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Dissertação apresentada à Universidade Federal
do Rio de Janeiro – Instituto de Nutrição, para
Obtenção do Título de Mestre em Nutrição.
Rio de Janeiro
2006
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2
SOUZA, Amanda Santos de
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Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio de
Janeiro. Instituto de Nutrição. Programa de Pós-graduação em
Nutrição.
Orientador: Maria das Graças Tavares do Carmo
1. Desnutrição; 2. Ácidos Graxos; 3. Esquiva Passiva; 4.
Labirinto Aquático de Morris; 5. Campo Aberto; 6. Ratos.
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Rio de Janeiro, 30 de Junho de 2006.
Presidente da banca: Maria das Graças Tavares do Carmo, Doutora, Universidade Federal do
Rio de Janeiro.
Banca examinadora:
Prof
a
. Dr
a
. Mônica Santos Rocha
Prof
a
. Dr
a
. Eliane Fialho de Oliveira
Prof
a
. Dr
a
. Fátima Lúcia de Carvalho Sardinha
Aprovada em 30 de Junho de 2006
iii
4
Este trabalho foi desenvolvido no Departamento de Nutrição e Dietética, Instituto de Nutrição
Josué de Castro, Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob orientação da Prof
a
. Dr
a
. Maria
das Graças Tavares do Carmo e Prof
a
. Dr
a
. Jan Nora Hokoç (Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho), durante o curso de Pós-graduação em Nutrição, com bolsa da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
iv
5
DEDICATÓRIA
Ao meu tio Luiz Eduardo dos Santos,
Para que sua recuperação ocorra
Plenamente e juntos possamos
Desfrutar as coisas simples
da vida.
v
6
“Se as coisas são feitas para usar
e as pessoas para amar, porque então
amamos as coisas e usamos as pessoas?”
Mix Bar.
vi
7
AGRADECIMENTOS
A Deus por me dar forças e iluminar sempre o meu caminho e é claro por aqueles momentos
que tenho certeza que me pegou no colo.
À Prof
a
. Dr
a
. Maria das Graças Tavares do Carmo por seus ensinamentos, compreensão e
confiança. Lembra aquele abraço apertado que me deu no momento mais difícil que passei
durante a realização deste trabalho? Foi ele que não me deixou desistir de tudo. À minha
orientadora e amiga, o meu eterno muito obrigada.
À Prof
a
. Dr
a
. Jan Nora Hokoç minha co-orientadora, confesso que a convivência com a
senhora foi um eterno aprendizado, obrigada também pelo apoio financeiro.
À Prof
a
. Dr
a
. Mônica Santos Rocha que me ajudou com os testes comportamentais, com os
artigos e resumos. Sem a senhora este trabalho não teria sido realizado.
À Prof
a
. Dr
a
. Geórgia Correa Atella. Tenho certeza que você foi um anjo que Deus colocou
em minha vida. Foi uma pena não ter a oportunidade de conviver com você por mais tempo.
Os seus ensinamentos, não só os experimentais, me fizeram entender o que é verdadeiramente
uma colaboração.
À Prof
a
. Dr
a
. Susana Ortiz Costa que sempre estava pronta para apaziguar as eufóricas e
calorosas ofensas.
E a todos os professores que me acompanharam durante este tempo.
Às minhas alunas Luciana da Camara Pacheco e Priscila da Silva Castro que sempre me
ajudaram com os experimentos e estiveram ao meu lado nos momentos mais difíceis
escutando meus desabafos e muitas das vezes me dando palavras de conforto. Se fui muito
exigente com vocês foi porque queria que fossem as “melhores”.
À Michele e Olívia pela ajuda com a análise dos ácidos graxos.
À toda equipe do laboratório de Bioquímica Nutricional (J2-21), Ana Paula, Gisele, Dani
Mizu, Dani Duque e Ingrid pela amizade no local de trabalho e pela maravilhosa convivência
fora dele, nunca esquecerei das nossas saídas. À Dilza pela ajuda em trabalhos extra oficiais e
pela música adaptada “Não tem hipocampo, não tem nada”. À Marcelle, Fernanda e a minha
querida “Érikinha” que não me deixou enquanto as minhas análises não terminaram.
Aos ratos, meu instrumento de trabalho, sem eles seria impossível a realização deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-CAPES pela bolsa de
Mestrado.
Aos secretários de pós-graduação Renata e Fabrício por serem muito educados, pacientes,
prestativos e competentes.
vii
8
Ao Sr. Zezinho por sempre conseguir ratos para mim.
À Tereza do E-17 pela ajuda na análise de lipídios da DBR.
Ao Sr. Jorge pelos cafezinhos.
Ao Marcelo, o meu amor, pela paciência, carinho, amor e companheirismo sempre
incondicional. Obrigada por ter me dado a oportunidade de realizar os meus sonhos e não
poderia esquecer que sem você este trabalho e todos os outros não existiriam no papel.
Ao meu pai Sylvio, por seus ensinamentos e valores como honestidade e integridade.
À minha mãe Eliana, pelo amor e coragem nos momentos em que pensei em desistir e por me
desejar sempre o melhor.
À minha irmã Bruna, meu irmão Leonardo e minha sobrinha Sylvia que sempre torceram por
mim e acreditaram que eu pudesse chegar.
Aos meus familiares que estiveram ao meu lado.
A todos que de alguma forma me ajudaram e tornaram possível esta realidade!
viii
9
SUMÁRIO
P.
Dedicatória..................................................................................................................................v
Epígrafe......................................................................................................................................vi
Agradecimentos........................................................................................................................vii
Resumo.....................................................................................................................................xii
Abstract....................................................................................................................................xiii
1 – INTRODUÇÃO....................................................................................................................1
1.1 - Papel da Nutrição no Desenvolvimento do Sistema Nervoso e no Comportamento.........1
1.2 - Desnutrição e suas Conseqüências no Sistema Nervoso e no Comportamento.................6
1.3 – Dieta Básica Regional (DBR)............................................................................................9
1.4 – Regiões Cerebrais............................................................................................................10
1.4.1 – Córtex Frontal..............................................................................................................10
1.4.2 – Hipocampo....................................................................................................................11
1.4.3 – Cerebelo........................................................................................................................14
1.5 – Testes de Aprendizagem e Memória................................................................................16
1.5.1 – Esquiva Passiva ou Inibitória.......................................................................................16
1.5.2 – Labirinto Aquático de Morris.......................................................................................17
1.5.3 - Campo Aberto................................................................................................................18
2 – OBJETIVOS.......................................................................................................................20
2.1 – Geral.................................................................................................................................20
2.2 – Específicos.......................................................................................................................20
3 – MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................................21
3.1 – Animais............................................................................................................................21
3.2 – Preparação de Dieta Básica Regional (DBR)...................................................................22
3.3 – Obtenção do Leite Materno..............................................................................................23
3.4 – Análise Comportamental..................................................................................................24
3.4.1 – Esquiva Passiva ou Inibitória.......................................................................................24
3.4.2 – Labirinto Aquático de Morris.......................................................................................25
3.4.3 – Campo Aberto...............................................................................................................27
3.5 - Sacrifício e Coleta de Amostras.......................................................................................28
ix
10
3.6 - Análise dos Lipídios na DBR, Leite Materno, Córtex Frontal, Hipocampo e
Cerebelo....................................................................................................................................28
3.6.1 - Extração dos Lipídios Totais.........................................................................................28
3.6.2 - Metilação dos Lipídios..................................................................................................29
3.6.3 – Cromatografia Gasosa.................................................................................................29
3.7 - Análise Estatística.............................................................................................................29
4 – RESULTADOS...................................................................................................................30
Artigo 1 – A Desnutrição Promovida pela Dieta Básica Regional (DBR) Altera o Perfil de
Ácidos Graxos do Leite Materno, o Crescimento e Desenvolvimento da Prole Desnutrida e
Recuperada Nutricionalmente...................................................................................................31
Resumo......................................................................................................................................32
Abstract.....................................................................................................................................33
Introdução.................................................................................................................................34
Materiais e Métodos..................................................................................................................37
Resultados.................................................................................................................................41
Discussão..................................................................................................................................46
Referências Bibliográficas........................................................................................................52
Tabelas e Gráficos………………………………………………….………………………...55
Artigo 2 – The Multideficient Regional Brazilian Diet: Brain Fatty Acid Profiles and Learning
Performance in Malnourished and Rehabilitated Young Rats……………….……………….66
Abstract.....................................................................................................................................67
Introduction...............................................................................................................................68
Materials and Methods..............................................................................................................70
Results.......................................................................................................................................74
Discussion.................................................................................................................................78
References.................................................................................................................................84
Tables and Figures……………………………………………………………………………88
Artigo 3 – Effects of the Multideficient Regional Brazilian Diet and Nutritional Rehabilitation
on Motor Activity, Emotionality and Exploratory Behavior in Young Rats…………….….102
Abstract...................................................................................................................................103
Introduction.............................................................................................................................104
Materials and Methods............................................................................................................106
Results.....................................................................................................................................109
x
11
Discussion...............................................................................................................................111
References...............................................................................................................................115
Figures.....................................................................................................................................120
5 – CONCLUSÃO..................................................................................................................125
6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................129
xi
12
RESUMO
A desnutrição promovida nos períodos críticos de desenvolvimento pré e pós-natal pode
produzir alterações no cérebro afetando parâmetros morfológicos, neuroquímicos e
comportamentais. Estas alterações podem ocorrer no córtex frontal, hipocampo e cerebelo,
regiões do cérebro envolvidas em processos cognitivos como aprendizagem e memória.
Considerando a importância dos lipídios na estrutura e funcionalidade do cérebro, o objetivo
deste trabalho foi avaliar o efeito da multideficiente Dieta Básica Regional (DBR) do nordeste
brasileiro sobre a composição relativa de ácidos graxos cerebrais de ratos e associar com
medidas comportamentais. Foram utilizados ratos wistar de ambos os sexos divididos em três
grupos experimentais. 1) Controle (GC), cujas mães, durante o período de gestação e lactação
e a prole, após o desmame, receberam dieta comercial; 2) Desnutrido (GD), animais que
receberam ração DBR durante o mesmo período do GC e 3) Recuperado (GR), cujas mães
durante o período de gestação e lactação receberam DBR e a prole, após o desmame, recebeu
ração comercial. Os animais foram monitorados diariamente obtendo-se a massa corporal e
consumo alimentar. Os filhotes com 70 dias de vida foram sacrificados por decapitação e os
órgãos retirados e pesados. Os animais receberam água e ração ad libitum. Aos 14 dias de
lactação, as ratas lactantes foram anestesiadas e o leite foi extraído por compressão manual de
suas tetas. A resposta de esquiva inibitória foi avaliada nos filhotes com 42 dias de vida
através do teste de esquiva passiva, a aprendizagem e memória espacial através do labirinto
aquático de Morris e a atividade locomotora e exploratória no campo aberto. Os lipídios do
leite, ração e regiões cerebrais foram extraídos e os ácidos graxos foram analisados por
cromatografia gasosa após prévia extração e separação dos ésteres metílicos. Os ácidos graxos
foram identificados por comparação do seu tempo de retenção com padrões conhecidos. A
análise estatística utilizada foi o teste t student ou ANOVA de uma via e o pós-teste de
Bonferroni. A DBR apresentou maior porcentagem de ácidos graxos saturados,
monoinsaturados, α-linolênico, EPA, DHA e menor de linoléico. O leite das ratas desnutridas
apresentou maior percentual de ácidos graxos saturados e DHA, menor dos poliinsaturados
linoléico, α-linolênico e araquidônico. Houve menor ganho de peso nas mães e filhotes
desnutridos durante a lactação, permanecendo até o final do experimento. Nenhuma diferença
estatística foi observada na massa corporal entre fêmeas recuperadas e controle. O GD
apresentou expressivo déficit cognitivo no labirinto aquático, enquanto que o GR não
apresentou diferença estatística significativa em relação ao GC. No campo aberto, os animais
desnutridos, tanto machos quanto fêmeas, apresentaram menor atividade locomotora e
exploratória. Os animais recuperados apresentaram maior atividade locomotora. Os animais
desnutridos apresentaram concentração aumentada de DHA no hipocampo e cerebelo, embora
tenham apresentado valores diminuídos de alguns ácidos graxos no córtex frontal, hipocampo
e cerebelo. Os animais recuperados também apresentaram diferenças no perfil de ácidos
graxos nessas regiões cerebrais, sugerindo que concentrações aumentadas ou diminuídas
provavelmente denotam que o cérebro tenta preservar ao máximo suas funções e isto,
provavelmente, altera a absorção, o turnover e a utilização desses nutrientes, buscando um
mecanismo compensatório ao insulto imposto em períodos críticos do desenvolvimento.
xii
13
ABSTRACT
The malnutrition promoted in pre- and postnatal critical development period may produce
alterations on the brain affecting morphological, neurochemical and behavioral parameters.
These alterations can occur in the prefrontal and frontal cortex, hippocampus and cerebellum,
regions of the brain that have been implicated in the cognitive processes underlying learning
and memory. Taking into account the importance that fats performs in brain structure and
functionality, the aim of this work was to assess the effect of multideficient Regional Basic
Diet (RBD) of Brazilian Northeast upon the relative brain fatty acid composition and to
associate it with behavioral measures. Wistar rats of both sexes were used, maintained in a
room with controlled temperature and light. After mating, pregnant rats were divided in three
groups. 1) Control group (CG) that during the pregnancy and lactation period (21 days each),
mother plus litter and the offspring after weaning, were fed commercial lab chow 2)
Malnourished group (MG) that received RBD chow during the same period of CG and 3)
Rehabilitated group (RG) whose mothers during the pregnancy and lactation period received
RBD and the offspring after weaning received commercial lab chow up to 70 days of age. The
animals received water and food ad libitum and were handled daily to obtain the body weight
and food intake. The offspring were killed by decapitation and the organs were extracted and
weighed. On day 14 of lactation period the mothers were anaesthetized and the milk was
extracted by manual compression. The inhibitory response was assessed in offspring on day
42 of age through passive avoidance test, the spatial learning and memory through Morris
water maze, and locomotor and exploratory activity in open field test. The fat of experimental
diets, maternal milk and brain regions were extracted and the fatty acids were analyzed by
gas-liquid chromatography after extracting and separating metil esters. The fatty acids were
identified by comparison of retention time with known standards. The results were analyzed
using t student, one-way ANOVA and Bonferroni post hoc test. The RBD presented higher
saturated, monounsaturated, α-linolenic, EPA, DHA and lower linoleic fatty acid percentages.
The malnourished maternal milk showed higher saturated and DHA fatty acid percentages
and lower linoleic, α-linolenic and arachidonic polyunsaturated ones. The increase in body
weight of malnourished mother and offspring was lower during the lactation period until the
end of the experiment. No statistic difference was observed on body weight between
rehabilitated and control females. The MG presented cognitive deficit in water maze, while
the RG was similar to the CG. In the open field, malnourished animals, males and females,
showed lower locomotor and exploratory activities. The rehabilitated animals presented
higher locomotor activity. The malnourished animals presented increased DHA concentration
in hippocampus and cerebellum, although these regions had shown decreased values of some
fatty acids. The rehabilitated animals also presented differences in the fatty acid profile in
these brain regions, thus suggesting that increased or decreased concentration likely denote
that the brain tries to preserve, at maximum, its functions and this probably alters the
absorption, turnover and the utilization of these nutrients, searching one compensatory
mechanism to the insult imposed in critical period of development.
xiii
14
1 – INTRODUÇÃO
1.1 - Papel da Nutrição no Desenvolvimento do Sistema Nervoso e no Comportamento
Para o cérebro (figura 1A e B) funcionar eficientemente na vida adulta é necessário que
ele tenha se desenvolvido de forma adequada no início da vida.
Figura 1: Cérebro de rato (A) vista superior e (B) vista lateral. Adaptado de BEAR, M. F.;
CONNORS, B.W.; PARADISO, M. A. Neurociências: Desvendando o Sistema Nervoso.
Artmed, 2002, 2 ed., 855 pp.
Nos mamíferos, o desenvolvimento do cérebro começa na embriogênese e continua
durante uma fase relativamente curta da vida pós-natal. Esta fase, em seres humanos, termina
ao final dos primeiros dois a quatro anos de vida. No rato albino, o mamífero mais usado para
estudos experimentais sobre o tema, tal fase compreende as três primeiras semanas da vida
pós-natal que coincide com o período do aleitamento (Almeida et al., 2002). Neste período, o
cérebro é mais vulnerável as agressões do ambiente, inclusive as nutricionais, devido ao fato
de que nesta fase os processos implicados no desenvolvimento cerebral ocorrem com muita
rapidez. Estes processos compreendem a hiperplasia (aumento da quantidade de células
nervosas), a hipertrofia (aumento do seu tamanho), a mielinização (formação, nas fibras
nervosas, de um envoltório de material lipídico - a mielina, fundamental para a transmissão
A
B
Córtex frontal
15
eficiente dos impulsos elétricos neuronais) e a organização das sinapses (pontos de
comunicação entre os neurônios) (Morgane et al., 2002).
A deficiência de um ou mais nutrientes na alimentação diária pode perturbar a
organização estrutural (histológica) e bioquímica de um ou mais dos processos acima
descritos, levando, geralmente, a repercussões sobre as funções do Sistema Nervoso Central
(SNC). Funções neurais básicas, como o processamento de informações sensoriais (por meio
dos cinco órgãos dos sentidos) e a percepção das sensações correspondentes, bem como a
execução de tarefas motoras (produção de movimentos, resultantes da ativação dos músculos
pelo sistema nervoso) podem ser afetadas em extensões variadas e de forma diretamente
proporcional à intensidade e à duração das deficiências nutricionais (Guedes et al., 1996). Isto
também se aplica no caso de funções neurais mais elaboradas, como aquelas envolvendo
cognição, consciência, emoção, aprendizado e memória, processos cuja perturbação na
infância pode levar a condições patológicas importantes para a vida adulta capazes de
interferir na qualidade de vida do indivíduo, como na sua contribuição para a sociedade em
que vive (Morgane et al., 2002).
Desta forma, a nutrição adequada, ao lado de variáveis como a carga genética e o
ambiente psicológico e socioeconômico, têm influência decisiva no desenvolvimento e
manutenção das funções psicomotoras e cognitivas ao longo da vida. Todos os nutrientes são
importantes para o desenvolvimento estrutural e funcional do cérebro, entretanto, alguns têm
importância particular em determinados períodos do desenvolvimento mental (Georgieff et
al., 2001).
Dentre os macronutrientes que influenciam o processo de maturação cerebral, as
proteínas e os lipídios aparecem como os componentes mais críticos para o desenvolvimento
das funções neurais. Vários aminoácidos provenientes das proteínas dietéticas são precursores
de neurotransmissores ou, em muitos casos, são os próprios neurotransmissores como o ácido
16
γ-amino-butírico (GABA), o glutamato, o aspartato e a glicina. Eles também são precursores
de proteínas estruturais, de enzimas e de hormônios peptídicos (Morgane et al., 2002).
Neurotransmissores e neuromoduladores são unidades básicas da comunicação química no
sistema nervoso. Dentre estes, incluem-se os sistemas colinérgicos, as indolaminas,
catecolaminas, aminoácidos e seus derivados peptídeos, os nucleosídeos, hormônios, entre
outros. A maioria destes neurotransmissores/moduladores pode ser sintetizada a partir de
precursores presentes no alimento ingerido, como os aminoácidos, estando, portanto, sob
influência direta da dieta oferecida. Triptofano e tirosina, por exemplo, são aminoácidos
precursores para a síntese de serotonina e catecolaminas, respectivamente e, a colina, serve
como precursor para a síntese de acetilcolina (Almeida et al., 2002).
Lipídios formam 60% da massa do tecido cerebral. Os lipídios, por sua vez, são
constituídos em grande proporção por ácidos graxos. Os ácidos graxos são compostos
formados por uma cadeia de carbonos, sendo os mais comuns aqueles que apresentam entre
12 e 22 átomos de carbono (Turatti et al., 2002) e um grupo carboxila terminal. Os ácidos
graxos são geralmente representados por símbolos numéricos (C18:2 n-6); onde o número
justaposto ao C indica o número de átomos de carbono; o segundo número, após dois pontos,
o número de duplas ligações e o número após o n expressa a posição da última dupla ligação a
partir do grupamento metil terminal (Siddiqui et al., 2004). Os ácidos graxos podem ser
classificados de acordo com a presença ou não de duplas ligações na cadeia carbônica
(insaturações) em saturados, quando não possuem insaturação na molécula; monoinsaturados,
quando apresentam uma insaturação e poliinsaturados, quando possuem mais de uma
insaturação na molécula (Graziola et al., 2002) (figura 2).
17
Figura 2: Tipos de ácidos graxos. Adaptado de CURI, R.; POMPÉIA, C.; MIYASAKA, C.
K.; PROCOPIO, J. Entendendo a Gordura. Os Ácidos Graxos. Manole, 2002, 1 ed., 580 pp.
Os ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (AGPI-CL) como o DHA (ácido
docosahexaenóico) da família n-3 e o AA (ácido araquidônico) da família n-6 representam os
componentes principais, cuja importância para o desenvolvimento do sistema nervoso central
(SNC), inclui participação sobre seu crescimento, função e integridade (Youdim et al., 2000).
A incorporação de AGPI-CL no cérebro ocorre durante o último trimestre de gestação e os
primeiros 6-10 meses após o nascimento, em humanos e, nos primeiros 15 dias após o
nascimento em ratos. Assim, os dois períodos mais críticos para a aquisição desses ácidos
graxos ocorrem durante o desenvolvimento fetal e após o nascimento, até que o
desenvolvimento bioquímico do cérebro e da retina seja concluído. Desta forma, durante a
gravidez, a mãe mobiliza o DHA e o AA para garantir o desenvolvimento cerebral do feto,
continuando a fornecê-los através do leite materno após o nascimento (Connor, 2000).
