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Luciana Basili Dias
Candidíase vulvovaginal em pacientes gestantes e não gestantes atendidas no
Hospital Geral Universitário de Cuiabá/MT – prevalência, identificação das
leveduras e susceptibilidade aos antifúngicos através de duas metodologias
distintas (CLSI e Etest).
Universidade Federal de Mato Grosso
Faculdade de Ciências Médicas
Programa de Pós-Graduação
Mestrado em Ciências da Saúde
Área de Concentração: Doenças Infecciosas e Tropicais
Cuiabá – Mato Grosso
2007
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Universidade Federal de Mato Grosso
Faculdade de Ciências Médicas
Programa de Pós-Graduação
Mestrado em Ciências da Saúde
Área de Concentração: Doenças Infecciosas e Tropicais
Candidíase vulvovaginal em pacientes gestantes e não gestantes atendidas no
Hospital Geral Universitário de Cuiabá/MT – prevalência, identificação das
leveduras e susceptibilidade aos antifúngicos através de duas metodologias
distintas (CLSI e Etest).
Dissertação apresentada ao Mestrado em Ciências da Saúde,
Programa de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Federal de Mato Grosso, como
requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em
Ciências da Saúde, Área de Concentração: Doenças
Infecciosas e Tropicais.
Orientadora: Profa. Dra. Rosane Christine Hahn
Cuiabá – Mato Grosso
2007
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FICHA CATALOGRÁFICA
D541c Dias, Luciana Basili
Candidíase vulvovaginal em pacientes gestantes e
não gestantes atendidas no Hospital Geral Universitário
de Cuiabá/MT – prevalência, identificação das levedu-
ras e susceptibilidade aos antifúngicos através de duas
metodologias distintas (CLSI e Etest) / Luciana Basili
Dias. – 2007.
xv, 100p.: il. ; color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Mato Grosso, Faculdade de Ciências Médicas,
Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde,
Área de Concentração: Doenças Infecciosas e
Tropicais, 2007.
“Orientador: Prof.ª Dr.ª Rosane Christine Hahn”.
CDU –616.9:618.16
Índice para Catálogo Sistemático
1.
Candidíase vulvovaginal
2.
Candidíase vulvovaginal – Gestante
3.
Candidíase vulvovaginal – Antifúgicos
4.
Candidíase vulvovaginal – Susceptibilidade in vitro
5.
Candidíase vulvovaginal – Drogas antifúgicas – Sus-
ceptibilidade
6.
Candidíase vulvovaginal – Diagnóstico
“Experiência é o nome que nós damos aos nossos próprios erros”.
“Experiência é o nome que nós damos aos nossos próprios erros”.“Experiência é o nome que nós damos aos nossos próprios erros”.
“Experiência é o nome que nós damos aos nossos próprios erros”.
Oscar Wilde
Oscar WildeOscar Wilde
Oscar Wilde
“Ning
“Ning“Ning
“Ninguém é bom por acaso; a virtude deve ser bem aprendida”.
uém é bom por acaso; a virtude deve ser bem aprendida”.uém é bom por acaso; a virtude deve ser bem aprendida”.
uém é bom por acaso; a virtude deve ser bem aprendida”.
Chico Xavier
Chico XavierChico Xavier
Chico Xavier
Dedico esta dissertação
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Dedico esta dissertação
À minha família, meu grande alicerce.
À minha família, meu grande alicerce.À minha família, meu grande alicerce.
À minha família, meu grande alicerce.
Meu avô Miguel Basili
Meu avô Miguel Basili Meu avô Miguel Basili
Meu avô Miguel Basili
in memoria
in memoriain memoria
in memoriam
mm
m
, exemplo de amor e por sempre torcer
, exemplo de amor e por sempre torcer , exemplo de amor e por sempre torcer
, exemplo de amor e por sempre torcer
por mim.
por mim.por mim.
por mim.
À minha orientador
À minha orientadorÀ minha orientador
À minha orientadora Dra.
a Dra. a Dra.
a Dra. Rosane Christine Hahn.
Rosane Christine Hahn.Rosane Christine Hahn.
Rosane Christine Hahn.
AGRADECIMENTOS
A Deus força maior que me guia, pela vida, fé, energia, saúde e por ter guiado sempre os
meus caminhos dando-me coragem e garra nesta e em todas as caminhadas de minha vida!
Às pessoas mais importantes da minha vida, meus pais (Albino e Francisca) pelo exemplo
de vida, educação concedida, valores que me ensinaram, pelo esforço de sempre lutarem para os
filhos conseguirem alcançar os objetivos, doação, incentivo, dedicação, confiança plena, respeito
e amor que é o grande alicerce que sustenta nossa maravilhosa família. Amo-os muito. Vocês são
tudo para mim. Obrigada!!!
A meus irmãos (Flávio e Miguel), pela nossa união, amor, carinho, amizade, pelo porto
seguro de apoio, respeito que nos envolve e grande ajuda moral. Obrigada, vocês são minhas
alegrias.
À Profa. Dra. Rosane Christine Hahn, pela orientação sempre concedida a mim, não só na
realização deste trabalho, mas por todos os caminhos já percorridos ao seu lado, pelos
ensinamentos acadêmicos, científicos e humanos, pela oportunidade, dedicação, atenção,
carinho, paciência, confiança em mim depositada e grande amizade adquirida. Enfim, por tudo
que já contribuiu à minha formação pessoal e profissional, transformando-me em uma pessoa
melhor. Agradeço a Deus por ter conhecido-a e me colocado em seu caminho. Obrigada!!!
Ao Prof. Dr. José Meirelles Filho, coordenador da ginecologia/obstetrícia do Hospital
Geral Universitário (HGU), pela colaboração ao abrir as portas para que esta pesquisa fosse
realizada, por toda contribuição durante as coletas de materiais clínicos, ensinamentos quanto
aos aspectos clínicos, co-orientação e empenho durante todo o trabalho.
À Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Federal de Mato Grosso (FCM /
UFMT), pela oportunidade de conceder a pós-graduação e o mestrado em ciências da saúde.
Ao Prof. Dr. Francisco Souto, ex-coordenador da pós-graduação UFMT por todo o esforço
em fazer crescer a pós-graduação e gentilezas prestadas.
Ao Prof. Dr. Cor Jesus, pelo apoio, sugestões, ensinamentos e colaborações nas análises
estatísticas.
Ao Prof. Dr. Anselmo, coordenador da pós-graduação, por todas as gentilezas prestadas.
Ao Prof. Dr. Domingos Tabajara, diretor da FCM/UFMT, por todas as contribuições,
mesmo indiretamente, para realização deste trabalho.
A todos os professores da pós-graduação que fizeram parte de minha formação,
contribuindo com grandes conhecimentos.
À secretária da pós-graduação Ana Paula, pelas gentilezas prestadas.
A todos da secretaria da FCM/UFMT, que de alguma forma contribuíram para a realização
deste trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Micologia/UFMT - João, Daciene, Sebastião, Sara,
Marilana, Katherine e Olívia pelo apoio, amizade, respeito, confiança, experiência trocada e
convivência agradável.
À amiga Daciene, pela ajuda incansável, fundamental enquanto estive no IAL, pelas
amostras enviadas, enfim, pela grande companhia e amizade adquirida.
Ao João Batista, pelo apoio, colaboração e auxílio imprescindível na formatação deste
trabalho.
À Naiana, pelo auxílio na elaboração da apresentação em Powerpoint.
À amiga Katherine, pelo apoio e ajuda na rotina laboratorial (HGU) nos últimos meses,
disponibilizando-me maior tempo para a conclusão deste trabalho.
A todos os mestrandos colegas em especial: Alberto, Cristiano, Íris, João Félix, Marlene,
Neyres e Vera pela companhia, experiências trocadas e pelas amizades adquiridas!!!
Aos colegas do Laboratório de Investigação/UFMT - Ana Paula Muller, Aparecida,
Eduardo, Gustavo, Marlene, Naiana, Ricardo e Rogério, pelo apoio e colaborações.
Às pessoas que conheci na pós-graduação, que de alguma forma, colaboraram com a minha
formação.
Ao Instituto Adolfo Lutz (IAL) - seção micologia - pela oportunidade de realizar os testes
de sensibilidade aos antifúngicos.
À Profa. Dra. Márcia de Souza Carvalho Melhem - IAL, pela oportunidade, receptividade
no IAL, ensinamentos adquiridos, acolhida em São Paulo e amizade adquirida.
À Dra. Maria Walderez Szeszs – IAL, pelos ensinamentos, ajuda fundamental nos testes de
sensibilidade, pela companhia e amizade durante esta pesquisa.
A todos que me acompanharam no Instituto Adolfo Lutz, em especial: Andress, Dona
Maria, Fumiko, Sandra Freitas, Sandra Brasil, Leo, Leda, Simone, Dulce, pela força e companhia
durante esta etapa.
À Universidade de Cuiabá (UNIC), pelo incentivo, contrapartida financeira inicial e
liberação para a realização deste trabalho.
À Profa. Ilza Martha, diretora do curso de farmácia UNIC, pela oportunidade e incentivo.
Aos professores, mestres e doutores da faculdade de farmácia da UNIC, que fizeram parte
da minha formação acadêmica, contribuindo para esta etapa alcançada.
Ao Prof. Paulo Tamashiro, pelo grande incentivo para cursar o mestrado.
Aos colegas e funcionários da UNIC por todas as colaborações na realização deste
trabalho.
À amiga Marta Rocha, pela ajuda técnica, fundamental na realização deste trabalho, pelo
estímulo, atenção, carinho, lealdade, companhia, amizade e conversas agradáveis.
À amiga Juscinei (Nica), pela ajuda técnica na realização deste trabalho, carinho, amizade e
conversas descontraídas.
À residente Larissa Silvério pela ajuda na realização da coleta de dados e materiais clínicos
e pela amizade adquirida.
Aos acadêmicos de medicina 3º ano UNIC - Adriana, Ana Júlia, Emanuela, Franciele,
Juliana, Kelly, Maria Carolina, Patrícia, Raquel e Thiago, vinculados, de forma voluntária, a este
projeto, pela responsabilidade, dedicação e interesse em toda a etapa de coleta de materiais
clínicos.
Aos acadêmicos de medicina 4º ano UNIC - Alessandra, Ana Paula, Camila, Carla,
Karime, Maria Fernanda, Mariana, Michele, Naiana, Patrícia, vinculados, de forma voluntária, a
este projeto, pela responsabilidade, dedicação e interesse em toda a etapa de coleta de materiais
clínicos.
À amiga Helane pela força na seleção do mestrado, amizade, apoio e interesse em todo o
projeto.
A todos os professores, médicos, residentes, alunos de ginecologia/obstetrícia do HGU, que
contribuíram na clínica e etapa de coleta de materiais clínicos.
Às pacientes atendidas, neste período do desenvolvimento deste projeto, por aceitarem
fazer parte do estudo, cedendo as amostras.
Ao Hospital Geral Universitário (HGU), pela oportunidade, interesse e incentivo.
À amiga Nicolina (Nicoli), pela ajuda técnica na realização deste trabalho, paz transmitida
a todo o momento de convívio e amizade.
Ao farmacêutico-bioquímico Nestor, pelo apoio e atenção sempre.
Ao farmacêutico-bioquímico Eduardo Vessoni, pela amizade e contribuições nos
momentos em que estive ausente do laboratório.
Aos colegas e funcionários do laboratório de análises clínicas do HGU pelo apoio durante a
realização deste trabalho.
À Secretaria de Estado de Saúde de Mato Grosso (SES/MT), pelo incentivo e liberação
para qualificação profissional, contribuindo para melhor desempenho no desenvolvimento do
projeto.
Ao Pabllo Vinícius, por acreditar em mim e não medir esforços na liberação para a minha
qualificação profissional.
À Coordenadoria de Assistência Farmacêutica (CAF), por contribuir com minha
transferência para maior disponibilidade de horários na realização do mestrado.
À amiga Patrícia Freitas por todo apoio ao processo necessário da minha transferência.
Ao Centro Integrado de Apoio Psicossocial (CIAPS) Adauto Botelho por receber-me e
favorecer a liberação para a minha qualificação profissional.
Aos colegas de trabalho do CIAPS Adauto Botelho pelo apoio e incentivo. Especialmente
Niedja e Maria Idair, por não medir esforços na contribuição da minha licença.
Aos professores do ensino fundamental e médio que foram base à minha educação,
contribuindo para que eu atingisse mais esta etapa em minha vida.
Ao tio Bartolomeu e tia Edinalva, pela força, incentivo, amizade e grande contribuição na
revisão gramatical desta dissertação.
Ao Julio, pela gentileza prestada na tradução do resumo deste trabalho.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT), pelo apoio
financeiro e incentivo à pesquisa.
À farmacêutica-bioquímica Tomoko, pela ajuda e apoio quando estive no IAL e pelas
experiências trocadas.
À Andréia pela ajuda na execução do projeto.
Às amigas Scheila e Ellen, pela amizade, exemplo, incentivo e apoio. Vocês deixaram
muitas saudades!!!
Ao amigo Gustavo e sua família, pelo apoio, companhia enquanto estive em São Paulo e
pela valiosa amizade.
Ao Thiago Trindade, que através de suas atitudes, fez-me crescer muito neste período.
Aos colegas – amigos: Acy, Alanna, Ana Júlia, Camila Lopes, Carolina, Cleide, Dacie,
Diniz, Duanra, Ednaldo, Elaine, Eli, Elizângela, Elizandra, Ellen, Evelin, Fabrício, Gabriela,
Giseli, Glauco, Greicy, Gu, Gustavo, Iberê, Íris, John, Josi, Karen, Katherine, Keyla, Laiana,
Luciana, Luís, Mari, Maria Elisângela, Maria Idair, Olívia, Rainúzia, Raquel, Rodrigo, Roney,
Sara, Scheila, Stela, Thaysa, Tiago, Valéria, fica assim registrada a grande presença concedida
em alguns ou todos os momentos de realização deste trabalho, com contribuições valiosas,
estímulos, incentivos ou apenas colocando o sorriso em meu rosto.
Aos tios (as), primos (as), pela grande força, incentivo, estímulo, amizade e união de
nossas famílias.
À minha avó Ana Maria in memoriam pela admiração.
A meu avô Miguel in memoriam, pelo apoio, incentivo, confiança e por sempre acreditar
em mim.
i
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AMB – Anfotericina B
ATCC – American Type Culture Collection
C. albicans – Candida albicans
C. colliculosa – Candida colliculosa
C. dubliniensis – Candida dubliniensis
C. famata – Candida famata
C. glabrata – Candida glabrata
C. guilliermondii – Candida guilliermondii
C. humicola – Candida humicola
C. inconspicua – Candida inconspicua
C. kefyr – Candida kefyr
C. krusei – Candida krusei
C. lusitaniae – Candida lusitaniae
C. magnoliae – Candida magnoliae
C. norvegensis – Candida norvegensis
C. parapsilosis – Candida parapsilosis
C. pseudotropicalis – Candida pseudotropicalis
C. rugosa – Candida rugosa
C. tropicalis – Candida tropicalis
C. vinaria – Candida vinaria
C-N – Carbono-nitrogênio
CDC – Center of Disease Control
CEP – Comitê de ética em pesquisa
CIM – Concentração inibitória mínima
CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute
CTZ – Cetoconazol
CVV – Candidíase vulvovaginal
CVVR – Candidíase vulvovaginal recorrente
dL – Decilitro
DMSO – Dimetilsulfóxido
ELISA – Enzyme-liked immunosorbent assay
FCZ – Fluconazol
ii
FDA – Food and Drug Administration
GAL – Galactose
GLI – Glicose
HGU – Hospital Geral Universitário
HIV – Human Imunnedeficiency Virus
IAL – Instituto Adolfo Lutz
IC – Intervalo de confiança
ITZ – Itraconazol
Kg – Kilograma
KH
2
PO
4
– Fosfato de potássio monobásico
KOH – Hidróxido de potássio
L – Litro
Lab. - Laboratório
LAC – Lactose
MAL – Maltose
MEL - Melibiose
mg – Miligrama
MgSO
4
.7H
2
O – Sulfato de magnésio hepta hidratado
Mic. - Micologia
mL – Mililitro
mm - Milimetro
mol – Quantidade de matéria
MOPS – Ácido 3 –[N-morfolino] propanosulfônico
MT – Mato Grosso
NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standards
ºC – Graus Celsius
pH – Potencial hidrogeniônico
R – Resistente
RAF – Rafinose
RAPD – Ramdomly amplified polymorphic DNA
RPMI-1640 – Meio Roswell Park Memorial Institute - 1640
S – Susceptível
SAC – Sacarose
S. cerevisiae - Sacharomyces cerevisiae
iii
SDD – Susceptível dose-dependente
SIDA – Síndrome da imunodeficiência adquirida
T. inkin – Trichosporon inkin
TRE - Trealose
UFC – Unidade formadora de colônias
UNIC – Universidade de Cuiabá
XIL - Xilose
µg – Micrograma
µg/mL – Microgramas por mililitro
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Aspecto clínico do corrimento de candidíase vulvovaginal 10
Figura 2 - Estrutura química da anfotericina B 19
Figura 3 – Estrutura química do cetoconazol 21
Figura 4 – Estrutura química do fluconazol 22
Figura 5 – Estrutura química do itraconazol 23
Figura 6 – Kit utilizado para coleta e semeadura de material clínico 33
Figura 7 – Plaqueamento de colônias em meio CHROMagar 34
Figura 8 – Presença de tubo germinativo – Candida albicans 35
Figura 9 – Aspecto micromorfológico de Candida albicans 36
Figura 10 – Aspecto micromorfológico de Candida parapsilosis 36
Figura 11 – Aspecto micromorfológico de Candida tropicalis 36
Figura 12 – Aspecto micromorfológico de Candida glabrata 37
Figura 13 – Aspecto micromorfológico de Candida krusei 37
Figura 14 – Teste de fermentação de carboidratos, evidenciando a fermentação e formação de
gás em glicose, maltose, galactose e trealose. 40
Figura 15 – Teste de assimilação de carboidratos 41
v
Figura 16 – Placa de microtitulação com diferentes concentrações de itraconazol (CLSI) e
amostras de leveduras do gênero Candida. 45
Figura 17 – Placa ilustrando fitas de Etest (cetoconazol, fluconazol, itraconazol e anfotericina
B). 46
Figura 18 – Distribuição das pacientes não gestantes examinadas, segundo presença de sintomas
e leveduras isoladas (C. albicans e não albicans), Hospital Geral Universitário de Cuiabá-MT,
2005-2006. 49
Figura 19 –– Distribuição das pacientes gestantes examinadas, segundo presença de sintomas e
leveduras isoladas (C. albicans e não albicans), Hospital Geral Universitário de Cuiabá-MT,
2005-2006. 49
Figura 20 – Identificação das espécies de leveduras do gênero Candida em pacientes não
gestantes, Hospital Geral Universitário de Cuiabá-MT, 2005-2006. 50
Figura 21 – Identificação das espécies de leveduras do gênero Candida em pacientes gestantes,
Hospital Geral Universitário de Cuiabá-MT, 2005-2006. 51
Figura 22 – Distribuição das concentrações inibitórias mínimas de quatro drogas antifúngicas
(cetoconazol-Ctz, fluconazol-Fcz, itraconazol-Itz e anfotericina B-Amb) determinadas pelos
métodos de susceptibilidade in vitro - CLSI e Etest de isolados de Candida albicans obtidos de
pacientes não gestantes, n= 51 (A, B, C, D) e gestantes, n= 83 (E, F, G, H). 57
Figura 23 – Distribuição das concentrações inibitórias mínimas de quatro drogas antifúngicas
(cetoconazol-Ctz, fluconazol-Fcz, itraconazol-Itz e anfotericina B-Amb) determinadas pelos
métodos de susceptibilidade in vitro - CLSI e Etest de isolados de Candida parapsilosis obtidos
de pacientes não gestantes, n= 10 (A, B, C, D) e gestantes, n= 01 (E, F, G, H). 58
Figura 24 – Distribuição das concentrações inibitórias mínimas de quatro drogas antifúngicas
(cetoconazol-Ctz, fluconazol-Fcz, itraconazol-Itz e anfotericina B-Amb) determinadas pelos
métodos de susceptibilidade in vitro - CLSI e Etest de isolados de Candida tropicalis obtidos de
pacientes não gestantes, n= 04 (A, B, C, D) e gestantes, n= 01 (E, F, G, H). 59
vi
Figura 25 – Distribuição das concentrações inibitórias mínimas de quatro drogas antifúngicas
(cetoconazol-Ctz, fluconazol-Fcz, itraconazol-Itz e anfotericina B-Amb) determinadas pelos
métodos de susceptibilidade in vitro - CLSI e Etest de isolados de Candida glabrata obtidos de
pacientes não gestantes, n= 03 (A, B, C, D) e gestantes, n= 02 (E, F, G, H). 60
Figura 26 – Distribuição das concentrações inibitórias mínimas de quatro drogas antifúngicas
(cetoconazol-Ctz, fluconazol-Fcz, itraconazol-Itz e anfotericina B-Amb) determinadas pelos
métodos de susceptibilidade in vitro - CLSI e Etest de isolados de Candida krusei obtidos de
pacientes não gestantes, n= 02 (A, B, C, D) e gestantes, n= 03 (E, F, G, H). 61
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Morfologia das espécies de leveduras do gênero Candida. 38
Tabela 2 – Prevalência de leveduras do gênero Candida em pacientes não gestantes e pacientes
gestantes do Hospital Geral Universitário de Cuiabá-MT, 2005-2006. 48
Tabela 3 – Perfil bioquímico (assimilação e fermentação) das espécies de leveduras do gênero
Candida segundo Kwon-Chung & Bennett, 1992; Kurtzman & Fell, 1998. 52
Tabela 4 - Variações das concentrações inibitórias mínimas (CIM), CIM
50
e CIM
90
de isolados
de C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata e C. krusei em pacientes não gestantes,
para quatro drogas antifúngicas, determinadas por duas metodologias. 62
Tabela 5 - Variações das concentrações inibitórias mínimas (CIM), CIM
50
e CIM
90
de isolados
de C. albicans, C. krusei e C. glabrata em pacientes gestantes, para quatro drogas antifúngicas,
determinadas por duas metodologias. 63
Tabela 6 – Comparação dos perfis de susceptibilidade in vitro de isolados de leveduras do
gênero Candida em pacientes não gestantes, utilizando duas metodologias (CLSI e Etest). 66
Tabela 7 – Comparação dos perfis de susceptibilidade in vitro de isolados de leveduras do
gênero Candida em pacientes gestantes, utilizando duas metodologias (CLSI e Etest). 67
Tabela 8 – Média, mediana e moda das concentrações inibitórias mínimas, expressos em µg/mL,
para quatro drogas antifúngicas de isolados de leveduras do gênero Candida em pacientes não
gestantes, para as duas metodologias utilizadas (CLSI e Etest). 68
Tabela 9 – Média, mediana e moda das concentrações inibitórias mínimas, expressos em µg/mL,
para quatro drogas antifúngicas de isolados de leveduras do gênero Candida em pacientes
gestantes, para as duas metodologias utilizadas (CLSI e Etest). 69
RESUMO
ix
A candidíase vulvovaginal é considerada um problema universal que atinge um
número elevado de mulheres em todo o mundo.
O presente estudo objetivou a determinação da prevalência de candidíase
vulvovaginal em pacientes gestantes ou não, seguida da identificação das espécies de leveduras
do gênero Candida, associadas à infecção fúngica, como também a determinação do perfil de
susceptibilidade in vitro a quatro drogas antifúngicas.
Foram obtidos 160 (39,6%) isolados de leveduras a partir de 404 amostras de
secreções vaginais. Das 404 pacientes avaliadas, 201 eram gestantes e 203 não. Das gestantes
foram isoladas 90 (44,8%) leveduras do gênero Candida e das demais 70 (34,5%).
A pureza dos isolados foi aferida pelo emprego do meio de CHROMagar, o qual foi
também útil à confirmação das espécies pela metodologia clássica. Os testes bioquímicos
(zimograma e auxanograma) e morfológicos (prova do tubo germinativo e microcultivo em
lâmina) constituíram a metodologia clássica.
Todos os isolados revelando colônias puras foram submetidos à determinação do
perfil de susceptibilidade in vitro. Para a determinação deste perfil, foram utilizadas quatro
drogas antifúngicas (cetoconazol, fluconazol, itraconazol e anfotericina B) através de duas
metodologias: CLSI – “Clinical and Laboratory Standards Institute” / microdiluição e Etest® –
fitas impregnadas com concentrações de antifúngicos, comercialmente disponível.
Para as pacientes não gestantes foi obtida a seguinte distribuição: Candida albicans
(72,9%), C. parapsilosis (14,3%), C. tropicalis (5,7%), C. glabrata (4,3%) e C. krusei (2,8%). Já
nas gestantes 92,3% foram identificadas como C. albicans, 3,3% como C. krusei, 2,2% como C.
glabrata, 1,1% como C. parapsilosis e 1,1% como C. tropicalis.
Todas as drogas testadas apresentaram excelentes atividades in vitro frente aos
isolados. Considerando pacientes não gestantes, todos os isolados foram susceptíveis ao
cetoconazol e a anfotericina B. Em relação ao fluconazol, apenas um isolado de C. glabrata de
um total de três, mostrou-se susceptível dose-dependente pela metodologia do Etest, e um de C.
krusei de um total de dois, mostrou-se resistente pela metodologia do CLSI e susceptível dose-
dependente pela metodologia do Etest. Para o itraconazol, observou-se susceptibilidade dose-
dependência para um, de um total de três isolados de C. glabrata e para os dois isolados de C.
krusei, em ambas as metodologias utilizadas. Em relação às pacientes gestantes, não foi
observada resistência para nenhuma das espécies avaliadas frente às quatro drogas. Apenas para
o itraconazol, dois, de um total de três isolados de C. krusei mostraram-se susceptíveis dose-
dependentes quando empregada à metodologia do CLSI.
x
De forma geral, houve boa correlação entre os resultados obtidos através de duas
metodologias distintas (CLSI e Etest).
A leitura dos testes realizada com o emprego da técnica de microdiluição (CLSI) em
aparelho de ELISA oferece maior precisão, eliminando problemas referentes à subjetividade da
leitura visual. Por outro lado, a complexidade metodológica desfavorece o seu uso em
laboratórios de rotina, sendo o Etest uma opção confiável, tendo como vantagens a praticidade e
tempo de execução em que se pese o custo elevado. Por estes motivos, pode ser apontada como
melhor opção para a rotina laboratorial nos casos de candidíase vulvovaginal, nos quais sejam
úteis os testes de susceptibilidade in vitro.
ABSTRACT
xii
Candidiasis is considered a universal problem that affects a great number of women
throughout the world.
The purpose of this study was to determine the prevalence of vulvovaginal
candidiasis in pregnant and nonpregnant patients, as well as to identify the species of yeasts of
the genus Candida associated with the fungal infection and determine the in vitro susceptibility
profile to four antifungal drugs.
One hundred sixty (39.6%) yeast isolates were obtained from 404 samples of vaginal
secretions. Of the 404 patients evaluated, 201 were pregnant and 203 were not. From the
pregnant patients, 90 (44.8%) yeasts of the genus Candida were isolated, while 70 (34.5%)
yeasts were isolated from the other patients.
The purity of the isolates was measured by using CHROMagar medium, which was
also useful in the confirmation of the species through the use of classic methods. Biochemical
tests (zymogram and auxanogram) and morphological tests (germ tube test and microculture)
constituted the classic methods.
All isolates revealing pure colonies were submitted to determination of the in vitro
susceptibility profile. For that purpose, four antifungal drugs were used (ketoconazole,
fluconazole, itraconazole, and amphotericin B) by two different methods: CLSI – “Clinical and
Laboratory Standards Institute” / microdilution and the Etest® – strips impregnated with
concentrations of antifungals, which are commercially available.
For the nonpregnant patients, the following distribution was obtained: Candida
albicans (72.9%), C. parapsilosis (14.3%), C. tropicalis (5.7%), C. glabrata (4.3%), and C.
krusei (2.8%). Among the pregnant patients, 92.3% were identified as C. albicans, 3.3% as C.
krusei, 2.2% as C. glabrata, 1.1% as C. parapsilosis, and 1.1% as C. tropicalis.
