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Estrogênio e progesterona modulam a
expressão da proteína da Na
+
-K
+
-ATPase e
do canal de sódio CNGA-1 em rins de ratas
Jones Bernardes Graceli
Tese de Doutorado em Ciências Fisiológicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
Centro Ciências da Saúde
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, ES 2008
Jones Bernardes Graceli
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2
Estrogênio e progesterona modulam a
expressão da proteína da Na
+
-K
+
-ATPase e
do canal de sódio CNGA-1 em rins de ratas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
Centro Ciências da Saúde
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, ES 2008
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Fisiológicas do
Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Espírito Santo,
para obtenção do Grau de Doutor em
Ciências Fisiológicas.
ORIENTADORA
Prof
a
Dr
a
Margareth Ribeiro Moysés (PPGCF/UFES/ES)
CO-ORIENTADOR
Prof
o
Dr
o
Marcelo Marcos Morales (IBCCF/UFRJ/RJ)
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3
Estrogênio e progesterona modulam a
expressão da proteína da Na
+
-K
+
-ATPase e
do canal de sódio CNGA-1 em rins de ratas
Jones Bernardes Graceli
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Espírito Santo,
para obtenção do Grau de Doutor em Ciências Fisiológicas.
Aprovada em 21 de novembro de 2008, por:
_____________________________________________________________
Prof
a
Dr
a
Margareth Ribeiro Moysés –Orientadora, UFES.
______________________________________________
Prof Dr Marcelo Marcos Morales –Co-orientador, UFRJ.
_______________________________________________
Prof
a
Dr
a
Maria Souza de Oliveira, USP, SP.
______________________________________________
Prof
a
Dr
a
Nazaré Souza Bissoli, UFES
______________________________________________
Prof
a
Dr
a
Gláucia Rodrigues. Abreu, UFES
Coordenador do PPGCF: _____________________________________________________________
Prof. Dr. Luiz Carlos Schenberg
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, ES 2008
4
Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas
Centro de Ciências da Saúde
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória, ES 2008
Dedico este trabalho à minha mãe,
Iracy, e ao meu pai, Jones, pela
confiança, pelo grande incentivo,
pelo exemplo de vida, pelo carinho
e pelo amor, além das condições
ofertadas para que pudesse me
dedicar a este objetivo. E, claro aos
meus professores Margareth R.
Moysés e Marcelo M. Morales.
Muito obrigado mesmo!!!!!!!!!.
5
Agradecimentos
A Deus por estar sempre ao meu lado nos momentos de provações, de
angústias e de dúvidas, dando-me força, perseverança e humidalde para
continuar e, não é que continuei mesmooo!!!!!
A todos os meus familiares, em especial: minha mãe, Iracy, meu pai,
Jones, minha avó, Brígida (em memória), minhas tias, Ancelma, Irca e Ilma e
meus tios, Ozílio e Carlos Eugênio, pela paciência, incentivo e pelo carinho em
todos os momentos.
À Prof
a
. Dr
a
. Margareth Ribeiro Moysés, por ter me aceito como
orientado, demonstrando, assim, confiança em minha pessoa e em meu
trabalho. Agradeço tudo que aprendi e estou ainda aprendendo, o que permitiu
que me tornasse melhor não só como aluno, mas também como pessoa.
Obrigado pela atenção e carinho, que não são apenas de uma professora-
pesquisadora, mas de uma verdadeira mãe cientista.
Ao Prof
.
Dr. Marcelo Marcos Morales por ter me aceito como co-
orientado em seu laboratório de Fisiologia Celular e Molecular no Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho (IBCCF-UFRJ) me dando todas as condições
necessárias para a realização deste trabalho. Agradeço tudo que aprendi a
orientação, as discussões, os experimentos, a capacidade de fazer ciência
séria e ética, através de várias parcerias e, consequentemente, uma grande
amizade. E, claro, a paciência e o incentivo em todos os momentos no
desenrolar dos protocolos.
Aos amigos do Laboratório de Fisiologia Molecular e Celular do Instituto
de Biofísica Carlos Chagas Filho na UFRJ, com os quais passei momentos de
alegria, de aprendizado e de dificuldades, pois tudo fica mais fácil, quando se
6
trabalha entre amigos verdadeiros: Carolina Lemos Barbosa (Carolzinha!!!,
Obrigado por todo apoio, pelas caronas, pelas discussões, pelos protocolos,
pela grande amizade, por tudo!!!! ), Débora Ornellas, Felipe Mateus Ornellas
(Pela paciência, pelos finais de semanas e feriados perdidos, pelas horas
extras, pela amizade, etc), Felipe Mancilha Protta, Jackson de Souza Menezes
(pelas orientações nos protocolos, pela amizade e apoio nas maiores dúvidas,
pela segurança em momentos de decisões difícies, pela grande amizade!!!),
Raquel Castiglione, Tatiana Marom Guitierrez e André.
Aos amigos no Laboratório de Patologia Celular no Instituto de
Morfologia (UFRJ) chefiado pela Profa Dra Chistina Maeda Takya, como
Viviam Samoto, Leandro Alves, Leonardo Monção, André Barreira, Luis e
Silvania. Um obrigado especial para a Profa Dra Chistina Maeda Takya que
disponibilizou vosso laboratório para que pudesse desenvolver o protocolo de
Imunofluorêscencia. Obrigado pelo seu amor e por sua dedicação pela ciência
e, pelo meu trabalho.
Aos amigos no Laboratório de Bioquímica Renal do Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho (UFRJ) chefiado pela Prof. Dr. Celso Caruso Neves, como
Mira Wengert, Janaína, com os quais apreendi a desenvolver uma alegria
diferenciada nos momentos de maior dificuldade no desenrolar dos protocolos.
Não podia deixar de mencionar o apoio impar de a Dra Mira Wengert no
desenrolar do protocolo da mensuração da Atividade da Na
+
-K
+
-ATPase renal.
Não sei ao certo como expressar minha gratidão, pelo exemplo, pelo apoio, por
ser em alguns momentos “uma luz no fim do túnel, pelos protocolos
desenvolvidos em vosso laboratório, pelo meu amadurecimento com
pesquisador e pela amizade. Obrigado Prof. Dr. Celso Caruso Neves.
7
E por fim, e claro não menos importante, meus amigos do Laboratório de
Estudos em Coração Isolado da UFES, Washington Gonçalves Luis, Helena
Lima Gomes, Érica Broetto, Roger Lyrio Santos, Thiago Dal-Cin de Paula,
MarielaPiccin , Marina Dapieve, Renata. Obrigado pelo incentivo e pelo apoio
nos momentos de provações.
A todos os professores deste Programa de Pós-graduação em Ciências
Fisiológicas da UFES que contribuíram de alguma forma em minha formação.
À equipe da secretaria, Sebastião da Fonseca e Cláudia Batista de
Deus, pela colaboração e atenção, quando necessário.
Muito obrigado mesmo!
8
SUMÁRIO
Página
Lista de tabelas..................................................................................................09
Lista de figuras...................................................................................................10
RESUMO...........................................................................................................11
ABSTRACT........................................................................................................14
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................17
2. OBJETIVOS.................................................................................................34
3. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................37
3.1 Animais Experimentais...........................................................................38
3.2 Grupos Experimentais............................................................................39
3.3 Protocolos Experimentais.......................................................................39
3.3.1Ovariectomia bilateral...........................................................................39
3.3.2 Reposição hormonal ...........................................................................39
3.3.3 Função renal............................ ...........................................................40
3.3.4 Western blotting ..................................................................................41
3.3.5 Medida da Atividade ATPásica........................................................... 43
3.3.6 Densitometria..................................................................................... 45
3.3.7 Imunofluorescência.............................................................................45
3.3.8 Cultura celular.................................................................................... 47
3.3.9 Análise Estatística...............................................................................48
4. RESULTADOS.............................................................................................49
5. DISCUSSÃO................................................................................................62
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................84
9
LISTA DE TABELAS
Página
50
52
Tabela 1: Valores médios de concentrações séricas de estrogênio e de
progesterona dos grupos controle (C), ovariectomizado (OVX),
ovariectomizado reposto com benzoato de 17b-estradiol (OVE) e reposto com
progesterona (OVP), por 10 dias
Tabela 2: Valores médios das frações de excreção (FE) de Na
+
, K
+
, Cl
-
, e
Uréia, fluxo urinário, Ritmo de Filtração Glomerular (RFG), ingestão hídrica e
peso corporal, dos grupos controle (C), ovariectomizado (OVX),
ovariectomizado reposto com benzoato de 17b-estradiol (OVE) e reposto com
progesterona (OVP), por 10 dias
10
LISTA DE FIGURAS
Página
53
55
58
59
61
Figura 1: Modulação da expressão da proteína e atividade Na
+
-K
+
-
ATPase em rins de ratas sob diferentes condições.
Figura 2: Expressão da proteína do canal de sódio CNGA-1 em rins de
ratas sob diferentes condições.
Figura 3: Efeito de diferentes concentrações de benzoato de 17b-estradiol
na expressão da proteína do canal de sódio CNGA-1 em cultura de células
IRPT (túbulo proximal de ratos) sob diferentes condições.
Figura 4: Efeito de diferentes concentrações de benzoato de 17b-estradiol
na modulação da expressão da proteína e da atividade da Na
+
-K
+
-ATPase
em cultura de células IRPT (túbulo proximal de ratos) sob diferentes
condições.
Figura 5: Imunolocalização do canal de sódio CNGA-1 no túbulo distal e
proximal do néfron de ratas controle.
11
RESUMO
12
Estrogênio (E
2
) e progesterona (P
4
) são os esteróides femininos que
envolvidos na regulação da função reprodutiva e dentre outros efeitos, eles
podem modular a expressão e atividade de transportadores de Na
+
do néfron e
interferir com a regulação do volume do fluido extracelular. O objetivo desse
trabalho é avaliar a influência desses dois hormônios, de forma isolada, sobre a
expressão da proteína da Na
+
, K
+
-ATPase e do canal de sódio CNGA-1renais.
Para tanto utilizamos Ratas Wistar (200-250g) divididas em dois grupos:
1) controle-sham (C, n=4), 2) ovariectomizadas (OVX, n=12). Após 10 dias da
ovariectomia bilateral, oito delas foram redivididas e receberam o tratamento
subcutâneo de 17-β-estradiol (2.0µg kg
-1
, OVE, n=4) e de progesterona (1.7mg
kg
-1
, OVP, n=4) diariamente por 10 dias. Amostras de sangue e de urina foram
coletadas para avaliação da função renal. Os animais foram sacrificados por
eutanásia e tiveram os rins retirados para a análise da expressão da Na
+
, K
+
-
ATPase e do canal CNGA-1por Western blotting.
Observamos um aumento significativo na fração de excreção (FE) de
Na
+
no OVX (0,21±0,02, P<0.01), vs C (0,12±0,01 ), esses valores retornaram
ao normal após reposição com E
2
(0,12±0,01)ou P
4
(0,11±0,02) O fluxo urinário
(mL/min) e a ingestão hídrica (mL/dia) foram menores no OVX (0,004±0,002;
7,7±1,4, respectivamente) vs C (0,01±0,001; 15,6±1,8, respectivamente). A
expressão e a atividade da Na
+
, K
+
-ATPase cortical foram menores em 44%
(P<0.01), e 50% (P<0.05) nos grupos OVX e C, respectivamente. Apenas no
OVE aumentou em 30% a expressão da Na
+
, K
+
-ATPase (P<0.01). Não
encontramos, alterações significativas na expressão ou na atividade da Na
+
,
K
+
-ATPase na medula renal. O tratamento de 24h com E
2
em células de túbulo
proximal (CTP),
apenas ocasionaram um aumento na expressão da proteína
13
Na
+
, K
+
-ATPase de 32,5%, 30% e 120% nas doses de 10
-9
, 10
-8
e 10
-7
M,
respectivamente. E esse aumento na expressão da proteína, foi corroborado
com um aumento na atividade da Na
+
-K
+
-ATPase, nas mesmas doses de de
150%, 140% e130%, respectivamente
A expressão da proteína do CNGA-1 cortical foi reduzida em 42%
(P<0.01) no OVX, vs C, retornando aos valores normais após reposição com E
2
ou P
4
. O tratamento de 24h com E
2
nas doses de 10
-11
, 10
-10
, 10
-9
, 10
-8
e 10
-7
M
aumentaram a expressão do CNGA-1 utilizando CTP em 70%, 80%, 80%, 90%
e 110%, respectivamente Também detectamos, por imunofluorescência, sua
localização na região basal nos túbulo proximal e distal do néfron.
A modulação da expressão da proteína e da atividade da Na
+
, K
+
-
ATPase ocorrem de forma similar a modulação da expressão da proteína do
canal de sódio CNGA-1, em córtex renal de ratas, sob influência do estrogênio.
Isso sugere que há uma relação funcional entre esses dois carreadores, de
maneira que o CNGA-1 poderia manter as concentrações de sódio
intracelulares adequadas para o funcionamento da Na
+
, K
+
-ATPase .
14
ABSTRACT
15
Estrogen (E
2
) and progesterone (P
4
) are both steroids hormones and
they are involved mainly in the control of female reproductive functions. Among
other effects, E
2
and P
4
can modulate Na
+
reabsorption along the nephron
altering the body hydroelectrolyte balance. The female hormones can modulate
corporal Na
+
balance by alterations of ion channel and ion pumps expressions
and activities. In this work, we studied the possible involvement of E
2
and P
4
in
modulating the expression and function of Na
+
-K
+
-ATPase pump and sodium
channel CNG-A1 in the kidney of female Wistar rats subjected to ovariectomy
with or without near-physiological 17b-estradiol benzoate and progesterone
treatment for 10 days. The CNGA-1 and Na-K-ATPase protein expression from
cortex and medulla renal were analyzed by Western blot.
The decreased renal cortex expression of CNGA-1 and Na
+
-K
+
-ATPase
protein observed in OVX group was restored to control levels after treatment
with doses of estradiol and progesterone. The Na
+
,K
+
-ATPase activity in renal
cortex decreased in 50% in OVX group and the replacement of estradiol or
progesterone in OVX animals increased those parameters to control group
values. The other hand, there was no significant variation of, CNGA-1 protein
expression, Na
+
,K
+
-ATPase protein expression and activity in the medulla renal
tissue of animals subjected to the same treatment. The 17b-estradiol added to
cell culture medium significantly increased rat renal culture proximal tubule cell
CNG1-A protein expression and Na
+
,K
+
-ATPase protein expression and activity
of control levels.
The indirect immunofluorescence microscopy of the female adult rat
kidney labeled with anti-sodium channel-CNG1-A antibody revealed that CNG1-
A was expressed in the basolateral membrane of proximal and distal connecting
16
tubules. The reactivity to this antibody was only seen in kidney cortex. No
immunofluorescence was detected in kidney medulla.