Vale ressaltar que durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal do SNC, AGPI-
CL, especialmente o DHA (C22:6 n-3), acumulam-se e constituem cerca de 60% dos ácidos
graxos na membrana do segmento externo dos fotorreceptores e nas membranas sinápticas do
18
cérebro (Jensen et al., 1996) e também desempenham papel essencial na fisiologia do cérebro
e da retina (Carrié et al., 2000), cuja ação é essencial para a síntese e integridade das
membranas celulares e para os mecanismos de transferência de sinais no sistema nervoso,
devido a sua participação no processo de mielinização (Wainwright, 1987). A deficiência pré-
natal de ácidos graxos n-3 reduz, particularmente, as concentrações cerebrais de DHA e a
recuperação é muito lenta comparada a de outros tecidos. Quantidades reduzidas de AGPI-CL
n-3 no cérebro não podem ser normalizadas através da oferta de dietas adequadas na vida
tardia, o que enfatiza a importância de um suprimento ótimo de AGPI-CL n-3 ao recém-
nascido. Menores concentrações deste ácido graxo no cérebro estão associadas com reduzida
habilidade na aprendizagem. Ingestão de óleos ricos em DHA é acompanhada por elevados
teores de DHA nos fosfolipídios de todos os tecidos, incluindo os lipídios cerebrais, sugerindo
que AGPI-CL n-3 pré-formados são mais rapidamente incorporados para assegurar a função
ótima do cérebro (Jensen et al., 1996). Já o AA contribui de forma importante na função
regulatória do SNC por atuar como segundo mensageiro, bem como precursor dos
eicosanóides (Wainwright, 2002). O AA está envolvido com déficits cognitivos observados
em ratos envelhecidos (Ulmann et al., 2001). Alimentar camundongos durante o período de
gestação com dieta desbalanceada, ou seja, com quantidade de ácidos graxos essenciais
inadequada, como por exemplo, baixa razão n-6/n-3 e elevados teores de DHA resultam em
retardo no crescimento associado com retardo comportamental nos filhotes, similar ao quadro
de retardo observado em desnutridos (Wainwright et al., 1999).
Ainda que a utilização dos ácidos graxos seja diferente de acordo com as diferentes
áreas do cérebro (Ulmann et al., 2001), reconhece-se também que uma das principais ações
dos ácidos graxos no SNC está relacionada com a manutenção da fluidez adequada nas
membranas neurais, envolvida na modulação de uma série de interações entre lipídios e
proteínas, assim como no fornecimento de um ambiente apropriado para o funcionamento
19
ótimo de enzimas e transportadores de membrana, receptores e canais iônicos (Yehuda et al.,
1999). Os ácidos graxos podem também modular o metabolismo de neurotransmissores e as
funções sinápticas. Delion e cols. (1996) observaram concentrações reduzidas de dopamina e
menor densidade de receptores serotoninérgicos 5-HT2, assim como redução de receptores
dopaminérgicos D2, em ratos deficientes em DHA. Adicionalmente, Yoshida e cols. (1997)
observaram menor densidade de vesículas sinápticas nos terminais da região CA1 do
hipocampo, em ratos alimentados com dieta pobre em ácidos graxos da série n-3. Já em
relação ao cerebelo, Jamieson e cols. (1999) observaram várias disfunções nesta região que
está envolvida com a coordenação e memória motora.
Todos estes estudos mostram uma estreita relação entre os lipídios provenientes da
dieta e o desenvolvimento do cérebro durante o período perinatal.
1.2 - Desnutrição e suas Conseqüências no Sistema Nervoso e no Comportamento
As conseqüências clínicas da desnutrição dependem de vários fatores, incluindo o grau
de severidade e a duração das deficiências nutricionais. A desnutrição materna é um fator que
contribui significativamente para os elevados índices de mortalidade peri-natal e infantil (Onís
et al., 1993). De acordo com a Organização Mundial da Saúde e a Organização Pan-
Americana de Saúde, aproximadamente 174 milhões de crianças abaixo de cinco anos são
desnutridas e em muitas regiões como na África e no Sul da Ásia existe alta prevalência de
desnutrição em mulheres em idade reprodutiva. No Brasil, estima-se que o número de
desnutridos seja maior em áreas rurais, principalmente na região nordestina (WHO, 2002).
A desnutrição imposta precocemente constitui fator ambiental capaz de produzir
alterações no cérebro. Estas alterações podem afetar aspectos morfológicos, neuroquímicos,
neurofisiológicos e funcionais do desenvolvimento cerebral (Fukuda et al., 2002). As lesões
20
decorrentes da desnutrição sobre o desenvolvimento e maturação do SNC são bastante
extensas. Cérebros de ratos desnutridos são imaturos ao nascimento tanto metabolicamente
quanto funcionalmente (Lecours et al., 2001). A desnutrição também pode reduzir o número
de neurônios, células gliais, alterar as conexões sinápticas e a mielinização das fibras
nervosas, diminuindo a velocidade de condução neural. Intracelularmente, a desnutrição pode
afetar a atividade de enzimas e com isto interferir com a síntese e com a própria estrutura
protéica e ainda, na incorporação de lipídios nas biomembranas (Morgane et al., 2002). Os
efeitos da desnutrição intrauterina são particularmente severos no período de proliferação e
crescimento neuronal, sendo enfatizada a suscetibilidade de determinadas estruturas do
sistema nervoso central, como córtex, hipocampo e cerebelo (Dobbing et al.,1971; Dobbing,
1976). Muitos dos efeitos da má nutrição pré-natal e pós-natal são permanentes, ainda que
algum grau de melhoramento possa ser produzido por exposição a diferentes estímulos,
inclusive ambiental. A má nutrição é prejudicial também durante o desenvolvimento do SNC,
não somente durante o chamado período de crescimento máximo do cérebro, mas também
durante processos organizacionais iniciais, tais como a neurogênese, migração e diferenciação
celular (Morgane et al., 1993).
De fato, a desnutrição causa importante perda de neurônios hipocampais e sinapses. A
formação hipocampal tem sido considerada como uma estrutura que está envolvida em
processos de aprendizagem e memória. Animais com lesões nesta área têm um desempenho
deficiente quando comparado com animais controle em tarefas que requerem a memória
espacial (Campbell e Bedi, 1989). Desde que esta estrutura tem sido implicada em
aprendizagem espacial (O'Keefe e Nadel, 1978) e memória operacional (Olton et al., 1979),
muitos pesquisadores têm se preocupado em estudar como estes aspectos do comportamento
seriam afetados em animais com uma história prévia de desnutrição (Morgane et al., 1993).
Pode-se especular que o distúrbio de emocionalidade em animais desnutridos possa interferir
21
com sua performance em tarefas comportamentais relacionadas à memória. Alterações
relacionadas à nutrição, em determinadas regiões do cérebro como o córtex pré-frontal e
parietal, que estão envolvidas na regulação da resposta emocional ao estímulo aversivo,
contribuem para a prejudicada performance de animais desnutridos na tarefa de esquiva ao
choque. A memória de trabalho ou operacional representa o conjunto de informações que são
úteis apenas para o raciocínio imediato e para resolução de problemas ou para a elaboração de
comportamentos. Este tipo de informação é armazenada temporariamente, podendo ser
descartada (esquecida) logo a seguir. O déficit deste tipo de memória é observado na
desnutrição estabelecida durante o desenvolvimento, podendo ser parcialmente associado ao
prejuízo na função do córtex pré-frontal, que é conhecido por desempenhar um papel chave
em processos neuronais relacionados ao estoque de informações (Lukoyanov et al., 2000). A
memória de referência conteria informações gerais aplicáveis a diferentes situações e
contextos relacionados (Olton, 1983). Assim, ela independeria do contexto temporal em que a
informação é apresentada. Tarefas comportamentais que requerem memória de referência
enfatizam a retenção de informações aplicáveis a diversas sessões de treino. De acordo com
esse ponto de vista, a versão onde uma plataforma escondida permanece fixa ao longo de
diversos dias de treino no labirinto aquático seria um teste de memória de referência espacial.
Por outro lado, a memória operacional arquivaria informações sobre o contexto temporal
pessoal específico em que uma informação foi obtida (Olton, 1983; O’Keefe, 1983). Tarefas
que requerem a memória operacional enfatizam informações relevantes aplicáveis a uma
tentativa específica, não necessariamente aplicável a outras tentativas. Portanto, na condição
em que a localização da plataforma é modificada diariamente, a informação específica sobre
sua localização é relevante apenas para aquele determinado dia de teste, mas não para outros
dias; assim, essa informação seria mantida na memória operacional.
22
A desnutrição também mostrou dano oxidativo aumentado nos lipídios e proteínas do
córtex, hipocampo e cerebelo quando a desnutrição foi imposta tanto no período pré quanto
pós-natal, indicando um mecanismo importante para as mudanças no desenvolvimento do
cérebro que são causadas pela desnutrição (Feoli et al., 2006).
1.3 – Dieta Básica Regional (DBR)
A maioria dos trabalhos experimentais que avalia os efeitos da desnutrição não utiliza
dietas que refletem, com fidedignidade, a inadequação nutricional observada em regimes
alimentares deficitários, característicos dos segmentos populacionais de baixa renda, que
vivem em áreas de desnutrição endêmica (Prazeres et al., 2004). Buscando a aproximação
máxima ao que ocorre com a população desnutrida, utilizamos no presente estudo a Dieta
Básica Regional (DBR), que foi identificada através de inquérito de freqüência de consumo
alimentar, realizado pelo Setor de Nutrição Humana da Universidade Federal de Pernambuco.
Esta dieta constitui a base da alimentação diária da população desfavorecida da Zona da Mata
de Pernambuco. A DBR corresponde a uma dieta multideficiente, contendo cerca de 8% de
proteínas dos quais a maior proporção é de origem vegetal e 1% de lipídios. A DBR tem sido
considerada um modelo adequado para estudar os efeitos da desnutrição materna e na prole
(Teodósio et al., 1990).
Almeida e cols. (2002) têm revelado em modelo experimental, conseqüências adversas
derivadas da utilização da DBR durante o período de gestação e lactação. Observou-se
alteração da proteína ligante de cálcio, calretinina (Almeida, 1999). Adicionalmente, ocorrem
modificações na expressão de neurotransmissores como GABA e acetilcolina e ainda,
alterações na retina durante o desenvolvimento (Almeida et al., 2001). O conjunto destes
23
achados indica ocorrência de retardo no processo de desenvolvimento destes animais
(Almeida et al., 2001).
Além disto, o estudo do nervo óptico (nervo central) (Almeida et al., 2005) e do nervo
sural (nervo periférico) dos animais submetidos a DBR mostrou graves e irreversíveis
alterações no processo de mielinização durante o desenvolvimento embrionário ou pós-natal
(Almeida et al., 2001). Resultados de Silveira (2004) mostram retardo na expressão do
neurotransmissor GABA durante a neurogênese de células da retina no grupo desnutrido que
recebeu a DBR. No entanto, até o presente momento não é sabido se estas alterações
observadas em animais desnutridos com a DBR poderiam ocasionar alterações nas funções do
cérebro e conseqüentemente prejuízos comportamentais em ratos.
1.4 – Regiões Cerebrais
1.4.1 – Córtex Frontal
O córtex pré-frontal é a parte anterior do lobo frontal do cérebro, situado em frente a
área motora e pré-motora. Citoarquitetonicamente, o córtex pré-frontal é definido pela
presença da camada granular interna IV. É dividido em áreas lateral, orbitofrontal e pré-
frontal medial. O córtex frontal (figura 1B) está envolvido com função motora, raciocínio,
planejamento de ações, tomada de decisões racionais e emocionais, pensamento abstrato e
outras funções cognitivas complexas como a memória de trabalho e inteligência (Semendeferi
et al., 2002). O córtex frontal media funções cognitivas, usualmente chamadas como
executivas, que são necessárias para otimizar a performance em tarefas complexas e incluem
um número de processos denominados: (1) seleção e percepção de informação pertinente; (2)
manutenção, recuperação e manipulação da informação que é mantida “on-line” na memória
24
de trabalho; (3) auto-orientação do planejamento e organização em relação a contingências
específicas; (4) controle comportamental e adaptação a mudanças no ambiente e (5) tomada
de decisão apropriada na base de resultados positivos ou negativos (Chudasama e Robins,
2006).
Uma teoria amplamente aceita em consideração a função do córtex pré-frontal é que
este serve como um estoque de memória de curta duração. Esta idéia foi primeiramente
formulada por Jacobsen, o qual relatou em 1936 que o dano do córtex pré-frontal de primatas
causou déficits na memória de curta duração. Karl Pribram e cols. (1952) identificaram a
região do córtex pré-frontal responsável por este déficit como área 46, também conhecido
como córtex pré-frontal dorsolateral. Mais recentemente, Funahashi e cols. (1993) evocaram a
perda de memória de curta duração pela inativação temporária de regiões localizadas nas
porções do córtex pré-frontal dorsolateral. Como o conceito de memória de trabalho tem sido
bem estabelecido, estes achados neuropsicológicos contribuíram para a teoria que o córtex
pré-frontal implementa a memória de trabalho e em algumas situações extremas, somente a
memória de trabalho. Em 1990, esta teoria encontrou um grande número de adeptos e tornou-
se predominante da função do córtex pré-frontal, especialmente para primatas não humanos.
O conceito de memória de trabalho usado por seguidores desta teoria focou principalmente na
manutenção da informação de curta duração e menos na manipulação ou monitoramento de
tais informações ou no uso desta informação para tomada de decisões (Lebedev et al., 2004).
1.4.2 - Hipocampo
A denominação hipocampo (do grego hippos = cavalo, kampos = monstro do mar) é
proveniente da semelhança desta estrutura com um cavalo marinho, quando observada em um
corte coronal do cérebro humano.
25
O hipocampo do rato é constituído pelas regiões CA1, CA2, CA3 e CA4 (do latim
cornu Ammon ou corno de Ammon), as quais estão dispostas radialmente a partir do subículo
em direção à fímbria (Lorente de Nó, 1934). As regiões CA1 e CA3 constituem a maior parte
do hipocampo, enquanto que as regiões CA2 e CA4 são tão pequenas e indistintas que, na
maioria das vezes, são ignoradas (figura 3A e B). Uma outra divisão introduzida por Ramón y
Cajal separa o hipocampo em região superior e inferior. O hipocampo compreende seis
regiões citoarquitetônicas distintas, incluindo o giro denteado, o hipocampo propriamente dito
(CA1, CA2, CA3 e CA4), o subículo, o pré-subículo, o parasubículo e o córtex entorrinal. O
subículo, o pré-subículo, o parasubículo são agrupados no chamado complexo subicular. O
hipocampo e o giro denteado são formados por três camadas corticais. As três camadas
fundamentais do hipocampo são: a camada polimorfa (stratum oriens), a camada piramidal
(stratum pyramidale) e a camada molecular (stratum radiatum e stratum lacunosum-
moleculare). O giro denteado consiste da camada polimorfa (hilus), a camada granular
(stratum granulosum) e a camada molecular (stratum moleculare) (Brown e Zador, 1990).
Figura 3: Corte sagital de cérebro de rato (A) mostrando a localização de hipocampo e (B)
corte coronal de hipocampo de rato. Adaptado de http://www.genaltruista.com.
O hipocampo é uma região do cérebro responsável pela aprendizagem e memória,
principalmente aquelas com características espaciais. Há relatos de que a desnutrição precoce
afeta a morfologia, neuroquímica e neurofisiologia do hipocampo, interferindo na
aprendizagem espacial. Déficits na aprendizagem e memória espacial foram observados após
lesão da formação hipocampal, reforçando a importância desta estrutura na aprendizagem
A
B
26
espacial. Adicionalmente, foi demonstrado que a aprendizagem e a memória estão
correlacionadas com alterações anatômicas, principalmente na área CA1, CA3 e CA4 e com
diminuição nos níveis de DNA no hipocampo (Fukuda et al., 2002).
Na neurociência, memória espacial é a parte da memória responsável por gravar a
informação sobre o próprio ambiente e sua orientação espacial. Por exemplo, a memória
espacial de pessoas é exigida para navegar ao redor de uma cidade familiar, enquanto que a
memória espacial de um rato é necessária para aprender a localização da comida no final de
um labirinto. A memória espacial é formada após um organismo reunir e processar a
informação sensorial sobre seu ambiente. Em geral, mamíferos requerem o funcionamento do
hipocampo (particularmente a área CA1) para formar e processar a memória acerca do espaço
(Gutbrod et al., 1987; Nunn et al., 1999; Tucker et al., 1999).
Eventos deletérios durante a gravidez induzem defeitos neurobiológicos e
comportamentais na prole, alguns destes defeitos envolvendo a formação hipocampal
(Lukoyanov et al., 2000).
Olton (1983) propõe que o hipocampo e suas interconexões estejam associados com a
memória operacional e espacial, enquanto, algum outro sistema, como o córtex e o cerebelo
com a memória de referência. Diferentemente da memória operacional, a memória de
referência generaliza através dos instantes e é menos propensa à interferência temporal, isto é,
na memória de referência as associações aprendidas independem do contexto temporal e
podem ser utilizadas a qualquer momento dependendo dos aspectos não temporais do
contexto. As informações da memória operacional são úteis para uma única tentativa,
enquanto as informações da memória de referência são úteis para muitas tentativas. Por esta
razão é importante estudar outras regiões do cérebro, além do hipocampo, envolvidas no
comportamento de aprendizagem e memória.
27
Prejuízo de aprendizagem e memória espacial conseqüente à desnutrição em estágios
iniciais da vida foi descrito por alguns autores, enquanto outros não encontraram diferenças
entre animais desnutridos e bem nutridos (Fukuda et al., 2002). De outro modo, foi
demonstrado que ratos desnutridos durante o desenvolvimento exibem numerosos e
irreversíveis prejuízos comportamentais, incluindo alterações no comportamento social, na
esquiva e exploração, distúrbios de emocionalidade e déficits relacionados à memória
(Lukoyanov et al., 2000).
1.4.3 – Cerebelo
O cerebelo é um órgão integrativo para a coordenação e sincronização de movimentos
finos do corpo e para a regulação do tônus muscular. Sendo dividido em córtex, que contém
tanto células nervosas quanto gliais e medula, que contém, por sua vez, fibras nervosas e
células gliais. O córtex cerebelar consiste de três camadas: a molecular, granular e de células
de Purkinje, todas contendo células nervosas interconectadas por fibras nervosas e sinapses
(Nygren et al., 2006).
O cerebelo é necessário para a aquisição e expressão da resposta condicionada, mas o
local de estoque da memória de longa duração não é conhecido (Cristian e Thompson, 2005).
Na teoria da aprendizagem motora, o cerebelo (figura 1B e 4) é o local do estoque do engrama
(informação). Evidências recentes mostram que o cerebelo além da resposta de aprendizagem
motora simples tem um papel em comportamentos cognitivos. Para este tipo de
aprendizagem, é possível que o local de estoque não seja o cerebelo, mas áreas alvo
cerebelares (Lalonde e Botez, 1990).
28
Figura 4: Corte coronal de cerebelo de rato. Adaptado de PETROSINI, L.; LEGGIO, M. G.;
MOLINARI, M. The cerebellum in the spatial problem solving: a co-star or a guest star?
Progress in Neurobiology, v. 56, p. 191-210, 1998.
Em ratos hemicerebeloctomizados, a aprendizagem do local da plataforma não é
impedida, mas sim alterada, pois a latência de escape no teste de labirinto aquático de Morris
diminui no decorrer das séries, porém é sempre pior que o observado entre os animais que não
tiveram um dos hemisférios cerebelares retirados, mostrando que os animais operados tem
distúrbio de aprendizagem espacial e não alteração de sua memória espacial, visto que no
teste de recuperação da memória, a latência é a mesma da última série do teste de
aprendizagem do local da plataforma. A deficiência dos ratos operados foi muito maior
quando a plataforma não estava visível, sugerindo que a retirada de um dos hemisférios
cerebelares também altera a aquisição da representação espacial do ambiente (Colombel et al.,
2004). Molinari e cols. (1997) também demonstraram que o cerebelo está envolvido na
discriminação de processos de orientação espacial e particularmente, na aprendizagem de
procedimentos dos aspectos espaciais e na exploração. Quando a localização da plataforma foi
modificada, o tempo gasto no quadrante alvo pelos ratos hemicerebeloctomizados não foi
maior que o dos outros animais, isto demonstra que os animais operados comportam-se ao
acaso e, conseqüentemente, são incapazes de adaptar-se a uma nova situação (Molinari et al.,
1997; Colombel et al., 2004). Os dados descritos indicam que ratos que têm um de seus
hemisférios cerebelares retirados apresentam deficiência na habilidade em mudar um
comportamento aprendido inicialmente, sugerindo disfunção do córtex frontal, visto que
29
alterações cognitivas do córtex frontal têm sido demonstradas em conseqüência de síndromes
cerebelares. Desta forma, o cerebelo é responsável pela adaptação do comportamento através
de sua relação com o córtex frontal e pré-frontal, como tem sido visto que a degeneração do
cerebelo contribui para a disfunção do córtex frontal e pré-frontal (Colombel et al., 2004).
1.5 – Testes de Aprendizagem e Memória
A performance de ratos desnutridos tem sido avaliada através da utilização de
diferentes paradigmas comportamentais, incluindo o campo aberto, o labirinto radial, o
labirinto em T, tarefa de discriminação condicional espacial, alternação espacial, esquiva
passiva e labirinto aquático de Morris (Lukoyanov et al., 2000 e Hebihara et al., 2002).
1.5.1 – Esquiva Passiva ou Inibitória
Testes de esquiva têm sido amplamente empregados em pesquisas sobre as bases
neurofisiológicas da memória em animais de laboratório. Na esquiva passiva o animal penetra
em um compartimento ou desce de uma plataforma e então recebe o choque (descarga
elétrica); por conseqüência, o animal aprende a não ir mais ao compartimento a fim de evitar
aquela resposta, ou seja, é um procedimento experimental que utiliza o choque elétrico como
estímulo aversivo e o resultado é interpretado como indicativo de emocionalidade (ansiedade
e medo) (Almeida et al., 1996).
30
1.5.2 – Labirinto Aquático de Morris
Na neurociência, o labirinto aquático de Morris é um procedimento de análise
comportamental projetado para testar a memória espacial. Foi desenvolvido pelo
neurocientista Richard G. Morris em 1984 e é comumente utilizado atualmente para explorar
o papel de regiões do cérebro envolvidas na formação da memória espacial (Morris, 1984).
O paradigma típico concentra-se em colocar um rato ou camundongo dentro de um
tanque com água opaca contendo uma plataforma de escape escondida. A face do animal deve
ser virada para a parede do tanque para que o stress e os erros sejam evitados. Ao liberar o
animal, este nada ao redor da piscina a procura de uma saída, enquanto vários parâmetros são
investigados, incluindo tempo gasto para encontrar a plataforma, velocidade alcançada e
distância percorrida. Os ratos devem imaginar uma área e nadar num padrão de investigação e
com o decorrer dos treinos o animal aprende onde a plataforma está escondida, desta forma há
o melhoramento da performance do rato que é capaz de localizar a plataforma rapidamente.
Esta habilidade é atribuída a um mapa espacial no hipocampo. A medida clássica de
aprendizagem é a latência, que é o tempo gasto para encontrar uma plataforma (Morris, 1984).
Dentre os diversos procedimentos e aparelhos desenvolvidos para avaliar o desempenho
de animais em labirintos, o teste de aprendizagem e memória espacial (no labirinto aquático)
vem se destacando nos estudos sobre a neurobiologia da memória (Gallagher et al., 1993) e
considerado adequado para modelos de desnutrição, pois é um teste que não utiliza o alimento
como recompensa (Fukuda et al., 2002).
