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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E
PARASITOLOGIA
Papel de ExoU na modulação da expressão de moléculas de adesão
por células endoteliais humanas infectadas por Pseudomonas
aeruginosa
Renata Ximenes Lins
Rio de Janeiro
2008
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E
PARASITOLOGIA
Papel de ExoU na modulação da expressão de moléculas de adesão
por células endoteliais humanas infectadas por Pseudomonas
aeruginosa
Renata Ximenes Lins
Rio de Janeiro
2008
Dissertação apresentada à Faculdade de
Ciências Médicas da Universidade do Estado
do Rio de Janeiro visando à obtenção do grau
de Mestre em Microbiologia.
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LINS, Renata Ximenes
Papel de ExoU na modulação da expressão de moléculas de adesão por células
endoteliais humanas infectadas por Pseudomonas aeruginosa. Rio de Janeiro, 2008.
Dissertação (Mestrado) – Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade de
Ciências Médicas, Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia.
xv. 78p.:il.
Orientadora: Alessandra Mattos Saliba
1. Pseudomonas aeruginosa 2. ExoU 3. Sistema de secreção do tipo III 4. Inflamação
5. Moléculas de adesão. 6. Fator Nuclear B.
I. Saliba, Alessandra Mattos. II. Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Faculdade
de Ciências Médicas. III. Papel de ExoU na modulação da expressão de moléculas de
adesão por células endoteliais humanas infectadas por Pseudomonas aeruginosa.
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO
CENTRO BIOMÉDICO
FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA, IMUNOLOGIA E
PARASITOLOGIA
Papel de ExoU na modulação da expressão de moléculas de adesão
por células endoteliais humanas infectadas por Pseudomonas
aeruginosa.
Renata Ximenes Lins
Trabalho realizado na Disciplina de Microbiologia e Imunologia da Faculdade de
Ciências Médicas da Universidade do Estado do Rio de Janeiro sob a orientação da
Dr
a
Alessandra Mattos Saliba
Dissertação apresentada em 21 de julho de 2008.
Banca examinadora:
Dra Lucimar Gonçalves Milagres (presidente)
Dra Patrícia Torres Bozza
Dra Leila Lopes Bezerra
Dr. Raphael Hirata Junior (suplente)
Rio de Janeiro
2008
5
Quero, um dia, poder dizer às pessoas
que nada foi em vão... que o amor existe,
que vale a pena se doar às amizades a às pessoas,
que a vida é bela sim, e que eu sempre dei o melhor de mim...
E que valeu a pena!
(Mário Quintana)
....
6
Agradecimentos
a Deus, por toda a minha vida;
ao meu querido pai, Luiz, pelo amor inesquecível que me deu;
à minha querida mãe, Jane, por todo apoio à minha formação, intelectual e
pessoal;
aos meus irmãos, Luiz Augusto, Januário e Rosana pela dedicação na falta do
meu pai;
à minha tia, Zuleida, por todo seu carinho e atenção;
aos meus demais familiares, que sempre torceram para o meu sucesso, e em
especial aos meus sobrinhos que amo tanto;
à minha orientadora, Dr
a
Alessandra Mattos Saliba, a quem devo muito do meu
aprendizado; obrigada por sua paciência e apoio;
à Dr
a
Maria Cristina Maciel Plotkowski pela acolhida, que me fez ser dela uma
profunda admiradora, por quem sempre terei grande respeito e gratidão;
à Dr
a
Maria Cristina de Assis pela sua constante dedicação, grande exemplo de
altruísmo que tive ao longo deste curso;
ao corpo docente do Departamento de Microbiologia e Imunologia, por todos os
ensinamentos e atenção durante estes anos, e, em especial, ao Professor Dr Rafael
Hirata Júnior e à Dr
a
Ana Luíza Mattos Guaraldi, que já me acompanham desde da
graduação, e por quem tenho grande carinho e gratidão;
à Dr
a
Professora Fátima Alvarenga, a quem devo minha iniciação na pesquisa
em microbiologia, todo o meu carinho;
7
aos funcionários do Departamento de Microbiologia e Imunologia, pelo apoio
técnico e administrativo neste período;
ao secretário Fábio pela atenção no atendimento aos alunos;
aos meus amigos pela compreensão, incentivo e amizade;
aos companheiros do laboratório 4 pela amizade e cooperação, e em especial à
Carla Freitas, que através de sua experiência, muito me transmitiu;
aos meus colegas do curso de mestrado que compartilharam nestes dois anos
todas as alegrias e dificuldades;
aos funcionários do Departamento de Bioquímica, pelo apoio técnico na
realização de alguns ensaios, e em especial ao funcionário Roberto, sempre disposto
a nos ajudar;
à FAPERJ (Fundação de Apoio à Pesquisa do Rio de Janeiro), pelo apoio
financeiro.
8
Sumário
Páginas
Lista de Tabelas 10
Lista de Figuras
11
Lista de Abreviaturas
13
Resumo
14
Abstract
16
1.Introdução
1.1 Pseudomonas aeruginosa
1.2 Células endoteliais na resposta inflamatória
1.3 Molécula de Adesão Intercelular-1 (ICAM-1)
1.4 Fator de Transcrição NF-κB na reposta inflamatória
18
18
25
30
36
2. Objetivos 40
3.Material e Métodos
3.1 Amostras bacterianas
3.2 Cultivo bacteriano e preparo das suspensões
3.3 Cultura de células endoteliais humanas
3.4 Infecção
3.5 Avaliação do efeito da proteína ExoU na expressão de ICAM-1 na
superfície de células endoteliais da linhagem HMEC-1
3.5.1 Avaliação da modulação da expressão de ICAM-1 por
citometria de fluxo
3.5.2 Análise da expressão de ICAM-1 na superfície de células
endoteliais por imunocitoquímica
3.5.3 Avaliação da importância da atividade tipo fosfolipase A
2
de ExoU na expressão de ICAM-1 por citometria de fluxo
3.5.4 Avaliação do papel das vias de cicloxigenase e
lipoxigenase na modulação da expressão de ICAM-1 por citometria de
fluxo
3.6 Avaliação do efeito de ExoU na expressão dos genes de ICAM-1,
VCAM-1 e E-selectina por células endoteliais
3.6.1 Extração do RNA total
3.6.2 Síntese de cDNA
3.6.3 Amplificação dos genes das moléculas de adesão e de β-
actina por PCR
3.7 Dosagem de ICAM-1 solúvel no sobrenadante das culturas de
células endoteliais
3.8 Avaliação do efeito de ExoU sobre a translocação nuclear do fator
41
41
41
42
43
43
43
44
45
45
46
46
46
46
48
49
9
transcricional NF-B por Ensaio de Mudança de Mobilidade
Eletroforética (EMSA)
3.8.1 Extração de proteínas nucleares
3.8.2 Dosagem de proteínas
3.8.3 Reação de marcação radioativa da sonda para NF-B
3.8.4 Reação de ligação do complexo de NF-B à sonda
3.8.5 Eletroforese em gel de poliacrilamida
3.8.6 “Supershift”
3.9 Análise estatística
49
50
50
51
51
52
52
4.Resultados
4.1 ExoU modula a expressão de ICAM-1 na superfície de células
endoteliais
4.2 A atividade fosfolipase A
2
de ExoU é responsável pela redução da
expressão de ICAM-1
4.3 As vias de cicloxigenase e lipoxigenase modulam a expressão de
ICAM-1 na superfície de células endoteliais
4.4 ExoU parece não exercer repressão transcricional sobre ICAM-1,
mas é responsável pela inibição da expressão de outras moléculas de
