( PDF ) Contribuição da IL-5 e de leucotrienos na eosinofilia, na liberação de citocinas e na produção de imunoglobulinas durante a Síndrome da Larva Migrans Visceral

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

Contribuição da IL-5 e de leucotrienos na

eosinofilia, na liberação de citocinas e na

produção de imunoglobulinas durante a Síndrome

da Larva Migrans Visceral

Fernanda de Freitas Anibal

Ribeirão Preto – SP

2005

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Fernanda de Freitas Anibal

Contribuição da IL-5 e de leucotrienos na eosinofilia, na liberação de

citocinas e produção de imunoglobulinas durante a Síndrome da Larva

Migrans Visceral

Tese de doutorado apresentada à Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São

Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências.

Área de Concentração: Imunologia Básica e Aplicada.

Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Helena Faccioli

Ribeirão Preto – SP

2005

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FICHA CATALOGRÁFICA

Anibal, Fernanda de Freitas

“Contribuição da IL-5 e de leucotrienos na eosinofilia, na liberação

de citocinas e produção de imunoglobulinas durante a Síndrome da

Larva Migrans Visceral”

/ Fernanda de Freitas Anibal. – Ribeirão Preto, 2005

.133.p.

Tese de doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Imunologia Básica e

Aplicada

Orientadora: Faccioli, Lúcia Helena

1- Eosinófilos. 2- IL-5 e Leucotrienos. 3- Imunoglobulinas.

Deus nos concede, a cada dia, uma página de

vida nova no livro do tempo. Aquilo que

colocarmos nela, corre por nossa conta.

(Chico Xavier)

AGRADECIMENTOS

DEDICO ESTE TRABALHO...

Ao meu marido e companheiro Claudio pelo AMOR, incentivo, apoio,

carinho e muita paciência nas horas mais difíceis e a nossa filha, Ana

Beatriz, que está por chegar pela paciência, amor e respeito durante a

finalização deste trabalho...

Aos meus pais Ana e Wilson, pelo apoio e incentivo durante todos

estes anos de estudo, e aos meus irmãos Aurélia, Júnior e Fernando

(irmão de coração) pelo apoio e compreensão nas horas confusas e

difíceis...

Aos meus segundos pais Concepcion e Claudio pelo carinho e amizade.

A todos vocês meu muito obrigada.

AMO VOCÊS!!!!!!

MEUS SINCEROS AGRADECIMENTOS

Primeiramente a DEUS pela vida e oportunidade de crescer como ser

humano, aprendendo a perdoar e acreditar que tudo o que passamos é para

nosso crescimento espiritual.

Dra. Lúcia H. Faccioli pela paciência, compreensão e ensinamentos durante

esta trajetória científica.

Dr. Auro Nomizo pelo desprendimento e dedicação a meu trabalho,

contribuindo de forma significativa para o término desta tese. E pelo amigo que

sempre foi durante nossas extensas conversas no laboratório.

Aos membros da banca Dra. Vânia L. D. Bonato Martins, Dra. Silmara

Marques Allegretti, Dra. Sônia Jancar Negro, e ao Dr. Luís R. Orsini Tosi pela

disponibilidade, compreensão e sugestões enriquecedoras ao meu trabalho.

Ana Cristine Ferreira pela amizade, apoio, incentivo, carinho e por tudo que

facilitou para a conclusão deste trabalho. Muito obrigada!

Dr. Gutemberg de Melo Rocha pelo incentivo à ciência e pelo carinho

durante todos estes anos.

Dra. Cristina Roque-Barreira pelas portas abertas de seu laboratório e a

pesquisadora Elaine Lourenço pelo apoio para a execução da purificação do

anticorpo usado neste estudo.

Dr. Marcelo Dias Baruffi pela amizade e ajuda no final da purificação de

nossas proteínas, e a técnica Marlisi pela disponibidade e atenção prestada.

As técnicas Aninha e Cristina do Laboratório de Bioquímica (FCFRP-USP)

pela atenção e ajuda durante o desenvolvimento de parte deste trabalho.

Aos meus amigos e responsáveis técnicos pelo laboratório Erika Vitaliano

da Silva pela ajuda e atenção nos experimentos e ao Carlos Artério Sorgi pelas

dosagens de citocinas, imunoglobulinas e pelas discussões valiosas.

As minhas amigas de laboratório que estiveram presentes no momentos

bons e ruins, no riso e no choro, Eleuza, Lucinha, Xan, Dani Isa, Dani Carlos,

Camila, Fabiani, Rosane, Adriana (Auro), Adriana (Xan), e em especial a Xan pela

atenção durante minha qualificação e a Adriana Malheiro, que mesmo hoje

estando em outra instituição sempre foi uma pessoa muito especial em minha vida

pessoal e acadêmica servindo de exemplo pela sua determinação na vida

cientifica.

Aos meus amigos do laboratório Alexandre, Anderson (Homer), Walter

(Tatu) e Beto. Em especial ao Alexandre pelo carinho e amizade durante todos

estes anos.

As minhas amigas e irmãs de coração, Bela, Claudia, Iza, Ana Renata, Karina,

Cidinha, Karen, Alessandra Cheraim, Raissa, Sandrinha, Isabelinha, Rubia,

Luciane, Daniela, Alessandra Bruxelas, Maria, Adriana, Maria Fernanda, Carol,

Taiza, Colete e todas que estiveram presente durante esta luta. Obrigada pelos

ombros e pelo carinho!

Aos meus amigos Parron, Alexandre, Mozart, Cristiano, Claudio Miranda, Márcio

Furtado, Disney, Pety, Hugo, Armando, Eduardo, Valdir, João, Danilo, Moisés,

Moisés Bauer, Guará, Ceará, meu primo Luiz, Rubinho, pelos momentos

divertidos e pela torcida para esta conquista. Em especial ao Humberto pela

disponibilidade e atenção na impressão deste trabalho.

A todos os meus alunos e alunas do Centro Universitário de Araraquara,

das Faculdades Integradas Fafibe e das Faculdades São Luís pela compreensão

e apoio durante as reposições de aulas no término deste estudo. E aos

professores e funcionários destas instituições Orivaldo (coordenador), Odila

(coordenadora), Colete (coordenadora), Miriane Gileno, Renata Joviliano, Adilson

Bernardo, Jairo, Wellington, Sueli, Gustavo e Andréa pela amizade nestes anos.

A todos os meus amigos do Centro Cáritas pela amizade e amor prestado

durante estes anos.

A todos os meus colegas de pós-graduação pela agradável convivência

durante estes anos.

A todos os funcionários da FMRP-USP e FCFRP-USP pelo carinho e

convívio agradável.

À área de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada e ao seu

coordenador Dr. João Santana da Silva incentivo para a realização de uma

Imunologia séria e competente.

Às instituições de fomento FAPESP, CAPES e FAEPA pelos auxílios

financeiros.

LISTA DE ABREVIATURAS

AA: ácido aracdônico

EPO: peroxidase de eosinófilos

FcRI: receptor da porção Fc das imunoglobulinas

FLAP: proteína ativadora da 5-lipoxigenase

GM-CSF: fator estimulador de colônia granulócitos e macrófagos

HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana

IFN-γ: Interferon gama

IgA....M: Imunoglobulinas A, D, E, G, M

IL-1...16: Interleucinas 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 112, 13, 16....

KC: homólogo da IL-8 em camundongos

KO: “knockout”, deficiente

LBA: lavado broncoalveolar

LTA4, B4, C4 e D4: leucotrienos A4, B4, C4 e D4

MIP-1α: proteína -1α de macrófago inflamatório

MIP-1β: proteína -1β de macrófago inflamatório

NK: células natural killer

OPD: o-phenylenediamine

PAF: Fator Ativador de Plaquetas

PGE1, PGE2: prostaglandinas E1 e E2

PMN: Polimorfonucleares

RANTES: quimiocina CXCL-5

SLMV: Síndrome da Larva Migrans Visceral

TGF-α e β: fator transformador do crescimento alfa e beta

TNF-α: Fator de Necrose Tumoral alfa

TXB2: tromboxano B2

VIP: polipeptídeo intestinal vasoativo

5-LO: enzima 5-lipoxigenase

RESUMO E ABSTRACT

Dentre as doenças parasitárias que acometem principalmente as

crianças, podemos destacar a Síndrome de Larva Migrans Visceral (SLMV)

causada pelo Toxocara canis, um dos helmintos mais freqüentes em cães.

