( PDF ) Estudos ultra-estruturais e imunocitoquímicos da infecção do vírus da hepatite C em macacos rhesus

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Doutorado em Biologia Parasitária

ESTUDOS ULTRA-ESTRUTURAIS E IMUNOCITOQUÍMICOS DA

INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C EM MACACOS

RHESUS

SELMA MAJEROWICZ

Rio de Janeiro

2008

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M233 Majerowicz, Selma

Estudos ultra-estruturais e imunocitoquímicos da infecção pelo vírus da

hepatite C em macacos rhesus / Selma Majerowicz. – Rio de Janeiro, 2007.

xi, 85 f. : il. ; 30 cm.

Tese (doutorado) – Instituto Oswaldo Cruz, Biologia Parasitária, 2007.

Bibliografia: f. 60-85.

1. Hepacivirus. 2. Macaca mulatta. 3. Hibridização in situ. 4. Microscopia

imunoeletrônica. I. Título.

CDD: 616.3623

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INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-Graduação em Biologia Parasitária

Selma Majerowicz

ESTUDOS ULTRA-ESTRUTURAIS E IMUNOCITOQUÍMICOS DA

INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C EM MACACOS RHESUS

Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos

para obtenção do título de Doutor em Biologia Parasitária

Orientadora: Dr

. Ortrud Monika Barth

Rio de Janeiro

2008

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Pós-Graduação em Biologia Parasitária

Selma Majerowicz

ESTUDOS ULTRA-ESTRUTURAIS E IMUNOCITOQUÍMICOS DA

INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C EM MACACOS

RHESUS

ORIENTADORA: Prof

. Drª. Ortrud Monika Barth

Aprovada em: 27/02/2008

EXAMINADORES:

Prof

. Dr

. Elizabeth Lampe-Presidente

Prof. Dr. José Nelson Couceiro

Prof

. Dr

. Suzana Corte-Real Faria

AGRADECIMENTOS

Agradecimentos

À Dr

. Ortrud Monika Barth, meu obrigada por tudo.

Ao Dr. Hermann Schatzmayr pelo apoio proporcionado desde meu ingresso no

Departamento de Virologia.

Ao Dr. Christopher Grief, pesquisador visitante pelo Convênio FIOCRUZ-FAPERJ e

do NIBISC pela valiosa colaboração durante os dois anos de convívio em nosso

laboratório.

À Dr

. Marcia Leite Baptista pela elaboração das sondas utilizadas na técnica de

hibridização in situ.

Ao Dr. Renato Marchevsky pela correção do terceiro artigo científico, pelas sugestões

valiosas e pela sua cordialidade e generosidade sempre presentes.

Ao Dr. Marcelo Alves Pinto e Dr

. Claudia Lamarca Vitral pela correção do terceiro

artigo científico.

À Dr

. Suzana Corte-Real Faria e Dr

. Clara Yoshida, integrantes da Banca de Exame

de Qualificação de Doutorado do Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária,

pelas sugestões e considerações oportunas.

Ao Dr. Marcos de Bonis pela disponibilidade no uso do microscópio eletrônico e do

scanner de negativos do Instituto de Microbiologia da UFRJ, na ocasião do reparo de

nosso equipamento.

À Angela Teixeira Pinhão e Bárbara Rodrigues dos Santos pela assistência técnica

excelente e pela amizade.

vii

`A Renata Airano, bolsista de Apoio Técnico FAPERJ, pela colaboração técnica.

Ao Alexandre Santos da Silva, bolsista de especialização do Curso Técnico em Biologia

Parasitária, pela assessoria e amizade.

Aos técnicos Levy e Luciano do Departamento de Ultra-Estrutura e Biologia Celular do

Instituto Oswaldo Cruz pela disponibilidade na utilização do microscópio eletrônico de

transmissão, enquanto o do Departamento de Virologia estava em reparo.

Ao Genilton José Vieira, chefe do Laboratório de Produção e Processamento de

Imagem do Instituto Oswaldo Cruz e sua equipe: Bruno Eschenazi, Rodrigo Mexas,

Heloísa Dinis e Leonardo Marcus Perim pelo suporte no processamento das imagens,

pela competência, disponibilidade e cordialidade sempre presentes.

Aos amigos do Departamento de Virologia que participaram indiretamente no

desenvolvimento deste trabalho, meus agradecimentos.

À Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária do Instituto

Oswaldo Cruz.

viii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

% - Porcentagem

nm - Nanômetro

Proteína E - Proteína do envelope

Proteína NS - Proteína não-estrutural

RNA - Ácido ribonucleico

RE - Retículo endoplasmático

REr - Retículo endoplasmático rugoso

HCV - Vírus da hepatite C

Célula Huh7 - Célula de hepatoma humano 7

ALT - Amino alanina transferase

ATP - Adenosina trifosfato

Fiocruz - Fundação Oswaldo Cruz

Indice

ÍNDICE

Resumo x

Abstract xii

1. Introdução 1

1.1 O vírus da hepatite C 2

1.2.1Replicação viral 6

1.2.1 Adsorção viral 7

1.2.2 Penetração viral 8

1.2.3 Replicação do genoma viral 8

1.2.4 Formação e liberação da partícula viral 9

1.3 Aspectos da patogenia da hepatite C 11

1.4 Modelos primatas não-humanos para o estudo do HCV 13

2. Objetivos 15

2.1 Objetivo geral 16

2.2 Objetivos específicos 16

3.Resultados 17

3.1 Artigo 1- Ultrastructure of hepatocytes of a rhesus monkey infected with hepatitis

C virus 18

3.2 Artigo 2- In situ hybridization of hepatitis C virus RNA in liver cells of

an experimentally infected rhesus macaque 27

3.3 Artigo 3- Ultrastructural localization of hepatitis C virus positive and negative

strand RNA and proteins in hepatocytes of a rhesus monkey (Macaca mulatta) 31

4. Discussão 51

4.1 Características morfológicas ultra-estruturais nas células hepáticas de

macacos rhesus inoculados experimentalmente com HCV 52

4.2 Localização das proteínas virais 54

4.3 Localização do RNA viral 55

5.Conclusões 58

6.Referências Bibliográficas 60

xii

Resumo

xiii

RESUMO

Alterações morfológicas do tecido hepático de macaco rhesus (Macaca mulatta)

infectado experimentalmente com o vírus da hepatite C (HCV) foram analisadas

utilizando técnicas em microscopia eletrônica. A localização do RNA e de proteínas

específicas do HCV nos hepatócitos foi demonstrada por meio das técnicas de

hibridização in situ e imuno-microscopia eletrônica. As modificações no tecido hepático

mais marcantes foram observadas entre a 5

e 7

semana pós-inoculação. Numerosos

hepatócitos apresentaram, progressivamente, citoplasma rarefeito e vacuolizado,

culminando com a citólise na 7

semana. Na 8

semana alguns hepatócitos já exibiam

sinais regenerativos, indicados pelo aumento de células binucleadas e recuperação da

individualização celular. A proliferação reticular de membranas e vesículas derivadas

do retículo endoplasmático rugoso (REr) observada no citoplasma dos hepatócitos do

macaco rhesus infectado evidenciou semelhança com a do HCV encontrado em

chimpanzé, em culturas celulares que abrigam os réplicons do HCV. Para a localização

das proteínas virais, cortes de amostras de fígado incluídas em LR-gold, foram

incubados com anticorpos monoclonais contra a proteína do nucleocapsídeo e a

proteína NS5A e com anticorpo policlonal contra as proteínas E1, E2, NS3 e NS4,

seguido de incubação com o conjugado proteína A-ouro coloidal. A proteína do

nucleocapsídeo foi localizada sobre membranas do REr que envolvem as mitocôndrias e

diretamente associada à membrana externa da mitocôndria. As proteínas não-estruturais

foram localizadas em vesículas e cisternas dilatadas derivadas do REr. Na localização

do RNA viral pela técnica de hibridização in situ foram utilizadas sondas de fita

negativa complementar e fita positiva, utilizando para ambas, oligonucleotídeos

específicos. As observações ultra-estruturais evidenciaram marcações específicas sobre

membranas do REr e sobre vesículas dentro das cisternas do REr que se formam

durante a infecção por HCV. O RNA viral de polaridade negativa, juntamente com o

RNA viral de polaridade positiva e as proteínas virais, foram todos localizados em

membranas do REr.

xiv

Abstract

Morphological alterations of the rhesus monkey (Macaca mulatta) hepatic tissue

experimentally infected with hepatitis C virus (HCV) were analyzed using electron

microscopy techniques. The localization of viral RNA and viral proteins inside the

hepatocytes was demonstrated using in situ hybridization and immunelectron

microscopy. The most conspicuous modifications in the hepatic tissue were observed

between the 5

and 7

week after inoculation. Numerous hepatocytes presented

progressively rarified and vacuolated cytoplasm, cumulating in their damage in the 7

week. In the 8

week some hepatocytes already showed signs of organization, indicated

by the increase of binucleated cells and the recuperation of cell individualization that

formely had been lost

. The reticular proliferation of membranes and vesicles derived

from the rough endoplasmatic reticulum, observed in the hepatocytes cytoplasm of the

infected rhesus monkey, showed similarities with HCV found in other systems. In order

to localize the viral proteins, sections of samples embedded in LR-gold were incubated

with monoclonal antibodies against the core and the NS5A proteins and with a

polyclonal antibody against the proteins E1, E2, NS3 and NS4, followed by incubation

with colloidal gold- protein A conjugated. The core protein was found on REr

membranes that involve the mitochondria and was directly associated to the

mitochondria external membrane. The nonstructural proteins were localized in dilated

vesicles and cisternae derived from the REr. In situ hybridization labelling was

performed using a positive and a negative strand probe made with specific primers.

Ultrastructural observations showed specific labelling on the REr membranes and on the

vesicles within the REr cisternae that form during HCV infection. The viral RNA

negative strand together with the viral positive RNA strand and the viral proteins were

all located in REr membranes.

xvi

1. Introdução

xvii

1. Introdução

1.1 O vírus da hepatite C

O vírus da hepatite C (HCV) é considerado a maior causa de hepatite crônica

que pode evoluir em cirrose e carcinoma hepatocelular (Lauer & Walker, 2001). O

HCV é caracterizado por possuir considerável variação genética e grande capacidade de

escapar do controle do sistema imunológico determinando alta incidência do estado

crônico e persistência viral (Bertoletti et al., 1997).

No início dos anos 70, empregando-se os testes sorológicos disponíveis, muitos

casos de hepatite pós-transfusional não foram atribuídos à infecção pelo vírus da

hepatite B (HBV) nem pelo vírus da hepatite A (HAV). Um número expressivo desses

casos continuou a ser notificado, apesar da exclusão de doadores com positividade para

o antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) (Alter et al., 1972). Por

exclusão, esta forma de hepatite pós-transfusional foi designada de hepatite não-A não-

B (HNANB) (Feinstone et al., 1975).