This results suggest that Na
+
-K
+
-ATPase and CNGA-1 would be included
in the family of transporters stimulated by estrogen and progesterone in the
kidney and it might have an important role in renal function and that Na
+
-K
+
-
ATPase and CNGA-1 subunit would be function relation in reabsorption of
sodium in the proximal tubules.
17
18
INTRODUÇÃO
19
Em indivíduos normais a composição do fluido corporal, seu volume e a
sua distribuição entre os diversos compartimentos celulares devem
permanecer dentro de faixas estreitas de variações (Jacobson e Rector,
1990). Esse equilíbrio depende do balanço de água e de sais que são
ingeridos e excretados diariamente pelo organismo. Os principais órgãos
envolvidos na regulação do volume do fluido extracelular são o trato gastro-
intestinal e os rins por serem os principais responsáveis, respectivamente,
pela absorção, secreção/ excreção de sais e de água (Cowley e Roman,
1996). O volume do fluido extracelular compreende o volume de fluidos
contidos nos compartimentos intersticiais, linfáticos e vasculares. A
regulação do volume contido dentro dos vasos está relacionada com o
controle de um dos mais importantes parâmetros hemodinâmicos, a pressão
arterial sistêmica que deve ser mantida dentro dos limites normais para a
devida irrigação dos vários tecidos. Além do controle do volume intravascular
circulante, a pressão arterial também pode ser alterada por variações do
tônus vascular, da força de contração cardíaca e da função endotelial
(Santos et. al., 2004).
A composição do volume do fluido extracelular é diferente quando
comparada a do meio intracelular, ele é constituído predominantemente de
sódio (Na
+
) 140 mEq/l e cloreto (Cl
-
) 100 mEq/l, contendo, diferentemente do
meio intracelular, uma concentração baixa de potássio (K
+
). O segundo
ânion em abundância no FEC é o bicarbonato (HCO
3
-
), presente na
concentração de cerca de 25 mEq/l (Macknight & Leaf, 1977). Desta forma,
o volume do FEC é, praticamente determinado pelo balanço entre a ingestão
e a excreção renal de NaCl por serem os íons osmoticamente ativos mais
20
abundantes nesse meio. Cerca de 20% do peso corpóreo corresponde ao
fluido extracelular, sendo que mais de 90% de sua osmolaridade é devida
aos sais de sódio, posto que estes sejam íons tipicamente extracelulares,
que geralmente está acompanhado por quantidades equimolares de cloreto.
(Macknight e cols., 1977).
Diariamente, dos 1200 litros de sangue que chegam até os rins, 180
litros (L) de plasma são filtrados nos glomérulos, sendo eliminado pelos rins
apenas um total de 1 a 2 L de urina em virtude da grande reabsorção que
ocorre ao longo dos túbulos renais. A maior parte do sódio filtrado nos
glomérulos é reabsorvida ao longo dos vários segmentos do néfron, sendo que
nos túbulos proximais, alça de Henle e túbulo distal à reabsorção de sódio é
proporcional à quantidade filtrada (Dantzler, 2003). Em contrapartida, ao longo
do sistema coletor, composto pelas porções cortical, medular externa e
medular interna, a reabsorção do íon é finamente regulada por hormônios,
sendo esta fundamental para a manutenção da volemia. Alterações dos níveis
circulantes e locais de substâncias que aumentam a excreção de sódio, ou
seja, natriuréticas (peptídeo natriurético atrial, bradicinina, adenosina) e que
diminuem a excreção de sódio, ou seja, anti-natriuréticas (angiotensina,
vasopressina, aldosterona, hormônios tireóideos) estão associadas a
modificações na atividade e na expressão dos transportadores iônicos renais e
a mudanças do volume extracelular, já que, a reabsorção de Na
+
ao longo do
néfron é o processo primário responsável pela reabsorção de água e
manutenção do volume do fluido extracelular (Repke & cols., 1995; Morales &
cols., 1996; Dantzler, 2003).
21
Alterações na ingestão de sódio ou nos mecanismos de sua excreção,
através do epitélio renal podem estar relacionadas com a gênese de
distúrbios do volume do fluido extracelular, tais como a hipertensão, que
pode levar ao acometimento de vários órgãos e ao desenvolvimento de
doenças, como a insuficiência renal, acidentes vasculares cerebrais e infarto
do miocárdio. Essas doenças apresentam alta mortalidade e constituem
causa de incapacidade física e laboral na população economicamente ativa,
com grande impacto social (Heagerty & cols., 1993; Brown & Haydock,
2000).
Uns dos hormônios que merecem destaque na reabsorção de sódio são
os mineralocorticóides, que são representados primordialmente pela
aldosterona. Este esteróide possui ação importante na dinâmica de
transporte de sódio no epitélio renal diminuindo a excreção de sódio
principalmente pela urina, mas também pela saliva, pelo suor e pelas fezes
(Guyton, 1989). Em condições normais, a massa de sódio eliminada pelo
suor e pelas fezes é desprezível, sendo os rins os principais efetores dessa
excreção (Dusing e cols., 1976). A liberação da aldosterona secretada pelo
córtex adrenal depende de um refinado controle que envolve a liberação da
renina pelas células justaglomerulares dos rins. A renina liberada age sobre
o substrato protéico, angiotensinogênio produzido no fígado, dando origem a
um decapeptídeo, a angiotensina-I, que sob a ação da enzima conversora
de angiotensina, localizada em endotélio, principalmente pulmonar, é
transformada no octapeptídeo angiotensina-II. A angiotensina II, além de agir
no rim promovendo a reabsorção de sódio no segmento do túbulo proximal,
promove no córtex adrenal a liberação da aldosterona. A aldosterona tem
22
como função principal estimular a reabsorção de sódio, principalmente,
através dos segmentos distais do néfron (Work e Jamison, 1987), onde
promove o aumento da permeabilidade luminal ao sódio através de canais
de sódio conhecidos como Canais de Sódio Epiteliais (ENaC) (Garthy e
Palmer, 1997) concomitantemente, à secreção de potássio e de hidrogênio.
A reabsorção de sódio leva ao aumento da osmolaridade plasmática com
conseqüente estímulo à liberação e secreção do hormônio antidiurético pela
hipófise posterior, que ao atuar nos túbulos distais convolutos e nos ductos
coletores, ocasiona a ativação e a inseração dos canais de água
(aquaporina-2), levando a uma maior reabsorção de água por eles, além de
estimular o centro da sede, localizado no sistema nervoso central, com
conseqüente estímulo para a ingestão (Tanaka et al., 2004).
Por outro lado, o principal hormônio relacionado com a excreção de
sódio pelos rins é o peptídeo natriurético atrial. Este peptídeo é produzido
pelos miócitos atriais e o estímulo para a sua liberação na corrente
sanguínea é o aumento do volume efetivo de sangue que chega aos átrios,
ocasionando seu estiramento mecânico (Antunes et al., 2004). A expansão
dos átrios em situações, como, por exemplo, no aumento do volume do
fluido extracelular, promove a liberação e a produção do fator atrial
natriurético pelos miócitos atriais. O peptídeo natriurético atrial circulante
pode inibir o efeito estimulador da angiotensina II na reabsorção de sódio no
túbulo proximal, inibir a reabsorção de sódio no ducto coletor, causar
vasodilatação medular, com conseqüente aumento do fluxo sanguíneo
medular ou ainda, levar a uma redução na liberação de renina, de
aldosterona e de vasopressina (Antunes et al., 2004). De modo que sua
23
principal ação é inibir a reabsorção de sódio na porção medular interna e
medular externa do ducto coletor e, desta forma, favorecer a diurese,
diminuindo o volume do fluido extracelular a valores normais (Aires, 1999).
Dessa maneira, o organismo depende de um grande número de
processos regulatórios para manter o equilíbrio do seu meio interno (líquido
extracelular), o que inclui o controle da pressão arterial sistêmica, do volume
extra e intracelular, da osmolaridade, do pH, das concentrações iônicas, etc.
Estas propriedades do meio interno devem ser mantidas dentro de faixas
estreitas de variação para permitir a adequada função celular. Estas
propriedades, em seu conjunto, são denominadas de homeostase, e seu
estudo é um dos principais objetivos das Ciências Fisiológicas.
Apesar de muitos estudos, os papéis funcionais dos vários
transportadores iônicos ao longo do néfron, não estão totalmente esclarecidos.
Muito menos são conhecidas as suas participações no transporte regulado por
hormônios e os mecanismos moleculares envolvidos.
É evidente, no entanto, que muitos desses fatores autócrinos,
endócrinos e parácrinos podem modular a absorção e a excreção de NaCl
através da ação sobre os transportadores iônicos presentes no epitélio renal
(Kunzelmann & Mall, 2002). Os canais iônicos são geralmente seletivos e
transportam íons a favor de seu gradiente eletro-químico (Kunzelmann & Mall,
2002). Nesse sentido, vários processos patológicos, principalmente os que
alteram a excreção renal de NaCl, conduzem aos desequilíbrios eletrolíticos no
organismo (Kunzelmann & Mall, 2002).
Assim, quando se estuda o transporte trans-epitelial renal, duas vias
possíveis devem ser mencionadas, isto é, a transcelular, através das duas
24
membranas celulares tubulares, a membrana luminal ou apical (ML) e a
membrana basolateral (MBL) e a via inter- ou paracelular (através das tight-
junctions) (Aires et al., 1999).
Na reabsorção no túbulo proximal, o transporte de água segue o de
soluto, graças ao pequeno gradiente osmótico existente, pois o fluido luminal
nessa porção é ligeiramente hipotônico em relação ao plasma peritubular. O
túbulo proximal reabsorve aproximadamente 67% de água filtrada, Na
+
, Cl
-
, K
+
e outros solutos. O processo de reabsorção de íons tem como força motriz
geradora de gradiente, a enzima Na
+
-K
+
-ATPase localizada na membrana
basolateral (Feraille and Doucet, 2001).
O Na
+
é reabsorvido por mecanismos diferentes na primeira metade e na
segunda metade do túbulo proximal. No segmento inicial, o Na
+
é reabsorvido,
pela membrana luminal, através do co-transporte eletrogênico com solutos
orgânicos, tais como açúcares e aminoácidos, e também pelo contra-transporte
Na
+
/H
+
eletroneutro. Este último transporta Na
+
para dentro da célula em troca
da secreção luminal de H
+
. Também é observado o co-transporte neutro de Na
+
com ânions orgânicos como o lactato na membrana luminal nesse segmento
(Aronson, 1996; Knepper & Brooks, 2001; Dantzler, 2003).
Na segunda metade do túbulo proximal, o Na
+
é reabsorvido através
tanto da via trans-celular como da para-celular. Este entra na célula tubular
renal pela ação paralela do trocador Na
+
/H
+
e um ou mais trocadores aniônicos
envolvendo a reabsorção de Cl
-
localizados na membrana luminal deste
segmento. A energia necessária para este processo é originada pelo gradiente
eletroquímico gerado pela bomba Na
+
/K
+
na membrana basolateral (Feraille
and Doucet, 2001), sendo o Na
+
reabsorvido para o interstício, por transporte
25
ativo, através do funcionamento desta enzima. O Cl
-
por sua vez, é reabsorvido
para o interstício pela ação de um co-transportador K
+
-Cl
-
também localizado
na membrana basolateral.
O NaCl é reabsorvido também pela via para-celular nesta porção do
túbulo proximal favorecida pelo gradiente de concentração de Cl
-
gerada pelo
aumento da sua concentração na luz tubular produzida pela grande reabsorção
de água nesse segmento. Todavia, uma parte deste NaCl é reabsorvido
carregado pelo movimento de água entre os espaços intercelulares (solvent
drag) (Aronson, 1996; Aronson & Giebisch, 1997; Knepper & Brooks, 2001).
O segmento fino descendente da Alça de Henle é altamente permeável
a água pela presença de aquaporinas (canais de água). Nesse segmento, o
Na
+
é secretado passivamente para a luz tubular, pelo menos em algumas
espécies animais. Já o segmento fino ascendente é impermeável a água e a
reabsorção de NaCl é preferencialmente passiva.
A porção grossa ascendente da Alça de Henle reabsorve
aproximadamente 25% do NaCl e K
+
filtrados, a reabsorção de Na
+
é feita
através de transporte ativo secundário, pelo co-transportador Na
+
/K
+
/2Cl
-
,
localizado na membrana luminal e inibido pelo diurético de alça furosemida.
Neste segmento não ocorre reabsorção de água, pois seu epitélio é altamente
impermeável à água. A reabsorção de Na
+
no túbulo distal convoluto é passiva,
através do simporte Na
+
-Cl
-
ou ativa secundária, pelo trocador Na
+
/H
+
.
Virtualmente, não existe reabsorção de água no túbulo distal convoluto, na
presença ou não do hormônio antidiurético (HAD) (Greger, 1985; Haas, 1989;
Kaplan & cols., 1996; Dantzler, 2003).
26
O ducto coletor cortical e o medular reabsorvem aproximadamente 7%
do NaCl filtrado, a reabsorção de Na
+
é eletrogênica, pois esse íon difunde-se
da luz tubular para o interior da célula “principal” do ducto coletor, através de
canais sensíveis ao amilorida , diurético poupador de potássio, localizados na
membrana luminal, a favor tanto de um gradiente químico como elétrico. Ao
contrário dos outros segmentos do néfron, o ducto coletor reabsorve Na
+
em
atendimento às necessidades do organismo, um ajuste fino (Vincigerra et al.,
2004), e não em função da quantidade de Na
+
que lhe é oferecida. A
reabsorção de Na
+
neste segmento é regulada pela ação da aldosterona.
Nesses segmentos, o epitélio é classificado como epitélios tight, ou de baixa
permeabilidade. A permeabilidade à água varia diretamente com a
concentração plasmática do hormônio antidiurético, que aumenta a
permeabilidade à água desses segmentos, permitindo que a água passe, a
favor do gradiente de concentração, da luz tubular para o interstício peritubular
hipertônico, reabsorvendo uma quantidade variável de água (entre 8 a 17%)
(Breyer & Ando, 1994; Hebert, 1999).
As células do ducto coletor reabsorvem quantidades significativas de Cl
-
,
provavelmente através da via para-celular. A reabsorção de Cl
-
é movida pela
diferença de voltagem através do túbulo distal e do ducto coletor.
