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Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Bioquímica Médica
Laboratório de Bioquímica de Insetos
RENATA CRISTINA CALDEIRA NASCIMENTO
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Rio de Janeiro
2007
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Renata Cristina Caldeira Nascimento
Atividade antifúngica associada aos ovos de Rhodnius prolixus
(Hemiptera Reduviidae): Uma possível associação simbiótica
entre bactérias e insetos
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas (Química Biológica),
Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Mestre em Ciências (Química
Biológica).
Orientador: Prof. Hatisaburo Masuda
Co-orientadora: Daniela Sales Alviano
Rio de Janeiro
2007
I
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FICHA CATALOGRÁFICA
Nascimento, Renata Cristina Caldeira 2007 -
Atividade antifúngica associada aos ovos de Rhodnius prolixus
(Hemiptera Reduviidae): Uma possível associação simbiótica
entre bactérias e insetos.
Rio de Janeiro, UFRJ – Instituto de Bioquímica Médica, 2007.
f. : il.
Dissertação de Mestrado (Química Biológica)
1. Rhodnius prolixus. 2. Ovos 3. Atividade antifúngica 4.
Bactérias I. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Curso de
Pós-Graduação em Química Biológica II.
II
FOLHA DE APROVAÇÃO
Renata Cristina Caldeira Nascimento
ATIVIDADE ANTIFÚNGICA ASSOCIADA AOS OVOS DE Rhodnius prolixus (Hemiptera
Reduviidae): uma possível associação simbiótica entre bactérias e insetos
Dissertação submetida ao Instituto de Bioquímica Médica, da Universidade Federal do Rio
de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Ciências
(Química Biológica).
Rio de Janeiro, 29 de março de 2007
______________________________________________________________________________
(Prof. Hatisaburo Masuda, Prof. Titular do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ). Orientador)
_____________________________________________________________________________
(Prof. ª. Lucy Seldin, Prof. ª. Titular do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes – UFRJ).
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(Prof.ª. Rosangela Maria de Araújo Soares, Prof. ª. Adjunta do Instituto de Microbiologia
Prof. Paulo Góes – UFRJ).
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(Prof. ª Andréa Thompson da Poian, Prof. ª Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica –UFRJ)
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(Prof.
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Kátia Calp Gondin, Prof. ª Adjunta do Instituto de Bioquímica Médica –UFRJ)
(revisora e suplente)
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(Prof ª. Ana Claudia do Amaral Melo, Prof ª Adjunta do Instituto de Química – UFRJ).
(Prof.ª suplente externo)
____________________________________________________________________________
(Prof. Pedro Lagerblad de oliveira, Prof. Titular do Instituto de Bioquímica Médica – UFRJ)
III
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Bioquímica de Insetos do
Instituto de Bioquímica Médica, sob a orientação do Prof. Hatisaburo Masuda, e co-
orientação de Daniela Sales Alviano do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo Góes com o
auxílio financeiro das seguintes instituições:
• Conselho Nacional de Desenvolvimento e Pesquisa (CNPq)
• Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)
• PADCT/RIO
IV
Dedico esta tese a Célia, minha mãezinha querida, pois devo tudo a ela ........
V
AGRADECIMENTOS
A Deus que me deu a dádiva da vida, e Quem me dá forças para caminhar nesta
estrada da vida.
Ao Masuda que me incentivou e lutou comigo até o fim. É engraçado que a sua
calma e perseverança me mostraram que podemos transformar tudo, e que devemos usar
isso no nosso dia-a-dia........OBRIGADO.
A minha mãe, Célia, a ela foi concedido o papel de educadora e protetora. Sempre
no momento de tormenta é a esses braços que eu corro para me aconchegar, agradeço a
Deus por tê-la como mãe.
Ao meu Pai, Mauricio, que me ensinou a ser honesta e trabalhadora. Eu tenho
orgulho de você, apesar das pedras do caminho da vida.
Ao Humberto Libonati, meu amor, Grande Homem. A vida me deu vários presentes
e dentre eles está você. Veio no tempo certo me mostrar que não sou um peixe fora d’água
e sim um peixe em outro lago. Às vezes me sinto com cem anos, mas é só estar perto de
você, que é uma pessoa tão alegre, para eu me deixar ser um pouco criança......Te amo.
Ao meu irmão que sempre tentou ser meu pai e deu o melhor que pode para ajudar a
mim e a minha mãe nas horas difíceis do passado. Aos sobrinhos lindos que ele me deu
Yago e Yohan e agora a cegonha esta trazendo, para breve a, Ysabela.
A Márcia, minha cunhada, e a sua Família que há muito tempo fazem parte da
minha.
A Minha tia Graça e ao meu tio Nilton, aos meus primos Niltinho e Família,
Marcinha e Família, Débora e Família, Cristiane e Família, Philippe.
VI
A minha madrinha, Glória, que sempre foi minha segunda mãe.
As minhas amigas de sempre: Danielle, como eu a amo, Elisabete, é a amiga mais
Fashion e a Paula que está distante, mas nunca vou esquecer nossas travessuras.......E suas
respectivas Famílias.
Aos meus vizinhos, Seu Arnaldo e Dona Lilina e Família, e que Família!!! Nunca
em toda minha vida vi uma Família tão unida.... Continue sempre assim.
A Luciene, Diogo e Robson.
A Helô, pois devo tudo o que eu sei de HPLC e sempre que eu precisei foi a ela
quem eu recorri primeiramente, te desejo tudo de bom.
A Liliam, pois sempre tem uma palavra para dizer que a vida é bela, além disso,
deixou tudo pronto para a microscopia eletrônica, antes de entrar de férias, beijos.
Ao Junior e a Litiane que tiveram a maior paciência comigo neste tempo que eu
estava coletando ovos.
A Dedê, pois foi ela que deu os primeiros passos para que essa dissertação pudesse
sair, além disso, pelo seu grande coração e palas longas conversas sobre o futuro.
As meninas do Lab. Lize que sempre me ajudou em tudo o que eu não sabia,
Angélica, Maya (quantas conversas enquanto íamos para Barra, Hein!!!), Paula Santos,
Anne, Renatinha (que agora está lá embaixo) e Fabiana.
Ao Pessoal do GKM: Raquel, por me escutar e me dar bons conselhos, a Rachel que
com seu jeitinho faz todos rirem, Alan, Alan Brito, Aline (sempre solícita), Michele, Lívia,
David, Petter, Felipe e todos os membros desta “Grande Família”.
A Prof.ª Katia que revisou a minha dissertação com muito cuidado e ainda
entendendo o curto tempo para ler e entregar, e apesar disso, o fez com muito esmero.
Ao Prof. Mario que me deu várias idéias para o meu projeto,
VII
A Prof.ª Geórgia, sempre está de braços abertos para o que você precisar.....
Obrigado.
Ao Prof. Horácio que sempre tem uma história para nos contar.
Ao Prof. Pedro e seus alunos: Zé, Clara, Chistine, Lili.
A Prof.
a
Sonia Rozental Pela grande ajuda com a microscopia eletônica
A Prof.
a
Lucy Seldin que está nos ajudando a caracterizar o gênero e espécie da
bactéria deste trabalho.
A Luiza que é uma das minhas melhores amigas desde a faculdade, teve papel
importantíssimo na minha vida durante o mestrado. Obrigado por você existir.
Por falar em faculdade, não posso esquecer dos meus grandes amigos: Erica, Flávio,
vulgo vovô, Ademir, Cristiane, Sheila e Ana Paula.
A Márcia que teve boa vontade para me ajudar com algumas fotos.
Ao Roberto que tirou algumas fotos para esta dissertação e ao Robinson que
melhorou a qualidade das fotos...Obrigado.
A Celuta e a Daniela que me co-orientaram com muito carinho.
A Tereza e a Patrícia, da Pós-Graduação, que organizam e nos ajudam, “Salvam”,
quando mais precisamos.
A Dona Joana por manter sempre o bom humor e a Rosângela por deixar eu usar a
autoclave e ainda vinha me avisar que tinha acabado...Obrigado.
Enfim, obrigado a todos que passaram pelo meu caminho e que deixaram algum
ensinamento, para que eu leve comigo a vida inteira.
VIII
RESUMO
Os insetos, por serem animais ovíparos, apresentam todo o desenvolvimento
embrionário fora do organismo materno. A perpetuação das espécies depende do
desenvolvimento dos embriões e, portanto, os ovos necessitam estar protegidos na natureza
contra a ação de predadores e agentes microbianos, como fungos e bactérias. Nesta
dissertação investigou-se o sistema de proteção antifúngica de ovos de Rhodnius prolixus.
Os ovos de Rhodnius prolixus são capazes de produzir um halo de inibição de crescimento
de Aspergillus niger, o que sugeria a associação com algum agente antifúngico. A primeira
hipótese de trabalho que norteou a investigação foi a de que o inseto estivesse produzindo o
agente antifúngico para a sua própria proteção. Toda a pesquisa neste sentido resultou em
dados pouco convincentes. Durante a realização dessas experiências notou-se que, próximo
ao halo de inibição do crescimento de Aspergillus. niger, havia também a formação de
colônias de bactérias. Com a utilização de antibióticos nas experiências subseqüentes foi
possível demonstrar que as bactérias eram de fato as produtoras do agente antifúngico, já
que os fungos cresciam por cima dos ovos sem a formação de um halo de inibição. A
análise das bactérias mostrou a preponderância de duas formas diferentes: cocos (Gram-
positivo) e o Bastonete (Gram-negativo). As bactérias da forma cocos mostraram-se
incapazes de inibir o crescimento dos fungos, mas as bactérias da forma de bastonetes
mostraram-se bastante eficazes na inibição do crescimento de Aspergillus niger. Alterações
morfológicas grosseiras nas hifas de Aspergillus niger foram facilmente observáveis ao
microscópio. O agente antifúngico é secretado pelo bastonete para o meio de cultura e
apresenta um efeito que é dose-dependente na inibição do crescimento de Aspergillus niger.
A associação entre os bastonetes e os ovos de Rhodnius prolixus parece ser específica, já
que os bastonetes foram encontrados por observação direta ao microscópio, na glândula
IX
acessória, uma glândula interna que faz parte do aparelho reprodutor do macho.
Adicionalmente, foram encontradas bactérias associadas também aos órgãos genitais da
fêmea além da do macho, a julgar pela indução de halo de inibição de crescimento de
Aspergillus niger em placas de Petri. Parece não ser uma contaminação ambiental, mas sim
uma associação íntima entre a bactéria e o inseto, onde o inseto garante a existência de uma
cepa capaz de proteger os seus ovos contra o crescimento de fungos. Possivelmente as
bactérias adquiriram, ao longo da evolução, vantagens adaptativas neste processo de
associação. Embora os nossos dados não provem ainda de forma definitiva, as evidências
apontam fortemente na direção de um processo simbiótico entre o inseto e a bactéria. Além
de Aspergillus. niger, o meio de cultura filtrado, sem bactéria foi capaz de inibir com muita
eficiência o crescimento de outras espécies de fungos como Trichophyton rubrum;
Microsporum gypseum e moderadamente Aspergillus fumigatus, Aspergillus ochraceus,
Fonsecaea pedrosoi e se mostrou pouco eficiente ou ineficiente para Aspergillus
parasiticus, Fusarium solani, Sporothrise schenckii, Trichoderma harzianum. Os ovos de
Rhodnius prolixus não foram capazes de inibir o crescimento de bactérias do tipo Gram-
positivo ou Gram-negativo. O inseto parece não produzir substâncias antibióticas, talvez
com o sentido de preservar as bactérias de seu interesse.
