ads:
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
Papel de CCR2 na infecção oral por
Toxoplasma gondii
LUCIANA BENEVIDES
Ribeirão Preto-SP
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
Papel de CCR2 na infecção oral por Toxoplasma gondii
LUCIANA BENEVIDES
Ribeirão Preto-SP
2008
ads:
LUCIANA BENEVIDES
Papel de CCR2 na infecção por Toxoplasma gondii
Dissertação apresentada ao curso de Pós-
graduação em Imunologia Básica e Aplicada da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, para a obtenção do
grau de Mestre em Ciências - Área de
concentração: Imunologia Básica e Aplicada.
Orientação: Profa. Dra. Neide Maria da Silva
Ribeirão Preto-SP
2008
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,
POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E
PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Benevides, Luciana
Papel de CCR2 na infecção por Toxoplasma gondii. Ribeirão Preto,
2008. p.87 : il.; 30cm
Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração:
Imunologia Básica e Aplicada
Orientadora: Silva, Neide Maria.
1. Infecção oral. 2. Toxoplasma gondii.
3. Receptor de quimiocina. 4. Migração celular.
Trabalho realizado no Laboratório de Imunoparasitologia do Departamento de Bioquímica e
Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo-USP,
com auxílio financeiro da CAPES.
Dedico este trabalho aos meus pais Pedro e Lucia, os grandes amores da minha
vida. Por ensinar-me que a humildade, honestidade e perseverança são virtudes
essenciais na vida de uma pessoa. Agradeço à Deus, todos os dias, por fazerem
parte da minha vida, por todo o amor, confiança e dedicação depositada durante
todos os dias de minha vida. Amo vocês.
AGRADECIMENTOS
Ao nosso Senhor Jesus Cristo e a Maria, nossa Mãe, pela presença constante em
minha vida.
À Professora Dra Neide Maria da Silva, pela competente orientação, pelos
ensinamentos e pela boa convivência obtida durante esses dois anos, muito obrigada.
Ao Professor Dr. João Santana da Silva, por ter me dado a oportunidade de
desenvolver esse trabalho em seu laboratório, pelas sugestões, ensinamentos, disciplina e
responsabilidade com que conduz o seu laboratório.
Às Professoras Dra. Lucia Helena Faccioli (FCFRP-USP) e Dra Joseli Lannes Vieira
(FIOCRUZ) pela disponibilidade em participar da banca examinadora, pelas sugestões e
correções.
À Professora Dra. Lucy M. Yamauchi, pelo auxílio no início deste trabalho, pela sua
amizade.
À Professora Dra. Fernanda de Freitas Aníbal, pelo incentivo e pela amizade.
Aos Doutores Paulo M. Guedes, Tiago Mineo, Leandro Licursi, Cristina R. Cardoso e
Ana Paula Moreira por todos os auxílios que sempre prestaram ao laboratório e pela amizade.
A todos os colegas de laboratório que conquistei durante esses anos, em especial:
Fernanda, Fabrine, Vanessa, Wander, Diego, Djalma Junior, Fredy, Antônio, Gustavo,
Carlo, Giuliano, Juliana, Gisele, Karen, Marcelo, Talita, Grace e Flávia pelos bons
momentos que passamos juntos, pela companhia indispensável, pela amizade.
À Ana Cristine S. Ferreira, secretária da Pós-Graduação, pela competência e
dedicação com quem realiza seu trabalho. Obrigada por tudo, pela acolhida e amizade.
A todos os funcionários, em especial: Cristiane Milanezi, Wander C. R. da Silva,
Denise Ferraz, Júlio Siqueira, Edinelson Mazzoto, Cristiana Ribas, Sávio Miranda, Rubens
Campos e Lúcia Pacheco cuja contribuição foi essencial para o bom desenvolvimento deste
trabalho.
A todos os professores da Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada.
A todos os amigos da Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada pelo convívio
e amizade.
Á CAPES e FAEPA pelo auxílio financeiro para a realização deste trabalho.
À família
Agradeço a toda a minha família, por acreditarem no meu trabalho, em especial:
À minha mãe Lucia, meu alicerce, pelo amor incondicional, zelo, apoio e conselhos.
Ao meu pai Pedro, exemplo a ser seguido, por ensinar-me a ser forte e lutar pelos
meus ideais.
À minha avó Maria, pelo forte amor que nos une e pela oração.
À minha irmã e amiga Lucélia pela motivação e afeto.
Ao Luiz Fernando, pelos momentos de descontração e pelos sentimentos mais puros e
singelos.
Ao meu namorado José Arnaldo pelo carinho, paciência, compreensão e apoio.
“Se um dia tudo lhe parecer perdido,
lembre-se que você nasceu sem nada. E
que tudo que consegui foi através de
esforços, e os esforços nunca se perdem,
somente dignificam as pessoas.”
Charles Chaplin
Sumário
Resumo.......................................................................................................................................i
Abstract.....................................................................................................................................iv
Abreviaturas..............................................................................................................................vi
1. Introdução............................................................................................................................18
2. Objetivo................................................................................................................................30
2.1 Objetivos específicos....................................................................................................31
3. Materiais e métodos.............................................................................................................32
3.1 Animais experimentais....................................................................................................33
3.2 Organismos infecciosos..................................................................................................33
3.3 Infecção experimental e coleta de material....................................................................33
3.4 Coloração pela Hematoxilina e Eosina para análise histológica....................................34
3.5 Imunoistoquímica...........................................................................................................34
3.5.1 Análise do parasitismo tecidual..............................................................................34
3.5.2 Fenotipagem celular no intestino delgado e no SNC..............................................36
3.5.3 Análise da expressão do CCL2 e seu receptor CCR2 no intestino delgado...........37
3.6 Análise morfométrica......................................................................................................38
3.7 Mensuração de citocinas.................................................................................................38
3.8 Cultura de macrófago.....................................................................................................39
3.9 Mensuração de óxido nítrico (NO).................................................................................39
3.10 Análise estatística..........................................................................................................40
4. Resultados............................................................................................................................41
4.1 Presença de células CCR2
+
no intestino delgado de camundongos infectados por
T. gondii................................................................................................................................42
4.2 Presença de células CCR2
+
no intestino delgado de camundongos infectados por
T. gondii................................................................................................................................44
4.3 Suscetibilidade de animais CCR2
-/-
após infecção por T. gondii....................................47
4.4 Parasitismo tecidual de animais C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados por T. gondii...............49
4.5 Análise patológica dos órgãos periféricos e SNC de camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados por via oral com T. gondii...................................................................................51
4.6 Detecção e quantificação de células MAC-1
+
, CD4
+
e CD8
+
no intestino delgado e SNC
de camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados por T. gondii............................................55
4.7 Mensuração de citocinas pró-inflamatórias IL-12, TNF-α, IFN-γ e anti-inflamatórias
IL-10, TGF-β e IL-4 no soro e homogenato intestinal de camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados por T. gondii........................................................................................................61
4.8 Expressão de iNOS no intestino delgado e SNC de animais C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados por T. gondii.....................................................................................................65
4.9 Produção de NO por células de baço de animais C57BL/6 e CCR2
-/-
estimuladas com
IFN-γ ou CCL2.....................................................................................................................67
5. Discussão.............................................................................................................................69
6. Conclusão............................................................................................................................77
7. Referências Bibliográficas...................................................................................................79
8. Anexos.................................................................................................................................88
Resumo
Papel de CCR2 na infecção oral po
r
Toxoplasma gondii
.
_
_
____________________
_
BENEVIDES, L. Papel de CCR2 na infecção oral por Toxoplasma gondii. 2008. 87f.
Dissertação de Mestrado - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP/SP
Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório. Estima-se que 1/3 da população
do mundo esteja infectada por esse patógeno. A infecção oral por esse parasito induz uma
reação inflamatória exacerbada que se não controlada pode levar a morte do animal. Além
disso, quimiocinas produzidas por células epiteliais intestinais infectadas estão envolvidas na
migração e ativação de células inflamatórias. Entretanto, como a via de infecção natural é a
oral, nosso objetivo foi verificar o papel de CCR2 na infecção oral por T. gondii. Dessa
forma, animais C57BL/6 e CCR2
-/-
foram infectados por via oral com 5 cistos da cepa ME-49
de T. gondii e a sobrevivência e parâmetros imunológicos foram avaliados. Os dados obtidos
nesse estudo demonstram um aumento da migração de células CCR2
+
no intestino delgado,
bem como de células CCL2
+
em ambas as linhagens dos animais após a infecção. Contudo, os
animais CCR2
-/-
apresentam uma profunda suscetibilidade à infecção pelo parasito, com
100% de mortalidade até o 28º dia após a infecção. Os órgãos periféricos dos animais CCR2
-/-
apresentam um aumento do parasitismo tecidual e uma reação inflamatória suave, que no
intestino delgado, são associados com uma pequena migração de células T CD4
+
e MAC-1
+
.
Em contraste, há um aumento na migração de células T CD8
+
que são relacionados com o
controle da resposta imune inflamatória nesse órgão. Entretanto, no início da fase crônica,
camundongos CCR2
-/-
apresentam um aumento do parasitismo tecidual no SNC com uma
diminuição de células T CD4
+
e MAC-1
+
e um aumento de células T CD8
+
quando
comparados com os animais C57BL/6. Foi observado também, que na ausência do receptor, a
expressão de iNOS é ausente no intestino delgado na fase aguda e no SNC no início da fase
crônica de infecção. Além disso, na ausência de CCR2 a produção de NO por células de baço
é quase ausente. Em conjunto, os resultados sugerem que CCR2 é essencial para ativar
mediadores microbicidas principalmente no SNC para o controle da proliferação do parasito,
favorecendo a resistência do hospedeiro.
Abstract
Papel de CCR2 na infecção oral po
r
Toxoplasma gondii
.
_
_
____________________
_
BENEVIDES, L. The role of CCR2 in oral infection by Toxoplasma gondii. 2008. 87f.
Dissertação de Mestrado - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP/SP
Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan. It is estimated that about one-third
of the world population is infected with the parasite. The oral infection by the parasite with a
high load of the organism induces an exacerbated inflammatory reaction if uncontrolled can
lead to the death of the animals. Moreover, chemokines produced by intestinal epithelial cells
are involved in the migration and activation of inflammatory cells. In order to verify the role
of CCR2 in the oral T. gondii infection, we inoculated 5 ME-49 T. gondii cysts and the
survival and immune parameters were analyzed. The results demonstrated increased migration
of CCR2
+
cells in the small intestine of the C57BL/6 mice. In addition, both lineages of mice
showed increased CCL2
+
cells in this site of infection after T. gondii inoculation. Although
CCR2
-/-
mice displayed higher susceptibility to infection being all of mice died on day 28
post-infection. Peripheral organs from CCR2
-/-
mice presented a greater parasite burden and a
milder inflammatory reaction that were associated with a smaller CD4
+
and MAC-1
+
cell
infiltration in the small intestine. On the other hand, it was observed in this lineage of mice a
greater CD8
+
cell migration that seems to be link with the control of inflammatory immune
response in this organ. However, CCR2
-/-
showed uncontrolled parasite multiplication in the
Central Nervous System (CNS) with a smaller CD4
+
and MAC-1
+
cell infiltration and a
greater CD8
+
cell migration compared with C57BL/6 mice on day 23 of infection. In the
absence of CCR2 the iNOS expression was down regulated in the small intestine in acute
phase and in the CNS in the initial of chronic phase of infection. Additionally it was observed
a small nitric oxide production by spleen macrophages from CCR2
-/-
mice. In conclusion,
CCR2 seems to be essential to activate microbicidal mediators mainly in the CNS that are
involved in the control of parasite replication.
Abreviaturas
Papel de CCR2 na infecção oral po
r
Toxoplasma gondii
.
_
_
____________________
_
ABC – Complexo Avidina-Biotina
AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
BSA – “bovine albumin fraction V”
CC – quimiocina C
CCL2/MCP-1 – Proteína 1 quimiotática de monócito
CCL3/MIP-1α – Proteína 1 α inflamatória de macrófago
CCL4/MIP-1β – Proteína 1 β inflamatória de macrófago
CCL5/ RANTES – Quimiocina expressa e secretada por células T normais e regulada após
ativação
CCL25 (TECK) – Quimiocina expressa e secretada por células epiteliais da mucosa
CCR – Receptor de quimiocina
CCR2
-/-
- Camundongo geneticamente deficiente do receptor CCR2
CXCL2/MIP-2 – Proteína 2 inflamatória de macrófago
CXCL10/IP-10 – Proteína induzível por IFN-γ
DAB – Diaminobenzidina
GM-CSF – Fator estimulador de colônia de granulócito e macrófago
H&E – Hematoxilina e Eosina
IBD – Doença Intestinal Inflamatória
IECs – Células epiteliais intestinais
IELs – Linfócitos epiteliais intestinais
IFN-γ – Interferon-gamma
IL – Interleucina
iNOS – Enzima sintase de óxido nítrico induzível
LP – Lâmina própria
MAC-1 – Integrina/ CD11b
ME-49 – Cepa de baixa virulência de Toxoplasma gondii
NK – Célula Natural Killer
NO – Óxido nítrico
NO
3
-
– Nitrito
PBS – Salina tamponada com fosfato
RPMI – Meio de cultura RPMI 1640
SBF – Soro bovino fetal
SNC – Sistema Nervoso Central
TGF-β – Fator de crescimento e transformação beta
TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa
Th – Linfócito T auxiliar
1.Introdução
Papel de CCR2 na infecção oral po
r
Toxoplasma gondii
.
_
_
____________________
_
Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório pertencente ao Filo
Apicomplexa e a classe Sporozoa. Este parasito apresenta grande incidência entre ambos
hospedeiros animais e humanos, podendo ser encontrado por todo o mundo. Estima-se que
1/3 da população do mundo esteja infectada por esse patógeno (MONTOYA; LIESENFELD,
2004).