Por outro lado, além dos fatores clássicos (fator natriurético atrial,
aldosterona e hormônio antidiurético) que estão relacionados com a
regulação do volume e da composição salina do fluido extracelular, outros
hormônios vêm se destacando nesse papel fisiológico, como os hormônios
sexuais femininos, que incluem o estrogênio e a progesterona (Stachelfeld et
al., 1999). Seus receptores podem ser encontrados nos túbulos renais
27
(Mosselman et al., 1996; Dubey & Jackson, 2001) e estão envolvidos na
regulação de sódio, de potássio e de cálcio (Brunette & Leclerc, 2001;
Brunette & Leclerc, 2002).
O estrogênio participa da modulação do equilíbrio de sal e de água do
organismo (Stachenfeld et al., 1999), por efeitos diretos nos túbulos proximal
e distal (Verlander et al., 1998; Brunette & Leclerc, 2001; Stachenfeld et al.,
2003), via uma grande expressão de seus receptores α e β (Sharma and
Thakur, 2004). Ou indiretamente, modulando o sistema renina angiotensina-
aldosterona, diminuindo a atividade da renina plasmática e a enzima
conversora de angiotensina (Suelly et al., 2004). É observado um aumento
na retenção de água e de sal no organismo pela ação da angiotensina II,
concomitantemente com um aumento nos níveis de aldosterona e de
progesterona (Sealy et al., 1994; Stachenfeld et al., 2005), sugerindo uma
ação progestogênica não específica na competição com a aldosterona pelos
receptores de mineralocorticóides ao longo túbulo distal. Sugere-se um
mecanismo compensatório, que estimula uma maior formação de
angiotensina II, bem como de aldosterona nesse modelo (Myles & Funder,
1996).
As ações do estrogênio, normalmente, são mediadas por dois tipos de
receptores, que são conhecidos como receptores de estrogênio (RE) que
são geneticamente diferentes, são os receptores, REα (alfa) e REβ (beta)
(Katzenellenbogen et al. 2000; Hall et al., 2001; Gustafsson, 2003), que
possuem uma distribuição vasta em vários órgãos do indivíduo (Kuiper et al.,
1997). Eles são membros da superfamília de receptores nucleares, com
ações regulatórias variadas na transcrição gênica, no citoplasma e na
28
membrana celular (Nadal et al., 2001). Quando ligados ao hormônio, esses
receptores sofrem rearranjos conformacionais, levando a formação de homo
ou heterodímeros de REα e REβ. Ativados, interagem, com alta afinidade,
diretamente com regiões específicas do material genético da célula, isto é,
genes específicos, chamados de elementos responsivos do estrogênio,
como promotores ou, indiretamente, através de interações protéicas com
fatores de transcrição (Hall et al., 2001), que podem ativar/ e ou inibir a
transcrição gênica. Contudo, parece que o REα é mais potente ativador que
o REβ em indivíduos adultos. Nos rins de camundongas em idade
reprodutiva, há uma maior expressão da proteína dos REα, se comparada à
expressão da proteína do REβ (Carley et al., 2003). Assim, a resposta
dependente do estrogênio, pode ser expressa pela presença de um de seus
subtipos de receptores no tecido alvo em questão (Turgeon et al., 2004).
Estudos vêm mostrando que os esteróides femininos regulam a
expressão de diferentes transportadores em diferentes tecidos do
organismo. Em pulmão, o estrogênio combinado com a progesterona
aumentam a expressão de canais epiteliais de Na
+
(ENaC) e de cloreto
reguladores da condutância transmembrana da fibrose cística (CFTR)
(Johannesson M, et al., 2000). O estrogênio e a progesterona modulam de
forma diferenciada a expressão do RNAm das subunidades do canal epitelial
de Na
+
em rins de ratas em idade reprodutiva (Gambling etal., 2004). In
vitro, o estrogênio aumentou a expressão do co-transportador NaCl e da
Na
+
-K
+
-ATPase em células de túbulos distais de ratos (Tran et al., 2001), já
a progesterona aumentou captação de Ca
+2
de forma não genômica (rápida)
29
em cultura celular de túbulos proximais de coelhos (Brunette and Leclerc,
2002).
Outra protéica importante na reabsorção de sódio ao longo do néfron, é
a Na
+
-K
+
-Adenosina-trifosfatase (Na
+
-K
+
-ATPase), que é uma proteína
transmembrana com função transportadora e catalítica, que mantém o
gradiente eletroquímico de Na
+
e de K
+
através da energia liberada pela
hidrólise do ATP (Fedosova and Esmann, 2007). Quando ativada
funcionalmente, ela transporta 3 íons Na
+
para o meio extracelular e 2 íons
K
+
para o meio intracelular, gerando um efluxo ordenado resultante de
cargas positivas para o meio extracelular, por isso é dita como eletrogênica
(Or et al., 1996). Nas células dos mamíferos, é composta basicamente, por
duas subunidades, a alfa (α) com aproximadamente 113kDa, formada por 10
domínios transmembrânicos, sítios de interação com o ATP, com os íons
Na
+
e K
+
e de fosforilação, possuindo três isoformas (α1, α2 e α3). A
segunda subunidade é a beta (β) com aproximadamente 35kDa e apenas
um domínio transmembrânico, sendo essencial para a atividade do
complexo protéico e possuindo quatro isoformas (β1, β2, β3 e β4)
(Mobasheri et al., 2000). A bomba funcional requer a presença de ambas às
subunidades, formando um dímero α-β (Fedosova and Esmann, 2007), mas
considerando sua importância fisiológica, pouco se sabe sobre da cinética e
da distribuição tecidual dessas isoformas. Adicionalmente, ao lado dessas
subunidades, outros pequenos peptídeos, como o FXYD5 (Lubarki I et al.,
2007), que atravessam a membrana apenas uma vez, interagem com a
bomba. O primeiro deles a ser identificado, foi denominado subunidade
30
gama (γ) e, é um peptídeo hidrofóbico de cerca de 7kDa que no rim
colocaliza-se com a subunidade alfa (Lubarki et al., 2007).
No tecido renal, a Na
+
-K
+
-ATPase se encontra na membrana basolateral
dos segmentos do néfron, gerando o gradiente eletroquímico para o
transporte vetorial de sódio (Feraille and Doucet, 2001), merecendo
destaque o ajuste fino desse íon no ducto coletor (Vincigerra et al., 2004).
Trabalhos mostram que sua regulação é multifatorial, incluindo hormônios,
como aldosterona e vasopressina (Gonin et al., 2001), fatores parácrinos,
como a adenosina (Wengert et al., 2007), a concentração de sódio
intracelular e a osmolaridade extracelular (Feraille and Doucet, 2001, Feraille
et al., 2003 ). A sua modulação crônica pode alterar a expressão da proteína
de suas subunidades, já sua modulação aguda pode modificar a
redistribuição/ reciclagem da proteína-enzima entre a superfície celular e o
meio intracelular, por influência na fisiologia da reciclagem vesicular do
aparelho de Golgi (Vincigerra et al., 2003).
Recentemente, muitos trabalhos têm mostrado que os esteróides
femininos participam da modulação da Na
+
-K
+
-ATPase em diferentes tecidos
(Aperita et al., 1981; Monteiro et al., 2007;Morril et al., 2008; Liu et al., 2007).
Em ratos com 20 dias de vida, o tratamento com estrogênio aumentou a
atividade da Na
+
-K
+
-ATPase em células de túbulos proximais em
desenvolvimento (Aperita et al., 1981). Já no trabalho de Monteiro et al.,
2007 a ovariectomia bilateral aumentou a atividade da bomba no hipocampo
de ratas em idade reprodutiva. Embora, a reposição estrogênica com doses
variando entre 1, 100 e 1000 nmol/L tenham diminuído tanto a expressão,
quanto a atividade da Na
+
-K
+
-ATPase. Já o trabalho de Tran et al., 2001 que
31
mostrou in vitro que o estrogênio aumenta a expressão da proteína Na
+
-K
+
-
ATPase em células de túbulos distais de ratas. O tratamento com a
progesterona pode atenuar ou não influenciar de forma direta em sua
atividade, isso foi demonstrado no trabalho de Morril et al., 2008, em que o
tratamento com a progesterona apresentou resultados similares de
atividade, ao tratamento com a ouabaína, um inibidor conhecido da atividade
da Na
+
-K
+
-ATPase, sugerindo assim que a progesterona pode se ligar a um
sítio inibitório da Na
+
-K
+
-ATPase (Morril et al., 2008). Como o estrogênio e a
progesterona participam da regulação do balanço de sal e de água no
organismo por vários mecanismos, e o rim é o principal órgão responsável
por esse equilíbrio, será que um desses mecanismos não seria a
modulação da expressão e da atividade da Na
+
-K
+
-ATPase no tecido
renal de ratas fêmeas em idade reprodutiva?
Em 1989, foi clonado em células de retina (cones e bastonetes) o canal
de sódio sensível a amilorida, pertencente à família dos canais dependentes de
GMP cíclico, cyclic nucleotide-gated channel (CNG), denominado CNGA-1, que
tem função comprovada na transdução de sinais sensoriais do olfato e da visão
(Kaupp et al., 1989).
O canal de sódio CNGA-1 é uma proteína expressa no tecido cardíaco,
(Ahmad et al., 1990), no pulmão, no fígado (Ding et al., 1997), na musculatura
esquelética (Feng et al., 1996) e testicular (Shi F and Wang T, 2005). A sua
presença no tecido renal tem sido questionada ou não determinada de forma
convergente pelos diferentes métodos, pois apenas por reação em cadeia de
polimerase (PCR) e Northem blotting apresentaram alguns resultados positivos
(Ding et al., 1997), embora outros trabalhos não conseguiram detectá-lo (Zhang
32
et al. 1997), nem por Western blotting ou por imunohistoquímica (Ding et al.,
1997). Será que a proteína desse canal de sódio é realmente encontrada
no rim de mamíferos? Se encontrada, ela possui algum papel na fisiologia
renal desses animais?
O transporte do sódio através de canais sensíveis a amilorida, no túbulo
renal, tem comprovado papel na regulação do volume do fluido extracelular e
da pressão sangüínea (Cowley & Roman, 1996; Garty & Palmer, 1997). Dentre
esses canais o papel clássico é referido ao canal epitelial de Na
+
, ENaC,
expresso no ducto coletor e inibido pela amilorida.
Por outro lado, é proposto em alguns trabalhos que as isoformas dos
canais CNG possam ter um papel importante ao longo do néfron, como
demonstrado em cultura celular de ducto coletor medular interno (Vandorpe
et al., 1997), ou em rins de ratos , que expressam o RNAm e a proteína da
isoforma CNG3-A (Noivara et al., 2004). Os canais dessa grande família
CNG possuem uma estrutura heterotetramérica consistindo de subunidades
proteicas “principais” e protéicas “modulatórias” (Richards & Gordon, 2000;
Bradley & cols., 2005). As subunidades principais se caracterizam pela
habilidade de induzir a formação/ conformação funcional do canal, expressa
em sistemas heterólogos. No entanto, as subunidades modulatórias somente
são co-expressas com a subunidade principal, conferindo a esses canais um
arranjo protéico que conferirá as propriedades nativas dos canais
pertencentes a família dos CNGs. Trabalhos têm demonstrado que esses
canais possuem um aumento da sensitividade/ possibilidade de ativação a
nucleotídeos cíclicos, como o AMPc e o GMPc. (Biel et al., 1996; Biel et
,1999).
33
Assim, os canais da família dos CNGs presentes nas células dos
mamíferos estão divididos em duas diferentes subfamílias. A sub-família dos
canais representada pelas sub-unidades principais, designadas CNGA-1,
CNG-A2, CNG-A3 e CNG-A4, sendo que o CNG-A4, encontra-se dentro
desta família, mas sem capacidade de induzir a formação/ conformação
funcional do canal (freqüentemente denominada sub-unidade modulatória), e
a segunda sub-família desses canais é compreendida por dois membros, o
CNG-B1 e o CNG-B3, denominados de sub-unidades modulatórias (Kaupp &
Seifert, 2002).
O canal de sódio CNGA-1 é uma proteína de aproximadamente 63
kDa (Molday et al., 1991), embora outros trabalhos apresentem os seus
peso molecular em torno de 79,6 kDa, contendo cerca de 690 resíduos de
aminoácidos (Ding et al., 1997; Shi F and Wnag T, 2005). Essa discrepância
no tamanho e peso molecular pode ser devido à ausência/ presença de 92
resíduos de aminoácidos (Kaupp and Seifert, 2002), que pode ser
encontrado em células sensórias olfatórias humanas, de camundongo, de
rato e de porco (Molday et al., 1992). Além disso, o canal de sódio CNGA-1
pode ser glicolisada no resíduo N327. A glicolisação ou a não glicolisação
pode alterar o peso molecular do canal em 2kDa (Wohlfart et al., 1992).
Trabalhos demosntram que o canal de sódio CNGA-1 é formado por 6
domínios transmembranais (TMDs), sendo que o poro funcional do canal,
parece que está localizado entre os domínios 5 e 6. Ambos grupos NH
2
(N) e
COOH (C) terminais contêm regiões funcionais para a regulação dess canal.
O sítio de ligação de nucleotídeos cíclicos, isto é, AMPc e GMPc, está
localizado na região C terminal e, o sítio de ligação ao íon Ca
++
, bem como
34
o sítio de ligação ao cálcio-calmodulina, localizado na região N terminal da
estrutura proteína do CNGA-1.
No entanto, estudos não demonstraram ainda se a proteína do canal
de sódio CNGA-1 está expressa ao logo das membranas das células dos
néfrons dos rins. Mais recentemente, estudos realizados em rins de ratos
submetidos a dietas hipo e hipersódicas demonstraram que a isoforma do
canal de sódio CNG-A3 estão expressas nas membranas luminais das
células da alça ascendente espessa de Henle e nas células do ducto coletor
cortical, sendo moduladas pela ação da aldosterona, participando da
reabsorção de Na
+
ao longo dos néfrons desses animais (Noivara et al.,
2004). Contudo, ainda nenhum estudo foi realizado com a proteína do
canal de sódio CNG-1A em tecido renal para determinar a sua
localização e sua função, isto é, a localização da expressão de sua
protéica em qual segmento tubular do néfron, bem como a possível
função destes canais nesse epitélio tubular, assim como, investigar a
influência dos esteróides femininos em sua modulação.
35
OBJETIVOS
36
Objetivos gerais
Investigar a ação dos hormônios sexuais femininos, de forma isolada,
sobre a função renal, por meio da avaliação das alterações na expressão da
proteína da Na
+
-K
+
-ATPase e do canal de sódio CNGA-1 renais.
Objetivos específicos
-Verificar o efeito da deficiência do estrogênio e da progesterona, de
forma isolada, sobre a expressão da proteína e da atividade da Na
+
-K
+
-ATPase
no córtex e na medula renais, bem como a expressão da proteína do canal de
sódio CNGA-1.