adesão
4.5 ExoU aumenta a liberação de sICAM-1 no sobrenadante de
células endoteliais após 21 horas de infecção
4.6 ExoU aumenta a translocação nuclear de NF-κB em células
endoteliais após 2 e 12 horas de infecção por P. aeruginosa
53
53
55
58
61
62
63
5.Discussão 66
6.Conclusões 78
7.Referências Bibliográficas 79
10
Lista de Tabelas
Pá
g
inas
Tabela 1 - Indutores e inibidores de sICAM-1..................................................................................34
Tabela 2 - Oligonucleotídeos utilizados e condições de termociclagem das reações de amplificação de
ICAM-1, VCAM-1, E-selectina e β-actina.......................................................................................47
11
Lista de Figuras
Páginas
Figura 1 - Blocos de homologia de ExoU com cPLA
2
s e iPLA
2
s. ...............................06
Figura 2 - Cascata de adesão leucocitária proposta por Ley et al., 2007.......................11
Figura 3 - Esquema da sinalização mediada por ICAM-1 na transmigração de leucócitos 15
Figura 4 - Percentual de células e mediana da intensidade de fluorescência da expressão
de ICAM-1 por células HMEC-1....................................................................................36
Figura 5 - Imunocitoquímica para a expressão de ICAM-1 por células HMEC-1........37
Figura 6 - Efeito de MAFP sobre o percentual de células e mediana da intensidade de
fluorescência da expressão de ICAM-1 por células HMEC-1 39
Figura 7 - Percentual de células HMEC-1 expressando ICAM-1 em culturas infectadas
pela cepa PA103UT/S142A .......................................................................................40
Figura 8 - Efeito do tratamento com ibuprofeno sobre o percentual de células e mediana
da intensidade de fluorescência da expressão de ICAM-1 por células HMEC-1 ..........42
Figura 9 - Efeito do tratamento com NDGA sobre o percentual de células e mediana da
intensidade de fluorescência da expressão de ICAM-1 por células HMEC-1 ...............43
Figura 10 - Eletroforese em gel de agarose representativa de ensaios de RT-PCR semi-
quantitativo para as moléculas de adesão........................................................................44
Figura 11 - Concentração de ICAM-1 solúvel ..............................................................45
Figura 12 - Autorradiografia de ensaio de mobilidade eletroforética após 2 horas de
infecção. .........................................................................................................................46
12
Figura 13 - Autorradiografia de ensaio de mobilidade eletroforética após 12 horas de
infecção..........................................................................................................................47
Figura 14 - Supershift de extrato nuclear de HMEC-1 infectada pela cepa PA103.......48
13
Lista de Abreviaturas
BSA - albumina sérica bovina
CAMs - moléculas de adesão celular
COX-2- cicloxigenase 2
cPLA
2
- fosfolipase A
2
citosólica
DTT - dithiothreitol
EMSA - Ensaio de Mudança de Mobilidade Eletroforética
ICAM-1(CD-54) - molécula de adesão intercelular 1
iPLA
2
- fosfolipase A
2
independente de cálcio
LFA-1- antígeno associado à função de linfócitos
LPS - lipopolissacarídeo
MAFP - metil araquidonil fluorofosfonato
mICAM-1- molécula de ICAM-1 ancorada na membrana celular
NDGA- ácido nodihidroguaiarético
NF-B - Fator Nuclear B
PBS - salina tampão fosfato
PGE
2
-prostaglandina E
2
PGI
2
- prostaciclina
PLA
2
- fosfolipase A
2
iPLA
2
- fosfolipase A
2
independente de cálcio
sICAM-1- molécula de ICAM-1 solúvel
SSTT - sistema de secreção do tipo III
UFC - unidades formadoras de colônias
VCAM-1 - molécula de adesão vascular-1
VEGF - fator de crescimento vascular do endotélio
14
Resumo
Células endoteliais exercem papéis chave na defesa do hospedeiro contra
patógenos, como o recrutamento de leucócitos para o sítio da infecção. Sabendo-se que
a infecção por Pseudomonas aeruginosa gera uma intensa resposta inflamatória e que a
atividade tipo fosfolipase A
2
(PLA
2
) da toxina ExoU parece ser fundamental neste
processo, este trabalho avaliou o efeito de ExoU na modulação da expressão de
moléculas de adesão por células endoteliais infectadas. Para isto, células endoteliais da
linhagem HMEC-1 foram infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de
ExoU) e com as mutantes PA103∆exoU (incapaz de produzir ExoU) e
PA103∆UT/S142A (produtora de ExoU sem atividade PLA
2
). Análises da expressão de
ICAM-1 na membrana de células endoteliais (mICAM-1), por citometria de fluxo e
imunocitoquímica, mostraram que, embora as células infectadas por PA103 e
PA103∆exoU tenham apresentado aumento da expressão de mICAM-1 em relação às
células não infectadas, a expressão de mICAM-1 foi superior nas culturas infectadas
com a cepa mutante. O tratamento com um inibidor de PLA
2
e a infecção com a cepa
PA103∆UT/S142A revelaram que a atividade tipo PLA
2
de ExoU foi responsável pela
redução da expressão de mICAM-1. Já o tratamento com inibidores de cicloxigenase
(COX) ou lipoxigenase mostraram que o efeito de ExoU na expressão de mICAM-1
parece estar relacionado à ativação de COX. Análises por RT-PCR semi-quantitativo
mostraram que ExoU não parece afetar os níveis de mRNA de ICAM-1 nas células
infectadas. Este resultado levou à investigação da liberação de ICAM-1 solúvel
(sICAM-1), que foi maior nas células infectadas pela cepa parental do que nas células
infectadas pela cepa mutante. Este achado sugere que ExoU pode levar à clivagem da
molécula de mICAM-1, gerando sICAM-1. Como a interação entre leucócitos e células
endoteliais depende de outros fatores, como a expressão de outras moléculas de adesão,
foram realizados ensaios de RT-PCR semi-quantitativo para pesquisar o efeito de ExoU
na expressão de E-selectina e VCAM-1. Estes ensaios mostraram que, embora a
infecção por P. aeruginosa tenha levado ao aumento da expressão destas moléculas,
ExoU parece reprimir parcialmente a transcrição de E-selectina e VCAM-1. A avaliação
do papel de ExoU na ativação de NF-kB mostrou uma maior translocação nuclear de
p65/p50 em células infectadas com a cepa PA103 do que em células não infectadas ou
infectadas com a cepa PA103∆exoU. A infiltração de leucócitos durante a infecção por
P. aeruginosa não apenas leva à perda da integridade das barreiras endoteliais,
15
favorecendo a disseminação bacteriana, como também contribui para o dano tecidual
em decorrência da inflamação. Assim, a descoberta de mecanismos celulares alterados
durante o processo infeccioso pode contribuir para a identificação de novos alvos
terapêuticos, visando ao controle da resposta inflamatória e da disseminação bacteriana.