A primeira descrição desse parasito foi feita em 1908, em dois países: na Tunísia, por
Nicolle e Manceaux, de formas oriundas do roedor Ctnodatylus gondii e no Brasil, por
Esplendore, de formas recolhidas de coelhos doentes ou mortos “naturalmente” em
laboratório. Em 1909 Nicolle e Manceaux descreveram o parasito e criaram o gênero
Toxoplasma e a espécie T. gondii (KRICK; REMINGTON, 1978).
T. gondii apresenta três estágios infecciosos, os taquizoítas (do grego tachys = rápido;
em grupos ou clones), forma que apresenta uma rápida proliferação na célula hospedeira,
ocorrendo principalmente na fase aguda de infecção, os bradizoítas (do grego brady = lento,
em cistos teciduais) forma que pelo estresse imposto pelo sistema imune encontra-se dentro
de cistos sob replicação lenta na fase crônica de infecção, e os esporozoítas (contidos dentro
dos oocistos liberados nas fezes de felídeos), que corresponde às formas infectantes oriundas
do processo de reprodução sexuada do parasito que ocorre no intestino de felídeos (DUBEY;
LINDSAY; SPEER, 1998).
Membros da família dos felídeos, mais particularmente os gatos domésticos, são os
únicos hospedeiros definitivos capazes de completarem todo o ciclo de vida de T. gondii,
sendo os principais reservatórios de infecção. Hospedeiros intermediários são todos os
animais de sangue quente. O ciclo de vida sexual do parasito é definido pela formação de
oocisto que ocorre somente no hospedeiro definitivo. Após a ingestão de cistos ou oocistos,
os parasitos são liberados e se diferenciam em taquizoítas invadindo as células epiteliais do
intestino iniciando uma fase assexual de multiplicação, produzindo vários estágios
intermediários de T. gondii. Estas formas provavelmente iniciam a formação dos gametas
femininos e masculinos. A fusão dos gametas produz o zigoto que secreta uma membrana
cística rígida e este é eliminado com as fezes como oocisto não esporulado. Os oocistos
eliminados não são imediatamente infectivos e após 1 a 5 dias de exposição ao ar e
temperatura ambiente, ocorre a esporulação, produzindo dois esporocistos, cada um contendo
quatro esporozoítos. Estes oocistos estáveis são altamente infecciosos e podem permanecer
viáveis no solo por muitos anos (COPPIN et al., 2003; DUBEY, 1998; MONTOYA;
LIESENFELD, 2004; ALIBERTI, 2005).
A transmissão de T. gondii é adquirida principalmente através da via oral, sendo esta a
via natural de infecção deste parasito. Esta se dá através da ingestão de carne crua ou mal
cozida (principalmente de suínos e carneiros) contendo cistos do parasito ou através da
ingestão de água ou alimentos contaminados com oocistos liberados pelas fezes dos felídeos
(MONTOYA; LIESENFELD, 2004; ALIBERTI, 2005). Outra via de infecção é a congênita
que pode ocorrer quando a mulher é infectada durante a gestação ou por reativação de
infecção latente. Quando a transmissão vertical ocorre no primeiro trimestre da gestação, a
toxoplasmose pode causar aborto, mortalidade neonatal e anormalidades fetais associadas
principalmente com o Sistema Nervoso Central (SNC) e retina (MONTOYA; LIESENFELD,
2004). A transmissão também pode ocorrer através de transplantes de órgãos de doadores
soropositivos ou raramente por transfusão sanguínea ou acidente laboratorial (MONTOYA;
LIESENFELD, 2004; ALIBERTI, 2005).
A fase aguda da doença se caracteriza pela ampla disseminação de T. gondii no
organismo do hospedeiro, com multiplicação ativa dos taquizoítas no interior de células
nucleadas. Na fase crônica, os parasitos permanecem encistados e viáveis, principalmente nos
músculos esquelético e cardíaco e no cérebro, nos quais podem permanecer durante toda a
vida do hospedeiro (YAP; SHER, 1999).
A evolução clínica da toxoplasmose adquirida é habitualmente benigna. Clinicamente,
a infecção por T. gondii pode não ser notificada ou pode apresentar sinais e sintomas que vão
depender do estado imunológico do indivíduo. Os sinais e sintomas mais comuns em uma
infecção primária em crianças e adultos (indivíduos imunocompetentes) são assintomáticos,
porém algumas manifestações clínicas podem surgir como linfadenite e febre, acompanhada
por astenia e mialgia. Uma pequena proporção de indivíduos, situação não muito freqüente,
pode apresentar miocardite, pneumonia, hepatite ou ainda encefalite (MONTOYA;
LIESENFELD, 2004). Dentre as manifestações clínicas da toxoplasmose congênita,
observa-se a hidrocefalia, microcefalia, calcificações intracranianas, corioretinite, estrabismo,
cegueira, epilepsia, retardamento mental e psicomotor e anemia (MONTOYA;
LIESENFELD, 2004). Porém, a principal patologia resultante desse tipo de infecção ocorre na
fase crônica da doença, quando a supressão do sistema imune causado por drogas ou outras
infecções, podem levar a reativação da infecção, resultado da ruptura do cisto, causando
necrose tecidual. Quando essa reação ocorre no SNC, é frequentemente fatal (ALIBERTI,
2005). Essa ocorrência é muito comum em indivíduos imunocomprometidos (como pacientes
com AIDS) cujas manifestações clínicas incluem encefalite, alterações mentais, déficit motor,
distúrbios nos nervos craniais, tontura, febre, entre outros sintomas (MONTOYA;
LIESENFELD, 2004).
A toxoplasmose é uma infecção de ampla disseminação entre humanos e animais. A
soroprevalência da infecção por T. gondii nos humanos aumenta com a idade, não apresenta
grandes variações entre os sexos e é baixa em regiões frias, quentes e áridas. Em geral, a
incidência da infecção varia com os grupos populacionais e a localização geográfica
(MONTOYA; LIESENFELD, 2004). Além disso, constitui uma infecção oportunista que se
manifesta com gravidade sempre que o paciente venha a sofrer um processo de
imunodeficiência. A infecção por Toxoplasma é talvez a infecção parasitária com maior
incidência em todo o mundo. Entre 15-33% de todos os adultos nos Estados Unidos são
soropositivos para anticorpos deste parasito. Na França, a estimativa de soroprevalência é alta
atingindo 60-70% (KASPER et al., 2004). Contudo a soroprevalência também é elevada nos
países da América Latina, incluindo o Brasil, variando de 51-72% (TENTER; HECKEROTH;
WEISS, 2000).
O tamanho do inóculo, virulência do organismo, “background” genético, sexo e estado
imunológico do hospedeiro afetam o curso da infecção em seres humanos e modelos animais
(MONTOYA; LIESENFELD, 2004). Quando T. gondii invade o hospedeiro pela via natural
de infecção, oocistos ou cistos teciduais são ingeridos, podendo ser observado a multiplicação
do parasito na lâmina própria (LP) do intestino, levando ao desenvolvimento de desordens
inflamatórias intestinais em certas linhagens de camundongos. Em camundongos C57BL/6
infectados por via oral com 100 cistos da cepa ME-49 de T. gondii observa-se letalidade de
100% dos animais, enquanto que camundongos BALB/c sobrevivem (LIESENFELD et al.,
1996). Esta patologia compartilha características morfológicas e histológicas como a Doença
Intestinal Inflamatória (IBD) em humanos, tais como, a perda da arquitetura epitelial
intestinal, influxo maciço de células inflamatórias na LP e focos de necrose. Essa resposta
inflamatória exacerbada resulta em uma mortalidade precoce dos hospedeiros suscetíveis
(KASPER, 2004; LIESELFELD, 2002).
Quando adquirido o parasito, pela via oral, a infecção se dissemina via vasos
linfáticos, linfonodos, pelo sangue ao fígado e do fígado aos pulmões e a outros órgãos. Com
o desenvolvimento da imunidade a multiplicação de taquizoítas cessa. O tecido pode se
regenerar no fígado ou em tecidos não regenerativos como coração e cérebro, os focos de
necrose se transformam em cicatrizes fibrosas. Se a infecção não for controlada pelo sistema
imune, os taquizoítas são altamente virulentos e causam uma toxoplasmose generalizada e
fatal (FRENKEL, 1988).
Com o desenvolvimento da imunidade, os taquizoítas se transformam em bradizoítas
que sobrevivem dentro de cistos teciduais latentes que se desenvolvem principalmente no
SNC e provocam pouca ou nenhuma reação inflamatória (DENKERS, 1999). A patologia
associada com encefalite toxoplásmica em camundongos imunocompetentes suscetíveis é
caracterizada pela presença de células inflamatórias nas meninges, manguitos perivasculares
contendo plasmócitos, neutrófilos, linfócitos e macrófagos. Áreas de necrose podem também
ser observadas, associadas com grande número de parasitos (HUNTER; REMINGTON,
1994).
A imunidade à toxoplasmose é mediada por uma resposta imunitária celular
específica, dependente principalmente da produção da citocina interferon-gama (IFN-γ). Na
fase aguda da infecção, o hospedeiro desencadeia mecanismos inespecíficos de defesa que
influenciam no desenvolvimento da resposta imunitária celular específica (DENKERS;
GAZZINELLI, 1998).
No início da infecção, T. gondii estimula macrófagos, células dendríticas e neutrófilos
a liberarem a interleucina 12 (IL-12) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). A IL-12, por
sua vez, induz células “Natural Killer” (NK) a produzirem IFN-γ, que age sinergisticamente
com TNF-α, aumentando a atividade microbicida dos macrófagos (BLISS; ZHANG;
DENKERS, 1999; BOURGUIN et al., 1998; GAZZINELLI et al., 1994), e leva a proliferação
de células T CD4
+
e T CD8
+
, que produzem ainda mais IFN-γ. Essas células produtoras de
IFN-γ têm uma importante função na indução e manutenção do controle da infecção aguda e
crônica por T. gondii (YAP; SHER, 1999).
Macrófagos infectados por T. gondii e ativados por IFN-γ produzem óxido nítrico
(NO), responsável pelo controle da replicação do parasito (ADAMS et al., 1990;
LANGERMANS et al., 1992). Embora os mecanismos induzidos por IFN-γ sejam potentes,
não são completamente efetivos na eliminação dos parasitos (YAP; SHER, 1999). Alguns
parasitos escapam do controle imune e sobrevivem no hospedeiro por longos períodos,
continuando sua proliferação pelo organismo (ALIBERTI, 2005). Os linfócitos T auxiliares
(CD4
+
) e T citotóxicos (CD8
+
) agem sinergisticamente para prevenir a reativação do parasito
durante o estágio crônico da infecção. E ainda, outros estudos indicam que células T CD8
+
são as principais células efetoras da imunidade protetora e que as T CD4
+
exercem importante
papel auxiliar na ativação das T CD8
+
e, portanto, da imunidade protetora (GAZZINELLI et
al., 1991).
Trabalhos anteriores demonstraram que camundongos atímicos C57BL/6, assim como
camundongos deficientes em células T CD4
+
não desenvolvem necrose no íleo e sobrevivem
mais do que os camundongos controles, embora apresentem grande número de parasitos no
íleo. A patologia e a necrose intestinal são dependentes de linfócitos T CD4
+
, do aumento das
citocinas IFN-γ, TNF-α e da enzima sintase de óxido nítrico induzível (iNOS) na mucosa
intestinal dos camundongos suscetíveis ao Toxoplasma (LIESENFELD, 2002). Além disso,
quando esses animais são tratados com anticorpo monoclonal anti-TNF-α ou anti-IFN-γ,
observa-se a prevenção do desenvolvimento de necrose intestinal, indicando que ambas as
citocinas, IFN-γ e TNF-α, estão envolvidas no desenvolvimento de necrose intestinal em
camundongos C57BL/6 infectados por T. gondii (LIESENFELD et al., 1999).
Outras citocinas como IL-12 e IL-18 também possuem um importante papel na
indução da imunopatologia intestinal após a infecção oral por T. gondii. Quando
camundongos C57BL/6 são tratados com anticorpos anti-IL-12 e anti-IL-18 depois da
infecção com 100 cistos da cepa ME-49 de T. gondii, o desenvolvimento da necrose intestinal
é prevenida (VOSSENKAMPER et al., 2004).
Após a infecção oral por T. gondii, células epiteliais intestinais (IECs) são invadidas
por parasitos, podendo ocorrer distúrbios fisiológicos e morfológicos. Essas células passam a
secretar moléculas citotóxicas como NO. Além disso, os enterócitos respondem à infecção
pela secreção de várias quimiocinas (CCL2, CXCL2, CCL3 e CCL4) e citocinas (IL-1, IL-6,
IL-15, GM-CSF). Essas moléculas são essenciais para iniciar uma série de eventos
imunológicos que levam a um robusto processo inflamatório no intestino através do
recrutamento de vários tipos celulares do sistema imune, como neutrófilos, macrófagos e
células dendríticas (BUZONI-GATEL et al., 2006; MENNECHET et al., 2002). Quando essas
células são estimuladas, inicia-se uma ação microbicida, pois elas são fontes de IL-12, a qual
estimula a ativação de células T CD4
+
, dando início a uma resposta específica. Células NK e
NKT são estimuladas pela produção de IL-15 secretada pelos enterócitos, passando a secretar
IFN-γ, ativando macrófagos, células dendríticas e enterócitos para a eliminação dos parasitos
(BUZONI-GATEL et al., 2006).