X
ABSTRACT
Insects are oviparous animals and have all embryonic development outside maternal
body. The perpetuation of species depends on the development of the embryo, thus the eggs
must be protected in nature against predators and microbial agents, such as fungus and
bacteria. Here, the antifungal protection elicited by the egg of Rhodnius prolixus was
investigated. The eggs of Rhodnius prolixus are capable of inhibiting the growth of
Aspergillus niger producing a halo of inhibition, suggesting the association with some
antifungal agent. The initial working hypothesis that conducted the investigation was that
the insect was the producer of the antifungal agent for its own protection. All the
investigation in that direction resulted in non-convincing data. During the development of
these experiments, we noted the presence of bacterial colonies near the halo of inhibition of
Aspegillus niger. The use of antibiotics in the culture media, in subsequent experiments,
made possible the demonstration that the bacteria were in fact the producers of antifungal
agent, since the fungus spread all over the eggs without the formation of a halo of
inhibition. Analysis of the bacteria present in the culture medium showed two major types:
coccus (Gram+) and bacillus (Gram-). The coccus was incapable of inhibiting the growth
of Aspergillus niger, but the bacillus type was very efficient in inhibiting the growth of
Aspegillus niger. Gross morphological alterations could be easily seen under the
microscope. The antifungal agent was secreted by the bacillus to the culture medium and
was effctive against Aspergillus niger, in a dose-dependent manner. The association of the
bacillus with the eggs of Rhodnius prolixus, seemed to be specific, since the bacillus was
found in an internal gland associated with the reproductive tract of the male, the accessory
gland. Additionally, bacteria were found associated with internal glands of females, as
XI
judged by the induction of a halo of inhibition of Aspergillus niger growth in a Petri dish.
It seems to be a close association between bacteria and insects, where the insect provides
the existence of a strain of bacteria capable of protecting the eggs against the growth of
fungus. Possibly, the bacteria acquired, during evolution, adaptative advantages with this
association process. Although our data do not prove yet in a definite fashion, the evidences
point strongly to the direction of a symbiotic process between insect and bacteria. Besides
Aspergillus niger, the antifungal agent was capable of inhibiting very efficiently the growth
of other species, such as Trichophyton rubrum, Microsporum gypseum and moderately,
Aspergillus fumigatus, Aspergillus ochraceous, Fonsecaea pedrosoi, and with low
efficiency or inefficiently Aspergillus parasiticus, Fusarium solani, Sporothrise scheenckii
and Trichoderma harzianum. The antifungal agent is not capable of inhibiting neither the
growth of Gram positive neither Gram negative bacteria. The insect does not produce
substances with antibiotic activity maybe to preserve the bacteria of its own interest.
XII
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AIDS Síndrome da imuno deficiência adquirida
BHI Meio de cultura de Infusão de cérebro e coração bovino
BSA Albumina de sérica bovina
ELISA “Enzyme-linked immunosorbent assay”
ESP Espermateca
GAF Glândula acessória de fêmea
GAM Glândula acessória de macho
HPLC Cromatografia líquida de alta resolução
kDa Quilodáltons
PBS Tampão fosfato-salina
PKA Fosfoquinase A
PDA Meio de cultura Agar Dextrose-Batata
PD Meio de cultura Dextrose-Batata
RNA Ácido ribonucleico
VG Vitelogenina
VT Vitelina
XIII
ÍNDICE
1.Introdução
1 Introdução..............................................................................................................1
1.1 Ovários ................................................................................................................2
1.2 O modelo Rhodnius prolixus................................................................................3
1.3 Vitelogênese.........................................................................................................5
1.4 Microorganismos.................................................................................................12
1.5 Substâncias antimicrobianas................................................................................13
1.6 Interações inseto e microorganismos...................................................................16
2. Objetivos...........................................................................................................................17
3. Materiais e métodos
3.1 Insetos......................................................................................................18
3.2 Dosagem de proteínas..............................................................................18
3.3 Código das espécies de microorganismos...............................................19
3.4 Ensaio de inibição do crescimento de diferentes fungos e bactérias na
presença de ovos fertilizados de Rhodnius prolixus ....................................20
3.5 Obtenção de substâncias antifúngicas solúveis do envoltório protetor de
Rhodnius prolixus e fracionamento do lavado de ovo em HPLC................21
3.6 Ensaio de inibição em lâminas dos fatores solúveis do lavado de ovo...21
3.7 Análise morfológica de hifas de A. niger submetidas aos ensaios de
inibição do crescimento descrito no item 3.3...............................................22
3.8 Isolamento das colônias de Bactérias.....................................................22
XIV
3.9 Observação do fator liberado pelas bactérias em meio de cultura
Saboraud sólido.......................................................................................25
3.10 Preparação do sobrenadante esterilizado de Bactérias..........................25
3.11 Observação do crescimento de A. niger contra o sobrenadante de
bastonetes.....................................................................................................25
3.11.1 Crescimento de A. niger em meio de cultura Saboraud sólido.........25
3.11.2 Crescimento de A. niger em meio de cultura Saboraud líquido........26
3.12 Ensaio antifúngico em microplacas de 96 poços, com o sobrenadante de
bacilos esterilizados......................................................................................26
a)Por observação ao microscópio estereocópico por dois observadores
independentes...............................................................................................21
b) Leitura no leitor de ELISA a 540nm.................................................21
3.13 Análise do conteúdo de bactérias do aparelho reprodutor de machos e
fêmeas de R. prolixus...................................................................................27
3.14 Coloração Gram...................................................................................27
4. Resultados .....................................................................................................................29
5. Discussão .......................................................................................................................66
6. Referências ....................................................................................................................70
XV
Lista de Figuras
Figura 1 ....................................................................................................................04
Figura 2 ....................................................................................................................11
Figura 3 ....................................................................................................................15
Figura 4 ....................................................................................................................24
Figura 5 ....................................................................................................................30
Figura 6 ....................................................................................................................31
Figura 7 ....................................................................................................................34
Figura 8 ....................................................................................................................35
Figura 9 ....................................................................................................................36
Figura 10 ..................................................................................................................37
Figura 11 ..................................................................................................................39
Figura 12 ..................................................................................................................40
Figura 13 ..................................................................................................................41
Figura 14 ..................................................................................................................42
Figura 15 ..................................................................................................................43
Figura 16 ..................................................................................................................46
Figura 17 ..................................................................................................................47
Figura 18 ..................................................................................................................48
XVI
Figura 19 .................................................................................................................50
Figura 20A...............................................................................................................51
Figura 20B.................................................................................................................52
Figura 21 ...................................................................................................................53
Figura 22....................................................................................................................56
Figura 23A.................................................................................................................57
Figura 23B ................................................................................................................58
Figura 24 ...................................................................................................................59
Figura 25....................................................................................................................60
Figura 26....................................................................................................................61
Figura 27....................................................................................................................62
Figura 28....................................................................................................................63
Tabela I .....................................................................................................................63
Figura 29....................................................................................................................64
XVII
INTRODUÇÃO
Durante a evolução das espécies, teve início um processo importante que foi o
desenvolvimento de um organismo multicelular a partir de uma única célula, o ovócito
fertilizado. Entre os organismos ovíparos, que inclui os insetos, o desenvolvimento
embrionário ocorre isolado do organismo materno e, assim, o ovo irá sobreviver somente se
contiver todo o material necessário para o desenvolvimento do embrião. Este material, o
vitelo, é composto de proteínas, açúcares, lipídeos, material genético e outros compostos
menos abundantes, estocados no interior do ovo de forma organizada. Após a fertilização do
ovócito, o ovo irá se desenvolver e resultar em um novo indivíduo. Durante o
desenvolvimento, o vitelo será utilizado pelo embrião de acordo com as necessidades
impostas pelo programa genético da espécie.
Os triatomíneos foi o primeiro grupo onde se descreveu o acúmulo de proteínas extra-
ovarianas pelos ovócitos em desenvolvimento (Wigglesworth, 1943). Neste trabalho,
Wigglesworth relatou o acúmulo de um pigmento rosa, originário da degradação da
hemoglobina, do sangue do hospedeiro vertebrado, “katahemoglobin”, que abriu caminho ao
conhecimento do processo de endocitose de proteínas como o conhecemos hoje. Os trabalhos
pioneiros de Telfer (1954; 1961), associando endocitose com acúmulo de vitelo, foram
seguidos pelo trabalho de Roth e Porter (1964), que identificaram estruturas celulares, como
as “coated vesicles” e outras, associadas à endocitose específica de proteínas. A estes
trabalhos pioneiros seguiram-se inúmeros outros que corroboraram as investigações iniciais
(Snigirevskaya e Raikhel, 2005).
A classe Insecta apresenta uma grande diversidade, formando o maior grupo do reino
animal, organizada em 800 famílias, reunidas em 32 ordens, e já são mais de um milhão de
espécies descritas (Hoy, 1994). Devido a essa diversidade, existe um grande interesse
1
econômico e médico, visto que os insetos são muitas vezes pragas agrícolas e vetores de
doenças.
Os insetos possuem ciclos de vida especializados. Por terem vida, muitas vezes, curta
e não possuírem cuidado parental, as fêmeas investem, estrategicamente, em produzir um
grande número de ovos viáveis em um curto período de tempo. A reprodução é sexuada,
sendo as fêmeas ovíparas e, em alguns casos, ovovíparas. As fêmeas chegam a produzir uma
quantidade de ovos superior à metade de seu peso corporal (Yamashita e Indrasith, 1988). O
desenvolvimento do inseto, de ovo a adulto, é variável, podendo incluir uma fase larvária,
como no caso dos insetos holometábolos, tendo como exemplo a borboleta. Insetos
hemimetábolos, como os percevejos, apresentam diferentes formas de vida juvenis conhecidas
como ninfas. A cada estadio de ninfa o inseto sofre um processo conhecido por muda ou
ecdise, onde este deixa os seus tegumentos externos, rígidos (exúvia), para poder crescer e
produzir um novo tegumento.
1.1 Ovários
Nos insetos os ovários estão classificados conforme o padrão de organização tecidual,
diferenças estruturais e a origem das reservas citoplasmáticas. O ovário consiste de ovaríolos,
que variam em número e tipo. Esses ovaríolos podem ou não ter células nutrizes. Estas
células, quando presente, tem a função de carrear variadas substâncias para o interior dos
ovócitos, onde serão estocadas ou utilizadas durante o desenvolvimento embrionário. O
germário está presente em cada ovaríolo e é onde se dá a origem do epitélio folicular. Além
do germário, o ovaríolo é composto por um vitelário, onde ocorre acumulação de vitelo.
Entre os insetos existem diferentes tipos de ovários: 1. Panoístico (caracterizado pela
ausência de células nutrizes), 2. Meroístico (com células nutrizes associadas aos ovócitos),
que pode ser subdividido em 2.A Politrófico (com células nutrizes em contato com ovócito)
2
ou 2.B Telotrófico (com células nutrizes distantes e ligadas ao ovócito através de pontes
citoplasmáticas ou cordões tróficos), 3. Adenotrófico.
A fêmea de Rhodnius prolixus assim como outros hemípteros (Davis, 1956; Masner,
1968; Brunt, 1971; Huebner e Anderson, 1972; Schreiner, 1977; Couchman e King, 1979;
Buning, 1981), apresenta um ovário do tipo meroístico telotrófico, sendo constituído de dois
hemi-ovários e cada um destes subdividido em sete ovaríolos Figura 01. Cada ovaríolo é
constituído de duas regiões distintas, o trofário e o vitelário. O trofário é formado por um
tecido trófico, que apresenta células nutrizes que produzem e enviam substâncias necessárias
ao crescimento dos ovócitos, através do cordão trófico. A função primária do tecido trófico é
a produção e o transporte de RNAs e proteínas para os ovócitos em desenvolvimento. O
vitelário é constituído pelos ovócitos (pré-vitelogênicos e vitelogênicos, que estão em linha) e
epitélio folicular, que reveste o ovócito em desenvolvimento. O ovaríolo pode ser considerado
uma “linha de montagem” que termina com a formação de um ovócito. A forma como esta
“linha de montagem” opera depende da história evolutiva de cada espécie considerada.