-Verificar o efeito da deficiência do estrogênio e da progesterona, de
forma isolada, sobre a expressão da proteína e da atividade da Na
+
-K
+
-ATPase
no córtex e na medula renais.
-Verificar o efeito da deficiência do estrogênio e da progesterona, de
forma isolada, sobre a expressão da proteína do canal de sódio CNGA-1 no
córtex e na medula renais.
37
-Verificar o efeito do estrogênio sobre a expressão da proteína e da
atividade da Na
+
-K
+
-ATPase em cultura de células de túbulo proximais de
ratos.
-Verificar o efeito do estrogênio sobre a expressão da proteína do canal
de sódio CNGA-1 em cultura de células de túbulo proximais de ratos.
-Verificar a localização da expressão da proteína do canal de sódio
CNGA-1 ao longo do néfron de ratas controle.
38
MATERAIS E MÉTODOS
39
1- Animais experimentais
Foram utilizadas ratas adultas da linhagem Wistar (Ratus novergicus
albinus) com peso variando entre 200–250 g, provenientes e mantidas pelo
biotério do Laboratório de Fisiologia Celular e Molecular do Programa de Pós-
Graduação do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ, RJ, Brasil.
Neste experimento os animais foram mantidos em gaiolas, em ambiente com
temperatura (20-24ºC) e iluminação artificiais controladas de acordo com o
recomendado para biotérios de pesquisa (FINEP). As gaiolas permitiram o livre
acesso dos animais à ingestão de água e ração.
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia de
quetamina (30 mg/kg, via intraperitonial) e xilazina (3 mg/kg, via intraperitonial)
e, ao término da cirurgia receberam antibiótico (Enrofloxacina 25mg/ml), por via
intramuscular. Os animais foram pesados no inicio e no final dos tratamentos.
2- Grupos experimentais
Os animais foram separados, pesados e divididos nos seguintes
grupos experimentais:
♦ grupo controle-SHAM (CON,n=4);
♦ grupo ovariectomizado (OVX, n=12);
40
Após a cirurgia, os animais foram mantidos em gaiolas individuais e
tiveram 10 dias para sua recuperação. No décimo dia, o grupo ovariectomizado
foi separado em três subgrupos, isto é, um somente ovariectomizado, um com
reposição estrogênica e o outro, com reposição progestogênica. De maneira
que no final do décimo dia, os grupos experimentais foram os seguintes:
♦ grupo controle-SHAM (CON,n=4);
♦ grupo ovariectomizado (OVX, n=4);
♦ grupo OVX+ estrogênio (OVE, n=4);
♦ grupo OVX+ progesterona (OVP, n=4);
3. Protocolos experimentais
•
Ovariectomia bilateral
Após a anestesia, as fêmeas foram submetidas a uma incisão de 1 a
1,5 cm na pele e celular subcutâneo, entre a última costela e a coxa, a 1 cm
da linha mediana, seguida de uma incisão na camada muscular, abrindo a
cavidade peritoneal para posterior ligadura das tubas uterina e remoção dos
ovários, de acordo com Moyses et al., 2001. Depois a cavidade peritonial foi
suturada e a região limpa com gaze e a pele fechada com linha de nailon
preta.
•
Reposição hormonal
No final do décimo dia de recuperação iniciou-se a reposição com os
hormônios sexuais femininos de forma isolada, com o 17-β-estradiol (OVE,
41
2µg/Kg peso corporal, Sigma, St. Louis, Mo., USA) e com o progesterona
(OVP, 1,7mg/Kg peso corporal, Sigma, St. Louis, Mo., USA), de acordo com
Moyses et al., 2001. Esses hormônios foram diluídos em óleo de milho filtrado
(veículo) e, administrados nos animais através de injeções subcutâneas diárias
em mesmos horários, por 10 dias consecutivos. Assim, no final o experimento,
o grupo OVX foi exposto à ovariectomia por 20 dias.
•
Análise dos parâmetros sanguíneos e urinários (Função
renal)
No décimo dia da reposição hormonal, os animais foram colocados em
gaiolas metabólicas individuais (Insight), em que se analisaram os parâmetros
urinários e sanguíneos, de acordo com Ornellas et al, 2002 e, Noivara et al.,
2003. Para tanto, foram coletadas amostras de urina e de sangue, no período
de 24h, no momento do sacrifício de cada grupo experimental. Com essas
amostras coletadas foram dosadas as concentrações plasmáticas e urinárias
de potássio (K
+
), sódio (Na
+
), cloreto (Cl
-
), uréia (U) e creatinina (Cr), para
calcularmos o ritmo de filtração glomerular (RFG) e a fração de excreção (FE)
de cada um deles, de acordo com as seguintes fórmulas:
FE(%)=[(U
x
×V)/(GFR×P
x
)]×100 and, RFG=(U
cr
×V)/P
cr
), em que Ux,
concentração urinária do eletrólito (mg/ml), Px, concentração plasmática do
eletrólito (mg/ml), Ucr, concentração urinária de creatinina (mg/ml), Pcr,
concentração plasmática de creatinina (mg/ml) e V, fluxo urinário (ml×min
−1
).
•
Dosagem Hormonal
42
Após a avaliação da função renal, parte do plasma coletado foi utilizada
para a dosagem sérica de estrogênio (pg/mL) e de progesterona (ng/mL) por
quimiluminescência, avaliando a eficácia da ovariectomia bilateral e da
reposição hormonal dos grupos analisados, de acordo com Eckert, 1999.
•
Excisão Renal
Todos os animais utilizados nesta tese foram sacrificados por eutanásia,
com doses elevadas de anestésicos (quetamina e xilazina), cerca de três vezes
mais, que o mínimo para sua anestesia, e submetidos à laparotomia para
excisão do rim esquerdo e direito. Inicialmente os rins foram perfundidos com
20 ml de solução salina 0,9% com auxílio de um cateter de polietileno (PE-50)
inserido na aorta abdominal. Depois de removido, os rins foram decapsulados
manualmente e colocado em uma placa de Pétri estéril, sobre gelo, contendo
solução salina. Nesse momento foi realizada identificação do córtex e da
medula renais, utilizando uma lupa. A dissecação foi realizada com micrótomo,
e imediatamente iniciou-se o procedimento de extração de proteína total e de
membrana dos mesmos.
4. Immunoblotting (Western blotting)
Com o intuito de determinar a expressão da proteína codificadora da
Na
+
-K
+
-ATPase e do canal de sódio CNGA-1 em córtex e medula de ratas
utilizamos a técnica de Western blotting.A expressão da proteína da Na
+
-K
+
-
ATPase e do canal de sódio CNGA-1 em córtex e medula de ratas controle,
submetidos à ovariectomia bilateral e à reposição hormonal foram
43
comparadas por immunoblotting. Utilizamos anticorpos específicos para as
proteínas dos referidos genes. No caso da proteína da Na
+
-K
+
-ATPase foi
utilizada um peptídeo sintético que reconhece especificamente a sua
subunidade alfa 1 (Amersham, Buckinghamshyre, UK). Para o canal de
sódio CNGA-1 foi utilizado um anticorpo de policlonal coelho anti-CNGA-1
que reconhece o domínio N-terminal do CNGA-1 (Alpha Diagnostic
International, San Antonio, TX, USA) como descrito por Ding et al., 1997.
Utilizamos a expressão da proteína β-actina para nosso controle interno,
tanto na expressão da proteína da bomba, quanto na expressão da proteína
do canal, e para analisar a sua expressão, foi utilizado um anticorpo
monoclonal rato anti-β-actin (Novus Biologicals, Littleton, CO 80160, USA).
O córtex e a medula das ratas foram homogeneizados em uma solução
contendo 250 mmol/l de sacarose, 1 mmol/l EDTA, 20 mmol/l de imidazol,
pH 7.2, e os seguintes inibidores de protease: 1 mmol/l 4-(2-aminoetil)-
benzosulfonila fluorado, 1 mmol de benzamida, 10 mg/l de leupeptina, 1 mg/l
pepstatina A, 1 mg/l aprotinina, e 1 mg/l de quimiostatina. O homogenato foi
centrifugado a 1000g por 10min. O sobrenadante foi retirado, e o pellet foi
suspenso em três volumes da mesma solução, e a centrifugação foi
repetida. Ambos os sobrenadantes foram centrifugados a 10.000g por 20
min para separação da fração mitocondrial e o sobrenadante contendo a
proteína total e a concentração das proteínas foi obtida utilizando-se o
reagente de Bradford, e a albumina bovina usada como padrão (Bradford,
1976). O sobrenadante formado foi centrifugado a 100.000 g por 1 h, e o
pellet contendo as membranas celulares foi suspenso em tampão de
homogeneização e a concentração das proteínas foi obtida utilizando-se o
44
reagente de Bradford, e a albumina bovina usada como padrão (Bradford,
1976). Os extratos foram solubilizados aquecendo a 95°C por 2 min em
solução tampão (15 g/l SDS, 10 mmol/l Tris-Cl pH 6.8, 6 g/l DTT, e 60 ml/l de
glicerol). As proteínas (100µg para Na
+
-K
+
-ATPase e canal de sódio CNGA-
1) foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida e transferidas
para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, CA).
Após a transferência, as membranas foram bloqueadas com tampão
salino (TBS-T) contendo 5% de caseína (136,8 mmolL NaCl; 74,5 mmolL
KCl; 24,8 mmolL Tris base; pH 7,4; 0,5% (V/V) T233n 20; 50g/l leite em pó
desnatado) (Sambrook et al, 1989) e incubadas ou com anticorpo contra a
proteína da Na
+
-K
+
-ATPase e do canal de sódio CNGA-1 na diluição de
1:500 por 1 hora à temperatura ambiente em tampão TBS-T 3% de caseína
(136,8 mmol/L NaCl; 74,5 mmol/L KCl; 24,8 mmol/L Tris base; pH = 7,4;
0,5% (V/V) T233n 20; 30g/l leite em pó desnatado) (Sambrook et al, 1989).
Incubações seqüenciais foram realizadas utilizando anticorpos secundários
específicos para os anticorpos primários, no caso Na
+
-K
+
-ATPase e canal de
sódio CNGA-1, o anticorpo secundário utilizado foi o goat anti-mouse IgG e
goat anti-rabbit IgG, respectivamente. A revelação do imunoblotting da Na
+
-
K
+
-ATPase foi realizada com ECL Plus (Amersham, Buckinghamshyre, UK)
e do canal de sódio CNGA-1 com a fosfatase alcalina. Utilizamos o padrão
de peso molecular de proteína (Sigma Chemical, St. Louis, MO) para
assegurar uma eletroforese e uma transferência de proteínas adequadas.
5. Medida da atividade ATPásica
Com o intuito de associar a expressão da proteína codificadora Na
+
-K
+
-
45
ATPase com a sua funcionalidade enzimática foi realizada a quantificação
de sua atividade (Na
+
+K
+
) ATPásica.Para tanto, após a homogeinação do
tecido renal dissecado (córtex e medula), alíquotas foram retiradas para a
mensuração da atividade (Na
+
+K
+
) ATPásica em cada grupo experimental.
A composição do meio de reação para medir a atividade (Na
+
+K
+
)
ATPásica, em volume final de 0,1ml, foi: MgCl
2
10mM, ATP 5mM (atividade
específica de aproximadamente 10
4
Bq/nmol), 20mM Hepes-Tris (pH= 7,0),
NaCl 90mM, e KCl 30mM.
A atividade ATPásica foi medida pelo método descrito por Grubmeyer
e Penefsky (1981). A reação foi iniciada com a adição da fração
microssomal de córtex e de medula renais de rata (concentração final de
proteína: 0,3mg/ml). A reação foi parada após 20 minutos pela adição de
0,5ml de carvão ativo por HCl (0,1N). O [
32
P]Pi liberado foi medido em
alíquotas do sobrenadante, obtidas após a centrifugação da suspensão de
carvão a 2000 rpm, por 5 minutos em centrífuga clínica. A radioatividade foi
determinada por cintilação líquida (packard Tri-Carb 2100 TR).
O cálculo da atividade Na
+
-K
+
-ATPásica foi obtido pela diferença de
[
32
P]Pi liberado na ausência e na presença de ouabaína 0,1mM (inibidor
específico da Na
+
-K
+
-ATPase), (Osswad et al., 1978; Vallon 2003; Proverbio
et al., 1986). A concentração de proteína foi determinada pelo método de
Bradford (Bradford 1956), usando albumina sérica bovina como padrão.
Cada experimento foi realizado com no mínimo quatro preparações distintas
de fração microssomal de córtex e da medula desses animais.
46
6. Densitometria
Para quantificar a expressão da proteína codificadora da Na
+
-K
+
-ATPase
e do canal de sódio CNGA-1 foi realizada a densitometria de suas bandas
correspondentes, após a revelação nas diferentes situações descritas, com
a utilização de programa de análise computacional (Scion Image
corporation, gel analysing software, USA). Os valores obtidos para o gene
da Na
+
-K
+
-ATPase e do canal de sódio CNGA-1 foram padronizados com o
controle interno da β-Actina .
7. Immunohistoquímica (Imunofluorescência)
Para determinar a localização da proteína do canal de sódio CNGA-1 foi
realizada a técnica de imunohistoquímica do tipo fluorescência. Nesse
protocolo, esperamos encontrar o segmento tubular, bem como sua posição
luminal ou basolateral ao longo do néfron. Para isso, após a anestesia, os
rins foram obtidos de ratas fêmeas adultas controles após a perfusão com
solução salina 0.9% heparinizada (1 mL/500mL) e com solução de
paraformaldeído tamponado 4%. Os rins foram extirpados, isolados,
coletados, decapsulados, cortados em cortes transversais, criopreservados
em soluções crescentes de sacarose (10, 20 e 30%) e congelados a -70ºC.
Cortes de 6 µm foram obtidos e fixados em acetona gelada por 5 minutos.