No final da década de 70 foi demonstrado que chimpanzés infectados

experimentalmente com plasma humano de portadores de HNANB desenvolviam

hepatite crônica (Alter et al., 1978; Hollinger et al., 1978).

Identificado em 1989, por meio de clonagem viral utilizando a tecnologia do

DNA recombinante (Choo et al., 1989), o HCV está classificado no gênero Hepacivirus

(Major & Feinstone, 1997), família Flaviviridae, devido às semelhanças que apresenta

em relação à sua estrutura genômica com os gêneros Flavivírus e Pestivírus (Robertson

et al., 1998). Apoiado em análises filogenéticas, o HCV é atualmente classificado em

seis genótipos (Simmonds et al., 2005), os quais exibem diferenças na sua distribuição

mundial, transmissão e progressão da doença (Hnatyszyn, 2005).

O isolamento das partículas virais a partir do soro só foi possível na metade dos

anos 90 quando, por meio da microscopia eletrônica, foi descrito o tamanho e a

estrutura das partículas virais. Os vírions foram caracterizados como partículas

esféricas, envelopadas, medindo de 50 a 65 nm de diâmetro contendo projeções na

superfície e apresentando características morfológicas semelhantes às dos flavivírus

(Kaito et al., 1994; Li et al., 1995, Shimizu et al., 1996) (Figura 1.1)

Trabalhos recentes, utilizando a técnica de imunomicroscopia eletrônica e

rotação óptica, demonstraram que o nucleocapsídeo possui 33 a 40 nm de diâmetro e

xviii

faces hexagonais, sugerindo a estrutura icosaédrica (Ishida et al., 2001; Kaito et al.,

2006).

xix

Utilizando as técnicas de contrastação negativa, criomicroscopia eletrônica e

reconstrução tridimensional de vírions do HCV, Yu e colaboradores (2007),

confirmaram a simetria icosaédrica e forneceram a evidência direta do complexo das

proteínas do envelope E1-E2 que integra a camada bilipídica do envoltório da partícula

viral.

Figura.1.1. Representação esquemática da estrutura da partícula do vírus da hepatite C.

www.trugene.com/labs/companionproducts.shtm.[22 set.2006]

(Legenda adaptada para o português)

O genoma viral é formado por um filamento simples de RNA, de polaridade

positiva, contendo aproximadamente 9.600 nucleotídeos (Figura 1.2). Este genoma

apresenta um segmento altamente estruturado (“Internal ribosome entry site” ou IRES)

que desempenha papel importante na ligação do RNA viral com a subunidade

ribossomal 40S (Wang et al., 1993; Otto & Puglisi, 2004) e na iniciação da síntese da

poliproteína viral (Lytle et al., 2001). O RNA viral codifica uma poliproteína precursora

de cerca de 3000 resíduos de aminoácidos (Moradpour et al., 2002). Ela é clivada por

enzimas codificadas pelo genoma viral e da célula hospedeira, originando 10 diferentes

produtos (Grakoui et al., 1993): as proteínas estruturais, representadas pela proteína do

nucleocapsídeo (proteína C) e pelas duas proteínas do envelope E1, E2 e pelas proteínas

não-estruturais NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, e NS5B

xxi

envelope E1, E2 e pelas proteínas não-estruturais NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, e

NS5B, que têm funções importantes durante toda a morfogênese viral, especialmente

durante a replicação do genoma (Bartenschlager & Lohmann, 2000; Suzuki et al., 2007)

(Figura 1.2). As proteínas estruturais são clivadas por peptidases da célula hospedeira

(Penin et al., 2004b) e são separadas das proteínas não-estruturais por uma pequena

proteína integral de membrana (63aa) designada de P7. A proteína P7 pertence à família

viporina e forma um canal iônico (Griffin et al., 2003). Possui as propriedades de

mediar a permeabilidade iônica de membrana e de formar hexâmeros (Griffin et al.,

2003; Pavlovic et al., 2003); além disso, foi demonstrado que a proteína p7 tem um

importante papel na maturação e liberação viral (Steinmann et al., 2007).

xxii

Figura.1.2. Representação esquemática do RNA do HCV (Roingeard et al., 2004)

xxiii

As proteínas glicosiladas E1 e E2, componentes essenciais do envoltório lipídico

da partícula viral, têm função na ligação inicial da partícula viral com a membrana da

célula hospedeira (Bartenschlager & Lohmann, 2000), na fusão com a membrana do

endosoma (Flint & McKeating, 2000) e na entrada do vírus na célula (Bartosch et al.,

2003). Tem sido relatado também que a forma não glicosilada da proteína E2 (Pavio et

al., 2002) possa interagir com a proteína kinase (Taylor et al., 1999). Essa interação

seria o mecanismo pelo qual o HCV resiste ao efeito anti-viral do interferon

(Tellinghuisen & Rice, 2002).

A proteína do nucleocapsídeo do HCV contem 3 domínios distintos: domínio N-

terminal hidrofílico de 120 aminoácidos (D1), um domínio C-terminal hidrofóbico de

aproximadamente 50 aminoácidos (D2) e um domínio contendo 20 aminoácidos que

servem como peptídeo de sinal para a proteína estrutural E1 (Grakoui et al., 1993;

Santolini et al., 1994).

Os domínios da proteína do nucleocapsídeo estão envolvidos com a ligação do

RNA viral, com a sua localização no núcleo (Chang et al., 1994; Suzuki et al., 1995;

Kasprzak et al., 2005), na associação com membranas do retículo endoplasmático (RE),

com a membrana externa da mitocôndria, com o metabolismo de lipídeos (Perlemuter et

al., 2002; Schwer et al., 2004; Suzuki et al., 2005) e também na regulação da translação

do RNA e interações com glicoproteínas para a formação do vírion (Choi et al., 2001).

Além disso, tem sido proposto seu envolvimento na sinalização celular e modulação da

apoptose (Ruggieri et al., 1997; Suzuki & Suzuki, 2006), indução da fibrogênese

através da estimulação das células estrelares (Shin et al., 2003) e indução de carcinoma

hepatocelular em camundongo transgênico (Moriya et al., 1997; Koike, 2007; Tanaka et

al., 2008).

Os estudos iniciais sobre a distribuição intracelular da proteína do

nucleocapsídeo em biópsias de fígado de indivíduos infectados utilizando métodos de

imunomarcação, demostraram a dificuldade de sua detecção (Gonzalez-Peralta et al.,

1994; Nouri-Aria et al., 1995) e que a sua distribuição se restringia a uma pequena

proporção da célula sendo predominantemente citoplasmática (Yap et al., 1994.

Santolini et al., 1994) e também nuclear (Yasui et al., 1998). A análise em microscopia

eletrônica localizou a proteína do nucleocapsídeo sobre membranas do RE (Moradpour

et al., 1996; Barba et al., 1997; Falcón et al., 2003; Kasprzak et al., 2005).

A maioria das proteínas não-estruturais (NS) são necessárias para a replicação

do RNA viral (Lohmann et al., 1999). A proteína não-glicosilada NS2 é uma protease

xxiv

que tem como função conhecida a participação na clivagem proteolítica da junção NS2-

NS3 da poliproteína viral (Kiiver et al., 2006). Recentemente foi descrita a sua

participação junto com a proteína P7 nas etapas iniciais da formação do vírion (Jones et

al., 2007).

xxv

NS3 é uma proteína multifuncional com atividade de serina protease e de

helicase atuando no desenrolamento de duplas fitas de RNA utilizando ATP (Tai et al.,

1996; Penin et al., 2004b); foi também descrito a sua atuação na ativação de múltiplas

vias de sinalização celular regulando a atividade e produção de várias proteínas

celulares como as ciclooxigenases (Lu et al., 2008). As proteínas NS3 e NS4A formam

um complexo molecular bifuncional essencial para o processamento da poliproteína e

para a replicação do RNA (Bartenschlager et al., 2005; Suzuki et al., 2007). NS4A é

uma proteína que, apresenta atividade de protease (Grakoui et al., 1993) e acredita-se ter

um papel importante na regulação da replicação viral (Kohara, 2000). NS4B é uma

proteína hidrofóbica; trabalhos têm mostrado sua localização no RE (Hugle et al., 2001;

Lindstiöm et al., 2006) e sua participação na indução da formação de um

compartimento especializado de membranas que ocorre durante a replicação do HCV

(Egger et al., 2002; Penin et al., 2004b). A proteína NS4B colocaliza-se com

marcadores do RE, sugerindo que o complexo replicativo é derivado de compartimentos

do RE (Stone et al., 2007).

A NS5A é uma fosfoproteína que tem um importante papel regulatório na

replicação do genoma viral (Brass et al., 2002; Penin et al., 2004a; Huang et al., 2007),

no envolvimento na inibição dos efeitos anti-virais ao interferon, regulação do

crescimento celular (Tan & Katze, 2001) e na modulação da sinalização celular

(Macdonald et al., 2005). Estas propriedades poderiam contribuir na patogênese do

HCV durante a infecção (Polyak et al., 2001; Pawlotdky, 2004). A atividade da proteína

não-estrutural NS5B como RNA-polimerase foi caracterizada pela sua habilidade de

sintetizar o genoma do HCV in vitro (Lohmann et al., 1997; Luo et al., 2000; Jennings

et al., 2008) e por sua interação com a ciclofilina B, uma isomerase celular, que modula

a sua ligação com o RNA, contribuindo para uma replicação eficiente do RNA do HCV

(Watashi et al., 2005).

xxvi

1.2. Replicação Viral

A detecção e localização dos componentes da partícula viral do HCV na célula

são importantes na compreensão da interação célula-vírus e dos mecanismos de

patogênese viral. Além disso, o conhecimento das etapas da morfogênese viral torna-se

uma ferramenta em potencial para a utilização de antivirais (Pawlotsky et al., 2007).

A visualização das partículas virais presentes no soro e em tecidos de indivíduos

infectados é limitada pela dificuldade na obtenção de um eficiente sistema que permite

o estudo da morfogênese viral. Esta limitação foi em parte superada com o

desenvolvimento de um sistema celular elaborado por Lohmann e colaboradores (1999).

Este sistema é fundamentado na transfecção de réplicons subgenômicos do HCV na

linhagem celular de hepatoma humano Huh-7. Os réplicons são clones de pequenos

segmentos de RNA que codificam somente as proteínas não-estruturais do HCV,

especificamente as enzimas que o vírus utiliza para a sua replicação; assim, replicam-se

autonomamente em cultura de células Huh-7 (Lohmann et al., 1999; Bartenschlager &

Sparacio, 2007). No entanto, não possuindo capacidade de formar partículas virais

íntegras (Pitschmann et al., 2002; Blight et al., 2003), não podem infectar outras

células.