31
1.5.3 - Campo Aberto
O equipamento de campo aberto foi descrito pela primeira vez por Hall em 1941. Este
aparelho, primeiramente, tinha forma circular e era utilizado para testar a emocionalidade em
ratos, frente a ambientes nunca antes visitados.
Testes que submetem animais a um novo ambiente, como é o caso do open field,
utilizam medidas simples tais como defecação, ambulação, rearing, grooming e freezing que
são ditas medidas de confiança de emocionalidade (Archer, 1973).
Mais de 20 diferentes comportamentos têm sido quantificados no teste de open field,
mas poucos são de confiança em ratos (Walsh e Cummins, 1976) e em outros roedores. Estes
incluem os mais comumente usados como ambulação, rearing e defecação (Ivinskis, 1968).
Este tipo de teste, que utiliza-se do confinamento do animal, baseia-se no fato de que, no
intuito de explorar o ambiente, o animal precisa locomover-se nele e assim a quantidade de
movimentos torna-se um indicador de atividade exploratória. A atividade exploratória
relaciona-se à obtenção de informação em relação ao ambiente. A taxa de ambulação pode ser
medida através da contagem do número de secções do ambiente atravessadas pelo animal e
por tratar-se de um método de fácil mensuração tem sido um dos parâmetros mais utilizados
para este fim. Um outro tipo de resposta exploratória é o chamado rearing que traduz o
movimento característico do animal de levantar-se nas patas traseiras. O comportamento de
rearing correlaciona-se à atividade de autolimpeza corporal chamada de grooming (Archer,
1973). Medidas de comportamento motor têm sido consideradas como índice de exploração,
ao passo que, a medida de defecação tem geralmente sido sugerida por refletir
emocionalidade ou reatividade do sistema nervoso autônomo (Russell et al., 1987). A
defecação em ratos e camundongos é considerada como um indicador positivo de
emocionalidade (Archer, 1973) e em camundongos machos reflete demarcação territorial
32
(Brain e Nowell, 1970, Brain et al., 1971). Maimanee e cols. (2003) mostraram que a
defecação não é inversamente relacionada a ambulação neste teste, então a defecação e a
ambulação aumentam proporcionalmente e animais adultos produzem mais fezes que animais
jovens. No entanto, Denenberg (1969) definiu como animal emocional aquele que tem uma
menor taxa de ambulação e maior taxa de defecação. Candland e Nagy (1969) mostraram que
tanto a ambulação quanto a defecação aumentam com a idade, sendo que a defecação diminui
a partir da exposição repetida à situação. A defecação, rearing e grooming estão aumentados
em ratos com exposição ao barulho intenso, enquanto que nenhum efeito significante na
ambulação foi encontrado (Weyers et al., 1994), sugerindo que a defecação é influenciada por
estimulo provocado pelo medo.
O nível de ansiedade pode ser medido no campo aberto, levando-se em consideração
que a área central provoca mais ansiedade, enquanto que a área periférica provoca menos
ansiedade, por isso o equipamento do presente estudo foi separado em área periférica e
central. Animais são mais ansiosos no open field quando gastam menos tempo no centro
(Choleris et al., 2001), já que a área central é considerada como ansiogênica e aversiva
(Meyer et al., 2006).
Considerando as complexas desordens que a desnutrição acarreta nas estruturas
cerebrais, inclusive nos processos de aprendizagem e memória, a importância dos ácidos
graxos poliinsaturados na manutenção da integridade estrutural e da função celular o presente
estudo buscou investigar, em ratos, os efeitos da DBR sobre a composição de ácidos graxos
em diferentes compartimentos cerebrais e a ocorrência de prejuízos comportamentais
associados.
33
2 – OBJETIVOS
2.1 – Geral
Avaliar em ratos jovens, machos e fêmeas, o efeito da DBR consumida pela mãe
durante o período de gestação e lactação, sobre a composição relativa de ácidos graxos
cerebrais e associar com medidas de comportamento.
2.2 – Específicos
• Avaliar a evolução da massa corporal de mães e filhotes;
• Quantificar o consumo alimentar de mães e filhotes;
• Quantificar o teor relativo de ácidos graxos nos lipídios totais nas dietas
experimentais;
• Quantificar o teor relativo de ácidos graxos nos lipídios totais do leite materno durante
a lactação exclusiva;
• Avaliar a resposta de esquiva inibitória, a memória espacial, a emocionalidade e a
atividade exploratória e locomotora dos filhotes a partir do 42º dia de vida;
• Quantificar a massa do cérebro, córtex frontal, hipocampo, cerebelo, coração, fígado,
rim direito e esquerdo dos filhotes com setenta dias de vida;
• Quantificar o teor relativo de ácidos graxos nos lipídios totais das diferentes regiões
cerebrais (córtex frontal, hipocampo e cerebelo) e associar com os testes
comportamentais dos filhotes pertencentes aos diferentes grupos experimentais.
34
3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 – Animais
Foram utilizados ratos albinos de linhagem Wistar de ambos os sexos, provenientes do
biotério de roedores do Instituto de Nutrição da Universidade Federal do Rio de Janeiro. A
manipulação e o sacrifício dos animais seguiram as normas estabelecidas pela Sociedade
Brasileira de Neurociências e Comportamento (SBNeC) e foram aprovadas pela comissão de
uso de animais experimentais do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho.
Ratas jovens, nulíparas foram submetidas ao acasalamento com ratos de mesma
linhagem e origem. Após ser detectada sua provável prenhez, através da verificação em
lâmina a presença de espermatozóides, o primeiro dia de gravidez foi considerado como dia
embrionário 0 (E0).
Os animais foram subdivididos em três grupos experimentais conforme descrito na
tabela 1:
Tabela 1: Descrição dos três grupos experimentais
CONTROLE DESNUTRIDO
RECUPERADO
Mães durante o período de gestação
(21 dias de duração)
Ração comercial
Ração DBR Ração DBR
Mães e filhotes durante o período de
lactação (nascimento até 21 dias de
vida)
Ração comercial
Ração DBR Ração DBR
Filhotes após o desmame (22º dia de
vida) até 70 dias de vida
Ração comercial
Ração DBR Ração comercial
35
Ao nascimento, a ninhada foi reduzida a oito filhotes. Os animais receberam água e
ração ad libitum e foram mantidos em biotério com ciclo de luz claro/escuro de 12/12 horas e
temperatura de 24±2ºC.
Durante o período do ensaio, os animais foram monitorados diariamente obtendo-se a
massa corporal e consumo alimentar.
3.2 – Preparação de Dieta Básica Regional (DBR)
A ração DBR foi elaborada a partir dos seguintes ingredientes: batata doce (Iponea
batatas), feijão mulatinho (Phaseolus vulgaris), farinha de mandioca (Manihot esculenta),
carne seca (carne bovina salgada e prensada) e gordura da própria carne.
Modo de preparo:
Os ingredientes, adquiridos em feiras livres ou supermercados, foram coccionados
(exceto a farinha de mandioca) e em seguida secos (desidratados) em estufa com circulação
de ar (50-60ºC) durante aproximadamente 24 horas;
Uma vez desidratados, foram moídos e assim reduzidos a pó. Ao final, foi obtido o pó
de feijão, pó de carne seca ou carne de charque, pó de batata doce e a farinha de mandioca,
que por ser naturalmente pó, não precisou passar pelas etapas de cocção, desidratação e
moagem;
Procedeu-se a mistura dos 4 pós obtidos, nas proporções indicadas na tabela 2,
acrescentando-se também a gordura da própria carne de charque. Durante o procedimento de
mistura, acrescentou-se 845±50 mL de água morna (±40-50ºC) para preparar 1 kg de ração,
até a formação de uma pasta que foi então processada em uma masseira para a obtenção de
36
pequenos pedaços (pellets). Os pellets assim obtidos permaneceram em estufa com circulação
de ar (50-60ºC) durante cerca de 24 horas, até a sua secagem e solidificação.
PS: A gordura da carne seca foi retirada com faca, antes do cozimento da carne, deste
modo a carne foi cozida, seca e moída com o menor conteúdo possível de tecido adiposo. A
gordura retirada da carne foi e acrescentada à mistura de pós na proporção indicada na tabela
2.
Tabela 2: Ingredientes e composição centesimal da Dieta Básica Regional
Dieta Básica Regional
(DBR)
g% Proteína
(g)
Carboidrato
(g)
Lipídio
(g)
Mineral
(g)
Fibra
(g)
Kcal
Feijão Mulatinho 18,34 3,99 10,66 0,24 0,57 1,09 60,76
Farinha de Mandioca 64,81 0,84 48,59 0,12 0,43 5,64 198,80
Carne Seca 3,74 2,74 0,43 0,06 0,06 0,00 13,22
Gordura da Carne Seca 0,35 0,00 0,00 0,35 0,00 0,00 3,15
Batata Doce 12,76 0,30 9,99 0,03 0,20 0,48 41,43
Total 100,00
7,87 69,67 0,80 1,26 7,21 317,36
Fonte: Teodósio et al., 1990.
Tabela 3: Composição percentual da ração Comercial
Dieta Comercial Proteína Carboidrato
Lipídio Mineral Fibra Kcal
100g 23% 50,44% 5% 10% 10% 338,76
Fonte: PURINA®
3.3 – Obtenção do Leite Materno
Aos 14 dias de lactação, as ratas lactantes do grupo controle e desnutrido foram
anestesiadas intraperitonealmente com pentobarbital sódico (30mg/Kg) e receberam ocitocina
através das narinas (1mL/Kg). O leite foi extraído por compressão manual das tetas,
acondicionado em tubos plásticos e estocado à -70ºC até a análise de seu conteúdo lipídico.
37
3.4 – Análise Comportamental
Os testes comportamentais começaram quando os animais atingiram 42 dias de vida. O
primeiro teste utilizado foi a esquiva passiva ou inibitória (Passive Avoidance) que durou três
dias, em seguida foi realizado o teste de labirinto aquático de Morris (Morris Water Maze).
Após uma semana do teste de labirinto aquático de Morris, os animais com dois meses de
idade foram avaliados no campo aberto (Open Field).
3.4.1 – Esquiva Passiva ou Inibitória
O equipamento consiste em uma caixa de metal que possui em sua base uma grade
também de metal acoplada a um gerador de choque (figura 5). Situada ao lado da grade existe
uma plataforma de escape.
No primeiro dia de teste foi realizada a ambientação do animal na caixa de esquiva. O
rato foi colocado dentro da caixa permanecendo por 120 segundos para a sua familiarização
com o novo ambiente. No dia seguinte, o animal foi cuidadosamente colocado sobre a
plataforma de escape e o tempo que ele levou para descer da mesma foi cronometrado.
Quando o rato atingiu a grade com as quatro patas, um choque (0,6mA/3,0s) foi aplicado. No
terceiro dia, o teste de retenção da memória foi conduzido, o tempo (latência) para o rato
descer da plataforma com as quatro patas foi registrado e o aprendizado foi aferido em função
dessa latência.
38
Figura 5: Vista superior da esquiva passiva com o rato na plataforma (A) e o gerador de
choque ao lado (B).
3.4.2 – Labirinto Aquático de Morris
O labirinto consiste em um tanque circular com 180cm de diâmetro. O equipamento foi
preenchido com água em temperatura ambiente contendo tinta hidrossolúvel não tóxica para
tornar a água opaca. O labirinto (figuras 6 e 7) foi dividido em quatro quadrantes imaginários
de igual tamanho e uma plataforma foi fixada permanentemente no centro de um destes
quadrantes, 1,5cm abaixo da superfície da água. Nos três quadrantes restantes foram definidos
cinco diferentes pontos de saída eqüidistantes. Para a aquisição da informação, os animais
receberam 5 treinos durante 4 dias consecutivos. Cada rato foi colocado na água com a face
voltada para a parede do tanque em um dos cinco pontos de saída demarcados. Em cada treino
os pontos de saída eram os mesmos para todos os animais, os quais deviam encontrar a
plataforma escondida em um período de 120 segundos. No caso do animal não encontrar a
plataforma de escape, o experimentador guiava-os até a plataforma onde permaneciam por 10
segundos. Foi conferido um intervalo de 30 minutos entre cada uma das cinco saídas. O
A
B
39
tempo transcorrido para o animal encontrar a plataforma foi cronometrado e denominado
latência.
Após um intervalo de 18 dias desde o último treino, os animais foram desafiados a
encontrar a plataforma escondida no mesmo quadrante da fase de treinamento, de forma a
avaliar a memória de longa duração.
Figura 6: Representação esquemática da vista superior do labirinto aquático de Morris.
Figura 7: Vista superior do labirinto aquático de Morris com o rato tentando encontrar a
plataforma (A) e com o animal sobre a plataforma (B).
Plataforma
escondida
Saída 1
Saída 2
Saída 3
Saída 4
Saída 5
A
B
40
3.4.3 – Campo Aberto
O teste consistiu na permanência do animal em uma caixa de madeira (figura 8)
medindo 60x60x60 (3600 cm
2
), 60x53,08x53,08 (2816,8 cm
2
) e 60x23,24x23,24 (540,16
cm
2
) cm (altura x largura x profundidade) para os grupos controle, recuperado e desnutrido,
respectivamente.
A medida original da caixa foi alterada em função das diferenças nos valores de massa
corporal verificada entre os animais pertencentes aos diferentes grupos experimentais.
A base da caixa foi dividida por linhas pretas formando um total de 16 quadrados.
Durante 4 dias consecutivos, os ratos permaneceram dentro da caixa por 5 minutos. Todo o
experimento foi filmado para que, posteriormente, os seguintes parâmetros fossem
quantificados: (1) número de quadrados percorridos na periferia da arena, (2) número de
quadrados percorridos no centro, (3) número de vezes que os ratos levantaram as patas
anteriores (rearing), (4) número de vezes que limparam as vibrissas (grooming) e (5)
quantidade de fezes eliminadas.
Figura 8: Vista superior do campo aberto com o rato dentro da caixa.
41
3.5 - Sacrifício e Coleta de Amostras
Ao completarem 70 dias de vida, os animais foram sacrificados por decapitação com
guilhotina. O cérebro, coração, fígado e rins foram retirados para a determinação da massa
total desses órgãos. O cérebro foi dissecado em córtex frontal, hipocampo e cerebelo, os quais
foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados à -70°C para posterior
análise de ácidos graxos.
3.6 - Análise dos Lipídios Totais na DBR, Leite Materno, Córtex Frontal, Hipocampo e
Cerebelo
3.6.1 - Extração dos Lipídios Totais
Os lipídios totais foram extraídos segundo Bligh e Dyer, 1959. O córtex frontal,
hipocampo, cerebelo, leite materno ou as dietas experimentais foram pesados e
homogeneizados com solução salina 0,9%. Ao homogenato foram adicionados 2 mL de
metanol e 1 mL de clorofórmio. Após agitação em intervalos de 5 em 5 minutos por um
período de 2 horas, o homogenato foi centrifugado, durante 10 minutos, à 3000rpm e o
sobrenadante armazenado em geladeira. Ao precipitado resultante no tubo foi adicionado
novamente 2 mL de metanol, 1 mL de clorofórmio e 0,8 mL de água, agitado de 5 em 5
minutos por 1 hora e centrifugado durante 10 minutos à 3000rpm. O sobrenadante foi extraído
e misturado ao que permaneceu armazenado na geladeira, adicionado de 1 mL de água e 1 mL
de clorofórmio. Após agitação por 30 segundos e centrifugação por 30 minutos à 3000 rpm, a
solução foi separada em 2 fases: fase aquosa e fase orgânica que contém os lipídios totais. A
fase orgânica foi extraída e seca sob corrente de nitrogênio. A amostra foi então pesada.
42
3.6.2 - Metilação dos Lipídios
A metilação foi feita partindo-se de uma alíquota das amostras de lipídios extraídas
conforme descrição no subitem anterior, de acordo com a técnica descrita por Lepage e Roy
(1986), que preconiza o seu tratamento com uma solução de 2mL de metanol-benzeno
(4:1v/v) e 200µL de cloreto de acetila acrescentado sob leve agitação. A mistura final
contendo os metil-ésteres de ácidos graxos foi estocada em freezer (-20ºC) para análise
posterior em cromatógrafo a gás.
3.6.3 – Cromatografia Gasosa
Os ácidos graxos metilados foram quantificados por cromatografia gasosa em um
cromatógrafo Perkin Elmer Autosystem XL, equipado com detector de chama ionizável,
ligado a um software Perkin Elmer Nelson - EUA. Os ácidos graxos foram separados em
coluna capilar SP-2330 (Supelco Inc., Bellefonte, PA) com 60mx0,32m de diâmetro interno.
Os ésteres foram identificados por comparação com seu tempo de retenção com padrões
conhecidos (Sigma, Supelco e Nuchek).
3.7 - Análise Estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. A análise
estatística utilizada foi o teste t student para comparar as variáveis entre o grupo controle e
desnutrido ou a análise de variância ANOVA de uma via para comparar os efeitos da
recuperação nutricional entre os grupos. Para a comparação entre as médias dos resultados foi
aplicado o pós-teste de Bonferroni, adotando-se como nível mínimo de significância o valor
de p<0,05.
43
4 – RESULTADOS
Os resultados desta dissertação estão representados na forma de três artigos científicos:
1) A Desnutrição Promovida pela Dieta Básica Regional (DBR) Altera o Perfil de
Ácidos Graxos do Leite Materno, o Crescimento e Desenvolvimento da Prole
Desnutrida e Recuperada Nutricionalmente (a ser submetido à Revista de Nutrição).
2) The Multideficient Regional Brazilian Diet: Brain Fatty Acid Profiles and Learning
Performance in Malnourished and Rehabilitated Young Rats (a ser submetido à
revista Brain and Cognition).
3) Effects of the Multideficient Regional Brazilian Diet and Nutritional Rehabilitation
on Motor Activity, Emotionality and Exploratory Behavior in Young Rats (a ser
submetido à revista Behavioural Brain Research).
44
A Desnutrição Promovida pela Dieta Básica Regional (DBR) Altera o Perfil de Ácidos
Graxos do Leite Materno, o Crescimento e Desenvolvimento da Prole Desnutrida e
Recuperada Nutricionalmente*
The Malnutrition Promoted by Regional Basic Diet (DBR) Alters the Profile of Maternal Milk
Fatty Acid, Growth and Development of Malnourished and Nutritionally Rehabilitated
Offspring
1
Amanda Santos de SOUZA,
2
Luciana da Câmara PACHECO,
2
Priscila da Silva CASTRO,
3
Jan Nora HOKOÇ,
1
Maria das Graças TAVARES DO CARMO
Instituições
1
Laboratório de Bioquímica Nutricional - Instituto de Nutrição Josué de Castro, Universidade
Federal do Rio de Janeiro.
2
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - Acadêmica do Curso
de Nutrição da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
3
Instituto de Biofísica Carlos Chagas
Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Título curto: Desnutrição, leite materno e crescimento de ratos jovens.
Enviar correspondência para:
Dra. Maria das Graças Tavares do Carmo
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Nutrição Bloco J - 2º andar
21.9415.90 - Rio de Janeiro - Brasil
FAX: +55 21 280 8343
e-mail: tcarmo@editema.com.br
*Apoio: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
45
RESUMO
A Dieta Básica Regional (DBR) constitui a base da alimentação diária da população
desfavorecida da Zona da Mata de Pernambuco. A DBR corresponde a uma dieta
multideficiente e tem sido considerada como um modelo adequado para estudar os efeitos da
desnutrição materna e na prole. O objetivo foi avaliar os efeitos do consumo da DBR e da
reabilitação nutricional, durante os períodos críticos de crescimento e desenvolvimento de
ratos, sobre a evolução da sua massa corporal e tecidual, bem como o consumo alimentar de
mães durante a gestação e lactação e de seus filhotes até setenta dias de vida. Adicionalmente,
verificou-se o percentual dos ácidos graxos nas dietas experimentais e no leite materno.
Foram utilizados ratos Wistar, de ambos os sexos. Após a constatação da prenhez, as ratas
foram divididas em três grupos. 1) Grupo Controle (GC), animais alimentados com ração
comercial durante o período de gestação e lactação (mães e filhotes) e, após o desmame, os
filhotes até 70 dias de vida; 2) Grupo Desnutrido (GD), animais alimentados com ração DBR
durante o mesmo período descrito para o GC e 3) Grupo Recuperado (GR), animais
alimentados com ração DBR durante o período de gestação e lactação e, os filhotes após o
desmame, alimentados com ração comercial até 70 dias de vida. Os animais foram
monitorados diariamente, aferindo-se a massa corporal e consumo alimentar. Os filhotes com
70 dias de vida foram sacrificados por decapitação e o cérebro, coração, fígado e rins retirados
e pesados. Os animais receberam água e ração ad libitum e foram mantidos em biotério com
temperatura e luminosidade controladas. Os testes estatísticos utilizados foram o teste t
student, ANOVA e o pós-teste de Bonferroni. Encontramos alterações importantes no
percentual de ácidos graxos essenciais na DBR, assim como no leite materno das mães
desnutridas. O ganho de peso das mães desnutridas e de seus respectivos filhotes foi menor
que o de animais controle desde a lactação até o final do experimento. As fêmeas recuperadas
apresentaram valores de massa corporal estatisticamente semelhantes aos do grupo controle.
Os resultados sugerem que o comprometimento da massa corporal materna durante a lactação
e o déficit na taxa de crescimento dos filhotes foi devido a ingestão da dieta multideficiente-
DBR. A diminuição dos teores de ácidos graxos específicos do leite materno poderia, ainda
que não completamente, justificar o déficit de crescimento observado.
Termos de indexação: desnutrição, ácidos graxos, leite materno, ratos, Dieta Básica
Regional, taxa de crescimento.
46
ABSTRACT
The Regional Basic Diet (RBD), consumed by poor populations in the Northeastern
part of Brazil, is a multideficient diet and it has been considered an appropriate model to
study the malnutrition effects in dam and offspring. The aim was to evaluate the effects of
malnutrition and nutritional rehabilitation in rats in development in relation to the body and
tissue weight evolution, food intake of dam and offspring until 70 days of age. Additionally,
the percentage of fatty acids in experimental diets and maternal milk was verified. Wistar rats
of both sexes were used. After mating, pregnant rats were divided in three groups. 1) Control
group (CG) that during the pregnancy and lactation period (21 days each), mother plus litter
and, the offspring after weaning, were fed commercial lab chow 2) Malnourished group (MG)
that received RBD chow during the same period of CG and 3) Rehabilitated group (RG)
whose mothers during the pregnancy and lactation period received RBD and the offspring
after weaning received commercial lab chow up to 70 days of age. The animals received
water and food ad libitum and were maintained in a room with controlled temperature and
light. The animals were handled daily to obtain the body weight and food intake. At 70 days,
the offspring were killed by decapitation and the organs were extracted and weighed. The
results were analyzed using t student, one-way ANOVA and Bonferroni post hoc test. It has
been observed important alterations in essential fatty acid percentages in RBD, as well as,
maternal milk of malnourished rat. The increased in body weight of malnourished mother and
offspring was lower during the lactation period until the end of experiment. No differences in
body weight were found between females of rehabilitated and control groups. The results
suggest that the loss maternal body weight during lactation and growth rate deficit of
offspring due to multideficient-RBD diet intake may be, in part, brought about by decreased
maternal milk specific fatty acid levels that are essential for growth neonate.
