( PDF ) Análise da expressão gênica no dermatófito Trichophyton rubrum mimetizando a infecção in vitro: pH e diferentes fontes de carbono regulando genes

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE GENÉTICA

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA NO DERMATÓFITO Trichophyton rubrum

MIMETIZANDO A INFECÇÃO IN VITRO: pH E DIFERENTES FONTES DE

CARBONO REGULANDO GENES

FERNANDA CRISTINA DE ALBUQUERQUE MARANHÃO

Ribeirão Preto – SP

2008

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FERNANDA CRISTINA DE ALBUQUERQUE MARANHÃO

ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA NO DERMATÓFITO Trichophyton rubrum

MIMETIZANDO A INFECÇÃO IN VITRO: pH E DIFERENTES FONTES DE

CARBONO REGULANDO GENES

Orientação: Profa. Dra. Nilce Maria Martinez Rossi

Ribeirão Preto – SP

2008

Tese apresentada ao Departamento de Genética

da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, da

Universidade de São Paulo, como requisito

parcial para a obtenção do Título de Doutor em

Ciências: Área de concentração Genética.

FICHA CATALOGRÁFICA

Maranhão, Fernanda Cristina de Albuquerque

Análise da expressão gênica no dermatófito Trichophyton rubrum

mimetizando a infecção in vitro: pH e diferentes fontes de carbono

regulando genes. Ribeirão Preto, 2008.

117p. il. 30cm.

Tese apresentada ao Departamento de Genética da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo. Área de

concentração Genética.

Orientação: Profa. Dra. Nilce Maria Martinez Rossi

1. Trichophyton rubrum, 2. Fontes de carbono e pH, 3. Virulência,

4. Hidridização subtrativa supressiva

Dedico

Às pessoas mais importantes da minha vida,

meus pais Fátima e Fernando,

pelo Amor, atenção e esforço constante.

À vocês, dedico toda a minha vida.

AGRADECIMENTOS

Agradeço incansavelmente aos meus pais, Sra. Fátima Dias e Sr.

Fernando Maranhão, e ao meu irmão Fábio Maranhão, pelo constante apoio nos

meus estudos, carinho e incentivo nas horas de dificuldades, e pelas palavras

sinceras que me empurraram para frente nas horas em que a queda parecia

inevitável. Obrigada pela presença constante nos mais de 5 anos em que estive

longe e mesmo com quase 2.400 km de distância.

À Profa. Dra. Nilce Maria Martinez-Rossi, pela oportunidade de trabalho

em seu grupo de pesquisa, orientação e assistência.

Aos amigos Wesley C. Brandão, Cleyde H. Vega, Daniela Pedrosa, Edna

do Sim e Ronai F. Ramos, pela amizade e auxílio em todas as horas, por estarem

comigo nos momentos de felicidade e de tristeza, e pelas intervenções

determinantes na minha saúde física. Amigos que nunca esquecerei, e que

estarão comigo independente de onde a Vida me levar.

Aos companheiros de trabalho, Fernanda Gonzales Paião, Jeny Cursino-

Santos, Roseli Aquino-Ferreira e Rodrigo A. Cazzaniga, pelas valiosas discussões

e auxílios experimentais, pelas palavras de incentivo, companheirismo e convívio

que renderam boas risadas. E claro, pelo indiscutível apoio emocional, crucial em

determinadas etapas.

À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo)

pela concessão da bolsa de Doutorado, a CAPES, CNPq e FAEPA que deram

suporte financeiro em várias etapas desse trabalho e no projeto temático em que

estive envolvida, propiciando a efetivação e divulgação dos resultados obtidos.

Aos funcionários do Departamento de Genética, em especial às queridas

meninas da Secretária, Susie Adriana Penha Nalon, Maria Aparecida O. S. Elias e

Silvia Sant’anna Consiglieri, pela cordialidade e presteza, sempre prontas a dar

qualquer suporte.

A todos os colegas atuais e àqueles que já passaram pelo Laboratório de

Biologia e Genética Molecular de Microrganismos e do Laboratório de Bioquímica

de Fungos, coordenado pelo Prof. Dr. Antônio Rossi.

À Ana Lúcia Fachin e Roseli Aquino-Ferreira, pela parceria técnica nas

análises da linhagem mutante ∆TruMDR2. Aos técnicos, Mendelson Mazucato e

Pablo Rodrigo Sanches, que dão conta de toda a demanda de sequenciamento e

análises bioinformáticas do nosso laboratório, e foram imprescindíveis na

elaboração do meu projeto, bem como a ajuda do técnico Marcos D. Martins.

E finalmente, gostaria de agradecer a todos que cruzaram meu caminho

positivamente nessa fase, que acreditaram que tudo daria certo e sempre me

incentivaram. Obrigada pela chance de aprendizado e amizade.

“Meus amigos quando me dão a mão

Sempre deixam outra coisa

Presença

Olhar

Lembrança

Calor

Meus amigos quando me dão a mão

Deixam na minha a sua mão”

(Paulo Leminski)

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R

A

S

Figura 1:

(A) Aspecto macroscópio de T. rubrum cultivado em meio Sabouraud

Agar durante 14 dias (28

°

C) e (B) microscopia do perfil de conídios de

T. rubrum, evidenciando a maior presença de microconídios em relação

aos macroconídios.........................................................................................

.

3

Figura 2:

Dermatofitoses causadas por T. rubrum: (A) Tinea corporis, (B) Tinea

pedium e (C) Tinea unguium .........................................................................

.

6

Figura 3:

Modelo de infecção proposto para dermatófitos, baseado na regulação

de enzimas proteolíticas secretadas em resposta ao pH ambiente.

(Martinez-Rossi et al., 2004) .........................................................................

.

12

Figura 4:

Representação esquemática da síntese de cDNA fita dupla a partir do Kit

SMART

®

da Clontech ....................................................................................

.

34

Figura 5:

Esquema do procedimento de subtração de cDNA com o uso de PCR

supressivo. Boxes marcados ou em aberto representam partes distintas

dos adaptadores 1 e 2 (Gurskaya et al., 1996)..............................................

.

40

Figura 6:

Etapas resumidas da construção da biblioteca TRSSHQue: (A) Gel de

agarose-formaldeído desnaturante 1,5% com RNA total das condições

controle-glicose (G) e teste-queratina (Q); (B) Gel agarose 1,2% com 1

kb DNA ladder (PM) e cDNA fita dupla das condições G e Q; (C) Gel de

agarose 1,2% com λ HindIII (PM) e o produto de Nested PCR ...................

.

53

Figura 7:

Reverse Northern Blot. Autoradiografias apresentando o rastreamento

de clones. Seis membranas em duplicata contendo clones da Biblioteca

Subtrativa de T. rubrum (TRSSHQue) (forward), hibridizadas com

sonda de pool de cDNAs obtidos na Nested-PCR da condição controle

(Taglicht & Michaelis) e teste (Que).............................................................

.

55

Figura 8:

Northern Blot. Validação de transcritos diferencialmente expressos e

similares a proteases (Subtilisina 5, Metaloprotease 4 e Subtilisina 3),

após contato de T. rubrum com queratina durante 72 h. (C) controle,

micélio cultivado em glicose; (Q) teste, micélio cultivado em queratina.

Abaixo estão representados os respectivos géis desnaturantes contendo

RNAs equalizados das condições citadas. Ao lado, gráficos

representando as intensidades relativas da expressão gênica de cada

transcrito, através da comparação entre controle (G) e teste (Q)................

.

66

ii

Figura 9:

Northern Blot. Validação de transcritos diferencialmente expressos e

similares a proteína TINA, No Match (sem similaridade), Gag-

poliproteína e Hsp30, após contato de T. rubrum com queratina durante

72 h. (C) controle, micélio cultivado em glicose; (Q) teste, micélio

cultivado em queratina. Abaixo estão representados os respectivos géis

desnaturantes contendo RNAs equalizados das condições citadas. Ao

lado, gráficos representando as intensidades relativas da expressão

gênica de cada transcrito, através da comparação entre controle (G) e

teste (Q) .........................................................................................................

.

67

Figura 10:

Northern Blot. Validação de transcritos diferencialmente expressos e

similares a transportadores transmembranas, após contato de T. rubrum

com queratina durante 72 h. (C) controle, micélio cultivado em glicose;

(Q) teste, micélio cultivado em queratina. Abaixo estão representados os

respectivos géis desnaturantes contendo RNAs equalizados das

condições citadas. Ao lado, gráficos representando as intensidades

relativas da expressão gênica de cada transcrito, através da comparação

entre controle (G) e teste (Q) ........................................................................

.

68

Figura 11:

Otimização dos ciclos de PCR para amplificação dos cDNAs controle e

teste, evitando o “platô” para manter a variação quantitativa dos

diferentes genes em cada condição. Fixou-se 20 ciclos para o controle

e 27 para o teste. PM1: 1Kb DNA ladder; PM: padrão de peso

molécula λHind..............................................................................................

.

69

Figura 12:

Nested-PCR. (PM) 1Kb Plus DNA Ladder; (1) cDNAs da condição teste

(azeite de oliva, 1%); (2) cDNAs da condição controle (glicose 55 Mm)..........

70

Figura 13:

Reverse Northern Blot. Autoradiografias apresentando o rastreamento

de clones. Sete membranas em duplicata contendo clones da Biblioteca

Subtrativa de T. rubrum (TRSSHLip) (forward), hibridizadas com sonda

de pool de cDNAs obtidos na Nested-PCR da condição controle e teste

(Lip) ...............................................................................................................

.

72

iii

Figura 14:

Northern Blot. Validação de transcritos diferencialmente expresso, sem

(Gorani et al., 2002)a glicoproteína de 43 kDa, após contato de T.

rubrum com lipídeos durante 72 h. (C) controle, micélio cultivado em

glicose; (L) teste, micélio cultivado em azeite de oliva (1%). Abaixo está

representado o respectivo gel desnaturante contendo RNAs equalizados

das condições citadas. O gráfico representa a intensidade relativa da

expressão gênica do transcrito, após a comparação entre controle (G) e

teste (L)..........................................................................................................

.

75

Figura 15:

Northern Blot. Comparação do padrão de expressão gênica de

transcritos diferencialmente expressos e similares a proteases nas

linhagens H6 (selvagem) e ∆PacC-1 (mutante) de T. rubrum, após

cultivo durante 72 h: (1) H6 cultivado em glicose; (2) H6 cultivado em

queratina; (3) ∆PacC-1 cultivado em glicose; (4) ∆PacC-1 cultivado em

queratina. O respectivo gel desnaturante contendo RNAs equalizados

das condições citadas está representado. Os gráficos representam as

intensidades relativas da expressão gênica de cada transcrito após a

comparação entre as linhagens (2) selvagem H6 e (4) mutante ∆pacC-1....

.

77

Figura 16:

Ensaio de infecção mostrando o crescimento de diferenes linhagens de T.

rubrum cultivadas em fragmentos de unhas humanas durante 6 dias a 28

°C. O crescimento fúngico nas unhas foi avaliado por microscopia

óptica e as imagens capturadas através do Axion vision System (Zeiss)

com objetiva (plan neofluar) 20x/0.5. As partes pretas no lado esquerdo

das figuras são os fragmentos de unhas. (A) Controle negativo (sem

inóculo); (B) H6 (linhagem selvagem H6) e (C) linhagem mutante

∆

TruMDR2. Esses resultados são representativos de dois experimentos

distintos..........................................................................................................

.

78

iv

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Tabela 1:

Sequência dos oligonucleotídeos para uso na RT-PCR ................................

.

35

Tabela 2: Alteração do pH quando várias linhagens de T. rubrum foram cultivadas

em meio mínimo com glicose (controle) (55 mM), queratina (teste 1)

(2,5g/L) e fonte lipídica (teste 2) (1 %) .........................................................

.

52

Tabela 3:

Contigs e singlets identificados a partir de sequências expressas no

dermatófito T. rubrum após tratamento com queratina durante 72 h ..........

.

57

Tabela 4: Análise bioinformática e anotação funcional de unigenes selecionados

da Biblioteca Subtrativa Supressiva de T. rubrum cultivado em meio

contendo fonte lipídica ..................................................................................

.

73

Gráfico 1:

Classificação funcional dos unigenes gerados após a análise dos clones

que compõem a Biblioteca Subtrativa Supressiva TRSSHQue, de acordo

com banco de dados do MIPS (Munich Information Center for Protein

Sequences) .....................................................................................................

.

64

Gráfico 2:

Classificação funcional dos unigenes gerados após a análise dos clones

que compõem a Biblioteca Subtrativa Supressiva TRSSHLip, de acordo

com banco de dados do MIPS (Munich Information Center for Protein

Sequences) .....................................................................................................

.

74

v

RESUMO

Dermatófitos são fungos filamentosos com a habilidade de invadir substratos

queratinizados e causar dermatofitoses em humanos e animais, penetrando profundamente

apenas em hospedeiros imunocomprometidos. Trichophyton rubrum é um fungo

antropofílico e cosmopolita, o mais comum agente de micoses superficiais, que usa

componentes celulares como proteínas e lipídeos após uma específica regulação de sua

expressão gênica governada pelo pH ambiente e sensoriamento celular. A virulência de T.

rubrum é relacionada com a secreção de enzimas proteolíticas, um importante fator

determinante na invasão, utilização e subseqüente disseminação através do estrato córneo.

O objetivo desse estudo foi identificar através de Hibridização Subtrativa Supressiva

(SSH) genes de T. rubrum preferencialmente expressos durante o crescimento na presença

de queratina e lipídeos, quando T. rubrum degrada fontes de carbono tipicamente

encontradas em células epidérmicas. Inicialmente, nós avaliamos as mudanças no pH

extracelular durante seu crescimento em queratina e lipídeo (depois de 6, 12, 24, 48, 72 h e

7 dias) em pH inicial 5,0, onde foi observado um gradual aumento do pH basal sob ambas

as condições de teste, comparado com a condição glicose (controle). Também

identificamos 576 transcritos de T. rubrum diferencialmente expressos por SSH usando

conídios cultivados por 72 h em queratina como teste e em glicose como controle. Os

genes de T. rubrum ativados codificam proteínas putativas que foram validadas por cDNA

dot-blot e northern blot, mostrando similaridade com proteínas fúngicas envolvidas no

metabolismo básico, crescimento e virulência, p. ex., transportadores ABC-MDR, MFS e

ATPase de cobre, permease, NIMA interactive protein, poliproteína Gag-Pol, fatores de

virulência subtilisinas serino-proteases (Sub 3 e 5) e metaloproteases (Mep 3 e 4) e Hsp30.

Adicionalmente, entre os 762 clones obtidos na biblioteca da condição lipídeo (72 h), 80

transcritos superexpressos foram confirmados por cDNA dot-blot, revelando 14 unigenes

similares à proteínas de vários organismos patogênicos, como glicoproteína 43 kD,

transportador MDR, proteína G, quitina sintase e serino/treonina fosfatase.

Transcritos do gene TruMDR2, codificador de um transportador ABC, foi isolado

tanto na presença de queratina quanto em lipídeo, e a análise da linhagem mutante

∆TruMDR2 de T. rubrum mostrou uma redução na atividade infectante, caracterizada pelo

baixo crescimento em unhas humanas comparada com o tipo selvagem. A alta expressão

de transportadores por T. rubrum em condições que mimetizam a infecção e a redução na

vi

virulência de ∆TruMDR2 durante o modelo in vitro sugerem que transportadores estão

envolvidos na patogenicidade de T. rubrum. Outro linhagem mutante (∆pacC-1) com um

nocaute no gene pacC que codifica um fator de transcrição regulado pelo pH local,

mostrou a expressão de proteases (Sub 3 e 5 e Mep 4) diminuída após o crescimento em

queratina em comparação com o tipo selvagem em análises de northern blots. Essas

proteases tem uma atividade ótima em pH alcalino, e nossos resultados indicam uma

regulação defectiva do gene pacC de T. rubrum na ativação de proteases.

Em conclusão, através do uso de SSH foi possível identificar genes de T. rubrum

ativados após tratamentos específicos, o que sugere a importância dos mesmos na interação

dermatófito-hospedeiro, instalação e manutenção da doença. Esses resultados

disponibilizam novos dados sobre T. rubrum que levarão a um melhor entendimento dos

mecanismos moleculares envolvidos no crescimento, metabolismo geral e patogenicidade,

e também auxiliar na identificação de novos e efetivos alvos de drogas para dermatófitos.

vii

ABSTRACT

Dermatophytes are a group of fungi filamentous that have the ability to invade

keratinized substrates, causing dermatophytosis in humans and animals and only penetrate

deeper if the host is immunocompromised. Trichophyton rubrum is an anthropophilic and

cosmopolitan fungi, the most common agent of superficial mycoses, which uses cell

components such as proteins and lipids after a specific regulation of its gene expression

governed by pH environment and sensing cell. The virulence T. rubrum is related to

secretion of proteolytic enzymes, an important factor determinant in the invasion,

utilization and subsequently dissemination through the stratum corneum. The aim of this

study was to indentify by Suppression Subtractive Hybridization (SSH) T. rubrum genes

preferentially expressed during growth in the presence of keratin and lipids, upregulated

when this fungus degrades carbon source typically found at epidemic cells. Initially, this

work evaluated the changes in the extracellular pH during its growth in keratin and lipid

(after 6, 12, 24, 48, 72 h and 7 days) at initial pH 5.0, where we observed a gradual

increase of basal pH under both tests when compared to glucose condition (control). Also,

we identified 576 T. rubrum transcripts differentially expressed by SSH using conidia

cultivated for 72 h in keratin as tester, and in glucose as driver. The T. rubrum genes

upregulated encode putative proteins that were validated by cDNA dot-blot and northern

blot, showing similarity to fungi proteins involved in basic metabolism, growth and

virulence, i.e., transporters ABC-MDR, MFS and ATPase of copper, permease, NIMA

interactive protein, Gag-Pol polyprotein, virulence factors serine-protease subtilisins (Sub

3 and 5) and metalloproteases (Mep 3 and 4) and Hsp30. Additionally, among the 762

clones obtained in a library of lipid condition (72 h), 80 over-expressed transcripts were

confirmed by cDNA dot-blot, revealing 14 unigenes similar to proteins of several

pathogenic organisms, like glicoprotein 43 kD, MDR transporters, G protein, chitin

synthase and serine/threonine-protein phosphatase.

Transcripts of TruMDR2 gene, encoding an ABC transporter in T. rubrum, were

isolated in the presence of keratin and lipid, and the examination of ∆TruMDR2 mutant T.

rubrum showed a reduction in infecting activity, characterized by low growth in human

nails compared to wild-strain. The high expression of transporter by T. rubrum in

conditions that mimetize the infection and the virulence reduction of ∆TruMDR2 in an in

vitro model suggests that transporters are involved in T. rubrum pathogenicity. Another

viii

mutant, ∆pacC-1 with a knockout in PacC gene that encodes a transcription factor

regulated by local pH, showed the expression of proteases (Sub 3, Sub 5 and Mep 4)

decreased after growth in keratin (72 h) in comparison to wild-strain in northern blot

analyzes. These proteases have an optimal activity in alkaline pH, and our results indicate a

defective regulation of T. rubrum pacC gene in the activation of proteases.

In conclusion, by means of SSH to identify genes upregulated in T. rubrum after

specific treatments, their importance in the dermatophyte-host interaction, installation and

maintenance in the disease is suggested. These results provide new insights about T.

rubrum that will contribute to a better understanding of molecular mechanisms about the

growth, metabolism and pathogenicity, and may also aid in the identification of novel

effective drug targets for dermathophytes.

A

PRENDIZADO

Do mesmo modo que te abriste à alegria

abre-te agora ao sofrimento

que é fruto dela

e seu avesso ardente.

Do mesmo modo

que da alegria foste

ao fundo

e te perdeste nela

e te achaste

nessa perda

deixa que a dor se exerça agora

sem mentiras

nem desculpas

e em tua carne vaporize

toda ilusão

que a vida só consome

o que a alimenta.

(F

ERREIRA GULLAR)

1

1.

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1.1.

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Os fungos são organismos eucarióticos, uni ou pluricelulares, heterotróficos,

quimiorganotróficos, aeróbios ou microaerófilos, sendo que alguns possuem parede celular

constituída de quitina ou quitina e celulose. Essa diversidade morfológica e fisiológica

permite que tais organismos sejam encontrados em variados ambientes, sendo delimitados

em um reino próprio por possuírem características peculiares que os distinguem dos seres

de outros reinos. Com relação à nutrição, os fungos fazem absorção do alimento,

acumulam glicogênio como substâncias de reserva, com estilo de vida saprobiótico,

comensal, simbionte ou parasitário (Tortora et al., 2005). Estes organismos são

importantes por trazerem benefícios em diversos aspectos, p.ex., na cadeia alimentar como

decompositores, servindo de alimento ou na produção de pão e drogas, no controle

biológico e com grande influência biotecnológica por inovar na produção de enzimas

utilizadas industrialmente.

Ao longo da última década, a incidência de infecções causadas por fungos tem

aumentado, seja em infecções hospitalares afetando principalmente indivíduos debilitados

imunologicamente ou como fitopatógenos, infectando plantas economicamente

importantes. Os fungos de interesse médico (agentes de micoses) podem ser leveduras,

fungos filamentosos ou apresentar-se com as duas formas (fungo dimórfico) a depender

das condições ambientais como pH e temperatura. As micoses são classificadas em cinco

grupos de acordo com o grau de envolvimento no tecido e o modo de entrada no

hospedeiro: sistêmica, subcutânea, cutânea, superficial ou oportunista. A criptococcose

causada por Cryptococcus neoformans var. neoformans, principalmente o sorotipo A, é

caracterizada como infecção oportunista iniciada pelas vias aéreas que pode se tornar

sistêmica em hospedeiros com imunosupressão, enquanto membros do gênero Aspergillus

2

podem provocar doenças em homens e animais através de vários mecanismos com

características variadas, sendo a maioria das espécies fúngicas considerada oportunista

(Sidrim & Rocha, 2004).

As dermatofitoses estão entre as micoses superficiais mais comuns e determinam

lesões limitadas ao extrato queratinizado da pele e seus anexos. São causadas por fungos

filamentosos denominados dermatófitos, que através de um longo processo evolutivo

tornaram-se altamente capazes de invadir e colonizar tecidos queratinizados. Estes

compreendem cerca de 30 espécies classificadas de acordo com o habitat preferencial

(antropofílicos, zoofílicos ou geofílicos), e em 3 gêneros anamórficos (assexuado ou

imperfeito): Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton (Weitzman & Summerbell,

1995; Graser et al., 2000). Os dermatófitos antropofílicos têm específica afinidade por

queratina de tecidos humanos como cabelo, pele e unha para utilizá-los como fonte de

nutrientes. Eles afetam cerca de 25% da população mundial, como constatado pela

Organização Mundial da Saúde (Marques et al., 2000). Menos freqüentemente, os

dermatófitos estão relacionados às infecções subcutâneas e profundas com quadros clínicos

mais complexos como abcessos, granulomas e micetomas em indivíduos imunodeprimidos

(Speth et al., 2008). A infecção pode ser branda ou severa, e depende de vários fatores, p.

ex., relacionados com a capacidade infectante do fungo para superar os mecanismos de

defesa do hospedeiro, local da infecção, pH ambiente, concentração de nutrientes (Ogawa

et al., 1998) e outros aspectos, podendo gerar diferentes manifestações clínicas a depender

da área anatômica infectada.

3

1.2.

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Entre os representantes do gênero, Trichophyton rubrum (Castellani; Sabouraund,

1911) tem sido o agente etiológico isolado com maior freqüência nos casos de

dermatofitoses humanas. Quando cultivado em placa de Petri contendo meio adequado,

apresenta crescimento lento e colônias brancas com textura algodonosa ou aveludada (Fig.

1A), com pregas radiais e pigmentação vermelha no lado reverso (Kwon-Chung &

Bennett, 1992; Cervelatti et al., 2004), mas variedades com aspecto granular e ausência de

pigmentação podem ocorrer. Os microconídios são piriformes localizados geralmente ao

longo de hifas hialinas não ramificadas, com macroconídios pouco abundantes, longos e

com formas fina e claviformes (Ferreira & Ávila, 2001) (Fig. 1B). Os artroconídios de T.

rubrum são bem resistentes às adversidades dos fatores ambientais e capazes de sobreviver

por longos períodos, sendo os principais elementos infecciosos (Coelho et al., 2008).

A B

Figura 1: (A) Aspecto macroscópio de T. rubrum cultivado em meio Sabouraud Agar durante 14 dias (28

°

C) e (B) microscopia do perfil de conídios de T. rubrum, evidenciando a maior presença de microconídios

em relação aos macroconídios.

4

Para o diagnóstico, geralmente é feita coleta e cultivo em meio Sabouraud, fazendo-

se análise da formação de conídios e de caracteres morfológicos das colônias com ou sem

uso de microscopia para distinguir as espécies (Gorani et al., 2002). Várias técnicas

moleculares vêm sendo utilizadas e dão resultados mais rápidos e confiáveis, como por

exemplo, PCR utilizando primers de regiões repetitivas conservadas, análise de RAPD,

DNA mitocondrial e do número de repetições da região espaçadora não transcrita (ITS) do

RNA ribossômico (Kano et al., 1997; Kano et al., 2000; Nascimento & Martinez-Rossi,

2001). Recentemente foi proposto o seqüenciamento do genoma do T. rubrum por

pesquisadores de várias universidades (Projeto Fungal Genome Initiative do Broad

Institute; http://www.broad.mit.edu/) pela sua importância e prevalência, e sua efetivação

auxiliará em diversos estudos sobre taxonomia, epidemiologia e processos metabólicos

gerais, dando melhores condições para o surgimento de terapias mais eficientes. A

cariotipagem molecular deste dermatófito, utilizando a técnica CHEF (Contour-clamped

homogeneous eletric field), foi definida por Cervelatti et al (2004) que identificou cinco

bandas cromossomais de peso molecular entre 3,0 a 5,8 Mb.

1.3.

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Quanto à distribuição geográfica, os dermatófitos são encontrados atualmente em

diferentes regiões do mundo, havendo variações regionais em relação às freqüências de

determinadas espécies. Muitas espécies têm distribuição mundial (cosmopolita), como o T.

rubrum, que infecta os humanos e pode eventualmente causar dermatofitoses em animais

(Chermette et al., 2008; Seebacher et al., 2008), sendo a espécie mais prevalente deste

gênero e o dermatófito mais comumente encontrado em lesões superficiais de pele e unha

(Costa et al., 2002; Zahra et al., 2003). Mas apesar de ser considerado cosmopolita, o T.

rubrum no passado apresentava uma distribuição mais restrita, sendo a mudança

5

possivelmente um resultado da extensa migração humana transportando tais dermatófitos

(Weitzman & Summerbell, 1995). Condições geoclimáticas e sociais interferem na

distribuição das espécies dermatofíticas isoladas. No Brasil, as regiões Sul e Sudeste têm

apresentado alta incidência de T. rubrum, seguido de M. canis e T. mentagrophytes como

as mais isoladas, enquanto na região Nordeste há maior prevalência de T. tonsurans, T.

rubrum e M. canis (Sidrim & Rocha, 2004). O fluxo populacional e alterações positivas ou

negativas das condições de saneamento podem interferir na freqüência de cada espécie em

determinadas regiões com o decorrer do tempo e modificar esses padrões.