16
Abstract
Endothelial cells play a key role in human host defense against pathogens, such as
leukocyte recruitment to the infection site. Since Pseudomonas aeruginosa causes an
intense inflammatory response and the phospholipase A
2
(PLA
2
)
activity of ExoU toxin
seems to be required in this process, we aimed to investigate the modulation of adhesion
molecules in endothelial cells by ExoU. To address this question, HMEC-1 endothelial
cells were infected with the ExoU-producing P. aeruginosa PA103 strain and the
mutants PA103∆exoU (unable to produce ExoU) and PA103∆UT/S142A (producing
ExoU without PLA
2
activity). Analysis of membrane-bound ICAM-1 (m-ICAM-1)
expression, by flow cytometry and immunocytochemistry, revealed that, although both
PA103- and PA103∆exoU-infected cells have showed increased mICAM-1 expression
compared to non-infected cells, expression of mICAM-1 was higher in PA103∆exoU-
infected cells. The treatment with a PLA
2
inhibitor and the infection with
PA103∆UT/S142A strain showed that ExoU PLA
2
activity was responsible to lower
mICAM-1. Moreover, inhibition of cyclooxygenase (COX) or lipoxygenase suggested
that ExoU effect on mICAM-1 expression probably is related to COX activation. Data
obtained by semi-quantitative RT-PCR indicated that ExoU doesn’t seem to affect
ICAM-1 mRNA levels of infected cells. These findings led us to investigate the
secretion of soluble ICAM-1 (sICAM-1), which was higher in PA103-infected cultures
than in PA103∆exoU-infected cultures. This result may indicate that ExoU induce
mICAM-1 cleavage, producing sICAM-1. As the interaction between leukocytes and
endothelial cells depends on a variety of factors, such as other adhesion molecules, RT-
PCR assays were carried out to address the effect of ExoU on E-selectin and VCAM-1
expression. These analyses showed that although P. aeruginosa have induced the
expression of these molecules, ExoU seems to partially repress E-selectin and VCAM-1
transcription. The assessment of the role of ExoU in NF-kB activation showed an
increased p65/p50 nuclear translocation in endothelial cells infected with PA103 strain,
compared to non-infected or PA103∆exoU-infected cells. The leukocyte infiltration
during infection by P. aeruginosa not only causes loss of the membrane integrity,
favoring bacteria dissemination, but also contributes to damage in inflamed tissues.
Therefore, the discovery of altered cellular mechanisms during the infection may
17
contribute to the identification of new therapeutics’ targets, to obtain the control of the
inflammatory response and the bacteria spreading.
18
1. INTRODUÇÃO
1. Pseudomonas aeruginosa
A espécie P. aeruginosa se apresenta na forma de bastonetes Gram-negativos
não-fermentadores, e se caracteriza pela sua ampla distribuição na natureza graças à sua
flexibilidade metabólica, baixas exigências nutricionais e capacidade de adaptar-se às
variações do meio. São microrganismos ubiquitários, encontrados no solo, na água e nos
vegetais, mas é no ambiente hospitalar que esta bactéria tem sido apontada como uns
dos principais patógenos associados aos processos agudos e crônicos de doenças
nosocomiais, gerando um alto índice de morbidade e mortalidade entre os doentes
(Augustin et. al., 2007; Bodí et. al., 2007). Esta preocupação se torna real especialmente
entre os pacientes imunocomprometidos, queimados, com câncer e aqueles com fibrose
cística, diante de quadros de bacterimia e sepse, além de ser a maior causa de
pneumonia severa em pacientes mecanicamente ventilados (Lyczak et. al., 2000; Matsui
et. al., 2006; Favre-Bonté et. al., 2007).
Classicamente considerada oportunista, em seres humanos saudáveis esta
bactéria raramente é capaz de iniciar uma infecção, mas, diante de um paciente
hospitalizado, seus inúmeros fatores de virulência associados a sua versatilidade
amplificam seu inexorável potencial patogênico. Além disso, o ambiente hospitalar,
saturado de antibióticos, aliado a procedimentos invasivos favorecem a colonização e
infecção por P. aeruginosa (Dalhoff, 1987). Este contexto contribui para a aquisição de
resistência, levando ao crescente aumento de cepas multiresistentes nos últimos anos,
dificultando o tratamento dos pacientes internados (Bodí et. al., 2007).
19
Os múltiplos vieses que podem ser assumidos por P. aeruginosa são atribuídos
ao seu vasto genoma, que codifica uma grande variedade de fatores de virulência,
favorecendo sua sobrevivência frente aos mais diferentes desafios, incluindo os
mecanismos de defesa do hospedeiro (Lee et. al., 2005). Soma-se a esta diversidade
genética o surgimento de bactérias hipermutadas, relatadas com grande proporção entre
as cepas de P. aeruginosa (Hall et. al., 2006). A patogenicidade de P. aeruginosa é
multifatorial (Soscia et. al., 2007); para colonizar e se multiplicar no organismo
hospedeiro, a bactéria dispõe de uma série de fatores de virulência, que incluem desde a
expressão de estruturas na superfície bacteriana (pili, flagelo, cápsula) e formação de
biofilmes à secreção de proteínas efetoras (Lazdunski, 1998).
A expressão de uma variedade de fatores de virulência é controlada pelo sistema
de quorum sensing, mecanismo pelo qual a bactéria coordena sua expressão gênica de
acordo com a população bacteriana do meio através de uma sinalização célula-célula
(Bleves et. al., 2005). Segundo Favre-Bonté et. al., 2007, o circuito de quorum sensing
envolve pelo menos dois autoindutores: N-(3-oxododecanoil)-homoserina lactona (3-
oxo-C
12
-HSL) e N-butiril-L-homoserina lactona (C
4
-HSL), codificados pelos genes lasI
e rhlI respectivamente. A produção destes autoindutores está relacionada à regulação de
fatores de virulência extracelulares e à formação de biofilme.