Trabalhos anteriores demonstraram que amostras de intestino delgado infectado por
T. gondii apresentam um aumento significativo na secreção da quimiocina, Proteína 1
quimiotática de monócito (MCP-1/CCL2) e, em menores proporções a secreção de
quimiocinas como Proteína induzível por IFN-γ (IP-10/ CXCL10), Proteína 1α e β
inflamatória de macrófago (MIP-1α e β/ CCL3 e CCL4), MIP-2/ CXCL2 e quimiocina
regulada em ativação e normalmente expressa em célula T (RANTES/ CCL5)
(MENNECHET et al., 2002). Após a infecção, o número de células T CD4
+
aumenta e a
produção de diferentes quimiocinas por células endoteliais e epiteliais no intestino infectado é
importante para estabelecer um gradiente quimiotático para a migração de células T da
circulação e para a produção de IFN-γ que, juntamente com TNF-α, aumenta a produção de
quimiocinas, incluindo CXCL2, CCL2, CCL3 e CXCL10, ampliando a inflamação
(MENNECHET et al., 2002).
Várias evidências sugerem que os neutrófilos são essenciais durante os primeiros dias
de infecção. CXCL2 secretada pelos enterócitos está envolvida no recrutamento dos
neutrófilos aos sítios de infecção. Camundongos que sofrem depleção de neutrófilos
apresentam lesões de gravidade aumentada e uma maior carga parasitária que os animais
normais (BLISS et al., 2001). Além disso, camundongos deficientes de CXCR2 e CXCL2,
não recrutam neutrófilos ao sítio de infecção e apresentam uma maior carga parasitária (DEL
RIO et al., 2001).
A expressão de quimiocinas pelo epitélio intestinal representa um importante
mecanismo desse processo imune. IELs (linfócitos epiteliais intestinais) expressam
constitutivamente CCR9, CXCR3, CCR2 e CCR5 (ZABEL, et al., 1999; KUNKEL, et al.,
2000). Camundongos C57BL/6 infectados com 35 cistos da cepa 76 K de T. gondii expressam
quimiocinas CC e CXC no intestino delgado, incluindo CCL5, CCL3, CCL4, CCL2,
CXCL10 e CXCL2 liberadas por enterócitos infectados que são responsáveis pelo
recrutamento de IELs CD8
+
. A migração para o intestino de linfócitos intraepiteliais CD8β
+
induzida pela interação entre CCR5 nestes linfócitos e seus ligantes correspondentes CCL3 e
CCL4 é essencial para o controle da resposta inflamatória exacerbada induzida pelo parasito,
através da produção de TGF-β (BUZONI-GATEL et al., 2001, LUANGSAY et al., 2003).
Devido à imunopatologia induzida pela resposta Th1 exacerbada durante infecção oral
com alta carga parasitária, uma forte imunoregulação é importante para prevenir esta
patologia. Tem sido demonstrado que ambas citocinas, TGF-β e IL-10, induzem efeitos
anti-inflamatórios, importantes na prevenção de necrose intestinal, sendo TGF-β um potente
agente imunoregulador (AHUJA, et al., 1993). No intestino infectado por T. gondii, a
composição de células infiltradas é representada pelos linfócitos T CD4
+
na LP e IELs CD8
+
,
que estão localizados entre as células epiteliais componentes principais da imunidade
protetora contra T. gondii (MENNECHET et al., 2002). A população de linfócitos T CD8
+
isolada de camundongos infectados com T. gondii produz quantias aumentadas de TGF-β.
Esses linfócitos intraepiteliais interagem com os linfócitos T CD4
+
da LP e regulam
negativamente a produção de IFN-γ, reduzindo a atividade proliferativa dessas células, efeitos
ligados à produção de TGF-β (MENNECHET et al.; 2004).
IL-10 tem um importante papel homeostático na resposta à infecção aguda por
T. gondii (KASPER et al., 2004). Infecção oral com 20 cistos de T. gondii resultou em 100%
de mortalidade em animais deficientes em IL-10, mas não em animais controles (C57BL/6).
Animais deficientes em IL-10, infectados por T. gondii apresentaram alteração inflamatória
grave no intestino. Estes resultados demonstram a importância de IL-10 no controle da
patologia induzida pela infecção com T. gondii (SUZUKI et al., 2000). Quando os
camundongos IL-10
-/-
foram tratados com anticorpo monoclonal anti-IFN-γ, para examinar os
efeitos na mortalidade, esses animais sobreviveram significativamente mais tempo do que os
camundongos controles tratados com IgG irrelevante. Esses resultados indicam que a
produção exagerada de IFN-γ está envolvida no desenvolvimento da necrose no intestino em
camundongos IL-10
-/-
(SUZUKI et al., 2000).
As quimiocinas secretadas pelas IECs e seus receptores tem um papel crítico na
indução e modulação da resposta imune a vários patógenos (PEREZ DE LEMA et al., 2001;
MURDOCH; FINN, 2000). As quimiocinas protéinas quimiotáticas de monócitos (MCP)
constitui um importante grupo da subfamíla de quimiocinas CC (COILLIE; DAMME;
OPDENAKKER, 1996). Existem quatro MCPs que apresentam 60-70% de similaridade
estrutural. Essas quimiocinas foram recentemente classificadas como CCL2 (MCP1), CCL8
(MCP2), CCL7 (MCP3) e CCL13 (MCP4) (ZLOTNIK; YOSHIO, 2000). CCR2 é o receptor
para as quimiocinas MCP (GONG et al.,1997) com importância funcional em vários
sistemas, incluindo o recrutamento de células do sistema imune (BRUHL et al., 2004) e
rejeições a aloenxertos (ABDI et al., 2004).
A CCL2 foi a primeira a ser descoberta e dentre as MCPs tem sido a melhor
caracterizada. Ela é produzida por células endoteliais e células mononucleares, tendo como
único receptor funcional o CCR2. Esse receptor é expresso em muitos tipos celulares,
incluindo monócitos, células dendríticas, células NK e células T ativadas (COILLIE;
DAMME; OPDENAKKER, 1999). A interação entre CCL2 e CCR2 tem uma importante
função na imunidade inata, direcionando a migração para o foco inflamatório e na defesa do
hospedeiro contra vários patógenos (ROBBEN et al., 2005; CONRAD et al., 2007;
HARDISON et al., 2006).
De maneira interessante, foi recentemente demonstrado que CCR2 é importante para
migração e localização de células de Langerhans aos linfonodos de drenagem e para
desenvolvimento de uma resposta tipo 1 protetora em infecção por Leishmania major (SATO
et al., 2000). Foi descrito também, que uma população restrita de macrófagos positiva para
CCR2 presentes em infecção por L. major, tem a capacidade de matar os parasitos e resolver a
infecção (CONRAD, et al., 2007). Vários autores têm demonstrado a importância do receptor
CCR2 no controle de diversas infecções bacterianas e virais, causadas por Mycobacterium
tuberculosis (PETERS et al., 2004), Listeria monocytogenes (KURIHARA, et al., 1997), vírus
Influenza (WAREING et al., 2007), vírus da hepatite (MHV) (HELD et al., 2004) ou em
infecções por protozoários como Trypanossoma cruzi (HARDISON et al., 2006) e
Leishmania major (QUINONES et al., 2007; CONRAD et al., 2007) sugerindo que esse
receptor é importante para recrutamento de células essenciais na eliminação de patógenos.
Recentemente foi relatada a importância do recrutamento de monócito (Gr-
1
+
/CCR2
+
/CX
3
CR
1
) para o controle de toxoplasmose aguda, sendo que estes monócitos têm a
capacidade de controlar a infecção intraperitoneal por T. gondii (ROBBEN et al., 2005). O
recrutamento de monócitos (Gr-1
+
/CCR2
+
/CX
3
CR
1
) está intimamente associado com a
capacidade de suprimir a replicação inicial do parasito após a inoculação. A infecção de
camundongos CCR2
-/-
e CCL2
-/-
com 100 taquizoítas da cepa ME-49 de T. gondii resultou
numa diminuição do recrutamento dos monócitos (Gr-1
+
/CCR2
+
/CX
3
CR
1
) para a cavidade
peritoneal, o que ocasionou alta mortalidade. Foi também observado que os monócitos
(Gr-1
+
/CCR2
+
/CX
3
CR
1
) produzem iNOS e IL-12, sendo capazes de inibir o crescimento do
parasito in vitro (MORDUE; SIBLEY, 2003).
Em trabalhos anteriores já havia sido demonstrado que a infecção oral de
camundongos C57BL/6 por T. gondii induz uma resposta pró-inflamatória exacerbada que se
não controlada pode levar a morte do animal. Já foi também demonstrado que quimiocinas
são importantes na migração e ativação de células inflamatórias em infecção por T. gondii e
outros patógenos. Em particular, o CCR2 e seu ligante CCL2 estão envolvidos no controle da
infecção intraperitoneal por T. gondii. Com o objetivo de verificar se o receptor CCR2 está
envolvido no controle da infecção pela via oral, rota natural de infecção por T. gondii ou na
exacerbação da patologia intestinal, este estudo foi proposto.
2. Objetivo
Papel de CCR2 na infecção oral po
r
Toxoplasma gondii
.
_
_
______________________
_
O objetivo deste estudo foi avaliar o papel do receptor de quimiocina CCR2 na
infecção oral por Toxoplasma gondii.
2.1. Objetivos específicos
Observar a presença de células positivas para o receptor CCR2, bem como do seu
ligante CCL2 no intestino delgado de animais infectados por T. gondii.
Determinar a suscetibilidade dos animais CCR2
-/-
após infecção oral com 5 cistos da
cepa ME-49 de T. gondii.
Analisar o parasitismo tecidual e alterações histológicas em animais infectados por
T. gondii, assim como a disseminação do parasito nos órgãos do hospedeiro.
Determinar o fenótipo das células presentes no infiltrado celular do intestino delgado e
SNC de camundongos infectados.
Determinar o perfil de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias e da quimiocina
CCL2 a nível sistêmico e intestinal em animais C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados por
T. gondii.
Determinar a expressão da enzima iNOS no intestino delgado e no cérebro após
infecção por T. gondii, bem como a produção de óxido nítrico por células de baço
provenientes de camundongos CCR2
-/-
.
3. Material e Métodos
Papel de CCR2 na infecção oral po
r
Toxoplasma gondii
.
_
____________________________
_
3.1 Animais experimentais
Foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6 selvagens e animais
geneticamente deficientes em CCR2 (CCR2
-/-
), fêmeas de 8-10 semanas de idade. Todos os
animais foram mantidos no biotério do Departamento de Bioquímica e Imunologia da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP. Camundongos deficientes em CCR2 foram
obtidos do laboratório Jackson (Bar Harbor, ME). Todos os experimentos foram
desenvolvidos de acordo com protocolo aprovado pelo Comitê de Experimentação Animal da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, FMRP-USP (processo – 037/2006).
3.2 Parasito
Para realizar a infecção dos animais, foi utilizada a cepa ME-49 de T. gondii. A
manutenção da cepa foi feita por inoculação intraperitoneal de 20 cistos de T. gondii em
camundongos C57BL/6. Um mês após a inoculação, os cistos cerebrais foram coletados,
homogeneizados em 2 mL de PBS estéril. Em seguida, os cistos foram contados e diluídos em
solução de PBS. Para a infecção experimental, camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
foram
infectados por via oral com cinco cistos de T. gondii em um volume de 0.2 mL.
3.3 Infecção experimental e coleta de material
Camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
foram infectados por via oral com 5 cistos da cepa
ME-49 de T. gondii. Para avaliar a sobrevida dos animais, oito camundongos de cada grupo
foram infectados e a sobrevivência foi acompanhada durante dois meses. Um grupo de 3 a 5
animais C57BL/6 e CCR2
-/-
foi infectado e nos dias 8 e 23 de infecção, o sangue foi coletado
através de punção do plexo retro-orbital para obtenção do soro e realização de ensaios
sorológicos, e em seguida, os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical. Após a
eutanásia, os órgãos, Sistema Nervoso Central (SNC), pulmão, fígado e intestino delgado
foram coletados, fragmentos e acondicionados em formas diferentes dependendo do destino
final.
3.4 Coloração pela Hematoxilina e Eosina para análise histológica
Para observação da morfologia e alterações patológicas nos diferentes órgãos dos
animais infectados, fragmentos de SNC, pulmão, fígado e intestino delgado foram coletados
nos dias 8 e 23 de infecção, fixados em formol tamponado a 10% e, após 24 horas,
desidratados em concentrações crescentes de álcoois e xilol. Posteriormente, os fragmentos
foram incluídos em parafina e cortes de 4µm de espessura dos tecidos foram obtidos com o
auxílio de um micrótomo. Os cortes foram dispostos em lâminas e incubados a 60
o
C para
fixação. Em seguida foram lavados em xilol para retirar o excesso de parafina e hidratados
com concentrações decrescentes de álcoois (do absoluto ao álcool 70%). Os cortes foram
então corados com Hematoxilina e Eosina (H&E), desidratados com concentrações crescentes
de álcoois (de 70% ao absoluto), lavados com xilol e montados em lamínula e Bálsamo do
Canadá (Vetec Química, Rio de Janeiro, Brasil).
Para análise das lesões patológicas induzidas por T. gondii no intestino delgado, este
foi coletado e lavado em PBS para retirada das fezes, após a lavagem, o intestino foi
seccionado em quatro partes: duodeno, jejuno proximal, jejuno distal e íleo. Esses fragmentos
foram então enrolados individualmente em um “rolo suíço”.