All four tested presented excellent in vitro activity with the isolates. In the
nonpregnant patients, all isolates were found to be susceptible to ketoconazole and amphotericin
B. As for fluconazole, only one C. glabrata isolate, of a total of three, showed dose-dependent
susceptibility when using the Etest method, and one C. krusei isolate, of a total of two, showed
susceptibility when using the CLSI method and dose-dependent susceptibility when using the
Etest method. For itraconazole, dose-dependent susceptibility was observed for one of three C.
glabrata isolates and the two C. krusei isolates, for both methods used. Among the pregnant
patients, no resistance of any of the species evaluated, to any of the four drugs, was observed.
Only for itraconazole, two of three C. krusei isolates showed dose-dependent susceptibility when
the CLSI method was used.
xiii
In general, there was a good correlation between the results obtained through the two
different methods (CLSI and Etest).
The microdilution technique (CLSI) on an ELISA device offers greater precision for
test reading, eliminating problems with the subjectivity of visual reading. On the other hand, the
complexity of the method makes it difficult to use it routinely, and the Etest is a reliable option
with the advantages of being practical and fast to perform, despite its high cost. For these
reasons, one can consider it as the best option for laboratory routine in cases of vulvovaginal
candidiasis in which in vitro susceptibility tests may be helpful.
xiv
SUMÁRIO
1.
RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
...............................................................
1
2.
IN
TRODUÇÃO
..................................................................................................
5
2.1.
O gênero Candida e as candidíases
.......................................................
6
2.2.
Candidíase vulvovaginal
.........................................................................
7
2.2.1. Microbiologia / Fisiopatologia / Mecanismos defensivos ................... 8
2.2.2. Formas de apresentação ..................................................................... 11
2.2.3. Fatores predisponentes ....................................................................... 12
2.3.
Diagnóstico micológico
........................................................................... 13
2.4.
Diagnóstico diferencial
...........................................................................
14
2.5.
Tratamento da candidíase vulvovaginal
...............................................
2.6. Drogas antifúngicas .................................................................................
16
17
2.6.1. Polienos ............................................................................................... 17
2.6.2. Derivados azólicos .............................................................................. 19
2.7.
Resistência a drogas antifúngicas
..........................................................
24
2.8.
Testes de suscepti
bilidade
às
drogas antifúngicas
...............................
24
2.9.
Clinical and Laboratory Standards
Institute
–
CLSI
………….…….
25
2.10.
Metodologia comercial (Etest)
…..………………….………………….
26
2.11. Correlação entre os resultados dos testes de susceptibilidade in vitro
os efeitos terapêuticos in vivo ..............................................................................
27
2.12.
Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
...................
27
3.
OBJETIVOS
......................................................................................................
29
3.1.
Objetivo geral
..........................................................................................
30
3.2.
Objetivos específicos
...............................................................................
30
4.
METODOLOGIA
..............................................................................................
31
4.1.
Seleção de pacientes
................................................................................
32
4.2.
Cultivo das amostras
..............................................................................
32
4.3.
Identi
ficação das amostras
.....................................................................
33
4.3.1. Avaliação quanto à pureza ..................................................................
34
4.3.2. Pesquisa de tubo germinativo ............................................................. 34
xv
4.3.3. Microcultivo ........................................................................................ 35
4.3.4. Provas bioquímicas ............................................................................. 39
4.3.4.1. Zimograma ................................................................................ 39
4.3.4.2. Auxanograma ............................................................................ 40
4.4. Testes de sensibilidade aos antifúngicos: cetoconazol, fluconazol,
itraconazol e anfotericina B ...................................................................................
42
4.4.1. Cepas de referência .............................................................................
4.4.2. Microdiluição em caldo CLSI (2005)...................................................
42
42
4.4.3. Etest...................................................................................................... 45
4.5.
Procedimentos de análise dos resultados
..............................................
46
5.
RESULTADOS
..................................................................................................
47
5.1.
Isolamento das amostras
........................................................................
48
5.2.
Sintomatologia associada às pacientes e leveduras isolad
as
................
48
5.3.
Identificação das espécies ..
.....................................................................
50
5.4. Determinação da concentração inibitória mínima de quatro drogas
antifúngicas para os isolados de leveduras do gênero Candida de pacientes
não gestantes e pacientes gestantes .......................................................................
53
5.4.1. Microdiluição em caldo CLSI (2005) ..................................................
53
5.4.2 Etest ..................................................................................................... 55
5.4.3 Variação do perfil de susceptibilidade obtido pela metodologia de
microdiluição segundo o documento M 27 A2 (CLSI, 2005) ................................
63
5.4.4. Variação do perfil de susceptibilidade obtido pela metodologia
comercial Etest ......................................................................................................
64
5.4.5. Grau de concordância entre as metodologias CLSI e Etest .................. 65
6.
DISCUSSÃO
......................................................................................................
70
7.
CONCLUSÕES
..................................................................................................
84
8.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
.............................................................
86
9.
ANEXOS
............................................................................................................
101
1. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
Relevância e Justificativa 2
Candidíases são infecções fúngicas predominantementes endógenas e de caráter
oportunista, envolvendo leveduras pertencentes ao gênero Candida, que compreende
aproximadamente 163 espécies, sendo apenas um número reduzido dessas, comprovadamente
associadas a processos patológicos humanos, devendo-se destacar: C. albicans, C. tropicalis, C.
parapsilosis, C. glabrata, C. krusei, C. kefyr, C. lusitaniae, C. rugosa, C. guilliermondii e C.
dubliniensis (Kwon-Chung & Bennet, 1992; Kurtzman & Fell, 1998; Lacaz et al., 2002a).
Distúrbios na defesa imune celular, alterações fisiológicas ou patológicas e
desequilíbrios na microbiota normal, podem levar ao desenvolvimento das candidíases. A
gravidade da doença dependerá mais diretamente do grau de alteração do hospedeiro do que do
potencial patogênico dessas leveduras. Em função do caráter predominantemente endógeno, da
habilidade de colonização e do oportunismo evidente dessas leveduras, as candidíases são
bastante freqüentes e têm distribuição mundial (Lacaz et al., 2002a).
A partir dos anos 90, o fenômeno de resistência às drogas tornou-se um problema
mais agudo associado a vários tipos de infecções, destacando-se aquelas relacionadas ao Human
Imunnedeficiency Vírus (HIV), à tuberculose, além daquelas referentes às bactérias da
microbiota humana normal, que são responsáveis por quadros graves de infecções hospitalares.
Concomitantemente, têm-se observado a emergência e o aumento da ocorrência das infecções
fúngicas, resultantes de alterações no sistema imune associadas à epidemia da síndrome da
imunodeficiência adquirida (SIDA), tratamentos oncológicos através de quimioterapia e/ou
radioterapia, transplantes de órgãos, além do uso abusivo e indiscriminado de antimicrobianos,
que são responsáveis pela alteração da microbiota autoctone e favorecedores do aumento do
número de microrganismos resistentes, tornando-se cada vez mais difícil o tratamento destas
infecções (Cuenca-Estrela & Rodriguez-Tudella, 2002).
O aumento da ocorrência das infecções fúngicas tem evidenciado a necessidade do
desenvolvimento de novas drogas antimicóticas. Atualmente são utilizados nas condutas
terapêuticas basicamente dois grupos de antifúngicos: o grupo dos poliênicos e dos azóis que,
apesar de serem drogas de eficácia comprovada, apresentam vários problemas associados ao seu
uso, podendo-se destacar os efeitos colaterais, a ineficiência de alguns desses agentes frente às
espécies emergentes e, principalmente, à detecção de várias amostras resistentes aos principais
antifúngicos disponíveis.
Considerando a candidíase vulvovaginal, o CDC (Center of Disease Control) divide
esta infecção fúngica em duas categorias: simples e recorrente. A simples tem gravidade leve à
moderada, episódios esporádicos, não recorrentes, em uma hospedeira normal com uma espécie
Relevância e Justificativa 3
de C. albicans sensível. Porém, a candidíase vulvovaginal recorrente, é assim considerada pela
gravidade, recorrência, acometimento em uma hospedeira imunologicamente comprometida ou
ser causada por uma espécie menos sensível, por exemplo, aquelas não-albicans (Sobel et al.,
1998a).
Ao desencadear da infecção, alguns fatores predisponentes são apontados como
contribuições significativas, dentre eles podem ser citados: gravidez, uso de anticoncepcionais,
terapêutica com corticosteróides, antibioticoterapia, higiene pessoal deficiente, distúrbios
endócrinos, roupas íntimas sintéticas, relações sexuais, agentes sensibilizantes da pele. Podem
ainda ser citadas como fontes de re-infecção: parceiros masculinos, pele dos genitais, artigos de
uso pessoal e trato gastrointestinal (Ziarrusta, 2002).
A candidíase vulvovaginal (CVV) é a segunda causa mais freqüente de
vulvovaginite. Estima-se que 75 % das mulheres terão um episódio de CVV ao longo de suas
vidas, sendo que 40% a 50% destas teriam a segunda infecção e cerca de 5% poderiam adquirir
padrão crônico, com episódios de repetição (Adad et al., 2001).
Leveduras do gênero Candida são responsáveis por 15% a 25% dos casos de
vulvovaginites, sendo causadas por espécies que habitam as mucosas vaginal e digestiva e que
crescem em meio favorável ao seu desenvolvimento. C. albicans está presente como microbiota
vaginal normal em 15% a 20% das mulheres adultas saudáveis e em 30% a 40% das grávidas.
Outras espécies como C. glabrata e C. parapsilosis podem estar presentes em proporções
relativamente menores (Bauters et al., 2002).
O diagnóstico da CVV deve ser bem estabelecido, com todos os critérios clínicos e
exames laboratoriais adequados, para que não ocorram erros e o uso desnecessário de drogas
antimicóticas. O autodiagnóstico de CVV, sem exame microscópico e/ou avaliação clínica,
dificulta os estudos epidemiológicos e pode induzir resistência do microrganismo ao tratamento
convencional.
Ao que tange à terapêutica da CVV, os azólicos orais tem sido bastante empregados
com altas taxas de cura, e os efeitos colaterais são leves e infrequentes. Porém são contra-
indicados durante a gravidez. O regime de uma única dose oral com fluconazol é altamente
eficaz em casos não complicados. As drogas antimicóticas tópicas atingem em média 80% de
cura. Para os casos recorrentes, recomenda-se terapia antifúngica oral mantida por seis meses.
Em vários estados brasileiros têm sido registrados dados referentes ao perfil
epidemiológico das espécies de leveduras isoladas, a partir de espécimens clínicos (secreções
vaginais) provenientes de pacientes acometidas por quadros de candidíase vulvovaginal. Há
Relevância e Justificativa 4
também relatos do perfil de susceptibilidade às drogas antifúngicas para as referidas espécies do
gênero Candida (Aleixo Neto et al., 1999; Galle & Gianini, 2004; Ferraza et al., 2005).
No entanto, em que pese à reconhecida importância das candidíases vulvovaginais e
o seu freqüente aparecimento devido aos fatores predisponentes classicamente conhecidos, em
Cuiabá, a grande maioria dos laboratórios ainda não realiza a identificação das espécies de
leveduras. Testes in vitro podem ser úteis para estabelecer o perfil de susceptibilidade aos
antifúngicos para leveduras do gênero Candida em vulvovaginites.
Atualmente tem-se observado o aumento de espécies não-albicans associados aos
casos de candidíase vulvovaginal recorrente. Com o emprego dos azólicos observa-se que
fracassos terapêuticos são infrequentes e quando ocorrem, estão relacionados à detecção destas
espécies em episódios recorrentes.
Desta forma, considera-se relevante à realização do estudo da distribuição de
espécies de leveduras do gênero Candida isoladas a partir de secreções vaginais, em pacientes
com suspeita clínica de candidíase e determinar o perfil de susceptibilidade aos antifúngicos in
vitro, ainda não documentados na literatura no que se refere ao Estado de Mato Grosso.
2. INTRODUÇÃO
Introdução 6
2.1. O gênero Candida e as candidíases
As leveduras são microrganismos predominantementes unicelulares, imóveis e
congregam um grupo funcional de organismos heterotróficos que colonizam substratos contendo
fontes de carbono. Com relação à faixa de temperatura são classificadas como mesófilos,
crescendo preferencialmente entre 18º e 45° C. Taxonomicamente pertencem a 98 gêneros entre
as classes Ascomycetes e Basidiomycetes (Kurtzman & Fell, 1998).
Leveduras do gênero Candida são classificadas no Reino Fungi, como membros do
Phylum Ascomycota, divisão Deuteromycetes, ordem Saccharomycetales, família
Saccharomycetaceae (Alexopoulos et al., 1996). O gênero Candida compreende
aproximadamente 200 espécies que se reproduzem assexuadamente por brotamento. Essas
leveduras possuem tanto a capacidade fermentativa quanto assimilativa, sendo capazes de
crescer em uma variedade de substratos orgânicos (Segal & Baum, 1994). A maioria das
espécies patogênicas cresce muito bem em cultivos aeróbios, embora possa crescer também em
elevadas concentrações de gás carbônico atmosférico e em meios pobres ou ricos em nutrientes,
com um pH entre 2,5 e 7,5 e temperatura entre 20
o
C e 38
o
C. Quase todas as espécies do gênero
requerem biotina para o crescimento e algumas delas exigem um suplemento vitamínico mais
elaborado (Odds, 1988a).
A classificação específica de Candida é baseada primariamente em critérios
fisiológicos e morfológicos (Meyer & Ahearn, 1984). Isso inclui a diferenciação por padrões de
assimilação e fermentação de carboidratos e atividades enzimáticas específicas. Além disso,
devem-se considerar características micromorfológicas como tamanho e forma dos
blastoconídios, produção de pseudomicélio e presença ou ausência de clamidoconídios (Segal &
Baum, 1994).
As leveduras são ubíquas no meio ambiente, sendo encontradas no solo, na água, nos
vegetais e como habitantes do corpo humano, fazendo parte da microbiota normal endógena.
Podem estar presentes em espécimens clínicos, como resultado de contaminação ambiental,
colonização ou processo infeccioso. Portanto, o significado de sua presença em material
biológico, depende do número de amostras positivas com o mesmo organismo em um mesmo
paciente, do número de colônias formadas e se o material é proveniente de sítios estéreis ou não
(Mendes-Giannini & Melhem, 1996; Warren & Hanzen, 1999).
A maioria das espécies do gênero Candida habita uma variedade de nichos
ecológicos, geralmente como saprófitas (Rose & Harrison, 1989). Apenas um pequeno número,
Introdução 7
dessas espécies, associa-se aos processos patológicos humanos, representando grande interesse
em clínica médica (Odds, 1988a). Do ponto de vista clínico, C. albicans é a principal espécie do
gênero, associada à maioria das manifestações patológicas causadas por essas leveduras (Lacaz
et al., 2002). Pelo fato dessa espécie fazer parte da microbiota humana normal, a doença
apresenta um evidente caráter oportunista (Kwon-Chung & Bennett, 1992). Além dessa espécie,
são reconhecidas outras com potencial patogênico: C. tropicalis, C. parapsilosis, C. krusei, C.
glabrata, C. guilliermondii, C. pseudotropicalis (ou C. kefyr), Clavispora lusitaniae e C. rugosa.
Sulivan et al. (1993; 1995), descreveram uma espécie do gênero Candida atípica,
isolada da cavidade oral de pacientes HIV sorotipos e portadores de SIDA; esta espécie foi
denominada C. dubliniensis.
Independente do potencial patogênico de diferentes espécies do gênero Candida, é
observado que as doenças determinadas por essas leveduras se constituem em quadros
infecciosos essencialmente oportunistas, ocorrendo sempre em associações com alguma
condição mórbida subjacente. Uma série de fatores predisponentes vem sendo associada à
ocorrência das candidíases, podendo ser agrupados àqueles inerentes ao hospedeiro e, por outro,
naqueles extrínsecos, ou referentes aos procedimentos médicos iatrogênicos (Odds, 1988a;
Rippon, 1988; Kwon-Chung & Bennet, 1992; Lacaz et al., 2002a).
Quando há ruptura do equilíbrio, local ou imunológico, leveduras do gênero Candida
passam do estado saprofítico para o patogênico, podendo formar pseudo-hifas, invadir tecidos e
provocar candidíase, ocasionando sintomas indesejáveis (Fidel, 2002).
As candidíases podem acometer todos os tecidos do hospedeiro humano,
ocasionando uma diversidade de quadros clínicos, tanto no que se referem à localização,
podendo ser superficiais, profundas, localizadas ou disseminadas, quanto ao modo de evolução
(agudo, subagudo, crônico ou episódico) e gravidade da doença, apresentando-se como infecções
leves e benignas até graves ou mesmo fatais. Geralmente estão associadas, e progridem de
acordo com o grau de acometimento do hospedeiro (Odds, 1988a; Rippon, 1988).
2.2. Candidíase vulvovaginal
A maioria das mulheres apresenta pelo menos um episódio de CVV ao longo de sua
vida. Outras, porém, apresentam pelo menos três episódios infecciosos em um ano. Entretanto,
5% das mulheres apresentam candidíase vulvovaginal recorrente (CVVR), isto é, quando ocorre
Introdução 8
quatro ou mais episódios em um ano. As recidivas são um desafio para os ginecologistas e
alteram a qualidade de vida das mulheres (Hurley, 1981).
Candidíase vulvovaginal é um problema universal que afeta um número significativo
de mulheres em todo o mundo. Esse tipo de infecção fúngica cria um desconforto na mulher
muito grande, que pode comprometer a relação sexual e afetiva, devido às dificuldades de
tratamento e o desconforto que elas sofrem (Kent, 1991).
A infecção micótica vulvovaginal foi descrita pela primeira vez por JS Wilkinson em
1949, o qual estabeleceu uma relação entre a existência de fungos na vagina e o aparecimento de
uma vaginite. A partir deste momento os conhecimentos foram evoluindo progressivamente.
Atualmente vulvovaginite micótica é causada por fungos leveduriformes e a maior parte por
espécies pertencentes ao gênero Candida (Ziarrusta, 2002).
Peria (2003) verificou a presença de outros gêneros e espécies de leveduras, além de
alga aclorofilada associadas à vulvoganinites, identificando C. albicans, C. glabrata, C.
parapsilosis, C. tropicalis, encontrou também, C. famata, C. kefyr, C. vinaria, C. guilliermondii,
Trichosporon asahii, T. inkin, Prototheca wickerhamii, Saccharomyces cerevisiae e Rhodotorula
mucilaginosa, em estudo realizado com 300 mulheres.
2.2.1. Microbiologia / Fisiopatologia / Mecanismos defensivos
São conhecidas mais de 200 espécies de leveduras do gênero Candida, sendo que
apenas um pequeno número afeta o homem com caráter patogênico. C. albicans é muito comum
e freqüentemente, é a espécie mais detectada em ginecologia (80 a 90% dos casos) (Sobel,
1996). C. glabrata é encontrada em 5 a 15% dos casos de candidíase vulvovaginal. Outras
espécies detectadas em infecções ginecológicas são: C. tropicalis, C. krusei, C. pseudotropicalis
e C. parapsilosis. Neste sentido, nos últimos anos tem sido relacionado o aumento de outras
espécies de leveduras do gênero Candida a uma maior taxa de recorrência de episódios de
vulvovaginites (Ziarrusta, 2002).
O trato genital feminino apresenta um complicado biótipo microbiológico e as
leveduras podem estar presentes na vagina com a ausência de sintomas clínicos sendo que as
mulheres podem tornar–se colonizadas por diversos motivos, permanecendo por um longo
período de suas vidas com esses microrganismos (Mendling et al. 2000).
Leveduras do gênero Candida são fungos oportunistas que podem ser encontrados
em dois diferentes estados. Os esporos (blastosporos) constituem o fenótipo para extensão,
Introdução 9
disseminação e transmissão. Compõem uma forma resistente do fungo e estariam associados
com a colonização assintomática. Por outro lado, os pseudo-micélios são as formas germinativas,
este fenótipo tem capacidade invasora tissular e ocasiona a sintomatologia própria da infecção
(Ferrer, 2000).
O processo de patogênese da Candida segue três etapas, sendo a primeira à adesão.
A adesão é muito importante para a sobrevivência dos esporos. A capacidade de adesão da C.
albicans é maior que das outras espécies, isto poderia explicar a grande freqüência desta espécie
neste tipo de infecção. A adesão ocorre pela união de uma proteína transmembrana presente na
membrana do fungo ao receptor de membrana da célula (Ziarrusta, 2002).
Existem fatores que podem atuar como promotores e facilitadores do processo de
adesão. Um ambiente hiperestrogênico aumenta a exposição dos complexos glicoproteicos que
atuam como receptores, facilitando assim, à aderência do fungo na superfície epitelial. Por isso, a
candidíase vulvovaginal é menos freqüente em situações de baixa de estrogênio, como na pré-
menarca e pós-menopausa. Todavia, a gestação e a ingestão de anticoncepcionais orais de altas
doses de estrogênios podem aumentar a chance de infecção (Ziarrusta, 2002).
Redd (1992) determinou que as altas taxas de hormônios contribuem para um
aumento dos níveis de glicogênio, bem como o pH vaginal resultando numa disponibilidade
maior de fontes de carbono para a multiplicação das leveduras.
Outro fator que pode afetar a capacidade de adesão dos fungos é a competição com a
microbiota vaginal (lactobacilos vaginais). Os lactobacilos inibem a adesão do fungo à superfície
epitelial por um processo de co-agregação e competição pelos receptores. Desta forma uma
redução dos lactobacilos favorece o aumento da infecção (Veronesi, 1996; Ferrer, 2000;
Ziarrusta, 2002).
Os bacilos de Doderlein, lactobacilos produtores de peróxido formam ácido láctico a
partir do glicogênio, cuja produção e secreção são estimuladas pelos estrogênios. Este
mecanismo propicia uma acidez adequada (pH 4,5) do ambiente vaginal, dificultando a maioria
dos patógenos. As leveduras do gênero Candida são exceções, pois proliferam em ambiente
ácido (Val & Almeida Filho, 2001). Os lactobacillus também são capazes de produzir
substâncias bactericidas capazes de inibir a formação de pseudo-hifas (Ziarrusta, 2002).
Biasoli et al (1999) demostraram em seus trabalhos que as leveduras podem
aumentar sua adesão sob variações de pH, principalmente em 7,2.
Após adesão, os esporos são capazes de penetrar no epitélio vaginal e causar a
vulvovaginite. Para isto, é necessária a reprodução dos esporos e formação de pseudo-hifas. Uma
vez formado os pseudo-micélios, as leveduras do gênero Candida são capazes de penetrar e
Introdução 10
invadir o epitélio vaginal. Este processo de penetração está diretamente relacionado com a
produção de uma série de proteases pelas pseudo-hifas capazes de destruir proteínas com função
de defesa em nível de mucosa vaginal (Ziarrusta, 2002).
Os estrogênios promovem também a formação de pseudo-micélios, facilitando a
penetração e conseqüentemente o aparecimento da infecção clínica (Ziarrusta, 2002).
A invasão epitelial ocasiona liberação de uma série de substâncias (prostaglandinas e
bradicininas) com capacidade de induzir um processo inflamatório local: ocasionando edema,
eritema e aumento do fluido vaginal. A leucorréia causada por leveduras do gênero Candida é
composta de células vaginais esfoliadas e polimorfonucleares (Ziarrusta, 2002).
Acredita-se que uma das causas dessa doença esteja relacionada ao sistema imune, e
que a recorrência vaginal seja devido a uma disfunção ou deficiência no sistema imunológico
(Fidel & Sobel, 1998; Weissenbacher et al, 2000).
Além do equilíbrio da microbiota vaginal, outros fatores contribuem para a defesa
vaginal: integridade da mucosa, presença das imunoglobulinas A e G e dos polimorfonucleares e
monócitos (Val & Almeida Filho, 2001).
Os sintomas característicos da candidíase vulvovaginal são: prurido intenso,
ardência, escoriação, edema, eritema vulvar ou vaginal, disúria e dispareunia. O corrimento
vaginal é branco, espesso, floculado, com aparência de leite coalhado e inodoro (Figura 1) (Val
& Almeida Filho, 2001; Shimp, 2002; Bates, 2003; Lopes Consolaro et al., 2004; Moreira &
Paula, 2006).
Figura 1
– Aspecto clínico do corrimento de candidíase vulvovaginal
Fonte: www.crbetinho.hpg.ig.com.br
Introdução 11
2.2.2. Formas de apresentação
Segundo a forma de apresentação, a candidíase é classificada como: não complicada
(candidíase vulvovaginal esporádica, candidíase vulvovaginal de grau leve a moderado,
candidíase frequentemente associada à C. albicans e candidíase na ausência de gravidez) e
complicada (candidíase vulvovaginal recorrente, candidíase vulvovaginal severa, candidíase não-
albicans e alterações do hospedeiro – diabetes, imunodepressão e gravidez) (Sobel et al., 1998a).
No que diz respeito à candidíase vulvovaginal recorrente é definida como infecção
por leveduras do gênero Candida caracterizada por quatro ou mais episódios em um período de
12 meses (Val & Almeida Filho, 2001).
Existe consenso sobre a necessidade de se determinar o fato a que se deve essa
recorrência, e por qual motivo, a levedura persiste na vagina causando infecções (Millon et al,
1994).
Duas hipóteses foram formuladas para explicar os episódios de candidíase
vulvovaginal recorrente. Por um lado pode ocorrer a reinfecção a partir de outros sistemas
orgânicos (sistema digestivo, trato urinário, etc) ou por contaminação sexual (Sobel, 1985;
Lanchares & Hernández, 2000). Por conseguinte, a recorrência ou recidiva pode ser devido à
hipótese de diferentes biotipos de cepas detectadas em sucessivos episódios. A ausência de uma
completa erradicação por um tratamento inadequado ou por existência de cepas resistentes pode
ocasionar em falha terapêutica, ocasionando recidiva (Ziarrusta, 2002).
A maioria das infecções por C. albicans são de origem endógena decorrentes da
proliferação ou da mudança de sítio da levedura, induzidos por alguns fatores predisponentes do
hospedeiro ou do parasita, mas também pode existir a possibilidade de ocorrerem infecções
exógenas (Ferrer, 2000).
Diferentes fatores têm sido observados em ambas as hipóteses, incluindo aqueles
referentes ao agente infeccioso e ao hospedeiro. Reinfecção através de fonte digestiva
(contaminação anal) e fonte sexual (contaminação através do parceiro) podendo ser consideradas
infecções causadas pela mesma cepa. Quadros recidivantes geralmente causados por espécies
não albicans, podem estar associados à genes de resitência aos antifúngicos. As recidivas
também podem estar relacionadas ao hospedeiro, através de causas imunológicas como baixa da
imunidade humoral e celular ou não imunológicas como alteração da microbiota vaginal e
aumento dos níveis de estrogênios (Maffei et al., 1997; Ziarrusta, 2002).
Introdução 12
2.2.3. Fatores predisponentes
A gravidez predispõe tanto a candidíase vulvovaginal primária quanto às recidivas. É
especialmente mais freqüente a partir da 28ª semana de gestação. A infecção nesta situação
supõe um desafio terapêutico importante provavelmente devido aos altos níveis de glicogênio
produzido pelo epitélio vaginal estimulado pelos altos níveis de estrogênios gestacionais;
favorecendo assim um elemento nutritivo e facilitador tanto da reprodução como da
multiplicação dos fungos. Níveis elevados de progesterona podem apresentar efeito supressor
sobre a imunidade celular, além de aumentar a expressão do gene responsável pela síntese
celular do receptor epitelial destinado à ligação do fungo (Ziarrusta, 2002).
Do mesmo modo, a utilização de anticoncepcionais orais de altas doses de
estrogênios, predispõe o aparecimento de candidíase vulvovaginal (Ziarrusta, 2002). Estudos
mostram que quando são administrados baixos níveis de estrogênios, o nível da infecção mostra-
se baixo. O mesmo autor sugere que a interrupção da administração de anticoncepcionais pode
levar a cura de candidíase vulvovaginal (Sobel, 1992).