Dentre os exoprodutos, encontram-se enzimas com diferentes tipos de atividade,
como exotoxina A, ADP-ribosiltransferase, elastase, fosfolipase C, protease alcalina e
neuraminidase, que se relacionam com a habilidade do microrganismo em disseminar-se
pela corrente sanguínea e causar sepse fatal (Sato et. al., 2004). Destaca-se, também, o
lipopolissacarídeo (LPS), estrutura comum a bactérias Gram-negativas, responsável pela
atividade endotóxica (Wieland et. al., 2002). De acordo com Augustin et. al., 2007, o
LPS é o principal fator de virulência de superfície de P. aeruginosa. Esta molécula sofre
20
mudanças de acordo com o modo de vida da bactéria, plantônico ou agregrada em
biofilme, os quais têm sido associados, respectivamente, aos processos infecciosos
agudos e crônicos. Infecções agudas por P. aeruginosa são primariamente mediadas por
bactérias plantônicas expressando o sistema de secreção do tipo III (SSTT), que parece
ter uma forte associação cooperativa com a estrutura do antígeno O da molécula de
LPS, sugerindo uma co-regulação entre estes dois aspectos de virulência.
O crescimento em biofilme, dependente da produção de matriz extracelular
polissacarídea, tem sido associado aos processos infecciosos crônicos, especialmente
nos casos de fibrose cística, e à colonização de superfícies abióticas como catéteres,
lentes de contato e tubos de ventilação (Augustin et. al., 2007; Soscia et. al., 2007).
Esse desenvolvimento em biofilme é coordenado por uma série de eventos, iniciando-se
pela adesão à superfície pelas bactérias plantônicas, seguida da formação de
microcolônias e subsequente diferenciação estrutural que culminará na secreção de
exopolissacarídeos (Ventre et. al., 2006). Este mesmo grupo de pesquisadores propôs
um modelo, através de proteínas quinases sensoras, para as redes de sinalização
envolvidas na regulação da expressão de genes de virulência associados aos estados
crônicos e agudos da infecção, que antagonizam o biofilme ao SSTT.
A formação e maturação do biofilme em P. aeruginosa estão bem documentadas
na literatura em níveis moleculares e envolve um largo arsenal de organelas de
superfície, incluindo flagelo, pili tipo IVa ou tipo IVb. Estudos de Soscia et. al., 2007,
encontraram uma correlação negativa entre motilidade flagelar e eficiência do SSTT.
Uma vez que a estrutura flagelar relaciona-se à formação de biofilme e este está
associado ao perfil crônico da infecção por P. aeruginosa, é presumível que o SSTT
esteja reprimido neste fenótipo. Este fato corrobora com as características da cepa
PA103, que possui um robusto SSTT, mas não apresenta flagelo e nem motilidade.
21
Em estudos que caracterizam isolados clínicos e ambientais de P. aeruginosa,
observa-se que, enquanto a maioria dos isolados do ambiente são positivos para o
SSTT, aproximadamente metade dos isolados de crianças recentemente infectadas
expressam as proteínas do SSTT. Ao contrário, somente uma pequena parte dos
isolados de crianças cronicamente infectadas apresentam habilidade de secretar as
proteínas do SSTT e, menos ainda, os adultos fibrocísticos (Jain et al., 2004). De
acordo com Corech et al., 2005, a expressão do SSTT é comum nos estágios iniciais da
infecção por P. aeruginosa, tendo esta prevalência reduzida nos estágios crônicos. Estes
achados sugerem uma importante atuação do SSTT nos estágios iniciais da colonização
por P. aeruginosa.
Desta forma, entende-se que a expressão dos genes do SSTT é finamente
regulada pelas condições do ambiente, que se traduzirá na patogênese da infecção aguda
ou crônica. Segundo Yahr & Wolfgang, 2006, os dois maiores indutores da expressão
do SSTT são o contato com a célula hospedeira e a concentração extracelular de cálcio,
enquanto sinais repressores incluem estresse metabólico, dano no DNA, altas
concentrações extracelulares de cobre e baixa osmolaridade. Esta expressão condicional
do SSTT é favorável à bactéria, uma vez que conserva suas fontes energéticas e
restringe a expressão das proteínas do SSTT, que são antígenos capazes de desencadear
uma resposta imune do hospedeiro mediada por anticorpos.
Recentemente, são notáveis os esforços dos pesquisadores em elucidar a
complexa rede de regulação transcricional da expressão do SSTT, que é controlada pelo
regulon ExsA. Uma redução na atividade de ExsA poderia melhorar a performance da
terapia antibiótica, assim como a de outros tratamentos para erradicar a infecção e
limitar sua disseminação (Filipon, et al., 2006). Aliás, o SSTT é considerado por muitos
como um fator chave na virulência de P. aeruginosa (Soscia et. al., 2007). Este
22
destaque se dá por sua habilidade de evadir as defesas do hospedeiro, pela translocação
de proteínas citotóxicas ao citoplasma de células eucarióticas (Ghosh, 2004).
Em P. aeruginosa são descritas quatro proteínas efetoras translocadas pelo
SSTT: ExoS, ExoT, ExoY e ExoU (Frank et al., 1997). Enquanto, ExoS e ExoT são
ADP-ribosiltransferases que inibem a fagocitose, desorganizando o citoesqueleto de
actina e a cascata de transdução de sinais, importantes para a funcionalidade da
fagocitose (Barbieri & Sun, 2004); ExoY apresenta atividade de adenilato ciclase,
atuando na célula hospedeira aumentado os níveis de AMP cíclico e interferindo na
morfologia celular (Yahr et al., 1998, Sato & Frank, 2004).
ExoU, que apresenta atividade de fosfolipase A
2
, se destaca pela sua atividade
citotóxica e sua expressão é encontrada nas espécies que causam infecção aguda (Lee et
al., 2007). A secreção de ExoU por P. aeruginosa foi correlacionada com morte de
células eucarióticas, lesão pulmonar, disseminação bacteriana e óbito de animais
experimentais e pacientes (Finck-Barbançon et al., 1997; Hauser et al., 1998; Kurarashi
et al., 1999; Allewelt et al., 2000; Saliba et al., 2006). Essa importância foi ratificada
por estudos clínicos, nos quais a produção da toxina mostrou ser um marcador de
virulência em isolados de P. aeruginosa obtidos de pacientes com pneumonia
nosocomial (Schulert et al., 2003) e bacterimia (Berthelot et al., 2003).
Desta forma, entender plenamente o mecanismo de ação da proteína ExoU ainda é
objetivo de muitos estudos, e Sato et al., em 2003, deram uma importante contribuição
para esta finalidade. Este grupo de pesquisadores descreveu a atividade similar à
fosfolipase A
2
(PLA
2
) apresentada pela proteína ExoU, que, além de possuir atividade
lipásica também ativa lipases da célula hospedeira, desencadeando mecanismos que
levam à perda da integridade da membrana celular. Além disso, foram identificadas três
23
regiões de homologia altamente conservadas entre as proteínas ExoU, as formas
citosólica (cPLA
2
) e independente de cálcio (iPLA
2
) da enzima PLA
2
de células de
mamíferos e patatinas de plantas. Estas últimas são enzimas vegetais com atividades
acil-transferase, esterase e acil-hidrolase lipídicas, agregando assim mais substratos para
a ação lipásica de ExoU e contribuindo para a conseqüente necrose da célula hospedeira
devido ao dano membranar.