3.5 Imunoistoquímica
3.5.1 Análise do parasitismo tecidual
Para a quantificação do parasitismo tecidual nos diferentes órgãos dos animais
infectados, fragmentos de SNC, pulmão, fígado e intestino delgado foram coletados nos dias 8
e 23 de infecção, fixados em formol tamponado a 10% e, após 24 horas, desidratados em
concentrações crescentes de álcoois e xilol. Posteriormente, os fragmentos foram inclusos em
parafina e cortes de 4µm de espessura dos tecidos foram obtidos com o auxílio de um
micrótomo. Os cortes foram dispostos em lâminas e incubados a 60
o
C para fixação na lâmina,
lavados em xilol para retirar o excesso de parafina e hidratados com concentrações
decrescentes de álcoois (do absoluto ao álcool 70%). Em seguida, a peroxidase endógena do
tecido foi bloqueada através da incubação dos cortes com água oxigenada a 3%, por 30
minutos. Posteriormente, as lâminas foram lavadas por três vezes com PBS e foi realizado o
resgate antigênico em tampão citrato pH 6.0 por 7 minutos em forno microondas em potência
máxima. Após o resgate antigênico, as lâminas permaneceram em temperatura ambiente por
20 minutos para resfriamento. Em seguida, as lâminas foram lavadas por três vezes com PBS
e incubadas com PBS BSA 1% (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) por 30 minutos a fim de se
obter o bloqueio das ligações inespecíficas. Os cortes foram finalmente incubados com
anticorpo primário em câmara úmida, à 4ºC por 12 horas. Como anticorpo primário foi
utilizado o anti-soro anti-Toxoplasma da cepa ME-49 produzido em coelho. Após esse
período, o anticorpo secundário e, em seguida, a streptavidina foram adicionados ambos da
Dako Cytomation, LSAB
®
, Dako North America, CA, USA e incubados por 30 minutos à
temperatura ambiente. Decorridos os minutos de incubação, os cortes foram lavados com PBS
e procedeu-se a revelação da reação através do substrato revelador diaminobenzidina (DAB)
(Zymed Laboratories Inc., CA, USA). As reações foram interrompidas com água destilada, as
lâminas contra-coradas com Hematoxilina de Mayer por 1 minuto e, então, montadas com
Bálsamo do Canadá (Vetec Química, Rio de Janeiro, Brasil).
A análise do parasitismo tecidual foi realizada através da contagem do número de
vacúolos parasitóforos em toda a extensão do intestino delgado, bem como no fígado e
pulmão em quarenta campos microscópicos (aumento de 40X) e no SNC uma secção sagital
foi analisada por hemisfério cerebral (aumento de 40X).
3.5.2 Fenotipagem celular no intestino delgado e no SNC
Com o intuito de caracterizar o infiltrado celular dos animais infectados com 5 cistos
de T. gondii, foi realizada a análise da expressão de CD4
+
, CD8
+
, MAC-1
+
e iNOS . O
intestino delgado foi coletado no 8° dia de infecção e o SNC no 23º dia de infecção de
camundongos selvagens e CCR2
-/-
. O seguimento íleo e o SNC foram incluídos em meio OCT
(Sakura Finetek Inc., Torance, CA, USA) e cortes de 5µm de espessura foram obtidos com o
auxílio de um criostato. A reação iniciou-se com a fixação das lâminas em acetona 100% por
10 minutos a –20°C. A peroxidase endógena do tecido foi bloqueada através da incubação dos
cortes com água oxigenada a 3% em PBS por 30 minutos. Posteriormente, as lâminas foram
lavadas por três vezes com PBS e incubadas com 3% de leite desnatado (Nestle, SP, Brasil)
por 45 minutos a fim de se obter o bloqueio das ligações inespecíficas. Os cortes foram
finalmente incubados com anticorpos primários em câmara úmida, à 37ºC por 2 horas. Foram
utilizados os anticorpos IgG anti-CD4, anti-MAC-1 e anti- iNOS (Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, CA, USA), anti-CD8 (Caltag Laboratories, USA), ou IgG irrelevante (controle)
diluído 100 vezes em PBS. Após esse período, as lâminas foram lavadas e incubadas por 45
minutos à temperatura ambiente com os anticorpos secundários biotinilados (Vector
Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Após novas lavagens, foi adicionado o complexo
avidina-biotina peroxidase (ABC kit, PK-4000; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)
por 30 minutos, à temperatura ambiente. Decorridos os minutos de incubação, os cortes foram
lavados com PBS e procedeu-se a revelação da reação através do substrato revelador DAB
(Zymed Laboratories Inc., CA, USA). As reações foram interrompidas com água destilada, as
lâminas contra-coradas com Hematoxilina de Mayer por 1 minuto e, então, montadas com
Bálsamo do Canadá (Vetec Química, Rio de Janeiro, Brasil).
3.5.3 Análise da expressão de CCL2 e seu receptor CCR2 no intestino delgado
Para analisar a expressão da quimiocina CCL2 e do seu receptor CCR2 no intestino
delgado de animais infectados com 5 cistos de T. gondii, o íleo foi coletado no 8° dia de
infecção, fixado em formol tamponado a 10% e incluído em parafina, posteriormente, os
cortes foram desparafinados. Em seguida, a peroxidase endógena do tecido foi bloqueada
através da incubação dos cortes com água oxigenada a 3% em PBS por 30 minutos.
Posteriormente, as lâminas foram lavadas por três vezes com PBS e foi realizado o resgate
antigênico em tampão citrato pH 6.0 por 7 minutos em forno microondas em potência
máxima. Após o resgate antigênico, as lâminas permaneceram à temperatura ambiente por 20
minutos para resfriamento. Em seguida, as lâminas foram lavadas por três vezes com PBS e
incubadas com PBS BSA 1% (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) por 30 minutos, para bloqueio
das reações inespecíficas. Os cortes foram finalmente incubados com anticorpo primário em
câmara úmida, a 4ºC por 12 horas. Foram utilizados os anticorpos anti-CCL2 e anti-CCR2
(Abcam, Inc., USA) diluído 100 vezes em PBS ou PBS 0,01% saponina (Sigma Aldrich, St.
Louis, USA) para a análise das marcações intracelulares. Após esse período, o anticorpo
secundário e, em seguida, a streptavidina foi adicionado ambos Dako Cytomation, LSAB
®
,
Dako North America, CA, USA e incubados por 30 minutos à temperatura ambiente.
Decorridos os minutos de incubação, os cortes foram lavados com PBS e procedeu-se a
revelação da reação através do substrato revelador DAB (Zymed Laboratories Inc., CA,
USA). As reações foram interrompidas com água destilada, as lâminas contra-coradas com
Hematoxilina de Mayer por 1 minuto e, então, montadas com Bálsamo do Canadá (Vetec
Química, Rio de Janeiro, Brasil).
3.6 Análise morfométrica
A análise morfométrica foi realizada para quantificar o número de células positivas
para os marcadores de superfície (CD4
+
, CD8
+
e MAC-1
+
), quimiocina (CCL2) e seu receptor
(CCR2). Após a realização das reações de imunoistoquímica, as lâminas foram analisadas em
microscópio óptico (Olympus ® America INC, USA) acoplado a uma câmara digital e a um
sistema de computação - Programa Image Tool (HLIMAGE). Quarenta campos
microscópicos foram fotografados do seguimento íleo (aumento de 40 X) por corte de tecido e
no SNC uma secção sagital foi analisada por hemisfério cerebral e, em seguida, células
coradas para os marcadores supracitados (coloração marrom) foram quantificadas como
positivas.
3.7 Mensuração de citocinas
Para analisar a produção de citocinas em resposta à infecção por T. gondii o
fragmento íleo (100 mg) de animais C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados com T. gondii foi coletado
no 8º dia de infecção. O fragmento foi homogeneizado em 0.5 mL de PBS contendo
inibidores de protease [aprotinina 10 µg/mL (SIGMA), leupeptina 100 µg/mL (SIGMA),
PMSF 1,6 mM (Phenylmethylsulfonyl fluoride, SIGMA)]. Cada amostra foi centrifugada
durante 10 minutos a 3000 x g e o sobrenadante foi armazenado a -70 ºC até o momento do
uso. O sangue dos animais foi coletado no 8º dia de infecção e, em seguida, centrifugado
durante 5 minutos a 3000 x g e armazenado a -20ºC até o momento do uso. As concentrações
das citocinas IL-12p70, TNF-α, IFN-γ, IL-10, TGF-β, IL-4 e da quimiocina CCL2 presentes
no homogenato intestinal e no soro dos animais foram quantificadas pelo método
imunoenzimático (ELISA), utilizando kits comerciais e seguindo as normas do fabricante.
Para a mensuração das citocinas IL-12p70, IFN-γ, IL-10 e TGF-β foram utilizados o kits
comerciais da OpTEIA, BD Biosciences (San Diego-CA, USA) e das citocinas TNF-α, IL-4
e CCL2 foram utilizados kits comerciais da Duoset R&D Systems (Minneapolis-MN, USA).
A concentração das citocinas nas amostras foi calculada a partir da curva padrão de cada
citocina recombinante. A sensibilidade de detecção do kit ELISA foi de 31.25 pg/ml
(IL-12p70), 15.63 pg/ml (TNF-α, IFN-γ, IL-10, CCL2), 62.5 pg/ml (TGF-β) e 3.9 pg/ml
(IL-4). A leitura das placas foi feita em leitor de microplacas a 495 nm.
3.8 Cultura de macrófagos
Para isolar macrófagos do baço, camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
foram eutanasiados
e seus baços foram coletados e macerados. A suspensão de células do baço foi lavada em
meio RPMI 1640 e tratada por 4 minutos com tampão de lise (9 volumes de 0.16 mol/L
NH4Cl e 1 volume de 0.17 mol/L Tris-HCl, pH 7.5). Em seguida, as células foram lavadas
três vezes em meio RPMI suplementado com 5% de soro bovino fetal (SBF). As células
foram distribuídas (1 x 10
6
células/mL) em triplicata em placas de cultura de 96 poços
(Corning, Incorporated Costar®, USA) e incubadas por 3 horas, a 37ºC em estufa de CO
2
. As
células não aderentes foram removidas através de lavagem com solução de meio RPMI
completo com 5% SBF. As células aderentes foram estimuladas com diferentes concentrações
de IFN-γ (1, 5 e 25 U/mL) e CCL2 (2, 10 e 50 ng/mL) e após 48 horas o sobrenadante da
cultura foi coletado para determinar a produção de óxido nítrico.
3.9 Mensuração de Óxido Nítrico (NO)
A produção de óxido nítrico foi indiretamente avaliada pela mensuração da produção
de nitrito (NO
3
-
) no sobrenadante da cultura de macrófagos. As concentrações de nitrito e
nitrato foram mensuradas pela reação colorimétrica de Griess (GREEN; TANNENBAUM;
GOLDMAN, 1981). Resumidamente, 0.05 mL das amostras do sobrenadante da cultura de
macrófagos foram adicionadas a 0.05 mL de reagente de Griess. Em seguida, determinou-se a
absorbância em 540 nm em leitor de microplacas. A concentração de nitrito foi calculada a
partir da curva padrão de NaNO
2
.
3.10 Análise estatística
A curva de Kaplan-Meier foi utilizada para comparar a sobrevivência dos grupos de
animais estudados e os dados de mortalidade dos grupos experimentais foram analisados pelo
teste Qui-quadrado (χ
2
). A análise histológica, parasitismo tecidual e os níveis de citocinas
produzidos pelos grupos dos animais foram comparados usando o teste t de Student´s
bicaudal: duas amostras presumindo variâncias equivalentes. A análise estatística e os
gráficos foram feitos usando GraphPad prism versão 4.0 (GraphPad Software, San Diego,
USA). Os valores foram expressos como média ± erro padrão da média (SEM). Todos os
valores foram considerados significativos quando P < 0.05.
4. Resultados
Papel de CCR2 na infecção oral po
r
Toxoplasma gondii
.
_____________________
___
4.1 Presença de células CCR2
+
no intestino delgado de camundongos infectados por
T. gondii
Uma vez que a resposta imune celular é um importante mecanismo de defesa do
hospedeiro contra T. gondii e o receptor de quimiocina CCR2 está intimamente relacionado
com o recrutamento de diferentes tipos celulares para o sítio de infecção, analisamos
inicialmente a expressão desse receptor, no intestino delgado, após a infecção com o
protozoário. A presença de CCR2 foi avaliada por imunoistoquímica nos fragmentos do
intestino delgado de camundongos C57BL/6 infectados com 5 cistos de T. gondii no 8º dia
após a infecção.
A análise de secções de íleo demonstrou pequeno número de células com marcação
para CCR2 (CCR2
+
) na lâmina própria (LP) dos animais C57BL/6 não infectados (Figura
1A), porém o número de células CCR2
+
no 8º dia após a infecção por T. gondii aumentou
significativamente na LP desses animais (Figura 1B e C). Resultados similares foram obtidos
nos fragmentos do intestino delgado, duodeno, jejuno proximal e jejuno distal. Esses
resultados indicam que após a infecção por T. gondii, células positivas para CCR2 estariam
migrando para o foco de infecção.
Figura 1. Detecção e quantificação de células CCR2
+
no intestino delgado de camundongos
infectados por T. gondii. Secções de íleo de camundongos C57BL/6 não infectados (A) e
infectados (B) por via oral com 5 cistos da cepa ME-49 de T. gondii foram obtidas no 8º dia
após a inoculação e analisadas por imunoistoquímica para a detecção da presença de células
CCR2
+
. (C) O número de células CCR2
+
no íleo foi quantificado em 40 campos
microscópicos (aumento de 40X). **Significativamente diferente de valores obtidos dos
animais não infectados (P < 0.005). Os resultados foram obtidos com três animais em cada
grupo experimental.