Os dispositivos intra-uterinos também têm sido associados a episódios de candidíase
vulvovaginal, provavelmente por agirem como reservatório (Ziarrusta, 2002). O dispositivo
intra-uterino “Diu” pode propiciar o aparecimento de candidíase vulvovaginal, devido ao
surgimento do biofilme na sua superfície externa, que acaba por proteger as leveduras da ação
dos antifúngicos (Marrie & Costerton, 1983; Parewijck et al, 1988; Auler et al, 2001a; Chandra
et al, 2001).
Qualquer alteração nos níveis de glicose (especialmente em situações de
hiperglicemia – diabetes ou em qualquer outro estado que produz a elevação do glicogênio
vaginal) pode promover uma candidíase vulvovaginal. O excesso de glicogênio, além de
aumentar os substratos nutritivos para os fungos, promove o aumento da capacidade de adesão
dos fungos (Ziarrusta, 2002).
A utilização de antibióticos pode tanto aumentar a colonização quanto infecção por
leveduras do gênero Candida. Os antibióticos agem na microbiota vaginal, eliminando o
principal mecanismo de defesa vaginal frente aos fungos (Ziarrusta, 2002).
Doenças da tireóide, obesidade, corticoterapia, drogas imunossupressoras e infecção
por HIV, parecem aumentar o risco de infecção causada por leveduras do gênero Candida (Sobel
et al., 1998a; Val & Almeida Filho, 2001; Ribeiro, 2004; Ribeiro, 2005).
Introdução 13
2.3. Diagnóstico micológico
O exame microscópico direto (à fresco) da candidíase vulvovaginal com solução
salina se caracteriza por conter grande número de células epiteliais, esporos, micélios e
leucócitos (Jovanovic et al., 1991). Com adição de hidróxido de potássio (KOH) a 10 ou 20%, há
facilidade quanto à observação dos elementos fúngicos, clareando o material a ser examinado
por dissolução dos grumos de células epiteliais, tornando-os transparentes, dissolvendo piócitos e
hemácias, permitindo melhor visualização das leveduras e pseudo-hifas que adquirem aspecto
intumescido (Val & Almeida Filho, 2001).
O ágar Sabouraud dextrose é o meio padrão para cultivo de fungos. O ágar
Sabouraud modificado, acrescido de antibacteriano e cicloheximida é usado rotineiramente, pois
a adição destes compostos objetiva inibir, respectivamente, bactérias e fungos contaminantes,
presentes na microbiota normal da pele e/ou ambiente (Rippon, 1988a, Weitzman &
Summerbell, 1995). No entanto, várias espécies de leveduras do gênero Candida que não C.
albicans, são inibidas pela cicloheximida, o que desaconselha o uso exclusivo deste meio na
rotina micológica.
As técnicas convencionais para identificação das espécies de leveduras do gênero
Candida são baseadas principalmente em métodos bioquímicos, como fermentação e assimilação
de carboidratos, habilidade em formar tubo germinativo a 37ºC em soro e produzir
clamidoconídios em ágar fubá acrescido de Tween 80 (Kurtzmann & Fell, 1998).
Para a identificação rápida e presuntiva de C. albicans verifica-se, primeiramente, a
formação de tubo germinativo de amostra incubada em soro humano 37° C por 3 horas. A
identificação das outras espécies é confirmada através de testes bioquímicos, que medem a
capacidade de cada espécie de assimilar e fermentar compostos químicos que representam
diferentes fontes de carbono e nitrogênio. Há alguns anos estão disponíveis “kits” comerciais
para identificação de leveduras pela técnica de turbidimetria (Kwon-Chung & Bennett, 1992).
O microcultivo em ágar fubá acrescido de Tween 80, incubado a 28° C por até sete
dias, evidencia a presença de clamidoconídios terminais, quando o isolado é C. albicans. Outras
características micromorfológicas, tais como tipo de brotamento, presença ou não de pseudo-
hifas e distribuição dos blastoconídios ao longo destas estruturas, podem definir, para o
examinador experiente, outras espécies de leveduras do gênero Candida de interesse médico
(Koneman et al., 2001a).
Introdução 14
Odds & Bernaerts (1994) analisaram o meio de cultura cromogênico, CHROMagar
Candida, para isolamento e diagnóstico diferencial de leveduras do gênero Candida em amostras
clínicas.
2.4. Diagnostico diferencial
Em se tratando de corrimento vaginal, o diagnóstico diferencial de candidíase
vulvovaginal se faz necessário, com outras etiologias, pois implicará em diferentes tratamentos.
O corrimento vaginal é uma das preocupações mais freqüentes entre as mulheres,
principalmente, nas que estão em idade reprodutiva (Ferracin & Oliveira, 2005).
A secreção vaginal é uma resposta fisiológica do organismo feminino. Quando não
existe processo patológico envolvido, o fluxo vaginal apresenta-se de cor clara ou branca, sendo
composta de líquidos cervicais, podendo variar na quantidade e no aspecto, dependendo do
período do ciclo menstrual. No entanto, quando algum processo infeccioso ou inflamatório
encontra-se presente, as características da secreção modificam-se, caracterizando o corrimento
vaginal (Shimp, 2002; Bates, 2003).
Observar a história da paciente como: início do corrimento, fase do ciclo menstrual,
duração, cor, odor, história sexual ou uso concomitante de medicamentos, pode auxiliar no
reconhecimento da causa e no tratamento adequado do corrimento vaginal. As causas que podem
contribuir para a ocorrência de corrimento vaginal são: infecções sexualmente transmitidas
(clamídia, gonorréia, tricomoníase, herpes simples), outras infecções (candidíase, vaginose
bacteriana), causas comumente associadas às condições predisponentes (gravidez, iatrogenia,
diabetes, câncer e condições dermatológicas) e por alterações fisiológicas (vaginite atrófica)
(Ferracin & Oliveira, 2005, Moreira & Paula, 2006).
Os patógenos mais freqüentes associados às vaginites, ao lado de leveduras do
gênero Candida, são: bactérias, principalmente Gardnerella vaginalis e o protozoário flagelado
Trichomonas vaginalis (Pray, 2001). Das infecções sexualmente transmissíveis, a infecção por
Chlamydia trachomatis é a mais comum. A clamídia é um parasita intracelular que infecta o
epitélio do canal endocervical e a uretra (Bates, 2003). Cerca de 80% das pacientes infectadas
por clamídia são assintomáticas (“Centers for Disease Control and Prevention”, 2002), porém se
os sintomas existem, se manifestarão de uma a três semanas após a infecção, como um
corrimento vaginal purulento, sangramento pós-coital ou inter-menstrual, dor abdominal baixa e
dispareunia (Bates, 2003).
Introdução 15
A Neisseria gonorrhoeae é um diplococo gram-negativo que infecta os sítios de
contacto sexual como o endocérvix, a uretra e o reto. O período de incubação do gonococo é de
cinco a sete dias. Na maioria das vezes, a infecção é assintomática na mulher, mas pode aparecer
um corrimento vaginal espesso e purulento. A infecção não tratada pode evoluir para doença
inflamatória pélvica (Bates, 2003). O diagnóstico laboratorial de rotina da gonorréia se faz pela
microscopia, coloração de Gram e cultura (Macseen & Ridgway, 1998).
Um corrimento vaginal abundante, delgado, espumoso e fétido, de cor acinzentada,
amarelada ou esverdeada, constitui o principal sintoma da infecção por Trichomonas vaginalis
em 70% das mulheres. A via primária de transmissão é o contacto sexual, com um período de
incubação entre quatro a vinte dias após a exposição ao protozoário (Shimp, 2002).
O diagnóstico da tricomoníase em mulheres é baseado nos sintomas que a paciente
apresenta, no exame pélvico e na avaliação laboratorial do corrimento vaginal. A paciente pode
apresentar prurido, eritema vulvar, erosões na cérvix e linfoadenopatia localizada. O pH do
corrimento vaginal é geralmente maior que 4,5 e o exame microscópico revela a presença de
leucócitos e trichomonas. A adição de KOH à 10% ao corrimento pode produzir um
característico “odor de peixe” (Centers for Disease Control and Prevention, 2002).
A vaginose bacteriana é a causa mais comum de corrimento vaginal em mulheres em
idade reprodutiva. É caracterizada por um crescimento anormal de bactérias anaeróbias como
Gardnerella vaginalis, Peptostreptococcus, Mobiluncus, Prevotella, Bacteroides e Micoplasma
hominis, com concomitante diminuição de lactobacilos da microbiota normal (Shimp, 2002;
Bates, 2003).
Os lactobacilos produzem o ácido lático através da glicólise, e assim mantém o pH
vaginal ácido. A alcalinização repetida da vagina, que pode ser resultante de intercursos sexuais
freqüentes, uso de duchas vaginais ou período pré-menstrual, favorece a alteração da microbiota
bacteriana vaginal (Soper, 1998). O “odor de peixe” pode aparecer por causa da produção de
aminas pelo metabolismo aeróbio (Bates, 2003).
Metade das mulheres com vaginose bacteriana é assintomática. Mas, os sintomas
comuns incluem corrimento vaginal delgado, homogêneo e geralmente de cor branca,
acinzentada, amarelo-esverdeada. Prurido, inflamação e irritação podem ocorrer em cerca de
15% das mulheres (Shimp, 2002).
O diagnóstico da vaginose bacteriana baseia-se no pH, sempre maior que 4,5, e na
presença de células indicadoras ou “clue cells” no exame direto do corrimento (Bates, 2003).
A vaginite atrófica caracteriza-se por uma inflamação relacionada com a atrofia da
mucosa, secundária a uma diminuição nos níveis de estrogênio (Bates, 2003).
Introdução 16
Com a diminuição do estrogênio, o epitélio vaginal torna-se fino e a lubrificação
vaginal diminui. Estas alterações provocam uma redução na produção de lactobacilos e um
aumento do pH, favorecendo o crescimento de coliformes, contribuindo assim a produção do
corrimento vaginal (Shimp, 2002). Além da diminuição da lubrificação vaginal, sintomas como
irritação, secura, ardência, prurido e dispareunia podem ocorrer (Shimp, 2002; Bates, 2003). O
corrimento vaginal se apresenta delgado, aquoso, fétido, de cor amarelada e ocasionalmente
podendo conter sangue (Sobel, 1997; Shimp, 2002).
Durante a gravidez, a presença de um corrimento vaginal é comum e decorre
principalmente da hipertrofia do epitélio vaginal com aumento de células contendo glicogênio
(Bates, 2003).
Tratamento da candidíase vulvovaginal
A CVV não complicada responde prontamente à terapia antifúngica tópica ou oral de
curso curto. Em geral, os antifúngicos imidazólicos aplicados topicamente durante 1-3 dias são
os agentes mais efetivos, alcançando taxas de cura clínica em torno de 85-90%, quando
comparados com a nistatina, a cura se estabelece em 75-80% (Sobel et al., 1998a).
Butaconazol, clotrimazol, miconazol e tioconazol têm espectros de ação similares,
sendo que o terconazol tem melhor atividade contra espécies de Candida não albicans. A terapia
com agentes orais apresenta taxa de cura ligeiramente melhor que a terapia com antifúngicos
tópicos, sendo que a maioria das mulheres prefere a terapia oral pelo conforto da administração
(Sobel et al., 1998b). Os antifúngicos orais que tem mostrado efeito nestas condições são:
cetoconazol, itraconazol e fluconazol. O fluconazol é único antifúngico oral aprovado para o
tratamento da CVV pela FDA – Food and Drug Administration (Val & Almeida, 2001).
Os esquemas de tratamentos têm sido preferencialmente os sistêmicos, pois
erradicam os reservatórios genitais e extragenitais. É recomendável tratar ambos os parceiros
principalmente em recidivas e insucessos (Halbe, 2000).
As doses únicas são os esquemas terapêuticos de escolha, devido a sua praticidade. A
primeira dose única comercializada foi na década de 80 (formulação de 500 mg de clotrimazol).
Posteriormente outras formulações foram lançadas com fenticonazol, tioconazol e sertoconazol
alcançando grande difusão no mercado (Ziarrusta, 2002; Ferracin & Oliveira, 2005).
Na CVV complicada, há necessidade de terapia prolongada, sendo eleitos
antifúngicos tópicos por mais de 07 dias, associados ou não, dependendo do quadro, com
Introdução 17
antifúngicos orais em esquemas de doses maiores e prolongadas (Val & Almeida, 2001; Ferracin
& Oliveira, 2005). Após controle da CVV deve ser instituida terapêutica medicamentosa
prolongada. A profilaxia ou um regime de manutenção deve ser realizado por 6 meses,
incluindo: fluconazol 150 mg (1 x por semana), cetoconazol 100 mg (1 x ao dia), itraconazol 100
mg (dias alternados) ou aplicação de imidazólico tópico diariamente (Sobel et al., 1998a; Sobel
et al., 2001).
O tratamento de gestantes com candidíase vulvovaginal é mais difícil devido à
resposta clínica ser mais lenta e as recorrências serem mais freqüentes. Em geral, a maioria dos
agentes tópicos é eficaz, principalmente quando prescritos por longos períodos, de uma a duas
semanas. Contudo, dose única com 500 mg de clotrimazol também tem mostrado eficácia em
gestantes. Embora a absorção sistêmica do antifúngico tópico seja mínima, o potencial de risco
ao desenvolvimento do feto durante o 1º trimestre deve ser avaliado em relação ao benefício
materno (Sobel, 1993).
Em pacientes gestantes a experiência clínica oral com cetoconazol, fluconazol e
itraconazol são limitadas, sendo que sua administração deve ser feita quando não houver
disponibilidade de terapêutica alternativa (Halbe, 2000)
Drogas antifúngicas
Os organismos do reino Fungi compartilham com a célula do hospedeiro humano o
caráter eucariota, com conseqüentes similaridades bioquímicas e fisiológicas que limitam, em
muito, o arsenal terapêutico fúngico disponível. Portanto, as drogas antifúngicas apresentam, em
geral, toxicidade significativa e poucos são os compostos que exibem seletividade suficiente para
uso nas micoses humanas. A maioria dos agentes antifúngicos, comercialmente disponíveis, tem
como alvo os esteróis da membrana celular fúngica, que se assemelham aos da célula humana. A
parede celular fúngica é a única organela que não é encontrada nas células dos mamíferos;
consequentemente, antifúngicos ativos contra este componente celular, provavelmente
apresentarão menor toxicidade e serão mais bem tolerados (Ferrari & Hamdan, 1998).
2.6.1. Polienos
O mecanismo de ação primário dos polienos, representados aqui pela anfotericina B
(Figura 2), reporta à ligação aos esteróis de membrana, preferencialmente ao ergosterol, o
Introdução 18
principal esterol presente na membrana de células fúngicas. Esta interação resulta na formação
de poros, alteração da permeabilidade da membrana, levando à perda de sódio, potássio e outros
constituintes citoplasmáticos, geralmente causando a morte da célula fúngica (Ferrari &
Hamdan, 1998). O mecanismo envolvido na interação polieno-esterol ainda não se encontra
totalmente elucidado e para explicá-lo vários modelos moleculares vêm sendo propostos
(Langlet et al., 1994).
Foi demonstrado, experimentalmente, que os efeitos letais produzidos por altas
concentrações desta droga sobre fungos, não são apenas conseqüência do aumento da
permeabilidade da membrana, mas podem implicar também em danos oxidativos à célula
(Sokol-Anderson et al., 1986). Os mecanismos exatos envolvidos nesse processo permanecem
por elucidar, mas alguns autores têm sugerido que a anfotericina B induziria uma cascata de
reações oxidativas na célula fúngica, provavelmente devido à sua auto-oxidação (Brajtburg et al.,
1990; Warnock, 1991).
A formulação convencional da anfotericina B, para uso médico, associa a esta droga
o desoxicolato de sódio, cuja finalidade é solubilizá-la em água e estabilizar a suspensão na
forma de micélios. A dose diária única de 1 mg/kg de peso corporal resulta em concentrações
séricas máximas aproximadas de 1 a 2 µg/mL na primeira hora após a infusão, e estima-se que a
sua meia-vida inicial seja em 24 a 48 horas. A anfotericina B convencional alcança maiores
concentrações no fígado, baço, rins e pulmões (Christiansen et al., 1985). A principal via de
excreção é a renal, mas há também eliminação por via hepatobiliar, e presume-se que parte da
droga seja metabolizada (Gallis et al., 1990).
A anfotericina B produz freqüentes efeitos adversos, relacionados à infusão e tardios,
por toxicidade celular e tecidual. Aqueles relacionados à infusão manifestam-se como febre,
calafrios, taquicardia, hipertensão arterial, náuseas e vômitos. Os efeitos adversos tardios mais
comuns são nefrotoxicidade e a anemia, que requerem correção de doses, intervalos de
administração e, eventualmente, obrigam a uma suspensão da terapia (Pathak et al., 1998).
O uso clínico da anfotericina B é limitado pelos efeitos adversos e necessidade de
aplicação endovenosa. Portanto, o antibiótico é mais empregado em casos de infecções fúngicas
invasivas, particularmente em imunossuprimidos. Constituem indicações primárias de terapia
com anfotericina B casos de criptococose, aspergilose, infecções disseminadas por leveduras do
gênero Candida resistentes a triazólicos e infecções por certos agentes de feohifomicose e de
hialohifomicose (Martinez, 2006).
Introdução 19
Tentativas para reduzir a nefrotoxicidade específica surgiram nos últimos anos.
Adicionalmente, a necessidade de se instituírem tratamentos agressivos para as micoses
sistêmicas invasivas, com dosagens, necessariamente, mais altas, motivou o desenvolvimento de
diferentes veículos para a administração de anfotericina B. Dentre eles, o encapsulamento de
base lipossômica, a formação de complexos lipídicos e dispersões coloidais destacam-se com os
melhores resultados na diminuição da toxicidade e aumento da eficácia terapêutica (Filippin &
Souza, 2006).
2.6.2. Derivados azólicos
Os derivados azólicos são compostos sintéticos que vem emergindo como uma
alternativa ao uso da anfotericina B, uma vez que apresentam uma menor toxicidade além de
exibirem amplo espectro de ação e melhores propriedades farmacocinéticas (Saag & Dismukes,
1988; Lyman & Walsh, 1992).
A estrutura química dos azólicos compreende, basicamente, um ou mais anéis de
cinco átomos de carbono (anel azólico), unido (s) ao restante da molécula por ligação do tipo C-
N. Os imidazólicos (miconazol e cetoconazol) contêm dois átomos de nitrogênio no anel azólico,
enquanto que, para os triazólicos (fluconazol e itraconazol), um terceiro átomo de nitrogênio foi
introduzido neste anel (Gupta et al., 1994a). Considerando as drogas de uso sistêmico,
encontram-se incluídos os imidazólicos: miconazol e cetoconazol e os triazólicos: fluconazol,
itraconazol, voriconazol, posaconazol e ravuconazol (Martinez, 2006). Embora haja diferenças
na estrutura química das diversas drogas que compõem este grupo, é suposto que elas
compartilhem um mecanismo de ação comum (Lyman & Walsh, 1992).
Figura 2
-
Estrutura química da anfotericina B.
Fonte: Hamdan & Hahn, 2006.
Curr Med Chem - Anti-Infective Agents
O
OH
O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
NH
2
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
Introdução 20
O mecanismo de ação primário de todos os derivados azólicos, incluindo tanto os
imidazólicos quanto os triazólicos, envolve a inibição da biossíntese do ergosterol, que é o
produto final da via metabólica de esteróis fúngicos. Isto ocorre através da inibição da enzima 14
α-demetilase, dependente do citocromo P-450, que participa da seqüência de eventos envolvida
na conversão de lanosterol e ergosterol. Esta inibição resulta no acúmulo de uma série de
precursores metilados, incluindo o lanosterol, e diminuição ou mesmo ausência do produto final
da via biossintética. Em seguida, a substituição do ergosterol pelos precursores metilados
determinará a formação de membrana defectiva, com permeabilidade alterada (Lorens & Parks,
1990; Shimokawa & Nakayama, 1992; Espinel-Ingroff & Pfaller, 1995; Franzot & Hamdan,
1995; Kokjohn et al., 2003).
Este mecanismo de ação, fundamentado na inibição enzimática, é responsável pela
atividade fungistática dos derivados azólicos (Pye & Marriot, 1982; Bossche & Marichal, 1992).
Em nível molecular, foi descrito que um dos átomos de nitrogênio do anel azólico se ligaria ao
grupo heme do citocromo P-450 fúngico, resultando na inibição da ativação deste citocromo e
consequentemente, impedindo a função da enzima (Bossche & Marichal, 1992; Lyman & Walsh,
1992).
Outros efeitos antifúngicos dos derivados azólicos têm sido descritos, parecendo
provir, essencialmente, das modificações estruturais da membrana plasmática, acarretadas pela
inibição da biossíntese do ergosterol. Estes efeitos incluem: alteração da atividade de enzimas
ligadas à membrana como a quitina-sintetase, interferência com o metabolismo respiratório,
interferência na biossíntese de outros lipídios, inibição da formação de hifas e de tubo
germinativo, entre outros (Watson et al., 1989; Barret-Bee et al., 1991; Bossche & Marichal,
1992; Lyman & Walsh, 1992; Van Den Anker et al., 1995; Ferrari & Hamdan, 1998; Sheehan et
al., 1999).
Além disso, vem sendo aventado que os derivados azólicos poderiam exercer o efeito
direto sobre os ácidos graxos da membrana alterando sua estrutura, desorganizando-a,
ocasionando perda de aminoácidos e proteínas e interferindo na tomada de nutrientes pela célula.
Os derivados azólicos poderiam ainda provocar a inibição de enzimas oxidativas e peroxidativas,
com resultante aumento na formação de peróxido intracelular (Saag & Dismukes, 1988; Bossche
& Marichal, 1992; Lyman & Walsh, 1992; Sheehan et al., 1999).
A toxicidade seletiva dos derivados azólicos é fato fundamentado pela evidência de
que, embora alguns processos metabólicos da célula humana também dependam de reações
Introdução 21
mediadas pelo citocromo P-450, estas drogas demonstram uma maior afinidade pelo sistema
enzimático fúngico (Kerridge, 1986; Lyman & Walsh, 1992). Entretanto, em alguns casos parece
ocorrer interação dos azólicos também com o citocromo P-450 humano, podendo esta alterar,
como por exemplo, a síntese de hormônios adrenais, o que foi evidenciado particularmente para
o imidazólico cetoconazol (Ferrari & Hamdan, 1998). Os triazólicos, itraconazol, fluconazol e
voriconazol apresentam menor toxicidade do que os imidazólicos em função de sua ligação mais
específica ao citocromo celular fúngico do que àquele de mamíferos, demonstrando pouca ou
nenhuma interação com o sistema enzimático humano (Gupta et al., 1994a; Espinel-Ingroff &
Pfaller, 1995; BidartH, 2004).
O cetoconazol (Figura 3) representou o primeiro derivado azólico com atividade
antifúngica evidente e em disponibilidade para uso oral, com relatos de seu uso clínico
remontando a 1979. Este antifúngico pode interferir em processos metabólicos da célula humana,
tendo sido evidenciados também efeitos tóxicos em nível hepático e gastrointestinal (Gupta et
al., 1994a; Ferrari & Hamdan, 1998).
A posologia varia de 200 a 600 mg diários, em dose única, e o tempo para obtenção
da cura é variável com o tipo de infecção fúngica. Após a ingestão, atinge níveis plasmáticos
elevados em uma a duas horas. A sua biodisponibilidade diminui quando tomado logo após as
refeições e com antiácidos, cimetidina e ranitidina. É metabolizado na sua totalidade pelo fígado
e eliminado in natura pelo rim, na percentagem de 2 a 4%. Quanto aos efeitos colaterais,
raramente ocorre intolerância gástrica (náuseas, azia, vômitos, dores abdominais e diarréia). Tem
sido relatado, também, prurido intenso, alopecia difusa, fotossensibilidade, mialgias, artralgias,
insônia, nervosismo, anemia, leucopenia, eosinofilia e trombocitopenia. Em cerca de 5 a 10%
dos casos ocorre elevação das transaminases e da amilase pancreática, que regridem quase
sempre com a suspensão do tratamento. Alguns estudos demonstram que em cerca de 1 para
10.000 casos surge hepatite tóxica. É conveniente, portanto, acompanhar com dosagem de
transaminases periódicas os pacientes submetidos a tratamentos prolongados com esse
antifúngico (Lacaz et al., 2002b).
Figura 3
– Estrutura química do cetoconazol
Fonte: Hamdan & Hahn, 2006.
Curr Med Chem - Anti-Infective Agents
O
N
O
N
N
O
O
H
N
Cl Cl
Introdução 22
O fluconazol (Figura 4) possui características farmacocinéticas acentuadamente
distintas daquelas de outros derivados azólicos atualmente em uso clínico, possuindo uma
notável atividade antifúngica (Lyman & Walsh, 1992). Efeitos colaterais são raros e geralmente
ocorrem em nível hepático e gastrointestinal (Gupta et al., 1994b; Ferrari & Hamdan, 1998).
A posologia varia de 100 – 1200 mg/dia. A dose habitual para candidíase invasiva é
de 400mg/dia. Alguns autores recomendam doses mais elevada em caso de infecções por
espécies não-albicans (Lumbreras et al., 2003).
O fluconazol é muito hidrossolúvel. Sua absorção oral é rápida e completa e não se
modifica pela alimentação. Os níveis sanguíneos se alcançam entre a 2 a 4 horas e o estado de
equilíbrio se consegue em quatro a cinco dias. Uma de suas características mais importantes é a
elevada penetração nos líquidos biológicos de todo o organismo. É eliminado principalmente
pela urina, sem metabolizar, embora grande parte seja reabsorvida nos túbulos renais. Os efeitos
adversos mais comuns são distúrbios gastrointestinais, cefaléias e exantemas cutâneos
(Lumbreras et al., 2003).
Este medicamento foi bem tolerado em experiências com voluntários humanos. Seu
perfil, como antifúngico oral e intravenoso, sugere ter ele, potencial para representar importante
avanço na terapêutica das infecções fúngicas, em especial nas candidíases e criptococose (Lacaz
et al., 2002b).
O fluconazol é ativo contra leveduras incluindo leveduras do gênero Cryptoccocus.
A maioria de espécies de leveduras do gênero Candida é susceptível, embora algumas cepas de
C. glabrata apresentem-se resistentes e C. krusei mostre-se intrinsicamente resistente (Mellado
et al., 2002).
N
N
N
F
F
N
OH
N
N
Figura 4
– Estrutura química do fluconazol
Fonte: Hamdan & Hahn, 2006.
Curr Med Chem - Anti-Infective Agents
Introdução 23
O itraconazol (Figura 5) é um derivado triazólico insolúvel em água e altamente
lipofílico (Negroni & Arechavala, 1993; Espinel-Ingroff & Pfaller, 1995). Em comparação com
o cetoconazol, suas vantagens estão representadas pelo maior espectro de atividade antifúngica,
melhor perfil farmacocinético e menor toxicidade (Lyman & Walsh, 1992).
A alta taxa de distribuição da droga, detectada em quase todos os tecidos, em níveis
superiores às concentrações sanguíneas, explicaria a sua eficácia no tratamento de grande
número de micoses humanas (Negroni & Arechavala, 1993; Espinel-Ingroff & Pfaller, 1995). Os
efeitos colaterais deste composto, raramente detectados, geralmente envolvem o fígado e o trato
gastrointestinal (Gupta et al., 1994b).
A posologia varia de 200 – 400 mg/dia estando disponível em forma de cápsulas e
solução oral. A solução oral se apresenta com uma concentração de 10 mg/dL (Lumbreras et al.,
2003).
Este medicamento é formalmente contra-indicado nos doentes sensíveis à medicação
ativa ou a seus excipientes. Não há formação de reação de hipersensibilidade cruzada com outros
imidazólicos. Foram relatados raros casos de hepatite tóxica reversível e formas mais graves,
inclusive fatais, como do uso concomitante de múltiplas medicações. A função hepática e renal
deve ser monitorada. O aumento das bilirrubinas e das transaminases pode ocorrer em 9% dos
casos dos doentes tratados. Alterações no ritmo cardíaco foram relatadas quando da associação
com anti-histamínicos, com terfenadina e astemizol (Lacaz et al., 2002b).