Uma das principais conseqüências desta infecção é o aumento marcante de

eosinófilos, principalmente nos pulmões e no sangue circulante. Neste

modelo a IL-5 parece ser a principal citocina envolvida na indução da

eosinofilia e do controle in vivo da síntese de IL-8. Além disso, não está

descrito na literatura nenhum dado sobre o envolvimento de leucotrienos na

eosinofilia, na produção e secreção de interleucinas e de imunoglobulinas

durante a SLMV murina. Assim nossos objetivos neste projeto foram,

investigar na Síndrome da Larva Migrans Visceral murina se eosinofilia

sangüínea e pulmonar é dependente de IL-5 e de leucotrienos e se estes

mediadores modulam a liberação de citocinas e a síntese de IgE, IgG1 e

IgG2a. Nossos resultados demonstraram que, em animais C57BL/6, 129 e

5LO-KO ocorre eosinofilia pulmonar e sangüínea, dependente de IL-5 e

leucotrienos. E ainda nestes animais, IL-8 é dependente de IL-5. E que

apenas nos camundongos C57BL/6 TNF-α, IL-4, IgE e Ig2a dependente

tanto de IL-5 quanto de leucotrienos, embora a liberação de IL-10 seja

dependente apenas de leucotrienos. Entretanto, em animais 129 e 5 LOKO a

IL-8 seja dependente de IL-5, os níveis de IgE, IgG2a e IgG1 independente

destes dois mediadores. Deste modo, sugerimos que leucotrienos e IL-5

modulam a liberação de IL-8 in vivo, mas que para as imunoglobulinas

observadas esta modulação é dependente da linhagem dos animais

estudados.

Among some mainly diseases that affect the children, we can name

the Visceral Larva Migrans Syndrome (VLMS), which is caused by infective

larvae of the common ascarid of dogs, Toxocara canis. One of the most

important consequences of this infection is the raise of the eosinophilias,

especially on the lungs and on the circulating blood. On this model the IL–5

seems to be the main cytokine involved on the eosinophilia induction and of

the in vivo control of the IL–8 synthesis. There is nothing on the literature that

describes the involvement of the leukotrienes on the eosinophilia, on the

interleukin production and secretion, and the immunoglobulin during the

(VLMS) murina. So the objectives of this research were to investigate on the

Visceral Larva Migrans Syndrome murina if the blood and lung eosinophilia

depends on the IL-5 and the leukotrienes, moreover if these mediators

modulate the release of cytokines and the synthesis of IgE, IgG1 and IgG2a.

Our results had demonstrated that in animals C57BL/6, 129 and 5LO-KO

pulmonary and blood eosinofilia occurs depending on the IL-5 and

leukotrienes. And also in these animals, IL-8 depends on the IL-5. In addition,

only in mice C57BL/6 TNF-a, IL-4, IgE and Ig2a, depends on the IL-5 as

much as on the leukotrienes, even though the IL-10 release is dependent

only on the leukotrienes. However, in animals 129 and 5 LOKO the IL-8 it is

dependent of IL-5, the levels of IgE, IgG2a and IgG1 are independent of

these two mediators. So, we suggest that the leukotrienes and IL-5 modulate

the IL-8 release in vivo, but for the immunoglobulines observed this

modulation is dependent of the ancestry of the animals studied.

Investir em conhecimentos rende

sempre melhores juros.

(Benjamin Franklin)

SUMÁRIO

1- RESUMO 07

1.1- ABSTRACT 09

2- INTRODUÇÃO 11

3- JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS 21

4- MATERIAL E MÉTODOS 23

4-1- Animais 24

4-2- Obtenção de ovos embrionados de T. canis 24

4-3- Infestação dos camundongos com ovos de T. canis e

grupos experimentais

4-4- Obtenção das células dos lavados broncoalveolares (LBA)

e do sangue

4-5- Contagem total e diferencial das células do LBA e do

sangue

4-6. Produção de anticorpos anti-IL-5 (TRFK-5) 26

4-7- Tratamento dos Animais com Inibidor da Síntese de

Leucotrienos (MK-886)

4.8- Tratamento com anticorpos anti-IL-5 27

4.9- Dosagem de peroxidase de eosinófilos (EPO) no tecido

pulmonar de camundongos

4-10- Estudos Histológicos e Microfotografias 29

4-11- Ensaio de imunoenzimático (ELISA) 29

4-11-1 Para detecção de citocinas 29

4. 11.2-Para detecção de Imunoglobulinas 30

4-12- Preparo de soluções 31

4-13- Análise Estatística 32

5- RESULTADOS – PARTE I 34

5.1- Padronização do modelo da Síndrome da Larva Migrans

Visceral (SLMV) em camundongos C57BL/6

5.1.1- Células presentes no espaço broncoalveolar de C57BL/6 35

5.1.2- Número de eosinófilos no sangue circulante 36

5.2- Efeito da inibição da síntese de leucotrienos ou da

neutralização de IL-5

5.2.1- Efeito da neutralização de IL-5 40

5.2.2- Efeito da inibição da síntese de leucotrienos e/ou

neutralização da IL-5 sobre o número de eosinófilos e células

mononucleares no espaço broncoalveolar de animais C57BL/6

5.2.3- Efeito da inibição da síntese de leucotrienos e/ou

neutralização da IL-5 sobre o número de eosinófilos e células

mononucleares no sangue de animais C57BL/6

5.3.- Níveis de peroxidase de eosinófilos (EPO) em pulmões de

animais C57BL/6, infectados e submetidos ou não aos

diferentes tratamentos

5.4- Histopatologia do parênquima pulmonar de camundongos

infectados com ovos de T. canis tratados ou não com MK-886

e/ou TRFK-5

5.4.1- Histopatologia do tecido pulmonar de camundongos

Balb/c infectados com ovos de T. canis tratados ou não com

MK-886 e/ou TRFK-5

5.4.2- Histopatologia do tecido pulmonar de camundongos

C57BL/6 infectados com ovos de T. canis tratados ou não com

MK-886 e/ou TRFK-5

5.5- Citocinas nos pulmões de animais infectados com T. canis

tratados ou não com MK-886 e/ou TRFK-5

5.5.1- Efeito da inibição de IL-5 e leucotrienos na produção de

quimiocina KC (IL-8) no soro de camundongos infectados com

T. canis tratados ou não com MK-886 ou TRFK-5 ou ambos

5.5.2- Efeito da inibição de IL-5 e leucotrienos na produção de

citocinas por células de pulmões de camundongos infectados

com T. canis tratados ou não com MK-886 ou TRFK-5 ou ambos

5.6.- Efeito da depleção de IL-5 e/ou leucotrienos nos níveis

séricos de anticorpos parasita específicos em camundongos

infectados com T. canis

5.6.1- Efeito da neutralização da IL-5 e de leucotrienos nos 59

níveis das imunoglobulinas nos pulmões de camundongos

infectados com T. canis

5- RESULTADOS – PARTE II 62

5.7- Padronização do modelo da Síndrome da Larva Migrans

Visceral (SLMV) em camundongos 129

5.7.1- Células presentes no espaço broncoalveolar de Balb/c e

129

5.7.2- Número de eosinófilos no sangue circulante 63

5.8- Efeito da inibição da síntese de leucotrienos 65

5.8.1- Efeito da inibição da síntese de leucotrienos e/ou

neutralização da IL-5 sobre o número de eosinófilos e células

mononucleares no LBA de animais 129

5.8.2- Efeito da inibição da síntese de leucotrienos e/ou

neutralização da IL-5 sobre o número de eosinófilos e células

mononucleares no sangue de animais 129

5.8.3- Efeito da neutralização da IL-5 sobre o número de

eosinófilos e células mononucleares no LBA de animais 5-

lipoxigenase deficiente (5LO-KO)

5.8.4- Efeito da neutralização da IL-5 sobre o número de

eosinófilos e células mononucleares no sangue de animais 5

lipoxigenase deficiente (5LO-KO)

5.9.- Níveis de peroxidase de eosinófilos (EPO) em pulmões de

animais 129 e 5LO-KO infectados e submetidos ou não aos

diferentes tratamentos

5.10- Histopatologia do parênquima pulmonar de camundongos

infectados com ovos de T. canis tratados ou não com MK-886

e/ou TRFK-5

5.10.1- Histopatologia do tecido pulmonar de camundongos 129

infectados com ovos de T. canis tratados ou não com MK-886

e/ou TRFK-5

5.10.2- Histopatologia do tecido pulmonar de camundongos

deficientes da enzima 5-Lipoxigenase (5LO-KO) infectados com

ovos de T. canis tratados ou não com TRFK-5

5.11- Citocinas nos pulmões de animais infectados com T. canis

tratados ou não com MK-886 e/ou TRFK-5

5.11.1- Efeito da inibição de IL-5 e leucotrienos na produção de

KC (IL-8) no soro de camundongos infectados com T. canis

tratados ou não com MK-886 ou TRFK-5 ou ambos

5.11.2- Efeito da inibição de IL-5 e leucotrienos na produção de

citocinas inflamatórias por células de pulmões de

camundongos infectados com T. canis tratados ou não com MK-

886 ou TRFK-5 ou ambos

5.12.- Efeito da depleção de IL-5 e/ou leucotrienos nos níveis de

anticorpos específicos no soro

5.12.1- Efeito da neutralização da IL-5 e de leucotrienos nos

níveis de anticorpos específicos nos pulmões

6- DISCUSSÃO

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

INTRODUÇÃO

Sábio é aquele que conhece os

limites da própria ignorância.

