( PDF ) Associação vírus-hospedeiro e epidemiologia molecular de hantavírus em dois distintos ecossistemas amazônicos: Maranhão e Pará-Mato Grosso

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Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

Associação vírus-hospedeiro e epidemiologia

molecular de hantavírus em distintos ecossistemas

amazônicos: Maranhão e Pará–Mato Grosso

DBP/IOC

FIOCRUZ

2008

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Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

Associação vírus-hospedeiro e epidemiologia

molecular de hantavírus em distintos ecossistemas

amazônicos: Maranhão e Pará – Mato Grosso

Tese de Doutorado apresentado a pós-

graduação em Biologia Parasitária do Instituto

Oswaldo Cruz para a obtenção do Título de

Doutor em Ciências na área de Ecologia e

Epidemiologia.

Orientadores: Professora Dra. Elba Regina Sampaio de Lemos

Professor Dr. Pedro Fernando da Costa Vasconcelos

Rio de Janeiro

2008

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Salbé-Travassos da Rosa, Elizabeth

Associação vírus-hospedeiro e epidemiologia molecular de hantavírus em

distintos ecossistemas amazônicos: Maranhão e Pará – Mato Grosso / Elizabeth Salbé

Travassos da Rosa, Rio de Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz, 2008.

xxi, 152 f. il.

Tese (Doutorado em Biologia Parasitária) Coordenação do Curso de Pós-

Graduação em Biologia Parasitária, Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ

1. Hantavírus 2. Ecossistema Amazônico 3. Epidemiologia molecular.

I .Título.

CDU: 578.82/.83:599.323.4

Associação vírus-hospedeiro e epidemiologia molecular de

hantavírus em distintos ecossistemas amazônicos:

Maranhão e Pará – Mato Grosso

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

Tese submetida à Comissão Examinadora composta pelo corpo docente do

Programa de Pós-graduação em Biologia Parasitária da Fundação Oswaldo Cruz e

por professores convidados de outras instituições, como parte dos requisitos

necessários à obtenção do grau de Doutor.

Aprovado em 29 de abril de 2008

Banca Examinadora:

Membros titulares:

Presidente Professor Dr. Paulo Sérgio D’Andrea

Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios

IOC/Fundação Oswaldo Cruz

Revisora Professora Dra. Cibele Rodrigues Bonvicino

Pesquisadora do Instituto Nacional de Câncer – INCA / RJ

Membro convidado: Professor Dr. Luis Tadeu Moraes Figueiredo

Professor Associado da USP, Brasil / Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto / SP

Professora Dra. Elizabeth Lampe

Laboratório de Hepatites Virais / IOC Fundação Oswaldo Cruz

Suplentes:

Professor Dr. Eduardo Volotão

Laboratório de Virologia Comparada / IOC Fundação Oswaldo Cruz

Rio de Janeiro

2008

“Os brotos da esperança crescem alimentados pelo sonho.”

(Taniguchi)

Dedicatória

Dedico a Deus, Pai e Senhor de toda vida,

fonte inesgotável de força em todos os momentos desta e de outras caminhadas.

Ao meu pai Antônio e minha saudosa mãe Adnair (in memoriam),

simplicidade e humildade, fonte de sabedoria,

sendo exemplo de fé e perseverança.

Dando prioridade a educação dos filhos, diante de todas

as adversidades da vida.

Ao Roberto, meu esposo e companheiro, com amor,

pela paciência e esforço na compreensão da minha ausência em nosso lar durante

essa etapa de minha vida.

Ao Roberto, Rodrigo e Rafaela,

filhos amados,

pelo apoio e incentivo nessa jornada.

iii

Agradecimentos

“Somos fortes quando unidos.”

(Platão)

A Deus, por estar sempre presente na minha vida, e tornar tudo possível.

Aos meus orientadores Dra. Elba Regina Sampaio de Lemos, Chefe do Laboratório

de Hantaviroses e Rickettsioses da FIOCRUZ e Dr. Pedro Fernando da Costa

Vasconcelos, Chefe da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do IEC, pelo

apoio, amizade, incentivo e confiança na orientação deste trabalho.

A toda a minha família e amigos pelo incentivo, amor, carinho e compreensão.

Aos meus primeiros e grandes mestres no IEC, Dr. Francisco de Paula Pinheiro, Dr.

Alexandre da Costa Linhares, Dra. Amélia P. A. Travassos da Rosa e Dr. James Le

Duc, pelos ensinamentos e exemplos de profissionalismo.

À direção do Instituto Evandro Chagas, na pessoa da Dra. Elisabeth Conceição de

Oliveira Santos, atual diretora, e sua equipe técnico-administrativa, pelo suporte e

apoio institucional.

Ao Dr. Jorge Fernando S. Travassos da Rosa, pelo incentivo e apoio institucional na

ocasião do ingresso nessa pós-graduação.

À minha companheira de trabalho MSc. Daniele Barbosa de Almeida Medeiros pela

amizade, dedicação, colaboração e apoio técnico, imprescindíveis, no

desenvolvimento desta tese.

Ao Dr. Márcio Roberto Teixeira Nunes pela amizade, valiosa colaboração na biologia

molecular e apoio técnico indispensável para a conclusão deste estudo.

Aos outros colegas do Laboratório de Biologia Molecular, da SEARB/IEC, em

especial as Dras. Ana Cecília Cruz e Helena Vasconcelos, pela amizade, sugestões

e contribuições técnicas.

Aos Drs. Paulo D’Andrea, Cibele Bonvicino e equipe pela colaboração na

identificação taxonômica dos roedores.

À Dra. Cibele Bonvicino pela revisão minuciosa e sugestões feitas a esta tese.

À Dra. Sueli Guerreiro Rodrigues pelo incentivo, apoio e amizade.

Aos colegas de laboratório, Técnico de pesquisa Sr. Armando Pereira, MSc. Taciana

Barbosa, Mestranda Lívia Casseb, MSc. Daniele Medeiros e Auxiliar de pesquisa Sr.

Mário Ferro que assumiram com responsabilidade suas atividades laboratoriais

proporcionando-me a disponibilidade de tempo para concluir esse estudo.

Aos componentes da equipe do trabalho de campo, em especial, aos técnicos Srs.

Osvaldo Vaz, Armando Pereira e Mário Ferro, cuja participação foi de fundamental

importância para o desenvolvimento desse projeto.

Aos demais colegas da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas,

pesquisadores, consultores, técnicos e outros funcionários pela ajuda e

companheirismo fraterno.

À bolsista do PIBIC/CNPq/IEC, sob minha orientação, Darlene Simith, bem como

aos demais estagiários da Seção, em especial ao Samir Casseb, pela ajuda e

colaboração.

À Dra. Olinda Macedo, Seção de Virologia do IEC, por gentilmente ter cedido espaço

no seqüenciador sob sua responsabilidade, em ocasião que necessitei.

Aos colegas do Laboratório de Hantaviroses e Rickettsioses da FIOCRUZ, em

especial as Dras. Renata, Alexsandra, Fabiana e secretária Cristiane pela acolhida

fraterna e apoio técnico.

À bibliotecária do IEC Vânia B. da Cunha Araújo pela revisão na editoração deste

trabalho e a toda sua equipe técnica, pelo apoio na obtenção de artigos científicos e,

em especial à Isabella M. Almeida Mateus, pela impressão desta tese.

Às equipes técnicas da Informática e ASCOM pelo apoio recebido.

Aos colegas da turma do Doutorado Drs. Aldo Valente, Ana Yece, Ana Maria

Ventura, Eliete Araújo, Ester Miranda, Gionovaldo Lourenço, Joana D’Arc

Mascarenhas, Sâmia Demachki, Solange Costa, Vânia Noronha, Wallace e em

especial a Dra. Yvone Gabbay Mendes, pela amizade, convivência fraterna e

solidária no decorrer dessa jornada.

À Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária/

IOC/FIOCRUZ, Dra. Ana Maria Gaspar, atual Coordenadora, Sra. Luciane

Wandermurem, Secretária, e aos demais funcionários pelo apoio e orientação

concedidos durante esse estudo.

Aos professores Drs. Cláudio Ribeiro, José Coura, Ricardo Lourenço, Márcio Bóia,

Henrique Lenz, Ana Maria Gaspar, Márcia Lazera, Bodo Wanke, Diamar Pinto, Yara

Traub-Cseko, Andréa Pons, Leonardo Carvalho e Alda Cruz / FIOCRUZ e Maristela

Cunha / UFPA pelos ensinamentos repassados.

Aos professores Drs. Cristovam Picanço Diniz, Maria da Conceição Pinheiro, Luís

Carlos Silveira e José Luís Nascimento/ UFPA, pelo empenho para a realização

dessa pós-graduação.

À Secretaria Executiva de Ciência, Tecnologia e Meio Ambiente do Estado do Pará

(SECTAM), atualmente SEDECT, pela concessão de bolsa de estudo.

Às Secretarias de Saúde dos Estados e Municípios que fazem parte desse estudo,

responsáveis pelo encaminhamento das amostras biológicas humanas ao IEC.

Aos Drs. Mauro Rosa Elkhoury e Elizabeth Davi, da Gerência Técnica de

Hantavirose/SVS/MS, no ínicio desse estudo, e à Dra. Marília Lavocat Nunes,

atualmente, nessa gerência, pelo bom entrosamento no estudo colaborativo, bem

como pelo fornecimento de dados epidemiológicos atualizados sobre as

hantaviroses no Brasil.

A todos os pacientes que tiveram suas amostras biológicas incluídas nesse estudo,

alguns (in memoriam), o meu muito obrigado.

A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse

trabalho e para minha formação profissional, minha eterna gratidão.

RESUMO

A Síndrome Pulmonar por Hantavírus (SPH) na Amazônia brasileira vem sendo

diagnosticada desde 1995, com a identificação do hantavírus Castelo dos Sonhos.

Até setembro de 2007 já foram registrados 158 casos de SPH procedentes dos

estados do Amazonas, Pará, Rondônia, Maranhão e Mato Grosso. O objetivo

principal deste estudo foi à caracterização genética de hantavírus e determinação da

associação vírus-hospedeiro dos hantavírus brasileiros associados com SPH em

distintos ecossistemas amazônicos no Maranhão e Pará-Mato Grosso. As amostras

biológicas, estudadas, procederam de casos de SPH, de inquérito sorológico

humano e de espécimes de roedores provenientes de estudos ecoepidemiológicos

realizados nos municípios de Anajatuba/MA, Campo Novo do Parecis/MT, Tangará

da Serra/MT e Altamira/PA. Amostras de soros e/ou sangue de humanos, bem como

sangue de roedores foram, inicialmente, submetidos ao teste imunoenzimático

(ELISA) visando à detecção de anticorpos anti-hantavírus. A RT Nested-PCR e/ou

RT Hemi-Nested-PCR, seguidas do seqüenciamento nucleotídico parcial do gene N

e análises filogenéticas das amostras positivas foram realizados para caracterização

genética. A amplificação do genoma viral foi obtida em três amostras humanas do

Maranhão; três do Pará; e 20 de Mato Grosso; bem como em 14 amostras de

roedores capturados, sendo três de Anajatuba [Necromys lasiurus (n=1) e

Oligoryzomys aff. fornesi (n=2)]; cinco roedores de Campo Novo do Parecis e dois

de Tangará da Serra, todos da espécie Calomys aff. callosus; e quatro amostras de

roedores da espécie Oligoryzomys aff. moojeni, dos estudos em Campo Novo do

Parecis. O inquérito sorológico em humanos realizado no ano de 2005 em Anajatuba

mostrou imunidade em 10,9 % da população local estudada sugerindo a circulação

de hantavírus autóctones e ocorrência silenciosa dessa virose na região. As análises

filogenéticas entre as seqüências obtidas neste estudo e de outros hantavírus

disponíveis no GenBank demonstraram que o vírus Anajatuba é o hantavírus

responsável pelos casos de SPH no Estado do Maranhão e os roedores

Oligoryzomys aff. fornesi constituem os reservatórios transmissores desse

hantavírus nesse estado; o vírus Castelo dos Sonhos continua sendo o responsável

pelos casos de SPH no Pará, tendo provavelmente como reservatório o roedor

Oligoryzomys aff. moojeni; o vírus Laguna Negra associado ao roedor Calomys aff.

callosus é o hantavírus responsável pelos casos de SPH no Estado do Mato Grosso.

Finalmente, se demonstrou a ocorrência do vírus Castelo dos Sonhos em roedores

da espécie Oligoryzomys aff. moojeni capturados no Município de Campo Novo do

Parecis, sugerindo a possibilidade que esse vírus também seja responsável pelos

casos de SPH nesta área. Esse trabalho é pioneiro no estudo das hantaviroses na

Amazônia brasileira, e servirá de suporte para estudos moleculares e

epidemiológicos futuros.

vii

ABSTRACT

In the Brazilian Amazon the Hantavirus Pulmonary Syndrome (HPS) has been

diagnosed since 1995, with the identification of Castelo dos Sonhos virus. Up to

September 2007 158 HPS cases have been already reported from the states of

Amazonas, Pará, Rondônia, Maranhão and Mato Grosso. The main objective of this

study was the genetic characterization of hantavirus and determination of the virus-

host association of Brazilian hantaviruses associated with HPS in different

Amazonian ecosystems in Maranhão and Pará-Mato Grosso. Samples studied were

obtained from HPS cases, serological survey on humans and rodents from eco-

epidemiological studies conducted in the municipalities of Anajatuba / MA, Campo

Novo do Parecis / MT, Tangará da Serra / MT and Altamira / PA. Samples of serum

and / or blood of humans as well as blood of rodents were initially submitted to on

enzyme-linked immunesorbent assay (ELISA) for the detection of anti-hantavirus

antibodies. The Nested RT-PCR and / or Hemi-nested RT-PCR, followed by partial

nucleotide sequencing of N gene and phylogenetic analyses of positive samples

were performed to genetic characterization. Amplification of the viral N gene was

obtained from three human serum samples of Maranhão; three of Pará, and 20 of

Mato Grosso, and in 14 samples of trapped rodents being in: three of Anajatuba,

[Necromys lasiurus (n = 1) and Oligoryzomys aff. fornesi (n = 2)]; five rodents from

Campo Novo do Parecis and two of Tangará da Serra, all of them from Calomys aff.

callosus, and four specimens from Oligoryzomys aff. moojeni, collected in Campo

Novo do Parecis. The serological survey conducted in humans in 2005 in Anajatuba

showed immunity in 10.9 % of the studied local population suggesting that infections

by indigenous hantavirus and the occurrence of asymptomatic or mild infections by

these viruses is commonplace the region. The phylogenetic analyses between

sequences obtained in this study and from other hantaviruses available in the

GenBank showed that Anajatuba virus is responsible for HPS cases in the state of

Maranhão and rodents Oligorzomys aff. fornesi are its natural reservoir in this state;

Castelo dos Sonhos virus remains responsible for HPS cases in Pará state, and

probably its reservoir is the rodent Oligoryzomys aff. moojeni. Furthermore, Laguna

Negra virus associated with rodent Calomys aff. callosus is responsible for HPS

cases in Mato Grosso state. Finally it was demonstrated the occurrence of the

Castelo dos Sonhos virus in rodents Oligoryzomys aff. moojeni captured in Campo

Novo do Parecis municipality, suggesting the possibility that this virus also be

responsible for HPS cases in this area. This is a pioneer work on hantaviruses in the

Brazilian Amazon, and will provide support for further molecular and epidemiological

studies.

viii

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

~ Aproximadamente

® Marca registrada / Registered trademark

ºC Centígrados

% Percentagem

α Alfa

β Beta

∆div Divergência genética

µL Microlitro

A Adenina

A 549 Linhagem celular humana de carcinoma de pulmão

ABTS Substrato enzimático (2,2-azino-di [3-ethybenthiazoline

sulfonate])

AIC Akaike Information Criterion

ANAJV Vírus Anajatuba

AND AH-1 Vírus Andes Sout AH-1

ANDV Vírus Andes

APV Vírus Alto Paraguay

ARAV Vírus Araraquara

BAYV Vírus Bayou

BCCV Vírus Black Creek Canal

BERJ Vírus Andes North Bermejo

BLLV Vírus Bloodland Lake

BMJV Vírus Andes Bermejo

C Citosina

CANOV Vírus Cãno Delgadito

CASV Vírus Castelo dos Sonhos

CDC Centers for Disease Control and Prevention

cDNA Ácido desoxirribonucléico complementar

CG Complexo de Golgi

CHOV Vírus Choclo

CITV Comitê Internacional em Taxonomia de Vírus

CTI Centro de Terapia Intensiva

DNA Ácido desoxirribonucléico / Deoxyribonucleic Acid

dNTP Deoxinucleotídeo

D.O. Densidade óptica

DOBV Vírus Dobrava

DTT 1,4-ditiotreitol

EDTA Etileno-diamino tetra acetato de sódio

ELISA Ensaio imunoenzimático / Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ELMCV Vírus El Moro Canyon

FHSR Febre Hemorrágica com Síndrome Renal

FIOCRUZ Fundação Instituto Oswaldo Cruz

Gn Glicoproteína n

Gc Glicoproteína c

g Grama

G Guanina

HCl Ácido clorídrico

HLA Human Leucocyte Antigens

HTNV Vírus Hantaan

IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais

Renováveis

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IEC Instituto Evandro Chagas

IFI Imunofluorescência Indireta

IgG Imunoglobulina G

IgM Imunoglobulina M

INCA Instituto Nacional de Câncer

IslaV Vírus Isla Vista

JUQV Vírus Juquitiba-Araucária

KHAV Vírus Khabarovsk

KCl Cloreto de potássio

KDa Kilodáltons

km Quilômetros

Quilômetros quadrado

L Litros

LECV Vírus Andes Lechiguanas

LNV Vírus Laguna Negra

LPI Local provável de infecção

LSCV Vírus Limestone Canyon

MCMC Markov Chain Monte Carlo

MgCl

Cloreto de magnésio

M RNA RNA do segmento M

mL Mililitro

mm Milímetro

mM Milimolar

MP Máxima Parcimônia

MS Ministério da Saúde

MULV Vírus Muleshoe

MV Máxima Verossimilhança

N Nucleoproteína

NaCl Cloreto de sódio

NB3 Laboratório com nível de biossegurança 3

NCR Região não codificadora

NEMV Vírus Andes Neembucu

NI Não informado

NJ Neighbor Joining

nm Nanômetro

nt Nucleotídeo

NYV Vírus New York

OMS Organização Mundial da Saúde

ORF Cadeia aberta para leitura (Open Reading Frame)

ORNV Vírus Andes North Oran

pb Pares de bases

PBS Solução salina tamponada

PCR Reação em cadeia mediada pela polimerase

pH Potencial hidrogeniônico

PHV Vírus Prospect Hill

PRNV Vírus Pergamino

PUUV Vírus Puumala

QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit

RE Retículo endoplasmático

RIMEV Vírus Rio Mearim

RIOMV Vírus Rio Mamoré

RIOSV Vírus Rio Segundo

RNA Ácido ribonucleico / Ribonucleic Acid

RT Transcrição reversa

RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

SAAV Vírus Saaremaa

SEOV Vírus Seoul

SESPA Secretaria de Estado de Saúde Pública do Estado do Pará

SPCVH Síndrome Pulmonar e Cardiovascular por Hantavírus

SPH Síndrome Pulmonar por Hantavírus

SNV Vírus Sin Nombre

SRNA RNA do segmento S

SVS Secretaria de Vigilância em Saúde

T Timina

TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

xii

Trademark

TOPV Vírus Topografov

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

TULV Vírus Tula

U Uracila, Unidade internacional

URSS União das Repúblicas Socialistas Soviéticas

UV Ultravioleta

VERO E-6 Células de rim de macaco verde africano

v/v Volume/volume

–

Qui-quadrado

xiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 –

(A) Mapa da Coréia do Norte e do Sul, mostrando a

localização do rio Han próximo da divisa entre os dois países.

(B) Vilarejo de Songnaeri, área rural da Coréia do Sul, situado

às margens do rio Han. Local de captura do roedor Apodemus

agrarius, do qual foi isolado o vírus Hantaan, em 1976; (C) Rio

Han.…………………………………………................................... 2

Figura 2 –

Representação esquemática dos membros da família

Bunyaviridae, mostrando componentes virais. Genoma

constituído por três segmentos de RNA (L, M, S), associados

com a polimerase viral (proteína L); a proteína do

nucleocapsídio (proteína N); envelope viral de constituição

lipoprotéica, apresentando espículas que representam as

glicoproteínas Gn e Gc............................................................... 6

Figura 3 –

Estrutura genômica dos hantavírus............................................ 8

Figura 4 –

Esquema da estratégia de replicação dos membros da família

Bunyaviridae............................................................................... 10

Figura 5 –

Ciclo biológico de transmissão dos hantavírus........................... 13

Figura 6 –

Mapa do continente americano, mostrando os hantavírus

identificados e seus respectivos roedores-reservatórios............ 15

Figura 7 –

Distribuição dos casos de hantaviroses por Unidade

Federada, Brasil, 1993 a setembro de 2007.............................. 16

Figura 8 –

Árvore filogenética dos hantavírus baseada nas seqüências

completas das ORFs do segmento S......................................... 22

Figura 9 –

Município de Anajatuba, Estado do Maranhão........................... 29

Figura 10 –

Mapa do Estado do Maranhão, mostrando a localização dos

municípios de Anajatuba e Santa Rita, onde ocorreram casos

de SPH....................................................................................... 30

xiv

Figura 11 –

Município de Santa Rita, Estado do Maranhão.......................... 31

Figura 12 –

Mapa do Município de Anajatuba, Estado do Maranhão,

mostrando a localização dos povoados onde foi realizado o

inquérito sorológico em humanos, o local da captura de

roedores e locais de ocorrência dos casos de

SPH............................................................................................

Figura 13 –

Locais utilizados para a captura de roedores, povoado de São

Roque......................................................................................... 33

Figura 14 –

Mapa do Brasil destacando a região sudeste da Amazônia

brasileira, constituída pelo sul do Estado do Pará e Estado do

Mato Grosso. Distribuição do número de casos de SPH por

município amazônico no período de 1993 a 2006...................... 34

Figura 15 –

Mapa do Estado do Pará, mostrando a sede do Município de

Altamira e os distritos de Castelo dos Sonhos e Cachoeira da

Serra, locais de registro de casos de SPH................................. 35

Figura 16 –

Mapa do Estado do Mato Grosso, destacando os municípios

dos casos de SPH estudados..................................................... 37

Figura 17 –

Esquema da técnica de ELISA IgM e IgG ................................. 40

Figura 18 –

Esquema da técnica de RT Nested-PCR ou RT Hemi-Nested-

PCR............................................................................................ 42

Figura 19 –

Gel de agarose a 1,5%, mostrando amplicons de

aproximadamente 400 pares de base (pb) das amostras RT

Nested-PCR positivas do Estado do Maranhão......................... 49

Figure 20 –

Análise filogenética das seqüências parciais do segmento

SRNA de cepas de hantavírus procedentes do Estado do

Maranhão, utilizando os métodos de Máxima Verossimilhança

e Bayesiano................................................................................ 50

Figura 21 –

Análise filogenética das seqüências parciais do segmento

SRNA de cepas de hantavírus procedentes dos estados do

Mato Grosso e Pará, utilizando os métodos de Máxima

Verossimilhança e Bayesiano..................................................... 58

Figura 22 –

Análise filogenética das seqüências nucleotídicas parciais do

segmento SRNA de cepas de hantavírus procedentes dos

Municípios do Estado do Mato Grosso, associando os

genótipos do hantavírus LNV ao ano de notificação, local

provável de infecção e evolução clínica dos casos de

SPH.............................................................................................

Figura 23 –

Mapa da distribuição geográfica dos grupos e subgrupos de

hantavírus e correlação com os roedores hospedeiros

sigmondontineos no continente Americano................................ 65

Figura 24 –

Mapa do Brasil, mostrando os biomas com respectivos

hantavírus associados a seus roedores hospedeiros.................

Figura 25 –

Atividades de risco comumente praticadas em Anajatuba......... 69

Figura 26 –

Distribuição geográfica do Calomys nos estados do Mato

Grosso do Sul e Mato Grosso.................................................... 74

Figura 27 –

Distribuição das espécies de roedores silvestres Oligoryzomys

sp. e Necromys lasiurus no Brasil..............................................

xvi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 –

Dados dos municípios matogrossenses de procedência

das amostras selecionadas nesse estudo........................... 36

Tabela 2 –

Hantavírus utilizados para a construção da árvore

filogenética de seqüências nucleotídicas parciais do gene

N, segmento S..................................................................... 44

Tabela 3 –

Sumário dos casos de SPH procedentes do Estado do

Maranhão, confirmados laboratorialmente no IEC, 2003 a

2006..................................................................................... 45

Tabela 4 –

Amostras de soros humanos coletadas em zona urbana e

rural do Município de Anajatuba em maio de

2005..................................................................................... 47

Tabela 5 –

Roedores capturados no povoado de São Roque,

Município de Anajatuba, Estado do Maranhão, nos anos

de 2003 e 2005.................................................................... 48

Tabela 6 –

Homologia entre cepas de hantavírus procedentes do

Estado do Maranhão e outros hantavírus relacionados da

América do Sul..................................................................... 52

Tabela 7 –

Dados das amostras de pacientes dos estados do Pará e

Mato Grosso e incluídos neste estudo com

seqüenciamento nucleotídico parcial do gene N................. 54

Tabela 8 –

Roedores capturados nos municípios de Campo Novo do

Parecis e Tangará da Serra, Estado do Mato Grosso, em

2001 e Castelo dos Sonhos, Estado do Pará no ano de

2005..................................................................................... 55

Tabela 9 –

Roedores capturados no Estado do Mato Grosso,

sorologicamente positivos, que foram selecionados para

análise molecular (RT Nested-PCR) ................................... 56

xvii

Tabela 10 –

Homologia entre cepas de hantavírus identificadas de

casos humanos de SPH procedentes do Estado do Pará,

de amostras de Oligoryzomys aff. moojeni capturados no

Estado do Mato Grosso e de outros hantavírus

relacionados a estes da América do Sul.............................. 59

Tabela 11 –

Homologia entre cepas de hantavírus procedentes do

Estado do Mato Grosso e outros hantavírus relacionados

a estes da América do Sul................................................... 62

xviii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 1

1.1 HISTÓRICO............................................................................................ 1

1.2 ASPECTOS VIROLÓGICOS................................................................... 5

1.2.1 Classificação taxonômica, morfologia, propriedades físico-químicas

e estrutura genômica.......................................................................... 5

1.2.2 Replicação Viral................................................................................... 9

1.3 ASPECTOS CLÍNICOS E TRATAMENTO DA SÍNDROME

PULMONAR POR HANTAVÍRUS...................................................... 10

1.3.1 Manifestações clínicas......................................................................... 10

1.3.2 Tratamento........................................................................................... 11

1.4 EPIDEMIOLOGIA E ECOLOGIA............................................................ 12

1.4.1 Transmissão......................................................................................... 12

1.4.2 Distribuição Geográfica........................................................................ 14

1.4.3 Reservatórios....................................................................................... 17

1.5. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL......................................................... 19

1.6 FILOGENIA E DIVERSIDADE GENÉTICA............................................. 21

1.7 CONTROLE E PREVENÇÃO................................................................. 24

2 RELEVÂNCIA............................................................................................ 26

3 OBJETIVOS............................................................................................... 28

3.1 GERAL.................................................................................................... 28

3.2 ESPECÍFICOS........................................................................................ 28

4 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................... 29

4.1. ESTUDO NO MARANHÃO.................................................................... 29

4.1.1. Descrição da área............................................................................... 29

4.1.2 Estudo em Humanos............................................................................ 31

4.1.2.1 Casos de SPH................................................................................... 31

4.1.2.2 Inquérito sorológico .......................................................................... 31

4.1.3 Estudo em Roedores .......................................................................... 32

4.1.3.1 Captura dos roedores ...................................................................... 32

4.1.3.2 Coleta do material biológico e identificação dos roedores ............... 33

4.2 ESTUDO NO PARÁ-MATO GROSSO................................................... 34

4.2.1 Descrição da Área............................................................................... 34

4.2.1.1 Estado do Pará................................................................................. 34

4.2.1.2 Estado do Mato Grosso.................................................................... 35

4.2.2 Estudo em Humanos .......................................................................... 37

4.2.2.1 Casos de SPH.................................................................................. 37

4.2.3 Estudo em Roedores ........................................................................ 38

4.3 TÉCNICAS SOROLÓGICAS................................................................. 38

4.3.1 ELISA para detecção de IgM humana anti-hantavírus ...................... 39

4.3.2 ELISA para detecção de IgG humana anti-hantavírus ...................... 40

4.3.3 ELISA para detecção de IgG roedores anti-hantavírus...................... 41

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................ 41

4.5 TÉCNICAS MOLECULARES.......................................................,......... 41

4.5.1 Extração do RNA viral.......................................................................... 41

4.5.2 RT Nested-PCR.................................................................................. 42

4.5.3 Seqüenciamento nucleotídico ............................................................ 43

4.5.4 Análise filogenética............................................................................. 43

5 RESULTADOS.......................................................................................... 45

5.1 ECOSSISTEMA DO MARANHÃO.......................................................... 45

5.1.1 Casos de SPH...................................................................................... 45

5.1.2 Inquérito sorológico em moradores do Município de

Anajatuba......................................................................................... 46

5.1.3 Roedores capturados em Anajatuba.................................................... 47

5.1.4 Detecção do genoma viral e análise filogenética................................. 48

5.2 ECOSSISTEMA DO PARÁ-MATO GROSSO......................................... 53

5.2.1 Amostras Humanas.............................................................................. 53

5.2.2 Amostras de roedores.......................................................................... 54

5.2.3 Análise filogenética.............................................................................. 57

5.3 FILOGENIA: ASSOCIAÇÃO GEOGRÁFICA E COM ROEDORES

HOSPEDEIROS................................................................................... 63

6 DISCUSSÃO.............................................................................................. 67

6.1 ECOSSISTEMA DO MARANHÃO.......................................................... 67

6.2 ECOSSISTEMA PARÁ-MATO GROSSO............................................... 72

6.3 ASSOCIAÇÃO FILOGENIA, DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA E

ROEDOR-HOSPEDEIRO..................................................................... 78

6.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................... 81

7 CONCLUSÕES.......................................................................................... 83

8 PERSPECTIVAS FUTURAS .................................................................... 84

9 REFERÊNCIAS......................................................................................... 85

APÊNDICES.................................................................................................. 108

APÊNDICE A ................................................................................................ 109

APÊNDICE B................................................................................................ 115

ANEXOS....................................................................................................... 117

ANEXO A...................................................................................................... 118

ANEXO B ..................................................................................................... 119

ANEXO C...................................................................................................... 121

ANEXO D..................................................................................................... 131

ANEXO E ..................................................................................................... 136

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

1 INTRODUÇÃO

1.1 HISTÓRICO

A hantavirose é uma doença zoonótica amplamente distribuída nos

continentes Europeu, Asiático e Americano, causada por vírus pertencentes à família

Bunyaviridae, gênero Hantavirus. Os hantavírus até o ano de 1993 eram apenas

reconhecidos como agentes etiológicos da Febre Hemorrágica com Síndrome Renal

(FHSR), nome recomendado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para

designar um grupo de doenças infecciosas agudas hemorrágicas com disfunção

renal, identificadas desde 1913 em países da Europa e Ásia, e desde 1986 na

África, recebendo diferentes denominações: nefrosenefrite hemorrágica na antiga

União das Repúblicas Socialistas Soviéticas (URSS), febre songo ou febre

hemorrágica epidêmica na China, febre hemorrágica coreana na Coréia, nefropatia

epidêmica na Escandinávia, nefrite epidêmica ou febre hemorrágica epidêmica na

Europa Oriental e febre hemorrágica epidêmica no Japão (LEE, 1988).