4.2 Presença de células CCL2
+
no intestino delgado de camundongos infectados por
T. gondii
Com o intuito de avaliar a presença do ligante de CCR2, a quimiocina CCL2, após
infecção por T. gondii, as células positivas para CCL2 foram analisadas por imunoistoquímica
no intestino delgado de animais C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados por via oral com 5 cistos de
T. gondii no 8º dia de infecção.
A análise imunoistoquímica de secções de íleo utilizando anticorpo anti-CCL2
apresentou também uma alta expressão de CCL2 em ambas as linhagens de animais após a
infecção por T. gondii (Figura 2C e D). Porém, os animais C57BL/6, demonstraram um
aumento significativo de células positivas para CCL2 quando comparados com os animais
deficientes em CCR2 (Figura 2E). Resultados similares foram obtidos nos demais fragmentos
do intestino delgado. Foi também verificado a produção de CCL2 no homogenato intestinal e
no soro em ambas as linhagens de camundongos após a infecção por T. gondii. A análise foi
feita por ELISA. Nossos resultados demonstram que a infecção induz um aumento da
produção de CCL2 no soro e no intestino delgado no 8º dia após a infecção (Figura 3A e B).
De maneira interessante, a produção de CCL2 local e sistêmica foi aumentada nos animais
CCR2
-/-
quando comparados com os animais do tipo selvagem.
Esses resultados sugerem que, após a infecção por esse parasito, há um aumento da
produção e expressão de células CCL2
+
e CCR2
+
e que a interação entre essa quimiocina e
seu receptor poderia estar envolvida com a migração e a retenção das células CCR2
+
no sítio
de infecção.
Figura 2. Detecção e quantificação de células CCL2
+
no intestino delgado de camundongos
infectados por T. gondii. Secções de íleo de camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
não infectados
(A e B) e infectados (C e D) com 5 cistos de cepa ME-49 de T. gondii foram obtidas no 8º dia
de inoculação por via oral e analisadas por imunoistoquímica para a detecção da presença de
células CCL2
+
. (E) O número de células CCL2
+
no íleo foi quantificado em 40 campos
microscópicos (aumento de 40X). **Significativamente diferente de valores obtidos dos
animais controles (P < 0.005). Os resultados foram obtidos com três animais em cada grupo
experimental.
Figura 3. Concentração da quimiocina CCL2 no soro e homogenato intestinal após infecção
por T. gondii. Camundongos C57BL/6 e CCR2
–/–
foram infectados com 5 cistos de T. gondii,
e no 8º dia de infecção, amostras do intestino delgado (A) e soro (B) foram coletados para
mensuração da quimiocina. O íleo (100 mg) foi homogeneizado em PBS na presença de
inibidores enzimáticos e o sobrenadante foi utilizado para dosagem de CCL2 por ELISA. Os
resultados mostrados representam a média ± erro padrão da média (SEM) de cinco animais
por grupo experimental. *Significativamente diferente de valores obtidos dos animais
controles (P < 0.05).
4.3 Suscetibilidade de animais CCR2
-/-
após a infecção oral por T. gondii
Para determinar o papel de CCR2 na infecção oral por T. gondii, animais C57BL/6 e
CCR2
-/-
foram infectados por via oral com 5 cistos da cepa ME-49 de T. gondii. Para realizar
esse experimento, 8 animais de cada grupo foram utilizados e a mortalidade foi monitorada
até 60 dias após a infecção. Os animais C57BL/6 apresentaram 70% de sobrevida por mais de
60 dias de infecção. Em contraste, os animais CCR2
-/-
apresentaram uma profunda
suscetibilidade à infecção pelo parasito (χ
2
=12.47; P = 0.0004; df = 1), apresentando 100%
de mortalidade até o 28º dia após a infecção (Figura 4). Esses resultados indicam que os
animais CCR2
-/-
são altamente suscetíveis à infecção por T. gondii.
Figura 4. Suscetibilidade de animais CCR2
-/-
após a infecção oral por T. gondii. Camundongos
C57BL/6 e CCR2
-/-
foram infectados por via oral com 5 cistos de cepa ME-49 de T. gondii
(segundo material e métodos). A sobrevivência foi monitorada até o 60º dia após a infecção.
Os resultados foram obtidos com oito animais em cada grupo experimental. Os animais
CCR2
-/-
foram significativamente mais suscetíveis à infecção que os animais controles
(χ
2
=12.47; P = 0.0004; df = 1).
4.4 Parasitismo tecidual de camundongos CCR2
-/-
e C57BL/6 infectados por T. gondii
Para determinar se a diminuição da resistência em animais CCR2
-/-
é devido ao
aumento da replicação do parasito, camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
foram infectados por
via oral com 5 cistos de T. gondii e analisados quanto ao parasitismo tecidual total (presença
de vacúolos parasitóforos e estruturas em forma de cistos) nos órgãos periféricos e no SNC
através da reação de imunoistoquímica. A análise do parasitismo tecidual foi feita nos dias 8 e
23 após a infecção.
No 8º dia após a infecção foi observado um aumento significativo de parasitos nos
órgãos periféricos, tais como, intestino delgado (Figura 5A), fígado (Figura 5B) e pulmão
(Figura 5C) de animais CCR2
-/-
quando comparados com os animais C57BL/6. Além disso,
foi observada no SNC a presença de parasitos em ambas as linhagens de animais infectados
por T. gondii, porém os animais CCR2
-/-
apresentaram um aumento significativo de parasitos
no SNC quando comparados com os animais C57BL/6 (Figura 5D).
No presente trabalho, a maioria dos animais CCR2
-/-
morre em decorrência da infecção
no 23º dia de infecção. Assim, nós investigamos a presença do parasito nesse período. O
parasitismo tecidual apresentou-se bastante reduzido nos órgãos periféricos aos 23 dias de
infecção em ambas as linhagens de camundongos, entretanto, os animais CCR2
-/-
apresentaram um aumento significativo da carga parasitária no SNC, 4 vezes mais parasitos
nesse órgão quando comparados com os animais C57BL/6 (Figura 5E).
Esses resultados demonstram que animais CCR2
-/-
apresentam uma deficiência na
capacidade de controlar a replicação do parasito, principalmente no SNC, no início da fase
crônica de infecção. Assim, nós sugerimos a existência de um mecanismo dependente do
receptor CCR2 para auxiliar o controle da replicação do parasito.
Figura 5. Parasitismo tecidual total de camundongos infectados por T. gondii. Os órgãos
periféricos e SNC de camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados por via oral com 5 cistos
de cepa ME-49 de T. gondii foram analisados por imunoistoquímica para a detecção da
presença de parasitos. Nos órgãos periféricos a contagem dos parasitos foi realizada em 40
campos microscópicos e no SNC foi feita em uma secção sagital do hemisfério cerebral
(aumento 40X). O parasitismo tecidual foi quantificado no intestino delgado (A), fígado (B),
pulmão (C) e SNC (D e E). A quantificação do parasitismo tecidual (A, B, C e D) foi
realizada no 8º dia e (E) no 23º dia após a infecção. *Significativamente diferente de valores
obtidos dos animais controles (P < 0.05); **Significativamente diferente de valores obtidos
dos animais controles (P < 0.005). Os resultados foram obtidos com três animais em cada
grupo experimental.
4.5 Análise patológica dos órgãos periféricos e SNC de camundongos C57BL/6 e
CCR2
-/-
infectados por via oral com T. gondii
Desde que os animais CCR2
-/-
apresentaram-se altamente suscetíveis a infecção oral
com 5 cistos de T. gondii, nós investigamos se a suscetibilidade estava associada a reposta
inflamatória nos diferentes órgãos de camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
. Fragmentos do
intestino delgado, fígado, pulmão e SNC obtidos nos dias 8 e 23 após a infecção foram
corados com hematoxilina e eosina (H&E).
No 8º dia após a infecção, o intestino delgado, fígado e pulmão apresentaram um
processo inflamatório em ambas as linhagens de camundongos. O intestino delgado dos
animais C57BL/6 apresentou segmentos com um infiltrado de células inflamatórias moderado
na lâmina própria e submucosa. Em algumas áreas, o comprimento das vilosidades
apresentava-se reduzido e a espessura destas aumentada. Além disso, com freqüência reduzida
observou-se uma perda focal das células epiteliais superficiais em alguns locais, indicando os
estágios mais precoces de necrose intestinal (Figura 6A). Os animais CCR2
-/-
apresentaram
lesões intestinais menos graves no mesmo período de infecção quando comparados com
animais C57BL/6 (Figura 6B). Resultados similares foram obtidos em todos os fragmentos do
intestino delgado. No fígado dos camundongos C57BL/6, as lesões foram caracterizadas por
infiltrados inflamatórios organizados como focos, constituídos principalmente por células
mononucleadas. O fígado dos animais C57BL/6 apresentaram alterações inflamatórias mais
graves aos 8 dias de infecção em comparação aos animais CCR2
-/-
(Figura 6C e D). As lesões
pulmonares de animais infectados por T. gondii caracterizaram-se pela presença de infiltrados
inflamatórios nos septos alveolares, constituídos por células mononucleadas, levando a uma
pneumonia intersticial As alterações inflamatórias pulmonares foram mais graves no pulmão
dos animais C57BL/6 aos 8 dias de infecção em comparação aos animais CCR2
-/-
(Figura 6E
e F). O SNC também foi analisado no 8º dia de infecção, mas não foram verificadas
alterações inflamatórias relevantes nesse período em ambos os animais C57BL/6 e CCR2
-/-
.
Entretanto, aos 23 dias de infecção as lesões inflamatórias no intestino delgado e
fígado foram controladas em ambas as linhagens de camundongos. Porém, as lesões
pulmonares persistiram em ambas as linhagens. Nessa fase de infecção, a maioria das
alterações inflamatórias foi observada no SNC. As lesões foram caracterizadas por manguitos
perivasculares constituídos por células inflamatórias mononucleadas e infiltrados
inflamatórios mononucleados organizados como focos, os nódulos gliais. Foram observadas
também células inflamatórias espalhadas pelo parênquima e nas meninges. Ambas as
linhagens de camundongos apresentaram alterações inflamatórias no SNC com intensidade
similar (Figura 7).
Estes resultados demonstram que a reação inflamatória mediada por T. gondii nos
órgãos periféricos é suave na ausência de CCR2 em uma fase inicial, porém no início de uma
fase crônica o processo inflamatório no SNC é aumentado em ambas as linhagens de
camundongos.
Figura 6. Alterações histológicas nos órgãos periféricos de animais infectados por T. gondii.
Os animais C57BL/6 (A, C e E) e CCR2
-/-
(B, D e F) foram infectados por via oral com 5
cistos de T. gondii. O íleo (A e B), fígado (C e D) e pulmão (E e F) foram coletados no 8º dia
após a infecção, fixados, parafinados e corados por H&E. Os resultados foram obtidos com
três animais de cada grupo experimental. Aumento original de 10X.
Figura 7. Alterações histológicas no SNC de animais infectados por T. gondii. Os animais
C57BL/6 (A) e CCR2
-/-
(B) foram infectados por via oral com 5 cistos de T. gondii. O SNC foi
coletado no 23º dia após a infecção, fixado, parafinado e corados por H&E. Os resultados
foram obtidos com três animais em cada grupo experimental. Aumento original de 10X.
4.6 Detecção e quantificação de células MAC-1
+
, CD4
+
e CD8
+
no intestino delgado e
SNC de camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados por T. gondii
Para caracterizar o perfil celular encontrado no intestino delgado no 8º dia de infecção
e no SNC no 23º dia de infecção de camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
, analisamos, por
imunoistoquímica, o fenótipo das células com o uso de anticorpos anti-MAC-1, anti-CD4, e
anti-CD8 e posteriormente quantificamos o número de células presentes no infiltrado celular
desses animais.
Camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
apresentaram um aumento na migração de células
MAC-1
+
, CD4
+
e CD8
+
no intestino delgado após a infecção por T. gondii quando
comparados com animais não infectados (Figuras 8, 9 e 10).
Corroborando com os resultados da análise histológica no 8º dia de infecção, os
animais CCR2
-/-
apresentaram uma redução da migração de células positivas para MAC-1
(Figura 8C, D e E) e CD4 (Figura 9C, D e E) no intestino delgado após a infecção por
T. gondii quando comparados com os animais C57BL/6. Em contraste, os animais CCR2
-/-
apresentaram uma maior migração de células CD8
+
nesse órgão quando comparados com os
animais C57BL/6 (Figura 10C, D e E).
No início da fase crônica, no 23º dia de infecção foi também observada uma redução
da migração de células MAC-1
+
(Figura 11A, B e G) e CD4
+
(Figura 11C, D e G) no SNC
nos animais CCR2
-/-
quando comparados com os animais C57BL/6. Contudo, os animais
CCR2
-/-
apresentaram um aumento de células CD8
+
quando comparados com os animais
C57BL/6 (Figura 11E, F e G).
Esses resultados indicam que, de fato, CCR2 está envolvido no recrutamento e
retenção de células inflamatórias como MAC-1
+
e CD4
+
em uma fase aguda e início da fase
crônica, mas não de células CD8
+
, provavelmente a deficiência na migração de células
MAC-1
+
e CD4
+
estaria contribuindo, para o aumento da replicação do parasito em animais
deficientes em CCR2.
Figura 8. Detecção e quantificação de células MAC-1
+
no intestino delgado de camundongos
infectados por T. gondii. Secções de íleo de camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
(A e B) não
infectados e (C e D) infectados com 5 cistos de T. gondii foram obtidas no 8º dia após a
infecção por via oral e analisadas por imunoistoquímica para a detecção da presença de
células MAC-1
+
. (E) O número de células MAC-1
+
foi quantificado em 40 campos
microscópicos através do Programa Image Tool. *Significativamente diferente de valores
obtidos dos animais controles (P < 0.05). Aumento original de 40X. Os resultados foram
obtidos com três animais em cada grupo experimental.