O itraconazol tem uma excelente atividade in vitro contra as leveduras, incluindo
algumas espécies de Candida resistente ao fluconazol, embora também tenha fraca atividade
contra a C. krusei. A maioria das cepas de Cryptococcus neoformans é sensível (Lumbreras et
al., 2003).
N
O
N
N
N
N
O
N N
N
O
Cl
O
Cl
H
Figura 5
– Estrutura química do itraconazol
Fonte: Hamdan & Hahn, 2006.
Curr Med Chem - Anti-Infective Agents
Introdução 24
2.7. Resistência a drogas antifúngicas
Infecções fúngicas causadas por patógenos leveduriformes comuns e emergentes têm
se tornado cada vez mais freqüentes, particularmente como resultado do aumento do número de
pacientes imunocomprometidos. A introdução dos azólicos promoveu maiores opções
terapêuticas, incluindo o uso prolongado de altas dosagens, o que ocasionou a emergência de
resistência à terapia antifúngica (Espinel-Ingroff et al., 1998).
Ao se conceituar susceptibilidade e resistência deve-se considerar dois pontos de
vista, o microbiológico e o clínico. Do ponto de vista microbiológico, uma amostra é resistente a
um antifúngico quando sua concentração inibitória mínima (CIM) é elevada em relação à CIM
habitual para a espécie. Clinicamente, deve-se considerar que amostras resistentes
microbiologicamente podem responder perfeitamente ao tratamento, pois a concentração da
droga no local da infecção pode ser maior que a CIM do microorganismo. Um fungo é resistente
clinicamente quando continua crescendo e produzindo sintomatologia apesar da concentração do
fármaco ser máxima no local da infecção (Rodriguez-Tudella et al., 2003).
Há vários mecanismos pelos quais a célula fúngica torna-se resistente aos azólicos:
alterações da entrada da droga na célula fúngica, alterações no processamento intracelular,
modificações na degradação do fármaco, alterações das enzimas que participam do mecanismo
de ação das drogas, mutações, alterações de enzimas que participam do processo de biossíntese
do ergosterol e alterações nas bombas de efluxo (Rodriguez-Tudella et al., 2003). Sanglard et al.
(1997) identificaram genes envolvidos no sistema de efluxo em C. albicans e demonstraram que
eles podem conferir resistência ao fluconazol, outros azólicos e uma variedade de outros
compostos.
2.8. Testes de susceptibilidade às drogas antifúngicas
Ao contrário dos testes de susceptibilidade a antibacterianos, os testes de
susceptibilidade a antifúngicos não são comumente realizados na maioria dos laboratórios
clínicos. Há uma década, testes de susceptibilidade a antifúngicos eram ocasionalmente
executados e não havia cuidados no seu desenvolvimento e na padronização. Este fato é
inaceitável e atribuído a testes intra e interlaboratoriais apresentando resultados com baixas
reprodutibilidade e concordância (Perea & Patterson, 1999).
Introdução 25
Os primeiros testes visando à padronização foram desenvolvidos por Espinel-Ingroff
et al. (1992) tornando possível a comparação de resultados e abrindo caminho para o
desenvolvimento de outros testes.
O surgimento de espécies patogênicas com resistência intrínseca aos antifúngicos,
principalmente pelo uso de terapia antifúngica profilática, tem aumentado a necessidade de
desenvolvimento e padronização de testes de susceptibilidade aos antifúngicos (Cuenca-Estrela
et al., 2002).
Um fator preponderante deve sempre ser levado em consideração: a associação dos
testes in vitro à resposta in vivo, que dependerá essencialmente do estado do indivíduo, incluindo
doença pré-existente e resposta imune celular (Conti et al., 1999).
Nos últimos anos foram desenvolvidas técnicas para o estudo da susceptibilidade in
vitro aos antifúngicos, sendo o método de microdiluição em caldo considerado a técnica de
referência. O National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) aprovou um
primeiro padrão para estudar a sensibilidade dos antifúngicos frente a leveduras em 1999
(documento M27-A) (NCCLS, 1997), modificado posteriormente e aprovado no ano 2002 o
padrão (documento M27-A2) (NCCLS, 2002). Em 2005 passou a ser denominado Clinical and
Laboratory Standards Institute – CLSI (CLSI, 2005).
Métodos alternativos foram surgindo conforme a necessidade de técnicas que podem
ser usadas para o diagnóstico diário em laboratório clínico (Vandenbossche et al., 2002), as
técnicas de difusão em ágar são amplamente difundidas, sendo o Etest o mais utilizado em nosso
meio (AB Biodisk, 1994).
2.9. Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI
A partir de 1982, o NCCLS, que em 2005, foi denominado CLSI, preocupado com a
determinação precisa da metodologia dos testes e do ponto de resistência aos antifúngicos, criou
uma subcomissão para elaborar normas e métodos para testes de susceptibilidade a antifúngicos,
semelhantes àqueles usados com agentes antibacterianos. Isso se fez necessário, devido à
inexistência de uma concordância dos valores de CIM de diferentes antifúngicos estabelecidos
por diversos laboratórios, dificultando a orientação sobre a terapêutica a ser empregada no
tratamento (Murray, 1991).
Em 1998, Espinel-Ingroff et al., fizeram uma análise do protocolo M27-A, do então
NCCLS. Este protocolo trata da metodologia padronizada e aprovada para testes de
Introdução 26
susceptibilidade aos antifúngicos para espécies de leveduras do gênero Candida e Cryptococcus
neoformans var. neoformans. Os autores citados recomendam meios de culturas, técnicas e
critérios alternativos para a determinação das CIM para leveduras, ao mesmo tempo, propuseram
procedimentos técnicos para fungos filamentosos gerando dados para o protocolo M38-P, que
foram, então, utilizados para estes fungos.
Em 2002, o documento M-27A sofreu algumas modificações (M-27A2) para melhor
adaptar a metodologia da microdiluição, que é mais atrativa para testes de susceptibilidade
antifúngica que a macrodiluição (pela execução mais fácil e por motivos econômicos) passando a
incluir a leitura de 24 horas para Candida spp devido ao crescimento “trailing” (crescimento
residual). Em função desse problema, um isolado que se determina como susceptível em 24
horas pode apresentar-se completamente resistente em 48 horas de incubação (NCCLS, 2002).
O método de macrodiluição proposto pelo CLSI (2005), utiliza o meio de cultura
sintético RPMI-1640 com tampão MOPS, um inóculo de 0,5 a 2,5 x 10
3
UFC/mL, 48 horas de
incubação a 35° C para leveduras do gênero Candida e 72 horas para Cryptococcus neoformans,
e um esquema para preparação de diluições em duplicata. Para os azólicos, o critério
recomendado para a determinação da CIM é de 80% de inibição no crescimento, comparado com
o controle de crescimento. Já o teste de microdiluição é idêntico ao método de macrodiluição,
exceto pelo volume. As suspensões do inóculo estão diluídas em 1:1000 para se obter duas vezes
as concentrações teste. O experimento é realizado em duplicata. Controvérsias existem sobre o
tempo de incubação (24 ou 48 horas). Um tempo de incubação menor seria instrumento eficiente
em laboratórios clínicos.
2.10. Metodologia comercial (Etest)
O Etest é um método utilizado para determinar quantitativamente a susceptibilidade
in vitro aos antifúngicos, baseado em gradientes de concentração dos antifúngicos empregados
em fita plástica, através da técnica de difusão em ágar. Este método nos permite determinar uma
cepa como sensível ou resistente, pois também determina a concentração inibitória mínima
(CIM) (Sanchez & Jones, 1992; Colombo et al., 1995).
Esta técnica tem sido usada por muitos autores, pois é de fácil e rápida execução e
interpretação dos resultados, características estas que fazem da técnica a mais difundida para
estudo da sensibilidade aos antifúngicos (AB Biodisk, 1994).
Introdução 27
2.11. Correlação entre os resultados dos testes de susceptibilidade in vitro
e os efeitos terapêuticos in vivo
São realizados testes de susceptibilidade para detecção de resistência dos
microorganismos aos antifúngicos, auxiliando na eleição da melhor alternativa de tratamento e
reduzindo a possibilidade de falha terapêutica. Em micologia, a ocorrência de espécies
patogênicas com resistência intrínseca e secundária tem determinado a grande importância
desses testes. Entretanto, estabelecer a relevância clínica dos resultados in vitro – in vivo, tem
sido uma tarefa complexa, uma vez que os testes de susceptibilidade são realizados em condições
padronizadas utilizando uma fase constante de crescimento do microorganismo, condições fixas
de pH, temperatura, umidade e concentração de oxigênio. No tratamento de uma infecção não há
nada padronizado; numerosos fatores relacionados ao microorganismo, ao hospedeiro e ao
fármaco influenciam na correlação in vitro – in vivo (Rex et al., 1997; Costa et al., 2001;
Cuenca-Estrela & Rodriguez-Tudella, 2002).
Os testes de susceptibilidade às drogas antifúngicas, podem ter maior utilidade na
determinação de casos onde os isolados se originam de pacientes que apresentam falha
terapêutica ou que tenham recebido medicação antifúngica profilática ou então, quando
consideradas amostras de espécies pouco freqüentes, das quais se desconhece totalmente o perfil
de susceptibilidade. Nestes casos, os estudos de susceptibilidade in vitro podem ajudar a eleger a
melhor alternativa farmacológica e oferecer informações para aumentar a dose ou empregar
combinação de drogas. Apresentam também, importante papel em epidemiologia, pois podem
ser conhecidos os perfis de susceptibilidade de diferentes espécies, a taxa de ocorrência destes
perfis e estabelecidos quais os tratamentos provavelmente mais adequados (Rex et al., 1997;
Cuenca-Estrela & Rodriguez-Tudella, 2002; Costa, 2004).
2.12. Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
A determinação da CIM não é uma medida química ou física. Fatores como a
farmacocinética das drogas, resposta imunológica do paciente, estágio de evolução da doença
infecciosa, regime de administração medicamentosa realizada pelo paciente, sítio acometido pela
infecção e gravidade da mesma, virulência do patógeno e interações hospedeiro/microrganismo
e/ou droga/droga têm sido sugeridos como aspectos mais significativos na determinação dos
resultados clínicos, do que os valores obtidos in vitro. Um valor baixo da CIM nem sempre
Introdução 28
resulta em sucesso terapêutico. Porém, a obtenção de valores altos, sugerindo resistência fúngica,
freqüentemente corresponde à falha terapêutica medicamentosa (Espinel-Ingroff et al., 1998).
A interpretação dos testes de susceptibilidade aos antifúngicos foi avaliada pelo
CLSI, para os valores de CIM capazes de determinar susceptibilidade e/ou resistência às drogas
normalmente empregadas.
Assim, para o fluconazol CIM ≤ 8,0 µg/mL respondem às doses padrões (100 – 200
mg/dia). Resposta à terapia com doses mais altas (400 – 800 mg/dia tem sido requerida em
situações onde os valores de CIM foram 16 a 32 µg/mL. Para isolados com valores de CIM ≥ 64
µg/mL, uma droga alternativa deve ser utilizada no tratamento do processo infeccioso. O CLSI
estabeleceu valores de CIM para agrupar amostras como susceptíveis refletindo aquelas nas
quais os valores de CIM foram ≤ 8,0 µg/mL; amostras susceptíveis, mas dependentes da
concentração da droga, aquelas que apresentaram valores de CIM de 16 a 32 µg/mL e amostras
resistentes aquelas cujos valores de CIM foram ≥ 64 µg/mL.
Para o itraconazol, isolados cujos valores de CIM foram ≤ 0,125 µg/mL são
considerados susceptíveis à droga. Valores de CIM compreendidos entre 0,25 e 0,5 µg/mL são
susceptíveis, mas dependem da concentração da droga utilizada. Isolados cujas CIM são ≥ 1,0
µg/mL estão associados à grande probabilidade de falha na terapêutica por desenvolvimento de
resistência (CLSI, 2005).
Em relação ao cetoconazol o CLSI (2005), apenas registra que os valores das
concentrações da droga geralmente são encontrados entre 0,03 – 16 µg/mL Este fato é
justificado, pois até o presente momento não há uma boa correlação entre os valores de CIMs
encontrados in vitro e a terapêutica in vivo.
De acordo com CLSI (2005), as CIMs da anfotericina B, para isolados de leveduras
do gênero Candida, apresentam-se agrupados em pequeno intervalo entre 0,25 e 1,0 µg/mL e
quando se obtém um valor de CIM de anfotericina B > 1,0 µg/mL para um isolado de Candida
spp, é provável que o isolado seja resistente à anfotericina B.
3. OBJETIVOS
Objetivos 30
3.1. Objetivo geral
Determinar a prevalência e o perfil de susceptibilidade in vitro a quatro drogas
antifúngicas de espécies de leveduras do gênero Candida, isoladas em pacientes atendidas no
ambulatório de ginecologia/obstetrícia do Hospital Geral Universitário de Cuiabá/MT.
3.2. Objetivos específicos
3.2.1. Isolar leveduras do gênero Candida a partir de pacientes gestantes ou não
atendidas no ambulatório de ginecologia/obstetrícia do Hospital Geral Universitário de
Cuiabá/MT.
3.2.2. Avaliar, através da técnica de CHROMagar, a pureza das colônias isoladas e
realizar a identificação presuntiva das espécies a partir de secreções vaginais obtidas.
3.2.3. Determinar a prevalência de candidíase vulvovaginal e das espécies de
leveduras do gênero Candida na população avaliada.
3.2.4. Identificar as leveduras através de técnicas laboratoriais padronizadas (tubo
germinativo, microcultivo, zimograma e auxanograma).
3.2.5. Determinar o perfil de susceptibilidade in vitro das espécies isoladas a quatro
antifúngicos através de metodologia de referência CLSI microdiluição.
3.2.6. Determinar o perfil de susceptibilidade in vitro das espécies isoladas a quatro
antifúngicos utilizando kit comercialmente disponível (Etest).
3.2.7. Comparar os valores de CIM, obtidos através de duas metodologias distintas
(CLSI e Etest), para avaliar a sensibilidade do método disponível comercialmente (Etest) em
relação ao de referência (CLSI), visando a sua possível utilização em laboratório clínico.
4. METODOLOGIA
Metodologia 32
4.1. Seleção de pacientes
Para a realização de estudo descritivo de prevalência, foram incluídas, 404 pacientes
(gestantes ou não) atendidas no ambulatório de ginecologia/obstetrícia do Hospital Geral
Universitário de Cuiabá/MT, no período compreendido entre novembro de 2005 a novembro
2006. As pacientes avaliadas neste estudo apresentaram algum sinal ou sintoma de leucorréia.
Destas, foram coletadas secreções vaginais com auxílio de swabs estéreis, objetivando a
realização de culturas para fungos.
Profissionais médicos e/ou residentes realizaram entrevistas com as pacientes
incluídas, seguindo questionário específico (Anexo 1) previamente elaborado, visando à
elucidação de fatores predisponentes, possivelmente, associados à vulvovaginite micótica e
elucidação do agente etiológico.
Todas as coletas só foram realizadas após assinatura do termo de consentimento
pelas pacientes, aprovado pelo comitê de ética em pesquisa (CEP) do HGU/UNIC em 26 de
agosto de 2005 (Anexo 2).
As pacientes atendidas foram divididas em dois grupos quanto à sintomatologia
apresentada: assintomáticas, presença de apenas um sintoma (corrimento característico) e
sintomática, pacientes que apresentaram dois ou mais sintomas (corrimento característico,
prurido vulvovaginal, ardência vulvovaginal, disúria e dispareunia).
A classificação adotada em nosso estudo segue parcialmente aquela proposta por
Lopes Consolaro et al. (2004). Estes autores classificam as mulheres em assintomáticas quando
há ausência ou presença de apenas um sintoma. Quanto às pacientes sintomáticas, há
concordância que as mesmas devam apresentar dois ou mais sintomas.
4.2. Cultivo das amostras
Todas as amostras clínicas foram cultivadas em dois tubos de vidro contendo ágar
Sabouraud-dextrose (DIFCO) (Figura 6), acrescido de cloranfenicol à concentração de 100 mg/L
de meio. O pH foi ajustado entre 5,6 e 6,0 (Koneman et al., 1989).
O meio de cultura ágar Sabouraud-dextrose foi obtido comercialmente (DIFCO) e
seu preparo procedeu de acordo com orientações do fabricante.
As amostras clínicas também foram diretamente semeadas em um tubo de vidro com
ágar Mycosel, contendo cicloheximida em sua composição (DIFCO) (Figura 6), com pH
Metodologia 33
ajustado entre 6,7 e 7,1. Este foi utilizado objetivando o isolamento e triagem na identificação
das espécies, já que a cicloheximida pode inibir o crescimento de algumas espécies de leveduras
do gênero Candida.
O meio de cultura ágar Mycosel foi obtido comercialmente (DIFCO) e seu preparo
procedeu de acordo com orientações do fabricante.
Os meios cultivados foram incubados a 25º C por até sete dias. As culturas que não
apresentaram qualquer crescimento em relação a colônias fúngicas foram consideradas
negativas.
No momento das coletas um swab com material clínico, foi introduzido em um tubo
de salina estéril (Figura 6), para realização do exame à fresco, cujo objetivo era observar a
presença ou ausência de células ovaladas/arredondadas e pseudo-hifas com características
morfológicas sugestivas de leveduras do gênero Candida.
4.3. Identificação das amostras
Após detecção das colônias isoladas, em células leveduriformes, foi realizado um
esfregaço delgado e posteriormente corado utilizando-se a técnica de coloração de Gram para
visualização de características morfotintoriais. A partir dos resultados pós-coloração de Gram, as
leveduras foram submetidas à identificação.
A identificação foi realizada a partir de culturas puras, repicadas em tubo de vidro
contendo ágar Sabouraud, 24 horas antes de seu uso. Este procedimento visa à obtenção de
Figura 6
– Kit utilizado para coleta e
semeadura de material clínico
Fonte: Imagem obtida pela autora
Lab. Micologia - HGU
Metodologia 34
células leveduriformes em fase exponencial de crescimento. Para a identificação de leveduras do
gênero Candida, vários taxonomistas vêm propondo, além de estudos micromorfológicos, o uso
de uma série de provas bioquímicas (Odds, 1988a).
4.3.1. Avaliação quanto à pureza
Após isolamento, as colônias foram testadas quanto sua pureza através de
plaqueamento em meio cromogênico CHROMagar Candida (BBL). Este procedimento foi útil
para isolar e identificar presuntivamente: colônias de coloração verde claro – sugestivas de C.
albicans, colônias de cor azul – sugestivas de C. tropicalis, colônias apresentando coloração rosa
em diferentes tonalidades e aspectos – sugestivas de outras espécies de leveduras do gênero
Candida (Figura 7). O fundamento deste método preconiza a utilização do substrato β
glicosaminidase (Cooke et al., 2002, Quindós et al., 2001) e a diferenciação das leveduras de
acordo com a morfologia e a cor das colônias (Carrillo Munõz et al., 2001, Fotedar & Al-
Hedaithy, 2002).
4.3.2. Pesquisa de tubo germinativo
Em relação às características micromorfológicas, foi verificado, em primeiro
momento, a habilidade de formação de tubo germinativo ou efeito Reynolds-Braude. Para
visualização desta característica, uma pequena quantidade da colônia foi transferida para um
Figura 7
– Plaqueamento de colônias em meio CHROMagar
Fonte: Imagem obtida pela autora
Metodologia 35
tubo, previamente esterilizado, contendo 0,5 mL de soro humano e incubada a 37º C em banho
maria por três horas. Após este período, uma gota desta suspensão foi examinada ao microscópio
entre lâmina e lamínula. A evidenciação de tubo germinativo configura teste positivo e,
presuntivamente, diagnóstico de C. albicans (Figura 8) (Koneman et al., 2001b).
4.3.3. Microcultivo
O microcultivo ou técnica de Ridell (Lacaz et al., 1991) foi realizado com o objetivo
de visualizar as estruturas morfológicas típicas de cada espécie do gênero. Ágar fubá, acrescido
de Tween 80, com pH ajustado entre 5,8 e 6,2, foi distribuído, com auxílio de pipeta estéril, em
camada fina sobre lâminas previamente preparadas em câmara de microcultivo. Após
solidificação do meio, cada amostra foi semeada em três linhas finas, horizontais e paralelas na
superfície do ágar e coberta com lamínula. Após a adição de água destilada estéril ao algodão
presente na placa, para obtenção de câmara úmida, o sistema fechado foi incubado a 25º C, por
até três dias. A leitura foi executada anotando-se a presença de pseudomicélio, arranjo dos
blastosporos (ocorrendo em grupos ou cachos, no início da hifa e/ou ao longo desta, isolados ou
aos pares nos pontos de constrição ou irregularmente distribuídos no pseudomicélio). A presença
de clamidósporos foi anotada como diagnóstico presuntivo de C. albicans (Figura 9). As outras
espécies do gênero foram avaliadas conforme características morfológicas específicas (Tabela 1)
(Figura 10 a 13).
O meio de cultura ágar fubá foi obtido comercialmente – agar Corn Meal (DIFCO) e
seu preparo obedeceu às orientações do fabricante.
Figura 8
– Presença de tubo germinativo –
Candida albicans
Fonte: Imagem obtida pela autora, Lab. Mic. – HGU
Metodologia 36
Figura 9
– Aspecto micromorfológico de
Candida albicans.
Fonte: Imagem obtida pela autora, Lab. Mic. – HGU
Figura 10
– Aspecto micromorfológico de
Candida parapsilosis
Fonte: Imagem obtida pela autora, Lab. Mic. – HGU
Figura 11
– Aspecto micromorfológico de
Candida tropicalis
Fonte: Imagem obtida pela autora, Lab. Mic. – HGU
Metodologia 37
Figura 12
– Aspecto micromorfológico de Candida
glabrata
Fonte: Imagem obtida pela autora, Lab. Mic. – HGU
Figura 13
– Aspecto micromorfológico de Candida
krusei
Fonte: Imagem obtida pela autora, Lab. Mic. – HGU
Metodologia 38
Tabela 1 – Morfologia das espécies de leveduras do gênero Candida.
Levedura
Forma de
conídios
Pseudo-
hifas
Micromorfologia
Tubo
germinativo
Colônias
Taxa de
crescimento
Outras características
úteis
C. krusei
Esferas, elipses e
blastoconídios
alongados, ovais,
vários tamanhos
Sim
Células longas, finas, retas,
com ramificações arboriforme
e cadeias de blastoconídios das
junções intercelulares; como
palitos de fósforos cruzados.
Ausente
Semelhante
à C. albicans,
porém mais
fosca
2 - 3 dias
Colônias muito
velhas tornam-se
amarelo-esverdeadas
foscas, com franja
periférica.
C. parapsilosis
Blastoconídios
esféricos e
elípticos
Sim
Células fina, curtas, curvas
pronunciadas; ocasionalmente
células gigantes,
blastoconídios isolados, em
cachos e cadeias curtas nas
pseudo-hifas.
Ausente
Compacta,
úmida, branca,
brilhante ou
creme , pode ser
rendada
2 – 3 dias
Colônias velhas
tornam-se sulcadas
com bordas marrons
C. tropicalis
Blastoconídios
ovóides ou
alongados
Sim
Pseudo-hifas longas,
ramificadas, com
blastoconídios em qualquer
lugar na pseudo-hifa.
Clamidoconídios ocasionais.
Ausente Branca a creme 2 – 3 dias
A franja periférica
pode estar submersa
no ágar.
C. glabrata
Blastoconídios
pequenos
Não
Não apresenta pseudo-hifas
apenas pequenos
blastoconídios agrupados.
Ausente
Cremosa,
creme, lisa e
brilhante
3 – 4 dias
Colônias antigas
formam película.
Metodologia 39
4.3.4. Provas bioquímicas
4.3.4.1. Zimograma
No teste de fermentação de carboidratos foi utilizado o meio basal (conforme
fórmula abaixo), acrescido de azul de bromotimol e distribuídos em alíquotas de 2 mL em tubos
de Kahn contendo tubos de Durham invertidos, para visualização de gás. As amostras foram
testadas quanto à habilidade de fermentar glicose, galactose, maltose, sacarose, lactose, trealose,
xilose, melibiose e rafinose. Para tanto, foi adicionado 1 mL da solução de cada carboidrato
(preparadas à concentração de 6%) a cada tubo de meio de cultura autoclavados.
Meio Basal (Van Der Walt & Yarrow, 1984)
- Peptona ........................................................................ 7,5 g
- Extrato de levedura ..................................................... 4,5 g
- Azul de bromotimol .................................................... 0,4 g
- Água destilada ............................................................ 1000,00 mL
O pH foi acertado para 6,5. Logo após, o azul de bromotimol foi dissolvido em etanol e
adicionado, aos poucos, a este meio até obtenção de coloração verde intensa.
Para a preparação do inóculo, uma pequena porção da levedura foi ressuspensa em 5
mL de salina estéril. A concentração celular foi avaliada através do cartão de Wickerham – trata-
se de uma técnica que permite uma estimativa da densidade de células de uma suspensão, tendo
sido estabelecidos quatro níveis de concentração celular com avaliação feita comparativamente,
observando-se o crescimento baseado no seguinte critério: 0 (poucas células – linhas totalmente
visíveis), 1 (densidade fraca – linhas visíveis, um pouco embaçadas), 2 (densidade média –
linhas embaçadas e difusas), 3 (densidade forte – linhas não visíveis).
Foram transferidos 0,1 mL da suspensão obdecendo ao critério 2 para cada um dos nove
tubos de meio basal, contendo os diferentes açúcares. A bateria de testes foi incubada a 25º C e
as leituras foram realizadas periodicamente observando-se a produção de ácido através da
mudança de coloração do meio basal para amarelo e a formação de gás capturado no interior do
tubo de Durham. As observações foram feitas por um período máximo de sete dias (Lacaz et al.,
1991). Os resultados foram considerados positivos em função da produção de gás (Figura 14).
Metodologia 40
4.3.4.2. Auxanograma
Este teste foi realizado visando observar o padrão de assimilação de nove
carboidratos (glicose, galactose, maltose, sacarose, lactose, trealose, xilose, melibiose e rafinose)
como única fonte de carbono. Para isto, foram preparados: meio C e uma solução de vitaminas,
conforme descrito a seguir.
Meio C (Lacaz et al., 1991)
- Sulfato de amônio .................................................................... 5,0 g
- Fosfato de Potássio Monobásico (KH
2
PO
4
) ........................... 1,0 g
- Sulfato de Magnésio Hepta Hidratado (MgSO
4
.7H
2
O) .......... 0,5 g
- Ágar .......................................................................................... 20 g
- Água destilada .......................................................................... 1000,00 mL
Solução de Vitaminas
- Biotina ................................................................................ 0,10 mg
- Niacina ................................................................................ 6,00 mg
Figura 14
– Teste de fermentação de carboidratos,
evidenciando fermentação e formação de gás em glicose,
maltose, galactose e trealose.
Fonte: Imagem obtida pela autora, Lab. Mic. – HGU
Metodologia 41
- Piridoxina ........................................................................... 10,00 mg
- Riboflavina .......................................................................... 1,00 mg
- Tiamina ............................................................................... 6,00 mg
- Pantotenato de cálcio .......................................................... 6,00 mg
- Inositol ................................................................................ 1,00 mg
- Ácido fólico ....................................................................... 10,00 mg
- Cloreto de colina ................................................................ 10,00 mg
- Água destilada .................................................................... 100,00 mL
Placas de Petri esterilizadas, de 140 mm de diâmetro, foram marcadas no fundo, em
nove pontos eqüidistantes, com as siglas correspondentes aos carboidratos utilizados. Em cada
placa foram dispensados 0,1 mL de solução de vitaminas, 4 mL da suspensão de leveduras
preparada em salina esterilizada, correspondendo ao critério 2 do cartão de Wickerham e
aproximadamente 45 mL de meio C fundido e resfriado (aproximadamente 45º C) (Van Der
Walt & Yarrow, 1984).
