGE:641098 Data not found
IMAGE:640110 In multiple clusters
IMAGE:583825 Data not found
IMAGE:640282 Bcap31 B-cell receptor-associated
protein 31
IMAGE:574533 Cutl1 Cut-like 1 (Drosophila)
IMAGE:573667 H2-K1 Histocompatibility 2, K1, K
region
IMAGE:640898 Sfrs1 Splicing factor,
arginine/serine-rich 1
(ASF/SF2)
IMAGE:5181343 CD80 CD80 molecule
IMAGE:582991 Sh3gl1 SH3-domain GRB2-like 1
IMAGE:583202 Zcchc6 Zinc finger, CCHC domain
containing 6
IMAGE:583131 Sfrs5 Splicing factor,
arginine/serine-rich 5
(SRp40, HRS)
IMAGE:573651 Def6 Differentially expressed in
FDCP 6
IMAGE:582824 Rgs10 Regulator of G-protein
signalling 10
IMAGE:583178 Mpp1 Membrane protein,
palmitoylated
IMAGE:574707 Lamp1 Lysosomal membrane
glycoprotein 1
IMAGE:583716 Mis12 MIS12 homolog (yeast)
IMAGE:582250 Data not found
IMAGE:575047 Sugt1 SGT1, suppressor of G2
allele of SKP1 (S. cerevisiae)
IMAGE:1328063 Il18 Interleukin 18
IMAGE:574088 Ifit2 Interferon-induced protein
with tetratricopeptide repeats
2
IMAGE:1327907 Zwint ZW10 interactor
IMAGE:5766881 IL18 Interleukin 18 (interferon-
gamma-inducing factor)
IMAGE:260035 IRF5 Interferon regulatory factor 5
IMAGE:574153 Data not found
IMAGE:639852 Bsg Basigin
IMAGE:576409 Nkx6-2 NK6 transcription factor
related, locus 2 (Drosophila)
IMAGE:575123 Rps20 Ribosomal protein S20
IMAGE:576731 Dedd Death effector domain-
containing
IMAGE:640580 Arl1 ADP-ribosylation factor-like
1
IMAGE:640263 In multiple clusters
IMAGE:1282235 Hivep2 Human immunodeficiency
virus type I enhancer binding
protein 2
IMAGE:576539 Mapk8ip3 Mitogen-activated protein
kinase 8 interacting protein 3
IMAGE:575266 Data not found
IMAGE:574422 Ly6a Lymphocyte antigen 6
complex, locus A
IMAGE:582931 Arntl Aryl hydrocarbon receptor
nuclear translocator-like
IMAGE:582917 C3 Complement component 3
IMAGE:576164 Slc12a6 Solute carrier family 12,
member 6
IMAGE:582778 Tnpo2 Transportin 2 (importin 3,
karyopherin beta 2b)
IMAGE:640698 Prkd2 Protein kinase D2
IMAGE:574837 Hcst Hematopoietic cell signal
transducer
IMAGE:573632 Btg2 B-cell translocation gene 2,
anti-proliferative
IMAGE:576262 Fmnl3 Formin-like 3
IMAGE:573640 Data not found
IMAGE:573637 Sdf2 Stromal cell derived factor 2
IMAGE:583592 Rgs1 Regulator of G-protein
signaling 1
IMAGE:574381 Unc84b Unc-84 homolog B (C.