1.2 O modelo Rhodnius prolixus
Rhodnius prolixus pertence à família Reduviidae, da qual é a espécie mais estudada,
tendo sido gerado um grande número de dados sobre a fisiologia desse inseto (Wigglesworth,
1972). É um hemíptero hematófago, hemimetábolo, e é transmissor da doença de Chagas,
ocorrendo principalmente na América Central e norte da América do Sul.
O Rhodnius prolixus tem cinco estadios de ninfas e necessita se alimentar somente
uma vez antes de cada muda. Este inseto hematófago chega a ingerir de 10 a 12 vezes o seu
peso, em sangue. A fonte sanguínea pode influenciar o seu metabolismo (Friend e cols., 1965;
Valle e cols., 1987). O ovo de Rhodnius prolixus completa seu desenvolvimento
3
Ovócito Vitelário
Ovário Ovaríolo
Cordão trófico
Trofário
A B
C
Figura 01. Ovário de Rhodnius prolixus do tipo meroístico telotrófico. A: Ovário
constituído por dois hemi-ovários ligados por um oviduto comum, sendo cada hemi-ovário
composto de 7 ovaríolos. Um dos ovaríolos foi destacado para ser mostrado em detalhe em
(B). Cada ovaríolo apresenta ovócitos em diferentes etapas de desenvolvimento. C:
esquema de um ovaríolo: os ovaríolos são formados por duas regiões distintas, trofário e
vitelário
4
embrionário em 15 dias, dando origem a uma ninfa de primeiro estadio (Lent e Valderrama,
1977).
1.3 Vitelogênese
A indução do processo de ovogênese é estritamente dependente da alimentação. Vinte
quatro horas após a alimentação, devido ao enorme volume de sangue ingerido, este inseto
elimina 40% de seu peso pela urina (Friend e cols., 1965). O material não eliminado é
digerido, absorvido no sistema digestivo e utilizado como fonte energética e de substratos
para várias funções biológicas, incluindo o processo de formação dos ovos ou ovogênese.
A ovogênese é um processo controlado por hormônios, como o hormônio juvenil e a
ecdisona (Engelmann, 1970). A atividade destes hormônios no controle da fisiologia dos
diferentes órgãos e tecidos são também modulados por hormônios locais como os
eicosanóides (Medeiros e cols., 2002; Medeiros e cols., 2004).
O processo de ovogênese pode ser dividido em fases distintas, como a pré-
vitelogênese, vitelogênese e coriogênese. A pré-vitelogênese corresponde ao período de
desenvolvimento das estruturas ovarianas, especialmente dos folículos, que correspondem ao
ovócito em desenvolvimento circundado pelas células do epitélio folicular. Nesta fase os
ovócitos crescem às custas de outras células do ovário, como as células nutrizes, que enviam
proteínas e RNA que são estocados nos ovócitos para serem utilizados posteriormente no
processo de embriogênese.
A transição entre a fase pré-vitelogênica e a vitelogênica na maioria dos insetos é
induzida pela ação de ecdisona, um hormônio esteróide. Em Drosophila melanogaster, o
início da vitelogênese constitui o ponto de controle da ovogênese que integra sinais internos
(hormônios) e externos (ambientais), que permitem o desenvolvimento dos folículos
(Spradling, 1993). Durante a fase vitelogênica os ovócitos recebem substâncias das células
5
nutrizes, das células foliculares e que são endocitadas da hemolinfa por processos mediados
por receptores (Telfer, 1960; Telfer, 1961; Roth e Porter, 1964; Roth e cols., 1976). A estes
trabalhos pioneiros uma enorme quantidade de informações foi sendo adicionada, como
revisto por Telfer e cols.(1982); Raikhel e Dhadiala (1992); Snigirevkaya e Raikhel (2005);
Atella e cols., (2005). Em geral, esta fase compreende crescimento rápido dos ovócitos pelo
acúmulo de proteínas, principalmente a vitelogenina (VG). Na maioria dos insetos, a
vitelogenina é sintetizada no corpo gorduroso, é secretada para a hemolinfa e transportada até
a superfície dos ovócitos. Como os ovócitos são revestidos com uma camada de células do
epitélio folicular, a vitelogenina não teria acesso aos ovócitos. No entanto, as células do
epitélio folicular abrem espaços entre elas permitindo o livre acesso aos ovócitos. Este
fenômeno é conhecido por Patência e a sua formação é controlada por hormônios como o
hormônio juvenil (Sevala e Davey, 1989; Raikhel e O’Lea, 1991). A vitelogênese é, portanto,
um processo heterossintético onde há a necessidade de um tecido extra-ovariano precursor das
proteínas de vitelo. Devido a esse fato, os ovócitos se tornaram altamente especializados em
captar precursores de vitelo extra-ovarianos (Raikhel e Dhadialla, 1992).
Telfer (1960) demonstrou que ovócitos de Hyalophora cecropia acumulavam
proteínas de fêmeas e carotenóides, mas que as proteínas eram captadas 80% mais
rapidamente do que os carotenóides, mostrando que há uma certa seletividade no mecanismo
de transporte destas proteínas. Em 1961, Telfer demonstrou por fluorescência que o espaço
intercelular (espaço entre as células foliculares) poderia ser considerado uma rota de
passagem das proteínas vindas da hemolinfa até a superfície do ovócito.
Em Rhodnius prolixus o espaçamento entre as células ocorre por modificação no
citoesqueleto e perda de água destas células. (Davey, 1972), mostrou que fêmeas sem corpora
allata, ou seja, que não produzem hormônio juvenil, não desenvolviam Patência.
6
Micrografias de ovócitos de fêmeas de Aedes aegypti alimentadas com sangue
mostraram o aumento de cerca de 300.000 “pits”, 15 vezes mais que o ovócito em repouso.
São esses “pits” que irão dar origem às vesículas contendo proteínas da hemolinfa (Roth e
Porter, 1964). Segundo Roth e Porter (1964), o desenvolvimento do “pit” ocorre por dobras da
membrana do ovócito, após o quê há o seu preenchimento e a formação da vesícula. Estas
formam densas esferas e estas esferas se fundem umas com as outras para formar esferas
maiores chamado, de grânulos de vitelo e onde o seu conteúdo fica numa forma paracristalina,
chamado vitelo. Uma vez completa a provisão de material dos ovócitos, e antes deles serem
expelidos para os ovidutos, os folículos passam por um processo de transição para a
coriogênese. Nesta fase os ovócitos são selados por uma membrana vitelínica antes de serem
revestidos pelo córion, uma complexa estrutura protéica.
Ao final da fase vitelogênica as células do epitélio folicular perdem a Patência, o que
resulta no impedimento do transporte de proteínas de vitelo para os ovócitos (Wang e Telfer,
1996). Concomitantemente, a expressão de genes do epitélio folicular, associados à produção
de proteínas de vitelo cessam, e os genes necessários para a formação do córion são induzidos
(Kafatos e cols., 1977). Em Drosophila melanogaster, antes da coriogênese, as células
nutrizes esvaziam o conteúdo citoplasmático nos ovócitos e entram em um processo
apoptótico (Mahajan-Niklos e Cooley, 1994). No Rhodnius prolixus, este desligamento do
ovócito com as células nutrizes ocorre muito antes do final da vitelogênese, pelo rompimento
dos canais tróficos que unem estas células.
Na fase final da vitelogênese, que precede o início da coriogênese, ocorrem ainda
eventos importantes, como a síntese das membranas vitelínicas e de ecdisteróides pelas
células do epitélio folicular (Kadono-Okuda e cols., 1994; Kendirgi e cols., 2002). Ocorrem
também movimentos morfogenéticos das células do epitélio folicular antes do seu
comprometimento com a síntese de proteínas do córion (Spradling, 1993; Montell, 2001).
7
O processo de formação do córion ocorre quando as células do epitélio folicular se
diferenciam e começam a expressar os genes relacionados com a síntese de proteínas do
córion, que subseqüentemente são montadas extracelularmente em uma estrutura
macroscópica (Orr-Weaver, 1991; Kafatos, 1995), a casca do ovo. A casca do ovo deve evitar
dessecação, mas também deve permitir a troca de gases para a respiração do embrião.
Portanto, trata-se de uma estrutura complexa capaz de permitir a entrada de gases através de
canais próprios (aeropila), canais que permitem o esperma atravessar a estrutura protetora
(micrópila) e atingir a superfície dos ovócitos para a fertilização. Além disso, é necessária
uma estrutura capaz de permitir que o embrião recém formado seja liberado para o exterior, o
opérculo (Spradling, 1993). O processo de deposição das proteínas de córion para a formação
da casca do ovo ocorre por aposição de novas proteínas sobre aquelas já existentes, formando
camadas, como na Drosophila melanogaster. Sobre a membrana vitelínica são depositadas
uma camada de cera, uma camada mais interna de córion, um endocórion e exocórion
(Spradling, 1993; Trougakos e Margaritis, 1998). O número e o tipo de proteínas que
constituem o córion variam entre as espécies. Na Drosophila melanogaster o número é
relativamente pequeno, sendo 6 majoritárias e 14 minoritárias (Kafatos e cols., 1985; 1995).
Já em Bombyx mori o número supera a casa de 100 polipeptídeos (Nadel e cols., 1980; Iatrou
e cols, 1982). Recentemente, as estruturas do córion do coleóptero Leptinotarsa decemlineata
foram descritas por Papassideri e cols. (2003). A evolução da estrutura do córion de
lepidópteros já havia sido revista por Regier e cols. (1995).
Terminada a fase de coriogênese, inicia-se o processo de ovulação. Durante a
ovulação, a camada de epitélio folicular é removida e pouco se sabe sobre o destino destas
células. Provavelmente elas sofrem necrose ou apoptose e os remanescentes são removidos
por fagocitose. O ovócito maduro é então expelido em direção ao oviduto lateral (Bloch Qazi
8
e cols., 2003). Os insetos ovíparos produzem seus ovos e, quando são ovipostos, eles têm que
ter todo o material necessário para o desenvolvimento do embrião.
Os insetos, por serem animais dióicos tiveram, durante os processos evolutivos, que
resolver alguns problemas associados à reprodução, como por exemplo, a necessidade de
colocar juntos o esperma e os ovócitos maduros no lugar certo (trato reprodutivo da fêmea) e
no tempo certo (quando ambos os sexos são reprodutivamente competentes) e no ambiente
adequado para que o zigoto possa se desenvolver. O problema da fecundação interna foi
resolvido através do desenvolvimento de um espermatóforo (que contém esperma) e que é
colocado ou formado no trato reprodutivo da fêmea durante a cópula. Quatro tipos de
formação de espermatóforo foram reconhecidos, dependendo do local e da sua complexidade.
(Gerber, 1970).
O esperma, uma vez no trato reprodutivo da fêmea, torna-se ativo, adquire motilidade
e se dirige atraído quimicamente, para a espemateca, ou é passivamente empurrado para a
espermateca por movimentos peristálticos. Os restos do espermatóforo devem ser removidos
do trato reprodutivo da fêmea para posterior re-inseminação. Em muitas espécies, se não em
todas, a remoção é feita através de enzimas do trato reprodutivo das fêmeas (Gillot, 1988).
Em Drosophila, e também em outros insetos, o processo de ovulação é estimulado
pelo acasalamento e específcamente pelo esperma e pelo conteúdo de glândulas acessórias de
machos (Heinfetz e cols., 2000; 2001). Além do movimento dos espermatozóides, quando o
macho copula com a fêmea ele libera substâncias capazes de causar contrações rítmicas na
bursa ou bolsa copuladora (recebe o esperma antes de ser enviado para a espermateca),
fazendo com que o oviduto e os dutos da espermateca auxiliem na movimentação do esperma
(Davey,1982). As estruturas internas do sistema reprodutivo de machos e de fêmeas estão
mostradas na Figura 02.
9
Na maioria dos insetos, a espermateca serve tanto como um reservatório de esperma,
mas também apresenta funções secretórias, isto é, existem células glandulares em sua parede.