Estima-se que aproximadamente 80-93% das dermatofitoses crônicas ou

recorrentes são causadas por T. rubrum, que pode ainda ter um comportamento invasivo ao

causar infecções oportunistas atípicas em pacientes com o sistema imune comprometido,

como ocorre em portadores do vírus HIV, pacientes com órgãos transplantados e outros

que são submetidos a tratamento quimioterápico contra o câncer (Georgopapadakou &

Walsh, 1994; Grossman et al., 1995; Weitzman & Summerbell, 1995; Gorani A et al.,

2002; Gong et al., 2007). No Estado de São Paulo, 4.500 crianças de 0-15 anos foram

avaliadas para determinar a incidência de tinea capitis entre 1996 e 2000. Em 132 crianças

com suspeita de contaminação, 112 pacientes (85%) tiveram a confirmação através de

microscopia direta e cultura, sendo apenas 0,9% relacionado à presença de T. rubrum

(Moraes et al., 2006). Já entre as onicomicoses, T. rubrum é o mais prevalente e afeta

crianças e adultos em cerca de 70% dos casos, seguido de T. mentagrophytes.

Em relação aos hospedeiros em potencial, fatores de riscos estão associados à

micoses como a onicomicoses, dentre eles a idade, diabetes melittus, anomalias

morfológicas na unha, fatores genéticos, imunodeficiência, tratamento e higiene

inadequados, tanto para infecções primárias como em reincidências. Além disto, as taxas

hormonais de cada indivíduo afetam a freqüência de infecções em homens e mulheres

6

(Tosti et al., 2005). Então, vários fatores climáticos, práticas sociais, migração

populacional e características individuais afetam a epidemiologia das dermatofitoses.

1

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4

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A infecção por T. rubrum e conseqüente propagação podem ocorrer através do

contato direto ou indireto entre indivíduos infectados e sadios, ou com objetos inanimados

contaminados (fomites). As manifestações clínicas, conhecidas popularmente como

impigem (tinha), são caracterizadas de acordo com o sítio anatômico atingido. Este

dermatófito causa tinea corporis, tinea pedis e tinea unguium, e mais raramente tinea

capitis (Graser et al., 2000), sendo as lesões resultantes da reação do hospedeiro contra

enzimas específicas produzidas e liberadas pelo fungo durante o processo de infecção, que

viabilizam a digestão tecidual do hospedeiro em busca de nutrientes para o

desenvolvimento e manutenção do fungo (Martinez-Rossi et al., 2004).

A B C

Figura 2: Dermatofitoses causadas por T. rubrum: (A) Tinea corporis, (B) Tinea pedium e (C) Tinea

unguium.

7

A complexidade dos eventos envolvidos no desenvolvimento de uma doença requer

a combinação de características do patógeno e do hospedeiro, existindo vários fatores do

hospedeiro que estão envolvidos no processo de colonização dos dermatófitos. Vários

fungos e outros parasitas que se desenvolvem em tecidos queratinizados são incapazes de

se manter na presença de fatores séricos e muitas vezes em temperaturas como a fisiológica

humana (37 °C). Caracteres do extrato córneo favorecem essa adaptação, como a alta

hidratação devido à presença de glândulas e o fato das células superficiais já se

encontrarem mortas e inacessíveis a diversos mecanismos de defesa provenientes da

circulação ativa, além da temperatura e do pH em torno de 5,0 a 6,7 (ácido) (Sidrim &

Rocha, 2004). Ou seja, além da temperatura da pele ser menor que 37 °C, os fungos

queratinolíticos não são diretamente afetados pelos componentes inflamatórios já que a

extensa camada de queratina age como uma barreira que impede o contato do fungo com

componentes séricos.

Entretanto, segundo Ogawa et al (1998), após o contato para a transmissão do

dermatófito, a etapa inicial da patogênese envolve a capacidade infectante do fungo em

superar os mecanismos de resistência do hospedeiro, p.ex., barreiras físicas como as

camadas da pele em descamação e a adaptação às características físico-químicas do

ambiente (incidência de luz U.V., temperatura, umidade, pH, etc). Para o estabelecimento

das dermatofitoses, a aderência aos queratinócitos e a germinação conidial são cruciais

(Samdani, 2005). Efetivada a aderência inicial, segue-se a competição com a flora

microbiana normal e germinação dos artroconídios para subseqüente colonização da

superfície celular, culminando na penetração das hifas em camadas mais profundas do

extrato córneo. Sendo assim, é essencial a regulação da expressão gênica para induzir ou

inibir genes de acordo com a necessidade, como em todos os seres vivos. A capacidade de

adesão nas superfícies celulares vem sendo atribuída à presença de glicoproteínas na

8

parede celular desses microorganismos (Ferreira-Nozawa et al., 2003), como também é

observado no fungo dimórfico patogênico Candida albicans (Ogawa et al., 1998).

Uma vez ultrapassadas essas etapas, os fungos devem ser capazes de obter

nutrientes essenciais para sua completa instalação, desenvolvimento e permanência no

hospedeiro (Martinez-Rossi et al., 2004). Mas a seletividade da membrana citoplasmática

impede que macromoléculas como proteínas, amido, celulose e lipídeos sejam

transportadas para o interior da célula. Para que essas moléculas sejam utilizadas, é

necessário degradá-las em compostos menores aos quais as membranas são permeáveis. A

quebra dessas moléculas é promovida por enzimas hidrolíticas secretadas (exoenzimas)

que apresentam especificidade pelo substrato, atuando sobre proteínas, amidos ou lipídeos,

e constituem um fator de virulência por hidrolisar componentes estruturais de tecidos e

conferir ao microrganismo a capacidade invasora.

Um dos principais alvos desse ataque enzimático é a queratina, uma molécula

protéica fibrosa de alto peso molecular (Vignardet et al., 2001), com uma matriz rica em

cisteína e composta por fortes ligações peptídicas e acetamídicas que garantem estabilidade

para a função de revestimento e proteção (Fraser & Parry, 2005). Esta é produzida apenas

por humanos e outros animais, sendo o principal constituinte de acessórios como a pele,

unhas, cascos e cornos. Outro componente importante encontrado nas paredes celulares e

alvos das enzimas fúngicas são os lipídeos, que em conjunto com diversas proteínas

garantem a forma e maleabilidade da parede celular (Tenchov et al., 2008). Então, frente a

esses componentes, é necessário que os fungos patogênicos regulem sua expressão gênica

para ativar genes durante a infecção, induzindo a síntese e liberação de várias proteases

não específicas, queratinase, lipase, elastase, nuclease, fosfatase, fosfolipase e enzimas

mucinolíticas, dentre outras, para degradar macromoléculas e fazer uso de elementos mais

simples (carbono, nitrogênio, fósforo e enxofre) como fonte de nutrientes.

9

Como os principais componentes da membrana celular são proteínas e

fosfolipídeos, hidrolisados na desestabilização da membrana para a devida instalação dos

fungos invasores (Apodaca & McKerrow, 1989), a secreção de proteases e fosfolipases é

um importante fator de virulência para os dermatófitos no processo de digestão tecidual no

hospedeiro. Essa ação já foi demonstrada em fungos patogênicos, como C. albicans, C.

dubliniense, T. mentagrophytes var. erinacei Penicillium notatum, C. neoformans, A.

fumigatus (Okumura et al., 1980; Ghannoum et al., 1994; Tsushima et al., 1994; Birch et

al., 1996; Muhsin et al., 1997; Fotedar & Al-Hedaithy, 2005; Kadir et al., 2007), sugerindo

que de fato estas enzimas são importantes para a efetivação de determinadas doenças.

Estudos de caracterização fenotípica em diferentes isolados de T. rubrum e M. canis

mostraram a assimilação de diferentes fontes de carbono, sendo todas as cepas capazes de

secretar queratinases, proteinases e fosfolipases (Viani et al., 2001; da Silva et al., 2002).

Atividade lipolítica também foi observada em dermatófitos (E. floccosum, M. canis,

T. mentagrophytes e T. rubrum) após a adição de diferentes fontes de lipídeos em meio

ágar, sendo quantificada a ação de lipases e fosfolipases em espécies do gênero

Trichophyton e Microsporum (Hellgren & Vincent, 1980; Muhsin & Aubaid, 2001). A

produção de lipases e esterases foi demonstrada em testes de plaqueamento em meio sólido

e líquido. Um dos melhores substratos naturais para lipases secretadas é o óleo de oliva.

Tween 60 e 80 também podem ser hidrolizados por dermatófitos (Muhsin & Aubaid,

2001). De acordo com a literatura disponível, ocorrem grandes diferenças na atividade

lipolítica entre as várias espécies e linhagens de dermatófitos, sendo importante salientar

que algumas enzimas que apresentam atividade contra lipídeos podem agir também em

substratos queratinizados e em Sabouraud glucose-peptona devido às atividades mais

abrangentes observadas, como é o caso da fosfolipase A (Shiba et al., 2001; Hong et al.,

2005).

10

Já os transportadores presentes nas membranas que auxiliam na manutenção da

composição citoplasmática de uma célula tanto em relação ao meio extracelular ou às

organelas membranosas, também têm atividades relacionadas à patogenicidade de diversos

organismos e na adaptação às alterações ambientais. Bactérias, leveduras e diversos

fungos, bem como células especializadas de plantas e animais expressam proteínas de

membrana para captação de aminoácidos, dipeptídeos e tripeptídeos (Fan et al., 2002;

Parisot et al., 2002), sendo essenciais para regular a captação de nutrientes no meio,

exclusão de metabólitos secundários ou de substâncias tóxicas.

Com uma gama de mecanismos metabólicos complexos que se interligam para a

ativação da patogenicidade fúngica, é nítida a importância de conhecer mais detalhes acerca da

expressão gênica dos dermatófitos. Utilizando cultivo em meio com proteínas e lipídeos para

avaliar a interferência de diferentes fontes de carbono na expressão de genes ativadores de

virulência e patogenicidade de fungos de interesse biomédico, é possível aprofundar o

conhecimento acerca da adaptação, fisiologia e aspectos moleculares em fungos patogênicos.

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É bem documentado que o pH homeostático governa o crescimento, diferenciação,

fisiologia e viabilidade de todos os seres vivos, e que as células mudam a resposta de

acordo com os fatores abióticos presentes. Os microrganismos possuem a capacidade de

adaptar-se ao pH local modulando sua expressão gênica para ajustes fisiológicos

adequados a cada ambiente. A expressão gênica na célula ocorre de forma coordenada em

resposta a um sinal interno ou externo e dados comprovam que certos mecanismos de

patogenicidade e de resistência a inibidores dependem direta ou indiretamente dos genes

responsáveis pelo monitoramento do pH extracelular (Ferreira-Nozawa et al., 2003; Li,

2004; Ferreira-Nozawa et al., 2006).

11

Os fungos filamentosos A. nidulans e N. crassa são capazes de crescer em várias

condições, mesmo com variações extremas de pH (Rossi & Arst, 1990; Bignell et al., 2005).

Para isto é necessário uma regulação do pH homeostático, a partir do monitoramento do pH

extracelular. Assim, é possível direcionar a síntese de permeases e enzimas secretadas, como

por exemplo, a secreção de fosfatase ácida em meio ácido e fosfatase alcalina em meio alcalino

(Nahas et al., 1982; Ferreira-Nozawa et al., 2003). De Bernadis et al (1998) demonstrou a

relação no controle da expressão dos genes PHR1 e PHR2 de C. albicans com as mudanças no

pH ambiente, sendo estes expressos respectivamente acima e abaixo do pH 5.5. Davis et al

(1999), também identificou linhagens responsivas ao pH ambiente deste mesmo patógeno (De

Bernardis et al., 1998; Davis et al., 2002).

A ativação de várias enzimas proteolíticas liberadas no meio com atividade ótima

em pH ácido, provavelmente porque a pele humana tem um pH levemente ácido, propicia

o início da infecção. As proteinases ativas em meio ácido agem em substratos

queratinizados ou não, liberando peptídeos que são hidrolisados em aminoácidos. Estes

podem reprimir a síntese de proteases inespecíficas e induzir a produção de queratinases

(Apodaca & McKerrow, 1989; Cutler, 1991). De acordo com o modelo proposto por

Martinez-Rossi et al (2004) para a regulação de enzimas proteolíticas em função do pH, o

dermatófito monitora o pH da pele ao iniciar a infecção, desreprimindo proteases não

especificas e queratinases com atividade ótima em pH ácido enquanto reprimem

queratinases efetivas em pH alcalino, gerando polipeptídeos pela digestão tecidual.

Provavelmente, peptidases putativas clivam os polipeptídeos e geram fontes de carbono,

nitrogênio e enxofre para a nutrição do fungo. A captação e metabolismo desses

aminoácidos geram a alcalinização do meio, podendo levar à repressão de enzimas

proteolíticas com ação em pH ácido e ativar queratinases com atividade ótima em pH

alcalino, permitindo que a infecção se instale.

12

Dermatófito

+

-

+

pH ácido da pele

Queratina, proteínas

solúveis, ácidos nucleicos,

etc.

Indução de queratinases e

fosfatases alcalinas,

nucleases, etc.

Indução de proteases e

fosfatases ácidas,

nucleases, etc.

Infecção

Alcaliniz a ção

Aquisição,

metabolização e

sinalização

Aminoácidos, Pi, etc

Polipeptídeos,

oligonucleotídeos, etc.

Peptidases, nucleases

putativas de fungos

Dermatófito

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+

pH ácido da pele

Queratina, proteínas

solúveis, ácidos nucleicos,

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Indução de queratinases e

fosfatases alcalinas,

nucleases, etc.

Indução de proteases e

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Infecção

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Aquisição,

metabolização e

sinalização

Aminoácidos, Pi, etc

Polipeptídeos,

oligonucleotídeos, etc.

Peptidases, nucleases

putativas de fungos

Figura 3: Modelo de infecção proposto para dermatófitos, baseado na regulação de enzimas proteolíticas

secretadas em resposta ao pH ambiente. (Martinez-Rossi et al., 2004).

13

Genes responsivos ao pH já foram isolados em fungos filamentosos (Delgado-

Jarana et al., 2002; Brakhage et al., 2004), sendo a regulação pelo pH descrita

primeiramente em N.crassa (Nahas et al., 1982), quando foi observado que a secreção de

fosfatases ácidas e alcalinas eram dependentes do pH do meio. Em A. nidulans é conhecida

a existência de genes alcalino-específicos e ácido-específicos. Os primeiros genes

envolvidos no sensoriamente do pH ambiente foram identificados em A. nidulans (Caddick

et al., 1986), onde a resposta ao pH é mediada por uma via metabólica constituída pelo

menos por 7 genes. Um deles é o fator de transcrição PacC em fungos, homólogo ao

Rim101 de leveduras (Li, 2004), que apresenta regiões zinc-fingers (Cys2His2) como

domínio que interage com regiões do DNA e atua na ativação da transcrição de genes

alcalino-específicos e conseqüente repressão de genes ácido-específicos (Caddick et al.,

1986). Este modelo determina que a versão íntegra de pacC (PacC

72

) é ativada por

processamento pós-traducional em pH alcalino através de dois passos proteolíticos, nos

quais remove-se o domínio C-terminal. Inicialmente a clivagem forma uma proteína

intermediaria (PacC

53

) que sofre uma proteólise gerando a forma ativa PacC

27

. O pH

ambiente é decisivo para o primeiro passo da síntese do PacC ativo, que é resultado de uma

cascata de sinalização para a correta ativação em pH específico. A interação no domínio C

(entre os resíduos 529 e 678) previne o processamento sob condições inapropriadas de pH

(Flaherty et al., 2003).

Tal sistema de sinalização é composto por seis genes que foram clonados e

seqüenciados: pal A, B, C, F, H e I (Orejas et al., 1995; Maccheroni Jr. et al., 1997;

Denison, 2000; Arst & Penalva, 2003). Arst e Peñalva (2003) propuseram algumas

alterações no modelo de regulação do pH inicialmente proposto por Caddick et al (1986),

sugerindo que os genes palI e palH codificam proteínas transmembranas que funcionariam

como sensores do pH externo (Peñalva & Arst, 2002). Já o produto do gene palB geraria

14

uma calpaína (cisteína protease) responsável pelo reconhecimento do sinal que envia sinal

intracelular que efetiva a clivagem do fator de transcrição pacC em sua forma ativa,

removendo então a porção de 180 aminoácidos na região C-terminal (Diez et al., 2002). A

ativação da transcrição de genes alcalino-específicos ocorre pelo reconhecimento de

elementos cis na região promotora desses genes, enquanto que a repressão de genes ácido-

específicos ocorre por inibição competitiva quando o pacC se sobrepõe ao sítio promotor e

previne a ligação do fator de ativação intA (Denison et al., 1995; Tilburn et al., 2005).

Essa resposta em pH alcalino é crucial mas parece ocorrer apenas após a transcrição, uma

vez que não há evidências de que os genes pal sejam regulados pelo pH (Maccheroni Jr. et

al., 1997; Diez et al., 2002; Rollins, 2003).

A via de sinalização pelo pacC regula muitos eventos metabólicos envolvidos no

sensoriamento do pH extracelular em diferentes níveis. Além da regulação do gene pacC,

os elementos desta via também atuam na glicosilação dependente de pH de fosfatases

secretadas por determinadas linhagens fúngicas, alterando o nível de carboidratos ligados

as fosfatases ácidas e alcalinas, dependendo do pH ambiente (Nozawa et al., 2003). A

ativação da transcrição de genes alcalinos pela proteína pacC foi demostrada

experimentalmente para a síntese e secreção da Penicilina em A. nidulans, que ocorre

preferencialmente em pH alcalino envolvendo um conjunto interligado de genes. Foram

descritas mutações nos genes pal (A, B, etc), com alterações como o aumento dos níveis de

fosfatases ácidas e a diminuição das fosfatases alcalinas quando o pH extracelular se

encontrava neutro. Entretanto, mutação com remoção do gene pacC foi caracterizada por

fenótipo semelhante ao crescimento em pH ácido (Tilburn et al., 1995).

T. rubrum codifica uma proteína homóloga ao regulador transcricional pacC (A.

nidulans) / Rim101p (C. albicans) da conservada via de sinalização do pH, tipo zinc-finger

cuja transcrição é auto-induzida em meio de cultivo com pH alcalino. O gene pacC de T.

15

rubrum foi clonado, seqüenciado e nocauteado, conforme descrito por Ferreira-Nozawa et

al (2006). Experimentos realizados com a linhagem mutante pacC-1 teve a sua capacidade

infectante reduzida quando cultivada em fragmentos de unha humana, correlacionando

com a diminuição acentuada da atividade queratinolítica no meio de cultivo liquido

suplementado com queratina. As habilidades de crescimento e capacidade queratinolítica

foram comparadas com os resultados na linhagem selvagem H6, sendo evidente a

diferença. Estes resultados sugerem que o desenvolvimento em queratina e a conseqüente

degradação desta proteína típica de regiões infectadas pelo dermatófito T. rubrum está de

alguma forma sob regulação do gene pacC, interferindo na secreção de proteases com

ótima atividade em pH alcalino, necessárias para a manutenção da infecção.

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Os fungos patogênicos são responsáveis pela maioria das doenças infecciosas em

animais e plantas. Devido ao grande número de espécies fúngicas patogênicas, é crescente

o interesse em abordagens para estudo de fisiologia, morfologia e análise genética, visando

o aprofundamento de conhecimentos gerais e específicos que podem auxiliar na

formulação de novas estratégias terapêuticas, para um ataque mais efetivo ao dermatófito.

Um dos problemas no tratamento de infecções fúngicas é a ocorrência de linhagens

resistentes a agentes antifúngicos encontrados no mercado, dificultando tratamentos e

elevando os custos dos mesmos.

Com a emergência da AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida; SIDA em

inglês) e o advento da terapia com antibióticos de largo espectro, bem como o tratamento

de pacientes com doenças metabólicas crônicas, neoplásicos e transplantados com agentes

citotóxicos e imunossupressores, tornou-se pouco clara a diferença entre fungos

contaminantes e patogênicos (classicamente os agentes de micoses superficiais,

16

subcutâneas e profundas) (Surjushe et al., 2007; Seebacher et al., 2008). Agentes como

Aspergillus, Candida e Cryptococcus, considerados antigamente como contaminantes de

laboratório e, portanto, de pouca importância clínica, são agora conhecidos como

causadores de doenças disseminadas em pacientes imunodeprimidos, como endocardites e

infecções pulmonares (Sidrim & Rocha, 2004). Nessa nova conjuntura, os dermatófitos

também se tornaram mais agressivos.

O uso repetido de antifúngicos no tratamento ou prevenção de infecções causadas

por fungos e na preservação de alimentos e sementes leva freqüentemente à ineficiência

dos antimicóticos, devido ao surgimento ou seleção de linhagens fúngicas resistentes, com

graves conseqüências econômicas e sociais. Esse efeito ameaça a saúde pública e dificulta

tratamentos ao elevar os custos dos mesmos. Ademais, existem poucas classes químicas de

antifúngicos disponíveis comercialmente e com um número de alvos limitados: o

ergosterol e as enzimas de sua síntese, a síntese de ácidos nucléicos e da parede celular

(DiDomenico, 1999). O ergosterol é o principal esterol da membrana plasmática do fungo,

contribui para a fluidez e integridade da membrana e para o funcionamento adequado de

enzimas da própria membrana celular, incluindo a quitina sintetase, uma enzima envolvida

no crescimento e divisão celular (Georgopapadakou & Walsh, 1994; Sarifakioglu et al.,

2007). A resistência à drogas já foi documentada para todos antifúngicos largamente

empregados em terapias, havendo uma necessidade crescente por novos antifúngicos de

largo espectro de ação (Sarifakioglu et al., 2007). É importante salientar que o fato da

baixa diversidade em relação às classes de antimicóticos pode ser também um indício da

existência de diferenças ainda não exploradas, entre o patógeno e o hospedeiro, que podem

ser utilizadas no desenvolvimento de novas substâncias para interferir em funções

essenciais dos fungos (Pena-Muralla, 2002).

17

Hashimoto & Blumenthal (1978) relataram, já na década de 70, resistência a

nistatina pela espécie T. mentagropytes. No caso do T. rubrum, nos últimos anos alguns

estudos foram realizados a respeito dos mecanismos de resistência a drogas e de outros

processos que ocorrem durante a infecção (Hashimoto & Blumenthal, 1978; Fachin et al.,

2006; Maranhão et al., 2007; Paião et al., 2007; Coelho et al., 2008; Martinez-Rossi et al.,

2008; Segato et al., 2008). Entretanto, a busca de dados que auxiliem no desenvolvimento

de novas drogas e na identificação e caracterização de novos alvos terapêuticos a partir de

um criterioso estudo de genômica funcional ainda é constante e necessária, sendo crucial

um maior entendimento da biologia dos fungos patogênicos, seja quanto à fisiologia ou aos

aspectos moleculares e sistemas de adaptação a diferentes condições de estresse ambiental,

assim como aprofundar o conhecimento das interações patógeno-hospedeiro.

Após o advento da Genômica Estrutural, estudos de seqüenciamento de ESTs

(Expressed Sequence Tags) foram conduzidos em diversos organismos para identificar as

populações de mRNA expressas em determinadas condições ou etapas do desenvolvimento

(transcriptoma) (Bouzidi et al., 2007; Schumacher et al., 2008), e o desenvolvimento

desses projetos propiciou o surgimento de melhores metodologias que tornaram as análises

da expressão gênica mais apuradas, como por exemplo com novas técnicas de hibridização

subtrativa, SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) e microarrays (Kasuga et al., 2005;

Kronstad, 2006; Poggeler et al., 2006).

Esta abordagem utilizando ESTs mostrou-se versátil, considerada rápida e

econômica para identificar genes, e vem sendo cada vez mais utilizada para anotação de

seqüências completas genômicas de organismos eucariotos, pois podem dar evidências

biológicas para a previsão de centenas de genes (baseada em seqüências heterólogas) ou

podem indicar a presença de novos genes preferencialmente expressos em certos tecidos ou

células de organismos multicelulares (Franco et al., 1995). Hoje, mais de dez milhões de

18

ESTs estão disponíveis no banco de dados de ESTs (dbEST) do GenBank e auxiliam nessa

busca por dados moleculares no estudo do metabolismo fúngico (Tugendreich et al., 1993).

A nossa proposta de estudo da biologia do T. rubrum com ênfase na funcionalidade de

alguns genes, como os potencialmente envolvidos na sua patogenicidade, é de interesse

geral da comunidade científica, e a divulgação dos resultados representará um grande

avanço nesta área.

É

PRECISO NÃO ESQUECER NADA

É preciso não esquecer nada:

nem a torneira aberta nem o fogo aceso,

nem o sorriso para os infelizes

nem a oração de cada instante.

É preciso não esquecer de ver a nova borboleta

nem o céu de sempre.

O que é preciso é esquecer o nosso rosto,

o nosso nome, o som da nossa voz, o ritmo do nosso pulso.

O que é preciso esquecer é o dia carregado de atos,

a idéia de recompensa e de glória.

O que é preciso é ser como se já não fôssemos,

vigiados pelos próprios olhos severos conosco,

pois o resto não nos pertence.

C

ECÍLIA MEIRELES

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Tendo em vista a importância clínica do dematófito T. rubrum devido à necessidade

de controle epidemiológico, desenvolvimento de novos antifúngicos e de um maior

entendimento acerca do metabolismo do mesmo, o presente trabalho teve como objetivo

geral identificar genes diferencialmente expressos em função de nutrientes específicos e do

pH de cultivo, visando caracterizar genes possivelmente envolvidos na fixação e

manutenção do processo infeccioso por este patógeno no hospedeiro. Sendo assim, foram

delimitados os seguintes objetivos específicos:

• Cultivar o T. rubrum em meio contendo componentes celulares característicos

de tecidos epidérmicos (queratina e lipídeos) para avaliar a capacidade de

crescimento e possíveis alterações na expressão gênica.

• Isolar genes diferencialmente expressos das linhagens de T. rubrum tratadas nas

condições descritas através de técnicas de expressão diferencial, principalmente

Biblioteca Subtrativa Supressiva;

• Clonar as seqüências de cDNAs diferencialmente expressas e identificar genes

cujos produtos estejam envolvidos no metabolismo, secreção enzimática e

obtenção de nutrientes no tecido hospedeiro;

• Usar ferramentas bioinformáticas para análises comparativas entre os

transcriptomas de T. rubrum (nas condições ensaiadas) e de outros fungos

patogênicos;

• Selecionar genes diferencialmente expressos e que sejam relevantes para a

virulência e/ou patogenicidade de T. rubrum e validar por northern blot.

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A linhagem H6 de T. rubrum (ATCC MYA – 3108), isolada de paciente do sexo

feminino acometida de tinea pedis no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto (FMRP-USP), foi a principal cepa utilizada neste estudo. A H6 foi

identificada por métodos morfológicos e bioquímicos padrões (McGinnis, 1980), e cedida

pela Dra. Cláudia M. Leite Maffei do Setor de Micologia do Departamento de Biologia

Celular Molecular e Bioagentes Patogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,

USP. O estoque da linhagem H6 de T. rubrum foi mantido em placas de Petri contendo

meio Ágar Dextrose Sabouraud, com repiques periódicos, e armazenados em estufa

climatizada a 28ºC. Morfologicamente em meio Sabouraud, a linhagem apresenta colônias

brancas de aspectos cotonoso e denso, com o reverso sem pigmentação devido às

sucessivas repicagens, além de conídios claviformes.

Outra linhagem utilizada no nosso trabalho foi a CBS118892, de T. rubrum, cedida

pelo Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS Holanda) e alvo de futuro

seqüenciamento através de consórcio internacional, tendo sido utilizada para a obtenção de

cDNAs subtraídos após crescimento em fonte lipídica. As linhagens mutantes ∆pacC-1 e

∆TruMDR2 de T. rubrum, obtidas após disrupção gênica do gene regulatório pacC e no

transportador MDR, respectivamente (Fachin et al., 2006; Ferreira-Nozawa et al., 2006),

também foram utilizadas para experimentos de northern blots e infecção in vitro.

21

3.1.2.

