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NAUDIMAR DI PIETRO SIMÕES
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE LASER He-Ne E A ESTIMULAÇÃO
ELÉTRICA NO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO DE PELE DE RATOS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
TECNOLOGIA EM SAÚDE
PUCPR
CURITIBA
2007
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Pontifícia Universidade Católica do Paraná
Programa de Pós-Graduação em Tecnologia da Saúde
Naudimar Di Pietro Simões
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE LASER He-Ne E A ESTIMULAÇÃO
ELÉTRICA NO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO DE PELE DE RATOS
Curitiba
2007
NAUDIMAR DI PIETRO SIMÕES
ESTUDO COMPARATIVO ENTRE LASER He-Ne E A ESTIMULAÇÃO
ELÉTRICA NO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO DE PELE DE RATOS
Dissertação apresentada como requisito parcial à obtenção
do grau de mestre em Tecnologia em Saúde do Programa de
Pós-Graduação em Tecnologia e Saúde da Pontifícia
Universidade Católica do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. Percy Nohama
Co-orientadora: Profa. Dra. Maria de Fátima da Costa Almeida
CURITIBA
2007
Simões, Naudimar Di Pietro
S593e Estudo comparativo entre laser He-Ne e a estimulação elétrica no processo
2007 de cicatrização de pele de ratos / Naudimar Di Pietro Simões ; orientador,
Percy Nohama ; co-orientadora, Maria de Fátima da Costa Almeida. – 2007.
103 f. : il. ; 30 cm
Dissertação (mestrado) – Pontifícia Universidade Católica do Paraná,
Curitiba, 2007.
Bibliografia: f. 81-90
1. Tecidos (Anatomia e fisiologia). 2. Laser. 3. Pele – Efeito da eletricidade.
4. Cicatrização de feridas. 5. Pele – Inflamação. I. Nohama, Percy. II. Almeida,
Maria de Fátima da Costa. III. Pontifícia Universidade Católica do Paraná.
Programa de Pós-Graduação em Tecnologia em Saúde. IV. Título.
CDD 20. ed.612.028
RESUMO
A reparação tecidual consiste em uma das características mais importantes dos
seres vivos. Alguns fatores podem reduzir, retardar ou impedir este processo.
Recursos como o LASER e a estimulação elétrica são indicados na aceleração do
processo de cicatrização. O objetivo deste estudo foi comparar os efeitos da terapia
com LASER de baixa potência e da estimulação elétrica sobre o processo da
cicatrização de feridas na pele de ratos. Utilizaram-se 45 ratos machos Wistar,
submetidos a uma lesão no dorso, divididos em três grupos e tratados diariamente
com: LASER He-Ne, dose de 4J/cm² (grupo LA); estimulação elétrica com
intensidade 100µA, (grupo C.E) e injeção de diclofenaco de sódio, 3mg/Kg (grupo-
controle D.C.F). As aferições foram realizadas no 1º, 2º, 5º, 7º e 15º dia de pós-
operatório, ressecando-se retalhos da cicatriz. A preparação histológica das lâminas
com Hemotoxilina-eosina (HE) e Sirius red forneceram uma análise de números de
células do tecido de granulação, vasos neoformados e densidade de colágeno.
Comparando-se os três tratamentos, ao longo do período, a análise das células do
tecido de granulação, apresentou um aumento significativo no grupo (LA) no 7º dia
do experimento (p=0,0379) em relação ao controle. Os grupo C.E e D.C.F não
apresentaram variação significativa (0,2105) comparados ao controle. Os vasos
neoformados, apresentaram uma diferença significativo no grupo LA (p=0,0023) e no
grupo C.E (p=0,0325) no 7º dia, em relação ao controle . A densidade de colágeno
tipo III aumentou progressivamente entre o 3º e 15º dias nos grupos tratados com
LASER e estimulação elétrica em relação ao grupo controle. Os resultados
mostraram que a estimulação elétrica e o LASER são igualmente eficientes na
aceleração da reparação tecidual. Observou-se um pico na proliferação de vasos no
7º dia, com conseqüente aumento progressivo de produção de colágeno tipo III,
quando comparados ao controle (D.C.F).
Palavras-chave: LASER, Estimulação elétrica, Inflamação, Cicatrização.
ABSTRACT
The tissue repairing consists of one of the most important characteristics of the
livings beings. Some factors can reduce, delay or hinder this process. Resources as
LASER and electrical stimulation are indicated in the acceleration of the tissue
repairing. The goal of this study was the comparison of the effect of low-power
LASER to that obtained with electrical stimulation on the healing process of wounds
in the skin of rats. Forty five male Wistar rats had been submitted to an injury in the
back, divided in three groups and daily treated with: He-Ne LASER, dose of 4J/cm²
for 30s (group LA); electrical stimulation with magnitude of 100µA (group C.E) and
injection of sodium diclofenaco, 3 mg/kg (D.C.F control group). The gaugings had
been carried through in 1
st
, 2
nd
, 5
th
, 7
th
and 15
th
day after the surgery procedure of
postoperative, drying up remnants of the scar. The histology preparation of the
blades with Hemotoxilina-eosine (HE) and Sirius red had supplied cells of granulation
tissue analysis of frame numbers of the granular, newborn vases and density of
collagen. Comparing the three treatments, the analysis of
cells of granulation tissue,
throughout the period, had presented a significant increase in the group (LA) in 7
th
day of the experiment (p=0,0379). Groups C.E and D.C.F had not presented a
significant (0,2105) variation. In relation to the newborn vases it had significant
increase in the group (LA) in 7
th
day (p=0,0023), group C.E also presented in 7
th
day
(p=0,0325), in relation to the control group (D.C.F). The density of collagen type III
increased gradually between the 3
rd
and the 15
th
day in the groups treated with
LASER and electrical stimulation in relation to the control group (D.C.F). The results
indicate that the electrical stimulation and LASER are equally efficient in the
acceleration of the tissue repairing. It was observed a peak activity at the 7
th
day for
vessel´s branching and consequently progressive increase of the proliferation of
collagen type III when compared to control (DCF).
Key- words: He-Ne LASER, Electrical stimulation, Inflammatory process, Healing
Process.
iv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- ESQUEMA ILUSTRATIVO REPRESENTADO AS 3 FASES DO
PROCESSO INFLAMATÓRIO...............................................................................18
FIGURA 2 – LEI DE ARNDT - SCHULTZ COM A FASE PRÉ - LIMIAR (A);
BIOESTIMULAÇÃO(B); BIOINIBIÇÃO (C)........................................................... 37
FIGURA 3 – ESPECTRO DE ABSORÇÃO DOS PRINCIPAIS CROMÓFOROS
DA PELE.............................................................................................................. 39
FIGURA 4 – POSSÍVEIS REAÇÕES PRIMÁRIAS COM CROMÓFOROS NA
CADEIA RESPIRATÓRIA CELULAR................................................................... 42
FIGURA 5 – PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS COM OS GRUPOS
ANALISADOS ...................................................................................................... 51
FIGURA 6 – MORFOLOGIA DO ESTIMULO ELÉTRICO UTILIZADO NA
PESQUISA EXPERIMENTAL .............................................................................. 52
FIGURA 7 – CÉLULAS DO TECIDO DE GRANULAÇÃO (MUITAS) NO 7º DIA
– LASER .............................................................................................................. 59
FIGURA 8 – CÉLULAS DO TECIDO DE GRANULAÇÃO (MUITAS) NO 7º DIA
– DICLOFENACO DE SÓDIO.............................................................................. 59
FIGURA 9 – FORMAÇÃO DE VASOS NO 7º DIA – LASER................................ 61
FIGURA 10 – FORMAÇÃO DE VASOS NO 7º DIA – CORRENTE ELÉTRICA... 61
FIGURA 11 – MORFOMETRIA POLARIZADA DEMONSTRANDO FIBRAS
COLÁGENAS TIPO III NO GRUPO CE NO 15º DIA - CONCENTRAÇÃO DE
TONALIDADES VERDE/AMARELADA................................................................ 64
FIGURA 12 – MORFOMETRIA POLARIZADA DEMONSTRANDO FIBRAS
COLÁGENAS TIPO III NO GRUPO LA NO 15º DIA – CONCENTRAÇÃO DE
TONALIDADES VERDE/AMARELADA................................................................ 64
FIGURA 13 – MORFOLOGIA POLARIZADA DEMONSTRANDO FIBRAS
COLÁGENAS TIPO III NO GRUPO DCF NO 15º DIA - CONCENTRAÇÃO DE
TONALIDADE AVERMELHADA .......................................................................... 65
FIGURA 14 – MORFOMETRIA POLARIZADA DEMONSTRANDO FIBRAS
COLÁGENAS TIPO I NO GRUPO CE NO 15º DIA – TONALIDADE
AVERMELHADA.................................................................................................. 65
FIGURA 15 – MORFOMETRIA POLARIZADA DEMONSTRANDO FIBRAS
COLÁGENAS TIPO I NO GRUPO LA NO 15º DIA – TONALIDADE
AVERMELHADA.................................................................................................. 66
FIGURA 16 – MORFOMETRIA POLARIZADA DEMONSTRANDO FIBRAS
COLÁGENAS TIPO I NO GRUPO DCF NO 15º DIA – TONALIDADE
AVERMELHADA.................................................................................................... 66
FIGURA 17 – MORFOLOGIA DO ESTIMULO ELÉTRICO UTILIZADO NA
PESQUISA EXPERIMENTAL................................................................................103
FIGURA 18 - CIRCUITO UTILIZADO NOS ENSAIOS DE DESEMPENHO DO
ESTIMULADOR ELÉTRICO ..................................................................................103
vi
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 – COMPARAÇÃO ENTRE OS TRATAMENTOS LASER (LA),
DICLOFENACO DE SÓDIO (DCF) E CORRENTE ELÉTRICA (CE)
RELACIONANDO A OCORRÊNCIA DE “MUITAS CÉLULAS” DA
GRANULOSA, POR GRUPO DE TRATAMENTO EM CADA DIA DO
EXPERIMENTO................................................................................................... 57
GRÁFICO 2 – COMPARAÇÃO ENTRE OS TRATAMENTOS LASER (LA),
DICLOFENACO DE SÓDIO (DCF) E CORRENTE ELÉTRICA (CE)
RELACIONADO A OCORRÊNCIA DE “MUITOS” VASOS NEOFORMADOS
EM CADA DIA DE TRATAMENTO ...................................................................... 60
GRÁFICO 3 – COMPARAÇÃO DO PERCENTUAL DE “MUITOS” VASOS
ENTRE OS TRATAMENTOS LASER (LA), DICLOFENACO DE SÓDIO (DCF)
E CORRENTE ELÉTRICA (CE) NO 7º DIA ......................................................... 62
GRÁFICO 4 – COMPARAÇÃO DA QUANTIDADE DE COLÁGENO TIPO III
NO 3º, 4º E 15º DIA EM CADA UM DOS GRUPOS DE TRATAMENTO
(MEDIANAS)........................................................................................................ 63
GRÁFICO 5 – COMPARAÇÃO DA QUANTIDADE DE COLÁGENO TIPO I NO
3º, 7º E 15º DIA EM CADA UM DOS GRUPOS DE TRATAMENTO
(MEDIANAS)........................................................................................................ 63
vii
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 – EFEITO DA CORRENTE ELÉTRICA NA INCORPORAÇÃO DE
GLICINAS MAS PROTEÍNAS E NO ÁCIDO DE ALPHA-AMINOISOBUTÍRICO
PELA PELE DURANTE A INCUBAÇÃO EM UM MEIO QUE CONTÉM O
AMINOÁCIDO ..................................................................................................... 24
QUADRO 2 – OS EFEITOS DA ELETROESTIMULAÇÃO NAS
CONCENTRAÇÕES DO ATP NA PELE DO RATO ............................................ 25
QUADRO 3 – TIPOS DE EMISSÃO, COMPRIMENTO DE ONDA, PULSO E
INDICAÇÕES DO LASER ................................................................................... 33
viii
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................ iii
ABSTRACT............................................................................................................ iv
LISTA DE FÍGURAS............................................................................................... v
LISTA DE GRÁFICOS........................................................................................... vii
LISTA DE QUADROS.......................................................................................... viii
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................. . 1
1.1 VISÃO GERAL DO PROBLEMA.................................................................... . 1
1.2 MOTIVAÇÃO.................................................................................................. . 3
1.3 OBJETIVOS................................................................................................... . 4
1.4 ORGANIZAÇÃO DA DISSERTAÇÃO ............................................................ . 4
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ . 7
2.1 REPARO DA PELE........................................................................................ . 7
2.1.1 Fase Inflamatória ................................................................................... . 8
2.1.2 Fase Proliferativa................................................................................... 14
2.1.3 Fase de Remodelamento....................................................................... 17
2.2 ESTIMULAÇÃOELÉTRICA NO REPARO TECIDUAL................................... 19
2.3 LASER............................................................................................................ 30
2.3.1Princípios Físicos.................................................................................... 31
2.3.2 Características....................................................................................... 32
2.3.3 Parâmetros de Irradiação LASER.......................................................... 33
2.3.4 Interação com Tecido Biológico............................................................. 38
2.3.5 Aplicação de Laserterapia – Base Científica da Aplicação Clínica do
LASER de Baixa Potência ...................................................................... 41
3 MATERIAS E MÉTODOS................................................................................. 49
3.1 GRUPO EXPERIMENTAL.............................................................................. 49
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMETAL................................................................. 49
3.3 ANÁLISE HISTOLÓGICA............................................................................... 51
3.4 ANÁLISE HISTOLÓGICA SEMI-QUANTITATIVA ...........................................53
3.5 ANÁLISE HISTOLÓGICA QUANTITATIVA MORFOMÉTRICA...................... 53
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA................................................................................ 54
4 RESULTADOS.................................................................................................. 57
4.1 CÉLULAS DA GRANULOSA.......................................................................... 57
4.2 VASOS NEOFORMADOS.............................................................................. 58
4.3 DENSIDADE DE COLÁGENOS TIPO I E III.................................................. 62
5 DISCUSSÃO..................................................................................................... 67
5.1 ASPECTOS GERAIS ..................................................................................... 67
5.2 DA METODOLOGIA....................................................................................... 70
5.3 SOBRE OS RESULTADOS ........................................................................... 73
5.4 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................. 77
6 CONCLUSÕES................................................................................................. 79
REFERÊNCIAS ................................................................................................... 81
ANEXOS.............................................................................................................. 97
x
CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO
1.1 VISÃO GERAL DO PROBLEMA
Qualquer interrupção na continuidade das camadas constituintes da pele
representa uma ferida. A cicatrização da ferida consiste em uma coordenada
cascata de eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a
repavimentação e a reconstituição do tecido. A cicatrização é, portanto, um processo
dinâmico que envolve fenômenos bioquímicos e fisiológicos que se comporta de
forma harmoniosa, a fim de garantir a restauração tissular (CONTRAN; KUMAR;
COLLINS, 2001). O reparo completo do tecido resulta de alternâncias sucessivas de
reações anabólicas e catabólicas que vão gerar a substituição das células destruídas
por células novas.
O processo de cicatrização envolve três estágios: inicialmente, um estágio
inflamatório, seguido por um de proliferação e finalizando com o reparo em um
estágio de remodelação
(CLARCK, 1988). De forma mais detalhada, ainda de
acordo com Clarck (1985), pode-se considerar descrição, mais detalhada, cinco
fases principais: coagulação, inflamação, proliferação, contração de ferida e
remodelação.
O processo inflamatório destrói, dilui ou engloba o agente agressor,
preparando o tecido para a reparação
(PRANDI et al.,1988). Dentre os fenômenos
envolvidos nessa reação, pode-se observar uma fase inicial com ênfase na
vascularização com neoformação de vasos, migração de leucócitos, mitose dos
fibroblastos, ação de mediadores químicos como a histamina, serotonina, bradicinina
e prostaglandina (BOULTON; MARSHALL, 1986). A fase proliferativa caracteriza-se
pela proliferação e migração dos fibroblastos e o desenvolvimento de matriz
colagenosa. A remodelação consiste na fase final do processo, em que a matriz vai
2
sendo enriquecida por fibras de colágeno, formando finalmente a cicatriz (CLARCK,
1985).
Fatores locais ou sistêmicos tais como a localização da lesão, presença de
corpos estranhos, desnutrição, diabetes e alterações vasculares entre outros, podem
influenciar negativamente qualquer uma das fases de cicatrização (SANTOS, 2002).
Porém, segundo Contran, Kumar e Collins (2001), as falhas mais importantes do
reparo são as que ocorrem nos estágios iniciais, levando à acentuação do edema, o
que reduz a proliferação vascular e diminui os elementos celulares tais como
leucócitos, macrófagos e fibroblastos. As alterações desses eventos são
responsáveis por uma baixa síntese de colágeno, além de contribuírem para
aumentar os riscos de infecções.
Atualmente, existem recursos fisioterapêuticos que agem no processo de
cicatrização, melhorando a nutrição tecidual das áreas acometidas e vizinhas às
feridas. Dentre os recursos utilizados, destacam-se a crioterapia, a radiação
ultravioleta, o ultra-som, a estimulação elétrica, o LASER de baixa intensidade e a
oxigenação hiperbárica (BAUERMANN et al. 2001).
A laserterapia tem sido utilizada no tratamento de feridas cutâneas desde a
década de 60. Acredita-se que o avanço em sua utilização e o seu êxito devem-se
às particularidades das respostas que induz nos tecidos como: redução de edema,
diminuição do processo inflamatório, aumento da fagocitose celular, aumento
na
mitose dos fibroblastos (LUBART et al., 1992; VAN BRENGEL; BAR, 1992),
aumento da síntese de colágeno e da epitelização (WATSON,
2003; LOOW ; REED,
2001; ORTIZ, et al., 2001),
aumento na síntese de mediadores químicos
(ENWEMEKA et al., 1990; YU et al., 1994) e angiogênese
(CORAZZA, 2005).
Com relação à estimulação elétrica na cicatrização de pele há fortes
evidências que confirmam a facilitação na migração de células ( ALCAIDE, 1998;
ALVAREZ et al. 1993), (FALCONE; SPADARO, 1986; SPADARO; CHASE;
WEBSTER, 1986), intra-crescimento dos fibroblastos e o alinhamento das fibras de
colágeno foram incrementados com a estimulação elétrica, além da desaceleração
sobre o crescimento das bactérias (FALCONE; SPADARO, 1986; SPADARO,
CHASE; WEBSTER, 1986; XIAOBING; WANG; SEENG, 2001). Dentro do campo de
experimentação clínica, Assimacopoulos (1968) mostrou que a estimulação elétrica,
3
quando aplicada para tratamento de úlceras causadas pelo enfraquecimento venoso,
acelera o processo de cicatrização. Estudo feito por Cheng et al. (1982) com pele de
ratos demonstrou o efeito da estimulação elétrica no aumento da adenosina
trifosfato, na síntese de proteína, bem como no transporte da membrana
plasmática (CHENG; VAN HOFF; BOCKX, 1982).
1.2 MOTIVAÇÃO
Segundo dados apresentados no 15º Encontro da Sociedade Européia de
Reparo de Pele (2006), 3% da população mundial com mais de 65 anos, sofre com
problemas relacionados à deficiência no processo de reparo de pele (Lubbers,
2006).
Dados descritos por Chen (1999) relatam que nos EUA aproximadamente 2
milhões de pessoas sofrem de algum tipo de ferida crônica, com gastos que chegam
a 2 bilhões de dólares anuais.
No Brasil, apesar da falta de registros numéricos sobre a incidência de
úlceras, considera-se, um problema importante para a saúde pública, em função da
elevada incidência e custos (PEREIRA, 2002).
A incidência de úlceras de perna é elevada, acometendo 1 a 3 % da
população de vários países da América, África e Europa (Cuzzel; Krasner, 2003).
Segundo Rogenski e Santos (2005), 45% dos pacientes internados em
hospitais brasileiros desenvolvem úlceras.
Cuzzel e Krasner (2003) salientam a existência no mercado de
aproximadamente 2.500 itens indicados para o tratamento de feridas crônicas e
agudas. Apesar das inúmeras opções para auxiliar no processo de cicatrização,
estes recursos muitas vezes são ineficazes, além de alguns produtos apresentarem
custos elevados, tornando o tratamento inviável.
A fisioterapia utiliza tecnologias de baixo custo, tais como LASER e
estimulação elétrica de baixa intensidade, como recursos de tratamento na
regeneração dos tecidos. Trabalhos publicados indicam a eficácia do LASER de He-
Ne no processo de cicatrização de pele (PARIZOTTO, 1998; BAUERMANN et al.,
2001; VINCENSI; CARVALHO, 2002; MENDEZ, 2002; WIETZILKOSKI et al., 2003;
4
SIMÕES, et al., 2006; BALDAN, 2006; SONNEWEND, 2006). Da mesma forma, a
estimulação elétrica tem sido referendada por alguns autores com a mesma função
(OWOEYE; SPEIHOLZ, 1985; CHU, 1996; BAKER, 1997; BOGIE el al., 2000;
KLOTH, 2005; GODBOUT; FRENETTE, 2006; SIMÕES, 2006). Porém os estudos
que utilizaram a corrente elétrica no processo de reparo de pele, constataram um
número limitado de ensaios com controle, falta de quantificação e comparação de
dados, além destes serem controversos no que diz respeito à intensidade, forma de
onda, tempo de aplicação e posicionamento dos eletrodos. Com relação aos estudos
sobre LASER de baixa potência, a maioria dos autores demonstra maior velocidade
no processo de cicatrização, apesar de alguns resultados contraditórios.