A secreção da espermateca é uma mistura de materiais e foi confirmada por eletroforese. Em
Apis mellifera, em 1969, Lensky e Alumont separaram mais de 20 proteínas. As funções desta
secreção não são bem conhecidas, mas presume-se que sirva para a manutenção dos
espermatozóides.
Após a ovulação inicia-se o processo de ativação do ovo, que envolve hidratação no
oviduto (Heinfetz e cols., 2001), impermeabilização através de “crosslinking” entre a
membrana vitelínica e córion (Page e Orr-Weaver, 1997; Chen e cols., 2000; Bloch e Qazi
Cols., 2003). Em Drosophila e alguns outros insetos, a ativação do ovo ocorre
independentemente da fertilização.
A fecundação dos ovos não ocorre durante a cópula, mas sim depois, quando os
ovócitos se encontram inteiramente desenvolvidos. Os espermatozóides armazenados
anteriormente na espermateca são ejetados, através do canal eferente, sobre os ovos quando
estes passam pela vagina. Os espermatozóides devem encontrar no córion a micrópila, por
onde atravessam a barreira, para que possam encontrar o ovócito, iniciando-se assim um novo
processo, o da embriogênese.
O ovo posto enfrenta agora um ambiente natural que pode ser hostil. O ovo deve estar
preparado para enfrentar as variações do meio ambiente, como alterações bruscas de umidade,
10
A
B
Figura 02 Aparelhos reprodutores de fêmea (A) e de macho (B): Aparelho reprodutor
de fêmea: 1 – Filamento terminal; 2 – Ovaríolos; 3 – Oviduto comum; 4 – Vagina; 5 –
Cálix; 6 – Oviduto lateral; 7 – Espermateca; 8 – Glândula acessória. Para esta tese foram
usadas as partes 7 e 8.Aparelho reprodutor de macho: 1 – Tubos testiculares; 2 – Canal
deferente anterior; 3 – Vesícula seminal e 4;5;6;e 7 - Glândula acessória; 5A – Hilo; 8 –
Conduto glandular; 9 – Canal deferente posterior e 10 – conduto ejaculador. Nesta
dissertação foram utilizados 4, 5, 6, 7 e 3.
(Perez, 1969).
11
temperatura, ação mecânica e de predadores, caso contrário o embrião não terá chance de
sobrevivência. O córion protege mecanicamente os ovos, e também contra a dessecação e
deve proteger também contra a ação de microorganismos.
1.4 Microorganismos
A) Fungos:
Durante anos, os fungos pertenciam ao Filo Plantae, somente a partir de 1969, os
fungos foram colocado em um novo Reino, denominado Fungi. Existem muitas características
que distingue os fungos dos vegetais: não sintetizam pigmentos fotossintéticos, sua parede
celular não possui celulose, exceto alguns fungos aquáticos e não armazenam amido como
fonte de reserva.
Os fungos são eucariotos podendo ter um núcleo, como as leveduras ou vários
núcleos, como os fungos filamentosos, estão presentes em diversos ambientes e sua dispersão
é feita através de animais, insetos, água e principalmente, ar.
Fungos das divisões Zigomiceta, Ascomiceta e Basidiomiceta produzem ambos
esporos, os sexuais chamados zigosporo, ascosporo e basidiosporo, respectivamente e esporos
assexuais chamados conídios. Na divisão Deuteromiceta ainda não foi observado ciclo sexual
produzindo somente conídios (Osherov e May, 2001).
Existem vários mecanismos conhecidos que podem desencadear a esporulação.
Coutinho e Corrêa (1999) sugeriram que em Blastocladiella emersonii a indução da
esporulação depende de cálcio extracelular, provavelmente para formar um gradiente pelos
canais do tipo II, e que essa dependência ocorre nos estágios iniciais da esporulação. Em
Aspergillus nidulans o cálcio também se faz importante na esporulação, mas não sendo
essencial na fase inicial (Osherov e May, 2001).
12
Outras vias são conhecidas como, por exemplo, em saccharomyces cerevisiae a via de
sinalização é a glicose, Já em Fusarium solani a esporulação é induzida por nutrientes e
pisatin, (Osherov e May, 2001).
Em A. niger, Bencina e cols. (2005), mostraram que os canais de cálcio foram ativados
por fosforilação dependente de PKA mediada por cAMP durante uma perturbação mecânica.
B) Bactérias:
As bactérias podem apresentar formas esféricas, cilíndricas e espirais. Estas também
podem ser divididas em dois grupos, conforme sua coloração: Gram-positiva e Gram-
negativa. O crescimento das bactérias se dá por divisão binária ou brotamento. O termo Gram
vem do nome Christian Gram, pesquisador que, em 1884, desenvolveu, de modo empírico, o
método de coloração que passou ter seu nome e que permite dividir as bactérias em dois
grupos: Gram-positivo e Gram-negativo, Trabulsi (2002).
Todas as bactérias absorvem de maneira idêntica o cristal violeta e o lugol. Entretanto,
ao serem tratados com álcool, apresentam comportamentos diferentes, isto é, as Gram-
positivas não se deixam descorar, e ao receber fucsina, só as Gram-negativas, que foram
descoradas pelo álcool, coram. Ao observar as lâminas coradas pelo método Gram, as
bactérias Gram-positivas apresentam cor roxa e as Gram-negativas, cor avermelhada. Trabulsi
(2002).
1.5 Substâncias antimicrobianas
Os insetos desenvolveram uma série de barreiras estruturais e um complexo sistema
imune inato, em função de prolongada exposição e convivência com diversos
microorganismos (Dimopoulos, 2003). O exoesqueleto e o envoltório protetor dos ovos
13
constituem barreiras contra a invasão microbiana. O exoesqueleto se caracteriza por ser uma
cutícula dura de origem epidérmica, composta por um polissacarídeo (quitina) e proteínas.
Achava-se que a cutícula serviria apenas como um exoesqueleto inerte, estabilizando a
estrutura física do inseto e provendo uma barreira mecânica contra agressões externas. Hoje
se sabe que essa matriz extracelular apresenta um papel ativo e complexo na resposta imune
dos insetos. O exoesqueleto contém fenóis e quinonas, como componentes da cascata da pró-
fenoloxidase, responsável pelo endurecimento da cutícula. Estas cutículas apresentam
aldeídos e ácidos graxos, ambos com atividades antifúngicas e antibacterianas (Ratcliffe e
Whitten, 2004).
Além das barreiras estruturais, os insetos apresentam um forte sistema imune inato que
inclui uma série de peptídeos/polipeptídeos antimicrobianos (Otvos, 2000; Bulet e cols.,
2004). O modelo de análise dos mecanismos de defesa inata em resposta a uma invasão
patogênica se originou da mosca Drosophila melanogaster. Este inseto é capaz de sintetizar
varias substâncias em resposta à injúria como as drosomicinas, cecropinas, diptericinas,
drosocinas, attacinas. Drosomicinas e metchnikowinas com propriedades antifúngicas e
antibacterianas (Reddy e cols., 2004). Além do exoesqueleto e a resposta imune inata, os
insetos dispõem do envoltório protetor dos ovos como uma proteção estrutural que tem como
função proteger o ovo e o embrião em desenvolvimento. Marchini e cols. (1997) descreveram
atividades antibacteriana e antifúngica associada ao exocórion da mosca Ceratitis capitata.
Estas atividades estavam relacionadas à presença de um peptídeo hidrofílico (ceratotoxina de
3kDa), produzido pela glândula acessória no momento da postura.
Lamberty e cols (2001) relataram que o cupim Pseudacanthotermes spiniger era capaz
de proteger seus ovos contra fungos e bactérias com a sua saliva. Esta atividade microbicida
estava associada à presença de dois peptídeos antimicrobianos (termicina e espinigerina).
Eventos semelhantes de atividade antimicrobiana associada aos ovos foram observados ainda
14
em Aedes aegypti e Anopheles gambiae, (Furtado, 2004). Em Rhodnius prolixus, (Bouts,
2001) mostrou a presença de um fator difusível, com atividade antifúngica, sensível à
temperatura, associado aos ovos Figura 03.
15
Figura 03: Inibição do crescimento de Aspergillus niger por córions de
R
hodnius
prolixus: Os ovos foram lavados e parte deles autoclavados, depois colocados numa placa
de Petri estéril, que continha 0.01 mg/mL de tetraciclina.
A: Córions de Rhodnius prolixus
B: Córions Rhodnius prolixus autoclavados
(Bouts, 2001)
A
B
16
1.6 Interações entre inseto e microorganismo
A ocorrência de interações simbióticas entre microorganismos e insetos é bem
conhecida. Esses microorganismos podem ser encontrados no intestino e em outras regiões do
corpo do inseto. Em alguns casos essa simbiose é essencial para o desenvolvimento do inseto,
por exemplo, existem evidências que leveduras associadas a duas espécies de abelha,
Stegobium paniceum e Lasioderma serricorne, produzam vitaminas do grupo B para suas
hospedeiras, Baynes (1956).
Em Rhodnius prolixus uma bactéria da forma Cocos do grupo Gram-positivo, foi
descrita como uma bactéria simbiótica, tendo participação importante na nutrição desse
hemíptero. Em uma colônia sem a presença dessa bactéria, 40% das ninfas de quarto estádio
não faziam a muda, mostrando que a bactéria é importante para o desenvolvimento do R.
prolixus, Baynes (1956).
Outros tipos de interações entre insetos e microorganismos ocorrem na natureza. Em
2006, Matsuura demonstrou que existem fungos que mimetizam os ovos de R. speratus.
17
2. OBJETIVO GERAL
Compreender o sistema de proteção dos ovos de Rhodnius prolixus contra a ação de
Fungos e bactérias.
2.1 Objetivos específicos
Verificar a origem da ação antimicótica solúvel associada aos ovos de Rhodnius
prolixus:
Testar:
• Ação sobre o fungo Aspergillus niger e sobre outros microorganismos;
18
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Insetos
Os insetos foram obtidos da colônia de Rhodnius prolixus, pertencente ao Laboratório
de Bioquímica de Insetos, onde os animais são mantidos a 28
o
C e umidade relativa de 70-
80%. As fêmeas adultas foram alimentadas com sangue de coelho em intervalos de três
semanas.
3.2 Dosagem de proteínas
A estimativa do conteúdo de proteínas foi realizada segundo o protocolo descrito
por Lowry e cols (1951), utilizando albumina sérica bovina (BSA), como padrão.
19
3.3 Código das espécies de microoganismos
Espécie Código Origem
Aspergillus niger
AD102
Aspergillus fumigatus
ATCC 16913
Aspergillus ochraceus
ATCC 22947
Aspegillus parasiticus
ATCC 15517
Candida albicans
ATCC 36802
Staphylococcus aureus
ATCC 25923
Trichophyton rubrum
-
Isolado clínico do
Hospital Clementino
Fraga Filho
Microsporum gypseum
-
Isolado clínico do
Hospital Clementino
Fraga Filho
Fusarium solani
LGM-L
LAB-de Estruturas
de superfície de
microorganismos
Fonsecaea pedrosoi
5VPL
LAB-de Estruturas
de superfície de
microorganismos
Sporothrise schenckii
SS-18
LAB-de Estruturas
de superfície de
microorganismos
Trichoderma harzianum
-
LAB-de Estruturas
de superfície de
microorganismos
Escherichia coli
PCEM
LAB-de Estruturas
de superfície de
microorganismos
20
3.4 Ensaio de inibição do crescimento de diferentes fungos e bactérias na presença de
ovos fertilizados de Rhodnius prolixus.
(1) De uma suspensão de fungos ou de bactérias foram retirados 10μL e colocadas na
câmara de Neubauer para serem contados. Para os experimentos foram utilizados 3x10
5
células/mL.