Este inóculo correspondeu a uma concentração celular de 1 – 6 x 10
6
UFC/mL, de
acordo com experimentos preliminares. A mistura obtida na placa foi cuidadosamente
homogeneizada, evitando-se a formação de bolhas e deixada solidificar à temperatura ambiente.
Após solidificação, os carboidratos foram distribuídos em quantidades mínimas nos pontos
previamente marcados (Campbell & Stewart, 1980), com auxílio de palitos esterilizados. A
incubação foi feita à temperatura de 25ºC, por até 72 horas e a leitura foi realizada diariamente.
O resultado foi considerado positivo, quando da evidenciação do halo de crescimento em torno
de cada carboidrato (Figura 15).
Figura 15
– Teste de assimilação de
carboidratos.
Fonte: Imagem obtida pela autora, Lab. Mic. – HGU
Metodologia 42
4.4. Testes de sensibilidade aos antifúngicos: cetoconazol, fluconazol,
itraconazol e anfotericina B.
4.4.1. Cepas de referência
As amostras de referência utilizadas neste estudo corresponderam à (C. parapsilosis
– ATCC 22019 e C. krusei – ATCC 6258) e foram gentilmente cedidas pela Dra.
Márcia S. C.
Melhem - Instituto Adolfo Lutz - SP.
4.4.2. Microdiluição em caldo - CLSI (2005)
As drogas antifúngicas utilizadas em forma de pó foram: cetoconazol (Sigma, St.
Louis, USA), itraconazol (Janssen – Cilag do Brasil), fluconazol (Pfizer do Brasil) e anfotericina
B (Sigma, St. Louis, USA). As drogas cetoconazol, itraconazol e fluconazol foram gentilmente
cedidas pelos laboratórios fabricantes.
A solução-mãe de cada antifúngico foi preparada conforme recomendação do M27
A2 (CLSI, 2005), utilizando a seguinte equação:
Peso (mg) = Volume (mL) x Concentração (µg/mL)
Potência da substância (µg/mg)
A solução-mãe de fluconazol (FCZ) na concentração de 5120 µg/mL, com potência
de 100%, foi preparada em água destilada e as soluções-mãe de cetoconazol (CTZ), com
potência de 100%, itraconazol (ITZ) com potência de 100% e anfotericina B (AMB), com
potência de 80%, ambos com concentração de 1600 µg/mL, foram preparadas em
dimetilsulfóxido (DMSO). As soluções-mãe dos quatro antifúngicos foram divididas em
pequenas quantidades e colocadas em tubos estéreis para armazenamento em freezer à
temperatura de – 70º C.
No teste de susceptibilidade, cada antifúngico foi avaliado em 10 concentrações
diferentes, preparadas conforme documento M 27 A2 (CLSI, 2005) (Anexos 3 e 4). Para
cetoconazol, itraconazol e anfotericina B, as concentrações foram iguais a 8 µg/mL à 0,015
µg/mL e para fluconazol compreendidos entre 64 µg/mL à 0,12 µg/mL (CLSI, 2005).
Metodologia 43
As provas foram realizadas em placas de microtitulação com tampa (Evergreen
Scientific, USA), contendo 96 orifícios e fundo plano. Cada antifúngico foi distribuído em uma
placa de microtitulação em alíquotas de 100 µL, desde a coluna 2 até a coluna 11,
correspondendo cada coluna, à uma concentração diferente. A coluna 2 correspondeu à maior
concentração do antifúngico e a coluna 11 à menor concentração. Todos os orifícios das linhas
de A a H foram preenchidos com antifúngicos, exceto os orifícios da coluna 1 e 12, reservados
para controle de esterilidade e controle de crescimento respectivamente.
As placas com diferentes concentrações de antifúngicos foram cobertas com película
plástica (Parafilm) e congeladas à temperatura de - 70º C. Para realização dos testes, as placas
foram descongeladas a temperatura ambiente, 30 à 40 min antes da utilização.
O meio de cultura utilizado no teste de antifungigrama foi o RPMI-1640 (Sigma
Chemical, St. Louis, USA) com 0,165 mol/L de MOPS e pH 7,0.
Meio RPMI – 1640 (com glutamina e vermelho fenol, sem bicarbonato) (CLSI, 2005).
L-arginina ..................... 0,200 g/L Glicina .............................. 0,010 g/L
Biotina .......................... 0,0002 g/L PABA ............................... 0,001 g/L
L-aspargina .................. 0,050 g/L L-histidina ........................ 0,015 g/L
D-pantotênico .............. 0,0002 g/L Piridoxina ......................... 0,001 g/L
L-ácido aspártico .......... 0,020 g/L L-hidroxiprolina ............... 0,020 g/L
Cloreto de colina .......... 0,003 g/L Riboflavina ....................... 0,0002 g/L
L-ácido glutâmico ........ 0,020 g/L L-isoleucina ...................... 0,050 g/L
Ácido fólico ................. 0,001 g/L Tiamina .............................
0,001 g/L
L-cistina ...................... 0,0652 g/L L-leucina ...........................
0,050 g/L
Mioinositol ................... 0,035 g/L Vitamina B12 ................... 0,000005 g/L
L-glutamina .................. 0,300 g/L L-lisina ..............................
0,040 g/L
Niacinamida ................. 0,001 g/L Nitrato de cálcio ............... 0,100 g/L
L-metionina .................. 0,015 g/L L-treonina ......................... 0,020 g/L
Cloreto de potássio ....... 0,400 g/L D-glicose .......................... 2,000 g/L
L-fenilalanina ............... 0,015 g/L L-triptofano ...................... 0,005 g/L
Fosfato de sódio ........... 0,800 g/L Glutation ………………... 0,001 g/L
Sulfato de magnésio ..... 0,0488 g/L L-tirosina .......................... 0,029 g/L
L-prolina ...................... 0,020 g/L Vermelho de fenol ............ 0,005 g/L
Cloreto de sódio ........... 6,000 g/L L-valina ............................ 0,020 g/L
L-serina ....................... 0,030 g/L
Metodologia 44
Este meio é sintético e recomendado através de resultados obtidos por estudos
comparativos dentre vários meios sintéticos (Fromtling et al., 1993).
O controle de esterilidade do meio RPMI-1640 foi feito na primeira coluna em todas
as placas. Os orifícios da coluna 1 receberam apenas 200 µL de RPMI-1640 que serviram para
comprovar a ausência de contaminação do meio. O controle de crescimento da reação foi feito
em todas as placas na coluna 12 com 100 µL de RPMI-1640 e 100 µL do inóculo da levedura,
considerando adequado quando a absorbância foi maior que 0,4 (Galgiani & Stevens, 1976).
Para preparação do inóculo as amostras de leveduras do gênero Candida foram
cultivadas em tubos contendo meio Sabouraud sólido sem cloranfenicol e incubadas a 35º C
durante 24 horas. A massa de células obtida foi recolhida assepticamente com alça esterilizada e
ressuspensa em tubos contendo 5 mL de solução salina 0,85% estéril, com turbidez após a
homogeneização em vórtex, equivalente a escala 0,5 de McFarland, com concentração
equivalente a 1 x 10
6
a 5 x 10
6
células por mL (CLSI, 2005). A leitura da turbidez foi feita em
espectofotometria a 530 nm. Após preparo do inóculo foi feita uma diluição 1:50 e depois 1:20
com meio de cultura RPMI-1640, para obter um inóculo com concentração de 1 x 10
3
a 5 x 10
3
UFC/mL.
O inóculo, referente a cada amostra de levedura, foi distribuído nas placas contendo
antifúngico (CTZ, FCZ, ITZ, AMB), em alíquotas de 100 µL e incubados à temperatura de 35º C
por um período de 48 horas. As placas de AMB foram protegidas da luz durante todo o processo.
Em todos os testes foram utilizadas as cepas padrão de referência Candida parapsilosis ATCC
22019 e Candida krusei ATCC 6258 para controle de qualidade da reação.
A leitura das placas foi realizada através de leitura visual após 48 horas de incubação
a 35º C, observando presença ou ausência de crescimento visível, depois de agitar as placas no
agitador de Kline. Os poços de microdiluição receberam uma pontuação (escore). O crescimento
em cada poço foi comparado com o poço controle de crescimento com auxílio de um espelho de
leitura; assim cada poço recebeu um valor numérico, usando a seguinte escala: 0 – opticamente
claro; 1 – crescimento indefinido; 2 – redução proeminente de crescimento; 3 – ligeira redução
do crescimento; e 4 – nenhuma redução do crescimento. O valor de CIM da anfotericina B foi
definido como a menor concentração que se observa o escore 0, sendo a CIM para os azólicos a
menor concentração em que foi observado o escore 2, o que corresponde à aproximadamente
50% da inibição do crescimento (CLSI, 2005). Toda leitura visual foi confirmada pela leitura da
absorbância de luz, em leitor de ELISA com comprimento de onda de 492 nm, através do
espectofotômetro Multiskan Titertek (Flow Laboratories, Sweden) 48 horas após preparação das
placas (Figura 16).
Metodologia 45
As cepas padrão de referência apresentaram valores de CIM dentro dos intervalos
abaixo para validar os resultados, Candida parapsilosis ATCC 22019, CTZ = 0,06 – 0,25
µg/mL, FCZ = 0,5 – 4 µg/mL, ITZ = 0,12 – 0,50 µg/mL, AMB = 0,5 – 2 e Candida krusei
ATCC 6258, CTZ = 0,25 – 1 µg/mL, FCZ = 16 - ≥64 µg/mL, ITZ = 0,25 – 1 µg/mL, AMB = 0,5
– 2 µg/mL.
Após a leitura das placas e análise de dados, os resultados foram considerados
válidos quando: as cepas padrão apresentaram valor de CIM dentro do intervalo acima citado, o
controle de esterilidade não apresentou crescimento e o controle positivo apresentou crescimento
considerado satisfatório.
A interpretação dos resultados das drogas testadas foi realizada conforme documento
M27 A2 (CLSI, 2005).
4.4.3. Etest
O Etest foi utilizado de acordo com instruções do fabricante (AB Biodisk, Solna,
Sweden). Meio RPMI-1640 com L-glutamina, sem bicarbonato de sódio com glicose 2%
protegido com tampão MOPS, pH 7,0 e 1,5 % de Bacto ágar (DIFCO Laboratories, USA) foi
preparado em placas para o uso do Etest. Cada colônia de levedura do gênero Candida a ser
testada, foi repicada em ágar Sabouraud dextrose sem cloranfenicol e incubada por 24 h à 35° C.
Foram realizadas suspensões individuais das colônias a serem testadas em 5 mL de salina (0,85
%) estéril correspondendo a 0,5 da escala de McFarland. Cada suspensão foi inoculada em
Figura 16
– Placa de microtitulação com
diferentes concentrações de itraconazol
(CLSI) e amostras de leveduras do gênero
Candida.
Fonte: Imagem obtida pela autora
Seção Micologia - IAL
Metodologia 46
placas de Petri de 150 mm contendo ágar RPMI-1640, usando swab estéril, estriando de forma
homogênea toda a superfície do ágar. Aguardou-se 15 min para absorver (secar) o excesso da
mistura, após as fitas Etest impregnadas com os antifúngicos: cetoconazol, itraconazol e
anfotericina B em concentração de 32 a 0,002 µg/mL e o antifúngico fluconazol na concentração
de 256 a 0,016 µg/mL, foram aplicadas sobre a superfície do ágar com o auxílio de pinça estéril.
A CIM dos compostos foi determinada como a concentração mais baixa da droga que a elipse
conseguiu inibir e interceptar a tira de antifúngico, após incubação à 35º C e leitura realizada
após 24 hs (Figura 17).
4.5. Procedimentos de análise dos resultados
Os dados foram tabulados e analisados com auxílio da planilha eletrônica Microsoft-
Excel, versão 2000 e Epi-Info, versão 6.04d. A distribuição das espécies do gênero Candida foi
descrita nos grupos de gestantes e não gestantes e segundo presença ou ausência de
sintomatologia. Diferenças nessas proporções foram analisadas pelo teste do qui-quadrado com
correção de Yates. A concordância entre os resultados dos valores de CIM observados nas duas
metodologias (CLSI e Etest) foi analisada pelo coeficiente de correlação de Pearson e os
resultados do perfil de susceptibilidade estabelecidos pelo ponto de corte da CIM foram
avaliados pela estatística Kappa que exclui os resultados concordantes por acaso. Para todas as
análises considerou-se o nível de significância de 95%.
Figura 17
– Placa ilustrando fitas de Etest
(cetoconazol, fluconazol, itraconazol e
anfotericina B).
Fonte: Imagem obtida pela autora
Seção Micologia - IAL
5. RESULTADOS
Resultados 48
5.1. Isolamento das amostras
Os espécimens clínicos (secreções vaginais) foram colhidos de pacientes atendidas
no ambulatório de ginecologia/obstetrícia do Hospital Geral Universitário de Cuiabá – MT, no
período compreendido entre novembro 2005 a novembro de 2006. O número total correspondeu
a 404 pacientes, sendo 203 referentes a pacientes não gestantes e 201 a pacientes gestantes.
A partir das 404 amostras se secreções vaginais, foram obtidos 160 isolados de
leveduras do gênero Candida, resultando uma prevalência (IC 95%) total de candidíase
vulvovaginal de 39,6 % (35% – 44%). Considerando pacientes não gestantes, foram obtidos 70
isolados de leveduras do gênero Candida, com prevalência (IC 95%) de 34,5% (28% – 41%).
Nas pacientes gestantes foram obtidos 90 isolados de leveduras do gênero Candida, com
prevalência (IC 95%) de 44,8% (38% – 52%) (Tabela 2).
A idade média das pacientes não gestantes foi de 30,7 anos, variando de 16 a 54 anos
e das pacientes gestantes correspondeu a 25,3 anos, variando entre 16 a 41 anos.
Tabela 2 – Prevalência de leveduras do gênero Candida em pacientes não gestantes e
pacientes gestantes do Hospital Geral Universitário de Cuiabá-MT, 2005-2006.
Pacientes
Isolamento leveduras gênero Candida
(n)
Prevalência (IC 95%)
Não gestantes
70 34,5 % (28% – 41%)
Gestantes
90 44,8 % (38% – 52%)
Total
160 39,6 % (35% – 44%)
5.2. Sintomatologia associada às pacientes e leveduras isoladas
Em relação à sintomatologia presente em pacientes, durante a coleta do material
clínico, foi observado que: entre as pacientes não gestantes, 13 (18,6%) apresentaram-se
assintomáticas (7 com C. albicans e 6 não albicans) e 57 (81,4%) apresentaram-se sintomáticas
(44 com C. albicans e 13 não albicans). Esta diferença, no entanto, não foi estatisticamente
significante (p= 0,16) (Figura 18).
Entre as pacientes gestantes, 14 (15,5%) apresentaram-se assintomáticas (12 com C.
albicans e 2 não albicans) e 76 (84,4%) apresentaram-se sintomáticas (71 com C. albicans e 5
Resultados 49
não albicans). Esta diferença, contudo, não foi estatisticamente significante (p= 0,30) (Figura
19).
86,3
68,4
13,7
31,6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C. albicans
C. não
albicans
%
Si
ntomáticas
Assintomáticas
p= 0,16
85,5
71,4
14,5
28,6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
C. albicans
C. não
albicans
%
Sintomáticas
Assintomáticas
p= 0,30
Figura 18
– Distribuição das pacientes não
gestantes examinadas, segundo presença de
sintomas e leveduras isoladas (C. albicans e não
albicans), Hospital Geral Universitário de
Cuiabá-MT, 2005-2006.
Figura 19
– Distribuição das pacientes
gestantes examinadas, segundo presença de
sintomas e leveduras isoladas (C. albicans e
não albicans), Hospital Geral Universitário
de Cuiabá-MT, 2005-2006.
Resultados 50
5.3. Identificação das espécies
As 160 amostras de leveduras do gênero Candida isoladas, a partir de secreções
vaginais, foram confirmadas como pertencentes ao gênero Candida, através de esfregaço obtido
de colônias coradas pela técnica de Gram. Em seqüência, as colônias foram testadas quanto a
pureza, através do plaqueamento em meio CHROMagar. E este procedimento não serviu apenas
para avaliar a pureza das colônias, mas, contribuir de forma presuntiva na identificação das
mesmas, através da coloração observada: C. albicans – colônias verdes, C. tropicalis – colônias
azuis e Candida spp – colônias rosas. A confirmação da identificação das espécies de leveduras
do gênero Candida isoladas, foi realizada através das provas do tubo germinativo, microcultivo,
características bioquímicas: auxanograma e zimograma. As características bioquímicas
(assimilação e fermentação) das espécies de leveduras do gênero Candida estão representadas na
tabela 3.
As amostras de pacientes não gestantes identificadas obedecem a seguinte
distribuição: 51 (72,9%) foram identificadas como C. albicans, 10 (14,3%) como C.
parapsilosis, 4 (5,7%) como C. tropicalis, 3 (4,3%) como C. glabrata e 2 (2,8%) como C. krusei
(Figura 20). Já nas pacientes gestantes: 83 (92,3%) foram identificadas como C. albicans, 3
(3,3%) como C. krusei, 2 (2,2%) como C. glabrata, 1 (1,1%) como C. parapsilosis e 1 (1,1%)
como C. tropicalis (Figura 21).
51
10
4
3
2
0
10
20
30
40
50
60
70
C. albicans C. parapsilosis C. tropicalis C. glabrata C. krusei
n pacientes não gestantes
Figura 20
– Identificação das espécies de leveduras do gênero Candida
em pacientes não gestantes, Hospital Geral Universitário de Cuiabá-
MT, 2005-2006.
Resultados 51
83
3
2
1 1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
C. albicans C. krusei C. glabrata C. parapsilosis C. tropicalis
n pacientes gestantes
Figura 21
– Identificação das espécies de leveduras do gênero Candida
em pacientes gestantes, Hospital Geral Universitário de Cuiabá-MT,
2005
-
2006.
Resultados 52
Tabela 3 – Perfil bioquímico (assimilação e fermentação) das espécies de leveduras do gênero Candida segundo Kwon-Chung & Bennett, 1992;
Kurtzman & Fell, 1998.
Espécies
Assimilação Fermentação
GLI MAL SAC GAL LAC RAF TRE XIL MEL
GLI MAL SAC GAL LAC RAF TRE XIL MEL
C. albicans
+ + + + - - + + - + + - + (v) - - +/- -
C. parapsilosis
+ + + + - - + + - + - (v)
- (v)
+/-
(v)
- - - - -
C. tropicalis
+ + + (v) + - - + + - + + + (v) + (v) - - +/- +/- -
C. krusei
+ - - - - - - - - + - - - - - - - -
C. glabrata
+ - - - - - + - - + - - - - - + - -
GLI: Glicose, MAL: Maltose, SAC: Sacarose, GAL: Galactose, LAC: Lactose, RAF: Rafnose, TRE: Trealose, XIL: Xilose, MEL: Melibiose
V = Variável
Resultados 53
5.4. Determinação da concentração inibitória mínima de quatro drogas
antifúngicas para os isolados de leveduras do gênero Candida de
pacientes não gestantes e gestantes.
Foram determinadas as concentrações inibitórias mínimas do cetoconazol,
fluconazol, itraconazol e anfotericina B para os 70 isolados de leveduras do gênero Candida de
pacientes não gestantes e 90 isolados de leveduras do gênero Candida de pacientes gestantes,
pela metodologia de microdiluição proposta pelo CLSI e por metodologia comercial usando fitas
de Etest, com leitura realizada após 48 horas e 24 horas respectivamente. Os resultados das CIM
das quatro drogas, para cada amostra das pacientes não gestantes e gestantes considerando as
duas metodologias (Anexos 5 a 14), estão representados nas figuras 22 a 26.
A variação entre os valores mínimos e máximos das CIM das amostras de pacientes
não gestantes está representada na tabela 4, e ainda os valores da CIM
50
e CIM
90
. Estes valores
representam a concentração inibitória mínima suficiente para inibir 50% dos isolados e 90% dos
isolados respectivamente.
A CIM
90
dos isolados de C. tropicalis e C. glabrata e as CIM
50
e CIM
90
dos isolados
de C. krusei não foram determinadas devido ao restrito número de amostras.
A variação entre os valores mínimos e máximos das CIM das amostras de pacientes
gestantes está representada na tabela 5, assim como os valores da CIM
50
e CIM
90
. A CIM
90
dos
isolados de C. krusei e as CIM
50
e CIM
90
dos isolados de C.glabrata, C. parapsilosis e C.
tropicalis, como anteriormente mencionado, não foram determinados devido ao número
diminuto de amostras.
5.4.1. Microdiluição em caldo CLSI (2005)
Os valores de CIM dos antifúngicos expressos em µg/mL, para as amostras de
pacientes não gestantes após 48 horas foram: C. albicans oscilaram entre 0,015 – 0,25 para o
cetoconazol, 0,12 – 1,0 para o fluconazol, 0,015 – 0,12 para o itraconazol e 0,015 – 0,5 para a
anfotericina B. Com relação aos valores de CIM
50
e CIM
90
, respectivamente, pôde–se observar
valores de 0,015 e 0,015 µg/mL para o cetoconazol, 0,25 e 0,50 µg/mL para o fluconazol, 0,03 e
0,06 µg/mL para o itraconazol e 0,06 e 0,12 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 4).
Para os isolados de C. parapsilosis de pacientes não gestantes os valores oscilaram
entre 0,015 – 0,03 µg/mL para o cetoconazol, 0,12 – 2,0 µg/mL para o fluconazol, 0,015 – 0,06
Resultados 54
µg/mL para o itraconazol e 0,015 – 0,12µg/mL para a anfotericina B. Com relação aos valores de
CIM
50
e CIM
90
, respectivamente, pôde–se observar valores de 0,015 e 0,03 µg/mL para o
cetoconazol, 0,25 e 1,0 µg/mL para o fluconazol, 0,015 e 0,03 µg/mL para o itraconazol e 0,03 e
0,12 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 4).
Para os isolados de C. tropicalis de pacientes não gestantes os valores oscilaram
entre 0,015 – 0,25 µg/mL para o cetoconazol, 0,12 – 0,5 µg/mL para o fluconazol, 0,015 – 0,06
µg/mL para o itraconazol e 0,12 – 0,12 µg/mL para a anfotericina B. Com relação aos valores de
CIM
50
, pôde–se observar 0,015 µg/mL para o cetoconazol, 0,12 µg/mL para o fluconazol, 0,015
µg/mL para o itraconazol e 0,12 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 4).
Para os isolados de C. glabrata de pacientes não gestantes os valores oscilaram entre
0,015 – 0,25 µg/mL para o cetoconazol, 0,12 – 4,0 µg/mL para o fluconazol, 0,015 – 0,25 µg/mL
para o itraconazol e 0,015 – 0,25 µg/mL para a anfotericina B. Com relação aos valores de
CIM
50
, pôde–se observar 0,06 µg/mL para o cetoconazol, 0,12 µg/mL para o fluconazol, 0,06
µg/mL para o itraconazol e 0,03 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 4).
Para os isolados de C. krusei de pacientes não gestantes os valores oscilaram entre
0,06 – 1,0 µg/mL para o cetoconazol, 2,0 – 64 µg/mL para o fluconazol, 0,25 – 0,25 µg/mL para
o itraconazol e 0,015 – 0,5 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 4).
Não foi possível estabelecer os valores de CIM
90
para as
espécies: C. tropicalis e C.
glabrata e os valores de CIM
50
e CIM
90
para a espécie C. krusei, isoladas das pacientes não
gestantes devido ao restrito número de isolados.
Entretanto, para as pacientes gestantes os valores de CIM referentes à C. albicans
após 48 horas oscilaram entre 0,015 – 0,25 µg/mL para o cetoconazol, 0,12- 1,0 µg/mL para o
fluconazol, 0,015 – 0,12 µg/mL para o itraconazol e 0,015 – 0,25 µg/mL para a anfotericina B.
Com relação aos valores de CIM
50
e CIM
90
, respectivamente, pôde –se observar valores de 0,015
e 0,03 µg/mL para o cetoconazol, 0,25 e 0,25 µg/mL para o fluconazol, 0,03 e 0,06 µg/mL para o
itraconazol e 0,06 e 0,12 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 5).
Para os isolados de C. krusei de pacientes gestantes os valores oscilaram entre 0,12 –
0,25 µg/mL para o cetoconazol, 0,12 – 1,0 µg/mL para o fluconazol, 0,06 – 0,25 µg/mL para o
itraconazol e 0,015 – 0,5 µg/mL para a anfotericina B. Com relação aos valores de CIM
50
, pôde-
se observar 0,12 µg/mL para o cetoconazol, 0,25 µg/mL para o fluconazol, 0,25 µg/mL para o
itraconazol e 0,25 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 5).
Para os isolados de C. glabrata de pacientes gestantes os valores oscilaram entre
0,015 – 0,03 µg/mL para o cetoconazol, 0,12 – 2,0 µg/mL para o fluconazol, 0,03 – 0,03 µg/mL
para o itraconazol e 0,12 – 0,12 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 5).
Resultados 55
Não foi possível estabelecer os valores de CIM
90
para a
espécie: C. krusei e os
valores de CIM
50
e CIM
90
para a
espécie: C. glabrata, isoladas das pacientes gestantes devido ao
pequeno número de amostras.
Para as espécies C. parapsilosis e C tropicalis isoladas de pacientes gestantes, não
foi possível demonstrar a oscilação dos valores de CIM, bem como os valores de CIM
50
e CIM
90
devido a presença de apenas um isolado de cada espécie neste grupo.
5.4.2. Etest
Os valores de CIM dos antifúngicos referentes a C. albicans para as amostras de
pacientes não gestantes após 24 horas oscilaram entre 0,003 – 0,38 µg/mL (cetoconazol), 0,094 –
1,5 µg/mL (fluconazol), 0,002 – 0,125 µg/mL (itraconazol) e 0,008 – 0,125 µg/mL (anfotericina
B). Com relação aos valores de CIM
50
e CIM
90
, respectivamente, pôde–se observar valores de
0,006 e 0,012 µg/mL para o cetoconazol, 0,38 e 1,0 µg/mL para o fluconazol, 0,016 e 0,047
µg/mL para o itraconazol e 0,064 e 0,125 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 4).
Para os isolados de C. parapsilosis de pacientes não gestantes os valores oscilaram
entre 0,004 – 0,032 µg/mL para o cetoconazol, 0,038 – 2,0 µg/mL para o fluconazol, 0,006 –
0,16 µg/mL para o itraconazol e 0,008 – 0,19 µg/mL para a anfotericina B. Com relação aos
valores de CIM
50
e CIM
90
, respectivamente, pôde–se observar valores de 0,012 e 0,023 µg/mL
para o cetoconazol, 0,5 e 0,75 µg/mL para o fluconazol, 0,012 e 0,064 µg/mL para o itraconazol
e 0,047 e 0,19 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 4).
Para os isolados de C. tropicalis de pacientes não gestantes os valores oscilaram
entre 0,003 – 0,016 µg/mL para o cetoconazol, 0,125 – 0,75 µg/mL para o fluconazol, 0,023 –
0,047 µg/mL para o itraconazol e 0,023 – 0,19 µg/mL para a anfotericina B. Com relação aos
valores de CIM
50
, pôde–se observar 0,006 µg/mL para o cetoconazol, 0,125 µg/mL para o
fluconazol, 0,023 µg/mL para o itraconazol e 0,047 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 4).
Para os isolados de C. glabrata de pacientes não gestantes os valores oscilaram entre
0,004 – 0,25 µg/mL para o cetoconazol, 0,25 – 16 µg/mL para o fluconazol, 0,023 – 0,5 µg/mL
para o itraconazol e 0,064 – 0,38 µg/mL para a anfotericina B. Com relação aos valores de
CIM
50
, pôde–se observar 0,012 µg/mL para o cetoconazol, 0,25 µg/mL para o fluconazol, 0,064
µg/mL para o itraconazol e 0,094 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 4).
Resultados 56
Para os isolados de C. krusei de pacientes não gestantes os valores oscilaram entre
0,023 – 0,5 µg/mL para o cetoconazol, 1,5 - 32 µg/mL para o fluconazol, 0,25 – 0,25 µg/mL para
o itraconazol e 0,016 – 0,047 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 4).