Diante desse cenário e da falta de estudos que comparem os resultados da
estimulação elétrica e do LASER de baixa potencia no processo de reparo tecidual,
justifica-se a continuidade de pesquisas nesta área.
1.3 OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho consiste em comparar a efetividade das
tecnologias do LASER HeNe e da estimulação elétrica de baixa intensidade, no
processo da cicatrização de feridas na pele de ratos.
Os objetivos específicos englobam:
(1) estruturar modelo metodológico experimental;
(2) aplicar protocolo experimental utilizando LASER no processo de
regeneração tecidual;
(3) aplicar protocolo experimental de estimulação elétrica no processo de
regeneração tecidual;
(4) analisar a partir do material biológico coletado os elementos relacionados
com o processo de regeneração tecidual;
(5) comparar quantitativamente células da granulosa, vasos neoformados e
fibras de colágeno dos grupos tratados com LASER, Estimulação elétrica e
Diclofenaco de sódio a partir de material biológico coletado.
5
1.4 ORGANIZAÇÃO DA DISSERTAÇÃO
O conteúdo dessa dissertação foi dividido em 6 capítulos. No capítulo 1,
apresentam-se os aspectos introdutórios sobre a problemática do reparo de pele
assim como da falta de estudos comparativos entre as técnicas de estimulação
elétrica e a radiação LASER no tratamento de reparo tecidual.
No capítulo 2, visando embasar o trabalho, descreve-se uma revisão
bibliográfica sobre o processo de reparo tecidual, enfocando os aspectos
histológicos, bioquímicos e fisiológicos relacionados ao processo inflamação-reparo.
Outro aspecto descrito no decorrer do texto abrange o mecanismo de ação da
estimulação elétrica e da radiação LASER.
No capítulo 3, descreve-se a metodologia adotada para a realização do
trabalho, com a descrição do modelo experimental e levantamento de dados.
No capitulo 4, expressam-se os resultados por meio de tabelas, gráficos e
relações estatísticas.
No capítulo 5, são discutidos os resultados encontrados defrontando com a
literatura.
6
CAPÍTULO 2
REVISÃO DE LITERATURA
Nesta seção serão abordados, inicialmente, os aspectos histológicos,
bioquímicos e fisiológicos relacionados ao processo de inflamação e reparação
tecidual, como resposta às mais diversas lesões ou irritações. Na seqüência, serão
relacionados aspectos teóricos sobre a aplicação da estimulação elétrica e do
LASER no reparo tecidual.
2.1 REPARO DE PELE
A cicatrização ou auto-reparação é um dos atributos mais importantes dos
seres vivos, representa a possibilidade de formação de estruturas que
desempenham as mesmas funções daquelas originais (NELSON, 2003).
A reparação tecidual é um assunto de interesse constante na área de saúde,
visto que o homem deve ao reparo a sua capacidade para enfrentar as lesões e
reconstruir os tecidos (CONTRAN, KUMAR; COLLINS, 2001).
As lesões, agressões ou agentes lesivos, são muito numerosos e
didaticamente são divididos em endógenos (do próprio organismo) e exógenos (do
meio ambiente) (BRASILEIRO, 2000).
Toda lesão desencadeia respostas adaptativas locais ou sistêmicas, uma
série complexa de eventos que têm a finalidade, sempre que possível, de cura e
reconstituição do tecido agredido (PRADI et al., 1988; CONTRAN, KUMAR;
COLLINS, 2001; MANDELBAUM, SANTIS; MANDELBAUM, 2003).
Alguns fatores podem reduzir, retardar ou impedir este processo. Dentre eles,
pode-se citar: infecções, presença de corpos estranhos na área lesionada,
desnutrição, alterações circulatórias conseqüentes de lesões vasculares, baixa
perfusão dos tecidos decorrentes da compressão do corpo sobre o leito, diabetes e
envelhecimento fisiológico (BRASILEIRO, 2000).
8
O reparo tecidual consiste na sucessão ou sobreposição de fase inflamatória
e reparativa consistindo, na prática, como um evento único (CONTRAN; KUMAR;
COLLINS, 2001). Na tentativa de compreender melhor esta complexa cascata de
eventos, os autores pesquisados utilizam variadas classificações e subdivisões do
processo inflamação/reparo.
Para Pereira (2004), o processo inflamatório pode ser entendido como uma
superposição e sucessão de fenômenos: irritativos, vasculares, exsudativos,
alternativos, produtivos e reparatórios.
Segundo Balbino (2005), a dinâmica dos eventos de reparação se divide em
três fases: fase inflamatória, fibroblástica e deposição da matriz extracelular e fase
de remodelamento.
2.1.1 Fase Inflamatória
A inflamação foi descrita por Cornelius Celsus no primeiro século, da Era
Cristã como sendo uma reação composta por quatro sinais: rubor, calor, tumor e dor
(CAMERON, 2003). Mais tarde, um quinto sinal clínico, a perda de função, foi
acrescentada por Virchow (1821-1902) (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001).
A inflamação é um termo derivado do latim que significa queimar. A resposta
inflamatória serve para destruir, diluir ou isolar os agentes lesivos e as células do
tecido que foram destruídas pela lesão (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001;
BRASILEIRO, 2000; CLARCK, 1988).
Segundo Pereira (2004),inflamação ou flogose é uma reação dos tecidos
vascularizados a um agente agressor caracterizado morfologicamente pela saída de
líquidos e de células do sangue para o interstício.
O processo inflamatório nos vertebrados é caracterizado como uma reação
dos vasos sanguíneos (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001). Esta resposta
hemodinâmica consiste em um fator fundamental para o processo de reparo
tecidual.
9
O primeiro sinal após uma lesão é uma constrição dos vasos sangüíneos, que
nas lesões mais leves pode durar em torno de 3 a 5 s (CONTRAN; KUMAR;
COLLINS, 2001; CAMERON, 2003; BRASILEIRO, 2000).
Por descarga adrenérgica, sinalizada por estímulos físicos (trauma) e
químicos (fragmentos de células lesadas), uma seqüência de eventos é disparada e
o sangue coagulado, diminui a hemorragia. A coagulação é precipitada pela
agregação de plaquetas, prosseguindo com sua ativação e posterior recrutamento
de novas plaquetas e pela liberação de uma “cascata” de enzimas, que convertem
protrombina em trombina, transformando o fibrinogênio em fibrina insolúvel
(BALBINO; PEREIRA e CURI, 2005). Este infiltrado forma um meio temporário que
serve para coaptar as bordas das feridas e também para atração e movimentação
de fibroblastos, células endoteliais e queratinócitos, responsáveis pelo processo de
reparo (BALBINO; PEREIRA e CURI, 2005; MANDELBAUM, S.; SANTIS;
MANDELBAUM, M.H. S, 2003).
Um aspecto de interesse em estudos mais recentes sobre inflamação diz
respeito à adesão inicial de plaquetas à superfície lesada. Segundo Balbino (2005),
a adesão das plaquetas ocorre por proteínas presentes nas suas membranas. Tais
glicoproteínas apresentam sítios de ligação para o fibrinogênio, a vitronectina, a
fibronectina e a trombospondina. Outra condição responsável pela adesão das
plaquetas é a conversão de trombospondina em TxA2 um forte agonista na
agregação plaquetária e um importante vasoconstritor.
A vasodilatação dá continuidade ao processo, sendo um acontecimento
fundamental envolvendo, inicialmente, as arteríolas seguidas pela abertura de novos
capilares e vênulas (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001).
O aumento da circulação sangüínea local é a marca registrada da inflamação
(PRANDI et al. 1988; CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001).
As alterações vasculares consistem de uma cascata de reações ativadas e
controladas por uma infinidade de mediadores químicos. Estas substâncias são
responsáveis por todos os aspectos da inflamação. Os estudos científicos, in vitro
vêm descobrindo inúmeros mediadores envolvidos no processo inflamatório. A
origem dessas substâncias são os tecidos lesionados, o processo de agregação
plaquetária e o plasma. Tais mediadores atuam principalmente na micro- circulação,
10
provocando, dentre outras modificações, o aumento da permeabilidade vascular.
Podem ser classificados em: mediadores de ação rápido-transitória e mediadores de
ação prolongada (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001; RANG, 2001).
Os mediadores de ação rápido-transitória são liberados imediatamente após a
lesão e têm ação principalmente sobre os vasos, envolvem o grupo das aminas
vasoativas, atingem um máximo em 5 a 10 min e depois desaparecem entre 15 a 30
min (RANG, 2001).
As aminas vasoativas são originadas do tecido agredido e atuam sobre a
parede vascular. Compreendem, dentre outros, a histamina e a serotonina. A
histamina é sintetizada nos granulócitos, basófilos, plaquetas e, principalmente, nos
mastócitos que liberam este mediador quando agredidos e, como conseqüência,
ocorre uma contração das células endoteliais venulares, vasodilatação e aumento da
permeabilidade vascular
(CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001; BRASILEIRO, 2000;
RANG, 2001).
A serotonina, encontrada nas plaquetas, tem uma ação semelhante, esta
amina causando vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular, mais
especificamente, das vênulas (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).
Os mediadores de ação prolongada são liberados mais tardiamente e, diante
da persistência do agente lesivo, atuam nos vasos principalmente, na quimiotaxia
celular. São mantidos por diversas horas ou por dias, dependendo da gravidade da
lesão. Dentro desta classificação, encontram-se as substâncias plasmáticas e os
mediadores de natureza lipídica (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001; RANG,
2001).
As substâncias plasmáticas estão divididas em três grandes sistemas: o
sistema das cininas (envolvendo, principalmente, a plasmina e a bradicinina), o
sistema complemento e o sistema de coagulação (representado pelo fibrinopeptídeo)
(CAMERON, 2003).
A plasmina é uma protease que digere uma ampla gama de proteínas
teciduais, tais como a fibrina, protrombrina e globulina. Sua forma inativa, o
plasminogênio é ativado por enzimas lipossômicas, quinases bacterianas, teciduais
e plasmáticas. A presença da plasmina incrementa a permeabilidade vascular
(CONTRAN; KUMAR e COLLINS, 2001).
11
A bradicinina é um pepitídeo ativado no interstício, com ação vasodilatadora
de pequenas artérias e arteríola, aumenta a permeabilidade vascular e por atuar em
terminações nervosas pode provocar dor (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001;
BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005; BRASILEIRO, 2000). A bradicinina, além de
propriedades vasoativas, induz à metabolização do ácido araquidônico, precursor
das prostaglandinas (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005; RANG, 2001). Este ácido
consiste em um composto graxo insaturado (RANG, 2001) e pode ser liberado por
inúmeros estímulos, sendo a lesão celular uma fonte importante de liberação. Sua
ação está relacionada a várias etapas do processo inflamatório, dentre elas destaca-
se a atividade quimiotáxica (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001).
O sistema do complemento é um conjunto de proteínas que se ativam em
cascata, cujas proteínas são nomeadas com números por ordem de descoberta (C
1
,
C
2
, C
3
). Este sistema é normalmente ativado por complexo antígeno-anticorpo,
servindo como mediador das lesões imunológicas e inflamatórias (CONTRAN;
KUMAR; COLLINS, 2001; BRASILEIRO, 2000; RANG, 2001). Os componentes do
complemento com atividade biológica na inflamação produzem, de maneira geral, as
seguintes reações: aumento da permeabilidade vascular e quimiotaxia dos
neutrófilos e macrófagos (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001).
O sistema de coagulação-fibrinolítica é formado por um grupo de proteínas do
plasma que, quando ativadas, transformam o fibrinogênio em fibrina por ação da
trombina; esta, por sua vez, ativa as plaquetas e cria um meio para a ligação da
vitamina K ao cálcio, formando, então, a coagulação inicial, já citada. O sistema
fibrinolítico tem ação no aumento da permeabilidade vascular, além de ação
quimiotáxica sobre os neutrófilos (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001; RANG,
2001).
Os mediadores de natureza lipídica são lipídios ácidos encontrados nas
membranas e estão envolvidos no processo de formação de prostaglandinas a partir
do ácido araquidônico (RANG, 2001). As prostaglandinas são consideradas uma
família de compostos de ácidos graxos que, na sua maioria, têm origem a partir do
ácido araquidônico. Participam das fases mais tardias da inflamação, sendo
considerados potentes vasodilatadores, que aumentam a permeabilidade vascular.
O edema inflamatório é fortemente influenciado pela ação potencializadora da
12
bradicinina sobre outro mediador químico: a histamina. E essa relação
potencializadora ocorre também sobre a dor (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001).
As prostaglandinas também estão envolvidas com o sinal inflamatório de calor,
sendo consideradas um mediador importante na regulação térmica e aparecimento
da febre em reações inflamatórias (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001; RANG,
2001).
Além da resposta hemodinâmica, os mecanismos celulares fazem parte
integrante do processo inflamatório e, consequentemente, do reparo.
Os sinais inflamatórios são resultantes da ativação de células nervosas,
estromais, vasculares e circulatórias, cuja ativação é desencadeada por estímulos
físicos ou químicos a partir das células ou fragmentos de tecidos lesados ou
mediadores inflamatórios pré-formados ou neo formados (BALBINO; PEREIRA;
CURI, 2005).
As células envolvidas na inflamação podem ser agrupadas em: células
presentes nos tecidos (endoteliais vasculares, mastócitos, e macrófagos) e células
que chegam a partir do sangue (plaquetas e leucócitos) (RANG, 2001). Os
leucócitos são ativamente móveis e se dividem em: células polimorfonucleares
(neutrófilos, eosinófilos e basófilos) e células mononucleares (monócitos e linfócitos)
(CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001; RANG, 2001).
Os mastócitos são células que estão normalmente presentes nos tecidos
lesados e secretam diversos mediadores químicos: um dos principais é a histamina,
outros são a heparina, os leucotrienos, as prostaglandinas, fator de ativação de
plaquetas, fator de crescimento neural e algumas interleucinas
(RANG, 2001).
A
histamina liberada produz vasodilatação arteríolar, aumenta a permeabilidade
vascular e possibilita a passagem das proteínas do plasma para o interstício,
especialmente, o fibrinogênio (PEREIRA, 2004). Os neutrófilos são os primeiros
tipos de leucócitos a alcançar a área inflamada, aderem às células endoteliais
vasculares, atraídos por quimiotaxia; daí migra até os agentes agressores
(CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001; RANG, 2001). Os neutrófilos participam da
resposta inflamatória com função de eliminação de microorganismos pela fagocitose,
são auxiliadas pelos macrófagos, células tradicionalmente reconhecidas como
células fagocitárias; estas, além de eliminarem fragmentos teciduais e
13
microorganismos, removem neutrófilos que perderam sua função (NEWMAN;
HENSON J.; HENSON P., 1992).
Dentre as inúmeras funções dos macrófagos no processo inflamatório,
destaca-se a de liberação de enzimas, que teriam um papel de degradar o tecido
conjuntivo, limpando a área lesada, e a liberação de inúmeros mediadores químicos
(lipídios, peptídeos, fatores de coagulação e fatores de crescimento) (CONTRAN;
KUMAR; COLLINS, 2001; BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).
Os mediadores químicos produzidos pelos macrófagos são de fundamental
importância para intensificar a migração e a ativação dos fibroblastos (principal
célula envolvida na próxima etapa – proliferativa) (BALBINO; PEREIRA; CURI,
2005).
Os eosinófilos parecem ter funções semelhantes às dos neutrófilos. Essas
células aparecem nas últimas fases do reparo. Acredita-se que elas sirvam para
degradar os mediadores químicos, função possível pela presença de uma enzima
chamada histaminase, presente nos grânulos desta célula. Esta enzima tem função
na eliminação da histamina (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001).
Os basófilos são células que têm funções semelhantes aos mastócitos, na
sua estrutura contém grânulos que são preenchidos por heparina e histamina, cuja
ação mais específica estaria ligada com as reações de hipersensibilidade (RANG,
2001). Para o interesse deste estudo, é suficiente o entendimento que em conjunto
com os mastócitos, essas células liberam histamina e heparina, importantes
mediadores do processo inflamatório, como já discutido anteriormente (CONTRAN;
KUMAR; COLLINS, 2001).
Os monócitos possuem funções que se assemelham às desempenhadas
pelos macrófagos. Estas células que são encontradas em grande quantidade nos
estágios tardios da inflamação, com atividade de fagocitose e de digestão de
invasores e de partículas estranhas (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).
Os linfonodos desempenham função secundária de defesa; são ativados a
partir do sistema linfático quando a reação inflamatória local não consegue
neutralizar a lesão.
As células endoteliais representam papel importante na resposta dos tecidos
a mecanismos patogênicos de muitas lesões. O endotélio pode ser estimulado por
14
citocinas, quimiocinas, variações do fluxo sangüíneo, variações de O
2
, mediadores
(histamina, prostaglandinas, leucotrienos). As principais contribuições dessas células
relacionam-se com a produção de substâncias que ativam a coagulação, fatores de
aderência dos leucócitos e vasomotricidade (PEREIRA, 2004).
As plaquetas são fundamentais na cicatrização. Quando ativadas, liberam
grânulos que agem como poderosos fatores pró-coagulantes: fator plaquetário 4,
serotonina, tromboxano A
2
e cálcio. Esses produtos contidos nos grânulos causam a
agregação de outras plaquetas formando um agregado, constituindo o tampão
plaquetário, fundamental na fase inicial da cicatrização (BRASILEIRO, 2004).
2.1.2 Fase Proliferativa
Esta fase caracteriza-se pela migração e proliferação de fibroblastos, células
endoteliais e pequenos vasos na área lesada, formando o tecido de granulação. Os
fibroblastos são os principais componentes do tecido de granulação, produzem e
organizam os principais componentes extracelulares. A migração e ativação do
fibroblasto ocorrem por influência de mediadores químicos produzidos
principalmente pelos macrófagos e plaquetas (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001;
BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).
O número de fibroblastos ativados desencadeia a síntese de
mucopolissacarídeos e de fibras de colágeno.
A proliferação dos fibroblastos, ou fenômeno de fibroplasia, depende da
liberação de fatores de crescimento: (1) dos fibroblastos (FGF); (2) das plaquetas
(PDGF), produzidas por macrófagos e (3) transformante beta (TGF), produzido por
linfócitos e macrófagos. Os fibroblastos proliferam, deslocam-se e iniciam o depósito
de ácido hialurônico e colágeno do tipo III, formando uma matriz extracelular fluida,
permitindo a migração de células e a formação de um ambiente propício para a
sobrevivência e diferenciação das mesmas, conhecido pelo nome de tecido de
granulação (PEREIRA, 2004).
Algumas vezes, a formação do tecido de granulação inicia-se nas primeiras
24 h, através da proliferação dos fibroblastos e das células endoteliais, no período
de 3 ou 5 dias, ocorrendo a combinação de neovascularização, fibroblastos,
15
miofibroblastos e matriz extracelular, formada por colágeno e ácido hialurônico,
dando origem a um tecido conjuntivo ricamente vascularizado que preenche a área
lesada
(BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005). Na seqüência, o depósito de colágeno
aumenta progressivamente até que, no 14.º dia após a lesão, atinge o seu pico. Em
paralelo ocorre a redução de ácido hialurônico e o predomínio de colágeno tipo I
(CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001).
Os fibroblastos sintetizam procolágeno, composto por 3 cadeias de
polipeptídios, formando tropolcolágeno. Múltiplas cadeias de tropocolágeno, formam
fibrinas de colágeno que formam filamentos de colágeno (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 1995).
O termo colágeno é genérico e pode significar diferentes tipos de formação
em cadeia compostas basicamente por glicoproteínas. Existem cerca de 20 tipos de
cadeias alfa, que são capazes de originar até 1000 tipos diferentes de colágeno, dos
quais 11 tipos já foram identificados, sendo que os mais conhecidos são os tipos I, II
e III. Nas feridas, os tipos e quantidades de colágeno são modificados dependendo
do estágio do processo de reparo (KITCHEN, 2003; BRASILEIRO, 2000). O
colágeno tipo III (embrionário) vai sendo gradualmente absorvido e substituído por
colágeno tipo I, que é do tipo fibrilar maduro. O do tipo IV normalmente é produzido
como parte da membrana basal quando a pele é lesada e o colágeno do tipo V é
depositado em torno da célula como suporte estrutural (ROCHA, 2004).