(2) Os microorganismos testados nesta dissertação foram: Aspergillus niger,
Aspergillus fumigatus, Aspergillus ochraceus, Trichophyton rubrum, Microsporum gypseum,
Fusarium solani, Fonsecaea pedrosoi, Sporothrise schenckii, Trichoderma harzianum,
Aspergillus parasiticus, Candida albicans, Staphylococcus aureus e Escherichia coli.
O ensaio foi realizado em placa de Petri contendo meio de cultura sólido estéril (Agar
bacteriológico 1,5%, 10 mLmeio PD–Dextrose-Batata; BHI – Infusão de cérebro e coração
bovino ou Saboraud – dextrose e peptona). Estas placas com meio sólido continham ou não
antibiótico, cloranfenicol, 0.150mg/mL. Os ovos postos fertilizados de R. prolixus foram
umidecidos com água deionizada (Milli-Pore). Em seguida, os ovos foram colocados na placa
de Petri. Em algumas experiências os ovos foram lavados com água deionizada (Milli-Pore) e
os lavados foram testados na placa de Petri para verificar a presença de atividade antifúngica.
A experiência foi feita em condições assépticas e o crescimento dos microorganismos foi
acompanhado durante cinco dias, a temperatura ambiente de 28ºC.
Hifas de algumas regiões destas placas foram retiradas e colocadas em uma lâmina e
observada ao microscópio, para comparar a morfologia das que estavam em contato com o
halo de inibição e das que estavam fora da área de influência dos ovos.
21
3.5 Obtenção de substâncias antifúngicas solúveis do envoltório protetor de Rhodnius
prolixus e fracionamento do lavado de ovo em HPLC.
Dezesseis gramas de ovos ovipostos de Rhodnius prolixus foram lavados,
repetidamente, com 32 mL de água deionizada (Milli-Pore), sob agitação contínua por 15
minutos em temperatura ambiente. O material das duas lavagens foi centrifugado a 12.000g
por 15 minutos. E este sobrenadante concentrado no “Speed Vac” (SpeedVac SCV100 –
Savant instrument Inc.NY) até um volume de 200 µl. Em seguida, foi dosada a concentração
de proteína e aproximadamente 1 mg foi aplicado em uma coluna de gel filtração, Superdex-
75 HR 10/30 (Amersham Pharmacia-Biotech-NJ) (faixa de separação: 3.000 -70.000 Da)
acoplada a um aparelho de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC-Shimadzu LC-
10AT-Japão). A coluna foi previamente equilibrada em tampão fosfato de sódio (PBS),
75mM, pH 7,4 sob um fluxo contínuo de 0,5mL/min. A leitura dos picos foi acompanhada
utilizando-se três comprimentos de onda (214, 225 e 280 nm).
Entre as frações 25 e 55, que saíram do HPLC (Shimadzu LC-10AT- Japão), foram
submetidas, novamente ao “Speed Vac” para a secagem das amostras.
3.6 Ensaio de inibição em lâmina dos fatores solúveis do lavado de ovo.
Este ensaio foi feito segundo Banzet e cols (2002), 3x10
2
conídeos/mL foram diluídos
em meio de cultura Saboraud líquido. Uma alíquota de 200µL de cada fração da
cromatografia foi concentrada e ressuspensa em 100 µL de meio inoculado com Aspergillus
niger. Este volume foi transferido para uma lâmina estéril de microscopia. As lâminas foram
colocadas dentro de uma placa de Petri estéril e incubadas por 48h, à temperatura ambiente
28ºC, no escuro e com umidade do ar saturada. Após o período de incubação, as lâminas
22
foram coradas, ou não, com azul de metileno 0,3%, cobertas com lamínulas e fotografadas em
microscópio de luz de campo claro (Zeiss Axionshop 40-Alemanha) acoplado a uma câmera
digital (Zeiss Axioncam CRc5-Alemanha), com aumento final de 200 vezes.
3.7 Análise morfológica de hifas de Aspergillus niger submetidas aos ensaios de inibição
do crescimento descrito no item 3.3.
Das regiões da placa de Petri aonde houve o crescimento de Aspergillus niger estava
em meio de cultura, Saboraud sólido sem antibiótico (Cloranfenicol), foram retiradas hifas
que estavam em contato ou não, com o halo de inibição de crescimento, induzido pela
presença de ovos úmidos de R. prolixus, e observados ao microscópio de luz de campo claro
(Zeiss Axionshop 40-Alemanha) acoplado a uma câmera digital (Zeiss Axioncam CRc5-
Alemanha), com um aumento final de 400 vezes.
3.8 Isolamento das microorganismos em cultura pura.
Das experiências descritas no item 3.3, a técnica de isolamento usado foi a de
esgotamento. Esta técnica se baseia no princípio que uma vez a célula microbiana isolada,
quando depositado em meio de cultura sólido BHI dará origem a colônias. Assim, a colônia
teve origem de uma célula. Então bactérias foram semeadas, com auxílio de uma alça de
inoculação, fazendo estrias no meio de forma não sobrepostas, que vão da borda para o centro
da placa em três setores como mostra a figura 04, de modo que a quantidade de
microorganismos contida na alça seja menor. Cada colônia isolada poderia ser passada para
um novo meio de cultura, de modo a se obter uma cultura pura. Uma porção dessas colônias
foram transferidas para placa de Petri que continha meio de cultura sólido BHI e erlenmeyer
que continha meio de cultura BHI líquido. Logrou-se obter culturas isoladas de Cocos e
23
Bastonetes. Para as experiências seguintes, as bactérias foram crescidas em meio de cultura
Saboraud líquido.
24
Figura 04 Técnica de isolamento de cultura por esgotamento. Bactérias foram
semeadas, com auxílio de uma alça de inoculação, fazendo estrias no meio de forma
não sobrepostas, que vão da borda para o centro da placa em três setores como mostra
a figura, de modo que a quantidade de microorganismos contida na alça seja cada vez
menor. Cada colônia isolada foi passada para um novo meio de cultura, de modo a se
obter uma cultura pura.
(Vermelho, 2006)
25
3.9 Observação de substâncias liberadas pelas bactérias em meio de cultura Saboraud
sólido.
As duas bactérias foram crescidas separadamente em meio de cultura Saboraud sólido,
em placa de Petri sem fungo por 24h. Depois das 24h, elas foram inativadas em ambiente
saturado de clorofórmio (chumaço de algodão embebido em clorofórmio por 15 minutos).
Após este tempo, as placas ficaram abertas por 5 minutos para evaporar o excesso de
clorofórmio. A segunda parte da experiência consistiu em inocular Aspergillus niger sobre as
bactérias inativadas. As placas foram observadas de 24h a 72h depois da inoculação.
3.10 Preparação do sobrenadante esterilizado de bactérias.
Cocos e Bastonetes foram crescidos em meio de cultura líquido BHI ou Saboraud.
Para se obter o sobrenadante. Dois mililitros de cada bactéria, em distintos meios de cultura,
foram centrifugados a 12.000g por 20 minutos. O sobrenadante foi separado do precipitado e
filtrado em membrana de 0,2μm.
3.11 Observação do crescimento do Aspergillus niger contra o sobrenadante de
bastonetes.
3.11.1 Crescimento de Aspergillus niger em meio de cultura Saboraud sólido.
Nesta experiência foi utilizada lâmina escavada. Dentro das lâminas foi colocado
200μl de meio de cultura Saboraud estéril contendo Agar e antibiótico, cloranfenicol,
0,15mg/mL. Pelo lado esquerdo das microplacas de Agar (lâmina escavada), inoculou-se 50
μl dos fungos que continha 3x10
5
conídeos/mL e pelo lado direito das microplacas (lâmina
escavada), adicionou-se 50 μl de sobrenadante estéril de bastonete. No controle, ao invés de
por sobrenadante, adicionou-se 50 μL de meio de cultura Saboraud líquido. Este protocolo
26
experimental foi também utilizado para testar diferentes tipos de fungo. O resultado foi
observado de 24 a 72h após o início da experiência.
3.11.2 Crescimento de Aspergillus niger em meio de cultura Saboraud líquido.
O Aspergillus niger foi inoculado em meio de cultura Saboraud líquido, com
antibiótico, cloranfenicol, 0,15mg/mL, que continha 3x10
5
conídeos /mL. O volume de fungo
era fixo para todas as lâminas 20μL. Já, volumes crescentes de sobrenadante estéril de
bastonete, em microlitro, foram adicionados na placa (0; 10; 40 e 70). Além disso, meio de
cultura Saboraud líquido puro, com antibiótico, foram colocados até completar o volume final
de 100μL. O resultado foi observado de 24 a 72h após o início da experiência. Uma alíquota
de 70μL de sobrenadante estéril foi fervida por 10 minutos.
Quando em lâmina escavada, o experimento era fotografado com uma câmera digital
com auxílio de uma ocular invertida de um microscópio estereocópico (Zeiss-West
Alemanha) (10X).
3.12 Ensaio antifúngico em microplacas de 96 poços, com o sobrenadante de bacilos
esterilizado.
O ensaio antifúngico foi realizado em 50 μL de meio de cultura Saboraud líquido com
uma quantidade de 3x10
5
conídeos/mL dos diferentes tipos de fungos. Nos poços
experimentais contendo os diferentes fungos foram adicionados além de 50μL meio de cultura
Saboraud líquido acrescido dos microorganismos, 50μL sobrenadante estéril. Nos controles
substituiu-se o sobrenadante por 50μL de meio de cultura Saboraud líquido.Os poços
continham diferentes espécies: Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus
ochraceus, Aspergillus parasiticus, Trichophyton rubrum, Microsporum gypseum, Fusarium
solani, Fonsecaea pedrosoi, Sporothrise schenckii, Trichoderma harzianum.
O crescimento dos fungos foi avaliado de duas formas distintas:
27
a) Por observação ao microscópio estereocópico (Zeiss-West Alemanha), por
dois observadores independentes atribuindo valores de 0 a 4 cruzes, sendo 4 cruzes o valor de
maior grau de inibição
b) Leitura no leitor de ELISA a 540nm, Versa Max (Molecular Devices co.
Sunnyvale. Ca).
3.13 Análise do conteúdo de bactérias do aparelho reprodutor de machos e fêmeas de R.
prolixus.
Por observação direta ao microscópio: Machos e fêmeas de Rhodnius prolixus foram
dissecados e os aparelhos reprodutores analisados ao microscópio (Zeiss Axionshop 40-
Alemanha) e fotografados em uma câmera digital acoplada (Zeiss Axioncam CRc5-
Alemanha), com um aumento final de 400X. As partes observadas foram: glândula acessória
(macho e fêmea), espermateca (fêmea) e vesícula seminal (macho). Os órgãos foram
dissecados e mantidos por 48h em meio de cultura Saboraud sólido sem cloranfenicol, na
presença de Aspergillus niger, para permitir o crescimento dos bacilos e formação de halo de
inibição de crescimento.
3.14 Coloração de Gram.
Como a técnica é baseada na composição da parede de diferentes bactérias e na
capacidade destas paredes reterem os corantes utilizados, sabemos que as bactérias Gram
+
possuem uma parede celular mais espessa que as bactérias Gram
-
. As duas formas de
bactérias, cocos e bastonetes, foram coradas com cristal de violeta associado ao iodo por 1
minuto. O corante foi removido com água destilada, uma solução de lugol foi colocada sobre
28
o esfregaço por mais 1 minuto e removida também com água destilada Depois foi utilizado o
álcool 95% que possui duas funções dissolver os lipídeos e desidratar as células. O excesso de
etanol foi retirado com água destilada. Após a lavagem foi adicionado a safrina durante 45
segundos e logo depois removida e a lâmina seca com cuidado em papel filtro.
29
4 RESULTADOS
Em trabalho anterior realizado no nosso laboratório, foi demonstrada a existência de
fatores antifúngicos solúveis associados aos ovos de Rhodnius prolixus Figura 03, porém a
sua origem era ainda desconhecida. Sugeriu-se na ocasião que o fator antifúngico pudesse ter
origem ovariana e seria, possivelmente, secretado pelo próprio inseto. Nesta dissertação de
mestrado decidiu-se realizar um conjunto de estudos que pudesse definir a origem desse(s)
fator(es) com atividade antifúngica e, se possível, definir também suas características.