(Sócrates)

Síndrome da Larva Migrans Visceral

No presente trabalho utilizamos o modelo da Síndrome da Larva Migrans

(SLMV) ou toxocaríase para estudar a participação da IL-5 e leucotrienos na

inflamação eosinofílica crônica em diferentes compartimentos

, principalmente,

no pulmão e também para estudar a relação entre estes mediadores, citocinas

e imunoglobulinas. A SLMV é uma doença que afeta principalmente crianças,

as quais se infectam pela ingestão acidental de ovos larvados de T. canis

, um

parasita de cães (Beaver et al., 1952;

Gomes de Moraes et al.,

1971). As larvas

no estágio L3

saem dos ovos no intestino, vão para o fígado através do sistema

porta, rompem os vasos sinusóides e caem no parênquima hepático, ou migram

diretamente das veias hepáticas para a veia cava inferior. Algumas larvas

podem atravessar os vasos linfáticos e atingir o pulmão. Do pulmão, através da

veia pulmonar

, as larvas vão para o coração esquerdo e caem na circulação

sistêmica. Embora

o mecanismo não tenha sido esclarecido totalmente, sabe-se

que as larvas em lugar de completarem o seu ciclo evolutivo e voltarem para o

intestino, s

e espalham por todo organismo, e podem encistar-se em diferentes

órgãos, como por exemplo, no fígado e no pulmão. Nestes locais elas podem

ser destruídas, ou continuam a migrar através dos tecidos durante muitos

meses, a despeito da resposta imune

humoral (Gomes de Moraes et al, 1971).

Ao migrarem pelos tecidos as larvas liberam metabólitos e antígenos de

superfície (Rockey et al., 1983), iniciando uma resposta inflamatória que tem

como principal característica intenso infiltrado eosinofílico em diferentes tecidos

(Sugane & Oshima, 1980; Kayes & Oaks, 1980; Faccioli et al., 1996 e 1998) e

altos níveis de IgE (Turner et al., 1981; Nutman et ai., 1984). Tais características

também estão presentes em doenças alérgicas (Kay et al., 1991) e na asma (de

Monchy et al., 1985; Metzger et al., 1987).

Alguns autores demonstraram em seus experimentos que a infecção por T.

canis induz eosinofilia nas vias aéreas com diminuição da capacidade pulmonar.

Estes autores sugeriram que antígenos de T. canis atuam como ativadores

policlonais de linfócitos B, levando ao aumento da síntese

de IgE específica para

este parasita e também para outros antígenos não

relacionados, predispondo à

asma (

Buijs et al., 1994;

Buijs & Van-Knapen, 1994). Fato interessante

foi a

detecção de IgE específica para T. canis em crianças com asma e doenças

alérgicas (Buijs et al., 1997; Oteifa et al., 1998). Por outro lado, outras

observações sugerem que o aumento da produção de IgE nas infecções

helmínticas é capaz de bloquear a resposta alérgica a antígenos não

relacionados. Nesse caso, as moléculas de IgE específicas para o parasita,

estariam ocupando os

receptores FcRI e impedindo a ligação de IgE específicas

contra os alérgenos

(Dessaint et al., 1975; Turner et al., 1981; revisto por

Masters & Barret-Connor, 1985

; revisto por Moqbel & Pritchard, 1990; revisto por

Weiss, 2000). A atividade

bloqueadora da IgE parasita específica, nas reações

alérgicas, foi demonstrada em modelos animais e descrita em pacientes (Turner

et al., 1981; revisto por

Masters & Barrett-Connor, 1985; Moqbel & Pritchard,

1990).

Os eosinófilos são células capazes de secretar uma série de potentes

mediadores, como por exemplo: após a estimulação com ionóforo de cálcio

A2187 ou zymosan opsonizado, liberam os derivados do ácido araquidônico

pela via da 5-lipoxigenase, como o leucotrieno C4 (LTC4) (de Andres et al.,

1990, Del Pozo et al. 1990), leucotrieno B4 (LTB4) e compostos

intermediários como o 15-HETE (Wardlaw et al., 1994). Além destes

mediadores, os eosinófilos também liberam mediadores derivados pela via

da cicloxigenase, como prostaglandinas (PGE1) e PGE2) e tromboxana B2

(TXB2). Outros mediadores e citocinas liberados por estas células são PAF

(Fator Ativador de Plaquetas) (Wardlaw

et al.,

1994); polipeptídeo intestinal

vasoativo (VIP), fator transformador do crescimento alfa e beta (TGF-α e

TGF-β) (Kadin et al., 1993; Elovic, et al., 1994), fator estimulador de colônia

granulócitos e macrófagos (GM-CSF) (MOQBEL

et al.,

1991; Durham et al.,

1992); Fator de Necrose Tumoral (TNF-α) (Del Pozo et al., 1990; Weg et al.,

1995); interleucinas 1 (IL-1) (Del Pozo et al., 1990; Sanzs et al., 1995), IL-3

(Durham et al., 1992; Fujisawa

et al.,

1994); IL-4 (Durham et al., 1992;

Wardlaw et al., 1994; Nakajima et al., 1996), IL-5 (Desreumaux et al., 1992;

Durham et al., 1992; Terada et al., 1993; Faccioli et al., 1996), IL-6 (Hamid et

al., 1992), IL-8 (Nakajima et al., 1996), IL-10 (Nakajima et al., 1996;

Lamkhioued et al., 1996), IL-12 (Pearlman et al., 1997), IL-16 (Ferland et al.,

2004), proteína -1α de macrófago inflamatório (MIP-1α) (Oliveira et al., 2002;

Asano et al., 2003), RANTES (Schroder et al., 1994), eotaxina (Kitaura et al.,

1996) e interferon gama (IFN-γ) (Fujisawa et al., 1994; Lamkhioued et al.,

1996).

Além disso, eosinófilos ativados produzem uma grande quantidade de

citocinas inflamatórias que podem modular vários aspectos da resposta imune

(Moqbel et al., 1991; Kita, 1996). Muitos modelos experimentais têm sido

utilizados para o entendimento do processo inflamatório eosinofílico como, por

exemplo, o induzido pela imunização ovalbumina (Bruselle et al., 1997; Sano et

ai., 1999); S. mansoni (Lee et al., 2001), T. canis (Faccioli et al., 1996; Rogério et

al., 2003; Sá-Nunes et al., 2005), dentre outros.

Nas parasitoses, a eosinofilia é dependente da IL-5, uma vez que animais

infectados pelo Nippostrongylus brasiliensis (Coffman et al., 1989), S. mansoni

(Sher et al., 1990), T. canis (Faccioli et al., 1996 e 1998, Rogério et al., 2003) ou

Heligmosomoides polygyrus

(Urban et al., 1991) e tratados com anticorpos anti-

IL-5 tiveram diminuição

significativa do número de eosinófilos teciduais ou

circulantes (Faccioli et al., 1996).

Interleucina 5 (IL-5)

A IL-5 é uma citocina produzida e secretada por células T, mastócitos

e eosinófilos (Sanderson, 1992), a qual promove a diferenciação e

proliferação dos eosinófilos (Yamaguchi e col., 1988) e células B (Abbas e

col., 2000), possui também papel essencial na indução da eosinofilia em

inflamações alérgicas (Coëffier

et al.,

1994), asma (Hamid

et al.,

1991),

viroses (Coyle

et al.,

1995) e infecções helmínticas (Coffamn et al., 1989;

Limaye et al., 1990; Faccioli et al., 1996;). Outro papel importante atribuído a

IL-5 juntamente com outras citocinas, é a produção de anticorpos da classe

IgA e IgM (Abbas et al., 2000).

Experimentos utilizando camundongos

transgênicos para IL-5 sugeriram que os eosinófilos migram somente para

tecidos que expressam esta citocina (Dent et al., 1990). Curiosamente, em

outros modelos experimentais, alguns autores

descreveram pouca (Wang et al.,

1989)

atividade quimiotática da IL-5 para eosinófilos.

Faccioli e col

aboradores

(1996) relataram que esta citocina também é essencial para a saída dos

eosinófilos da medula óssea para o sangue e a migração destes para os tecidos.

A IL-5 é considerada uma das mais importantes citocinas

responsáveis pela indução direta e indireta de migração de eosinófilos. A

administração intratraqueal de IL-5 foi capaz de promover acúmulo de

eosinófilos no pulmão de cobaia “in vivo” (Collins et al., 1995)

e também

aumento o potencial os efeitos quimioatraentes da eotaxina (Collins et al., 1995;

Rothenberg et al., 1996), uma quimiocina da família C-C responsável pela

gração seletiva de eosinófilos para o local da inflamação (Griffiths-Jonhson et

at., 1993; José et al., 1994; Rothenberg et al., 1995; Garcia-Zepeda et al., 1996;

Ponath et al., 1996; Gonzalo et al., 1996; Li et al., 1997). Além disso, alguns

autores demonstraram que, modelos experimentais animais utilizando helmintos,

quando tratados com anti-IL-5 observa-se aumento de TNF-

, IL-10 e G-CSF,

enquanto IL-8 apresentou-se fortemente reduzida (Al-Qaoud et al., 2000).

O aumento de IgE sérica é outra característica importante da

toxocaríase em humanos (Turner et al., 1978), e em ratos como demonstrado

por anafilaxia cutânea passiva, usando extratos de vermes adultos como

antígeno (Dobson et al., 1966). A eosinofilia e aumento de IgE são

características comuns dos processos alérgicos (Hubscher, 1975; Okubo et

al., 1998) e da asma (Preiser et al., 1969; Kotsimbos & Hamid, 1997).

Algumas citocinas parecem participar da regulação da produção de IgE.