Após a fixação dos cortes nas lâminas, elas foram lavadas rapidamente em
tampão salino-fosfato 0,01M (PBS), pH 7.4, e incubadas em câmara úmida
com solução de bloqueio contendo albumina sérica bovina (BSA) 5%, soro
normal de cabra 3% em PBS 0.01M pH 7.4 por 1 h em temperatura
ambiente, seguida de soluções de avidina e de biotina (Vector biotin
47
blocking kit, SP-2001, Vector Laboratories INC., Burlingame, CA, USA) de
acordo com instruções do fabricante. Posteriormente, os cortes foram
incubados com anticorpo primário (rabbit anti-CNGA-1, Sigma
Immunochemicals , St Louis, USA, diluído: 1:20 em PBS contento BSA 3%,
Triton X-100 0.1% e Tween 20 0.05%), “overnight” em 4°C. No dia seguinte,
os cortes foram lavados três vezes de 5 minutos em PBS em temperatura
ambiente e foram incubados com anticorpo goat anti-rabbit IgG conjugado a
um Alexa 586 (A11010, Molecular Probes, USA; diluição: 1: 200 Carlsbad,
California) em PBS por 1 h em temperatura ambiente. Para a marcação da
porção tubular do néfron em que se localiza a proteína do canal de sódio
CNGA-1, utilizamos a lectina biotinilada Dilochus biflorus lectin (DBA) que
reage especificamente com a região do túbulo proximal convoluto e do
ducto coletor (Zolotnitskaya Anna, and Lisa M. Satlin, 1999) e lectina
biotinilada Arachis hypogaea (PNA) que reage especificamente com a
região do túbulo coletor distal e do ducto coletor (Shepard M et al., 2002),
na concentração de 15 µg/mL (DBA- B-1035; PNA – BA-2301-2, Vector
Laboratories) por 2h em temperatura ambiente. Em seguida, os cortes
foram lavados em PBS e incubados com estreptavidina conjugada a FITC
(SA-1001, Caltag, Burlingame, CA, USA; diluição: 1:100) por 1h em
temperatura ambiente. Os cortes foram lavados três vezes de 5 minutos em
PBS em temperatura ambiente e, incubados com DAPI (diluição: 1 µg/ 100
µL) para a marcação nuclear, e montada em lâminas de fluorescência com
Vectashield (H-1000, Vector Laboratories). As imagens foram adquiridas
usando microscópio de fluorescência Nikon E-800 equipado com a câmera
Evolution VF (MediaCybernectis). Todas as resoluções, filtragens,
48
movimentação e aquisição das imagens dos cortes renais obtidas foram
controladas e filtradas pelo programa ImagePro Plus (Media Cybernetics,
Silver Spring, MD, USA).
8. Cultura de células imortalizadas de túbulos proximais
Nos protocolos de quantificação funcional do canal sódio CNGA-1
(expressão da proteína) e da enzima Na
+
-K
+
-ATPase (expressão da
proteína e medida da atividade) foram utilizados tecidos renais extraídos
dos animais após seu respectivo tratamento hormonal. Com o intuito de
analisar, de forma isolada, as ações do estrogênio sobre a funcionalidade
desses carreadores iônicos de sódio utilizaram um protocolo experimental
de cultura celular (in vitro) com células de túbulos proximais imortalizadas
(IRPTC) fornecidas pela Dra Mello-Aires (Renal Biophysics Laboratory of
the Biomedical Science Institute in University of São Paulo, Brazil). As
células IRPTC foram mantidas no meio DMEM (Dulbecco’s modified
Eagle’s) complementadas com soro bovino fetal 10% (Gibco BRL, Grand
Island, N.Y., USA), glicose 25 mM, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml e
streptomicina 100 µg/ml (Gibco BRL, N.Y., USA). Após atingirem 90% de
confluência, elas foram incubadas com o meio DMEM sem o soro fetal
bovino por 16 h, e tratadas com 17-β-estradiol nas diferentes concentrações
de 10
–11
M, 10
–10
M, 10
–9
M, 10
–8
M e 10
–7
M por 24h. Posteriormente, foi
realizada a extração e a quantificação da proteína total dessas células
IRPTC (forma similar descrita no item 4. Immunoblotting) para analisar a
expressão da proteína do canal de sódio CNGA-1. Além disso, analisamos
também a expressão da proteína e a atividade ATPásica (forma similar
49
descrita no item 5. Medida da atividade ATPásica) nos mesmos
tratamentos.
9. Análise Estatística
Os resultados encontrados foram apresentados como média ± EPM (erro
padrão da média). Para análise dos experimentos com quatro grupos de
animais foi realizado o teste ANOVA, uma via, seguido pelo teste de
múltiplas comparações Student-Newman Keuls. A diferença foi aceita como
significativa quando *p<0.05. Utilizamos o programa estatístico GraphPad
Prism, 2003.
50
RESULTADOS
51
Na avaliação da reposição hormonal com estrogênio e com
progesterona (TABELA 1), observamos que grupo ovariectomizado (OVX),
que recebeu o óleo de milho como veículo, apresentou uma redução
significante nas concentrações plasmáticas de estrogênio e de
progesterona, 31±3,0 ng/mL e 9,3±3,1 pg/mL (TABELA 1, p<0.01),
respectivamente, quando comparado ao grupo controle (C, estrogênio:
98±12 pg/mL; progesterona: 18±2,8 ng/mL). Após o 10º dia de ovariectomia,
o grupo ovariectomizado que foi subdividido em grupo ovariectomizado
reposto com benzoato de 17b-estradiol (OVE), apresentou uma
concentração sérica de estrogênio de 110±5,8 pg/mL. Esse valor não foi
estatisticamente diferente do grupo controle (C, 98±12 pg/mL) Já o grupo
ovariectomizado que foi reposto com progesterona (OVP) apresentou uma
concentração sérica de progesterona de 16±0,7 ng/mL. Esses valores não
foram estatisticamente diferentes do grupo controle (C, 18±2,8 ng/mL). O
grupo OVE e o grupo OVP apresentaram valores hormonais maiores que o
grupo OVX, após sua respectiva reposição hormonal.
TABELA 1. Concentrações séricas de estrogênio e de progesterona.
Grupos
C (n=4)
OVX(n=4) OVE (n=4) OVP (n=4)
E
2 (pg/mL)
98±12.0
31±3.0**
110±5.8##
32±0.9**
P
4(ng/mL)
18±2.8
9.3±3.1**
10±0.8**
16±0.7##
Valores expressos como média±EPM. ** p<0,01 vs C. ## p<0,01 vs Ovx
Após o 10
o
dia de tratamento com benzoato de 17b-estradiol e com
progesterona
, e, na tentativa de averiguar os efeitos de cada um desses
52
hormônios nos parâmetros renais, como a fração de excreção (FE), fluxo
urinário, ritmo de filtração glomerular e osmolaridade urinária, que estão
representados na TABELA 2. Observamos que a FE do Na+ e do Cl-
aumentaram significativamente no grupo ovariectomizado (FE
Na+
: 0,21±02,
p<0.01; FE
Cl-
: 0,61±09, p<0.05), quando comparado ao grupo controle. A
reposição com benzoato de 17b-estradiol e com progesterona diminuíram
esses valores, apresentado resultados similares aos do grupo controle
(FE
Na+
: 0,12±0,01; FE
Cl-
: 0,41±0,19). A FE do K+, embora não tenha
apresentado uma diferença significativa após a ovariectomia (24,2±1,2), vs
o grupo controle (25,3±3.0), diminuiu após a reposição com benzoato de
17b-estradiol (10,3±1.2, p<0.01) e com progesterona (11,6±1.2, p<0.01) de
forma isolada vs grupo controle (25,3±3.0). O fluxo urinário
(0.004±0.002mL/min, p<0.01) e a ingestão hídrica (7,7±1.4mL/dia, p<0.05)
diminuíram no grupo ovariectomizado vs o grupo controle
(0.01±0.001mL/min; 15,6±1.8mL/dia). A reposição hormonal aumentou
esses parâmetros, apresentando resultados similares aos do grupo controle,
isto é, com benzoato de 17b-estradiol (fluxo urinário: 0.009±0.002mL/min;
ingestão hídrica: 24,4±3,1mL/dia) e com progesterona (0.013±0.001mL/min;
ingestão hídrica: 24,5±6,5mL/dia).
Os valores do ritmo de filtração glomerular, da FE da uréia, da
osmolaridade urinária e do peso corporal não apresentaram mudanças
significantes em relação aos do grupo controle (TABELA 2).
Ao analisarmos a influência da ovariectomia e da reposição hormonal
com benzoato de 17b-estradiol e com progesterona, de forma isolada,
53
TABELA 2. Valores de FE de Na+, K+, Cl- e Uréia, fluxo urinário, RFG, ingestão
hídrica e peso corporal, dos grupos controle (C), ovariectomizado (OVX),
ovariectomizado reposto com estradiol (OVE) e reposto com progesterona (OVP) ,
por 10 dias
Grupos
C (n=4) OVX (n=4) OVE (n=4)
OVP (n=4)
FE Na
+
(%)
0,12±0,01
0,21±0,02**
0,12±0,01
0,11±0,02
FE K
+
(%)
25,3±3,0
24,2±1,2
10,3±1,2***
11,6±1,2**
FE Cl
-
(%)
0,41±0,01
0,61±0,01*
0,35±0,08
0,45±0,05
FE Urea (%)
0,69±0,09
0,64±0,09
0,58±0,19
0,41±0,07
Fluxo Urinário
(mL/min)
0,01±0,001
0,004±0,002**
0,009±0,002
0,013±0,001
Osmolaridade
(mOsm/L)
1544±172
1716±129
1234±159
1332±142
GFR (mL/min)
1,7±0,4
1,5±0,2
1,7±0,4
2,1±0,04
Ingestão Hídrica
(mL/day)
15,6±1,8
7,7±1,4*
24,4±3,1
24,5±6,5
Peso Corporal (g)
209±6,0
231±2,4
214±9,0
214±11,0
Valores expressos como média±EPM. . * p<0,05; ** p<0,01 vs do grupo controle.
sobre a expressão da proteína e sobre a atividade da Na
+
-K
+
-ATPase em
rins de ratas, encontramos resultados que demonstram que a ovariectomia
bilateral diminuiu significativamente a expressão da proteína da Na
+
-K
+
-
ATPase em 30% no homogenato celular (Figura 1 A, p<0,01) e em 44% na
fração microsomal (Figura 1B, p<0.01) no córtex renal desses animais,
respectivamente. Fato que também foi corroborado com a redução na
atividade desta enzima na fração microsomal, do córtex renal desses animais
em cerca de 50% (Figura 1C, p<0.05). A reposição com
benzoato
54
Figura 1.Modulação da expressão da proteína e atividade Na
+
-K
+
-ATPase em rins de ratas sob
diferentes condições. A e B representam, respectivamente, o immunoblot para α
1
-Na
+
-K
+
-
ATPase na preparação total e microssomal de proteína do córtex renal de animais controle (C,
lane 1), ovariectomizado (OVX, lane 2), ovariectomizado reposto com benzoato de 17b-
estradiol (OVE, lane 3) e ovariectomizado reposto progesterona (OVP, lane 4). 100 mg de
proteína foram colocadas em cada lane. C, representa a atividade da fração microssomal da
Na
+
-K
+
-ATPase do córtex renal. D e E representam, respectivamente, o immunoblot para α
1
-
Na
+
-K
+
-ATPase na preparação total e microssomal de proteína extraídas da medula renal. F,
representa a atividade da fração microssomal da Na
+
-K
+
-ATPase da medula renal. Os
resultados foram expressos como média± EPM (n=4). *P<0.05 vs Controle.
C OVX OVE OVP
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
***
Valores Densitométricos
Arbitrários
α1- Na-K-ATPase
β- Actina
110 kDa
42 kDa
C OVX OVE OVP
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
***
**
Valores Densitométricos
Arbitrários
α1-Na-K-ATPase
110 kDa
42 kDa
A
B
(Na
+
+K
+
)ATPase activity
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
10
20
30
OVX
OVE O VP
-
*
medula total bomba
CON OVX OVE OVP
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
1,06±0,03
1,20±0,11
1,16±0,23
Valores Densitométricos
Arbitrários
C
110 kDa
42 kDa
α1- Na-K-ATPase
D
β
-
Actin
a
C OVX OVE OVP
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Valores Densitométricos
Arbitrários
E
β- Actina
42 kDa
110 kDa
medula mem brana
Atividade (Na
+
+K
+
)ATPásica
(nmol Pi x mg
-1
x min
-1
)
0
20
40
60
OVX
OVE OVP
-
F
α1- Na-K-ATPase
β
-
Actin
a
55
.17b-estradiol por 10 dias consecutivos aumentou sua expressão protéica a
um valor similar ao do grupo controle, na preparação do homogenato celular
(Figura 1A). Já sua expressão na fração de membrana, observamos um
aumento de 30% em relação ao grupo controle (p<0,01).
Sugerindo, uma ação estrogênica mais efetiva na fração de membrana
funcional das células do córtex renal desses animais. Na medida da
atividade da Na
+
-K
+
-ATPase na fração de membrana, observamos que após
a reposição com benzoato de 17b-estradiol, houve um aumento nesses
valores, apresentando resultados similares aos do grupo controle (Figura
1C).
A reposição com progesterona aumentou expressão da proteína da
Na
+
-K
+
-ATPase a valores similares aos do grupo controle, tanto na
preparação de homogenato celular (Figura 1A), quanto na preparação da
fração de microsomal (Figura 1B) desses animais. Esse mesmo padrão de
resposta foi encontrado nos resultados da medida da atividade da Na
+
-K
+
-
ATPase, a reposição com progesterona normalizou seus valores, ficando
similares ao grupo controle (Figura 1C).
Já na preparação do homogenato celular (Figura 1D), da fração
microsomal (Figura 1E) e na medida da atividade da Na
+
-K
+
-ATPase
(Figura 1F) da região medular desses animais não encontramos diferença
significativa entre na função da Na
+
-K
+
-ATPase.
Com esses resultados, evidenciamos a influência da ovariectomia
bilateral e da reposição hormonal, em especial com benzoato de 17b-
estradiol na modulação da expressão protéica e na atividade da Na
+
-K
+
-
ATPase no córtex renal de ratas em idade reprodutiva. Contudo, esses
56
resultados não apresentaram o mesmo padrão de resposta na medula renal
desses animais, isto é, não apresentaram diferença significativa em relação
Figura. 2. Expressão da proteína do canal de sódio CNGA-1 em rins de ratas sob diferentes
condições. A e B representam o immunoblot para canal de sódio CNGA-1 na preparação
micossomal e total de proteína, respectivamente, de córtex renal de animais controle (C, lane
1), ovariectomizado (OVX, lane 2), ovariectomizado reposto com benzoato de 17b-estradiol
(OVE, lane 3) e ovariectomizado reposto progesterona (OVP, lane 4). 100 mg de proteína foi
colocada em cada lane. Os resultados foram expressos como média± EPM (n=4). *P<0.05 vs
Controle.
C OVX OVE OVP
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
**
*
V alo r e s D en sitom étrico s
A r bitr á r io s
A
CNG
A
-
1
80 kDa
β
-
actin
a
42 kDa
B
C OVX OVE OVP
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
*
*
Valores Densitom étricos
Arbitrários
CNG
A
-
1
80 kDa
β
-
actin
a
42 kDa
C OVX OVE OVP
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Valores Densitométricos
Arbitrários
C
CNG
A
-
1
80 kDa
β
-
actin
a
42 kDa
D
C OVX OVE OVP
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Valores Densitométricos
Arbitrários
CNG
A
-
1
β
-
actin
a
80 kDa
42 kDa
57
ao grupo controle.