Um processo de regeneração adequado parece estar relacionado com o
equilíbrio entre a estimulação e a inibição do colágeno. O metabolismo do colágeno
pode ser afetado por citocinas como a TGF- β , IL-1 e TNF, sendo que a inibição
destas substâncias é dado pelas citocinas do tipo IFN (α,β,γ), TNF-α, e PGE
2
(KITCHEN, 2003). Os colágenos são as principais proteínas da matriz extracelular
perfazendo aproximadamente 25%. Suas fibras são birrefringentes e, portanto,
quando examinadas ao microscópio de polarização apresentam-se brilhantes contra
um fundo escuro (GUIRRO, 2002).
Segundo Carvalho (2003), as falhas que ocorrem na fase inicial do reparo da
pele são responsáveis por uma baixa síntese de colágeno.
Outra substância produzida pelos fibroblastos é o ácido hialurônico, um
polissacarídeo com característica hidrófila que auxilia na resistência do tecido de
16
granulação a compressão
(RANG, 2001) parecem facilitar a mobilidade celular além
de realimentar a produção de colágeno
(LARK; LATERRA; CULP, 1985).
Observa-se uma realimentação entre o ácido hialurônico e a proliferação de
fibroblasto, pois esse ácido é importante agente na proliferação deste tipo de célula.
O ácido hialurônico permite a atração de cátions, principalmente, o sódio,
estimulando a osmose de uma grande quantidade de água, formando um gel
hidratado que favorece o trânsito de nutrientes, hormônios e outros mediadores
químicos que também atuam na mobilidade e crescimento do fibroblasto. Toda essa
situação favorece o início da deposição de colágeno para formar a matriz
extracelular de uma ferida (PEREIRA, 2004; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 1995;
KITCHEN; BAZIN, 2003).
Os fibroblastos também sintetizam fibronectina, agente químico que
desempenha papel de facilitador da atração de fibroblastos e células endoteliais e o
aumento da ligação de fibroblastos na fibrina.
Com o número aumentado de fibroblastos e conseqüente aumento de fibras
de colágeno e de elastina, a matriz extracelular começa a ser substituída por tecido
conjuntivo mais forte e elástico. Esta fibroplasia exige a formação de vasos
sanguíneos para sua realimentação (BALBINO; PEREIRA e CURI, 2005).
Como já citado, a angiogênese é fundamental na fase proliferativa; então, um
sistema vascular extensivo será necessário para suprir a fase proliferativa, existindo
uma relação fundamental entre a quantidade de vasos na ferida, a quantidade
suficiente de oxigênio e a formação de procolágeno (CARVALHO, 2002). Para a
formação de novos vasos, serão necessários múltiplos estímulos, desencadeados
no momento da lesão e nos estágios iniciais do reparo. Inicialmente, ocorre um
brotamento de capilares, as células endoteliais migram em direção à lesão como um
cordão de células, formando o lume dentro dos cordões e o fluxo sanguíneo é
progressivamente estabelecido
(CLARCK, 1985). As pontas desses novos vasos são
muito permeáveis permitindo a infiltração de proteínas e glóbulos vermelhos para o
espaço intersticial, o que explica a persistência do edema após a fase aguda
(CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001).
As células endoteliais desempenham um papel fundamental na angiogênese,
o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o fator de crescimento dos
17
fibroblastos (FGF), estão fortemente relacionados com a formação de novos vasos
(PEREIRA, 2004). Segundo Bacit e Akin (2001), o VGEF é um dos fatores mais
importantes na angiogênese. As citocinas angiogênicas também desempenham
papel importante na neoformação de vasos, entre elas a TGF-β, TNF-α e IL-8, e as
antiangiogênicas, angiostatina e endostatina. Ocorre também anastomose e
reorganização dos vasos pré-existentes, resultando em um vasto suprimento
sanguíneo dentro do tecido de granulação.
Outro aspecto da fase proliferativa é a contração da ferida, importante para o
fechamento da mesma. A contração inicia-se logo após a lesão e
tem o seu auge em 15 dias. Quando a contração é insuficiente e lenta,
favorece ao sangramento e à infecção; porém, a contração intensa pode causar
contraturas, retrações e possíveis disfunções
(WATSON, 2003). São consideradas
duas teorias para explicar este mecanismo. A teoria da contração celular sugere, um
processo de contração da ferida, pela ação contrátil dos miofibroblastos (estruturas
já discutidas). Essas células através de atividade sincronizada, desencadeiam
retração da ferida e encolhimento da mesma (WATSON,
2003). A teoria da tração
celular sugere uma ação dos fibroblastos, cujas células exerceriam força de tração
nas fibras da matriz extracelular.
2.1.3 Fase de Remodelamento
O processo de remodelamento é considerado, didaticamente, a terceira fase
do processo de reparo, apesar da matriz iniciar seu amadurecimento quase no
mesmo tempo em que é formado. A matriz vai sendo gradualmente substituída e
remodelada nos meses e anos subseqüentes. Nos estágios iniciais, o colágeno
apresenta pouca força tensil e tem um aspecto semelhante ao de um gel. Com a
evolução do processo, as fibras de colágeno do tipo III vão sendo substituídas por
fibras do tipo I (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2001).
O colágeno imaturo (tipo III) vai gradativamente passando de um aspecto de
gel para uma estrutura com maior força tensil. Por volta do 21º dia, a ferida
apresenta uma força tensil aproximadamente igual a 20% da força normal da pele
(KITCHEN, 2003).
18
Todas as fases ou eventos descritos na figura 1 podem ser comprometidos
por fatores classificados em: sistêmicos e locais.
Entre os fatores sistêmicos, podem-se destacar a idade, o estado nutricional,
doenças associadas e o uso contínuo de medicamentos, em especial as drogas
imunossupressoras. Dentre os fatores locais, a localização anatômica da ferida,
infecção e desvitalização dos tecidos podem ser agravantes para o fechamento de
uma ferida (SANTOS, 2000).
PROLIFERAÇÃO ( 3 /5 DIAS)
Migração e proliferação celular,
angiogenese, fibroplasia
REPARAÇÃO ( meses/anos)
Maturação do colágeno
INFLAMAÇÃO (24 /48 h)
Vasoconstrição seguida de vasodilatação
Figura 1 – Esquema ilustrativo representado as 3 fases do processo inflamatório
com seus sinais característicos.
A idade gera impacto no funcionamento de todos os sistemas orgânicos,
dificultando a cicatrização. O estado nutricional pode interferir, em função da
importância das proteínas para a síntese de colágeno, proliferação epidérmica e
neovascularização, sendo que a hipoproteinúria prolonga a cicatrização e colabora
para a imunosupressão (TURNER, 1978).
As feridas podem ser classificadas, de acordo com o tempo de reparação
tissular em agudas e crônicas. Outra classificação complementar utilizada para
feridas, refere-se às estruturas anatômicas comprometidas e a profundidade da
19
lesão (SANTOS 2000). As lesões podem ocorrer por incisão, abrasão, laceração,
avulsão, perfuração, esmagamento ou queimadura (DEALEY, 1996).
Na tentativa de interferir terapeuticamente sobre o comprometimento, local ou
sistêmico, do processo de reparo tecidual, várias investigações vêm sendo
realizadas. Tratamento farmacológico e fitoterápico, exercícios fisioterapêuticos
(BERNARD et al., 2002), terapias gênicas (ISHII et al., 2004).
Entre os recursos mais utilizados, nas últimas décadas, destaca-se a
laserterapia (BAXTER, 1994). A estimulação elétrica vem sendo estudada desde o
século XVII como recurso de tratamento de feridas (WATSON, 2003); porém a partir
da década de 60 várias publicações foram popularizando esta forma de tratamento.
Nos Estados Unidos, a partir de 2002, a estimulação elétrica passou a ser paga nos
centros de saúde. Desde então, são tratados indivíduos portadores de úlceras de
pressão, úlceras venosas, arteriais e diabéticas.
2.2 ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA NO REPARO TECIDUAL
As correntes elétricas vêm sendo utilizadas em reabilitação, no tratamento de
diversas disfunções
(KITCHEN; BAZIN, 2003; CAMERON, 2003).
O estudo e o entendimento de que a condução elétrica dos sistemas
biológicos desencadeia efeitos fisiológicos e terapêuticos é tão antiga quanto a
descoberta de que os sistemas biológicos são um meio condutor (NELSON, 2003).
O médico italiano, professor de obstetrícia e anatomia Luigi Galvani (1737-
1798), foi um dos primeiros a investigar experimentalmente o fenômeno chamado
“bioeletrogênese”. Este descobriu que a corrente elétrica causava a contração dos
músculos na perna de sapos e de outros animais. Galvani observou também que a
contração muscular ocorria quando os músculos eram colocados em contato com
dois metais diferentes (zinco e cobre).
As cargas elétricas aplicadas em um corpo desencadeiam variados efeitos
que são dependentes da amplitude e da natureza da corrente elétrica
(LOOW;
REED, 2001). Estes efeitos são possíveis em função das células exibirem inúmeras
propriedades elétricas como, tensão, capacitância, fluxo de corrente e de resistência
(KITCHEN, S.; BAZIN, 2003).
20
A eletrofisiologia ganhou notoriedade, com o professor de fisiologia Emil
Heinrich Du Bois Reymond, responsável pelo desenvolvimento de um novo tipo de
galvanômetro capaz de detectar o que ele chamou de “corrente de ação”,
posteriormente chamado de “potencial de ação” (SABBATINI, 2005).
O interesse pela estimulação elétrica no processo de regeneração de pele
tem registros que datam do século XVII, quando da utilização de folhas de ouro na
cicatrização de feridas causadas por varíola (KITCHEN, S.; BAZIN, 2003).
Em 1860, Du Bois Reymond verificou que um dedo lesionado e sangrando era
eletricamente positivo em comparação ao dedo não lesionado, resultando numa
corrente elétrica na ferida de aproximadamente 1µA de amplitude (ROBINSON;
MACKLER, 2000; ALCAIDE; ALMEIDA, 2001).
Por volta de 1869, Berstein postulou que as células possuem potencial de
membrana; porém, a corrente elétrica desencadeada em um ferimento modifica-se
por alterações elétricas nas membranas celulares (BECKER; MARINO, 1982). Em
1938, Harold Burr et al. verificaram, em animais de laboratório, uma mudança no
potencial na lesão por toda a extensão de uma cicatriz (KITCHEN; BAZIN, 2003;
CHAMBARELLI, 1992).
Dois anos mais tarde, em 1940, Harold Burr et al. estudaram o potencial
elétrico de superfície em pacientes submetidos a uma cirurgia abdominal e
verificaram que o potencial elétrico sobre as cicatrizes era no início positivo e após o
quarto dia tornava-se negativo até a completa cicatrização
(GUIRRO; GUIRRO,
2000).
Em 1945, Barnes mediu o potencial elétrico das feridas em humanos.
Inicialmente, foi medido o potencial entre as pontas de dedos homólogos não
lesados (direito e esquerdo) de 70 homens. Em seguida, uma lesão foi provocada
até o sangramento das pontas dos dedos da mão esquerda (exceto o polegar).
Imediatamente após a lesão e até o término do processo de cicatrização os
potenciais eram medidos. Antes da lesão, os pontos medidos foram inferiores a
1mV, imediatamente após a lesão, variaram entre 15 e 50 mV, sendo os dedos
lesionados mais positivos (KITCHEN; BAZIN, 2003). Na mesma linha, em 1967,
Becker observou que a superfície de uma ferida cutânea é eletricamente positiva em
21
relação à pele circunjacente e esse potencial diminui com a progressão do processo
de cicatrização (BECKER; MARINO, 1982).
Em 1960, Becker demonstrou que a corrente elétrica endógena é o gatilho
que estimula o restabelecimento, crescimento e a regeneração de todos os tecidos
orgânicos vivos (BECKER; SPADARO 1972; KIRSCH; LERNER, 2002; KIRSCH;
LERNER, 2002; MERCOLA; KIRSCH, 1995).
Em 1985, Carley e Warnapel relataram que os tecidos vivos possuem
eletropotenciais de corrente contínua que regulam, em parte, o processo de
cicatrização dos tecidos. Mais tarde, em 1990, Weiss et al. e em 1991, Grifte,
comprovaram tais relatos (KIRSCH; LERNER, 2002; KIRSCH, 2002; KITCHEN;
BAZIN, 2003)
Becker e Spadaro (1972) foram responsáveis pelo desenvolvimento de um
modelo teórico para tentar explicar a relação das correntes elétricas endógenas e o
processo de cicatrização e reparação dos tecidos. Segundo os autores, uma lesão
desencadeia no sistema vivo uma série de correntes elétricas complexas, que são
responsáveis por um potencial bioelétrico alterado nos tecidos. Este efeito elétrico
local (corrente de lesão) seria o responsável pela mitose celular. Esta teoria não
descarta a importância dos mediadores químicos envolvidos na cicatrização e já
citados no capítulo 1; entretanto, sugere que as correntes elétricas endógenas sejam
responsáveis pela deflagração e direcionamento deste processo.
No decorrer do tempo, atraídos por essas várias idéias, pesquisadores que
serão citados no decorrer deste estudo, desenvolveram propostas para a utilização
de correntes elétricas exógenas, na tentativa de acelerar a cicatrização e o reparo
tecidual. Apesar da eletroterapia ser uma forma de tratamento utilizada desde o
século XVII, com o crescimento da tecnologia na área da bioengenharia,
equipamentos e novos tipos de correntes elétricas estão sendo estudadas e
aplicadas pela comunidade científica, e suas propriedades terapêuticas descritas em
vários estudos nos últimos anos
(ALCAIDE; ALMEIDA, 2001).
Em 1982, Becker e Marino, publicaram o livro “Eletromagnetism & Life”, no
qual os autores relatam a origem da bioeletricidade, a função fisiológica da energia
eletromagnética intrínseca e os efeitos da energia eletromagnética nos órgãos do
corpo humano. Descrevem vários trabalhos seus e de outros cientistas que
22
aplicaram corrente elétrica de baixa intensidade, similares às que fluem no corpo
humano e obtiveram o restabelecimento das feridas e a cicatrização óssea
(BECKER; MARINO, 1982).
Para Thomas Wing (1989), apud ROBINSON e MACKLER o papel da
eletricidade no controle dos tecidos vivos, recebeu um impulso muito grande com os
trabalhos de Becker, considerado um nome importante no campo da “regeneração
dos tecidos” (ROBINSON; MACKLER, 2000).
Lorner e Kersch, em 1981, desenvolveram um sistema chamado “terapia da
biocondutividade”, com o objetivo de gerar corrente na faixa de microamperes que
aumentava a “corrente de dano”, controlando a dor e iniciando o restabelecimento
da ferida
(KIRSCH; LERNER, 2002).
Em 1993, Wendsos Lester e Henrring, apud MERCOLA e KIRSCH, 1995
verificaram que a área ferida tem uma resistência elétrica maior que a área do seu
redor, diminuindo assim a condutância elétrica na região ferida e concluíram que a
aplicação da estimulação elétrica de baixa intensidade no local ferido aumenta o
fluxo endógeno e permite às células a recuperação da sua capacitância, reduzindo a
resistência ao fluxo endógeno e facilitando o restabelecimento da homeostase local.
Existe um volume substancial de estudos in vitro e in vivo, relacionando os
efeitos da estimulação elétrica na regeneração de tecidos em ordem cronológica.
O primeiro uso registrado de corrente elétrica em cicatrização tecidual data do
século XVII, com o uso de uma folha de ouro carregado eletricamente para diminuir
a cicatriz, provocadas pela varíola (NELSON, 2003).
Assimacopoulus, em 1968, realizou um estudo em seres humanos utilizando
a estimulação elétrica para a recuperação de feridas. Três pacientes portadores de
úlcera venosa crônica na região do pé foram tratados com corrente elétrica contínua,
com intensidade variando entre 50 e 100 µA na polaridade negativa. O pesquisador
relata o completo restabelecimento em seis semanas de tratamento
(ASSIMACOPOULOS, 1968; MERCOLA; KIRSCH, 1995; LAMPE, 1998).
Em 1974, Rowley, Mackenna e Wolcott realizaram um estudo em um grupo
de 250 pacientes com úlcera isquêmica e 15 pacientes de controle. Os pacientes
estimulados eletricamente tiveram uma aceleração na cicatrização quatro vezes
mais rápida do que o grupo controle (MERCOLA; KIRSCH, 1995). No mesmo ano,
23
Rowley observou que a estimulação elétrica por corrente contínua catódica era
bactericida, retardando o crescimento de microrganismos gran negativos e positivos.
Gault e Gatens, em 1976, selecionaram 100 pacientes portadores de úlceras
e 76 foram tratados com estimulação elétrica direta de 200 à 800 µA. Foi utilizada
polaridade negativa até o controle da infecção e, após a polaridade foi invertida. Os
pacientes tratados com estimulação elétrica apresentaram um restabelecimento
duas vezes mais rápido que os grupos de controle.
Dueland et al., em 1978, provocaram queimaduras de terceiro grau, nos
flancos de oito suínos. Cada animal teve um lado tratado diariamente com uma
corrente direta de baixa intensidade de 400µA com eletrodo de contato por 2 h pela
manhã e pela tarde até que a cura ocorresse. A estimulação era catódica em quatro
porcos e anódica em outros 4 porcos. Foram realizadas biópsias e culturas
semanais dos grupos. O tratamento local com 400µA não acelerou nem atrasou a
cura das queimaduras; e uma infecção superficial por Proteus ocorreu em 80% dos
casos. Tomaya Ohno, em 1982 (apud Van Papendorp e Joubert, 2002), tratou cães
com lesões em mandíbula com estimulação elétrica direta de 50 µA. Observou-se o
restabelecimento ósseo da mandíbula de forma acelerada.
Na Universidade de Louvain, na Bélgica, em 1982, Cheng et al. realizaram um
estudo que se tornou clássico: ”The Effects of Electric Current on ATP Generation,
Protein Synthesis and Menbrane Tansport in Rat Skin”. Neste estudo, Cheng et al.
demonstraram que efeitos da estimulação com correntes de baixa intensidade
(microamperes) são superiores às correntes na ordem de miliampere.
Foram
utilizados retalhos de peles de rato machos. Os pelos foram removidos e da parte
dorsal dos ratos foram retirados retalhos de pele medindo 5 x 6 cm (largura) e 0,5
mm (espessura) dos tecidos adiposo e subcutâneo. Foram utilizados eletrodos de
platina e fio de aço inoxidável para fixar o retalho de pele aos eletrodos. Este
sistema foi colocado em um recipiente plástico e submerso na solução de Krebs-
Ringer, pH 7,4, contendo 1.000 U de penicilina, 100mg de estreptomicina de 20mg
de gentamicina em 100ml. Sobre o retalho de pele foi aplicada corrente elétrica
entre 0,01 µA e 30.000 µA, durante uma até duas horas. A corrente contínua foi
produzida por duas baterias de 9 V e reguladas por um potenciômetro. As amostras
de controle foram submersas, nos mesmos componentes; porém, não foram
24
estimuladas eletricamente. O maior efeito estimulatório foi observado entre 50 a
1.000 µA, em que a incorporação de glicina aumentou cerca de 75% comparada
com o grupo controle. As correntes que excederam 1.000 µA inibiram a síntese de
proteínas em torno de 50%.
As correntes constantes entre 100 e 500µA elevaram o transporte de
aminoácidos em 30/40%, enquanto a estimulação com intensidades mais elevadas
reduziram a absorção do ácido aminoisobutírico. Com correntes de 10µA, este ácido
reduziu em 73% e a 300 µA a redução chegou a 20%. Nos retalhos incubados, foi
adicionada uma mistura de aminoácidos e a eletro-estimulação teve um resultado
mais pronunciado (CHENG; HOFF; BOCK, 1982), conforme descrito no quadro 1.
O estímulo elétrico com 100µA aumentou a incorporação de glicina para 72%
e do ácido alfa-aminoisobutírico para 41%, em relação ao retalho de pele não
tratado. O estímulo elétrico com 500µA aumentou a incorporação de glicina para
123% e do ácido alfa-aminoisobutírico para 90%. A síntese das proteínas teve início
com 10µA e do ácido alfa-aminoisobutírico após 100µA. Com o aumento das
correntes elétricas, o efeito inibitório do ácido alfa-aminoisobutírico ocorreu em
750µA. A eletroestimulação dos tecidos resultou em concentrações notavelmente
aumentadas de ATP. Com correntes de 50µA, os níveis de ATP triplicaram e a 1.0
mA, quintuplicaram. Com correntes de 100 a 500µA, os efeitos estimulatórios foram
similares. Com correntes acima de 1.0 mA, a concentração de ATP foi nivelada e a
5.0 mA foram reduzidos em comparação ao grupo de controle não tratado. O
quadro 2 sintetiza essas informações.
Quadro 1 - Efeito da corrente elétrica na incorporação de glicina nas proteínas e no ácido de alpha-
aminoisobutírico pela pele durante a incubação em um meio que contem o aminoácido.