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Para a propagação de plasmídeos recombinantes (pGEM

®

-T) durante as etapas de

clonagem, foram utilizada células competentes pMOS Blue de Escherichia coli, que

apresentam a seguinte constituição genotípica: endA1, hsdR17 (r

k12

-m

k12

) supE44, thi-1,

recA1, gyrA96, relA1, lac [F’, pro A

+

B

+

, lac 1

q

Z∆M15, Tn10 (Tc

R

)].

Para a manutenção, E. coli foi cultivada em meio LB líquido com tetraciclina (15

µg/mL) por 12 a 24 horas a 37 °C. Após preparar alíquotas de 1 mL e adição de glicerol

estéril (70%), foram estocadas a -80 ºC para descongelamento de alíquotas apenas no

momento do uso.

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Solução de sais 20 mL

Água destilada (q.s.p) 1000 mL

O meio mínimo foi suplementado com glicose (55 mM) e nitrato de sódio (70 mM),

com o pH ajustado em 6,8 não tamponado. O meio foi autoclavado a 1 atm de pressão e

120 °C por 20 minutos.

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)

Glicose

20 g

Peptona

10 g

Água destilada (q.s.p.)

1000 mL

O pH do meio foi ajustado para 5,7. O meio foi autoclavado a 1 atm de pressão a 120

°C por 20 minutos, tendo sido adicionado agar 1,5% para o preparo do meio sólido.

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8

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)

Triptona 10g

Extrato de levedura 5g

Cloreto de potássio 0,2g

Cloreto de sódio 0,6g

Água destilada (q.s.p.) 1000 mL

O pH do meio foi ajustado para 7,4. O meio foi autoclavado a 1 atm de pressão e

120 °C por 20 minutos. Para o preparo do meio sólido foi adicionado ágar para uma

concentração final de 1,5% (m/v).

3

.

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0

,

2

5

%

)

Queratina (Promega)

2,5g

Água destilada (q.s.p.)

1000 mL

O pH do meio foi ajustado para 5,0, não tamponado. O meio foi autoclavado a 1

atm de pressão e 120 °C por 20 minutos.

3

.

3

.

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Borato de sódio decahidratado

40 mg

Sulfato de cobre pentahidratado

400 mg

Sulfato de ferro heptahidratado

532 mg

Sulfato de manganês monohidratado

292 mg

Molibdato de sódio bihidratado

800 mg

Sulfato de zinco heptahidratado

2 g

Água destilada esterilizada (q.s.p.)

250 mL

Solução foi mantida sob clorofórmio a 4 °C.

23

3

.

3

.

2

.

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1

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6

)

Cloreto de potássio

26 g

Sulfato de magnésio heptahidratado

26 g

Fosfato de potássio monobásico

76 g

Solução de elementos-traço

50 mL

Água destilada esterilizada (q.s.p.)

1000 mL

Solução foi mantida sob clorofórmio a 4 °C.

3

.

4

.

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,

1

9

8

9

)

A água destilada necessária para o preparo de todas as soluções utilizadas na

extração de RNA e elaboração do gel desnaturante, bem como na lavagem de material de

uso exclusivo para o RNA, evitando a contaminação com RNase, teve a adição de 0,1%

(v/v) de DEPC (Dietilpirocarbonato). Esta solução foi incubada a 37 °C por 18-20 horas

com leve agitação, sendo autoclavada em seguida por 30 minutos, a 1 atm de pressão e 120

°C.

3

.

4

.

1

.

2

.

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.

,

1

9

8

9

)

A agarose foi dissolvida em água tratada com DEPC (1,5 %) por aquecimento, e

após leve resfriamento foram adicionadas as seguintes soluções: Formaldeído e tampão de

corrida MOPS 5X. As quantidades são de acordo com o volume do aparato eletroforético e

a concentração de agarose necessária.

Após a solidificação do gel, as amostras (5 µL) foram preparadas com 10 µL de

“Loading Buffer para RNA”, as mesmas foram denaturadas através de incubação a 65 °C

por 15 minutos e colocadas imediatamente no gelo para resfriamento. A seguir, as

24

amostras foram aplicadas no gel e submetidas à eletroforese por 4 V/cm em tampão de

corrida MOPS 1x.

3

.

4

.

1

.

3

.

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Água DEPC

930 µL

MOPS 10X

150 µL

Formamida

240 µL

Glicerol

100 µL

Azul de Bromofenol

80 µL

Brometo de etídio

5 µL

Solução preparada em tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e estocada a -20 ºC.

Preparado com água livre de RNAse (DEPC) e mantido em frasco escuro à temperatura

ambiente.

3

.

4

.

1

.

4

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MOPS (3-(N-morpholino) propanesulphonic acid) pH 7,0 100 mM

Acetato de sódio 40 mM

EDTA pH 8,0 5 mM

Preparado com água livre de RNAse (DEPC), o pH ajustado para 7.0 e mantido em

frasco escuro à temperatura ambiente.

3

.

4

.

1

.

6

.

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,

1

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)

Tris-base 242 g

Ácido acético glacial 57,1 mL

EDTA 0,5M 100 mL

Água destilada (q.s.p) 1000 mL

O pH foi ajustado para 8,0 e a solução autoclavada a 1 atm de pressão e 120 °C por

20 minutos.

25

3

.

4

.

2

.

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4

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2

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1

.

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I

Glicose 50 mM

Tris-HCl 25 mM

EDTA pH 8,0 10 mM

O pH foi ajustado para 8,0 e a solução foi autoclavada a 1 atm de pressão e 120 °C

e estocada a 4 °C.

3

.

4

.

2

.

2

.

S

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I

SDS 1% (m/v)

Hidróxido de sódio 0,2 M

A solução de SDS foi autoclavada separadamente e o NaOH foi adicionado no

momento do uso.

3

.

4

.

2

.

3

.

S

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I

Acetato de potássio 60 mL

Ácido acético glacial 11,5 mL

Água destilada (q.s.p.) 100 mL

O pH foi ajustado para 8,0 e a solução foi autoclavada a 1 atm de pressão e 120 °C

e estocada a 4 °C.

3.4.3.

S

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3

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Hidróxido de sódio

0,5 M

Cloreto de sódio

1,5 M

Solução autoclavada a 1 atm de pressão e 120 °C por 20 minutos e mantida à

temperatura ambiente.

26

3

.

4

.

3

.

2

.

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Tris-base pH 7,4 1,0 M

Cloreto de sódio 1,5 M

Solução autoclavada a 1 atm de pressão e 120 °C por 20 minutos e mantida à

temperatura ambiente.

3

.

4

.

3

.

3

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Cloreto de sódio 175,3 g

Citrato de sódio 88,2 g

Água destilada (q.s.p.) 1000 mL

Solução autoclavada a 1 atm de pressão e 120 °C por 20 minutos e mantida à

temperatura ambiente.

3

.

4

.

3

.

4

.

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Dextran Sulfato 5 g

SSC 20X 25 mL

SDS 10% (m/v) 1 mL

Líquido bloqueador 5 mL

Água deionizada (q.s.p.) 100 mL

3

.

4

.

3

.

5

.

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EDTA pH 8,0 1 mM

SDS 5%

Tampão fosfato de sódio pH 7,5 40 mM

3

.

4

.

3

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6

.

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SDS 0,1%

Tampão fosfato de sódio pH 7,5 40 mM

27

3

.

4

.

3

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Tris-HCl 10 mM

EDTA pH 8,0 1 mM

3

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4

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4

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EDTA 0,5 M 1 mL

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17,45 g

H

3

PO

4

85% 1 mL

Caseína 1% hidrolisada 5 g

SDS 35 g

Água deionizada (q.s.p.) 500 mL

3

.

4

.

4

.

2

.

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SSC 20 x 100 mL

SDS 10% 20 mL

Água deionizada (q.s.p.) 1000 mL

3

.

4

.

4

.

3

.

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I

SSC 20 x 2,5 mL

SDS 10% 5 mL

Água deionizada (q.s.p.) 1000 mL

28

3

.

4

.

5

.

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As soluções, oligonucleotídeos, adaptadores e tampões utilizados nestas

metodologias estão descritas ou acompanham os kits SMART

TM

PCR cDNA Synthesis Kit

e PCR Select cDNAs subtraction kit (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA).

3

.

4

.

6

.

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4

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6

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1

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1

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9

)

A solução estoque de X-gal foi preparada em N, N-dimetilformamida na

concentração de 20 mg/mL. Esta solução foi mantida a -20 °C em frasco escuro para evitar

a fotodegradação.

3

.

4

.

6

.

2

.

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,

1

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9

)

A solução estoque de IPTG foi preparada dissolvendo-se IPTG na concentração de

1 M em água destilada esterilizada, sendo aliquotada e mantida a -20 °C.

3

.

5

.

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Após cultivo em meio Sabouraud Ágar (Eto et al.) por 15 dias a 28 ºC, a linhagem

H6 de T. rubrum teve o micélio coletado com espátula estéril e depositado em tubos

contendo solução salina (0,9%) estéril, suplementada com 0,01% de Tween 80 (v/v) para

facilitar a liberação dos conídios. O material foi agitado vigorosamente para desagregar a

massa conidial, com posterior filtração em lã de vidro e centrifugação por 10 minutos. O

precipitado formado foi ressuspendido em solução salina estéril, obtendo assim um

concentrado de conídios estimado em câmara de Neubauer e usado na etapa seguinte.

29

3

.

6

.

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A suspensão de conídios foi transferida para 100 mL de meio Sabouraud líquido

(Eto et al.) e mantida sob agitação por 72 horas a 28 ºC para estimular a germinação dos

conídios e a formação de hifas. Após esse período, o micélio obtido foi filtrado em papel

esterelizado Whatman (Whatman International, Maidstone, UK) e dividido

igualitariamente em diferentes erlenmayers contendo 100 mL de meio mínimo (Cove et

al., 1966) com pH inicial 5,0, parte deles contendo queratina (2,5 g/L) (Invitrogen), e outra

parte glicose (55 mM) como únicas fontes de carbono, ambas suplementadas com fonte de

nitrogênio (solução de nitrato a 70 mM). Os frascos foram mantidos a 28 ºC sob agitação

por diferentes períodos (6 h; 12 h; 24 h; 48 h; 72 h e 7 dias). Após determinado período de

incubação nos meios contendo queratina, lipídeo ou glicose, o micélio resultante foi

filtrado em papel Whatman num sistema à vácuo e estocado a -80 ºC até a etapa de

extração de RNA total. O cultivo em meio contendo glicose foi utilizado como controle da

indução gênica em relação aos experimentos com as outras fontes de carbono (Teste 1 e

teste 2). Para controles negativos, os meios de cultivo correspondentes foram incubados

sem inóculos. Ao final de todos os experimentos, o pH final dos meios foi aferido para

registrar possíveis alterações durante o cultivo.

3

.

6

.

1

.

2

.

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A suspensão de conídios foi processada como descrito acima, dividindo o material

final retirado do meio SAB em diferentes erlenmayers contendo 100 mL de meio mínimo

(Cove et al., 1966) com pH inicial 5,0, parte deles contendo azeite de oliva (1 %) como

fonte lipídica, e outra parte glicose (55 mM), únicas fontes de carbono, ambas

30

suplementadas com fonte de nitrogênio (solução de nitrato a 70 mM). Os frascos foram

mantidos a 28 ºC sob agitação por 72 h. O micélio resultante foi filtrado em papel

Whatman num sistema à vácuo e estocado a -80 ºC até a etapa de extração de RNA total.

Ao final de todos os experimentos, o pH final dos meios foi aferido para registrar possíveis

alterações durante o cultivo.

3

.

6

.

2

.

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Inicialmente, todo o material necessário para a extração de RNA total foi tratado

com solução de NaOH 0,5 N e enxaguado com água livre de RNase. Esta etapa foi

realizada com o RNA Isolation Kit - Gentra System

®

ou Trizol

®

reagente (Invitrogen), este

último adotado durante experimentos de northern blot. Para a extração com o Kit Gentra

System

®

, os micélios de T. rubrum tratados separadamente em diferentes condições foram

pesados individualmente (100 mg) e macerados para homogeneização na solução de lise

celular (3 mL), adicionando-se em seguida 1 mL da solução de precipitação de proteína-

DNA. Após 5 minutos de incubação e 3 minutos de centrifugação, o material resultante foi

precipitado com 3 mL de isopropanol e após centrifugação, lavado com 1 mL de etanol

70% para a última etapa de centrifugação e o descarte do sobrenadante. A secagem foi feita

à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, o material final contendo RNA foi

ressuspendido em 30 µL de água livre de RNase e estocado a -80 ºC. Na extração com o

Trizol

®

, os micélios foram separadamente macerados com o reagente (100 mg de cada) em

suporte adequado contendo nitrogênio líquido, sendo o RNA total de cada amostra isolado

de acordo com as instruções do fabricante e estocado a -80 ºC.

Todas as amostras de RNA total foram tratadas com a enzima DNase, adicionando-

se os seguintes reagentes a 10 µL de cada amostra: 1 µL de tampão da DNase I (10x) ; 1

µL de DNase I Amp Grade (1U/µL); 15µL de água livre de RNase (q.s.p.). A concentração

31

de RNA da amostra foi determinada em GeneQuant

TM

calculator (Amersham Biosciences),

pela absorbância das preparações a 260 nm, utilizando como valor padrão, 1A

260

= 40

µg/mL de RNA, e o grau de pureza avaliado através das razões A

260

/A

280

, que deve ser

próxima a 2,0. A qualidade dos RNAs também foi observada através de fracionamento em

gel de agarose (1,5%) com formaldeído por 4 V/cm em tampão MOPS 1X, após

desnaturação a 65 ºC em tampão de corrida apropriado. O preparo do gel foi efetivado de

acordo com Sambrook et al. (1989), sendo o resultado final documentado em sistema

digital Kodak

®

e todas as amostras estocadas a -80 ºC até o momento do uso.

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O RNA poli (A) foi obtido pela utilização do kit PolyA Tract Isolation System

(Promega) a partir de 5 mg de RNA total, inicialmente incubado a 65 ºC por 10 minutos,

em seguida sendo adicionado 10 µL de sonda oligo (dT) biotinilada e 60 µL de SSC 20x. A

mistura foi homogeneizada e conservada à temperatura ambiente até o resfriamento. Todo

o conteúdo foi misturado a streptavidin-paramagnetic particles (AS-PMPs) previamente

lavados com SSC 20x e incubados por 10 minutos à temperatura ambiente, misturando-se a

cada 2 minutos. As AS-PMPs foram capturadas pela ação de uma estante magnética para

que o sobrenadante fosse cuidadosamente removido, sendo as partículas lavadas 4 vezes

com SSC 0,1x. O precipitado de AS-PMPs foi ressuspendido em 1 mL de água livre de

RNase. Novamente foi utilizada a estante magnética para capturar as AS-PMPs e o RNA

poli (A) eluído foi transferido para novos tubos estéreis. A concentração do RNA poli (A)

isolado foi determinada por espectrofotômetro e a sua integridade verificada em gel de

agarose desnaturante (1%) com formaldeído como descrito anteriormente.

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Esta metodologia visa a comparação entre duas populações de cDNAs oriundos de

diferentes fontes, permitindo a identificação de um conjunto de genes que se expressam em

uma condição específica de teste. A geração de cDNA dupla fita e a construção das

bibliotecas foram efetivadas utilizando-se o SMART

TM

PCR cDNA Synthesis Kit e o PCR

– Select cDNA Subtraction

®

kit (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA),

respectivamente, tendo como testes os cDNAs obtido a partir da linhagem H6 cultivada em

meio na presença de queratina (1) (Forward) e lipídeo (2), e como controle a mesma

linhagem cultivada em glicose. Foi realizada uma segunda hibridização supressiva

invertendo as condições teste 1 e controle para que o produto final fosse utilizado nos

experimentos de confirmação.

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Os RNAs extraídos de T. rubrum obtidos a partir de micélio tratado nas diferentes

condições descritas anteriormente (testes e controle) foram usados para síntese de cDNAs

através do kit SMART

TM

PCR cDNA Synthesis Kit, conforme instruções do fabricante,

baseando-se na transcrição reversa a partir do RNA total e a amplificação dos cDNAs

gerados. O kit faz uso da atividade transferase terminal da enzima transcriptase reversa

(RT) para ancorar iniciadores na região 5’ terminal de todos os cDNAs sintetizados,

gerando sítios de ligação para o primer poli (T) específico usado na síntese da primeira fita.

Ao chegar à porção 5’ final do RNAm, a enzima catalisa a adição de uma pequena região

de citosinas na fita de cDNA sintetizada, devido ao fato do kit apresentar um iniciador que

contem uma região rica em guaninas, anela com o poli (C) adicionado e passa a servir

33

como molde para a RT. A reação para síntese da primeira fita de cDNA foi realizada da

seguinte forma:

RNA total 1 µg (1-3 µL)

3’BD Smart CDS Primer IIA (12 µM) 1 µL

BD Smart IIA oligonucleotide (12 µM) 1 µL

Água deionizada estéril (q.s.p.) 5 µL

As amostras foram incubadas a 72 ºC por 2 minutos, resfriadas em gelo e

centrifugadas rapidamente. Em seguida, foram adicionados os reagentes a cada amostra:

5x First-strand Buffer 2 µL

DTT (20 mM) 1 µL

dNTP Mix (10 mM de cada dNTP) 1 µL

BD Power Script reverse transcriptase 1 µL

Após a incubação durante 1 hora a 42 ºC, as amostras foram diluídas com 40 µL de

TE e estocadas a -20 ºC, ou utilizadas imediatamente para a geração da segunda fita do

cDNA.

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A 2ª fita foi sintetizada através de reação de cadeia da polimerase à longa

distância (Long Distance PCR; LD-PCR), uma etapa que necessita de otimização dos

números de ciclos para cada amostra, evitando que teste e controle cheguem ao “platô” da

reação para manter as diferenças quantitativas de cada cDNA diferencialmente expresso.

Foi utilizada uma amostra diluída de cada tubo da primeira reação e adicionados os

reagentes descritos abaixo:

34

10x BD advantage 2 PCR 10 µL

50x dNTP (10m mM de cada dNTP) 2 µL

5’PCR Primer IIA (12 ) 2 µL

50x advantage 2 Polymerase Mix 2 µL

Água deionizada estéril (q.s.p.) 74 µL

As amostras foram submetidas ao termociclador aquecido a 95 ºC por 2 minutos,

com a seguinte ciclagem: 95 ºC (15’’); 65 ºC (30’’); 68 ºC (6’); 4 ºC (∞), com o número de

ciclos determinado para cada amostra na padronização. Os produtos de PCR foram

visualizados em gel de agarose 1,2% corado com brometo de etídio e corrido em tampão

TAE 1x.

Figura 4:

Representação esquemática da síntese de cDNA fita dupla a partir do Kit SMART

®

da Clontech.

35

Tabela 1: Sequência dos oligonucleotídeos para uso na RT-PCR

Tipo Sequência

3' SMART™ CDS Primer II A 5´ AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30) VN 3`

5' PCR Primer II A 5´AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3´

Smart II™ A oligonucleotídeo 5´ AAGCAGTATGGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG 3`

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O produto final da amplificação foi purificado em colunas CHROMA SPIN-

1000, seguindo as instruções contidas no SMART PCR cDNA Synthesis Kit User Manual.

Para isso, em cada amostra foi adicionado igual volume de Fenol: Clorofórmio: Álcool iso-

amílico (25:24:1) para uma vigorosa agitação e centrifugados a 20.817 g por 10 minutos. A

fase superior foi removida e transferida para um novo tubo estéril contendo 700 µL de N-

butanol, seguidos de leve homogeneização e centrifugação por 1 minuto a 20.817 g.

Posteriormente a fase orgânica (superior) foi retirada e o material concentrado (cerca de

40-70 µL) aplicado nas colunas de cromatografia CHROMA SPIN-1000 (teste e controle

separadamente) para ressuspensão e subsequentes aplicações de tampão TNE 1x. Após

averiguar o material em gel de agarose 1,2 % corado com brometo de etídio, as amostras

de cDNAs purificadas foram quantificadas em espectrofotômetro (260 nm) considerando-

se o valor padrão 1A

260

= 50 µg/mL de DNA.

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Cada amostra purificada foi digerida com a enzima RsaI (Invitrogen), com

objetivo de normalizar o tamanho dos fragmentos e gerar sítio de ligação para os

adaptadores (1 e 2R) na etapa seguinte. A reação abaixo foi efetivada para a digestão:

36

Tampão de restrição da enzima (10x) 40 µL

RsaI (10U/µL) 1,5 µL

cDNA fita dupla 320 µL

Água Milli-Q® (q.s.p.)

400 µL

A digestão foi incubada a 37 ºC por 3 horas. Separou-se 5 µL da reação para a

análise da eficiência da digestão em gel de agarose 1,5% (m/v), sendo adicionados ao

restante das reações separadamente 2,5 µL do Mix EDTA/Glicogênio 20X. Cada amostra

digerida foi purificada utilizando-se o kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE

Healthcare).

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A amostra de cDNA teste purificada foi dividida em dois tubos diferentes para a

ligação dos adaptadores 1 e 2R, ou seja, apenas nas moléculas de cDNA diferencialmente

expressas na condição testada (queratina ou lipídeo). Cada um desses adaptadores

apresenta uma seqüência diferente que funciona como sítio para anelamento de um

iniciador, e uma única extremidade fosforilada para permitir a ligação nos fragmentos de

cDNA. Esta etapa é fundamental para o funcionalmento adequado da etapa seguinte de

subtração. Para isso a reação foi realizada adicionando-se os seguintes componentes:

Reagentes Tubo 1

(adaptador 1)

Tubo 2

(adaptador 2R)

Água deionizada 3µL 3 µL

Tampão de ligação 2 µL 2 µL

T4 DNA ligase 1 µL 1 µL

cDNA tester diluído (1:5) 2 µL 2 µL

Adaptador 1 2 µL ─

Adaptador 2 ─ 2 µL

Volume final 6 µL 6 µL

37

As diferentes alíquotas foram incubadas a 16 ºC por 18 horas e a reação

interrompida acrescentando-se 1 µL do Mix EDTA/Glicogênio (20x), seguida de

incubação a 72 ºC por 5 minutos para inativação da T4 DNA ligase.

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Uma vez com os adaptadores 1 e 2R foram ligados aos cDNAs das amostras

teste, seguiu-se para o início das hibridizações subtrativas. Na primeira hibridização os

cDNAs de todas as amostras foram desnaturados a 98 ºC, sendo adicionado cDNA controle

em excesso a cada tubo de amostra teste com seus devidos adaptadores e subseqüente

diminuição da temperatura para 68 ºC durante 8 horas, permitindo a renaturação de parte

das amostras. As moléculas mais abundantes se anelam com mais facilidade e há formação

de 5 tipos diferentes de moléculas: (1) cDNA teste não hibridizado; (2) cDNA teste

hibridizado com moléculas iguais; (3) cDNA teste hibridizado com cDNA controle; (4)

cDNA controle hibridizado com moléculas iguais ou (5) somente cDNA controle, livre de

hibridização. Ou seja, as moléculas comuns de cada tubo teste se hibridizam, separando

esses cDNAs que não são de interesse no estudo. Para a realização desta etapa, 1,5 µL de

cada tubo (Teste com adaptador 1 e teste com adaptador 2R) foi separada para adição de:

cDNA controle digerido com RsaI (desnaturado – 98ºC por 1’30’’) 1,5 µL

Tampão de hibridação 4x 1 µL

Água deionizada (q.s.p.) 4 µL

Na segunda etapa, ocorre a junção dos materiais oriundos da primeira

hibridização (amostras com diferentes adaptadores contidas nos tubo 1 e tubo 2) que foram

hibridizadas antes separadamente, com a adição de amostras controle em excesso e

desnaturadas e posterior incubação a 68 ºC por 18 horas. Após esta incubação, foi

38

adicionado 100 µL de tampão de diluição e a amostra aquecida a 68 ºC por 7 minutos,

tendo sido estocada a -20 ºC até o momento do uso. Essa etapa diminui o background, e

apenas as moléculas de cDNA fita simples diferencialmente expressas podem se associar,

formando novos híbridos. Esses novos híbridos são cDNAs fita-dupla com diferentes

seqüências nas extremidades que correspondem aos diferentes adaptadores ligados. A

reação foi feita como descrita abaixo:

cDNA teste 1 e 2R (1,5 µL de cada cDNA) 3 µL

cDNA controle digerido com RsaI (desnaturado a 98ºC por 1’30’’) 1,5 µL

Tampão de hibridação 4x 1 µL

Água deionizada (q.s.p.) 4 µL

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Após as duas hibridizações, o material foi submetido a uma primeira reação de

PCR com um único tipo de iniciador para amplificar apenas os cDNAs diferencialmente

expressos, excluindo por exemplo as seqüências sem adaptadores ou com adaptadores

únicos. Neste caso, o iniciador é único para as seqüências das extremidades mais externas

dos cDNAs que possuem diferentes adaptadores. Então, foi realizada uma amplificação

exponencial com o cDNA da reação anterior diluído (1:100), de acordo com os seguintes

parâmetros:

Tampão da Taq 10x 2,5 µL

MgCl

2

50mM 1,5 µL

dNTP (1,25mM) 4 µL

Oligonucleotídeo 1 (10µM) 1 µL

cDNA diluído 3 µL

Taq polimerase (5U/ µL) 0,5 µL

Água deionizada (q.s.p.) 25 µL

39

Foi realizada uma incubação (5 minutos) antes do programa de ciclagem para que

os adaptadores fossem estendidos, gerando um adequado sítio para o iniciador, sendo

submetidos ao seguinte programa no termociclador: 94 °C (30’’); 66 °C (30’’); e 72 °C

(1’30’’) por 30 ciclos.

Após a diluição da reação anterior (3 µL de cDNA em 27 µL de água deionizada),

foi preparada uma nova PCR tipo Nested com o objetivo de reduzir o background e

enriquecer a amostra de genes diferencialmente expressos. Foram adotados os mesmos

parâmetros indicados na PCR primária, substituindo-se o oligonucleotídeo 1 pelos

oligonucleotídeos Nested 1 e 2 (10µM cada).

O programa de ciclagem utilizado foi: 94 °C (30’’); 68 °C (30’’); e 72 °C (1’30’’),

após 15 ciclos: 4 °C (∞). Nesta etapa, amplificações inespecíficas são eficientemente

suprimidas e apenas as moléculas diferencialmente expressas amplificadas para culminar

numa amostra final enriquecidas dos cDNAs de interesse. Após a Nested PCR (amostra

com transcritos diferencialmente expressos da condição teste obtidos por SSH), as

amostras foram aplicadas em gel de agarose 2% (m/v) e submetidas à corrida

eletroforética. Após a eletroforese, os fragmentos com mais de 150 pb foram recortados do

gel com auxílio de um bisturi e o material transferido para um tubo de microcentrifuga

(cerca de 300 mg/tubo) esterelizado e identificado, separando-os de acordo com os pesos

moleculares (200-400 pb; 400-500 pb; 500-700 pb; 700-1 kb; 1,5 kb). Em seguida,

realizou-se a extração das bandas de DNA do gel utilizando o Kit GFX PCR DNA and Gel

Band Purification (GE). O produto purificado de cada amostra foi concentrado em Speed-

Vac (Eppendorf) e ligado em vetor, como descrito posteriormente.

40

Figura 5: Esquema do procedimento de subtração de cDNA com o uso de PCR supressivo. Boxes marcados

ou em aberto representam partes distintas dos adaptadores 1 e 2 (Gurskaya et al., 1996).

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Os fragmentos obtidos após técnicas de análise da expressão diferencial (SSH) e

purificados em colunas GFX foram ligados (cerca de 200 ng) em vetor pGEM

®

-T (50 ng),

numa reação com 1 µL (5U) de T4 DNA ligase e 5 µL de tampão da enzima com 10 mM

tris-acetato, 10 mM acetato de magnésio e 50 mM acetato de Potássio, incubada a 16 ºC

por 18 horas. O produto de cada reação foi utilizado em transformações bacterianas com

células competentes, conforme descrito abaixo.