Outro carreador de sódio que é foco de nosso estudo é o canal de
sódio CNGA-1. Após a ovariectomia bilateral, observamos que expressão
de sua proteína diminui significativamente em 30% na preparação do
homogenato celular (Figura 2A, p<0,01) e em 42% na preparação da fração
microsomal (Figura 2B, p<0.05) no córtex renal desses animais,
respectivamente. A reposição hormonal com benzoato de 17b-estradiol
aumentou a expressão da proteína desse canal de sódio a um valor similar
ao do grupo controle na preparação da fração microsomal (Figura 2B).
Contudo, observamos um aumento significante na preparação do
homogenato das células dos córtices renais desses animais. Fato que foi
evidenciado em um aumento de 25% de sua expressão protéica (Figura 2A,
p<0.05). Já a reposição com a progesterona não influenciou de forma
significativa na expressão da proteína do canal CNGA-1 na preparação do
homogenato celular vs grupo controle (Figura 2A).
Apesar disso, encontramos uma modulação negativa significativa de
33% deste hormônio na fração microsomal do córtex renal dessas ratas, em
relação ao grupo controle (Figura 2B, p<0.05).
Com esses dados, sugerimos que a ação da ovariectomia bilateral e
da reposição com o benzoato de 17b-estradiol na expressão da proteína do
canal de sódio CNGA-1 apresentaram um padrão de resposta similar
observada na expressão da proteína/ atividade da Na
+
-K
+
-ATPase em
córtex renais de ratas férteis. Isso também foi observado na modulação do
canal de sódio CNGA-1 na medula renal dessas ratas, isto é, a ovariectomia
bilateral, a reposição com
benzoato de 17b-estradiol e com a progesterona
58
não influenciaram de forma significativa na expressão da proteína desse
canal de sódio e na expressão da proteína/ atividade da Na
+
-K
+
-ATPase, na
preparação do homogenato celular e na fração microsomal. Evidenciando
uma ação diferenciada do estrogênio no córtex desses animais.
Como encontramos em nossos resultados uma modulação da função
(expressão da proteína e da atividade) da Na
+
-K
+
-ATPase e do canal de
sódio CNGA-1 apenas no córtex renal de ratas submetidas à ovariectomia e
à reposição hormonal com benzoato de 17b-estradiol, hipotetizamos que
essa modulação também ocorra de forma isolada, sem a influência de
outros fatores humorais.
Assim, analisamos a expressão da proteína do canal de sódio CNGA-
1 em cultura de células imortalizadas de túbulo proximal de ratos (IRPTC)
submetida ao tratamento com concentrações crescentes de benzoato de
17b-estradiol por 24h. O tratamento nas doses de 10
-11
M, 10
-10
M, 10
-9
M, 10
-
8
M e 10
-7
M ocasionaram um aumento na expressão da proteína de 70%,
80%, 80%, 90% e 110%, respectivamente, quando comparado ao grupo
controle (Figura 3).
Já a expressão da proteína e a atividade da Na
+
-K
+
-ATPase em
cultura celular de células IRPTC, com o mesmo protocolo de tratamento
descrito acima (24h), com doses crescentes de benzoato de 17b-estradiol,
observamos que as concentrações de 10
-11
M e de 10
-10
M de benzoato de
17b-estradiol não apresentaram modificações significativas na expressão da
proteína (homogenato celular, Figura 4A) e na atividade da Na
+
-K
+
-ATPase
(Figura 4B). Contudo, nas concentrações de 10
-9
M, 10
-8
M e 10
-7
M
de benzo-
59
Figura 3. Efeito de diferentes concentrações de benzoato de 17b-estradiol na expressão da
proteína do canal de sódio CNGA-1 em cultura celular de células IRPT (túbulo proximal de
ratos) sob diferentes condições. O immunoblot para CNGA-1 na preparação de proteína total
para as células controle (C, lane 1), com apenas o veículo (V, lane 2), tratadas com benzoato
de 17b-estradiol a 10
-11M
(-11M, lane 3), a 10
-10 M
(-10M, lane 4), a 10
-9 M
(-9 M, lane 5), a 10
-8 M
(-8 M, lane 6) e a 10
-7 M
(-7 M, lane 7). 100 mg de proteína foi colocada em cada lane. Os
resultados foram expressos como média± EPM (n=4). **P<0.01 e **P<0.001 vs Controle.
ato de 17b-estradiol encontramos um aumento na expressão de sua proteína
de 32,5%, 30% e 120%, respectivamente (Figura 4A). Esse aumento na
expressão da proteína, foi corroborado com um aumento na atividade da Na
+
-
K
+
-ATPase, isto é, o tratamento com as concentrações de 10
-9
M, 10
-8
M e 10
-
7
M, apresentaram um aumento de 150%, 140% e130%, respectivamente
(Figura 4B)
C V -11M -10M -9M -8M -7M
0
1
2
3
4
**
**
**
**
***
Valores Densitométricos
Arbitrários
CNG
A
-
1
80 kDa
42 kDa
β
-
actin
a
60
Figura 4. Efeito de diferentes concentrações de benzoato de 17b-estradiol na modulação da
expressão da proteína e da atividade da Na
+
-K
+
-ATPase em cultura celular de células IRPT
(túbulo proximal de ratos) sob diferentes condições. A e B representam o immunoblot e a
atividade, respectivamente, para α
1
-Na
+
-K
+
-ATPase na preparação de proteína total extraídas
de células controle (C, lane 1), com apenas o veículo (V, lane 2), tratadas com benzoato de
17b-estradiol a 10
-11M
(-11M, lane 3), a 10
-10 M
(-10M, lane 4), a 10
-9 M
(-9 M, lane 5), a 10
-8 M
(-8
M, lane 6) e a 10
-7 M
(-7 M, lane 7). 100 mg de proteína foi colocada em cada lane. Os
resultados foram expressos como média± EPM (n=4). *P<0.05 vs Controle.
C V -11M -10M -9M -8M -7M
0
1
2
3
4
***
*
*
Valores Densitométricos
Arbitrários
A
-log [estrogênio], M
11 10 9 8 7
Atividade (Na
+
+K
+
)ATPásica
(% do controle)
0
100
200
300
B
β- Actina
110 kDa
42 kDa
α1- Na-K-ATPase
*
*
*
61
E por fim, realizamos o protocolo de imunofluorescência para a
localização da proteína do canal de sódio CNGA-1 ao longo do néfron de
animais controle, localizando, com marcações específicas, em qual
segmento tubular e em qual porção da membrana tubular ele seria
expresso.
Observamos que ele é expresso na membrana basolateral, em que
foi incubado com anticorpo anti-CNGA-1 e revelado em vermelho (Figura
5A). Ao utilizarmos uma marcação de túbulo proximal com a Lectina DBA,
revelada em verde, observamos a localização da marcação porção da
membrana luminal (Figura 5B).
Evidenciamos com a sobreposição das imagens, o mergê, que o
canal de sódio CNGA-1 é expresso na porção basal do túbulo proximal
(Figura 5C). Esse mesmo padrão de localização foi encontrado no túbulo
distal, isto é, a proteína do canal CNGA-1 é expressa na porção basal,
revelado em vermelho (Figura 5D). Realizando a marcação do túbulo distal
com a lectina PNA, revelado em verde (Figura 5E) e a colocalização da
imagem, evidenciando sua localização na porção basal no túbulo distal
(Figura 5F).
Não encontramos reação imunofluorescente positiva na região medular
desses animais. Sugerindo assim, uma maior evidência histoquímica na
região cortical do néfron desses animais.
62
Figura 5. Imunolocalização do canal de sódio CNGA-1 no túbulo distal e proximal do
néfron. (A) CNG1 é revelado com o anticorpo primário policlonal de coelho a seguido a
um anticorpo secundário conjugado ao ALEXA 586. A sua imunoexpressão está
presente na região basal (vermelho). (B) Lectina biotilinada DBA seguida da
estreptavidina conjugada a FITC, revelada na membrana luminal do túbulo proximal
conectivo (verde). (C) Sobreposição – CNGA-1 reveledo pelo ALEXA 586 (vermelho)
na membrana basolateral túbulo proximal conectivo, detectado pela lectina DBA
(verde). (D). CNGA-1 imunorevelado na membrana basal do túbulo pelo ALEXA 586
(E). Túbulo distal conectivo identificado pela lectina biotinilada PNA, revelada com a
estreptavidina conjugada a FITC (verde) (F) Sobreposição – CNGA-1 revelado pelo
ALEXA 586 (vermelho) na membrana basolateral túbulo distal conectivo, detectado
pela lectina PNA (verde). Baras: 20 µm.
63
Discussão
64
Neste estudo, verificamos a participação dos hormônios sexuais
femininos na modulação da função da enzima Na
+
-K
+
-ATPAse e do canal de
sódio CNGA-1 em rins de ratas férteis, bem como a possível contribuição e a
localização desse canal na fisiologia dos segmentos tubulares do néfron. Uma
de nossas primeiras observações foi o fato da ovariectomia bilateral aumentar
significativamente os valores da FE do Na
+
e do Cl
-
, afetando diretamente a
função renal, na reabsorção de sódio. A reposição com estrogênio e com
progesterona, de forma isolada, diminuiu esses valores, os tornando similares
aos do grupo controle. Esses resultados foram corroborados pelo trabalho de
Stachenfeld et al., 2005, em que a reposição hormonal por 4 dias diminuía a
massa de Na
+
urinária em mulheres de 20-30 anos submetidas a menopausa
experimental com o antagonista de hormônio liberador de gonadotrofinas. Por
outro lado, demonstramos que o fluxo urinário e a ingestão hídrica diários
foram reduzidos significativamente pela ovariectomia bilateral. O volume
urinário (24h) reduzido está relacionado com a menor ingestão de água por
esses animais. A reposição hormonal aumentou esses valores a resultados
similares aos do grupo controle. O estrogênio aumenta o estímulo para a sede,
como demonstrado por Krause et al., 2003, em que a reposição estrogênica
estimulava a ingestão hídrica das ratas, fato que explicaria a normalização dos
valores de ingestão hídrica após a reposição com estrogênio.
Muitos outros estudos vêm demonstrando a participação dos esteróides
femininos na modulação do fluido extracelular e do equilíbrio de Na
+
corporal
(Brunette and Leclerc, 2001; Gambling et al., 2004; Stachenfeld et al., 2005).
Essa influência no controle hidrossalino pode ocorrer pela modulação na
expressão dos transportadores de eletrólitos em diferentes tecidos corporais.
65
No pulmão, por exemplo, o estrogênio combinado com a progesterona levaram
a um aumento na expressão dos canais epiteliais de sódio amilorida sensíveis
(ENaC) e nos canais de cloreto reguladores da condutância transmembrana da
fibrose cística (CFTR) (Johannesson et al., 2000). Em células epiteliais
glandulares endometriais de cobaias (“guinea-pig”), a progesterona diminuiu a
expressão do RNAm do canal de cloreto CFTR (Mularoni et al., 1995). Já em
células de ducto pancreático humano, após 20 horas de tratamento com a
progesterona, ocorreu um aumento na expressão do RNAm e da proteína do
canal de cloreto CFTR. Resultado que não foi observado após o tratamento
com estrogênio nas mesmas condições (Sweezey et al., 1996). Nas células de
túbulos distais de rins de cães (MDCK), o tratamento com estrogênio aumentou
a expressão do RNAm dos co-transportadores de sódio/ sulfatos (Lee et al.,
2000). Assim, em nosso trabalho, demonstramos que a ovariectomia bilateral
diminui significativamente a expressão da proteína do canal de sódio CNGA-1
em preparação de proteínas de membranas e totais no córtex renal. A
reposição estrogênica normalizou a expressão das proteínas de membranas e
aumentou em 25% a expressão das proteínas totais, respectivamente. Já a
reposição com a progesterona reduziu de forma significativa a expressão da
proteína do canal de sódio CNGA-1 na preparação de proteínas de membranas
e não alterou a expressão do canal na preparação de proteínas totais,
respectivamente, no córtex renal. De maneira que há uma modulação
diferenciada pelo estrogênio e pela progesterona na expressão da proteína do
canal CNG1-A no córtex renal. Contudo, essa modulação não foi evidenciada
na medula renal desses animais em nosso modelo experimental, uma vez que
a ovariectomia bilateral e/ou as reposições isoladas dos hormônios sexuais
66
femininos não alteraram de forma significativa a expressão da proteína desse
canal de sódio.
A influência direta da ação da progesterona na modulação dos canais de
sódio na medula renal, encontrada em nosso trabalho, foi corroborado pelo
trabalho de Thomas et al., 2006, em que a administração da progesterona em
três doses no período de 36 horas, não alterou significativamente a expressão
do RNAm da subunidade alfa do ENaC em rins de camundongos com 30 e
com 32 dias de vida. Esse resultado também foi observado in vitro após a
expressão do RNAm utilizando células de túbulos distais dos rins de cães
(MDCK) da linhagem C7.
Essa modulação diferenciada também é observada no trabalho de
Gambling e cols. (2004) em que a reposição com estrogênio, durante 8 e 24h
aumentou a expressão do RNAm da subunidade α do canal de sódio ENaC (α-
ENaC) nas fêmeas ovariectomizadas. O tratamento com a progesterona inibiu
esse efeito do estrogênio sobre a expressão do RNAm da α-ENaC, após 8h de
sua administração, embora, sua administração tenha aumentado a expressão
do RNAm da subunidade γ do ENaC. Além disso, nenhum dos hormônios,
administrados separados e/ou combinados alteraram de forma significativa a
expressão do RNAm da subunidade β-ENaC após 8 ou 24h de tratamento.
O canal de sódio ENaC está localizado principalmente nas
células do túbulo convoluto distal, ducto coletor e ducto coletor cortical
(DCC) nos rins dos mamíferos (Schmitt et al., 1999; Biner et al., 2002).
Estudos mostram que a atividade deste canal é um fator limitante para a
reabsorção de sódio no DCC (Petty et al., 1981). Anormalidades que
aumentam atividade do ENaC ao longo do néfron, tais que levam a um
67
aumento na reabsorção de sódio, na expansão do fluido extracelular e
podem gerar hipertensão arterial. Já na síndrome de Liddle (Shimkes et al.,
1994), ou a diminuição na atividade do canal, resultam em perda de sal e em
hipotensão (Chang et al., 1996). O transporte de sódio é dependente do
número de ENaC localizados na membrana epitelial, normalmente, luminal e
da freqüência com que o sódio é transportado por eles. O canal de sódio
ENaC é composto por três subunidades α, β e γ (Canessa et al., 1994), e a
abundância do RNAm dessas subunidades é um importante fator
determinante da atividade do mesmo. A aldosterona é modulador do RNAm
e das proteínas da αENaC, mas não das outras subunidades no rim de ratos
(Stokes et al., 1998; Masilamani et al., 1999).