A semelhança de ExoU com a patatina, cPLA
2
e iPLA
2
mostrou que o aminoácido
serina na posição 142 e o aspartato na posição 344 são essencias à atividade catalítica da
toxina. Este fato foi comprovado pela supressão da citotoxicidade após a mutagênese
sito-específica destes aminoácidos, com sua substituição por alanina.
Phillips et al., 2003, investigaram a importância da ação fosfolipásica de ExoU
na patogênese da bactéria, empregando inibidores de fosfolipases. Utilizando alguns
diferentes inibidores de fosfolipase A
2
, os autores observaram a supressão do efeito
citotóxico de ExoU, tendo, inclusive, sugerido estas drogas como possíveis
Figura 1- ExoU apresenta dois blocos de homologia com cPLA
2
s, iPLA
2
s e patatinas. Destacadas em azul as regiões altamente
co
n
se
r
vadas
(
Philli
ps
et.
al.
,
2
003).
24
instrumentos terapêuticos nas infecções agudas mediadas por ExoU. O estudo mostrou
que a atividade de ExoU é dependente de co-fatores da célula hospedeira, necessitando
do contato celular para efetivamente exercer seu efeito.
A produção de fosfolipases como fator de virulência não é uma novidade
introduzida por P. aeruginosa. De fato, essa enzima é capaz de propiciar não só a lise
celular, mas também desencadear uma cascata de reações pró-inflamatórias nas células
infectadas. Desde o primeiro estudo publicado 20 anos atrás, demonstrando células
humanas contendo cPLA
2
com especificidade para o ácido araquidônico, uma gama
extensiva de evidências vêm consubstanciando o papel primordial da cPLA
2
como
enzima chave que medeia a liberação do ácido araquidônico para a produção de
eicosanóides, família de substâncias endógenas de biossíntese comum, a partir de ácidos
graxos essenciais, com importante perfil farmacológico (Gosh et al., 2006).
Estudos com camundongos knockout para a enzima cPLA
2
têm contribuído para o
entendimento do papel da mesma em processos fisiológicos e na doença. A contribuição
da enzima em uma série de doenças se destaca naquelas em que a inflamação
desempenha papel central, como reações alérgicas, lesão pulmonar aguda, fibrose
pulmonar, lesão cerebral, artrite, reabsorção óssea e encefalomielite auto-imune (Hegen
et al., 2003 ; Miyaura et al., 2003; Marusic et al., 2005). Em modelos de infecção
pulmonar em murinos knockout de cPLA
2
, os níveis de eicosanóides pró-inflamatórios
encontrados nos lavados bronco-alveolares apresentaram redução significativa (Nagase
et al., 2002).
Estudos de nosso laboratório também corroboraram estes achados através de
investigações do papel da proteína ExoU em modelos de infecção in vitro e in vivo.
Saliba et al., 2005, demonstraram que, na infecção por cepa produtora da toxina ExoU,
25
células endoteliais exibem um aumento expressivo da liberação do ácido araquidônico e
da secreção de dois eicosanóides derivados da via das cicloxigenases (COX):
prostaglandina E
2
(PGE
2
) e prostaciclina (PGI
2
). Além disso, observou-se uma marcante
reação inflamatória provocada por ExoU em dois modelos in vivo de infecção, efeito
que foi significativamente suprimido pela ação de inibidores de cicloxigenase e
lipoxigenase. Adicionalmente, em modelo experimental de infecção respiratória, o
lavado broncoalveolar de camundongos exibiu um grande influxo de células
inflamatórias e liberação de PGE
2
devido à ação da toxina ExoU.
2- Células endoteliais na resposta inflamatória.
Atualmente, o endotélio é reconhecido como regulador ativo e passivo de
processos que envolvem coagulação, adesão plaquetária, homeostase de fluidos,
cicatrização, extravazamento leucocitário e tônus vascular. As células endoteliais
exercem um papel chave para a defesa do hospedeiro contra agentes infecciosos,
regulando a migração de leucócitos para o sítio da infecção, produzindo quimiocinas e
apresentando antígenos através de moléculas de MHC classe II (Behling-Kelly &
Czuprynski, 2007).
Para a manutenção da integridade vascular e da defesa contra patógenos invasivos,
há necessidade de uma rápida regulação das interações adesivas entre as células
sanguíneas e as células endoteliais. O acúmulo de leucócitos no sítio inflamado resulta
de interações adesivas entre as células circulantes e o endotélio vascular, tendo sua
natureza e magnitude dependentes de vários fatores, como expressão de moléculas de
adesão, ativação do endotélio e dos leucócitos e forças hemodinâmicas geradas pelo
movimento do sangue ao longo dos vasos sanguíneos (Granger & Kubes, 1994). A
ativação das células endoteliais possui papel chave na inflamação, pois, através da
26
modulação da resposta imune, estas células podem ativar ou inibir diversos genes
(Stuhlmeier et al., 1997).
Lee et al., 2004, tentando entender os mecanismos celulares e moleculares
envolvidos na resposta inflamatória, empregaram um ensaio de microarranjos de DNA
para investigar o perfil global de expressão gênica de células endoteliais estimuladas
pela citocina IL-4, conhecida por sua participação na inflamação e no estresse oxidativo.
Houve um aumento na expressão de 106 genes, dentre estes, observaram aumento
significativo da expressão das moléculas de adesão estudadas, VCAM-1 e E-selectina.
Durante o processo inflamatório, ocorre uma vasodilatação minutos após uma
lesão aguda, levando inicialmente a um aumento do fluxo sanguíneo local. Segue-se a
vasoconstricção das vênulas pós-capilares, gerando aumento da permeabilidade vascular
e favorecendo o extravasamento de proteínas plasmáticas e de células de defesa. Nesta
fase, os macrófagos presentes nos tecidos secretam quimiocinas que irão ativar o
endotélio, que modula a expressão de moléculas de adesão.
Selectinas são as moléculas responsáveis pela adesão de leucócitos ao endotélio
vascular na fase precoce da cascata de eventos que levam aos processos de inflamação.
Estas proteínas são responsáveis pelo rolamento dos leucócitos junto à parede vascular,
que resultará no extravasamento deste grupo celular aos sítios de lesão. A interação das
selectinas com seus ligantes determina um declínio dramático da velocidade dos
leucócitos, o que permite às proteínas conhecidas como integrinas promoverem ligações
firmes dos leucócitos ao endotélio (Rezavandi et al., 2003).
Desta forma, a interação inicial entre leucócitos e o endotélio ativado é mediada
pela ligação entre selectinas e seus ligantes, mas a adesão íntima entre estas células é
27
mediada pela ligação entre integrinas e moléculas de adesão celular (CAMs).