Considerando que o fator era solúvel em água, decidiu-se obtê-lo(s) através de lavagens
sucessivas de ovos com água, partindo de um grande número de ovos. O material obtido foi
concentrado e aplicado em uma coluna de gel filtração. O perfil da coluna está mostrado na
Figura 05. Todas as frações foram ensaiadas para verificar a existência de atividade
antifúngica associada. As setas indicam a posição das frações que apresentaram alguma
atividade. A atividade antifúngica foi monitorada pela inibição do crescimento do Aspergillus
niger, avaliada pela quantidade de hifas na presença das frações e comparada com lâminas
controle, como está mostrado na Figura 06. As frações 27 e 50 apresentadas na Figura
mostraram uma quantidade muito menor de hifas quando comparadas com o controle e
frações vizinhas, sugerindo a existência de substâncias capazes de inibir um pouco o
desenvolvimento das hifas. A pequena atividade antifúngica observada poderia estar
relacionada a uma concentração baixa dessas substâncias no lavado de ovos. Para tentar
resolver esta questão, aumentou-se muito a quantidade de ovos dos quais se extrairia os
fatores antifúngicos. Curiosamente, não se observou uma relação linear da atividade
antifúngica com a quantidade de ovos que davam origem ao lavado de ovos. As frações com
alguma atividade antifúngica permaneciam em torno das frações 27 e 50, mas a atividade não
aumentava com o aumento da concentração de lavado de ovo, pelo menos de forma
perceptiva. Suspeitou-se que a coluna de HPLC estivesse retendo ou inativando a substância
30
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
0
500
1000
1500
2000
2500
min
D.O.280nm
Figura 05. Fracionamento do lavado de ovo no HPLC: O sobrenadante do lavado de
ovo foi concentrado antes de ser injetado no HPLC (Shimadzu LC-10AT-Japão), coluna
Superdex 75 HR 10/30 (Amersham Pharmacia-Biotech-NJ). As frações foram coletadas e
testadas contra Aspergillus niger. Cerca de 1 mg de proteína foi injetada num volume de
200μl.
As setas indicam as frações que continham alguma atividade antifúngica.
31
A
BC
D E F
Figura 06. Microscopia ótica do Aspergillus niger tratado com as frações obtidas do
lavado de ovo. As frações obtidas na cromatografia mostrada na Figura 4, foram
submetidas a teste de atividade antifúngica contra Aspergillus niger crescidas em meio
Saboraud líquido, como descrito em material e métodos. (A) Controle: tampão PBS diluído
2 vezes; (B) Fração 27; (C) Fração 28; (D) Fração 49; (E) Fração 50; e (F) Fração 51.
32
que se procurava. Para tentar evitar os possíveis problemas advindos do uso da coluna,
resolveu-se utilizar o lavado de ovos diretamente no meio de crescimento dos fungos em Agar
e analisar a sua morfologia. A Figura 07 mostra pequenas variações morfológicas nos
diversos campos observados (painéis A-D), porém nada muito significativo quando
comparado com hifas controles mostradas nos painéis E e F. Embora se percebesse a
existência de atividade antifúngica, havia alguma coisa que não conseguíamos controlar
adequadamente. Por isso, foi retomada a abordagem inicial, ou seja, a experiência de
formação de um halo de inibição como mostrado anteriormente por Bouts (2001). A Figura 07
mostra que de fato na imediação dos ovos houve a formação de um nítido halo de inibição.
Além disso, observa-se também inibição na região assinalada com a letra (a), onde se
adicionou lavado de ovos As características morfológicas das hifas próximas aos ovos e
também de regiões distantes, fora da área de influência dos ovos, foram analisadas como
assinalado na Figura 08 (quadrados verdes). As hifas dessas regiões foram analisadas ao
microscópio, como mostra a Figura 09. A Figura mostra claramente que na região próxima
aos ovos (painéis B-D) as hifas sofreram transformações morfológicas importantes, como
diminuição do tamanho da segmentação da hifa, arredondamento do ápice desta hifa,
provavelmente relacionadas à inibição do seu desenvolvimento normal, e talvez a sua
viabilidade celular. Enquanto nas regiões distantes, fora da área de influência dos ovos, as
hifas apresentaram aspecto normal (painel A). Esta observação foi fundamental para que
prosseguíssemos na busca desse(s) agentes antifúngicos. A Figura 10 mostra em detalhe uma
região da placa mostrada anteriormente na Figura 08, com o crescimento total dos fungos de
três dias. O halo de inibição continuou nítido, mas observa-se que as hifas estavam muito
próximas de uma grande quantidade de microorganismos em desenvolvimento com aparência
de bactérias. Esta observação introduziu uma nova variável: as bactérias. A existência do halo
de inibição poderia ser devido a substâncias secretadas pelas bactérias e que se somariam
33
àquelas produzidas pelos insetos. Com o intuito de separar os possíveis efeitos produzidos
pelas substâncias das bactérias daquelas dos insetos, planejou-se uma
34
Figura 07. Aspectos morfológicos de hifas de Aspergillus niger tratadas com lavado
de ovos de Rhodnius prolixus. Os esporos foram inoculados em meio de cultura
Saboraud líquido na presença de lavado de ovos concentrados e mantidos em lâminas por
24 h, para posterior observação ao microscópio. Aumento 400X. (A-D). Morfologia das
hifas tratadas com lavado de ovos, encontradas em diferentes lâminas (quadruplicatas).
(E-F) Lâminas controle onde o lavado de ovo foi substituído pela adição de tampão
fosfato diluído 2X.
AB
C
D
D
EF
35
Figura 08. Atividade antifúngica associada aos ovos de Rhodnius prolixus. Os ovos
foram distribuídos sobre uma placa de Petri contendo meio de cultura Saboraud sólido. As
áreas demarcadas foram retiradas, após 24 h de crescimento para a análise da morfologia
das hifas. Os ovos são as estruturas avermelhadas vista na figura. A região assinalada com
a letra (a) corresponde àquela onde se adicionou lavado de ovos.
a
36
Figura 09. Efeito dos ovos de R. prolixus sobre a morfologia das hifas de Aspergillus
niger. (A) Região distante (fora da área de influência dos ovos); (B) Vista panorâmica das
hifas na região de contato com os ovos de Rhodnius prolixus; (C-D) Detalhes da
morfologia das hifas na região próxima aos ovos de Rhodnius prolixus
.
AB
C
D
37
Figura 10. Atividade antifúngica associada aos ovos de Rhodnius prolixus. Os ovos
foram distribuídos sobre uma placa de Petri contendo meio de cultura
Saboraud sólido. Detalhe da mesma placa mostrada na Fig.08, mas com 72h de
crescimento dos fungos.
38
experiência onde os efeitos produzidos pelos ovos seriam observados em placas contendo
antibiótico, o que anularia o efeito bacteriano. A Figura 11 mostra que de fato, quando a placa
não continha antibiótico (painel A), as bactérias cresceram e houve a formação de um halo de
inibição. Já na presença de antibiótico, situação na qual não se observou o desenvolvimento
de colônia de bactérias, o fungo se desenvolveu sobre os ovos (painéis B-D), indicando que o
halo deveria ser o resultado da secreção de alguma substância produzida pelas bactérias,
sugerindo que o ovo não apresenta agentes antifúngicos solúveis produzidos pelo inseto,
tornando-se importante a análise das bactérias.
Das placas sem antibióticos, as bactérias foram retiradas e analisadas ao microscópio
como mostra a Figura 12. Observou-se claramente a existência de duas formas preponderantes
de bactérias, cocos (setas no painel A) e bastonetes (setas no painel B). Este fato trouxe
algumas dificuldades adicionais: como saber se o efeito era produzido pelos cocos ou pelos
bastonetes, ou eventualmente pelos dois. Tornou-se necessário a obtenção de culturas puras e
individualizadas. Das placas contendo a mistura de bactérias, logrou-se identificar pequenas
colônias isoladas e que foram cultivadas independentemente. A Figura 13 mostra que
obtivemos uma cultura apenas de cocos e essa cultura foi corada pelo método Gram,
mostrando que essa bactéria é Gram-positiva e a Figura 14 mostra uma cultura apenas de
bastonetes e pelo mesmo método de coloração obtivemos o resultado que os bastonetes são
Gram-negativos. Com a obtenção dessas duas culturas de bactérias foi possível realizar a
experiência mostrada na Figura 15. A experiência foi realizada em duas etapas: na primeira
fase as bactérias foram crescidas nas placas até tomarem praticamente toda a área da placa.
Em seguida as bactérias foram inativadas em ambiente de vapor de clorofórmio. Na segunda
etapa inoculou-se os fungos sobre as bactérias inativadas. A Figura 15 mostra de forma
contundente que o tipo cocos não produz nada que possa afetar o desenvolvimento do
Aspergillus niger, que foi capaz de se desenvolver e tomar toda a superfície da placa de Petri.
39
Já no caso dos bastonetes o Aspergillus niger não foi capaz de se desenvolver sugerindo ser
ele o produtor do agente antifúngico.
A
C
B
D
A
Figura 11. Efeito do cloranfenicol sobre a atividade antifúngica de ovos de R. prolixus. (A)
Inibição do crescimento em placas sem cloranfenicol. A seta mostra uma região onde aparece
um halo de inibição de crescimento do fungo; (B-D) Detalhes do crescimento de Aspergillus
niger sobre os ovos de Rhodnius prolixus em meio de cultura contendo cloranfenicol.
40
41
Figura 12. Bactérias associadas aos ovos de Rhodnius prolixus. As
bactérias foram retiradas da placa de Petri mostrada na Fig.10 e
observadas diretamente ao microscópio. Aumento 200X (A); Aumento
400 X (B). As setas indicam em (A) o aspecto de coco isolado e em
(B) de bastonetes.
A
B
42
Figura 13. Análise por coloração Gram das bactérias da forma cocos
isoladas da mistura de bactérias provenientes das placas contendo ovos de
Rhodnius prolixus. Bactérias da forma cocos foram isoladas das bactérias da
forma bastonete e submetidas a técnica de coloração Gram.
A
B
B
42
43
Figura 14. Análise por coloração Gram das bactérias da forma de bastonetes
isoladas da mistura de bactérias provenientes das placas contendo ovos de
Rhodnius prolixus. Bactérias da forma bastonetes foram isoladas das bactérias da
forma bastonete e submetidas a técnica de coloração Gram.
43
Figura 15. Teste de crescimento de Aspergillus niger na presença de fatores liberados
pelas bactérias isoladas da forma cocos (A) ou bastonetes (B). As bactérias foram
crescidas até tomarem praticamente toda a placa de Petri, na ausência do fungo e em
seguida inativadas em ambiente saturado de clorofórmio. Na segunda fase da experiência
os fungos foram inoculados e deixados crescer sobre as colônias inativadas das bactérias.
Em (A) a região mais escura da placa corresponde ao crescimento do Aspergillus niger
com esporulação evidente. Em (B) a região mais clara da placa corresponde à colônia
inativada de bactérias sem crescimento do fungo.