Dados da literatura mostraram que, IL-8 inibe a produção de IgE in vivo por

um processo dependente da inibição da produção de IL-4 (Kimata et al.,

1992). Sabe-se que, IL-4 é indutora de “switching” de classe para IgE, e que

sua produção pode ser inibida por IL-8 (Kimata et al., 1992), IFN-β, IFN-α ou

PGE

(Pene et al., 1988). Trabalhos recentes demonstraram que, animais

depletados do receptor de IL-8 apresentam aumento da produção de IgE em

resposta ao desafio com ovalbumina (De Sanctis et al., 1999).

Além disso, IL-8 é modulada por IL-5 em modelo de inflamação

eosinofílica (Faccioli et al., 1998). Estes autores observaram que IL-5 pode

regular negativamente a produção de IL-8 e conseqüentemente contribuir

para a manutenção de altos níveis de IgE, durante as infecções parasitárias

(Faccioli et al., 1998). Infecções parasitárias tem mostrado ser um importante

indutor de ativação para células B em animais (Jarrets & Bazin, 1974) e em

humanos (Turner et al., 1978), e antígenos parasitários induzem in vitro

síntese de IgG, IgM e IgE (Nutman et al., 1984). Em modelo experimental da

toxocaríase observou-se que após 14 e 21 dias de infecção as classes de

anticorpos IgM e IgG foram as primeiras a serem detectadas, onde IgM

persistiu apenas no 42° dia de infecção e a IgG manteve-se no soro até 105°

dia (Cuéllar et al., 2001).

Leucotrienos

Quanto aos mediadores lipídicos, os metabólicos do ácido aracdônico

pela via da lipoxigenase, entre eles os leucotrienos, estão entre os mais

potentes mediadores quimioatraentes, tanto para neutrófilos como para

eosinófilos (Shak

et al., 1

983; Lee & Arm, 1991; Faccioli

et al., 1

991). Os

leucotrienos são secretados por inúmeras células, entre elas macrófagos,

neutrófilos, eosinófilos e mastócitos (Samuelsson, 1983; Lewis

et al.,

1984).

O ácido aracdônico (AA), presente nos fosfolipídios da membrana celular, é

liberado pela ação da fosfolipase A

e metabolizado após ativação da 5-

lipoxigenases, a qual é ativada pela proteína ativadora da 5-lipoxigenase

(FLAP) (Miller

et al.,

1990). A FLAP cataliza os dois primeiros passos da

biossíntese dos leucotrienos (Rouzer

et al.,

1986; Ueda e

t al.,

1986). Nestas

reações, ocorre a adição de oxigênio molecular ao carbono 5 do ácido

aracdônico, formando o 5-HPETE, seguido da conversão deste para LTA

, o

qual é metabolizado por outras enzimas formando LTB

ou LTC

dependendo do tipo de célula, espécie animal e natureza do estímulo

(Hogaboom

et al.,

1986).

Vários são os trabalhos demonstrando o envolvimento dos

leucotrienos no recrutamento de leucócitos. Altos níveis de LTB

e LTC

acompanhados de intensa infiltração de PMN e eosinófilos, foram

demonstrados em lavados broncoalveolares (LBA) de pacientes e em

modelo experimental de asma (Wardlaw

et al.,

1989; Sehmi

et al.,

1991). Foi

demonstrado também que injeção intradérmica de LTB

, in vivo, promove

intenso acúmulo de eosinófilos em cobaias (Faccioli

et al.,

1991) e PMN em

humanos (Komatsu et al., 1999) da mesma forma que a inalação deste

mediador induziu intenso infiltrado destes granulócitos nas vias aéreas de

cães (Lee & Arm, 1991). No entanto, nada se sabe da participação tanto de

mediadores protéicos quanto de mediadores lipídicos, particularmente

leucotrienos, no recrutamento de eosinófilos na reação inflamatória induzida

pelo Toxocara canis.

Outros autores observaram que, altos níveis de LTB

e LTC

acompanhados de intenso infiltrado de neutrófilos e eosinófilos, são

observados nos LBA de pacientes asmáticos e em modelos experimentais

de asma (Wardlaw et al., 1989; Sehmi et al., 1991). Trabalhos anteriores

sugerem que, leucotrienos têm importante papel modulador na síntese de

diferentes citocinas inflamatórias e imunes. LTB

regula positivamente a

produção de IL-1, IL-2 e IFN-α e aumenta a atividade de células NK

(Hwang, 1989). Morita e colaboradores (1999) demonstraram que, culturas

de células T tratadas com antagonista de receptor de leucotrieno, o

composto FK506, inibem a proliferação das mesmas e também a síntese de

IL-2, IFN-α IL-4 e IL-12. Além disso, Velenga e colaboradores (1999)

observaram que linhagens de monócitos estimulados com LPS, na

presença de um inibidor da síntese de LTC4, o composto MK571,

apresentam aumento na síntese de IL-1 e IL-6 quando comparados com

monócitos estimulados apenas com LPS. Estes trabalhos mostram que,

leucotrienos estão intrinsecamente envolvidos na regulação da síntese de

citocinas inflamatórias e da resposta imune protetora como IL-6, IL-1, IL-12

e IL-2 e, que conseqüentemente, regulam a proliferação e ativação de

linfócitos T que são fundamentais para a resolução de doenças infecciosas,

como a toxocaríase.

Por outro lado, alguns trabalhos têm investigado o papel regulatório de

algumas citocinas sobre a produção de leucotrienos. Peters-Golden & Coffey

(1998) verificaram que, a incapacidade de macrófagos alveolares e

neutrófilos de produzir leucotrienos em pacientes HIV positivo é resultado da

redução da liberação de citocinas, como por exemplo, IFN-γ e G-CSF, por

estas células.

Os leucotrienos podem ainda modular a produção de algumas

classes de imunoglobulinas. Alguns pesquisadores demonstraram que, LTB

pode estimular a secreção de diferentes classes de imunoglobulinas como

IgM, IgG e IgE (Claesson et al., 1992; Yamaoka et al., 1994). Por outro lado,

a liberação de LTC

, LTD

e PGE

por monócitos, induz a produção de IgG,

IgA e IgE, mas não de IgM in vitro (Ferreri et al., 1986). No entanto, nada se

sabe a respeito da modulação da produção de citocinas e imunoglobulinas

por leucotrienos em modelo in vivo como na SLMV.

A investigação da participação da IL-5 e leucotrienos na regulação da

síntese e liberação de outras citocinas e diferentes isotipos de

imunoglobulinas, assim como a regulação da resposta inflamatória induzida

pelo T. canis, poderão auxiliar na compreensão da relação

parasita/hospedeiro. E ainda, auxiliar no desenvolvimento de drogas para o

tratamento das inflamações eosinofílicas presentes em diferentes doenças

como parasitoses, alergias e asma.

A morte do homem

começa no instante em

que ele desiste de

aprender.

(Albino Teixeira)

JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

Faccioli e colaboradores (1996; 1998), demonstraram que em cobaias

infectadas com T. canis ocorrem à liberação seqüencial de IL-5, IL-8 e TNF-

α, e que a IL-5 inibe a produção e liberação de IL-8 in vivo e in vitro. Neste

modelo a IL-5 parece ser a principal citocina envolvida na indução da

eosinofilia e do controle in vivo da síntese de IL-8. Sabendo que IL-8 diminui

a síntese de IgE, via inibição de IL-4, foi sugerido que IL-5 pode contribuir

indiretamente para o aumento da síntese de IgE observada nas doenças

parasitárias e alérgicas, em paralelo à eosinofilia. Devido a importância

destes dados para o controle das respostas alérgicas e parasitárias onde

ocorre aumento de IgE e de eosinófilos, consideramos importante avaliar na

toxocaríase murina, um modelo de resposta imune padrão Th2, se a IL-5

além de participar da eosinofilia, também regula a produção e liberação de

IL-8 e de outras citocinas, assim como os diferentes isotipos de

imunoglobulinas. Além disso, não está descrito na literatura nenhum dado

sobre o envolvimento de leucotrienos na eosinofilia, na produção e secreção

de interleucinas e de imunoglobulinas na SLMV em camundongos.

Assim nosso objetivo neste projeto foi, investigar na Síndrome da Larva

Migrans Visceral:

• Se a eosinofilia sangüínea e pulmonar é dependente de IL-5 e leucotrienos;

• Se IL-5 e leucotrienos modulam a liberação de citocinas e a síntese de IgE,

IgG1 e IgG2a.

MATERIAL E MÉTODOS

Feliz aquele que transfere o que

sabe e aprende o que ensina.

(Cora Coralina)

4-1- Animais

Os animais utilizados foram camundongos fêmeas da linhagem

C57BL/6, pesando entre 15 e 18 gramas, provenientes do Biotério

Unidade II da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo (FCFRP-USP). Animais “Knockout (KO)” para

a enzima 5-lipoxigenase e 129 (animais “background” para os 5LO-KO)

foram adquiridos do The Jackson Laboratory – JaxMice (Bar Harbor, ME)

e se encontram no Biotério Unidade II da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FCFRP-

USP). E os animais “Knockout (KO)” para a citocina IL-5 não foram

importados a tempo dos experimentos para a tese. ainda estão sendo

providenciados devido a problemas apresentados pelo JaxMice por causa

das novas regras de importação do governo federal do Brasil. Todos os

animais foram mantidos no Biotério da FCFRP-USP, com livre acesso à

água e alimento.