Index Terms: malnutrition, fatty acid maternal milk, Regional Basic Diet, growth rate, rats.
Running title: Malnutrition, maternal milk and growth of juvenile rats.
47
INTRODUÇÃO
A desnutrição materna é um fator que contribui significativamente para os elevados
índices de mortalidade perinatal e infantil. De acordo com a Organização Mundial da Saúde e
a Organização Pan-Americana de Saúde, aproximadamente 174 milhões de crianças abaixo de
cinco anos são desnutridas e em muitos países como na África e no Sul da Ásia existe alta
prevalência de desnutrição em mulheres em idade reprodutiva. No Brasil, estima-se que o
número de desnutridos seja maior em áreas rurais, principalmente na região nordestina
(WHO, 2002). As conseqüências clínicas da desnutrição dependem de vários fatores,
incluindo o grau de severidade e a duração das deficiências nutricionais (Morgane et al.,
2002).
A ingestão materna de dietas nutricionalmente deficientes durante a gravidez e/ou
lactação ocasiona efeitos deletérios na prole (Kalter e Warkany, 1959; Zeman, 1967),
principalmente durante o desenvolvimento do Sistema Nervoso Central (Morgane et al.,
1993). Estudos mostraram que alimentar ratas durante a gravidez e lactação com dietas
deficientes em proteína diminui o tamanho da ninhada e a massa corporal de filhotes (Seegers,
1937; Curtiss, 1953; Nelson e Evans, 1953). Hipoplasia e atrofia de tecidos podem ocorrer na
deficiência protéico-energética (Robbins et al., 1986) e desta forma há diminuição do
tamanho corporal e de órgãos (Madi et al., 1975; Nunes et al., 2002). Muitos dos efeitos da
má nutrição pré-natal e pós-natal são permanentes, ainda que algum grau de melhoramento
possa ser produzido por exposição a diferentes estímulos, inclusive ambiental e nutricional
(Morgane et al., 1993).
A Dieta Básica Regional (DBR) constitui a base da alimentação diária da população
desfavorecida da Zona da Mata de Pernambuco. A DBR corresponde a uma dieta
multideficiente, pois contém cerca de 8% de proteínas dos quais a maior proporção é de
48
origem vegetal e 1% de lipídios. A DBR tem sido considerada um modelo adequado para
estudar os efeitos da desnutrição materna e na prole (Teodósio et al., 1990).
O crescimento e o desenvolvimento dos neonatos estão diretamente relacionados com a
qualidade e a quantidade do leite materno por eles consumido (Worthington-Roberts, 1997).
Entre os macronutrientes presentes no leite materno de várias espécies, os lipídios exercem
funções de grande relevância, fornecendo 50 a 60% do total de energia contido nesta fonte
alimentar essencial para o neonato. Triglicerídeos constituem 98% dos lipídios presentes,
enquanto fosfolipídeos 1% e colesterol e seus ésteres 0,5% (Nicholas e Hartmann, 1991;
Buison, 1997).
Os ácidos graxos (AG) que compõem os triglicerídeos do leite materno podem ter
distintas origens, tais como: dietética, síntese hepática, circulação (ácidos graxos livres
liberados do tecido adiposo após lipólise) ou síntese “de novo” pela glândula mamária.
Aproximadamente 30% dos AG do leite derivam diretamente da ingestão dietética (Lauritzen
et al., 2001; Anderson et al., 2005). Os AG sintetizados na glândula mamária são
principalmente de cadeia média (C10:0, C12:0 e C14:0) (Lauritzen et al., 2001) e
compreendem cerca de 10 a 12% do conteúdo total de AG do leite (Lauritzen et al., 2001;
Anderson et al., 2005). Este tipo de AG representa uma fonte energética de fácil absorção
para o lactente (Neville e Picciano, 1997). Dietas hipolipídicas e ricas em carboidratos
aumentam a síntese destes AG na glândula mamária (Lauritzen et al., 2001). Alguns dos
ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (AGPI-CL), tais como o araquidônico (AA,
C20:4 n-6) e o derivado do ácido graxo essencial α-linolênico, o ácido graxo
docosahexaenóico (DHA, C22:6 n-3), também são encontrados no leite, ainda que em menor
porcentagem (Makrides et al., 1995). Na maioria da população Ocidental a concentração
média de DHA no leite humano está entre 0,2 e 0,4% e este conteúdo é influenciado pela dieta
materna (Lauritzen et al., 2001). Esses ácidos graxos são necessários para o desenvolvimento
49
cerebral do neonato, pois participam da mielinização, da proliferação celular e da função
retiniana (Makrides et al., 1995; Lauritzen et al, 2001).
Não encontramos na literatura estudos demonstrando o perfil dos ácidos graxos no leite
de animais tratados com a DBR durante a gestação e lactação, neste sentido, o objetivo do
presente estudo foi avaliar os efeitos da desnutrição promovidos pelo consumo de DBR e da
reabilitação nutricional, durante a gestação, lactação e até 70 dias de vida pós-natal sobre a
evolução da massa corporal, da massa dos tecidos cerebrais, cardíacos, hepáticos e renais bem
como sobre o consumo alimentar de ratas gestantes e lactantes e de seus filhotes até setenta
dias de vida. Adicionalmente, verificou-se o percentual dos ácidos graxos nas dietas
experimentais e no leite materno.
50
MATERIAIS E MÉTODOS
Animais, dieta e procedimentos
Foram utilizados 118 ratos albinos de linhagem Wistar de ambos os sexos, provenientes
do biotério de roedores do Instituto de Nutrição da Universidade Federal do Rio de Janeiro
(UFRJ). A manipulação e o sacrifício dos animais seguiram as normas estabelecidas pela
Sociedade Brasileira de Neurociências e Comportamento (SBNeC) e foram aprovadas pela
comissão de uso de animais experimentais do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho.
Ratas jovens, nulíparas foram submetidas ao acasalamento com ratos de mesma linhagem e
origem. A provável prenhez das ratas foi detectada através da visualização de
espermatozóides na secreção vaginal e a partir deste momento as ratas receberam suas
respectivas rações. Os animais receberam água e ração ad libitum e foram mantidos em
biotério com temperatura de 24 ± 2ºC e ciclo claro-escuro de 12 em 12 horas.
As ratas grávidas foram subdivididas em três grupos experimentais, a saber: 1) Grupo
Controle (GC), animais alimentados com ração comercial (tabela 1) durante o período de
gestação e lactação (mães e filhotes) e, após o desmame, os filhotes até 70 dias de vida; 2)
Grupo Desnutrido (GD), animais alimentados com ração DBR durante o mesmo período
descrito para o GC e 3) Grupo Recuperado (GR), animais alimentados com ração DBR
durante o período de gestação e lactação e, os filhotes após o desmame, alimentados com
ração comercial até 70 dias de vida. Durante o período de ensaio, os animais foram
monitorados diariamente, aferindo-se a massa corporal e estimando-se o consumo alimentar
através da pesagem da ração antes e após a oferta ao o animal, calculando-se então a diferença
entre estes valores. Os filhotes com 70 dias de vida foram sacrificados por decapitação e o
cérebro, coração, fígado, rim direito e esquerdo foram retirados e pesados em balança digital
Coleman modelo PW-1100.
51
A Dieta Básica Regional (DBR), identificada através de inquérito de freqüência de
consumo alimentar, realizado pelo Setor de Nutrição Humana da Universidade Federal de
Pernambuco foi confeccionada no laboratório do Instituto de Nutrição da UFRJ, utilizando-se
como ingredientes a batata doce (Iponea batatas), feijão mulatinho (Phaseolus vulgaris),
farinha de mandioca (Manihot esculenta), carne seca (carne bovina salgada e prensada) e
gordura da própria carne (Teodósio et al., 1990). Os ingredientes (exceto a farinha de
mandioca) foram coccionados e em seguida secos (desidratados) em estufa com circulação de
ar (50-60ºC), durante aproximadamente 24 horas. Em seguida, foram moídos e
homogeneizados nas proporções indicadas na tabela 2, acrescentando-se também a gordura do
charque, que foi retirada antes do cozimento da carne. Deste modo, a carne foi coccionada,
seca e moída com o menor conteúdo possível de tecido adiposo. A gordura foi derretida e
acrescentada na proporção preconizada pela fórmula. Após os componentes em pó serem
homogeneizados, fez-se uma pasta, acrescentando-se aos poucos, 845±50 mL de água morna
(±40-50ºC) para o preparo de 1 kg de ração. A massa foi então processada em uma masseira
para obtenção de pequenos pedaços “pellets”. Os pellets assim obtidos permaneceram em
estufa com circulação de ar (50-60ºC) durante aproximadamente 24 horas até a sua secagem e
solidificação.
Inserir tabelas 1 e 2
Obtenção do leite materno
Aos 14 dias de lactação, as ratas lactantes do grupo controle e desnutrido foram
anestesiadas intraperitonealmente com pentobarbital sódico (30mg/Kg) e receberam ocitocina
através das narinas (1mL/Kg). O leite foi extraído por compressão manual das tetas,
acondicionado em tubos plásticos e estocado à -70ºC até a análise de seu conteúdo lipídico.
52
Análise dos Lipídios Totais na DBR e Leite Materno
Extração dos Lipídios Totais
Os lipídios totais foram extraídos segundo Bligh e Dyer, 1959. O leite e as dietas
experimentais foram pesados e homogeneizados com solução salina 0,9%. Ao homogenato
foram adicionados 2 mL de metanol e 1 mL de clorofórmio. Após agitação em intervalos de 5
em 5 minutos por um período de 2 horas, o homogenato foi centrifugado, durante 10 minutos,
à 3000rpm e o sobrenadante armazenado em geladeira. Ao precipitado resultante no tubo foi
adicionado novamente 2 mL de metanol, 1 mL de clorofórmio e 0,8 mL de água, agitado de 5
em 5 minutos por 1 hora e centrifugado durante 10 minutos à 3000rpm. O sobrenadante foi
extraído e misturado ao que permaneceu armazenado na geladeira, adicionado de 1 mL de
água e 1 mL de clorofórmio. Após agitação por 30 segundos e centrifugação por 30 minutos à
3000 rpm, a solução foi separada em 2 fases: fase aquosa e fase orgânica que contém os
lipídios totais. A fase orgânica foi extraída e seca sob corrente de nitrogênio. A amostra foi
então pesada.
Metilação dos Lipídios
A metilação foi feita partindo-se de uma alíquota das amostras de lipídios, do leite ou
das dietas experimentais, de acordo com a técnica descrita por Lepage e Roy (1986), que
preconiza o seu tratamento com uma solução de 2mL de metanol-benzeno (4:1v/v) e 200µL
de cloreto de acetila acrescentado sob leve agitação. A mistura final contendo os metil-ésteres
de ácidos graxos foi estocada em freezer para análise posterior em cromatógrafo a gás.
Cromatografia Gasosa
Os ácidos graxos metilados foram quantificados por cromatografia gasosa em um
cromatógrafo Perkin Elmer Autosystem XL, equipado com detector de chama ionizável,
53
ligado a um software Perkin Elmer Nelson - EUA. Os ácidos graxos foram separados em
coluna capilar SP-2330 (Supelco Inc., Bellefonte, PA) com 60mx0,32m de diâmetro interno.
Os ésteres foram identificados por comparação com seu tempo de retenção com padrões
conhecidos (Sigma, Supelco e Nuchek).
Análise Estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. A análise
estatística utilizada foi o teste t student para comparar as variáveis entre o grupo controle e
desnutrido e a análise de variância ANOVA de uma via para comparar os efeitos da
recuperação nutricional entre os grupos. Para a comparação entre as médias dos resultados foi
aplicado o pós-teste de Bonferroni, adotando-se como nível mínimo de significância o valor
de p<0,05.
54
RESULTADOS
Percentual de Ácidos Graxos nas Dietas Experimentais
Os resultados apresentados na tabela 3 correspondem ao percentual de ácidos graxos
nas dietas consumidas pelos diferentes grupos experimentais durante o período de estudo. Na
dieta DBR observa-se que o somatório da concentração relativa de ácidos graxos saturados e
monoinsaturados foi significativamente maior em relação a dieta controle. No entanto, em
relação aos ácidos graxos poliinsaturados, a DBR apresentou valores percentuais
significativamente menores. Observa-se também que o percentual do ácido graxo
poliinsaturado essencial da família n-3, alfa-linolênico, foi significativamente maior na DBR,
enquanto que os teores de ácido poliinsaturado essencial da família n-6, linoléico, foi
significativamente menor na dieta DBR. Isto pode ser explicado pelo fato de que a DBR
contém 18,34g de pó de feijão mulatinho que possui uma grande concentração do ácido graxo
alfa-linolênico, já a dieta comercial é preparada com óleo de soja que é rico em ácido
linoléico. Os ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa como o AA e DHA apresentaram
valores percentuais abaixo de 0,50% e os valores encontrados não foram estatisticamente
diferentes entre as dietas.
Inserir tabela 3
Consumo alimentar e massa corporal na gestação
A figura 1 apresenta os valores médios de consumo alimentar relativo (gramas de
ração/100gramas de massa corporal). Observa-se que as mães desnutridas apresentaram
consumo alimentar significativamente menor no primeiro e no último dia de gestação em
relação ao GC.
Inserir figura 1
55
Como conseqüência das poucas variações da ingestão alimentar materna entre os
grupos, a figura 2 mostra que não houve diferença significativa na massa corporal materna
entre o grupo controle e desnutrido durante a gestação.
Inserir figura 2
Consumo alimentar e massa corporal na lactação
Na figura 3 observa-se diminuição significativa no consumo alimentar relativo nos dias
1, 14 e 21 de lactação nas mães do grupo desnutrido em comparação as mães do grupo
controle (p<0,001). Como conseqüência observamos na figura 4 que durante todo o período
lactacional a massa corporal das mães do grupo desnutrido foi diminuindo gradativamente,
apresentando ao final da lactação perda de 31,6% do peso em relação as mães do grupo
controle.
Inserir figuras 3 e 4
Percentual de Ácidos Graxos no Leite Materno
Os valores apresentados na tabela 4 mostram que o leite das ratas desnutridas
apresentou maior percentual de ácidos graxos saturados de cadeia média (C10, 12 e 14) e no
somatório de saturados em relação ao leite do grupo controle. Não foi observada, entre os
grupos, diferença significativa no total de ácido graxo monoinsaturado e no ácido graxo
oléico. Com relação aos ácidos graxos poliinsaturados essenciais, observa-se diminuição
significativa, no leite das ratas desnutridas, dos ácidos graxos linoléico e α-linolênico em
relação ao GC. Quanto aos ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa, observa-se no leite
do GD percentuais significativamente aumentados de DHA (C22:6 n-3) e teores diminuídos
56
de AA (C20:4 n-6) em relação ao GC. O valor percentual total de poliinsaturados foi menor
no leite do GD em relação ao GC.
Inserir tabela 4
Massa Corporal da prole durante a amamentação (do nascimento até 21 dias de vida)
A partir do nascimento já é possível observar a diferença significativa na massa corporal
entre a prole do grupo desnutrido e controle, tanto nos machos (figura 5) quanto nas fêmeas
(figura 6).
Inserir Figuras 5 e 6
Consumo alimentar e massa corporal da prole, machos e fêmeas, dos grupos controle,
desnutrido e recuperado após o desmame (22 dias de vida) até 70 dias de vida pós-natal.
Machos
A figura 7 mostra que ao longo do período estudado, o consumo alimentar relativo dos
filhotes machos do grupo desnutrido foi significativamente maior em relação ao controle,
exceto aos 35 dias de vida. O grupo recuperado aumentou significativamente o consumo
alimentar em relação ao controle nos dias 35, 63 e 70 de vida pós-natal.
Inserir Figura 7
Os filhotes machos do grupo desnutrido apresentaram déficit ponderal significativo
quando comparado ao grupo controle e recuperado (figura 8). Os animais do grupo
57
recuperado apresentaram maior ganho de massa corporal que os animais desnutridos,
entretanto a massa corporal final desse grupo foi 28,9% menor que a do GC.
Inserir Figura 8
Fêmeas
A figura 9 mostra que os filhotes fêmeas do grupo desnutrido consumiram
relativamente maior quantidade de ração nos 56, 63 e 70º dia de vida pós-natal em relação ao
GC. O grupo recuperado consome menos ração que o grupo controle no 28, 42, 49 e 56º dia
pós-natal.
Inserir Figura 9
A figura 10 mostra que as fêmeas do grupo desnutrido apresentaram menor massa
corporal comparados ao controle e recuperado ao longo do período estudado. A partir dos 42
dias de vida o incremento na massa corporal do grupo recuperado foi semelhante ao do grupo
controle, exceto aos 56 dias de vida e esta situação foi mantida até o final do experimento. A
figura 11 é ilustrativa quanto a diferença do aspecto ponderal dos grupos estudados.
Inserir Figura 10
Inserir Figura 11
Massa total do cérebro, fígado, coração e rins da prole com 70 dias de vida
Os resultados apresentados na tabela 5 demonstram que a massa dos diferentes tecidos
nos filhotes machos do grupo desnutrido apresentou-se diminuída em comparação aos grupos
58
controle e recuperado. A massa correspondente ao cérebro, coração, fígado e rim direito e
esquerdo dos machos do grupo recuperado foi significativamente maior que o grupo
desnutrido, mas significativamente menor que o grupo controle, mostrando que a introdução
da dieta controle permite o aumento da massa, mas não o suficiente para se igualar ao grupo
controle. Quando avaliamos a massa relativa dos tecidos, observamos que somente o cérebro
e o coração dos machos do grupo desnutrido apresentam massa significativamente maior que
o grupo controle e recuperado. Nos demais órgãos não ocorreram diferenças significativas
entre o grupo controle e recuperado.
Inserir tabela 5
Com relação as fêmeas, similarmente aos machos, os resultados apresentados na tabela
6 mostram que a massa dos diferentes tecidos do grupo desnutrido apresentou-se inferior em
comparação aos valores respectivos dos grupos controle e recuperado. A massa dos tecidos
das fêmeas recuperadas foi significativamente maior que o grupo desnutrido, porém menor
que o grupo controle. Entretanto, a massa cerebral das fêmeas recuperadas foi igual,
estatisticamente, ao grupo controle. A massa dos órgãos das fêmeas do grupo recuperado
quando corrigido pela massa corporal, não diferiu significativamente dos valores do grupo
controle.
Inserir Tabela 6
59
DISCUSSÃO
Com a finalidade de avaliar experimentalmente os efeitos da desnutrição nas mães e
suas respectivas proles sobre aspectos ponderais (corporal e tecidual), bem como sobre o
conteúdo de ácidos graxos do leite produzido, administramos durante a gestação, lactação e
após o desmame até 70 dias de vida a DBR, uma dieta multideficiente não somente em
proteína, como também em lipídios, vitaminas e minerais. A DBR é considerada uma dieta
isocalórica (Teodósio et al., 1990; Monteiro et al., 2001), devido ao seu elevado conteúdo de
carboidratos que compensa a redução energética devido a menores teores de lipídeos e
proteínas (tabelas 1 e 2), sugerindo assim um modelo de restrição nutricional qualitativo e não
calórico, similar ao que ocorre na Zona da Mata do Nordeste brasileiro (Teodósio et al.,
1990). Além disso, quando avaliamos a composição dos ácidos graxos da Dieta Básica
Regional (DBR), constatamos que além do reduzido conteúdo lipídico, esta dieta apresenta
uma composição de ácidos graxos que não satisfaz as necessidades do feto e/ou neonato em
desenvolvimento, apresentando menores percentuais de ácidos graxos poliinsaturados e
elevadas proporções de ácidos graxos saturados (tabela 3). Os ácidos graxos poliinsaturados
são necessários para adequada função tecidual e ótimo crescimento e desenvolvimento do
neonato (Sellmayer e Koletzko, 1999).
Em concordância com os resultados de Teodósio e cols. (1990), as ratas desnutridas
desse estudo apresentaram ao longo do período gestacional pouca variação na ingestão
alimentar (figura 1) e, portanto, o incremento no ganho de massa corporal (figura 2) foi
semelhante ao do controle. É provável que isto se deva também ao fato da DBR ter sido
introduzida no 1º dia de prenhez, ou seja, quando as reservas maternas de gordura
armazenadas no tecido adiposo ainda estavam preservadas, o que difere do estudo de Langley
e cols. (1994) que introduziram a dieta hipoprotéica antes mesmo do acasalamento e durante a
prenhez das ratas. Entretanto, durante o período lactacional detectamos redução significativa
60
na ingestão alimentar e na massa corporal das ratas lactantes tratadas com DBR em relação ao
grupo controle (figuras 3 e 4). Como conseqüência, os filhotes das mães alimentadas com a
DBR durante a gestação e lactação apresentaram taxa de crescimento significativamente
menor durante todo o período da lactação em relação aos filhotes de mães controles (figuras 5
e 6), sugerindo que a depleção nutricional durante a lactação foi mais prejudicial do que na
gestação e interferiu de forma significativa no crescimento da prole.
Em estudo abordando os efeitos de diferentes concentrações de proteína dietética na
alimentação de ratas foi observado que após o parto, as ratas do grupo controle apresentavam
30g a mais de peso corporal que na época da concepção, enquanto as malnutridas
apresentaram perda de peso (Marín, 1995). De fato, prévios estudos sugerem que a ingestão
dietética materna é de grande importância no período lactacional, tanto para a saúde da mãe
quanto para a performance lactacional e crescimento das crias (Baker, 1979). Ratas no pico da
lactação (12-14 dias da lactação) mobilizam gordura corporal e proteínas de reserva,
acumuladas durante a gestação, para ajudar a manter as necessidades energéticas desse
período (Pine, 1994). A mobilização das proteínas de reserva materna, durante a lactação, é
uma alternativa para melhorar o desempenho lactacional principalmente sob condições de
inadequada ingestão de nutrientes pela dieta (Pine, 1994). Neste período, grande parte da
energia e dos nutrientes de reserva materna está disponível para manter a produção de leite
(Picciano, 1996; Araya e Barriga, 1996). A restrição alimentar diminui a quantidade de leite
produzido e a taxa de crescimento de suas crias (Rasmussen, 1998).