Figura 9. Detecção e quantificação de células CD4
+
no intestino delgado de camundongos
infectados por T. gondii. Secções de íleo de camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
não infectados
(A e B) e infectados (C e D) com 5 cistos de cepa ME-49 de T. gondii foram obtidas no 8º dia
pós-infecção por via oral e analisadas por imunoistoquímica para a detecção da presença de
células CD4
+
. (E) O número de células CD4
+
foi quantificado em 40 campos microscópicos
através do Programa Image Tool. **Significativamente diferente de valores obtidos dos
animais controles (P < 0.005). Aumento original de 40X. Os resultados foram obtidos com
três animais em cada grupo experimental.
Figura 10. Detecção e quantificação de células CD8
+
no intestino delgado de camundongos
infectados por T. gondii. Secções de íleo de camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
não infectados
(A e B) e infectados (C e D) com 5 cistos de cepa ME-49 de T. gondii foram obtidas no 8º dia
pós-infecção por via oral e analisadas por imunoistoquímica para a detecção da presença de
células CD8
+
. (E) O número de células CD8
+
foi quantificado em 40 campos microscópicos
através do Programa Image Tool. *Significativamente diferente de valores obtidos dos
animais controles (P < 0.05). Aumento original de 40X. Os resultados foram obtidos com três
animais em cada grupo experimental.
Figura 11. Detecção e quantificação de células MAC-1
+
, CD4
+
e CD8
+
no SNC de
camundongos infectados por T. gondii. Secção do SNC de camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados com 5 cistos de T. gondii de cepa ME-49 foram obtidas no 23º dia pós-infecção por
via oral e analisadas por imunoistoquímica para a detecção da presença de células MAC-1
+
(A
e B), CD4
+
(C e D) e CD8
+
(E e F). O número de células (G) foi quantificado em uma secção
do SNC através do Programa Image Tool. *Significativamente diferente de valores obtidos
dos animais controles (P < 0.05). Aumento original de 20X. Os resultados foram obtidos com
três animais em cada grupo experimental.
4.7 Mensuração de citocinas pró-inflamatórias IL-12, TNF-α, IFN-
γ
e
anti-inflamatórias IL-10, TGF-β e IL-4 no soro e homogenato intestinal de camundongos
C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados por T. gondii
Desde que os animais CCR2
-/-
demonstraram-se altamente suscetíveis à infecção por
T. gondii, foi verificado se a ausência de CCR2 afetaria a produção de citocinas e se estas
estariam envolvidas na suscetibilidade dos animais. Foi analisado o padrão de citocinas em
resposta à infecção por T. gondii em camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
através da mensuração
das concentrações de citocinas pró-inflamatórias IL-12, TNF-α, IFN-γ e anti-inflamatórias
IL-10, TGF-β e IL-4 no homogenato intestinal e no soro no 8º dia após a infecção.
De maneira interessante, os animais CCR2
-/-
apresentaram um aumento significativo
na concentração de IFN-γ no soro quando comparados com os animais C57BL/6 (Figura 12
B). Em contraste, os camundongos C57BL/6 apresentaram um aumento da produção de
TNF-α quando comparados com os animais CCR2
-/-
(Figura 12A). Além disso, camundongos
C57BL/6 e CCR2
-/-
foram capazes de produzir concentrações comparáveis de IL-10 e TGF-β
no soro (Figura 12C e D).
A infecção por T. gondii induziu um aumento da produção de IL-12 (Figura 13A),
TNF-α (Figura 13B) e IFN-γ (Figura 13C) no intestino delgado de animais C57BL/6 e
CCR2
-/-
. A produção de IL-12 e TNF-α no sítio de infecção foi aumentada nos animais
CCR2
-/-
quando comparados com os animais C57BL/6 (Figura 13A e B). Os níveis de IL-10
(Figura 13E), TGF-β (Figura 13F) e IL-4 (Figura 13D) foram aumentados no intestino
delgado de animais infectados por T. gondii, porém os animais CCR2
-/-
apresentaram níveis
mais elevados TGF-β e IL-4 quando comparados com os animais C57BL/6 (Figura 13F e D).
Todos esses resultados sugerem que a alta produção de citocinas anti-inflamatórias nos
animais CCR2
-/-
pode estar contrabalanceando a produção de citocinas pró-inflamatórias, que
em grandes quantidades pode ser prejudicial ao hospedeiro causando uma resposta imune
exacerbada.
Figura 12. Concentração de citocinas no soro de animais C57BL/6 e CCR2
–/–
infectados por
T. gondii. Os níveis das citocinas TNF-α (A), IFN-γ (B), IL-10 (C) e TGF-β (D) foram
mensurados no soro de camundongos C57BL/6 e CCR2
–/–
infectados com 5 cistos de T.
gondii no 8º dia de infecção, utilizando-se o método ELISA. Os resultados mostrados
representam a média ± erro padrão da média (SEM) de cinco animais por grupo experimental.
*Significativamente diferente de valores obtidos dos animais controles (P < 0.05). nd- não
detectado.
Figura 13. Concentração de citocinas no homogenato intestinal de animais C57BL/6 e
CCR2
–/–
infectados por T. gondii. Os níveis das citocinas IL-12 (A), TNF-α (B), IFN-γ (C),
IL-4 (D), IL-10 (E) e TGF-β (F) foram mensurados no homogenato intestinal de
camundongos C57BL/6 e CCR2
–/–
infectados com 5 cistos de T. gondii no 8º dia de infecção.
Amostras do intestino delgado, íleo (100mg) foram coletados e homogeneizados em PBS na
presença do inibidor enzimático e o sobrenadante foi coletado para dosagem das citocinas
utilizando-se método ELISA. Os resultados mostrados representam a média ± erro padrão da
média (SEM) de cinco animais por grupo experimental. *Significativamente diferente de
valores obtidos dos animais controles (P < 0.05). nd- não detectado.
4.8 Expressão de iNOS no intestino delgado e SNC de animais C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados por T. gondii
Desde que os animais CCR2
-/-
apresentaram uma alta carga parasitária e, sabendo que
reativos intermediários de nitrogênio são importantes no controle da replicação do
protozoário, foi verificado, por imunoistoquímica, a expressão da enzima sintase de óxido
nítrico induzível (iNOS) no intestino delgado no 8º dia, bem como no SNC no 23º dia após a
infecção, em camundongos C57BL/6 e CCR2
-/-
infectados com 5 cistos de T. gondii.
Os resultados demonstraram um aumento de células que expressam a enzima iNOS no
intestino delgado (Figura 14A) no 8º dia de infecção e no SNC (Figura 14C) no 23º dia de
infecção em animais C57BL/6. De maneira surpreendente, as células que expressam iNOS
nos animais CCR2
-/-
foram bastante reduzidas nos órgãos dessa linhagem de camundongo
(Figura 14B e D). Esses dados sugerem que a indução da expressão da iNOS é dependente de
CCR2, sendo que esta via de controle do parasito não é funcional na ausência de CCR2.
Figura 14. Detecção de células iNOS
+
após infecção por T. gondii. Secções do íleo e SNC de
camundongos C57BL/6 (A e C) e CCR2
-/-
(B e D) foram infectados com 5 cistos da cepa ME-
49 de T. gondii. Os órgãos foram coletados no 8º (A e B) e no 23º dia pós-infecção (C e D) e
analisados por imunoistoquímica para a detecção da presença de células iNOS
+
. (Aumento
original de 40X).
4.9 Produção de NO por células de baço de animais C57BL/6 e CCR2
-/-
estimuladas
com IFN-γ ou CCL2
Para determinar se a ausência de CCR2 interfere no mecanismo microbicida de
macrófagos, os níveis de NO foram mensurados no sobrenadante de cultura de células de baço
estimuladas com IFN-γ ou CCL2 de animais C57BL/6 e CCR2
-/-
.
Os resultados demonstram que ambos os estímulos foram capazes de induzir os
macrófagos, provenientes de animais do tipo selvagem, a produzirem NO, porém os
macrófagos provenientes de animais deficientes de CCR2 não foram capazes de produzir NO
(Figura 15A e B). Assim, a interação CCR2-CCL2 esta envolvida na produção de NO. Esses
resultados sugerem que a ausência de reativos intermediários de nitrogênio, em camundongos
CCR2
-/-
, provavelmente leva a um aumento da carga parasitária nestes animais quando
comparados com os animais C57BL/6.
Figura 15. Produção de NO por células de baço provenientes de camundongos C57BL/6 e
CCR2
-/-
estimulados com IFN-γ ou CCL2. Células do baço foram coletadas, plaqueadas em
meio RPMI e incubadas por 3 h. Logo após as células não aderentes foram removidas através
de sucessivas lavagens, e as aderentes foram estimuladas com doses crescentes de (A) IFN-γ
(1, 5, e 25 U/ml) ou (B) CCL2 (2, 10 e 50 ng/ml). Após 48 h de estímulo o sobrenadante foi
coletado para mensuração da produção de NO pelo método de Griess.
5.Discussão
Papel de CCR2 na infecção oral po
r
Toxoplasma gondii.
_____________________
___
A toxoplasmose é uma infecção de ampla disseminação entre humanos e animais
podendo ser encontrada em todo o mundo (MONTOYA; LIESENFELD, 2004). Embora a
infecção por T. gondii seja usualmente assintomática, apresenta um caráter oportunista
manifestando-se com gravidade quando o indivíduo venha sofrer um processo de
imunodeficiência. Nestes casos o parasito pode se disseminar por todo o organismo causando
toxoplasmose grave com sinais de encefalite.
A infecção natural por T. gondii é adquirida pela ingestão de carne crua ou mal cozida
contendo cistos ou oocistos do parasito (DUBEY, 1998; MONTOYA; LIESENFELD, 2004).
Após a ingestão, bradizoítas ou esporozoítas são liberados dos cistos e invadem rapidamente a
mucosa intestinal e convertem-se em taquizoítas, com ativa multiplicação e invasão das
células hospedeiras, disseminando-se por todo o organismo (BUZONI-GATEL et al., 2006;
LIESENFELD et al., 2002). Pelas razões mencionadas acima, a via oral de infecção reflete
uma infecção típica que ocorre em toxoplasmose adquirida em humanos. Dessa forma, é
importante utilizar um modelo animal infectado pela via oral, para investigar os mecanismos
naturais de defesa do hospedeiro contra esse parasito.
Assim, o presente estudo foi proposto com o objetivo de verificar se o receptor de
quimiocina, CCR2, está envolvido no controle da infecção oral ou numa migração celular
exacerbada que poderia causar uma patologia intestinal. Estudos anteriores demonstraram que
células epiteliais intestinais, infectadas por T. gondii, produzem quimiocinas que são
importantes na migração celular para esse sítio de infecção (BUZONI-GATEL, et al., 2006;
MENNECHET, et al., 2002). Amostras de intestino delgado infectado por T. gondii
apresentam um aumento significativo na secreção de CCL2, produzida por uma variedade de
células em resposta à inflamação, tendo um importante papel no recrutamento de monócitos
(MENNECHET, et al., 2002). CCR2 é caracterizado como um receptor de quimiocina
expresso por células mononucleares, dentre elas, monócitos, células dendríticas imaturas,
célula NK e células T ativadas residentes, que migram para o tecido após contato com agentes
patogênicos (MOSER; LOETCHER, 2001).
Neste trabalho, observamos que uma pequena população de células CCR2
+
é
residente, enquanto que, após a infecção por T. gondii, células CCR2
+
migram para o intestino
delgado, em adição, há um aumento de células CCL2
+
depois do contato com o parasito no
sítio de infecção. Em paralelo, a produção de CCL2 apresentou-se elevada em amostras de
soro no período inicial de infecção na ausência de CCR2. Assim, após a infecção por
T. gondii, células CCR2
+
são recrutadas para o sítio de infecção e na ausência do receptor a
concentração da quimiocina é elevada. Nossos resultados sugerem que a interação entre a
quimiocina CCL2 e seu receptor CCR2 pode estar envolvida com a migração e a retenção das
células CCR2
+
no sítio de infecção.
A resistência à toxoplasmose aguda em modelos animais está associada com a
capacidade de supressão da replicação do parasito. Camundongos CCR2
-/-
apresentam uma
alta mortalidade associada com alta carga parasitária nos órgãos periféricos na fase aguda e no
SNC no início de uma fase crônica de infecção. Em nosso trabalho foi observado que o
parasitismo tecidual foi pelo menos parcialmente controlado nos órgãos periféricos nos
camundongos CCR2
-/-
mas persiste no SNC. Assim, a deficiência de CCR2 compromete o
controle da replicação do parasito, sugerindo a existência de um mecanismo dependente deste
receptor para auxiliar o controle de T. gondii.
Trabalhos anteriores demonstraram que camundongos C57BL/6 infectados com alta
carga parasitária são altamente suscetíveis à infecção por T. gondii, com o desenvolvimento
de uma forte resposta inflamatória contra o parasito no intestino delgado, causando focos de
necrose tecidual (LIESENFELD et al., 1996). Além disso, é bem descrito que camundongos
deficientes em CCR2 apresentam deficiência no recrutamento de macrófagos (KURIHARA et
al., 1997). Em nossos experimentos, nós verificamos que no 8º dia de infecção, a reação
inflamatória nos órgãos periféricos é menor em animais CCR2
-/-
quando comparados com os
animais C57BL/6, indicando que esse receptor de quimiocina está envolvido na promoção da
migração de células inflamatórias para o sítio de infecção. Dessa forma, observamos migração
menor de células CCL2
+
nos animais CCR2
-/-
em relação à migração observada nos animais
do tipo selvagem, refletindo assim a deficiência do recrutamento de alguns tipos celulares na
ausência de CCR2.