B
A
44
O resultado mostrado na figura 15 sugeriu, então ser o bastonete o produtor da
substância antifúngica. Entretanto, não era possível saber se esta substância estava sendo
secretada para o meio de cultura ou se o efeito observado era resultante da liberação da
substância antifúngica através da lise dos bastonetes. Embora a experiência do halo de
inibição estivesse indicando a secreção do agente antifúngico para o meio de cultura, esse
ponto foi averiguado realizando-se a experiência que se segue, utilizando-se um sobrenadante
estéril (ultrafiltrado), de bactérias. Como as bactérias não foram lisadas, mas isoladas por
centrifugação e ultrafiltração, não havia a possibilidade de liberação do conteúdo das
bactérias. O efeito, se houvesse, deveria ser atribuído a alguma substância secretada pelas
bactérias para o meio de cultura. Além disso, para se ter certeza de que no ultrafiltrado não
havia a presença de bactérias contaminantes, esse material foi analisado ao microscópio,
como mostra a Figura 16. Nos vários campos analisados não se observou nenhuma bactéria,
mas sim pequenos fragmentos provavelmente oriundos do filtro utilizado. Ainda assim, para
garantir que o efeito não pudesse ser atribuído ao crescimento de bactérias contaminantes,
realizou-se a experiência em meio de cultura contendo antibiótico. A Figura 16 mostrou a
presença de algum fator inibidor do crescimento de Aspergillus niger e que o seu efeito foi
dose dependente, a julgar pela inibição completa do crescimento do fungo na medida em que
se aumentou o volume do ultrafiltrado no meio de cultura. Como o ultrafiltrado tinha a mesma
composição do meio de cultura, não havia a possibilidade do seu efeito ser atribuído a uma
possível diluição do meio de cultura que explicasse o não crescimento dos fungos. Portanto,
esta experiência sugeriu fortemente que os bacilos secretaram alguma substância capaz de
inibir o crescimento do fungo. O meio utilizado para o crescimento das bactérias foi o BHI.
Em seguida investigamos se os bacilos produzem e secretam estas substâncias em quaisquer
condições de crescimento, ou se apenas em uma condição muito específica como a mostrada
45
na Figura 17. Para dirimir esta dúvida, esta experiência foi feita cultivando-se os bastonetes
em meio de cultura Saboraud, ou seja, em
46
Figura 16. Análise microscópica do ultrafiltrado do sobrenadante de meio de
cultura de bastonetes. O ultrafiltrado de bactérias foi analisado ao microscópio
ótico. Aumento de 630 X.
47
Figura 17. Inibição do crescimento de Aspergillus niger promovido pelo
ultrafiltrado de cultura de bastonetes (BHI) associados aos ovos de
R
hodnius
prolixus: Os fungos foram crescidos em microplacas em meio de cultura contendo
antibiótico, na presença e na ausência de diferentes quantidades de ultrafiltrado. (A)
Controle (sem a adição de ultrafiltrado); (B) 10µL de ultrafiltrado; (C) 40µL de
ultrafiltrado; (D) 70µL de ultrafiltrado.
A
A
B
C
D
48
A B
C D
Figura 18. Inibição do crescimento de Aspergillus niger promovida pelo
ultrafiltrado de cultura de bastonetes (Saboraud) associados aos ovos de
R
hodnius
prolixus: Os fungos foram crescidos em microplacas em meio de cultura contendo
antibiótico, na presença e na ausência de diferentes quantidades de ultrafiltrado. (A)
Controle, ausência de ultrafiltrados; (B) 10µL de ultrafiltrado; (C) 40µL de ultrafiltrado;
(D) 70µL de ultrafiltrado.
A
B
C
D
49
condições diferentes daquela usada na Figura 17, onde as bactérias haviam crescido em meio
BHI. A Figura 18 mostra basicamente os mesmos resultados, sugerindo fortemente ser esta
uma característica típica desta bactéria. Elas são capazes de sintetizar e secretar substâncias
antifúngicas para o meio de cultura.
Os resultados mostrados até agora indicaram com clareza que os bastonetes são
capazes de promover uma certa proteção aos ovos de Rhodnius prolixus. No entanto, caso a
associação destes bastonetes com os ovos de Rhodnius prolixus seja uma associação eventual,
configurando-se como contaminação, ela não terá nenhuma implicação biológica. Mas se,
pelo contrário, houver uma associação simbiótica entre as partes, o significado biológico
torna-se extremamente interessante e merecedor de novas investigações. Para verificar esta
possibilidade, ou seja, de uma associação íntima dos insetos com estes bastonetes, procurou-
se encontrar os bastonetes em estruturas internas dos aparelhos reprodutivos tanto de fêmeas
como de machos. Os órgãos internos eram dissecados e analisados ao microscópio na procura
de bastonetes semelhantes aos da nossa cultura. A Figura 19 mostra o conteúdo da
espermateca e vesícula seminal, mas não foram encontrados nenhum forma de bastonetes.
Apenas o conteúdo da vesícula seminal apresentava-se cheio de espermatozóides, como
esperado. A análise do conteúdo da glândula acessória do macho mostrou, por outro lado,
vários campos da lâmina podia se observar bastonetes (Figuras. 20A e 20B) muito
semelhantes ao da cultura, sugerindo a possibilidade de uma associação íntima desta bactéria
com o inseto. Além disso, a glândula acessória do macho, assim como outras estruturas
internas do órgão genital da fêmea, também, foram capazes de induzir halo de inibição de
crescimento em Aspegillus niger em placa de Petri (Figura 21). Este é um dado extremamente
interessante do ponto de vista biológico, já que o inseto estaria pré-selecionando a cepa de
bactéria importante para o processo reprodutivo, promovendo a proteção contra a ação
saprofítica de fungos sobre os ovos.
50
A
B
Figura 19. Procura por bastonetes na espermateca e vesícula seminal. Os
insetos foram dissecados em condições estéreis, os ógãos retirados e
imediatamente analisados ao micróscópio ótico. (A) Espermateca; (B) Vesícula
seminal.
51
Figura 20A. Análise do conteúdo de bastonetes na
g
lândula acessória de machos
de Rhodnius prolixus. (A e B) Campos diferentes da mesma lâmina. A glândula foi
dissecada e observada diretamente ao microscópio após leve pressão com a lamínula
para expulsar o seu conteúdo. A seta em (B) indica a presença de bacilos. (A) ausência
de setas e de bastonetes.
B
A
52
A
B
Figura 20B. Análise do conteúdo de bacilos na
g
lândula acessória de machos
em outros campos da mesma lâmina. (A e B) Campos diferentes da mesma
lâmina.
53
54
A
B C
D
E
VS GAM.
ESP GAF
Figura 21. Análise do efeito antifún
g
ico de bactérias de or
g
ãos reprodutores de
Rhodnius prolixus: Os órgãos foram dissecados inteiros e colocados na placa de Petri. A
espermateca (ESP), a glândula acessória da fêmea (GAF), a glândula acessória do macho
(GAM) e a vesícula seminal (VS) foram dissecados e mantidos em meio Saboraud
inoculados com Aspergillus niger que foram deixados crescer por 48 h e fotografados. No
p
ainel A
,
vista
p
anorâmica da
p
laca
;
Em B-E detalhes do halo de inibi
ç
ão.
VS
GAM
ESP GAF
Até o momento, estivemos estudando o processo de proteção dos ovos pela associação
com as bactérias, em especial contra a ação de Aspergillus niger, mas nada sabíamos sobre
uma possível participação de agentes antifúngicos produzidos pelo inseto contra outros tipos
de fungos. Para investigar esta possibilidade, diferentes tipos de fungos foram cultivados em
meio de cultura contendo antibióticos na presença de ovos de Rhodnius prolixus. As Figuras
22, 23A e 23B mostram que o inseto não produz nada que proteja os ovos contra o
crescimento de Candida albicans, Aspergillus parasiticus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus
ochraceus e Fusarium solani, a julgar pelo crescimento dos fungos sobre os ovos. Ao
observar a figura 23A parece que há a formação de um pequeno halo de inibição, deixando
alguma dúvida sobre a produção de substâncias antifúngicas pelos ovos de R. prolixus, mas
nesse experimento o antibiótico foi colocado somente no meio líquido e isso pode ter afetado
o grau de difusão deste, no meio sólido, facilitando a sobrevivência de algumas bactérias.
Nenhum dos ovos eclodiu, sugerindo que os fungos foram capazes de se beneficiar do seu
conteúdo. Restava saber agora se o material secretado pela bactéria era ou não efetivo para
conter o crescimento de fungos diferentes de Aspergillus niger. O ultrafiltrado da cultura de
bastonetes foi testado de duas formas contra diferentes espécies de fungo; em meio Saboraud
contendo Agar em microplacas (lâmina escavada) e em meio líquido (placa de ELISA). No
meio contendo Agar (meio sólido) o fungo foi inoculado em um dos lados e o ultrafiltrado
adicionado pelo lado oposto e o efeito exercido observado visualmente e fotografado (Figuras.
24, 25, 26 e 27). A placa de ELISA foi avaliada por espalhamento de luz a 540 nm (Figura
28), e adicionalmente por inspeção visual sob a lupa por dois avaliadores independentes,
atribuindo aos seus efeitos cruzes, de acordo com uma escala de 0 a 4, sendo 4 cruzes a
inibição do crescimento mais proeminente (Tabela I). As Figuras. de 24 a 28 e a Tabela I, que
analisaram o efeito do fator antifúngico sobre várias espécies, indicam que ele é bastante
efetivo para inibir o crescimento de Aspergillus niger, T. rubrum; M. gypseum, que tem efeito
55
moderado contra A .fumigatus, A. ochraceus, F. pedrosoi, e se mostrou pouco eficiente ou
ineficiente para A. parasiticus, F. solani, S. schenckii, T. harzianum. Os ovos de Rhodnius
prolixus, quando colocados em contato com bactérias do tipo Gram-positivo ou Gram-
negativo, Figura 29, não foram capazes de induzir a formação de um halo de inibição de
crescimento. As bactérias
56
Figura 22. Teste de crescimento de Candida albicans. Os fungos foram
inoculados em meio de cultura BHI contendo cloranfenicol e expostos à
presença de ovos de Rhodnius prolixus. Os ovos do lado esquerdo da figura
foram umedecidos com água e o do lado direito aplicados secos sobre a placa
de Petri.
57
A
C
B
D
Figura 23A. Análise de antifún
g
icos associado aos ovos, produzidos pelo inseto.
Diferentes tipos de fungos filamentosos foram crescidos por 24 h em meio de cultura
Saboraud sólido contendo cloranfenicol (0,150 mg/mL) para prevenir o crescimento das
bactérias associadas aos ovos de Rhodnius prolixus. (A) A. parasiticus; (B) A. fumigatus;
(C) A. ochraceus; (D) F. solani.
58
A B
C
D
Figura 23B. Teste para a análise de antifún
g
icos associados aos ovos de
Rhodnius prolixus produzidos pelo inseto. Diferentes tipos de fungos filamentosos
foram crescidos por 15 dias em meio de cultura Saboraud sólido contendo
cloranfenicol (0,150 mg/mL) para prevenir o crescimento das bactérias associadas
aos ovos de Rhodnius prolixus. (A) A. parasiticus; (B) A. fumigatus;(C);
A.ochraceus; (D) F. solani. As mesmas placas mostradas na figura anterior estão
sendo mostradas para evidenciar a invasão dos fungos sobre os ovos após duas
semanas a mais de crescimento dos fungos.
59
A
B
C
D
Figura 24. Análise do efeito do ultrafiltrado de bastonetes sobre diferentes espécies
de Aspergillus crescidos em microplacas de Agar contendo cloranfenicol. Aspergillus
niger (A-B); A. parasiticus (C-D). As setas verticais indicam o ponto onde os fungos
foram inoculados. As setas horizontais indicam o ponto onde 50 μL de meio de cultura
(controles, painéis A e C) ou 50 μL de ultrafiltrado de bastonetes (painéis A e B) foram
aplicados.
E
C
A
B
C D
60
A
B
C
D
Figura 25. Análise do efeito do ultrafiltrado de bastonetes sobre diferentes espécies
de Aspergillus crescidos em microplacas de Agar contendo cloranfenicol. A.
ochaceous (A-B); A. fumigatus (C-D). As setas verticais indicam o ponto onde os
fungos foram inoculados. As setas horizontais indicam o ponto onde 50 μL de meio de
cultura (controles, painéis A e C) ou o 50 μL de ultrafiltrado de bastonetes (painéis A e
D) foram aplicados.