Essa modulação estrogênica/ progestogênica explicaria a
maior excreção de sódio observado no grupo ovariectomizado, já que a
ausência hormonal diminuiria a expressão de muitos desses canais e,
conseqüentemente, a reabsorção de sódio ao longo do néfron estaria
prejudicada, evidenciando desta forma a participação do canal de sódio
CNGA-1 na regulação do balanço de Na
+
corporal e, sua importância para a
fisiologia renal.
Outro íon importante para a regulação dos fluidos corporais é o
cloreto, um ânion predominante do ultrafiltrado glomerular e reabsorvido ao
longo do néfron por mecanismos transepiteliais ou paracelulares (Aronson &
Giebsch, 1997). O transporte transcelular de cloreto envolve muitas
proteínas de membrana, incluindo canais de cloreto expressos ao longo dos
túbulos renais (Morales et al., 1996; Uchida, 2000). Estudos prévios
elucidam que o canal de cloreto, ClC-2, é membro da abundante família dos
68
canais de cloreto e foi isolado originalmente no coração e cérebro de rato,
além de ser expresso em células epiteliais adultas, incluindo as de rim.
Como possui uma expressão elevada no rim, esse canal de cloreto pode ter
um importante papel na reabsorção de cloreto ao longo do néfron (Ornellas
et al., 2002).
Nascimento e cols. (2003), utilizando rins de ratas Wistar
mostraram que a ovariectomia ocasionou uma redução na ordem de 28% na
expressão do RNAm do ClC-2, quando comparada ao grupo controle. A
ovariectomia reduziu a expressão do RNAm do ClC-2 em 42% e 52%, túbulo
convoluto proximal (TCP) e no túbulo reto proximal (TRP), respectivamente,
fato que explicaria um aumento na FE do Cl
-
nas ratas ovariectomizadas de
nossos resultados. Quando foi realizado o tratamento com terapia
estrogênica de baixa e de alta dose, aumentou na expressão desses canais
a valores similares ao controle, e nos TCP e TRP, na ordem de 38 e 86%,
respectivamente. Assim, esses resultados sugerem que o estrogênio é um
modulador fisiológico da expressão dos canais de cloreto ClC-2, agindo
diretamente no túbulo proximal, uma região do néfron responsável por 60%
da reabsorção de sal e água do filtrado glomerular (Jacobson, 1981). Essa
modulação estrogênica explicaria a excreção de uma urina com uma maior
quantidade de íons cloreto no grupo ovariectomizado, já que com a ausência
hormonal, haveria uma diminuição na quantidade dos canais de cloreto ClC-
2 e, conseqüentemente, uma menor reabsorção destes íons, aumentado a
excreção dos mesmos pela urina.
Muitos outros trabalhos suportam a idéia de que uma das
ações do estrogênio na regulação do equilíbrio hidroeletrolítico seja atuando
69
diretamente nos segmentos tubulares renais, através de diferentes
mecanismos de ação celulares (Verlander et al., 1998; Brunette & Leclerc,
2001; Brunette & Leclerc, 2002; Stachenfeld et al., 2003).
Um dos mecanismos seria a ação não-genômico do estrogênio,
dependente da ativação da proteína quinase C-delta (PKCδ), que fosforilaria
a proteína quinase A (PKA), para ativar o transportador trocador Na
+
/H
+
,
aumentando a absorção de sódio em células de colon distal (Harvery et al.,
2002). A aldosterona estimularia a proteína quinase C-alfa (PKCα), ativando
o mesmo trocador. Além disso, esses dois hormônios esteróides possuem
uma via de ação em comum, ativando a enzima fosfolipase-A
2
(FLA
2
)
,
que
clivaria o ácido araquidônico (AA) presente na membrana celular, e através
da via da ciclooxigenase (COX), liberaria as prostaglandinas (PGE
2
), para
ativar o trocador Na
+
/H
+
, isoforma-3 (NHE-3) aumentando a reabsorção de
sódio (Harvery et al., 2002).
O outro mecanismo de ação celular seria via genômica
(clássico dos esteróides) através de seus receptores citoplasmáticos e
nucleares, alterando a transcrição e tradução gênica da célula (Nadal et al.,
2001). Essa forma de ação na fisiologia renal foi demonstrada, no trabalho
em que a expressão da proteína do cotransportador NaCl apresentou uma
redução de 34% nas ratas ovariectomizadas e, o tratamento com estrogênio,
elevou sua densidade em cerca de 60% (Verlander et al., 1998). Esses
resultados elucidam o efeito genômico do estrogênio nas células do túbulo
coletor distal, aumentando a densidade dos cotransportadores NaCl, devido
à presença de seus receptores nessa porção do néfron, possibilitando sua
modulação e maior retenção de sódio nessas condições.
70
A ação estrogênica pode atuar indiretamente na modulação da
função renal, como na interação com o sistema renina angiotensina
aldosterona (SRAA). A interação do estrogênio com o SRAA tem sido
demonstrada em vários estudos e em vários tecidos (Olkers, 1996; Ojeda et
al., 2007; Pendergrass, et al., 2008; Hoshi-Fukushima et al, 2008). Em um
desses estudos, a ovariectomia foi capaz de aumentar a densidade da
enzima conversora de angiotensina (ECA) e a densidade dos receptores AT
1
nos rins de fêmeas Wistar (Gallagher et al., 1999). Apesar de haver uma
redução na densidade da ECA pulmonar, principal isoforma de atuação na
conversão para o peptídeo angiotensina II. O tratamento com o estrogênio
aboliu o efeito da ovariectomia em todos os resultados, além de diminuir a
expressão do RNAm da ECA nos rins, tanto na região cortical, quanto na
medular, no pulmão e na aorta (Gallagher et al., 1999).
Além disso, trabalhos realizados em nosso laboratório (UFES-
ES) mostraram que a ovariectomia bilateral aumentou a atividade da ECA
plasmática e não alterou a atividade da ECA no tecido das artérias
coronarianas de ratas (Gonçalves et al., 2004). No trabalho de Ahmed e
cols. (2004), o uso de contraceptivos por mulheres jovens após uma infusão
com angiotensina II não parece estar associada a uma diminuição dos
receptores AT
1,
já que houve um aumento no seu RNAm, se comparado aos
de mulheres que não faziam uso dos contraceptivos. O uso desses
contraceptivos resulta em um aumento na circulação dos componentes do
sistema renina angiotensina aldosterona (SRAA), incluindo a angiotensina II
(Kang et al., 2001).
71
Essa interação do estrogênio com o sistema renina
angiotensina é muito controversa, variando de acordo com a metodologia
utilizada, o órgão analisado, as fases do ciclo hormonal, as diferentes
espécies e a quantidade de sal na dieta. Além disso, não existe apenas o
SRAA sistêmico, mas vários SRAA locais, tecidos-específicos, como o renal,
o cardíaco, o cerebral, o testicular, etc (Dzau et al., 2001). Portanto, os
componentes do SRAA são regulados cooperativamente e por mecanismos
compensatórios (Dean et al., 2005).
Outro dado relevante no nosso estudo foi à modulação
diferenciada da expressão da proteína e da atividade da Na
+
-K
+
-ATPase
pelo estrogênio e pela progesterona em rins de ratas férteis. A ovariectomia
bilateral ocasionou uma redução de cerca de 44% e de 30% os valores da
expressão da proteína da Na
+
-K
+
-ATPase na preparação de proteínas de
membrana e total do córtex renal, respectivamente. Uma redução também
foi encontrada na atividade da Na
+
-K
+
-ATPase na preparação de proteínas
de membrana do córtex desses animais, após a ovariectomia. A reposição
com estrogênio aumentou a sua expressão protéica em 30% e a valores
similares aos do controle, na preparação de proteínas de membrana e total,
respectivamente. A atividade da Na
+
-K
+
-ATPase aumentou de forma similar
ao controle, na fração microsomal do córtex renal desses animais.
Esses resultados poderiam demonstrar um dos mecanismos
nos quais o estrogênio participaria da reabsorção de Na
+
ao longo do néfron,
pela modulação de carreadores de sódio renais, evidenciado na
normalização da fração de excreção de sódio no grupo ovariectomizado
após a reposição estrogênica. Entretanto, nossos resultados não
72
encontraram alteração significante na expressão da Na
+
-K
+
-ATPase na
medula renal desses animais sob as mesmas condições experimentais.
Esse mecanismo de ação do estrogênico de reabsorção de sódio também foi
comprovado por Tran et al. (1998), em que o estrogênio in vitro aumentou a
expressão da proteína e da atividade da Na
+
-K
+
-ATPase em cultura de
células de túbulos distais. Assim, a redução sérica nos níveis dos esteróides
femininos e a terapia de reposição estrogênica teriam um efeito significativo
na função dos transportadores de sódio no túbulo convoluto distal, podendo
acarretar alterações clínicas importantes, particularmente nas mulheres pós-
menopausadas, ou ainda, contribuindo para uma alteração no balanço dos
fluidos corporais em mulheres na idade reprodutiva, ou na presença de
hipertensão arterial e na gravidez (Verlander et al., 1998).
Na reposição com progesterona, não observamos alterações
significantes na expressão da proteína e na atividade da Na
+
-K
+
-ATPase no
córtex renal desses animais. Os dados são corroborados pelo trabalho de
Rafestin-Oblin et al., 1991, em células de túbulo coletor cortical de ratos
adrenalectomizados. Nesse trabalho, as células tubulares foram isoladas e
pré-incubadas com aldosterona até atingirem sua atividade máxima da Na
+
-
K
+
-ATPase. O tratamento com a progesterona e com a espiranolactona
(antagonista do receptor de mineralocorticosteróide) apresentou o mesmo
padrão de resposta, isto é, ambos inibiram o efeito estimulatório da
aldosterona sobre a atividade da Na
+
-K
+
-ATPase dose dependente. Já
quando foram incubadas isoladas, sem a pré-incubação da aldosterona, não
apresentaram alteração significante na atividade dessa enzima nos rins
desses animais, similares aos nossos resultados. Outro dado interessante foi
73
à ação diferenciada dos metabólitos progestogênicos, o 18-vinil-
progesterona e o 18-etil-progesterona, que inibiu e estimulou,
respectivamente, o efeito da aldosterona sobre a atividade da Na
+
-K
+
-
ATPase dose dependente.
Outro dado relevante encontrado na literatura foi o trabalho de
Morril et al., 2008, em que sugerem que a progesterona compete com a
ouabaína com baixa afinidade, pelo seu sítio de ligação da subunidade alfa1
da Na
+
-K
+
-ATPase. Ao utilizarem a ouabaína (inibidor da Na
+
-K
+
-ATPase) e
a progesterona marcada radioativamente, observaram que ambas
competem e estimulam a meiose de ovócitos de anfíbios, como a Rana
pipiens in vitro.
Embora trabalhos apresentem resultados mostrando que a
progesterona compete pelos receptores de mineralocorticosteróide no túbulo
renal distal (Rafestin-Oblin et al., 1991; Myles and Funder, 1996), causando
um efeito natriurético transitório (Muller J, 1988; Myles and Funder, 1996),
dependente da fase hormonal do animal, nosso resultado da fração de
excreção de sódio no grupo tratado com progesterona foi similar ao do grupo
controle. Isso poderia ser justificado por estudos que mostram um efeito
compensatório da progesterona nos mecanismos de regulação do balanço
de sódio corporal (Muller J, 1988; Braley et al., 1996; Thomas et al., 2006),
como na ativação do sistema renina angiotensina aldosterona, de forma
similar a uma situação de restrição de sódio na dieta (Muller J, 1988; Adler et
al., 1993; Braley et al., 1996).
Ratas ovariectomizadas tratadas com progesterona e com
restrição de sódio na dieta não apresentaram diferença significante no
74
aumento dos níveis plasmáticos de aldosterona e da atividade da renina
plasmática in vivo. Utilizando células isoladas da zona glomerulosa da
adrenal desses animais, a progesterona aumentou a sensibilidade dessas
células, estimulando uma via de conversão de corticosterona em aldosterona
e a transcrição do RNAm da enzima aldosterona sintase in vitro (Braley et
al., 1996), sugerindo uma maior ação na reabsorção de sódio nessas
condições.
É provável ainda que a progesterona possa ter um efeito direto
no sistema renina angiotensina aldosterona, independente da ação anti-
mineralocorticosteróide, como demonstrado por Oelkers et al., 1974, em que
o tratamento por 6 dias com progesterona aumentou a atividade da renina
plasmática (ARP), os níveis plasmáticos da angiotensina II e a excreção de
aldosterona, sugerindo que o aumento na excreção de aldosterona seja um
efeito agudo (3 horas) e que o aumento na ARP seja um efeito crônico,
apenas observado em três dias (Oparil et al., 1975). Uma terceira
possibilidade, a progesterona poderia atuar como substrato para a
biossíntese de aldosterona (Muller J, 1988). Uma quarta possibilidade foi
demonstrada no trabalho de Rafestin-Oblin et al (2002) em que o metabólito
11-beta-hidroxi-progesterona pode atuar como um agonista do receptor de
mineralocorticóide, estimulando absorção de sódio em células principais de
ducto coletor cortical de mamíferos.
Alguns trabalhos vêm demonstrando efeitos indiretos da
progesterona na concentração de sódio na composição do fluído
extracelular, contudo devido à presença de seus receptores em segmentos
do néfron (Rafestin-Oblin et al., 1991; Myles and Funder, 1996; Brunette and
75
Leclerc, 2002), sua ação também pode ser efetivada de forma direta, como
na modulação da expressão de transportadores iônicos. Sua ação ocorre
principalmente no túbulo distal, como demonstrado no trabalho de Brunette
and Leclerc, 2002, em que a incubação de células isoladas de túbulo distal
do néfron de coelhos, apresentou uma alteração máxima no transporte de
sódio e cálcio em apenas 1 minuto. Resultado que não foi observado em
células de túbulo proximal nas mesmas condições, sugerindo um
mecanismo de ação direto e não-genômico. No trabalho de Thomas et al.,
2006, o acetato de medroxi-progesterona aumentou a expressão do RNAm
da α-ENaC in vivo, no córtex renal de camundongos machos, e in vitro, em
células de túbulos distais dos rins de cães (MDCK, C7), resultando em um
mecanismo de ação direto e genômico.
Todos esses mecanismos de retenção de sódio pela ação
direta e indireta da progesterona poderiam explicar os valores da fração de
excreção de sódio similar do grupo reposto com apenas progesterona aos
do grupo controle.