4-2- Obtenção de ovos embrionados de T. canis

Os ovos foram obtidos de fêmeas do parasita, retiradas de cães

jovens sacrificados rotineiramente no Biotério Central da Prefeitura do

Campus Administração de Ribeirão Preto (PCARP) - USP. As fêmeas

foram dissecadas para extração de seus úteros, os quais foram

divulsionados em placas de Petri, contendo formalina 3%. O material foi

filtrado em gaze para obtenção dos ovos, e armazenados em solução de

formalina em placas de Petri, deixados à temperatura ambiente até

alcançarem o estágio infectivo (L3) (GOMES DE MORAES, 1971).

4-3- Infecção dos camundongos com ovos de T. canis e grupos

experimentais

Os camundongos C57BL/6 foram infectados oralmente por

gavagem com 1000 ovos/0,5 ml salina, empregando cânulas

apropriadas. Os animais foram sacrificados com anestésico no tempo

por nós estabelecidos, ou seja no 18° dia após a infecção para a

realização dos procedimentos descritos a seguir. Para este período

estudado foram utilizados 4 animais para o grupo controle (sem

infecçãpo e sem tratamento), 6 para o grupo infectados com T. canis, 6

para os grupos infectados com T. canis tratados com anti-IL-5 e/ou

tratados com MK-886, 6 para o grupo “Knockout (KO)” para a enzima 5-

lipoxigenase infectados com T. canis e 6 para o 129 com os respectivos

tratamentos citados anteriormente para o C57BL/6, em cada

experimento. Foram realizados três experimentos independentes.

4-4- Obtenção das células dos lavados broncoalveolares (LBA) e do

sangue

No tempo já descrito, os animais foram sacrificados com

anestésico tribromoethanol (Acros Organics) com 30 mg/kg s.c. e

realizados LBA dos grupos. Para tanto, foi utilizado 1,0 mL de solução

salina tamponada (PBS), contendo 0,5 % de citrato de sódio

(PBS/Citrato), empregando cânulas de polietileno introduzidas na parte

superior da traquéia. O procedimento foi repetido 3 vezes, totalizando

um volume final de 3 mL. O sangue foi obtido por sangria total dos

animais, através de punção cardíaca. A contagem do número de células

nos lavados foi realizada como descrito no item 4-5.

4-5- Contagem total e diferencial das células do LBA e do sangue

Número total das células dos diferentes compartimentos foi

determinado empregando solução de Turk e a contagem foi feita em

câmara de Neubauer. A contagem diferencial foi feita nos esfregaços

sangüíneos e nas preparações em citocentrífuga (Cytospin 3, Shandon

Souther Products Lt., Cheshire, UK) e corada pelo corante de Rosenfeld

(FACCIOLI e col., 1991). Em cada lâmina foram contadas 100 células,

utilizando microscopia de luz com aumento final de 1000 X.

4-6. Produção de anticorpos anti-IL-5 (TRFK-5)

Os hibridomas TRFK-5 foram gentilmente cedidos pela Dra. Wirla

Tamshiro, UNICAMP. Os anticorpos monoclonais TRFK-5 (IgG1) foram

purificados de sobrenadantes de culturas do respectivo hibridoma. Estes

sobrenadantes foram congelados até atingirem o volume de um litro e em

seguida foram ultrafiltrados e concentrados para 1/10 do volume inicial, em

AMICON utilizando membrana YM-100. O conteúdo protéico deste

concentrado foi precipitado em solução de sulfato de amônio à 45% de

saturação e posteriormente centrifugado a 5000 g por 30 minutos. O resíduo

foi ressuspenso em PBS e dialisado por quatro dias em PBS, com trocas a

cada 12 horas. Após a diálise, os anticorpos foram purificados através de

cromatografia de afinidade, em coluna de Proteína A (PHARMACIA Biotech,

Uppsala, Sweden) e posteriormente quantificados, aliquotados e

armazenados para uso posterior em freezer -70

4-7- Tratamento dos Animais com Inibidor da Síntese de

Leucotrienos (MK-886)

O composto MK-886 ou L663,536 (3-[1-(4-clorobenzil)-3-t-butil-tio-

5-isopropilindol-2-yl]-2,2-ácido dimetilpropanóico, cedido pela “MERCK-

FROSST, CANADA INC”) é um inibidor da síntese de leucotrienos. A

droga foi diluída em 100 µl de etanol absoluto seguido da adição de 900

µl de água filtrada. Após esta diluição, o volume foi completado com

água filtrada, de modo a se obter a concentração de 1 mg/mL Os

animais foram tratados diariamente com 1 mg/kg com intervalo de 24 hs,

por via oral, sendo a primeira dose administrada 1 hora antes da

infecção com ovos de T. canis e a última, 1 hora antes do sacrifício nos

diferentes tempos pré- estabelecidos.

4.8. Tratamento com anticorpos anti-IL-5

A literatura mostra bastante variação quanto à dose exata desses

anticorpos que pode promover uma depleção desta citocina eficiente em

camundongos (Buijs et al., 1994). Sendo assim, foi feito uma curva dose-

resposta para cada dose do anticorpo, observando as alterações nas

populações circulantes de animais controles e a migração dessas células

para a cavidade peritoneal após estímulos específicos. Os estímulos foram

carragenina (100 µg/ml) e a infecção com T. canis (1000 ovos/animal),

devido capacidade dos mesmos promoverem migração relativamente

seletiva de neutrófilos e eosinófilos respectivamente em tempos

apropriados. As alterações provocadas pelos anticorpos foram observadas

24 e 48 horas (fase aguda) e 7 e 30 dias (fase crônica) após a depleção. A

dose de TRFK-5 utilizada foi de 3 mg/kg/animal.

4.9- Dosagem de peroxidase de eosinófilos (EPO) no tecido

pulmonar de camundongos

Para determinar a atividade da EPO no tecido pulmonar, os pulmões são

inicialmente perfundidos com solução salina contendo 10 mM de EDTA (ácido

etilendinitrilotetracético - Merck S.A., Brasil) através da artéria

pulmonar. Os

órgãos são removidos, pesados e ressuspendidos a 5% do

seu peso em

tampão Hanks sem vermelho de fenol, contendo 10 mM de Hepes (Sigma) e

então homogeneizado em homogeneizador Potter (ou no homogeneizador

elétrico, na posição entre 1 e 2). O homogeneizado é centrifugado a 1950xg por

10 minutos e o "pellet" resultante lisado através de choque hipotônico, esta

suspensão é novamente centrifugada a 1950xg por 10 min. e o "pellet"

resultante também ressuspendido a 5% em tampão Hanks contendo 0,5% de

HTAB (brometo de hexadecil-trimetil amónio –Sigma) Esta suspensão sofre

choque térmico utilizando-se nitrogênio líquido e é em seguida centrifugada em

microcentrífuga (3000 rpm na centrífuga "eppendorf" ou 2 minutos no

momentâneo de outras centrífugas). O sobrenadante é diluído seriadamente em

tampão Hanks/HTAB para análise da EPO como citado a seguir. Amostras do

tecido são diluídas seriadamente e incubadas em placas de 96 poços com 1,5

mM de OPD (13,5 mg) em 0,05 mM de tampão TRIS/HCI (50 mL) e 6,6 mM de

(37,35

) durante 30 minutos à temperatura ambiente. A reação é

interrompida com H2SO4 4M e a absorbância determinada

no leitor de ELISA

(Metertech Inc. Modelo 960, filtro de 492 nm)

4-10- Estudos Histológicos e Microfotografias

Pulmões foram removidos dos camundongos dos diferentes

grupos, 18 dias após a infecção e imediatamente fixados em formol

tamponado 10%. Em seguida, estes tecidos foram incluídos em blocos de

parafina, seccionados em cortes de 4-6 µm e foram corados com H.E.

(Hematoxilina/Eosina), para microscopia ótica. As lâminas foram

fotografadas, com o auxílio de microscópio contendo máquina fotográfica

acoplada (ARISTOPLAN-LEITZ WETZLAR Germany). Os aumentos das

fotografias analisadas foram de 100 X e 1000 X.