E F
A
B
C
D
A B
C D
61
Figura 26. Análise do efeito do ultrafiltrado de bacilos sobre diferentes
g
êneros de
fungos crescidos em microplacas de agar contendo cloranfenicol. M gypseum (A-B);
T. rubrum (C-D); F. pedrosoi (E-F). As setas verticais indicam o ponto onde os fungos
foram inoculados. As setas horizontais indicam o ponto onde 50 μL de meio de cultura
(controles, painéis A, C e E) ou o ultrafiltrado de bastonetes (50 μL) (painéis B,D e F)
foram aplicados.
A B
C D
E F
62
63
A
B
C D
E F
Figura 27. Análise do efeito do ultrafiltrado de bastonetes sobre diferentes
g
êneros de
fungos crescidos em microplacas de Agar contendo cloranfenicol. F. solani (A-B); T.
harzianum (C-D); S. schenckii (E-F). As setas verticais indicam o ponto onde os fungos
foram inoculados. As setas horizontais indicam o ponto onde 50 μL de meio de cultura
(controles, painéis A, C e E) ou o ultrafiltrado de bastonetes (50 μL) (painéis B, D e F)
foram aplicados.
A B
C D
E F
64
++S. schenckii+++++A. Ochraceus
+++++F. pedrosoi+++++A.fumigatus
-
-
++++
Obs 2
-F. solani++++++++M. Gypseum
-T. harzianum++(+)A. parasiticus
++++T. rubrum++++++++A. niger
Obs 1NomeObs 2Obs 1Nome
++S. schenckii+++++A. Ochraceus
+++++F. pedrosoi+++++A.fumigatus
-
-
++++
Obs 2
-F. solani++++++++M. Gypseum
-T. harzianum++(+)A. parasiticus
++++T. rubrum++++++++A. niger
Obs 1NomeObs 2Obs 1Nome
Figura 28. Análise do efeito do sobrenadante estéril de bacilos e
inóculos de diferentes fungos: Leitura da placa de ELISA de 96 poços em
540 nm. Números ímpares (controles- ausência de sobrenadante estéril);
Números pares (experimental - adição de 50 ul de sobrenadante estéril
Tabela I: Análise do efeito do sobrenadante estéril de bacilos em inóculos
de diferentes fungos. A placa de ELISA, contendo os fungos crescidos em meio
de cultura Saboraud líquido foi analisada em microscópio estereoscópico por
dois observadores independentes que atribuiram pontos de 0-4 para o grau de
inibição de crescimento dos fungos em questão. 0 - não houve inibição.
4 – inibição total.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
A. parasiticus
T. harzianum
S. schenckii
F. pedrosoi
F. solani
M. gypseum
T. rubrum
A. ochraceus
A. fumigatus
A. niger
D.O 540 nm
Figura 29 Teste de crescimento de bactérias Gram positivas e Gram
negativas em meio BHI na presença de ovos de Rhodnius prolixus. (A) E. coli;
(B) S. aureus. Os ovos do lado esquerdo da figura foram umedecidos com água e
os do lado direito aplicados secos sobre a placa de Petri.
B
A
65
foram capazes de crescer em toda a extensão das duas placas e em íntimo contato com os
ovos, sugerindo que nem o inseto e nem a bactéria associada produzem substâncias capazes
de inibir o crescimento de outras bactérias.
66
5 DISCUSSÃO
Os resultados apresentados nesta dissertação de Mestrado mostraram pela primeira vez
a associação de uma bactéria da forma de bastonetes com órgãos de reprodução de insetos,
tanto dos machos como das fêmeas de Rhodnius prolixus. Esta associação é benéfica para o
inseto, uma vez que ele se beneficia da produção e secreção de substâncias antifúngicas
produzidas pelos bastonetes que por estarem associados aos ovos, acabam por protegê-los da
ação saprofítica dos fungos, nas condições laboratoriais. Na presença de antibiótico como o
cloranfenicol, o bastonete associado é eliminado e os fungos crescem sobre os ovos,
inviabilizando o seu desenvolvimento normal. O fato de nenhum dos ovos ter eclodido sugere
que os fungos devem ter-se beneficiado do conteúdo dos ovos. Experiência semelhante
realizada com ovos de Rhodnius prolixus, mas com tetraciclina no meio, não impediu a
formação de um halo de inibição e parte dos ovos eclodiu (Bouts, resultado não publicado).
Este resultado talvez explique o fato da possibilidade da presença de bactérias não ter sido
considerada naquela ocasião. A quantidade de tetraciclina talvez não tenha sido suficiente
para inibir totalmente o crescimento das bactérias. Nas próximas experiências seria
interessante investigar a sensibilidade desta bactéria a esse antibiótico.
Embora não tenhamos tido ainda a possibilidade de investigar a natureza desta
substância, sabe-se que ela é termoestável (dado não mostrado), sugerindo que possa ser um
peptídeo, se ele for de natureza protéica, ou pode ser de outra natureza. Uma informação
bastante relevante é que esta substância tem um amplo espectro de ação, sendo capaz de inibir
diferentes espécies de Aspergillus, como Aspergillus fumigatus e Aspegillus ochraceous e
diferentes gêneros como T. rubrum; M. gypseum, F. pedrosoi e se mostrou pouco eficiente ou
ineficiente para A. parasiticus, F. solani, S. schenckii, T. harzianum. Junto com o bastonete
foi encontrada também uma bactéria da forma de cocos, que não teve nenhum efeito sobre o
crescimento do fungo. No entanto, é possível que esta bactéria seja o Rhodococcus rhodnii,
67
um simbionte obrigatório presente nas fezes de Rhodnius prolixus e que habita o sistema
digestivo desses insetos. O inseto não consegue se desenvolver muito bem na ausência desta
bactéria, pois ela produz substâncias importantes para o seu desenvolvimento (Baines, 1956;
Harrington, 1960 e Hill e cols., 1976). Talvez o Rhodococcus rhodnii não seja o único
simbionte obrigatório de Rhodnius prolixus. O bastonete isolado nesta dissertação talvez seja
uma segunda bactéria simbionte desta espécie de inseto. Embora existam evidências de
associação das bactérias com os insetos, tanto por observação direta da presença dessas
bactérias nos órgãos de reprodução do inseto assim como quando foi mantido estes órgãos em
meio de cultura (condição esta que permitiu o crescimento dessas bactérias com formação de
um halo de inibição de crescimento), os dados são ainda circunstanciais e não provam de
forma definitiva a associação simbiótica entre o inseto e as bactérias. Além da proteção
antifúngica exercida pelo bastonete, o ovo de Rhodnius prolixus apresenta uma outra barreira
antifúngica associada ao envoltório protetor de ovos de Rhodnius prolixus, uma proteína de
45 kDa que supõe-se estar associada à membrana vitelínica desse inseto (Bouts, 2006). Esta
proteína é sintetizada pelo epitélio folicular, uma camada unicelular que reveste o ovócito em
crescimento, e é uma das primeiras proteínas que irão compor o envoltório protetor. Por ser
uma das primeiras proteínas a serem secretadas e depositadas sobre os ovócitos, as proteínas
subseqüentes serão depositadas por aposição sobre as camadas de proteínas pré-existentes.
Desse modo, esta proteína será aquela que ficará em íntimo contato com o embrião em
desenvolvimento. Ela não é consumida pelo embrião e é descartada no envoltório protetor.
Foi verificado por Bouts (2006), que esta proteína é capaz de inibir o crescimento de
Aspegillus niger de uma forma dose dependente. A associação destes dois antifúngicos em
ovos de Rhodnius prolixus pode ser redundante, no entanto, é comum se encontrar na natureza
mecanismos redundantes de proteção das estruturas dos organismos. Por exemplo, os
mecanismos de proteção antioxidantes são muito redundantes e conferem aos organismos
68
vivos a possibilidade de utilizar o oxigênio, sem os perigos associados à sua utilização, que
colateralmente geram espécies ativas de oxigênio. Os mecanismos antioxidantes, que são
redundantes, minimizam os perigos dos agentes oxidantes gerados durante a utilização do
oxigênio, viabilizando a vida desses animais (Boveris e Cadenas, 1975; Cadenas e Boveris,
1977; Cadenas e Boveris, 1980). Desse modo, a redundância na proteção antifúngica pode ter
sido uma estratégia vitoriosa que nesse inseto permitem o combate à ação de fungos que são
normalmente predadores. Os fungos desenvolveram mecanismos de secreção de enzimas
(Hube, 2000; Naglik e cols., 2003; Santos e cols., 2006) sobre os hospedeiros para permitir a
invasão das células. Fungos como o Aspergillus niger que são saprofíticos, secretam essas
enzimas primariamente para prover nutrientes para as suas células. Para sobreviver, as células
hospedeiras devem contra atacar e impedir a ação dos fungos, como observamos neste caso.
A síntese desses antifúngicos pelo inseto e pela bactéria é eficiente, a julgar pela história
evolutiva desse inseto que está na natureza há milhões de anos. A sobrevivência desta espécie
na natureza pode estar dependendo, em grande parte, da ação dessas substâncias. O fato do
Aspergillus niger quando crescido em placas contendo antibiótico, ter sido capaz de
inviabilizar o crescimento do embrião de Rhodnius prolixus, pode ser explicado pelo fato do
fungo secretar enzimas para o interior do ovo, e não pela invasão direta das hifas, pois o
inseto tem a segunda barreira antifúngica a proteína de 45 kDa.
Agentes antifúngicos inibem, geralmente, reações enzimáticas envolvidas na
biossíntese celular dos fungos, como a síntese de nucleotídeos, aminoácidos, lipídeos e
polissacarídeos. Além disso, foi demonstrado por Kojima e cols., (2004) que a interferência
sobre o metabolismo dos fungos pode se realizar através dos mecanismos de transdução de
sinal intracelular, que podem afetar simultaneamente várias vias metabólicas, tornando o seu
efeito antifúngico muito eficiente, mas tornando também difícil o estudo dos mecanismos de
ação envolvidos. Nesta dissertação não se estudou o mecanismo de ação dessas substâncias,
69
mas a julgar pelas alterações morfológicas produzidas, ficou claro que as hifas sofreram uma
desorganização metabólica importante, a ponto de alterar muita a sua morfologia original.
Essa interação antagônica observada entre microorganismos não é nova na literatura.
Pasteur e Jourbert (apud Oliveira, 1887) relataram um efeito inibitório de um isolado
bacteriano contra Bacillus anthracis. Este foi somente um dos primeiros relatos a este
respeito. Posteriormente, observou-se inúmeras interações antagônicas em E. coli e cunhou-se
um nome genérico para estas substâncias, as bacteriocinas (Jacob, 1953 apud Lima, 2002).
Estas substâncias foram definidas como sendo proteínas biologicamente ativas que agem de
forma bactericida (Ingolf e cols., 1996).
O fato dos órgãos de reprodução do inseto, tanto os masculinos como os femininos,
estarem abertos para o meio externo torna-os sujeitos a infecções. Portanto, o fato dos órgãos
internos estarem associados a bactérias capazes de protegê-los contra a ação de várias
espécies de fungos também parece ter outro significado biológico além de pré-selecionar uma
cepa capaz de proteger os ovos. Na realidade, esta associação poderia também estar
protegendo os órgãos de reprodução do inseto como um todo.
Um grande número de substâncias antifúngicas têm sido descritas nas últimas décadas
para auxiliar no tratamento de pacientes portadores de AIDS que são tratados por terapias
imunossupressivas, assim como pacientes submetidos a transplantes de órgãos. Estes
pacientes tornam-se susceptíveis a infecções de fungos oportunistas.
A descoberta deste bastonete, que é capaz de crescer em meio de cultura muito
simples, e de secretar para o meio um agente antifúngico com amplo espectro de ação, merece
ser melhor investigada, pois a maior parte dos microorganismos testados são de importância
médica. Se essa substância se mostrar, em investigações futuras, promissora, o modelo seria
muito adequado para a produção em larga escala, com implicações biotecnológicas muito
claras.
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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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