Embora o desenvolvimento dos réplicons subgenômicos tenha facilitado os

estudos sobre a replicação do HCV em culturas celulares (Wakita et al., 2005;

Lindenbach et al., 2005; Zhong et al., 2005), as pesquisas que abordam a morfogênese

viral in vivo se tornaram necessárias por permitirem levar em consideração fatores do

hospedeiro essenciais à replicação completa do HCV (Lohman et al., 2003).

1.2.1 Adsorção viral

Vírus envelopados penetram nas células hospedeiras através de uma série de

interações complexas entre a superfície viral e a membrana celular. Isto requer a ligação

das glicoproteínas de envelope a receptores específicos presentes na superfície celular

(Lavillette et al., 2007).

A ligação inicial do HCV com a célula hospedeira requer a interação das

glicoproteínas de envoltório viral E1 e E2 com o receptor presente na superfície da

xxvii

célula, ligação necessária para a entrada do vírus (Deleersnyder et al., 1997; Bartoch et

al., 2003). Prováveis receptores têm sido identificados incluindo a proteína

transmembranar CD81 (Nakajima et al., 2005; Bertaux & Dragic, 2006; Kapadia et al.,

2007; Koutsoudakis et al., 2007), a lipoproteína de baixa densidade (LDL) (Agnello et

al., 1999; Molina et al., 2007), a lipoproteína SR-BI (Voisset et al., 2005; Maillard et

al., 2006), Claudin-1 (Evans et al., 2007; Yang et al., 2008), ASGPR

(asialoglicoproteína) (Saunier et al., 2003). Apesar da descoberta de numerosos

candidatos a receptores, a sua ligação com a partícula viral não garante a entrada do

vírus na célula. A entrada do HCV na célula hospedeira requer interações entre as

proteínas E1 e E2 as quais podem promover modificações comformacionais (Bartosch

& Cosset, 2006), em que vários segmentos de E1 e E2 formam um complexo estrutural

que contribui para a fusão de membranas (Lavillette et al, 2007) (Figura 1.3).

1.2.2 Penetração Viral

Após a entrada do vírus na célula, por endocitose (Agnello et al., 1999; Flint et

al., 1999; Blanchard et al., 2006) mediada pela proteína clatrina (Blanchard et al., 2006;

Meertens et al., 2006), as glicoproteínas de envoltório viral se fusionam com a

membrana do endosoma (Blanchard et al., 2006) através de um mecanismo dependente

de pH (Tscherne et al., 2006), resultando na degradação do capsídeo viral, liberando

assim, o RNA viral para o citoplasma, onde vai atuar como RNA mensageiro para a

síntese da poliproteína viral.

1.2.3 Replicação do genoma viral

O genoma viral, então, é direcionado aos ribosomos pelo sítio de entrada

ribosomal (IRES), onde é traduzido resultando em uma poliproteína, que é clivada em

proteínas individuais (Lemon & Honda, 1997) (Figura 1.3).

As proteínas não-estruturais formam junto com o RNA viral um complexo de

replicação associado a membranas derivadas do retículo endoplasmático (Moradpour et

al., 1998; Pietschmann et al., 2001; Egger et al., 2002; Mottola et al., 2002; Moradpour

et al., 2003). Neste contexto, interações físicas entre as proteínas não-estruturais foram

descritas (Dimitrova et al., 2003).

Dentro deste complexo de replicação, fitas de RNA de polaridade positiva

formam por transcrição cópias de fitas complementares chamadas de RNA de

polaridade negativa (Chu & Westaway, 1985), que vão servir de molde para a síntese de

xxviii

quantidades excessivas de fitas de polaridade positiva. As fitas positivas formadas

podem ser usadas para sintetizar novas fitas negativas, para a tradução ou para formar o

nucleocapsídeo viral (Bartenschlager & Lohmann, 2000; Bartenschlager et al., 2004)

(Figura 1.3).

Sabe-se que as principais etapas do ciclo de vida de vírus RNA positivos

depende de membranas celulares. Estes vírus modificam determinadas membranas

intracelulares das células hospedeiras criando um compartimento onde acontece a

replicação do genoma (Salonen et al., 2004; Novoa et al., 2005). Tem sido relatado que

vírus com genoma RNA de polaridade positiva, como poliovirus e dengue, formam um

complexo de replicação associado a membranas do retículo endoplasmático rugoso

(Bienz et al., 1992; Barth, 1999, 2000; Egger et al., 2000), no qual foram detectados o

RNA e as proteínas virais (Grief et al., 1997; Teterina et al., 2001). Estas estruturas e as

relatadas na infecção com HCV, provavelmente, têm as funções de formar um

compartimento onde são concentrados os produtos virais, formar um suporte físico para

a organização do complexo de replicação do RNA, provisão de lipídeos que são

constituintes importantes para a replicação, proteção das fitas de RNA contra enzimas e

defesas da célula hospedeira (Miyanari et al., 2003; Aizaki et al., 2004; Quinkert et al.,

2005).

Experimentos utilizando linhagens celulares modificadas inoculadas com HCV

evidenciaram, por imunomicroscopia eletrônica, proteínas não-estruturais (Pietschmann

et al., 2001; Mottola et al., 2002; Egger et al., 2002), estruturais (Egger et al., 2002;

Greive et al., 2002) e RNA viral (Gosert et al., 2003) em membranas associadas ao

retículo endoplasmático, sendo proposto ser esta estrutura o sítio de replicação do HCV

(Gosert et al., 2003).

1.2.4 Formação e liberação da partícula viral

A formação de novos vírions consiste na reunião de 3 componentes: o RNA

viral, a proteína do nucleocapsídeo e as proteínas do envoltório viral. O RNA viral é

envolvido pela proteína do capsídeo, constituindo-se o nucleocapsídeo e pelo envoltório

viral derivado, provavelmente, da membrana do retículo endoplasmático rugoso,

contendo as proteínas estruturais E1 e E2 (Baertenschlager & Lohmann, 2000) (Figura

1.3).

Quanto ao mecanismo de formação do nucleocapsídeo do HCV, sabe-se que o

capsídeo viral é formado por subunidades da proteína do nucleocapsídeo adquirindo

xxix

uma forma icosaedral (Kunkel et al., 2001). As interações entre a proteína do

nucleocapsídeo e a região 5' do RNA viral conduzem o RNA para dentro do capsídeo

(Kunkel et al., 2001).

Relatos sugerem que a morfogênese do HCV procede através do brotamento da

proteína do nucleocapsídeo em domínios da membrana do retículo endoplasmático

contendo as proteínas E1 e E2 (Op De Beeck & Dubuisson, 2003; Roingeard et al.,

2004; Hourioux et al., 2007). Esta interação foi demonstrada em células de mamífero

(BHK-21) transfectadas com o vetor “Semlike forest” (Alphavirus) recombinante com

RNA replicativo do HCV. O brotamento de partículas semelhantes a vírus de 50 nm de

diâmetro para o interior de vesículas dilatadas do retículo endoplasmático foi observado.

Nestas partículas, a proteína E1 foi detectada, mas não foi provado se elas continham o

RNA viral, além disso, poucas partículas são liberadas das membranas do retículo

endoplasmático rugoso (REr), sugerindo que fatores da célula hospedeira sejam

necessários para a completa liberação das partículas de HCV (Blanchard et al., 2002;

Blanchard et al., 2003).

Embora sistemas para produção de partículas semelhantes a vírus (VLPs)

(Baumert et al., 1999; Blanchard et al., 2002), nucleocapsídeos (Kunkel et al., 2001;

Matsuo et al., 2006) e de vírions (Kato et al., 2007; Gottwein et al., 2007) tenham sido

elaborados, a visualização de partículas íntegras do HCV na célula hospedeira, até o

presente, não foi apresentada em nenhum sistema de estudo (Régeard et al., 2007).

xxx

As proteínas estruturais do HCV, além do retículo endoplasmático rugoso, foram

também detectadas no compartimento intermediário (Martire et al., 2001) e complexo

Cis-Golgi, sugerindo que estes compartimentos poderiam também estar envolvidos nas

etapas finais de maturação viral (Martire et al., 2001; Serafino et al., 2003).

Os mecanismos que determinam a liberação de vírions para o espaço peri-celular

não estão bem esclarecidos, contudo, provavelmente ocorra por exocitose em analogia

com outros membros da família Flaviviridae (Barth, 1999).

Figura 1.3 Representação esquemática da morfogênese do HCV (Pawlotsky et al.,

2007)

(legendas adaptadas para o português)

xxxi

1.3. Aspectos de patogenia da hepatite C

A principal célula susceptível à infecção pelo HCV é o hepatócito (Boisvert et

al., 2001), embora alguns autores descrevam a detecção viral em várias células extra-

hepáticas como monócitos, macrófagos, células dendríticas, linfócitos T e B (Goutagny

et al., 2003; Castillo et al., 2005; Falcón et al., 2005; Valli et al., 2006; Alisi et al.,

2007; Pham et al., 2008).

O virus da hepatite C tem sido considerado um dos principais agentes da

hepatite crônica. Provavelmente, 170 milhões de pessoas no mundo são infectadas com

o HCV (Shepard et al., 2005).

O HCV causa inicialmente uma infecção aguda após quatro a doze semanas de

incubação. Entre os indivíduos infectados 20% recuperam-se expontâneamente,

enquanto que em 50 a 80% a infecção viral torna-se crônica (Lavillette et al., 2005;

Brass et al., 2006). Os efeitos da infecção podem ser variáveis, ocasionando lesões

hepáticas mínimas em alguns pacientes e 4 a 20% desses pode ocorrer o

desenvolvimento de fibrose extensiva e cirrose hepática ao longo de décadas (Lavillette

et al., 2005; Brass et al., 2006). O risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular

nos pacientes com cirrose é de 1 a 5% (Brass et al., 2006).

A fase aguda da infecção pode durar vários meses e durante este tempo tanto

pacientes quanto animais de experimentação são virêmicos (Shimizu et al., 1990; Farci

et al., 1992). A infiltração de células inflamatórias, a ativação de macrófagos, as lesões

nos hepatócitos e a esteatose que surgem na infecção por HCV são mais brandas e

focais em relação a outros tipos de hepatites virais em fase aguda (Goodman & Ishak,

1995; Kobayashi et al., 1993).

Os mecanismos responsáveis pela persistência do HCV durante a infecção não

estão bem definidos, porém sabe-se que o HCV escapa da resposta imune do hospedeiro

através de uma combinação de processos complexos que incluem a interferência na

sinalização celular (Sato et al., 2008) como, por exemplo, a interrupção da produção de

interferon pela protease viral NS3/4A (Gale & Foy, 2005), a intermitente variação

genética do HCV (Le Guillou-Guillemette et al., 2007) e a evidência da replicação em

células linfóides pelo HCV (Pham et al., 2008; Pal et al., 2006). Estas estratégias

permitiriam o estabelecimento da infecção crônica e à propagação viral (McLaughlin-

Drubin & Muger, 2008).

xxxii

A hepatite crônica, analisada em cortes histológicos, está principalmente

associada à presença de agregados linfóides dentro do espaço porta, ocasionando lesões

focais e degenerativas lobulares (Scheuer et al., 1992). Vários trabalhos assinalam que

as lesões de resposta imune local não são específicas, embora características da infecção

crônica pelo HCV (Lefkowitch et al., 1993; Cerny & Chisari, 1999; Pawlotsky, 2004).