Nossos resultados vêem demonstrando que tanto o estrogênio
como a progesterona participam da modulação do CNGA-1 diretamente no
córtex renal de ratas em idade reprodutiva. E na tentativa de isolar essa
ação hormonal, in vitro, demonstramos que o estrogênio aumentou a
expressão da proteína do CNGA-1, em uma incubação por 24h, doses
dependentes (10
-11
M, 10
-10
M, 10
-9
M, 10
-8
M e 10
-7
M) em cultura celular,
utilizando células de túbulo proximal de ratos (IRPTC). Esses dados de ação
do estrogênio isolado e in vitro também foram corroboradas no trabalho de
Brunette & Leclerc (2001), em uma incubação durante 15 minutos com 17-β-
76
estradiol (10
-8
M) em células dos túbulos proximais e distais de rins de
coelhos, apresentaram um forte aumento na reabsorção de sódio, tanto nos
segmentos proximais, quanto nos distais, mostrando que o efeito direto do
estrogênio se daria da mesma forma que nos co-transpotadores NaCl
(Verlander et al., 1998), e na bomba Na-K-ATPase (Tran et al., 1998),
ocorrendo por mecanismos não-genômicos.
O estrogênio e a progesterona são hormônios esteróides, cujo
mecanismo de ação clássico se dá pela ligação a receptores intracelulares.
O hormônio atravessa a membrana plasmática das células-alvo e se liga aos
receptores intracelulares específicos, formando o complexo hormônio
receptor (Nadal et al., 2001; Norman et al., 2004). Esse complexo, então,
desloca-se para o núcleo, onde atua como cofator de transcrição, ligando-se
a regiões específicas do DNA (Silberger & Magleby, 1999), regulando a
expressão de genes-alvo (Tsai & O’Malley, 1994). A ligação do complexo
hormônio receptor ao DNA estimula ou iniba (Norman et al., 2004) as
transcrições gênicas, que é seguida pelo processo de tradução e, caso não
tenha sido inibida, aumenta os níveis de RNAm, o que leva à formação de
proteínas específicas (O’Malley & Means, 1974). As proteínas estão
relacionadas às respostas celulares (Santos et al., 2004). Além desse
mecanismo genômico clássico, o estrogênio e a progesterona podem atuar
em receptores presentes na membrana plasmática que ativam respostas
celulares mais rápidas por segundos mensageiros específicos, isto é,
mecanismo de ação não-genômica.
Além dos dados de função renal, nossos resultados pela técnica
de Western blotting demonstraram a presença do canal de sódio CNGA-1 no
77
córtex e na medula renal. Contudo, essa localização não foi totalmente
confirmada pela técnica de imunohistoquímica (imunofluorescência) que
detectou esse canal predominantemente no córtex renal, situado na membrana
basolateral nos túbulos proximais e distais do néfron, principais alvos de ação
do estrogênio e da progesterona na modulação dos transportadores iônicos
renais.
Os rins possuem a maior influência na regulação dos fluídos e
dos eletrólitos corporais, apresentando uma elevada atividade metabólica
tecidual. Para tanto, há a necessidade de um aporte gasoso (oxigênio e gás
carbônico) e energético em constante dinamismo, que é mantido em
detrimento de seu fluxo sangüíneo renal (FSR). Nos indivíduos normais e em
repouso, o FSR pode chegar a consumir 25% do débito cardíaco e a sua
manutenção ocorre pela autoregulação.
A autoregulação do fluxo sangüíneo é um fenômeno que
evidencia a função da parede vascular na manutenção de uma perfusão
sangüínea constante e fisiológica, em detrimento da labilidade nos níveis de
pressão arterial que ocorre momento-a-momento (Juste et al., 2007;
Cupples, 2007). Essa função está presente em alguns tecidos do organismo,
embora seja particularmente destacado em órgãos como o cérebro e os rins
(Juste et al., 2007). A autoregulação do fluxo sangüíneo renal (FSR) é
baseada tradicionalmente em dois mecanismos: a resposta miogênica ou
mecanismo miogênico (RM) e o “feedback” tubuloglomerular ou balanço
tubuloglomerular (FTG) .
O mecanismo miogênico envolve a propriedade intrínseca do
músculo liso vascular de contrair em resposta a uma força de estiramento
78
(tensão) (Johnson PC, 1980). No caso do músculo liso vascular, ele se
contrai ou se relaxa de acordo com um respectivo aumento ou uma
diminuição da tensão na parede elástica vascular causada pela pressão de
perfusão renal (PPR). O aumento na pressão intraluminal dos vasos de
menor calibre induz um aumento no raio vascular, determinando um
aumento no fluxo sangüíneo do renal. O resultante desse estiramento
aumenta a resistência vascular, ocasionando uma vasoconstrição,
praticamente imediata entre 5-10 segundos (Just, 2007), diminuindo a
pressão de perfusão renal e normalizando o fluxo sangüíneo do renal
(Cupples, 2007). O início dos eventos que ocasionam o mecanismo
miogênico é a despolarização da membrana celular. O estiramento pode
ativar canais iônicos mecanossensíveis (estiramento-sensíveis), receptores
de integrinas e a enzima fosfolipase C (D’Angelo and Meininger, 1994).
Depois de iniciada a despolarização, ocorre à ativação de canais de cálcio
voltagem dependente, levando ao influxo de cálcio, que ativa a liberação de
cálcio dos estoques intracelulares, aumentando a liberação do segundo
mensageiro inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), ativando a resposta miogênica
(Davis MJ, et al., 2001). A mobilização do aumento de cálcio intracelular
envolve a calmodulina e a miosina leve, que são ativadas por fosforilação
pela via da citocromo P450, da proteína quinase C, da rho-quinase e da
fosforilase de miosina (Murphy et al., 2002; Just, 2007).
O balanço tubuloglomerular é um mecanismo de regulação
complexa e específica renal, que ocasiona uma vasoconstrição na arteríola
aferente, em detrimento de um aumento na concentração luminal do cloreto
de sódio no fluido intratubular que perfunde o início do túbulo distal
79
detectado pelas células da mácula densa do aparelho justaglomerular (AJG)
(Schnermann J et al., 1997). O aparelho justaglomerular é um aparato
anatômico formado pelo sistema tubular e pelo sistema vascular de cada
néfron, em que a alça ascedente espessa cortical de Henle, ou a parte inicial
do túbulo distal convoluto (túbulo distal reto) se dispõe em contato íntimo
com seu correspondente glomérulo e, sua respectiva arteríola aferente e
eferente, formando uma unidade vasotubular (Thurau and Schnermann,
1965; Just, 2007). Nessa região do mesângio extraglomerular, existem
células especializadas, chamadas de células da mácula densa, com a
capacidade de detectar alterações na composição de NaCl do lúmen tubular,
estabelecendo uma modulação retroalimentativa intra-néfron com o controle
da resistência pré-glomerular e, consequentemente, com ritmo de filtração
glomerular (RFG) (Castrop H, 2007). Isso ocorre em virtude da reabsorção
de sal no segmento ascendente da alça de Henle ser ativa e,
frequentemente, limitada pela difusão passiva de água pelo seu segmento
tubular descendente. De modo que a concentração de NaCl luminal
percebida pelas células da mácula densa é dependente da freqüência de
fluxo tubular, isto é, uma maior freqüência de fluídos, ocasiona uma maior
concentração de sal detectada pelo segmento distal tubular do néfron (Bell
and Lapointe, 1997). E, um aumento na pressão arterial sistêmica pode
aumentar o fluxo tubular, elevando na filtração glomerular e, redução na
reabsorção ao longo do túbulo proximal. Essa informação de aumento na
concentração de NaCl percebido pelas células da mácula densa é enviada
para as células granulares da arteríola aferente por mecanismos parácrinos,
causando uma vasoconstrição, restabelecendo as freqüências de filtração
80
glomerular e, mantendo o fluxo sangüíneo renal em níveis fisiológicos (Just,
2007). A atividade do transportador sensível a furosemida e a bumetanida
Na
+
-K
+
-2Cl
-
presente na membrana luminal das células da mácula densa é o
sensor primário para a percepção da concentração de NaCl no aparelho
justaglomerular (Bell and Lapointe, 1997) e, sua inibição aboliu a resposta do
“feedback” tubuloglomerular (Wright and Schnermann, 1974).
Trabalhos vêm destacando duas moléculas purinérgicas como
mediadores do balanço tubuloglomerular, o adenosina-tri-fosfato (ATP) e a
adenosina (White et al., 2001; Jackson et al., 2002). Todas as classes dos
receptores de adenosina são expressas no tecido renal, o receptor A1A está
presente na arteríola aferente e quando ativado, causa vasoconstrição
durante a resposta do balanço tubuloglomerular (Jackson et al., 2002; Peti-
Peterdi, 2006), mediada pela proteína Gi, dependente da fosfolipase C e,
subseqüente aumento ao cálcio intracelular, através da ativação de canais
de cálcio voltagem dependentes (Hansen et al., 2003). E, a administração de
antagonistas inespecíficos dos receptores de adenosina, ocasiona uma
redução significante na resposta do “feedback” tubuloglomerular
(Schnermann et al., 1977), sugerindo que a ativação do receptor de
adenosina A1A é indispensável para a resposta fisiológica do balanço
tubuloglomerular (Castrop et al., 2007).
Os receptores do ATP também estão expressos na vasculatura
renal, como o P2X e P2Y (White et al., 2001) e, a isoforma P2X1 está
presente na arteríola aferente e na artéria interlobular, cuja ativação
ocasiona um efeito vasoconstritor (Chan et al., 1998; Inscho et al., 2004). A
vasoconstrição da arteríola aferente é atenuada em resposta a um aumento
81
na pressão de perfusão renal, após o bloqueio farmacológico do receptor
P2X e também, em camundongos deficientes geneticamente para o receptor
P2X1 (Inscho et al., 1996; 2004). O estresse de cisalhamento vascular
ocasiona liberação celular de ATP (Wang et al., 1996), a exposição ao
antagonista do receptor P2X, desensibiliza os receptores de ATP, de modo
que uma seguida exposição ao ATP, ocasiona um prejuízo na resposta do
balanço tubuloglomerular e, consequentemente, na autoregulação do fluxo
sanguíneo renal mediada pelo endotélio (Inscho et al., 1996).
Além do efeito isolado do ATP e da adenosina na resposta do
balanço tubuloglomerular, estudos vêm demonstrando que há uma
cooperação metabólica entre eles (Peti-Peterdi, 2006; Castrop, 2007), isto é,
o ATP liberado pela membrana basolateral das células justaglomerulares e,
secundariamente, pelas células mesangiais, pode sofrer degradação pela
ação da enzima hidrolase-difosfato-1-nucleosídeo-trifosfato e pela 5’-ecto-
nucleotidase no espaço intersticial do aparelho justaglomerular, gerando
adenosina e ativando os receptores A1A, causando vasoconstrição na
arteríola aferente, normalizando a perfusão to tecido renal (Shnermann J and
Levine DZ, 2003, Castrop, 2007).
Portanto, um aumento no fluxo tubular, devido a um aumento
no ritmo de filtração glomerular, reduziria a reabsorção de Na
+
no túbulo
proximal e, poderia aumentar a sua excreção renal. Em nossos resultados, o
ritmo de filtração glomerular permaneceu sem alterações significantes,
dados que foram corroborados pelo trabalho de Kurella et al., 2004, em que
não foi detectado associação entre a função hormonal feminina e o ritmo de
filtração glomerular. Ou ainda, no trabalho de Nielsen et al, 2003 em que a
82
reposição de estrogênio, isolada ou combinada com a progesterona não
influenciou os níveis basais do ritmo de filtração glomerular e do fluxo
plasmático renal efetivo (FPRE). Contudo, mostramos que a fração de
excreção de sódio aumentou no grupo ovariectomizado e a reposição
hormonal restabeleceu seus valores a resultados similares ao do grupo
controle, de modo que parece haver uma descompensação no balanço
tubuloglomerular, em virtude da reposição isolada de estrogênio e de
progesterona. Novak et al., 2001 observaram que a ovariectomia bilateral
aumentou e a reposição conjugada de estrogênio/progesterona restabeleceu
os valores do ritmo de filtração glomerular e do fluxo plasmático renal
efetivo. Fato que explicaria um aumento na fração de excreção de sódio de
nossos resultados.
Outros trabalhos vêm demonstrando uma influência do dos
hormônios sexuais femininos na modulação dos principais efetores do
balanço tubuloglomerular, o ATP e a adenosina (Cario-Toumaniantz et al.,
1998; Xu et al., 2001). O estrogênio diminui o influxo de cálcio e aumentou o
cálcio citosólico, ativando os receptores P2X7 ativados pelo ATP em células
epiteliais (Gorodeski, 2004). Ou, que a ausência dos esteróides femininos
module a expressão de receptores de adenosina, de modo que a
ovariectomia bilateral reduziu a expressão dos receptores de adenosina A1,
A2a e A3 nos cérebros de ratas (Rose’Meyer et al., 2003).
Já em células de rins de macacos, o 17-β-estradiol inibiu a
ativação do receptor P2X7 pelo ATP, diminuindo a possibilidade de abertura
do canal quando ativado, e conseqüentemente, da passagem de corrente
pelo mesmo. O tratamento dessas células com a progesterona e com o 17-
83
α-estradiol nas mesmas condições não afetou significativamente a
passagem da corrente por esse canal. E, como essas células não possuem
receptores nucleares para o estrogênio (White et al., 1987), esses dados
indicam um mecanismo esterio-específico e não-genômico ativados pelo
estrogênio (Cario-Toumaniantz et al., 1996), evidenciando a relação dos
esteróides femininos com balanço tubuloglomerular.
Enfim, diante desses resultados podemos concluir que:
-O canal de sódio CNGA-1 está presente na membrana
basolateral nos rins de ratas, preferencialmente na região do túbulo proximal
e distal do néfron cortical;
-O canal de sódio CNGA-1 e a enzima Na
+
-K
+
-ATPase são
modulados de forma diferenciada pelo estrogênio e pela progesterona no
córtex renal de ratas. Isto é, o estrogênio modula de forma positiva a
expressão da proteína do CNGA-1 e, a expressão da proteína e a atividade
da enzima Na
+
-K
+
-ATPase renais, atuando diretamente em células do túbulo
proximal. De modo que o CNGA-1 poderia ser um canal de influxo de sódio,
mantendo as concentrações de sódio intracelulares adequadas para o
funcionamento da enzima Na
+
-K
+
-ATPase, na reabsorção de sódio, sob
influência do estrogênio.
-Essa modulação seria mais um mecanismo pelo quais os
esteróides femininos participam do controle do fluido extracelular e do
balanço de sódio, principalmente, nos túbulos proximais e distais ao longo
do néfron.
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