As dietas nutricionalmente deficientes durante a lactação também podem alterar a
composição do leite e repercutir no desenvolvimento do lactente. Reconhecendo a
importância dos lipídios no período perinatal, dada a sua essencialidade para funções
estruturais e regulatórias (Innis, 2004), nos propusemos a analisar a composição dos ácidos
graxos do leite de ratas lactantes alimentadas com a DBR. Em geral, as concentrações dos
61
ácidos graxos no leite refletem a composição desses ácidos graxos na dieta materna (Neville e
Picciano, 1997). Vários trabalhos apontam que dietas ricas em carboidratos favorecem a
síntese de ácidos graxos de cadeia média na glândula mamária (Lauritzen et al., 2001). De
maneira similar, no presente estudo o leite secretado pelas ratas desnutridas, que consumiram
uma dieta rica em carboidratos e hipolipídica, apresentou composição em ácidos graxos
diferente daquela de mães controles por conter teor mais elevado de ácidos graxos de cadeia
média (C10:0, C12:0 e C14:0) e menores proporções de ácidos graxos poliinsaturados da
família n-6 essenciais e de cadeia longa como o ácido araquidônico (tabela 4).
Estas diferenças na composição dos ácidos graxos saturados de cadeia média são
favoráveis ao neonato por fornecerem maiores teores de ácidos graxos rapidamente
absorvíveis e combustíveis facilmente oxidados (Neville e Picciano, 1997) o que de certa
forma, entre outros fatores, poderia garantir a sobrevivência da prole frente a esta situação de
grave depleção nutricional. No entanto, os ácidos graxos polienóicos de cadeia longa,
principalmente o araquidônico, necessário para o crescimento (Makrides et al., 1995;
Lauritzen et al, 2001) apresentou-se severamente depletado no leite do grupo desnutrido.
Estes dados nos permitem sugerir, portanto, que o déficit de crescimento observado nos filhotes
do GD ocorreu, pelo menos em parte, por alteração na proporção de araquidônico no leite dessas
mães, ocasionando menor disponibilidade desse ácido graxo para o neonato.
Por outro lado, os AGPI-CL n-3 como o ácido docosahexaenóico (C22:6 n-3 DHA),
apresentaram-se em maior porcentagem no leite da rata desnutrida em relação ao da rata
controle. DHA é essencial para o crescimento e desenvolvimento funcional do cérebro dos
neonatos (Makrides et al., 1995; Lauritzen et al, 2001; Marszalek e Lodish, 2005). No
presente estudo, as ratas desnutridas consumiram 20,89±0,88g de DBR na última semana de
amamentação (figura 3), isto significa dizer que a ingestão diária de DHA foi de 0,042%, já o
grupo controle consumiu 0,24% de DHA em 77,22±1,69g de ração comercial, entretanto a
62
porcentagem de DHA no leite da rata desnutrida foi maior que a do leite da rata controle. É
provável que os triglicerídeos armazenados no tecido adiposo materno durante a gestação,
contendo DHA, tenham sido mobilizados devido a intensa lipólise, sendo então liberados para
a glândula mamária e disponibilizados ao neonato através do leite. Considerando que o DHA
pode ser formado a partir do ácido graxo essencial α-linolênico, através das vias enzimáticas
de dessaturação e alongamento, principalmente hepática, é possível que a maior proporção do
ácido graxo α-linolênico (C18:3 n-3) verificada na DBR em relação à ração comercial,
11,44% e 2,87%, respectivamente (tabela 3), ao ser dessaturado e alongado no tecido hepático
também poderia contribuir para o suprimento de DHA para o leite das ratas desnutridas.
Análises complementares, como por exemplo da atividade das enzimas dessaturases no fígado,
são necessárias para melhor elucidar estes achados.
Quando avaliamos a prole de machos e fêmeas após o desmame até a idade jovem (70
dias) observamos que os filhotes, machos e fêmeas, de mães desnutridas que receberam a
DBR, apesar de consumirem quantitativamente mais ração que o grupo controle (figuras 7 e
9) não recuperaram a massa corporal ao longo do período do estudo (figura 8 e 10),
apresentando um déficit na massa corporal significativo na idade jovem em relação aos
grupos controle e recuperado (figura 11). De maneira similar, a massa tecidual também foi
significativamente afetada (tabelas 5 e 6). De modo que os machos desnutridos deste estudo
apresentaram perda de 86,8% na massa do fígado (tabela 5) com redução de 86,9% na massa
corporal (figura 8). Estes achados diferem dos de Boza e cols. (1999) que observaram valores
30% menores no peso do fígado e 14,5% na massa corporal na desnutrição causada pela
restrição dietética. Observa-se que na análise da massa de tecidos por 100 gramas de massa
corporal, o cérebro e o coração dos machos do grupo desnutrido apresentaram maior peso
comparativamente ao grupo controle e recuperado, mostrando que a desnutrição preserva a
massa de órgãos com função primordial como já havia sido descrito por Parra e cols. (1995),
63
de modo que na desnutrição há, prioritariamente, perda de massa hepática para garantir a
disponibilidade de energia aos órgãos mais vitais como o cérebro e o coração.
No grupo recuperado, os machos apresentaram incremento gradativo na massa corporal
durante a recuperação nutricional (figura 8), sem que houvesse grandes variações no consumo
alimentar em relação ao grupo controle (figura 7). Comportamento semelhante foi observado
no estudo de Nunes e cols. (2002) os quais acompanharam os animais até 30 dias de idade. A
persistência de diferenças na massa corporal em relação ao grupo controle, mesmo após
reabilitação nutricional, por tempo mais prolongado, também foi observada por outros
pesquisadores, em ratos machos na idade de 90 dias (Sharma et al., 1990) e 120 dias (Campos
e Madi, 1975). Estes resultados não surpreenderam, visto que o déficit de massa corporal
induzido pela restrição protéica em fase de crescimento rápido não consegue ser
completamente restabelecido por uma dieta normal (Ventrucci et al., 2004). Além disso,
observamos alterações na massa absoluta dos órgãos, no entanto, em termos proporcionais a
massa do cérebro (g/100g massa corporal) foi preservada nas fêmeas do grupo recuperado
(tabela 6), confirmando estudos anteriores que sugerem a existência de mecanismos capazes
de proteger tecidos essenciais como o cérebro (Parra et al., 1995).
No trabalho de Nunes e cols. (2002) não foi verificada diferença significativa entre
machos e fêmeas em relação a massa corporal, após a reabilitação nutricional, de modo que
para ambos os gêneros essa variável foi significativamente menor em relação ao grupo
controle. No entanto, os resultados do presente estudo com a DBR mostram que
diferentemente do que ocorre com os machos, as fêmeas recuperadas apresentaram menor
consumo alimentar (figura 9) e incremento na massa corporal que estatisticamente se
assemelham ao do grupo controle a partir do 42º dia de vida, exceto aos 56 dias (figura 10). Já
com relação a massa dos órgãos aos 70 dias, nota-se que em termos proporcionais a massa de
todos os órgãos não diferiram das respectivas do grupo controle (tabela 6), incluindo o
64
cérebro. Seria interessante realizar estudo posterior neste modelo experimental para avaliar a
composição corporal. Com a determinação do conteúdo de gordura e proteína da carcaça seria
possível obter uma melhor compreensão acerca da compartimentalização da massa corporal
das fêmeas do presente estudo no sentido dos percentuais de massa gorda e magra.
Em conclusão, os resultados do presente estudo sugerem que a desnutrição durante o
período pré e pós-natal promovida pela Dieta Básica Regional (DBR) compromete a massa
corporal materna durante a lactação e repercute em notório déficit na taxa de crescimento dos
filhotes lactentes, o que, entre outros fatores, poderia ser devido a uma redução no conteúdo
ou alteração da proporção entre os diferentes tipos de ácidos graxos do leite materno,
principalmente araquidônico, reconhecidos essenciais para o crescimento do neonato. Além
disso, a reabilitação nutricional iniciada após o desmame produz efeitos diferentes na massa
corporal e de órgãos dos filhotes, machos e fêmeas na idade jovem, sendo estes parâmetros
mais comprometidos nos filhotes machos do que nas fêmeas. Estes resultados reforçam o
conceito que a restrição nutricional qualitativa durante o período perinatal altera em idades
mais tardias o desenvolvimento da prole e de maneira diferenciada entre os sexos.
AGRADECIMENTOS
Ao PIBIC/CNPq/UFRJ e CAPES pelas bolsas concedidas às alunas de Iniciação
Científica e Mestrado, respectivamente.
65
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TEODÓSIO, N. R.; LAGO, E. S.; ROMANI, S. A. M.; GUEDES, R. C. A. A Regional Basic
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93, p. 167-173, 1967.
68
Tabelas e Gráficos
Tabela 1: Composição percentual da Ração Comercial.
Dieta Comercial Proteína Carboidrato
Lipídio Mineral Fibra Kcal
100g 23% 50,44% 5% 10% 10% 338,76
Fonte: PURINA®
Tabela 2: Ingredientes e composição centesimal da Dieta Básica Regional.
Dieta Básica Regional
(DBR)
g% Proteína
(g)
Carboidrato
(g)
Lipídio
(g)
Mineral
(g)
Fibra
(g)
Kcal
Feijão Mulatinho 18,34 3,99 10,66 0,24 0,57 1,09 60,76
Farinha de Mandioca 64,81 0,84 48,59 0,12 0,43 5,64 198,80
Carne Seca 3,74 2,74 0,43 0,06 0,06 0,00 13,22
Gordura da Carne Seca 0,35 0,00 0,00 0,35 0,00 0,00 3,15
Batata Doce 12,76 0,30 9,99 0,03 0,20 0,48 41,43
Total 100,00
7,87 69,67 0,80 1,26 7,21 317,36
Fonte: Teodósio et al., 1990.
69
Tabela 3: Composição percentual de ácidos graxos das dietas experimentais.
( ) – quantidade de dietas utilizadas. nd – não detectado. AA – ácido araquidônico. EPA –
ácido eicosapentaenóico. DHA – ácido docosahexaenóico. Valores representam a média ±
erro padrão da média. * p≤0,05 e ** p≤0,001 em relação a dieta comercial segundo o teste t.
Dieta Comercial (5) Dieta Básica Regional (DBR) (6)
C10:0 nd 0,22±0,02
C12:0 0,13±0,01 0,49±0,04**
C13:0 0,12±0,01 0,61±0,06*
C14:0 3,13±0,30 5,38±0,54*
C15:0 0,69±0,06 1,50±0,10
C16:0 19,63±0,31 23,07±0,66**
C17:0 0,14±0,01 0,45±0,04*
C18:0 3,54±0,13 8,02±0,41**
C23:0 nd 0,20±0,02
Total saturados 27,41±0,85 39,37±0,78**
C14:1 0,61±0,06 0,59±0,05
C16:1 0,68±0,06 1,44±0,10*
C17:1 nd 0,24±0,02
C18:1 n-9 trans 0,36±0,03 0,43±0,04
C18:1 n-9 cis 20,87±1,01 23,85±0,80*
C18:1 n-9 isômero nd 0,14±0,01
C24:1 n-9 nd 0,08±0,00
Total monoinsaturados 22,52±1,28 25,96±0,78*
C18:2 n-6 cis 45,48±1,15 19,66±0,85**
C18:3 n-6 0,13±0,01 0,23±0,02**
C20:2 n-6 2,87±0,20 nd
C20:4 n-6 AA 0,31±0,03 0,44±0,04
C22:4 n-6 nd 0,09±0,00
Total n-6 46,39±1,36 20,38±0,90**
C18:3 n-3 2,87±0,09 11,44±0,57**
C20:3 n-3 nd nd
C20:5 n-3 EPA 0,16±0,01 0,48±,05**
C22:5 n-3 0,21±0,02 0,16±0,01*
C22:6 n-3 DHA 0,31±0,03 0,20±0,02
Total n-3 3,44±0,07 12,25±0,57**
C18:2 n-6/C18:3 n-3 15,91±0,39 1,75±0,13**
n-6/n-3 13,49±0,19 1,69±0,11**
Total poliinsaturados 49,82±1,43 32,63±1,09**
70
Tabela 4: Percentual de ácidos graxos no leite de ratas com 14 dias de lactação.
CONTROLE (3) DESNUTRIDO (4)
C10:0 nd 3,44±0,32
C11:0 0,16±0,02 nd
C12:0 2,82±0,18 6,28±0,39***
C13:0 0,13±0,01 nd
C14:0 9,61±0,91 17,68±1,15**
C15:0 0,14±0,01 0,22±0,01**
C16:0 17,12±0,26 28,22±2,05**
C17:0 0,89±0,09 0,28±0,02***
C18:0 5,22±0,50 9,11±0,99*
C22:0 0,28±0,03 nd
Total saturados 39,37±2,96 65,23±1,91***
C14:1 3,15±0,10 4,89±0,49*
C15:1 nd nd
C16:1 0,20±0,01 1,61±0,08***
C17:1 0,18±0,02 0,28±0,02*
C18:1 n-9 cis 20,31±2,00 19,72±1,90
C20:1 n-9 0,10±0,01 nd
C22:1 n-9 nd nd
C24:1 n-9 0,11±0,01 nd
Total monoinsaturados 24,01±2,07 26,43±2,73
C18:2 n-6 cis 29,92±1,00 5,47±0,53***
C18:3 n-6 0,20±0,00 nd
C20:2 n-6 0,73±0,05 nd
C20:4 n-6 AA 1,81±0,04 0,63±0,06***
C22:4 n-6 0,59±0,06 nd
Total n-6 33,00±0,85 6,14±0,63***
C18:3 n-3 1,98±0,20 0,07±0,00***
C20:5 n-3 EPA 0,18±0,01 nd
C22:5 n-3 0,28±0,01 nd
C22:6 n-3 DHA 0,40±0,05 2,12±0,30***
Total n-3 2,84±0,30 2,19±0,29
C18:2 n-6/C18:3 n-3
15,80±1,60 78,14±6,90***
n-6/n-3
11,62±1,18 1,92±0,19***
Total poliinsaturados 35,84±1,09 8,33±0,86***
( ) – quantidade de animais utilizados. nd – não detectado. AA – ácido araquidônico. EPA –
ácido eicosapentaenóico. DHA – ácido docosahexaenóico. Valores representam a média ±
erro padrão da média. * p≤0,05, ** p≤0,01 e *** p<0,001 em relação ao grupo controle
segundo o teste t.
71
Tabela 5: Efeito da ingestão das diferentes dietas experimentais sobre a massa do
cérebro, do coração, do fígado e rins nos filhotes machos com 70 dias de vida.
Tecidos
Controle (17) Desnutrido (15) Recuperado (14)
Cérebro (g) 1,716±0,038
a
1,193±0,037
b
1,566±0,032
c
Cérebro (g/100gMC) 0,65±0,010
a
3,46±0,009
b
0,84±0,014
c
Coração (g) 1,071±0,030
a
0,237±0,015
b
0,708±0,029
c
Coração (g/100gMC) 0,41±0,012
a
0,69±0,008
b
0,38±0,017
a
Fígado (g) 11,944±0,591
a
1,574±0,087
b
7,138±0,419
c
Fígado (g/100gMC) 4,53±0,317
a
4,56±0,009
a
3,81±0,213
a
Rim Direito (g) 1,004±0,032
a
0,182±0,011
b
0,750±0,043
c
Rim Direito (g/100gMC) 0,38±0,017
a
0,53±0,003
a
0,40±0,018
a
Rim Esquerdo(g) 1,002±0,036
a
0,173±0,010
b
0,730±0,038
c
Rim Esquerdo (g/100gMC) 0,38±0,016
a
0,50±0,002
a
0,39±0,015
a
g – gramas, g/100gMC – gramas de tecido por 100 gramas de massa corporal, ( ) -
quantidade de animais utilizados. Os valores estão expressos como média ± erro padrão da
média. Letras diferentes na mesma linha representam valores estatisticamente diferentes com
p<0,05 determinado pelo pós-teste de Bonferroni.
72
Tabela 6: Efeito da ingestão das diferentes dietas experimentais sobre a massa do
cérebro, do coração, do fígado e rins nos filhotes fêmeas com 70 dias de vida.
Tecidos
Controle (14) Desnutrido (17) Recuperado (17)
Cérebro (g) 1,512±0,045
a
1,139±0,035
b
1,470±0,021
a
Cérebro (g/100gMC) 0,74±0,019
a
3,3±0,014
b
0,76±0,011
a
Coração (g) 0,788±0,025
a
0,207±0,008
b
0,661±0,057
c
Coração (g/100gMC) 0,39±0,012
a
0,60±0,002
b
0,34±0,026
a
Fígado (g) 8,337±0,322
a
1,473±0,048
b
7,064±0,505
c
Fígado (g/100gMC) 4,08±0,029
a
4,26±0,003
a
3,66±0,075
a
Rim Direito (g) 0,800±0,018
a
0,169±0,005
b
0,666±0,052
c
Rim Direito (g/100gMC) 0,39±0,006
a
0,49±0,001
a
0,35±0,017
a
Rim Esquerdo(g) 0,765±0,021
a
0,155±0,004
b
0,630±0,051
c
Rim Esquerdo (g/100gMC) 0,37±0,008
a
0,45±0,001
a
0,33±0,012
a
g – gramas, g/100gMC – gramas de tecido por 100 gramas de massa corporal, ( ) –
quantidade de animais utilizados. Os valores estão expressos como média ± erro padrão da
média. Letras diferentes na mesma linha representam valores estatisticamente diferentes com
p<0,05 determinado pelo pós-teste de Bonferroni
73
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1 7 14 21
Dias Gestacionais
g de ração/100g de massa corporal
Controle
Desnutrido
Figura 1: Consumo alimentar (g de ração/100g de massa corporal) de mães durante o
período de gestação. Os valores estão expressos como média ± erro padrão da média. * p<
0,05 em relação ao grupo controle segundo o teste t.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
1 7 14 21
Dias Gestacionais
Massa Corporal (g)
Controle
Desnutrido
Figura 2: Evolução ponderal das mães durante o período de gestação. Os valores estão
expressos como média ± erro padrão da média. Não houve diferença estatística em relação ao
grupo controle p>0,05.
*
*
74
0
5
10
15
20
25
30
35
1 7 14 21
Dias de Lactação
g de ração/100g de massa corporal
Controle
Desnutrido
Figura 3: Consumo alimentar (g de ração/100g de massa corporal) de mães durante o
período de lactação. Os valores estão expressos como média ± erro padrão da média. *
p≤0,001 em relação ao grupo controle segundo o teste t.
0
50
100
150
200
250
300
1 7 14 21
Dias de Lactação
Massa Corporal (g)
Controle
Desnutrido
Figura 4: Evolução ponderal das mães durante o período de lactação. Os valores estão
expressos como média ± erro padrão da média. * p≤0,05 e ** p≤0,001 em relação ao grupo
controle segundo o teste t.
*
*
*
*
**
**
**
75
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
1 7 14 21
Dias de Vida
Massa Corporal (g)
Controle
Desnutrido
Figura 5: Evolução ponderal de filhotes machos do 1 aos 21 dias de vida pós-natal de
mães que foram alimentadas com a DBR e ração comercial. Os valores estão expressos
como média ± erro padrão da média. * p≤0,01 e ** p≤0,001 em relação ao grupo controle
segundo o teste t. DBR - Dieta Básica Regional.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
1 7 14 21
Dias de Vida
Massa Corporal (g)
Controle
Desnutrido
Figura 6: Evolução ponderal de filhotes fêmeas do 1 aos 21 dias de vida pós-natal de
mães que foram alimentadas com a DBR e ração comercial. Os valores estão expressos
como média ± erro padrão da média. * p≤0,01 e ** p≤0,001 em relação ao grupo controle
segundo o teste t. DBR - Dieta Básica Regional.
*
**
**
**
*
**
**
**
76
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
28 35 42 49 56 63 70
Dias
g de ração/100g de massa corporal
Controle
Desnutrido
Recuperado
Figura 7: Consumo alimentar (g de ração/100g de massa corporal) de filhotes machos
com 28 aos 70 dias de vida pós-natal alimentados com as diferentes dietas
experimentais. Os valores estão expressos como média ± erro padrão da média. Letras
diferentes representam valores estatisticamente diferentes com p<0,05 determinado pelo pós-
teste de Bonferroni.
0
50
100
150
200
250
300
28 35 42 49 56 63 70
Dias
Massa Corporal (g)
Controle
Desnutrido
Recuperado
Figura 8: Evolução ponderal de filhotes machos com 28 aos 70 dias de vida pós-natal
alimentados com as diferentes dietas experimentais. Os valores estão expressos como
média ± erro padrão da média. Letras diferentes na mesma linha representam valores
estatisticamente diferentes com p<0,05 determinado pelo pós-teste de Bonferroni.
a
b
ab
a
b
a
a
b
ab
a
b
a
a
a
b
a
b
b
a
b
c
a
b
c
a
b
c
a
b
c
a
b
c
a
b
c
a
b
c
a
b
c
77
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
28 35 42 49 56 63 70
Dias
g de ração/100g de massa corporal
Controle
Desnutrido
Recuperado
Figura 9: Consumo alimentar (g de ração/100g de massa corporal) de filhotes fêmeas
com 28 aos 70 dias de vida pós-natal alimentadas com as diferentes dietas experimentais.
Os valores estão expressos como média ± erro padrão da média. Letras diferentes representam
valores estatisticamente diferentes com p<0,05 determinado pelo pós-teste de Bonferroni.
0
50
100
150
200
250
28 35 42 49 56 63 70
Dias
Massa Corporal (g)
Controle
Desnutrido
Recuperado
Figura 10: Evolução ponderal de filhotes fêmeas com 28 aos 70 dias de vida pós-natal
alimentadas com as diferentes dietas experimentais. Os valores estão expressos como
média ± erro padrão da média. Letras diferentes representam valores estatisticamente
diferentes com p<0,05 determinado pelo pós-teste de Bonferroni.
a
ab
b
a
b
c
a
a
b
a
a
b
a
b
c
a
b
b
a
b
a
a
b
c
a
b
c
a
b
a
a
b
a
a
b
c
a
b
a
a
b
a
78
Figura 11: Filhotes machos com 45 dias de vida pertencentes aos três grupos
experimentais. Animal controle (superior), animal recuperado (centro) e animal desnutrido
(inferior).
79
The Multideficient Regional Brazilian Diet: Brain Fatty Acid Profiles and Learning
Performance in Malnourished and Rehabilitated Young Rats
Authors:
1
Amanda Santos de SOUZA,
2
Luciana da Câmara PACHECO,
2
Priscila da Silva
CASTRO,
2
Jan Nora HOKOÇ,
3
Mônica Santos ROCHA,
1
Maria das Graças TAVARES DO
CARMO
1
Laboratório de Bioquímica Nutricional, Instituto de Nutrição Josué de Castro,
2
Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho,
3
Departamento de Farmacologia - Universidade Federal do
Rio de Janeiro.