As observações feitas em biópsias de fígado humano infectado com HCV por

microscopia eletrônica de transmissão, revelaram lesões nucleares nos hepatócitos,

incluindo alterações na forma do núcleo, na estrutura da cromatina, do nucléolo e no

envoltório nuclear, proliferação de membranas e modificações no retículo

endoplasmático, lesões mitocôndriais e presença de vacúolos lipídicos no citoplasma

(Falcon et al., 2003; Kasprzak et al., 2003).

A esteatose, caracterizada pelo acúmulo de lipídeos no citoplasma de

hepatócitos, é outra característica freqüentemente observada na infecção crônica pelo

HCV (Goodman et al., 1995). Estudos recentes relatam que a esteatose é mais freqüente

e severa em pacientes infectados pelo HCV genótipo 3 (Rubbia-Brandt et al., 2000;

Adinolfi et al., 2004; Reddy et al., 2008) induzindo efeito citopático (Rubbia-Brandt et

al., 2000; Kumar et al., 2002; Hézode et al., 2004). Além disso, há relatos sugerindo

que interações entre a proteína do nucleocapsídeo do HCV e inclusões lipídicas são

necessárias durante o ciclo viral (Barba et al., 1997; Rouillé et al., 2006; Boulant et al.,

2007; Pérez-Berná et al., 2008; Jhaveri et al., 2008). Esta interação parece direcionar a

indução de esteatose pelo vírus, o qual envolve a deposição de triglicerídeos no fígado e

contribui para a progressão de fibrose em pacientes com hepatite crônica (André et al.,

2005; Roigeard & Hourioux, 2008) e em camundongos transgênicos (Moriya et al.,

1997; Naas et al., 2005).

A fibrose hepática é a principal complicação na infecção crônica pelo HCV. A

fibrose é definida como a deposição de colágeno e outros componentes da matriz

extracelular dentro do parênquima hepático (Bedossa & Paradis, 2003). Durante a

infecção pelo HCV, as células hepáticas estrelares são ativadas gerando miofibroblastos

que são capazes de produzir grande quantidade de componentes da matriz extracelular

como α-actina (Friedman, 1996; Friedman, 2003). Shulze–Krebs e colaboradores (2005)

investigaram por quais mecanismos o HCV pode induzir a fibrose hepática,

independente da inflamação, utilizando células Huh-7 contendo genes das proteínas

não-estruturais NS3, NS5B e células hepáticas estrelares como células efetoras

xxxiii

xxxiv

fibrogênicas. Os resultados acima indicaram a indução do aumento na expressão de

fatores pro-fibrogênicos nos hepatócitos infectados e que esta indução direta poderia

explicar a freqüente observação de progressiva fibrose hepática apesar do baixo nível de

inflamação.

A inflamação crônica e a cirrose indicam ser os principais fatores de risco para o

desenvolvimento do carcinoma hepatocelular durante a infecção pelo HCV, embora os

mecanismos exatos não estejam completamente compreendidos (Kohla & Bonacini,

2006).

As múltiplas funções das proteínas do HCV e a sua influência na sinalização

celular demonstram que tanto fatores virais quanto do hospedeiro podem ter um papel

importante na progressão do carcinoma hepatocelular (McLaughlin-Drubin et al., 2008).

Estudos utilizando camundongos transgênicos e em cultura celulares

demonstraram a função oncogênica da proteína do nucleocapsídeo do HCV (Tanaka et

al., 2008; Koike, 2007) e a sua modulação na proliferação e apoptose em hepatócitos

(Sato et al., 2006), indicando que o HCV tem um envolvimento direto na

hepatocarcinogênese. Outros fatores como morte e regeneração celular contínuas

associadas à inflamação podem causar erros no DNA de novas células, acarretando a

regeneração irregular do órgão, a qual é um fator importante para o desenvolvimento do

carcinoma hepatocelular (Shibata et al., 1998; Ueno et al., 2001; Koike, 2007).

1.4. Modelos primatas não-humanos para o estudo do HCV

O estudo da replicação do HCV tem sido dificultado pelo baixo nível de partículas

virais em indivíduos infectados, a inabilidade de propagação eficiente em cultura de

células e pela falta de um modelo animal conveniente (Shimizu et al.,1990).

Chimpanzés (Pan troglodytes) mostraram ser susceptíveis à infecção com vírus

da hepatite não-A, não-B, adquiridos de pacientes infectados (Prince et al., 1978; Alter

et al., 1978; Tabor et al., 1978; Hollinger et al., 1978; Tsiquaye & Zuckerman, 1979).

Desde então, são considerados como único animal susceptível para estudos da infecção

com o vírus da hepatite C (Bukh, 2004). Neste modelo, o RNA viral foi detectado no

citoplasma de hepatócitos um a dois dias após a infecção (Negro et al., 1992) e o

antígeno viral detectado três dias após a infecção também no citoplasma de hepatócitos

(Shimizu et al., 1990; Krawczynski et al., 1992). A fase inicial da infecção, observada

xxxv

por microscopia eletrônica, indicou modificações nos hepatócitos, tais como núcleos

apresentando densidade heterogênea e picnóticos, mitocôndrias dilatadas, retículo

endoplasmático distorcido, estruturas tubulares nas cisternas do retículo endoplasmático

rugoso (Shimizu et al., 1979), inclusões reticulares, membranas convolutas, estruturas

tubulares e agregados microtubulares citoplasmáticos (Pfeifer et al., 1980; Shimizu et

al., 1979; Shimizu et al., 1990; Jacob et al., 1990; De Vos et al., 2002).

Os chimpanzés têm se tornado animais raros e em conseqüência muito caros.

Desta forma, experimentos têm sido feitos com a finalidade de se obter um modelo

primata susceptível à infecção com HCV, que possa substituir o atual modelo

(Karaylannis et al., 1983; Watanabe et al., 1987). Estudos com sagüis, um macaco do

gênero Sagüinus mostraram sua susceptibilidade ao vírus não-A, não-B (Karayiannis et

al., 1983; Watanabe et al., 1987), embora pesquisas mais recentes, utilizando técnicas

específicas para o HCV indicaram que esses macacos não eram susceptíveis ao HCV

(Garson et al., 1997). Macacos cynomolgus (Macaca fascicularis) foram infectados

experimentalmente com a forma entérica da hepatite não-A, não-B. Partículas virais de

32 a 34 nm de diâmetro foram identificadas nos hepatócitos (Krawczynski & Bradley,

1989). Na espécie de primata Tupaia belangeri chinensis foi constatada a infecção por

HCV com desenvolvimento da viremia e produção de anticorpos anti-HCV (Xie et al.,

1998); porém, estes resultados parecem não ter tido reprodutibilidade.

O estudo sobre a avaliação da susceptibilidade de macacos rhesus (Macaca

mulatta) à infecção por HCV foi introduzido no Departamento de Virologia do Instituto

Oswaldo Cruz com o objetivo de descobrir um modelo primata alternativo para o estudo

da infecção por este vírus. O macaco rhesus foi a espécie de primata escolhida pela

comprovada susceptibilidade aos vírus das hepatites A, B e E (London et al., 1972,

Lankas & Jensen, 1987, Arankalle et al., 1993), pelo seu tamanho e pela sua

disponibilidade no Setor de Primatologia da Fiocruz. A análise genética destes animais

determinou uma taxa alta de genes heterozigotos e possível ausência de

consangüinidade (Andrade et al., 2004).

Os animais foram inoculados com amostras de plasma comprovadamente

positivos para HCV e a infecção foi analisada por meio de técnicas bioquímicas,

sorológicas e histológicas, por um período de 70 dias. Neste experimento o antígeno

viral foi detectado por imunoperoxidase e as alterações morfológicas observadas no

fígado, por microscopia eletrônica, coincidiram com o aumento nos níveis sorológicos

de ALT (Vitral et al., 1997; Barth et al., 1997). No intuito de complementar o estudo da

xxxvi

citopatologia do fígado de macacos rhesus na infecção com o HCV e também de estudar

detalhadamente a replicação viral in vivo, foi elaborado um novo projeto, sendo este o

tema desta tese.

xxxvii

2. Objetivos

xxxviii

2. Objetivos:

2.1. Objetivo Geral

Comprovar, por meio de observações morfológicas e reações

imunocitoquímicas, a replicação do vírus da hepatite C em hepatócitos de macacos

rhesus infectados experimentalmente.

2.2. Objetivos Específicos

2.2.1 Estudar as alterações morfológicas induzidas pelo HCV em tecido hepático de

macacos rhesus através da microscopia eletrônica.

2.2.2 Demonstrar a presença e localização do RNA do vírus da hepatite C nos

hepatócitos dos macacos infectados experimentalmente por meio da técnica de

hibridização in situ.

2.2.3 Demonstrar a presença e localização das proteínas virais em hepatócitos de

macacos rhesus infectados experimentalmente utilizando a técnica de imunomicroscopia

eletrônica.

xxxix

3. Resultados

Os resultados desta tese constam de dois artigos publicados (2003 e 2004) e um

submetido (2007) contendo contribuições originais resultantes de estudos ultra-

estruturais, imunocitoquímicos e hibridização in situ da infecção experimental pelo

vírus da hepatite C em macaco rhesus, relacionados a seguir:

3.1: Artigo 1: Barth OM, Majerowicz S, Vitral CL, Yoshida CFT, Schatzmayr HG.

Ultrastructure of hepatocytes of a rhesus monkey infected with hepatitis C virus. Virus

Reviews and Research 2003; 1(8):29-34.

Resumo

Este trabalho relata as alterações ultra-estruturais em hepatócitos de um macaco

rhesus infectado experimentalmente com o vírus da hepatite C. O experimento foi

conduzido por 70 dias, sendo observado modificações estruturais intensas na 7

semana

pós-inoculação, coincidindo com a elevação máxima dos níveis de ALT. Estes

resultados foram comparados com hepatócitos de chimpanzés infectados com HCV. A

resposta dos hepatócitos em relação à infecção por HCV é dependente do hospedeiro e

estruturas citoplasmáticas diferentes foram observadas em macaco rhesus e chimpanzé.

xli

xlii

xliii

xliv

xlv

xlvi

xlvii

xlviii

3.2 Artigo 2: Majerowicz S, Grief C, Ferguson D, Airano RC, Baptista ML, Pinto MA,

Barth OM. In situ hybridization of hepatitis C virus RNA in liver cells of an

experimentally infected rhesus macaque. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 2004;

99(6):629-631.