Corrente Elétrica Incorporação de Glicina
(DPM/200g de tecido)
Ácido Alpha Aminoisobutírico
(DPM/200 mg de tecido)
Controle Tratamento Controle Tratamento
100 µA 7200 ±510 12400±840 20895±1050 29549±1840
Fonte: CHENG; HOFF e BOCK, 1982.
Com esse trabalho, Cheng et al. (1982) concluíram que as correntes elétricas
diretas variando de 10 a 1.0 mA aumentam a concentração de ATP nos tecidos e
25
estimulam a incorporação de aminoácido nas proteínas da pele do rato. O transporte
do aminoácido é estimulado entre 100 a 750µA. Os efeitos na produção do ATP
podem ser explicados pelas modificações nos gradientes elétricos da membrana
celular.
Quadro 2 - Os efeitos da eletroestimulação nas concentrações do ATP na pele do rato.
Tratamento Elétrico
Corrente µA
Concentração de ATP
(µmol/gm tecido)
Controle (Sem corrente) 4.2 ± 0.8
100 16.9 ± 1.9
500 20.1 ± 2.2
1000 15.0 ± 1.8
5000 3.9 ± 0.6
Fonte: CHENG; HOFF e BOCK, 1982.
Alvarez et al., em 1983, demonstraram a biosíntese do colágeno dérmico e
epidérmico, utilizando corrente contínua de 50 a 300 µA em porquinhos yorkishire.
Os autores sugerem que o campo elétrico acelera a proliferação e a migração das
células do tecido epitelial e conectivo, envolvidos no processo de regeneração e
reparo dos tecidos (ALCA IDA, 1998; ALVAREZ et al., 1983).
Em 1985, Carley e Wainapel selecionaram 30 pacientes com úlceras,
divididos em dois grupos de 15. Um grupo foi utilizado como controle e o outro foi
tratado com estímulo de corrente direta em amplitudes que variaram entre 200-800
µA. Este grupo foi estimulado por períodos de 2 h por 3 dias catodicamente e após
anódicamente. Depois de 6 semanas, o grupo tratado com estimulação elétrica
apresentou um restabelecimento de 150 a 250% mais rápido, com formação de
cicatriz mais resistente, redução de dor e diminuição da infecção na área tratada
(KIRSCH, 1995; LAMPE, 1998; ALCAIDE1998; KIRSCH; LERNER, 2002; KIRSCH,
2002; MERCOLA; CARLEY; WAINAPEL, 2003).
Spadaro, Chase e Webster (1986), realizaram uma pesquisa, em que feridas
foram inoculadas com Staphylococcus aureus, o objetivo era testar a eficiência dos
eletrodos de prata no controle da infecção. Foram utilizados eletrodos de prata em 4
aplicações diárias. Ocorreu uma inibição significativa da infecção com um estímulo
26
de 20µA. A estimulação com eletrodo de prata mostrou-se eficiente na ação anti-
microbiana (SPADARO; CHASE; WEBSTER,1986).
Em 1986, Falcone e Spadaro confirmaram os relatórios precedentes que
demonstravam uma penetração eficaz do íon de prata e de sua ação antibacteriana.
As áreas estimuladas eletricamente com eletrodos de prata mostraram estar livres
de bactérias
(FALCONE; SPADARO,1986).
Nessler e Mass, em 1987, removeram cirurgicamente oitenta tendões de
coelhos brancos, divididos em 4 grupos de vinte animais. O grupo controle não foi
tratado (n= 10). Nos grupos de tratamento foi utilizada corrente elétrica com
intensidade de 7µA. Os grupos tratados apresentaram como resultado um
incremento na atividade celular do tendão dentro de 7 dias, persistindo por 42 dias
(NESSLER; MASS, 2003).
No mesmo ano, Oweye, Spielholz, Fetto e Nelson removeram cirurgicamente
o tendão de Aquiles de 60 ratos e os dividiram em três grupos de vinte. O primeiro
grupo não foi tratado, o segundo teve seus tendões de Aquiles estimulados com
polaridade positiva e o terceiro grupo com polaridade negativa. Foi aplicada uma
corrente elétrica com intensidade de 75 µA e freqüência de 10 Hz, por 15 sessões,
duas vezes por semana. O grupo que melhor respondeu foi aquele tratado com
estimulação anódica (NESSLER; MASS, 2003; OWOEYE; SPEIHOLZ,1985)
Weiss, Eaglestein e Falanga, em 1989, estudaram o efeito da estimulação
elétrica com polaridade positiva na espessura resultante da cicatriz das feridas
cirurgicamente induzidas e relataram que a eletroterapia reduz a espessura e a
formação hipertrófica da cicatriz
(WEISS; KIRSNER; EAGLSTEIN, 2003).
No ano seguinte, Weiss et al. descreveram num artigo no qual examinam as
propriedades bioelétricas dos sistemas vivos e reviram a literatura existente sobre a
estimulação elétrica, a cura acelerada das feridas e as propriedades tensoras dos
tecidos expostos às correntes elétricas
(SPADARO; CHASE; WEBSTER,1986).
Uezono, em 1990, na Universidade de Kagoshima no Japão, observou que o
estímulo de 100µA com eletrodos de prata mostrou-se eficaz no controle da bactéria
Staphylococcus Aureus
(UEZONO, 2003).
Sersa et al., em 1992, estudaram os efeitos anti-tumorais da estimulação
elétrica associada à interleucina-2, utilizaram o cátodo inserido no tumor e ânodo ao
27
redor do tumor, aplicando intensidade de corrente de 400, 600, 1400 e 1800µA e
verificaram uma redução do crescimento do tumor
(ALCAIDE,1998).
Wood, Evans e Schallreuter em 1992 trataram 43 pacientes com úlcera de
decúbito crônica por meio de corrente elétrica pulsada com amplitudes entre 300 e
600 µA a 0,8 Hz de freqüência, inicialmente com polaridade negativa. O resultado
alcançou 58% do grupo tratado com cura em 8 semanas
(LAMPE,1998).
Pleniscar et al., em 1994, estudaram cinco pacientes com metástase ou
lesões cutâneas de melanoma primário, aplicando corrente contínua catódica de
baixa intensidade, ao nível de 1000µA, por 30 min. Após doze aplicações, observou-
se regressão do tumor em todas as lesões cutâneas do melanoma
(ALCAIDE, 1998).
Em 1994, Byl et al., na Universidade de São Francisco, USA, realizaram um
estudo em feridas de porcos, sob controle, utilizando corrente elétrica pulsada de
100µA em 0,1 Hz de freqüência, com tempo de aplicação de 1 h durante 5 dias
consecutivos. Os resultados não mostraram efetividade da estimulação elétrica na
cicatrização das feridas
(BYL, 2003).
Em 1995, Bertolucci e Grey (apud Andersen, 2004) trataram 48 pacientes
com doença degenerativa temporomandibular, os quais foram divididos em três
grupos: um grupo recebeu placebo, outro foi tratado com estimulação elétrica de
baixa intensidade e um terceiro foi tratado com LASER. Os grupos tratados com
estimulação elétrica e LASER tiveram efeitos mais significativos que o grupo tratado
com placebo, sendo o grupo do laser ligeiramente mais efetivo do que aquele com
estimulação elétrica.
Chu et al., em 1996, no Texas, USA, realizaram uma pesquisa em fase aguda
de queimaduras provocadas em ratos. Aplicaram corrente contínua entre 4 e 40 µA
e observaram que a corrente tem um efeito benéfico na redução do edema. Quando
aplicada nas primeiras 8 h, produz um menor acúmulo de edema, mas a redução
mantém-se significativa mesmo quando aplicada após 36 h depois de ocorrida a
queimadura.
Em setembro do mesmo ano, esses pesquisadores realizaram outro trabalho
com o objetivo de observar os efeitos da corrente direta a 40µA no extravasamento
de albumina do plasma sangüíneo após uma queimadura e concluíram que a
28
corrente contínua tem um efeito benéfico em reduzir o extravasamento da proteína
do plasma após uma queimadura (MATYLEVICH; CHU, 2003).
Baker et al., em 1997, estudaram os efeitos de duas formas de onda em
oitenta pacientes com úlceras abertas em decorrência de diabetes. Um grupo foi
estimulado com uma forma de onda bifásica assimétrica, outro com bifásica
simétrica e o terceiro grupo não recebeu estimulação. O grupo estimulado com
forma de onda bifásica assimétrica obteve aumento significativo da taxa de cura em
quase 60%, em um período de tratamento de 3 meses, quando comparado ao grupo
controle. A estimulação com a forma de onda bifásica simétrica não aumentou a taxa
de cura quando comparado com o grupo de controle. Concluíram que a estimulação
elétrica diariamente com a forma de onda bifásica, pulsada, assimétrica curta foi
eficaz para o aumento da taxa de cura em pacientes com úlceras abertas em
decorrência de diabetes.
Dunn et al. (1988) examinaram o efeito da corrente contínua na matriz do
colágeno implantada em feridas dérmicas de porcos da Índia e descobriram que a
corrente contínua de baixa intensidade (cátodo sobre a ferida) aumentou a migração
de fibroblastos e estimulou o realinhamento de colágeno, enquanto que com o ânodo
sobre a ferida atraiu as células inflamatórias (DUN, 1988; BRAGA et al., 2002).
Preocupados em evidenciar os efeitos da estimulação elétrica na cicatrização
de feridas crônicas, Gardner et al. (1999) desenvolveram uma meta-análise para
quantificar os efeitos da estimulação elétrica relacionando o tipo de estímulo elétrico
e o tipo de úlcera. Foram selecionados 15 estudos, enquadrados dentro dos critérios
de inclusão: estudos clínicos que utilizaram estimulação elétrica em úlceras crônicas
e que relatassem dados quantitativos do tamanho da ferida antes e após o
tratamento ou ainda um relatório do percentual de cicatrização por semana. A
especificidade desta meta-análise foi calcular e comparar a taxa de cicatrização de
diferentes tipos de feridas crônicas com diversos tipos de estimulação elétrica em 15
estudos. Como conclusão os autores afirmam haver evidências de que independente
do tipo de estimulação, a maioria das experimentações clínicas avaliadas
demonstram eficiência deste recurso no processo de cicatrização de feridas. O
percentual de cicatrização por semana foi de 22% nos grupos tratados com
estimulação elétrica contra 9% de cicatrização dos grupos controles.
29
No ano de 2000, Bogie et al. apresentaram um estudo que revê as aplicações
específicas da estimulação elétrica terapêutica para cura de feridas e prevenção de
úlceras de pressão. Os estudos preliminares foram realizados em dois centros de
pesquisa para avaliar o papel da estimulação elétrica na prevenção de úlceras de
pressão. Os estudos mostraram que a estimulação elétrica nas feridas provocou um
aumento na taxa de cura em mais de 50%, e pode produzir mudanças positivas em
curto prazo, tal como o aumento do fluxo sanguíneo
(BOGIE et al., 2003).
Kloth (2005) constatou, em uma revisão de literatura, as evidências da
estimulação elétrica na cicatrização de pele. Avaliou aspectos relacionados ao
mecanismo de ação da estimulação elétrica no metabolismo celular, na
galvanotaxia, efeitos antibactericidas e resultados clínicos em úlceras de perna.
Baseado nos achados in vitro, conclui que a estimulação elétrica nas células da
pele, produziriam a abertura dos canais de cálcio (Ca
+
) da membrana celular do
fibroblasto com conseqüente impregnação da insulina e TGF-β , aumento na
produção de colágeno e na síntese de DNA. Com relação à galvanotaxia as
investigações demonstraram que as células envolvidas nas lesões de pele migram
em direção ao ânodo ou ao cátodo, dependendo do tipo de célula. Os estudos que
evidenciaram os efeitos antibactericidas da estimulação elétrica indicam resultados
positivos sobre feridas infectadas quando utilizados intensidades na ordem de
microamperes. Os experimentos clínicos demonstraram que a estimulação
elétricacombinada com cuidados com a ferida tem resultado positivo para várias
feridas de diferentes etiologias.
Sonnewend et al. (2006) estudaram os efeitos de duas doses de estimulação
elétrica na cicatrização de feridas. Neste estudo, os autores utilizaram 21 ratos
Wistar, separados em um grupo controle (GC) e dois grupos tratados com
intensidades de 30µA e de 160µA com frequências de 0,3 Hz e 0,8 Hz. Os animais
sofreram uma lesão no dorso e foram tratados com uma única sessão de
estimulação elétrica com forma de onda quadrada, bifásica, simétrica balanceada,
com um tempo de aplicação de 30 min. A redução do diâmetro da ferida foi
verificada entre 48 e 168 h após a cirurgia. A contagem de fibroblastos foi um outro
parâmetro de análise. Os autores observaram que o grupo tratado com 160µA
apresentou uma aproximação das bordas da ferida, estatisticamente significativo em
30
relação ao controle no período de 72, 144, e 168 h, enquanto o grupo de 30µA
apresentou diferença significativa no período de 144 e 168 hs. A contagem de
fibroblastos apresentou significância no grupo de 160µA, o grupo de 30µA não
apresentou diferença significativa em relação ao controle.
Charles Godbout e Jérome Frenette (2006) desenvolveram um estudo para
validar a hipótese que a corrente direta acelera o fechamento da ferida. Usando um
modelo dinâmico in vitro de migração celular, este estudo utilizou corrente direta em
várias intensidades (85; 120; 165; 215 µA) e com reversão periódica da polaridade.
A avaliação foi realizada durante 8 h, em diferentes momentos. No grupo controle
foram utilizados os mesmos critérios, porém sem a aplicação de corrente elétrica.
Para a análise foi utilizado um vídeo microscópio, que capturou as imagens das
células a cada 30s e foram realizados cálculos sobre o tempo de movimento das
células. A direção do movimento do fibroblasto foi avaliado, medindo o valor do
cosseno do ângulo entre a posição da célula no início e no final do protocolo. Os
resultados mostraram que a estimulação elétrica não apresentou resultados na
migração celular e a estimulação prolongada, com maior intensidade, foi
responsável por uma redução no fechamento da ferida.
2.3 LASER
1
O fenômeno físico que envolve a emissão estimulada tem origem com o
trabalho publicado por Albert Einstein, em 1917, intitulado Zur Quantun Theorie der
Strabing (PIMENTA, 1990).
Vários prêmios Nobel foram conferidos na década de 60 para estudos sobre
laser. Na área de saúde, a terapia com laser de baixa potência começou a ser
estudada no final da década de 60, inicio da década de 70, sendo que um dos
pioneiros no uso do laser de baixa potência foi o Professor André Mester (1995),
também conhecido como o pai da bioestimulação. Seu grupo de estudos
desenvolveu pesquisas em animais e ensaios clínicos, indicando que o potencial de
irradiação laser de intensidade baixa, aplicada diretamente ao tecido poderia
1
O termo laser é abreviação do termo inglês Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation sendo
então o seu principio de geração fundamentado na amplificação da luz por Emissão Estimulada de Radiação
(LOOW; REED, 2001).
31
modular alguns processos biológicos, particularmente, a regeneração de tecidos
(KITCHEN; BAZIN, 2003).
Nos últimos 15 anos ocorreu um aumento progressivo de estudos e uso
clínico do laser de baixa potência (laserterapia) em inúmeras situações, incluindo o
tratamento de lesões de tecidos moles, doenças articulares, lesões tendíneas, dores
e feridas abertas
(BAXTER et al.,1991).
2.3.1 Princípios Físicos
A produção da radiação LASER ocorre pela energização do átomo, a partir da
passagem do elétron de um estado de menor para um estado de maior energia,
caindo novamente para um estado de menor energia.
De uma forma simplificada, poder-se-ia descrever que existem dois estados de
energia: estado (E
1
) de menor energia e um estado excitado de maior energia (E
2
),
depois de algum tempo, esses elétrons energizados irão cair para o estado E
1
espontaneamente, emitindo um fóton de luz. Os fótons emitidos têm propriedades
que são determinadas por diferentes níveis de energia de onde o elétron excitado
“caiu”. Em condições normais, os átomos de um material têm um número maior de
elétrons no nível de menor energia. Quando este material é bombardeado com
fótons, os átomos deste material irão absorver o fóton e os elétrons irão para
estados superiores de energia, o átomo mais excitado do que o normal é uma
condição básica para geração do efeito laser. O mecanismo de bombeamento, além
de excitar os átomos (ou moléculas), deve ser capaz de produzir inversão de
população entre dois níveis quaisquer de energia, geralmente acima do estado
fundamental. Finalmente, a realimentação faz com que a radiação efetue múltiplas
passagens de ida e volta através do meio ativo, aumentando a eficiência de geração
de fótons por emissão estimulada. Os processos de bombeamento mais utilizados
para produzir inversão de população são descargas elétricas em gases e
bombeamento óptico. No primeiro caso, os mecanismos físicos envolvidos no
bombeamento são as colisões diretas de elétrons com átomos e a transferência de
energia por colisões entre átomos diferentes (PÉCORA; BRUGNERA ,2003).
32
Para que isso ocorra, o material que produz o laser deverá estar em uma
cavidade óptica, composta de dois espelhos cuidadosamente alinhados, de modo tal
que a radiação laser reflita de um lado para o outro. Um dos espelhos é
parcialmente refletor, para permitir que a radiação seja emitida
(PIMENTA, 1990).
Meios sólidos, líquidos e gasosos têm sido utilizados para produzir luz LASER
em comprimentos de ondas específicos (COLLS, 1984).
O comprimento de onda de uma radiação laser é determinado pelo meio
usado para produzi-la, dependendo do tipo de estimulação são derivados
componentes de ondas diferentes e, conseqüentemente, diversos tipos de LASER.
2.3.2 Características
O LASER é um tipo de energia luminosa que possui características muito
próprias que o diferenciam de outras fontes similares. É uma radiação não ionizante,
monocromática, colimada e polarizada (PIMENTA, 1990; KITCHEN; BAZIN, 2003).
A monocromaticidade relaciona-se ao comprimento de onda da radiação
LASER e conseqüentemente os efeitos terapêuticos produzidos pela mesma. O
comprimento de onda e a energia do fóton relacionam-se à constante de Planck, na
qual há uma razão diretamente proporcional entre a energia e a freqüência, de
acordo com a equação (1) (COLLS, 1984):
E= h.f = hc/λ (1)
Onde:
E: energia (J)
h: constante de Planck (Js)
f: freqüência (Hz)
c: velocidade daluz no vácuo ou no ar (m/s)
λ: comprimento de onda (m)
A colimação refere-se à característica do feixe de LASER ser extremamente
organizado e se propagar na mesma direção, com cristas alinhadas e orientadas
num só plano; este grau de paralelismo, uniformidade e pouca dispersão possibilitam
a utilização da radiação laser (BAXTER, 1997).
33
A coerência representa o sincronismo das ondas de luz devido a emissão
ordenada. A radiação laser é coerente no tempo e no espaço, sendo, então,
unidirecional, permanecendo em fase por longas distâncias e com pouca dispersão
(BAXTER, 1997).
2.3.3 Parâmetros de Irradiação LASER
O uso do LASER como alternativa na terapêutica clínica foi proposto
inicialmente pelo professor André Mester, no final da década de 60 (MESTER, E.;
MESTER, A. E.; MESTER, A, 1985).
Os efeitos da radiação LASER nos tecidos biológicos relacionam-se ao
comprimento de onda, ao tipo de pulso, à densidade de energia e freqüência de
tratamento. Esses efeitos abrangem desde bioestimulação até ablação cirúrgica
(BAXTER, 1997; LOOW; REED, 2001).
O quadro 3 relaciona os diferentes tipos de emissão, seus respectivos
comprimentos de onda, tipo de pulso e efeitos.
Quadro 3 – Tipos de emissão, comprimentos de onda, pulso e indicações do LASER.
MATERIAL COMPRIMENTO DE
ONDA
Nm
REGIME DE PULSO INDICAÇÃO
CRISTAIS
Rubi 694 Pulsado/Contínuo Remoção de
tatuagem/pêlos
Alexandrite 755 Pulsado Remoção de pêlos
Neodímio-YAG 1064 Pulsado Coagulação de tumores
Hólmio-YAG 2130 Pulsado Endodontia
Érbio-YAG 2940 Pulsado Peeling
SEMICONDUTORES
AlGaInP 630-685 Continuo Bioestimulante
AsGaAl 780-870 Continuo Bioestimulante
AsGa 904 Pulsado Bioestimulante
GASES
Eximeros 193/248/308 Pulsado Cirurgia vascular e
oftálmica
Argônio 350-514 Contínuo Cirurgia oftálmica e
dermatológica
Vapor de Cobre 578 Pulsado/Contínuo Cirurgia dermatológica
HeNe 632,8 Continuo Bioestimulante
CO
2
10600 Pulsado/Continuo Cirurgia Dermatológica
Fonte: TUNER e HODE, 1999.