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A linhagem pMOS Blue de E. coli foi inoculada em 5mL de meio LB contendo

tetraciclina (15 µg/mL), a partir de uma célula isolada obtida do estoque, sendo então

cultivada por 12-24 horas a 37 °C. A seguir, 3mL desta cultura foram inoculados em 250

mL de meio de cultura LB e cultivados por aproximadamente 2 horas e 30 minutos ou até

que uma absorvância de 0.4-0.5, a 550 nm, fosse atingida. A cultura foi colocada em banho

de gelo por 15 minutos e centrifugada 5.000 g por 10 minutos a 4 °C. As células foram

ressuspendidas em 125 mL de solução I (Tris-HCl pH 7,5 10mM; cloreto de cálcio

50mM), incubadas em gelo por 15 minutos e centrifugadas a 5.000 g por 10 minutos a 4

°C. O precipitado foi suspenso em 3,5 mL de solução II (Tris-HCl pH 7,5 10 mM; cloreto

de cálcio 10 mM; glicerol 15 % (v/v). As células foram aliquotadas, congeladas em

nitrogênio líquido e mantidas a -80 °C.

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Essa etapa objetivou a inserção das moléculas recombinantes (DNA + Vetor) em

células bacterianas competentes (linhagem pMOS Blue de E. coli.) pelo método de

transformação por choque térmico. Uma alíquota de 200 µL de células competentes foi

descongelada em gelo, sendo adicionado cerca de 50 a 100 ng de DNA transformante. Esta

mistura foi incubada em gelo por 30 minutos e posteriormente aquecida a 42 °C por 40

segundos. As células foram imediatamente incubadas em gelo por 2 minutos e 1 mL de

meio LB foi adicionado, seguindo-se uma incubação por 1 hora a 37 °C. Reservadamente,

foram preparadas placas de Petri contendo meio de cultura LB ágar acrescido de 50 µg/mL

de ampicilina, 15 µg/mL de tetraciclina, IPTG e X-gal (Sambrook et al., 1989), para cada

amostra, tendo sido preparado controles negativos e positivos. As placas inoculadas foram

incubadas por 18-20 horas a 37 °C para posterior repicagem de todas as colônias brancas,

correspondentes àquelas bactérias que receberam os plasmídeos contendo insertos de

cDNAs culminando na ativação do sistema de seleção IPTG/X-gal. Todo o material

clonado foi então estocado a -80 °C para análises posteriores.

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A extração de DNA plasmidial foi efetivada com a finalidade de eliminar todos os

outros componentes celulares, inclusive o DNA genômico. Os clones foram repicados em

placas 96 deep well contendo meio de cultura LB líquido acrescido de ampicilina (50

µg/mL) e tetraciclina (15 mg/mL) para cultivo a 37 ºC por 18 horas, em agitador a 250

rpm. Decorrido este período, as placas foram centrifugadas por 6 minutos a 3.220 g, o

sobrenadante descartado e a placa invertida para rápida secagem.

43

Foi adicionado a cada poço 240 µL de Solução I, selou-se a placa com adesivo e esta

foi agitada (vortex) por 2 minutos, para ressuspender bem as células, seguindo-se com uma

centrifugação de 6 minutos, 3.220 g e o sobrenadante dispensado. Posteriormente, foi

preparado um mix contendo 17,6 mL de Solução I e 550 µL RNAse (10 mg/mL) para duas

placas, sendo adicionado 85 µL em cada poço para forte agitação (vortex) durante 2

minutos cada placa. Numa placa tipo Elisa (fundo U), foram transferidos 60 µL da

suspensão de células de cada poço, sendo adicionado a cada 60 µL de NaOH/SDS 10%. As

placas foram seladas e o conteúdo misturado por inversão (10x). Após breve centrifugação,

foi adicionado a cada poço 60 µL de acetato de potássio (KOAc), sendo novamente

misturadas por inversão, e submetidas à incubação de 10 minutos a temperatura ambiente.

O adesivo foi removido de cada placa e estas dispostas na estufa a 90 ºC para incubação

por 30 minutos. Durante este período, foi fixada uma placa filtro Millipore no topo de uma

microplaca tipo Elisa fundo V. Após um rápido resfriamento em gelo por 5 minutos, foi

realizada uma centrifugação de 4 minutos a 3.220 g, sendo todo o volume transferido para

a placa com filtro, evitando a transferência dos debris celulares. Foi efetivada uma

centrifugação de 8 minutos, o filtro descartado e adicionado 110 µL de isopropanol. As

placas foram seladas e centrifugadas por 45 minutos (3.220 g/20 ºC), o sobrenadante

descartado e as mesmas invertidas para uma breve centrifugação e adição de 200 µL de

etanol 70 %. Após uma centrifugação de 10 minutos para a lavagem e descarte do

sobrenadante, as placas foram secas a 65 ºC e o material ressuspendido em 25 µL de água

deionizada e esterelizada, sendo estocado a -20 ºC.

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O método de reverse northern blot (Dilks et al., 2003) foi realizado para confirmar

a expressão gênica diferencial, através da análise dos clones recombinantes gerados nas

bibliotecas subtrativas após fixação em membrana de naílon. Estas foram expostas às

sondas marcadas com fluoraceína ou radioativo, seguindo protocolo adotado neste

laboratório e descrito a seguir.

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Os clones bacterianos selecionados das bibliotecas foram cultivados em placas tipo

deep well com meio de cultura LB contendo ampicilina (50 µg/mL) e tetraciclina (15

µg/mL) e mantidas a 37 ºC por 24 horas sob agitação (250 rpm). Dois microlitros de cada

cultura foram utilizados em uma reação de PCR descrita abaixo, com a seguinte ciclagem:

94 °C (2’); 35 ciclos com 94 °C (30’’); 68 °C (45’’); 72 ºC (1’30’’); e 72 ºC (10’).

1X tampão da Taq DNA polimerase

2 µL

primers Nested 1 e Nested 2 (10 µM cada)

1µL de cada

dNTPs (1,25 mM)

4 µL

Cloreto de magnésio (1,5 mM)

1,5µL

Taq DNA polimerase (5 U/µL) 0,3µL

Água deionizada (q.s.p.)

20 µL

O produto final foi resolvido em gel de agarose 1,2% nas devidas condições para

avaliação, procedendo-se para o preparo das membranas.

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Cerca de 300 ng de cada produto de PCR obtido foram diluídos em tampão TE (pH

7,6) e fixados em membrana de náilon Hybond N

+

(GE Healthcare) utilizando

transferência à vácuo com aparelho específico para dot blot (96 amostras em cada

membrana). Em seguida, as membranas foram tratadas em papéis-filtro umedecidos

separadamente durante 5 minutos em cada solução: Solução desnaturante; solução

neutralizante; e SSC 2X. Após o tratamento, as membranas secaram a temperatura

ambiente por 20 minutos e as amostras foram fixadas por exposição à luz ultra violeta

durante 2 minutos em cada lado.

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Cinqüenta ng do pool de cDNAs diferencialmente expressos oriundos da Nested-

PCR (SSH) foram desnaturados e utilizados como sonda, sendo efetivada a estratégia de

marcação a frio com os Kits Genes Images Random Prime Labeling Module (marcação da

sonda) e Gene Image CDP-Star Detection Module (revelação) (GE Healthcare).

Inicialmente, procedeu-se com a pré-hibridização das membranas em solução de

hibridação (5x SSC; 0,1 % SDS; 5 % dextran sulfato; líquido bloqueador diluído 20 vezes)

para marcação a frio por 1 hora a 60 °C. A seguir, a sonda marcada foi adicionada a esta

solução e as membranas hibridizadas a 60 °C por 18 horas. Após este período, seguiram-se

duas lavagens a 60 °C, a primeira com uma solução de SSC 1X e SDS 0,1 % (m/v) e a

segunda com uma solução de SSC 0,5X e SDS 0,1 % (m/v). Em seguida, incubou-se a

membrana em uma solução de líquido bloqueador e tampão A (1:10) durante 1 hora a

temperatura ambiente. A detecção da marcação foi realizada com o kit descrito acima, que

é composto por um anticorpo anti-fluoresceína conjugado com fosfatase alcalina (anti-

fluorescein alkaline phosphatase AP conjugate) diluído em albumina bovina sérica 0,5 %

46

(m/v), preparada com tampão A (Tris-HCl 100 mM pH 9,5; NaCl 300 mM). A incubação

com o anticorpo deu-se por 1 hora à temperatura ambiente, com três lavagens em uma

solução 0,3 % de Tween 20 (v/v) preparada com tampão A, para remover o excesso de

conjugado. O reagente de detecção foi colocado sobre a membrana e esta foi exposta em

filme fotográfico por cerca de 2-18 horas.

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A reação de sequenciamento foi efetivada com o Kit Big Dye Terminator Cycle

Sequence Ready Reaction, que contém nucleotídeos (adenina – dATP; guanina – dGTP;

citosina – dCTP e timina – dTTP) adicionados pela DNA polimerase II Thermo sequenase

na síntese nucleotídica. Também presente no kit estão os dideoxinucleotídeos (ddATP;

ddGTP; ddCTP e ddTTP) marcados com corantes fluorescentes (fluoraceína e rodamina) e

que foram utilizados como bloqueadores da reação e solução para aplicação no gel (70 %

de formamida e 1mM EDTA). Utilizou-se 200 a 400 ng de DNA, 5 pmol do

oligonucleotídio universal M13 forward ou reverse e 2 µL de Big Dye e o programa de

PCR utilizado para as reações de seqüenciamento foi: 96 °

C (2’); 96 °C (2’’); 52 °C (30’’)

e 60 °C (4’) por 39 ciclos. Após a ciclagem, as amostras foram precipitadas com 80 µL de

isopropanol 75 % (v/v), incubadas por 15 minutos no escuro à temperatura ambiente e

centrifugadas a 5.000 g por 45 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi descartado, seguindo-se

duas lavagens com etanol 70 % (v/v) gelado, centrifugando a 5.000 g por 10 minutos a 4

°C. Após a secagem, as amostras foram ressuspendidas em 2,5 µL de Loading Color,

aplicando-se 0,7 µL em gel de poliacrilamida no sequenciador ABI Prism 377 (Perkin

Elmer).

47

Enquanto os fragmentos de DNA migravam através do gel para a separação

eletroforética, um laser excitou a fluoraceína (idêntica para as 4 bases nitrogenadas) e esta

em seguida excitou a rodamina (diferente para cada base). Os cromóforos emitiram sinais

em forma de cromatograma, onde os picos produzidos representavam as bases

nitrogenadas identificadas através de diferentes cores, as quais foram traduzidas em

sequências lineares.

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Após corrida eletroforética em gel 1,5 % de agarose-formaldeído desnaturante com

quantidades iguais de RNA para cada amostra e marcador de peso molecular específico, o

gel de RNA foi tratado com solução de NaOH 0,05 N por 20 minutos, lavado com água

livre de RNase e mantido em solução SSC 20x durante 45 minutos. Os RNAs foram

transferidos para membranas de náilon Hybond N

+

(GE Healthcare) por capilaridade. Para

isso, foi montado um sistema de gradiente constituído de folhas de papel de filtro

umedecidas em solução SSC 20x, uma membrana umedecida em solução SSC 10x e folhas

de papel filtro em SSC 2x, seguidos de vários papéis absorventes. Após a transferência o/v

(over/night), as amostras foram fixadas à membrana através da exposição da mesma por 2

minutos na luz UV de cada lado.

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Os clones selecionados dos experimentos de expressão diferencial para

confirmação dos genes foram cultivados em meio de cultura LB líquido suplementado com

ampicilina (50 µg/mL) e tetraciclina (15 µg/mL), mantidas a 37 ºC por 24 horas sob

48

agitação (200 rpm). Em seguida, 2 µL da cultura foram utilizados em uma reação de PCR

contendo:

1X tampão da Taq DNA polimerase

2 µL

oligonucleotídeo universal M13 (forward e reverse; 10 pmol)

1 µL de cada

dNTPs (10 mM)

1 µL

Cloreto de magnésio (1,5 mM)

1,5 µL

Taq DNA polimerase (5 U/µL) 0,3 µL

Água deionizada (q.s.p.)

20 µL

O programa utilizado foi: 94 °C (2’); 30 ciclos com 94 °C (30’’); 68 °C (45’’); 72

ºC (1’30’’) durante 35 ciclos. Após a amplificação, todas as amostras foram purificadas

separadamente com o Kit GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare) e

corridas em gel de agarose 1,2 % para confirmar a qualidade. Após a desnaturação da

sonda (50-100 ng) por 7 minutos a 95 ºC, esta foi marcada radioativamente pela adição de

Mix contendo os seguintes componentes:

Tampão

15µL

dATP

2 µL

dGTP

2 µL

dTTP

2 µL

Klenow

1µL

Água deionozada (q.s.p.)

50 µL

A reação de marcação foi realizada adicionando-se 5 µL de dCTP P

32

seguindo com

uma incubação a 37 ºC em termociclador por 1 hora, para que a fita de nucleotídeos

marcada fosse gerada, procedendo-se para uma breve purificação em coluna Sephadex

49

(Life Sciences) e nova desnaturação (5 minutos a 95 ºC) para a mistura na solução de

hibridização (procedimento descrito abaixo).

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As membranas foram pré-hibridizadas durante 2-6 horas a 65º C em tampão de

hibridização (EDTA 1 mM; 17,45 g Na

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; 1 mL de H

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4

85 % (v/v); 5g de Caseína

hidrolisada 1%, SDS 7%). A seguir, a sonda radioativamente marcada foi adicionada à

solução de hibridização e incubada a mesma temperatura por 18 horas. As membranas

foram lavadas com a solução I (SSC 2x, SDS 0,2 %) e II (SSC 0,05x; SDS 0,05 %) e a

seguir expostas em screenings e reveladas no Cyclone (Perkin Elmer).

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As sequências de cDNA obtidas foram analisadas através de ferramentas

computacionais com programas bioinformáticos, auxiliando na análise da expressão gênica

diferencial. Primeiramente, foi feita uma análise por comparação através do site do NCBI

com o programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool -

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST (Altschul et al., 1997), para buscar similaridades com

sequências depositadas no GenBank (NR). Os clones identificados como proteínas

hipotéticas tiveram suas sequências submetidas à busca por similaridade de domínios e/ou

motifs protéicos no programa InterProScanc do EMBL (European Bioinformatics

Institute), disponível no endereço eletrônico http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/. Os pontos

marcados nas membranas foram quantificados utilizando o programa Image J, disponível

na rede pelo endereço eletrônico http://rsb.info.nih.gov/ij/, sendo obtida uma razão entre os

pontos teste e controle.

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∆TruMDR2 de T. rubrum

Os ensaios de infecção in vitro com as linhagens H6 (selvagem) e ∆TruMDR2

(mutante) (Fachin et al., 2006) foram realizados conforme descrito anteriormente

(Takasuka, 2000), com o objetivo de avaliar a interferência do nocaute no gene TruMDR2

enquanto os fungos estão em contato com a queratina. Fragmentos de unha humana foram

recortados com aproximadamente 1x1 mm, dispostos em uma placa de petri estéril com

etanol durante 15 minutos. Após a secagem em temperatura ambiente, esses fragmentos

foram arranjados em placa tipo Elisa de 96 poços para o inóculo com 5 µL de suspensão

conidial (3x10

6

conídios/mL) de cada linhagem testada. Após 1 h à temperatura ambiente,

adicionou-se 200 µL de água destilada esterelizada e o experimento seguiu-se por 6 dias a

28 ºC. Após o período de incubação, o material foi analisado através de microscopia óptica

de epiflucorescência equipado com sistema de imagem digital (Axion vision system Zeiss).

Os controles foram elaborados a partir de fragmentos de unha sem inóculo de conídios.

N

ÃO ENTENDO

Isso é tão vasto que ultrapassa qualquer entender.

Entender é sempre limitado.

Mas não entender pode não ter fronteiras.

Sinto que sou muito mais completa quando não entendo.

Não entender, do modo como falo, é um dom.

Não entender, mas não como um simples de espírito.

O bom é ser inteligente e não entender.

É uma benção estranha, como ter loucura sem ser doida.

É um desinteresse manso, é uma doçura de burrice.

Só que de vez em quando vem a inquietação:

quero entender um pouco.

Não demais: mas pelo menos entender que não entendo.

C

LARICE LISPECTOR

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Para avaliar possíveis alterações no pH com a atividade metabólica de T. rubrum

e identificar genes preferencialmente envolvidos na resposta do T. rubrum à queratina e

lipídeo (Que; Lip), os micélios foram tratados com uma mistura heterogênea de queratina

(teste 1) (raspados de cornos e cascos de animais) e 1% de azeite de oliva puro (teste 2),

sendo a glicose (Taglicht & Michaelis) escolhida como suplemento na condição controle

dos experimentos, uma vez que se trata de uma molécula simples e não-proteica, e assim o

metabolismo basal não seria excessivamente alterado. Os conídios de T. rubrum foram

cultivados por 6h, 12h, 24h, 48h, 72h e 7 dias em meio mínimo suplementado

separadamente com Que, Lip ou Glic (pH inicial 5,0), além de fonte de nitrogênio em

ambos. Após vários testes, as condições ideais de cultivo foram delimitadas e optou-se

pelo inóculo da suspensão de conídios em meio Sabouraud líquido com cultivo por 72

horas a 28 ºC, e imediata transferência da massa micelial gerada para os meios de testes e

controle. A mesma metodologia foi aplicada no preparo do cultivo das linhagens H6,

∆pacC-1 (Que/Glic), CBS118892 e ∆TruMDR2 (Lip/Glic) de T. rubrum.

O pH foi aferido durante todos os cultivos, sendo observado o aumento gradativo

do pH basal do meio mínimo com queratina e lipídeo durante os períodos de tratamento

pré-estabelecidos (Tabela 2). Na condição controle Glic não houve alteração significativa

do pH em relação à condição Que. Resultados semelhantes foram observados durante o

cultivo das linhagens H6, CBS118892 e ∆TruMDR2 de T. rubrum em fonte lipídica (Lip),

quando o pH do meio após 72 horas de cultivo de todas as linhagens alcalinizou, enquanto

52

o controle do experimento, onde o fungo cresceu em meio mínimo com glicose, não

ultrapassou 5,7.

Tabela 2: Alteração do pH quando várias linhagens de T. rubrum foram cultivadas em meio mínimo com

glicose (controle) (55 mM), queratina (teste 1) (2,5g/L) e fonte lipídica (teste 2) (1 %).

Tempo

pH final

Linhagem H6 Linhagem CBS118892 Linhagem ∆TruMDR2

Glic Que Glic Lip Glic Lip Glic Lip

6 h 5,1 5,5 5,0 5,0 4,9 4,9 4,9 4,9

12 h 4,8 5,6 5,1 5,2 5,0 5,3 4,4 5,0

24 h 4,6 6 4,9 5,3 4,9 5,8 4,3 5,1

48 h 4,8 7,8 5,0 5,4 4,6 6,0 4,5 5,8

72 h 4,7 8,4 4,8 5,6 5,7 7,4 4,9 7,0

7 dias 5,2 8,3 4,3 7,0 4,3 7,2 4,4 7,1

pH inicial de todas as condições: 5,0.

Glic: Condição controle cultivado em glicose.

Que: Condição teste 1 cultivado em queratina.

Lip: Condição teste 2, cultivo em fonte lipídica.

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Nesta etapa, o uso da hibridização subtrativa seguida de PCR supressivo teve

como objetivo a seleção de genes preferencialmente expressos por T. rubrum cultivado em

queratina (forward). Para obtenção de sonda utilizada nos experimentos de reverse

northern blot, foram subtraídos cDNAs obtidos na presença de glicose como teste

(reverse). O micélio de T. rubrum submetido às condições Que e Glic (72 horas) foi

utilizado para extração de RNA total e obtenção do RNA poli (A), seguindo-se com a

síntese de cDNAs (dupla fita), etapas de hibridizações e PCRs específicas. Ao final das

reações de PCR, os híbridos de cDNAs representavam os genes diferencialmente expressos

na condição teste de cada biblioteca. A extração de RNA total, síntese de cDNA dupla fita

e Nested PCR da biblioteca TRSSHQue72 estão apresentadas na Figura 6.

Figura 6: Etapas resumidas da construção da biblioteca TRSSHQue: (A) Gel de agarose-formaldeído

desnaturante 1,5% com RNA total das condições controle-glicose (G) e teste-queratina (Q); (B) Gel agarose

1,2% com 1 kb DNA ladder (PM) e cDNA fita dupla das condições G e Q; (C) Gel de agarose 1,2% com λ

HindIII (PM) e o produto de Nested PCR.

54

Os fragmentos clonados variaram entre 0,15-2,0 kb (Fig. 6), e os clones brancos

selecionados pelo sistema do gene LacZ (IPTG/X-gal) foram coletados para distribuição

em placas de 96 poços (totalizando 6 placas) para cultivo em meio líquido LB, estoque e

posterior amplificação por PCR, utilizando oligonucleotídeos com sequências idênticas aos

utilizados na Nested PCR. Dessa forma, as sequências dos adaptadores nas extremidades

de cada cDNA clonado foram praticamente excluídas do produto final da PCR. Os insertos

amplificados dispostos em membranas de náilon foram rastreados através de reverse

northern blot (Fig. 7) para a seleção dos clones preferencialmente expressos na condição

teste Que, sendo utilizada também a sonda de cDNAs oriundos da Nested PCR da

biblioteca reverse (condição Glic), como indicado, para excluir os falsos positivos

marcados. Os clones com sinais intensos após a hibridização com sonda Que foram

avaliados após seqüenciamento.

55

Figura 7: Reverse Northern Blot. Autoradiografias apresentando o rastreamento de clones. Seis membranas

em duplicata contendo clones da Biblioteca Subtrativa de T. rubrum (TRSSHQue) (forward), hibridizadas

com sonda de pool de cDNAs obtidos na Nested-PCR da condição controle (Taglicht & Michaelis) e teste

(Que).

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4.2.1.

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Foram gerados 576 clones contendo insertos diferencialmente expressos durante

o contato com queratina. Todo o material foi sequenciado e os eletroferogramas analisados

no programa Phred (Ewing & Green, 1998), que determina valores referentes à qualidade

dos picos correspondentes a cada base, e o Crossmatch (http://www.phrap.org) aplicado

para indicar a região vetorial em cada seqüência. Os resultados foram organizados com o

programa CAP3 para gerar os contigs e singlets e visualizados através do Consed.

Duzentos e quarenta e uma (241) sequências se agruparam em 35 contigs e as restantes

como singlets. Todas foram analisadas automaticamente por comparação no banco de

dados de seqüências não redundantes (NR) do NCBI, e após a seleção das sequências com

alta qualidade foi gerada a Tabela 3. Através do algoritmo BLASTx, as sequências dos

contigs e singlets foram avaliadas e os resultados obtidos tiveram como parâmetro de

aceitação, um e-value igual ou menor que 10

-3

, que confirma a obtenção de alinhamento

com similaridade confiável por estar mais próximo de zero e diminui a probabilidade do

alinhamento ter ocorrido casualmente.

57

Tabela 3: Contigs e singlets identificados a partir de sequências expressas no dermatófito T. rubrum após tratamento com

queratina durante 72 h.

Nome Acesso

GenBank

pb Anotação funcional; Organismo N◦

clones

E-value Ident

(%)

Contig Q-1 FE526298 435 Leucine Rich Repeat domain protein; Aspergillus clavatus 8 3e-10 40.86

Contig Q-2 FE526255 777 kynurenine aminotransferase, putative; Neosartorya fischeri 2 8e-55 75.74

Contig Q-3 FE526251 190 DNA polymerase gamma; Aspergillus terreus 3 4e-22 74.19

Contig Q-4 FE526258 735 NIMA interactive protein; Emericella nidulans 9 8e-06 33.09

Contig Q-5 FE526254 371 cytochrome P450nor; Aspergillus oryzae 4 6e-16 56.47

Contig Q-6 FE526268 176 copper-sulfate regulated protein; Ajellomyces capsulatus 2 7e-18 84.62

Contig Q-7 FE526252 520 multidrug resistance protein MDR; Trichophyton rubrum 9 9e-23 86.89

Contig Q-8 FE526257 284 ribosomal protein/carboxylic ester hydrolase (Ppe1), putative; Neosartorya fischeri 7 3e-25 63.64

Contig Q-9 FE526275 459 hypothetical protein Afu3g08320; Aspergillus fumigatus 3 3e-07 45.45

Contig Q-10 FE526297 143 nonribosomal peptide synthase; Alternaria brassicae 6 4e-07 72.22

Contig Q-11 FE526301 198 hypothetical protein CIMG_06490; Coccidioides immitis 7 2e-10 57.81

Contig Q-12 FE526306 275 glycerophosphodiester phosphodiesterase, cytosolic; Herminiimonas arsenicoxydans 4 1e-07 56.00

Contig Q-13 FE526370 720 glucosamine-6-phosphate deaminase, putative; Aspergillus fumigatus 11 2e-55 77.10

Contig Q-14 FE526478 682 oligopeptide transporter; Neosartorya fischeri 4 9e-43 55.73

Contig Q-15 FE526362 102 heat shock Hsp30-like protein, putative; Aspergillus clavatus 2 2e-07 75.00

Contig Q-16 FE526534 812 oligopeptide transporter; Aspergillus clavatus 13 1e-45 69.23

Contig Q-17 FE526367 300 Sem similaridade 2 - -

Contig Q-18 FE526368 701 Sem similaridade 2 - -

Contig Q-19 FE526388 268 oligopeptide transporter; Neosartorya fischeri 2 4e-21 65.33

Contig Q-20 FE526510 787 hypothetical protein CIMG_03466; Coccidioides immitis 9 7e-08 65.22

Contig Q-21 FE526330 375 Sem similaridade 2 - -

Contig Q-22 FE526523 755 Sem similaridade 23 - -

Contig Q-23 FE526545 727 Sem similaridade 6 - -

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Contig Q-24 FE526434 733 Sem similaridade 4 - -

Contig Q-25 FE526480 691 glucosamine-6-phosphate deaminase; Coccidioides immitis 5 1e-16 55.79

Contig Q-26 FE526350 215 V-type ATPase, B subunit, putative; Neosartorya fischeri 15 1e-20 88.68

Contig Q-27 FE526467 760 subtilisin-like protease SUB5; Trichophyton rubrum 44 1e-40 78.18

Contig Q-28 FE526464 757 subtilisin-like protease SUB3; Trichophyton rubrum 4 5e-25 90.62

Contig Q-29 FE526458 853 MFS peptide transporter, putaitve; Aspergillus clavatus 3 2e-10 42.17

Contig Q-30 FE526512 711 ENSANGP00000027824; Anopheles gambiae str. PEST 2 6e-13 65.96

Contig Q-31 FE526327 746 oligopeptide transporter; Aspergillus clavatus 9 2e-13 73.08

Contig Q-32 FE526529 711 Sem similaridade 4 - -

Contig Q-33 FE526537 823 Sem similaridade 7 - -

Contig Q-34 FE526552 222 DUF895 domain membrane protein; Aspergillus fumigatus 2 4e-18 67.19

Contig Q-35 FE526522 340 hypothetical protein CIMG_00654; Coccidioides immitis 1 5e-04 80

Singlet Q-1 FE526280 449 pol protein; Glomerella cingulata 1 2e-43 66.94

Singlet Q-2 FE526317 285 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-3 FE526320 250 MFS transporter, putative; Aspergillus clavatus 1 4e-11 47.89

Singlet Q-4 FE526322 277 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-5 FE526329 180 hypothetical protein CIMG_04750; Coccidioides immitis 1 9e-07 63.41

Singlet Q-6 FE526335 444 ISCps6, transposase; Colwellia psychrerythraea 1 2e-11 58.93