Send correspondence to:
Dra. Maria das Graças Tavares do Carmo
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Nutrição Bloco J - 2º andar
21.9415.90 - Rio de Janeiro - Brazil
FAX: +55 21 280 8343
E-mail adress: tcarmo@editema.com.br
Supported by: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
80
ABSTRACT
This study tested the effects of malnutrition and nutritional rehabilitation on brain fatty
acid composition, the learning and memory performance in young rats. Pregnant and lactating
Wistar rats were either fed ad libitum a commercial lab chow or a multideficient diet of
Northeast of Brazil (RBD). Since weaning until day 70, control offspring continued on
commercial diet (Control group), while the RBD offspring either continued on multideficient
diet (RBD group) or switched to control diet (Rehabilitated group). The behavior of the
offspring (age, 42-70 days) was tested in the passive avoidance procedure and in the Morris
water maze. On day 70 postnatal life, the composition of fatty acids in total lipids of frontal
cortex, hippocampus and cerebellum was assessed by gas-liquid chromatography. The data
suggest that a multideficient diet with an extreme imbalance of dietary (n-6):(n-3) fatty acids
and other deficiency in essential nutrients may interfere with learning ability in young rats and
that nutritional rehabilitation results in partial restoration of the fatty acid profiles and in the
cognitive deficit with different responses in male and female young rats.
KEYWORDS: brain fatty acids, malnutrition, nutritional rehabilitation, Regional Basic Diet
(RBD), passive avoidance, Morris water maze, rats.
81
INTRODUCTION
The long-chain polyunsaturated fatty acid (LC-PUFA) docosahexaenoic (DHA) and
arachidonic (AA) are derived from the α-linolenic (αLA; 18:3n-3) and linoleic (LA; 18:2n-6)
fatty acids (FA), respectively, through a series of shared metabolic pathways involving
desaturation and subsequent chain elongation. These LC-PUFAs are fundamental components
of the structural membrane lipids of the brain. Linoleic (LA; 18:2n-6) and α-linolenic acids
(αLA; 18:3n-3) are called essential fatty acids (EFA) because they cannot be synthesized de
novo by animals, and must, therefore, be provided by the diet (1,2,3). The brain is an organ
generally well protected against external blood-borne influences, but the cerebral fatty acid
composition can be extensively modulated by dietary lipids (4,5).
The influences of dietary PUFA composition are, however, not restricted to structural
changes in the plasma membranes but can also be reflected in behavioral and cognitive
functionings (6,7). Long chain n-3 PUFA supplementation to laboratory animals has been
demonstrated to improve spatial learning capacity. Providing rats with n-3 PUFAs resulted in
a lower percentage of rats unable to locate the escape platform in the Morris water maze and
shorter escape latencies indicative of improved working memory, when compared to control
animals (8). Long-term n-3 fatty acid deficiency in the presence of n-6 fatty acids has been
shown to affect learning behavior (2,3). The n-6 fatty acids are also important in proper brain
function because they affect neurotransmitter release and they also influence the ability of
neurons to use glucose (9). Therefore, the dietary (n-6):(n-3) ratio as well as the absolute
amounts of these fatty acids in the diet are important during development.
The Regional Basic Diet (RBD) experimental model was utilized in the present study.
RBD is a multideficient diet which was found to be insufficient in content and quality of
proteins, fat, vitamins and minerals compared to the average diet, as determined by a
82
nutritional survey. This diet is consumed by some rural communities in the northeastern part
of Brazil and produces in rats a type of malnutrition similar to that prevalent among children
in this region, namely an association with nutritional dwarfism, with some clinical signs of
marasmus (10).
The RBD is very low fat and no previous studies were undertaken to analyze its
composition effects of RBD and nutritional rehabilitation in profile of fatty acids in regions of
the brain related to learning and memory and to associate it with behavioral tests in rats. Thus,
the aim of the present work was to assess the composition of fatty acids in total lipids of
frontal cortex, hippocampus and cerebellum and to compare it to behavioral tests.
83
MATERIALS AND METHODS
Animals, diets and general procedures
Wistar rats originated from the colony of the Instituto de Nutrição Josué de Castro of
Universidade Federal do Rio de Janeiro (Brazil) were used. Virgin mature female rats were
mated with males and kept in single cages, maintained under standard laboratory conditions
(24 ± 2ºC and a 12:12-h light-dark cycle) and provided with water and chow ad libitum.
Pregnancy was assumed to have been established when sperm was found in vaginal secretion.
The day following the night of mating was considered day zero of pregnancy and at this
moment the female rats were divided according to the diet employed during pregnancy and
lactation: nourished group - control group (CG) - the rats received the control diet with 23%
of protein and 5% of lipids (Purina of Brazil Ltda); and malnourished group - the rats received
the Regional Basic Diet - RBD with 7.8% protein and 0.8% lipid. The composition of RBD is
shown in Table 1. Given its higher carbohydrate content, the RBD is considered to be an
isocaloric diet since its caloric adequacy was found to be comparable to that of the
commercial control diet (10). The fatty acid composition of the diets is summarized in Table
2. After weaning (22 days after birth), female and male offspring from each group was
subdivided according to nutritional treatment: the control offspring continued on nutritionally
adequate diet (Control group) until the day of experiment, while the RBD offspring either
continued on the multideficient diet (RBD group) or were switched to the control diet
(Rehabilitated group). Body weights were determined and the behavior of the offspring (42-
70 days of age) was tested in the passive avoidance apparatus and in the Morris water-maze.
On day 70 postnatal life, the composition of fatty acids in total lipids of frontal cortex,
hippocampus and cerebellum was assessed by gas-liquid chromatography.
[Insert Tables 1 and 2 about here]
84
Passive avoidance
At the 42 days of life, the animals were tested using a modification of the step-down
passive avoidance procedure (11). The apparatus consisted of a steel box (20x30cm) featuring
a grid floor made of steel rods (3 mm in diameters, spaced 1cm apart), where a foot shock
(0.6mA for 3s) could be delivered. A rectangular steel platform (8x20cm, 15mm high) was
beside the grid floor. On the first day, the animals were placed in the box for 2 min for them
to explore and to get used to the new environment. After 24h, on the second day, rats were
placed on the platform and the latency to step down to the grid floor with all four paws was
measured. When the rats stepped down, the electric shock was delivered to the grid floor and
the rats immediately returned to the platform, where they remained for 10s (time necessary
since the rats had to learn avoiding the footshock), returning to the home cage. Animals that
did not step down to the platform for a period of 20s were discarded from the experiment. On
the third day, the retention test was performed 24h after the training trial using the same
procedure and step-down latencies were measured (maximum 120s) and no shock was
applied.
Morris water maze
At the 50 days of life, spatial memory was tested using a modified version of the Morris
water maze, in which rats learned to escape from opaque water onto a hidden platform (12).
The maze consisted of a polypropylene circular recipient (1.8m diameter and 0.5m high) filled
with cloudy water at room temperature (20-22°C). Animals were challenged to find a hidden
platform (8cm diameter and 18cm high) located 1.5cm below water level (19cm), on the same
place during the whole experiment. The platform was always positioned 40cm out of the rim
of the pool on the same location, in the center of one quadrant, with respect to the distal,
85
visual cues. Swimming patterns were analyzed, and the time (in seconds) spent by the rats to
find the hidden platform was computed and called escape latency.
The test was performed during four consecutive days, when rats were kindly placed into
the water facing the rim from 5 different start points in the pool (trials), with the platform kept
on the same place. The interval between each trial was of 30 min. The animals had to swim to
locate the hidden platform in 120s (maximum time), where they were allowed to stay for 10s.
If they failed to find the platform, rats were placed on it for 10s in order to associate spatial
cues of the room with the position of the escape platform. Afterwards, rats returned to their
home cage. Eighteen days after the last entered into the pool, the animals underwent a probe
trial to test the memory consolidation.
Analyses of brain lipids
On the 70th day, the offspring from each group were killed by decapitation between
10.00 and 11.00h a.m. Brain was quickly removed and the frontal cortex, hippocampus and
cerebellum structure were extracted. Tissues were excised, snap frozen in liquid nitrogen and
stored at -70ºC until processing.
The total lipids were extracted according to Bligh and Dyer method (13). Fatty acids of
three brain regions were chromatographed as methyl esters according to Lepage and Roy (14).
Analysis was performed on a Perkin-Elmer Autosystem XL gas chromatograph equipped with
a flame ionization detector and Turbochrom software. The column was wall-coated with 0.20
mm SP-2560. Hydrogen was used as carrier gas and synthetic air as make-up gas. The split
ratio was 1:70. The injection port temperature was 260ºC and the detector was 280ºC. The
column temperature was held at 135ºC for 5 min in a step-wise fashion reached a plateau of
240ºC. The gas chromatograph was calibrated using a standard mixture of fatty acids (Sigma,
Supelco). The results were expressed like percent of weights (g/100g all fatty acid).
86
Statistics
Data were presented as mean and standard error of mean. Data were analyzed using
one-way ANOVA. Bonferroni post hoc test was used where appropriate. A p value ≤ 0.05
was considered to be significant.
87
RESULTS
Body and Brain Weight
The malnourished animals weighed less than the control animals and the nutritional
rehabilitation procedure did not restore the body weight deficit of malnourished males (Table
3). However, in females, after nutritional rehabilitation, there were not differences in body
and brain weight compared to control group (Table 4).
As shown in Table 3 and 4, brain weight of males and females was significantly lower
(30% and 25%, respectively) in the malnourished group and in the rehabilitated group one
(9% and 3%, respectively) as compared to controls rats. Total weight in selected regions of
the malnourished offspring, as frontal cortex, was lower in males (29%) and in females (27%)
as compared to control rats. Malnourished males and females had lower weight (17% and
22%, respectively) in the hippocampus and in the cerebellum (40% and 27%, respectively) as
compared to control rats. Overall, post-malnutrition rehabilitation did not correct all the
damage imposed by malnutrition, since total weight of frontal cortex and cerebellum of
rehabilitated male rats showed a significant decrease (23% and 18%, respectively) in
comparison to the control male.
[Insert Tables 3 and 4 about here]
Behavioral measures
Passive avoidance
The results of the passive avoidance testing are shown in Fig. 1 for males and in Fig. 2
for females. Malnourished and nutritionally rehabilitated animals did not differ from control
rats in the baseline latency to step down to the grid floor averaged across pre-shock trials.
Likewise, in the retention test, ANOVA did not reveal any significant effect on the step-down
88
latency, indicating unimpaired performance of the malnourished and rehabilitated animals in
relation to the control group in this test. However, shorter latencies were observed in
rehabilitated males on the third day of testing compared to malnourished males.
[Insert Figures 1 and 2 about here]
The latency to escape onto the platform is shown in Fig. 3 for males and in Fig. 4 for
females. There was a significant reduction of latency for the control group on the second day
when compared to day 1, from 86.05 ± 6.66s to 43.15 ± 7.17s, attaining 36.80 ± 9.89s, 23.40
± 4.72s and 27.18 ± 5.15s on days 3, 4 and 18 after training, respectively. The malnourished
group presented significant cognitive deficit, showing latency of 99.97 ± 4.40s, 89.43 ± 6.88s,
78.05 ± 8.65s, 69.15 ± 9.58 and 55.75 ± 8.89s on days 1, 2, 3, 4 and 18 after training,
respectively, when compared to the control group. However, the rehabilitated group was
statistically similar to the control group which presented latency of 64.93 ± 5.11s, 45.67 ±
5.55s, 34.64 ± 5.96s, 23.09 ± 4.67s and 15.47 ± 2.60s on days 1, 2, 3, 4 and 18 after training,
respectively. The females of the malnourished group like the males showed spatial memory
deficit, when compared to the control group, whereas the females of the rehabilitated group
presented a result significantly equal to the control group.
[Insert Figures 3 and 4 about here]
As shown in Table 5, compared to control, malnourished males had lower frontal
cortex brain proportions of linoleic, EPA and 18:2n-6 + 18:3n-3. No significant difference of
the other fatty acids was observed. The 18:2n-6/18:3n-3 ratio was lower in the malnourished
and rehabilitated groups than in the control group one. However, frontal cortex of
89
rehabilitated male presented significantly high percentage of saturated fatty acids, accordingly
low monounsaturated and polyunsaturated, n-3 and n-6 PUFA, AA and DHA fatty acids when
compared to the control group.
[Insert Table 5 about here]
Table 6 shows no significant difference in the fatty acids of frontal cortex was
observed between malnourished and control females. Similarly to the males, rehabilitated
females showed increased percentage of SFA and EPA, and decreased MUFA, AA, DHA, n-3
and n-6 PUFA, (n-3) + (n-6) as compared to control females.
[Insert Table 6 about here]
Table 7 lists the percentages of fatty acids in the hippocampus of the male offspring.
No significant differences were observed in the total saturated and monounsaturated fatty
acids among males of the groups studied. The percentage of DHA and sum of n-3 FA
increased in the malnourished group. LA was low in malnourished and rehabilitated groups,
accompanied by low sum n-6 FA, 18:2n-6 + 18:3n-3 and (n-6)/(n-3) ratio. Furthermore, there
was a decreased in the sum of PUFA in the rehabilitated males.
[Insert Table 7 about here]
The female hippocampus of the malnourished and rehabilitated groups presented
higher proportion of SFA and DHA, and lower proportion of MUFA, linoleic, α-linolenic,
EPA, 18:2n-6 + 18:3n-3 and 18:2n-6/18:3n-3 ratio. The total PUFAs n-6 and AA/DHA ratio
90
were similar among the groups. The rehabilitated female presented a higher proportion of AA
and malnourished group higher total PUFAs n-3 (Table 8).
[Insert Table 8 about here]
In relation to the cerebellum, as shown in Table 9, no significant differences were
observed in the total saturated, 18:2n-6/18:3n-3 and AA/DHA ratio among males of the
groups studied. As regards the essential PUFAS, it was observed that the proportion 18:2 n-6
cis linoleic and 18:2n-6 + 18:3n-3 was lower in the cerebellum of the malnourished and
rehabilitated groups than in the control group, where only the offspring from the
malnourished group presented lower proportions of α-linolenic acid, (n-6)/(n-3) ratio and the
total PUFAs n-6 than those in the control group. Rehabilitated males presented lower
proportions of total MUFA. PUFAs were higher in the malnourished and rehabilitated groups.
The sum of n-3 PUFA and DHA was increased in the malnourished group.
[Insert Table 9 about here]
As shown in Table 10, percentages of total saturated, monounsaturated, α-linolenic
acid and 18:2n-6/18:3n-3 and AA/DHA ratio in the cerebellum from the female offspring did
not differ among the groups studied. Malnourished females presented a lower proportion of
AA, total PUFAs n-6 and (n-6)/(n-3) ratio than controls, while DHA was higher in
malnourished females than in control group. Offspring from the rehabilitated group showed
lower proportion of AA, DHA, total PUFAs n-3 and (n-3) + (n-6) as compared to control
group.
[Insert Table 10 about here]
91
DISCUSSION
In the present study, growth, behavior effects and brain fatty acid composition were
evaluated in the young male and female progeny of mothers that ingested, throughout
pregnancy and lactation, as well as their respective offspring after weaning, either a control
diet or a multideficient diet-RBD. In the malnourished offspring, maintained in the RBD until
young age (Malnourished group), both the body and brain weights in specific brain regions
(frontal cortex, hippocampus and cerebellum) were severely affected, both in female and male
rats. In the malnourished offspring exposed to the control diet after weaning (Rehabilitated
group) the body weight deficit was partially recovered in males (20% deficit in relation to
control at day 70) and entirely recovered in females (see Table 3). The persistence of
differences in body weight, even after nutritional rehabilitation, was also observed by other
authors in malnutrition studies, both in short periods (up to 30 days) (15) and in longer
periods (up to 90 days) (16).
Nutritional rehabilitation after weaning was also unable to recover the full weight of
the frontal cortex and cerebellum of the rehabilitated young males. On the other hand, this
effect was not observed in the rehabilitated females, which presented, at day 70, in all specific
brain regions studied, weight similar to the control group (see Table 4). This finding with
rehabilitated males suggests that, when dams are fed the RBD during pregnancy and lactation,
fetal brain development is affected in a negative and possibly irreversible fashion, in a more
pronounced way in males than females.
It is possible that the growth deficit may be caused in part by the low protein contents
(8%) of RBD, or even by the poor quality of the protein in this diet. Protein provides essential
amino acids for the rapid growth, and protein deficiency has been recently linked to behavior
problems (17). In fact, impaired growth of rats submitted to low-protein diets is well
92
established in several studies (15,18,19). However, the impaired growth in these animals may
also be due to the deficit in other nutrients, once RBD presents deficiencies in proteins, lipids,
vitamins and minerals (20). Regarding this aspect, there is extensive experimental evidence in
animals that the offspring of rats, fed a diet containing marginal levels of either zinc or protein
throughout pregnancy and lactation, show impaired brain development (21,22). On the other
hand, the importance of the availability of the (n-6) FA for growth and development has been
clearly established (23). Thus, it is not possible in this study to attribute the differences in
growth and development between the control and the malnourished offspring to any specific
dietary factor, but to deficiency in various nutrients. To the best of our knowledge, this is the
first time that the effects of RBD-induced malnutrition on learning and memory were
investigated. The results of the present study showed that passive avoidance behavior was not
significantly impaired in malnourished rats, however, the results in the Morris water-maze test
demonstrated that both malnourished females and males evidenced higher latency than control
group during all time. It is likely that the learning and retention deficit presented by
malnourished rats be due to any alteration in their sensorimotor abilities and/or it can be
speculated, however, that the disturbed emotionality of malnourished animals (open field
article) may interfere with their performance in memory-related behavioral tasks (24). The
experimentator, when observing the acquisition trials, noticed that malnourished animals
showed impaired thigmotaxis behavior, swimming longer distances than controls in the
peripheral annulus of the pool. It has been suggested that rats feel safer swimming close to the
walls and, therefore, the increased ambulation in the peripheral part of the maze can
presumably indicate a high level of emotional reactivity (25) that was confirmed during all
period of the open field test (data not shown). These observations suggest that the
multideficient diet (RBD) given to mothers and subsequently to young offspring following
93
weaning has a negative impact on cognitive function in male and female offspring, at least in
relation to spatial memory.
Analysis of data from the rehabilitated group showed that nutritional rehabilitation
results in improvement of the behavioral impairments in male and, mainly, female young
offspring, in spatial memory functions evaluated by the Morris maze performance. However,
the performance of rehabilitated males in passive avoidance differed significantly from that of
malnourished males, but was similar to that of the control male, whereas rehabilitated females
have not presented significant variations in relation to malnourished females. A possible
explanation for these behavioral differences could be that the stress of the electric shock
applied in rehabilitated male offspring caused negative results in the passive avoidance test. In
fact, passive avoidance performance is known to be altered by hippocampal lesions and/or
responses to shock stress (26).
Based on our results, we suggest that the behavioral changes observed in the
malnourished offspring exposed to the RBD diet, pre- and postnatally, could be in part a
consequence of deficiency in various nutrients. Several nutrients have important regulatory
roles in the Central Nervous System (CNS) and serve as necessary precursors for the
synthesis of specific neurotransmitters (27). In fact, protein malnutrition induces structural,
neurochemical and functional alterations in the CNS, leading to behavioral alterations (28,29).
Iron (30,31), copper (27), and zinc (32) deficiencies have been associated with deficits in
performance on other behavioral measures and, finally, dietary essential fatty acid (EFA)
deficiency (both n-6 and n-3 FA) results in characteristic changes in brain fatty acid
composition, accompanied by retardation of both growth and behavioral development (33).
The multideficient-RBD has a very low lipid level, but is relatively rich in n-3 fatty
acids and poor in n-6 fatty acids. The n-6:n-3 fatty acids ratio is 1.69:1 (see Table 2).
Therefore, another point of interest in the present study was to know if a multideficient-RBD
94
since the perinatal period until young age can alter the fatty acid composition of the young rat
brain, and if these effects are region-specific. Furthermore, if there is a relationship between
these effects and the overall cognitive development and growth.
Our results showed that RBD intake decreased the concentrations of the n-6 and
increased the n-3 fatty acids, mainly DHA, resulting in a lowered n-6/n-3 ratio in all regions,
except in the frontal cortex of the young offspring. Furthermore, the levels of linoleic acid and
EPA were reduced in the frontal cortex of male offspring, but not in female ones.
Malnourished males had lower levels of essential fatty acids (linoleic and linolenic acids) in
hippocampus and cerebellum, while in malnourished females only linoleic acid was lower in
cerebellum compared to control. The changes in fatty acid composition were more
pronounced in the hippocampus and cerebellum than in the frontal cortex. The results
indicated a gender-specific and region-specific effect of malnutrition (RBD) upon the brain
fatty acid composition.
The brain and the central nervous system are very rich in AA and DHA, which affects
membrane enzymes, ion channels, signal transduction and neural network systems (34). (n-
6):(n-3) FA imbalance in diet could reflect the similar effects on brain fatty acid composition
(35). A decrease in AA, although not having reached statistical significance, with a significant
elevation in DHA in all regions, from malnourished males and females, partly reflect the
preference of fatty acid desaturase enzymes for fatty acids of the n-3 series than the n-6 series,
mainly when the 3 series is predominant (24). Decrease in AA levels in brain affects the
synthesis of eicosanoids, which serves as intracellular or extracellular signals (35).
One particular result of this work was the observation of the extraordinary ability of
the brain of malnourished groups in retaining appreciable amounts of DHA, even in face of
the low lipid contents of the diet and the reduced intake of diet by these animals (78% in
relation to control, data not shown). These results suggest the existence of some kind of
95
adaptative mechanism preserving brain DHA levels, even in face of severe deprivation. DHA
is essential in brain membranes to keep an appropriate state of the membrane fluidity (27)
which may modulate a number of aspects of lipid-protein interactions, including the activity
of certain enzymes that play important roles in brain function (9). On the other hand, DHA,
with its high degree of unsaturation, may be a vulnerable target to the damaging effects of
lipid peroxidation. Some authors suggested oxidative damage in brain as a possible
explanation for decreased performance in old rats fed a diet with high level of fish oil, rich in
DHA (36).
It is interesting to note that lower alterations observed in frontal cortex's PUFAS
profile correspond to better performances in the passive avoidance test. Malnourished groups
usually retain on the second day of testing the memory of the electric shock applied on the
first day. It is well documented that the frontal cortex is involved in short-term learning and
memory (37). This could explain why this group was less affected in this test. In contrast, the
hippocampus and cerebellum are recognized to be important in spatial learning and long-term
memory (17,38), and in the present study these were the regions most sensitive to changes in
PUFAS composition, what was parallel to a worse performance in the Morris water-maze test.
The imbalance of (n-6):(n-3) fatty acid ratio in these brain regions of the malnourished group
probably could also have contributed to this altered performance, as previously demonstrated
in a study by Wainwright and coworkers (1999). Nutritional rehabilitation improved the fatty
acid profile imposed by malnutrition in these regions of offspring brain. In parallel, it also led
to an improvement in the behavioral impairments.