34
Os LASERS terapêuticos apresentam comprimentos de onda na faixa do
visível e do infravermelho. As emissões infravermelhas estão entre os comprimentos
de onda de 770nm e 1300nm, produzidos a partir do Arseneto de gálio (As-Ga), e do
Arseneto de gálio alumínio (AsGaAl). A emissão visível, por sua vez, apresenta
comprimento de onda na faixa de 632,8 nm e potência, entre 1 e 10 mW
(BAXTER,1997).
De acordo com Karu (1998), os comprimentos de onda na faixa entre 810 nm
a 840 nm apresentam maior profundidade de penetração, em função dos cromóforos
superficiais apresentarem pouca absorção nesta faixa do espectro luminoso
(KARU,1998).
Meireles (2005) desenvolveu um estudo controlado, utilizando emissão de de
AsGaAl com comprimento de onda de 660nm e 780nm no reparo de queimaduras
em dorso de ratos diabéticos e não diabéticos. O resultado demonstra um efeito
mais evidente no grupo tratado com 660nm nos animais não diabéticos, sendo que o
comprimento de onda de 780nm foi mais efetivo no grupo de animais diabéticos.
A utilização do LASER terapêutico tem sido aplicada desde a sua concepção.
Embora existam mais de uma centena de LASERs ativo, somente alguns são
utilizados em aplicações clínicas (SILFAST, 1996).
O LASER de Rubi pulsado foi o primeiro material a demonstrar aplicação em
medicina, desenvolvido em 1960 com o objetivo de tratar deslocamentos de retina. A
partir de então, pesquisadores do mundo todo desenvolveram ampla gama de
materiais capazes de emissão de radiação laser (SILFAST, 1996).
A maior parte das aplicações médicas utiliza a radiação laser na forma de
calor. O aumento da temperatura tecidual decorre da vibração rápida de átomos e
moléculas induzidas por fótons de baixa energia (região infra-vermelho).
Segundo Ribeiro (1991), a penetração da radiação laser, em geral,
diferencia-se no tecido de granulação de úlceras de pele, quando comparado à pele
normal. A penetração no tecido de granulação chega a aproximadamente 2,5 vezes
mais que a penetração da pele normal de espessura similar.
De maneira geral, há aumento gradativo da profundidade de penetração do
laser na pele quando seus comprimentos de onda são mais longos. Os
35
comprimentos de onda mais penetrantes ficam na região do vermelho (He Ne) e o
Arseneto de Gálio, perto do infravermelho.
A profundidade de penetração e absorção da radiação LASER é de difícil
quantificação em função da complexidade das camadas da pele. Cada extrato
cutâneo comporta-se de forma diferenciada em relação à reflexão, absorção,
transmissão e dispersão (PARRISCH; ANDERSON, 1983).
A reflexão na pele pode ocorrer entre os diferentes extratos, em função da
diferença do índice de reflexão. Já a absorção relaciona-se com o comprimento de
onda e cor do tecido irradiado, desta maneira, o LASER de HeNe é mais absorvido
por tecidos vascularizados e o de As Ga por tecidos pouco vascularizados
(GUIRRO; GUIRRO,2000). Outro parâmetro corresponde à refração que é uma
mudança na direção à medida que atravessa os tecidos com diferentes índices
variáveis de refração (BAXTER, 2003).
O estudo de Melo et al. (2001) ressaltam que os coeficientes de absorção e
refração são essenciais para avaliar a penetração do LASER nos tecidos. Os
autores chegaram a esta conclusão através de um estudo experimental animal, onde
foram gravadas imagens da dispersão da radiação LASER. Foram utilizados dois
comprimentos de onda (630 nm e 514 nm), sendo que todos os tecidos irradiados
demonstraram a característica isotrópica da dispersão e como conseqüência, a
diminuição da intensidade. Quando os autores analisaram e compararam a
profundidade de penetração do laser em fígados saudáveis, comparados a fígados
cirróticos, observaram uma penetração 4 vezes maior nos fígados normais. A fibrose
característica dos estados de regeneração hepática pode explicar o aumento da
dispersão da radiação (MELO, 2001).
A relação de profundidade de penetração do laser com diversas porcentagens
de energia são ressaltadas em muitos estudos (DIEZ DE LOS RIOS,1987).
Apesar da complexidade em se determinar índices de penetração, Prochazka
(2000) afirma que as radiações LASER com potência na faixa de 30mW com
emissão no espectro do infravermelho, conseguem penetrar alguns centímetros
(PROCHAZKA, 2000).
36
Tunér e Hode (2000) são mais específicos afirmando que o LASER de As-Ga
alcança profundidade de 20 a 50 mm e que no de He Ne a penetração é de 0,8 mm
(TURNER; HODE, 2000).
Para Tunér e Hode (2000), a densidade de energia e a densidade de potência
são importantes para determinar a profundidade de penetração da radiação LASER
(TURNER; HODE, 2000).
A densidade, também conhecida como irradiância representa a concentração
de potência de saída medida em W/cm
2
. A densidade de energia, também
conhecida como fluência ou dose, significa a energia por centímetro quadrado de luz
que é dirigida para uma área (TURNER; HODE, 2000). Percebe-se, portanto, que
existe uma relação de proporcionalidade direta entre a energia radiante e a potência
do equipamento, sendo a potência diretamente proporcional à variação de energia
emitida e inversamente proporcional ao intervalo de tempo de aplicação, como pode
ser observado pela equação (2) (COLLINS, 1998).
P = ∆E/ ∆t (2)
Na qual:
P: potência média (W)
∆E: variação da energia (J)
∆t: intervalo de tempo (s)
Segundo Sandoval-Ortiz et al. (2001), a dose adequada para utilização
terapêutica dos LASERS de baixa potência ainda permanece em discussão.
O cálculo da dose deve levar em consideração vários fatores como: a
distância entre a pele e o aparelho, a área total irradiada, o tipo de lentes ou
espelhos utilizados no aparelho, o tipo de fonte, a potência de saída, a divergência
do feixe, assim como a sua reflexão, transmissão, dispersão e absorção,
profundidade do tecido tratado e, finalmente, o tempo de aplicação (BECKERMAN,
1992), assim como a técnica de aplicação.
Pesquisadores como Lubart (1993), Somer (2001), Freitas (2000), defendem
a idéia que efeitos fisiológicos são dependentes da dose.
37
O efeito dose-dependente é explicado por um modelo conhecido como lei de
Arndt-Schultz, cuja teoria é representada pela curva dose versus resposta
representada na Figura 1.
Em estudos de Karu (1995,1998), o efeito dependente da dose é
demonstrado pela avaliação da mitose celular, a curva apresentava-se com um
limiar, um máximo e uma fase de descendência, comportando-se como na lei de
Arndt-Schultz. Esse comportamento, porém, não se repetiu nas bactérias. Neste
caso, ocorria uma segunda fase, que dependia do tempo de exposição
(KARU,
1998).
A dose de irradiação ou densidade de energia é o parâmetro mais importante
na laserterapia. Se a dose for muito alta (acima de 10 J/cm
2
), ou muito baixa (menos
que 0,1 J/cm
2
) não se produz efeitos de estimulação. Porém, deve-se considerar que
o efeito da irradiação é cumulativo ao longo de aplicações (KARU, 1989; SILVA,
2003).
Figura 2 - Lei de Arndt-Schultz, A: pré-limiar (repouso). B: Bioestimulação. C: Bioinibição
Fonte:
Adaptada de Baxter, 2003.
O estudo de Silva (2003) também defende que a dose de radiação é fator
decisivo na modulação da resposta biológica, podendo ser protetora ou deletéria. A
autora realizou uma pesquisa experimental, em que irradiação com laser de HeNe
na dose de 3,5 J/cm
2
exerceu ação protetora no tecido muscular, contra a ação
38
miotóxica induzida por veneno (B. Jararacussu), enquanto na dose de 10,5 J/cm
2
,
ocorreu uma ação deletéria muscular (SILVA, 2003).
Como já ressaltado em parágrafo anterior, a absorção depende,
principalmente, da constituição do tecido irradiado. Esta consiste no fator mais
importante, no que diz respeito aos efeitos biológicos e fisiológicos da aplicação do
laser na área da saúde. A absorção nos tecidos depende de uma biomolécula que,
em função da sua configuração eletrônica, é capaz de ser excitada por fótons
incidentes. Este cromóforo transforma esta energia e desencadeia os efeitos
bioquímicos, bioelétricos e bioenergéticos (KARU, 1998; BAXTER, 2003).
O processo de absorção ocorre quando o fóton cede sua energia para
moléculas que apresentam faixas características de absorção, esta estrutura-alvo
também conhecida com o nome de cromóforo tem transições específicas entre as
órbitas eletrônicas que favorecem a absorção (KARU, 1989).
Segundo Anderson e Parrish (1981), o coeficiente de absorção é a
probabilidade de um fóton ser absorvido por unidade de comprimento de trajeto. O
coeficiente de absorção depende da concentração dos cromóforos presentes no
tecido (ANDERSON; PARRISH,1981).
Na epiderme, a absorção nas ligações peptídicas das proteínas e o DNA
ocorrem mais intensamente em comprimentos de onda ultra-violeta abaixo de 300
nm. A absorção pela melanina ocorre nos comprimentos de onda de 320 a 1200 nm.
No sangue, a absorção é reduzida pela oxihemoglobina e pela hemoglobina-
reduzida, mais intensamente na faixa de 600 a 1200 nm (ANDERSON; PARRISH,
1981). Na figura 2, é possível observar os principais cromóforos e seus respectivos
espectros de absorção.
2.3.4 Interação com Tecido Biológico
Acredita-se que o laser de baixa intensidade seja responsável por efeitos
fotoquímicos, fotofísicos e fotobiológicos nas células e tecidos. A interação da luz
com tecidos e células pode estimular ou inibir determinadas funções celulares. Este
efeito parece ser particularmente evidente se a célula irradiada estiver com suas
funções debilitadas (KARU, 1989). Túner e Hode (1999) também descrevem em seu
39
trabalho que a radiação laser de baixa intensidade tem efeitos mais evidentes sobre
órgãos e tecidos enfraquecidos, assim como em pacientes que sofrem alterações
funcionais nos tecidos.
O contato inicial da radiação LASER ocorre no extrato córneo, da epiderme,
sendo que cerca de 5 a 7% da radiação é refletida (PARRISH; DEUTSCH, 1984).
Proporcionalmente à absorção e à dispersão da radiação, ocorre a atenuação dos
efeitos nos tecidos biológicos (OHSHIRO, 1991).
Os efeitos estimulantes do laser nos tecidos biológicos são explicados por
várias teorias.
Segundo Wilden e Karthein (1998), a radiação laser estimula componentes da
cadeia respiratória ativando o metabolismo celular por intensificação da produção
mitocondrial de ATP
(WILDEN; KARTHEIN,1998).
Comprimento de onda (µm)
Figura 3 – Espectro de absorção dos principais cromóforos da pele.
Fonte: Adaptada de ANDERSON e PARRISH, 1983.
A teoria fotoquímica é demonstrada em um modelo de Karu (1989), no qual o
autor observa que a radiação LASER produz mudanças químicas em fotorreceptores
das mitocôndrias, alterando o metabolismo e conduzindo à transdução (processo de
transferência de energia de um sistema para o outro) do sinal a outras partes da
40
célula que, finalmente, conduzem à foto-resposta (biomodulação). Smith (1991)
sugere modificações no modelo de Karu (1989) propondo que os efeitos foto físicos
da radiação infravermelha, iniciariam a cascata de eventos metabólicos nos canais
de cálcio da membrana celular.
Os fotorreceptores ou cromóforos seriam as estruturas responsáveis por
transformar a energia eletromagnética em energia química. São um grupo de
moléculas que podem ser enzimas, membranas ou qualquer outra substância capaz
de absorver a luz (KARU,1998). Baxter (1997) diferencia os fotorreceptores dos
cromóforos, classificando os ácidos nucléicos e aminoácidos como responsáveis por
absorver a luz e a melanina e a hemoglobina como cromóforos, os quais teriam seu
espectro de absorção na faixa da luz visível do espectro, enquanto os
fotorreceptores teriam alta absorção nos comprimentos de onda menores que do
ultravioleta.
Sandoval-Ortiz et al. (2001) afirmam que a teoria fotoquímica é mais
fundamentada para explicar a reação das células à luz. Em estudos mais recentes,
Karu (2000) refere-se às ações primária e secundária da radiação. As reações
secundárias podem ocorrer horas ou até dias após a irradiação e são creditadas à
enzima citocromo c oxidase como possível fotorreceptor, quando as células são
irradiadas com luz monocromática. A autora propõe cinco mecanismos primários,
como resultado da fotoexcitação: mudanças nas propriedades redox dos
componentes da cadeia respiratória com liberação de óxido nítrico (NO), formação
de oxigênio molecular, aquecimento transitório local de cromóforos absorvedores,
proporcionando alterações na atividade bioquímica e estrutural e aumento na
produção de superóxido com aumento subseqüente na concentração dos produtos
de sua dismutação, H
2
O
2
. No esquema ilustrado na figura 3, foram relacionados os
cinco mecanismos citados por Karu.
As reações físico/químicas iniciais induzidas pela luz nos cromóforos, são
seguidas por uma cascata de reações celulares que levam à homeostase celular. O
responsável por desencadear este processo de homeostasia é o estado redox, já
que o mesmo desempenha um papel de equilíbrio, proporcionando redução, ligada à
inibição celular e à oxidação associadas à estimulação celular. As células com pH
mais baixo (estado redox reduzido) são consideradas mais sensíveis à ação
41
estimuladora da luz, quando comparadas com aquelas em que os parâmetros são
considerados ótimos. O mecanismo de regulação redox pode explicar alguns efeitos
clínicos da radiação, por exemplo, os resultados positivos alcançados no tratamento
de feridas e inflamações crônicas, ambas caracterizadas por acidose (pH diminuído)
e hipóxia (pO
2,
pressão parcial de oxigênio diminuída) (KARU, 2000).
2.3.5 Aplicação da Terapia com LASER
Na literatura, encontra-se a indicação que o laser de baixa potência apresenta
efeitos e aplicações variadas na prática clínica, incluindo a estimulação de
regeneração de feridas, o tratamento de disfunções articulares e lesões de tecido
mole, bem como no alívio da dor (BAXTER, 2003).
Na tentativa de compreender melhor estes efeitos, numerosos estudos in
vitro, in vivo e estudos clínicos vêm sendo realizados (YU et al. 1994; Karu,
Pyatibrat; Kalendo,1995; KARU,1998; SANDOVAL-ORTIZ et al., 2001). Apesar
destes e do largo uso clínico, segundo Herascu et al. (2005) ainda existem
controvérsias sobre a eficácia desse tratamento na prática clínica. Baxter (2003)
alerta que, muito dos resultados apresentados até agora, são mal controlados com
casuística relativamente pequena, e com resultados contraditórios.
No Brasil, depara-se com um agravante com relação à eficácia clínica dos
LASERs de baixa potência. Em estudo realizado por Bertolini & Nohama (2003),
constatou-se que os equipamentos utilizados no estado do Paraná apresentavam
precárias condições para o uso clínico, do total de aparelhos avaliados, 61,29%
encontravam-se fora dos padrões de potência irradiada. Os valores nominais não
coincidiam com as medidas encontradas nos testes realizados.
A pesquisa celular tem sido utilizada por diversos estudiosos, para avaliar os
efeitos da radiação LASER de baixa potência e suas bases para uso clínico,
principalmente, na promoção e regeneração de feridas. Porém, segundo Baxter
(2003), a correlação destes estudos com a prática clínica é difícil, em função da
diferença e complexidade de um microambiente clínico, comparado aos modelos
biológicos utilizados em laboratório.
42
Figura 4 - Possíveis reações primárias com cromóforos na cadeia respiratória celular
Fonte: Adaptado de KARU, 2000.
Passarela et al. (1984) observaram que a radiação LASER de baixa potência
é capaz de gerar potenciais eletroquímicos na membrana celular e afirmam que
estes potenciais são responsáveis pela normalização da atividade da membrana. O
estudo foi realizado aplicando LASER de HeNe a 5 J/cm
2
em mitocôndrias de
hepatócitos.
Em 1988, Mester E., Mester A.E. e Mester A., por meio de um estudo in vitro,
atribuem à radiação LASER o aumento da formação de colágeno e aumento da
síntese de D.N.A.
Os efeitos do laser sobre a ativação de mediadores químicos ligados ao
processo de reparação tecidual também foi observado por um estudo in vitro
realizado por Yu et al. (1994), em que foram investigados a produção do fator de
crescimento transformador (TGFβ
2
) e do fator derivado de plaquetas (PDGF) de
fibroblastos irradiados com laser em vários comprimentos de onda: 630, 640, 650,
660 nm. Todos os valores testados aumentaram os fatores de crescimento em
relação ao controle. Além da conclusão deste estudo sobre o aumento do TGFβ
2
e
do
PDGF, os autores sugerem que a bioestimulação pelo laser pode estar associada
à regulação das células via produtos autócrinos dos diferentes fatores de
crescimento.
43
Karu, Pyatibrat e Kalendo (1995) pesquisaram os níveis de ATP em células in
vitro, após a utilização da radiação LASER de HeNe com comprimento de onda de
632,8 nm com densidade de potência de 100 J/cm
2
. Os resultados mais evidentes
ocorreram após 20 min da irradiação, chegando a um aumento de 170,8%, após
este máximo atingido, o nível de ATP foi diminuindo lentamente até chegar ao índice
do controle.
Lubart et al. (1992) avaliaram o efeito de vários comprimentos de onda sobre
a mitose em culturas de fibroblastos e observaram que utilizando LASER com
comprimento de onda de 632 nm, ocorreu um significativo aumento, em comparação
ao controle. O máximo resultado foi alcançado com uma dose de 15 J/cm
2
.
Com
doses acima de 60 J/cm
2
,
o número de mitoses diminuiu.
Em 1997 Manteifel, Bakeeva e Karu irradiaram linfócitos com LASER de
HeNe com potência de 6 mW, densidade de 5,6 W/cm
2
e densidade de energia de
56 J/cm
2
. O objetivo era observar se a ativação funcional da mitocôndria seria
acompanhada de mudanças estruturais. O achado importante deste trabalho está na
observação de mitocôndrias gigantes (85%) em relação ao grupo controle,
Justificando os achados de outros trabalhos já citados que evidenciaram o aumento
da síntese de ATP.
Os estudos de Van Breugel e Bar (1992) evidenciaram a fotobiomodulação de
fibroblastos in vitro e mostraram que o espectro de absorção de monocamadas de
fibroblastos humanos possui várias bandas de absorção, entre elas, uma centrada
em 630nm.
Nas pesquisas realizadas em animais, um dos principais aspectos de estudo
tem sido os efeitos da bioestimulação na regeneração de feridas e o reparo de
tecidos (BAXTER, 2003).
O estudo experimental de Buerger et al. (2004) teve como objetivo verificar,
através de análise histológica, a ação do LASER terapêutico de baixa potência no
processo de regeneração de uma lesão experimental por esmagamento do nervo
ciático de ratos. Na metodologia, foram utilizados 18 ratos jovens, machos, da
linhagem Wistar, divididos em 3 grupos de igual número, sendo que os três grupos
foram submetidos a lesão por esmagamento do nervo ciático. O primeiro grupo não
foi irradiado com o laser (grupo controle); o segundo foi irradiado com LASER de
44
baixa potência durante 21 dias intercaladamente; e o terceiro grupo foi irradiado com
LASER de baixa potência diariamente (durante os 21 dias). Foram realizadas
aplicações com o LASER de Alumínio-Gálio-Indio-Fósforo (GaAlInP), com a técnica
pontual em 12 pontos perpendiculares de acordo com o trajeto do nervo. Após 21
dias, os animais foram submetidos à eutanásia por sobredosagem anestésica. Após
avaliação histológica dos músculos dos 3 grupos, observou-se que no primeiro e
segundo grupos havia sinais claros de atrofia nos cortes musculares (reveladas por
infiltrados de tecido gorduroso, rarefação celular e presença de linfócitos). No grupo
que recebeu LASER diariamente (grupo 3), observou-se nas fibras nervosas,
aspecto morfológico tipicamente normal com presença de fibras mielinizadas de
grande e médio diâmetro, fibroblastos presentes e aumento de vasos sangüíneos.
Tais reações foram melhor observadas a partir do 14º dia de experimentação.
Na tentativa de explicar os efeitos do laser de baixa potência no processo
inflamatório e, conseqüentemente, na cicatrização de feridas, inúmeros trabalhos
foram realizados (MANTENFEL; BAKEEVA; KARU, 1997). Estes mesmos estudos,
focalizam também os mecanismos da interação do LASER com os tecidos, que
estão envolvidos neste processo. No entanto, Baxter (2003) alerta que muitos dos
resultados encontrados até agora, são mal controlados com casuística relativamente
pequena, e com resultados contraditórios.
A utilização da laserterapia no tratamento de feridas humanas popularizou-se
a partir da década de 60 e início da década de 70, com os trabalhos de
experimentação animal e clínica de Mester e Mester, que utilizando radiação de
laser de rubi e HeNe, obtiveram resultados na aceleração da regeneração das
feridas (BAXTER, 2003).