No 8º dia de infecção, o intestino delgado dos camundongos CCR2
-/-
apresentam uma
resposta inflamatória menos intensa, com menor migração de linfócitos T CD4
+
e células
MAC-1
+
em comparação aos animais selvagens. No entanto, os animais CCR2
-/-
apresentam
uma maior migração de linfócitos T CD8
+
quando comparados com os animais C57BL/6. No
intestino delgado infectado por T. gondii, a composição de células infiltrantes é representada
por linfócitos T CD4
+
na LP e linfócitos T CD8
+
localizados entre as células epiteliais,
componentes principais da imunidade protetora contra T. gondii (MENNECHET et al., 2002).
Além disso, as células T CD4
+
na LP são responsáveis por alterações histopatológicas no
intestino delgado levando à necrose tecidual e, subseqüentemente, a uma mortalidade
acelerada (LIESENFELD et al., 1996, 1999). Outros trabalhos demonstraram que células
T CD8
+
presentes no epitélio intestinal são capazes de modular a atividade inflamatória dos
linfócitos T CD4
+
da LP (MENECHET et al., 2004). Nossos estudos demonstram uma
pequena migração de células T CD4
+
e MAC-1
+
na ausência de CCR2 que podem estar
associadas com a menor reação inflamatória encontrada no intestino dessa linhagem de
camundongo. Em paralelo, encontramos um aumento de células T CD8
+
nesses animais no
sítio de infecção. De maneira interessante, é bem descrito que outros receptores de
quimiocinas estão aumentados após infecção por T. gondii e são importantes na resistência à
toxoplasmose aguda, dentre eles CCR1, CCR2, CCR5 e CXCR3. CCR5 é um importante
componente no recrutamento de linfócitos intraepiteliais intestinais para o sítio de infecção
em camundongos infectados oralmente por T. gondii (BUZONI-GATEL et al., 2001). CCR9 é
um receptor quimioatraente de linfócitos que se liga a quimiocina CCL25 (TECK) e está
envolvido na migração de IELs e da LP. Esse receptor é expresso em todos os linfócitos
T CD4
+
e T CD8
+
presentes no intestino delgado (KUNKEL, et al., 2000). Todos esses
resultados juntos indicam que, de fato, a migração de alguns tipos celulares como linfócitos
T CD4
+
e células MAC-1
+
é dependente de CCR2, enquanto que, na ausência de CCR2 outros
receptores estão envolvidos na migração de células T CD8
+
. Assim, a pequena migração de
células T CD4
+
na LP e o aumento de células T CD8
+
poderiam estar contribuindo para o
desenvolvimento de lesões inflamatórias menos intensas no intestino de animais CCR2
-/-
.
No presente estudo, nós verificamos uma alta suscetibilidade dos animais CCR2
-/-
infectados por T. gondii. Contudo, esta suscetibilidade poderia estar relacionada com uma
deficiência no desenvolvimento de uma resposta Th1. Assim, a resposta Th1 é essencial para
a proteção do animal contra a infecção, entretanto, se não controlada, esta passa a ser
prejudicial ao hospedeiro (YAP; SHER, 1999). Nossos resultados demonstraram que a
produção de IL-12, TNF-α e IFN-γ ocorre normalmente em animais CCR2
-/-
infectados, com
altos níveis de IFN-γ no soro e alta produção de IL-12 e TNF-α no intestino delgado quando
comparados com os animais C57BL/6. Foi também observado no intestino delgado de
animais CCR2
-/-
níveis elevados de citocinas anti-inflamatórias como IL-4 e TGF-β. De
maneira interessante, a alta produção de TGF-β no intestino delgado dos animais CCR2
-/-
pode estar relacionada com o aumento de linfócitos intraepiteliais, uma vez que estes
produzem altas concentrações de TGF-β que é um agente regulador da resposta imune, tendo
a capacidade de regular negativamente a proliferação de células T CD4
+
assim como a
produção de IFN-γ (BUZONI-GATEL et al., 2001, LUANGSAY et al., 2003). Os linfócitos
intraepiteliais intestinais apresentam um papel chave na manutenção da homeostase intestinal,
desempenhando uma importante função de proteção a lesões inflamatórias induzidas pela
infecção oral por este parasito, que podem ser observadas em animais CCR2
-/-
. Assim nossos
resultados demonstram que tanto citocinas pró como anti-inflamatórias são produzidas após
infecção por T. gondii na ausência de CCR2, e que a alta produção de citocinas
anti-inflamatórias poderia estar contribuindo para diminuição de uma resposta
pró-inflamatória exacerbada no intestino delgado.
Como os animais CCR2
-/-
são altamente suscetíveis no início de uma fase crônica, em
nosso modelo, nós investigamos o processo inflamatório e a carga parasitária no SNC nesse
período de infecção. A reação inflamatória no SNC foi similar em ambas as linhagens de
camundongos no 23º dia após a infecção, porém nos animais CCR2
-/-
há uma diminuição da
migração de células MAC-1
+
e CD4
+
no SNC quando comparados com os animais C57BL/6.
Como observado no intestino delgado, no SNC há um aumento de células CD8
+
em animais
CCR2
-/-
quando comparados com os animais C57BL/6. No entanto, há um aumento
descontrolado do parasitismo tecidual nos animais CCR2
-/-
quando comparados com os
animais C57BL/6, sendo que a maioria desses animais morre nesse período de infecção. Esses
resultados sugerem que, além do receptor CCR2, outros receptores de quimiocinas estão
envolvidos com a migração de células MAC-1
+
e CD4
+
para esse órgão, mas a ausência de
CCR2, mesmo com o recrutamento de outros tipos celulares, não é capaz de controlar o
parasitismo tecidual levando ao aumento da suscetibilidade dos animais CCR2
-/-
.
Desde que a produção de óxido nítrico pelos macrófagos é considerada um importante
mecanismo microbicida contra uma variedade de patógenos intracelulares, incluindo
Toxoplasma gondii (KHAN et al., 1997), nós verificamos a expressão da enzima iNOS no
intestino delgado dos animais de ambas as linhagens estudadas no 8º dia e no SNC no 23º dia
de infecção. Os resultados demonstraram que camundongos CCR2
-/-
apresentam menor
expressão de células iNOS
+
no intestino delgado quando comparados com os camundongos
selvagens, uma vez que essa enzima é um importante componente produzido pelos leucócitos
na indução da morte dos parasitos. De maneira interessante, foi observada também a
deficiência da enzima iNOS no cérebro de camundongos CCR2
-/-
após 23 dias de infecção por
T. gondii. Esses dados sugerem que a ativação integral dessas células é dependente de CCR2.
Assim, provavelmente a ausência de iNOS em animais CCR2
-/-
leva ao aumento da carga
parasitária quando comparados com os animais do tipo selvagem.
A importância da atividade da iNOS na resistência a T. gondii foi observada através de
experimentos realizados anteriormente com camundongos deficientes em iNOS, com uma
diminuição da inflamação no intestino delgado e um aumento da carga parasitária,
demonstrando que as alterações patológicas no intestino envolvem eventos mediados por NO,
e que este é necessário para controlar a replicação do parasito (KHAN et al., 1996, 1997,
1998).
Além disso, NO pode ser considerado uma molécula reguladora (CANDOLFI et al.,
1994) envolvida em alterações imunopatológicas induzidas pelo parasito durante uma
infecção crônica. Várias citocinas apresentam a capacidade de suprimir a produção de IFN-γ
e, além disso, IL-4, IL-10 e TGF-β são citocinas conhecidas como fatores de desativação de
macrófagos, modulando diretamente a produção de NO. A capacidade que essas citocinas têm
de inibir a atividade citotóxica de macrófagos é sinérgica, assim como a exposição individual
de cada citocina é insuficiente na supressão da produção de NO (OSWALD et al., 1992;
JAMES, 1995). Nossos resultados demonstraram que na ausência de CCR2, a produção de
IL-4, IL-10 e TGF-β está aumentada no intestino delgado e, em contrapartida, a produção de
iNOS nesses animais é quase ausente, sugerindo que a combinação dessas citocinas poderia
estar inibindo a produção de NO neste sítio de infecção., ou ainda desativando os macrófagos.
Além disso, como citado anteriormente, NO é um metabólito que tem uma importante
função microbicida. Corroborando com os resultados anteriores, macrófagos provenientes de
camundongos CCR2
-/-
são incapazes de produzir NO em resposta à estimulação com IFN-γ,
ou pequenas quantidades de NO quando estimulados com CCL2. Isso comprova o importante
papel de CCR2 na indução da expressão de iNOS e na produção de NO. Possivelmente, a
ausência de NO em células de camundongos CCR2
-/-
resulta em um menor controle da
replicação do parasito. Portanto, tomados em conjunto, esses dados indicam que os
camundongos CCR2
-/-
apresentam durante a infecção pelo T. gondii, um grande prejuízo na
ativação das células que compõem o infiltrado inflamatório, resultando em uma alta carga
parasitária sistêmica e, conseqüentemente, em uma maior suscetibilidade ao parasito.
Nossos estudos demonstraram que a ausência de CCR2, após infecção oral por
T. gondii, leva a um elevado parasitismo nos órgãos periféricos e um aumento progressivo do
parasito no SNC, sugerindo que a deficiência desse receptor prejudica o recrutamento e
ativação celular e, conseqüentemente, o controle do parasito. Assim, nós propomos que o
CCR2 é essencial para controlar a migração de populações celulares envolvidas no controle
do parasito e ativar mediadores microbicidas principalmente no SNC para o controle da
proliferação deste, favorecendo a suscetibilidade do hospedeiro no modelo estudado.
6. Conclusão
Papel de CCR2 na infecção oral po
r
Toxoplasma gondii
.
_
_
____________________
_
Como conclusão, o receptor CCR2 está envolvido no recrutamento de linfócitos
T CD4
+
e células MAC-1
+
no intestino delgado e no SNC após a infecção por T. gondii. Além
disso, esse receptor é essencial para ativar mediadores microbicidas tanto na fase aguda de
infecção no intestino delgado, como no início da fase crônica no SNC, mecanismo importante
para que ocorra o controle da proliferação do parasito, favorecendo assim a resistência do
hospedeiro.
7. Referências
Papel de CCR2 na infecção oral po
r
Toxoplasma gondii.
_____________________
___
ABDI, R.; MEANS, T. K.; ITO, T.; SMITH, R. N.; NAJAFIAN, N.; JUREWICZ, M.;
TCHIPACHVILI, V.; CHARO, I.; AUCHINCLOSS-JR., H.; SAYEGH, M. H.; LUSTER, A.
D. Differential role of CCR2 in islet and heart allograft rejection: tissue specificity of
chemokine/chemokine receptor function in vivo. The Journal of Immunology, v. 172, p.
767-775, 2004.
ADAMS, L. B.; HIBBS, J. B.; TAINTOR, R. R., Krahenbuhl JL: Microbiostatic effect of
murine-activated macrophages for Toxoplasma gondii. Role for synthesis of inorganic
nitrogen oxides from L-arginine. The Journal of Immunology, v. 144, p. 2725-2729, 1990.
AHUJA, S. S.; PALIOGIANNI, F.; YAMADA, H.; BALOW, J. E.; BOUMPAS, D. T. Effect
of transforming growth factor-β on early and late activation events in human T cells. The
Journal of Immunology, v.150, p. 1461-1471, 1993.
ALIBERTII, J. Host persistence: Explotation of anti-inflammatory pathways by Toxoplasma
gondii. Nature Immunology, v. 5, p. 162-170, 2005.
BLISS, S. K.; GAVRILESCU, L. C.; ALCARAZ, A.; DENKERS, E. Y. Neutrophil depletion
during Toxoplasma gondii infection leads to impaired immunity and lethal systemic
pathology. Infection and Immunity, v. 69, p. 4898-4905, 2001.
BLISS, S. K.; ZHANG, Y.; DENKERS, E. Y. Murine neutrophil stimulation by Toxoplasma
gondii antigen drives high level production of IFN-gamma independent IL-12. The Journal
of Immunology, v. 4, p. 2081-2088, 1999.
BRUHL, H.; CIHAK, J.; SCHNEIDER, M. A.; PLACHY, J.; RUPP, T.; WENZEL, I.;
SHAKARAMI, M.; MILZ, S.; ELLWART, J. W.; STANGASSINGER, M. ;
SCHLONDORFF, D.; MACK, M. Dual role of CCR2 during iniation and progression of
collagen-induced arthritis: evidence for regulatory activity of CCR2
+
T cells. The Journal of
Immunology, v.174, p. 890-898, 2004.
BOURGUIN, I.; MOSER, M.; BUZONI-GATEL, D.; TIELEMANS, F.; BOUT, D.;
URBAIN, J.; LEO, O. Murine dendritic cells pulsed in vitro with Toxoplasma gondii antigens
induce protective immunity in vivo. Infection and Immunity, v. 66, p. 4867-4874, 1998.
BUZONI-GATEL, D.; DEBBABI, H.; MENNECHET, F. J. D.; MARTIN, V.;LEPAGE, A.
C.; SCHWARTZMAN, J. D.; KASPER, L. H. Murine ileitis after intracellular parasite
infection is controlled by TGF-β - producing intraepithelial lymphocytes. Gastroenterology,
v. 120, p. 914-924, 2001.
BUZONI-GATEL, D.; SCHULTHESS, J.; MENARD, L. C.; KASPER, L. H. Mucosal
defences against orally acquired protozoan parasites, emphasis on Toxoplasma gondii
infections. Cellular Microbiology, v. 8, p. 535-544, 2006.
CANDOLFI, E.; HUNTER, C. A.; REMINGTON, J. S. Mitogen- and antigen-specific
proliferation of T cells in murine toxoplasmosis is inhibited by reactive nitrogen
intermediates. Infection and Immunity, v. 62, p. 1995-2001, 1994.