In conclusion, the results of the present study show that the malnutrition imposed by
RBD in early periods of life (gestation, lactation and young age) affects the ability of the
offspring to retain information related to learning, mainly spatial and of long term. However,
the nutritional intervention showed to be able to reverse these deficiencies, in different
96
degrees for males and females. Furthermore, we can observe a clear association between these
alterations and important nutrients required by the development of the CNS. Increased or
decreased levels presumably show that the brain of these animals tries to preserve as much as
possible its functions, probably altering the absorption, turnover and utilization of these
nutrients, seeking for a mechanism that could compensate for the insult imposed in periods
that are critical to development.
Acknowledgements
We would like to express our appreciation to Érika Coloneze for her technical
assistance in chromatographic analyses.
97
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100
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101
Tables and Figures
Table 1
Centesimal Composition of "Regional Basic Diet" (RBD).
Ingredients Centesimal Composition
g% Proteins Carbohydrates Fats Ash Fibers Kcal
Beans
a
18.34 3.99 10.66 0.24
0.57 1.09 60.76
Manioc flour 64.81 0.84 48.59 0.12
0.43 5.64 198.80
Poor fat-dried and salted meat 3.74 2.74 0.43 0.06
0.06 - 13.22
Dried and salted meat fat 0.35 - - 0.35
- - 3.15
Sweet potato
a
12.76 0.30 9.99 0.03
0.20 0.48 41.43
100 7.87 69.67 0.80
1.26 7.21 317.36
a, cooked and dried
102
Table 2
Fatty acid composition of total lipids in different experimental diets.
Values represent means ± SEM in wt%. ( ) - number of diets utilized. Abbreviations: nd, not
determined; SFA, saturated fatty acids; MUFA, monounsaturated fatty acids; PUFA,
polyunsaturated fatty acids; ∑ (n-6) PUFA, sum of linoleic series; ∑ (n-3) PUFA, sum of
linolenic series; (n-6) + (n-3), sum of linoleic and linolenic series; AA, arachidonic acid; EPA,
eicosapentaenoic acid; DHA, docosahexaenoic acid. * p≤0.05 and ** p≤0.001 in relation to
commercial lab chow according to t test.
Commercial Lab Chow (5) Regional Basic Diet (RBD) (6)
∑
∑∑
∑ SFA
27.41±0.85 39.37±0.78**
∑
∑∑
∑ MUFA
22.52±1.28 25.96±0.78*
18:2n-6 cis linoleic 45.48±1.15 19.66±0.85**
18:3n-6 0.13±0.01 0.23±0.02**
20:2n-6 2.87±0.20 nd
20:4n-6 AA 0.31±0.03 0.44±0.04
22:4n-6 nd 0.09±0.00
∑
∑∑
∑ (n-6) PUFA
46.39±1.36 20.38±0.90**
18:3n-3 α-linolenic 2.87±0.09 11.44±0.57**
20:5n-3 EPA 0.16±0.01 0.48±0.05**
22:5n-3 0.21±0.02 0.16±0.01*
22:6n-3 DHA 0.31±0.03 0.20±0.02
∑
∑∑
∑ (n-3) PUFA
3.44±0.07 12.25±0.57**
18:2n-6/18:3n-3
15.91±0.39 1.75±0.13**
18:2n-6 + 18:3n-3 48.35±0.94
31.10±0.62**
AA/DHA
1.00±0.03
2.20±0.03**
(n-6)/(n-3)
13.49±0,19 1.69±0.11**
(n-6) + (n-3) 49.82±1.43 32.63±1.09**
103
Table 3
Body, brain, frontal cortex, hippocampus and cerebellum weight of male rats fed different
diets.
Control (17) Malnourished (15) Rehabilitated (14)
Body (g) 263.59±6.84
a
35.07±0.64
b
190.13±8.08
c
Brain (g) 1.716±0.038
a
1.193±0.037
b
1.566±0.032
c
Frontal cortex (g) 0.091±0.008
a
0.065±0.005
b
0.070±0.003
b
Hippocampus (g) 0.161±0.006
a
0.134±0.007
b
0.140±0.009
ab
Cerebellum (g) 0.260±0.008
a
0.156±0.004
b
0.212±0.015
c
Values represent means ± SEM. ( ) - number of animals utilized. Values in the same row
with different superscript letters are significantly different from one another at p<0.05 as
determined by Bonferroni post hoc test.
104
Table 4
Body, brain, frontal cortex, hippocampus and cerebellum weight of female rats fed different
diets.
Control (14) Malnourished (17) Rehabilitated (17)
Body (g) 204.15±7.37
a
34.54±0.59
b
182.83±7.78
a
Brain (g) 1.512±0.045
a
1.139±0.035
b
1.470±0.021
a
Frontal cortex (g) 0.084±0.007
a
0.061±0.004
b
0.068±0.003
ab
Hippocampus (g) 0.159±0.008
a
0.124±0.007
b
0.143±0.010
ab
Cerebellum (g) 0.221±0.008
a
0.161±0.012
b
0.207±0.021
ab
Values represent means ± SEM. ( ) - number of animals utilized Values in the same row
with different superscript letters are significantly different from one another at p<0.05 as
determined by Bonferroni post hoc test.
105
Table 5
Relative fatty acid composition (% total fatty acids) in total lipid frontal cortex of male
offspring.
Control (5) Malnourished (5) Rehabilitated (7)
∑
∑∑
∑ SFA
55.40±0.69
a
58.57±1.12
a
69.38±1.10
b
∑
∑∑
∑ MUFA
16.48±0.17
a
15.17±0.38
a
9.77±0.85
b
18:2 n-6 cis linoleic 0.61±0.06
a
0.29±0.03
b
0.62±0.07
a
20:4 n-6 AA 9.83±0.12
a
8.74±0.41
a
7.19±0.38
b
∑
∑∑
∑ (n-6) PUFA
11.05±0.67
a
9.55±0.43
ab
8.56±0.40
b
18:3 n-3 α-linolenic 0.07±0.01
a
0.09±0.01
ab
0.12±0.01
b
20:5 n-3 EPA 0.28±0.02
a
0.11±0.01
b
0.33±0.03
a
22:6 n-3 DHA 15.18±0.26
a
16.01±0.40
a
11.85±0.56
b
∑
∑∑
∑ (n-3) PUFA
15.72±0.24
a
16.64±0.48
a
12.23±0.48
b
18:2n-6/18:3n-3 8.71±0.83
a
4.17±0.42
b
5.23±0.57
b
18:2n-6 + 18:3n-3 0.68±0.04
a
0.38±0.01
b
0.74±0.05
a
AA/DHA 0.65±0.05
a
0.55±0.04
a
0.61±0.05
a
(n-6)/(n-3) 0.70±0.07
a
0.57±0.01
a
0.70±0.02
a
(n-6) + (n-3) 26.77±0.46
a
26.19±0.88
a
20.78±0.83
b
Values represent means ± SEM in wt%. ( ) - number of animals utilized. Abbreviations: nd,
not determined; SFA, saturated fatty acids; MUFA, monounsaturated fatty acids; PUFA,
polyunsaturated fatty acids; ∑ (n-6) PUFA, sum of linoleic series; ∑ (n-3) PUFA, sum of
linolenic series; (n-6) + (n-3), sum of linoleic and linolenic series; AA, arachidonic acid;
EPA, eicosapentaenoic acid; DHA, docosahexaenoic acid. Values in the same row with
different superscript letters are significantly different from one another at p<0.05 as
determined by Bonferroni post hoc test.
106
Table 6
Relative fatty acid composition (% total fatty acids) in total lipid frontal cortex of female
offspring.
Control (5) Malnourished (5) Rehabilitated (5)
∑
∑∑
∑ SFA
57.77±0.79
a
57.11±0.66
a
69.44±2.88
b
∑
∑∑
∑ MUFA
15.49±0.56
a
16.79±0.52
a
10.91±1.21
b
18:2 n-6 cis linoleic 0.75±0.05
a
0.63±0.04
a
0.32±0.04
b
20:4 n-6 AA 9.42±0.32
a
8.48±0.44
a
6.19±0.69
b
∑
∑∑
∑ (n-6) PUFA
10.63±0.40
a
9.63±0.11
a
6.73±0.82
b
18:3 n-3 α-linolenic 0.10±0.02
a
0.07±0.01
a
0.09±0.01
a
20:5 n-3 EPA 0.28±0.06
a
0.17±0.02
a
1.80±0.16
b
22:6 n-3 DHA 15.30±0.15
a
15.73±0.78
a
10.71±0.96
b
∑
∑∑
∑ (n-3) PUFA
16.01±0.07
a
16.38±0.74
a
12.54±1.13
b
18:2n-6/18:3n-3 8.84±0.62
a
10.33±0.84
a
4.47±0.03
a
18:2n-6 + 18:3n-3 0.85±0.07
a
0.70±0.12
a
0.41±0.02
b
AA/DHA 0.62±0.05
a
0.54±0.04
a
0.58±0.05
a
(n-6)/(n-3) 0.66±0.03
a
0.59±0.02
ab
0.53±0.02
b
(n-6) + (n-3) 26.64±0.35
a
26.01±0.84
a
19.27±1.94
b
Values represent means ± SEM in wt%. ( ) - number of animals utilized. Values in the same
row with different superscript letters are significantly different from one another at p<0.05 as
determined by Bonferroni post hoc test. See Table 5 for abbreviations.
107
Table 7
Relative fatty acid composition (% total fatty acids) in total lipid hippocampus of male
offspring.
Control (8) Malnourished (6) Rehabilitated (6)
∑
∑∑
∑ SFA
48.75±0.60
a
49.76±0.24
a
51.87±1.21
a
∑
∑∑
∑ MUFA
24.68±0.38
a
23.94±0.46
a
23.06±1.24
a
18:2 n-6 cis linoleic 1.34±0.17
a
0.51±0.05
b
0.62±0.07
b
20:4 n-6 AA 9.40±0.20
a
8.72±0.16
a
8.88±0.25
a
∑
∑∑
∑ (n-6) PUFA
12.62±0.36
a
10.49±0.13
b
10.99±0.18
b
18:3 n-3 α-linolenic 0.28±0.02
a
0.16±0.01
b
0.43±0.04
c
20:5 n-3 EPA 1.00±0.10
a
0.65±0.06
b
0.87±0.08
ab
22:6 n-3 DHA 11.98±0.22
a
14.28±0.24
b
12.61±0.42
a
∑
∑∑
∑ (n-3) PUFA
13.70±0.11
a
15.61±0.26
b
13.97±0.23
a
18:2n-6/18:3n-3 5.31±0.99
a
3.27±0.87
ab
1.73±0.15
b
18:2n-6 + 18:3n-3 1.62±0.06
a
0.67±0.02
b
1.05±0.05
c
AA/DHA 0.78±0.06
a
0.61±0.05
a
0.70±0.06
a
(n-6)/(n-3) 0.92±0.03
a
0.67±0.02
b
0.79±0.02
c
(n-6) + (n-3) 29.00±1.26
a
26.10±0.22
ab
24.96±0.19
b
Values represent means ± SEM in wt%. ( ) - number of animals utilized. Values in the same
row with different superscript letters are significantly different from one another at p<0.05 as
determined by Bonferroni post hoc test. See Table 5 for abbreviations.
108
Table 8
Relative fatty acid composition (% total fatty acids) in total lipid hippocampus of female
offspring.
Control (6) Malnourished (6) Rehabilitated (5)
∑
∑∑
∑ SFA
47.05±0.69
a
49.35±0.48
b
50.76±0.66
b
∑
∑∑
∑ MUFA
25.83±0.17
a
23.53±0.26
b
22.33±0.50
b
18:2 n-6 cis linoleic 1.86±0.19
a
0.31±0.03
b
0.48±0.04
b
20:4 n-6 AA 8.69±0.12
a
8.90±0.13
a
9.64±0.09
b
∑
∑∑
∑ (n-6) PUFA
12.73±0.67
a
11.27±0.36
a
11.91±0.37
a
18:3 n-3 α-linolenic 0.28±0.02
a
0.18±0.02
b
0.20±0.02
b
20:5 n-3 EPA 1.16±0.11
a
0.74±0.03
b
0.63±0.06
b
22:6 n-3 DHA 11.58±0.26
a
14.14±0.32
b
13.55±0.64
b
∑
∑∑
∑ (n-3) PUFA
13.70±0.24
a
15.61±0.25
b
14.86±0.66
ab
18:2n-6/18:3n-3 7.28±0.83
a
1.84±0.20
b
2.48±0.11
b
18:2n-6 + 18:3n-3 2.14±0.07
a
0.49±0.02
b
0.68±0.03
c
AA/DHA 0.75±0.06
a
0.63±0.05
a
0.71±0.06
a
(n-6)/(n-3) 0.93±0.07
a
0.72±0.03
b
0.81±0.06
ab
(n-6) + (n-3) 26.43±0.46
a
27.50±0.24
a
26.77±0.36
a
Values represent means ± SEM in wt%. ( ) – number of animals utilized. Values in the same
row with different superscript letters are significantly different from one another at p<0.05 as
determined by Bonferroni post hoc test. See Table 5 for abbreviations.
109
Table 9
Relative fatty acid composition (% total fatty acids) in total lipid cerebellum of male
offspring.
Control (5) Malnourished (5) Rehabilitated (7)
∑
∑∑
∑ SFA
45.75±0.58
a
45.54±0.64
a
50.59±1.90
a
∑
∑∑
∑ MUFA
27.29±1.11
a
26.88±0.75
a
20.54±1.98
b
18:2 n-6 cis linoleic 1.18±0.12
a
0.64±0.06
b
0.83±0.02
b
20:4 n-6 AA 7.40±0.30
ab
6.85±0.09
a
7.81±0.27
b
∑
∑∑
∑ (n-6) PUFA
11.74±0.24
a
9.80±0.39
b
12.51±0.25
a
18:3 n-3 α-linolenic 0.63±0.06
a
0.40±0.04
b
0.59±0.05
ab
20:5 n-3 EPA 1.02±0.07
a
0.95±0.07
a
1.58±0.14
b
22:6 n-3 DHA 11.85±0.75
a
14.85±0.32
b
12.49±0.36
a
∑
∑∑
∑ (n-3) PUFA
13.92±0.72
a
16.96±0.24
b
15.68±0.64
ab
18:2n-6/18:3n-3 1.88±0.17
a
1.38±0.12
a
1.42±0.14
a
18:2n-6 + 18:3n-3 1.81±0.08
a
1.04±0.03
b
1.42±0.03
c
AA/DHA 0.62±0.06
a
0.46±0.04
a
0.63±0.06
a
(n-6)/(n-3) 0.85±0.06
a
0.58±0.03
b
0.80±0.02
a
(n-6) + (n-3) 25.65±0.49
a
26.76±0.20
b
28.18±0.87
c
Values represent means ± SEM in wt%. ( ) – number of animals utilized. Values in the same
row with different superscript letters are significantly different from one another at p<0.05 as
determined by Bonferroni post hoc test. See Table 5 for abbreviations.
110
Table 10
Relative fatty acid composition (% total fatty acids) in total lipid cerebellum of female
offspring.
Control (5) Malnourished (5) Rehabilitated (5)
∑
∑∑
∑ SFA
46.71±1.19
a
47.45±1.01
a
50.12±0.91
a
∑
∑∑
∑ MUFA
26.25±0.63
a
26.63±0.78
a
25.03±0.60
a
18:2 n-6 cis linoleic 0.80±0.13
a
0.33±0.02
b
0.55±0.03
ab
20:4 n-6 AA 7.07±0.18
a
6.52±0.02
b
6.43±0.16
b
∑
∑∑
∑ (n-6) PUFA
11.57±0.57
a
9.16±0.18
b
10.47±0.41
ab
18:3 n-3 α-linolenic 0.52±0.24
a
0.51±0.08
a
0.59±0.11
a
20:5 n-3 EPA 1.01±0.35
a
1.06±0.18
a
1.32±0.14
a
22:6 n-3 DHA 12.97±0.06
a
14.47±0.55
b
11.15±0.21
c
∑
∑∑
∑ (n-3) PUFA
15.34±0.12
a
16.52±0.48
a
13.88±0.34
b
18:2n-6/18:3n-3 2.11±1.21
a
0.71±0.14
a
1.07±0.18
a
18:2n-6 + 18:3n-3 1.32±0.14
a
0.84±0.03
b
1.14±0.04
ab
AA/DHA 0.55±0.05
a
0.45±0.04
a
0.58±0.05
a
(n-6)/(n-3) 0.75±0.03
a
0.56±0.02
b
0.75±0.02
a
(n-6) + (n-3) 26.90±0.70
a
25.68±0.44
ab
24.35±0.69
b
Values represent means ± SEM in wt%. ( ) - number of animals utilized. Values in the same
row with different superscript letters are significantly different from one another at p<0.05 as
determined by Bonferroni post hoc test. See Table 5 for abbreviations.
111
0
20
40
60
80
100
120
140
Training Retention
Step-down Latency (s)
Control
Malnourished
Rehabilitated
Fig. 1. Mean latency to step down to the grid floor in seconds for the training trials and for the
retention test of the passive avoidance task of male in control (n=7), malnourished (n=14) and
rehabilitated (n=14) groups. * Significant difference in relation to the malnourished group
(p<0.05).
*
112
0
20
40
60
80
100
120
140
Training Retention
Step-down Latency (s)
Control
Malnourished
Rehabilitated
Fig. 2. Mean latency to step down to the grid floor in seconds for the training trials and for the
retention test of the passive avoidance task of female in control (n=9), malnourished (n=14)
and rehabilitated (n=17) groups. No significant difference in relation to the control group was
detected (p>0.05).
113
0
20
40
60
80
100
120
Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 18 days after training
LATENCY (s)
Control
Rehabilitated
Malnourished
Fig. 3. Morris water maze of males. Latency (mean ± SEM) to escape from water to a
submerged platform in control (n=9), malnourished (n=13) and rehabilitated (n=13) groups. *
Significant difference in relation to the rehabilitated group (p<0.05). ** Significant difference
in relation control and rehabilitated groups (p<0.05).
*
**
**
**
**
114
0
20
40
60
80
100
120
Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 18 days after training
LATENCY (s)
Control
Rehabilitated
Malnourished
Fig. 4. Morris water maze of females. Latency (mean ± SEM) to escape from water to a
submerged platform in control (n=11), malnourished (n=15) and rehabilitated (n=14) groups.
* Significant difference in relation to the rehabilitated group (p<0.05). ** Significant
difference in relation to control and rehabilitated groups (p<0.05).
*
**
**
**
**
115
Effects of the Multideficient Regional Brazilian Diet and Nutritional Rehabilitation on
Motor Activity, Emotionality and Exploratory Behavior in Young Rats
Authors:
1
Amanda Santos de SOUZA,
2
Luciana da Câmara PACHECO,
2
Priscila da Silva
CASTRO,
2
Jan Nora HOKOÇ,
3
Mônica Santos ROCHA,
1
Maria das Graças TAVARES DO
CARMO
1
Laboratório de Bioquímica Nutricional, Instituto de Nutrição Josué de Castro,
2
Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho,
3
Departamento de Farmacologia - Universidade Federal do
Rio de Janeiro.
Corresponding author:
Dra. Maria das Graças Tavares do Carmo
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Nutrição Bloco J - 2º andar
21.9415.90 - Rio de Janeiro - Brazil
FAX: +55 21 280 8343
E-mail adress: tcarmo@editema.com.br
Supported by: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
116
ABSTRACT
The effects of malnutrition caused by the multideficient diet-RBD intake during
pregnancy, lactation and after weaning and nutritional rehabilitation after weaning on motor
activity, emotionality and exploratory behavior were examined in offspring rats at a young
age. Wistar females were divided into control group (CG), comprising mothers, litters and the
offspring after weaning, that were fed with commercial lab chow during the pregnancy and
lactation period (21 days each); malnourished group (MG), that received multideficient diet-
RBD during the same period of CG; and rehabilitated group (RG), whose mothers during the
pregnancy and lactation period received RBD and the offspring after weaning received
commercial lab chow. The offspring at two months of age were tested in the open field.
Malnourished animals showed lower locomotor and exploratory activity, besides higher
emotionality, while rehabilitated females increased the locomotor activity. The nutritional
rehabilitation brought about less anxiety level in males and females. These results suggested
that malnutrition may depress or exacerbate behaviors in open field test.
Keywords: Malnutrition, Nutritional Rehabilitation, Multideficient Regional Brazilian Diet,
Open Field, Rat
117
INTRODUCTION
The malnutrition during development of rats exhibit numerous and irreversible
behavioral impairments (Lukoyanov et al., 2000) that lead to antisocial behavior (Almeida et
al., 1996; Raine, 2002), reduced anxiety (Almeida et al., 1996a), increased exploratory
behavior (Almeida et al., 1996b), disturbances of emotionality (de Vicent et al., 1991;
Almeida et al., 1996c; Jaiswal et al., 1996; Moreira et al., 1997) and memory-related deficits
(Celedon et al., 1979; Jordan et al., 1981; Goodlett et al., 1986; Castro & Rudy, 1987, 1993;
Tonkiss et al., 1990; Bedi, 1992; Cordoba et al., 1994; Fukuda et al., 2002). Furthermore, it
has been reported that cognitive deficits result from pre- and early postnatal malnutrition,
especially in underprivileged socioeconomic groups (Morgane et al., 1993, 2002).
Malnourished rats exhibit hyperactivity and increased exploratory behavior when
undernutrition was employed postweaning (Alamy et al., 2005) and reduced emotional
reactivity and impaired habituation in the open field test when the malnutrition was imposed
in adulthood (Lukoyanov et al., 2000). Moreover, dietary restriction showed to cause deficits
in skilled movements and hyperactivity in adult males (Smith and Metz, 2005). Spontaneous
behavior modifications may reflect subtly altered central nervous system activity.
However, many works did not utilize the legitimate diet consumed by underprivileged
populations that live in endemic malnutrition areas (Prazeres et al., 2004). To approach the
maximum of the reality, the Regional Basic Diet (RBD) experimental model was utilized in
the present study. RBD is a multideficient diet, with about 8% protein, 1% lipid and 70%
carbohydrates content, as determined by a nutritional survey. This diet is consumed by some
rural communities in the northeastern part of Brazil (Teodósio et al., 1990). Investigations
into the effects of this diet are based on the pronounced incidence of different degrees of
malnutrition seen in the population of this region. No previous studies were undertaken to
118
analyze the behavioral effects of multideficient diet-RBD. The present study was
accomplished to determine whether multideficient diet-RBD administration to rats during
their pregnancy and lactation periods as well to their respective offspring after weaning
affects motor activity, emotionality and exploratory behavior in offspring rats in young age.
The same parameters were also assessed in nutritionally recovered young rats.