As hantaviroses foram reconhecidas por volta de 1951 a 1954, quando

tropas militares durante a guerra da Coréia foram acometidas de uma doença febril

aguda com manifestações hemorrágicas e ocorrência de mais de 3.000 casos com

taxa de letalidade em torno de 5 a 10%. No entanto, o isolamento do vírus Hantaan

(HTNV), agente etiológico dessa febre hemorrágica da Coréia somente ocorreu em

1976, obtido a partir do tecido pulmonar de roedor silvestre (Apodemus agrarius

coreae), capturado às margens do rio Han, no vilarejo de Songnaeri, região rural da

Coréia (Figura 1), o que possibilitou um grande avanço no estudo dos hantavírus

(LEE e LEE, 1976, 1977 e 1978; LEE, 1989; SCHMALJOHN e NICHOL, 2007). Esse

vírus foi incluído na família Bunyaviridae, por recomendação de McCORMICK et al.

(1982), WHITE et al. (1982), HUNG et al. (1983a) e HUNG et al. (1983b) já que, pela

morfologia das partículas virais, esses autores observaram inequívoca evidência de

similaridade com outros membros dessa família (IVERSSON, 1996).

Com efeito, pesquisas realizadas posteriormente mostraram que tanto a

febre hemorrágica epidêmica da República Popular da China quanto à nefrose

nefrite da ex-URSS tinham como agente etiológico o vírus Hantaan ou outro vírus a

ele relacionado. Mais tarde, outro vírus antigenicamente relacionado ao vírus

Hantaan foi isolado, sendo denominado Puumala (PUUV), agente etiológico da febre

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

hemorrágica com síndrome renal da Europa Oriental e da nefropatia epidêmica da

Escandinávia (BRUMMER et al., 1980; BRUMMER et al., 1982; LEE et al., 1982;

YANAGIHARA et al., 1984a; YANAGIHARA et al., 1984b). Em 1982, foi identificado

novo vírus denominado Seoul (SEOV), isolado de roedores capturados na região

urbana de Seoul, na Coréia (LEE et al., 1982).

Figura 1 – (A) Mapa da Coréia do Norte e do Sul, mostrando a localização do rio Han próximo da

divisa entre os dois países. (B) Vilarejo de Songnaeri, área rural da Coréia do Sul, situado

às margens do rio Han. Local de captura do roedor Apodemus agrarius, do qual foi isolado

o vírus Hantaan, em 1976; (C) Rio Han. Fonte: (A) adaptado de Google Earth

(http://earth.google.com/intl/pt/); (B e C) LEE, 1989.

Posteriormente, verificou-se notável freqüência de infecção por hantavírus

em diversas espécies de roedores silvestres nativos do Velho Mundo e Novo Mundo,

com exceção do vírus Seoul, que é encontrado infectando Rattus norvegicus

(ratazana) e Rattus rattus (rato do telhado), espécies urbanas e amplamente

distribuídas em todos continentes (LEDUC et al., 1986).

Em 1984, outro hantavírus foi isolado a partir de roedores silvestres

(Microtus pennsylvanicus) capturados em Prospect Hill, Frederick, Maryland, EUA,

denominado Prospect Hill (LEE et al., 1985), porém sem evidência de infecção

clínica humana (YANAGIHARA et al., 1984c).

Nas Américas, apesar da ausência de roedores nativos da subfamília

Murinae, reservatórios estes responsáveis pela transmissão da doença ao homem,

os hantavírus associados à FHSR provavelmente foram introduzidos juntamente

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

com os muríneos das espécies R. rattus e R. norvegicus, hospedeiros do vírus Seoul

(LEE, 1988). Esta hipótese foi corroborada em inquéritos sorológicos realizados por

estudos colaborativos no Brasil, na década de 1980, pelo Instituto Evandro Chagas

(IEC), e laboratórios dos Estados Unidos e da Coréia, que revelaram a presença de

anticorpos (7,4%) por Imunofluorescência Indireta (IFI) para o vírus Hantaan em

residentes de várias localidades da Amazônia (LEDUC et al., 1985).

Posteriormente, comprovou-se a imunidade para o agente em 56% dos

ratos de Belém, 14% de São Paulo e 6% de Recife e Olinda (LEDUC et al., 1986).

Em 1983, se obteve o primeiro isolamento de um vírus do gênero Hantavirus na

América do Sul, a partir das vísceras de um R. novergicus, capturado em Belém, que

na sua identificação mostrou tratar-se de amostra antigenicamente relacionada ao

vírus Seoul (LEDUC et al., 1985).

Ainda em 1984, mais evidências dessa hipótese foram encontradas nos

Estados Unidos, onde se correlacionou a alta incidência de doença crônica renal em

habitantes de Baltimore, Maryland, EUA, com alta prevalência de anticorpos para

infecção do vírus Seoul e outros hantavírus em R. norvegicus (LEDUC et al., 1984).

Sabe-se que o vírus Seoul é o único hantavírus de ocorrência cosmopolita, atingindo

inclusive a área urbana, devido à distribuição do roedor e seu hospedeiro principal,

R. norvegicus (LEDUC et al., 1984; LEDUC et al., 1985).

No ano de 1987, atendendo sugestão de trabalhos de DESMYTER et al.

(1984) e SCHMALJOHN et al. (1985), o Comitê Internacional em Taxonomia de

Vírus (CITV) aceitou a criação de um novo gênero da família Bunyaviridae

denominado Hantavirus que incluiu como membros os vírus Hantaan, Seoul,

Puumala e Prospect Hill (LEE, 1988).

No Brasil, em 1990, anticorpos específicos para o vírus Seoul foram

detectados em pacientes com diagnóstico de leptospirose em Recife, no Estado de

Pernambuco e anticorpos para o vírus Hantaan e Puumala nas cidades de São

Paulo, no Estado de São Paulo e Paranaguá, no Estado do Paraná, caracterizando

a circulação desse vírus no país (LEDUC, 1991; IVERSSON, 1991; IVERSSON et

al., 1994; ROMANO-LIEBER et al., 1995a, 1995b). Em 1991, durante investigação

para esclarecer a causa de sete óbitos ocorridos em Manaus, Estado do Amazonas,

suspeitos de febre hemorrágica, 80 soros de familiares e vizinhos foram colhidos,

seis dos quais apresentaram títulos elevados para hantavírus, sugerindo uma

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circulação endêmica silenciosa desses vírus (VASCONCELOS et al., 1992). Em

1993, diversos casos diagnosticados clinicamente como febre hemorrágica,

ocorridos em Mato Grosso (n=1), São Paulo (n=4), Roraima (n=2) e Rondônia (n=1)

foram confirmados sorologicamente e atribuídos a hantavírus (LEDUC, 1991

IVERSSON et al., 1994).

A forma respiratória da doença, com grande letalidade, reconhecida em

junho de 1993 (NICHOL et al., 1993; CDC, 1993, 1994a e 1994b) em uma epidemia

de doença respiratória grave, na região sudoeste dos Estados Unidos conhecida

como four corners teve como responsável um novo hantavírus, que foi chamado

inicialmente Four Corners, em seguida Muerto Canyon e finalmente Sin Nombre

(SNV), e representou o primeiro registro de Síndrome Pulmonar por Hantavírus

(SPH) no mundo, doença considerada emergente de grande impacto na saúde

pública. Estudos retrospectivos sugerem a ocorrência dessa doença desde 1959

(FRAMPTON apud SCHMALJOHN e NICHOL, 2007).

Em novembro e dezembro de 1993, três casos da SPH foram

diagnosticados na área rural de Juquitiba, Estado de São Paulo, constituindo o

primeiro registro clínico no Brasil (IVERSSON et al.,1994; VASCONCELOS et al.,

1997). A seguir a SPH passou a ser reconhecida em outros países e possibilitou o

isolamento de novas espécies, se encontrando hoje amplamente distribuída nas

Américas. Após a descrição de importante comprometimento cardíaco, a partir da

publicação dos primeiros casos da América do Sul, a SPH tem sido descrita no

Brasil como Síndrome Pulmonar e Cardiovascular por Hantavírus (SPCVH)

(FIGUEIREDO et al., 2001; FERREIRA, 2003; SAGGIORO et al., 2007).

Em 1994, foi observada uma positividade de 31,1% em soros de 119

doentes internados em hospitais de Salvador, Estado da Bahia (TRAVASSOS DA

ROSA et al., 1995). E em 1998, uma avaliação sorológica em 379 estudantes de

Salvador, Bahia, mostrou uma positividade para Hantaan de 13,2%, e todas as

amostras foram negativas para Sin Nombre, sugerindo infecção precoce por

Hantaan ou outro hantavírus associado (MASCARENHAS-BATISTA et al., 1998).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

1.2 ASPECTOS VIROLÓGICOS

1.2.1 Classificação taxonômica, morfologia, propriedades físico-

químicas e estrutura genômica

A família Bunyaviridae, formalmente estabelecida em 1975 e atualmente

contendo mais de 300 vírus sorologicamente distintos, está dividida em cinco

gêneros: Orthobunyavirus, Phlebovirus, Nairovirus, Hantavírus, e Tospovirus.

(SCHMALJOHN et al., 1985; SCHMALJOHN e NICHOL, 2007; FAUQUET et al.,

2005). Os hantavírus, mantidos na natureza pela infecção crônica de roedores

silvestres, formam um gênero separado dentro da família, e os demais são

arbovírus, vírus transmitidos por artrópodes, que se mantêm em natureza através da

transmissão biológica entre vertebrados suscetíveis e artrópodes hematófagos,

exceto para os tospovírus, que são vírus transmitidos por insetos para vegetais

(CALISHER e SCHMALJOHN, 1999; SCHMALJOHN e NICHOL, 2007).

A taxonomia dos hantavírus é complexa, e está sendo atualmente melhor

compreendida (LEDNICKY, 2003). O CITV estabeleceu que o conceito de espécie

de hantavírus deveria considerar os seguintes critérios: (i) estar associado a uma

única espécie ou subespécie de roedor reservatório primário (nicho ecológico); (ii)

apresentar, no mínimo, 7% de diferença na seqüência de aminoácidos das

glicoproteínas de superfície (Gn e Gc) e na nucleoproteína; (iii) apresentar, no teste

de neutralização, uma diferença mínima de quatro vezes no título de anticorpos; (iv)

e não formar rearranjos naturais com outras espécies de hantavírus (PLYUSNIN,

2002). Sendo assim, no oitavo relato do CITV, são reconhecidas 22 espécies

diferentes de hantavírus (FAUQUET et al., 2005).

Dentro dessa classificação de espécies de hantavírus preconizada pelo

CITV, existem algumas contrapartidas. O fato da dificuldade de isolamento em

cultivo celular aliada a não visualização de efeito citopático nas infecções in vitro por

muitos hantavírus, torna freqüentemente impraticável a realização dos ensaios de

neutralização em placa (MONROE et al., 1999). O outro critério relaciona-se à

complexa taxonomia dos roedores, uma vez que com o advento da análise da

seqüência do Ácido Desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic Acid, DNA) mitocondrial

tem-se revelado um número maior de espécies da subfamília Sigmodontinae do que

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era conhecido até pouco tempo atrás, gerando um movimento de reclassificação,

tanto em espécie como em gênero de roedores (PLYUSNIN, 2002).

Os hantavírus, bem como o restante dos integrantes da família

Bunyaviridae são similares morfologicamente, exibindo partículas de 80 a 120 nm de

diâmetro com forma esférica ou pleomórfica. Possuem um envelope formado por

dupla camada lipídica, oriunda da célula hospedeira, na qual estão inseridas as

espículas das glicoproteínas virais, de 5-10 nm, envolvendo o nucleocapsídio,

formado por um “core” protéico e pelo genoma Ácido Ribonucléico (Ribonucleic Acid,

RNA) trisegmentado associado à polimerase viral (Figura 2). Todos os bunyaviridae

têm duas proteínas designadas como Gn e Gc (anteriormente, G1 e G2), com

exceção dos nairovírus que possuem três glicoproteínas (FAUQUET et al., 2005;

LEDNICKY, 2003).

Figura 2 – Representação esquemática dos membros da família Bunyaviridae, mostrando

componentes virais. Genoma constituído por três segmentos de RNA (L, M, S),

associados com a polimerase viral (proteína L); a proteína do nucleocapsídio

(proteína N); envelope viral de constituição lipoprotéica, apresentando espículas que

representam as glicoproteínas Gn e Gc. Fonte: adaptado de MEDEIROS, 2004. O

canto direito inferior mostra eletromicrografia eletrônica de transmissão de células

infectadas com o vírus Hantaan, observando partículas virais (seta) com morfologia

similar aos dos integrantes da família Bunyaviridae. Fonte: CDC.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

Como os outros vírus envelopados, os hantavírus são rapidamente

inativados pelo calor, detergentes, solventes orgânicos e soluções de hipoclorito.

Apresentam uma densidade flutuante de 1,18 g/mL em gradiente de sucrose. Sua

partícula viral consiste de mais de 50% de proteína, 20 a 30% de lipídio e 2 a 7% de

carboidrato (GONZALEZ-SCARANO et al., 1996).

O genoma dos hantavírus é constituído por três segmentos de RNA fita

simples com polaridade negativa (anti-senso), sendo: um segmento grande (L)

contendo aproximadamente 6500 nucleotídeos, um segmento médio (M), que tem

agrupado de 3.600 a 3.800 nucleotídeos, e um segmento pequeno (S), com cerca de

1.700 a 2.100 nucleotídeos (NICHOL et al., 1996; McCAUGHEY e HART, 2000).

Regiões não codificadoras terminais (NCR) 5’ e 3’, altamente

conservadas (AUCAUCAUC) e complementares entre si, têm sido encontradas nos

três segmentos genômicos dentro de um mesmo gênero da família Bunyaviridae,

mas diferem entre os vírus dos distintos gêneros (PLYUSNIN et al., 1996;

SCHMALJOHN, 1996). Estas seqüências complementares que são formadas por

cerca de 40 a 50 nucleotídeos permitem a formação de estruturas estáveis em

formato de raquete, “pan-handle”, por meio de pareamento de bases, que

provavelmente conferem o aspecto circular do RNA observado em microscopia

eletrônica, característica peculiar da família Bunyaviridae. Ademais, esta região de

complementariedade, provavelmente, tem importante papel na transcrição,

replicação viral e empacotamento da partícula similar para outros vírus com a

mesma estrutura (ELLIOTT et al., 1991; PLYUSNIN et al., 1996).

A estratégia de tradução dos hantavírus é considerada a mais simples

entre os cinco gêneros da família Bunyaviridae. Todos os três segmentos codificam

somente uma proteína no sentido complementar do genoma do vírus. O segmento L

codifica a polimerase viral (proteína L) com aproximadamente 2.151 a 2.156

aminoácidos (246-247 KDa). O segmento M codifica uma única proteína de 1.132 a

1.148 aminoácidos (125-127 KDa), que é pós-traducionamente clivada nas proteínas

precursoras das glicoproteínas virais do envelope, Gn e Gc, com 648-658 (68-76

KDa) e 486-490 (52-58 KDa) aminoácidos, respectivamente. O segmento S codifica

a proteína N do nucleocapsideo com 428-433 aminoácidos (49-51 KDa)

(HENDERSON et al., 1995; CHIZHIKOV et al., 1995; NICHOL et al., 1996;

McCAUGHEY e HART, 2000; PLYUSNIN, 2002; FAUQUET et al., 2005). Não há

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evidência de proteína não estrutural, a qual está presente, nos demais gêneros da

família (SCHMALJOHN, 1996; FAUQUET et al., 2005) (Figura 3).

Figura 3 – Estrutura genômica dos hantavírus. Fonte: adaptado de FAUQUET et al., 2005.

A nucleoproteína N, codificada pelo segmento S é a proteína mais

conservada dos hantavírus, altamente imunogênica em humanos, o que a torna a

primeira escolha como reagente em testes diagnósticos para detecção desta

infecção viral. Análises comparativas entre seqüências nucleotídicas do segmento S

dos hantavírus revelam seqüências variáveis, tanto na sua composição quanto na

extensão, principalmente na região não codificadora, na extremidade 3’ (NCR).

Partindo do princípio que a NCR 3’ participa da replicação viral e do empacotamento

da partícula, poderia se supor que ou o mecanismo de replicação difere de um

hospedeiro para o outro ou a estrutura secundária mais do que a primária da NCR 3’

é crucial para a sua própria atividade (PLYUSNIN et al., 1996).

O segmento M apresenta uma fase aberta de leitura (Open Reading

Frame, ORF) principal (~ 52 a 3.465 nt). As cadeias oligossacarídicas são

componentes essenciais para o correto enovelamento ou estrutura das

glicoproteínas e participam em muitas reações de reconhecimento de receptores e

ligantes, podendo também, determinar o reconhecimento das proteínas do envelope

viral pelos componentes do sistema imune do hospedeiro. Portanto, diferenças no

padrão de glicosilação poderiam estar relacionadas às diferenças patogênicas das

cepas virais (TISCHLER et al., 2003). As posições de resíduos de cisteína nas

proteínas Gn e Gc também são conservadas, assim como os resíduos de prolina,

indicando uma estrutura tridimensional altamente conservada da proteína (ANTIC et

al., 1992).

ORF

Segmento L

cRNA

NCR

Segmento M

cRNA

Segmento S

cRNA

Gene L

Polimerase Viral

(proteína L)

2156 aa

(247KDa)

NCR

Gene Gn

Poliproteína precursora

das

lico

roteínas

Gene Gc

Gn Gc

652 aa

(76KDa)

488 aa

(58KDa)

NCR

Proteína do

Nucleocapsídio

(proteína N)

428 aa

(48KDa)

ORF

6500 nt

3600 nt

1700 nt

Gene N

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Com relação ao segmento L, deve-se considerar que, comparações de

seqüências nucleotídicas e de aminoácidos deste, demonstram que há uma

conservação na estrutura primária da proteína precursora, apesar da extrema

variabilidade na seqüência nucleotídica, podendo ser resultado da adaptação

evolutiva ao codon-usage do hospedeiro (TISCHLER et al., 2003).

1.2.2 Replicação Viral

A replicação dos hantavírus assemelha-se a dos demais integrantes da

família Bunyaviridae com todos os estágios ocorrendo no citoplasma (GONZALEZ-

SCARANO e NATHANSON, 1996; SCHMALJOHN, 1996; MURANYI et al., 2005), no

entanto com algumas peculiaridades.

A replicação se inicia com a fusão da partícula viral mediada pela

interação de uma ou ambas as proteínas integrais do envelope viral (Gn e Gc) aos

receptores α

integrinas da célula hospedeira, provavelmente células dendríticas e

subseqüente endocitose (MACKOW et al., 2001). O desnudamento viral se dá pela

fusão do envelope viral com a membrana endossomal, dependente de pH, e

liberação do nucleocapsídio para o citoplasma. A RNA polimerase viral logo é

ativada e transcreve o RNA genômico, de cada um dos três segmentos, em RNA

subgenômico, sentido positivo (senso), utilizando iniciadores próprios da célula

hospedeira, que servirá como RNA mensageiro. Embora seja observada uma ORF

em ambos os sentidos do genoma viral, senso e anti-senso, não há evidência de

proteína (SCHMALJOHN e DALRYMPLE, 1994).

As proteínas (L) e (N) são traduzidas por ribossomos livres, enquanto que

o precursor das glicoproteínas é traduzido por ribossomos associados ao retículo

endoplasmático (RE) para o interior da organela, onde se dá o processo de

glicosilação primária e clivagem desse precursor nas glicoproteínas Gn e Gc.

Posteriormente, as glicoproteínas são transportadas para o complexo de Golgi (CG),

onde se completa a glicosilação.

Ultraestruturalmente, corpo de inclusão intracelular, provavelmente

composto pela proteína N, é observado no citoplasma. Os vírions se formam na face

citoplasmática da membrana do CG, com montagem para dentro das cisternas.

Vesículas secretórias contendo as partículas virais são transportadas para a

membrana plasmática, seguida de exocitose (Figura 4).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

Figura 4 – Esquema da estratégia de replicação dos membros da família Bunyaviridae. Fonte:

adaptado de SCHMALJOHN, 1996.

1.3 ASPECTOS CLÍNICOS E TRATAMENTO DA

SÍNDROME PULMONAR POR HANTAVÍRUS

1.3.1 Manifestações clínicas

Na SPH, a infecção pode variar desde uma forma assintomática a

quadros clínicos clássicos de alta letalidade (40-60%), dependendo do genótipo viral

envolvido na transmissão. Após um período de incubação médio de 15 dias, que

pode variar de 5 a 42 dias, o paciente desenvolve um quadro semelhante à influenza

(febre e complicação pulmonar) evoluindo, na forma clássica, rapidamente para uma

forma respiratória grave (McCAUGHEY e HART, 2000; LEMOS e SILVA, 2005).

A SPH geralmente apresenta três fases clínicas distintas: a fase inicial

prodrômica, a fase cardiopulmonar e a fase convalescente. A fase prodrômica, que

dura geralmente de três a seis dias, é caracterizada por febre, mialgia, mal-estar

geral, cefaléia, calafrios, dor nas costas, náusea, vômito ou outra manifestação

gastrintestinal, como dor abdominal e diarréia, no entanto não há observação de

queixas respiratórias (McCAUGHEY e HART, 2000).

Exocitose

Segmentos

S, M e L

Tradução

L + S

Transcrição

RNAm

Tradução

Montagem

do vírion

Adsorção

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Na fase cardiopulmonar, inicialmente 4-12 horas após a instalação da

tosse sem expectoração (tosse seca) se caracteriza por, taquipnéia, dispnéia e

hipoxemia. Nas formas graves há evolução em pouco tempo para insuficiência

respiratória aguda associada com hipotensão, edema pulmonar não-cardiogênico,

hipovolemia, distensão abdominal e, possível manifestação hemorrágica. Nesta fase

há alterações na permeabilidade do endotélio, resultando na saída de fluídos e

proteínas para o parênquima pulmonar, ocorrendo em conseqüência, dispnéia e

taquicardia, o que exige imediata hospitalização do paciente com assistência

ventilatória mecânica (McCAUGHEY e HART, 2000; FIGUEIREDO et al., 2001;

LEMOS e SILVA, 2005).

Os pacientes que sobrevivem evoluem para uma fase diurética na qual há

reabsorção do líquido previamente retido no interstício, e em seguida sobrevém a

fase de convalescença (LEMOS e SILVA, 2005).

O avanço dos conhecimentos médicos sobre as duas formas clínicas de

hantavíroses, FHSR e SPH, leva a concluir que ambas as síndromes são

parcialmente sobrepostas. O número de registros de casos de FHSR com

comprometimento dos pulmões e casos de SPH com comprometimento renal está

continuamente crescendo, concebendo-se que a descrição dos cursos de ambas as

síndromes convergirá em um futuro próximo (MURANYI et al., 2005).

1.3.2 Tratamento

Até o presente, não há drogas antivirais que sejam aplicáveis para o

tratamento da infecção por hantavírus na SPH. A terapêutica baseia-se em medidas

de manutenção do estado geral e no atento acompanhamento dos sinais vitais dos

doentes. Qualquer alteração deve ser avaliada pelo clínico e pode resultar em

intervenção. Os pacientes com quadro clínico compatível com a SPH devem ser

admitidos imediatamente em centros de terapia intensiva (CTI) (IVERSSON, 1996;

FIGUEIREDO et al., 2001; LEMOS e SILVA, 2005; MURANYI et al., 2005).

O conhecimento da fisiopatologia da doença é essencial para orientar a

manutenção da adequada oxigenação e monitoramento da função hemodinâmica,

devendo ser evitadas a hipóxia grave e a superidratação. Utilizam-se vasopressores

e cardiotônicos para manter perfusão sem haver administração excessiva de fluidos

(IVERSSON, 1996; FIGUEIREDO et al., 2001; LEMOS e SILVA, 2005).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

Estudos realizados na década de 1990 mostraram que o uso de terapia

intravenosa com ribavirina em pacientes com FHSR reduzia a taxa de letalidade

quando a droga era administrada precocemente (HUGGINS et al., 1991;

PROCHODA et al., 1993). Estudos sobre a utilização da ribavirina em casos de SPH

estão em desenvolvimento, mas ainda não existem resultados conclusivos

(CHAPMAN et al., 1999; MURANYI et al., 2005).

A imunização passiva tem sido objeto de estudos, mas ensaios clínicos

futuros com maior número de pacientes são necessários para confirmar se essa

metodologia representa um instrumento terapêutico essencial para o tratamento das

hantaviroses humanas em fase aguda (MURANYI et al., 2005).

1.4 EPIDEMIOLOGIA E ECOLOGIA

1.4.1 Transmissão

Os hantavírus são mantidos em natureza pela infecção crônica de

roedores. Nestes, a infecção é assintomática e aparentemente não é letal. Apesar

da presença de anticorpos neutralizantes no soro desses animais, o vírus pode ser

isolado principalmente de fragmentos de pulmões e rins, sendo concentrados e

eliminados durante longo período e em grande quantidade na saliva, urina e fezes.

Os hantavírus são transmitidos ao homem pelo contato com excretas ou por

aerossóis em locais onde roedores infectados eliminaram suas excretas contendo o

vírus (LEE, et al., 1981; LEE, el al., 1982; LEE, 1988; OPS, 1999; NICHOL, 1999)

(Figura 5).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

Figura 5 – Ciclo biológico de transmissão dos hantavírus. Fonte: adaptado

de http://www.nsf.gov/news/specialreports/ecoinf/solved.jsp

Outras formas naturais de transmissão à espécie humana foram também

descritas para certos hantavírus, como a transmissão por mordedura de roedores

infectados, bem como pela ingestão de alimentos contaminados por fezes e urina ou

pelo contato direto do tecido mucoso com material contendo partículas virais (RUO

et al., 1994; WELLS et al., 1997; SIMPSON, 1998).

A primeira evidência de transmissão interhumana por hantavírus nas

Américas foi verificada no sul da Argentina durante um surto de SPH causado pelo

vírus Andes (ANDV), durante o qual profissionais de saúde apresentaram risco

maior de se infectar do que o observado na população em geral (ENRIA et al., 1996;

PADULA et al.,1998). Posteriormente, outros casos de transmissão pessoa a pessoa

foram descritos tanto na Argentina (WELLS et al., 1997; PINNA et al., 2004;

MARTINEZ et al., 2005) como no Chile (FERRÉS et al., 2007) em ambos os países

o vírus Andes foi o implicado na transmissão.