Singlet Q-7 FE526336 247 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-8 FE526340 382 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-9 FE526342 175 cytochrome P450 phenylacetate hydroxylase, putative; Aspergillus fumigatus 1 2e-18 81.48

Singlet Q-10 FE526346 633 peptide transporter PTR2A; Hebeloma cylindrosporum 1 1e-11 44.44

Singlet Q-11 FE526352 738 glucosamine-6-phosphate deaminase, putative; Aspergillus fumigatus 1 6e-49 73.91

Singlet Q-12 FE526353 626 glucosamine-6-phosphate deaminase; Coccidioides immitis 1 8e-45 81.18

Singlet Q-13 FE526356 237 metalloprotease Mep3; Trichophyton equinum 1 8e-41 98.72

Singlet Q-14 FE526360 631 glucosamine-6-phosphate deaminase; Coccidioides immitis 1 9e-31 51.61

Singlet Q-15 FE526364 411 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-16 FE526366 655 MFS transporter, putative; Aspergillus fumigatus 1 4e-35 48.67

Singlet Q-17 FE526369 432 benzoate 4-monooxygenase cytochrome P450, Aspergillus clavatus 1 3e-35 68.87

59

Singlet Q-18 FE526372 696 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-19 FE526377 123 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-20 FE526391 482 CHK1 checkpoint homolog ; Saccharomyces pombe 1 7e-08 77.78

Singlet Q-21 FE526396 644 subtilisin-like protease SUB5; Trichophyton verrucosum 1 3e-28 78.21

Singlet Q-22 FE526402 384 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-23 FE526403 362 oxalate decarboxylase; Bacillus licheniformis 1 2e-09 35.09

Singlet Q-24 FE526406 399 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-25 FE526410 66 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-26 FE526415 283 phytanoyl-CoA dioxygenase family protein; Neosartorya fischeri 1 1e-18 63.01

Singlet Q-27 FE526416 684 hypothetical protein, unknown function; Leishmania major 1 7e-07 61.54

Singlet Q-28 FE526417 314 transposase domain protein; Pseudomonas aeruginosa 1 1e-22 60.71

Singlet Q-29 FE526418 417 K+/H+ antiporter, putative; Neosartorya fischeri 1 4e-41 70.25

Singlet Q-30 FE526419 358 gamma interferon inducible lysosomal thiol reductase (GILT), putative; Aspergillus clavatus 1 3e-06 55.56

Singlet Q-31 FE526422 55 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-32 FE526436 493 hypothetical protein CIMG_06605; Coccidioides immitis 1 8e-44 53.25

Singlet Q-33 FE526437 251 Ribosomal protein S7e; Aspergillus fumigatus 1 9e-31 84.21

Singlet Q-34 FE526439 501 Hypothetical protein CBG22239; Caenorhabditis briggsae 1 2e-12 50.59

Singlet Q-35 FE526446 496 glucosamine-6-phosphate deaminase; Coccidioides immitis 1 4e-22 61.76

Singlet Q-36 FE526452 685 oligopeptide transporter; Aspergillus clavatus 1 2e-21 57.89

Singlet Q-37 FE526453 135 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-38 FE526454 232 urease accessory protein UreD; Aspergillus clavatus 1 2e-06 50.91

Singlet Q-39 FE526455 56 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-40 FE526461 673 formin 2; Homo sapiens 1 9e-06 85.71

Singlet Q-41 FE526463 87 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-42 FE526468 455 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-43 FE526481 294 protein MGM1, mitochondrial precursor; Aspergillus terreus 1 3e-41 89.36

Singlet Q-44 FE526494 348 hypothetical protein CIMG_00073; Coccidioides immitis 1 1e-25 59.26

Singlet Q-45 FE526497 744 hCG1793893; Homo sapiens 1 2e-05 33.16

Singlet Q-46 FE526499 260 sterol 24-C-methyltransferase; Aspergillus terreus 1 7e-23 64.38

60

Singlet Q-47 FE526508 532 short chain dehydrogenase, putative; Aspergillus clavatus 1 1e-25 85.71

Singlet Q-48 FE526509 242 extracellular lipase, putative; Neosartorya fischeri 1 5e-19 63.01

Singlet Q-49 FE526513 920 unnamed protein product; Aspergillus niger 1 4e-12 64.10

Singlet Q-50 FE526514 713 cholinesterase; Aspergillus terreus 1 2e-08 44.64

Singlet Q-51 FE526515 726 arginine transporter, putative; Aspergillus clavatus 1 6e-17 57.50

Singlet Q-52 FE526519 131 hypothetical protein CIMG_04750; Coccidioides immitis 1 1e-07 63.16

Singlet Q-53 FE526521 353 flotillin domain protein; Aspergillus fumigatus 1 4e-16 56.41

Singlet Q-54 FE526535 89 Sem similaridade 1 - -

Singlet Q-55 FE526541 705 small GTPase RanA; Emericella nidulans 1 2e-40 76.92

Singlet Q-56 FE526376 576 hypothetical protein CIMG_07037; Coccidioides immitis 1 1e-06 35

61

Analisando a anotação funcional disposta na Tabela 3, observa-se que diversos

clones da biblioteca TRSSHQue apresentaram similaridades com sequências de fungos

como os patogênicos A. fumigatus e C. immitis e com outros dermatófitos. Dois contigs

(Q-27 e Q-28) apresentaram alta similaridade (identidade entre 78-91%) com subtilisin-like

proteases de T. rubrum, respectivamente tipos 5 e 3, conhecidos como fatores de virulência

de dermatófitos. Transcritos similares a metaloproteases (MEPs) também foram isolados,

como o contig Q-3 que apresenta dois clones alinhados com uma Mep 4 de T. tonsurans

(e-value 2e

-41

), enquanto o singlet Q-13 é similar a Mep 3 do T. equinum, ambas com 99 %

de identidade.

Muitos transcritos de transportadores foram isolados após o cultivo de T. rubrum

em queratina. O contig Q-29 e os singlets Q-3 e Q-16 são representados por clones

confirmados através de reverse northern blot com alta similaridade com uma sequência de

transportador tipo MFS (e-values 2e

-10

, 4e

-11

e 4e

-35

) de A. clavatus. As sequências dos

clones envolvidos neste contig foram analisadas no InterProScan, o que revelou um motif

conservado para transportadores de peptídeos tipo PTR2-A. Outro transportador

identificado nos alinhamentos com 9 clones sobrepostos num contig de 520 pb, foi do tipo

MDR (multidrug resistence) de T. rubrum, da grande família de transportadores ABC,

com e-value 9e

-23

e 88% de identidade. Dois clones no contig Q-6 apresentaram homologia

com um transportador ATPases de cobre de A. fumigatus e do fungo saprófita e

termoresistente Neosartorya fischeri, que teve seu genoma recentemente sequenciado pela

TIGR (http://www.tigr.org/tdb/e2k1/nfa1/). Vários outros transportadores de N. fischeri

foram isolados (contig Q-14 e Q-19), como V-type ATPase (contig Q-26) que auxilia na

manutenção do pH intracelular ideal para o metabolismo fúngico e uma bomba de

nitrogênio/hidrogênio (K

+

/H

+

) (singlet Q-29), além de permeases transportadoras de

62

oligopeptídeos e aminoácidos similares a sequências de A. clavatus (contigs Q-16 e Q-31;

singlet Q-16 e Q-51).

Uma proteína TINA interativa de NIMA quinase de Emericella nidulans

(anamorfo de A. nidulans) foi identificada (contig Q-4; e-value 8e

-06

), enquanto outros

quatro clones (contigs Q-5 e singlet Q-9) alinharam com sequências referentes ao

citocromo p450nor do A. fumigatus que participa da oxidação do ácido nítrico. Um clone

de 449 pb (singlet Q-1) e com alta similaridade (e-value 2e

-43

) com uma poliproteína de

Glomerella cingulata foi isolado, sendo similar a retrotransposons encontrados em

genomas de diversos organismos, inclusive os patogênicos. Interessantemente, também

foram identificadas sequências similares a proteína transposase (singlet Q-6 e Q-28) de P.

aeruginosa e da bactéria extremofílica Colwellia psychrerythraea, enzima relacionada à

movimentação dos chamados elementos de transposição num genoma.

O contig Q-8 com 284 pb apresentou similaridade (e-value 3e

-25

) com uma

putativa éster hidrolase carboxílica (Ppe1) de A. fumigatus e N. fischeri, identificada com

domínio de hidrolase Ppe1 no InterProScan. Também foi confirmado pelo BLASTx como

uma kynurenine aminotransferase putativa de A. fumigatus o contig Q-2. Os resultados do

InterProScan classificam esta sequência com assinatura conservada de sítio ativo da grande

família de redutases. Esta família inclui oxidoredutases relacionadas do tipo monoméricas

e dependentes de NADPH, todas com funções e estruturas semelhantes. Outra sequência

envolvida no metabolismo fúngico (contig Q-13; 77 % de identidade) gerada pela

sobreposição de 8 clones apresentou similaridade com a proteína participante do

catabolismo do N-acetilglicosamina (GlcNAc), a glucosamina-6-fosfato deaminase de A.

fumigatus, codificada pelo gene NAG1. Ademais, o contig Q-3 demonstrou similaridade

numa região da DNA polimerase gamma de A. terreus, tendo outro hit identificado como

uma subunidade catalítica de DNA polimerase mitocondrial de N. crassa (Acesso

63

XP_322362), além de uma proteína que apresenta domínio rico em leucina de A. fumigatus

(contig Q-1) e uma heat shock protein30 de A. clavatus (contig Q-15).

Varias sequências foram identificadas como proteínas hipotéticas ou conservadas

de fungos, como o contig Q-20 (787 pb), similar a proteína hipotética de C. immitis no

primeiro hit, seguidos dos hits com Botryotinia fuckeliana (1e

-16

) e Sclerotinia

sclerotiorum (2e

-16

). A busca por similaridade no NCBI utilizando BLASTx não trouxe

resultados de alinhamentos confiáveis para 25 sequências, selecionadas como “sem

similaridade”, variando entre 49 e 823 pb e que podem representar sequências de genes

exclusivos de T. rubrum.

Dentre os singlets, há sequências com anotação funcional idêntica à de alguns

contigs, como ocorre com sequências similares a transportadores tipo MFS, subtilisina,

metaloprotease, citocromo p450nor, glucosamina-6-fosfato deaminase e algumas

hipotéticas de C. immitis. Clones contendo singlets e confirmados pelo reverse northern

blot apresentaram similaridade com uma GTPase RanA (singlet Q-55), proteína de

membrana importante para a ativação de mecanismos de transdução de sinais que atuam

em conjunto com moléculas ativadoras da expressão gênica. Muitos transcritos que podem

ter participação em etapas básicas do metabolismo fúngico foram isolados, como proteínas

checkpoint de ciclo celular, decarboxilase e esterol-24-C-metiltransferase.

De acordo com as análises comparativas (Tabela 3), utilizamos o banco de dados

do MIPS para classificar funcionalmente os unigenes gerados, em percentagem dos

grandes grupos funcionais (Gráfico 1). Pode-se observar que 2,10 % dos produtos

expressos são relacionados a virulência, onde se enquadram as proteases, 32,9 % são

transportadores e 28,30 % são proteínas não caracterizadas, compilando dados de proteínas

hipotéticas, conservadas e sem similaridade.

64

Gráfico 1: Classificação funcional dos unigenes gerados após a análise dos clones que compõem a

Biblioteca Subtrativa Supressiva TRSSHQue, de acordo com banco de dados do MIPS (Munich Information

Center for Protein Sequences).

65

4.2.2.

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Sequências isoladas por SSH preferencialmente expressas sob contato com a

queratina, similares a genes codificadores de proteases e outros possivelmente relacionados

com processos patogênicos, foram priorizados nos estudos de validação por northern blot

para inferirmos o seu possível envolvimento na utilização de queratina e na virulência

deste dermatófito. Uma vez que muitas hipotéticas apresentaram similaridade com

sequências gênicas de A. fumigatus e outros fungos filamentosos patogênicos,

experimentos complementares também buscaram a confirmação desses transcritos. Sendo

assim, os fragmentos obtidos na biblioteca TRSSHQue com sequências similares a

subtilisina serino-protease, metaloprotease, proteína TINA, Hsp30, gag-poliproteina,

trasportadores MFS, Cu

++

ATPase, permease, MDR e uma sequência ainda não

caracterizada (Fig. 8, 9 e 10) foram selecionadas e mostraram-se diferencialmente

expressas na condição teste quando comparadas à marcação na condição controle avaliada.

66

Figura 8: Northern Blot. Validação de transcritos diferencialmente expressos e similares a proteases

(Subtilisina 5, Metaloprotease 4 e Subtilisina 3), após contato de T. rubrum com queratina durante 72 h. (C)

controle, micélio cultivado em glicose; (Q) teste, micélio cultivado em queratina. Abaixo estão representados

os respectivos géis desnaturantes contendo RNAs equalizados das condições citadas. Ao lado, gráficos

representando as intensidades relativas da expressão gênica de cada transcrito, através da comparação

entre controle (G) e teste (Q).

67

Figura 9: Northern Blot. Validação de transcritos diferencialmente expressos e similares a proteína TINA,

No Match (sem similaridade), Gag-poliproteína e Hsp30, após contato de T. rubrum com queratina durante

72 h. (C) controle, micélio cultivado em glicose; (Q) teste, micélio cultivado em queratina. Abaixo estão

representados os respectivos géis desnaturantes contendo RNAs equalizados das condições citadas. Ao lado,

gráficos representando as intensidades relativas da expressão gênica de cada transcrito, através da

comparação entre controle (G) e teste (Q).

68

Figura 10: Northern Blot. Validação de transcritos diferencialmente expressos e similares a transportadores

transmembranas, após contato de T. rubrum com queratina durante 72 h. (C) controle, micélio cultivado em

glicose; (Q) teste, micélio cultivado em queratina. Abaixo estão representados os respectivos géis

desnaturantes contendo RNAs equalizados das condições citadas. Ao lado, gráficos representando as

intensidades relativas da expressão gênica de cada transcrito, através da comparação entre controle (G) e

teste (Q).

69

4

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3

.

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Com o objetivo geral de isolar genes envolvidos na resposta a lipídeos e

complementares aos dados obtidos na biblioteca TRSSHQue, possivelmente envolvidos na

degradação de componentes celulares da pele durante infecção por T. rubrum, esta

biblioteca de cDNAs subtraídos foi construída a partir de micélio da linhagem CBS118892

de T. rubrum submetidos separadamente a 1% de óleo de oliva (teste) e glicose (controle).

Os cDNAs dupla fitas foram gerados após devida padronização quanto ao número

de ciclos da PCR, com a finalidade de não atingir o “platô” da reação evitando

interferência na quantidade diferencial de cada tipo cDNA presente nas amostras, e assim

garantir a análise diferencial (Fig. 11).

Figura 11: Otimização dos ciclos de PCR para amplificação dos cDNAs controle e teste, evitando o

“platô” para manter a variação quantitativa dos diferentes genes em cada condição. Fixou-se 20 ciclos

para o controle e 27 para o teste. PM1: 1Kb DNA ladder; PM: padrão de peso molécula λHind.

70

As amostras do Nested PCR contendo cDNA originados de transcritos

diferencialmente expressos (Fig. 12) foram excisadas do gel, de acordo com o tamanho

comparado ao padrão de peso molecular, sendo coletados material entre 200 pb e 1000 pb.

O conteúdo foi purificado e concentrado para clonagem e estocagem da biblioteca.

Figura 12: Nested-PCR. (PM) 1Kb Plus DNA Ladder; (1) cDNAs da condição teste (azeite de oliva, 1%);

(2) cDNAs da condição controle (glicose 55 mM).

71

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3

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1

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Nesta nova etapa, obtivemos 672 clones de biblioteca TRSSHLip, tendo sido

realizado o reverse northern blot visando a exclusão de clones falsamente positivos. Os

insertos clonados foram amplificados e transferidos para membranas em duplicata, sendo

efetivada a hibridização separadamemte com cDNAs teste e controle, obtidos a partir de

RNA total controle (glicose) e RNA total teste (lipídeo) (Fig. 14). Oitenta clones positivos

foram selecionados, sequenciados e analisados através de ferramenta bioinformáticas,

sendo possível organizar 5 contigs e 9 singlets entre os unigenes (Tabela 4). Dentre os

unigenes, 8 não apresentaram similaridade no banco de dados NR do NCBI e representam

58 clones, enquanto as demais sequências são similares a proteínas de fungos patogênicos

como H. capsulatum e A. niger e o próprio T. rubrum (Contig L-1). Classificamos

funcionalmente as sequências obtidas utilizando o MIPS e os resultados estão

representados no Gráfico 2. Do total, 4,24 % são transcritos que interferem no

metabolismo fúngico e 5,08 % relacionados à biogênese de compostos celulares, enquanto

que 62,71 % são proteínas hipotéticas, sem similaridade ou não caracterizadas.

72

Figura 13: Reverse Northern Blot. Autoradiografias apresentando o rastreamento de clones. Sete

membranas em duplicata contendo clones da Biblioteca Subtrativa de T. rubrum (TRSSHLip) (forward),

hibridizadas com sonda de pool de cDNAs obtidos na Nested-PCR da condição controle e teste (Lip).

73

Tabela 4: Análise bioinformática e anotação funcional de unigenes selecionados da Biblioteca Subtrativa Supressiva de T. rubrum cultivado

em meio contendo fonte lipídica.

Nome Acesso

GenBank

pb Anotação funcional; Organismo N◦ clones E-value Ident(%)

Contig L-1 GE468525 579 Multidrug resistance protein MDR; Trichophyton rubrum 16 4e-

25

96.72

Contig L-2 GE468526 503 43 kDa secreted glycoprotein precursor; Paracoccidioides brasiliensis 2 9e-

17

46.81

Contig L-3 GE468527 268 Sem similaridade 38 - -

Contig L-4 GE468528 589 Sem similaridade 12

Contig L-5 GE468529 249 Sem similaridade 3 - -

Singlet L-1 GE468530 166 Sem similaridade 1 - -

Singlet L-2 GE468531 89 Sem similaridade 1 - -

Singlet L-3 GE468532 94 Sem similaridade 1 - -

Singlet L-4 GE468533 155 chitin synthase B; Ajellomyces capsulatus (telemorfo Histoplasma capsulatum) 1 1e-

10

71.74

Singlet L-5 GE468534 416 Sem similaridade 1 - -

Singlet L-6 GE468535 369 Sem similaridade 1 - -

Singlet L-7 GE468536 485 Predicted protein; Coccidioides immitis 1 1e-

29

92.31

Singlet L-8 GE468537 346 Serine/threonine-protein phosphatase 2B catalytic subunit; Aspergillus niger 1 5e-

53

95.38

Singlet L-9 GE468538 217 copper-sulfate regulated protein 1; Ajellomyces capsulatus 1 6e-

06

43.06

74

Gráfico 2: Classificação funcional dos unigenes gerados após a análisedos clones que compõem a

Biblioteca Subtrativa Supressiva TRSSHLip, de acordo com banco de dados do MIPS (Munich Information

Center for Protein Sequences).

75

4.3.2.

V

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Após a análise dos clones isolados na Biblioteca THSSHLip, alguns foram

selecionados para validação por northern blot. Dessa forma foi possível confirmar que o

transcrito similar a uma glicoproteína de 43 kDa do P. brasiliensis está com alta expressão

diferenciada na condição teste Lip, em comparação com a condição controle (Fig. 14). O

mesmo ficou constatado com um transcrito sem similaridade (contig L-3), que foi

selecionado devido ao número de cópias isoladas na condição teste (38 clones) e também

teve sua expressão diferencial confirmada.

Figura 14: Northern Blot. Validação de transcritos diferencialmente expresso, sem similaridade e similar a

glicoproteína de 43 kDa, após contato de T. rubrum com lipídeos durante 72 h. (C) controle, micélio

cultivado em glicose; (L) teste, micélio cultivado em azeite de oliva (1%). Abaixo está representado o

respectivo gel desnaturante contendo RNAs equalizados das condições citadas. O gráfico representa a

intensidade relativa da expressão gênica do transcrito, após a comparação entre controle (G) e teste (L)

76

4.4.

A

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Uma vez que foi gerada uma biblioteca subtrativa supressiva contendo cDNAs

isolados de T. rubrum durante seu crescimento em queratina, ficou mais evidente a

importância de proteases queratinolíticas com ótima atividade em pH alcalino para o

processo infeccioso deste dermatófito. A adaptabilidade dos dermatófitos em ambiente

com pH alcalino, como ocorre após a instalação da infecção na pele humana inicialmente

com pH ácido, indica que devem existir mecanismos regulatórios que governam essas

mudanças na expressão gênica através do sensoriamento do pH externo.

Sendo assim, com o objetivo de relacionar funcionalmente a ação do fator de

transcrição PacC e enzimas envolvidas no mecanismo de virulência do dermatófito T.

rubrum, utilizamos 3 sondas obtidas a partir da recuperação de fragmentos de cDNAs da

biblioteca TRSSHQue, duas delas homólogas a subtilisinas serino proteases (contigs Q- 27

e Q-28), e outra similar a uma metaloprotease 4 (contig Q-35 ). Todas as sondas foram

marcadas radioativamente e utilizadas em experimentos de northern blot para comparar o

nível de expressão entre a linhagem selvagem H6 e a mutante ∆pacC-1, cultivados tanto na

glicose (controle) como na queratina (teste). Obtivemos marcações positivas nas amostras

de H6 e ∆pacC-1 em contato com queratina, com variações no nível da expressão gênica,

de acordo com as intensidades relativas quantificadas e observadas na Fig 15. Na linhagem

selvagem H6, o gene da subtilisina 5 apresentou-se 1,5 vezes expresso em relação a

amostra da linhagem mutante ∆pacC-1, enquanto a subtilisina 3 está 1,7 vezes e a

metaloprotease tem quase dobro de expressão (1,8 vezes) no selvagem, demonstrando que

há uma interferência na geração de transcritos de proteases no mutante com o gene pacC

nocauteado. Além disso, marcações na linhagem ∆pacC-1 cultivada na condição controle

(Taglicht & Michaelis) denotam uma provável ativação das proteases, podendo o PacC

estar relacionado à inibição de Sub 3 e 5 e Mep 4 em pH ácido na linhagem H6.

77

Figura 15: Northern Blot. Comparação do padrão de expressão gênica de transcritos diferencialmente

expressos e similares a proteases nas linhagens H6 (selvagem) e ∆PacC-1 (mutante) de T. rubrum, após

cultivo durante 72 h: (1) H6 cultivado em glicose; (2) H6 cultivado em queratina; (3) ∆PacC-1 cultivado em

glicose; (4) ∆PacC-1 cultivado em queratina. O respectivo gel desnaturante contendo RNAs equalizados das

condições citadas está representado. Os gráficos representam as intensidades relativas da expressão gênica

de cada transcrito após a comparação entre as linhagens H6 e ∆pacC-1, sendo considerado o controle (1).

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∆TruMDR2

de T. rubrum

O efeito da disrupção do TruMDR2 na patogenicidade de T. rubrum foi avaliada em

modelos de infecção em unhas humanas in vitro, para testar a habilidade de infecção da

linhagem mutante em comparação com o tipo selvagem H6. Preparações de conídios das

linhagens testadas foram individualmente distribuídas em fragmentos de unhas

esterelizados e o crescimento observado por microscopia óptica após 6 dias de inoculação

a 28 ºC. A deleção do TruMDR2 foi correlacionada com o a diminuição da habilidade do

mutante em crescer em unhas humanas (Fig. 16) como única fonte de nutriente, o principal

sítio de infecção de T. rubrum, enquanto a linhagem H6 cresceu abundantemente.

Figura 16: Ensaio de infecção mostrando o crescimento de diferenes linhagens de T. rubrum cultivadas em

fragmentos de unhas humanas durante 6 dias a 28 °C. O crescimento fúngico nas unhas foi avaliado por

microscopia óptica e as imagens capturadas através do Axion vision System (Zeiss) com objetiva (plan

neofluar) 20x/0.5. As partes pretas no lado esquerdo das figuras são os fragmentos de unhas. (A) Controle

negativo (sem inóculo); (B) H6 (linhagem selvagem H6) e (C) linhagem mutante

∆

TruMDR2. Esses

resultados são representativos de dois experimentos distintos.

A

SSIM EU VEJO A VIDA

A vida tem duas faces:

Positiva e negativa

O passado foi duro

mas deixou o seu legado

Saber viver é a grande sabedoria

Que eu possa dignificar

Minha condição de mulher,

Aceitar suas limitações

E me fazer pedra de segurança

dos valores que vão desmoronando.

Nasci em tempos rudes

Aceitei contradições

lutas e pedras

como lições de vida

e delas me sirvo

Aprendi a viver.

CORA CORALINA

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Os resultados apresentados nesse trabalho mostram o uso da tecnologia de SSH

para análise da expressão gênica durante a mimetização do processo infeccioso de um

dermatófito de grande interesse clínico. A principal resposta aos estímulos ambientais é a

modulação da expressão dos genes para o controle de todo o metabolismo celular frente às

reações adversas e mudanças bruscas abióticas e/ou nutricionais, inclusive na adaptação

em um novo nicho parasitado. Esse controle se apresenta com uma maior complexidade

nos organismos eucarióticos e pode ocorrer em vários níveis do metabolismo celular

(transcrição, processamento do RNAm, tradução, pós-tradução e funcionamento

enzimático). A construção e análise de bibliotecas de subtração de cDNAs obtidos de

células fúngicas de T. rubrum submetidas separadamente à queratina ou lipídeo como teste

durante períodos pré-programados, foi o principal objetivo deste trabalho, que culminou no

isolamento e identificação de genes posteriormente categorizados e associados ao

metabolismo e virulência deste dermatófito.

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A forma de tratamento dos conídios de T. rubrum foi definida após análises de

trabalhos anteriores e diversos testes, sendo a massa micelial dividida em diferentes

períodos de cultivo (6h; 12h; 24h; 48h; 72h e 7 dias) em meio mínimo suplementado

separadamente com queratina (teste 1), lipídeo (teste 2) e glicose (controle) (pH inicial 5,0)

com o objetivo de avaliar as alterações no pH durante o cultivo do fungo. Duek et al

(2003) criaram um modelo que mimetiza in vitro a infecção de T. mentagrophytes em

seções de pele humana, seguindo a ação do fungo com microscopia eletrônica. Foi

observado que após 12 horas de infecção os microconídios se acomodavam no extrato

80

córneo iniciando o processo de adesão, com germinação evidente após 24 horas

(crescimento do tubo germinativo) e nítida invasão do tecido pelo alongamento das hifas

(72 horas), culminando na propagação das mesmas após 10 dias de experimento (Duek et

al., 2004).

Em fungos, a identificação de proteases envolvidas na degradação de queratina tem

sido realizada com freqüência em diversos experimentos utilizando queratina de fontes

variadas, como proveniente de unha, cabelo, cascos de animais ou pele humana (Brouta et

al., 2001; Vignardet et al., 2001; Esquenazi et al., 2003; Ferreira-Nozawa et al., 2006),

com variações na concentração de 0,5-2,5% para a caracterização de queratinases

extracelulares (Brasch & Zaldua, 1994; Brouta et al., 2001). Quanto ao efeito da glicose,

Meevootison & Niedespruem (1979) observaram que este açúcar simples pode reprimir a

expressão de proteases extracelulares quando presente no cultivo de T. rubrum e outros

dermatófitos em meio ágar na concentração de 2%, quantificando especificamente a

diminuição na degradação de elastina (Meevootisom & Niederpruem, 1979). A glicose

também reprime a produção de enzimas no T. rubrum que participam da hidrólise de

substâncias presentes nos pêlos do porco da índia adicionado ao meio líquido (Apodaca &

McKerrow, 1989).