Não foi possível estabelecer os valores de CIM
90
para as
espécies: C. tropicalis e C.
glabrata e os valores de CIM
50
e CIM
90
para a espécie C. krusei, isoladas das pacientes não
gestantes devido ao restrito número de isolados.
Já para as pacientes gestantes os valores de CIM referentes à C. albicans após 24
horas oscilaram entre 0,002 – 0,16 µg/mL para o cetoconazol, 0,094 – 2,0 µg/mL para o
fluconazol, 0,003 – 0,125 µg/mL para o itraconazol e 0,006 – 0,19 µg/mL para a anfotericina B.
Com relação aos valores de CIM
50
e CIM
90
, respectivamente, foram observados valores iguais a
0,006 e 0,012 µg/mL para o cetoconazol, 0,38 e 1,0 µg/mL para o fluconazol, 0,016 e 0,047
µg/mL para o itraconazol e 0,047 e 0,125 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 5).
Para os isolados de C. krusei de pacientes gestantes os valores oscilaram entre 0,023
– 0,38 µg/mL para o cetoconazol, 1,5 – 8,0 µg/mL para o fluconazol, 0,008 – 0,1 µg/mL para o
itraconazol e 0,064 – 0,38 µg/mL para a anfotericina B. Com relação aos valores de CIM
50
,
foram observados valores iguais a 0,19 µg/mL para o cetoconazol, 8,0 µg/mL para o fluconazol,
0,094 µg/mL para o itraconazol e 0,125 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 5).
Para os isolados de C. glabrata das pacientes gestantes os valores oscilaram entre
0,064 – 0,125 µg/mL para o cetoconazol, 2,0 – 4,0 µg/mL para o fluconazol, 0,047 – 0,125
µg/mL para o itraconazol e 0,016 – 0,094 µg/mL para a anfotericina B (Tabela 5).
Não foi possível estabelecer os valores de CIM
90
para a
espécie: C. krusei e os
valores de CIM
50
e CIM
90
para a
espécie: C. glabrata, de pacientes gestantes devido ao pequeno
número de isolados.
Para as espécies C. parapsilosis e C tropicalis provenientes de pacientes gestantes,
não foi possível demonstrar a oscilação dos valores de CIM, bem como os valores de CIM
50
e
CIM
90
devido à presença de apenas um isolado de cada espécie neste grupo.
Resultados 57
Ctz-CLSI Ctz-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
CIM (mg/mL)
Ctz-CLSI Ctz-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
CIM (mg/mL)
Fcz-CLSI Fcz-Etest
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
CIM (mg/mL)
Fcz-CLSI Fcz-Etest
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
CIM (mg/mL)
Itz-CLSI Itz-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
CIM (mg/mL)
Itz-CLSI Itz-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
CIM (mg/mL)
Amb-CLSI Amb-Etest
0.00
0.25
0.50
CIM (mg/mL)
Amb-CLSI Amb-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
CIM (mg/mL)
Candida albicans
Figura 22
–
Distribuição das concentrações inibitórias mínimas de quatro drogas antifúngicas
(cetoconazol-Ctz, fluconazol-Fcz, itraconazol-Itz e anfotericina B-Amb) determinadas pelos
métodos de susceptibilidade in vitro - CLSI e Etest de isolados de Candida albicans obtidos
de pacientes não gestantes, n= 51 (A, B, C, D) e gestantes, n= 83 (E, F, G, H).
A
E
B
F
C
G
D
H
Resultados 58
Ctz-CLSI Ctz-Etest
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
CIM (mg/mL)
Ctz-CLSI Ctz-Etest
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
CIM (mg/mL)
Fcz-CLSI Fcz-Etest
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
CIM (mg/mL)
Fcz-CLSI Fcz-Etest
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
CIM (mg/mL)
Itz-CLSI Itz-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
CIM (mg/mL)
Itz-CLSI Itz-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
CIM (mg/mL)
Amb-CLSI Amb-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
CIM (mg/mL)
Amb-CLSI Amb-Etest
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
CIM (mg/mL)
Candida parapsilosis
Figura
23
– Distribuição das concentrações inibitórias mínimas de quatro drogas antifúngicas
(cetoconazol-Ctz, fluconazol-Fcz, itraconazol-Itz e anfotericina B-Amb) determinadas pelos
métodos de susceptibilidade in vitro - CLSI e Etest de isolados de Candida parapsilosis
obtidos de pacientes não gestantes, n=10 (A, B, C, D) e gestantes, n=01 (E, F, G, H).
A
E
B
F
C
G
D
H
Resultados 59
Ctz-CLSI Ctz-Etest
0.00
0.01
0.02
0.03
CIM (mg/mL)
Ctz-CLSI Ctz-Etest
0.00
0.01
0.02
CIM (mg/mL)
Fcz-CLSI Fcz-Etest
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
CIM (mg/mL)
Fcz-CLSI Fcz-Etest
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
CIM (mg/mL)
Itz-CLSI Itz-Etest
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
CIM (mg/mL)
Itz-CLSI Itz-Etest
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
CIM (mg/mL)
Amb-CLSI Amb-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
CIM (mg/mL)
Amb-CLSI Amb-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
CIM (mg/mL)
Candida tropicalis
Figura
24
–
Distribuição das concentrações inibitórias mínimas de quatro drogas antifúngicas
(cetoconazol-Ctz, fluconazol-Fcz, itraconazol-Itz e anfotericina B-Amb) determinadas pelos
métodos de susceptibilidade in vitro - CLSI e Etest de isolados de Candida tropicalis obtidos
de pacientes não gestantes, n=04 (A, B, C, D) e gestantes, n= 01 (E, F, G, H).
A
E
B
F
C
G
D
H
Resultados 60
Ctz-CLSI Ctz-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
CIM (mg/mL)
Ctz-CLSI Ctz-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
CIM (mg/mL)
Fcz-CLSI Fcz-Etest
0
5
10
15
20
CIM (mg/mL)
Fcz-CLSI Fcz-Etest
0
1
2
3
4
5
CIM (mg/mL)
Itz-CLSI Itz-Etest
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
CIM (mg/mL)
Itz-CLSI Itz-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
CIM (mg/mL)
Amb-CLSI Amb-Etest
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
CIM (mg/mL)
Amb-CLSI Amb-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
CIM (mg/mL)
Candida glabrata
Figura
25
– Distribuição das concentrações inibitórias mínimas de quatro drogas antifúngicas
(cetoconazol-Ctz, fluconazol-Fcz, itraconazol-Itz e anfotericina B-Amb) determinadas pelos
métodos de susceptibilidade in vitro - CLSI e Etest de isolados de Candida glabrata obtidos
de pacientes não gestantes, n=03 (A, B, C, D) e gestantes, n=02 (E, F, G, H).
A
E
B
F
C
G
D
H
Resultados 61
Ctz-CLSI Ctz-Etest
0.0
0.5
1.0
1.5
CIM (mg/mL)
Ctz-CLSI Ctz-Etest
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
CIM (mg/mL)
Fcz-CLSI Fcz-Etest
0
10
20
30
40
50
60
70
CIM (mg/mL)
Fcz-CLSI Fcz-Etest
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
CIM (mg/mL)
Itz-CLSI Itz-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
CIM (mg/mL)
Itz-CLSI Itz-Etest
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
CIM (mg/mL)
Amb-CLSI Amb-Etest
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
CIM (mg/mL)
Amb-CLSI Amb-Etest
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
CIM (mg/mL)
Candida krusei
Figura
26
– Distribuição das concentrações inibitórias mínimas de quatro drogas antifúngicas
(cetoconazol-Ctz, fluconazol-Fcz, itraconazol-Itz e anfotericina B-Amb) determinadas pelos
métodos de susceptibilidade in vitro - CLSI e Etest de isolados de Candida krusei obtidos de
pacientes não gestantes, n= 02 (A, B, C, D) e gestantes, n= 03 (E, F, G, H).
A
E
B
F
C
G
D
H
Resultados 62
Tabela 4 - Variações das concentrações inibitórias mínimas (CIM), CIM
50
e CIM
90
de isolados de C.
albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata e C. krusei em pacientes não gestantes, para
quatro drogas antifúngicas, determinadas por duas metodologias.
Amostras e
Drogas
antifúngicas
CLSI Etest
Faixa Intervalar
(µg/mL)
CIM
50
(µg/mL)
CIM
90
(µg/mL)
Faixa Intervalar
(µg/mL)
CIM
50
(µg/mL)
CIM
90
(µg/mL)
C. albicans (51)
Cetoconazol 0,015 - 0,25 0,015 0,015 0,003 - 0,38 0,006 0,012
Fluconazol 0,12 - 1,0 0,25 0,50 0,094 - 1,5 0,38 1,0
Itraconazol 0,015 - 0,12 0,03 0,06 0,002 - 0,125 0,016 0,047
Anfotericina B 0,015 - 0,5 0,06 0,12 0,008 - 0,125 0,064 0,125
C. parapsilosis (10)
Cetoconazol 0,015 - 0,03 0,015 0,03 0,004 - 0,032 0,012 0,023
Fluconazol 0,12 - 2,0 0,25 1,0 0,038 - 2,0 0,5 0,75
Itraconazol 0,015 - 0,06 0,015 0,03 0,006 - 0,16 0,012 0,064
Anfotericina B 0,015 - 0,12 0,03 0,12 0,008 - 0,19 0,047 0,19
C. tropicalis (4)
Cetoconazol 0,015 - 0,015 0,015 - 0,003 - 0,016 0,006 -
Fluconazol 0,12 - 0,5 0,12 - 0,125 - 0,75 0,125 -
Itraconazol 0,015 - 0,06 0,015 - 0,023 - 0,047 0,023 -
Anfotericina B 0,12 - 0,12 0,12 - 0,023 - 0,19 0,047 -
C. glabrata (3)
Cetoconazol 0,015 - 0,25 0,06 - 0,004 - 0,25 0,012 -
Fluconazol 0,12 - 4,0 0,12 - 0,25 - 16 0,25 -
Itraconazol 0,015 - 0,25 0,06 - 0,023 - 0,5 0,064 -
Anfotericina B 0,015 - 0,25 0,03 - 0,064 - 0,38 0,094 -
C. krusei (2)
Cetoconazol 0,06 – 1,0 - - 0,023 – 0,5 - -
Fluconazol 2,0 - 64 - - 1,5 – 32 - -
Itraconazol 0,25 - 0,25 - - 0,25 – 0,25 - -
Anfotericina B 0,015 – 0,5 - - 0,016 – 0,047 - -
Resultados 63
Tabela 5 - Variações das concentrações inibitórias mínimas (CIM), CIM
50
e CIM
90
de isolados de C.
albicans, C. krusei e C. glabrata em pacientes gestantes, para quatro drogas antifúngicas, determinadas
por duas metodologias.
Amostras e
Drogas
antifúngicas
CLSI Etest
Faixa Intervalar
(µg/mL)
CIM
50
(µg/mL)
CIM
90
(µg/mL)
Faixa Intervalar
(µg/mL)
CIM
50
(µg/mL)
CIM
90
(µg/mL)
C.albicans (83)
Cetoconazol 0,015 - 0,25 0,015 0,03 0,002 - 0,16 0,006 0,012
Fluconazol 0,12 - 1,0 0,25 0,25 0,094 - 2,0 0,38 1,0
Itraconazol 0,015 - 0,12 0,03 0,06 0,003 - 0,125 0,016 0,047
Anfotericina B 0,015 - 0,25 0,06 0,12 0,006 - 0,19 0,047 0,125
C. krusei (3)
Cetoconazol 0,12 - 0,25 0,12 - 0,023 - 0,38 0,19 -
Fluconazol 0,12 - 1,0 0,25 - 1,5 - 8,0 8,0 -
Itraconazol 0,06 - 0,25 0,25 - 0,008 - 0,1 0,094 -
Anfotericina B 0,015 - 0,5 0,25 - 0,064 - 0,38 0,125 -
C.glabrata (2)
Cetoconazol 0,015 - 0,03 - - 0,064 - 0,125 - -
Fluconazol 0,12 - 2,0 - - 2,0 - 4,0 - -
Itraconazol 0,03 - 0,03 - - 0,047 - 0,125 - -
Anfotericina B 0,12 - 0,12 - - 0,016 - 0,094 - -
5.4.3. Variação do perfil de susceptibilidade obtido pela metodologia de
microdiluição segundo o documento M27A2 (CLSI,2005)
Os resultados dos perfis de susceptibilidade de pacientes não gestantes, obtidos neste
estudo, para as quatros drogas antifúngicas, estão representados na tabela 6.
Todos os isolados de C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis de pacientes não
gestantes apresentaram 100% de susceptibilidade ao cetoconazol, fluconazol, itraconazol e
anfotericina B (Tabela 6).
Quanto aos isolados de C. glabrata de pacientes não gestantes, 100% apresentaram
susceptibilidade ao cetoconazol, fluconazol e anfotericina B. Para o itraconazol dois isolados
(66,7%) apresentaram susceptibilidade e um isolado (33,3%) foi susceptível dose-dependente
(Tabela 6).
Os isolados de C. krusei de pacientes não gestantes apresentaram 100% de
susceptibilidade ao cetoconazol e anfotericina B. Para o fluconazol um isolado (50%) apresentou
Resultados 64
susceptibilidade e um isolado (50%) exibiu resistência. Para o itraconazol 100% dos isolados
apresentaram susceptibilidade dose-dependente (Tabela 6).
Os resultados dos perfis de susceptibilidade de pacientes gestantes, obtidos neste
estudo, para as quatros drogas antifúngicas, estão representados na tabela 7.
Todos os isolados de C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis e C. glabrata de
pacientes gestantes apresentaram 100% de susceptibilidade ao cetoconazol, fluconazol,
itraconazol e anfotericina B (Tabela 7).
Quanto aos isolados de C. krusei de pacientes gestantes, 100% apresentaram
susceptibilidade ao cetoconazol, fluconazol e anfotericina B. Para o itraconazol 33,3%
apresentaram susceptibilidade e 66,7% foram susceptíveis dose-dependente (Tabela 7).
5.4.4. Variação do perfil de susceptibilidade obtido pela metodologia
comercial Etest
Os resultados dos perfis de susceptibilidade de pacientes não gestantes, obtidos neste
estudo, para as quatros drogas antifúngicas, estão representados na tabela 6.
Todos os isolados de C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis de pacientes não
gestantes apresentaram 100% de susceptibilidade ao cetoconazol, fluconazol, itraconazol e
anfotericina B (Tabela 6).
Os isolados de C. glabrata de pacientes não gestantes apresentaram 100% de
susceptibilidade ao cetoconazol e anfotericina B. Para o fluconazol e itraconazol dois isolados
(66,7%) apresentaram susceptibilidade e um isolado (33,3%) apresentou susceptibilidade dose-
dependente (Tabela 6).
Os isolados de C. krusei de pacientes não gestantes apresentaram 100% de
susceptibilidade ao cetoconazol e anfotericina B. Para o fluconazol um isolado (50%) apresentou
susceptibilidade e um isolado (50%) susceptibilidade dose-dependente. Para o itraconazol 100%
dos isolados apresentaram susceptibilidade dose-dependente (Tabela 6).
Os resultados dos perfis de susceptibilidade de pacientes gestantes, obtidos neste
estudo, para as quatros drogas antifúngicas, estão representados na tabela 7.
Todos os isolados de C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. parapsilosis e C.
tropicalis de pacientes gestantes apresentaram 100% de susceptibilidade ao cetoconazol,
fluconazol, itraconazol e anfotericina B (Tabela 7).
Resultados 65
5.4.5. Grau de concordância entre as metodologias CLSI e Etest
Em análise conjunta das pacientes gestantes ou não os valores de CIM produzidos
pelo CLSI e Etest apresentaram concordância excelente para o cetoconazol (r = 0,706; p <
0,00001) e baixa para o itraconazol e anfotericina B (r = 0,319; p < 0,00001 e r = 0,322; p <
0,00001, respectivamente). Para o fluconazol, não se observou concordância entre os valores de
CIM no CLSI e Etest (r = 0,042; p = 0,597). No entanto, para todas as drogas antifúngicas, foi
alta a concordância do perfil de susceptibilidade avaliado pela proporção de valores de CIM
abaixo do ponto de corte. (Kappa = 1,0, para cetoconazol e anfotericina B e Kappa = 0,99 para
fluconazol e itraconazol) (Tabela 6 e 7).
No grupo de pacientes não gestantes, foram observadas discrepâncias referentes aos
isolados de C. glabrata. O isolado (395) apresentou susceptibilidade dose-dependente ao
itraconazol na metodologia do CLSI e susceptibilidade (Etest); o isolado (205) apresentou
susceptibilidade (CLSI) e susceptibilidade dose-dependente (Etest) para o fluconazol e
itraconazol.
Quanto à C. krusei do mesmo grupo (não gestantes) houve uma discrepância: o
isolado (389) apresentou susceptibilidade dose-dependente (Etest) e resistência (CLSI) referente
ao fluconazol.
No grupo de pacientes gestantes foram observadas duas discrepâncias em relação aos
isolados (59 e 369) de C. krusei frente ao itraconazol. Estes isolados apresentaram
susceptibilidade (Etest) e susceptibilidade dose-dependente (CLSI).
Os resultados refletindo a comparação entre as metodologias avaliadas estão
representados na tabela 8, para as pacientes não gestantes e tabela 9, para as pacientes gestantes,
exibindo valores de média, mediana e moda das concentrações inibitórias mínimas para cada
droga antifúngica.
Resultados 66
Tabela 6 – Comparação dos perfis de susceptibilidade in vitro de isolados de leveduras do gênero Candida em pacientes não gestantes, utilizando duas
metodologias (CLSI e Etest).
Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
Amostras S SDD R S SDD R S SDD R S SDD R
Metodologia
(a) (b) (c) (d)
Conc. droga µg/mL < 4,0 - ≥ 4,0 ≤ 8,0 16 - 32 ≥ 64 ≤ 0,125 0,25 - 0,5 ≥ 1,0 ≤ 1,0 - > 1,0
C. albicans (51)
CLSI
51 (100%) - 0 51 (100%) 0 0 51 (100%) 0 0 51 (100%) - 0
Etest
51 (100% - 0 51 (100% 0 0 51 (100% 0 0 51 (100% - 0
C. .parapsilosis (10)
CLSI
10 (100%) - 0 10 (100%) 0 0 10 (100%) 0 0 10 (100%) - 0
Etest
10 (100%) 0 10 (100%) 0 0 10 (100%) 0 0 10 (100%) - 0
C. tropicalis (4)
CLSI
4 (100%) - 0 4 (100%) 0 0 4 (100%) 0 0 4 (100%) - 0
Etest
4 (100%) - 0 4 (100%) 0 0 4 (100%) 0 0 4 (100%) - 0
C. glabrata (3)
CLSI
3 (100%) - 0 3 (100%) 0 0 2 (66,7%) 1 (33,3%) 0 3 (100%) - 0
Etest
3 (100%) - 0 2 (66,7%) 1 (33,3%)
0 2 (66,7%) 1 (33,3%) 0 3 (100%) - 0
C. krusei (2)
CLSI
2 (100%) - 0 1 (50%) 0 1(50%) 0 2 (100%) 0 2 (100%) - 0
Etest
2 (100%) - 0 1 (50%) 1 (50%) 0 0 2 (100%) 0 2 (100%) - 0
S – Susceptibilidade / SDD – Susceptibilidade Dose-Dependente / R – Resistência
(a) Pontos de susceptibilidade estabelecidos para leveduras do gênero Candida em µg/mL (Rex et al. 1997, Espinel-Ingroff et al. 1998)
(b) (c) e (d) Pontos de susceptibilidade estabelecidos para leveduras do gênero Candida em µg/mL, segundo CLSI (2005)
Resultados 67
Tabela 7 – Comparação dos perfis de susceptibilidade in vitro de isolados de leveduras do gênero Candida em pacientes gestantes, utilizando duas metodologias
(CLSI e Etest).
Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
Amostras S SDD R S SDD R S SDD R S SDD R
Metodologia
(a) (b) (c) (d)
Conc. droga µg/mL < 4,0 - ≥ 4,0 ≤ 8,0 16 - 32 ≥ 64 ≤ 0,125 0,25 - 0,5 ≥ 1,0 ≤ 1,0 - > 1,0
C.albicans (83)
CLSI
83 (100%) - 0 83 (100%) 0 0 83 (100%) 0 0 83 (100%) - 0
Etest
83 (100%) - 0 83 (100%) 0 0 83 (100%) 0 0 83 (100%) - 0
C.krusei (3)
CLSI
3 (100%) - 0 3 (100%) 0 0 1 (33,3%) 02 (66,7%) 0 3 (100%) - 0
Etest
3 (100%) - 0 3 (100%) 0 0 3 (100%) 0 0 3 (100%) - 0
C. glabrata (2)
CLSI
2 (100%) - 0 2 (100%) 0 0 2 (100%) 0 0 2 (100%) - 0
Etest
2 (100%) - 0 2 (100%) 0 0 2 (100%) 0 0 2 (100%) - 0
C. parapsilosis (1)
CLSI
1 (100%) - 0 1 (100%) 0 0 1 (100%) 0 0 1 (100%) - 0
Etest
1 (100%) - 0 1 (100%) 0 0 1 (100%) 0 0 1 (100%) - 0
C. tropicalis (1)
CLSI
1 (100%) - 0 1 (100%) 0 0 1 (100%) 0 0 1 (100%) - 0
Etest
1 (100%) - 0 1 (100%) 0 0 1 (100%) 0 0 1 (100%) - 0
S – Susceptibilidade / SDD – Susceptibilidade Dose-Dependente / R – Resistência
(a) Pontos de susceptibilidade estabelecidos para leveduras do gênero Candida (Rex et al. 1997, Espinel-Ingroff et al. 1998)
(b) (c) e (d) Pontos de susceptibilidade estabelecidos para leveduras do gênero Candida segundo CLSI (2005)
Resultados 68
Tabela 8 – Média, mediana e moda das concentrações inibitórias mínimas, expressos em µg/mL para quatro drogas antifúngicas de isolados de leveduras do
gênero Candida em pacientes não gestantes, para as duas metodologias utilizadas (CLSI e Etest).
Amostras (n) Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
Metodologia Média Mediana Moda Média Mediana Moda Média Mediana Moda Média Mediana Moda
C. albicans (51)
CLSI
0,025 0,015 0,015 0,245 0,25 0,12 0,029 0,03 0,03 0,097 0,06 0,015
Etest
0,015 0,006 0,006 0,458 0,3 0,25 0,021 0,016 0,012 0,067 0,064 0,047
C.parapsilosis (10)
CLSI
0,018 0,015 0,015 0,473 0,25 0,12 0,021 0,015 0,015 0,06 0,045 0,12
Etest
0,014 0,014 0,016 0,586 0,5 0,5 0,036 0,014 0,012 0,084 0,047 0,047
C. tropicalis (4)
CLSI
0,015 0,015 0,015 0,248 0,185 0,12 0,038 0,038 0,015 0,12 0,12 0,12
Etest
0,008 0,006 0,006 0,361 0,285 - 0,031 0,028 0,023 0,089 0,071 -
C. glabrata (3)
CLSI
0,108 0,06 - 1,413 0,12 0,012 0,108 0,06 - 0,098 0,03 -
Etest
0,089 0,012 - 5,5 0,25 0,25 0,196 0,064 - 0,179 0,094 -
C. krusei (2)
CLSI
0,53 0,53 - 33 33 - 0,25 0,25 0,25 0,258 0,258 -
Etest
0,262 0,262 - 16,75 16,75 - 0,25 0,25 - 0,032 0,032 -
Resultados 69
Tabela 9 – Média, mediana e moda das concentrações inibitórias mínimas, expressos em µg/mL para quatro drogas antifúngicas de isolados de leveduras do
gênero Candida em pacientes gestantes, para as duas metodologias utilizadas (CLSI e Etest).
Amostras (n) Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
Metodologia Média Mediana Moda Média Mediana Moda Média Mediana Moda Média Mediana Moda
C. albicans (83)
CLSI
0,023 0,015 0,015 0,228 0,25 0,12 0,031 0,03 0,03 0,069 0,06 0,12
Etest
0,011 0,006 0,006 0,522 0,38 0,5 0,023 0,016 0,012 0,064 0,047 0,047
C.krusei (3)
CLSI
0,163 0,12 0,12 0,45 0,25 - 0,187 0,25 0,25 0,255 0,25 -
Etest
0,198 0,19 - 5,833 8 8 0,067 0,094 - 0,19 0,125 -
C. glabrata (2)
CLSI
0,023 0,023 - 1,06 1,06 - 0,03 0,03 0,03 0,12 0,12 0,12
Etest
0,095 0,095 - 3 3 - 0,086 0,086 - 0,055 0,055 -
C. parapsilosis (1)
CLSI
- - - - - - - - - - - -
Etest
- - - - - - - - - - - -
C. tropicalis (1)
CLSI
- - - - - - - - - - - -
Etest
- - - - - - - - - - - -
6. DISCUSSÃO
Discussão 71
A candidíase é apontada, entre as vulvovaginites, como a causa mais frequente em
mulheres, especialmente as que se encontram em idade fértil. Este quadro afeta milhões de
pacientes em todo o mundo, e estima-se que praticamente 75% das mulheres poderão apresentar
pelo menos um episódio de vulvovaginite por leveduras do gênero Candida ao longo de suas
vidas, sendo que destas 40 a 50% vivenciam novos surtos e 5% tornam-se recorrentes (Adad et
al., 2001; Moreira & Paula, 2006). Além disso, não é incomum o isolamento destas leveduras a
partir de secreções vaginais em mulheres assintomáticas. Estimativas refletem que 20 a 25% de
mulheres em pré-menopausa assintomáticas apresentem cultivo positivo para leveduras do
gênero Candida na vagina (Ziarrusta, 2002).
Na literatura, vários relatos apontam um aumento referente às espécies não-albicans
e aparecimento de episódios de repetição, muitas vezes associados ao fracasso terapêutico.
No entanto, vale ressaltar ainda a escassez de dados no que tange a estudos
realizados no Brasil em relação àqueles em outros países, especialmente europeus.
Por este motivo, torna-se necessário conhecer melhor, a partir de uma casuística
maior, populações de leveduras do gênero Candida, associadas a quadros de vulvovaginites, no
que tange à identificação das espécies. Consideramos relevante também estimar a prevalência, e
determinar a susceptibilidade às drogas antifúngicas in vitro, incluindo as mais utilizadas na
prática médica.
Em Mato Grosso, este estudo representa o marco inicial, e os resultados obtidos
apontam perspectivas referentes ao conhecimento de espécies envolvidas nos quadros de
vulvovaginites por leveduras do gênero Candida, em pacientes gestantes e não gestantes
atendidas no ambulatório de ginecologia/obstetrícia do Hospital Geral Universitário de Cuiabá.
A partir de um total de 404 pacientes (203 não gestantes e 201 gestantes) foram
isoladas 160 leveduras do gênero Candida, correspondendo a 70 (34,5%) as pacientes não
gestantes e 90 (44,8%) as gestantes.
A técnica de CHROMagar foi utilizada para avaliar a pureza das colônias isoladas,
inicialmente, a partir das secreções vaginais, seguindo a identificação de colônias puras. A
espécie C. albicans foi mais prevalente correspondendo a 51 (72,9%) no grupo de pacientes não
gestantes. Aleixo Neto et al (1999), avaliando apenas 72 mulheres não gestantes apresentando ou
não queixas específicas relataram encontrar a presença de leveduras do gênero Candida em 18
(25%) casos. Destes, a espécie C. albicans foi a mais prevalente (77,8%) e consequentemente
22,2% foram caracterizadas como não-albicans.