Resumo

A presença do RNA do virus da hepatite C (HCV) foi analisada utilizando a

técnica de hibridização in situ, por microscopia de luz e eletrônica, em tecido hepático

de um macaco rhesus experimentalmente infectado por HCV. O animal foi inoculado

via intra-esplênica por explante hepático autógeno. A amostra de soro utilizada foi

caracterizada por PCR e demonstrou ser positiva para o RNA do HCV genótipo 3 com

cópias de RNA/mL. Na técnica de hibridização in situ utilizou-se uma sonda de fita

complementar negativa elaborada com oligonucleotídeos específicos. O RNA viral foi

detectado em membranas alteradas do retículo endoplasmático rugoso das células

infectadas, o que evidencia a replicação do HCV in vivo.

xlix

Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 99(6): 629-631, October 2004 629

SHORT COMMUNICATION

In Situ Hybridization of Hepatitis C Virus RNA in Liver

Cells of an

Experimentally Infected Rhesus Macaque

Selma Majerowicz/

, Christopher Grief*, Debora Ferguson, Renata C

Airano,

Marcia L Baptista, Marcelo A Pinto, Ortrud Monika Barth

Departamento de Virologia, Instituto Oswaldo Cruz- Fiocruz, Av. Brasil 4365, 21040-900 Rio de Janeiro, RJ, Brasil

*NIBSC, Potters Bar, Herts, UK

The liver tissue of a rhesus macaque inoculated with hepatitis C virus (HCV) has been

analyzed for the presence

of HCV RNA using the technique of in situ hybridization, both at light and electron

microscopy levels. The animal

was inoculated by the intrasplenic route using a HCV infected autogenic hepatocyte

transplant. The serum sample

used to infect the hepatocyte cells was characterized by polymerase chain reaction

technique and shown to be

positive for HCV RNA, genotype 3 with 107 RNA copies/ml. In situ hybridization was

performed using a complementary

negative strand probe made with the specific primer. We were able to detect and

localize viral RNA in altered

membranes of the rough endoplasmic reticulum of infected liver cells, showing evidence

of virus replication in vivo.

Key words: in situ hybridization - hepatitis C virus - rhesus macaque

Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of chronichepatitis, liver cirrhosis, and

hepatocellular carcinoma(Houghton 1996). Identified in 1989, HCV has a

positivestranded RNA and was classified as a Hepacivirus withinthe Flaviviridae

family. Immunolabelling using electronmicroscopy methods of infected cell

culturesrevealed an association of HCV proteins and RNA with altered membranesof

the endoplasmic reticulum, designated the membranousweb, suggesting that this is the

site of viral RNAsynthesis and represents the replication complex of HCV(Egger et al

2002, Gosert et al. 2003). The aim of the presentstudy is to determine the intracellular

localization of theviral RNA and to obtain a better understanding of HCV replication in

vivo. In order to investigate the events inHCV infection, rhesus macaques were

inoculated by the intrasplenic route using a HCV infected autogenic

hepatocytetransplant in one animal, following the techniqueused by Rivas et al. (1994).

The serum sample used was characterized by polymerase chain reaction technique as

positive for HCV RNA, genotype 3 and shown to have107 RNA copies/ml. A suitable

non-inoculated animal wasalso included in the experiment. Liver needle biopsies were

obtained at two weekly intervals from rhesus monkey. Forlight microscopyobservations,

the tissue samples werefixed using neutral buffered 10% formalin and embedded

in paraffin wax. For electron microscopy observations,tissue samples were fixed using

2% glutaraldehyde in 0.06M sodium cacodylate buffer pH 7.4 for 1 h at room

temperaturefollowed by an overnight period at 4oC. The samples were then processed

for low temperature embeddingusing LR gold resin (Grief et al. 1991). Light

andelectron microscopy in situ hybridization was performed using a negative strand

probe made with the K15 primer (Grief et al. 1997). In situ hybridization at the light

microscopy level was performed on paraffin wax embeddednecropsy liver tissue from

animals sacrificed at 8 monthsinto the experiment. Sections of paraffin wax embedded

liver tissue were floated onto DEPC-treated water and picked up onto polylysine-coated

glass slides. The sections were allowed to dry, dewaxed using xylene, and then

rehydrated using solutions of ethanol followed by distilled water. The sections were

then incubated with a 50mg/ml solution of proteinase K in PBS for 30 min at 37oC

and washed using PBS followed by distilled water for 5min. Endogenous alkaline

phosphatase was blocked using a solution of 20% acetic acid, followed by a wash with

distilled water. The sections were then fixed by incubating with industrial methylated

spirits (IMS). The hybridization mixture was prepared by dilution of the

digoxigeninlabelling HCV probe 1:10 using hybridization buffer, and boiling for 5 min

prior to use. The hybridization mixture was added to each slide, which was then covered

with a Sigma plastic coverslip and incubated overnight at 37oC. The slides were washed

with SET buffer and incubated with a 1:500 dilution of sheep anti-digoxigenin alkaline

phosphatase using a Tris blocking buffer for 1 h at room temperature in a humidity

chamber. Slides were washed with Tris-HCL buffer and the alkaline phosphatase

detected by a colorimetric reaction. Following a further wash using Tris-HCL buffer the

slides were stained, dried and mounted using Locktite superglue. Electron microscopy

in situ hybridization was performed on infected and noninfected monkey liver tissue

using a 1:10 dilution of the digoxigenin-labelled probes. Gold grids containing ultrathin

sections of LR gold embedded liver tissue were

Financial support: Fiocruz/Faperj, CNPq

+Corresponding author. Fax: +55-21-2573.9591. E-mail:

[email protected]ruz.br

Received 24 May 2004

Accepted 9 September 2004

630 ISH of HCV RNA of Rhesus Macaque Liver • Selma Majerowicz et al.

immersed into droplets of the hybridization mixture and incubated for 4 h at 37oC. The

grids were washed by transferring onto droplets of TBS and then incubated with a 1/

40 dilution of goat anti-digoxigenin antibody conjugated to 10 nm colloidal gold. The

grids were then washed with distilled water and dried before contrast staining using a

2% aqueous solution of uranyl acetate. Despite the relatively low level of HCV

infection, we were able to detect and localize viral RNA successfully in the liver biopsy

material using in situ hybridization at light and ultrastructural levels. Positive RNA

labelling was observed over liver hepatocytes at 57 days and 4 months post-infection.

Light microscopy in situ hybridization showed a clear and moderate positive labelling

of the hepatocytes in the animal challenged with HCV (Fig. 1). The negative control

animal, which had not been challenged with HCV, showed no in situ hybridization

labelling. Electron microscopy observations showed that labelling was consistently

found over the rER membranes and over vesicles which proliferate during HCV

infection inside the rER cisterns (Fig. 2). The negative control material, which consisted

of liver biopsies from animals transplanted with non-infected hepatocytes, did not show

any specific labelling. In our experiment the in situ hybridization labelling, particularly

at the ultrastructural level has enabled the clear localization of HCV RNA in the liver of

infected rhesus macaque and provides useful data about in vivo intracellular HCV

replication. The ethic committee on research animal care at Fiocruz

approved the study.

lii

100nm

300um

Fig. 1: light microscopy. Liver biopsy showing positive labelling of hepatocytes using

in situ hybridization. 20x

Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 99(6), October 2004 631

Fig. 2: electron microscopy. Hepatocyte showing colloidal gold particles over vesicles

located inside the rER cysterns (arrows) using in situ

hybridization labelling. 60,000x

liii

Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 99(6), October 2004 631

ACKNOWLEDGEMENTS

To Dr Renato Marchevsky, Dr Claudia Lamarca Vitral, Dr

Renato Porrozzi, and Mr José Mariano da Silva, from Fundação

Oswaldo Cruz, for the succeful realization of the experiment.

REFERENCES

Egger D, Wölk B, Gosert R, Bianchi L, Blum HE, Moradpour

D, Bienz K 2002. Expression of hepatitis C virus proteins

induces distinct membrane alterations including a candidate

viral replication complex. J Virol 76: 5974-5984.

Gosert R, Egger D, Lohmann V, Bartenschlager R, Blum HE,

Bienz K, Moradpour D 2003. Identification of the hepatitis

C virus RNA replication complex in Huh-7 cells harboring

subgenomic replicons. J Virol 77: 5487-5492.

Grief C, Farrar GH, Kent KA, Berger EG 1991. The assembly

of HIV within the Golgi apparatus and Golgi derived vesicles

of JM cell syncytia. AIDS 5: 1433-1439.

Grief C, Galler R, Côrtes LMC, Barth OM 1997. Intracellular

localisation of dengue-2 RNA in mosquito cell culture using

electron microscopic in situ hybridisation. Arch Virol 142:

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Knipe, PM Howley (eds), Virology, 3rd ed., Lippoincott-

Raven Publishers, Philadelphia, p. 1035-1058.

Rivas PA, Fabrega AG, Schwartz D, Dagiantis W, Ward MG,

Blanchard J, Pollak R 1994. Transplantation of hepatocytes:

an in-vitro and in-vivo study in canines. Cell Transplant

3: 193-201.

liv

3.3 Artigo 3: Majerowicz S, Grief C, Pinto MP, Baptista ML, Pinhão AT, Airano RC,

Vitral CL, Marchevsky RS, Yoshida CFT, Barth OM. Ultrastructural localization of

hepatitis C virus positive and negative strand RNA and proteins in hepatocytes of a

rhesus monkey (Macaca mulatta). Memórias do Instituto Oswaldo Cruz (submetido)

Resumo

Alterações estruturais das células hepáticas em macaco rhesus (Macaca mulatta)

infectado experimentalmente com o vírus da hepatite C (HCV) foram analisadas por

técnicas em microscopia eletrônica de transmissão. Foi demonstrada a localização do

RNA e das proteínas virais nos hepatócitos usando as técnicas de hibridização in situ e

imunomicroscopia eletrônica. A infecção foi evidenciada somente no animal inoculado

por via intra-esplênica com transplante hepatocitário autogênico. O inóculo usado para

infectar os hepatócitos foi caracterizado como genótipo 3 com 10

cópias de RNA/ mL.

Na técnica de hibridização in situ foi utilizada uma sonda de fita negativa complementar

e outra de fita positiva, ambas feitas com oligonucleotídeos específicos. Apesar da

evolução branda da infecção, foi possível detectar e localizar fitas de RNA, de

polaridade positiva e negativa, em membranas alteradas do retículo endoplasmático

rugoso dos hepatócitos, demonstrando a replicação do HCV in vivo.

Running title:

Hepatitis C virus RNA and proteins in hepatocytes of a rhesus monkey

Ultrastructural localization of hepatitis C virus positive and negative strand RNA

and proteins in hepatocytes of a rhesus monkey (Macaca mulatta).