Na espécie humana a transmissão vertical já foi relatada em casos de

FHSR, associados ao vírus Hantaan, na Coréia. Neste episódio duas mães

transmitiram o vírus para seus fetos, resultando em aborto e morte fetal (LEE, 1989).

No entanto, essa forma atípica de transmissão ainda não foi registrada por outros

autores (CHAE et al., 1989; PARTANEN et al., 1990; HOWARD et al., 1999).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

1.4.2 Distribuição Geográfica

Após a identificação do vírus Sin Nombre nos Estados Unidos em 1993

(NICHOL et al., 1993), a SPH foi detectada em mais 21 estados daquele país

resultando no isolamento de outros hantavírus, tais como os vírus Black Creek Canal

(BCCV), Bayou (BAYV) e New York (NYV) associados a casos de SPH (FELDMANN

et al., 1993; CHILDS et al.,1994; ELLIOTT et al. ,1994; HJELLE et al., 1994; SONG

et al., 1994; ROLLIN et al., 1995).

Com a descoberta do primeiro hantavírus associado à SPH no continente

sul americano, no Município de Juquitiba, Estado de São Paulo, Brasil em 1993

(IVERSSON et al.,1994), identificado como vírus Juquitiba (JUQV) (JOHNSON et al.,

1999), outros hantavírus foram identificados no continente sul-americano, tais como:

o vírus Rio Mamoré (RIOMV) encontrado na Bolívia em 1995, que resultou na

primeira caracterização genética de um hantavírus sul americano (BHARADWAJ et

al., 1997), e que até o presente momento não foi associado com enfermidade

humana (CARROLL et al., 2005). Mais adiante, um surto de SPH no sudoeste

argentino permitiu a caracterização genética do vírus Andes (HJELLE et al., 1996;

LÓPEZ et al., 1996) associado a casos de SPH. Posteriormente, a SPH passou a

ser reconhecida em outros países e possibilitou o reconhecimento de novas

espécies de hantavírus, encontrando-se hoje amplamente distribuída na América do

Sul (PETERS, 1998) (Figura 6).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

Figura 6 – Mapa do continente americano, mostrando os hantavírus identificados e seus

respectivos roedores-reservatórios. Fonte: RAWLINGS et al., 1996; OPS, 1999;

VINCENT et al., 2000; ENRIA e LEVIS, 2004; TRAVASSOS DA ROSA et al.,

2005; CHU et al., 2006; PUERTA et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2007.

Nas Américas do Sul e Central têm sido registrados casos em muitos

países como Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Panamá, Paraguai e Uruguai e na

América do Norte, nos Estados Unidos e Canadá. A letalidade oscila entre 30 e 70%

(LEVIS et al., 1998; SESTARO et al., 1999; ENRIA e PINHEIRO, 2000; PADULA et

al., 2000b; VINCENT et al., 2000; BAYARD et al., 2004).

Atualmente, mais de 2.000 casos de SPH já foram notificados no

Continente. No entanto, países como México, Costa Rica, Colômbia, Venezuela e

Peru, onde estudos de soroprevalência, realizados em populações humanas e de

roedores têm demonstrado a circulação de hantavírus, e seus hospedeiros

reservatórios caracterizados não têm sido somados ao crescente registro de casos

de SPH nas Américas (HJELLE et al., 1994; SUZÁN et al., 2001; VALDO et al.,

2003).

Sin Nombre

(Peromyscus maniculatus)

Prospect Hill (Microtus pennsyvanicus)

Lechiguanas (Oligoryzomys flavescens)

Juquitiba (Oligoryzomys nigripes)

Araraquara (Necromys lasiurus)

Cano Delgaldito (Sigmodon alstoni)

Maciel

(

Necrom

s obscuru

)

Anajatuba (Oligoryzomys fornesi)

Castelo dos Sonhos (desconhecido)

Rio Segundo (Reithrodontomys mexicanus)

Andes

Bermejo

Oran

Laguna Negra

Rio Mamoré

El Moro Canyon

Choclo (Oligoryzomys fulvescens)

Isla Vista

Muleshoe (Sigmodon hispidus)

Black Creek Canal (Sigmodon hispidus)

Bayou (Oryzomys palustris)

New York (Peromyscus leucopus)

Bloodland Lake (Microtus ochrogaster)

Rio Mearim (Holochilus sciureus)

Pergamino (Akodon azarae)

Laguna Negra simil

(Microtus californicus)

(Reithrodontomys megalotis)

(Calomys laucha)

(Calomys callosus)

(

Oli

zom

s lon

icaudatu

)

(Oligoryzomys chacoensis)

(Oligoryzomys longicaudatus)

(

Oli

zom

s microti

)

Calabazo

Itapuã

(

Oli

zom

ripe

)

Jaborá

(

kodon montensi

)

Hantavírus não associados à enfermidade humana

Hantavírus res

onsáveis

elos casos de SPH

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

Os hantavírus Rio Mamoré, Punchana, Rio Segundo (RIOSV), El Moro

Canyon (ELMCV), Muleshoe (MULV), Isla Vista, Blue River, Bloodland Lake, Cãno

Delgadito (CANOV), Maciel, Calabazo, Pergamino (PRNV), Prospect Hill, Itapuã,

Anajatuba (ANAJV) e Rio Mearim (RIMEV) foram detectados, até o momento,

apenas em roedores silvestres, não estando associados com SPH (RAWLINGS et

al., 1996; OPS, 1999; VINCENT et al., 2000; ENRIA e LEVIS, 2004; TRAVASSOS

DA ROSA et al., 2005; PUERTA et al, 2006; CHU et al; 2006).

No Brasil, desde a ocorrência dos três primeiros casos clínicos da SPH

em 1993, até setembro de 2007 já foram notificados 938 casos da doença. Embora

a maioria dos casos de SPH tenha ocorrido nas regiões sul (n=401) e sudeste

(n=290) do país, considerável número de casos tem sido notificado na Amazônia

brasileira. Desde o aparecimento do primeiro caso de SPH no distrito de Castelo dos

Sonhos, Município de Altamira, Estado do Pará em 1995 (JOHNSON et al.,1999),

158 casos de hantavirose já foram registrados, até setembro de 2007, na região

Amazônica, correspondendo aos estados do Amazonas (n=4), Pará (n=34),

Rondônia (n=2), Maranhão (n=9) e Mato Grosso (n=109) (MS/SVS, 2007) (Figura 7).

Figura 7 – Distribuição dos casos de hantaviroses por Unidade Federada, Brasil, 1993 a

setembro de 2007. Fonte:

MS/SVS, 2007.

De primeiro de janeiro até cinco de novembro de 2007 foram confirmados

93 casos novos de hantavirose no Brasil. A taxa de letalidade geral encontrada para

o país nesse período foi de 43%, mostrando que a hantavirose é uma doença com

uma alta taxa de letalidade, sendo que os 93 casos foram detectados em nove

estados e o Distrito Federal, atingindo a 37% do total de Unidades Federadas, sendo

os casos de SPH registrados em todas as regiões do país, exceto a região nordeste.

Distribuição dos casos de hantaviroses por

Unidade Federada, Brasil, 1993 - 2007*

183

109

164

178

107

938

200

400

600

800

1000

IND

Unidades Federadas

Casos

mazônia b

asileira

Outras regiões do Brasil

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

Foram confirmados casos no Pará (n=4), Rondônia (n=1), São Paulo (n=17), Minas

Gerais (n=22), Mato Grosso (n=13), Distrito Federal (n=5), Goiás (n=4), Paraná

(n=6), Rio Grande do Sul (n=4), Santa Catarina (n=16) e procedência indeterminada

(n=1) (MS/SVS, 2007).

1.4.3 Reservatórios

Os roedores da ordem Rodentia, famílias Muridae e Cricetidae, são os

hospedeiros e reservatórios naturais dos hantavírus. Os estudos de fósseis

comprovam a presença de roedores murídeos nos últimos 20 milhões de ano na

América do Norte e três milhões e meio de anos na América do Sul (NOWAK, 1991;

OPS, 1999; MILAZZO et al., 2006).

Esses roedores vivem, atualmente, em diversos habitats em todo o

continente americano; se abrigam em buracos ou fendas no solo, debaixo de

troncos, em árvores ou troncos ocos, em ninhos construídos no solo em arbustos ou

árvores. Apesar de terem hábitos noturnos, as fêmeas podem gerar várias ninhadas

a cada ano, e em regiões quentes a procriação pode produzir-se de forma

ininterrupta durante todo o ano. É provável que a maioria das espécies viva menos

de dois anos, no entanto o enorme potencial reprodutivo de algumas espécies faz

com que aumente de forma extraordinária a população, seguida de uma diminuição

repentina do número de animais, por alguma causa, como por exemplo, quando se

esgota o alimento em uma zona particular. Essas flutuações podem mostrar uma

periodicidade de três a quatro anos em algumas espécies, dependendo dos habitats

e ecossistemas onde vivem (NOWAK, 1991).

Dentro da família Muridae, apenas roedores das subfamílias Murinae e

Arvicolinae, e a subfamília Sigmodontinae da família Cricetidae foram identificados

como reservatórios de hantavírus. Em relação à distribuição geográfica, os

murineos, são endêmicos na Eurásia, com exceção das espécies R. norvegicus, R.

rattus e Mus musculus, que foram introduzidas no Novo Mundo pelos colonizadores

europeus. Os roedores da subfamília Arvicolinae apresentam ampla distribuição no

hemisfério norte, ocorrendo na Eurásia até a América do Norte, enquanto os

sigmodontineos só ocorrem no continente americano. Os roedores da subfamília

Sigmodontinae, hospedeiros dos hantavírus que causam a SPH, são associados a

ambientes silvestres e rurais, embora alguns tenham predileção por um habitat

particular (NOWAK, 1991).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

A distribuição viral pode acontecer em toda a área de ocorrência da

espécie reservatória ou pode ser restrita a um pequeno espaço geográfico. Cada

hantavírus está predominantemente associado a um roedor hospedeiro específico

em uma determinada região geográfica, no entanto a infecção dos roedores

hospedeiros não específicos mediante o fenômeno do spillover pode ocorrer

(JOHNSON et al., 1999). A estreita associação entre cada um dos hantavírus e uma

espécie de roedor particular e a análise filogenética, sugerem que estes co-

evoluíram com seus hospedeiros (LÓPEZ et al., 1996, LEVIS et al., 1998).

A espécie de roedor-hospedeiro geralmente é a mais abundante dentro

de um habitat ecológico distinto, o que é essencial para a estratégia de

sobrevivência do vírus (PLYUSNIN, 2002). Conseqüentemente, a ocorrência de um

determinado hantavírus em áreas com altas densidades de roedores aumenta a

probabilidade de encontros interespecíficos, onde a infecção de uma espécie

secundária pode ocorrer. Por outro lado, em baixas densidades de roedores,

diminuem a probabilidade de encontros interespecíficos, resultando em poucas

oportunidades de uma espécie de roedor não reservatório demonstrar evidências de

infecção secundária (MILLS et al., 1997).

A ocorrência de casos humanos tem sido associada com mudanças na

densidade da população de roedores, a qual varia sazonalmente e anualmente na

dependência de fatores extrínsecos, como competição interespecífica, mudanças

climáticas e ações predatórias, assim como de fatores associados à mudança na

estrutura etária da população de roedores (LEMOS e SILVA, 2005).

Sabe-se que a epidemia ocorrida em 1993 no sudoeste dos Estados

Unidos, foi desencadeada por um desequilíbrio da população do roedor hospedeiro

P. maniculatus. Após um período prolongado de chuvas, a oferta de alimentos nesta

região desértica aumentou, favorecendo o aumento da população de roedores

silvestres. Com o restabelecimento das condições climáticas habituais normais, a

oferta de alimento diminuiu, levando a população de roedores a procurar alimentos

nas residências rurais, ocasionando, desta forma, o contato de seres humanos com

os roedores transmissores do vírus, e conseqüentemente, a ocorrência de casos da

doença (CHILDS et al.,1994).

De modo semelhante o súbito aparecimento do surto de 1993 no

Município de Juquitiba, Estado de São Paulo, causado por um vírus similar ao Sin

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

Nombre, posteriormente identificado como vírus Juquitiba, foi relacionado à

ocorrência de um fenômeno natural conhecido como “ratada”, que é o aumento da

população de roedores devido a maior oferta de sementes produzidas durante a

floração e frutificação cíclica (a cada dez anos) de determinadas espécies de

taquaras nativas da Mata Atlântica. Ao final do ciclo das taquaras, a diminuição da

oferta de alimento natural disponível, associado ao armazenamento inadequado de

rações animais no interior das habitações humanas, atraiu roedores da mata para o

interior das casas, o que resultou na infecção dos três indivíduos (IVERSSON et al.,

1994; PEREIRA et al., 1998).

Assim como ocorre no Estado do Paraná a hantavirose é uma doença

associada essencialmente à atividade rural, onde a maioria dos casos de SPH é

detectada em áreas de reflorestamento de pinus (Pinus elliottii), compreendendo

grandes extensões de terra, na região centro-sul do Estado, e com grande número

de trabalhadores rurais contratados para o corte das árvores em determinados

períodos. As condições precárias que esses indivíduos, na maioria adultos jovens e

do sexo masculino, acampam, estocam alimentos e outros víveres, permitem atrair

um grande número de roedores silvestres (reservatórios) propiciando a

contaminação no decorrer dessas atividades. Esses fatores fazem com que haja um

grupo de maior risco e, também uma diferença na sazonalidade observada nas

notificações, coincidindo com o período de corte de madeira (RABONI, 2006).

A doença tem sido observada também em áreas periurbanas, onde as

habitações humanas são construídas muito próximas a áreas rurais, pastos ou

depósitos para armazenamento de cereais. Os roedores podem invadir facilmente as

casas nesses locais à procura de alimento, particularmente em períodos de seca ou

mesmo fugindo de queimadas realizadas em plantações de cana de açúcar ou em

campos de capim seco. A grande expansão das áreas urbanas, ocupando espaços

em locais outrora considerados rurais, tem permitido maior contato do homem com

os reservatórios naturais dos hantavírus (FERREIRA, 2003).

1.5 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

O diagnóstico sorológico específico de hantavirose no Brasil, consiste na

detecção de anticorpos imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG), nos soros

suspeitos, contra a nucleoproteína viral, que é a proteína mais conservada e

altamente imunogênica dos hantavírus, sendo realizado pelo teste imunoenzimático

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay - ELISA), bem como pelas técnicas de IFI em

células de rim de macaco verde africano (VERO E-6) infectadas. Os testes de IFI e

ELISA oferecem resultados grupo-específicos, porém o ELISA tem mostrado maior

sensibilidade e especificidade, uma vez que são utilizadas proteínas recombinantes

de hantavírus como antígenos constituindo-se, portanto, no método de primeira

escolha para sorologia (TSAI, 1987; LEE, 1988; ZÖLLER et al., 1993; PADULA et al.,

2000a).

Os anticorpos da classe IgM aparecem durante os primeiros dias de doença e

podem ser detectados até cerca de 60 dias após o início dos sintomas. Quando não

é possível definir o diagnóstico sorológico, em amostra única, uma segunda amostra

deve ser coletada com intervalo de tempo de duas a três semanas após a coleta da

primeira. A positividade do teste é dada quando há detecção de anticorpos IgM em

amostra única ou quando, em duas amostras ocorre soroconversão, ou seja, na

segunda amostra de soro são detectados anticorpos da classe IgG com diferença de

títulos igual ou maior do que quatro vezes os títulos obtidos na primeira.

(FIGUEIREDO, et al., 2000; FERREIRA, 2003).

O diagnóstico laboratorial para a identificação das espécies de roedores

hospedeiros de hantavírus nos estudos ecoepidemiológicos é baseado no teste de

ELISA para a detecção de anticorpos da classe IgG (LEE, 1988; TSAI, 1987;

ZÖLLER et al., 1993; PADULA et al., 2000a).

A reação de imunohistoquímica, utilizando anticorpos monoclonais e

policlonais, tem sido muito útil na confirmação da presença do antigeno viral em

tecidos e fragmentos de órgãos em casos fatais (ZAKI et al.,1995).

O isolamento viral pode ser feito pela inoculação de fragmentos de vísceras

colhidas de roedores e humanos pós-morte, utilizando-se culturas de células VERO

E-6, linhagem celular humana de carcinoma de pulmão (A 549) e cultura primária de

pulmão de rato. A infecção não produz efeito citopático, mas pode ser detectada por

IFI (TSAI, 1987). Por se tratarem de agentes biológicos de considerável risco, para

as tentativas de isolamento de vírus associado com doença em humanos, bem como

de amostras biológicas de roedores, é necessária, segundo à OPS (1999) a

existência de laboratório com nível de biossegurança 3 (NB3).

A técnica de transcrição reversa seguida de reação em cadeia mediada pela

polimerase (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) tem-se

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

mostrado eficiente para detecção de RNA viral, utilizando como alvo os genes da

nucleoproteína e/ou das glicoproteínas, em amostras de soro e de coágulo

sanguíneo, colhidos o mais precocemente possível (NICHOL et al., 1993; XIAO et

al., 1992; XIAO et al., 1994), na fase aguda, durante os primeiros dez dias de

doença (TERAJIMA et al., 1999). O sucesso dessa técnica depende da escolha dos

iniciadores otimizados para os hantavírus do Novo Mundo, além da Nested-PCR

usada para promover maior eficiência na sensibilidade da técnica (PETERS e

KHAN, 2002). No entanto, não é recomendável como método padrão para

diagnóstico clínico-laboratorial, necessitando de maiores estudos (SCHMALJOHN e

NICHOL, 2007; MORELI et al., 2004; AITICHOU et al., 2005). O seqüenciamento do

produto amplificado por RT-PCR possibilita a caracterização genética dos hantavírus

(NICHOL et al., 1993; HJELLE et al., 1994; PETERS, 1998).

1.6 FILOGENIA E DIVERSIDADE GENÉTICA

A RT-PCR seguida de seqüenciamento nucleotídico tem se mostrado

uma importante ferramenta para a identificação de novos hantavírus, bem como

para a epidemiologia, utilizando tanto amostras biológicas de casos humanos como

de roedores (NICHOL et al., 1993; JOHNSON et al., 1997; FULHORST et al., 1997;

BHARADWAJ et al., 1997; LÓPEZ et al., 1997; SUZUKI et al., 2004; TRAVASSOS

DA ROSA et al., 2005; BAHR et al., 2006; CHUN et al., 2007; LI et al., 2007; ZHANG

et al., 2007).

A análise genética dos hantavírus é baseada, principalmente, nas

seqüências nucleotídicas dos segmentos S e M, bem como na análise das

seqüências aminoacídicas das proteínas codificadas por esses segmentos (proteína

N e Gn / Gc, respectivamente) (JONHSON et al., 1997; LÓPEZ et al., 1997;

TISCHLER et al., 2003; MORELI et al., 2004; SUZUKI et al., 2004; TRAVASSOS DA

ROSA et al., 2005). Comparando-se as seqüências nucleotídicas dos segmentos S e

M de hantavírus de um mesmo genótipo observa-se um percentual de identidade

muito similar (divergência < 2%) o que sugere que os dois segmentos tenham

evoluído paralelamente (HENDERSON et al., 1995; LÓPEZ et al., 1997). Contudo, é

importante ressaltar que sendo o genoma dos hantavírus segmentado, pode ocorrer

rearranjo genético entre os segmentos genômicos dentro de determinadas espécies

virais (HENDERSON et al., 1995).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

A análise comparativa do segmento S revela seqüências variadas tanto

na composição como na extensão, principalmente na NCR 3’ terminal. A ausência

de regiões conservadas entre as nucleoproteínas dos integrantes da família

Bunyaviridae e a presença de seqüências conservadas específicas entre os

hantavírus, faz com que esse segmento seja o alvo principal para muitos estudos

filogenéticos desse gênero (JONHSON et al., 1997; LÓPEZ et al., 1997; TISCHLER

et al., 2003; MORELI et al., 2004; SUZUKI et al., 2004; TRAVASSOS DA ROSA et

al., 2005), uma vez que se observa uma extensa variação quando seqüências

nucleotídicas e aminoacídicas das glicoproteínas são analisadas. É razoável concluir

que a menor variabilidade genética da nucleoproteína quando comparada às

glicoproteínas, se deve a menor pressão seletiva que a proteína N é submetida

(TISCHLER et al., 2003).

A relação filogenética dos hantavírus está estritamente relacionada às

subfamílias de seus roedores hospedeiros, dividindo os hantavírus em três grandes

grupos: os hantavírus associados aos roedores sigmodontineos, arvicolineos e

murineos (Figura 8).

Figura 8 – Árvore filogenética dos hantavírus baseada nas seqüências completas

das ORFs do segmento S. Fonte: adaptado de PLYUSNIN, 2002.

Os hantavírus arvicolineos estão mais próximos evolutivamente dos

sigmodontineos, do que cada um com os murineos, em virtude da ancestralidade

comum entre as subfamílias Arvicolinae e Sigmodontinae (PLYUSNIN, 2002).

Hantavírus associados a roedores

Arvicolineos

Hantavírus associados a roedores

Murineos

Hantavírus associados a roedores

Sigmodontineos

HTNV

SEOV

DOBV

SAAV

ISLAV

PHV

BLLV

TULV

PUUV

TOPV

KHAV

BCCV

BAYV

ANDV

LNV

RIOMV

NYV

ELMCV

RIOSV

SNV

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

De modo geral, a relação vírus-hospedeiro também se estende em nível

de espécies, tanto viral quanto de roedores, e está ligada a um território e nicho

ecológico próprios, que provavelmente faz parte da estratégia de sobrevivência do

vírus. Esse fato sugere que a filogenia dos hantavírus, sua distribuição geográfica e

o tipo de hantavirose – FHSR e SPH – estão intimamente ligados aos respectivos

reservatórios, demonstrando um exemplo clássico de co-evolução (PLYUSNIN et al.,

1996; VAPALAHTI et al., 1999; PLYUSNIN, 2002). Isso pode ser explicado pelo

fenômeno do spillover de um ancestral comum – duas espécies de hantavírus

distintas, porém relacionadas – que se adaptou a roedores do mesmo gênero, tal

como foi observado entre os vírus Sin Nombre e New York, que apresentam como

roedores hospedeiros P. maniculatus e P. leucopus, respectivamente (MORZUNOV

et al., 1998).

A análise das seqüências genômicas de hantavírus mostra uma

diversidade genética gerada pelo acúmulo de mutações de ponto e inserções e/ou

deleções de um ou muitos nucleotídeos. A maioria de inserções e deleções ocorre

nas NCRs, enquanto que as mutações de ponto são comumente observadas nas

ORFs, podendo ou não mudar as seqüências aminoacídicas (PLYUSNIN, 2002). As

mutações de ponto parecem contribuir para a maioria das variações genéticas

observadas entre os hantavírus (SCHMALJOHN e HJELLE, 1997).

Dentre os hantavírus sigmodontineos, observa-se uma diversidade

genética mais complexa dos hantavírus da América do Sul em relação aos da

América do Norte, o que provavelmente é reflexo da recente e rápida evolução dos

roedores sul-americanos (PETERS e KHAN, 2002). Isso pode ser observado quando

se analisa as seqüências de diversos genótipos do vírus Andes na Argentina, na

qual se observa uma acentuada divergência nucleotídica, porém as seqüências

aminoacídicas permanecem altamente conservadas, o que reflete em grupos

monofiléticos antigenicamente similares, mas geneticamente distintos (PADULA et

al., 2000b; BOHLMAN et al., 2002; PADULA et al., 2004).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

1.7 CONTROLE E PREVENÇÃO

Considerando que os roedores silvestres são os portadores de hantavírus

e que os excretam pelas fezes, urina ou saliva, as medidas de controle devem estar

voltadas a evitar o contato com esses roedores e suas excretas (LEMOS e SILVA,

2005). A erradicação desses reservatórios naturais do vírus no ambiente silvestre é

inviável dada à abundância das espécies hospedeiras, da sua grande dispersão e,

principalmente, pelo desequilíbrio ecológico que tal medida acarretaria (FERREIRA,

2003; LEMOS e SILVA, 2005). Entretanto, a eliminação dos animais no peridomicílio

e no domicílio mostra-se factível e deve ser realizada de forma estratégica e

contínua (FERREIRA, 2003).

Ademais, outras medidas simples de orientação e proteção individual

podem ser fundamentais para prevenção da SPH, tais como: (i) construção de

edificações adequadas, tanto para moradia como para acondicionamento de grãos e

rações, visando evitar o acesso do roedor; (ii) todos os alimentos para uso humano

ou animal necessitam de acondicionamento em recipiente de plástico

hermeticamente fechado, suprimindo a fonte alimentar para os roedores; (iii) iscas

contendo substâncias anticoagulantes devem ser distribuídas nesses locais

periodicamente para evitar a instalação e a proliferação desses mamíferos; (iv)

construções em área rurais fechadas por semanas ou meses devem ser,

primeiramente, abertas para ventilação. Preconiza-se 30 a 60 minutos antes da

limpeza de locais com dejetos de roedores, molhar o assoalho com solução de

hipoclorito ou lisoforme, a utilização de máscaras com filtro do tipo P3 e luvas de

borracha; e (v) deve ser realizada a orientação da população que habita essas áreas

rurais quanto à gravidade da doença, os meios de adquiri-la e as medidas de

prevenções (FERREIRA, 2003; LEMOS e SILVA, 2005).

A identificação precoce dos casos de SPH pode melhorar as

possibilidades de sobrevivência dos pacientes, onde os profissionais de saúde

desempenham um papel importante nessa identificação. Por essa razão, devem ser

realizados programas educativos para a orientação desses profissionais para o

melhor conhecimento dessa doença, procedimentos para o diagnóstico laboratorial,

manejo e tratamento dos pacientes, e recomendações preventivas (OPS, 1999).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Introdução

Os trabalhos ecoepidemiológicos são de suma importância para

proporcionar o conhecimento da espécie transmissora e prevalência da infecção em

roedores hospedeiros, contribuindo para o desenvolvimento de medidas de

intervenção para um efetivo controle da SPH (MILLS e CHILDS, 1998a; MILLS et al.,

1998b; POWERS et al., 1999; VINCENT et al., 2000).

Até o presente momento, não há uma vacina licenciada contra os

hantavírus causadores da SPH, porém trabalhos envolvendo a engenharia genética

têm sido desenvolvidos com esse intúito (HOOPER et al., 2006; CUSTER et al.,

2003). Vacinas contra os vírus Seoul e Hantaan vêm sendo desenvolvidas e têm

mostrado boa eficácia (YAMANISHI et al., 1988; SONG et al., 1992; ZHU et al.,

1994; PARK et al., 2004), no entanto não parecem conferir proteção cruzada contra

os hantavírus causadores da SPH (SCHMALJOHN e HJELLE, 1997; PETERS,

1998).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

2 RELEVÂNCIA

Os surtos de SPH observados no Brasil e outros países da América do Sul

indicam que a circulação de hantavírus em roedores silvestres é elevada (JOHNSON et

al., 1999; PEREIRA et al., 1998). Há, portanto, necessidade de maiores estudos sobre

as espécies de roedores envolvidas na cadeia epidemiológica dos casos observados no

país, a forma de transmissão do vírus, bem como a infectividade e informações sobre a

enfermidade, diagnóstico da situação epidemiológica, e o planejamento direcionado

para ações de controle.

Desde o aparecimento do primeiro caso de SPH no distrito de Castelo dos

Sonhos, Município de Altamira, Estado do Pará em 1995 (JOHNSON et al.,1999), casos

de hantavirose têm sido registrados na Amazônia brasileira com ocorrências nos

estados do Amazonas, Pará, Rondônia, Maranhão e Mato Grosso (MS/SVS, 2007).

A região Amazônica abrange aproximadamente um terço da área total da

América do Sul, incluindo cerca de 60% do território brasileiro. Nas regiões da

Amazônia e pré-Amazônia do Brasil ocorre ampla diversidade de roedores da

subfamília Sigmodontinae – família Cricetidae – (EISENBERG e REDFORD, 1999), e

uma grande parte da população rural vive próximo de áreas que têm extensas

populações de roedores e ocupam habitações de fácil acesso a esses animais. A

intensa exploração da mata nativa, alterações ambientais, a atividade produtora

agrícola crescente, o desequilíbrio ecológico das populações de roedores e o estreito

contato do homem com roedores e suas excretas favorecem o aparecimento de casos

de SPH (NICHOL et al., 1993; IVERSSON et al., 1994; PEREIRA et al., 1998).