Uma diferença significativa no pH final foi observado após o tratamento de 72

horas na condição de cultivo de T. rubrum em queratina, que variou de 5,0 para 8,4 (Tabela

2), dados que corroboram o modelo proposto por Martinez-Rossi et al (2004) para infecção

por dermatófitos. Okafor & Alda (2000) também observaram um aumento no pH basal do

meio tendo cabelo humano como substrato para testar a atividade queratinolítica de vários

dermatófitos, incluindo T. rubrum, T. mentagrophytes e M. gypseum (Okafor & Ada,

2000). Alterações no pH local também foram aferidas quando T. rubrum cresceu em fonte

81

lipídica. Mudanças graduais e lentas ocorreram, assim como no teste 1 (cultivo em

queratina), mas com a alcalinização do meio e pouca alteração da massa micelial.

Já que os elementos adicionados ao meio ativam a expressão de genes específicos

em T. rubrum, espera-se que haja uma alteração do meio em que o fungo se encontra

devido às enzimas secretadas atuantes na quebra de compostos de carbono para utilização

nutricional, viabilizando a sobrevivência fúngica. Ferreira-Nozawa et al (2003) também

observaram alteração no pH ambiente após cultivar T. rubrum em meio suplementado com

1 % de glicerol e 50 mM de glicina, obtendo níveis de pH que ultrapassaram 8,3. A glicina

é uma fonte de carbono que quando metabolizada, libera resíduos de Acetil CoA

citoplasmático, gerando a alcalinização local (Thedei Jr. et al., 1994). Uma vez que este

dermatófito alcaliniza o meio de cultivo, Ferreira-Nozawa et al (2003) também realizaram

experimentos dispondo micélios de T. rubrum em meio com pH inicial alcalino (8,0 e 9,0),

observando-se praticamente a ausência de crescimento fúngico com inalteração no pH

local (Thedei Jr. et al., 1994; Ferreira-Nozawa et al., 2003). Portanto, T. rubrum mostra-se

dependente do pH inicial ácido para viabilizar seu crescimento e fisiologia de modo que a

alcalinização do pH local ocorra.

As células de fato alteram o seu meio homeostático e efetivam uma resposta

metabólica em função do sensoriamento do pH, efeito já demonstrado em fungos

filamentosos como N. crassa e A. nidulans, que ajustam o pH do meio para ácido ou

alcalino dependendo de fontes de carbono como glicose ou acetato, respectivamente

(Nahas et al., 1982; Caddick et al., 1986). Recentes estudos têm demonstrado a

interferência do pH ambiente na modulação metabólica em diferentes fungos patogênicos,

como na transição dimórfica em C. albicans e Paracoccidioides brasiliensis com a

ativação de suas formas virulentas (Davis et al., 2000; Marques et al., 2004). A

identificação de genes que, uma vez ativos em específicas concentrações de pH podem

82

aumentar a virulência fúngica, foi crucial para o conhecimento de vias metabólicas

atuantes no dano ao hospedeiro.

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Atualmente, muitos estudos de genômica estrutural e funcional em fungos têm sido

realizados com base nos resultados obtidos do sequenciamento genômico completo de

fungos modelos como o A.nidulans, N. crassa e S. cerevisiae (Galagan et al., 2003; Li et

al., 2008), e esses dados vêm sendo amplamente utilizados para análises dos

transcriptomas de vários microrganismos, inclusive patógenos de grande interesse clínico e

agronômico em busca de fatores de virulência.

Há muitos dados disponíveis sobre patógenos fúngicos que apresentam uma

complexa regulação gênica modulando a morfogênese e a expressão de proteínas

intracelulares para transdução de sinais, bem como referente às proteínas extracelulares

para ação no substrato invadido e captação de nutrientes. Dentre estes, destacam-se as

informações acerca da patogênese de C. albicans, P. brasiliensis

e C. neoformans, tendo

sido caracterizados muitos fatores de virulência nestes patógenos (Kozel, 1995; Lorenz,

2002; Naglik et al., 2004). No processo de produção das ESTs em condições especificas de

cultivo, é comum observar um grande número de sequências com tamanhos inferior a 500

pb e ainda a alta redundância de dados, visto que os clones de cDNA são aleatoriamente

escolhidos de uma biblioteca. Na tentativa de superar estes problemas e ainda fornecer uma

visão mais detalhada dos genes selecionados, a utilização de programas computacionais

que avaliam a qualidade das seqüências isoladas, providenciando o agrupamento das

mesmas de acordo com as regiões de sobreposição (Oliveira & Johnston, 2001) aumenta a

qualidade dos dados avaliados através do NCBI.

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Dentre os transcritos expressos em maior abundância na condição de teste 1

(cultivo em queratina) estão as proteases, como as subtilisinas 3 (Sub 3) e 5 (Sub 5) e as

metaloproteases 3 (Mep 3) e 4 (Mep 4), muitas utilizadas como sonda para confirmar a

expressão através de experimentos de northern blot. Subtilisinas são serino proteases

características como fator de virulência de dermatófitos, identificadas em M. canis (Brouta

et al., 2001) através de screening em biblioteca de DNA utilizando sonda heteróloga

baseada na sequência de outras serino protease fúngicas. Jousson et al (2004) clonaram 7

genes de subtilisinas (SUBs) de T. rubrum (incluindo os genes das SUBs 3 e 5), avaliando

a atividade queratinolítica dessas SUBs e destacando a ótima atividade em pH alcalino

(entre 7,5-9,0). Saliento que após 72 h, o pH do meio de cultivo suplementado com

queratina já se encontrava alcalino (8,4) devido a atividade metabólica de T. rubrum

(Tabela 2).

Outra classe de proteases secretadas por dermatófitos é a de metaloproteases

(MEPs), enzimas que possuem um íon acoplado em seu sítio catalítico. Muitas espécies de

fungos que infectam humanos secretam proteases durante os processos infecciosos, sendo

essas proteases secretadas do tipo MEP importantes fatores de virulência em dermatófitos,

já bem caracterizadas em M. canis (Monod et al., 2002). Jousson et al (2004) também

caracterizaram genes MEPs em dermatófitos, observando similaridades entre MEPs de M.

canis, T. rubrum, T. mentagrophytes, A. fumigatus e A. oryzae. A detecção de MEPs na

biblioteca de cDNAs de T. rubrum expressos na presença de queratina e através de

northern blot atestam a provável funcionalidade na degradação de tecidos queratinizados

durante uma dermatofitose.

84

Para investigar a função de metaloproteases nos principais fungos que causam

patogenias na córnea, incluindo A. fumigatus e C. albicans, foram realizados ensaios

infecciosos. As atividades de MEP-2 e MEP-9 nas córneas infectadas alcançaram um alto

nível após três dias de infecção (72 h), também sendo possível correlacionar o número de

conídios aderidos com o nível da inflamação e dessas atividades protéicas (Dong et al.,

2005). A purificação de uma metalopeptidase de C. albicans e medições de sua atividade

mostraram degradação contra colágenos tipo I e IV, laminina e fibronectina de células

humanas e de ratos (el Moudni et al., 1995). Os autores supõem que ainda não está bem

definida a secreção de metalopeptidases pela levedura C. albicans, sendo importante a

poderosa ação degradatória de proteínas MEPs na migração da célula fúngica através da

camada endotelial e suas contribuições para a invasão do tecido hospedeiro. É conveniente

ressaltar que as metalopeptidases demonstram não possuir atividade em pH ácido em

linhagens selvagens, parecendo ter especificidade contra poucos tipos de substratos apenas

em pH alcalino (el Moudni et al., 1995).

Estudos com o patógeno Yersinia enterocolitica detectaram variações genéticas

entre cepas com níveis de patogenicidade diferenciados e cepas não-patogênicas. Neste

organismo, sequências codificantes de determinantes virulentos como hemolisinas e

metaloproteases foram identificadas em cepas altamente patogênicas, quando comparadas

às não patogênicas (Howard, 1999). Já em fungos filamentosos, estudos caracterizando

MEPs de dermatófitos determinaram que estas são inicialmente geradas como pré-

proteínas com processamento pós-traducional, com sítios de glicosilação identificados em

MEPs maduras que possuem ação na quebra de nutrientes e na invasão do tecido

hospedeiro (Apodaca & McKerrow, 1989; Brouta et al., 2001).

Dessa forma, a expressão de proteases, como SUBs e MEPs que agem

especificamente na quebra da queratina, reflete o alto nível de especialização que os

85

dermatófitos desenvolveram para a invasão e retirada de nutrientes da pele e seus anexos,

necessários para a manutenção do seu metabolismo durante a infecção. Isto inclui eventos

de duplicações em genes ancestrais que geraram famílias codificadoras de proteases

secretadas, culminando neste aperfeiçoamento essencial para a instalação da dermatofitose

(Jousson et al., 2004).

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Alguns cDNAs isolados na biblioteca TRSSHQue apresentaram alta similaridade

com outra grande classe de proteínas tipo transportadores de membranas, que são

responsáveis pela manutenção da composição citoplasmática de uma célula, seja em

relação ao meio extracelular ou às organelas membranosas. Estes são essenciais para a

manutenção da célula e para uma rápida adaptação de acordo com possíveis alterações

ambientais, seja para regular captação de nutrientes no meio, exclusão de metabólitos

secundários ou de substâncias tóxicas. O MFS (Major Facilitator Superfamily) é o maior

grupo de transportadores que se ligam a íons e translocam seus substratos contra um

gradiente eletroquímico (Vardy et al., 2004). Existem mais de 70 famílias distribuídas

nesta superfamília, com especificidades para diferentes substratos e transporte em uma

única direção ou em ambas (Marger & Saier Jr, 1993), incluindo diferentes permeases. As

sequências dos clones envolvidos neste contig (Q-29) foram analisadas no InterProScan, o

que revelou um motif conservado para transportadores de peptídeos tipo PTR2-A. A

hibridização via northern blot utilizando este transcrito como sonda foi presente em ambas

condições, com nítido aumento da expressão no teste (cerca de 1,5 vezes em relação ao

controle) (Fig. 10). Sendo assim, esse transportador de peptídeos deve estar envolvido no

transporte de metabólitos gerados na degradação da queratina disponível no meio para o

interior da célula fúngica.

86

Várias cópias de outras seqüências isoladas na biblioteca TRSSHQue foram

submetidas ao InterProScan e identificadas com região característica de hidrolase

transmembrana ATPase P-TYPE, com sítio de ligação para ATP, que participa também do

transporte de cobre. Em C. albicans e S. cerevisiae (Weissman et al., 2000) existem

transportadores associados à resistência a altas concentrações de cobre, servindo como uma

bomba de efluxo ao expulsar o excesso do cobre do citoplasma. A nossa seqüência

identificada de T. rubrum (EB086878) apresentou homologia em alguns alinhamentos com

transportadores deste tipo de C. albicans (acesso AAF04593; e-value 2e

-05

; Acesso

AAF78958; e-value 2e

-05

), com alta expressão confirmada através de northern blot (Fig.

10).

Na citação acima, os autores confirmaram a expressão do gene codificador deste

transportador ATPase em C. albicans (CaCRP1) quando esta foi cultivada em meio com

alta concentração de cobre e em condições ácidas e aeróbicas. Nestas circunstâncias há

uma associação quanto à capacidade de defesa contra a toxicidade do cobre através de

bombas de efluxo com a adaptação desta levedura em colonizar e infectar o trato

digestório, que possui uma concentração de cobre específica.

Várias ATPases estão implicadas no transporte de cobre intracelular entre

organelas, sendo proteínas relacionadas com a doença de Menkes e de Wilson em humanos

e também no metabolismo geral de S. cerevisiae, presentes na superfície do Complexo de

Golgi. Dados de microscopia fluorescente demonstraram a localização desta proteína

transmembrana na membrana plasmática de C. albicans (Weissman et al., 2000).

Recentemente foi isolada linhagem mutante de Salmonella sp resistente a prata que

apresentava sequência gênica similar a de um transportador ATPase de cobre. Pode ser que

a resistência a determinados metais mediada por esta proteína represente um importante

mecanismo associado à virulência de alguns patógenos (Riggle & Kumamoto, 2000).

87

Parisot et al (2002) geraram um mutante avirulento e com pouca pigmentação de

Colletrichum lindemuthianum. Neste caso, análises moleculares identificaram a inserção

do plasmídeo no gene clapI, responsável pela codificação do putativo transportador

ATPase de cobre homólogo ao gene CaCCC2 de S. cerevisiae. A complementação do

mutante de C. lindemuthianum com o alelo clapI selvagem restaurou a patogenicidade e a

pigmentação (Parisot et al., 2002). Todos os dados observados sugerem que o gene

responsável pela codificação deste transportador ATPAse de cobre deve estar relacionado

com a patogenicidade de alguns organismos, inclusive de T. rubrum.

Na biblioteca TRSSHQue, as análises no Blast revelaram que sequências altamente

reguladas nas populações de cDNAs teste apresentam homologia com um transportador

ABC tipo-MDR de T. rubrum (100% de identidade), codificado pelo gene TruMDR2,

clonado e identificado anteriormente (Fachin et al., 2006). No InterProScan foi confirmada

a classificação do clone como seqüência relacionada à resistência de múltiplas drogas com

sítio de ligação para o ATP. Transportadores ABC fúngicos têm ampla função como

bombas de efluxo, dando a característica de resistência a diversas drogas para vários

microrganismos (Urban et al., 1999). Várias sequências relacionadas ao sistema efluxo de

multidrogas foram identificadas na análise parcial de ESTs do T. rubrum (Wang et al.,

2006). Ademais, genes codificadores da classe ABC foram identificados como importantes

fatores de virulência nos estágios iniciais da infecção efetivada por fungos filamentosos,

como demonstrado em M. grisea (gene ABC1), Botrytis cinerea (BcatrB) e Gibberella

puricales (Vermeulen et al., 2001; Fleissner et al., 2002). Este transcrito também foi

validado em experimentos de northern blot, mostrando-se quase 8 vezes expresso na

condição teste (cultivo em queratina) em comparação com controle (Fig. 10).

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Outro transcrito isolado a partir dos clones de T. rubrum na biblioteca TRSSHQue

e que também foi testada nos experimentos de northern blot, apresentou similaridade com

um gene que codifica a proteína TINA, envolvida no ciclo celular de Emericella nidulans

(anamorfo de A. nidulans) e com marcação positiva na condição teste, obtida após

crescimento de T. rubrum em queratina.

O gene tinA codifica uma proteína de 553 aminoácidos (TINA) que interage a em

uma região da NIMA quinase (Never In Mitose A) e juntas regulam processos específicos

durante a mitose (Osmani et al., 2003). As proteínas tipo NIMA são caracterizadas

estrutural e funcionalmente como serino-treonina quinases, uma classe relacionada à

morfogênese, ciclo celular e patogenicidade em fungos filamentosos (Dickman & Yarden,

1999). Várias proteínas relacionadas às quinases tipo-NIMA têm sido isoladas e

caracterizadas em N. crassa e Schizosaccharomyces pombe (Grallert et al., 2004),

participando na ativação de diversas etapas da divisão celular como a condensação dos

cromossomos e a fragmentação da lâmina nuclear, sendo a proteína TINA associada à

estrutura que constituem os microtúbulos e a formação dos mesmos durante a mitose.

Alguns atores sugerem uma função especializada da NIMA quinase em fungos, que

pode ocorrer devido às características exclusivas da mitose na germinação conidial, como

durante a fase G2 do ciclo celular (O’Connel et al, 2003). Considerando que a germinação

dos conídios implica em alterações nos microtúbulos e na estrutura geral do citoesqueleto

da célula durante a divisão celular, é possível que a expressão de uma proteína TINA

identificada na biblioteca TRSSHQue e validada por northern blot (Fig. 9), que interage

com NIMA quinase, esteja relacionada ao alongamento das hifas de T. rubrum nesta etapa.

89

Isto afetaria a capacidade de invasão deste dermatófito no tecido hospedeiro durante o

processo infeccioso, momento de constante divisão celular.

Sequências de transcritos relacionadas a proteínas envolvidas no metabolismo geral

fúngico foram identificadas em abundância nas duas bibliotecas geradas, fato constatado

também com o isolamento na TRSSHQue de transcritos similares a glucosamina-6-fosfato

deaminase de A. fumigatus codificada pelo gene nag1. Esta enzima é induzida durante a

formação do tubo germinativo em C. albicans (Gopal et al., 1982). A linhagem de C.

albicans mutante homozigota para o gene nag1 mostrou deficiência na captação de

GlcNAc, ausência de formação de tubo germinativo e virulência altamente atenuada, como

observado em diversos testes bioquímicos e de infecção em ratos (Wei et al., 2001),

possivelmente através de mecanismos relacionados à produção de adesinas e enzimas

hidrolíticas (Niewerth et al., 2003).

Com a metodologia de northern blot foi possível confirmar a indução da expressão

diferencial do gene gag-pol em T. rubrum cultivado em queratina. O singlet Q-1 alinhou

com alta similaridade (e-value 2e

-43

) em uma poliproteína de Glomerella cingulata

(anamorfo: Colletotrichum gloeosporioicdes). No fitopatógeno C. gloeosporioides, o gene

Cgret codifica duas putativas poliproteínas que tem homologia com genes gag e pol de

outros transposons fúngicos e virais . Além disso, a nossa sequência analisada no InterPro

apresentou domínio vWF (von Willebrand factor, type C), encontrado em quase todas as

proteínas extracelulares. Outras proteínas intracelulares também apresentam domínio vWF

e estão envolvidas em funções como transcrição, reparo de DNA, transporte

transmembrana, transdução de sinais, adesão e migração celular. A região do gene Cgret

homóloga ao gene gag de retrovírus tem 2.520 pb, e apresenta domínio zinc-finger para

ligação em ácidos nucléicos (Zhu & Oudemans, 2000). Vários genomas virais são

traduzidos em grande poliproteínas pela maquinaria hospedeira, sendo clivados através de

90

regulação pós-transcricional em enzimas, material capsular e outros componentes virais, p.

ex., no caso do piconavírus com uma cisteína peptidase que é processada de uma

poliproteína. Esse conhecimento acerca da atuação das poliproteínas tem sido utilizado

para o desenvolvimento de drogas contra o HIV-1, preparando inibidores de poliproteínas

com a finalidade de se evitar o processamento das estruturas virais (James, 2006).

Baseado em dados do Blastx, este transcrito (singlet Q-1) também se mostrou

similar à retrotransposons encontrados em genomas de diversos organismos, como em C.

neoformans (Loftus et al., 2005), que possui um genoma rico em transposons. Elementos

transponíveis podem exercer influência no desenvolvimento de novos genótipos

patogênicos em vários microrganismos, já que são caracterizados como fonte de mutações

espontâneas com impacto evolutivo em muitos organismos procariotos e eucariotos

(Bingham & Judd, 1981; Shcherban et al., 2000; Galagan et al., 2003). Retrotransposons

têm sido detectados em diversos fungos filamentosos como Magnaporthe grisea,

Cladosporium fulvum e Fusarium oxysporu (Schmitt et al., 2001), e devido à conhecida

capacidade de movimentação dos transposons em genomas, essa característica pode

direcionar a instabilidade cariotípica e variação genotípica. Há evidências que indicam

funcionalidade em determinados transposons, tendo sido adotadas várias estratégias para

estudos de retrotransposons em fungos filamentosos, visando os mecanismos de geração de

diversidade genética e interferência na patogenicidade (Anaya & Roncero, 1996; Daviere

et al., 2001; James, 2006).

Adicionalmente, um dos singlets isolado e validado através de northern blot é

similar a uma pequena chaperona do tipo Hsp30. Seymour e Piper (1999) demonstraram

em S. cerevisiae que Hsp30 pode ser ativada sob diferentes condições de estresse além de

choque térmico, como exposição a etanol e a ácidos orgânicos (Seymour & Piper, 1999).

Baseando-se em vários dados, Plesofsky et al (1999) propuseram que Hsp30 se liga a uma

91

proteína translocase da membrana externa mitocondrial, agindo como chaperona em

componentes que interagem com essa translocase em determinadas temperaturas

(Borkovich et al., 2004). Chaperonas tem importante papel na translocação de proteínas,

proporcionando mudanças conformacionais qua auxiliam no transporte e consequente

ativação de proteínas nos seus locais de ação. A ação de Hsp30 em fungos patogênicos

ainda não foi determinada, portanto é necessário aprofundar o conhecimento para entender

quais as proteínas que dependem de associação com proteínas heat shock.

Muitas sequências dentre os singlets apresentaram-se praticamente idênticas a

determinados contigs. Isso pode ocorrer, já que o programa CAP3 tem parâmetros

definidos para aproveitar as sequências nas sobreposições, considerando um mínimo de 40

bases sobrepostas e pontuando de acordo com a qualidade de alinhamento entre cada base,

existência de gaps e outras características (Saier et al., 1999). Sendo assim, os singlets não

incluídos nos devidos contigs podem ter ficado fora do arranjo por não se enquadrarem nos

parâmetros considerados, como podemos observar entre os singlets com sequências

similares a transportadores MFS, subtilisina, metaloprotease, citocromo p450nor,

glucosamina-6-fosfato deaminase e hipotéticas de A. nidulans e A. fumigatus.

Apesar de vários clones da biblioteca TRSSHQue de T. rubrum terem apresentado

resultados satisfatórios nos alinhamentos e classificações funcionais, alguns contigs e a

maioria dos singlets não apresentaram similaridades no banco de dados NR do NCBI. Tais

sequencias podem ser sequências exclusivas do T. rubrum e representar genes únicos que

merecem uma abordagem mais aprofundada, pois há chances de caracterizar novos genes

não apenas relacionados ao metabolismo geral de fungos.

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A metodologia para geração de biblioteca subtrativa supressiva já foi utilizada para

confirmar a alta expressão de enzimas com ação direta/indireta em lipídeos, como no

patógeno Histoplasma capsulatum (Lisofosfolipase) (Shim et al., 2004), P. brasiliensis

(Marques et al., 2004) e M. grisea (Lu et al., 2005). Os produtos de genes relacionados à

resposta aos lipídeos vêm emergindo como potenciais alvos farmacológicos, uma vez que

os lipídeos e as vias metabólicas onde estes estão envolvidos têm sido associados a críticos

eventos celulares (crescimento da célula fúngica, replicação, diferenciação, apoptose,

transdução de sinal e transcrição) e nos processos infecciosos.

Na Tabela 4 observamos detalhes da anotação funcional através do Blast (NCBI),

onde o contig L-1 com 16 clones tem seqüências similares ao transportador MDR de T.

rubrum (97 % de identidade). É importante salientar que várias sequências de transcritos

com mesma anotação funcional (tipo MDR) também foram isolados na biblioteca

TRSSHQue, com validação por northern blot. A ampla função de transportadores tipo

MDR vem sendo estudada em patógenos humanos e de cultivares diversos (de Waard et

al., 2006). Apesar da multifuncionalidade, ainda não se conhece detalhes acerca do

transporte de nutrientes por MDRs, e o isolamento de várias sequências similares a

transportadores tipo MDR após o cultivo de fungos em fontes como queratina e lipideos

deve ser mais explorada.

O singlet L-9 apresentou similaridade com a subunidade alfa (α) da proteína G de

C. immitis (80 % de identidade; e-value 1e-

35

), uma proteína transmembrana e trimérica

(αβγ), mediadora de sinais de transdução em eucariotos, ativando e regulando atividades

metabólicas na célula com um fino controle da expressão gênica (Seo et al., 2005). São

necessários estímulos ambientais para ativação e consequente dissociação das subunidades

93

(α e βγ), cada uma com função ativadora em uma ampla variedade de moléculas efetoras,

como fosfolipases, canais de íons e adenilato ciclase (Kaufman et al., 2007). Na análise

dos genes diferencialmente expressos no patógeno M. grisea, pesquisadores confirmaram a

alta expressão da proteína G após a indução/formação do apressório maduro em

comparação com o controle (micélio vegetativo) (Jin et al., 2007).

Existem vários estudos das proteínas G em organismos fúngicos modelos

(Saccharomyces, Neurospora e Aspergillus) e patogênicos. Estudando o fungo N. crassa,

Ivey e colaboradores (1996) obtiveram uma cepa mutante (∆gna-1) da subunidade α que

apresentou alteração em múltiplos fenótipos durante o crescimento vegetativo e sexual. O

∆gna-1 exibiu vários defeitos na macroconidiação relacionados a diferenças na morfologia

das hifas aéreas e baixa produção de conídios, além de conídios pouco aderentes em

relação aos obtidos da cepa selvagem (Ivey et al., 1996), entre outras alterações. Vias

sinalizadoras no fitopatógeno F. oxysporum ativam cascatas enzimáticas através de

proteínas G, regulando sua patogenicidade (Jain et al., 2002), e a disrupção de genes

codificadores das subunidades α e β destas proteínas gerou mutantes morfologicamente

alterados e com conidiacão reduzida, caracterizando retardo na infecção em plantas

susceptíveis com redução marcante da virulência. Em Cochliobolus heterostrophus,

mutações nas subunidades α e β da proteína G afetaram vários estágios do

desenvolvimento celular e a formação do apressório, com redução da conidiacão e

virulência durante a infecção no arroz (Sherif, et al., 2004). Vários estímulos ambientais

podem acionar as proteínas G, muitos deles oriundos de fontes nutricionais, e assim

interferindo em diversas redes metabólicas, sendo importante avaliar este gene em T.

rubrum.

O contig L-2 apresentou similaridade com o gene que codifica um precursor da

glicoproteína secretada (43 kDa) de P. brasiliensis (47 % de identidade) e teve sua

94

expressão confirmada por northern blot (Fig. 14), enquanto o singlet L-7 é similar a uma

proteína hipotética de C. immitis (92 % de identidade; e-value 1e-

29

), todos fungos

altamente patogênicos. Uma glicoproteína é uma proteína que sofreu processamento pós-

traducional com glicosilação em algumas regiões específicas que interferem na estrutura e

função de proteínas secretadas e/ou de membranas. A adição de diferentes resíduos de

carboidratos (glicosilação) define parte da função protéica, e vem sendo largamente

estudada em S. cerevisiae (Herscovics & Orlean, 1993). Na levedura C. neoformans a

produção de fosfolipases secretadas é um fator de virulência (Chen et al., 1997; Hossain &

Ghannoum, 2000), sendo as principais conhecidas como PLB1 (fosfolipase B1), LPL1

(lisofosfolipase) e LPTA (lisofosfolipase/transacilase), enzimas que apresentam resíduo

glicoprotéico de 90-120 kDa e que degradam substratos preferencialmente saturados de

lipídeos. Em C. Gatti foi identificada nova fosfolipase com atuação marcante em pH 7,0,

também encontrada em C. neoformans var. grubii (Wright et al., 2004).

A capacidade de adesão de fungos nas superfícies celulares vem sendo atribuída à

presença de glicoproteínas na parede celular desses microrganismos (Ferreira-Nozawa et

al., 2003), como também é observado em C. albicans (Ogawa et al, 1998). Pouco é

conhecido sobre os mecanismos moleculares da secreção de proteínas em fungos

filamentosos. No Trichoderma reesei (Pakula et al., 2000), utilizado na produção e

secreção protéica para uso industrial, foi possível obter in vitro a glicosilação (com [35S]

metionina ou [14C] manose) e secreção da celobiohidrolase 1 (CBH1), destacando-se

como uma ferramenta biotecnológica útil. A superfície da glicoproteína 43 kDa de P.

brasiliensis é considerada o principal componente antigênico em pacientes acometidos por

paracoccidioimicose pulmonar (PCM) (Gonzalez et al., 2008), que diminui a função de

macrófagos como um mecanismo para fuga do sistema imune do hospedeiro.