Neutrófilos aderem firmemente às células endoteliais através da ligação de integrinas a
moléculas de adesão intercelular (ICAM)-1, enquanto monócitos e linfócitos ligam
integrinas a moléculas de adesão de células vasculares (VCAM)-1 expressas na
superfície de células endoteliais. Além disso, ICAM-1 difere das demais moléculas
citadas por sua ampla distribuição tecidual. Como sua expressão não é restrita às células
endoteliais, essa molécula de adesão ajuda a manter os leucócitos e monócitos nos
tecidos inflamados (Aoudjit et al., 1997).
Nas primeiras 4 horas de infecção, a transcrição de E-selectina é ativada para
permitir o rolamento dos neutrófilos nas células endoteliais. Segue-se a indução de
ICAM-1 e VCAM-1 para mediar a adesão firme entre os leucócitos e as células
endoteliais. Enquanto a expressão de VCAM-1 começa a diminuir após 24 horas de
indução, a expressão de ICAM-1 mantém-se elevada enquanto houver a presença de
citocinas pró-inflamatórias (Aoudjit et al., 1997).
Davies et al., 1996 avaliaram a ontogenia das moléculas de adesão através da
comparação de vasos dermais da pele de fetos que sofreram aborto com os da pele de
adultos. Os autores encontraram a expressão das moléculas de adesão logo nos estágios
iniciais de desenvolvimento fetal, fato que já contribui para o sofisticado mecanismo de
sobrevivência imune dos fetos. Estes autores também observaram diferenças na
expressão entre as moléculas, pois enquanto ICAM-1 e P-selectina foram encontradas já
nas primeiras semanas, E-seletina e VCAM-1 não foram observadas, denotando que
estas moléculas necessitam de estímulos inflamatórios para exercerem suas funções.
Nota-se que é complexa a rede de interações moleculares que atuam no processo
de adesão. Os avanços das pesquisas permitiram, recentemente, a proposição de um
28
novo esquema de adesão leucocitária por Ley et al., 2007, incluindo novas etapas e
fatores na cascata de reações, como apresentado na figura 2.
Após seu entendimento fisiológico, destaca-se a avaliação do papel destas
moléculas de adesão em inúmeras patologias como, por exemplo, em infecções nas
quais bactérias patogênicas invadem os tecidos do hospedeiro através de sua habilidade
de aderir às CAMs. As proteínas de superfície são alvos do primeiro contato que o
microrganismo exerce para interagir e aderir aos tecidos do hospedeiro (Vieira, et al.,
2007).
Inúmeros estudos exploram a interferência de microrganismos sobre a expressão
das moléculas de adesão e o papel destas moléculas no curso da infecção (Sellati et al.,
1995; Hobden et al., 1998; Zanone et al., 2003; Moreland et al., 2004), e na patogênese
de doenças inflamatórias, como doenças cardiovasculares, arteriosclerose e periodontite
(Lee et al., 2004; Mahmoudi et al., 2007; Rezavandi et al., 2003). Na maioria destes
estudos, é encontrada uma correlação positiva entre infecção e inflamação, com o
aumento da expressão de moléculas de adesão em células endoteliais. Segundo Amin et
Figura 2- Atualização da cascata de adesão leucocitária. Em negrito estão as três etapas originais. As etapas adicionais incluem
captura, rolamento lento, adesão forte e disseminação, penetração intravascular e transmigração paracelular e transcelular (Ley
et. al., 2007).
29
al., 2006, as moléculas VCAM-1 e ICAM-1 podem ser usadas como um fidedigno
marcador da extensão e progressão da arteriosclerose, e a expressão focal de moléculas
de adesão é consistentemente encontrada em placas arterioscleróticas de humanos. Já
em 1997, Naged et al. realizaram um estudo in vivo com camundongos knockout para
moléculas de adesão e observaram que estas cobaias eram resistentes à arteriosclerose,
mesmo recebendo uma dieta aterogênica. Estes estudos demonstram o papel das
moléculas de adesão em doenças mediadas pelo sistema imune.
A infecção por P. aeruginosa também é capaz de modular a expressão de
moléculas de adesão em fibroblastos, células epiteliais e endoteliais (Darveau et al.,
1995; Lin et al., 2002; Smith et al., 2002; Look et al., 2005). Este aspecto, em geral, é
acompanhado pelo aumento de outros genes envolvidos na reação inflamatória,
especialmente quimiocinas, controlados por reguladores transcricionais comuns.
A infecção por P. aeruginosa se caracteriza por uma intensa reação inflamatória,
fato que torna bastante relevante o entendimento das interações envolvidas neste
processo. A infiltração de neutrófilos em resposta à adesão de P. aeruginosa ao epitélio
respiratório também parece ser aumentada pela secreção de citocinas (Sadikot et al.,
2006; Joseph et al., 2005; Mori et al., 1999). Estudos mostraram que diversos fatores de
virulência de P. aeruginosa, incluindo pili, flagelo e peptideoglicano, induzem a
expressão de quimiocinas para neutrófilos, principalmente IL-8 (DiMango et al., 1995).
Poucos estudos na literatura, entretanto, relacionam a infecção por P. aeruginosa
às moléculas de adesão. Hobden et al., 1999 destacaram a importância de ICAM-1 na
patogênese da queratite por P. aeruginosa em camundongos knockout para a molécula
de adesão. Os camundongos knockout para ICAM-1 apresentaram significativamente
menos doença ocular que os camundongos selvagens, sugerindo que ICAM-1 contribui
para a gravidade da doença em resposta à infecção por P. aeruginosa.
30
No entanto, nenhum estudo na literatura relaciona a toxina ExoU de P.
aeruginosa à expressão de moléculas de adesão e à regulação transcricional de genes
pró-inflamatórios.
3- Molécula de Adesão Intercelular-1 (ICAM-1).
A molécula de ICAM-1(CD-54) surgiu como mediadora do processo de interação
celular a partir de estudos com a molécula LFA-1 (antígeno associado à função de
linfócitos), uma proteína encontrada em células linfóides e mielóides com papel
reconhecido na adesão célula-célula. Estudos envolvendo anticorpos anti-ICAM-1 para
bloqueio da adesão sugeriram que ICAM-1 seria um ligante para LFA-1 (Bierer &
Burakoff, 1988). Além disso, estudos com a molécula de ICAM-1 purificada
demonstraram sua ligação às células T, B e mielóides (Makgoba et al., 1988).
Vedder et al., 1988, também relataram o papel relevante da adesão leucocitária no
desenvolvimento da falência múltipla de órgãos e morte após isquemia-reperfusão
generalizada. Estes autores observaram redução significativa da lesão com o bloqueio
da adesão, empregando anticorpos anti-Mac-1, uma outra glicoproteína de leucócitos,
da família das integrinas, que também se liga à ICAM-1 no processo de adesão
leucocitária (Diamond et al., 1990).