Já em relação às espécies não albicans encontradas em nosso estudo, ainda
considerando as pacientes não gestantes, foram identificadas 10 (14,3%) como C. parapsilosis, 4
Discussão 72
(4,3%) como C. tropicalis, 3 (2,8%) como C. glabrata e 2 (2,8%) como C. krusei. Estes achados
contrastam com os publicados por Aleixo Neto et al. (1999), apontando a C. glabrata como a
mais prevalente (16,7%), seguida por C. parapsilosis (5,6%). Galle & Gianini (2004) avaliaram
250 mulheres, porém sem observância aos sintomas apresentados pelas mesmas. Deste total,
foram colhidas secreções vaginais, e 69 (27,%) apresentaram culturas positivas para leveduras do
gênero Candida. A espécie mais frequente foi C. albicans (74%), seguida por C. glabrata
(14,5%), C. tropicalis 5 (7,2%) e por ultimo C. parapsilosis 3 (4,3%). Estes valores exibem
concordância com os relatos de Aleixo Neto et al (1999), e discordância em relação aos nossos
achados, onde C. glabrata sucede tanto C. parapsilosis como C. tropicalis.
Ribeiro et al (2000) estudaram por um período de 2 anos pacientes atendidas na
Clínica Ambulatorial de Ginecologia e Obstetrícia da Universidade do Espírito Santo e
encontraram 25% de mulheres assintomáticas (30/121) e 60% de mulheres sintomáticas(50/84)
apresentando vulvovaginite por leveduras do gênero Candida, C. albicans foi a espécies mais
freqüente em ambos os grupos (46% e 90% respectivamente) seguida de C. glabrata (13% e 6%
respectivamente).
Dados mais recentes, publicados por Ferraza et al (2005), obtidos a partir do estudo
de 227 mulheres (sendo 130 procedentes de Santa Catarina e 97 do estado do Paraná),
registraram o isolamento de leveduras do gênero Candida em cultura em relação as 130 pacientes
catarinenses, em apenas 31 (23,8%) pacientes, correspondendo a 6 sintomáticas e 25
assintomáticas. Em 77,4% dos casos positivos foi isolada C. albicans (24/31), seguida de
espécies não albicans, obedecendo a seguinte distribuição: C. glabrata, 4 (13%), C.
guilliermondii 2 (6,4%) e apenas 1 (3,2%) C. parapsilosis. Já em relação ao outro grupo
representado por 97 mulheres paranaenses, foram observadas culturas positivas para 24 pacientes
(24,7%), das quais 15 foram assintomáticas e 9 sintomáticas. Em 50% dos casos positivos foram
isoladas C. albicans (12/24). Em relação às espécies não-albicans, foi observada a distribuição
seguinte: 20,8% para C. guilliermondii (5/24), 8,3% Rhodotorula sp (2/24), 8,3% C. lusitaniae,
4,2% C. tropicalis (1/24), 4,2% Trichosporon asahii (1/24) e 4,2% C. glabrata (1/24). Vale
ressaltar que a população de estudo foi subdividida em dois grupos (pacientes sintomáticas e
assintomáticas), exatamente como realizado em nosso trabalho, obedecendo ao critério
estabelecido por Lopes Consolaro et al (2004).
Estes autores relatam estudo avaliando 161 pacientes, destacando positividade de
culturas com isolamento de leveduras do gênero Candida em 35 pacientes (21,7%). A espécie C.
albicans foi isolada em 60% (21/35) dos casos. O percentual referente às espécies não-albicans
foi assim descrito: 27,5% (9/35) C. glabrata, 5,7% (2/35) Sacharomyces cerevisiae e 2,9%
Discussão 73
(1/35) Trichosporon sp. Segundo dados publicados por Lopes Consolaro et al (2004), a espécie
C. albicans foi mais frequente entre as pacientes sintomáticas, enquanto que as não-albicans
foram mais frequentes entre as assintomáticas. Os autores sugerem que proporcionalmente o
isolamento de C. albicans aumenta de acordo com a severidade do quadro de vulvovaginite,
enquanto que o oposto ocorre em se tratando das espécies não-albicans.
Corsello et al (2003) sugerem que a distribuição de espécies na vagina pode ser
variável e consideram diferenças metodológicas, as responsáveis por tais discordâncias.
Quando analisamos os resultados encontrados em nosso estudo nas pacientes
gestantes, observamos que de um total de 90 leveduras do gênero Candida isoladas, 83 (92,3%)
foram identificadas como C. albicans, 3 (3,3%) como C. krusei, 2 (2,2%) como C. glabrata, 1
(1,1%) como C. parapsilosis e 1 (1,1%) como C. tropicalis.
Alguns trabalhos já foram realizados no sentido de estabelecer a prevalência e fatores
de risco associados às infecções cérvico vaginais durante a gestação. Vale destacar a
contribuição, em relação a este aspecto, publicada por Simões et al (1996), os quais realizaram
um estudo tipo corte transversal de 328 pacientes gestantes acompanhadas no ambulatório de
pré-natal do departamento de Tocoginecologia da FCM/UNICAMP, no período compreendido
entre outubro de 1991 a fevereiro de 1993. No entanto, o diagnóstico de candidíase realizado
neste trabalho, baseou-se apenas nos achados de bacterioscopia da secreção vaginal, sem
realização de cultura e, por conseguinte, identificação de espécies. A prevalência total de
infecção foi de (40,6%), sendo: candidíase vaginal (19,3%), vaginose bacteriana (9,5%),
alteração da microbiota vaginal (6,7%), cervicite por Chlamydia trachomatis (2,1%) e infecção
pelo Papiloma Vírus Humano (0,9%).
Consideramos muito importante a realização da cultura para fungos em se tratando
de secreções vaginais, pois a partir da levedura isolada torna-se possível a identificação da
espécie e, posteriormente a realização dos testes de susceptibilidade in vitro às drogas
antifúngicas. Além disso, a detecção de candidíase vulvovaginal seria optimizada, reunindo os
métodos de bacterioscopia e cultura refletindo maior sensibilidade para estimar a prevalência.
Bauters et al (2002), avaliaram 612 pacientes, apresentando ou não queixas de
vaginite. As mulheres foram subdivididas em dois grupos, de acordo com o critério pré ou pós
menopausa. No primeiro grupo, foram incluídas as pacientes que usavam contraceptivos orais
(n=111), gestantes (n=103), pacientes que utilizavam dispositivo intra-uterino (n=57), e
pacientes que apresentavam ciclo regular, e não realizavam tratamento hormonal (n=114). O
segundo grupo incluiu pacientes em pós-menopausa, as quais estavam recebendo terapia
hormonal de reposição (n=108) e um grupo controle sem uso de terapia hormonal (n=119).
Discussão 74
Uma das técnicas metodológicas utilizadas por estes autores, difere daquela que
empregamos em nosso estudo, pois as espécies de leveduras do gênero Candida foram
identificadas a partir da realização de kits comerciais fundamentados na assimilação de açúcares
(API 20 C AUX; biomériuex Vitek). Duas provas foram executadas por Bauters et al (2002), de
maneira idêntica à realizada em nosso estudo (prova do tubo germinativo, características
micromorfológicas avaliadas em ágar-fubá).
Considerando as pacientes gestantes (n=103), foi observado um total de 33 (32%)
casos positivos no que se refere ao isolamento de leveduras do gênero Candida, superando os
cinco outros grupos: uso de contraceptivos orais, com 16 (14,4%) casos positivos; uso de
dispositivo intra-uterino 8 (14%), mulheres com ciclo regular 22 (19,3%); mulheres realizando
reposição hormonal 29 (26,9%), e controle 15 (12,6%). Ainda no grupo de gestantes, foi
observado que a taxa de colonização aumentou em relação à duração da gestação de 14,3%
(n=21) no primeiro trimestre para 38,3% (n=50) no terceiro trimestre (p=0,05).
Há relatos publicados por Mendes et al (2002) no que tange à prevalência e
distribuição de espécies de leveduras do gênero Candida em pacientes HIV positivas gestantes.
Os autores estudaram 205 gestantes, não necessariamente exibindo sinais e sintomas de vaginite,
porém, concomitância entre infecção pelo vírus HIV e gestação. Além do exame direto, pelo
método da potassa (KOH – 10%), foram realizadas culturas em Sabouraud dextrose ágar. Como
em nosso estudo, o meio de CHROMagar foi utilizado para conferir a pureza das colônias. 164
gestantes com infecção pelo HIV, foram identificadas com candidíase vulvovaginal através do
exame direto, destas 90 (54,9%) apresentaram positividade em cultura. Das culturas positivas, a
espécie C. albicans representou 83,5%, seguida por C. glabrata (10,6%), C. krusei (3,5%) e por
último C. tropicalis (2,4%). Nossos achados concordam em relação à maior prevalência de C.
albicans, porém diferem em número no que se refere às espécies não albicans. Diferenças quanto
à distribuição das espécies de leveduras do gênero Candida, podem estar relacionadas às
diferenças quanto a colonização em gestantes HIV soro positivas, todavia não foi observada por
Mendes et al (2002) correlação direta entre o estágio da infecção pelo HIV (CD4 < 200 células /
mm3) e culturas positivas.
No entanto, dados obtidos a partir de mulheres não gestantes infectadas pelo HIV,
em relação àqueles obtidos a partir de gestante HIV soro positivas indicam que a colonização
vaginal e vaginites sintomáticas refletem alterações na imunidade sistêmica. Estudos realizados
inferem sobre o papel do sistema imune no processo facilitador da colonização por leveduras do
gênero Candida, e subseqüente, vaginite em mulheres HIV negativas não é capazes de explicar a
predisposição à infecção. Desta forma, o efeito específico do sistema imune em predispor a
Discussão 75
infecção por leveduras do gênero Candida, durante a gestação, permanece não muito bem
esclarecido.
Mais recentemente, Namkinga et al (2005), realizaram a identificação de espécies de
leveduras do gênero Candida em mulheres gestantes procedentes da Tanzania. Eles avaliaram
mulheres de 13 a 45 anos de idade, em um período compreendido entre março de 1998 a
dezembro de 2000. Foram identificados 272 isolados, utilizando o sistema API Candida,
apontando a seguinte distribuição: Candida albicans 180 (66,2%), Candida tropicalis 13 (4,7%),
Candida glabrata 20 (7,35%), Candida famata 6 (2,2%), Candida parapsilosis 6 (2,2%) e
Candida lusitaniae 1 (0,37%). A identificação pelo sistema API Candida não conseguiu
especificar 43 isolados. O sistema API 20 C AUX foi utilizado para identificar 29 isolados
exibindo os resultados seguintes: 11/29 (37,9%) C. albicans, 1/29 (3,4%) C. tropicalis, 4/29
(13,8%) C. glabrata, 1/29 (3,4%) C. lusitaniae, 1/29 (3,4%) C. colliculosa / C. magnoliae, 5/29
(17,2%) C. albicans / C. tropicalis, 2/29 (6,8%) C. norvegensis / C. parapsilosis e 2/29 (6,8%)
C. krusei / C. inconspicua. Em concordância com os dados obtidos em nosso estudo, a espécie
mais prevalente no grupo de gestantes avaliados por Namkinga et al (2005), foi C. albicans
(66,2%), porém um considerável percentual (33,7%) foi atribuído às espécies não-albicans,
discordando do baixo valor encontrado em nosso trabalho (7,7%).
Fevi Waboso & Amadi (2001) avaliaram 1005 mulheres gestantes relatando
prevalência de 42,9% em relação à candidíase vaginal. As mulheres foram consideradas
assintomáticas, e o método de detecção de leveduras do gênero Candida foi a microscopia a
partir da secreção vaginal. Já Ashraf et al (2001), realizaram estudo, objetivando determinar a
correlação entre sintomas de vaginite com candidíase e prevalência de Candida albicans em
gestantes. De um total de 262 mulheres, a partir do isolamento de leveduras em cultura, em 74
casos, foi observada positividade para C. albicans.
Em relação às espécies não-albicans, Wenjin & Yifu (2006), avaliando uma
população de 628 gestantes, detectaram um total de 50 isolados de Candida glabrata. Desta
forma, a prevalência de C. glabrata durante a gestação foi igual a 7,96% (50/628). Estes autores
utilizaram a técnica de RAPD (Ramdomly Amplified Polymorphic DNA) com o objetivo de
comparar genótipos de C. glabrata a partir de mulheres com ou sem sintomas. A partir dos
resultados obtidos, eles concluem que os isolados de C. glabrata (pacientes assintomáticas),
obtidos naquelas incluídas no primeiro trimestre, apresentam maior similaridade genotípica. Os
resultados mostram ainda que, os genótipos apresentam similaridades, porém não são idênticos.
Na Jamaica, Kamara et al (2000) avaliaram 269 mulheres gestantes, reportando uma
prevalência de 30,7% para candidíase, valor superado apenas por vaginose bacteriana (44,1%).
Discussão 76
Aboyeji & Nwabuisi (2004) estudaram um grupo de mulheres (n= 230), na Nigéria
no período compreendido entre janeiro a dezembro do ano de 2000, com o objetivo de
determinar a prevalência de agentes etiológicos comuns, associados à doença sexualmente
transmissível. Em 114 mulheres, vários agentes/causas foram detectados, incluindo Candida spp
(37,8%), Trichomonas vaginalis (4,7%), Gardnerella vaginalis (3,9%), sífilis (1,7%) e Neisseria
gonorrhea (1,3%).
De forma geral, os trabalhos na literatura mostram proximidade aos valores
encontrados em nosso estudo (detecção de 44,8% de leveduras do gênero Candida em pacientes
gestantes, n=90), oscilando entre 28 a 66 %, variando com a população analisada (n), e com os
percentuais encontrados para as espécies não-albicans quando a identificação foi realizada.
A prevalência de C. albicans em relação às outras espécies é descrita em vários
relatos (Namkinga et al, 2005, Us & Cengiz, 2006, Garcia Heredia et al, 2006).
Recentemente, Garcia Heredia et al (2006) avaliaram 493 pacientes em Buenos
Aires, no período compreendido entre dezembro de 1998 e fevereiro de 2000, e encontraram
uma prevalência total de Candida spp igual a 28%. A distribuição entre as espécies foi: C.
albicans (90,4%), C. glabrata (6,3%), C. parapsilosis (1,1%), C. kefyr (1,1%), e espécies não
identificadas (1,1%).
O percentual encontrado para a espécie C. albicans (90,4%) no trabalho publicado
por Garcia Heredia et al (2006), foi próximo ao encontrado em nosso estudo (92,3%) em
pacientes gestantes.
Entretanto, os dados obtidos por Us & Cengiz (2006) estudando uma população de
218 mulheres gestantes, apresentando sinais e sintomas de candidíase vulvovaginal, apontaram o
percentual de 53,2% para a espécie C. albicans, refletindo valor bastante inferior ao nosso
achado. Estes autores encontraram a seguinte distribuição para as espécies não-albicans: C.
glabrata (28,5%), C. tropicalis (11,6%) e (6,4%) C. krusei, correspondendo a sequência e
percentuais diferentes dos obtidos em nosso trabalho.
Nos últimos anos têm sido observadas mudanças epidemiológicas atribuídas em
muitos casos às práticas terapêuticas empregadas. Neste contexto, vem sendo destacado o
aparecimento de cepas que tem desenvolvido resistência secundária aos antifúngicos e a
substituição de algumas espécies susceptíveis por outras resistentes (Cuenca-Estrella &
Rodriguez Tudella, 2002).
Esforços também têm sido realizados no sentido de padronizar técnicas para detecção
de resistências in vitro, as quais possam exibir certa correlação com a evolução clínica dos
pacientes. Atualmente, o CLSI recomenda a utilização dos documentos aprovados para
Discussão 77
realização dos testes de susceptibilidade in vitro a drogas antifúngicas com leveduras
(documento M27 A2, 2005), e com fungos micelianos (documento M 38 A).
Segundo Espinel-Ingroff (1992), os testes de susceptibilidade com agentes
antifúngicos, em geral e especialmente, com os azólicos para as leveduras são largamente
influenciados pela composição do meio, tempo de incubação e tamanho do inóculo.
É consenso na literatura que os métodos de referência aprovados pelo CLSI
apresentam dificuldades técnicas quanto a sua realização em laboratórios de rotina, devidos a
peculiaridades metodológicas. Entretanto, métodos comercialmente disponíveis tais como o
Etest, dentre outros, têm exibido boa correlação com aqueles considerados referência (Ballesté et
al, 2006).
Vários trabalhos publicados têm empregado testes de susceptibilidade in vitro a
drogas antifúngicas e leveduras do gênero Candida isoladas de quadros de vulvovaginite
primários ou recidivantes. Assim sendo, Czaika et al (2000) obtiveram 55 isolados a partir de 40
pacientes, apresentando candidíase recidivante crônica. A espécie C. glabrata foi a mais
prevalente, e os valores médios de CIM foram iguais a 32 µg/mL para o fluconazol, 1µg/mL para
o itraconazol, 1µg/mL para o cetoconazol, 0,5µg/mL para a anfotericina B, 0,03µg/mL para o
voriconazol, 128µg/mL para a terbinafina, 4µg/mL para a ciclopiroxolamina, 0.03µg/mL para a
5-fluorocitosina. De acordo com os valores obtidos, os autores inferiram que a terapia
preconizada com baixas doses de fluconazol é sempre ineficaz na candidíase vaginal recorrente,
e induz resistência secundária. Por outro lado, em relação às outras drogas avaliadas, foi
observada elevada susceptibilidade, especialmente para o voriconazol, anfotericina B e 5-
fluorocitosina considerando a espécie C. glabrata. Em nosso estudo, foram identificados nas
pacientes não gestantes, três isolados como C. glabrata, e nas gestantes apenas dois. O perfil de
susceptibilidade verificado em nosso trabalho para as drogas avaliadas (cetoconazol, fluconazol,
itraconazol e anfotericina B) revela susceptibilidade dos isolados às drogas testadas obtido a
partir da utilização de metodologia de referência (microdiluição em placa – CLSI). Ainda, em
relação à espécie C. glabrata, a partir do emprego do Etest, observou-se da mesma forma,
elevada susceptibilidade in vitro às drogas testadas. Para os isolados, obtidos a partir de
pacientes gestantes, foi observada também elevada susceptibilidade in vitro pelas duas
metodologias empregadas (CLSI e Etest).
Ribeiro et al (2000) estudaram 80 pacientes, onde a espécie mais prevalente foi a C.
albicans, seguida de C. glabrata, e testaram a susceptibilidade in vitro aos antifúngicos:
cetoconazol, fluconazol, itraconazol e anfotericina B pela metodologia de microdiluição NCCLS
e obtiveram todos os isolados susceptíveis a anfotericina B e somente 10 isolados susceptível
Discussão 78
dose dependente ou resistente aos azólicos testados sendo que 7 destes eram de espécies não-
albicans, dados estes concordantes com nossos resultados.
Andreu et al (2001) determinaram a prevalência de espécies em 68 isolados de
leveduras do gênero Candida e as concentrações inibitórias mínimas empregando a nistatina,
uma das drogas mais empregadas no tratamento da candidíase vulvovaginal. A partir dos dados
obtidos, eles inferiram que os valores baixos de CIM refletem que o fracasso terapêutico pode
não ser inerente a emergência de cepas resistentes. Candida albicans representou 75% do total
das espécies identificadas, seguida de C. parapsilosis, C. krusei, e C. glabrata. Consideramos
um restrito número de isolados avaliados por Andreu et al (2001), para que tal inferência possa
ser apontada, além de considerarmos importantes as questões levantadas por Cuenca-Estrella &
Rodriguez-Tudella (2002) no que se refere aos pontos de corte estabelecidos. Apenas para
algumas situações clínicas, através de estudos randomizados (Clancy & Nguyen, 1999; Rex et al,
1998) foi possível o estabelecimento de pontos de corte, os quais podem predizer uma boa
correlação entre susceptibilidade in vitro e resposta terapêutica.
Ainda Candido et al (1999), utilizando a metodologia comercialmente disponível
(Etest), avaliaram a prevalência e distribuição de espécies de leveduras do gênero Candida nos
sítios anatômicos vagina e ânus, a partir de 80 pacientes adultas na faixa etária entre 18 a 59
anos. Os autores obtiveram um percentual relativamente baixo (21,2%) no que se refere à
recuperação das leveduras a partir das 80 pacientes avaliadas. Eles detectaram resistência in vitro
para o cetoconazol e itraconazol, porém susceptibilidade ao fluconazol. Com relação ao
cetoconazol para a espécie C. albicans foi observado que 79% dos isolados foram susceptíveis,
diferindo dos nossos resultados que revelaram 100% de susceptibilidade para os 51 isolados de
C. albicans do grupo de não gestantes testados pelas metodologias do Etest e CLSI. Em relação
às espécies C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei, Candido et al (1999), mostraram valores de
CIM refletindo maior susceptibilidade em relação àquela detectada para C. albicans. Para estas
espécies, nas pacientes não gestantes, nossos resultados sugerem 100% de susceptibilidade para
10 isolados de C. parapsilosis, quatro de C. tropicalis e dois de C. krusei. Já para o fluconazol,
segundo dados publicados por Candido et al (1999), a espécie C. krusei apresentou valores de
CIM compreendidos entre 32 a 48 µg/mL, valores considerados altos, porém não significando
resistência in vitro (≥64µg/mL), em contraste com nossos achados, mostrando que dos dois
isolados avaliados, um apresentou-se resistente com o emprego da metodologia do CLSI, e o
outro mostrou-se susceptível dose-dependente pela metodologia do Etest, sem apresentar
correlação entre ambas as metodologias.
Discussão 79
Bauters et al (2002) determinaram a prevalência da colonização vaginal por
leveduras do gênero Candida utilizando como método de confirmação para identificação dos
isolados a prova do tubo germinativo, micromorfologia em ágar-fubá acrescido de Tween 80, e
testes de assimilação de açúcares (API20 C AUX, biomérieux Vitek). De um total de 612
pacientes, leveduras foram recuperadas a partir de 123 swabs correspondendo a 20,1%. O total
de pacientes foi subdividido em dois grupos, correspondendo 65 àquelas sintomáticas, das quais
60% (39/65) apresentaram exames diretos (método do KOH) positivos, e 40% (26/65) exibiram
resultados negativos. Leveduras foram recuperadas em 89,7% (35/39) naquelas mulheres que
apresentaram sintomas de vulvovaginite. Das 547 pacientes assintomáticas, foi demonstrada a
colonização em 81 pacientes. A espécie C. albicans foi a mais isolada (68,3%), seguida de C.
glabrata (16,3%), C. parapsilosis (8,9%), C. humicola (1,6%), C. krusei (0,8%) e C. lusitaniae
(0,8%). Outros isolados incluiram espécies do gênero Rhodotorula (2,4%) e S. cerevisiae (0,8%).
C. albicans foi predominante em mulheres em pré-menopausa (65,9%) e pós-menopausa
(73,2%) seguida por C. glabrata (18,3% e 12,2% respectivamente) e C. parapsilosis (8,5% e
9,8% respectivamente). Os resultados dos testes de susceptibilidade in vitro também realizados
por Bauters et al (2002), pela metodologia do NCCLS mostraram que 72,4% dos isolados foram
susceptíveis (n=89), embora susceptibilidade dose-dependente tenha sido observada para 6,5%
dos isolados (n=6) e resistência em 21,1% dos isolados (n=26) respectivamente.
Em nosso estudo, as pacientes não foram subdivididas em grupos, obedecendo a
fases do ciclo hormonal (pré-menopausa, pós-menopausa) ou ainda àquelas realizando reposição
hormonal, sendo portanto não recomendada à comparação em relação à distribuição de espécies
encontrada por Bauters et al (2002), com aquela encontrada em nosso estudo.
Entretanto, com relação à susceptibilidade ao fluconazol, para as pacientes gestantes,
não detectamos resistência através das duas metodologias utilizadas (CLSI e Etest) considerando
os 90 isolados avaliados. Já para as pacientes não gestantes (n=70), como anteriormente
mencionado, apenas dois isolados de C. krusei não se mostraram susceptíveis, sendo que um
exibiu valor de CIM compatível com resistência pela metodologia do CLSI e o outro se mostrou
susceptível-dose-dependente, quando utilizamos a metodologia comercial (Etest). Bauters et al
(2002) relataram que foram reavaliados 18 dos 19 isolados considerados resistentes pela
metodologia do NCCLS, pela metodologia do EUCAST e do Etest. Destes, oito isolados foram
susceptíveis considerando o método EUCAST e dois deles foram susceptíveis no método do
Etest; entretanto 11 isolados não foram reavaliados, pois foram perdidos.
De forma geral, em nosso estudo foi notável a concordância em relação à
susceptibilidade, susceptibilidade-dose-dependência e resistência, quando comparamos as duas
Discussão 80
metodologias, ressaltando a importância da leitura do teste, devido ao crescimento residual das
colônias quando empregamos a metodologia do Etest. Por outro lado, os valores obtidos pelo
método do CLSI, obtidos em leitor de ELISA, são importantes no que se refere à eliminação da
subjetividade imposta pela leitura visual dos testes.
Pádua et al (2003) avaliaram 412 mulheres com o objetivo de determinar a
colonização vaginal por leveduras e a susceptibilidade in vitro ao fluconazol, nistatina e
anfotericina B.
A freqüência de colonização detectada por estes autores foi igual a 20,15%, sendo
possível investigar a susceptibilidade in vitro em 83 isolados de leveduras. Das 83 pacientes
colonizadas por leveduras na mucosa vaginal, 84% delas tiveram culturas positivas para C.
albicans, valor próximo ao encontrado em nosso estudo, para o grupo de não gestantes (86,3%) e
gestantes (85,5%) quando consideramos mulheres sintomáticas.
Em relação à susceptibilidade in vitro, nossos achados também são próximos quando
comparamos os valores encontrados para o fluconazol por Pádua et al (2003), apontando apenas
um isolado como resistente (1,5%) dos 69 isolados identificados como C. albicans. De dois
isolados identificados como Torulopsis sp, apenas 1 (50%) foi considerado susceptível dose-
dependente e finalmente de dois isolados identificados como C. parapsilosis, apenas 1 (50%) foi
considerado resistente. Para a anfotericina B, dos 69 isolados de C. albicans, apenas 1 (1,5%) foi
considerado resistente por Pádua et al (2003). Vale ressaltar que não detectamos resistência in
vitro para a anfotericina B, para nenhuma das espécies avaliadas em nosso trabalho,
considerando as duas metodologias empregadas (CLSI e Etest).
Apesar de a nistatina ser bastante utilizada no Brasil para o tratamento de candidíase
vulvovaginal, não realizamos testes in vitro com este antifúngico em nosso estudo, porém Pádua
et al (2003), detectaram 29% de amostras susceptíveis-dose-dependentes, sugerindo limitações
ao emprego da droga para o seu emprego em vulvovaginites por leveduras do gênero Candida.
O estudo multicêntrico de Sobel et al (2003) avaliou 556 mulheres apresentando
candídiase vulvovaginal. De 393 isolados de C. albicans, 377 (96%) foram bastante susceptíveis
ao fluconazol, dados próximos aos obtidos em nosso trabalho, evidenciando (100%) de
susceptibilidade para os isolados de C. albicans nas pacientes não gestantes e gestantes.
Entretanto, Sobel et al (2003) detectaram em 14 (3,6%) isolados de C. albicans valores de CIM
iguais ou superiores a 64 µg/mL revelando resistência.
Vale a pena ressaltar que estes autores realizaram os testes de susceptibilidade após o
décimo quarto dia do seguimento terapêutico com fluconazol. Desta forma, 73 isolados foram
obtidos após término do tratamento, a partir de pacientes que apresentaram fracasso terapêutico e
Discussão 81
presença de achados micológicos. Esta análise revelou apenas 4 (5,5%) isolados resistentes e um
mostrou-se susceptível dose-dependente. Os 68 restantes permaneceram susceptíveis. Ainda,
estes autores obtiveram isolados de C. albicans a partir de 101 pacientes no trigésimo quinto dia
pós-seguimento terapêutico, sendo que algumas pacientes tornaram-se sintomáticas, porém, a
maioria mostrava-se assintomática. Dentre os 101 isolados, três exibiram resistência ao
fluconazol. Não foram detectados isolados susceptíveis dose-dependentes. Considerando os 98
isolados, foram observados valores de CIM menores que 1µg/mL em 96 deles, indicando que as
recidivas clínicas e micológicas ocorrem em pacientes infectadas com isolados altamente
susceptíveis ao fluconazol. Com relação aos isolados de C. glabrata, de um total de 44, 2 (4,5%)
foram resistentes ao fluconazol (CIM ≥ 64µg/mL), segundo Sobel et al (2003). Para nenhum dos
isolados foram encontrados valores de CIM entre 16 a 32 µg/mL, e para 42 (95%) de 44 foram
encontrados valores ≤ 8µg/mL e portanto considerados susceptíveis. Em nosso estudo,
detectamos susceptibilidade para o fluconazol, utilizando ambas as metodologias para os dois
isolados de C. glabrata de pacientes gestantes. No entanto, para as não gestantes, de três isolados
(C. glabrata) avaliados, um apenas mostrou-se susceptível dose-dependente ao fluconazol,
quando empregada à metodologia do Etest.