Experimentos em ratos tratados (teste) com células dendríticas estimuladas com plugs de

95

gp43 obtidos na presença de fonte lipídica mostraram um aumento das unidades

formadoras de colônias nos pulmões, o que não foi observado no grupo de ratos não

tratados (controle) (Ferreira & Almeida, 2006). Dessa forma, demonstraram que gp43 tem

o poder de afetar várias funções na célula hospedeira, diminuindo a atividade de moléculas

de classe II do MHC, CD54, CD40 e CD80, também com a redução da capacidade

aderente de células dendríticas, principal defesa que inicia a resposta imune contra o P.

brasiliensis. Mecanismos de resistência e susceptibilidade a PCM não são totalmente

claros, mas evidências de ação inibitória do sistema imune pelo antígeno gp43 com

aumento na patogenicidade de P. brasiliensis já foi relatado (Camargo et al., 1989;

Vicentini et al., 1994).

Já a sequência do singlet L-8 codifica uma proteína similar a uma serino/treonina

fosfatase (95 % de identidade) de A. niger, que remove os grupamentos fosfatos de

proteínas para a regulação de cascatas enzimáticas presentes em uma grande variedade de

processos celulares. Fosfatases ácidas e alcalinas são frequentemente produzidas e

secretadas por fungos filamentosos em condições específicas (Guimarães et al., 2003;

Borkovich et al., 2004), com associações diretas à patogenicidade da levedura C. albicans

(Lee et al., 2004) e de Botrytis cinerea (Schumacher et al., 2008)

Os transcritos isolados podem estar relacionados à patogenicidade ou virulência em

dermatófitos, sendo este o primeiro ensaio molecular para detectar genes expressos após

contato de T. rubrum com lipídeos, o que mostra a necessidade de experimentos mais

apurados de expressão gênica para atestar o envolvimento destes genes no estabelecimento

das dermatofitoses.

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Como já demonstrado, patógenos modulam o pH do sítio hospedeiro e regulam sua

virulência em um mecanismo que permite a expressão de genes e secreção de seus

produtos apenas em condições de pH ótimos para suas atividades (Nahas et al., 1982),

processo relacionado ao sucesso adaptativo durante a infecção . Em dermatófitos, a

adaptação metabólica também ocorre após a identificação das características do local e

consequente regulação gênica para estabelecer os passos iniciais da infecção. Dentre os

genes com ativação regulada pelo pH ambiente após cascata de sinalização estão os

codificadores de enzimas secretadas, permeases e reguladores da expressão de genes que

codificam enzimas de atuação intracelular (Espeso & Penalva, 1996; Nozawa et al., 2003;

Maranhão et al., 2007), além de outros compostos que podem ser exportados e causar uma

gradativa alcalinização do ambiente infectado. O modelo proposto por Caddick et al

(1986) para a regulação da expressão gênica através do pH em A. nidulans demonstrou que

o fator de transcrição pacC ativa ou reprime genes específicos, dependendendo do pH

extracelular.

A importância de grandes famílias de proteases (subtilisinas e metaloproteases)

relacionadas à virulência em vários fungos e com ótima atividade em pH alcalino foi

abordada anteriormente, ressaltando no importante papel destas para a degradação de

tecidos, e consequentemente na disseminação de patógenos para o desenvolvimento de

doenças (Jousson et al., 2004). Sendo assim, uma vez que na biblioteca TRSSHQue foram

isoladas seqüências de transcritos similares a proteases queratinolíticas com atividade em

pH alcalino, experimentos de northern blot com a linhagem ∆pacC-1 de T. rubrum

utilizando sondas desses transcritos foram efetivados para uma avaliação comparativa do

padrão de expressão em relação a linhagem selvagem. Para este fim, as linhagens foram

97

cultivadas separadamente seguindo o mesmo protocolo adotado para a geração da

biblioteca citada. Observou-se uma menor expressão de todas as proteases testadas (Sub 3

e 5 e Mep 4) na linhagem ∆pacC-1 cultivada em queratina em relação a selvagem H6 (Fig

15). Pode-se observar também que a expressão destas proteases estão ligeiramente

aumentadas na linhagem ∆pacC-1 comparada com a linhagem selvagem, ambas cultivadas

em glicose, onde o pH do meio de cultivo permanece ácido. Dessa forma é possível

concluir que o fator de transcrição PacC da linhagem selvagem de T. rubrum participa da

ativação destas proteases em queratina (pH alcalino) e parece também estar envolvido na

inibição das mesmas em glicose (pH ácido).

Esses resultados são corroborados por análises da linhagem ∆pacC-1, quando a

disrupção do gene pacC foi correlacionada com a diminuição na habilidade em crescer sob

fragmentos de unhas como única fonte de nutrição, em relação à linhagem selvagem H6

(Ferreira-Nozawa et al., 2006). O mesmo grupo também observou que a secreção de

proteases queratinolíticas é diminuída no mutante ∆pacC-1 em relação a linhagem H6, em

meio liquido suplementado com queratina, apesar das duas linhagens apresentarem o

mesmo fenótipo quando crescidas em meio Sabouraud ágar. Essas observações também

são consistentes com o fato de que T. rubrum falha ao crescer em meio contendo PMSF,

um inibidor especifico de proteases (Takasuka, 2000). Resultados similares foram obtidos

com o fungo filamentoso Fusarium verticillioides, um fitopatógeno que teve o gene

homólogo ao pacC de A. nidulans isolado e caracterizado (Flaherty et al., 2003).

Patógenos humanos como o fungo C. albicans e bactérias como Salmonella

typhimurium e E. coli apresentam virulência dependente do pH externo (Slonczewski &

Blankenhorn, 1999; Davis et al., 2000). Em C. albicans já foi confirmado que existem

genes diretamente relacionados à patogenicidade e que são regulados pelo homólogo do

gene pacC de A. nidulans (Ramon et al., 1999; Li, 2004), envolvidos em mudanças

98

morfológicas determinantes para estabelecer o estado patogênico leveduriforme. Bignell et

al (2005) estudaram mecanismos dependentes do pH em agentes causadores da aspergilose

pulmonar. Ao gerar mutantes para o gene pacC, observaram atenuação severa da virulência

nas novas cepas quando essas também se mostraram com limitações no crescimento in

vivo, concluindo que o gene pacC é requerido para a virulência em espécies de Aspergillus.

É possível observar resultados semelhantes em fungos que atacam plantas. A

expressão do gene que codifica a endo-1,4-β-gluconase foi aumentada em Alternaria

alternata (Eshel et al., 2002), bem como proteases que foram ativadas em Metarhizium

anisopliae (St. Leger et al., 1998), enquanto o pH ambiente encontrava-se alcalino. A

secreção de proteases em isolados fitopatogênicos de Colletotrichum, além de lipases,

celulases, pectinas (Maccheroni et al., 2004) também foi alterada em resposta ao pH

externo.

Uma cepa mutante do fitopatógeno Sclerotia sclerotiorum com perda de função

após mutação no gene homólogo ao pacC (pac1), teve seu crescimento completamente

inibido em pH alcalino com redução de 75% na produção de ácido oxálico, considerado

essencial para a virulência deste organismo (Rollins, 2003). Outras características deste

mutante foram avaliadas, como a diminuição na síntese de enzimas que degradam a parede

celular da célula hospedeira, o que reduziu drasticamente a virulência de S. sclerotiorum.

Já em A. niger ocorre conidiogênese alterada após mutação no pacC (MacCabe et al.,

1996), enquanto que a cepa de U. maydis mutada no pacC (altamente similar com a

sequência do pacC de A. niger) mostrou alteração na morfogênese, aumento na

sensibilidade às enzimas líticas e redução na produção de proteases (Arechiga-Carvajal &

Ruiz-Herrera, 2005), similarmente aos nossos resultados, apesar da transição dimórfica de

U. maydis induzida in vitro pelo pH não ter sido afetada após mutação no pacC.

99

A partir destes dados, sugere-se que o gene pacC de T. rubrum tenha um papel

fundamental na regulação de genes necessários à uma infecção eficiente, sendo notável a

sua relação com a virulência de fungos filamentosos como o T. rubrum. A busca de outros

genes ativados pelo gene pacC e estudos mais aprofundados de cada um deles pode

elucidar vias metabólicas e auxiliar no entendimento de mecanismos moleculares

importantes para a manutenção de dermatofitoses crônicas.

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∆TruMDR2

de T. rubrum

Uma vez que um grande número de sequências similares ao tranportador

ABC/MDR foram identificadas tanto na biblioteca com teste em queratina (TRSSHQue)

como no teste em fonte lipídica (TRSSHLip), optou-se por utilizar o modelo de infecção in

vitro com a linhagem H6 para entender melhor os efeitos de uma mutação no gene

TruMDR2, que codifica um transportador tipo- ABC/MDR em T. rubrum e que se mostrou

super expresso tanto em meio suplementado com queratina quanto com lipídeo. O gene

TruMDR2, foi altamente transcrito após a exposição à acriflavina, cetoconazol,

clorafenicol, griseofulvina, fluconazol e outros agentes citotóxicos, como demonstrou

Fachin et al. (2006) através de northern blots utilizando a linhagem selvagem H6. Fachin

et al (2006) também realizaram análises funcionais no mutante interrompido no gene

TruMDR2 (linhagem ∆TruMDR2) e constataram

a hipersensibilidade à 4-nitroquinoline-N-

oxide (4NQO), terbinafina e brometo de etídio. Em nossos ensaios infecciosos, o nocaute

foi estritamente correlacionado com a diminuição da habilidade do mutante ∆TruMDR2

em crescer sob unhas humanas quando comparado com a linhagem selvagem H6 (Fig. 16).

Logo, os genes tipo-MDR podem afetar outros aspectos do metabolismo além do efluxo de

100

drogas, podendo estar envolvido no transporte de nutrientes como fontes de carbono

diferenciadas.

A capacidade do fungo infectante em regular sua expressão gênica e ultrapassar as

resistências imunológicas do hospedeiro são cruciais para a sobrevivência dos dermatófitos

durante o processo infeccioso, e a expressão de vários transportadores de membrana

celular identificados nos nossos experimentos confirmam que há um sistema de transporte

requerido para o ótimo crescimento de T. rubrum em substratos queratinizados. Além

disso, com o uso de fragmentos de unha como única fonte nutricional para as linhagens

testadas, foi confirmada a baixa conidiação do mutante ∆TruMDR2 comparado com a

linhagem H6, sugerindo que o gene TruMDR2 pode estar envolvido em mecanismos de

virulência de T. rubrum.

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• T. rubrum foi capaz de alterar gradativamente o pH do meio de cultivo durante o

crescimento em diferentes fontes de carbono (queratina e lipídeo), sendo esta alteração

captada pela célula fúngica e relacionada com uma expressão regulada de genes.

• O uso da hibridização subtrativa seguida de PCR supressivo e de ferramentas

bioinformáticas possibilitou o isolamento e análise de genes diferencialmente

expressos de T. rubrum, após o tratamento pré-programado com fontes de carbono,

estabelecendo um padrão de resposta diferenciada frente a compostos tipicamente

encontrados em sítios infectados por dermatófitos.

• Queratina ou fonte lipídica no meio de cultivo ativa a expressão gênica em T.

rubrum, regulando genes codificadores de proteínas queratinolíticas, relacionadas

ao ciclo celular e ativas para a transdução de sinais, além de outros processos

metabólicos relacionados à virulência fúngica.

• Em T. rubrum, o isolamento e validação de transcritos similares à

transportadores transmembranas, após o cultivo tanto em queratina quanto em

lipídeo, reflete um sistema de transporte com provável função regulatória.

Observou-se ainda a redução da virulência na linhagem ∆TruMDR2 durante o

crescimento em fragmentos de unhas, sugerindo que o gene codificador de um

transportador tipo-MDR está envolvido na virulência de T. rubrum.

• O gene pacC interfere na expressão de genes alcalino-específicos neste

dermatófito, como os codificadores de importantes fatores de virulência ativos nas

dermatofitoses (subtilisinas e metaloproteases), atestando sua função na regulação

de genes necessários a infecção.

• O presente trabalho contribuiu para o depósito de sequências no banco dBEST

do NCBI, agregando dados acerca de Genômica estrutural e funcional que podem

auxiliar em estudos futuros.

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118

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E

X

O

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PATHOGENESIS

MICROBIAL

Microbial Pathogenesis 43 (2007) 166–172

Isolation of transcripts over-expressed in human pathogen Trichophyton

rubrum during growth in keratin

Fernanda C.A. Maranha

˜

o, Fernanda G. Paia

˜

o, Nilce M. Martinez-Rossi

Ã

Departamento de Gene

´

tica, Faculdade de Medicina de Ribeira˜o Preto, Universidade de Sa˜o Paulo, Av. Bandeirantes 3900,

14049-900 Ribeira˜o Preto, SP, Brazil

Received 2 March 2007; accepted 14 May 2007

Available online 21 May 2007

Abstract

Trichophyton rubrum is a cosmopolitan and anthropophilic fungus able to invade keratinized tissue, causing infection in human skin

and nails. This work evaluated the changes in the extracellular pH during its growth in keratin (after 6, 12, 24, 48, 72 h and 7 days) at

initial pH 5.0. We observed a gradual increase of basal pH under keratin exposure when compared to glucose condition. Also, we

identiﬁed 576 T. rubrum transcripts differentially expressed by subtractive suppression hybridization (SSH) using conidia cultivated for

72 h in keratin as tester, and cultivated in glucose as driver. The over-expression of 238 transcripts obtained under keratin condition was

conﬁrmed by macro-array dot-blot, revealing 28 unigenes. Putative proteins encoded by these genes showed similarity to fungi proteins

involved in basic metabolism, growth and virulence, i.e., transporters ABC-MDR, MFS and ATPase of copper, NIMA interactive

protein, Gag-Pol polyprotein, virulence factors serine-protease subtilisin and metalloprotease, cytochrome P450, GlcN-6-phosphate

deaminase and Hsp30. The upregulation of T. rubrum genes encoding subtilisin, metalloprotease and Gag-Pol polyprotein was also

validated by northern blot. The results of this study provide the ﬁrst insight into genes differentially expressed during T. rubrum grown in

keratin that may be involved in fungal pathogenesis.

Keywords: Dermatophyte; Keratin; SSH; Trichophyton rubrum; Virulence

1. Introduction

Dermatophytosis are superﬁcial mycoses caused by a

group of ﬁlamentous fungi called dermatophytes, which

are able to invade keratinized substrates such as hair, nails

and stratum corneum, causing diseases in humans and

animals [1]. Trichophyton rubrum, an anthropophilic and

cosmopolitan fungus, is the most common agent of

superﬁcial mycoses [2,3], causing rarely deep dermatophy-

tosis in immunoco mpromised hosts [4,5].

During infec tion, T. rubrum regulates the expression of

several genes involved in environment adaptation and

keratin degradation. This ﬁbrous protein, which is the

structural component of vertebrates skin and nails [6],

contains a cystine-rich matr ix with disulﬁde bonds to

maintain high stability [7]. The secretion of proteolytic

enzymes by dermatophytes is a key factor in the invasion,

utilization and subsequent dissemination through the

stratum corneum of the host [8]. Enzymes such as

phospholipases and proteases, which are speciﬁc virulence

factors associated with T. rubrum pathogenicity, have been

identiﬁed [9].

The homeostatic pH governs the growth, differentiation,

physiology, and viability of all living organisms and the

fungi Neurospora crassa and Aspergillus nidulans adjust the

ambient pH as function of the nutrient utilized [10]. The

pH inﬂuence in protein activity has been well documented,

interfering in metabolism and virulence of pathogenic

microorganisms. A model for the pH regulation of

proteolitic enzymes in dermatophytes [11] describes the

activation of general proteases acid-speciﬁc after contact

with skin (acid pH), while it repres ses keratinases and other

proteins with optimal activity in pH alkaline. During

infection, the metabolic machinery enables the fungus to

use macromolecules as source of nitrogen, sulfur and

ARTICLE IN PRESS

www.elsevier.com/locate/micpath

doi:10.1016/j.micpath.2007.05.006

Ã

Corresponding author. Tel.: +55 16 3602 3078; fax: +55 16 3633 0069.

E-mail address: [email protected] (N.M. Martinez-Rossi).

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carbon, creating signals that lead to an alkaline environ-

ment. In an adaptive response for environment pH, the

fungus represses proteases with optimal activity at acid pH

and activates alkaline-speciﬁc genes for infection installa-

tion. Thus, it is important to understand this machinery,

since the pathogenicity of many microorganis ms has been

demonstrated to depend on the sensing of pH ambient in

the host.

Subtractive suppression hybridization (SSH) has been

very useful for identifying genes upregulated during

host–pathogen interaction [12]. In an attempt to identify

genes involved in virulence and adaptation to the host, a

SSH cDNA library was constructed and transcripts

upregulated after T. rubrum exposure to keratin were

isolated. Our results show that growth on keratin induces

several genes that are probably virulence factors. Also,

these results will provide a greater understanding of the

infection strategy of this dermatophyte.

2. Results

2.1. pH change

The ability to regulate the gene expression in response to

changes in environment pH is relevant in the pathogenicity

of many ﬁlamentous and dimor phic fungi. Then, we

evaluated changes in pH of the media during T. rubrum

growth in glucose and keratin sources at 6, 12, 24, 48, 72 h

and 7 days post-inoculation. These times were chosen since

there was an infection model of dermatophytes that

proposes a gradual alkalinization during the adaptation

in infection process. T. rubrum promoted an increase of

medium initial pH from 5.0 to 8.4 in keratin. However, this

effect was not observed when the fungus was cultivated in

glucose as carbon source, where the pH was maintained at

approximately 5.0 (Table 1).

2.2. SSH and macro-array dot-blot

We cultivated MYA-3108 T. rubrum strain in keratin as

tester and in glucose as driver, both as carbon source for

72 h, to characterize fungal gene expression during inter-

action with a substrate typically found in the skin and

nails. Total RNAs were obtained and SSH cDNA library

was constructed, resulting in 576 clones. The mean size for

the ESTs from this library was about 0.5 kb. All clones

were sequenced.

The ampliﬁed inserts were blotted in membranes and

hybridized with tester and driver probes, individually, for a

preliminary screening of differentially expressed clones.

Different and intensive hybridization signals were observed

in membranes labeled with forward subtracted probe, when

compared with membrane hybridized with reverse sub-

tracted probe. These analyses revealed clones that were

considered as candidates for differential expression based

on differential hybridization signals with upregulation in

keratin (Fig. 1).

2.3. Sequence analysis and northe rn blot

Clusters were recovered with CAP3 sequence assembly

program, yielding 40 contigs and 215 singlets. Twenty-eight

non-redundant unigenes, conﬁrmed by macro-array dot-

blot, were compared to NCBI GenBank databases by

ARTICLE IN PRESS

Table 1

Evaluation of pH changing during T. rubrum cultivating in glucose or

keratin as carbon source

Time Final pH

Glucose Keratin

6 h 5.1 5.5

12 h 4.8 5.6

24 h 4.6 6.0

48 h 4.8 7.8

72 h 4.7 8.4

7 days 5.2 8.3

Initial pH was 5.0.

Fig. 1. Macro-array dot-blot proﬁle. Autoradiography of membranes blotted with PCR ampliﬁed cDNA sequences from subtracted library enriched for

T. rubrum gene expressed on the keratin, hybridized with (A) reverse and (B) forward probes cDNA. The clones A-10, G-9 and H-9 were considered false

positive.

F.C.A. Maranha˜o et al. / Microbial Pathogenesis 43 (2007) 166–172 167

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ARTICLE IN PRESS

Table 2

Summary of BLAST search and MIPS classiﬁcation of ESTs differentially expressed in T. rubrum cultivated in keratin (72 h) and identiﬁed by SSH

analysis

EST GenBank

accession

number

Size

a

(bp) Putative ID (GenBank) E-value Number of

clones

FunCat

MIPS

b

TR0046 EB086881 1130 Trichophyton rubrum, subtilisin-like protease SUB5, AAR02424 2eÀ125 49 (20.6%)

c

32

TR0042

EB086877 634 Aspergillus fumigatus, MFS peptide transporter, putative,

EAL84913

1eÀ69 38 (16.0%) 20

T. rubrum cDNA,

DW406372

d

3eÀ155

TR0040

EB086875 564 Coccidioides immitis RS, glucosamine-6-phosphate deaminase,

EAS33387

1eÀ73 37 (15.5%) 02

T. rubrum cDNA,

DW710894

d

0

TR0062

EE681873 500 C. immiti, hypothetical protein, EAS32987 1eÀ24 26 (10.9%) 99

T. rubrum cDNA, similar to Leucine Rich Repeat domain,

DW005365

d

2eÀ153

TR0097

EH038250 224 A. fumigatus, V-type ATPase, subunit B, EAL93618 8eÀ20 16 (6.7%) 20

dT. rubrum cDNA,

DW703261

d

1eÀ68

TR0057

EC275253 416 Emericella nidulans, NIMA interactive protein, AAP23304 4eÀ06 9 (3.8%) 10

T. rubrum cDNA, similar to NIMA interactive protein,

DW005360

d

1eÀ120

TR0044

EB086879 420 T. rubrum, multidrug resistance protein MDR, AAG01549 2eÀ20 9 (3.8%) 20

TR0098

EH038251 647 A. terreus, conserved hypothetical protein, EAU31587 6eÀ31 7 (2.9%) 99

T. rubrum cDNA,

DW692303

d

1eÀ121

TR0045

EB086880 308 A. fumigatus, carboxylic ester hydrolase (Ppe1), putative,

EAL88020

3eÀ23 7 (2.9%) 01

T. rubrum cDNA,

DW005383

d

1eÀ119

TR0041

EB086876 297 A. oryzae, cytochrome P450nor, BAC01275 5eÀ16 6 (2.6%) 32

T. rubrum cDNA,

DW685960

d

5eÀ80

TR0063

EE681874 349 T. rubrum, subtilisin-like protease SUB3, AAR11462 5eÀ25 5 (2.1%) 32

TR0056

EC275252 190 A. fumigatus, DNA polymerase gamma, EAL91351 9eÀ22 3 (1.3%) 10

T. rubrum cDNA, similat to DNA polymerase gamma,

DW005364

d

6eÀ87

TR0051

EB086886 713 Botryotinia fuckeliana, extracellular lipase, putative, AAU87359 1eÀ06 3 (1.3%) 01

TR0061

EC275257 920 C. immitis, conserve d hypothetical protein, EAS31011 7eÀ08 3 (1.3%) 99

T. rubrum cDNA,

DW005379

d

1eÀ83

TR0047

EB086882 259 Arthroderma benham iae, metalloprotease MEP4, AAQ21101 5eÀ27 3 (1.3%) 32

TR0043

EB086878 176 A. fumigatus, copper resistance-associated P-type ATPase,

EAL92309

2eÀ15 2 (0.8%) 20

T. rubrum cDNA,

DW005353

d

8eÀ73

TR0048

EB086883 102 A. oryzae, heat shock protein, class I (30kD), BAD02411 3eÀ06 2 (0.8%) 32

T. rubrum cDNA,

AJ883235

d

5eÀ34

TR0096

EH038249 273 A. fumigatus, short chain dehydrogenase, EAL89916 6eÀ13 2 (0.8%) 02

T. rubrum cDNA,

DW703055

d

1eÀ43

TR0059

EC275255 409 A. fumigatus, kynurenine aminotransferase, putative, EAL89672 7e À 58 1 (0.4%) 01

TR0060

EC275256 490 C. immitis, hypothetical protein, EAS32442 1eÀ30 1 (0.4%) 99

T. rubrum cDNA,

AJ882980

d

1eÀ76

TR0058

EC275254 300 C. immitis, hypothetical protein, EAS28871 2eÀ06 1 (0.4%) 99

T. rubrum cDNA,

DW005367

d

2eÀ142

TR0055

EB086890 231 A. fumigatus, urease accessory protein UreD, EAL93904 7eÀ05 1 (0.4%) 01

TR0052

EB086887 723 A. fumigatus, amino acid permease, putative acid permease,

AAC98709

8eÀ12 1 (0.4%) 20

TR0064

EE681875 446 Glomerella cingulata, Gag-Pol protein, AAG24792 1eÀ43 1 (0.4%) 38

T. rubrum cDNA,

DW005349

d

0

TR0053

EB086888 703 E. nidulans, small GTPase RanA, AAR08135 1eÀ38 1 (0.4%) 30

T. rubrum cDNA,

AJ883484

d

8eÀ109

TR0054

EB086889 237 T. rubrum, metalloprotease MEP3, AAQ21094 3eÀ39 1 (0.4%) 32

TR0065

EE681876 815 A. niger, hypothetical protein, CAK39928 2eÀ41 1 (0.4%) 99

TR0050

EB086885 328 C. immitis hypothetical protein CIMG_00654, EAS35300 3eÀ04 1 (0.4%) 99

T. rubrum cDNA,

DW680201

d

5eÀ54

TR0049

EB086884 484 No match 1 (0.4%) 99

a

Contigs or singlets ESTs.

b

MIPS: 01, metabolism; 02, energy; 10, cell cycle and DNA processing; 20, transport; 30, cellular communication/signal transduction mechanism; 32,

cell rescue, defense and virulence; 38, transposable elements; 99, unclassiﬁed/hypothetical proteins.

c

Percentage in parentheses was calculated based on 238 cDNA clones analyzed.

d

GenBank EST database.

F.C.A. Maranha˜o et al. / Microbial Pathogenesis 43 (2007) 166–172168

Author's personal copy

BLAST algorithms (Table 2). All the 28 genes that had

signiﬁcant hits in the non-redundant database were

homologous to sequences from fungi. The functional

classiﬁcation of these genes into 8 major groups was

performed according to Munich Information Center for

Protein Sequences (MIPs) categorization (Table 2). Table 2

also shows that about 55% of the transcripts analyzed

belong to two categories: the defense/virulence and the

cellular transporters. Five transcripts revealed by the

keratin subtracted library totalized 72% of all transcripts

obtained, which encode proteins similar to a subtilisin-like

protease, a MFS transporter, a glucosamine-6-phosphate

deaminase, an ATPase and a hypothetical protein

(Table 2).

Eighteen of the 28 transcripts had signiﬁcant homologies

with T. rubrum transcripts in the NCBI EST database

(Table 2).

The upregulation of the T. rubrum genes coding for

subtilisin proteas e (TR0046), metalloprotease (TR0047)

and Gag-Pol polyprotein (TR0064) in keratin condition

was conﬁrmed by northern blot analyses (Fig. 2).

Furthermore, the upregulation of copper-transporter gene

(TR0043) was conﬁrmed by virtual northern blot (data not

shown).

3. Discussion

The purpose of this study was to identify genes that are

preferentially expressed when the pathogenic fungus T.

rubrum is growing in medium supplemented with keratin as

carbon source at alkaline pH. We showed that the pH of

the medium remained almost constant during mycelial

growth on glucose as the only carbon source, while during

growth on keratin the pH increased, reaching values higher

than 8.0. Similar result (ﬁnal pH ranging from 8.3 to 8.9)

was obtained when T. rubrum was grown on a mixture

of glycine and glycerol, regardless of the initial growth

pH [13].

The inﬂuence of glucose in the media pH was observed in

experiments with other fungi [14,15]. The glucose represses

the expression of extracellular protease activity, when T.

rubrum and other dermatophytes grow in agar medium

with 2% glucose [16]. Also, it was described that glucose

can repress the production of enzymes from T. rubrum

which hydrolyze guinea pig hair in liquid medium [8].

However, several proteases have been shown to be present

in high levels in mycelium of dermatophytes and other

fungi treated wi th keratin [17,18]. At 72 h post-inoculation

in these experiments, the proteolytic activity of mycelia and

conidia germinated was probably increased. Thus, this time

point was chosen to extract total RNA for use in SSH,

because this period was considered an appropriate starting

point to isolate genes preferentially expressed in alkaline

pH, probably involved in infection maintenance.