4-11- Ensaio de imunoenzimático (ELISA)

4-11-1 Para detecção de citocinas

Para ELISA utilizamos placas (Corning Incorporated, Corning, NY,

USA) de microtitulação (Poly Sorp) com 96 poços, recobertas, com anticorpo

monoclonal (50µl/poço), anti as diferentes citocinas: KC (IL-8), TNFα, IL-4,

IL-10, IFN-γ, e IL-5 ( R&D Systems, MN e PharMingen, San Diego, CA) em

concentrações padronizadas. Os mesmo foram diluídos em tampão de

ligação (ver soluções). As placas foram incubadas a 4°C por 18 horas. Após

este período, os sobrenadantes foram desprezados e o bloqueio dos sítios

de ligações inespecíficas foi feito adicionando-se 150µl de PBS 2,5% de BSA

(GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA). Novamente, as placas foram

incubadas por 2 horas em temperatura ambiente e em seguida lavadas 4

vezes com tampão de lavagem (ver soluções). A seguir foram adicionadas as

diferentes diluições das citocinas padrão e as amostras em estudo (100

µl/poço) diluídas em tampão PBS/BSA/ 0,5% de Tween (Sigma, St. Louis,

MO). A primeira concentração da citocina recombinante padrão foi

padronizada de acordo com cada interleucina recombinante, a qual foi

sucessivamente diluída na base 2 até 15,6 pg/ml. Após incubação por 18

horas a 4°C, foi feito novo ciclo de lavagem e adicionado o anticorpo

policlonal ou secundário biotinilado (100 µl/poço), em concentração

determinada, diluído em PBS/BSA/Tween 0,5%. Após nova incubação, 2

horas a 37°C, e novo ciclo de lavagem, foi adicionado (100 µl/poço) do

reagente AB (Avidina/Biotina – Dako, Carpinteria, CA, USA) para

amplificação da reação. Novamente, as placas foram incubadas entre 30 min

a 60 min a 37°C, e em seguida lavadas 4 vezes vigorosamente. O substrato-

(OPD – Sigma, St. Louis, MO) foi adicionado (100 µl/poço) e após tempo de

45 min à 90 min da reação, a mesma foi bloqueada com 100 µl/poço de

1M. A leitura da absorbância foi feita no leitor de ELISA (Metertech

Inc. Modelo 960, filtro de 490 nm) e a concentração das interleucinas foi

calculada a partir da curva padrão.

4-11-2-Para detecção de Imunoglobulinas

Para detecção das imunoglobulinas (IgE, IgG1, IgG2a - PharMingen,

San Diego, CA) utilizamos placas (Corning Incorporated, Corning, NY, USA)

de microtitulação (Poly Sorp) com 96 poços, recobertas, 200 ng de proteína

do antígeno total de T.canis (diluídos em tampão carbonato e aplicados

100ul/poço). Posteriormente, lavamos a placa 5 X com PBS 1 X + 0,05%

Tween 20 (Sigma, St. Louis, MO) e acrescentamos 200 µL de tampão

bloqueio (PBS 1 X + Tween 0,05% + SBF 5% - (GIBCO BRL, Grand Island,

NY, USA) e incubamos por 1 hora a 37°C. Em seguida, lavamos a placa 5 X

novamente e colocamos 100 µL das amostras diluídas no tampão de

bloqueio e incubamos por 1 hora em estufa a 37

C. Posteriormente,

lavamos a placa 5 X e incubamos 1 hora a 37

C com 10

µL de Ac

conjugado com biotina (10 µL Ac + 10 mL solução tampão). Novamente,

após este procedimento, lavamos a placa 5 X e incubamos 30 min com 100

µL A/B (Dako, Carpinteria, CA, USA) (preparado 30 min antes do uso:

diluição 1:1000 – 10 µL para 10 mL). Em seguida, lavamos a placa 5 X e

incubamos com 100 µL de solução de OPD (Sigma, St. Louis, MO ) (1

pastilha de OPD + 10 mL de diluente OPD). Logo após, a reação foi

bloqueada com 50 ul/poço de H

1N. A leitura da absorbância foi feita

no comprimento de onda 450nm em leitor de ELISA (Metertech Inc. modelo

960).

4-12- Preparo de soluções

4.12.1- Corante Rosenfeld

Utiliza-se: 0,97g de Giemsa (Azur-Eosin-Methytenblau) e 0,53g de May-

Grünwalds (Hämatologie). Misturar os dois corantes em 1000 mL de

metanol (Merck) e conservar em geladeira. Para o uso, filtrar em papel de

filtro.

4.12.2- Salina tamponada com fosfato (PBS- 0,1 M)

Utiliza-se: 80 g (NaCl); 0.2 g (KCl); 11.5 g (Na

HPO

); 2.0 g (KH

Diluir em 1 litro de água de milli-Q. Acertar o pH para 7,4 e autoclavar.

Para o uso diluir 1:10 em água de milli-Q estéril.

4.12.3- Solução de Turk

Utiliza-se: 15 mL (Ácido acético glacial); 0.002 g (Violeta de genciana);

500 mL (água deionizada q.s.p).

4.12.4- Tampão de Ligação (ELISA)

Utiliza-se: 10,42 g de Na

HPO

pH 9,0. Diluir em 1000 mL de água de

milli-Q.

4.12.5- Meio RPMI (incompleto)

Utiliza-se: 5,2 g de RPMI (Sigma St. Louis, MO) (pó); 1,0 g de Bicarbonato

de sódio; 1,1 g de HEPES. Completar estes sais com 500 mL de água

miili-Q, e acertar o pH para 7,2. Filtrar e estocar em geladeira.

Para o meio RPMI completo, acrescentar ao incompleto 10 % de soro

fetal bovino e 1 mL de estreptomicina. Filtrar e estocar.

4-13- Análise Estatística

Os resultados são expressos como média ± EPM. Os resultados

obtidos nos diferentes experimentos foram analisados utilizando a análise de

variância ANOVA. Para análise estatística foi utilizado o programa INSTAT,

Graph Pad, (San Diego, California, USA). A significância estatística foi

estabelecida em valores de P < 0,05.

As únicas respostas

interessantes são aquelas que

destroem as perguntas.

(Susan Sontag)

RESULTADOS

5- RESULTADOS – PARTE I

5.1- Padronização do modelo da Síndrome da Larva Migrans Visceral

(SLMV) em camundongos C57BL/6

Durante o mestrado mostramos que, os camundongos Balb/c infectados

com T. canis, que é o modelo experimental da SLMV apresentavam eosinofilia no

peritôneo, pulmão e no sangue. A proposta para o doutorado foi avaliar se a IL-5 e

leucotrienos modulam a liberação de citocinas e imunoglobulinas neste modelo

utilizando camundongos deficientes de IL-5 (IL-5 KO) e camundongos deficientes

de 5-lipoxigenase (5LO-KO). Assim, nessa primeira etapa padronizamos o modelo

da SLMV em camundongos controles C57BL/6 que possuem o mesmo

“background” (wild type) para os camundongos IL-5 KO, utilizando como

parâmetro o modelo de infecção em camundongos Balb/c.

5.1.1- Células presentes no espaço broncoalveolar de C57BL/6

A figura 1 A mostra o aumento do número de eosinófilos no espaço

broncoalveolar de camundongos C57BL/6 infectados com ovos de T. canis, em

comparação com os animais Balb/c, 18 dias após a infecção. O tempo de 18 dias

foi escolhido porque anteriormente demonstramos que camundongos Balb/c

apresentavam neste período o pico da eosinofilia (Anibal et al., 2001). Quando

comparado com o grupo controle, que recebeu apenas PBS, animais infectados

de ambas linhagens apresentaram migração significativa de eosinófilos para o

espaço broncoalveolar. Neste período observamos que, em relação ao grupo

controle, animais Balb/c e C57BL/6 mostravam aumento na migração de

eosinófilos 40% e 70% respectivamente (Fig. 1 A).

5.1.2- Número de eosinófilos no sangue circulante

A figura 1 B mostra que camundongos Balb/c e C57BL/6 infectados com T.

canis apresentam um aumento no número de eosinófilos no sangue (25% e 40%,

respectivamente), quando comparados aos grupos controles, não infectados.

0.0

0.2

0.4

0.6

Balb PBS

Balb Tc

C57 PBS

C57 Tc

Grupos Experimentais

Eosinófilos x 10

/ml

0.0

0.2

0.4

0.6

Balb PBS

Balb Tc

C57 PBS

C57 Tc

Grupos Experimentais

Eosinófilos x 10

/ml

Figura 1: T. canis aumenta o número de eosinófilos no (A) espaço broncoalveolar

e (B) no sangue de camundongos Balb/c e C57BL/6. Os resultados estão

expressos como média ± EPM de três experimentos independentes (n=12). As

diferenças estatísticas foram determinadas pela análise de variância utilizando o

teste ANOVA. Os asteriscos representam diferenças significativas entre o grupo

infectado e o grupo não infectado. Foram considerados significativos os resultados

onde o * p <0,05.

5.2.- Efeito da inibição da síntese de leucotrienos ou da neutralização de IL-5.

Para avaliarmos a participação de leucotrienos e IL-5 na Síndrome da Larva

Migrans Visceral em camundongos, empregamos o composto MK-886 e o

anticorpo monoclonal TRFK-5, administrando isoladamente ou em associação.

Inicialmente verificamos a ação inibitória do composto MK-886 na linhagem

C57BL/6, comparando com os animais Balb/c. Para isto, realizamos em um

mesmo dia, empregando a mesma preparação de ovos de T. canis, um

experimento com as 2 linhagens de camundongos.

A figura 2 A mostra que o tratamento diário com MK-886 inibe a eosinofilia no

LBA (Fig. 2 A) e no sangue (Fig. 2B) em camundongos Balb/c e C57BL/6 com 18

dias de infestação pelo T. canis.