Selma Majerowicz

, Christopher Grief

1,2

Marcelo Alves Pinto

Marcia Leite Baptista

Angela Teixeira Pinhão

Renata Cristina Airano

, Cláudia Lamarca Vitral

, Renato

Sergio Marchevsky

, Clara FT Yoshida

and Ortrud Monika Barth

Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Avenida Brasil 4365, 21040-900 Rio de Janeiro,

Brazil.

NIBSC, Potters Bar, Herts, EN6 3QG, Inglaterra.

Instituto Biomédico, Universidade Federal Fluminense, Niterói, Brazil.

Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos, Fiocruz, Rio de Janeiro, Brazil.

* Corresponding author: E-mail:

[email protected]; Fax: 55 21 22604866

Morphological alterations of the liver from rhesus macaque (Macaca mulatta)

experimentally infected with hepatitis C virus (HCV) were analyzed using light and

electron microscopy. The localization of viral RNA and proteins inside hepatocytes was

demonstrated using in situ hybridization and immunoelectron microscopy techniques.

The animals were different routes. The infection was successful only by use of the

intrasplenic approach to HCV infected autogenic hepatocyte transplant. The inoculum

used to infect the hepatocytes was characterized as genotype 3 with 10

RNA

copies/mL. In situ hybridization was performed using a complementary negative and

positive strand probe made with the specific primer. Despite that the level of HCV

infection was considered to be low, we were able to detect and localize viral positive

and negative RNA strands and viral proteins in altered membranes of the rough

endoplasmic reticulum in infected liver cells, showing evidence of viral replication in

vivo.

_____________

Key words: rhesus monkey, hepatitis C virus, ultrastructure, in situ hybridization, viral

proteins, replication complex

lvi

Hepatitis C virus (HCV), a major cause of chronic hepatitis, may lead to cirrhosis

and to hepatocellular carcinoma (Houghton 1996). Identified only after the development

of recombinant DNA technology (Choo et al. 1989), the HCV contains a positive

stranded RNA genome and has been classified as a Hepacivirus within the Flaviviridae

family.

The viral RNA, after entry into the cell is liberated into the cytoplasm and translated to

a large polyprotein that is cleaved by action of cellular (Penin et al. 2004) and viral

proteases (NS2/3 protease and NS3 serine protease) into the structural proteins, which

consist of capsid protein (core) and envelope proteins (E1, E2), the hydrophobic peptide

P7 and the nonstructural

proteins NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B. The interactions that occur between

HCV proteins and intracellular membranes showed their essential role in virus

replication (Debuisson et al. 2002, Salonen et al. 2004)

The replication of positive-strand RNA viruses is associated with modified

cytoplasmic membranes with provides an environment for RNA replication and

assembly of viruses (Solonen et al.2004, Novoa et al. 2005). The proteins of HCV form

a complex tightly associated with endoplasmatic reticulum membranes (Egger et al.

2002), where the plus-strand RNA genome is copied into a minus-strand RNA

intermediate, that serves as a template for the synthesis of excess amounts of plus-strand

RNA molecules which are encapsulated forming virions or serving as mRNAs for viral

protein synthesis (Bartenschlager and Lohmann 2000, Pawlotsky 2004). Recent reports

considered the presence of negative strand RNA HCV as indicative of viral replication

and its correlation with cytological alterations in human liver (Chang et al. 2000, Quadri

et al. 2001, Falcón et al. 2003, Yuki et al. 2006).

HCV is difficult to cultivate in cell culture and in vivo the infectious titer is

usually quite low; consequently, details about its replication cycle both in vivo and in

vitro are not completely understood.

The detection of HCV minus-strand RNA in experimentally infected chimpanzee liver

was shown by reverse transcription/ polymerase chain reaction (RT-PCR) (Shimizu et

al. 1998). In situ hybridization studies of the genomic RNA have been revealed in

chimpanzee hepatocytes by immunohistochemical reaction (Negro et al., 1992). In

addition, some reports have described the detection of HCV RNA minus-

lvii

strand in human liver by in situ hybridization technique also, not showing the

ultrastructural localization of HCV RNA. (Lamas et al. 1992, Nouri-Aria et al. 1993,

Gastaldi et al. 1995, Sansonno et al. 1997, Chang et al. 2000).

Shimizu et al. (1996) observed in the liver biopsies from HCV infected

chimpanzees, positive reactions by immunofluorescence with anti-HCV envelope

protein. Ultrastructural observations of hepatocytes of chimpanzee and in human liver

biopsies showed the HCV core protein localized around lipids droplets and the

endoplasmic reticulum (Barba et al. 1997,Falcón et al. 2003).

Since the development of HCV replicons capable of replication in a human

hepatoma Huh-7 cell line (Lohmann et al. 1999), several studies of HCV

morphogenesis have been made. Using electron microscope observation,

immunolabelling of Huh-7 cells harboring a subgenomic HCV replicon shows HCV

non-structural proteins (Pietschmann et al. 2001, Mottola et al. 2002, Moradpour et al.

2003, Gosert et al. 2003, Moradpour et al. 2004), structural proteins (Pietschmann et al.

2002) and viral plus-strand RNA (Gosert et al. 2003) in altered membranes of the

endoplasmic reticulum, designated the membranous web (Egger et al. 2002) suggesting

that this is the site of viral RNA synthesis and represents the replication complex of

HCV. (Gosert et al. 2003).

The aim of the present study is to characterize at the ultrastructural level the

intracellular localization of the positive and negative HCV RNA strand and the viral

proteins in the liver tissue of HCV infected rhesus monkeys for a better understanding

of HCV replication in vivo.

MATERIALS AND METHODS

Animals - Six clinically healthy young-adult rhesus primates (Macaca mulatta) non-

reactive for HCV antibodies provided from the Primatology Department of the Centre

for Laboratory Animal Breeding of the Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brazil,

were included in the study. They showed normal levels of liver enzymes as alanine

aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST). Environmental conditions

included a temperature 22-24

C, a relative humidity of 60%, light for 12 hours per day.

The animals were feeded on commercial food and water ad libitum, and housed in

individual cages. The macaques were cared according to biosafety level 2 precautions

and procedures outlined in compliance with the Ethical Committee for Animal Research

lviii

and procedures outlined in compliance with the Ethical Committee for Animal Research

(CEUA/Fiocruz: P-0013/00).

Inoculum - The serum sample used in this experiment was chosen among human

patients during acute and early phase of HCV infection and the criteria of choice was

based on highest viral load and poor antibody response, so that a serial testing was

performed on the samples: alanine aminotransferase, anti-HCV, and HCV RNA. HCV

antibodies were tested through a third generation enzyme immune assay (EIA) (Abbott)

and qualitative and quantitative HCV RNA detection through a real time PCR. The

protocol of procedures was submitted to the Human Research Committee of the

Oswaldo Cruz Foundation and reviewed by the Institutional Review Board. The clinic-

based acute hepatitis C cases (jaundice and with elevated serum aminotransferase level)

were submitted to clinical evaluation and had blood samples collected at the National

Reference Laboratory of Viral Hepatitis (NRLVH) / Oswaldo Cruz Foundation, Rio de

Janeiro, Brazil. Finally, the inoculum was characterized by PCR as HCV positive RNA,

genotype 3 and quantified as 10

RNA copies/mL

Experimental design - Five rhesus monkeys were inoculated as described in Table 1.

The animals numbers S-11, 110 and 74 were inoculated by the parenteral via. The

monkey number 71 was used as negative control. The monkeys number A-18 and I-28

were intrasplenically transplanted with autogenic hepatocytes. In the former one, the

isolated liver cells were infected in vitro with HCV inoculum. Following both were

infused into the own splenic parenchyma of liver donor.

lix

The monkeys were anesthetized intramuscularly with ketamine HCl (20mg/kg)

and midazolan (1mL/kg) and maintained with additional doses of ketamine (5mg/mL)

before the surgical approaches of spleen. Liver wedge biopsies were processed for

obtention of hepatocyte suspensions for auto transplantation as described by Rivas et

al., (1994). The hepatocytes were cultured in DMEM supplemented with 10% FCS, 105

U/L penicillin, 0.1 g/L streptomycin, and nonessential amino acids. All the cells were

cultured at 37°C in 5% CO

. During hepatocyte auto transplantation, doses of 50 UL/kg

of intravenous heparin were given. Thereafter the control and HCV infected hepatocyte

suspensions (6x10

cells/10mL) were injected directly into the splenic parenchyma,

using a polypropylene tube (19G), while the splenic hilum was clamped. After infusion,

the clamp was removed slowly. The splenic hemostasis was obtained by compression of

the injection site. The abdominal incision was closed in layers. The animals were

followed by serum ALT level and serology to HCV. Aspirative liver biopsies were

performed with material taken at two different time intervals (57 days and 4 months)

available for morphological analyses to detect and localize HCV RNA using in situ

hybridization at the ultrastructural level and the viral proteins by immuno-electron

microscopy.

Electron microscopy

Epon embedding - Liver tissue biopsies were fixed with 2% glutaraldehyde in 0.06 M

sodium cacodylate buffer, pH 7.4, for one hour at room temperature, followed by an

overnight period at 4

C. They were dehydrated in graded acetone and embedded in

Epon resin. Ultra-thin sections were stained with uranyl acetate and lead citrate and

examined with a Zeiss EM-900 electron microscope.

Low temperature embedding - The glutaraldehyde fixed liver samples were dehydrated

in increasing concentrations of ethanol using progressively lower temperatures starting

with 30% ethanol followed by 50%, 70%, 90%, 95% ethanol at 4

C, and finally two

changes of 100% ethanol at –20

C. Samples were then infiltrated and embedded with

LR Gold resin containing 0.5% benzoin methyl ether at –20

C. Resin embedded

samples were then transferred to pre-cooled resin-filled Beem

capsules and

polymerized using ultraviolet irradiation for 24 h at 20

C followed by 16 h incubation at

room temperature (Grief et al. 1991).

In situ hybridization - Electron microscopy in situ hybridization (Grief et al. 1997) was

performed using a positive strand probe made with the K16 primer and negative strand

probe made with the K15 primer as formerly described in Majerowicz et al. (2004).

Immunoelectron microscopy - Liver samples of infected and control animals were

embedded in LR Gold resin and ultra-thin sections were placed on gold grids. The

sections were incubated with anti-hepatitis C core antibody (1:5 dilution), NS5A

monoclonal antibody (Virogen, 1:10 dilution) and with an anti-hepatitis C E1, E2, NS3,

NS4 polyclonal antibody (Oxford Technology, 1:10 dilution) using a buffer containing

0.2 M Tris HCl pH 8.2, NaCl 150 mM, fish gelatin 0.1%, 0.5% Tween 20, bovine

serum albumin 1% at 37

C for 1 hour. The grids were then washed with distilled water

and incubated again with 10nm colloidal gold linked protein-A solution in 0.2 M Tris

HCl pH 8.2, NaCl 150 mM, fish gelatin 0.1%, 0.5% Tween 20, bovine serum albumin

1% at 37

C for 1 hour. The grids were then washed with distilled water and dried before

stained with a 2% aqueous solution of uranyl acetate for 10 minutes and examined with

a Zeiss EM-900 electron microscope.