No ano de 2000 registrou-se o primeiro surto de SPH na Amazônia

brasileira, nas localidades de Quebra e São Jerônimo, área rural de Anajatuba,

Município do Estado do Maranhão (MENDES et al., 2001). Um estudo

ecoepidemiológico com roedores na região proporcionou a identificação de dois novos

hantavírus, o vírus Anajatuba e o vírus Rio Mearim, cujos reservatórios naturais

descritos foram os roedores Oligoryzomys fornesi e Holochilus sciureus,

respectivamente, sem ter havido, no entanto, comprovação de associação com os

casos humanos (TRAVASSOS DA ROSA et al., 2005). Desde então, já foram

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Relevância

notificados mais seis casos da doença no Maranhão envolvendo os municípios de

Anajatuba e Santa Rita (MS/SVS, 2007).

O Estado do Mato Grosso, atualmente, corresponde ao quarto estado com

maior número de casos notificados de SPH e é o primeiro de maior ocorrência na

região Amazônica, cabendo aos municípios de Tangará da Serra e Campo Novo do

Parecis o maior registro de casos, conhecidos por sua intensa atividade agrícola para

a produção de grãos, a qual proporciona ambiente propício para a manutenção dos

roedores silvestres, estreitando o contato entre os hantavírus e o homem (FERREIRA,

2003; DUBREUIL et al., 2005). Assim como o Estado do Pará, embora tenha sido o

primeiro estado da Amazônia brasileira com registro de SPH e identificação do

hantavírus circulante a partir de amostra humana, até então ainda é desconhecido o

roedor hospedeiro associado ao hantavírus nessa região.

Portanto, torna-se necessário a realização de estudos, para que se possa

identificar o hantavírus circulante nesses ecossistemas da Amazônia brasileira onde

ainda são desconhecidos, bem como desenvolver estudos para ter conhecimento da

associação dos hantavírus com seus hospedeiros reservatórios naturais e as

interações vírus-roedor-humano, gerando informações para o entendimento da

epidemiologia das hantaviroses. Ademais, o conhecimento da espécie e prevalência

da infecção em roedores hospedeiros poderá facilitar o desenvolvimento de medidas

de intervenção para controle da SPH na Amazônia brasileira (VINCENT et al., 2000;

POWERS et al., 1999; MILLS e CHILDS, 1998a; MILLS et al.,1998b).

O IEC, desde 1996, como laboratório de referência para o estudo de

hantavírus na Amazônia brasileira, cuja área de abrangência compreende os estados

do Acre, Amapá, Amazonas, Maranhão, Mato Grosso, Pará, Rondônia, Roraima e

Tocantins, tem como atribuições o diagnóstico laboratorial de rotina, a realização e/ou

colaboração em estudos ecoepidemiológicos na região, o desenvolvimento de

pesquisa, bem como a avaliação de novas técnicas para o diagnóstico de hantavírus.

Neste contexto, esse estudo objetiva fornecer novas e mais acuradas informações

sobre os hantavírus circulantes em ecossistemas da Amazônia brasileira, seus

roedores hospedeiros e a associação deles com SPH.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

3 OBJETIVOS

3.1 GERAL

Caracterizar geneticamente hantavírus amazônicos e determinar a

associação vírus-hospedeiro dos hantavírus associados com SPH, em distintos

ecossistemas amazônicos no Maranhão e Pará – Mato Grosso, no período de 2001

a 2006.

3.2 ESPECÍFICOS

¾ Pesquisar anticorpos IgM anti-hantavírus pelo ensaio imunoenzimático

(ELISA) em amostras de casos humanos suspeitos de SPH procedentes das

áreas de estudo da Amazônia brasileira, Maranhão, Pará e Mato Grosso;

¾ Pesquisar anticorpos IgG anti-hantavírus pelo ELISA em amostras de soros

humanos provenientes de um inquérito sorológico em uma das áreas do

estudo – Baixada Maranhense;

¾ Pesquisar anticorpos IgG anti-hantavírus pelo ELISA em amostras

sangüíneas de roedores silvestres capturados nas áreas de estudo;

¾ Detectar e amplificar o genoma viral pela técnica de RT Nested-PCR com

posterior seqüenciamento nucleotídico de hantavírus amazônicos em

amostras oriundas de casos humanos positivos e de roedores

sorologicamente positivos;

¾ Realizar análises filogenéticas a partir das seqüências nucleotídicas obtidas

de hantavírus amazônicos para comparação com as seqüências de outros

hantavírus já publicadas e disponíveis no GenBank.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

4 MATERIAL E MÉTODOS

Para utilização das amostras biológicas humanas e animais nesse estudo

foi feita solicitação à Direção do IEC, conforme orientação do Comitê de Ética em

Pesquisa da referida Instituição. Documento com aquiescência do pleito solicitado

está entre os anexos dessa tese (ANEXO A).

4.1 ESTUDO NO MARANHÃO

4.1.1 Descrição da Área

O Município de Anajatuba – 03º16’ S, 44º37’ O – está localizado na baixada

ocidental maranhense pertencendo à microrregião de alagado do rio Maranhão, no

Estado do Maranhão (Figura 9). Apresenta uma extensão territorial de 1.117 km

, onde

residem 23.907 habitantes (IBGE, 2007). Esse Município dista 135 km, em direção sul,

da capital São Luís, com acesso principal pela rodovia federal BR-135 e rodovia

estadual MA-324 (Figura 10). A região, conhecida como Baixada Maranhense, é

formada por cadeias de lagoas com extensos pântanos e campos inundados, sendo

que neste Município observam-se áreas de floresta e extensos campos de arroz,

inclusive aos arredores da zona urbana. O clima da região é tropical úmido com

temperatura média variando entre 26 ºC e 28 ºC, cujo período chuvoso estende-se

entre os meses de janeiro a julho. O poder aquisitivo da população é de baixa renda e a

economia é baseada na criação de gado, pesca e plantio de mandioca, arroz, cana-de-

açúcar e milho (TRAVASSOS DA ROSA et al., 2005; MENDES et al., 2001).

Figura 9 – Município de Anajatuba, Estado do Maranhão.

a) campo alagado, característico da

Baixada Maranhense

b) rua principal de Anajatuba (área urbana),

mostrando campo de arroz ao fundo

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

Figura 10 – Mapa do Estado do Maranhão, mostrando a localização dos municípios de Anajatuba e Santa

Rita, onde ocorreram casos de SPH. Fonte: adaptado de www.quatrorodas.abril.com.br.

O Município de Santa Rita – 03º09’ S, 44º20’ O – localiza-se a 76 km ao

sul de São Luís com acesso direto pela BR-135, na microrregião do Rosário (Figura

11). Sua área territorial é de 786 km

com população de 31.033 habitantes (IBGE,

2007). A vegetação é de campos naturais e floresta tropical. O clima é tropical

úmido, com temperatura máxima de 35 ºC e mínima de 25 ºC, tendo duas

temporadas distintas: uma de chuvas (janeiro a julho) e outra de seca (agosto a

dezembro), a cada ano. A economia, como em Anajatuba, é baseada na

agropecuária, destacando a plantação de mandioca, arroz, feijão, milho, melancia e

banana, e na criação de bovinos, suínos, caprinos e aves. Ademais, o Município é

provido de pequenas indústrias de produção de cachaça, de beneficiamento de

BR 135

MA 324

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

arroz, e produção de farinha de mandioca (http://monsenhordourado.br.tripod.com/

pag05.htm).

Figura 11 – Município de Santa Rita, Estado do Maranhão. Fonte:

(http://monsenhordourado.br.tripod.com/ pag05.htm).

4.1.2 Estudo em Humanos

4.1.2.1 Casos de SPH

Amostras biológicas (n=5), sangue ou soro, de casos humanos com o

diagnóstico sorológico confirmado de SPH, procedentes dos municípios de

Anajatuba (n=3) e de Santa Rita (n=2), Maranhão, foram encaminhadas ao IEC no

período de 2001 a 2006, pelo Serviço de Vigilância Epidemiológica da Secretaria de

Saúde do Estado do Maranhão.

4.1.2.2 Inquérito sorológico

Amostras séricas (n=293), provenientes de inquérito sorológico transversal

em humanos, realizado no Município de Anajatuba no ano de 2005, tanto na área

urbana (n=54), nos bairros de Limerique e Porção do Junco, localizados próximos às

plantações de arroz, quanto na área rural nos povoados de Areal (n=42), Bacabal

(n=57), Olho D’água (n=51), Quebra (n=38), São Roque e Pastoradouro (n=51)

(Figura 12), coletadas por demanda espontânea, mediante autorização por termo de

consentimento livre e esclarecido (TCLE) (ANEXO B).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

Povoados onde foi realizado o inquérito sorológico em humanos

Zona urbana

 Povoado de São Roque, local da captura de roedores

3 Locais de ocorrência dos casos de SPH

Figura 12 – Mapa do Município de Anajatuba, Estado do Maranhão, mostrando a localização dos

povoados onde foi realizado o inquérito sorológico em humanos, o local da captura de

roedores e locais de ocorrência dos casos de SPH. Fonte: adaptado de Google Earth.

4.1.3 Estudo em Roedores

As amostras biológicas (sangue e vísceras) de roedores silvestres foram

provenientes de dois estudos ecoepidemiológicos realizados no Município de

Anajatuba, povoado de São Roque (Figura 12) em maio de 2003 e maio de 2005, os

quais foram definidos pela proximidade da residência dos casos de óbitos humanos

por hantavirose ocorridos em março e julho de 2003.

4.1.3.1 Captura dos roedores

Esses estudos foram precedidos de consulta e autorização prévia junto ao

Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA)

conforme procedimentos de captura e manejo de roedores e protocolos de

biossegurança padronizados (MILLS e CHILDS, 1998a; MILLS et al.,1998b).

Os roedores silvestres foram capturados utilizando-se armadilhas de

alumínio do tipo "Sherman", dispostas aleatoriamente em transectos alinhados

aproximadamente com cinco metros de distância entre uma e outra, distribuídas nas

Bacabal

Fomento

Roncador

São Jerônimo

São Roque

Pastoradouro

Olho D’água

Quebra

Areal

ANAJATUBA

Bacabal

Fomento

Roncador

São Jerônimo

São Roque

Pastoradouro

Olho D’água

Quebra

Areal

ANAJATUBA

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

plantações de arroz, pastos de braquiárias e também no peridomicílio (Figura 13).

Como isca, utilizou-se uma mistura de pasta de amendoim e aveia em flocos.

Figura 13 – Locais utilizados para a captura de roedores, povoado de São Roque.

As armadilhas foram montadas durante a tarde e vistoriadas na manhã

seguinte e as que continham roedores foram colocadas em sacos plásticos de 20 L

firmemente fechados para evitar contaminação dos técnicos e do meio ambiente e

transportadas até a base laboratorial de campo, local ao ar livre delimitado e

sinalizado como área infectada.

4.1.3.2 Coleta do material biológico e identificação dos roedores

Na base laboratorial de campo, os animais foram anestesiados no interior

de sacos plásticos contendo compressas de gazes umedecidas com Metofane®, ou

halotan ou éter etílico e coletas de amostras de sangue foram obtidas mediante

punção retro-ocular com capilar heparinizado. Posteriormente, os roedores foram

sacrificados por deslocamento cervical e submetidos à coleta de dados biométricos

– peso do animal, comprimento total, da cauda, da orelha e das patas traseiras – e

imediatamente necropsiados para obtenção de fígado, pulmão, baço, coração e rim,

sob condições de biossegurança de nível 3, por equipe treinada e habilitada para

esses procedimentos. As amostras coletadas foram transportadas em nitrogênio

líquido e conservadas a -70 °C até o IEC.

A identificação taxonômica dos roedores foi realizada pela equipe do

Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios/

Fundação Instituto Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) e Instituto Nacional de Câncer (INCA),

por meio de morfologia, bem como pela análise molecular para o seqüenciamentro

do DNA mitocondrial – gene Citocromo b – dos roedores com sorologia positiva

(BONVICINO e MOREIRA, 2001).

a) campo de arroz margeado

por vegetação nativa

pasto de braquiária

c) peridomicílio da residência de

um dos casos de SPH em 2003

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

4.2 ESTUDO NO PARÁ − MATO GROSSO

4.2.1 Descrição da Área

A região Sudeste da Amazônia brasileira, compreendendo o Estado do

Mato Grosso e o sul do Pará, tem notificado mais do que 100 casos de SPH desde

1995 (Figura 14).

Figura 14 – Mapa do Brasil destacando a região sudeste da Amazônia brasileira, constituída pelo sul

do Estado do Pará e Estado do Mato Grosso. Distribuição do número de casos de SPH

por município amazônico no período de 1993 a 2006. Fonte: GT-Hantaviroses/COVEV/

CGDT/DEVEP/SVS.

4.2.1.1 Estado do Pará

O Município de Altamira, Estado do Pará – 03º12'12" S; 52º12'23" O – é o

maior município do Brasil e do mundo em extensão territorial com 159.696 km

uma população de 92.105 habitantes (IBGE, 2007), onde a maioria é composta por

famílias de baixa renda. Situa-se aproximadamente a 740 km, direção sul de Belém,

capital do estado, com acesso pelas rodovias estadual PA-150 e federais

Transamazônica (BR-230) e Santarém-Cuiabá (BR-163). O clima é equatorial úmido

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

com precipitação pluviométrica que varia de 2.300 a 3.000 milímetros/ano mais

freqüente entre os meses de setembro a abril, um período que corresponde à época

das chuvas. A vegetação local é típica da Floresta Amazônica, muito embora haja

grandes áreas de desmatamento. A economia do Município é baseada na agricultura

de arroz, cacau, feijão, milho, pimenta-do-reino e na extração de madeira, borracha

e castanha-do-pará.

Os casos de SPH no Município de Altamira têm sido registrados nos

distritos de Castelo dos Sonhos – 08º12'12" S; 55º12'23"O – e de Cachoeira da

Serra – 08º34'16,94" S; 55º3'4,34"O – situados ao longo da BR-163, próximos ao

limite com o Estado do Mato Grosso (Figura 15). A vegetação da área é típica de

terras de mata baixa – cipoal – propícia para agropecuária. As populações nessas

áreas vivem em condições precárias de infraestrutura e de subsistência. Esses

distritos surgiram a partir de campo de garimpo e, atualmente, o setor madeireiro

responde pela principal atividade econômica da região, vindo em seguida a

agropecuária.

Figura 15 – Mapa do Estado do Pará, mostrando a sede do Município de Altamira e os distritos de

Castelo dos Sonhos e Cachoeira da Serra, locais de registro de casos de SPH. Fonte:

adaptado de Google Earth.

4.2.1.2 Estado do Mato Grosso

O Estado do Mato Grosso com uma extensão de 903.357,908 km² e

população estimada em 2.803,274 habitantes, possui 141 municípios (IBGE, 2007),

dos quais 19 municípios têm registro de ocorrência de casos de SPH. A notificação

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

de casos concentra-se, principalmente, na área de influência da rodovia federal BR-

364. Essa rodovia, no Estado do Mato Grosso, localiza-se na parte ocidental, entre

as mesorregiões Norte e Sudoeste. Na sua área de influência o clima é tropical

quente e sub-úmido, com precipitação anual de cerca de 1.700 mm e temperatura

variando entre de 24 ºC a 40 ºC, e vegetação típica do Cerrado e mata pré-

Amazônica. Alguns municípios dessa região são produtores agropecuários de médio

a grande porte, com ênfase na produção de grãos, principalmente a soja, além de

terem um grande potencial industrial e para o turismo ecológico. Dentre esses, estão

os municípios de Barra do Bugres, Campo Novo do Parecis, Diamantino, Nova

Olímpia, Santo Afonso, São José do Rio Claro e Tangará da Serra, locais de

procedência das amostras selecionadas para este estudo (Tabela 1; Figura 16).

Tabela 1 – Dados dos municípios matogrossenses de procedência das amostras selecionadas nesse

estudo

Município

Latitude/

Longitude

Extensão

territorial (km

)

População

(hab)

Distancia

de Cuiabá

Mesorregião

matogrossense

Barra do

Bugres

15°0421”S

57°10’52”O

7.229 32.490 173 km Sudoeste

Campo

Novo do

Parecis

13°40’31”S

57°53’31”O

9.448 22.322 387 km Norte

Diamantino 14°24’31”O

56°26’46”O

7.630 18.428 205 km Norte

Nova

Olímpia

14°47’50”S

57°17’17”O

1.568 19.474 206 km Sudoeste

Santo

Afonso

14°29’51”S

57°00’07”S

7.229 32.490 156 km Sudoeste

São José do

Rio Claro

13°26’48”S

56°43’17”O

5.058 17.345 313 km Norte

Tangará da

Serra

14°37’10”S

57°29’09”O

11.566 76.657 240 km Sudoeste

Fonte: IBGE, 2007; guia 4 rodas.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

Figura 16 – Mapa do Estado do Mato Grosso, destacando os municípios dos casos de SPH

estudados. LPI – Local provável de infecção. Fonte: adaptado de Google Earth.

4.2.2 Estudo em Humanos

4.2.2.1 Casos de SPH

Foram selecionadas 27 amostras de soro ou sangue de casos humanos

confirmados sorologicamente, sendo três das 18 positivas do Estado do Pará e 24

de 83 do Estado do Mato Grosso. Essas amostras foram encaminhadas ao IEC no

período de 2001 a 2006, pelo Serviço de Vigilância Epidemiológica das Secretarias

de Saúde do Estado do Pará e do Mato Grosso, respectivamente. Os critérios

utilizados para seleção foram baseados na detecção de anticorpos IgM anti-

hantavírus pela técnica de ELISA com ausência de IgG e tempo de doença de até

dez dias do início dos sintomas e coleta do espécime. As amostras do Pará foram

obtidas de pacientes que tiveram o seu local provável de infecção nos distritos de

Castelo dos Sonhos (n=2) e Cachoeira da Serra (n=1), Município de Altamira,

enquanto que as amostras do Mato Grosso foram procedentes dos municípios de:

Barra do Bugres (n=1), Campo Novo do Parecis (n=13), Diamantino (n=3), Nova

Olímpia (n=1), Santo Afonso (n=1), São José do Rio Claro (n=1) e Tangará da Serra

(n=4).

Diamantino

Barra do Bugres

Nova Olímpia

Tangará da Serra

Santo Afonso

São José do Rio Claro

LPI dos casos

de SPH

Legenda

Campo Novo do Parecis

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

4.2.3 Estudo em Roedores

As amostras biológicas de roedores silvestres – sangue e vísceras –

foram provenientes de dois estudos ecoepidemiológicos, um realizado nos

municípios de Tangará da Serra e Campo Novo do Parecis / MT por equipe

composta de técnicos do IEC, Centro Nacional de Epidemiologia (CENEPI) e

Secretaria de Saúde do Estado do Mato Grosso no ano de 2001 e o outro no distrito

de Castelo dos Sonhos, Município de Altamira, Pará, coordenado pela Secretaria de

Vigilância em Saúde (SVS), Ministério da Saúde (MS), Brasil com apoio do IEC e da

Secretaria de Estado de Saúde Pública (SESPA) do Estado do Pará e Secretaria de

Saúde de Altamira, no ano de 2005.

Foram também selecionadas para esse estudo quatro amostras de

roedores com sorologia positiva (IgG) por ELISA, provenientes de estudos

ecoepidemiológicos realizados nos anos de 2005 (n=1), 2006 (n=2) e 2007 (n=1), no

Município de Campo Novo do Parecis, sob a coordenação da SVS/MS/Brasil, com

colaboração da Secretaria Municipal de Saúde de Campo Novo do Parecis,

Secretaria de Vigilância Epidemiológica do Estado do Mato Grosso, IEC, FIOCRUZ e

INCA, como parte do projeto “Dinâmica populacional de roedores silvestres e o grau

de infecção por hantavírus na microrregião do médio norte do Estado de Mato

Grosso”.

Os procedimentos de captura, coleta de material biológico e identificação

dos roedores, estão descritos nas seções 4.1.3.1 e 4.1.3.2.

4.3 TÉCNICAS SOROLÓGICAS

Os soros humanos provenientes dos casos suspeitos de SPH foram

submetidos ao teste imunoenzimático de ELISA visando a detecção de anticorpos

das classes IgM e IgG conforme protocolos descritos por T. G. Ksiazek, para os

antígenos dos vírus Laguna Negra (LNV) – fluído celular – e Sin Nombre (antígeno

recombinante de nucleocapsídio), respectivamente, produzidos no Centers for

Disease Control and Prevention (CDC), Atlanta (ZÖLLER et al., 1993) e/ou antígeno

do vírus Andes (antígeno recombinante de nucleocapsídio), produzido no Instituto

MÁLBRAN em Buenos Aires para detecção de IgM conforme protocolo descrito por

PADULA et al. (2000a).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

Para o inquérito soroepidemiológico foi realizada somente a pesquisa de

anticorpos da classe IgG, bem como as amostras de sangue de roedores foram

submetidas ao teste de ELISA visando à detecção de anticorpos da classe IgG

conforme protocolo descrito por T. G. Ksiazek do CDC/Atlanta, para o antígeno do

vírus Sin Nombre (ZÖLLER et al., 1993).

4.3.1 ELISA para detecção de IgM humana anti-hantavírus

As microplacas de ELISA foram sensibilizadas com a anti-IgM humana

diluída 1:500 em solução salina tamponada (PBS) pH 7,4 e incubada overnight a 4

ºC. No dia seguinte, após lavagem com tampão de lavagem – PBS pH 7,4 com 0,1%

de “tween” 20 – adicionou-se 100 µL dos soros testes e controles negativos e

positivos, diluídos 1:100 e 1:400 em diluente do soro – PBS pH 7,4 contendo

“tween” 20 a 0,01% e “Skim Milk" /Gibco a 5% – incubou-se em câmara úmida por

60 minutos a 37 ºC. Posteriormente, foi adicionado o antígeno específico do vírus

Laguna Negra, diluído 1:4, ou Andes, diluído 1:100, e os antígenos inespecíficos –

controle negativo do antígeno – diluídos 1:4 e 1:100, respectivamente, em diluente

do soro contendo soro humano normal – sem anticorpos para hantavírus – a 2%, de

forma que cada diluição da amostra foi testada com o antígeno e o seu controle.

Incubou-se em câmara úmida por 60 minutos a 37 ºC. A seguir, foi colocado um

anticorpo de coelho anti-hantavírus Laguna Negra ou Andes, nas diluições de

1:2000 e 1:1000, respectivamente, em diluente do soro, incubou-se em câmara

úmida por 60 minutos a 37 ºC. Na próxima etapa utilizou-se um anti-anticorpo de

coelho conjugado a peroxidase, diluído 1:5000 no diluente do soro contendo soro

humano normal a 2%, incubou-se em câmara úmida por 60 minutos a 37 ºC.

Finalmente foi colocado o substrato enzimático ABTS (2,2-azino-di [3-

ethybenthiazoline sulfonate]), incubou-se a 37 °C por 30 e 45 minutos e realizaram-

se as leituras da densidade óptica (D.O.) em ambos os tempos de incubação

utilizando-se espectrofotômetro (BIO-RAD Model 550 / Microplate Reader), com filtro

de 405 nm.

Visualmente, as amostras positivas adquiriram coloração verde, enquanto

as negativas ficaram incolores. As leituras de D.O. obtidas foram corrigidas

subtraindo-se o valor da leitura da D.O. da amostra com o antígeno do hantavírus

Laguna Negra ou Andes do valor da D.O. da amostra com o controle do antígeno. A

média dos valores ajustados de D.O. dos soros controles negativos mais três

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

desvios padrões constituíram o valor limite entre positivos e negativos, que

representou o cut off do ensaio. Quando a D.O. corrigida das amostras foi superior

ou igual a 0,1 – Laguna Negra – e 0,3 – Andes – na diluição de 1:100 do soro, foi

considerada positiva (Figura 17).

Figura 17 – Esquema da técnica de ELISA IgM e IgG.

4.3.2 ELISA para detecção de IgG humana anti-hantavírus

As microplacas de ELISA foram sensibilizadas overnight a 4 ºC com o

antígeno específico do hantavírus Sin Nombre e o antígeno inespecífico – controle

negativo do antígeno

– diluídos 1:1000 em PBS pH 7,4. A seguir, adicionou-se 100 µL

dos soros controles negativos e positivos, e dos soros a serem testados, diluídos

1:400 em diluente do soro, incubou-se a 37 °C em câmara úmida por 60 minutos.

Após lavagem, com o tampão de lavagem, foi acrescentada anti-IgG humana

conjugada com peroxidase na diluição de 1:10000 em diluente do soro, seguido de

incubação a 37 °C em câmara úmida por 60 minutos. Posteriormente, adicionou-se o

ABTS, incubando a 37 °C por 30 e 45 minutos. As leituras foram realizadas em

espectrofotômetro, em ambos os tempos de incubação, com filtro de 405 nm,

seguindo as mesmas instruções do ELISA IgM. No entanto, para o teste de IgG as

amostras consideradas positivas apresentaram D.O. maior ou igual a 0,2 na diluição

1:400 (Figura 17).

Placa sensibilizada

com Ac anti-IgM

humana

Adição do Ag

Adição do soro

do paciente

suspeito

Placa sensibilizada

com Ag recombinate

Adição do soro do

paciente suspeito ou

sangue do roedor

Adição Ac anti-IgG

humana ou de roedor

conjugada a peroxidase

Adição do

substrato ABTS

Adição do Ac de

coelho anti-

hantavírus

Adição do Ac anti IgG

de coelho conjugada a

peroxidase

Adição do

substrato ABTS

ELISA PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS IgG ANTI-HANTAVÍRUS

ELISA PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS IgM ANTI-HANTAVÍRUS

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

4.3.3 ELISA para detecção de IgG de roedores anti-hantavírus

As microplacas de ELISA foram sensibilizadas overnight a 4 ºC com o

antígeno específico do hantavírus Sin Nombre e antígeno inespecífico. A seguir,

adicionou-se 100 µL dos soros de roedores controles negativos e positivos, e soros

a serem testados diluídos 1:200 em diluente do soro, incubou-se a 37 °C em câmara

úmida por 60 minutos. Em seguida foi adicionado à reação um anticorpo anti-IgG de

roedor Peromyscus leucopus conjugado a peroxidase na diluição de 1:1000 no

diluente do soro, e então realizada a incubação a 37 °C em câmara úmida por 60

minutos e em seguida a adição de ABTS. Os resultados foram interpretados com

base na D.O., sendo consideradas positivas as amostras que apresentaram D.O.

corrigida maior ou igual a 0,2 (Figura 17).

4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As análises estatísticas foram realizadas com os objetivos de analisar a

diferença de percentual de positividade entre os sexos (homens X mulheres),

procedência (zona urbana x zona rural) e entre os povoados. O programa Bioestat

4.0 foi utilizado para os cálculos e análises estatísticas das variáveis estudadas,

sendo aplicado o teste de Qui-quadrado (X

), com correção de Yeates, tendo sido

estabelecido o limite de 95% com erro α de 5%. Os resultados foram considerados

significantes quando o valor de p < 0,05 (AYRES et al., 2005).

4.5 TÉCNICAS MOLECULARES

4.5.1 Extração do RNA viral

As amostras de soro ou sangue dos casos humanos IgM positivas, bem

como fragmentos de pulmões de roedores IgG positivos foram submetidos à

extração do RNA viral pelo kit comercial QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN),

seguindo o protocolo do fabricante.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

4.5.2 RT Nested-PCR

Para a amplificação parcial do gene N de hantavírus – segmento S –, foi

realizada a técnica de RT Nested-PCR para as amostras humanas e RT Hemi-

Nested-PCR para amostras de roedores utilizando os iniciadores descritos por

JOHNSON et al. (1997), seguindo protocolo modificado, como segue:

A amplificação do genoma viral foi realizada em três etapas distintas: (i)

RT ajustada para um volume final de 10 µL, contendo tampão para RT 1x (250 mM

Tris-HCl pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl

); DTT (1 mM – 0,01% (v/v) NP-40, 50%

(v/v) glicerol); dNTPs (0,2 mM); inibidor de RNase (0,4 U/µL, Invitrogen); iniciador

SS143C (0,2 µM); transcriptase reversa (100 U - Superscript II, Invitrogen), água

livre de DNase e RNase e 5 µL do RNA viral; (ii) PCR para o volume de 25 µL,

contendo tampão para PCR 1x (250 mM Tris-HCl pH 8,3, 100 mM NaCl, 0,1 mM

EDTA), MgCl

(1,5 mM), dNTP’s (0,2 mM), iniciadores SS143C e SS1070R para

humanos, SS143C e PPT7716R para roedores (0,2 µM), a enzima Platinum Taq (2,5

U, Invitrogen) e água livre de DNAse e RNAse e 5 µL do cDNA obtido na RT; (iii)

Nested-PCR e Hemi-Nested-PCR foram realizadas para o volume final de 100 µL,

seguindo o mesmo protocolo da PCR, substituindo, no entanto, os iniciadores, que

foram SS283C e PPT7716R, e a concentração do cDNA proveniente da PCR

(1:500).

Figura 18 – Esquema da técnica de RT Nested–PCR ou RT Hemi-Nested–PCR.