Dentro desse contexto, vale salientar a repercussão de um estudo publicado
por Mester et al., 1974 (apud Mester; Mester; Mester, 1985), onde foram estudados
970 voluntários, portadores de úlceras persistentes, sem respostas ao tratamento
convencional, advindas de variadas etiologias. O laser de He-Ne foi aplicado na
dose de 4 J/cm
2
, duas vezes por semana. O processo de cicatrização ocorreu em
torno da 12ª a 16ª semana, com cura total em 875 dos voluntários, melhora em 160
e apenas 85 não responderam ao tratamento.
45
Autores como Sandoval-Ortiz (2001) e Karu (1998) acreditam que o efeito do
laser sobre a inflamação ocorre, inicialmente, em função da inibição da liberação de
fatores quimiotáxicos, interferindo sobre os efeitos dos mediadores químicos
induzidos na inflamação, alterando a permeabilidade vascular com conseqüente
diminuição da quantidade de exsudato.
Albertini et al. (2002) estudaram o efeito de várias densidades de energia
laser (AsGaAl) em um modelo inflamatório agudo. O efeito da radiação LASER foi
avaliado a partir da análise do edema nas patas de ratos. O instrumento utilizado
para mensurar o volume de edema foi um hidroplestimômetro, com o qual o edema
foi medido antes e após a indução. Os resultados demonstraram entre outros
aspectos, que a densidade de energia do laser em um 1J/cm
2
e 2,5 J/cm
2
mostraram-se mais eficiente na redução de edema.
O trabalho de Honmura et al. (1992) reafirma o efeito do laser sobre a
permeabilidade vascular e diminuição do exsudato inflamatório. Este estudo foi
realizado em um modelo experimental inflamatório utilizando radiação com Laser de
AsGaAl com 10 mW de potência e de intensidade igual a 31,8 mW/cm
2
. Os
resultados demonstraram um efeito de diminuição da produção de exsudato em
grupo tratado imediatamente após a lesão e grupo tratado 3 h após a lesão.
Os níveis de prostaglandinas, secretados no processo inflamatório, foram
avaliados por Enwemeka et al. (1990), que evidenciaram efeito fotoestimulador do
laser na sua modulação.
Parizotto (1998) estudou os efeitos do laser de He-Ne no processo de reparo
tecidual de tendões de ratos, no qual evidenciou-se que uma maior produção de
colágeno ocorria com dose de 5 J/cm
2
. Entretanto, doses de 50 J/cm
2
e 0,5 J/cm
2
também apresentaram respostas favoráveis.
Bisht et al. (1999) pesquisaram o efeito do laser de He-Ne (5 mW) no
processo de reparação de pele, bem como o aumento da força de tensão do tecido
cicatricial. A análise histológica mostrou-se uma epitelização mais rápida e maior
habilidade em resistir à ruptura contra uma tensão no grupo tratado. O estudo
sugere que a maior força de tensão encontrada deve-se ao aumento da reação
fibroblástica, infiltração leucocitária e angiogênese.
46
Mendez (2002) estudou a influência da dose e do comprimento de onda do
LASER no reparo tecidual em feridas cutâneas em ratos. Em seu estudo, foram
utililizados os comprimentos de 830nm e 685nm isolados e em conjunto, com doses
de 20 J/cm
2
e 50 J/cm
2
e os animais foram divididos em sete grupos. Após a
irradiação laser, foram sacrificados de forma seriada no período de 3, 5 e 7 dias. Os
resultados obtidos, evidenciaram um aumento significativo na produção de colágeno,
quando comparados com o grupo controle. Os grupos trabalhando com os
comprimentos de onda de 830nm e 685nm com doses de 20 J/cm
2
e 50 J/cm
2
e o de
830nm com 50 J/cm
2
apresentaram o melhor resultado no final do período
experimental.
Em estudo experimental realizado por Pugliese et al.
(2003), 72 ratos Wistar,
sofreram sofrimento dorsal e em seguida, aplicação pontual de radiação laser de
baixa potência do tipo GaAsAI com diferentes densidades de energia. Os animais
foram sacrificados com 24, 48 e 72 h, como também com 5, 7 e 14 dias. Procedeu-
se à análise das secções teciduais coradas por hematoxilina-eosina, sírius vermelho
e orceína. Para a realização do estudo dos miofibroblastos, os anticorpos anti-
vimentina, anti-actina-alfa de músculo liso e anti-desmina foram usados pela técnica
de imunohistoquímica. As características ultraestruturais dessas células foram
estudadas através da microscopia eletrônica de transmissão. Observou-se que nos
grupos submetidos à laserterapia, houve maior redução de edema e infiltrado
inflamatório, assim como desgranulação de mastócitos. Com a evolução da
cicatrização, os níveis de colágeno demonstraram-se mais pronunciados nos grupos
tratados com laser. Com relação às fibras elásticas, não se constatou diferenças
entre os grupos. A marcação imunohistoquímica de miofibroblastos expressando o
fenótipo desmina/actina alfa de músculo liso foi mais evidente no 3º, 5º e 7º dias do
período pós-operatório, e foi superior nos grupos tratados. Os achados ultra
estruturais revelam a presença de células com filamentos intracitoplasmáticos,
corpos densos abaixo da membrana plasmática, rico retículo endoplasmático rugoso
e núcleo chanfrado. O grupo tratado com 4 J/cm
2
de densidade de energia
apresentou resultados mais favoráveis, comparativamente ao de 8J/cm
2
. O laser
contribuiu para a redução do edema pós-operatório, e proporcionou um aumento do
47
colágeno, em comparação ao grupo controle. Adicionalmente, induziu uma maior
expressão de miofibroblastos no leito do ferimento.
O estudo de Corazza (2005) comparou os efeitos angiogênicos da radiação
laser coerente e sem colimação, com a luz sem coerência e sem colimação (LED),
em feridas induzidas em ratos, com diferentes potências. O modelo experimental
consistia da indução de uma ferida circular no quadríceps dos animais. Os animais
foram divididos aleatoriamente em 5 grupos: LASER (660 nm) e LED (635 nm),
sendo que as doses foram ajustadas a 5 J/cm
2
e 20 J/cm
2
, além do controle. Após 6
h da indução das feridas, os grupos tratados recebiam aplicação pontual de laser,
com repetição do procedimento a cada 24 h. A angiogênese foi analisada por meio
da histomorfometria (H.E), e a contração das feridas pelo software de planimetria.
Os resultados foram analisados no 3º, 7º, 14º e 21º dias pós-lesão. Os achados
histológicos no 3º dia foram determinantes para observação de uma significativa
proliferação de vasos sanguíneos dos grupos tratados em relação ao controle. No
21º dia, os grupos tratados com potência de 5 J/cm
2
apresentavam valores
estatísticos com maior eficiência na angiogênese quando comparados com o grupo
laser a 20 J/cm
2
, sugerindo que fluências elevadas podem induzir um processo do
tipo saturação.
O estudo realizado por Baldan (2005) teve como objetivo investigar os efeitos
de diferentes doses de irradiação com laser de diodo semicondutor de baixa
potência, sobre a viabilidade de retalhos cutâneos. Neste experimento foi utilizado o
LASER vermelho de baixa potência, com 670 nm de comprimento de onda em 40
animais, divididos em 4 grupos, aleatoriamente, um grupo foi utilizado como controle
e os outros 3 grupos receberam radiação laser com doses de 2,14; 5,36 e 20,35
J/cm
2
. Foi analisada a área de necrose, sendo que os autores observaram um
melhor efeito com dose de 20,35 J/cm
2
em comparação às doses de 2,14 e 5,36
J/cm
2
.
48
CAPÍTULO 3
MATERIAIS E MÉTODOS
O estudo caracterizou-se como uma pesquisa experimental provocada,
randomizada, do tipo simples cego, sendo aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Faculdade Evangélica do Paraná, sob o registro nº 2109/05 no dia 21
de setembro de 2005 (anexo 1). Os procedimentos experimentais foram realizados
nos laboratórios da Faculdade Evangélica do Paraná, Curitiba-PR. O estudo
anátomo-patológico foi desenvolvido no laboratório da disciplina de Técnica
Operatória e Cirurgia Experimental da Pontifícia Universidade Católica do Paraná.
3.1 GRUPO EXPERIMENTAL
A amostra foi composta por 45 ratos machos adultos da linhagem Wistar
(Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia), com idade de cem a cento e trinta
dias, pesando entre 250-300 g, procedentes do biotério do Instituto de Tecnologia do
Paraná (TECPAR). Os animais foram mantidos em gaiolas individuais em
temperatura controlada, ciclo claro/escuro de 12 h, ração sólida comercial e água ad
libitum durante todo o período experimental, totalizando 15 dias (ANDERSEN, 2004).
Os animais foram pesados e randomicamente divididos em três grupos iguais
de 15 animais e, então, identificados por um número e pelos grupos LA (LASER), e
C.E (corrente elétrica) e D.C.F (diclofenaco de sódio- controle).
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Todos os procedimentos foram realizados respeitando-se os parâmetros da
Lei Federal n. 6.638 e do documento normativo do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal.
Utilizou-se anestésico Thiopental sódio na dose de 15mg/kg de peso do
animal e, ainda, 0,1ml de ketamina com concentração de 50mg/ml para cada animal,
50
ambos aplicados através da via intraperitoneal. Após anestesiar o animal, realizou-
se tricotomia dorsal, seguindo-se, então, a anti-sepsia com povidine-iodine (PVPI).
Uma incisão de 6 cm de comprimento foi marcada e confirmada com ajuda de um
paquímetro (Figura 5A). Foi utilizado um bisturi de lâmina 20 e realizada uma lesão
superficial na pele do dorso dos animais. Todas as incisões foram realizadas por
uma única pessoa, com o mesmo tipo de lâmina e no mesmo dia, com o objetivo de
manutenção da uniformidade da incisão. Os animais foram novamente colocados
individualmente em gaiolas também identificadas.
Após 24 h da lesão iniciaram-se os procedimentos de aplicação. No grupo LA
foi aplicado laser He-Ne (VR.KC 650, KROMAM
®
) com comprimento de onda em
632,28 nm, emissão contínua de 5mW, dose de 4 J/cm², por meio da técnica de
aplicação pontual, em toda a extensão da cicatriz, 30 s por ponto (Figura 5B).
O grupo C.E recebeu estimulação elétrica (Neurodyn Estetic, IBRAMED
®
),
com uma corrente elétrica pulsada bifásica, que apresentou dois padrões: o
primeiro, pulso quadrado com 24 s de duração e inversão de polaridade a cada 3 s
(figura 6), e o segundo, com duração de 16 s, apresentando pulsos retangulares,
apesar de existir simetria de carga. A morfologia do estímulo pode ser verificada no
resultado gráfico do ensaio de desempenho do estimulador elétrico (Anexo 4). A
intensidade utilizada foi de 100µΑ, por meio da técnica pontual em toda a extensão
da cicatriz, 30 s por ponto (Figura 5C).
O grupo D.C.F recebeu injeção intraperitoneal de diclofenaco de sódio, na
concentração de 3 mg/kg da massa corporal. Os animais foram tratados
diariamente, durante um período de 15 dias. A retirada das amostras foi realizada no
1º, 2º, 5º, 7º e 15º dias pós-cirurgia. Para este procedimento, os animais receberam
novamente a anestesia intraperitoneal, e as amostras de pele com 0,5 x 0,5 cm
foram cirurgicamente retiradas (Figura 5D). A ordem de retirada das amostras
seguiu um padrão de distância (caudal – cefálica – central - intermediária). O
armazenamento foi feito frascos com solução de formaldeido a 10%. Cada frasco foi
identificado com um código numérico do animal e a que grupo pertencia (LA, D.C.F e
C.E). Posteriormente as amostras foram encaminhadas para confecção das lâminas
e a realização da análise histológica.
51
3.3 ANÁLISE HISTOLÓGICA
Cada fragmento de pele, incluindo a margem do ferimento e o tecido
subcutâneo foi fixado em 10% de formalina (Reagen, RJ-Br) e embebido em parafina
(Nuclear, CAQ, SP, Brasil). Os blocos foram orientados de forma ao obter cortes
perpendiculares, com espessuras de, de 0,4 µm utilizando um micrótomo (Olympus
cut 4060, América. Inc.). As amostras foram coradas com hematoxilina-eosina e
Picrosirius. As lâminas foram identificadas, sendo que posteriormente os dados de
identificação eram ocultados para a análise dos elementos do tecido (células e
vasos), configurando um estudo simples cego. Os segmentos histológicos corados
com Hematoxilina-eosina (HE) permitiram avaliar de forma semi quantitativa os
vasos neoformados e o número de células do tecido de granulação na pele dos
animais dos três grupos. A identificação das células e vasos foi feita baseada em
Junqueira e Carneiro (1995).
Figura 5 – Procedimentos metodológicos com os grupos analisados Em (A) Incisão marcada e
confirmada com paquímetro; em (B) aplicação do LASER; em (C) aplicação da estimulação
elétrica e em (D) Retirada das amostras.
A
B
D
C
52
Para a avaliação da área e densidade de colágeno, os cortes histológicos
foram corados com Picrosirius.
As lâminas coradas com HE foram analisadas em um microscópio óptico
BX50 Modelo L 2000 A (03 Bioval) em aumento de 200 vezes e, em seguida,
fotografadas com ampliação de 100 vezes. O procedimento de leitura seguia a
seguinte padronização: Colocação da lâmina, escolha aleatória de um campo,
centralização da cicatriz, contagem do número de células, to de leitura Aquelas
coradas com Picrosirius foram analisadas com o auxilio de um microscópio BX50
com aumento de 200 vezes acoplado à uma câmara de vídeo Sony, cuja imagem
era enviada a um computador tipo Pentium, utilizando-se um aplicativo Image Pro-
Plus.
I(µA
100
9
12
15
0
3
6
t (s)
100(-)
Figura 6 - Corrente elétrica pulsada bifásica quadrada de 100 uA
com inversão de polaridade a cada 3s.
A coloração pelo método do Picrosirius faz com que grande quantidade de
moléculas do Sirius Red, de caráter ácido e alongadas, disponham-se paralelamente
às moléculas do colágeno, o que provoca aumento considerável da birrefringência
das fibras que contêm colágeno quando observadas à luz polarizada. Assim, o
método da coloração com Picrosirius associado à microscopia de polarização é um
53
método histoquímico específico para detecção de estruturas compostas de
moléculas de colágeno (
JUNQUEIRA, BIGNOLAS; BRENTANI, 1999).
3.4 ANÁLISE HISTOLÓGICA SEMI-QUANTITATIVA
Foram analisadas a quantidade de células do tecido de granulação e a
neoformação de vasos, por serem elementos que permitem avaliar a evolução do
processo de reparo tecidual. As lâminas foram focalizadas e a cicatriz centralizada
no campo. Em seguida processava-se a contagem de células e de vasos. A
codificação usada, para contagem, foi baseada em Pugliese et al. (2003) e
Wietzikoski (2005), onde ”pouco” foi considerado um número igual ou menor que 10
vasos e células do tecido de granulação; e “muito”, como um número maior do que
10 vasos ou 10 células do tecido de granulação em um campo escolhido
aleatoriamente.
3.5 ANÁLISE HISTOLÓGICA QUANTITATIVA MORFOMETRICA
A análise morfométrica foi realizada com lente polarizada para leitura do
depósito de colágeno, feita através das cores do tecido. Foram analisadas a
densidade dos colágenos tipo I e III, seguindo orientações contidas no manual para
análise de imagens do Image-Pro Plus.
O n dos grupos experimentais (LA, C.E e D.C.F) variou por dia de tratamento
(3
0
,5
0
e 7
0
). Esta variação pode ser explicada pela necessidade de se padronizar o
tamanho das amostras. Algumas lâminas, em função da falta de um padrão mínimo
de tamanho, foram excluídas. Este critério limitou o viés ou erro de observação.
Segundo Mandarin-Lacerda (1991), uma preocupação freqüente do pesquisador
que utiliza a morfometria é a possibilidade de ocorrência de erros de observação
que só podem ser excluídos com a padronização do tamanho das amostras.
Após a focalização da lâmina no microscópio, centralizou-se a cicatriz e
foram selecionados três campos aleatórios.
O aparelho foi ajustado com objetiva de 20 vezes. A imagem foi selecionada,
capturada e congelada em arquivo específico, com especificação de cada animal e
54
grupo a que pertencia (LA, D.C.F, C.E). A calibração do sistema orientou-se pela
densidade óptica de pontos (pixels) que formavam as imagens, escolhendo-se o
limiar de melhor resolução. O sistema se encontra ajustado dentro dos limites de
zero a 2, onde o zero determina a passagem total de luz e 2 a ausência total de luz.
Quanto maior for a densidade de colágeno mais próximo de 2 e quanto menor a
densidade de colágeno, mais próximo de zero.
As imagens foram, uma a uma, submetidas a uma seleção de cores, sob luz
polarizada. Inicialmente, foram selecionadas, manualmente, as cores vermelha e
alaranjada, por serem as cores que tingem o colágeno tipo I polarizado (colágeno
maduro), formado por fibras espessas e fortemente birrefringente, obtendo-se a
densidade total de colágeno tipo I nos três campos analisados. Repetiu-se o
processo, selecionando-se o amarelo e o verde, por serem as cores que tingem o
colágeno tipo III polarizado (colágeno imaturo), formado por fibras mais finas e
fracamente birrefringentes.
A observação de que colágenos dos tipos I e III mostram diferentes cores e
intensidades de birrefringência em um mesmo corte histológico, conforme descrito
por Junqueira et al., 1999, pode ser explicada pelo fato de que esses diferentes
tipos de colágenos apresentam padrões distintos de agregação física. Assim, o
colágeno do tipo I forma fibras grossas (fibras colágenas), compostas por fibrilas
grossas densamente agrupadas e, conseqüentemente, apresenta intensa
birrefringência com coloração avermelhada. O colágeno do tipo III forma fibras finas
(fibras reticulares), compostas por fibrilas finas, frouxamente dispostas mostrando
fraca birrefringência de coloração amarelo e verde. A utilização desse método
permite a identificação diferenciada das fibras de colágeno.
3.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Na primeira etapa do trabalho a análise estatística direcionou-se ao estudo
das células do tecido de granulação e dos novos vasos formados. Verificando-se a
ocorrência de muitas e poucas células do tecido de granulação e dos novos vasos
formados.
55
Foram organizadas tabelas de freqüências agrupando-as por cada dia de
tratamento ao longo do período (1º ao 15º dias) e realizada a comparação
intragrupo. Por meio da aplicação do teste Exato de Fisher investigou-se, em cada
grupo de tratamento (LASER, C.E e D.C.F) a existência de diferença significativa
entre os elementos nos dias de tratamento.
Outro aspecto analisado foi a comparação entre o número de células e vasos,
em cada dia, para os três grupos de tratamento (comparação intergrupos)
Na segunda etapa do trabalho para análise do colágeno aplicou-se o teste
Kruskal-Wallis para a densidade de colágeno tipo I (maturo) e o tipo III (imaturo),
com nível de significância adotado de 5%. Após a confecção das lâminas, foram
selecionados três campos em cada uma para a análise do colágeno, calculou-se a
média, o desvio padrão e a mediana.
O objetivo da análise foi comparar a densidade de colágeno nos grupos
submetidos aos 3 tratamentos (no 3º, 7º e 15º dia pós-lesão), assim como a
comparação, especificamente, da quantidade de colágeno tipo III (imaturo) dentro de
cada grupo entre, o 3º e 15º dias.
Na comparação da densidade de colágeno entre o 3º e o 15º dia no mesmo
grupo, foi usado o teste de Wilcoxon para amostras dependentes. Para todos os
testes, valores de p < 0,05 indicam significância estatística. Em todas as análises, o
software utilizado foi o Statistic 5.1.
56
CAPÍTULO 4
RESULTADOS
Neste capítulo, apresentam-se os registros gráficos dos resultados. Os dados
iniciais são referentes às análises de células do tecido de granulação e neovasos.
Posteriormente, organizou-se os resultados obtidos com a morfometria: densidade
de colágeno tipo III e tipo I.
4.1 CÉLULAS DO TECIDO DE GRANULAÇÂO
Na gráfico 1 estão expressos valores percentuais referentes ao número das
lâminas com “muitas” células do tecido de granulação, por dia de experimento. A
comparação foi realizada entre os grupos tratados com: LASER e diclofenaco de
sódio, corrente elétrica e LASER e corrente elétrica e diclofenaco de sódio. A tabela
contendo valores numéricos detalhados, incluindo o resultado da aplicação do teste
exato de Fisher encontra-se no apêndice 1.