elegans)
IMAGE:641072 Hspa14 Heat shock protein 14
IMAGE:575392 Ebag9 Estrogen receptor-binding
fragment-associated gene 9
IMAGE:582268 A630038E17Rik RIKEN cDNA A630038E17
gene
IMAGE:576085 Data not found
IMAGE:576679 Itk IL2-inducible T-cell kinase
IMAGE:573863 Ifngr2 Interferon gamma receptor 2
IMAGE:583468 Transcribed locus
IMAGE:574058 Data not found
IMAGE:576040 Cope Coatomer protein complex,
subunit epsilon
IMAGE:576252 Bat2d BAT2 domain containing 1
IMAGE:575468 Tnfrsf13b Tumor necrosis factor
receptor superfamily, member
13b
IMAGE:576236 4930427A07Rik RIKEN cDNA 4930427A07
gene
IMAGE:574316 Data not found
IMAGE:575230 Mark2 MAP/microtubule affinity-
regulating kinase 2
IMAGE:575300 Ccnd3 Cyclin D3
IMAGE:575732 Tpr Translocated promoter region
IMAGE:583471 Tspan3 Tetraspanin 3
IMAGE:640882 Trmt5 TRM5 tRNA
methyltransferase 5 homolog
(S. cerevisiae)
IMAGE:575796 Anapc2 Anaphase promoting complex
subunit 2
IMAGE:575958 Data not found
IMAGE:574375 Map2k1ip1 Mitogen-activated protein
kinase kinase 1 interacting
protein 1
IMAGE:30850 Rasa2 RAS p21 protein activator 2
IMAGE:575276 MMP17 Matrix metallopeptidase 17
(membrane-inserted)
IMAGE:577716 AI316807 Expressed sequence
AI316807
IMAGE:583712 Neil1 Nei endonuclease VIII-like 1
(E. coli)
IMAGE:582369 Jmjd3 Jumonji domain containing 3
IMAGE:582449 Irgm Immunity-related GTPase
family, M
IMAGE:582517 Cd69 CD69 antigen
IMAGE:581748 Mecp2 Methyl CpG binding protein
2
IMAGE:1263539 2610318N02Rik
RIKEN cDNA 2610318N02
gene
IMAGE:5213134 TNF
Tumor necrosis factor (TNF
superfamily, member 2)
IMAGE:639913 Data not found
IMAGE:5228776 CASP8
Caspase 8, apoptosis-related
cysteine peptidase
IMAGE:639854 D930015E06Rik
RIKEN cDNA D930015E06
gene
IMAGE:640959 Gramd1a
GRAM domain containing
1A
IMAGE:576194 Data not found
IMAGE:640924 Data not found
IMAGE:582815 Wasl
Wiskott-Aldrich syndrome-
like (human)
IMAGE:640743 Zfp496 Zinc finger protein 496
IMAGE:640501 Prss16 Protease, serine, 16 (thymus)
IMAGE:640309 Data not found
IMAGE:640212 In multiple clusters
IMAGE:640817 Data not found
IMAGE:640588 Data not found
IMAGE:641099 Data not found
IMAGE:640264 Data not found
IMAGE:640540 Data not found
IMAGE:583544 Data not found
IMAGE:640429 Data not found
IMAGE:639710 Data not found
IMAGE:583054 Data not found
IMAGE:573414 Hrbl
HIV-1 Rev binding protein-
like
IMAGE:640958 Rab14
RAB14, member RAS
oncogene family
IMAGE:640936 Hnrpdl
Heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein D-like
IMAGE:576815 Xcl1 Chemokine (C motif) ligand 1
IMAGE:640957 Data not found
IMAGE:640633 Data not found
IMAGE:640354 2310057D15Rik RIKEN cDNA 2310057D15
gene
IMAGE:640178 Gprk6
G protein-coupled receptor
kinase 6
IMAGE:583464 Data not found
IMAGE:641019 In multiple clusters
IMAGE:640405 Data not found
IMAGE:583462 Data not found
IMAGE:640837 Data not found
IMAGE:640861 Data not found
IMAGE:582950 Fbxl20
F-box and leucine-rich repeat
protein 20
IMAGE:640886 Prkrir
Protein-kinase, interferon-
inducible double stranded
RNA dependent inhibitor,
repressor of (P58 repressor)
IMAGE:640766 Data not found
IMAGE:640611 Stambpl1 Stam binding protein like 1
IMAGE:573147 Tcea3
Transcription elongation
factor A (SII), 3
IMAGE:583743 Rsnl2 Restin-like 2
IMAGE:583838 Glrx5
Glutaredoxin 5 homolog (S.