COILLIE, E. V.; DAMME, J. V.; OPDENAKKER, G. The MCP/eotaxin subfamily of CC
chemokines. Cytokines & Growth Factor Reviews, v. 10, p. 61-86, 1999.
CONRAD, S. M.; STRAUSS-AYALI, D.; FIELD, A. E.; MACK, M.; MOSSER, M. D.
Leishmania-derived murine monocyte chemoattractant protein 1 enhance the recruitment of a
restrictive population of CC chemokine receptor 2-positive macrophage. Infection and
Immunity, v. 75, p. 653-665, 2007.
COPPIN, A.; DZIERSZINSKI, F.; LEGRAND, S.; MORTUAIRE, M.; FERGUSON, D.;
TOMAVO, S. Developmentally regulated biosynthesis of carbohydrate and storage
polysaccharide during differentiation and tissue cyst formation in Toxoplasma gondii.
Biochimie, v. 85, p. 353-361, 2003.
DENKERS, E. Y. T lymphocyte-dependent effector mechanisms of immunity to Toxoplasma
gondii. Microbes and Infection, v. 1, p. 699-708, 1999.
DENKERS, E.Y.; GAZZINELLI, R.T. Regulation and fuction of T-cell mediated immunity
during Toxoplasma gondii infection. Clinical Microbiology Reviews, v.11, p. 569-588,
1998.
DEL RIO, L.; BENNOUNA, S.; SALINAS, J.; DENKERS, E. Y. CXCR2 deficiency confers
impaired neutrophil recruitment and increased susceptibility during Toxoplasma gondii
infection. The Journal of Immunology, v. 167, p. 6503-6509, 2001.
DUBEY, J.P. Advances in the life cycle of Toxoplasma gondii. Journal of Parasitology, v.7,
p. 1019-1024, 1998.
DUBEY, J. P.; LINDSAY, D. S.; SPEER, C. A. Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites,
bradyzoite, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clinical
Microbiology Reviews, v. 13, p. 267-299, 1998.
FRENKEL, J. K. Pathophysiology of Toxoplasmosis. Parasitology Today, v. 4, p. 273-278,
1988.
GAZZINELLI, R. T.; WYSOCKA, M.; HAYASHI, S.; DENKERS, E. Y.; HIENYS, S.;
CASPAR, P.; TRINCHIERI, G.; SHER, A. Parasite – induced Il-12 stimulates early IFN-
gamma synthesis and resistance during acute infection with Toxoplasma gondii. The Journal
of Immunology, v. 153, p. 2533-2543, 1994.
GAZZINELLI, R. T.; HAKIN, F. T.; HIENY, S.; SHEARER, G. M.; SHER, A. Synergistic
role of CD4
+
and CD8
+
T lymphocytes in IFN-gamma production and protective immunity
induced by an attenuated Toxoplasma gondii vaccine. The Journal of Immunology, v. 146,
p. 286-292, 1991.
GREEN, L. C.; TANNENBAUM, S. R.; GOLDMAN, P. Nitrite biosynthesis in germfree and
conventional rat. Science, v. 212, p. 56-58, 1981.
HARDISON, J. L.; KUZIEL, W. A.; MANNING, J. E.; LANE, T. E. Chemokine CC 2 is
important for acute control of cardiac parasitism but does not contribute to cardiac
inflammation after infection with Trypanosoma cruzi. The Journal of Infectious Diseases, v.
193, p. 1584-1588, 2006.
HELD, K. S.; CHEN, B. P.; KUZIEL, W. A.; ROLLINS, B. J.; LANE, T. E. Differential to
roles of CCL2 in host defense to coronavirus infection. Virology, v. 329, p. 251-260, 2004.
HUNTER, C. A.; REMINGTON, J. S. Imunopathogenesis of toxoplasmic encephalitis.
Journal Infection Disease, v. 170, p. 1057-1067, 1994.
JAMES, S. L. Role of nitric oxide in parasitic infectious. Microbiological Reviews, v. 59, p.
533-547, 1995.
KASPER, L.; COURRET, N.; DARCHE, S.; LUANGSAY, S.; MENNECHET, L. M.;
RACHINEL, N.; RONET, C.; BUZONI-GATEL, D. Toxoplasma gondii and mucosal
immunity. International Journal for Parasitology, v. 34, p. 401-409, 2004.
KHAN, I. A.; SCHWARTZMAN, J. D.; MATSUURA, T.; KASPER, L. H. A dichotomous
role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proccedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, v. 94, p. 13955-13960,
1997.
KHAN, I. A.; MATSUURA, T.; FONSEKA, S.; KASPER, L. H. Production of nitric oxide
(NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1
-/-
mice. The Journal of Immunology, v.156, p. 636-643, 1996.
KHAN, I. A.; MATSUURA, T.; KASPER, L. H. Inducible nitric oxide synthase is not
required for long-term vaccine-based immunity against Toxoplasma gondii. The Journal of
Immunology, v.161, p. 2994-3000, 1998.
KRICK, J; REMINGTON, J. Toxoplasmosis in the adult: an overview. New England
Medical Journal, v. 298, p. 550-553, 1978.
KUNKEL, E. J.; CAMPBELL, J. J.; HARALDSEN, G.; PAN, J.; BOISVERT, J. ROBERTS,
A. L.; EBERT, E. C.; VIERRA, M. A.; GOODMAN, S. B.; GENOVESSE, M. C.;
WARDLAW A. J.; GREENBERG, H. B.; PARKER, C. M.; BUTCHER, E.C.; ANDREW D.
P.; AGACE, W. W. Lymphocyte CC chemokine (TECK) expression distinguish the small
intestinal immune compartment: epithelial expression of tissue specific chemokines as an
organizing principle in regional immunity. The Journal of Experimental Medicine, v. 192,
p. 761-768, 2000.
KURIHARA, T.; WARR, G.; LOY, J.; BRAVO, R. Defects in macrophage recruitment and
host defense in mice lacking the CCR2 chemokine receptor. The Journal of Experimental
Medicine, v. 186, p. 1757-1762, 1997.
LANGERMANS, J. A. M.; VAN DER HULST, M. B. E.; NIBBERING, P. H.; HIEMSTRA,
P.S.; FRANSEN, L. VAN FURTH, R. IFN-γ induced L-arginine- dependent
toxoplasmmastatic activity in murine peritoneal macrophages is mediated by endogenous
tumor necrosis factor-α. The Journal of Immunology, v. 148, p. 568-574, 1992.
LIESENFELD, O. Oral infection of C57Bl/6 mice with Toxoplasma gondii: A new model of
inflammatory bowel disease? The Journal of infectious Diseases, v. 185, p. 96-101, 2002.
LIESENFELD, O.; KANG, H.; PARK, D.; NGUYEN, T. A.; PARKHE, C. V.;
WATANABE, H., ABO, T.; SHER, A.; REMINGTON, J. S.; SUZUKI, Y. TNF-α, nitric
oxide and IFN-γ are all critical for development of necrosis in the small intestine and early
mortality in genetically susceptible mice infected perorally with Toxoplasma gondii. Parasite
Immunology, v. 21, p. 365-376, 1999.
LIESENFELD, O.; KOSEK, J. REMINGTON, J. S.; SUZUKI, Y. Association of CD4
+
T
cell-dependent, interferon-gamma-mediated necrosis of the small intestine with genetic
susceptibility of mice to peroral infection with Toxoplasma gondii. The Journal of
Experimental Medicine, v. 184, p. 597-607, 1996.
LUANGSAY, S.; KASPER, L. H.; RACHINEL, N.; MINNS, L. A.; MENNECHET, F. J. D.;
VANDEWALLE, A.; BUZONI-GATEL, D. CCR5 mediates specific migration of
Toxoplasma gondii – primed CD8
+
lymphocytes to inflammatory intestinal epithelial cells.
Gastroenterology, v. 125, p. 491-500, 2003.
MENNECHET, F. J. D.; KASPER, L. H.; RACHINEL, N.; WEN, L.; VANDEWALLE, A.;
BUZONI-GATEL, D. Lamina Propria CD4
+
T Lymphocytes synergize with murine intestinal
epithelial cells to enhance proinflamatory response against an intracellular pathogen. The
Journal of Immunology, v. 168, p. 2988-2996, 2002.
MENNECHET, F. J. D.; KASPER, L. H.; RACHINEL, N.; MINNS, L. A.; LUANGSAY, S.;
VANDEWALLE, A.; BUZONI-GATEL, D. Intestinal intraepitelial lymphocytes prevent
pathogen-driven inflamation and regulate the Smad/T-bet pathaway of lamina propria CD4
+
T
cells. European Journal of Immunology, v. 34, p. 1059-1067, 2004.
MONTOYA, J. G.; LIESENFELD, O. Toxoplasmosis. The Lancet, v. 363, p. 1965-1976,
2004.
MORDUE, D. G.; SIBLEY, D. L. A novel population of Gr-1
+
- activated macrophages
induced during acute toxoplasmosis. Journal of LeuKocyte Biology, v. 74, p. 1015-1025,
2003.
MOSER, B.; LOETSCHER, P. Lymphocyte traffic control by chemokines. Nature
Immunology, v. 2, p. 123-127, 2001.
MURDOCH, C.; FINN, A. Chemokine receptors and their role inflammation and infectious
diseases. Blood, v. 95, p. 3032-3043, 2000.
OSWALD, I. P.; GAZZINELLI, R. I.; SHER, A.; JAMES, S. L. IL-10 synergizes with IL-4
and transforming growth factor to inhibit macrophage cytotoxic activity. The Journal of
Immunology, v. 148, p. 3578-3582, 1992.
PEREZ DE LEMA, G.; MAIER, H.; NIETO, E.; VIELHAUER, V.; LUCKOW, B.;
MAMPASO, F.; SCHLONDORFF, D. Chemokine expression precedes inflammatory cell
infiltration and chemokine receptor and cytokine expression during the initiation of murine
Lupies nephritis. American Society of Nephrology, v. 12, p. 1369-1382, 2001.
PETERS, W.; SCOTT, H. M.; CHAMBERS, J. L.; FLYNN, J. L.; CHARO, I. F.; ERNST, J.
D. Chemokine receptor 2 serves an early and essential role in resistance to Mycobacterium
tuberculosis. Proccedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, v. 98, p. 7958-7963, 2004.
PETERSEN, E. Toxoplasmosis. Seminars in Fetal εt Neonatal Medicine, v. 12, p. 214-223,
2007.
QUINONES, M. P.; ESTRADA, C. A.; JIMENEZ, F.; MARTINEZ, H.; WILLMONS, O.;
KUZIEL, W. A. CCL2-independent role of CCR2 in immune responses against Leishmania
major. Parasite Immunology, v. 29, p. 211-217, 2007.
ROBBEN, P. M.; LAREGINA, M.; KUZIEL, W. A; SIBLEY, D. L. Recruitment of Gr-1
+
monocytes is essential for control of acute toxoplasmosis. The Journal of Experimental
Medicine, v. 201, p. 1761-1769, 2005.
SATO, N.; AHUJA, S. K.; QUINONES, M.; KOSTECKI, V.; REDDICK, R. L.; MELBY, P.
C.; KUZIEL, W. A.; AHUJA, S. S. CC chemokine receptor (CCR)2 is required for
langerhans cell migration and localization of T helper cell type 1 (Th1)-inducing dendritic
cells. Absence of CCR2 shifts the Leishmania major-resistant phenotype to a susceptible state
dominated by Th2 cytokines, b cell outgrowth, and sustained neutrophilic inflammation. The
Journal of Experimental Medicine, v. 192, p. 205-218, 2000.
SILVA, N. M.; TAFURI, W. L.; ALVAREZ-LEITE, J. I.; MINEO J. R.; GAZZINELLI, R.
T. Toxoplasma gondii: the in vivo expression of BAG-5 and cyst formation is independent of
TNF receptor and inducible nitric oxide synthase functions. Microbes Infection, v. 4, p. 261-
270, 2002.
SUZUKI, Y.; SHER, A.; YAP, G.; PARK, D.; NEYER, L. E.; LIESENFELD, O.; FORT, M.;
GUFWOLI, E. IL-10 is required for prevention of necrosis in the small intestine and mortality
in both genetically resistent BALB/c and susceptible C57Bl/6 mice following peroral
infection with Toxoplasma gondii. The Journal of Immunology, v. 164, p. 5375-5382, 2000.
TENTER, A. M.; HECKEROTH, A.R.; WEISS, L. M. Toxoplasma gondii: from animals to
humans. International Journal of Immunology, v. 31, p. 1217-1258, 2000.
VOSSENKAMPER, A.; STRUCK, D.; ALVARADO-ESQUIVEL, C.; WENT, T.;
TAKEDA, K.; AKIRA, S.; PTEFFER, K.; ALBER, G.; LOCHNER, M.; FORSTER, I.;
LIESENFELD, O. Both IL-12 and IL-18 contribute to small intestinal Th1-type
immunopathology following oral infection with Toxoplasma gondii, but IL-12 is dominant
over IL-18 in parasite control. European Journal of Immunology, v. 34, p. 3197-3207,
2004.
YAP, G. S.; SHER, A. Cell-mediated immunity to Toxoplasma gondii: initiation, regulation
and effector function. Immunobiology, v. 201, p. 240-247, 1999.
WAREING, M. D.; LYON, A.; INGLIS, C.; GLANNONI, F.; CHARO, I.; SARAWAR, S.
R. Chemokine regulation of the inflammatory response to a low-dose influenza infection in
CCR2
-/-
mice. Journal of Leukocyte Biology, v. 81, p. 000-000, 2006.
ZLOTNIK, A.; YOSHIE, O. Chemokines: A new classification system and their role in
immunity. Immunity, v. 12, p. 121-127, 2000.
8. Anexo
Papel de CCR2 na infecção oral
por
Toxoplasma gondii.
_____________________
___
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