Desde então, ICAM-1 vem sendo amplamente estudada e se destaca por ser
considerado o mais importante receptor para a adesão firme de leucócitos a células
endoteliais (Vestweber, 2007). Desta forma, é a principal molécula de adesão da família
de ICAMs, composta por mais quatro moléculas: ICAM-2, -3, -4 e -5 (Gahmberg, 1997,
Stanley et al., 2000), que também são expressas constitutivamente pelas células
endoteliais. ICAM-1 é uma glicoproteína de membrana composta de dímeros ligados
não-covalentemente, que possui cinco domínios semelhantes aos de imunoglobulina,
31
um domínio transmembrana hidrofóbico e um curto domínio citoplasmático. No
primeiro e no terceiro domínios reside a afinidade de ligação às integrinas de leucócitos
LFA-1 e Mac-1, respectivamente. Além disso, ICAM-1 também é receptor para o
fibrinogênio de linfócitos, para a maioria dos rinovírus e para o seqüestro de
Plasmodium falciparum por eritrócitos (Casasnovas et al., 1998, Cook-Mills & Deem,
2005).
Em 1998, Casasnovas et al. mostraram que ICAM-1 dimérico se liga à LFA-1
com afinidade muito maior que ICAM-1 monomérico. Já Green et al., 2006,
demonstraram que o aumento da afinidade de LFA-1 durante o rolamento de leucócitos
proporciona a sinalização necessária à transmigração destas células no endotélio
inflamado. Assim, a interação entre ICAM-1 e LFA-1 nos leucócitos aderidos ao
endotélio depende da dimerização de ICAM-1 e do estado de ativação de LFA-1,
sugerindo que mudanças conformacionais regulam a afinidade molecular e a
estabilidade da adesão (Sarantos et al., 2005).
Diferentemente das outras moléculas de sua família, ICAM-1 é constitutivamente
expressa não apenas por células endoteliais, mas também por vários outros tipos
celulares, como fibroblastos, células epiteliais, linfócitos, monócitos e eritrócitos
(Davies et al., 1996). Após estimulação por mediadores inflamatórios, como TNF- e
IL-1, sua expressão é fortemente induzida em células endoteliais da macrovasculatura
em áreas inflamadas in vivo e também em células endoteliais da macro e
microvasculatura em estudos in vitro (Van Buul et al., 2007).
Além de seu inquestionável papel na adesão de leucócitos, ICAM-1 é a única
proteína de membrana que tem sido sugerida como participante na diapedese juncional e
transcelular (Vestweber, 2007). Utilizando células endoteliais de veias umbilicais
humanas (HUVECs) transformadas, Yang et al., 2005, demonstraram que a indução da
32
expressão de ICAM-1 contribui para um aumento de até 50% da diapedese transcelular.
Este papel também foi descrito na transmigração de células T por Reiss et al., 1998,
que, empregando células de endotelioma de camundongos, sugeriram a participação
essencial de ICAM-1 e ICAM-2 neste processo.
Recentes estudos têm identificado os papéis de ICAM-1, e possivelmente ICAM-
2, na sinalização celular. Estas proteínas induzem um amplo espectro de eventos de
sinalização intracelular no endotélio, levando ao aumento de cálcio citosólico livre,
ativação da tirosina cinase p60Src e das pequenas GTPases RhoA e ao rearranjo do
citoesqueleto. RhoA parece ter um papel chave na sinalização gerada por ICAM-1 e na
iniciação da sinalização intracelular dependente do citoesqueleto de actina (Van Buul et
al., 2007).
A ligação a ICAM-1 também resulta na produção de inositol fosfato e na
fosforilação de PLC. Etienne-Manneville et al., 2000, demonstraram que, quelando
íons cálcio ou inibindo PKC em células endoteliais cerebrais de camundongos tratadas
com IFN-, havia bloqueio da transmigração de linfócitos dependente de ICAM-1, sem,
no entanto, afetar a adesão destas células. A isoforma regulada por cálcio da enzima
PKC está envolvida na fosforilação da tirosina cinase Src e da cortactina. Aliás, PKC e
Rho também são necessárias para a fosforilação estimulada por ICAM-1, da cinase de
Figura 3 - Esquema da sinalização mediada por ICAM-1 na transmigração endotelial de leucócitos (Van Buul et. al., 2007).
33
adesão focal (FAK), paxilina e da p130
cas
, assim como para a formação da fibra de
estresse em células endoteliais cerebrais tratadas com IFN- (Cook-Mills & Deem,
2005). Em suma, vários dos sinais gerados pela ligação a ICAM-1 que determinam a
organização do citoesqueleto de células endoteliais podem ser importantes para a
migração leucocitária ou, ainda, para a regulação da adesão focal, conhecidamente
modulada pela paxilina e FAK.
Esta sinalização pode ser recíproca, ou seja, ICAM-1 também pode desencadear
uma cascata de sinalização na célula com a qual está interagindo. De acordo com
Lebedeva et al., 2005, o papel da molécula de ICAM-1 é crucial para a ativação de
células T CD8(+) na ausência da co-estimulação fornecida pelas moléculas CD80 e
CD86. A ligação de ICAM-1 nas células alvo permite o recrutamento das moléculas de
MHC de classe I para a área de sinapse, facilitando a apresentação do antígeno ao
linfócito T citotóxico.
Watabe et al., 2007, também demonstraram recentemente a importância de ICAM-
1 na adesão e ativação de linfócitos T CD4(+) em pacientes portadores de psoríase.
Utilizando anticorpos anti-ICAM-1, os autores observaram uma drástica redução na
adesão de células mononucleares isoladas de pacientes com psoríase às células
endoteliais cultivadas in vitro.
Esta sinalização celular desencadeada pela molécula de ICAM-1 se dá
principalmente pelos domínios citoplasmáticos da molécula ancorada à membrana
citoplasmática, porém ICAM-1 também pode ser encontrada em uma forma circulante,
denominada ICAM-1 solúvel (sICAM-1). Como já descrito, a interação entre ICAM-1 e
LFA-1 facilita a adesão leucocitária e a transmigração no endotélio, porém a ligação de
sICAM-1 a LFA1 é capaz de inibir a ligação de linfócitos às células endoteliais
(Rieckmann et al., 1995).
34
Encontra-se descrita na literatura a presença de sICAM-1 em fluidos corpóreos
como plasma, líquido cerebroespinhal, líquido sinovial, saliva, urina e lavado
broncoalveolar. A liberação de ICAM-1 solúvel é modulada por vários fatores e
citocinas, de acordo com a tabela 1. Os mecanismos que promovem a geração de
sICAM-1 ainda não estão completamente elucidados. Estudos in vitro empregando
cultura de células endoteliais sugeriram que sICAM-1 reflete a expressão de ICAM-1
nestas células e que a liberação de ICAM-1 da membrana celular ocorre via clivagem
proteolítica mediada por proteases específicas. Entretanto, outros estudos relataram a
existência de transcritos de RNA mensageiros específicos para a molécula de sICAM-1.
Assim, ao menos dois mecanismos devem estar envolvidos na geração de sICAM-1
(Witkowska & Borawska, 2004).