0.0

0.5

1.0

1.5

Balb Tc

Balb MK886

C57 Tc

C57 MK886

Grupos Experimentais

Eosinófilos x 10

/ml

0.0

0.5

1.0

1.5

Balb Tc

Balb MK886

C57 Tc

C57 MK886

Grupos Experimentais

Eosinófilos x 10

/ml

Figura 2: Efeito do inibidor da síntese de leucotrienos no recrutamento de

eosinófilos para o (A) espaço broncoalveolar (B) no número de eosinófilos no

sangue de camundongos C57BL/6 infectados com T. canis pelo composto MK-

886. Os resultados estão expressos como média ± EPM de três experimentos

independentes (n=12). O símbolo # representa a diferença significativa entre os

resultados dos animais infectados sem ou com tratamento. O símbolo #

representa diferença significativa entre os animais infectados não tratados e os

tratados com MK-886. As diferenças estatísticas foram determinadas pela

análise de variância utilizando o teste ANOVA.

5.2.1- Efeito da neutralização de IL-5.

Posteriormente, padronizamos as doses de TRFK-5 a serem utilizadas.

Foram empregados dois protocolos para a neutralização da IL-5. No primeiro

protocolo animais (C57BL/6) receberam apenas 1 mg/kg do anticorpo monoclonal

TRFK-5 no primeiro dia da infecção (i.p.), quinze minutos após a infecção. No

segundo protocolo os animais receberam 1 mg/kg de TRFK-5 no primeiro dia da

administração dos ovos (15 min antes dos ovos) e 0,3 mg/kg nos dias 3, 12 e 17

após a infecção com T. canis. Podemos observar na figura 3 A que os 2

esquemas de tratamento foram capazes de inibir a migração de eosinófilos para a

cavidade peritoneal. Para demonstrar que a inibição da eosinofilia estava

relacionada com a depleção de IL-5, esta citocina foi determinada no soro dos

animais parasitados e tratados ou não com TRFK-5. A figura 3 B mostra que os

tratamentos com TRFK-5 (1 e 4 doses) inibiram os níveis de IL-5 no sangue dos

animais. Embora, os tratamentos com TRFK-5 tenham reduzido 150% os níveis de

IL-5, esta diminuição refletiu na diminuição do número de eosinófilos circulantes

(Fig. 3B). Nos demais experimentos escolhemos o protocolo com 4 doses para

garantir a neutralização da IL-5 em todo o período do experimento.

Uma vez determinado o esquema de tratamento dos animais com anticorpo

anti-IL-5, e com o composto MK-886 prosseguimos com nossos estudos. Partindo

do princípio que o composto MK886 foi eficiente em inibir a eosinofilia no

camundongo Balb/c, a próxima etapa do foi avaliar a modulação da eosinofilia

pulmonar e sangüínea em animais C57BL/6.

PBS

T. canis (Tc)

Tc+TRFK-5 1dose

Tc+TRFK-5 4 doses

Grupos Experimentais

Eosinófilos x 10

/ml

100

200

300

400

500

PBS

T. canis

Tc+TRFK5 1 dose

Tc+TRFK5 4 doses

24 horas após TRFK-5

IL-5 pg/ml

Figura 3: (A) Eosinófilos no sangue (B) e níveis de IL-5 no soro de camundongos

C57BL/6 infectados com T. canis tratados ou não com TRFK-5. Os resultados

estão expressos como média ± EPM de três experimentos independentes (n=12).

O símbolo # representa a diferença significativa entre os resultados dos animais

infectados sem tratamento e os tratados. Os símbolos * representam diferença

significativa entre os animais controle e os infectados tratados ou não com TRFK-

5. As diferenças estatísticas foram determinadas pela análise de variância

utilizando o teste ANOVA.

5.2.2- Efeito da inibição da síntese de leucotrienos e/ou neutralização da

IL-5 sobre o número de eosinófilos e células mononucleares no espaço

broncoalveolar de animais C57BL/6

A figura 4 (A) mostra que o tratamento com MK-886, TRFK-5 ou ambos em

camundongos C57BL/6 infectados apresenta uma redução no número de

eosinófilos no espaço broncoalveolar em relação ao número verificado nos

animais somente infectados. Não foi observada diferença no número de

eosinófilos nos animais entre os três tratamentos.

O número de células mononucleares no espaço broncoalveolar também foi

inibido pelo tratamento com TRFK-5, na presença ou na ausência do composto

MK 886. No entanto, MK-886 sozinho não reduziu de forma significativa o número

de células mononucleares no LBA (Fig. 4B).

5.2.3- Efeito da inibição da síntese de leucotrienos e/ou neutralização da IL-5

sobre o número de eosinófilos e células mononucleares no sangue de

animais C57BL/6

Verificamos que o tratamento com o inibidor de leucotrienos (MK886) e/ou

anticorpo anti-IL-5 em camundongos infectados reduziram de forma significativa o

número de eosinófilos circulantes (Fig. 5 A). Embora o tratamento concomitante

tenha reduzido o número de eosinófilos no sangue, verificamos que não há

diferença significativa quando comparados aos grupos que receberam MK886 ou

anti-IL-5.

O número de células mononucleares no sangue periférico dos animais

infectados com T. canis apresentou significante diminuição em todos os

tratamentos empregados (Fig.5 B), sendo que a maior porcentagem de inibição

ocorreu com o tratamento conjunto com TRFK-5 e MK-886 (80%), seguido do

tratamento com MK886 (70%) e com TRFK-5 (60%).

PBS

T. canis (Tc)

Tc+MK-886

Tc+TRFK-5

Tc+MK+TRFK-5

Grupos Experimentais

Eosinófilos x 10

/ml

PBS

T. canis (Tc)

Tc+MK-886

Tc+TRFK-5

Tc+MK+TRFK-5

Grupos Experimentais

Células mononucleares x 10

/ml

Figura 4: Efeito da inibição da síntese de leucotrienos e/ou depleção de IL-5 no

número de (A) eosinófilos e de (B) células mononucleares no LBA de

camundongos C57BL/6 infectados com T. canis. O grupo controle recebeu apenas

PBS oral. Os resultados estão expressos como média ± EPM de três

experimentos independentes (n=8-16). O símbolo * representa a diferença

significativa entre os resultados dos animais controles e infectados (tratados ou

não). O símbolo # representa diferença significativa entre os animais infectados e

os tratados com MK-886 e/ou TRFK-5. As diferenças estatísticas foram

determinadas pela análise de variância utilizando o teste ANOVA.

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

PBS

T. canis (Tc)

Tc+MK-886

Tc+TRFK-5

Tc+MK+TRFK-5

Grupos Experimentais

Eosinófilos x 10

/ml

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

PBS

T. canis (Tc)

Tc+MK-886

Tc+TRFK-5

Tc+MK+TRFK-5

Grupos Experimentais

Células mononucleares

x 10

/ml

Figura 5: Efeito da inibição da síntese de leucotrienos e/ou depleção de IL-5 no

número de (A) eosinófilos e de (B) células mononucleares no sangue de

camundongos C57BL/6 infectados com T. canis. O grupo controle recebeu apenas

PBS oral. Os resultados estão expressos como média ± EPM de três

experimentos independentes (n=8-16). O símbolo * representa a diferença

significativa entre os resultados dos animais controles e infectados (tratados ou

não). O símbolo # representa diferença significativa entre os animais infectados e

os tratados com MK-886 e/ou TRFK-5. As diferenças estatísticas foram

determinadas pela análise de variância utilizando o teste ANOVA.

5.3.- Níveis de peroxidase de eosinófilos (EPO) em pulmões de animais

C57BL/6, infectados e submetidos ou não aos diferentes tratamentos

A dosagem da EPO foi primeiramente padronizada empregando diferentes

diluições das amostras. Com o objetivo de avaliar os eosinófilos no parênquima

pulmonar, quantificamos a enzima EPO nos tecidos pulmonares dos animais dos

diferentes grupos experimentais. As diluições do sobrenadante dos

homogeneizados de pulmão foram de 1/2, 1/32 e 1/96 (dados não mostrados). Os

melhores resultados foram obtidos empregando a diluição de 1/32.

Como o esperado, a Figura 6 mostra que a infecção de camundongos

C57BL/6 com T. canis aumenta significativamente os níveis de EPO nos pulmões.

Os nossos dados indicam que animais infectados e tratados com TRFK-5 ou MK-

886, apresentaram inibição nos níveis de EPO nos homogeneizados de pulmão.

Estes resultados correlacionam com os dados mostrando que o tratamento com

MK-886 ou TRFK-5 inibe o número de eosinófilos no LBA dos animais C57BL/6

infectados (Fig. 4A).

0.00

0.25

0.50

PBS

T. canis (Tc)

Tc+MK886

Tc+TRFK5

Grupos Experimentais

Densidade óptica (450

Figura 6: Níveis de EPO no sobrenadante dos homogeneizados de pulmões de

animais C57BL/6 infectados com T. canis tratados ou não com MK-886 e/ou TRFK-5.

Os resultados estão expressos como média ± EPM de três experimentos

independentes (n=12). O símbolo * representa a diferença significativa entre os

resultados dos animais controles e infectados (tratados ou não). O símbolo #

representa diferença significativa entre os animais infectados e os tratados com MK-

886 e/ou TRFK-5. As diferenças estatísticas foram determinadas pela análise de

variância utilizando o teste ANOVA.