3’

5’

Linearização do

RNA vir

55º por 5 min

Transcrição

reversa

(

)

SS143

42º por 90 min

PCR

cDNA

Degradação do RNA

5’- -3’

SS143

SS1070R

3’-

SS143

PPT7716R

Amostras de humanos

mostras de roedores

Aplificação do cDNA

Nested-PCR

(Amostras de humanos)

Hemi Nested-PCR

(Amostras de roedores)

3’- -5’

SS283

PPT7716R

95º por 45 seg

45º por 1 min

72º por 2 min

72º por 10 min

35 ciclos

72º por 10 min

35 ciclos

95º por 45 seg

45º por 1 min

72º por 2 min

CICLAGEM

ETAPA

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

O RNA viral foi inicialmente desnaturado a 55 ºC por 5 minutos e

transcrito reversamente a 42 °C por 90 minutos. O produto da RT foi então

submetido à PCR e posteriormente ao Nested ou Hemi-Nested-PCR, ambas

realizadas em 35 ciclos compostos de três etapas: 95 ºC por 45 segundos para

desnaturação, 45 ºC por um minuto para anelamento e 72ºC por dois minutos para

síntese; e extensão final a 72 ºC por 10 minutos, utilizando o termociclador

Mastercycler gradient (Eppendorf) (Figura 18). A visualização dos amplicons

(produto final de 434 pb) foi realizada em gel de agarose 1,5% corado com brometo

de etídio, utilizando transiluminador com luz UV (Vilber Lourmat).

4.5.3 Seqüenciamento nucleotídico

Os cDNAs obtidos foram purificados usando o kit comercial GFX

PCR

DNA and Gel Band Purification kit (GE healthcare) e em seguida submetidos ao

seqüenciamento utilizando o ABI PRISM Dye Terminator Kit (Applied Biossystems)

em seqüenciador automático, modelo ABI PRISM 377 (Applied Biossystems).

4.5.4 Análise filogenética

As seqüências nucleotídicas obtidas foram alinhadas e comparadas entre

si e com outras seqüências nucleotídicas de hantavírus disponíveis (Tabela 2) no

GenBank, utilizando o programa Clustal X (THOMPSON et al., 1997). As árvores

filogenéticas foram construídas pelos métodos de agrupamento de vizinhos

(Neighbor Joining, NJ) e máxima parcimônia (MP) implementados no programa

PAUP 4.0b.10 (SWOFFORD, 2002), bem como o método de máxima

verossimilhança (MV) utilizando o programa PHYML (GUINDON e GASCUEL,

2003). Para a análise pelo método de NJ, a matriz de distância foi calculada a partir

das seqüências alinhadas usando o modelo de Tamura-3 parâmetros (parâmetro de

distribuição gama = 1.0). A análise de bootstrap (1.000 réplicas) foi realizada para

gerar maior confiabilidade aos valores dos grupamentos que foram obtidos

(FELSENSTEIN, 1985) nos métodos de NJ, MP e MV.

O programa Moldest v. 3.6 (POSADA e CRANDALL, 1998) foi utilizado

para determinar o melhor modelo de substituição nucleotídica a ser usado baseado

no critério de informação Akaike (Akaike Information Criterion, AIC). A análise

Bayesiana foi realizada empregando o modelo de Markov Monte Carlo (Markov

Chain Monte Carlo, MCMC) e implementada no programa MrBayes 3.0b4. A análise

foi feita para dois milhões de réplicas, sendo a amostragem fixada a cada 1.000

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Material e métodos

árvores geradas. Os valores Bayesianos foram estimados em 50% das árvores

consenso geradas (HUELSENBECK e RONQUIST, 2001). O programa TRACER

(www.evolve.zoo.ox.ac.uk) foi utilizado para verificar se a análise realizada pelo

programa MrBayes havia alcançado a convergência apropriada.

Valores de confiabilidade foram calculados pelo programa Mega 3.0

(KUMAR et al., 2004) baseados na média de divergência nucleotídica obtidas para

diferentes cepas de hantavírus do Velho e do Novo Mundo até o momento

seqüenciados, sendo tais valores estimados em < 45%, < 25%, 22% e < 15% para o

grupamento das cepas em clusters, clades, sub-clades e espécie viral,

respectivamente.

Tabela 2 – Hantavírus utilizados para a construção da árvore filogenética de seqüências nucleotídicas

parciais do gene N, segmento S

Espécie viral ou

Variante

Abreviatura Hospedeiro Local de Coleta GenBank

Alto Paraguay

APV

Holochilus chacarius

Paraguay DQ345762

Anajatuba

ANAJV

Oligoryzomys aff. fornesi

Anajatuba, Maranhão

Brasil

DQ451829

Andes

ANDV

Oligoryzomys longicaudatus

Argentina NC003466

Andes Bermejo

BERJ

Oligoryzomys chacoensis

Oran, Argentina AF482713

Andes Lechiguanas

LECV

Oligoryzomys flavescens

Ilhas Lechiguanas,

Argentina

AF482714

Andes Neembucu

NEMV

Oligoryzomys chacoensis

Paraguay DQ345763

Andes North Oran

ORNV

Oligoryzomys longicaudatus

Oran, Argentina AF482715

Andes Sout AH-1

AND AH-1 - Argentina AF324902

Araraquara

ARAV

Necromys lasiurus

Araraquara, São

Paulo, Brasil

AF307325

Bayou

BAYV

Oryzomys palustris

Estados Unidos L36929

Black Creek Canal

BCCV

Sigmodon hispidus

Estados Unidos L39949

Cano Delgadito

CANOV

Sigmodon alsoni

Venezuela DQ285566

Castelo dos Sonhos

CASV

Altamira, Pará, Brasil AF307324

Choclo

CHOV

Oligoryzomys fulvescens

Panamá DQ285046

El Moro Canyo

ELMCV

Reithrodontomys megalotis

Estados Unidos,

México

U54577

Hantaan

HTNV

Apodemus agrarius

China, Rússia, Coréia NC005218

Itapuã cepa 38

Itapua Oligoryzomys nigripes

Paraguai DQ345766

Juquitiba-Araucaria

JUQV

Oligoryzomys nigripes

Santa Catarina, Brasil EF492472

Laguna Negra

LNV

Calomys laucha

Bolívia, Paraguai AF005727

Limestone Canyon

LSCV

Peromyscus boylii

Estados Unidos AF307322

New York

NYV

Peromyscus leucopus

Estados Unidos U09488

Muleshoe

MULV

Sigmodon hispidus

Estados Unidos U54576

Pergamino

PRNV

Akodon azarae

Pergamino, Argentina AF482717

Puumala

PUUV

Clethrionomys glareolus

Europa, Rússia,

Escandinávia

NC005224

Rio Mamoré

RIOMV

Oligoryzomys microtis

Bolívia U52138

Rio Mearim

RIMEV

Holochilus sciureus

Anajatuba, Maranhão,

Brasil

DQ451828

Rio Segundo

RIOS

Reithrodontomys mexicanus

Costa Rica, Panamá U18100

Sin Nombre

SNV

Peromyscus maniculatus

Estados Unidos,

Canadá, México

NC005216

Seoul

SEOV

Rattus norvegicus

Europa NC005236

Tula

TULV

Microtus arvalis

Europa NC005227

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

5 RESULTADOS

5.1 ECOSSISTEMA DO MARANHÃO

5.1.1 Casos de SPH

Foram confirmados sorologicamente no IEC por detecção de anticorpos

da classe IgM, em teste de ELISA, cinco casos de SPH procedentes do Estado do

Maranhão, dentre as amostras encaminhadas pela Secretaria de Saúde do Estado

do Maranhão, no período de 2001 a 2006, sendo três do Município de Anajatuba e

dois de Santa Rita (Tabela 3). Em Anajatuba, os casos ocorreram nos anos de 2003

(n=2) nos povoados de São Roque e Fomento, e 2006 (n=1) no povoado de

Roncador. Os dois casos do Município de Santa Rita ocorreram no ano de 2003,

sendo um no povoado de Conceição e o outro de procedência desconhecida. Todos

os pacientes foram do sexo masculino, com média de idade de 25,3 anos para os

casos de Anajatuba e de 30 anos para os de Santa Rita, apresentando clínica e

epidemiologia compatível com hantavirose. Desses, dois (40%) casos evoluíram

para óbito, um em 2003 (H 666379) e outro em 2006 (H 708080), ambos

procedentes de Anajatuba.

Tabela 3 – Sumário dos casos de SPH procedentes do Estado do Maranhão, confirmados

laboratorialmente no IEC, 2003 a 2006

Paciente

Município /

povoado

Idade

Data da

amostra

(soro)

Tempo

doença*

Evolução

ELISA

IgG

ELISA

IgM

H 666379

Anajatuba /

São Roque

24 anos 25/03/03 1 dia Óbito Negativo Positivo

H 668281

Santa Rita /

Conceição

21 anos 14/05/03 6 dias Cura Positivo Positivo

H 670957

Anajatuba /

Fomento

24 anos 22/07/03 4 dias Cura Positivo Positivo

H 672862

Santa Rita /

39 anos 21/10/03 10 dias Cura Negativo Positivo

H 708080

Anajatuba /

Roncador

28 anos 12/06/06 NI Óbito Negativo Positivo

* Informação da ficha clínica epidemiológica; NI - Não informado.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

5.1.2 Inquérito sorológico em moradores do Município de

Anajatuba

No inquérito sorológico transversal realizado em maio de 2005, foram

obtidas 293 amostras de soros humanos, por demanda espontânea de residentes

em diversas localidades do Município de Anajatuba, correspondendo a 8,1% da

população estudada e 1,2% da população total do Município, sendo 140 (47,8%) do

sexo masculino e 153 (52,2%) do sexo feminino.

As amostras foram procedentes da zona urbana, n=54 (moradores dos

bairros de Limirique e Porção do Junco), e zona rural, n=239, as quais procederam

dos povoados de Areal (n=42), Bacabal (n=57), Olho D’água (n=51), Quebra (n=38)

e São Roque e Pastoradouro (n=51) (Tabela 4). Dentre esses, participaram pessoas

que apresentavam diversas atividades de risco para a infecção por hantavírus, tais

como: moradia próxima aos arrozais; trabalho na lavoura; atividade de pesca;

presença de roedores na residência; contato com roedores silvestres no local de

trabalho, escola ou nos arredores da região que vivem, bem como pessoas com

hábito de armazenar arroz dentro de casa.

Das 293 amostras testadas, 32 (10,9%) foram positivas para anticorpos

IgG anti-hantavírus, entre essas nove (28,1%) da zona urbana e 23 (71,9%) da zona

rural. As nove positivas provenientes da zona urbana mostraram um percentual de

16,7% entre as 54 testadas, assim como, três (7,1%) de 42 do povoado do Areal,

sete (12,3%) de 57 do Bacabal, cinco (9,8%) das 51 do Olho D’água, cinco (13,2%)

de 38 de Quebra e três (5,9%) das 51 dos povoados de São Roque e Pastoradouro.

O teste de X

mostrou que não houve significância estatística quando se comparou o

percentual de positividade entre as zonas urbana e a rural (p=0,1683), bem como

entre os povoados (p=0,3844).

O maior número de amostras positivas foi do sexo masculino (n=21;

65,6%) com média de idade de 45,1 anos, mediana 43 anos e intervalo de 15 a 78

anos. O número de mulheres IgG positivas foi de 11 (34,4%) com idade média de

46,5 anos, mediana de 49 anos e intervalo de 20 a 80 anos. Houve diferença

estatísticamente significante entre os sexos (p=0,0018), sendo o risco maior de se

infectar por hantavírus no sexo masculino.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Tabela 4 – Amostras de soros humanos coletadas em zona urbana e rural do Município de Anajatuba

em maio de 2005

Área Povoado

Número de

habitantes*

Número

amostras

Participantes

IgG

Positivas

Percentual

Positividade

Zona

Urbana

Limirique e

Porção do

Junco

(bairros)

1059 54 5,09% 9 16,7%

Areal 375 42 11,2% 3 7,1%

Bacabal 790 57 7,2% 7 12,3%

Olho D’água 193 51 26,4% 5 9,8%

Quebra 584 38 6,5% 5 13,2%

Zona

Rural

São Roque e

Pastoradouro

634 51 8,0% 3 5,9%

Total Zona Rural 2576 239 9,3% 23 9,6%

TOTAL 3635 293 8,1% 32 10,9%

* Dados fornecidos pela Secretaria de Saúde do Município de Anajatuba, 2005.

5.1.3 Roedores capturados em Anajatuba

Foram capturados 216 de roedores, 96 (44,4%) no ano de 2003 e 120

(55,6%) no ano de 2005. As espécies predominantes capturadas em 2003 foram

Akodon sp. (n= 27; 28,1%) e N. lasiurus (n=62; 64,3%), no entanto apenas três

exemplares de N. lasiurus apresentaram anticorpos IgG anti-hantavírus (4,8%). Em

2005, de 120 roedores capturados, 102 (85%) foram da espécie N. lasiurus e três

(2,5%) de Oligoryzomys sp. Anticorpos IgG anti-hantavírus foram detectados nas

duas espécies: N. lasiurus e Oligoryzomys aff. fornesi, com percentuais de

positividade de 2,9 e 100%, respectivamente (Tabela 5).

Entre os roedores silvestres capturados, observou-se a presença de N.

lasiurus, Proechimys sp. e Oligoryzomys sp. em ambos os anos (Tabela 5).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Tabela 5 – Roedores capturados no povoado de São Roque, Município de Anajatuba, Estado do

Maranhão, nos anos de 2003 e 2005

Ano Espécie de roedores Nº

Freqüência

de captura

IgG

ELISA

Positivo

Percentual de

positividade

Akodon sp. 27 - - -

Necromys lasiurus

62 64,3% 3 4,8%

Proechimys sp.

2 2,1% - -

Mus musculus

3 - -

Oligoryzomys sp.

2 2,1% - -

2003

Total parcial 96 - 3 3,1%

Proechimys sp.

2 1,7% - -

Necromys lasiurus

102 85% 3 2,9%

Oligoryzomys aff. fornesi

2 1,7% 2 100%

Rattus sp.

3 - - -

Rattus rattus

2 - - -

Necromys lasiurus

3 - - -

Oecomys sp. 1 - - -

Oligoryzomys sp. 1 - - -

Cavia sp.

1 - - -

Mus musculus

3 - - -

2005

Total parcial 120

- 5 4,1%

TOTAL 216 - 8 3,7%

¹ Espécies de roedores capturadas nos dois anos; ² Roedores sinantrópicos comensais.

A análise filogenética das seqüências nucleotídicas parciais do gene

mitocondrial Citocromo b a partir do fígado dos roedores do gênero Oligoryzomys

sorologicamente positivos capturados no ano de 2005 (amostras biológicas AN

690424 e AN 690473) demonstrou que ambos os espécimes são homólogos entre si

e diferentes das demais espécies do gênero Oligoryzomys, no entanto apresentando

maior similaridade com roedores da espécie O. fornesi, resultado que possibilitou,

assim, uma classificação preliminar como Oligoryzomys aff. fornesi.

5.1.4 Detecção do genoma viral e análise filogenética

Dos cinco casos de pacientes com o diagnóstico laboratorial confirmado

para SPH, obteve-se amplicons de 434 pb de três deles, todos do ano 2003, sendo

dois de Anajatuba, H 666379 (sangue), H 670957 (sangue) e um de Santa Rita, H

672862 (soro) (Figura 19).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Figura 19 – Gel de agarose a 1,5%, mostrando amplicons de aproximadamente 400 pares de base

(pb) das amostras RT Nested-PCR positivas do Estado do Maranhão. Low DNA Mass

(Invitrogen) – Marcador de tamanho de fragmento e de peso molecular.

Das oito amostras de pulmões de roedores cujos soros mostraram presença

de anticorpos IgG, de três se conseguiu detectar o genoma de hantavírus: AN 669104

(N. lasiurus: RO 19238) de 2003, AN 690936 (O. aff. fornesi: RO 19491) e AN 690985

(O. aff. fornesi: RO 19540) todos de 2005. Esses amplicons foram seqüenciados,

obtendo-se seqüências nucleotídicas de aproximadamente 400 nt (posições 250 a 657

referente ao gene N do vírus Laguna Negra) que foram comparadas com outras

seqüências de hantavírus disponíveis no GenBank (Tabela 2).

A análise filogenética realizada pelos métodos de NJ, MP, MV e análise

bayesiana mostrou topologias semelhantes (dados não mostrados). A análise pelo

método MV, por apresentar valores de bootstrap com maior confiabilidade, foi

selecionada e está representada na árvore, assim como, os dados da análise

bayesiana correspondentes (Figura 20).

A árvore filogenética foi dividida em dois clusters principais, um

relacionado aos hantavírus do Novo Mundo associados aos roedores da família

Cricetidae, subfamília Sigmodontinae e outro relacionado aos hantavírus do Velho

Mundo associados aos roedores da família Muridae, sendo subdividido em dois

grupos: grupo da subfamília Murinae e grupo da subfamília Arvicolinae (Figura 20). A

divergência genética entre os clusters foi de 47,5% (valor de inclusão = 45%).

PM1

45678

Legenda

1 H 672862

2 H 666379

3 H 670957

4 AN 690985

5 AN 690936

6 AN 669104

7 Controle Negativo

Amplicons com

tamanho de

~400 pb

PM1

45678

PM1

45678

Legenda

1 H 672862

2 H 666379

3 H 670957

4 AN 690985

5 AN 690936

6 AN 669104

8 Controle Negativo

Amplicons

tamanho de

~400 pb

9 Água

PM1

45678

PM1

45678

Legenda

1 H 672862

2 H 666379

3 H 670957

4 AN 690985

5 AN 690936

6 AN 669104

7 Controle Negativo

Amplicons com

tamanho de

~400 pb

PM1

45678

101

45678

Legenda

1 H 672862

2 H 666379

3 H 670957

4 AN 690985

5 AN 690936

6 AN 669104

8 Controle Negativo

10 Low DNA Mass

Amplicons

tamanho de

~400 pb

9 Água

PM1

45678

Legenda

1 H 672862

2 H 666379

3 H 670957

4 AN 690985

5 AN 690936

6 AN 669104

7 Controle Negativo

Amplicons com

tamanho de

~400 pb

PM1

45678

PM1

45678

Legenda

1 H 672862

2 H 666379

3 H 670957

4 AN 690985

5 AN 690936

6 AN 669104

8 Controle Negativo

Amplicons

tamanho de

~400 pb

9 Água

PM1

45678

PM1

45678

Legenda

1 H 672862

2 H 666379

3 H 670957

4 AN 690985

5 AN 690936

6 AN 669104

7 Controle Negativo

Amplicons com

tamanho de

~400 pb

PM1

45678

101

45678

Legenda

1 H 672862

2 H 666379

3 H 670957

4 AN 690985

5 AN 690936

6 AN 669104

8 Controle Negativo

10 Low DNA Mass

Amplicons

tamanho de

~400 pb

9 Água

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Figura 20 – Análise filogenética das seqüências nucleotídicas parciais do segmento SRNA de cepas

de hantavírus procedentes do Estado do Maranhão, utilizando os métodos de máxima

verossimilhança e Bayesiano. Valores de bootstrap e bayesiano (dentro dos parênteses)

são mostrados para cada respectivo nó. As setas indicam a posição exata dos valores.

Os números dentro dos colchetes representam os valores de divergência entre os

grupos. A barra indica o valor de 30% na divergência de seqüências nucleotídicas.

Legenda: Alto Paraguay (APV), Anajatuba (ANAJV), Andes (ANDV) Andes Bermejo

(BMJV), Andes Neembuco (NEMV), Andes Lechiguanas (LECV), Andes Oran (ORNV),

Araraquara (ARAV), Bayou (BAYV), Black Creek Canal (BCCV), Cano Delgadito

(CANOV), Castelo dos Sonhos (CASV), Choclo (CHOV), El Moro Canyon (ELMCV),

Hantaan (HTNV), Juquitiba-Araucaria (JUQV), Laguna Negra (LNV), Limestone Canyon

(LSCV), Muleshoe (MULV), New York (NYV), Pergamino (PRNV), Puulmala (PUUV), Rio

Mamoré (RIOMV), Rio Mearim (RIMEV), Rio Segundo (RIOSV), Seoul (SEOV), Sin

Nombre (SNV) e Tula (TULV).

Velho Mundo

Hantavirus

(Muridae)

LSCV

I-a

I-b

I-c

II-a

II-b

Murinae

Arvicolinae

Novo Mundo

Hantavirus

(Cricetidae,

Sigmodontinae)

Subclade

Clade

Cluster

RIOSV

ELMCV

BMJV

NEMV

LECV

NDV

ORNV

NDV AH-1

CASV

JUQV

Itapua

RAV

PRNV

SNV

NYV

CANOV

CHOV

BAYV

BCCV

MULV

N 669104* N. lasiuru

ANAJV

H 672862

H 666379

N 690985

N 690936

H 670957

RIOMV

RIMEV

LNV

HTNV

SEOV

TULV

PUUV

100 (1.0) [28.2%]

100 (1.0)

96% (0.92)

91% (0.89)

95% (0.92)

97% (0.93)

100 (1.0)

[2.0 %]

100 (1.0)

0.3

[22.3%]

[22.5%]

[23.7%]

100 (1.0)

[47.5%]

[14%]

[23.5%]

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

O cluster dos hantavírus do Novo Mundo foi dividido em duas clades:

clade I e clade II, evidenciando uma distância genética de 28,2% (valor de inclusão =

25%). A clade I foi subdividida em três subclades (divergência genética de 23,5%),

sendo: subclade I-a compreendendo os hantavírus Andes North Bermejo (BERJ),

Andes Neembuco (NEMV), Andes Lechiguanas (LECV), Andes Cent Buenos Aires,

Andes North Oran (ORNV), Andes South AH-1 (AND AH-1), Castelo dos Sonhos

(CASV), Juquitiba-Araucária (JUQV), Itapuã, Araraquara (ARAV) e Pergamino, que

geneticamente se relacionam com o vírus Andes. A subclade I-b é representada

pelos vírus Sin Nombre, New York, Limestrone Canyon (LSCV), El Moro Canyon,

Rio Segundo, Choclo e Caño Delgadito, enquanto que a subclade I-c agrupou os

hantavírus Muleshoe, Bayou e Black Creek Canal.

A Clade II foi dividida em duas subclades (divergência genética de

23,7%): a subclade II-a que agrupa o vírus Anajatuba e as seqüências relacionadas

às amostras humanas H 666379 e H 670957 provenientes de Anajatuba, a amostra

H 672862 procedente de Santa Rita, bem como as amostras de roedores capturados

em Anajatuba AN 669104 (N. lasiurus) em 2003, AN 690936 e AN 690985 (O. aff.

fornesi) em 2005, apresentando divergência genética de 2% e bootstrap de 100% e

a subclade II-b, onde estão incluídos os vírus Rio Mamoré, Rio Mearim, Alto

Paraguay (APV) e Laguna Negra.

Os percentuais de homologia nucleotídica e aminoacídica entre o vírus

Anajatuba e as amostras estudadas do Maranhão (2003 e 2005) foram de 98% e

100%, respectivamente (Tabela 6), estando incluídas em um grupo relacionado aos

roedores do gênero Oligoryzomys, muito embora a amostra AN 669104 tenha sido

obtida de N. lasiurus.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Tabela 6 – Homologia entre cepas de hantavírus procedentes do Estado do Maranhão e outros hantavírus relacionados da América do Sul

Vírus AN 669104 AN 690985 AN 690936 H 670957 H 672862 H 666379 ANAJ LNV RIMEV RIOMV APV CASV Itapua ARAV JUQV

AN 669104 *** 98.6 97.9 97.2 99.3 98.8 99.5 79.6 81.3 82.4 81.3 77.7 77.8 79.4 80.6

AN 690985 100 *** 97.5 97.7 98.4 98.4 98.1 80.3 81.0 82.6 80.8 77.9 78.5 79.9 81.3

AN 690936 100 100 *** 97.5 97.7 97.2 97.9 78.9 81.5 82.2 81.5 78.7 78.5 79.7 81.0

H 670957 100 100 100 *** 97.9 97.0 97.2 80.1 80.8 82.6 80.8 78.9 78.5 79.7 81.0

H 672862 100 100 100 100 *** 99.1 98.8 79.6 81.0 82.9 81.7 78.4 78.2 79.9 81.0

H 666379 100 100 100 100 100 *** 98.4 80.3 81.5 82.6 81.7 77.9 78.0 79.9 80.8

ANAJV 100 100 100 100 100 100 *** 79.9 81.3 82.2 81.0 78.2 77.8 79.2 80.3

LNV 96.5 96.5 96.5 96.5 96.5 96.5 96.5 *** 78.7 82.2 78.9 77.7 79.2 79.7 78.9

RIMEV 96.5 96.5 96.5 96.5 96.5 96.5 96.5 94.4 *** 80.6 79.2 75.5 76.6 76.2 76.9

RIOMV 97.9 97.9 97.9 97.9 97.9 97.9 97.9 97.2 97.2 *** 80.8 76.7 78.2 81.4 77.8

APV 97.2 97.2 97.2 97.2 97.2 97.2 97.2 96.5 96.5 99.3 *** 78.7 78.5 78.9 78.7

CASV 93.4 93.4 93.4 93.4 93.4 93.4 93.4 93.4 91.9 92.6 91.9 *** 79.7 78.2 81.4

Itapua 94.4 94.4 94.4 94.4 94.4 94.4 94.4 93.8 91.7 93.1 92.4 96.3 *** 82.1 93.5

ARAV 93.3 93.3 93.3 93.3 93.3 93.3 93.3 94.1 91.2 92.6 91.9 95.6 97.8 *** 81.1

JUQV 94.4 94.4 94.4 94.4 94.4 94.4 94.4 93.8 91.7 93.1 92.4 96.3 100 97.8 ***

Legenda: Alto Paraguay (APV), Anajatuba (ANAJV), Castelo dos Sonhos (CASV), Juquitiba-Araucaria (JUQV), Laguna Negra (LNV), Rio Mamoré

(RIOMV), Rio Mearim (RIMEV), Rio Segundo (RIOSV).

Identidade das seqüências nucleotídicas

Identidade das seqüências aminoacídicas

Relação genética (nucleotídeos e aminoácidos) das cepas de hantavírus provenientes de humanos (H 670957, H 672862 e H 666379) e

Roedores (RO 19238/AN 669104; RO 19540/AN 690985; RO 19491/AN 690936) com o vírus Anajatuba

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

5.2 ECOSSISTEMA DO PARÁ − MATO GROSSO

5.2.1 Amostras Humanas

Das 27 amostras de casos de SPH selecionadas desse ecossistema, três

(11,1%) e 24 (88,9%) procederam dos estados do Pará e Mato Grosso,

respectivamente. O genoma de hantavírus foi detectado em 23 amostras: três

procedentes do Município de Altamira (duas do distrito de Castelo dos Sonhos e

uma de Cachoeira da Serra), Estado do Pará e 20 do Estado do Mato Grosso, sendo

uma de Barra do Bugres, dez de Campo Novo do Parecis, três de Diamantino, uma

de Nova Olímpia, uma de Santo Afonso, uma de São José do Rio Claro e três de

Tangará da Serra. Desse total em apenas quatro não se obteve o seqüenciamento

parcial do gene N segmento S de hantavírus, sendo três de Campo Novo do Parecis

e uma de Tangará da Serra. Informações detalhadas desses pacientes IgM positivos

podem ser vistas na tabela 7.

Com relação às amostras seqüenciadas, observou-se que todos os três

casos procedentes do Município de Altamira, foram do sexo masculino, com idade

média de 30 anos, sendo um notificado no ano de 2005 (H 695323) e dois em 2006

(H 700306 e H 712177). Os casos de SPH do Estado do Mato Grosso (n=16), dez

são do sexo masculino (62,5%), com a idade média de 30,2 anos e seis do sexo

feminino (37,5%), com idade média de 17,2 anos. Dessas amostras, uma foi

notificada no ano de 2001 (Campo Novo do Parecis), quatro de 2002 (Campo Novo

do Parecis, Diamantino, Nova Olímpia e Tangará da Serra), uma de 2003 (Campo

Novo do Parecis), uma de 2004 (Campo Novo do Parecis), quatro de 2005 (Barra do

Bugres, Campo Novo do Parecis, n=2 e Santo Afonso) e cinco de 2006 (Campo

Novo do Parecis, Diamantino, n=2, São José do Rio Claro e Tangará da Serra)

(Tabela 7).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Tabela 7 – Dados das amostras de pacientes dos estados do Pará e Mato Grosso e incluídos neste

estudo com seqüenciamento nucleotídico parcial do gene N

Município /

Registro do

Paciente

Sexo

Idade

(anos)

Amostra

Data da

amostra

Evolução

Estado do Pará

H 695323* M 24 Soro 14/09/05 NI

H 700306* M 30 Soro 09/02/06 NI

Altamira

H 712177** M 36 Soro 17/08/06 NI

Estado do Mato Grosso

Barra do

Bugres

H 678213 M 38 Soro 10/03/05 Cura

H 650736 M 33 Soro 19/12/01 Óbito

H 660462 F 23 Soro 08/07/02 Cura

H 671696 F 20 Soro 23/08/03 Óbito

H 682807 M 20 Soro 22/08/04 Óbito

H 695689 F 27 Soro 30/08/05 Cura

H 696558 M 22 Sangue 2005 Cura

Campo Novo

do Parecis

H 711891 M 42 Soro 17/08/06 Óbito

H 657848 M 42 Soro 14/05/02 Cura

H 706738 F 13 Soro 22/05/06 Cura

Diamantino

H 712518 M 33 Soro 29/08/06 Cura

Nova Olímpia H 653486 F 13 Soro 22/02/02 Cura

Santo Afonso H 695325 M 24 Soro 11/09/05 Cura

São José do

Rio Claro

H 713175 M 17 Soro 26/09/06 Cura

H 651686 M 31 Soro 22/01/02 Cura Tangará da

Serra

H 710031 F 07 Soro 18/07/06 Óbito

Fonte: Secretaria de Vigilância Epidemiológica do Estado do Mato Grosso, SESPA e IEC/SVS/MS.