119
MATERIAL AND METHODS
Animals and diets
Wistar rats obtained from the colony of the Instituto de Nutrição Josué de Castro of
Universidade Federal do Rio de Janeiro (Brazil) were used. Virgin mature female rats were
mated with males and maintained in single cages under standard laboratory conditions (24 ±
2ºC and a 12:12-h light-dark cycle) and provided with water and chow ad libitum. Pregnancy
was assumed to have been established when sperm was found in vaginal secretion. The day
following the night of mating was considered day zero of pregnancy and at this moment the
female rats received their respective chows. 1) Control group (CG) that during the pregnancy
and lactation periods (21 days each), mother plus litter and the offspring after weaning
received commercial lab chow; 2) Malnourished group (MG) that received RBD during the
same period of CG and 3) Rehabilitated group (RG) whose mothers during the pregnancy and
lactation period received RBD and the offspring after weaning received commercial lab chow.
The ingredients of the multideficient diet (g/g%) were beans (18.34), manioc flour
(64.81), dried and salted meat (3.74) and sweet potato (12.76), which had been cooked,
dehydrated at 60°C and pulverized. Each component was mixed by adding water. Meat fat
(0.35%) was added, and the mixture was shaped into balls that were dehydrated at 60°C for
24 h. The contents of the main nutrients were (g/g%): proteins (7.87), carbohydrates (69.67),
lipids (0.8), fibers (7.21), and minerals (1.26), for a total of 317.36 kcal. No vitamin
supplement was added to the diet. The same nutrients in the commercial lab chow (as
indicated by the manufacturer, Purina do Brasil, SP, Brazil) had the following values (g/g%):
proteins (23), carbohydrates (50.44), lipids (5), fibers (10), and minerals (10), for a total of
338.76 kcal.
120
When the animals attained two months of age they were submitted to the open field
test. In this age the weight body of groups was of 196.71 ± 10.95g; 153.92 ± 12.67g and 29.52
± 0.70g for the control, rehabilitated and malnourished groups, respectively.
The handling and care of the animals were conducted according to the Commission of
Animal Care of Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho/Universidade Federal do Rio de
Janeiro.
Open field
The open field was a wooden arena, measuring 60x60x60 (3600 cm
2
); 53.08x53.08x60
(2816.8 cm
2
); and 23.24x23.24x60 (540.16 cm
2
) cm for the control, rehabilitated and
malnourished groups, respectively. The measure of the box was altered for different groups,
taking into consideration the body weight of animals. The floor of the apparatus was divided
by black grid lines into 16 squares (15x15 cm - control group, 13.27x13.27 cm - rehabilitated
group and 5.81x5.81 cm - malnourished group) and into two areas: periphery (12 squares
along the walls) and center (4 squares in the central area of the apparatus). Each rat was
placed at the same location in a corner square of the outer area. Animals were tested in 5-min
sessions per day, on four consecutive days (one session per day). Activities were recorded
using a video camera (Model JVC GR SMX289UB). To assess the number of behavioral
elements the following parameters were utilized:
• Outer locomotor activity: when the animals crossed each grid line with all four paws
in the peripheral area;
• Inner locomotor activity: when the animals crossed each grid line with all four paws in
the central area;
• Rearing activity: when the animals rose on their hind legs;
• Grooming activity: when the animals cleaned their whiskers;
• Defecation: when the animals deposited fecal pellets on the arena floor.
121
To minimize stress and maximize the rat familiarity, the open field was carried out
under the identical conditions of illumination, temperature and background noise level to
different groups.
Statistics
Data were presented as mean and standard error of mean. Data were analyzed using
one-way ANOVA. Bonferroni post hoc test was used where appropriate. A p value ≤ 0.05
was considered to be significant.
122
RESULTS
The locomotor activity scores measured in the peripheral area of the open field during
the first testing session are shown in Fig. 1. The females of the malnourished group crossed
less lines in periphery of arena than those the control group. In contrast, females of the
rehabilitated group presented high outer locomotor activity on days 2, 3 and 4, when
compared to control group. The outer activity scores of malnourished males were significantly
lower than those of control animals in all testing sessions (p<0.05; Fig. 2). No significant
differences were observed between control and rehabilitated males.
[Insert Figures 1 and 2 about here]
There was no significant difference between the malnourished and control females on
days 2, 3 and 4 (Fig. 3) concerning inner locomotor activity. Malnourished females had an
increased inner locomotor activity on day 1 of the test. Rehabilitated females presented higher
inner activity in all the studied period, except on day 3. In relation to the males, the
malnourished group was not statistically different from the control group. The rehabilitated
group increased its inner locomotor activity gradually, showing significant difference from
day 2 onward (Fig. 4).
[Insert Figures 3 and 4 about here]
The Fig. 5 shows that the females of the malnourished group presented minor rearing
behavior on the four days of the test while the rehabilitated group was minor only on days 1
and 4. As shown in Fig. 6, the malnourished males showed a decreased rearing behavior
during the period studied. Whereas the rehabilitated males were increasing the rears number
123
until that on the last day of test their group presented a result similar, statistically, to that of
the control group.
[Insert Figures 5 and 6 about here]
The Fig. 7 shows that females of the malnourished and rehabilitated groups presented
decreased grooming behavior on days 2 and 3 of the session test. On the other hand, the male
rehabilitated group showed decreased grooming behavior only on day 2 of the test (Fig. 8).
[Insert Figures 7 and 8 about here]
The females of the malnourished and rehabilitated groups deposited less fecal pellets on
days 2 and 3 of the session test (Fig. 9). The malnourished male group produced less fecal
pellets than control group only on days 3 and 4. However, no difference was observed
between the rehabilitated group and the control one (Fig. 10).
[Insert Figures 9 and 10 about here]
124
DISCUSSION
The main brain function is to produce behavior that may to be depressed or
exacerbated on account of the type of the insult employed (Guedes, 1985). The open field test
is commonly used for the evaluation of emotionality in rats in a novel environment (Hall,
1934, 1936, 1941, Hall & Ballechey, 1932). It can also be used to assess motor activity levels
and exploration. Although a variety of methodologies have been referred to as open field test,
the majority of studies recorded the ambulation, number of central fields entered, defecation
rates, and number of rears and grooming (Beck & Chow, 1984; Almeida et al., 1996,
Campbell et al., 2003, Gregus et al., 2005).
In the present study we have found that multideficient diet-RBD intake during pre-
and immediately postnatally and post-weaning period in rats resulted in a hypoactivity of
male and female offspring, manifested in the open field by a decrease in square crossing and
rearing, and that the nutritional rehabilitation modified these behaviors. The oppositive
changes were observed in other studies with animal models for malnutrition. Several studies
have been found that malnourished animals exhibit increased emotionality and anxiety
(Levitsky & Barnes 1970, Choleris et al., 2001, Smith & Metz, 2005), increased exploratory
behavior (Almeida et al., 1996, Smith & Metz, 2005) and reduced movement accuracy
(Levitsky & Barnes 1970, Wolf et al., 1986).
The discrepancy between our findings and results reported by others may be due to
differences in the open field apparatus. The open field size has been commonly varied for
intraspecies studies, and the effects of such dimensional changes have been shown to exert a
significant effect on some aspects of behavior. As a general rule, ambulation seems to be
more susceptible to change in apparatus and environment (Broadhurst, 1957, 1958a, 1958b).
Ambulation increases with the increasing field size in rats (Montgomery, 1951; Broadhurst,
125
1957). Large field size has been reported to produce a disproportionately large increase in
ambulation (Blizard, 1971). In study by Lukoyanov and coworkers (2000), the malnourished
animals showed high locomotion scores in both outer and inner areas of open field). In the
present study the body weight of malnourished animals was severely affected, both in female
and male offspring (85% deficit in relation to the control at day 70). Thus, in the present
study, the open field apparatus size was altered taking into account the body weight of
animals and this could be relevant for the differences between previous studies and our
results.
The increase in outer locomotion activity was described by previous studies occurring
after protein-calorie malnutrition at weaning (Alamy et al., 2005), in adulthood rats
(Lukoyanov et al., 2000), and when chronic food restriction was induced at birth (Masur and
Ribiero, 1981). However, our data did not confirm these results. The outer locomotion activity
of malnourished females and males was decreased during all the testing period. According to
Archer (1975), animals with lower locomotion scores are highly emotional. Thus, in this case,
the malnutrition incited minor ambulation in the peripheral area showing that malnourished
rats were emotionally more reactive to a novel environment than control rats. Furthermore,
malnourished animals showed an increased rate of habituation to the open field as their
ambulation was lower than that of controls in all test session. However, rehabilitated females
presented less emotional behavior because of high ambulation index, except on day 1. The
introduction of control diet was able to reverse all these effects in rehabilitated males because
the outer locomotor activity was the same as that of the control group.
It is possible that these effects may be caused in part by the severe malnutrition
induced by multideficient diet-RBD, since RBD is a deficient-diet in protein, fat, vitamins and
minerals, and was instituted in both pre- and postnatally dam and offspring. The diets used by
other investigations are generally poor only in proteins or restrictive and offered in a
126
determined period (Masur and Ribiero, 1981; Lukoyanov et al., 2000; Alamy et al., 2005).
Furthermore, no research group adapted the arena in the open field test. So, it is probable that
the higher ambulation index found in these works was due to the big size of the apparatus in
relation to the size of the malnourished animal.
The measures of anxiety in the open field are assessed by number of lines crossed in the
central area, while the activity is measured by the distance moved in the peripheral area.
Animals that are more anxious, in the open field, will spend less time in the center (Choleris
et al., 2001), since the central area of a novel environment is considered as an anxiogenic and
aversive area (Meyer et al., 2006). The anxiety level of malnourished animals was decreased
only in females on day 1. Both rehabilitated females and males presented less anxiety in the
open field test. These findings suggest that malnutrition results in a reduction in anxiety, only
in females and on one day. Whereas, in the rehabilitated group, the introduction of
commercial lab chow decreased the anxiety level during all the experimental period.
In the open field, rearing is often positively correlated with ambulation (Satinder,
1968). Rearing behavior of both malnourished females and males decreased along the testing,
thus presenting data that confirmed the low outer locomotor activity. Rearing activity increase
suggests lower emotionality and increased exploration (Maimanee, 2003). Rehabilitated
females showed lower numbers of rears on days 1 and 4, being in disagreement with the
higher rate of ambulation on the three last days of testing. Nutritionally rehabilitated males
presented an increasing number of rears along the testing, although the outer locomotor
activity had been the same during all the studied period when compared to the control group.
Archer (1975) claimed in test of emotionality in rats that as more food intake, more
defecation. The food intake was 18.50±0.60g, 3.91±0.46g and 16.53±0.53g for the control,
malnourished and rehabilitated group, either males or females, respectively. Then, in the
present study, the malnourished females fed less RBD in the testing period and defecated
127
equal (days 1, 3 and 4) or less (day 2) than control females (Fig. 9). Malnourished males
behaved similarly to the females, i.e., deposited the same score of feces (days 1 and 2) or less
(days 3 and 4) than control group (Fig. 10). In relation to the rehabilitated group, both females
and males fed less chow than control group, however the females on days 1 and 4, and the
males during the four days of test deposited the same score of feces.
Thus, the results indicated that the offspring of RBD group were less active and
defecated more in open-field situation, hence being considered more emotional than control
animals.
The ketogenic diet is a high-fat, low-carbohydrate and low-protein diet, and deficient in
minerals and vitamins (Peterman, 1924; Swink et al., 1997). It is interesting to note that
Murphy and Burnham (2005) in a study on ketogenic diet showed similar results to the
present study. The ketogenic diet group differed from the control group in spending less time
in exploratory behavior and more time immobile. The likeness of the ketogenic diet results to
RBD multideficient diet is remarkable. Although, more direct experiments are required, there
is a possibility that such behavior alterations in rehabilitated females, at least in part,
presented a behavior comparable to the hyperactivity disorder and it is likely that such
changes, are due to micronutrients deficiency. The symptoms of the disorder include
inattentiveness, impulsiveness and overactivity. Children and adults with epilepsy often
exhibit symptoms of Attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) and the ketogenic diet
has proved to be an effective treatment of ADHD symptoms in subjects with epilepsy.
In conclusion, malnutrition introduced at pregnancy and lactation period until 60 days
of age resulted in lower activity level, possibly due to an increased emotionality to novel
environments. In malnourished animals that underwent nutritional recovery, the females were
behaviorally hyperactive, showing that malnutrition may to depress or exacerbate behaviors in
the open field test.
128
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4
6
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10
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Session
Control
Malnourished
Rehabilitated
Fig. 1. Outer locomotor activity of females. Mean number of lines crossed with all four
paws during 5-min session for each testing day in control (n=10), malnourished (n=15) and
rehabilitated (n=14) groups. Values in the same column block with different superscript
letters are significantly different from one another at p<0.05 as determined by Bonferroni post
hoc test.
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Session
Control
Malnourished
Rehabilitated
Fig. 2. Outer locomotor activity of males. Mean number of lines crossed with all four paws
during 5-min session for each testing day in control (n=14), malnourished (n=12) and
rehabilitated (n=13) groups. Values in the same column block with different superscript
letters are significantly different from one another at p<0.05 as determined by Bonferroni post
hoc test.
a
a
b
a
b
c
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b
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Session
Control
Malnourished
Rehabilitated
Fig. 3. Inner locomotor activity of females. Mean number of lines crossed with all four
paws during 5-min session for each testing day in control (n=10), malnourished (n=15) and
rehabilitated (n=14) groups. Values in the same column block with different superscript
letters are significantly different from one another at p<0.05 as determined by Bonferroni post
hoc test.
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Session
Control
Malnourished
Rehabilitated
Fig. 4. Inner locomotor activity of males. Mean number of lines crossed with all four paws
during 5-min session for each testing day in control (n=14), malnourished (n=12) and
rehabilitated (n=13) groups. Values in the same column block with different superscript
letters are significantly different from one another at p<0.05 as determined by Bonferroni post
hoc test.
a
b
c
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Session
Control
Malnourished
Rehabilitated
Fig. 5. Rearing behavior of females. Mean number of times the rats rose on hind legs during
5-min session for each testing day in control (n=10), malnourished (n=15) and rehabilitated
(n=14) groups. Values in the same column block with different superscript letters are
significantly different from one another at p<0.05 as determined by Bonferroni post hoc test.
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Session
Control
Malnourished
Rehabilitated
Fig. 6. Rearing behavior of males. Mean number of times the rats rose on hind legs during
5-min session for each testing day in control (n=14), malnourished (n=12) and rehabilitated
(n=13) groups. Values in the same column block with different superscript letters are
significantly different from one another at p<0.05 as determined by Bonferroni post hoc test.
a
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Session
Control
Malnourished
Rehabilitated
Fig. 7. Grooming behavior of females. Mean number of times the rats cleaned their whiskers
during 5-min session for each testing day in control (n=10), malnourished (n=15) and
rehabilitated (n=14) groups. Values in the same column block with different superscript
letters are significantly different from one another at p<0.05 as determined by Bonferroni post
hoc test.
0
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Session
Control
Malnourished
Rehabilitated
Fig. 8. Grooming behavior of males. Mean number of times the rats cleaned their whiskers
during 5-min session for each testing day in control (n=14), malnourished (n=12) and
rehabilitated (n=13) groups. Values in the same column block with different superscript
letters are significantly different from one another at p<0.05 as determined by Bonferroni post
hoc test.
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Session
Control
Malnourished
Rehabilitated
Fig. 9. Deposition of fecal boli on floor arena by females. Mean number of fecal pellets
produced during 5-min session for each testing day in control (n=10), malnourished (n=15)
and rehabilitated (n=14) groups. Values in the same column block with different superscript
letters are significantly different from one another at p<0.05 as determined by Bonferroni post
hoc test.
0
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1 2 3 4
Session
Control
Malnourished
Rehabilitated
Fig. 10. Deposition of fecal boli on floor arena by males. Mean number of fecal pellets
produced during 5-min session for each testing day in control (n=14), malnourished (n=12)
and rehabilitated (n=13) groups. Values in the same column block with different superscript
letters are significantly different from one another at p<0.05 as determined by Bonferroni post
hoc test.
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138
5 – CONCLUSÃO
• A Dieta Básica Regional (DBR), multideficiente, que constitui a base da alimentação
diária da população desfavorecida da Zona da Mata de Pernambuco contendo em
torno de 8% de proteínas e 1% de lipídios apresentou o seguinte perfil de ácidos
graxos: maior proporção de ácidos graxos saturados, monoinsaturados e dos ácidos
graxos da família n-3 (α-linolênico, EPA e DHA), no entanto, menor proporção dos
ácidos graxos da família n-6, incluindo o linoléico e uma relação n-6/n-3 de 1.69:1.
• A desnutrição imposta pela DBR durante a gestação e lactação mostrou-se mais
deletéria em agravar o estado nutricional materno com relação a diminuição do
consumo alimentar e massa corporal. Tais efeitos ocorreram com maior
predominância durante o período da lactação comparado com o período gestacional.
• Aos 14 dias de lactação, observou-se no leite das ratas desnutridas maior proporção de
ácidos graxos saturados, menor proporção dos ácidos graxos poliinsaturados
essenciais (linoléico e α-linolênico) e do ácido graxo de cadeia longa araquidônico, no
entanto, houve aumento nos teores do ácido docosahexaenóico (DHA) no leite. Tais
alterações refletem, em parte, a composição da dieta ingerida pelas mães e
possivelmente o intenso catabolismo das reservas corpóreas maternas.
• A prole das mães desnutridas, que no período de desmame até 70 dias de vida
consumiu a DBR, apresentou durante este período igual ou maior consumo alimentar
em relação ao grupo controle. No entanto, esta adaptação não foi suficiente para
normalizar a massa corporal, sendo esta significativamente menor nos animais
desnutridos comparada com os outros grupos.
• Na prole de mães desnutridas, que passou por um período de recuperação nutricional
que ocorreu após o desmame até 70° dia de vida (grupo recuperado) observa-se que os
139
animais machos aumentaram o consumo alimentar no final do experimento, embora a
massa corporal desses animais foi menor durante todo o período do estudo com
relação ao controle. As fêmeas recuperadas tiveram um comportamento diferente dos
machos, diminuindo o consumo alimentar no início para em seguida se igualar ao
controle no final do experimento. As fêmeas recuperaram massa corporal, verificada
pela semelhança com o grupo controle a partir do 42° dia de vida.
• Entre os órgãos estudados aos 70 dias de vida, a massa de todos os tecidos foram
afetadas na prole de animais machos e fêmeas alimentados com a DBR. No grupo
recuperado composto por machos, observou-se que a intervenção nutricional com
dieta adequada nutricionalmente pós-desmame não foi capaz de normalizar a massa
tecidual estudada. No entanto, as fêmeas recuperadas apresentaram massa cerebral
semelhante ao grupo controle.
• Em relação ao comportamento dos animais no labirinto aquático de Morris, o grupo
desnutrido apresentou expressivo déficit cognitivo quando comparado ao controle. A
administração da dieta controle (adequada nutricionalmente), a partir do desmame no
grupo recuperado foi capaz de reduzir os déficits causados pela desnutrição,
mostrando que os efeitos da desnutrição, pelo menos com relação a memória espacial,
podem ser revertidos através da dieta.
• No campo aberto, os animais desnutridos, tanto machos quanto fêmeas, apresentaram
menor atividade locomotora externa, assim como menor atividade exploratória. As
fêmeas desnutridas mostraram menor nível de ansiedade apenas no primeiro dia de
teste. Os animais recuperados ao contrário dos desnutridos apresentaram maior
atividade locomotora. A recuperação nutricional causou diminuição da atividade
exploratória apenas nos dias 1 e 4 nas fêmeas e houve aumento gradativo da atividade
exploratória até que no último dia do teste os machos foram semelhantes ao controle.
140
Os animais recuperados mostraram-se menos ansiosos que o grupo controle, pois estes
aumentaram o número de vezes que visitaram a área central durante todo o período
estudado.
• No córtex frontal, tanto de machos quanto de fêmeas, o perfil dos ácidos graxos
apresentou semelhança com o do grupo controle inclusive na relação n-6/n-3, exceto
para o linoléico e o EPA que se apresentaram diminuídos nos animais machos
desnutridos. Ainda no córtex frontal, apesar da não diferença estatística no
desempenho entre os grupos recuperado e o respectivo controle, observa-se que os
machos do grupo recuperado tende a reter melhor a informação do que os machos do
grupo controle. Além disso, estes animais do grupo recuperado apresentaram menor
percentual de ácidos graxos monoinsaturados e poliinsaturados n-3 e n-6, incluindo os
ácidos AA e DHA, comparado ao grupo controle.
• Quando associamos a relação n-6/n-3 no hipocampo com o teste de comportamento
relacionado com a memória espacial (water maze), observamos que o hipocampo dos
machos e fêmeas do grupo desnutrido apresentou inadequada relação a relação n-6/n-3
acompanhado de importante déficit na memória espacial nos animais quando
comparado ao grupo controle e recuperado. Já no grupo recuperado, a relação n-6/n-3
no hipocampo de machos é semelhante ao controle.
• O perfil de ácidos graxos no cerebelo de machos e fêmeas do grupo desnutrido
apresenta diferenças em relação ao controle, como por exemplo, menor porcentagem
de ácidos graxos poliinsaturados n-6 e linoléico e maior de ácidos graxos
poliinsaturados n-3 e DHA. Animais desnutridos mostraram menor atividade
locomotora e exploratória, então este aumento na porcentagem de ácidos graxos da
família n-3 não foi suficiente para resguardar o comportamento destes animais no
campo aberto, visto que os valores de n-6 e linoléico estão diminuídos. Os machos
141
recuperados apresentam menor porcentagem de monoinsaturados e ácido linoléico,
porém mostraram valores aumentados de n-6 + n-3 e isto pode ter favorecido ao
aumento gradativo da atividade exploratória até se tornarem, ao final do teste, iguais
ao grupo controle. Já em relação as fêmeas, estas apresentaram menor somatório de
AA, DHA, ácidos graxos n-3 e n-6 + n-3, isto pode explicar a menor atividade
exploratória das fêmeas nos dias 1 e 4.
Finalmente, os resultados apresentados mostram que a desnutrição imposta pela DBR
em períodos críticos da vida (gestação e lactação) altera, na fase jovem, a habilidade da prole
em reter informações relacionadas à aprendizagem, quais sejam espaciais ou de longa duração
e a atividade locomotora e exploratória. No entanto, a intervenção nutricional foi capaz de
reverter essa deficiência, com diferenças entre machos e fêmeas. Além disso, observa-se uma
nítida associação entre essas alterações e importantes nutrientes requeridos para o
desenvolvimento do SNC. Concentrações aumentadas ou diminuídas provavelmente denotam
que o cérebro desses animais tenta preservar ao máximo suas funções e isto, provavelmente,
altera a absorção, o turnover e a utilização desses nutrientes, buscando um mecanismo
compensatório ao insulto imposto em períodos críticos do desenvolvimento.
142
6 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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