5.4- Histopatologia do parênquima pulmonar de camundongos

infectados com ovos de T. canis tratados ou não com MK-886 e/ou

TRFK-5

A histopatologia dos pulmões dos animais infectados com T. canis e

tratados ou não com MK-886 e/ou TRFK-5 foi avaliada após 18 dias de

infecção. Neste período analisamos o infiltrado celular e a arquitetura do tecido

pulmonar dos animais Balb/c e C57BL/6, como descrito abaixo.

5.4.1- Histopatologia do tecido pulmonar de camundongos Balb/c

infectados com ovos de T. canis tratados ou não com MK-886 e/ou TRFK-

Em contraste com o grupo controle sem infecção, observamos grande

desorganização na arquitetura do parênquima pulmonar de animais infectados

com T. canis, com predomínio de grupamentos celulares, nas regiões

peribronquial constituídos de eosinófilos e macrófagos, com alguns linfócitos

presentes (Fig. 7).

Anteriormente, nós mostramos que camundongos Balb/c infectados com

T. canis e tratados com MK-886 apresentavam redução significativa de células

inflamatórias no parênquima pulmonar. Estes dados se repetem neste estudo

onde demonstramos novamente que MK-886 inibe o recrutamento de células

inflamatórias para o pulmão destes animais (Fig. 7 D). No entanto, tratamento

com TRFK-5 não alterou o infiltrado inflamatório instalado no parênquima

pulmonar dos animais Balb/c (Fig. 7 C).

5.4.2- Histopatologia do tecido pulmonar de camundongos C57BL/6

infectados com ovos de T. canis tratados ou não com MK-886 e/ou TRFK-5

Embora os resultados relativos à contagem de células no LBA (Fig. 4A e

4B) em camundongos C57BL/6 infectados com T. canis e tratados com MK-886

ou TRFK-5 indiquem uma diminuição do número de células inflamatórias no

espaço broncoalveolar e redução nos níveis de EPO em comparação com o grupo

infectado não tratado (Figura 4 e Figura 6, respectivamente). A análise

histopatológica surpreendentemente indica que animais infectados tratados ou

não com MK-886 ou TRFK-5 apresentam intenso infiltrado inflamatório no

parênquima pulmonar caracterizada pela presença de eosinófilos, macrófagos e

linfócitos (Fig. 8 B, C e D). Animais C57BL/6 infectados tratados com MK-886 ou

TRFK-5 apresentaram comprometimento pulmonar, com acúmulo de células

inflamatórias predominantemente ao redor dos vasos, caracterizando uma

periarteriolite distribuída por todo o parênquima pulmonar destes animais (Fig. 8 C

e D).

5.5- Citocinas nos pulmões de animais infectados com T. canis tratados ou

não com MK-886 e/ou TRFK-5

Uma vez que demonstramos que o recrutamento de eosinófilos induzido

pelo T. canis é parcialmente dependente de leucotrienos e IL-5 em animais

C57BL/6, nosso próximo passo foi avaliar se estes mediadores modulam a reação

inflamatória por um mecanismo dependente da síntese de citocinas. Assim,

determinamos a concentração de KC (IL-8), TNF-α, IL-4, IL-10 e IFN-γ nos

sobrenadantes dos homogeneizados do parênquima pulmonar de animais dos

diferentes grupos experimentais. No soro foi feito apenas dosagem para a KC (IL-

8) devido ao pequeno volume obtido de cada amostra. Os efeitos dos tratamentos

com MK-886 e TRFK-5 sobre produção das diferentes citocinas estão descritos

nos itens abaixo:

5.5.1- Efeito da inibição de IL-5 e leucotrienos na produção de quimiocina KC

(IL-8) no soro de camundongos infectados com T. canis tratados ou não com

MK-886 ou TRFK-5 ou ambos

O resultado expresso na Figura 9 indica que a infecção com T. canis induziu

aumento de KC no soro dos animais C57BL/6. Observamos também que o

tratamento com TRFK-5 em animais infectados, reduz os níveis de KC (IL-8) no

soro, porém essa diferença não é significante. Os tratamentos com MK-886 ou

MK-886 e TRFK-5 em animais infectados não alterou os níveis de KC sérico.

100

150

PBS

T.canis (Tc)

Tc+MK886

Tc+TRFK5

Tc+MK+TRFK5

Grupos Experimentais

KC pg/ml

Figura 9. Concentração de KC (IL-8 murina) no soro de camundongos C57BL/6

infectados com T. canis tratados ou não com MK-886, com TRFK-5 ou ambos e o

grupo controle. Os resultados estão expressos como média ± EPM de três

experimentos independentes (n=12). * p <0,05 representa a diferença significativa

entre os resultados obtidos do grupo controle em relação ao somente infectado, e

# representa a diferença significativos entre os animais infectados tratados com

MK-886, com TRFK-5 ou ambos comparados com o grupo somente infectado sem

tratamento. As diferenças estatísticas foram determinadas pela análise de

variância utilizando o teste ANOVA.

5.5.2- Efeito da inibição de IL-5 e leucotrienos na produção de citocinas por

células de pulmões de camundongos infectados com T. canis tratados ou

não com MK-886 ou TRFK-5 ou ambos

A Figura 10 mostra que a infecção de camundongos C57BL/6 com T. canis

aumenta significativamente a KC (IL-8) presente nos pulmões. Verificamos que

animais infectados e tratados com MK-886 ou TRFK-5 não afeta a produção de IL-

8 por células do parênquima pulmonar. No entanto, o tratamento de animais

infectados com MK-886 e TRFK-5, reduzem significativamente os níveis de KC

(IL-8) produzidos no pulmão.

Verificamos que a infecção de camundongos C57BL/6 pelo T. canis aumenta

significativamente os níveis de TNF-α nos pulmões quando comparado ao grupo

controle não infectado (Fig. 11 A). Níveis elevados de TNF-α, também foram

observados no pulmão de animais infectados tratados com MK-886 e/ou TRFK-5.

Os tratamentos empregados levam a uma tendência a reduzir os níveis de TNF-α

no pulmão de camundongos infectados, porém este efeito não é estatisticamente

significativo.

Em relação aos níveis de IFN-γ nos pulmões, observamos que não houve

diferença significativa quando comparamos os níveis desta citocina entre os

animais controles e infectados ou infectados submetidos aos diferentes

tratamentos (Figura 12B). As determinações dos níveis de IL-4 indicam que a

infecção leva a um aumento dos níveis dessa citocina no pulmão. Os tratamentos

com MK-886 ou TRFK-5 não afetaram os níveis dessas citocina. Animais

infectados e tratados com MK-886 e TRFK-5 apresentam uma tendência a terem

maiores níveis de IL-4 quando comparados aos animais infectados, porém essa

diferença não é significativa (Figura 11B). Quanto á produção de IL-10,

observamos na figura 12 A que, a infecção induziu aumento significativo desta

citocina, e também os animais infectados e tratados com MK-886 apresentam um

aumento relevante de IL-10 em relação aos níveis dessa citocina presentes no

pulmão de animais não infectados. Diferentemente, animais infectados e tratados

com TRFK-5 ou MK-886 e TRFK-5 apresentam uma redução significativa nos

níveis de IL-10 no pulmão, quando comparados aos níveis encontrados em

animais infectados e tratados com MK-886.

250

500

PBS

T.canis (Tc)

Tc+MK886

Tc+TRFK-5

Tc+MK+TRFK-5

Grupos Experimentais

KC pg/mL

Figura 10. Concentração de KC (IL-8 murina) no homogeneizado de pulmão de

camundongos C57BL/6 infectados com T. canis tratados ou não com MK-886,

com TRFK-5 ou ambos e o grupo controle. Os resultados estão expressos como

média ± EPM de três experimentos independentes (n=8-16). * p <0,05 representa

a diferença significativa entre os resultados obtidos do grupo controle em relação

ao somente infectado, e # representa a diferença significativas entre os animais

infectados tratados com MK-886, com TRFK-5 ou ambos comparados com o

grupo somente infectado sem tratamento. As diferenças estatísticas foram

determinadas pela análise de variância utilizando o teste ANOVA.

250

500

750

PBS

T.canis (Tc)

Tc+MK886

Tc+TRFK5

Tc+MK+TRFK5

Grupos Experimentais

TNF-

pg/mL

250

500

Grupos Experimentais

IL-4 pg/ml

Figura 11. Concentração de TNF-α (A) e IL-4 (B) no sobrenadante do

homogeneizado do pulmão de camundongos C57BL/6 infectados com T. canis

tratados ou não com MK-886, com TRFK-5 ou ambos e o grupo controle. Os

resultados estão expressos como média ± EPM de três experimentos

independentes (n=8-16). * p <0,05 representa a diferença significativa entre os

resultados obtidos do grupo controle em relação ao somente infectado, e #

representa a diferença significativa entre os animais infectados tratados com MK-

886, com TRFK-5 ou ambos comparados com o grupo somente infectado sem

tratamento. As diferenças estatísticas foram determinadas pela análise de

variância utilizando o teste ANOVA.

500

1000

1500

Tc+MK886

PBS

T.canis (Tc)

Tc+TRFK5

Tc+MK+TRFK5

Grupos Experimentais

IL-10 pg/mL

500

1000

1500

Grupos Experimentais

IFN-

pg/mL

Figura 12. Concentração de IL-10 (A) e IFN-γ (B) no sobrenadante do