Notas:

NI = não informado;

*Castelo dos Sonhos;

** Cachoeira da Serra

5.2.2 Amostras de roedores

No estudo ecoepidemiológico de 2001 no Estado do Mato Grosso foram

capturados 126 roedores, sendo 85 (67,4%) de Tangará da Serra e 41 (32,5%) de

Campo Novo do Parecis, com 68 (53,9%) roedores sinantrópicos comensais

capturados nos dois municípios, 49 (38,8%) roedores silvestres das espécies

Calomys sp., entre os quais 33 foram capturados em Tangará da Serra e 13 em

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Campo Novo do Parecis, dois N. lasiurus de Tangará da Serra, um Proechimys sp.

de Campo Novo do Parecis e nove (7,1%) não identificados. Destes, oito

apresentaram anticorpos IgG, todos identificados, morfometricamente e pelo

seqüenciamento parcial do DNA mitocondrial do gene Citocromo b, como

pertencentes a espécie Calomys aff. callosus, sendo dois (15,3%) capturados em

Campo Novo do Parecis e seis (18,1%) em Tangará da Serra (Tabela 8).

Tabela 8 – Roedores capturados nos Municípios de Campo Novo do Parecis e Tangará da Serra, Estado

do Mato Grosso, em 2001 e Castelo dos Sonhos, Estado do Pará no ano de 2005

Ano Espécie de roedores Nº

Freqüência

de captura

IgG / ELISA

Positivo

Percentual

positividade

Estado do Mato Grosso

Município de Tangará da Serra

Calomys sp. 33 38,8% 06

18,1%

Rattus rattus

30 - - -

Mus musculus

12 - - -

Necromys lasiurus

02 2,3% - -

Não identificado

08 - - -

Total parcial

85 67,4% 06 7,0%

Município de Campo Novo do Parecis

Calomys sp. 13 31,7% 02

15,3%

Rattus rattus

14 - - -

Mus musculus

12 - - -

Proechimys sp. 01 2,4% - -

Não identificado

01 - - -

Total parcial

41 32,5% 02 4,8%

2001

TOTAL 126 - 08 6,3

Estado do Pará

Município de Castelo dos Sonhos

Oligoryzomys sp. 16 53,3 -

Oxymycterus amazonicus

sp.

05 16,6 02

Oryzomys sp. 01 3,3 -

Akodon sp. 04 13,3 -

Proechimys sp. 02 6,6 -

Mus musculus

01 - -

Rattus rattus

01 - -

2005

TOTAL 30

02 6,6

Notas:

1 − roedores sinantrópicos comensais;

2 − Calomys aff. callosus;

3 − Oxymycterus amazonicus

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

A amplificação do genoma viral foi obtida em sete dos oito roedores IgG

positivos em amostras de pulmão e/ou coração. No entanto, em apenas três

roedores obteve-se o seqüenciamento nucleotídico parcial do gene N (Tabela 9).

Dos 30 roedores capturados em Castelos dos Sonhos, somente dois, do

gênero Oxymycterus amazonicus, foram IgG positivos, porém não se obteve

amplificação do genoma de hantavírus.

Dentre os roedores capturados no projeto de dinâmica populacional

realizado no Município de Campo Novo do Parecis (período de 2005 a 2007), 30

apresentaram anticorpos IgG anti-hantavírus, sendo 26 (86,7%) identificados

morfometricamente como pertencentes ao gênero Calomys sp. e quatro (13,3%) à

espécie Oligoryzomys aff. moojeni.

Somente as quatro amostras de O. aff. moojeni

foram selecionadas para os estudos moleculares, tendo sido detectado o genoma de

hantavírus e realizado o seqüenciamento nucleotídico dos mesmos (Tabela 9).

Tabela 9 – Roedores capturados no Estado do Mato Grosso, sorologicamente positivos, que foram

selecionados para análise molecular (RT Nested-PCR)

Roedor

Nº de

Campo

Espécie

Registro da

amostra

Órgão

Local da

captura

Ano de

captura

Resultado

RT Nested-

PCR

RO 18979

Calomys aff. callosus

- - TS 2001 +

RO 18980

Calomys aff. callosus

AN 649993 Coração TS 2001 +

RO 19002

Calomys aff. callosus

- - CNP 2001 +

RO 19049

Calomys aff. callosus

- - TS 2001 +

RO 19065

Calomys aff. callosus

AN 650204 Pulmão CNP 2001 +

RO 19087

Calomys aff. callosus

- - TS 2001 -

RO 19089

Calomys aff. callosus

AN 650228 Pulmão TS 2001 +

RO 19091

Calomys aff. callosus

- - TS 2001 +

RO 19856

Oligoryzomys aff. moojeni

AN 711258 Pulmão CNP 2005

RO 20345

Oligoryzomys aff. moojeni

AN 717307 Pulmão CNP 2006

RO 20351

Oligoryzomys aff. moojeni

AN 717313 Pulmão CNP 2006

RO 20949

Oligoryzomys aff. moojeni

AN 729965 Coração CNP 2007

Notas: CNP = Campo Novo do Parecis; TS = Tangará da Serra

a – amostras utilizadas para a obtenção de amplicons e subseqüente seqüenciamento nucleotídico;

b – amostras procedentes do projeto “Dinâmica populacional de roedores silvestres e o grau de infecção

por hantavírus na Microrregião do Médio Norte do Estado de Mato Grosso” que foram seqüenciadas.

Diagnóstico laboratorial realizado no IEC e identificação dos roedores feita pela equipe da FIOCRUZ e INCA,

com permissão para a utilização dos dados nesta tese pela Coordenação do Projeto (SVS/MS).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

5.2.3 Análise filogenética

A árvore filogenética das seqüências nucleotídicas parciais do gene N dos

hantavírus detectados nos estados do Pará e Mato Grosso foi dividida em cluster,

clade e subclade da mesma forma que a árvore obtida para o estudo de Anajatuba,

Maranhão.

As três amostras dos casos de SPH procedentes de Altamira-Pará, dos

distritos de Castelo dos Sonhos e Cachoeira da Serra, e as quatro amostras de O.

aff. moojeni capturados em Campo Novo do Parecis se agruparam juntamente com

o hantavírus Castelo dos Sonhos, na subclade I-a relacionada ao hantavírus Andes.

A variação da divergência genética (∆div) para o vírus Castelo dos Sonhos foi de

0,7% a 8,7%, sendo menor que o valor limítrofe para espécie viral (valor de inclusão

< 15%). Ademais, observou-se que as cepas relacionadas ao vírus Castelo dos

Sonhos foram divididas em três genótipos distintos: I-CASV, onde se agruparam as

cepas de roedores O. aff. moojeni, AN 717313, AN 717307 e AN 729965; II-CASV

que compreende as cepas dos casos humanos de SPH de Altamira-PA, H 695323,

H 712177 e H 700306; III-CASV correspondente ao protótipo do vírus Castelo dos

Sonhos, identificado no caso de SPH notificado em 1995 (GenBank: AF307324) no

distrito de Castelo dos Sonhos (JOHNSON et al., 1999) (Figura 21).

A divergência genética média no genótipo I-CASV foi de 4,4% (∆div =

6,2% a 3,2%), enquanto que no genótipo II-CASV foi de 1,06% (∆div = 0,7% a

1,4%). A distância genética do genótipo I-CASV para o II-CASV foi de 5,6% e para o

protótipo (III-CASV) foi de 7,6%. O genótipo II-CASV distancia-se geneticamente do

protótipo em 4,74%. A similaridade quanto à seqüência de aminoácidos em relação

às cepas de Castelo dos Sonhos foi 100% (Tabela 10), observando-se, na grande

maioria, mutações de pontos silenciosas ao longo do fragmento seqüenciado que se

restringe ou a um genótipo específico ou a todas as seqüências (400 nt) obtidas

nesse trabalho (Apêndice A).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Figura 21 – Análise filogenética das seqüências nucleotídicas parciais do segmento SRNA de cepas

de hantavírus procedentes dos estados do Mato Grosso e Pará, utilizando os métodos de

máxima verossimilhança e Bayesiano. Valores de bootstrap e bayesiano (dentro dos

parênteses) são mostrados para cada respectivo nó. As setas indicam a posição exata

dos valores. Os números dentro dos colchetes representam os valores de divergência

entre os grupos. A barra indica o valor de 30% na divergência de seqüências

nucleotídicas. Legenda: Alto Paraguay (APV), Anajatuba (ANAJV), Andes (ANDV) Andes

Bermejo (BMJV), Andes Neembuco (NEMV), Andes Lechiguanas (LECV), Andes Oran

(ORNV), Araraquara (ARAV), Bayou (BAYV), Black Creek Canal (BCCV), Cano Delgadito

(CANOV), Castelo dos Sonhos (CASV), Choclo (CHOV), El Moro Canyon (ELMCV),

Hantaan (HTNV), Juquitiba-Araucaria (JUQV), Laguna Negra (LNV), Limestone Canyon

(LSCV), Muleshoe (MULV), New York (NYV), Pergamino (PRNV), Puulmala (PUUV), Rio

Mamoré (RIOMV), Rio Mearim (RIMEV), Rio Segundo (RIOSV), Seoul (SEOV), Sin

Nombre (SNV) e Tula (TULV).

BMJV

NEMV

LECV

NDV

ORNV

NDV AH-1

JUQV

Itapua

RAV

PRNV

SNV

NYV

EMCV

RIOSV

LSCV

CANOV

CHOV

BAYV

BCCV

MULV

NAJV

RIOMV

RIMEV

HTNV

SEOV

TULV

PUUV

100 (1.0)

[28.2%]

100 (1.0)

96% (0.92)

91%

(0.89)

95%

(0.92)

97%

(0.93)

100%

(1.0)

[22.5%]

[15.7%]

[21.3%

[22.7%]

[22.0%]

[20.4%]

[18.3%]

[20.4%]

[23.7%]

[19.4%

[20.8%]

[21.1%]

[47.5%]

[ 6.3%]

[23.5%]

N 717313

N 717307

N 729965

N 711258

H 695323

H 712177

H 700306

CASV

[14%]

[22.3%]

98%

I-CAS

92%(0.9)

91%

(0.9)

[5,6%]

[7,6%]

II-CAS

97%

(0.9)

99%

(095)

100%

(1.0)

H 651686

LNV

H 650736

H 695325

H 713175

H 671696

H 712518

H 653486

H 682807

H 657848

H 660462

H 706738

H 695689

H 696558

H 711891

H 678213

H 710031

N 650228

N 650204

N 649993

I-LN

III-CAS

II-LN

III-LN

100% (1.0)

[ 6.8%]

[ 5.5%]

Subclades

I-a

I-b

I-c

II-a

II-b

0.3

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Tabela 10 – Homologia entre cepas de hantavírus identificadas de casos humanos de SPH procedentes do Estado do Pará, de amostras de Oligoryzomys

aff. moojeni capturados no Estado do Mato Grosso e de outros hantavírus relacionados a estes da América do Sul

695323

700306

712177

729965

717307

717313

711258

CASV ORNV LECV BMJV RIMEV RIOMV LNV ANAJV JUQV ARAV Itapua

H 695323 *** 99,3 98,8 95,6 94,8 93,8 97,3 94,6 80,4 82,8 81,1 75,5 77,7 78,9 77,7 81,9 79,9 81,4

H 700306 100 *** 98,5 95,3 94,1 94,1 97,3 95,3 80,6 82,6 80,9 74,8 77,0 78,2 77,0 81,6 79,2 80,6

H 712177 100 100 *** 94,9 93,6 93,8 96,6 94,9 80,9 83,1 81,4 75,7 77,5 78,7 78,2 81,1 78,9 80,6

AN 729965 100 100 100 *** 96,8 95,8 96,8 93,1 80,1 83,6 82,6 75,5 76,2 79,2 78,7 81,1 77,9 80,6

AN 717307 100 100 100 100 *** 97,5 94,3 91,4 81,2 84,0 82,2 75,6 78,3 79,8 79,0 81,7 79,8 81,5

AN 717313 100 100 100 100 100 *** 93,8 91,6 81,7 84,7 82,5 75,6 78,3 80,5 79,0 81,2 79,0 80,5

AN 711258 100 100 100 100 100 100 *** 93,6 80,1 83,8 81,9 74,3 76,5 78,9 77,5 80,4 77,9 79,9

CASV 100 100 100 100 100 100 100 *** 80,1 83,8 82,6 75,5 76,7 77,7 78,2 80,9 78,2 79,7

ORNV 97,8 97,8 97,8 97,8 97 97,8 97,1 97,8 *** 83,1 85,0 77,9 82,1 81,6 80,6 83,3 83,1 84,3

LECV 99,3 99,3 99,3 99,3 98,5 99,3 98,5 99,3 98,5 *** 90,0 77,2 81,1 83,1 80,1 81,4 79,7 81,4

BMJV 99,3 99,3 99,3 99,3 98,5 99,3 98,5 99,3 98,5 100 *** 77,0 77,9 82,4 79,9 82,4 80,6 83,1

RIMEV 91,9 91,9 91,9 91,9 91,1 91,9 91,2 91,9 93,4 92,6 92,6 *** 80,4 78,9 81,6 77,0 76,2 76,5

RIOMV 92,6 92,6 92,6 92,6 91,9 92,6 91,9 92,6 94,9 93,4 93,4 97,1 *** 82,8 82,1 77,9 81,4 78,2

LNV 93,4 93,4 93,4 93,4 92,6 93,3 92,6 93,4 95,6 94,1 94,1 94,9 97,8 *** 80,4 79,9 79,7 79,7

ANAJV 93,4 93,4 93,4 93,4 92,6 93,3 92,6 93,4 95,6 94,1 94,1 96,3 97,8 97,1 *** 80,9 79,2 77,9

JUQV 96,3 96,3 96,3 96,3 95,6 96,3 95,6 96,3 98,5 97,1 97,1 91,9 93,4 94,9 94,9 *** 81,1 93,4

ARAV 95,6 95,6 95,6 95,6 94,8 95,6 94,9 95,6 97,8 96,3 96,3 91,2 92,6 94,1 93,4 97,8 *** 82,1

Itapua 96,3 96,3 96,3 96,3 95,6 96,3 95,6 96,3 98,5 97,1 97,1 91,9 93,4 94,9 94,9 100 97,8 ***

Legenda: Anajatuba (ANAJ), Araraquara (ARAV), Bermejo (BMJV), Castelo dos Sonhos (CASV), Juquitiba-Araucaria (JUQV), Laguna Negra (LNV),

Lechiguanas (LECV), Rio Mamoré (RIOMV), Rio Mearim (RIMEV), Oran (ORNV).

Identidade das seqüências nucleotídicas

Identidade das seqüências aminoacídicas

Relação genética (nucleotídeos e aminoácidos) das cepas de hantavírus provenientes de Humanos (H) e Roedores (AN) com o vírus Castelo dos Sonhos

Genótipo I-CASV

Genótipo II-CASV

Genótipo III-CASV

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Todas as amostras humanas procedentes dos sete municípios

matogrossenses e os roedores C. aff. callosus capturados em Campo Novo do

Parecis em 2001 relacionaram-se entre si e com o vírus Laguna Negra (divergência

genética média de 4,8%), incluídos na subclade II-b. A espécie do vírus Laguna

Negra foi dividida em três genótipos: I-LNV onde estão agrupadas o protótipo do

vírus Laguna Negra (GenBank: AF005727), as amostras H 651686, H 650736, H

695325, H 713175, H 671696, H 712518, H 653486, H 682807, H 657848, H

660462, H 706738 e H 695689; II-LNV que compreende as amostras H 696558, H

711891, H 710031 e H 678213; e na III-LNV, agrupam-se as amostras dos roedores

C. aff. callosus - AN 650228, AN 650204 e AN 649993 (Figura 21). Entre as

amostras de roedores (III-LNV) e as amostras humanas se observa uma distância

genética de 5,5%, enquanto que entre os genótipos das amostras humanas, I-LNV e

II-LNV, a distância genética foi de 6,8%. Não se observou relação entre os genótipos

do vírus Laguna Negra com a evolução clínica – óbito ou cura – ano de notificação

dos casos e os municípios de procedências (Figura 22).

Figura 22 – Análise filogenética das seqüências nucleotídicas parciais do segmento SRNA de

cepas de hantavírus procedentes dos Municípios do Estado do Mato Grosso,

associando os genótipos do hantavírus LNV ao ano de notificação, local provável de

infecção e evolução clínica dos casos de SPH.

I-LNV

II-LNV

III-LNV

0.3

BMJV

NEMV

LECV

NDV

ORNV

NDV AH-1

JUQV

Itapua

RAV

PRMV

SNV

NYV

EMC

RIOSV

LSCV

CANOV

CHOV

BAYV

BCCV

MULV

NAJV

RIOMV

RIMEV

HTNV

SEOV

TULV

PUUV

100 (1.0) [28.2%]

100 (1.0)

96% (0.92)

91% (0.89)

95% (0.92)

97% (0.93)

100% (1.0)

[22.5%]

[15.7%]

[21.3%]

[22.7%]

[22.0%]

[20.4%]

[18.3%]

[20.4

[23.7%]

[19.4%]

[20.8%]

[21.1%]

[47.5%]

[ 6.3%]

[23.5%]

N 717313

N 717307

N 729965

N 711258

H 695323

H 712177

H 700306

CASV

LNV

[14%]

[22.3%]

98%

(1.0)

92%(0.9)

91%

(0.9)

[5,6%]

[7,6%]

97% (0.9)

99% (095)

100%

(1.0)

H 651686 / 2002 / Tangará da Serra / Cura

LNV

H 650736 / 2001 / Campo Novo do Parecis / Óbito

H 695325 / 2005 / Santo Afonso / Cura

H 713175 / 2006 / São José do Rio Claro / Cura

H 671696 / 2003 / Campo Novo do Parecis / Óbito

H 712518 / 2006 / Diamantino / Cura

H 653486 / 2002 / Nova Olímpia / Cura

H 682807 / 2004 / Campo Novo do Parecis / Óbito

H 657848 / 2002 / Diamantino / Cura

H 660462 / 2002 / Campo Novo do Parecis / Cura

H 706738 / 2006 / Diamantino / Cura

H 695689 / 2005 / Campo Novo do Parecis / Cura

H 696558 / 2005 / Campo Novo do Parecis / Cura

H 711891 / 2006 / Campo Novo do Parecis / Óbito

H 678213 / 2005 / Barra do Bu

res / Cura

H 710031 / 2006 / Tangará da Serra / Óbito

N 650228

N 650204

N 649993

100% (1.0)

[ 6.8%]

[ 5.5%]

Amostra / ano / município / evolução clínica

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Os dados de homologia mostram que não há diferença entre as

seqüências parciais de aminoácidos das amostras humanas e de roedores com o

vírus Laguna Negra (homologia de 100%). A homologia das seqüências

nucleotídicas entre vírus Laguna Negra com os genótipos I-LNV, II-LNV e III-LNV

foram de 93,4%, 89,9% e 91,1%, respectivamente (Tabela 11).

Observou-se que a maioria das alterações nucleotídicas ocorridas foram

mutações de ponto silenciosas nas seqüências nucleotídicas (Apêndice B) que

refletiram na divergência genética entre os genótipos do vírus Laguna Negra (∆div =

0,2% a 9,8%). As médias das distâncias genéticas nos genótipos I-LNV, II-LNV e III-

LNV foram de 4,9% (∆div = 0,6% a 9,1%), 1,7% (∆div = 0,2% a 3,4%) e 2% (∆div =

1,6% a 2,5%), respectivamente. O genótipo I-LNV distancia-se geneticamente do

genótipo II-LNV em 6,8% e do III-LNV em 7,5%. A distância genética entre os

genótipos II-LNV e III-LNV foi de 5,5%.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Tabela 11– Homologia entre cepas de hantavírus procedentes do Estado do Mato Grosso e outros hantavírus relacionados a estes da América do Sul

H 651686 H 650736 H 695325 H 713175 H 712518 H 671696 H 653486 H 682807 H 657848 H 660462 H 706738 H 695689 H 696558 H 711891 H 678213 H 710031 AN 649993 AN 650204 AN 650228 LNV APV RIMEV RIOM ANAJV CASV JUQV ARAV

H 651686 *** 98,1 96,8 95,1 95 94,1 95,6 95 95,7 93,5 94,6 92,9 91,6 91,6 92,1 90,1 92,4 93,4 92,8 96,8 71,1 72,7 76,9 72,7 75 72,7 77,2

H 650736 100 *** 96,9 95,3 95,6 94,7 95,9 95,6 94,9 92,8 93,8 92,4 91,3 91,3 91,8 89,7 92,1 92,8 92,1 96,5 70,5 72,5 76,1 73,2 75,2 72,9 77,2

H 695325 100 100 *** 97,1 95,2 94,6 96 95,7 95,9 93,8 94,9 92,7 91,6 91,6 92,1 90 94,3 95,2 94,4 94,1 71,3 71,8 76,3 72,5 74,8 73 76,7

H 713175 100 100 100 *** 96,6 95,7 97,2 96,9 97,1 95,9 97,8 94,7 94,6 94,6 94 92,1 92,2 93,1 92,4 92,8 70,7 73,3 75,6 75 74,5 72,6 78,4

H 712518 100 100 100 100 *** 98,5 99,1 98,5 98,7 96,8 97,8 96,3 95,3 95,3 95,7 93,7 91,8 91,8 91,8 93,8 70,8 73 76,3 77,4 75,5 73 78,2

H 671696 100 100 100 100 100 *** 98,5 97,9 97,8 95,7 96,8 95,3 94,4 94,4 94,9 92,8 90,9 90,9 90,9 93,1 71,3 73,3 76,4 77,1 75,2 72,1 77,2

H 653486 100 100 100 100 100 100 *** 99,4 99 96,9 97,9 96,3 95,3 95,3 95,7 93,7 91,8 91,8 91,9 93,5 71 73,5 76,4 76,9 75,5 73,3 77,2

H 682807 100 100 100 100 100 100 100 *** 98,4 96,3 97,4 95,7 94,7 94,7 95,2 93,1 91,2 91,2 91,3 93,4 70,8 73,3 76 76,8 75,7 73 77,5

H 657848 100 100 100 100 100 100 100 100 *** 97,8 98,8 96,6 95,6 95,6 96 94 91,9 92,2 92,1 92,8 70,7 73 75,9 77,1 75,2 72,6 77,7

H 660462 100 100 100 100 100 100 100 100 100 *** 98,1 95,4 94,9 94,9 95,2 96,2 90,7 91 90,9 90,9 70,4 72,2 75,9 79,2 76 73,2 78,2

H 706738 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 *** 96,6 96,8 96,8 96,2 94,3 91,9 92,2 92,1 91,9 70,5 72,7 76 77,2 75 72,6 77,5

H 695689 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 *** 96,2 96,2 96,8 95,3 93,7 95,3 94,6 90,9 71,3 72,5 76,4 78 75 73,6 77,5

H 696558 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 *** 100 99 96,8 94,4 92,5 92,5 90,2 71,1 73,5 76,7 78,3 76,2 73,2 77,7

H 711891 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 *** 99 96,8 94,4 92,5 92,5 90,2 71,1 73,5 76,7 78,3 76,2 73,2 77,7

H 678213 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 *** 96,6 94,6 93,1 93,1 90,6 71,1 73 76,6 78,1 75,5 73,3 77,5

H 710031 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 *** 94,6 92,6 92,6 88,7 71,3 72,9 77 81 76,5 74,2 79,4

AN 649993 99,6 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 *** 97,5 98,1 90,9 71,9 71,3 77,3 74,8 75,5 74,2 78,2

AN 650204 99,6 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 *** 98,4 91,6 72,3 71,5 77,5 75 74,3 74,4 77,2

AN 650228 99,6 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 *** 90,7 72,5 71,3 78,6 75 74 74,6 77

LNV 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 *** 72,3 72,7 77,9 74,4 75,5 75,3 77,7

APV 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,7 96,3 96,3 96,3 96,7 *** 76,6 76,6 79 76 72,6 76,2

RIMEV 94,8 94,8 94,8 94,8 94,8 94,8 94,8 94,8 94,8 94,8 94,8 94,8 94,8 94,8 94,8 94,8 94,2 94,2 94,2 94,8 96,2 *** 76,8 78,9 72,8 70 72,8

RIOMV 97,7 97,7 97,7 97,7 97,7 97,7 97,7 97,7 97,7 97,7 97,7 97,7 97,7 97,7 97,7 97,7 97,1 97,1 97,1 97,7 99,1 97,3 *** 81 74,3 73,2 79,9

ANAJV 96,2 96,2 96,2 96,2 96,2 96,2 96,2 96,2 96,2 96,2 96,2 96,2 96,2 96,2 96,2 96,2 96 96 96 96,2 96,7 95 93,8 *** 76,2 75,7 77,2

CASV 91,5 91,5 91,5 91,5 91,5 91,5 91,5 91,5 91,5 91,5 91,5 91,5 91,5 91,5 91,5 91,5 91 91 91 91,5 89,7 56,6 56 57,5 *** 79,4 77

JUQV 92 92 92 92 92 92 92 92 92 92 92 92 92 92 92 92 91,5 91,5 91,5 92 90,6 86,4 86,7 89,1 96,3 *** 79,2

ARAV 90,6 90,6 90,6 90,6 90,6 90,6 90,6 90,6 90,6 90,6 90,6 90,6 90,6 90,6 90,6 90,6 90 90 90 90,6 90,6 56,1 56 57,5 95,6 93,9 ***

Identidade das seqüências nucleotídicas

Identidade das seqüências aminoacídicas

Relação genética (nucleotídeos e aminoácidos) das cepas de hantavírus provenientes de Humanos (H) e Roedores (AN) com o vírus Laguna Negra

Legenda: Alto Paraguay (APV), Araquara (ARAV), Anajatuba (ANAJ), Castelo dos Sonhos (CASV), Juquitiba-Araucaria (JUQV), Laguna Negra (LNV), Rio

Mamoré (RIOMV), Rio Mearim (RIMEV).

Genótipo I-LNV

Genótipo II-LNV

Genótipo III-LNV

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

5.3 FILOGENIA: ASSOCIAÇÃO GEOGRÁFICA E COM

ROEDORES HOSPEDEIROS

Com relação aos hantavírus do Novo Mundo, observou-se uma

associação entre a divisão filogenética de clades e/ou subclades e a distribuição

geográfica dos hantavírus, bem como a correlação entre distribuição geográfica dos

roedores silvestres com os seus respectivos hantavírus.

A clade I compreende os hantavírus encontrados no extremo sul da

América do Sul (subclade I-a) e nas Américas do Norte e Central (subclade I-b e I-c).

Na subclade I-a se agrupam os hantavírus encontrados no Cone Sul (Chile,

Paraguai, Argentina e Sul do Brasil), com a exceção do vírus Castelo dos Sonhos,

que foi identificado originalmente na região Amazônica brasileira. Notou-se que os

hantavírus relacionados diretamente ao vírus Andes (vírus Andinos-relacionados) –

Bermejo, Neembuco, Lechiguanas, Andes, Oran, Andes cepa AH-1, Castelo dos

Sonhos, Juquitiba e Itapuã -, apresentam como reservatórios os roedores do gênero

Oligoryzomys, muito embora o vírus Itapuã também tenha sido detectado em

roedores da espécie Akodon montensis (CHU et al., 2006). Num braço associado

aos vírus andino-relacionados estão os vírus Araraquara, cujo reservatório é o N.

lasiurus, e o Pergamino, associado ao Akodon azarae (Figura 23).

Na subclade I-b agrupam-se os hantavírus Sin Nombre, New York e

Limestone Canyon, tendo como reservatórios os roedores Peromyscus sp.; os vírus

Rio Segundo e El Moro Canyon, são relacionados aos roedores Reithrodontomys

sp.; e os vírus Choclo e Caño Delgadito, cujos reservatórios são, respectivamente,

os roedores O. fulvescens e Sigmodon alstoni. Dentre esses vírus, o único que foi

identificado fora das Américas Central e Norte é o vírus Caño Delgadito (Venezuela),

no entanto seu roedor-hospedeiro é do mesmo gênero que os dos vírus Muleshoe e

Black Creek Canal (Sigmodon hispidus), que é uma espécie altamente disseminada

na costa atlântica das Américas do Norte e Central. Os vírus Muleshoe e Black

Creek Canal, juntamente com vírus Bayou que é relacionado ao roedor Oryzomys

palustris, formam a subclade I-c (Figura 23).