RESULTS

PCR analysis of liver tissue showed that only the animal intrasplenically

inoculated using the autogenic hepatocyte transplant methodology was infected with

HCV. The biopsy samples that were taken at two different time intervals (57 days and 4

months) were analyzed for morphological analyses, in order to detect and localize HCV

RNA and proteins.

Completely disorganized focal areas in the liver parenchyma were observed at

57 days p.i. by light microscopy in semi-thin sections. The cytoplasm of hepatocytes

was strongly vacuolated and rarefied. At 4 months p.i., hepatocytes in the damaged

areas became round and swollen, some picnotic nuclei occurred, the cell membrane was

apparently discontinuous, and the typical regular sinusoidal cell disposition was lost.

Ultrastructural observations of Epon-embedded infected liver sections showed a

membranous web and dilated rough endoplasmic reticulum (rER), vesicles and cysterns

surrounding mitochondria (Fig.1).

lxi

Electron microscopy in situ hybridization showed that gold labelling was

consistently found over the rER membranes (Fig. 2) and over vesicles which proliferate

during HCV infection inside the rER cysterns (Fig. 3). The negative control material,

which consisted of liver biopsies from an animal transplanted with non-infected

hepatocytes, did not showed any specific labelling.

The immuno-EM labelling obtained with a monoclonal antibody against the core

protein showed gold particles accumulated on membranes of dilated vesicles of the rER

surrounding mitochondria and on the outer membrane of mitochondria (Figs. 5, 6).

Similar findings were observed using a polyclonal antibody against NS3, NS4, E1, E2

proteins (Fig. 7), and with a NS5A-specific label (Fig. 8).

DISCUSSION

We previously reported the morphological changes of rhesus hepatocytes caused

by HCV infection, when patches of microtubuloreticular aggregates were observed

inside the hepatocytes cytoplasm (Barth et al. 2003). Similar structures were observed

in our present experiment also, by Pfeiffer et al. (1980) in hepatocytes of HCV-infected

chimpanzees, by expression of the HCV structural proteins from a SFV recombinant

RNA replicon (Greive et al. 2002) and by Egger et al.(2002) in a HCV infected

tetracycline-regulated cell line.

Positive RNA labelling was observed at both time intervals and with both

molecular probes, when the hepatocytes showed an increase in rER and vesicle

formation. However, the labelling pattern shown by each of the dig-labelled probes was

occasionally found to be rather different. Thus in the case of K16, which is the positive

strand probe, labelling was more frequently localized over associated rER membranes

and over vesicles which proliferate during HCV infection inside the rER cysterns (Figs.

2, 3). It is most likely that the K16 probe detected the presence of the replication

intermediate negative strand viral RNA. The location of this intermediate replication

form could represent the site of the HCV replication center within the liver cell. In the

case of K15, which is the negative strand complementary probe, the gold labelling was

consistently found over the membranes of dilated rER cysterns surrounding

mitochondria (Fig. 4), but was found over alterated membranes of the rER (Majerowicz

et al.2004) as with the K16 probe also.

lxii

The present investigation using EM-immuno labelling localized the core and the

NS HCV proteins in membranes of cysterns and vesicles of the rER in infected rhesus

monkey liver biopsies. Our results are in accordance with previous studies that found

HCV proteins in human and chimpanzee liver biopsies (Barba et al. 1997, Falcón et al.

2003, Kasprzak et al. 2005) and in genetically modified cell systems expressing

subgenomic HCV replicons (Egger et al. 2002, Mottola et al. 2002, Gosert et al. 2003).

We observed the core protein also on the outer membrane of mitochondria, as

described by Kasprzak et al. (2005), Okuda et. al. (2002) and Schwer et al. (2004). It

has been suggested that the localization of HCV core protein on mitochondria would be

a good position to encapsidate HCV RNA released from the replication complex and

that core protein may alterate the mitochondrial function, changing the cellular

physiology to favor viral replication (Schwer et al. 2004). Moreover, the viral RNA was

also observed, in our study, frequently on dilated rER cysterns close to mitochondria. It

has been known that is a contact site between ER and mitochondria (Rizzuto et al.

2000;Csordás et al. 2006), providing the condition to control ER-derived Ca

signal

distribution to the mitochondria (Hajnóczky et al. 2000) and the activity of apoptotic

proteins in the ER (Walter and Hajnóczky 2005).

The absence of any clearly defined virus particle in our EM specimens may be

explained by the fact that this virus replicates very slowly and that the number of virus

particles is likely to be very low making detection very difficult. Few virus-like

particles were observed in citoplasmic vesicles of human (Bosman et al. 1998, Falcón et

al. 2003) and chimpanzee (Shimizu et al. 1996) hepatocytes. These authors concluded

that HCV–positive cells in a liver tissue are very rare and difficult to be detected using

electron microscopy.

In conclusion, the in situ hybridization and immunolabelling at the

ultrastructural level of resolution has enabled the clear localization of HCV RNA and

viral proteins in hepatocytes of a rhesus monkey, which had been, previously

challenged with a strain of the HCV. It provides important information about the nature

of in vivo intracellular HCV replication in rhesus hepatocytes and supporting the

previous positive PCR results and confirming that this particular monkey was infected

with HCV.

lxiii

Acknowledgements

We thank to Bárbara Rodrigues dos Santos and José Mariano da Silva for excellent

technical assistance. Financial support was given to the last author by the Nacional

Council for Scientific and Technological Development (CNPq), Brazil.

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lxix

Legend of figures

Figure 1. Liver biopsy of a rhesus macaque infected with HCV at four months p.i. Liver

sample embedded in Epon showing alterated membranes of the rER membranous web

and vesicles, besides mitochondria (M). Bar =200nm.

Figure 2. In situ hybridization using a digoxigenin-labelled positive strand probe (K16).

The gold particles demonstrate the presence of the negative HCV strand RNA on the

membranous web. Barr = 300nm.

Figure 3. The same preparation as in Figure 2. Gold particles (arrow) are laying over a

smooth vesicle inside a rER cystern. Bar = 300nm.

Figure 4. HCV-infected hepatocyte using in situ hybridization. The label (K15 probe)

shows gold particles (arrows) on the membranes of the dilated rER in close association

with mitochondria (M) and the cell nucleus (N). Barr = 500nm.

Figure 5. Immunogold analysis of core protein labelled with a core-specific monoclonal

antibody. Gold label was detected on dilated rER vesicles in vicinity of mitochondria.

Bar = 300nm.

Figure 6. Immunogold analysis of core protein labelled with a core-specific monoclonal

antibody. Gold particles were detected on rER cystern membranes and on the outer

membrane of a mitochondrium. Bar = 300nm.

Figure 7. Hepatocyte labelled with a polyclonal antibody against HCV proteins E1, E2,

NS3 and NS4. Gold particles are present on membranes of rER vesicles. Barr = 300nm.

lxx

Figure 8. Immunolabelling of HCV NS5 protein showing gold particles on membranes

of rER cysterns. Barr = 300nm.

lxxi

lxxii

Table 1. Experimental HCV infection in rhesus monkeys using different routes

of virus inoculation.

rhesus

macaques

Weight

(Kg)

Age (year)

route inoculum Anti HCV

IgG

S-11

5.3

Intravenous

Serum sample

HCV RNA

negative

Negative

110

8.2

Intravenous

Serum sample

HCV RNA

positive

(10

RNA/mL

Negative

8.6

Intravenous

Serum sample

HCV RNA

positive

(10

RNA/mL)

Negative

I-28

7.7

Intrasplenic

Transplant of

non infected

hepatocytes

(10

cells/mL)

Negative

A-18

5.4

Intrasplenic

Transplant of

HCV infected

hepatocytes

(10

cells/mL)

Negative

8.0

Non-inoculated

Negative

lxxiii

4. Discussão

lxxiv

4. Discussão

Os critérios que permitiram sugerir o primata não-humano (Macaca mulatta)

como modelo experimental da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) incluíram

anormalidades nas enzimas hepáticas, principalmente a alanina aminotransferase (ALT),

identificação sorológica de seqüências do HCV pela técnica de reação em cadeia da

polimerase (PCR) e alterações ultra-estruturais sugestivas da infecção viral (Vitral et

al.,1997).

4.1 –

Características morfológicas ultra-estruturais nas células hepáticas de

macaco rhesus inoculado experimentalmente com HCV

Biópsias de fígado de um macaco rhesus inoculado com HCV foram analisadas

utilizando microscopia eletrônica, por um período de 70 dias.

As alterações morfológicas mais marcantes encontradas foram observadas entre

a 5

e 7

semana pós-inoculação. Observações de cortes semifinos e ultrafinos exibiram

áreas do parênquima hepático com numerosos hepatócitos apresentando

progressivamente citoplasma rarefeito e vacuolizado, culminando com sua destruição na

semana. Núcleos e mitocôndrias não mostraram alterações morfológicas muito

pronunciadas. Na 8

semana alguns hepatócitos já evidenciaram sinais de organização,

indicado pelo aumento de células binucleadas e recuperação da individualização celular

perdida. Esses resultados conferem com as modificações morfológicas encontradas em

biópsias de fígado humano (Pokroskii et al., 2003). Para Pokroskii e colaboradores

(2003), estas alterações morfológicas seguem o conceito da existência de uma proteção

antiviral nestas células infectadas. Sugerem que a supressão de reações de biossíntese

poderia resultar numa inibição da replicação viral e na degradação citoplasmática

levando, à eliminação de partículas virais por exocitose e à regeneração celular em

casos crônicos por infecção com o HCV. Além disso, vários autores têm relatado que,

como resultado de repetidos ciclos de necrose e regeneração dos hepatócitos na hepatite

crônica, ocorre uma regeneração irregular do tecido hepático, importante fator no

desenvolvimento do carcinoma hepatocelular (Shibata et al., 1998; Ueno et al., 2001;

Koike, 2007).

lxxv

No estudo ultra-estrutural das células hepáticas de chimpanzés infectados pelo

HCV (Shimizu, 1992; De Vos et al., 2002) foram relatadas membranas convolutas (tipo

II), complexos tubulares ou cisternas confrontantes (tipo III) e agregados microtubulares

(tipo IV) (Pfeifer et al., 1980). Estas alterações ultra-estruturais coincidem com as

relatadas na infecção desta espécie de primata não-humano pelo vírus da hepatite delta

(HDV) (Shimizu & Purcell, 1989) e na infecção com o vírus HIV em cultura de células

(Sidhu et al., 1983; Bockus et al., 1988).