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
40%
45%
50%
1º 2º 5º 7º 15º
DIA DO TRATAMENTO
OCORRÊNCIA MUITAS CÉLULAS
S
LASER
D.C.F
C.E
Gráfico-1 Comparação entre os tratamentos, LASER (LA), Diclofenaco de sódio (D.C.F) e Corrente
elétrica (C.E) relacionando a ocorrência de “muitas células” da granulosa, por grupo de tratamento,
em cada dia do experimento.
58
Ao longo do período de execução do protocolo experimental (comparação
intra-grupo), observou-se um aumento significativo do números de células do tecido
de granulação no grupo tratado com LASER (LA) entre o 2º e o 7º dia de aplicação
(p=0,0325). Nos grupos tratados com diclofenaco de sódio (D.C.F) e corrente
elétrica (C.E), não se encontrou variação significativa para as células do tecido de
granulação.
Na comparação intergrupos, constatou-se uma diferença significativa no 7º
dia pós-lesão entre o grupo tratado com LA e o grupo tratado com D.C.F (p=
0,0379): nenhuma das lâminas do grupo tratado com D.C.F apresentaram mais que
10 células do tecido de granulação; portanto, a porcentagem de muitas células é
zero, justificando a ausência da coluna do D.C.F no 7º dia (gráfico 2).
As figuras 7 e 8 são fotos dos resultados das análises microscópicas das
lâminas com coloração de Hematoxilina-eosina (HE), no grupo tratado,
respectivamente, com LASER e Diclofenaco de sódio. As imagens foram utilizadas
para a demonstração do número de células do tecido de granulação, no 7º dia de
pós-operatório. Pode-se observar um número de células do tecido de granulação
mais intenso na lâmina referente ao animal tratado com LASER, em relação ao
animal tratado com estimulação elétrica e DCF. As flechas indicativas sinalizam as
células do tecido de granulação.
4.2 VASOS NEOFORMADOS
No gráfico 2, representam-se os valores referentes ao número das lâminas
com “muitos” vasos, por dia do experimento. A comparação foi realizada entre o
grupo tratado com LASER e DCF, LASER e corrente elétrica e DCF e corrente
elétrica. A tabela contendo valores numéricos detalhados, incluindo o resultado da
aplicação do teste exato de Fisher encontra-se no apêndice 1.
Ao longo do período de tratamento, constatou-se um aumento significativo do
número de vasos no grupo tratado com laser entre o 1º e o 7º dia de aplicação (p =
0,030). No grupo tratado com DCF, houve uma variação significativa do número de
vasos entre o 5º e 15º (p=0,037) e entre o 2º e 7º (p=0,012) dias pós-lesão. No
grupo em que foi aplicada a corrente elétrica, verificou-se uma diferença significativa
com relação ao número de vasos entre o 5º e o 15º dias de tratamento (p= 0,032),
59
sendo que no 15º o número de vasos é menor. Também no 7º dia de aplicação,
verifica-se uma diferença significativa entre o grupo de animais tratados com
estimulação elétrica e o que recebeu doses diárias de DCF (p=0,0325) e do grupo
tratado com laser em relação ao controle (DCF) (p= 0,0023). Para os animais que
receberam aplicação da estimulação elétrica, o número de vasos foi maior (gráfico
2). No 7º e 15º dias, constata-se a ausência das barras referente aos grupos
tratados com DCF e estimulação elétrica, respectivamente. Este dado representa a
ausência de muitos vasos nas amostras analisadas.
CÉLULAS DO
TECIDO DE
GRANULAÇÃO
Figura 7 - Células do tecido de granulação (muitas) no 7º dia – LASER
CÉLULAS DO
TECIDO DE
GRANULAÇÃO
CÉLULAS DO
TECIDO DE
GRANULAÇÃO
Figura 8 - Células do tecido de granulação (muitas) no 7º dia – Estimulação elétrica.
60
90
OCORRÊNCIA DE MUITOS VASOS
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2º
1º 15º 5º 7º
DIA DO TRATAMENTO
LASE
R
D.C.
Gráfico 2 - Comparação entre os tratamentos LASER (LA), Diclofenaco de sódio (D.C.F) e Corrente
elétrica (C.E) relacionando a ocorrência de “muitos” vasos neoformados, por grupo de tratamento, em
cada dia de tratamento.
As figuras 9 e 10 decorrem das análises microscópicas com coloração com
Hematoxilina-eosina (HE), no grupo tratado, respectivamente, com LASER e
estimulação elétrica. As imagens foram utilizadas para a demonstração do número
de vasos, no 7º dia de pós- operatório, no grupo tratado com LASER e no grupo
tratado com corrente elétrica.
O gráfico 3 apresenta a ocorrência da porcentagem de “muitos” vasos no 7º
dia de tratamento, com uma diferença significativa entre o grupo de animais tratados
com corrente elétrica e o que recebeu doses diárias de diclofenaco de sódio
(p=0,0325). Sendo que, os animais que receberam aplicação estimulação elétrica
número de vasos foi maior.
No grupo tratado com LASER se observa o mesmo comportamento, com um
número de vasos significativamente maior em relação ao controle (D.C.F),
(p=0,0023). No grupo tratado com D.C.F, a coluna não aparece em função de não
haver mais de 10 vasos em nenhuma das lâminas analisadas.
C.E
61
Vaso
Figura 9 - Formação de vasos no 7º dia – LASER.
Vaso
Figura 10 - Formação de vasos no 7º dia - corrente elétrica.
62
90,00%
80,00%
70,00%
OCORRÊNCIA DE MUITOS
60,00%
50,00%
40,00%
30,00%
20,00%
10,00%
0,00%
LA
D.C.F. CE
GRUPOS DE TRATAMENTO
LA D.C.F. C.E
Gráfico 3- Comparação do percentual de ocorrência de muitos vasos entre os
tratamentos LASER (LA), Diclofenaco de sódio (DCF) e Corrente elétrica (C.E)
no 7º dia de tratamento
.
4.3 DENSIDADE DE COLÁGENO TIPO I E III
Para cada uma das variáveis, em cada momento da avaliação, testou-se a
hipótese nula de resultados iguais nos 3 grupos de estudo versus a hipótese
alternativa de resultados diferentes. No gráfico 4, estão representados os resultados
comparativos entre os grupos de tratamento para a densidade de colágeno tipo III,
quantificada em cada um dos três campos de análise das lâminas, no 3º, 7º e 15º dia
de pós-operatório. Os valores numéricos detalhados com a média, mediana e os
valores de p do teste estatísticos encontram-se na tabela3 do apêndice 1.
As figuras 11, 12 e 13 são resultados da análise microscópica com as lâminas
com coloração Sirius–red e polarização, respectivamente, do grupo corrente elétrica
(C.E), LASER (LA) e diclofenaco de sódio (D.C.F), no 15º dia de pós-operatório,
utilizando-se técnica de polarização. Nas figuras 11 e 12 (grupo C.E e grupo LA)
observa-se intensa tonalidade verde/amarelada, coloração específica do colágeno
tipo III (jovem). Na figura 13, grupo tratado com D.C.F a tonalidade avermelhada é
mais intensa, coloração mais específica para o colágeno tipo I (colágeno maduro).
63
60
No gráfico 5 estão representados os resultados comparativos entre os grupos
de tratamento para a densidade de colágeno tipo I, quantificada em cada um dos
três campos de análise das lâminas, no 3º, 7º e 15º dia de pós-operatório. Os
valores numéricos detalhados com a média, mediana e os valores de p do teste
estatísticos encontram-se na tabela 4 do apêndice 1.
Gráfico 5 - Comparação entre os tratamentos LASER (LA), diclofenaco de
sódio (D.C.F) e corrente elétrica (C.E), relacionando a densidade de
colágeno tipo I no 5º, 7º e 15 º dia em cada um dos grupos de tratamento.
(medianas)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
5715
DIA DE EXPERIMENTO
DENSIDADE / COLÁGENO I
L.
A
D.C.F
C.E
0
10
20
30
40
50
5º 7 15º
DIA DE EXPERIMENTO
LA
DCF
CE
DENSIDADE / COLÁGENO III
Gráfico 4 - Comparação da densidade de colágeno tipo III no 3º, 5º e 15ª dia,
em cada um dos grupos de tratamento (medianas)
64
As figuras 14, 15 e 16 são resultados da análise microscópica com coloração
Sirius–red e técnica de polarização, respectivamente, do grupo: corrente elétrica
(C.E), LASER (LA) e diclofenaco de sódio (D.C.F), no 15º dia de pós-operatório.
Observa-se coloração em tonalidade mais avermelhada, específica do colágeno tipo
I (colágeno maduro), em comparação às lâminas com densidade mais expressiva de
colágeno tipo III (colágeno jovem) que tingiram-se de tonalidade verde/amarelada
(figuras 11e12), nos grupos tratados com LASER e corrente elétrica.
Figura 11 - Morfometria polarizada mostrando fibras colágenas
tipo III, grupo CE no 15º dia - Concentração de tonalidades
verde/amarelada
Figura 12- Morfometria polarizada mostrando fibras colágenas
tipo III, grupo LA no 15º dia - Concentração de tonalidades
verde/amarelada.
65
Figura 13- Morfometria polarizada mostrando fibras
colágenas tipo III grupo DCF no 15º dia - Concentração de
tonalidade avermelhada.
Figura 14 – Morfometria polarizada mostrando
concentração de fibras colágenas tipo I no grupo CE no 15º
dia - Tonalidade avermelhada.
66
Figura 15 – Morfometria polarizada mostrando
concentração de fibras colágenas tipo I no grupo LA no 15º
dia - Tonalidade avermelhada.
Figura 16 - Morfometria polarizada mostrando concentração
de fibras colágenas tipo I no grupo DCF no 15º dia-
Tonalidade avermelhada.
CAPÍTULO 5
DISCUSSÃO
5.1 ASPECTOS GERAIS
Dentre os recursos físicos mais recentes para o tratamento de feridas
destacam-se a indicação do LASER e da estimulação elétrica como os mais
comumente utilizados para favorecer o processo de reparo da pele.
O processo de recuperação de uma ferida é quantificado pela medida de
aproximação das margens da pele. Com relação a este aspecto, na revisão de
literatura, encontram-se resultados positivos tanto para o LASER (MESTER et al.,
1974; BISHT et al., 1999; CARVALHO et al., 2002; CARVALHO et al., 2003;
WIETZILKOSKI et al., 2003; BUERGER, 2004) quanto para estimulação elétrica
(DUNN, 1998; BAKER, 1997; CHENG et al., 1982; CHU et al., 1996;
SONENEWEND et al., 2006).
Com relação à estimulação elétrica, o panorama científico parece bastante
conflitante, pode-se evidenciar que as publicações não relatam os parâmetros
exatos da estimulação, o número limitado de ensaios controlados dificultam a
quantificação e comparação dos efeitos da estimulação elétrica na reparação da
pele (WATSON, 2003). Os dados são controversos no que diz respeito à
intensidade, forma de onda, tempo de aplicação, posicionamento dos eletrodos.
Apesar desta falta de padronização nos resultados de ensaios clínicos, os efeitos
benéficos predominam e somente a minoria de estudos mostra resultados nulos ou
negativos.
O mecanismo de ação da estimulação elétrica baseia-se na teoria da
bioleletricidade, defendida por autores como: Barcker, Jaffe e Vanable (1982);
Becker (1974,1982); Weis, Kisner e Eaglsteir (2003). Estes autores evidenciaram
que a bioeletricidade endógena é responsável pela deflagração e direcionamento do
processo de reparo. Defendem, ainda, que os campos elétricos exógenos
(estimulação elétrica) teriam ação sobre o desencadeamento dos eventos químicos,
celulares e vasculares relacionados às fases da cicatrização.
68
Muitos investigadores têm evidenciado que as células envolvidas nas lesões
de pele migram em direção ao ânodo ou cátodo (galvanotaxia) dependendo do tipo
de célula (EBERHARDT,1986; BOURGUIGNON et al. 1989; DUNN, 1998; KLOTH,
2005). Dados contraditórios são relatados por Godbout e Frenette (2006), num
estudo em que não observaram o aumento da velocidade da taxa de migração do
fibroblasto por estímulos elétricos, em um modelo in vitro. A investigação realizada
por Dunn (1988) demonstrou que o uso de corrente direta com intensidades entre 20
a 100 µA, foi capaz de aumentar o número de fibroblasto para o cátodo. Kloth (2005)
destaca a galvanotaxia como um efeito fisiológico, evidenciado em 13 estudos
realizados in vitro.
Os achados de Godbout e Frenette 2006 podem ser discutidos, em função da
falta de similaridade biológica do modelo in vitro utilizado. A cicatrização é uma
seqüência orquestrada de eventos celulares e bioquímicos que prosseguem por
semanas. O estudo analisou o comportamento da migração celular nas primeiras 8
h, ignorando, também, o fato que a estimulação elétrica é mais apropriada para
reverter o potencial elétrico da lesão, em torno do 4º dia de reação inflamatória
(WEIS, 2003).
Outro efeito atribuído à estimulação elétrica ocorreria no processo de
regeneração dos tecidos através do efeito bactericida. As mudanças de pH,
liberação de íons de eletrodos de prata e o aumento da fagocitose teriam efeito no
controle da infecção (FALCONE e SPADARO, 1986; UEZENO, 1998; ROWLEY,
MACKENNA; WOLCOTT, 1974; SPADARO, CHASE; WEBSTER, 1986). Dado
contraditório observa-se no estudo de Dueland et al. (2003), que relata um efeito
nulo no processo de cicatrização, além da constatação de uma infecção por Proteus
que atingiu 80% do grupo tratado com estimulação elétrica. O modelo experimental
utilizado nesta pesquisa foi desenvolvido em porcos. A dificuldade em manter estes
animais em ambiente asséptico pode justificar este resultado negativo.
Os estudos in vitro indicam os efeitos da estimulação elétrica a nível celular.
Em especial, o estudo de Cheng (1982) mostra a ação da corrente elétrica de baixa
intensidade (100 a 500 µA) na concentração de ATP e na incorporação de
aminoácidos nas células da pele de ratos. Esses efeitos podem ser explicados pelas
modificações causadas pela estimulação elétrica, nos gradientes da membrana
69
celular. Este dado é sugestivo para suportar os efeitos, reafirmando os achados de
Cheng (1982).
Apesar do LASER de baixa potência ser uma das modalidades
bioestimulantes mais utilizadas em reabilitação e demonstrar resultados positivos
descritos na literatura, as evidências científicas ainda são limitadas e na maioria das
vezes contraditórias, necessitando explicações mais detalhadas para o seu uso
clínico.
O tratamento de úlceras crônicas foi a primeira aplicação do laser de baixa
intensidade experimentada em humanos, quando se utilizou laser HeNe, em doses
de 4 J/cm
2
(BAXTER, 2003). Devido ao êxito conseguido nesses primeiros estudos,
principalmente pela maior velocidade de cicatrização e redução da dor, a
modalidade tornou-se popular. Porém, ainda hoje, encontra-se na literatura
resultados que não confirmam cientificamente os efeitos benéficos. Acredita-se que
a não uniformidade destes resultados, deve-se ao fato de que os efeitos de
estimulação com laser de baixa potência dependem de inúmeros fatores como:
comprimento de onda, intensidade da luz irradiada, tipo de pulso, tipo e profundidade
do tecido irradiado, freqüência de tratamento (LOOW; REED, 2001), e das
condições funcionais do tecido irradiado (SILVA, 2003; TUNER; HODE,1999). No
Brasil, depara-se com um outro fator, ressaltado no trabalho de Bertolini & Nohama,
2003, que se relaciona com a eficácia terapêutica dos equipamentos para
laserterapia fabricados no Brasil no que tange aos baixos níveis de potência
apresentados nos equipamentos testados.
Várias teorias vêem sendo estruturadas para explicar as reações fisiológicas e
terapêuticas da radiação LASER nos tecidos. A teoria bioestimulante defende que a
energia absorvida atua na estimulação ou inibição de atividades bioquímicas,
fisiológicas e proliferativas. Os efeitos de estimulação ou inibição são
dose/dependentes (BAXTER, 2003). Ampliando esta idéia, Karu (1987) defende que
a bioestimulação (biomodulação) seria de natureza fotobiológica, os efeitos
inibitórios seriam causados por destruição de um ou mais citocromos da cadeia
respiratória da mitocôndria, portanto a irradiação de baixa potência resultaria numa
modulação do metabolismo celular. A teoria fotoquímica baseia-se no estudo de
vários autores, enfocando que a energia eletromagnética é transformada em
70
fotoquímica por estimulação dos cromóforos (BAXTER, 1997; KARU, 19995; KARU,
1998). Vários elementos vêm sendo propostos como cromóforos, especialmente a
citocromo c oxidase, encontrada na cadeia respiratória da mitocôndria. As reações
físico/químicas iniciais induzidas pela luz nos cromóforos são seguidas por uma
cascata de reações celulares que levam à homeostase celular (KARU, 2000).
5.2 DA METODOLOGIA
Nas referências pesquisadas sobre o emprego do LASER e da estimulação
elétrica no processo de cicatrização de feridas, pode-se destacar a variabilidade na
metodologia utilizada, assim como nos resultados encontrados.
A definição do modelo experimental é fator fundamental para aquisição de
resultados factíveis. Em estudos experimentais de cicatrização de pele, o rato é a
espécie mais comumente utilizada (CHENG, 1992; PARIZOTTO, 1998; MELO et al.,
2001; BUERGER, 2004; ALBERTINI et al., 2002; CORAZZA, 2005; SONEWEND et
al., 2006). Porém, alguns pesquisadores empregaram porquinhos Yorkishire
(ALVAREZ et al., 1983), porquinhos da Índia (DUNN et al., 1988) e porcos
(DUELAND et al., 2003; BY, 1994). A pele do porco é identificada como a que mais
se assemelha à pele humana. Porém, apresenta dificuldades com relação à
obtenção, manuseio, custos e assepsia. No trabalho realizado por Dueland (2003),
utilizando porcos observou-se infecção em 80% do grupo de animais tratado e no
controle.
Neste estudo, a opção pela utilização de ratos machos decorreu da facilidade
de obtenção e manutenção desses animais e a conseqüente possibilidade de um
grupo amostral maior. O gênero macho é justificado pela variação do ciclo hormonal
das fêmeas.
Como anestesia, foi utilizada a associação de Ketamina e thiopental. A
indicação da associação foi em função do efeito prolongado em animais com
metabolismo intenso como é o caso do rato (ANDERSEN,2004).
A utilização de um grupo controle utilizando a aplicação peritoneal de DCF é
justificada pelas exigências com a ética em pesquisa, sendo que a dose aplicada na
concentração de 3 mg/kg da massa corporal desencadeia ação analgésica
71
(ARANCIBIA, 2000). O DCF é um anti-inflamatório não hormonal (AINH) derivado do
ácido fenil-acético. Os anti-inflamatórios não hormonais (AINH) são drogas usadas
rotineiramente em clínica, freqüentemente empregados no período pós-operatório
imediato com finalidades analgésicas e antinflamatórias.
No presente estudo, as amostras de pele foram coletadas no 1º, 2º, 5º, 7º e
15º dia pós-lesão. A escolha desses dias foram definidas baseados na expectativa
de se evidenciar os efeitos do tratamento na fase inicial do processo inflamatório,
bem como o pico de formação de colágeno tipo I. Segundo Contran, Kumar e Collins
(2001), as falhas do reparo que ocorrem nos estágios iniciais, acarretam na
acentuação do edema, o que reduz a proliferação vascular e diminuição de
elementos celulares tais como leucócitos, macrófagos e fibroblastos,
desencadeando, por conseqüência, uma baixa síntese de colágeno e riscos de
infecções.
A ferida realizada no dorso do animal foi do tipo linear. Apesar deste tipo de
ferida não traduzir o ambiente característico de uma úlcera, as sucessivas retiradas
de amostras, foram importantes para simulação de um processo inflamatório
persistente, assemelhando-se ao processo de uma úlcera.
A definição da densidade de energia para aplicações da radiação LASER
continua sendo ponto de divergência. Segundo Baxter (2003) a densidade de
energia pode variar de menos de 1 para mais de 30 J/cm
2
. Especificamente para
tratamento de feridas, indica-se que a dose não deve ultrapassar 10J/cm
2
. Contrário
a esses dados os estudos realizados por Mendez (2002) e Baldan (2005), sugerem
melhores resultados no tratamento de feridas, utilizando doses acima de 10J/cm
2
.
A densidade de energia definida para este estudo baseou-se no protocolo
clássico de Mester que indica 4J/cm
2
(MESTER, E.; MESTER, A. E.; MESTER, A.,
1985).