A clade II compreende os hantavírus encontrados na região Amazônica e

pré-Amazônica, e se encontra subdividida nas subclades II-a e II-b. A subclade II-a é

restrita apenas ao vírus Anajatuba e as cepas a ele relacionadas, sendo associados

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

ao hospedeiro O. aff. fornesi. Os hantavírus da clade II-b são: os vírus Rio Mamoré

cujo reservatório é o O. microtis; o Rio Mearim e o Alto Paraguai, associados aos

roedores do gênero Holochilus; e os vírus relacionados ao vírus Laguna Negra,

sendo: o protótipo proveniente do Paraguai, identificado em C. laucha, e as cepas

encontradas no Estado do Mato Grosso associadas ao C. aff. callosus (Figura 23).

Quanto à relação hantavírus “versus” biomas brasileiros, o único

hantavírus identificado no bioma amazônico é o vírus Castelo dos Sonhos,

associado com casos humanos no Estado do Pará, muito embora as cepas desse

vírus tenham sido identificadas a partir de O. aff. moojeni, e sejam procedentes da

região pré-Amazônica, na qual se observa áreas de floresta e vegetação típica do

Cerrado. Nas regiões pré-Amazônica e Cerrado são encontrados os hantavírus da

clade II, onde o hantavírus Anajatuba, único representante da subclade II-a, é

encontrado somente no micro-ecossistema da Baixada Maranhense, enquanto o

hantavírus Laguna Negra foi encontrado, até o presente momento, no Estado do

Mato Grosso. Nos biomas de Cerrado e da Mata Atlântica, são encontrados os

hantavírus da subclade I-a, representados pelos vírus Araraquara e Juquitiba. O

primeiro associado com N. lasiurus e o segundo com O. nigripes (Figura 24).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Figura 23 – Mapa da distribuição geográfica dos grupos e subgrupos de hantavírus e correlação com os roedores hospedeiros sigmondontineos no

continente Americano.

91% (0.89)

100 (1,0)

BMJV

NEMV

LECV

NDV

ORNV

NDV AH-1

JUQV

Itapua

RAV

PRNV

SNV

NYV

EMCV

RIOSV

LSCV

CANOV

CHOV

BAYV

BCCV

MULV

RIOMV

RIMEV

HTNV

SEOV

TULV

PUUV

100 (1.0) [28.2%]

100 (1.0)

96% (0.92)

95% (0.92)

97% (0.93)

100% (1.0)

0.3

[22.5%]

[15.7%]

[21.3%]

[22.7%]

[22.0%]

[20.4%]

[18.3%]

[20.4%]

[23.7%]

[19.4%]

[20.8%]

[21.1%]

[ 6.3%]

[23.5%]

AN 711258

H 700306

CASV

[14%]

98%

[22.3%]

[7,5%]

92% (0,9)

H 650736

LNV

H 651686

AN 650204

H 653486

H 657848

H 713175

H 711891

H 710031

100% (1.0)

90% (092)

90% (0,86)

NAJV

H 672862

H 666379

N 690936

100 (1.0)

I-a

I-b

I-c

II-a

II-b

Murinae

Arvicolinae

Novo Mundo

Hantavirus

(Cricetidae)

Subclade

Clade Cluster

Oligoryzomys sp.

Necromys lasiurus

Akodon azarae

Peromyscus sp.

Reithrodontomys sp.

O. fulvescens

Sigmodon sp.

Oryzomys palustris

Oligoryzomys sp.

Holochilus sp.

Calomys sp.

Velho Mundo

Hantavirus

(Muridae)

Continente Americano

CLADE I

Subclade I

I-a

CLADE II

Subclade II

II-a and II-b

CLADE I

Subclade I

I-b and I-c

Cone Sul

Norte da América do Sul

Américas do Norte e Central

Áreas sem ocorrência de SPH

Legenda

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Resultados

Figura 24 – Mapa do Brasil, mostrando os biomas com respectivos hantavírus associados a seus

roedores hospedeiros.

Vírus Anajatuba

Oligoryzomys aff. fornesi

Vírus Castelo dos Sonhos

Vírus Araraquara

Necromys lasiurus

Vírus Juquitiba

Oligoryzomys

Vírus Rio Mearim

Holochilus sciureus

Subclade I-a

Subclade II-a

Subclade II-b

Subclade I-a

Vírus Anajatuba

Oligoryzomys aff. fornesi

Oligoryzomys aff. moojeni

Vírus Laguna Negra

Vírus

Necromys lasiurus

Vírus Juquitiba

Oligoryzomys nigripes

sciureus

Subclade I-a

Subclade II-a

Subclade II-b

Subclade I-a

Calomys aff. callosus

Vírus Anajatuba

Oligoryzomys aff. fornesi

Vírus Castelo dos Sonhos

Vírus Araraquara

Necromys lasiurus

Vírus Juquitiba

Oligoryzomys

Vírus Rio Mearim

Holochilus sciureus

Subclade I-a

Subclade II-a

Subclade II-b

Subclade I-a

Vírus Anajatuba

Oligoryzomys aff. fornesi

Oligoryzomys aff. moojeni

Vírus Laguna Negra

Vírus

Necromys lasiurus

Vírus Juquitiba

Oligoryzomys nigripes

sciureus

Subclade I-a

Subclade II-a

Subclade II-b

Subclade I-a

Calomys aff. callosus

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

6 DISCUSSÃO

Neste estudo se obteve informações novas e de suma importância para a

vigilância epidemiológica da SPH na Amazônia brasileira e áreas adjacentes. Dada a

grande complexidade da biodiversidade amazônica, aliada ao extenso espaço

territorial e as grandes distâncias de difícil acesso, a identificação tanto dos

hantavírus responsáveis pelos casos de SPH na região quanto ao roedor-

reservatório, bem como os seus hábitos e distribuição geográfica se tornam

ferramentas fundamentais para o controle e prevenção da SPH na região. Para isso,

é estritamente necessária a união de vários setores ligados direta ou indiretamente à

saúde pública, que se estende desde a formação de profissionais de saúde aptos a

identificar um caso suspeito de SPH e tratar a doença, uma efetiva vigilância

epidemiológica e estudos ecoepidemiológicos até o apoio laboratorial eficiente,

responsável tanto pela parte de diagnóstico quanto nas pesquisas direcionadas para

a caracterização dos hantavírus e para os estudos de identificação dos roedores.

A pesquisa visou à detecção do genoma e caracterização genética em

amostras provenientes da vigilância de hantaviroses na região, bem como de

estudos ecoepidemiológicos em roedores com participação ativa do IEC em distintos

ecossistemas da Amazônia brasileira, correspondendo ao Estado do Maranhão

constituído de campos alagados e sul da região Amazônica, compreendendo o sul

do Pará e Estado do Mato Grosso em que predominam a floresta típica amazônica e

cerrado.

6.1 ECOSSISTEMA DO MARANHÃO

O primeiro passo para a caracterização de hantavírus associado a

estudos ecoepidemiológicos na Amazônia brasileira se deu com o trabalho Newly

Recognized hantaviruses associated with hantavirus pulmonary syndrome in

northern brazil: partial genetic characterization of viruses and serologic implication

of likely reservoirs publicado na Vector-Borne and Zoonotic Diseases em 2005

(Anexo C), após a ocorrência do primeiro surto de hantavirose no Município de

Anajatuba, Estado do Maranhão (MENDES et al., 2001). Nesse trabalho, estudos

moleculares realizados em amostras biológicas de roedores silvestres capturados

nos arredores de Anajatuba, permitiram a identificação filogenética de dois novos

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

hantavírus os vírus Anajatuba e Rio Mearim, tendo como perspectiva futura a

pesquisa sobre a associação destes vírus identificados com os casos humanos

(TRAVASSOS DA ROSA et al., 2005), cuja confirmação foi possível com o

desenvolvimento desta tese.

No período entre 2003 e 2006, tem-se observado casos esporádicos de

SPH, intercalados por um período silencioso de dois anos. Tais casos procederam

dos municípios de Anajatuba – povoados de Fomento, São Roque e Roncador – e

de Santa Rita – povoado de Conceição – (Tabela 3).

No Município de Anajatuba, além dos povoados com casos de SPH

confirmados, o inquérito sorológico em humanos realizado em 2005 mostrou

imunidade na população local sugerindo a circulação de hantavírus autóctones e

ocorrência silenciosa dessa virose nos povoados de Areal, Bacabal, Pastoradouro,

Olho D’água e na zona urbana, através da detecção de anticorpos IgG em

moradores da região. No entanto, a presença de roedores sinantrópicos nos estudos

de campo nesses povoados faz com que não se exclua a possibilidade desses

anticorpos anti-hantavírus encontrados nas populações humanas poderem ser

também em decorrência da possível circulação do vírus Seoul nessa região, pois em

estudos realizados ainda na década de 1980 na região norte do Brasil, já se obteve

essa comprovação com a detecção de anticorpos em ratos e isolamento de um vírus

antigenicamente relacionado ao vírus Seoul (LEDUC et al., 1985; LEDUC et al.,

1986). A análise estatística demonstrou que não há diferenças quanto à exposição

de hantavírus nas populações residentes na área urbana ou rural, bem como entre

os povoados, mas houve diferença estatística quanto ao risco de se infectar por

hantavírus de acordo com o sexo e de sazonalidade.

De fato entre a população estudada que apresentou anticorpos IgG para

hantavírus, a média de idade observada, tanto para o sexo masculino como para o

feminino, está compreendida na faixa etária de 41 a 64 anos, corroborando com os

dados do estudo de MENDES et al. (2004). No entanto, a maior prevalência foi

observada em indivíduos do sexo masculino, havendo inclusive diferença

estatisticamente significante, conforme com relatos de outras regiões do país

(ELKHOURY et al., 2005). Tal fato pode ser explicado pela maior exposição de

indivíduos do sexo masculino aos fatores de risco em virtude das atividades

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

ocupacionais, tais como, trabalho na lavoura e atividades de pesca, como descrito

por MENDES et al. (2004). Ademais, também se pôde comprovar pela observação

dos casos registrados no Município que a maioria procede do sexo masculino

(MENDES et al., 2001). Quanto à sazonalidade, 80% dos casos ocorreram no

primeiro semestre, período que coincide com o manuseio e colheita do arroz e com

a estação chuvosa (MENDES et al., 2001) (Figura 25).

Figura 25 – Atividades de risco comumente praticadas em Anajatuba.

Apesar da taxa de letalidade dos casos notificados no Maranhão ser de

55,5% (MS/SVS, 2007), a elevada soroprevalência de anticorpos IgG na população

do Município de Anajatuba, descrita tanto neste trabalho quanto na literatura

(MENDES et al., 2001), sugere a ocorrência de casos assintomáticos e/ou

oligoassintomático, que aliado a uma provável subnotificação de casos menos

graves de SPH, pode indicar que essa letalidade seja bem menor que o percentual

atualmente encontrado. Novamente deve-se ressaltar a possibilidade de ocorrência

do vírus Seoul ou algum hantavírus a esse relacionado sem, no entanto, ter

associação com SPH (LEDUC et al., 1985; LEDUC et al., 1986).

No estudo ecoepidemiológico realizado em setembro de 2000, em

Anajatuba, nos povoados de Quebra e São Jerônimo, 104 roedores silvestres das

espécies N. lasiurus, O. fornesi, Proechimys guyannensis e H. sciureus, foram

capturados e a análise sorológica realizada detectou a presença de anticorpos anti-

hantavírus nas espécies O. fornesi, H. sciureus e N. lasiurus em ordem decrescente

de positividade (TRAVASSOS DA ROSA et al., 2005). Nos estudos realizados nos

anos de 2003 e 2005 no povoado de São Roque, os roedores com maior percentual

de captura foram das espécies N. lasiurus, Oligoryzomys sp. e Proechimys sp., dos

a) trabalho nos campos de arroz b) pesca nos campos alagados c) armazenamento de arroz

dentro do domicílio

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

quais N. lasiurus, Oligoryzomys aff. fornesi apresentaram anticorpos anti-hantavírus,

como anteriormente observado em 2000.

A ausência do roedor da espécie H. sciureus, conhecido popularmente

como rato d’água, nas capturas de 2003 e 2005 pode ser decorrente de três

hipóteses: (i) a mudança do sítio de captura, de Quebra e São Jerônimo para São

Roque; (ii) mudança do período de captura, de setembro (estação de seca) para

maio (estação chuvosa), que pode ter dificultado sua captura, pois no período de

seca a região dos alagados apresenta uma extensão menor, concentrando esses

animais, enquanto que no período de chuva há uma expansão da área alagada,

dispersando-os; e (iii) o pico populacional dessa espécie de roedor no decorrer do

ano pode ser variável.

A presença do roedor da espécie N. lasiurus – nome popular: rato do

capim – e seu elevado percentual de captura nos três estudos ecoepidemiológicos

realizados em Anajatuba, pode ser explicado por sua rápida multiplicação, com o

número de um a onze crias por gestação – média de quatro – sua reprodução

ocorrida durante todo o ano principalmente nos meses de abril a junho (FUNASA,

2002) e a oferta de alimentos em abundância, decorrente das plantações de arroz,

milho e outros grãos.

As espécies do gênero Oligoryzomys são conhecidas, de modo geral,

como rato do mato, sendo também encontradas em plantio de grãos (FUNASA,

2002). Muito embora, tenham sido capturadas nos três estudos ecoepidemiológicos,

com percentual baixo de captura, observou-se, tanto em 2000 (TRAVASSOS DA

ROSA et al., 2005) como em 2005, o maior percentual de positividade para

anticorpos anti-hantavírus nesta espécie dentre as capturadas, sendo sugerida como

a possível responsável pela transmissão de hantavírus aos seres humanos e

vinculadas ao vírus Anajatuba (TRAVASSOS DA ROSA et al., 2005).

É importante ressaltar que as mudanças climáticas (ANYAMBA et al.,

2006), bem como a ação antrópica – desmatamento, plantações em larga escala,

formação dos povoados, etc. – interferem na densidade populacional dos roedores

(PARMENTER e VIGIL, 1993) e conseqüentemente na transmissão de hantavírus. O

desequilíbrio ecológico já foi anteriormente associado à ocorrência de casos de SPH

nos Estados Unidos (NICHOL et al., 1993) e em outras regiões do Brasil

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

(IVERSSON et al., 1994; PEREIRA et al., 1998). Esses fatos corroboram nossos

achados, já que alterações no habitat de Anajatuba são comuns, de modo que é

possível que resultem em mudanças na dinâmica populacional dentre as espécies

de roedores como sugerido por MURÚA et al. (2003a, 2003b) e, conseqüentemente,

se tais alterações forem favoráveis ocorrerá o aumento da positividade de roedores

e da exposição humana aos hantavírus, respectivamente. De fato, segundo relatos

da população, os primeiros casos de SPH ocorridos em Quebra e São Jerônimo

surgiram após desmatamento em áreas de mata próximas às residências dos

pacientes.

Segundo TRAVASSOS DA ROSA et al. (2005), os genomas de dois

hantavírus foram detectados em amostras de O. fornesi e H. sciureus,

responsabilizando esses roedores, respectivamente, como possíveis reservatórios

naturais de dois novos hantavírus, o vírus Anajatuba e o vírus Rio Mearim, ambos

geneticamente próximos aos vírus Rio Mamoré e Laguna Negra. Neste estudo

observou-se que, apesar do vírus Anajatuba apresentar como hospedeiros roedores

do mesmo gênero que o vírus Rio Mamoré e topologia aproximada, a análise

filogenética mostrou que, este constitui um subgrupo monofilético (subclade II-a) e,

por conseguinte, uma espécie viral distinta, cujo ancestral é diferente do que deu

origem aos vírus Rio Mamoré, Rio Mearim, Alto Paraguai e Laguna Negra (subclade

II-b) (Figura 20).

Ademais, esses mesmos autores, com base em achados anteriores em

outros países e no sul e sudeste do Brasil, sugeriram que, possivelmente, os casos

humanos de SPH no Maranhão seriam causados pelo vírus Anajatuba, justamente o

que tem como reservatório o roedor O. fornesi, já que esses animais, ao contrário do

rato d’água (H. sciureus), vivem muito próximos às residências de humanos ou às

plantações de grãos (TRAVASSOS DA ROSA et al., 2005). De fato, a análise

genética das seqüências nucleotídicas parciais amplificadas a partir de casos

humanos de SPH e de roedores silvestres analisadas neste trabalho mostrou

elevada homologia entre si e com o vírus Anajatuba (Tabela 6), confirmando que

esse vírus é o responsável etiológico pelos casos de SPH dos municípios de

Anajatuba e Santa Rita, e também que os roedores geneticamente relacionados O.

fornesi (nesse trabalho designado como Oligoryzomys aff. fornesi) são os

reservatórios e transmissores desse hantavírus para os seres humanos, confirmando

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

a hipótese de TRAVASSOS DA ROSA et al. (2005). Embora os moradores desse

Município tenham o hábito de pesca, habitat natural do H. sciureus, até o presente

momento o vírus Rio Mearim não apresentou associação com casos humanos.

Muito embora o vírus Anajatuba tenha sido detectado em um roedor da

espécie N. lasiurus, sugere-se que esse seja apenas um hospedeiro acidental, o que

pode ser explicado pelo fenômeno de spillover descrito para outros hantavírus

(JOHNSON et al.,1999, WEIDMANN et al., 2005), em decorrência da alta densidade

populacional de uma determinada espécie de roedor não-reservatório (no caso N.

lasiurus), aumentando a probabilidade de encontros interespecíficos, no qual a

infecção de uma espécie secundária pode ocorrer, como anteriormente descrito por

MILLS et al. (1997). De fato, conforme descrito por TRAVASSOS DA ROSA et al.

(2005) as capturas realizadas no Município revelaram uma alta densidade do N.

lasiurus, porém com percentual de anticorpos IgG anti-hantavírus para esta espécie

muito baixo (Tabela 5).

Provavelmente, o desmatamento no Município de Anajatuba, alterou o

habitat natural dos roedores do gênero Oligoryzomys, deslocando-os para os locais

de plantio, forçando-os a coabitar o mesmo habitat que a espécie N. lasiurus,

propiciando a infecção ocasional destes últimos pelo vírus Anajatuba. Sendo assim,

é importante ressaltar que o número de casos de SPH pode aumentar no Município

de Anajatuba e em municípios vizinhos no momento que houver um aumento

significativo da população de Oligoryzomys, ou o vírus Anajatuba conseguir romper

a barreira interespécies e se adaptar melhor aos roedores da espécie N. lasiurus,

tido como principal transmissor do hantavírus Araraquara no sudeste do Brasil

(SUZUKI et al., 2004).

6.2 ECOSSISTEMA PARÁ – MATO GROSSO

No Estado do Pará, sede do primeiro caso de SPH da Amazônia brasileira

no ano de 1995 (JOHNSON et al., 1999), 34 casos já foram notificados até setembro

de 2007, todos provenientes dos municípios de Altamira e Novo Progresso

(MS/SVS, 2007). A detecção genômica e caracterização genética de três amostras

humanas provenientes de casos confirmados de SPH em Altamira, nos anos de

2005 e 2006 (Tabela 7) realizadas neste trabalho são relevantes. E mostrou que o

vírus Castelo dos Sonhos é o hantavírus responsável por esses casos no estado,

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

confirmando, além disso, que esse hantavírus continua circulando na região. No

entanto, dentre os roedores IgG positivos do gênero Oxymycterus amazonicus

capturados na área durante o estudo ecoepidemiológico de 2005, não foi possível

identificá-los como reservatório desse vírus.

A circulação de hantavírus no Estado do Mato Grosso foi detectada pela

primeira vez em 1999, nos municípios Campo Novo do Parecis e Peixoto de

Azevedo. Deste período até setembro de 2007 foram notificados 109 casos

provenientes dos municípios de Alta Floresta, Barra do Bugres, Brás Norte, Campo

Novo do Parecis, Diamantino, Denise, Guarantã do Norte, Jaciara, Matupá, Nova

Marilândia, Nova Maringá, Nova Olímpia, Peixoto de Azevedo, Sapezal, Santo

Afonso, São José do Rio Claro, Tangará da Serra, Terra Nova do Norte e União do

Sul (MS/SVS, 2007). Esses dados sugerem que a SPH é amplamente distribuída no

Estado de Mato Grosso, observando-se duas microrregiões como foco: uma

delimitada pela área de influência da rodovia federal Cuiabá-Santarém (BR-163),

situada no norte do estado e outra localizada na área de influência da rodovia BR-364,

envolvendo a região meio-norte e sudoeste do estado. É importante ressaltar o

maior índice de ocorrência de SPH nos municípios de Campo Novo do Parecis e

Tangará da Serra, localizados às margens da Rodovia BR-364 que é uma região

com intensa produção de grãos, o que resulta em maior oferta de alimentos para os

roedores favorecendo o contato desses animais com os humanos e aumentando o

risco de transmissão de hantavírus (MS/SVS 2007).

Neste trabalho foram usadas amostras de casos humanos procedentes

dos municípios de Barra do Bugres, Campo Novo do Parecis, Diamantino, Nova

Olímpia, Santo Afonso, São José do Rio Claro e Tangará da Serra para identificação

do hantavírus responsável pela SPH na área de influência da rodovia BR-364.

Apesar do baixo número amostral (n=19) selecionado aleatoriamente, os dados

refletem, muito bem, a maior prevalência da SPH no sexo masculino da faixa etária

economicamente produtiva, assim como foi visto no Estado do Maranhão e no

restante do país (ELKHOURY et al., 2005). O seqüenciamento parcial do gene N, S-

RNA, mostrou elevada homologia nucleotídica e aminoacídica dessas amostras com

o vírus Laguna Negra sugerindo que esse hantavírus é o responsável pelos casos

humanos (Tabela 11).

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

Por outro lado, os roedores IgG positivos capturados em Campo Novo do

Parecis e Tangará da Serra, das espécies C. aff. callosus e O. aff. moojeni, em cujas

amostras detectou-se o genoma de hantavírus e quando seqüenciados se pôde

mostrar associação desses com os vírus Laguna Negra e Castelo dos Sonhos,

respectivamente. Na captura de roedores de 2001, pode-se evidenciar que o gênero

Calomys apresenta a maior abundância em relação às demais espécies encontradas

na região, e também que é a espécie C. aff. callosus a única que apresenta

positividade. Portanto, quando se avalia a ecoepidemiologia desse roedor

juntamente com os dados genéticos das amostras humanas, concluí-se que os

roedores da espécie C. aff. callosus são os responsáveis pela transmissão do vírus

Laguna Negra à população local e, muito provavelmente, aos demais municípios da

área de influência da BR-364, tendo em vista que na vasta área dessa região onde

observa-se o mesmo tipo de vegetação e clima, bem como atividades econômicas

voltadas para agricultura de grãos é justamente onde esses roedores estão

distribuídos (Figura 26).

Figura 26 – Distribuição geográfica do Calomys no Estado do Mato Grosso do Sul (em

azul) e no Estado do Mato Grosso (em cinza), em áreas onde se observa

a vegetação típica de Cerrado e do Pantanal. Fonte: BONVICINO,

OLIVEIRA e D’ANDREA, dados não publicados. Foto do Calomys callosus

http://www.fiocruz.br/chagas/cgi/cgilua.exe/sys/start.htm?sid=117.

Calomys callosus

Calomys aff. callosus

Calomys callosus

Calomys aff. callosus

Calomys callosusCalomys callosus

Calomys aff. callosus

Calomys callosus

Calomys aff. callosus

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

Esta tese demonstra que tanto a amostra do vírus Laguna Negra obtida

de C. aff. callosus quanto o protótipo que ocorre no Paraguai e norte da Argentina

(JOHNSON et al., 1997) apresentam uma divergência genética média de 4,8%,

sugerindo se tratar da mesma espécie viral. Muito embora o vírus Laguna Negra

tenha sido associado com os roedores da espécie Calomys laucha no Paraguai

(JOHNSON et al., 1997), estudos posteriores referem à identificação de um vírus

Laguna Negra like associado ao C. callosus na Argentina e que é também

relacionado a casos humanos na Bolívia (LEVIS et al., 1998; LEVIS et al., 2004;

CARROLL et al., 2005).

A observação de uma mesma espécie de hantavírus infectando várias

espécies de um único gênero de roedores pode ser constatada nos estudos com o

vírus Sin Nombre, associado aos roedores Peromyscus maniculatus. Esses estudos

demonstraram altas taxas de anticorpos reativos para o Sin Nombre nas espécies

Peromyscus boylii, Peromyscus truei e Peromyscus leucopus, assim como o vírus

Seoul, que é encontrado infectando diferentes espécies de roedores dentro de um

mesmo gênero, que podem ser explicadas pelo fenômeno de spillover (MILLS et al.,

1997; LEE, 1988).

A análise filogenética dos casos humanos e de roedores C. aff. callosus

procedentes do Estado do Mato Grosso estudados nesta tese mostrou que as cepas

do vírus Laguna Negra foram divididas em três genótipos: um (I-LNV) mais

relacionado ao protótipo e que incluiu a maioria das amostras seqüenciadas, outro

(II-LNV) agrupando quatro amostras humanas matogrossenses, e o terceiro genótipo

(III-LNV) compreendendo as amostras dos roedores C. aff. callosus. Em relação aos

casos humanos, não foi observada uma associação entre os diferentes genótipos,

ao período do ano, distribuição geográfica e evolução clínica da doença (Figura 22).

De fato, no período de 2001 a 2006 foram encontrados ambos os

genótipos relacionados aos casos humanos, I-LNV e II-LNV. A árvore filogenética

sugere um ancestral comum para esses genótipos e que os mesmos estejam

evoluindo paralelamente (Figura 21). Quando se realizou a análise da geografia da

área de influência da BR-364, verificou-se que os dois genótipos estão circulando

nos municípios da região. Este fato pode ser explicado pela ausência de barreiras

geográficas capazes de delimitar reprodutivamente as populações de C. aff. callosus

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

e, conseqüentemente, isolar um determinado genótipo do vírus Laguna Negra

restringindo-o a uma área específica.

Sabe-se que a gravidade da SPH pode estar relacionada a múltiplos

fatores em cada região, tais como variação quanto à estratégia de tratamento, a

patogenicidade do vírus circulante, a fatores genéticos intrínsecos da população ou

mesmo à circulação de dois hantavírus numa mesma região. Assim como descrito

para os vírus Andes e Laguna Negra em outros países da América do Sul (PADULA

et al., 2000b), neste estudo não foi observada associação da evolução clínica com a

diversidade genética dos genótipos I-LNV e II-LNV encontrados no Estado do Mato

Grosso.

Não fez parte dos objetivos desta tese o estudo da patogenicidade das

cepas do vírus Laguna Negra circulante no Estado do Mato Grosso em relação às

outras cepas procedentes da Argentina, Bolívia e Paraguai, mas sabe-se que para

isso seria necessário realizar uma análise filogenética mais completa, com um

número maior de amostras de vários municípios matogrossenses, utilizando

seqüências maiores do gene N, bem como do segmento M, e compará-las com

seqüências nucleotídicas provenientes dos outros países sul-americanos. Somente

assim poder-se-á dizer se a cepa do vírus Laguna Negra circulante no Estado do

Mato Grosso é mais ou menos patogênica para humanos do que as cepas

procedentes da Argentina, Bolívia e Paraguai. Além disso, não se pode deixar de

levar em consideração as origens genéticas das populações humanas dos locais

onde o vírus Laguna Negra está circulando, visto que análises do human leucocyte

antigens (HLA) de pacientes infectados com o vírus Andes no Chile demonstraram

uma maior susceptibilidade do alelo HLA-B*08 a quadros clínicos mais graves,

enquanto que o alelo HLA-DRB1*15 está relacionado a manifestações mais brandas

e a proteção imunológica contra o vírus Andes (FERRER et al., 2007). Para isso,

seria necessário um estudo genético da população matogrossense associando a

infecção com o vírus Laguna Negra ao polimorfismo genético, além de um estudo

maior quanto à soroprevalência de anticorpos anti-hantavírus nos municípios de

maior ocorrência de casos de SPH para reconhecimento de imunidade a esses vírus

em decorrência de infecções oligossintomáticas ou assintomáticas.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

Muito embora, ainda não se tenha detectado casos de SPH associado ao

vírus Castelo dos Sonhos no Estado do Mato Grosso, a detecção do genoma viral

em roedores O. aff. moojeni, sugere sua ocorrência na região. É possível, portanto

que no Estado do Mato Grosso dois hantavírus sejam responsáveis pelos casos de

SPH, quais sejam o vírus Laguna Negra, responsável pela maioria dos casos até o

momento reconhecidos e o vírus Castelo dos Sonhos. É lícito levantar a hipótese

que a SPH no Estado do Mato Grosso está associada com o vírus Laguna Negra,

dado os resultados, desta tese.