Na literatura, encontramos trabalhos avaliando melhor a susceptibilidade de isolados
sanguíneos de leveduras do gênero Candida, porém informações similares em relação a estes
microrganismos em casos de vaginite sintomática são ainda escassas.
Houang et al (1990), realizaram a mensuração dos níveis de fluconazol em secreções
vaginais de pacientes que receberam dose única deste antifúngico igual a 150mg/mL. O pico de
concentração de fluconazol nas secreções raramente excedeu 2,0µg/mL. Desta forma, no
trabalho publicado por Sobel et al (2003), os autores correlacionaram a resposta terapêutica ao
fluconazol utilizando valores de CIM ≤ 1 µg/mL como susceptíveis.
De acordo com Sobel et al (2003), não deve ser recomendada à realização dos testes
de susceptibilidade in vitro para todas as pacientes com vaginites severas ou recorrentes por
leveduras do gênero Candida. Este procedimento estaria justificado apenas em situações de falha
terapêutica para episódios individualizados. Vale ressaltar, que os mesmos autores sugerem que
quadros de vaginites por leveduras do gênero Candida, atribuídos a isolados de C. albicans
resistentes ao fluconazol permanecem incomuns.
Há dúvidas e lacunas ainda quanto ao entendimento de questões tais como: porque
mulheres infectadas com isolados bastantes susceptíveis in vitro ocasionalmente não respondem
clinicamente e, muitas melhoram clinicamente, mas permanecem colonizadas com isolados de C.
albicans recuperados pós-terapêutica com fluconazol. O mecanismo de ação fungistático dos
Discussão 82
azólicos pode permear estas considerações. Além disso, leveduras que exibem valores altos de
CIM tendem a persistir na mucosa vaginal.
Dados mais recentes obtidos por Ritcher et al (2005) revelam um total de 593
leveduras isoladas a partir de 564 secreções vaginais, com a distribuição seguinte: C. albicans
(420), C. glabrata (112), C. parapsilosis (30), C. krusei (12), Sacharomyces cerevisiae (9), C.
tropicalis (8), C. lusitaniae (1) e um isolado de Trichosporon. De 429 mulheres que
apresentaram culturas positivas, 84 (19%) tiveram múltiplas culturas positivas (233 isolados)
durante o período do estudo. As espécies não albicans foram as mais comumente isoladas a partir
das pacientes que apresentaram múltiplas culturas positivas, e a espécie predominante foi C.
glabrata.
Quanto à susceptibilidade in vitro, referente aos 593 isolados, foi detectada
resistência ao fluconazol em apenas 3,7% dos isolados e 3,0% a 5-flucitosina. Já em relação ao
itraconazol, resistência foi observada para 16,2% dos isolados. Resistência ao fluconazol foi
observada somente entre isolados de C. glabrata (15,2%) e C. krusei (41,7%). A metodologia
empregada foi aquela recomendada pelo NCCLS.
Neste estudo, a espécie mais comumente associada à vulvovaginite por leveduras foi
C. albicans (76%), seguida por C. glabrata (16%). Elevado percentual de espécies não albicans
foi encontrado (24%), porém semelhante com aquele registrado em nosso trabalho para as
pacientes não gestantes (27,1%).
Vale ressaltar aspectos relativos à imunopatogênese da candidíase vulvovaginal,
destacando a possível perturbação na imunidade local da mucosa vaginal, como causa associada
a esta infecção fúngica em caráter recorrente.
Tseng et al (2005) recuperaram 102 isolados de leveduras do gênero Candida a partir
de 182 espécimens clínicos (secreções vaginais). Mais uma vez, a espécie C. albicans foi a mais
prevalente: 68 (67,3%), seguida de C. glabrata 25 (24,7%) dentre as não albicans. Para a
susceptibilidade in vitro, foi utilizada a metodologia do Etest testando o fluconazol e anfotericina
B. Para o fluconazol, foi obtido um percentual igual a 25,7% de isolados resistentes, 10,9%
foram considerados susceptíveis dose-dependentes e 63,4% foram susceptíveis. Em relação à C.
albicans, de um total de 68 isolados 10 (14,7%) foram resistentes ao fluconazol e 3 (4,4%)
susceptíveis dose-dependentes. As espécies não albicans foram susceptíveis ao fluconazol em
51,5% e resistentes em 48,5%. Este valor é mais elevado, e considerado discrepante a aqueles
encontrados em nosso estudo, revelando ausência de resistência, tanto nas pacientes gestantes,
como nas não gestantes, quando empregamos a mesma metodologia. Com relação à anfotericina
B, 100% dos isolados foram susceptíveis, exatamente como observado em nosso estudo.
Discussão 83
Recomendações realizadas por Tseng et al (2005) diferem daquelas propostas por Sobel et al
(2003) quanto à realização dos testes de susceptibilidade in vitro para pacientes com candidíase
recorrente, pois os últimos só sugerem a realização dos mesmos em casos individualizados e não
como rotina neste grupo.
De forma geral, consideramos a necessidade da realização de um maior número de
estudos epidemiológicos, avaliando não apenas a distribuição das espécies de leveduras do
gênero Candida, a partir de quadros de vulvovaginites, porém buscando a recuperação dos
isolados naquelas pacientes pós-seguimento terapêutico, especialmente com fluconazol.
As variações hormonais podem refletir diferenças quanto à distribuição de espécies.
Considerando os testes de susceptibilidade in vitro, o paralelismo evidenciado em
nosso estudo entre a metodologia preconizada pelo CLSI e a comercial empregada (Etest),
sugere a aplicação dos testes comerciais no laboratório clínico.
Para entender melhor a aquisição de resistência ao fluconazol ou a outro azólico,
torna-se necessária à realização de estudos com maior número de dias (seguimento pós-
terapêutico). Além disso, o estabelecimento da correlação in vitro e resposta clínica não pode ser
feito sem buscar associação a parâmetros farmacocinéticos.
Para a leitura dos testes de susceptibilidade, empregando o Etest, recomenda-se
cuidado no que refere ao aparecimento do crescimento residual (efeito trailing), levando a
leituras muitas vezes incorretas, refletindo modificações no perfil de susceptibilidade detectado
in vitro.
Já para a identificação de leveduras, a utilização do CHROMagar revela importância
para avaliar a pureza das colônias, bem como para identificá-las de forma presuntiva.
A realização de estudos multicêntricos em nosso país poderá permitir o estudo de um
número maior de isolados, objetivando conhecer melhor a susceptibilidade dos isolados de
leveduras do gênero Candida no trato genital feminino, aos derivados azólicos e outras drogas
antifúngicas. Para tanto, se torna essencial a realização das provas de susceptibilidade aos
antifúngicos in vitro, seguindo as recomendações do CLSI, bem como realizar identificações de
microrganismos seguindo metodologia convencional, com a opção de compará-las a outras
comercialmente disponíveis, desde que apresentem alto grau de concordância com as de
referência.
7. CONCLUSÕES
Conclusões 85
1. Foram obtidos 160 isolados de leveduras, sendo 70 referentes a pacientes não
gestantes e 90 a pacientes gestantes.
2. O meio CHROMagar apresentou boa concordância com a metodologia clássica
adotada para identificação das espécies de leveduras.
3. A prevalência total de candidíase vulvovaginal foi igual a 39,6% considerando 404
amostras de secreções vaginais obtidas.
4. A espécie C. albicans (72,9%) foi a mais prevalente em pacientes não gestantes,
seguida por C. parapsilosis (14,3%), C. tropicalis (5,7%), C. glabrata (4,3%) e C. krusei (2,8%).
5. Já em relação às gestantes, foi observada a seguinte distribuição: C. albicans
(92,3%), seguida por C. krusei (3,3%), C. glabrata (2,2%), C. tropicalis (1,1%) e C. parapsilosis
(1,1%).
6. As quatro drogas testadas (cetoconazol, fluconazol, itraconazol e anfotericina B)
apresentaram excelente atividade in vitro frente às amostras avaliadas, através das duas
metodologias empregadas (CLSI – microdiluição e Etest).
7. Em relação aos valores de CIM, discretas variações foram detectadas no que se
refere aos valores referenciados na literatura. Maiores discrepâncias foram observadas em
relação à susceptibilidade ao fluconazol, quando quase 100% dos isolados avaliados em nosso
estudo, mostraram-se susceptíveis em ambas as metodologias empregadas, em contrapartida a
valores elevados citados em alguns trabalhos.
8. As duas metodologias empregadas (CLSI e Etest) exibiram alto grau de
concordância, apresentando pequenas variações apenas para isolados de C. glabrata e C. krusei
em pacientes não gestantes e C. krusei em gestantes.
9. Considerando a metodologia exeqüível, na rotina laboratorial, sugerimos o Etest,
por apresentar resultados similares à metodologia de referência e praticidade para realização,
embora o custo seja elevado. Por outro lado, o CLSI apresenta vantagem no que se refere à
leitura dos testes em aparelho de ELISA, alternativa mais confiável em relação à subjetividade
imposta pela leitura visual.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9. ANEXOS
Ficha de Anamnese
Projeto: “Candidíase vulvovaginal em pacientes atendidas no ambulatório de
ginecologia/obstetrícia do Hospital Geral Universitário de Cuiabá/MT - prevalência,
identificação específica e susceptibilidade aos antifúngicos através de duas metodologias
distintas.”
Nº prontuário: Data:
Nome da paciente:
Idade: Estado civil:
Gestante: ( ) sim ( ) não DUM: I.G.:
Paciente: ( ) assintomática com clínica sugerindo candidíase
( ) sintomática com clínica sugerindo candidíase
( ) sintomática sem clínica sugerindo candidíase
( ) assintomática sem clínica sugerindo candidíase (porém com citologia positiva para
leveduras)
Sinais e sintomas:
Prurido ( ) sim ( ) não Hiperemia ( ) sim ( ) não
Ardor ( ) sim ( ) não Dor na relação ( ) sim ( ) não
Odor ( ) sim ( ) não Corrimento ( ) sim ( ) não
Característica do corrimento: ( ) branco leitoso ( ) branco talhado ( ) amarelo ( ) cinza
( ) bolhoso ( ) não definido
Fatores predisponentes:
Uso de contraceptivos orais ( ) sim ( ) não qual:
Diabetes ( ) sim ( ) não Uso de antibióticos ( ) sim ( ) não
Uso de drogas imunossupressoras ( ) sim ( ) não
Imunossupressão ( ) sim qual: ( ) não
Caso recidivante ( ) sim ( ) não
Tratamento ( ) sim qual: ( ) oral ( ) tópico ( ) não
Exame à fresco: ( ) positivo p/ leveduras ( ) negativo ( ) não realizado
Observações:
Resultado cultura: ( ) positivo Identificação específica:
( ) negativo
Susceptibilidade antifúngicos:
F
ORMULÁRIO DE
C
ONSENTIMENTO APÓS INFORMAÇÃO
:
Projeto:
Candidiase vulvovaginal em pacientes atendidas no ambulatório de ginecologia/obstetrícia do
Hospital Geral Universitário de Cuiabá-MT - prevalência, identificação específica e susceptibilidade aos
antifúngicos através de duas metodologias distintas.
Pesquisadores e instituições envolvidas:
Dra. Rosane Christine Hahn - UFMT.
Luciana Basili Dias – UFMT
Dr. José Meirelles Filho – UNIC
Larissa Rosa Silvério da Silva – UNIC
Dra. Márcia de Souza Carvalho Melhem - IAL
Esta pesquisa será realizada para determinar laboratorialmente, a partir de secreções vaginais, o nome
das espécies de leveduras do gênero Candida possivelmente associadas a quadros clínicos de
candidíase vulvovaginal. Posteriormente envolverá a determinação da susceptibilidade “in vitro” à drogas
antifúngicas e sua possível correlação com resposta terapêutica. Todas as informações colhidas, e
também as fotografias serão confidenciais, ficando sob o poder dos pesquisadores, os quais garantirão o
sigilo dos nomes das pessoas envolvidas. Você não terá nenhum risco de vida e nem risco de seqüelas.
Por fim, sua participação neste estudo é voluntária.
Eu.................................................................................................................., entendi o que foi
explicado sobre o estudo e concordo com minha participação.
Assinatura do participante
(ou do responsável, se
menor):........................................................................................................................................
Assinatura do pesquisador
principal:.....................................................................................................................................
Data: ............de ............................de 200........................................................................
Tabela A5 – Valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), expressos em
µg/mL para as amostras de C. albicans em pacientes não gestantes, por duas
metodologias, utilizando quatro drogas antifúngicas.
Amostras
Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest
6 0,015 0,004 0,25 0,38 0,03 0,008 0,015 0,064
27 0,015 0,016 0,12 0,5 0,06 0,012 0,12 0,064
36 0,25 0,012 0,12 0,75 0,015 0,016 0,015 0,008
44 0,12 0,008 0,12 0,5 0,03 0,016 0,015 0,008
54 0,06 0,006 0,5 0,5 0,06 0,023 0,06 0,047
58 0,12 0,006 0,12 0,5 0,03 0,016 0,015 0,125
64 0,015 0,004 0,5 0,25 0,06 0,012 0,03 0,023
67 0,015 0,003 0,25 0,125 0,03 0,012 0,015 0,125
68 0,015 0,003 0,25 0,25 0,03 0,004 0,015 0,094
73 0,015 0,006 0,25 0,19 0,03 0,016 0,06 0,064
77 0,03 0,008 0,25 0,19 0,03 0,023 0,06 0,047
81 0,015 0,003 0,25 0,25 0,06 0,006 0,06 0,047
89 0,015 0,004 0,25 0,25 0,03 0,023 0,06 0,064
104 0,015 0,004 0,12 0,25 0,03 0,008 0,06 0,047
106 0,015 0,004 0,5 0,5 0,06 0,012 0,06 0,047
107 0,015 0,003 0,12 0,25 0,015 0,006 0,12 0,125
128 0,015 0.004 0,12 0,25 0,015 0.047 0,015 0,047
142 0,015 0,008 0,25 0,25 0,03 0,032 0,06 0,047
143 0,015 0,012 0,25 1,0 0,03 0,047 0,015 0,047
147 0,015 0,06 0,25 0,75 0,015 0,012 0,03 0,047
152 0,015 0,006 0,25 0,5 0,015 0,012 0,03 0,047
176 0,015 0,006 0,12 0,5 0,03 0,012 0,06 0,032
177 0,015 0,002 0,12 0,125 0,03 0,002 0,015 0,016
179 0,015 0,006 0,12 0,5 0,015 0,008 0,015 0,125
184 0,015 0,008 0,12 0,125 0,015 0,012 0,015 0,064
185 0,015 0,004 0,12 0,5 0,015 0,016 0,015 0,047
186 0,015 0,012 0,5 1,5 0,015 0,032 0,015 0,094
209 0,015 0,006 0,12 0,75 0,015 0,008 0,015 0,094
211 0,015 0,006 0,25 0,5 0,03 0,012 0,015 0,064
219 0,015 0,008 0,12 1,5 0,03 0,032 0,12 0,094
231 0,015 0,006 0,12 0,5 0,015 0,012 0,015 0,094
232 0,015 0,004 0,12 0,3 0,015 0,012 0,12 0,032
235 0,015 0,006 0,12 0,25 0,03 0,003 0,015 0,032
238 0,015 0,006 0,12 1,0 0,03 0,023 0,06 0,047
241 0,015 0,006 0,12 1,0 0,015 0,023 0,12 0,125
251 0,015
0,004 0,12 0,19 0,015 0,002 0,015 0,012
256 0,015 0,012 0,12 1,0 0,03 0,016 0,06 0,094
Continuação Tabela A5.
281 0,015 0,016 0,5 1,0 0,03 0,094 0,06 0,047
306 0,015 0,004 0,25 0,5 0,03 0,008 0,12 0,125
312 0,015 0,012 0,25 0,25 0,03 0,023 0,12 0,016
320 0,015 0,012 0,5 0,75 0,06 0,047 0,5 0,064
326 0,015 0,012 0,25 0,5 0,03 0,125 0,06 0,047
327 0,015 0,003 0,25 0,125 0,015 0,016 0,12 0,125
337 0,015 0,016 0,25 0,25 0,03 0,032 0,06 0,094
365 0,015 0,006 0,25 0,25 0,03 0,064 0,12 0,125
379 0,015 0,006 0,5 0,25 0,06 0,016 0,5 0,094
380 0,015 0,006 0,12 0,125 0,03 0,016 0,5 0,064
385 0,015 0,004 0,5 0,25 0,03 0,012 0,06 0,064
392 0,015 0,004 1,0 0,094 0,03 0,016 0,5 0,094
397 0,015 0,38 0,12 0,125 0,015 0,016 0,5 0,047
403 0,015 0,006 0,25 0,25 0,12 0,016 0,12 0,094
Tabela A6 – Valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), expressos em
µg/mL para as amostras de C. parapsilosis em pacientes não gestantes, por duas
metodologias, utilizando quatro drogas antifúngicas.
Amostras
Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest
8 0,03 0,016 2,0 0,75 0,06 0,006 0,015 0,016
71 0,015 0,006 0,25 0,38 0,015 0,012 0,12 0,125
96 0,015 0,023 1,0 0,25 0,03 0,047 0,06 0,19
194 0,015 0,012 0,12 0,5 0,015 0,008 0,03 0,047
204 0,03 0,016 0,25 0,5 0,015 0,012 0,03 0,008
213 0,015 0,006 0,12 0,038 0,015 0,008 0,015 0,047
216 0,015 0,032 0,12 0,75 0,015 0,064 0,03 0,125
239 0,03 0,016 0,5 0,19 0,015 0,16 0,12 0,047
259 0,015 0,008 0,12 0,5 0,015 0,016 0,12 0,047
377 0,015 0,004 0,25 2,0 0,015 0,023 0,06 0,19
Tabela A7 – Valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), expressos em
µg/mL para as amostras de C. tropicalis em pacientes não gestantes, por duas
metodologias, utilizando quatro drogas antifúngicas.
Amostras
Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest
258 0,015 0,016 0,12 0,75 0,015 0,023 0,12 0,047
346 0,015 0,003 0,12 0,19 0,015 0,047 0,12 0,094
352 0,015 0,006 0,25 0,125 0,06 0,023 0,12 0,023
353 0,015 0,006 0,5 0,38 0,06 0,032 0,12 0,19
Tabela A8 – Valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), expressos em
µg/mL para as amostras de C. glabrata em pacientes não gestantes, por duas
metodologias, utilizando quatro drogas antifúngicas.
Amostras
Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest
74 0,015 0,012 0,12 0,25 0,015 0,064 0,03 0,064
205 0,25 0,25 0,12 16 0,06 0,5 0,015 0,094
395 0,06 0,004 4,0 0,25 0,25 0,023 0,25 0,38
Tabela A9 – Valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), expressos em
µg/mL para as amostras de C. krusei em pacientes não gestantes, por duas
metodologias, utilizando quatro drogas antifúngicas.
Amostras
Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest
41 0,06 0,023 2,0 1,5 0,25 0,25 0,015 0,016
389 1,0 0,5 64 32 0,25 0,25 0,5 0,047
Tabela A10 – Valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), expressos em
µg/mL para as amostras de C. albicans em pacientes gestantes, por duas metodologias,
utilizando quatro drogas antifúngicas.
Amostras
Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest
3 0,015 0,012 0,5 1,5 0,06 0,016 0,015 0,032
4 0,015 0,008 0,12 0,38 0,03 0,016 0,015 0,094
9 0,015 0,008 0,25 0,19 0,06 0,016 0,015 0,064
11 0,015 0,008 0,25 0,19 0,12 0,032 0,12 0,094
24 0,015 0,006 0,12 0,19 0,06 0,047 0,12 0,064
28 0,015 0,004 0,25 0,5 0,015 0,008 0,06 0,047
31 0,015 0,004 0,12 0,38 0,03 0,023 0,015 0,012
32 0,015 0,006 0,12 0,25 0,03 0,016 0,12 0,047
33 0,015 0,023 0,25 1,5 0,03 0,125 0,06 0,016
42 0,06 0,006 0,12 0,75 0,015 0,047 0,015 0,047
46 0,015 0,006 0,12 0,75 0,03 0,023 0,015 0,016
47 0,03 0,004 0,25 0,5 0,06 0,012 0,015 0,064
48 0,06 0,006 0,25 0,5 0,12 0,032 0,12 0,125
55 0,06 0,004 0,12 0,19 0,03 0,008 0,015 0,064
56 0,06 0,003 0,12 0,19 0,015 0,004 0,015 0,012
63 0,015 0,006 0,25 0,75 0,06 0,012 0,015 0,023
66 0,015 0,004 0,12 0,19 0,015 0,012 0,015 0,047
79 0,015 0,006 0,12 0,25 0,03 0,006 0,12 0,094
80 0,015 0,006 0,25 0,25 0,03 0,012 0,12 0,047
85 0,015 0,004 0,25 0,25 0,03 0,012 0,06 0,047
86 0,015 0,006 0,25 0,25 0,03 0,012 0,06 0,125
88 0,015 0,004 0,25 0,19 0,03 0,016 0,06 0,064
98 0,015 0,006 0,12 0,125 0,015 0,012 0,06 0,064
99 0,015 0,006 0,25 0,38 0,03 0,012 0,12 0,125
105 0,03 0,004 0,25 0,125 0,015 0,012 0,12 0,125
119 0,015 0,004 0,12 0,25 0,03 0,012 0,12 0,047
123 0,015 0,004 0,25 0,125 0,06 0,008 0,03 0,008
125 0,015 0,003 1,0 0,125 0,06 0,008 0,06 0,032
131 0,015 0,004 0,25 0,75 0,03 0,008 0,06 0,064
138 0,015 0,006 0,12 0,5 0,015 0,012 0,06 0,064
146 0,015 0,06 0,25 1,0 0,015 0,012 0,015 0,032
149 0,015 0,008 0,12 0,75 0,015 0,012 0,015 0,047
157 0,015 0,008 0,12 1,0 0,015 0,012 0,015 0,125
158 0,015 0,008 0,12 1,0 0,03 0,12 0,12 0,047
160 0,015 0,008 0,12 1,0 0,03 0,032 0,12 0,125
166 0,015 0,002 0,12 0,25 0,03 0,008 0,06 0,012
167 0,015 0,004 1,0 0,094 0,03 0,006 0,06 0,032
175 0,015 0,006 0,12 0,5 0,015 0,008 0,12 0,032
182 0,015 0,006 0,12 0,5 0,03 0,016 0,015 0,047
191 0,015 0,008 0,12 0,5 0,015 0,012 0,03 0,047
196 0,015 0,008 0,25 0,75 0,015 0,012 0,03 0,064
197 0,03 0,06 0,25 0,75 0,03 0,012 0,03 0,125
199 0,015 0,008 0,25 1,0 0,015 0,012 0,03 0,094
210 0,015 0,006 0,12 0,5 0,03 0,012 0,015 0,032
212 0,015 0,012 0,12 1,0 0,03 0,016 0,015 0,094
214 0,015
0,006 0,12 0,5 0,03 0,016 0,12 0,047
225 0,015 0,012 0,12 0,75 0,03 0,023 0,12 0,047
Continuação Tabela A10
229 0,015 0,012 0,12 1,0 0,03 0,023 0,015 0,094
242 0,015 0,006 0,12 0,5 0,015 0,023 0,12 0,064
245 0,03 0,008 0,12 0,75 0,03 0,023 0,12 0,047
250 0,015 0,012 0,12 1,0 0,03 0,016 0,12 0,047
253 0,015 0,006 0,12 1,0 0,015 0,016 0,06 0,012
254 0,015 0,006 0,12 1,0 0,015 0,016 0,06 0,094
262 0,015 0,006 0,12 1,5 0,015 0,047 0,06 0,064
263 0,015 0,004 0,12 0,25 0,015 0,012 0,12 0,19
267 0,015 0,003 0,12 0,125 0,015 0,004 0,015 0,016
268 0,25 0,006 0,12 0,5 0,03 0,012 0,06 0,023
276 0,015 0,008 0,12 2,0 0,03 0,047 0,12 0,094
278 0,015 0,006 0,12 0,75 0,03 0,008 0,03 0,023
279 0,015 0,006 0,12 0,75 0,03 0,023 0,06 0,032
283 0,12 0,125 0,5 0,125 0,12 0,003 0,25 0,016
290 0,015 0,008 0,25 0,38 0,03 0,032 0,06 0,047
291 0,015 0,016 0,25 0,38 0,03 0,064 0,06 0,064
292 0,015 0,006 0,25 0,38 0,03 0,012 0,12 0,125
302 0,015 0,008 0,25 0,5 0,03 0,016 0,06 0,125
303 0,015 0,004 0,25 0,5 0,015 0,012 0,06 0,094
309 0,015 0,006 0,25 0,38 0,03 0,032 0,12 0,064
317 0,015 0,006 0,12 0,125 0,015 0,006 0,03 0,006
318 0,015 0,006 0,5 0,38 0,015 0,008 0,06 0,006
322 0,015 0,012 0,25 0,5 0,015 0.032 0,12 0,016
325 0,015 0,012 0,25 1,0 0,03 0,016 0,06 0,047
332 0,015 0,008 0,25 0,094 0,015 0,012 0,03 0,008
333 0,015 0,006 0,25 0,25 0,03 0,023 0,12 0,094
334 0,06 0,008 0,25 0,25 0,015 0,023 0,06 0,125
339 0,015 0,006 0,25 0,25 0,015 0,032 0,12 0,125
354 0,015 0,16 0,25 0,5 0,03 0,125 0,06 0,064
355 0,015 0,008 0,25 0,38 0,03 0,032 0,12 0,19
358 0,03 0,008 0,25 0,38 0,015 0,032 0,06 0,094
368 0,015 0,012 0,25 0,19 0,03 0,125 0,12 0,047
373 0,015 0,004 0,5 0,25 0,03 0,012 0,12 0,064
384 0,015 0,012 0,25 0,19 0,015 0,012 0,12 0,094
388 0,03 0,006 1,0 0,25 0,03 0,047 0,06 0,125
404 0,015 0,004 0,12 0,25 0,03 0,016 0,25 0,047
Tabela A11 – Valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), expressos em
µg/mL para as amostras de C. krusei em pacientes gestantes, por duas metodologias,
utilizando quatro drogas antifúngicas.
Amostras
Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest
59 0,12 0,023 0,12 1,5 0,25 0,008 0,015 0,064
252 0,12 0,19 1,0 8,0 0,06 0,094 0,25 0,125
369 0,25 0,38 0,25 8,0 0,25 0,1 0,5 0,38
Tabela A12 – Valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), expressos em
µg/mL para as amostras de C. glabrata em pacientes gestantes, por duas metodologias,
utilizando quatro drogas antifúngicas.
Amostras
Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest
277 0,03 0,125 0,12 4,0 0,03 0,047 0,12 0,016
286 0,015 0,064 2,0 2,0 0,03 0,125 0,12 0,094
Tabela A13 – Valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), expressos em
µg/mL para as amostras de C. parapsilosis em pacientes gestantes, por duas
metodologias, utilizando quatro drogas antifúngicas
Amostras
Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest
187 0,015 0,012 0,12 0,25 0,015 0,125 0,015 0,094
Tabela A14 – Valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM), expressos em
µg/mL para as amostras de C. tropicalis em pacientes gestantes, por duas metodologias,
utilizando quatro drogas antifúngicas.
Amostras
Cetoconazol Fluconazol Itraconazol Anfotericina B
CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest CLSI Etest
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