T. rubrum genes upregulated under keratin treatment

belong to wide categories of genes. However, the SSH

revealed a high redundancy for some transcripts, such as

those encoding proteolitic enzymes—for instance, subtilisins

(TR0046 and TR0063) and metalloproteases (TR0047 and

TR0054). The differential expression of genes that encode the

subtilisin SUB5 (TR0046) and the metalloprotease MEP4

(TR0047) was also conﬁrmed by northern blot when T.

rubrum was grown into keratin. Since T. rubrum grows

preferentially in stratum corneum, nails or hair, it is evident

that secreted proteases are important for its virulence [19,20].

A SSH cDNA library constructed for Trichophyton menta-

grophytes in similar conditions but with longer incubation

time reve aled that the majority of the transcripts c orre-

sponded to the fungal thioredoxin and cellobiohydrolase

genes [21]. Also, the differential expression of T. mentagro-

phytes proteases genes was detected by RT-PCR amp liﬁca-

tions [2 1]. T. rubrum,

T. men tagro phytes and Microsporum

canis possess a ﬁve-member gene family encoding secreted

metalloproteases. A phylogenetic analysis of genomic and

protein sequences indicates that the multiplication of MEP

genes in dermatophytes occurred prior to species divergence,

suggesting that these genes have a conserved and essential

function in dermatophytes [22].

One gene (TR0040) upregulated upon keratin, which

represented about 16% of SSH clones analyzed, showed

high similarity to Aspergillus fumigatus gene encoding a

glucosamine-6-phosphate deaminase, which participates in

N-acetylglucosamine metabolism. This pathway is well

characterized in Candida albicans and is closely associated

with its virulence and morphogenesis [23]. The role of nag1

gene in C. albicans was investigated with disrupted mutants

ARTICLE IN PRESS

Fig. 2. Northern blot analysis showing differential expression of T.

rubrum genes encoding for a Gal-Pol polyprotein (TR0064), a subtilisin

(TR0046) and a metalloprotease (TR0047). Lanes 1 and 2 represent the

H6 strain grown in glucose and in keratin, respectively. An aliquot (15 mg)

of T. rubrum total RNA was loaded in agarose–formaldehyde gel and

probed with 50 ng of selected cDNA. Ethidium bromide-stained rRNA

bands are shown for comparison on the quantities of loaded RNA.

F.C.A. Maranha˜o et al. / Microbial Pathogenesis 43 (2007) 166–172 169

Author's personal copy

that exhibited highly attenuated virulence in murine model

[24]. In addition, this gene presented different patterns of

induction under several carbon sources and had inﬂuence

in germ-tube formation [25].

The identiﬁcation of EST (TR0064) similar to gap-pol

gene of Cgret retrotransposon element from Glomerella

cingulata (anamorp h: Colletotrichum gloeosporioides)sug-

gests that a transposable element participates in T. rubrum

keratin adaptation. The transposition of these elements in

response to stress conditions has been described in plants,

yeasts and Drosophila [26,27]. Also, several viral RNA

genomes are translated into a large polyprotein by the host-

cell machinery that is cleaved into mature capsid proteins,

non-structural proteins and proteases, such as the picorna-

viruses, which have a cysteine peptidase processed by a

polyprotein [28]. The upregulation of this gene (TR0064)

when T. rubrum was cultivated in keratin was conﬁrmed by

northern blot, suggesting its participation in the infectious

process.

The involvement of transporters in pathogenesis was

already described for phytopathogenic fungi [29]. Our

results show that about 27% of the isolated transcripts by

SSH were related to cellular transporters, and upregulated

upon keratin. One of these transcripts (TR0044) that had

been previously described [30] encodes for a putative

multidrug resi stance transporter (MDR) and is upregulated

also in the presence of different drugs [30,31]. Disruption of

this gene rendered the mutant more sensitive to some drugs

[30] and interestingly presented growth deﬁciency when

cultivated in fragments of nails, in comparison with wild-

type strain (Fachin AL, personal communication), con-

ﬁrming the role of this gene in T. rubrum virulence.

Another EST (TR0043) upregulated upon keratin encodes

for a transporter similar to a copper resistance-associated

P-type ATPase protein that is involved in intracellular

transporter in eukaryotes for stability of cell, since copper

is an essential cofactor of many enzymes [32]. Transmem-

branes proteins involved in metallic ions transport appear

to have roles in microbial pathogenicity [33] , as it was

described in Cu-ATPases mutants that showed reduced

virulence in Listeria monocytogenes [34] and Criptococcus

neoformans [35]. In the latter case, the Dvph1 avirulent

mutant had absence of laccase enzyme activity, essential

for the virulence of this pathogen. These data suggest that

this gene may have important implications for infection

mechanism of T. rubrum . Also, the sequence TR0042

showed high similarity with a putative transporter peptide

of superfamily MFS of A. fumigatus, containing a

conserved domain of PTR2 [36].

In co nclusion, we have successfully used SSH to identify

28 genes that are upregulated in T. rubrum submitted to

keratin. Most of these genes encode for proteins probably

relevant to the dermatophyte–host interaction and for

installation and maintenance of infection on the host. SSH

method represented an efﬁcient strategy for the identiﬁca-

tion of these genes and it can aid in the identiﬁcation of

potential drug targets in dermatophytes.

4. Materials and methods

4.1. Strains

The T. rubrum clinical isolate H6 (ATCC MYA-3108)

used throughout this study was obtained from a female

patient with tinea pedis [37]. Escherichia coli (Mos Blue)

was used for transformation and plasmid pGEM-T

s

(Promega) ampliﬁcation.

4.2. Growth and treatment conditions

The isolate H6 was cultivated in Petri dishes with

Sabouraud glucose agar for 15 days at 28 1C. Mycelia from

dishes were collected with a sterile spatula, vortexed into

saline solution (0.9 NaCl/Tween 0.1%), following ﬁltration

in ﬁber glass to remove de bris of mycelium. Conidia were

recovered by centrifugation, and the resuspended pellet was

transferred to liquid Sabouraud at 28 1C for 72 h in shaker.

The mycelia resulting were harvested by fast ﬁltration over

Whatman paper (Whatman International, Maidstone,

UK), washed and transferred to minimum medium [38]

at pH 5.0, being one part supplemented with glucose

(55 mM) and the other with keratin (Sigma) (2.5 g/L), both

with nitrate as nitrogen source (70 mM) and incubated

separately for 6, 12, 24, 48, 72 h and 7 days at 28 1Cin

shaker. The medium pH was measured after the ﬁnal time

of each condition.

4.3. RNA isolation and library preparations

Mycelia obtained after 72 h post-inoculation were

harvested by ﬁltration and total mycel ial RNA from each

treatment was extracted with the Gentra Kit and poly (A

+

)

RNA was isolated by means of PolyATract

s

mRNA

Isolation Systems (Promega), according to manufacturer’s

protocols. The SSH approach, based on the Clontech

PCR-Select cDNA Subtraction Kit, was used for the

construction of the cDNA library. The SSH subtraction

was performed by using driver (conidia germinated in

glucose) and tester (conidia germinated in keratin) cDNAs.

Reverse library was performed with conidia germinated in

glucose as tester to prepare su btracted cDNA for

differential screening. In all library constructions, two

sequential hybridization steps followed by two PCR

reactions were carried out. The PCR primers included in

the Clontech Kit were adopted, with nested primers (1 and

2R) in the second PCR.

The ﬁnal template enriched with differentially expressed

sequences from the tester population was electrophoresed

in 1.2% agarose gel, puriﬁed in GFX column and cloned

using pGEM-T

s

. After the transformation using IPTG/

X-gal for selection, white colonies were randomly picked

and grown in LB medium containing tetracycline (15 mg/

mL) a nd ampicilin (50 mg/mL). Clones were picked and

arrayed in 96-well plates, duplicated and kept at À80 1C for

storage.

ARTICLE IN PRESS

F.C.A. Maranha˜o et al. / Microbial Pathogenesis 43 (2007) 166–172170

Author's personal copy

4.4. Northern analysis

Macro-array dot-blots (differential screening) were

applied to identify upregulated genes. The colonies of

E. coli co ntaining individual inserts of the differen tially

expressed sequences in the tester population were picked

up, grown in ampicilin–LB medium, and ampliﬁed using

nested primers 1 and 2R from the SSH kit and E. coli

culture as a template. Ampliﬁed clones have cDNA inserts

carrying adaptor 1 and adaptor 2R on both ends, which

suggests that contaminating background due to non-

speciﬁc ampliﬁcation of the tester is low.

After denaturation at 94 1C for 5 min, the ampliﬁcation

reactions were performed for 30 cycles as follows: 30 s

denaturation at 94 1C, 30 s annealing at 55 1C, and 1 min

extension at 72 1C. PCR fragments were spotted onto nylon

membranes (Hybond-N

+

) via vacuum blotter (Bio Rad

Bio-dot) for the reverse northern blot analysis. Both cDNA

forward and reverse subtracted PCR product probes

labeled following manufacturer’s protocol (Genes Images

Random Prime Labeling Module) were used to screen the

membranes. The signals were evaluated between forward

and reverse blots by using Gene Image CDP-Star Detection

Module and these signals were also converted to relative

intensity values and quantiﬁed by using ImageJ software

(data not shown).

To perform the traditional northern blot, 15 mg total

RNA was electrophoresed on a 1.5% agarose gel contain-

ing formaldehyde, transferred to a Hybond-N

+

membrane

and hybridized with probes radioactively labeled with

[a-

32

P] dCTP. Individual cDNA clones selected from

subtraction procedure ampliﬁed by nested PCR were used

as probes. Probe co ncentrations of all blots were 50 ng.

4.5. DNA sequencing and bioi nformatic analysis

Automatic DNA sequencing of subtracted clones was

performed using Big Dye Terminator cycle sequencing

chemistry with universal primers M13. The sequences were

processed using PhredPhrap-Co nsed package, and sub-

jected to similarity searches against the non-redundant

GenBank database using BLASTX and the GenBank EST

database using BLASTN at National Center for Biotech-

nology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) [39].A

match was considered signiﬁcant if the expected (E) value

was less than 10

À3

. Sequences were functionally classiﬁed

into MIPS according to putative BLASTX results [40,41] ,

and were submitted to the GenBank database under the

accession numbers given in Table 2.

Acknowledgments

We thank R.A.P. Ferreira, A.C.C. Souza, M. Mazucato

and P.R. Sanches for techn ical support, and A. Borghi for

reviewing the English paper. This research was supported

by grants from the Brazilian agencies FAPESP, CNPq,

CAPES and FAEPA.

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119

Membrane transporter proteins are involved in Trichophyton

rubrum pathogenesis

Fernanda C. A. Maranhão, Fernanda G. Paião,

Ana Lúcia Fachin,

1

and Nilce M.

Martinez-Rossi

Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de

São Paulo, 14049-900 Ribeirão Preto, SP, Brazil

1

Present address: Departamento de Biotecnologia, Universidade de Ribeirão Preto, SP,

Brazil

Key words: dermatophyte, keratin, pathogenesis, membrane transporter, Trichophyton

rubrum

Running title: Transporter proteins in T. rubrum pathogenesis

Corresponding author

Tel: + 55-16-3602-3150; fax: + 55-16-3633-0069

E-mail address: nmmrossi@usp.br (Nilce M. Martinez-Rossi)

SUMMARY

Trichophyton rubrum is a dermatophyte responsible for the great majority of human

superficial mycoses. The functional expression of important proteins for the initial step

and maintenance of infection process were previously identified in T. rubrum by

Subtraction Suppression Hybridization (SSH) after growth in the presence of keratin.

Here, we isolated sequences similar to genes encoding for ATP binding cassette (ABC)

transporter (multidrug resistance, MDR), copper ATPase, major facilitator (MFS) and

permease, and used northern hybridizations to monitor the expression of these genes up

regulated in the presence of keratin. A sequence identical to TruMDR2 gene, encoding

an ABC transporter in T. rubrum, was isolated in our experiments, and the examination

of ΔTruMDR2 mutant T. rubrum showed a reduction in infecting activity, characterized

by low growth in human nails compared to wild-strain. The high expression of

transporter genes by T. rubrum in mimetic infection and the virulence reduction of

ΔTruMDR2mutant in a disease model in vitro suggest that transporters are involved in

T. rubrum pathogenicity.

INTRODUCTION

Fungal infections have caused morbidity in immunossupressed individuals, particularly

those undergoing transplants, chemotherapy and HIV positive patients, showing the

importance of an early diagnosis and appropriate antifungal therapy (Erbagci, 2002;

Nir-Paz et al., 2003). The dermatophytes, fungi specialized in keratin degradation, are

frequently involved in chronic infections that affect humans on global scale. The most

prevalent dermatophyte is the Trichophyton rubrum, isolated in tinea corporis, tinea

unguium and tinea pedis (Summerbell, 1997; Weitzman & Summerbell, 1995).

Several studies have provided evidence that pH environment-mediated effect regulates

the fungi gene expression and the secretory activity (Casadevall & Pirofski, 2001;

Ferreira-Nozawa et al., 2006), which play a role in the pathogenicity. During keratin

degradation, dermatophytes have been shown to secrete specific enzymes, depending on

the sensing of host ambient pH (Maranhão et al., 2007; Martinez-Rossi et al., 2004). A

sensing regulatory system in the response of T. rubrum towards carbon source

availability and the ability to adapt in the host is essential to fungal survival (Ferreira-

Nozawa et al., 2006; Kunert, 1972, 1976), inducing the expression of enzymes and

membrane transporters that facilitate the uptake of amino acids (Grobler et al., 1995;

Lechenne et al., 2007). Furthermore, specific genes are necessarily expressed to permit

these mechanisms, which are involved in the activation of signal transduction for the

maintenance of the infection process under keratin contact. The occurrence of

therapeutic failures due to resistance development is often associated with efflux pumps

in the membrane cell (Martinez-Rossi et al., 2008; Prasad et al., 2006). Recent

observations have indicated that membrane transporters are commonly involved in

bacterial and fungal pathogenesis, with important roles as virulent factors to ensure

successful colonization in a host environment (Mishra et al., 2007). The T. rubrum

TruMDR1 gene, which encodes an ATP-binding cassette (ABC) transporter, is

differentially expressed in the presence of antifungals such as griseofulvin and

itraconazole (Cervelatti et al., 2006). Early genetic knock-out analysis of ΔTruMDR2

strain has shown that TruMDR2 transporter-mediated toxicant efflux mechanism plays a

role in modulating susceptibility to terbinafine, 4NQO and ethidium bromide in T.

rubrum (Fachin et al., 2006). The aim of this study was to investigate the differential

expression of genes encoding proteins similar to transporters in the dermatophyte T.

rubrum grown in keratin, and to compare growth characteristics between wild type and

ΔTruMDR2 strain during nail infection. These findings suggest that membrane

transporter proteins are important to the dermatophyte infection process, adding new

knowledge about the T. rubrum gene expression profile.

METHODS

Fungal strain and culture conditions for expression analyses. The T. rubrum strains

ATCC MYA-3108, H6 (wild-type) and ΔTruMDR2 (Fachin et al., 2006) were used

throughout this study and cultured as previously described (Fachin et al., 1996). On the

expression assays, T. rubrum wild-type conidial were grown in liquid minimal medium

with nitrate as nitrogen source (70mM) (Cove, 1966), supplemented with keratin in the

test sample (2.5 g ml

-1

) to promote specific gene expression, and the control samples

were cultivated with glucose (55 mM), both during 72 h at 28 ºC at pH initial 5.0.

Isolation of RNA and cDNA synthesis by construction of suppression subtractive

hybridization. Total RNA of T. rubrum wild-strain was extracted from about 100 mg

frozen mycelium using Trizol

®

reagent (Invitrogen). The quality and concentration of

total RNA were checked by formaldehyde-agarose gel electrophoresis and

spectrophotometer. One µg was used for double-strand cDNAs synthesis with BD

SMART

TM

PCR cDNA Synthesis Kit (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA),

according to the manufacturer’s guide. A Subtraction Suppression Hybridization (SSH)

library was constructed as previously described (Diatchenko et al., 1996; Maranhão et

al., 2007), using PCR Select cDNAs subtraction kit (BD Biosciences Clontech, Palo

Alto, CA). We used T. rubrum mycelia treated in the presence of keratin as tester and in

glucose as driver. The final PCR sample obtained corresponds to genes differently

expressed when this dermatophyte is in keratin contact. All PCR products were cloned

into pGEM-T Easy Vector System (Promega) and transformed into Escherichia coli

(Mos Blue). After the selection by X-gal/IPTG system, white colonies were picked up,

grown in LB medium with selection by ampicilin and tetraciclin resistance during 20 h

at 37 °C and stored until the next steps.

DNA sequencing and Northern blot analysis. The cDNA clones were sequenced on

an ABI Prism 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA), using M13

forward and reverse primers. The sequences were processed using the PhredPhrap-

Consed package, and submitted to similarity searches against the nonredundant

GenBank database using BLASTX software at the National Center for Biotechnology

Information (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al., 1997). The clones

with inserts corresponding to transporter genes were selected to be used as probes in

northern analysis.

For validation of differential gene expression by Northern blot, T. rubrum were

cultivated in test and control conditions (keratin and glucose). Fifteen micrograms of

total RNA from each condition were separated through electrophoresis on 1.5%

agarose-formaldehyde gel and subsequently transferred onto nylon membranes

(Hybond-N

+

, Amersham) using the vacuum blotter (Bio Rad Bio-dot). Probes were

purified from plasmids containing inserts of the specific transporter genes by PCR

amplification. All probes (50 ng) were labeled by random priming (Random Primers

DNA labeling System; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) and [α-32P]-dCTP. The

hybridizations were performed overnight at 65 °C under agitation and the membranes

were washed using standard protocols (Sambrook et al., 1989), following the exposition

to storage phosphor screens (Applied Biosystem). Each transcript had the intensity

levels quantified based on digital light units (DLUs) generated by OptiQuant (Perkin

Elmer), subtracting the background. The Northern blot illustrations are representative of

two independent experiments.

Infection assays. Infection in vitro was performed as previously described (Takasuka,

2000). Human nail fragments of approximately 1 x 1 mm in size were treated with

ethanol for 15 min and dried at room temperature. Five µL of a conidia suspension (3 x

10

6

ml

-1

) of each T. rubrum strains (wild-type and mutant) were soaked on individual

nail fragments during 1 hour, followed by the addition of 200 µl of distilled water. The

eppendorf tubes were incubated at 28 °C for 6 days, and the fungal growth was

observed through light microscopy (Axion vision system, Zeiss). As a control, we used

nail fragments soaked in 200 µl of distilled water.

RESULTS AND DISCUSSION

Identification of transporter genes by SSH and bioinformatic analyses

In this report, we investigated the expression of several genes that may affect the T.

rubrum pathogenesis. After the isolation of genes differentially expressed by SSH,

which had T. rubrum mycelium cultivated in keratin as test condition, a BLASTX

analysis was performed and 66 clones similar to genes encoding putative transporters of

different families were focused. They represented 27.7% of the cDNA clones isolated

after T. rubrum had grown in the presence of keratin (Maranhão et al., 2007). From the

66 subtractive cDNA clones screened, five nonredundant unique ESTs were generated.

These ESTs named TR0042, TR0043, TR0044, TR0052 and TR0097 were predicted to

encode proteins corresponding to MFS peptide transporter, copper resistance-associated

P-type ATPase, MDR transporter, amino acid permease and V-type ATPase,

respectively (Table 1). Most of these proteins have similarity to well-known

homologues in Aspergillus fumigatus. MFS proteins, members of a large transporter

family, had a high incidence (57.6 %) among the transporter proteins expressed in T.

rubrum grown in the presence of keratin (Table 1).

It is known that the human skin has pH of approximately 5.0 (Marro et al., 2001) and

contains keratinized elements, which are important characters for dermatophyte

infection. Then, our experiments were performed with initial pH 5.0 with keratin or

glucose as carbon source. The results were obtained after 72 h of T. rubrum cultivation

(when the keratin medium reached pH 8.4), an experimental condition appropriate to

isolate genes probably involved in infection maintenance, being preferentially expressed

in alkaline pH (Maranhão et al., 2007).

.

Expression of transporter genes in T. rubrum

Northern blot analysis was carried out with total RNA isolated from mycelia of T.

rubrum (H6) strain cultivated individually with keratin and glucose. The mRNA steady

state levels of genes encoding for specific efflux pumps, metal transporter, MFS and a

permease were detected through northern blot analysis in test condition, during

germination in keratin media, revealing that the expression of specific transporters in

test media was higher than that in glucose media (Fig. 1). ABC and MFS transporters

are two major classes of proteins involved in drug resistance. The substrate range of

both membrane transporters is very broad and may include ions, amino acids, peptides,

sugars, secondary metabolites and drugs. Several studies have investigated the role of

MDR transporter in response to metabolic poisons and antifungal drugs (Prasad et al.,

2006). The BLASTX analysis revealed homology of a sequence highly up-regulated in

the tester cDNA population (TR0044) with a T. rubrum ABC transporter MDR-like, a

multidrug pump efflux (Fachin et al., 2006). Fungal ABC transporters play a function as

efflux pumps, providing resistance to several antifungal types (Mishra et al., 2007;

Urban et al., 1999). In addition, ABC-encoding genes were identified as an important

pathogenicity determinant in early stages of filamentous fungi pathogenesis, as

demonstrated for the ABC1 from Magnaporthe grisea, BcatrB from Botrytis cinerea,

and GpABC1 from Gibberella pulicaris. (Fleissner et al., 2002; Gupta & Chattoo,

2008; Vermeulen et al., 2001).

Additionally, the northern blot analyses with probe similar to MFS transporter-encoding

gene showed a strong signal in test keratin condition (Fig. 1). Although a high number

of clones similar to MFS were isolated through SSH when T. rubrum was grown in

keratin media, we also detected a weak hybridization signal in control condition in

comparison to test sample. This result was expected because MFS transporters are a

ubiquitous group of proteins involved in the transport of a wide range of compounds,

including external elements and toxins (Saier et al., 1999; Vardy et al., 2004). In

Aspergillus oryzae genome, 63.9 % of transporters are MFS-type, involved in secondary

metabolism (Akao et al., 2007). The analysis of a MFS transporter-like gene (CTB4) in

Cercospora nicotianae provided genetic evidence to support its role in virulence by

cercosporin accumulation (Choquer et al., 2007). In this study, experiments with a C.

nicotianae mutant displayed a drastic reduction of cercosporin production and

accumulation, causing fewer lesions on tobacco leaves (Choquer et al., 2007).

Expression of copper ATPase was barely detectable as an approximately 3 kb transcript

in a wild-type strain grown in minimal medium containing keratin. A subtractive library

enriched by T. rubrum genes expressed in the presence of cytotoxic components showed

the up-regulation of a gene encoding for copper resistance-associated P-type ATPase

after fluconazole contact (Paião et al., 2007). Copper is an essential metabolic element,

like a cofactor of many cellular enzymes, and copper-transporting P-type ATPases are

found in eukaryotes organisms and require an iron transporter for the adaptation in

different environments and hosts (Riggle & Kumamoto, 2000). The absence of copper-

transporter normal activity in Cryptococcus neoformans after VPH1 gene deletion was

observed in an avirulent mutant interfering in laccase activity (Zhu & Williamson,

2003), a strong virulent factor in this opportunistic pathogen. Also, a disruption in C.

albicans CaCCC2 gene led to an unusual phenotype of silver and copper resistance

(Weissman et al., 2002), and a clap1 mutation in Colletotrichum lindemuthianun caused

to a non-pathogenic phenotype (Parisot et al., 2002), both genes encoding for a putative

copper-transporting ATPase.

The virulence capacity was also affected in Listeria monocytogenes mutants, carrying

mutation in cptA, a gene involved in copper homeostasis (Francis & Thomas, 1997).

Furthermore, our northern experiments also demonstrated that a permease, a general

transporter, is highly expressed in T. rubrum cultures growing in the test media.

Assay infection of ΔTruMDR2

The effect of disrupting the TruMDR2gene (TR0044 cDNA) on pathogenicity of T.

rubrum was assessed in the nails model in vitro, to test the infection ability of the

ΔTruMDR2 strain mutant in comparison to wild-type H6. Conidia preparations of wild-

type and mutant were individually distributed in sterile nails and the growth was

observed by microscopy 6 days after inoculation at 28ºC. The deletion of TruMDR2 was

correlated with a decreased ability of ΔTruMDR2 mutant to grow on human nail (Fig.

2), a T. rubrum major infection site.

The TruMDR2 gene, encoding an ABC/MDR transporter in T. rubrum, is also highly

expressed after exposure to acriflavine, ketoconazole, chloramphenicol, griseofulvin,

fluconazole, and other cytotoxic agents revealed by northern blot analyses in wild strain.

Also, the mutant ΔTruMDR2 is more sensitive to terbinafine, 4NQO and ethidium

bromide than the control strain, confirming the involvement of this gene in drug

transporter (Fachin et al., 2006). The MDR genes might affect other aspects of

metabolism and nutrient availability, and in our infection T. rubrum assays in nails, the

mutant phenotype of ΔTruMDR2 strain was strictly correlated with the decreased

growth on human nails.

In conclusion, the capacity of infecting fungi to regulate their gene expression and

overcome the host resistances is crucial in the dermatophyte virulence. The expression

of several transporters reported in our studies confirmed that a membrane transporter

system is required for optimal growth on keratin sources that may reflect a regulatory

role for establishment of dermatophytoses in the host site. Furthermore, by using nail

fragments as the only source of nutrients, we noted that the ΔTruMDR2 mutant grows

poorly compared to the control strain suggesting that the TruMDR2 gene could be

involved in the virulence of T. rubrum.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work was supported by grants from the Brazilian agencies FAPESP, CNPq,

CAPES and FAEPA. We thank R.A.P. Ferreira, A.C.C. Souza, M. Mazucato for

technical support, Sanches P. R. for bioinformatic assistance, and Borghi A. for English

review.

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Table 1. Trichophyton rubrum transporter genes over-expressed during growth in the

presence of keratin

EST

GenBank

acession

number

Size

(bp)

Putative ID (GenBank)

E

-

value

Identity

Number of

clones

TR0042 EB086877 634

Aspergillus fumigatus

, MFS peptide transporter,

putative, XP_746951

1

E-69

66 % 38

TR0097 EH038250 224

A. fumigatus

, V

-

type ATPase, subunit B,

XP_755656

6

E-20

92 % 16

TR0044 EB086879 420

T. rubrum

, multidrug resistance protein MDR,

AAG01549 - TruMDR2 gene

2

E-20

100 % 9

TR0043 EB086878 176

A. fumigatus

, copper resistance

-

associated P

-

type

ATPase, XP_754347

2

E-15

75 % 2

TR0052 EB086887 723

A. fumigatus

, amino acid permea

se, putative acid

permease, AC98709

8

E-12

57 % 1

Legends for Figures

Fig. 1. Northern blot analyses showing differential expression of Trichophyton rubrum

genes encoding for a MFS transporter (TR0042), a Cu++ ATPase (TR0043), an MDR

ABC transporter (TR0044) and a permease (TR0052), using total RNA from strain H6.

This strain was cultivated in glucose, as a control (C) and in keratin (K). Ethidium

bromide-stained rRNA shows the relative loading of the samples. Numbers associated

with the bars indicate fold differences relative to the intensity of the Northern blots

shown by each clone expressed in the H6 strain cultivated in control condition (C;

glucose) and in keratin (K) as test, as established by densitometry analysis using

Phosphoimager Scanner.

Fig. 2. Infection assays showed the growth of different Trichophyton rubrum strains

cultivated in human nail during 6 days at 28 °C. The fungal growth on human nails was

observed through light microscopy and the images were captured by using the Axio

vision system (Zeiss) with a plan neofluar 20x/0.5 objective. The black parts on the left

side are nail fragments: (A) Control negative (no inoculum), (B) H6 (wild-type) and (C)

ΔTruMDR2 strain. The representative results of two experiments are shown.

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