Quanto à determinação do genótipo III-LNV associado somente a

roedores C.aff. callosus, torna-se necessário seqüenciar um maior número de

amostras de roedores IgG positivos, em outros períodos de capturas, para se

confirmar essa peculiaridade genética.

Na análise genética das seqüências do vírus Castelo dos Sonhos obtidas

a partir de amostras biológicas dos roedores O. aff. moojeni capturados em Campo

Novo do Parecis feita conjuntamente com as amostras humanas do Estado do Pará,

observou-se que esta espécie viral foi dividida em três genótipos, havendo uma

associação com a distribuição geográfica. Com efeito, o genótipo I-CASV, que

agrupa com as amostras dos roedores, está circulando no Estado do Mato Grosso

(área da BR-364) enquanto que o genótipo II-CASV, associado com os casos de

SPH, está circulando no Município de Altamira. Muito embora, o protótipo do vírus

Castelo dos Sonhos (JOHNSON et al., 1999) tenha sido identificado no distrito de

Castelo dos Sonhos, ele se manteve em um genótipo distinto (III-CASV). Diante do

exposto, faz-se necessário o seqüenciamento completo do gene N para se confirmar

esta formação genotípica. Além do mais, é fundamental o seqüenciamento de mais

amostras de casos humanos procedentes de Mato Grosso, na área de influência da

BR-163, visando detectar o genoma do vírus Castelo dos Sonhos nesse estado,

assim como de casos procedentes de Altamira, para se verificar a circulação destes

dois genótipos na referida região.

Tendo em vista a associação genética do vírus Castelo dos Sonhos em

casos de SPH e em roedores O. aff. moojeni, sugere-se que tal espécie seja o

reservatório deste hantavírus nos estados do Mato Grosso e do Pará, visto que, por

mais antropizada que a região matogrossense esteja lá ainda observa-se o mesmo

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

tipo de vegetação que existe na região Sul do Estado do Pará: vegetação pré-

Amazônica, com áreas de floresta e de Cerrado. Todavia, é necessário realizar

outros estudos ecoepidemiológicos em Altamira, buscando capturar roedores O. aff.

moojeni que possam estar infectados.

6.3 ASSOCIAÇÃO FILOGENIA, DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA E

ROEDOR-HOSPEDEIRO

A análise filogenética das seqüências parciais do segmento S RNA (gene

N) de hantavírus obtidas neste trabalho, quanto às divisões de cluster, clade e

subclade, apresentou topologia similar ao descrito na literatura (BOHLMAN et al.,

2002; TRAVASSOS DA ROSA et al, 2005; RABONI et al., 2005). Foi observado que

um ancestral comum dos hantavírus do Novo Mundo deu origem a dois grupos,

clades I e II que por sua vez foram divididos em cinco subgrupos monofiléticos: três

do grupo I (subclades I-a, I-b e I-c) e dois do grupo II (subclades II-a e II-b). Essas

divisões em clades e subclades apresentaram uma correlação geográfica positiva no

continente americano, sendo observado que a subclade I-a compreende hantavírus

Andes-relacionados distribuídos no Cone Sul, as subclades I-b e I-c agrupam

hantavírus das Américas do Norte e Central e os hantavírus de ambos as subclades

da clade II encontram-se distribuídos na região norte da América do Sul (Figura 23).

Dentro deste contexto, os hantavírus brasileiros estão enquadrados nas

subclades I-a (Castelo dos Sonhos, Juquitiba, Itapuã e Araraquara), II-a (Anajatuba)

e II-b (Rio Mearim e Laguna Negra). O ancestral comum da subclade I-a, deu origem

a dois grupos de hantavírus: um associado a roedores do gênero Oligoryzomys e o

outro a duas espécies, N. lasiurus (Araraquara) e Akodon azarae (Pergamino). A

análise filogenética sugere que o vírus Castelo dos Sonhos co-evoluiu com a

espécie O. aff. moojeni, (Figura 23) restringindo-se a área pré-Amazônica e Cerrado

(Figura 24). Essa restrição ecogeográfica do O. aff. moojeni na parte central do

Brasil (Figura 27 A) corrobora com os achados (em fase de elaboração) de

Bonvicino e colaboradores

, o que leva a pensar que esse vírus possa estar

Dados fornecidos pela autora contidos no livro Guia dos roedores do Brasil com chave para gêneros baseada

em caracteres externos de autoria de CR Bonvicino, JA de Oliveira e PS D’Andrea a ser lançado no II

Workshop Nacional sobre Pesquisas Aplicadas em Hantavírus, em agosto de 2008.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

circulando em outros municípios ou estados que possuam as mesmas

características ecológicas e onde o O. aff. moojeni possa ser encontrado. A

identificação de casos de SPH pelo vírus Castelo dos Sonhos no distrito de Castelo

dos Sonhos-PA e no Município de Campo Novo do Parecis-MT, onde este vírus foi

identificado em roedores O. aff. moojeni confirma e reforça a hipótese.

Figura 27 – Distribuição das espécies de roedores silvestres Oligoryzomys sp. (A) e Necromys

lasiurus (B) no Brasil. Fonte:

BONVICINO, OLIVEIRA e D’ANDREA.

Estudos realizados por SUZUKI et al. (2004) possibilitaram associar o

vírus Araraquara à espécie N. lasiurus, no Bioma do Cerrado e o vírus Juquitiba à

espécie Oligoryzomys nigripes, na Mata Atlântica. Analisando a filogenia dos

hantavírus (Figura 23) pode-se sugerir que o vírus Juquitiba co-evoluiu com a

espécie O. nigripes após adaptação do ancestral desse hantavírus ao ancestral do

gênero Oligoryzomys. Por outro lado, o vírus Araraquara é filogeneticamente

relacionado aos vírus andinos ligados aos roedores do gênero Oligoryzomys, no

entanto está associado ao roedor N. lasiurus (Figura 27 B), o que pode ser devido

ao fenômeno de spillover, dado a abrangência da distribuição desses roedores

favorecendo co-habitação com espécies Oligoryzomys sp. (FUNASA, 2002).

Na clade II se observam três gêneros de roedores silvestres:

Oligoryzomys associados ao vírus Anajatuba (O. aff. fornesi) e Rio Mamoré (O.

microtis); Holochilus associados ao vírus Rio Mearim (H. sciureus) e Alto Paraguai

(H. chacarius); e Calomys associados ao vírus Laguna Negra (C. laucha e C. aff.

callosus). Assim como os hantavírus da clade II (Figura 23) e seus respectivos

O. chacoensis

O. nigripes

O. microtis

O. fornesi

O. moojeni

O. flavescens

O. fulvescens

Legenda

Gênero Oligoryzomys

Necromys lasiurus

O. chacoensis

O. nigripes

O. microtis

O. fornesi

O. moojeni

O. flavescens

O. fulvescens

Legenda

Gênero Oligoryzomys

Necromys lasiurus

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hospedeiros estão relacionados geneticamente entre si e com os roedores do

gênero Oryzomys (VAPALAHTI et al., 1999; BAKER et al., 1983; EISENBERG e

REDFORD, 1999), sugere-se que o ancestral comum dessa clade se adaptou a

esses três gêneros de roedores divergindo-se evolutivamente nos hantavírus

associados a cada um dos respectivos gêneros. Ressalta-se que as espécies O. aff.

fornesi e O. microtis habitam a parte norte da América do Sul, correspondente a área

Amazônica, enquanto que a maior parte das espécies de Oligoryzomys associados

aos vírus Andes-relacionados se encontram distribuídas no Cone Sul e na Mata

Atlântica (Figura 27). Portanto a distribuição geográfica desses roedores está

relacionada com a distribuição das subclades dos hantavírus: subclades II-a e II-b

nas regiões Amazônica e pré-Amazônica e a subclade I-a no Cone Sul, que no

Brasil envolve os biomas de Cerrado e Mata Atlântica (Figura 24).

Com relação à densidade populacional de roedores e taxa de infecção,

sabe-se que a maioria dos hospedeiros de hantavírus é aquela espécie que

apresenta maior densidade numa dada região (PLYUSNIN, 2002). Este fato pôde

ser observado quanto ao vírus Laguna Negra no Estado do Mato Grosso, onde se

observa uma elevada densidade populacional e uma alta taxa de positividade de C.

aff. callosus na captura de 2001, em Campo Novo do Parecis e Tangará da Serra.

No entanto, em relação ao Município de Anajatuba, é importante considerar que,

muito embora, a densidade do reservatório do vírus Anajatuba, O. aff. fornesi, seja

bem menor do que a de N. lasiurus, fato observado nos três anos de estudo no

Município, maior positividade para hantavírus foi detectada na primeira espécie.

Considerando que esta informação é discordante das disponíveis na literatura

(PLYUSNIN, 2002), mais estudos necessitam ser desenvolvidos para o melhor

entendimento da dinâmica populacional do O. aff. fornesi na região do Alagado

Maranhense. Ademais, supõe-se que apenas muito recentemente ocorreram

alterações ambientais que favoreceram o contato desses roedores com seres

humanos. Se esta hipótese é verdadeira, podemos esperar para os próximos anos a

ocorrência de muitos casos de SPH na região dos campos alagados do Estado do

Maranhão, pois com o decorrer do tempo e o aumento das alterações ambientais, é

provável que aumente o contato entre roedores Oligoryzomys e seres humanos.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

6.4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Este trabalho foi pioneiro no estudo das hantaviroses na Amazônia

brasileira. Até então poucas informações eram disponíveis sobre os hantavírus e

seus reservatórios nessa região. A escolha da estratégia para a tentativa de

caracterizar geneticamente esses agentes foi de grande importância para o seu

sucesso. De fato, muito embora, tenham sido utilizados com sucesso iniciadores

específicos direcionados ao vírus Andes na identificação dos vírus Anajatuba e Rio

Mearim (TRAVASSOS DA ROSA et al., 2005), não se poderia deixar de levar em

consideração o fato de circular hantavírus autóctone que não fossem

significativamente relacionados com o vírus Andes, o que levaria a resultados falsos

negativos na amplificação genômica. Por isso, o uso de iniciadores degenerados,

utilizados por JOHNSON et al. (1997) na caracterização do vírus Laguna Negra, e

direcionados a uma região altamente conservada do gene N (posição 250 a 660

referente ao vírus Laguna Negra) foi uma ferramenta mais eficiente e adequada, em

virtude do desconhecimento dos hantavírus circulantes e da grande biodiversidade

encontrada na região Amazônica.

As análises filogenéticas aplicadas nos estudos de hantavírus,

geralmente, utilizam apenas um método de análise, tais como MP (SPIROPOULOU

et al., 1994; CHIZHIKOV et al., 1995; BHARADWAJ et al., 1997; PADULA et al.,

2000b; TRAVASSOS DA ROSA et al., 2005), NJ (BOHLMAN et al., 2002),

Unweighted Pair Group (MORELI et al., 2004), dentre outros, muito embora alguns

autores tenham preferido utilizar dois métodos associados (MP e NJ), o que permite

uma maior confiabilidade na análise (LEVIS et al., 1998; JOHNSON et al., 1999;

SUZUKI et al., 2004; RABONI et al., 2005).

Estudos mostram que os métodos de Máxima Verosimilhança e

Bayesiano aliados à determinação de critérios para grupamento, baseando-se na

divergência genética das seqüências, são mais acurados em termos de

reconstrução filogenética e origem evolutiva (HARRISON e LANGDALE, 2006;

LUNTER et al., 2005). Este modelo de estudo, aliado às análises de MP e NJ, vem

sendo aplicado com sucesso na caracterização de espécies e variantes de outros

vírus bastante conhecidos, tais como o flavivírus (BRYANT et al., 2005; MEDEIROS

et al., 2007) e o vírus da raiva (BARBOSA et al., 2008). Por isso o emprego de

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Discussão

métodos já utilizados para os estudos de hantavírus (MP e NJ) juntamente com os

métodos Máxima Verosimilhança e Bayesiano foi aplicado neste trabalho, o que

resultou em informações melhores e mais confiáveis.

Sabe-se que os estudos para caracterização de hantavírus associam o

seqüenciamento tanto do segmento S RNA (mais conservado) quanto do segmento

M RNA (mais variável) (HJELLE et al., 1994; JONHSON et al., 1997; JONHSON et

al., 1999; LÓPEZ et al., 1997; POWERS et al., 1999; PADULA et al., 2000b;

TISCHLER et al., 2003; MORELI et al., 2004; SUZUKI et al., 2004; TRAVASSOS DA

ROSA et al., 2005) para uma melhor determinação em nível de espécie viral,

segundo os critérios propostos pelo CITV (PLYUSNIN, 2002). Embora tenhamos

utilizado também os iniciadores para o segmento M, algumas dificuldades

impossibilitaram a finalização da análise em tempo hábil e assim, neste trabalho,

apenas com os iniciadores direcionados para o segmento S, conseguimos alcançar

o objetivo esperado, ou seja, identificar os hantavírus circulantes nos estados do

Maranhão, Mato Grosso e Pará, relacionando-os com os casos de SPH e

identificando seus roedores-reservatórios.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

7 CONCLUSÕES

¾ Dois novos hantavírus foram identificados para a ciência, vírus

Anajatuba e Rio Mearim, detectados em amostras de O. aff. fornesi e H.

sciureus, respectivamente, capturados nos municípios de Anajatuba

Estado do Maranhão no primeiro estudo ecoepidemiológico em 2000;

¾ O vírus Anajatuba é o hantavírus responsável pelos casos de SPH nos

municípios de Anajatuba e Santa Rita no Estado do Maranhão e que

roedores O. aff. fornesi constituem os reservatórios transmissores

desse hantavírus em ambos os municípios;

¾ O vírus Castelo dos Sonhos continua sendo o responsável pelos casos

de SPH no Município de Altamira, Pará, tendo provavelmente como

reservatório o roedor O. aff. moojeni;

¾ O vírus Laguna Negra associado ao roedor C. aff. callosus é o

hantavírus responsável pelos casos de SPH nos municípios situados na

área de influência da BR-364, no Estado do Mato Grosso;

¾ As seqüências nucleotídicas obtidas das amostras dos roedores O. aff.

moojeni capturados em Campo Novo do Parecis se mostraram

filogeneticamente idênticas as do vírus Castelo dos Sonhos, indicando

essa espécie de roedor como possível reservatório desse hantavírus

com possibilidade de associação com casos humanos nessa região;

¾ Os vírus Castelo dos Sonhos, Anajatuba e Laguna Negra foram

encontrados em associações com casos humanos de SPH nas regiões

Amazônica e pré-Amazônica, que compreendem os biomas de Floresta

Amazônica e Cerrado, respectivamente.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

8 PERSPECTIVAS FUTURAS

¾ Desenhar iniciadores específicos aos vírus identificados para completar

as seqüências do segmento S das amostras estudadas;

¾ Finalizar o seqüenciamento dos segmentos M e iniciar o do segmento L

dos hantavírus amazônicos;

¾ Caracterizar outros hantavírus circulantes na Amazônia brasileira,

especificamente nos estados de Rondônia e Amazonas;

¾ Desenhar iniciadores específicos para serem utilizados em testes de

RT-PCR no auxílio ao diagnóstico laboratorial da SPH;

¾ Desenhar iniciadores específicos para uso em estudos de PCR em

tempo real com hantavírus amazônicos.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

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APÊNDICES

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

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Apêndice A – Alinhamento das seqüências nucleotídicas entre as amostras humanas e de roedores C. aff. callosus de Mato

Grosso e LNV

LNV CTG CGT TAT GGA AAT GTC CTG GAT GTC AAT GCT ATT GAC CTT GAA GAA CCG AGT GGC CAA ACT GCC GAT TGG AAG GCT

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Continua

LNV ATT GGA GCC TAT ATT CTA GGA TTT GTA ATA CCA ATT ATC CTA AAG GCA TTA TAT ATG CTT TCA ACA AGA GGG AGA CAG

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Continua

LNV ACT GTT AAA GAG AAC AAA GGG ACC AGG ATT CGA TTC AAG GAT GAT TCA TCA TTT GAA GAA GTC AAT GGC ATC CGA AAA

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Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Apêndice A

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Continua

LNV CCT AAA CAC TTG TAT GTG TCA ATG CCT ACT GCA CAA TCT ACA ATG AAG GCA GAT GAG ATA ACA CCG GGG AGG TTT AGG

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H 657848 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ...

H 660462 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ...

H 706738 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ...

H 695689 ... ... ..T C.. ... ..T ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ...

H 696558 ... ... ..T C.. ... ..A ... ... ..C ... ..C ... ..C ..G ... ... ... ... ... ... ... ..A ..A ..A ... ..A

H 711891 ... ... ..T C.. ... ..A ... ... ..C ... ..C ... ..C ..G ... ... ... ... ... ... ... ..A ..A ..A ... ..A

H 678213 ... ... ..T C.. ... ..A ... ... ..C ... ..C ... ..C ..G ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..A ... ..A

H 710031 ... ... ..T C.. ... ..A ... ... ..C ... ..C ... ..C ..G ... ... ... ... ... ... ... ..A ..A ... ... ..A

AN 649993 ... ... ..T C.. ... ..A ... ... ..C ... ..C ... ..C ..G ... ... ... ... ... ... ... ..A ..A ... ... ..A

AN 650204 ... ... ..T C.. ... ..T ..C ... ... ... ..C ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ...

AN 650228 ... ... ..T C.. ... ..T ..C ... ... ... ..C ..G ... ..C ... ... ... ... ... ..C ... ..A ... ... ... C..

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Apêndice A

113

Continua

LNV ACA ATT GCA TGT GGC TTA TTT CCT GCT CAA ATC AAA GCT CGG AAC ATT ATA AGT CCA GTC ATG GGT GTC ATT GGC TTT

H 651686 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ..C ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

H 650736 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

H 695325 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ..C ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

H 713175 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ..C ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

H 712518 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

H 671696 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ..C ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

H 653486 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ..C ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

H 682807 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ..C ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

H 657848 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ..C ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

H 660462 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ..C ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

H 706738 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ..C ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

H 695689 ... ..A ..G ... ... C.. ..C ... ... ... ... ... ..C ..C ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

H 696558 ..G ... ... ... ... ... ... ..A ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

H 711891 ..G ... ... ... ... ... ... ..A ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

H 678213 ..T ... ... ... ... ... ... ..A ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

H 710031 ..G ..A ..G ... ... ... ..C ... ..A ... ... ... ... ... ..T ..C ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

AN 649993 ..G ..A ..G ... ... ... ..C ... ..A ... ... ... ... ... ..T ..C ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

AN 650204 ... ..A ..G ... ... C.. ..C ... ..A ... ... ... ... ... ..T ..C ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

AN 650228 ... ..A ..G ... ... C.. ..C ... ..A ... ... ... ... ... ..T ..C ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Apêndice A

114

fim

LNV GGT CAC TTT GTG AAG GAC TGG ATG GAA AGG ATT GAC AAC TTT CTA

H 651686 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 650736 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 695325 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 713175 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 712518 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 671696 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 653486 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 682807 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 657848 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 660462 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 706738 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 695689 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 696558 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 711891 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 678213 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

H 710031 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

AN 649993 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

AN 650204 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

AN 650228 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..A ..C ... ... ... ...

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

115

Apêndice B – Alinhamento das seqüências nucleotídicas entre as amostras humanas de Altamira, roedores da espécie O. aff.

moojeni e CASV

casv CTT GAG CCT GAT GAT CAT CTG AAA GAA AAG TCT TCT CTT AGA TAT GGG AAT GTC CTA GAT GTC AAT TCA ATT GAC CTA

H 695323 ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

H 700306 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

H 712177 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ...

AN 729965 ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

AN 717307 ..C ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

AN 717313 ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ...

AN 701258 ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

casv GAG GAA CCG AGT GGA CAG ACT GCT GAC TGG AGA TCA ATA GGG GCC TAC ATC TTG AGC TTT GCA ATC CCA ATA ATT CTG

H 695323 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

H 700306 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

H 712177 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ...

AN 729965 ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ..T ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ..C

AN 717307 ... ... ..C ... ... ... ... ... ..T ... ... ..T ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ...

AN 717313 ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ..T ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ...

AN 701258 ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ..T ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ..C

casv AAG GCC TTG TAC ATG CTG TCT ACC CGC GGG AGG CAA ACA GTA AAG GAC AAT AAA GGG ACT AGA ATA CGG TTT AAG GAT

H 695323 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T A.. ..C ... ...

H 700306 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T A.. ..C ... ...

H 712177 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T A.. ..C ... ...

AN 729965 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ...

AN 717307 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ..C ... ... ..A ..G ..T A.. ..C ... ...

AN 717313 ... ... ... ... ... ..T ... ..T ... ... ... ..G ..T ..C ... ... ..C ... ... ..A ..G ..T A.. ..C ... ...

AN 701258 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ...

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Apêndice B

116

fim

casv GAT TCA TCA TTC GAG GAA GTG AAC GGG ATT CGT AAA CCC AAA CAT CTG TAT GTA TCA ATG CCG ACT GCA CAA TCC ACA

H 695323 ... ... ..C ..T ... ... ..C ..T ..G ..A ..C ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C

H 700306 ... ... ..C ... ... ... ..C ... ... ..A ..C ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C

H 712177 ... ... ... ..T ... ... ..C ..T ... ..A ..C ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C

AN 729965 ... ... ..C ..T ... ... ..C ..T ..A ..A ..C ... ..A ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C

AN 717307 ... ... ..C ..T ... ... ..C ..T ..A ..A ..C ... ..A ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C

AN 717313 ... ... ..C ... ... ... ..C ..T ..A ..A ..C ... ..A ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C

AN 701258 ... ... ..C ..T ... ... ..C ... ... ..A ..C ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C

casv ATG AAA GCT GAA GAG ATA ACT CCA GGT AGA TTT AGA ACA ATA GCC TGT GGT CTT TTT CCA GCG CAA GTA AAA GCA AGA

H 695323 ... ..G ... ... ... ... ..A ... ... ... ... C.G ... ..T ... ..C ... ... ... ... ..C ... ... ... ..C AGA

H 700306 ... ..G ... ... ... ... ..A ... ... ... ... C.G ... ..T ... ..C ... ... ... ... ..C ... ... ... ..C ...

H 712177 ... ..G ... ... ... ... ..A ... ... ... ... C.G ... ..T ... ..C ... ... ... ... ..C ... ... ... ..C ...

AN 729965 ... ..G ..G ... ... ... ..A ... ... ... ... C.G ... ..T ... ... ..C ... ..C ... ..A ..G ... ... ... ...

AN 717307 ... ..G ... ... ... ... ..A ... ... ... ... C.G ... ..T ... ... ..C ... ..C ..T ..A ..G ... ... ... ...

AN 717313 ... ..G ... ... ... ... ..A ... ... ... ... C.G ... ..T ... ... ..C ... ... ..T ..A ..G ... ... ... ...

AN 701258 ... ..G ... ... ... ... ..A ... ... ... ... C.G ... ..T ... ..C ... ... ... ... ..C ... ... ... ..C ...

casv AAC ATC ATT AGC CCT GTA

H 695323 ... ..T ... ... ... ...

H 700306 ... ..T ... ... ... ...

H 712177 ... ..T ... ... ... ...

AN 729965 ... ..T ... ... ... ...

AN 717307 ... ... ... ... ... ...

AN 717313 ... ... ... ... ... ...

AN 701258 ... ..T ... ... ... ...

ANEXOS

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

118

Anexo A – Documento com autorização da Direção do Instituto Evandro Chagas

para utilização de material pertencente à Instituição, conforme preconiza

o Comitê de Ética em Pesquisa/MS

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

119

Anexo B – Termo de consentimento livre e esclarecido

Projeto de pesquisa: ESTUDO DA ASSOCIAÇÃO VÍRUS-HOSPEDEIRO EM INVESTIGAÇÕES DE

HANTAVÍRUS ASSOCIADOS A SPH NO MUNICÍPIO DE ANAJATUBA NO ESTADO DO

MARANHÃO

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Eu, _______________________________________________, com_______anos de

idade fui procurado (a) pela equipe do Instituto Evandro Chagas (IEC), oportunidade em que fui

informado sobre os objetivos da pesquisa, dentro do projeto acima citado. Compreendi que o

objetivo principal desta pesquisa é investigar se sou portador(a) de anticorpos contra hantavírus

que são vírus responsáveis por doença em seres humanos caracterizada por febre e outros

sintomas, genericamente conhecida como Síndrome Pulmonar por Hantavírus. Um membro da

equipe justificou que o objetivo da pesquisa é saber se uma população exposta ao risco em áreas

onde existem transmissores desses vírus irá infectar-se, e em caso positivo, se irá desenvolver

doença ou não e, explicou a mim e meus familiares, que a melhor maneira de se fazer esse

estudo é o acompanhamento a longo prazo de uma população.

Segundo as informações prestadas, a pesquisa consta de levantamento de meus dados

pessoais e da minha família, bem como de informações acerca da doença e outros sintomas

pregressos, que serão anotados em uma ficha própria, seguido da colheita de 5-10 mL do meu

sangue e dos meus familiares maiores que cinco anos de idade. Todo o procedimento de colheita

do sangue será realizado com material estéril e descartável. Também fui informado que embora

este procedimento seja inócuo pode ocasionar dor local discreta e causar choro em crianças.

Está claro que eu posso não querer participar desta pesquisa, e isso não causará mal,

nem a mim nem a minha família. Mas também foi dito e repetido que não receberei nenhum

pagamento por participar. E que se eu participar, tenho também o direito de desistir a qualquer

momento, eu e minha família, sem nenhum problema ou prejuízo.

Compreendido tudo isso, eu autorizo a colheita de sangue e os exames a serem feitos, no

meu sangue e no de meus familiares que estão sob minha responsabilidade, isto é, aquele(s)

maior(es) de cinco anos e menor(es) de dezoito anos de idade, com os seguintes

nome(s):...............................................................................................................................................

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo B

120

A equipe ainda me informou que os menores de idade acima citados podem não querer

participar do estudo, e que nesse caso vale a vontade deles sobre a minha. Foi garantido também

que as informações dadas ao projeto são sigilosas.

Caso necessite, posso fazer contato com os integrantes da equipe da Seção de

Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas (cito a Av. Almirante Barroso nº

492, Bairro do Marco, Belém-Pa) pelos telefones: (091) 3202-4609, 3202-4633, 3202-4665 e fax

(091) 3226-1284 e 3226-5262.

Por fim declaro que além de ler esse documento, recebi as explicações que desejei da

equipe do projeto, e por não ter mais dúvidas, concordo em participar como voluntário do projeto e

estudo agora proposto, o que fica confirmado pela minha assinatura abaixo. COMO TENHO

DIFICULDADE (SIM  NÃO ), DE ENTENDER O ESCRITO ACIMA, ATESTO TAMBÉM QUE

UM MEMBRO DA EQUIPE LEU PAUSADAMENTE ESTE DOCUMENTO E ESCLARECEU AS

MINHAS DÚVIDAS, E COMO TEM A MINHA CONCORDÂNCIA PARA PARTICIPAR DO

ESTUDO, COLOQUEI ABAIXO A MINHA ASSINATURA (ou IMPRESSÃO DIGITAL).

(Local) ..........................., ......... de ........................ de 2005

Assinatura: _________________________________________________

IMPRESSÃO DATILOSCÓPICA (quando se aplicar)

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

121

Anexo C – TRAVASSOS DA ROSA, E.S.; MILLS, J.M. PADULA, P.J.; ELKHOURY,

M.R.; KSIAZEK, T.G.; MENDES, W. S.; SANTOS, E.D.; ARAÚJO,

G.C.B.; MARTINEZ, V.P.; TRAVASSOS DA ROSA, J.F.S.; EDELSTEIN,

A.; VASCONCELOS, P.F.C. Newly Recognized Hantaviruses Associated

with Hantavirus Pulmonary Syndrome in Northern Brazil: Parcial Genetic

Characterization of Viruses and Serologic Implication of Likely

Reservoirs. Publicado na revista Vector Borne and Zoonotic Diseases,

Volume 5, Number 1, 2005.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo C

122

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo C

123

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo C

124

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo C

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Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo C

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Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo C

127

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo C

128

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo C

129

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo C

130

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

131

Anexo D – MENDES, W. S.; ARAGÃO, N. J. L.; SANTOS, H. J.; RAPOSO, L;

VASCONCELOS, P. F. C.; ROSA, E. S. T.; ELKHOURY, M. R.

Hantavirus pulmonary syndrome in Anajatuba, Maranhão, Brasil.

Publicado na Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo,

43 (4) 237-240, July – August, 2001.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo D

132

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo D

133

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo D

134

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo D

135

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa

136

Anexo E – SANTOS, M. C.; LACERDA, M. V. G; BENEDETTI, S.M.;

ALBUQUERQUE, B. C.; FILHO, A. A. B. V. A.; ELKHOURY, M. R.;

ROSA, E.S.T.; VASCONCELOS, P. F. C.; MEDEIROS, D. B. A.;

MOURÃO, M. P. G. Human Hantavírus Infection, Brazilian Amazon.

Publicado na revista Emerging Infectious Diseases. Vol. 12, N° 7,

July 2006.

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo E

137

Elizabeth Salbé Travassos da Rosa Anexo E

138

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