cerevisiae)
IMAGE:639880 Sri Sorcin
IMAGE:640384 Data not found
IMAGE:641101 Cotl1
Coactosin-like 1
(Dictyostelium)
IMAGE:640964 Brwd1
Bromodomain and WD repeat
domain containing 1
IMAGE:640265 Cflar
CASP8 and FADD-like
apoptosis regulator
IMAGE:640527 Data not found
IMAGE:640119 Transcribed locus
IMAGE:583048 Data not found
IMAGE:640582 Cecr5
Cat eye syndrome
chromosome region,
candidate 5 homolog (human)
IMAGE:583486 Zfr
Zinc finger RNA binding
protein
IMAGE:640660 Data not found
IMAGE:1527793 1700010I14Rik
RIKEN cDNA 1700010I14
gene
IMAGE:1226515 In multiple clusters
IMAGE:640578 Bap1 Brca1 associated protein 1
IMAGE:136821 TGFB1
Transforming growth factor,
beta 1 (Camurati-Engelmann
disease)
IMAGE:0 Data not found
IMAGE:641035 Data not found
IMAGE:641123 Data not found
IMAGE:583901 Mcm10
Minichromosome
maintenance deficient 10 (S.
cerevisiae)
IMAGE:641153 Data not found
IMAGE:573037 2310035C23Rik
RIKEN cDNA 2310035C23
gene
IMAGE:640194 Mll1
Myeloid/lymphoid or mixed-
lineage leukemia 1
IMAGE:640770 Data not found
IMAGE:583218 Data not found
IMAGE:640674 Data not found
IMAGE:1330038 Fbxo46 F-box protein 46
IMAGE:640290 Suhw2
Suppressor of hairy wing
homolog 2 (Drosophila)
IMAGE:640722 Cast Calpastatin
IMAGE:640338 Cdk4 Cyclin-dependent kinase 4
Tabela 3. Genes diferencialmente expressos (26) e com significância estatística de acordo com
o programa SAM (FDR = 0,05 e delta = 0,322) em ATOC de animais da linhagen DBA-2/J,
tratados com RNAi anti-Aire.
CloneID Símbolo dos genes Nomes dos genes
IMAGE:576305 Trim24 Tripartite motif protein 24
IMAGE:641132 Lypla1 Lysophospholipase 1
IMAGE:574250 Mapk1
Mitogen activated protein
kinase 1
IMAGE:575924 Gch1 GTP cyclohydrolase 1
IMAGE:573572 Hnrpa1
Heterogeneous nuclear
ribonucleoprotein A1
IMAGE:583488 Taf12
TAF12 RNA polymerase II,
TATA box binding protein
(TBP)-associated factor
IMAGE:583330 Data not found
IMAGE:576200 Tcf7
Transcription factor 7, T-cell
specific
IMAGE:583295 Data not found
IMAGE:574060 Bcap31
B-cell receptor-associated
protein 31
IMAGE:640025 Ndufa11
NADH dehydrogenase
(ubiquinone) 1 alpha
subcomplex 11
IMAGE:573637 Rgs1
Regulator of G-protein
signaling 1
IMAGE:583741 Data not found
IMAGE:577721 Foxo3a Forkhead box O3a
IMAGE:575254 Data not found
IMAGE:574058 Cope
Coatomer protein complex,
subunit epsilon
IMAGE:639878 Map3k7ip1
Mitogen-activated protein
kinase kinase kinase 7
interacting protein 1
IMAGE:639711 Data not found
IMAGE:640358 Rtn4 Reticulon 4
IMAGE:640278 Zhx1 Zinc fingers and homeoboxes
protein 1
IMAGE:639735 Data not found
IMAGE:640860 Data not found
IMAGE:640305 Data not found
IMAGE:640966 Data not found
IMAGE:639758 Tagap1
T-cell activation GTPase
activating protein 1
IMAGE:640886 Prkrir
Protein-kinase, interferon-
inducible double stranded
RNA dependent inhibitor,
repressor of (P58 repressor)
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