O comprimento de onda e densidade de energia são fatores predominantes
para o sucesso da terapia laser no tratamento de cicatrização de feridas
(TURNER;
HODE, 2000). Para a realização deste estudo, foi utilizada uma emissão de LASER
de HeNe com 632,28 nm de comprimento de onda, por ser indicado na literatura
como uma faixa de irradiação que promove melhores resultados em tecidos
superficiais (LOOW; RED, 2001; KITCHEN; BAZIN, 2003). Apesar de não existir
72
consenso com relação à profundidade de penetração do laser, o que parece existir é
uma dependência da profundidade com o comprimento de onda, forma de
apresentação (pulsada ou contínua), potência de saída e técnica de aplicação. Além
destes fatores, a penetração depende também do tipo de tecido irradiado e das
condições de assepsia da pele (COLLS, 1984; VEÇOSO, 1993). Porém segundo
KARU et al. 1995, a irradiação com LASER de 633 nm aumenta o potencial de
membrana da mitocôndria com conseqüente aumento na produção de Adenosina
Trifosfato (ATP). Como critério de confiabilidade, realizou-se uma calibração prévia
do equipamento de radiação LASER para verificar o comprimento de onda (632,28
nm) (laudo em anexo) e durante os 15 dias de realização da experimentação o
equipamento foi manuseado unicamente pela pesquisadora, durante as aplicações
experimentais.
Neste estudo com a aplicação de estimulação elétrica, optou-se pela
utilização de uma corrente elétrica com pulsos bifásicos, quadrados com inversão de
polaridade a cada 3 s. Porém, quando levado o aparelho para análise morfológica da
corrente, esta não apresentou o padrão esperado. Foi observado que o circuito
gerava pulsos bifásicos com dois padrões: um durava 24 s e tinha as características
esperadas, enquanto o outro se caracterizava por uma duração de 16 s e não
apresentava simetria na forma de onda dos pulsos gerados, havendo, entretanto,
simetria de carga entre as frações positiva e negativa dos pulsos. Apesar da
modificação do padrão da onda, não se esperava interferência no resultado, em
função do longo período de permanência do estímulo em cada pulso. A intensidade
de 100 µA foi confirmada pela medida (indireta) da corrente empregando um
osciloscópio. O fabricante estipula, no manual, uma margem de erro de 15%. As
medidas realizadas da intensidade de corrente mostraram erros inferiores aos
indicados pelo fabricante. A opção por este nível de intensidade, baseou-se no
trabalho de Cheng et al. (1982), cujos resultados mostram que a estimulação elétrica
de baixa intensidade, na faixa 100 µA, aumentava a geração de Trifosfato de
Adenosina (ATP) em até 300%. Quando a intensidade era aumentada, passando a
intensidade de corrente para miliamperes, o resultado de geração de ATP regredia.
Para a análise quantitativa de colágeno, utilizaram-se lâminas confeccionadas
com material biológico coletado especificamente no 5º, 7º e 15º dia. A opção por
73
uma análise mais tardia sustenta-se em função da deposição de colágeno aumentar
progressivamente após a lesão. O processo de formação do colágeno é
característico da segunda fase do reparo (fase proliferativa), sendo dependente da
formação das células do tecido de granulação e da neoformação de vasos (fase
inflamatória). A fase proliferativa precede o tecido cicatricial maduro, tendo seu início
por volta do 3º ou 4º dia, sendo que por volta do 14º dia, após a lesão, atinge seu
pico máximo (CONTRAN, KUMAR; COLLINS, 2001; ROCHA, 2004; BALBINO;
CURI, 2005; BRASILEIRO, 2004). Reforçando esta idéia, Watson (2003) afirma que
a contração da ferida inicia-se logo após a lesão e tem seu auge no 15º dia pós-
lesão.
Neste estudo, as densidades de colágeno tipo I e tipo III foram analisadas por
meio da coloração de Picrosirius. Segundo Junqueira, Bignolas e Brentani (1979), a
análise da imagem microscópica com lente de polarização destaca o procedimento
como bom método para estudo dos diferentes tipos de colágeno. Este método de
coloração e análise determina um padrão de coloração para as fibras colágenas tipo
III em tonalidades de amarelo e verde como ilustrado na figura 7. As fibras do tipo I,
fortemente birrefringentes, apresentam-se na cor laranja e/ou vermelho (figura 9).
A avaliação do colágeno, no processo de cicatrização, vem sendo alvo de
inúmeros estudos tais como os de BOULTON; MARSHALL, 1986; BOURGUIGNON
G, WENCHE e BOURGUINON, 1989; CARVALHO, MAZZER e SIQUEIRA, 2003;
DUNN, 1998; LUBART, FRIEDMANN, PELLED e GROSSMAN, 1992; PARIZOTTO,
1998. O colágeno desempenha uma função dinâmica no processo de cicatrização. A
quantidade, o tipo dessa proteína e a determinação adequada da taxa sintetizada e
destruída são imprescindíveis para o sucesso do processo de reparo tecidual. No
tecido de granulação, verifica-se a presença de colágeno tipo I e tipo III. A
resistência da cicatriz depende do colágeno tipo I, formada por fibras mais firmes,
que do tipo III.
5.3 DOS RESULTADOS
74
A análise dos resultados compreendeu uma etapa semi-quantitativa e outra
quantitativa. Na primeira, os elementos analisados foram os neovasos e as células
do tecido de granulação. O objetivo foi verificar a influência dos tratamentos LASER,
estimulação elétrica e diclofenaco de sódio na quantidade daqueles elementos, ao
longo do experimento. O tecido de granulação tem uma composição rica em matriz
extracelular, neovasos, macrófagos e fibroblastos suportados por uma matriz frouxa
de fibronectina, ácido hialurônico e colágeno tipos I e III. As células do tecido de
granulação são responsáveis pela fibroplasia (processo de proliferação e migração
de fibroblastos – produção de colágeno). A angiogênese, por sua vez, é um aspecto
fundamental da fase proliferativa. Um rico sistema vascular é fundamental para
suprir as necessidades de formação de elementos cicatriciais, existindo uma relação
fundamental entre a quantidade de vasos na ferida, quantidade suficiente de
oxigênio e a formação de procolágeno e, consequentemente, colágeno (CONTRAN,
KUMAR; COLLINS, 2001; CARVALHO, 2002; BRASILEIRO, 2004; BALBINO, 2005).
Pode-se observar a importância e a correlação dos elementos que foram estudados
nesta pesquisa.
Os resultados encontrados neste estudo evidenciam que no 7º dia, o número
de células do tecido de granulação apresentou aumento significativo no grupo
tratado com LASER em comparação ao grupo tratado com D.C.F (p=0,037). Com
relação à neoformação de vasos, houve melhora significativa com o tratamento do
LASER HeNe comparado com o grupo tratado com D.C.F (p=0,002), observa-se
também diferença significativa, quanto a neovascularização, entre o grupo de
animais tratados com corrente elétrica e o que recebeu doses diárias de D.C.F
(p=0,032). Isso indica que no 7º dia de tratamento ocorreu um pico de atividade com
laser e corrente elétrica, dado concordante com alguns achados de pesquisa como o
trabalho de Wietzkoski et al. (2005), que demonstraram alteração entre o 3º e 7º dia.
Viscensi e Carvalho (2002) constataram uma diferença significativa na neoformação
vascular com tratamento do laser AsGa após a indução da inflamação em joelho de
rato, também no 7º dia de tratamento.
O aumento significativo no número de células do tecido de granulação no
grupo tratado com LASER justifica-se por inúmeras evidências, demonstradas em
trabalhos anteriores (LUBART et al., 1992 e VAN ; BAR, 1992). É conhecido que as
75
células são sensíveis, à radiação LASER, a energia eletromagnética estimula os
fotoreceptores (enzimas, membranas moleculares). Uma vez a luz sendo absorvida
pela célula, ocorrerá uma cascata de reações como o aumento da produção de ATP
e atividade respiratória celular agindo diretamente sobre a mitose celular (KARU et
al. 1995; BAXTER, 1997).
Na cicatrização, a neoformação de vasos corresponde a um parâmetro
importante para o perfeito encadeamento do processo (WIETZILKOSKI et al., 2003;
CARVALHO; MAZZER; SIQUEIRA, 2003; WATSON, 2003; BOULTON; MARSHALL,
1986). A angiogênese é estimulada por inúmeros estímulos. A migração de células
endoteliais em direção à lesão é um fator importante para a angiogênese (CLARK et
al., 1982)
Os possíveis mecanismos da estimulação elétrica, que podem justificar a
aceleração da formação de neovasos, observados no 7
0
dia pós lesão, podem estar
baseados em achados de pesquisa in vitro, que demonstram a migração celular
(galvanotaxia).
Foi possível observar que no 5º dia pós-lesão, o grupo tratado com
estimulação elétrica respondeu com uma formação de vasos significativa quando
comparado com o 15º dia de lesão. Este achado é concordante com o trabalho de
Weiss et al. (1999) que mostra uma neoformação de vasos mais acentuada na fase
inicial de formação do tecido de granulação. Este incremento na produção de ATP,
associado à maior permeabilidade da membrana, explicaria o efeito da estimulação
elétrica no incremento da formação de vasos, observada no 5º em relação ao 15º dia
pós-lesão (gráfico 2). Neste estudo, os dados obtidos com a corrente elétrica
sugerem que o efeito desta terapia foi mais intenso na formação de vasos nos
primeiros dias pós-lesão (1
0
e 5
0
), quando comparados com o grupo tratado com
laser (7
0
e 15
0
).
O grupo tratado com D.C.F apresentou variação significativa do número de
vasos entre o 5º e 15º (p=0,037) e entre o 2º e 7º (0,012) dias pós lesão. Este dado
reforça os achados de literatura que identificam o efeito desta droga nas fases mais
iniciais do processo inflamatório (PRANDI, 1988; RANG, 2001). O 2º e o 5º dia
apresentaram um número de vasos mais significativos que o 7º e o 15º dias.
76
Algumas evidências de pesquisa podem explicar a angiogênese significativa
observada no grupo tratado com LASER. Segundo Yu et al. 1994 diferentes
comprimentos de onda (630; 640; 650; 660 nm) foram eficientes para ativar fatores
de crescimento (TGFβ; PDGF) ligados ao processo de reparação tecidual. O TGFβ é
uma citocina com inúmeras atividades biológicas, entre elas a estimulação de
quimiotaxia, proliferação dos fibroblastos, atividade miogênica e angiogênese.
Os estudos de Passarella et al. (1988) e Cheng (1982) podem justificar os
resultados encontrados no aumento da produção de fibras colágenas tipo III,
observadas no 15º dia pós-lesão (gráfico 3) no grupo tratado com corrente elétrica.
As fibras de colágeno tipo III (jovens) são originárias do intenso metabolismo do
fibroblasto (alto consumo de ATP). A neoformação vascular serviria como fonte de
nutrientes e oxigênio, além de meio de condução de células fibroblásticas,
contribuindo sobre maneira para o processo cicatricial. Ainda dentro deste contexto a
figura 7 demonstra intensa coloração verde/amarelada nos grupos tratados com
LASER e corrente elétrica no 15º dia do experimento. Esta tonalidade é
característica de intensa densidade de colágeno. Dados que podem se somar para o
entendimento desta fibroplasia incluem: a abertura dos canais de Ca
2
na membrana
dos fibroblastos, com subseqüente impregnação de insulina nos receptores das
células e aumento na produção de colágeno e na síntese do DNA, dados
observados por Bourguignon et al., 1989. Os estudos de Passarella et al. (1988) e
Cheng et al. (1982) relatam aumento, respectivamente, de 70% e de 300 a 500% na
síntese de adenosina trisfosfato, após a utilização de estimulação elétrica. Assim,
poder-se-ia esperar que as correntes elétricas produzissem um efeito de aceleração
na fase proliferativa.
Segundo Baynes (2000), a quantidade de colágeno aumenta com o tempo e,
por volta de duas semanas, suas fibras passam a predominar na matriz extracelular.
Pode-se observar pelo gráfico 3 que houve um aumento quantitativo e progressivo
da produção de colágeno tipo III (colágeno jovem) do 7º dia em relação ao 15º dia,
nos grupos tratados com LASER e estimulação elétrica. Esse comportamento que
não é constatado no grupo tratado com D.C.F. Tal resultado era esperado em
função da terceira fase do processo de reparo, atingir seu pico após duas semanas
da lesão.
77
A terceira e última fase do processo inflamatório é conhecida como
remodelamento ou reparo. Caracteriza-se por substituição da matriz extracelular. Na
proporção em que o tecido cicatricial amadurece o colágeno maduro (tipo I) aumenta
gradativamente. Parcialmente, o colágeno tipo III (imaturo) vai sendo absorvido e
substituído por um tipo de colágeno mais resistente. Analisando o gráfico 4,
constata-se esta tendência nos grupos tratados com LASER e estimulação elétrica.
Este estudo, direcionou-se especificamente à avaliação das primeiras fases do
processo inflamação/reparo; portanto, as curvas apresentam comportamento
esperado, com valores mais expressivos referentes ao colágeno tipo III (gráfico 4) e
valores menos expressivos de colágeno tipo I (gráfico 5).
Os dados semi-quantitativos e quantitativos, obtidos neste estudo, indicam
resultados favoráveis tanto para o LASER quanto para a estimulação elétrica quando
comparados com o grupo controle.
5.4 SUGESTÕES PARA FUTUROS TRABALHOS
Os processos ulcerativos cutâneos são responsáveis por um elevado índice
de mortalidade/morbidade. Apesar das muitas opções para acelerar o processo de
cicatrização, estes recursos são caros e muitas vezes ineficientes. O tratamento
aplicando LASER e estimilação elétrica, apesar de serem utilizados com o objetivo
de acelerar o processo de reparação tecidual, ainda necessitam de mais estudos, já
que os resultados clínicos dependem de inúmeras variáveis.
Algumas questões merecem ser objeto de novas pesquisas. Neste estudo
foi desenvolvido um modelo experimental com uma ferida linear, este tipo de lesão
não traduz um modelo ideal para o estudo da reação inflamatória em úlceras. Em
novos estudos, com objetivo de estudar os efeitos dos recursos terapêuticos
aplicados em úlceras, sugere-se o desenvolvimento de uma lesão por avulsão. Esse
modelo experimental poderia simular, de forma mais adequado o processo
inflamatório de uma úlcera. Além disso, pode-se destacar a necessidade da
realização de estudos mais aprofundados para a compreensão dos mecanismos de
ação da radiação LASER e da corrente elétrica nos tecidos biológicos.
78
Tendo o conhecimento das inúmeras variáveis físicas relacionadas com a
aplicação da eletroestimulação e da laserterapia no reparo de pele e sua
repercussão direta sobre a aplicação clínica, sugere-se extensão dos estudos
correlacionando: (1) diferentes comprimentos de onda da radiação LASER; (2)
diferentes densidades de energia da radiação LASER; (3) diferentes intensidades de
estimulação elétrica; (4) variações no tempo de aplicação da estimulação elétrica;
(5) análise dos efeitos da aplicação conjunta e seqüencial da estimulação elétrica e
do LASER no processo de reparação tecidual.
CAPÍTULO 6
CONCLUSÕES
A análise semiquantitativa indica um pico de ação do LASER e da
estimulação elétrica na neoformação de vasos no sétimo dia pós-lesão, quando
comparados ao grupo tratado com diclofenaco de sódio (controle). Com relação às
células do tecido granulação, o grupo tratado com LASER apresentou maior
efetividade na proliferação celular, quando comparado com grupo controle.
A análise quantitativa apresentou valores crescentes de colágeno tipo III
(imaturo) do 7º em relação ao 15º dia nos grupos tratados com LASER e
estimulação elétrica, quando comparados ao grupo controle.
A análise semi-quantitativa, somada à análise quantitativa, mostrou que o
LASER e a estimulação elétrica podem ser aplicados no processo de reparação de
feridas na pele de ratos com igual eficácia, quando comparados ao controle (D.C.F).
Pelos dados coletados, há um indicativo terapêutico de que uma aplicação
conjugada de estimulação elétrica e do LASER proporcionariam resultados mais
efetivos e mais rápidos no processo de cicatrização de feridas.
80
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APÊNDICE 1
Tabela 1: Resultados da análise das lâminas, mostrando os valores percentuais comparativos do
número de “muitas” células e “poucas” células da granulosa nos grupos de tratamento.
Dia Células
LA
(%)
D.C.F(%) P Células LA C.E P Células D.C.F C.E P
Muitas 16,7
20
,
0
Muitas 16,7 25,5 Muitas 20,0 25,5
1º
Poucas 83,3
80,0
1,0000
Poucas 83,3 75,0
1,0000
Poucas 80,0 75,0
1,000
Muitas 16,7 45,5 Muitas 16,7 20,0 Muitas 45,5 20,0
2º
Poucas 83,3 54,5
1,930
Poucas 83,3 80,0
1,0000
Poucas 54,5 80,0
0,3615
Muitas 16,7 45,5 Muitas 16,7 27,3 Muitas 45,5 27,3
5º
Poucas 83,3 54,4
0,1930
Poucas 83,3 72,7
0,6404
Poucas 54,4 72,7
0,6594
Muitas 45,5 0,00 Muitas 45,5 30,0 Muitas 0,00 30,0
7º
Poucas 54,5 100,0
*
0,0379
Poucas 54,5 70,0
0,6594
Poucas 100,0 70,0
0,2105
Muitas 30,0 11,0 Muitas 30,0 25,0 Muitas 11,0 25,0
15º
Poucas 70,0 88,9
0,5820
Poucas 70,0 75,0
1,0000
Poucas 88,9 75,0
1,000
LA : LASER
D.C.F: Diclofenaco de sódio
C.E: corrente elétrica
P: resultado aplicação do teste Exato de Fisher
* valor com significância estatística
Tabela 2: Resultados da análise das lâminas, demonstrando os valores comparativos do número de
“muitos” vasos e “poucas” vasos nos grupos de tratamento.
Dia Vasos LA (%) D.C.F (%) P Vasos LA C.E P Vasos D.C.F C.E P
Muitas 30,8 63,6 Muitas 30,8 46,2 Muitas 63,6 46,2
1º
Poucas 69,2 36,4
0,2173
Poucas 69,2 53,8
0,6882
Poucas 36,4 53,8
0,4442
Muitas 45,5 54,5 Muitas 45,5 40,0 Muitas 54,5 40,0
2º
Poucas 54,5 45,5
1,0000
Poucas 54,5 60,0
1,0000
Poucas 45,5 60,0
0,6699
Muitas 30,0 66,7 Muitas 30,0 58,3 Muitas 66,7 58,3
5º
Poucas 70,0 33,3
0,1984
Poucas 70,0 41,7
0,1984
Poucas 33,3 41,7
1,000
Muitas 77,8 0,00 Muitas 77,8 62,5 Muitas 0,00 62,5
7º
Poucas 22,2 100,0
*
0,0023
Poucas 22,2 37,5
0,3498
Poucas 100,0 37,5
*
0,0325
Muitas 30,0 11,1 Muitas 30,0 0,00 Muitas 11,1 0,00
15º
Poucas 70,0 88,9
0,5820
Poucas 70,0 100.0
1,0000
Poucas 88,9 100.0
1,000
LA : LASER
D.C.F: Diclofenaco de sódio
C.E: corrente elétrica
P: resultado aplicação do teste Exato de Fisher
* valores com significância estatística
96
Tabela 3 - Resultados da morfometria para densidade de colágeno tipo III.
Dias Grupo N Média Mediana Valor de p
C.E 12 13,2 12,23
LA 12 26,93 10,56
5
0
D.C.F 7 11,51 10,87
0,7401
C.E 12 73,61 22,82
LA 12 95,91 33,09
7
0
D.C.F 12 55,1 36,62
0,8256
C.E 11 56,71 53,03
LA 12 49,65 49,26
15
0
D.C.F 12 23,37 15,67
0,0988
LA : LASER
D.C.F: Diclofenaco de sódio
C.E: Corrente elétrica
P: resultado aplicação do teste de Wilcoxon
Tabela 4 - Resultados da morfometria para densidade de colágeno tipo I
Dia Grupo N Média Mediana Valor de p
CE 12 401,73 46,17
LA 12 213,56 53,01
5º
DCF 7 311,86 17,28
0,7401
CE 12 196,34 73,49
LA 12 47,48 35,52
7º
DCF 12 595,58 32,52
0,7983
CE 11 74,11 30,25
LA 12 231,5 38,61
15º
DCF 12 247,25 34,15
0,9557
LA :LASER
D.C.F: Diclofenaco de sódio
C.E: corrente elétrica
P: resultado aplicação do teste de Wilcoxon
ANEXO 1
Aprovação do Projeto pelo Comitê de Ética da PUC-PR
98
ANEXO 2
Parecer Técnico dos Parâmetros do LASER
100
ANEXO 3
Parecer Técnico dos Parâmetros da Corrente Elétrica
102
ANEXO 4
Morfologia do estimulo elétrico utilizado na pesquisa experimental.
B
A
Figura 17 - Características do estimulo elétrico, mostrando a presença de pulsos bifásicos que
apresentam dois padrões: um com 24 s de duração com inversão de polaridade a cada 3 s (A) um
outro padrão com duração de 16 s apresentando na inspeção visual uma simetria de carga (B).
Figura 18- Circuito utilizado nos ensaios de desempenho do estimulador elétrico empregado
Fonte: Morales, 2003.
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