Na presente pesquisa, foi observada nos hepatócitos de um macaco rhesus a

fragmentação de membranas e vesículas derivadas do retículo endoplasmático rugoso,

semelhante às inclusões espongiformes encontradas em hepatócitos de chimpanzés

(Pfeifer et al., 1980, De Vos et al., 2002) e às alterações membranares expressas pela

proteína NS4 do HCV em linhagens celulares (Egger et al., 2002; Konan et al., 2003).

Nestas foram detectadas por imunomicroscopia eletrônica as proteínas do vírus (Egger

et al., 2002) e também o RNA viral (Gosert et al., 2003), sendo consideradas como sítio

de replicação do HCV, conforme demonstrado no presente estudo.

Estudos bioquímicos comprovaram a função desta rede de membranas juntamente

com as proteínas virais, observados nas análises ultra-estruturais citadas acima.

Múltiplas cópias de proteínas não-estruturais formam um complexo construindo uma

estrutura vesicular (El-Hage et al., 2003; Quinkert et al., 2005), que protege o RNA

contra nucleases, proteases e do sistema imune (Yang et al., 2004).

O complexo de replicação do RNA de muitas famílias de vírus RNA de polaridade

positiva está associado a membranas do retículo endoplasmático. Estruturas aqui

relatadas são semelhantes àquelas observadas em células infectadas pelo vírus dengue

(Flaviviridae) e por poliovirus, um membro da família Picornaviridae utilizando,

entretanto, diferentes mecanismos para a formação do complexo de replicação (Salonen

et al., 2004). Durante a infecção do vírus dengue em células de mosquito C6/36 ocorre a

formação de vesículas e túbulos dentro de cisternas dilatadas do REr, em cuja superfície

foi detectado o RNA e proteínas virais caracterizando o local de replicação viral (Barth

et al., 1997, Grief et al., 1997; Barth 1999, 2000). O complexo de replicação de

poliovírus também contém todas as proteínas estruturais e não-estruturais e RNA viral,

o qual se replica na superfície de vesículas que se agregam em estruturas semelhantes a

rosetas (Bienz et al., 1992). No presente caso de infecção pelo HCV, o complexo de

replicação está localizado junto às membranas do REr de hepatócitos.

lxxvi

A evidência de alterações de membranas induzidas pelas proteínas virais, pode

sugerir que a patogenia do HCV se relaciona não somente com a resposta imunológica,

como também à contribuição direta do vírus na modificação da arquitetura celular

(Cerny & Chisari, 1999; Egger et al., 2002; Zerennski et al., 2007).

A constante presença de cisternas dilatadas do REr próximo a mitocôndrias foi

observada nos hepatócitos do macaco rhesus durante a infecção. Relatos indicam que há

um local específico de contato entre o RE e a mitocôndria (Csordás et al., 2006),

propiciando as condições para controlar a distribuição de íons Ca

do RE para a

mitocôndria (Hajnóczky et al., 2000; Romagnoli et al., 2007) e a atividade das proteínas

apoptóticas no RE (Walter & Hajnóczky, 2005).

A ausência de detecção de partículas virais íntegras no presente estudo pode ser

explicado pelo fato do número de partículas virais ser relativamente baixo. A

dificuldade na detecção de partículas virais é assinalada em alguns trabalhos, tendo sido

observadas poucas partículas semelhantes ao HCV em vesículas citoplasmáticas de

hepatócitos humanos (Bosman et al., 1998; Falcón et al., 2003) e em hepatócitos de

chimpanzé (Shimizu et al., 1996) infectados experimentalmente com HCV.

4.2. Localização das proteínas virais em hepatócitos

A utilização de anticorpos policlonais contra as proteínas estruturais (E1, E2) e

não-estruturais (NS3 e NS4) do HCV, permitiu localizar as proteínas virais em

membranas e vesículas derivadas do REr, coincidente ao que foi descrito utilizando

linhagens celulares que abrigam os réplicons do HCV (Pietschmann et al., 2001; Egger

et al., 2002; Greive et al., 2002; Mottola et al., 2002). Além da localização no RE, as

proteínas não-estruturais NS3 e NS4 foram também reveladas sobre membranas

mitocondriais associadas às membranas do RE (Mottola et al., 2002; Kasprzak et al.,

2005). No entanto, o exato significado desta localização não foi ainda bem definido.

A análise individual da proteína NS5A no presente experimento, revelou as

partículas de ouro coloidal sobre vesículas dilatadas e cisternas do REr. As

características aqui relatadas assemelham-se às descrições da localização da NS5A por

imunomicroscopia eletrônica em células de osteosarcoma humano (Egger et al., 2002) e

em células Huh-7 que abrigam o réplicon subgenômico do HCV (Gosert et al., 2003).

A presença da proteína do nucleocapsídeo foi detectada freqüentemente sobre

cisternas dilatadas do REr em associação com mitocôndrias e sobre a membrana externa

lxxvii

destas. A ocorrência desta proteína revelada ao longo de membranas do REr por

imunomarcação em biópsias de fígado de chimpanzés inoculados com HCV foi

assinalada por Barba et al (1997). Em biópsias humanas, a proteína do nucleocapsídeo

foi também localizada em vesículas do REr, freqüentemente perto de mitocôndrias

(Falcón et al., 2003; Kasprzak et al., 2005) e sobre a membrana externa da mitocôndria

(Kasprzak et al., 2005).

Além disso, estudos sugerem que a proteína do nucleocapsídeo quando

localizada na mitocôndria, poderia fornecer uma posição ideal para a encapsulação do

RNA viral liberado do complexo de replicação e que essa proteína poderia alterar a

função mitocondrial, modificando a fisiologia celular a favor da replicação viral (Okuda

et al., 2002; Schwer et al., 2004). Suzuki e colaboradores (2005) demonstraram uma

região localizada entre o RE e a mitocôndria que pode mediar a associação da proteína

de nucleocapsídeo, não sómente com o RE como também com a membrana externa da

mitocôndria. É assegurado que a mitocôndria forneceria a energia necessária para os

processos morfogenéticos virais. Estudos comprovam que a formação do capsídeo

depende de gradientes de cálcio e ATP (Cobbold et al., 2000).

Há descrições da localização da proteína de nucleocapsídeo, por

imunomicroscopia eletrônica, no núcleo de hepatócitos (Kasprzak et al., 2005; Suzuki

et al., 2005), porém não tão freqüente quanto nas membranas do REr e nas membranas

externas de mitocôndrias (Kasprzak et al., 2005). No presente estudo, a proteína de

nucleocapsídeo não foi encontrada no núcleo de hepatócitos, em concordância com as

descrições de Barba e colaboradores (1997) em chimpanzés infectados com HCV e de

Rouillé e colaboradores (2006) em células Huh7 transfectadas com RNA do HCV

sintetizado no plasmídeo pJFH1.

4.3. Localização do RNA viral em hepatócitos

Na presente pesquisa localizou-se o RNA de polaridade positiva sobre

membranas e vesículas derivadas do RE. Estes aspectos, de modo geral, coincidem com

as observações encontradas por Gosert e colaboradores (2003) em células Huh7 que

contêm os réplicons subgenômicos do HCV.

A observação de que todas as proteínas não-estruturais (Egger et al., 2002;

Gosert et al., 2003) e o RNA de polaridade positiva colocalizam em membranas

alteradas do RE, indicam essas estruturas como sendo o complexo replicativo do HCV

lxxviii

(Gosert et al., 2003). Estudos bioquímicos também demonstraram que as proteínas não-

estruturais e o RNA do HCV se colocalizam em membranas do RE, confirmando as

observações ultra-estruturais (El-Hage & Luo, 2003, Aizaki et al., 2004).

Detectou-se ainda no presente trabalho, a presença do RNA do HCV de

polaridade negativa nas estruturas vesiculares derivadas de membranas do RE. A

detecção do RNA de polaridade negativa representa um indicador da replicação viral

(Quinkert et al., 2005). Não obstante os numerosos relatos da detecção do RNA

negativo pela técnica de hibridização in situ, com o objetivo de monitorar a distribuição

e a replicação viral intrahepática (Lamas et al., 1992; Nouri-Aria et al., 1993; Gastaldi

et al., 1995, Sansonno et al., 1997; Chang et al., 2000; Quadri et al., 2001), a precisa

localização do RNA intermediário replicativo, em relação ao sítio de replicação, não foi

esclarecida. A técnica de hibridização in situ para microscopia eletrônica fornece a

localização exata e altamente específica de moléculas de RNA, quando comparada com

a hibridização in situ em amostras incluídas em parafina.

O número limitado de partículas de ouro coloidal encontradas na detecção do

RNA viral em hepatócitos de macacos rhesus, utilizando duas sondas complementares,

pode ser explicado pelo fato de que somente as moléculas de RNA expostas na

superfície de cortes ultrafinos podem ser detectadas e também pelos baixos níveis de

replicação. No complexo replicativo do HCV, estudos bioquímicos, detectaram uma

única fita de RNA de polaridade negativa, para várias fitas de RNA de polaridade

positiva e mais de mil cópias de cada proteína não-estrutural (Quinkert et al., 2005)

podendo-se, assim, explicar a dificuldade na marcação do RNA em microscopia

eletrônica.

A localização do RNA de polaridade negativa, juntamente com a do RNA de

polaridade positiva e as proteínas virais em membranas do RE, descritas no presente

trabalho, podem representar o sítio de replicação do HCV. Esses resultados descrevem o

primeiro relato da marcação do RNA de fita negativa replicativa e evidencia a

replicação do HCV em locais com alterações específicas de membranas do RE no

sistema in vivo por microscopia eletrônica.

As informações obtidas no presente estudo, além de contribuir para a

compreensão da morfogênese viral, poderão, em conjunto com futuros ensaios clínicos,

sorológicos e moleculares elucidar os mecanismos patogenéticos da infecção do HCV

em macacos rhesus.

lxxix

5. Conclusões

lxxx

Conclusões

- A análise ultra-estrutural de tecido hepático de macaco rhesus infectado

experimentalmente com o vírus da hepatite C demonstrou alterações específicas no

citoplasma dos hepatócitos ocasionadas pela infecção viral.

- A técnica de imunomicroscopia eletrônica evidenciou neste sistema in vivo, a

localização das proteínas estruturais e não-estruturais do vírus da hepatite C, em

membranas alteradas do RE, assim como em localização próxima a membranas

mitocondriais.

- A localização do RNA viral de fita de polaridade positiva e de polaridade

negativa foi demonstrada em membranas alteradas do RE, por hibridização in situ,

utilizando a microscopia eletrônica.

- As informações obtidas indicam evidências da replicação do vírus da hepatite C

no citoplasma de hepatócitos de macaco rhesus.

lxxxi

6. Referências Bibliográficas

lxxxii

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