Indutores Inibidores
IL-1
IL-6
INF-γ
angiotensina II,
ácidos graxos saturados
álcool
IL-10
TGF -1
Rinovírus
insulina
n-3 ácidos graxos
antioxidantes
ICAM-1 e sua forma circulante estão implicadas no desenvolvimento de inúmeras
patologias e alguns autores sugerem que a forma solúvel da molécula pode ser utilizada
como marcador de diagnóstico e progressão de doenças associadas a inflamação de
paredes vasculares. Em artrite reumatóide complicada por vasculite, por exemplo, a
concentração de sICAM-1 é claramente superior quando comparada à apresentada por
Tabela 1 - Indutores e inibidores de sICAM-1 (Witkowska & Borawska, 2004).
35
pacientes sem vasculite, sugerindo que maiores concentrações da molécula solúvel
refletem envolvimento vascular na doença.
Níveis elevados de sICAM-1 também estão associados com fatores de riscos
cardiovasculares, assim como hipertensão, fumo e consumo de álcool. Considerado um
possível marcador de eventos inflamatórios, sICAM-1 foi relacionada ao aumento da
pressão sanguínea sistólica (Witkowska & Borawska, 2004). Em um estudo
prospectivo, Blankenberg et al., 2001, avaliaram o efeito de moléculas de adesão
solúveis no risco de futuras ocorrências cardiovasculares entre pacientes com doença
coronária arterial documentada angiograficamente. Os autores observaram uma
correlação significativa entre as moléculas de adesão solúveis e o futuro óbito por causa
cardiovascular nos pacientes estudados.
Sessler et al., 1995 já haviam sugerido sICAM-1 como um possível marcador da
ativação de células endoteliais, correlacionando esta molécula a conseqüências da sepse,
como falência múltipla de órgãos e morte. Estes autores observaram uma relação
positiva entre as concentrações de sICAM-1 e agravidade do choque séptico. Mais
recentemente, Briassoulis et al., 2007, realizaram um estudo longitudinal que
correlacionou a significância clínica dos níveis de sICAM-1 e alguns outros marcadores
com o prognóstico de crianças com sepse, trauma cerebral agudo e síndrome do estresse
respiratório agudo. Os autores observaram que os níveis de sICAM-1 se encontravam
aumentados e que este dado pode ser valioso na predição dos quadros clínicos
avaliados.
Outro significado clínico relevante da concentração de sICAM-1 é observado em
alguns tipos de câncer. Os níveis séricos de sICAM-1 se correlacionam à progressão do
tumor em melanomas e câncer coloretal e gástrico, refletindo-se no tamanho do tumor e
na presença de metástases (Witkowska & Borawska, 2004).
36
Portanto, apesar das funções de sICAM-1 não estarem completamente elucidadas,
evidências sugerem sua implicação na evolução de inúmeras doenças. Assim, este
conhecimento torna-se importante para a identificação de riscos futuros e para
diagonósticos precoces.
4- Fator de Transcrição NF-κB na reposta inflamatória.
A regulação da transcrição de diversos genes que promovem a resposta
inflamatória envolve a ativação de membros da família NF-κB. Quando organizados em
homo ou heterodímeros, os membros desta família (p50, p52, p65, RelB e c-Rel) podem
atuar como fatores de transcrição. Para isso, os dímeros precisam ser translocados para
o núcleo, onde se ligam a seqüências polinucleotídicas consensos localizadas na região
promotora do gene a ser regulado. Geralmente, NF-κB encontra-se complexado a
moléculas inibitórias, denominadas IκB, que seqüestram NF-κB no citoplasma.
Estímulos pró-inflamatórios, entre outros, levam à fosforilação de IκB, promovendo a
ubiquitinação e degradação desta molécula pelo proteossoma 26S e, conseqüentemente,
a translocação de NF-κB para o núcleo (Karin & Lin, 2002).
Em uma revisão de literatura realizada por Pahl, 1999, o autor lista mais de 150
genes que são regulados pelo fator transcricional NF-κB. A maioria das proteínas
codificada pelos genes regulados participa da respota imunológica, e inclui diferentes
citocinas e quimiocinas, receptores requeridos no reconhecimento antigênico, proteínas
envolvidas na apresentação de antígenos e receptores necessários à adesão de
neutrófilos e à migração transendotelial. Além disso, o autor ainda relata que NF-κB é
capaz de inibir a apoptose em diversos tipos celulares, sugerindo que este fator
transcricional é um mediador central entre a resposta ao estresse e a sobrevivência da
célula.
37
Desta forma, NF-κB exerce um importante papel na imunidade inata e vem sendo
objeto de muitas pesquisas que buscam compreender os mecanismos envolvidos na
regulação inflamatória. Bohrer et al., 1997, correlacionaram pacientes com sepse à
atividade de NF-κB e à mortalidade. Os autores observaram que, entre os pacientes que
não sobreviveram, existia um aumento significativo da atividade de NF-κB em relação
aos sobreviventes.
Stuhlmeier et al., 1997, demonstraram em estudo in vitro que o ácido
araquidônico inibe a translocação nuclear de NF-κB em células endoteliais, bloqueando
a degradação de seu inibidor IκB e estabilizando o complexo IκB/NF-κB. Com base
nestes achados, os autores sugeriram a utilização de análagos do ácido araquidônico
como possíveis drogas antiinflamatórias.
Caposio et al., 2007, avaliaram a atividade de um inibidor da enzima IKK2 em
células endoteliais infectadas por citomegalovírus humano, patógeno capaz de infectar o
endotélio vascular, ativar NF-κB e desregular a expressão de genes pró-inflamatórios.
IKK2 é uma subunidade do complexo IκB cinase, responsável pela fosforilação e
conseqüente translocação nuclear dos dímeros de NF-κB. Estes autores observaram que
a inibição de IKK2 contribuiu significativamente para a redução da patogênese,
limitando a replicação viral e prevenindo a indução da expressão de ICAM-1, IL-8,
RANTES, IP-10, I-TAC e COX-2.
O envolvimento de NF-κB na regulação da expressão de ICAM-1 está bem
estabelecido na literatura. Aoudjit et al., 1997, avaliaram os mecanismos transcricionais
envolvidos na estimulação da expressão do gene de ICAM-1 por TNF-. Observaram
que os heterodímeros de NF-κB p65/p50 e p65/c-Rel são os maiores transativadores da
sequência promotora do gene de ICAM-1. True et al., 2000 sugeriram que TNF-
38
confere competência transcricional a NF-κB através da geração de sinais que
determinam a fosforilação de p65.
A modulação da ativação de NF-κB por infecções bacterianas também já foi
largamente explorada em pesquisas científicas. Beck et al., 2006, avaliaram o papel de
fatores de transcrição na resposta de células endoteliais ao LPS. Neste estudo, os autores
classificaram a resposta inflamatória de culturas de HUVEC ao LPS em dois tipos: tipo
I para respostas mais brandas e tipo II para respostas mais robustas. Observaram que em
todas as culturas havia ativação de NF-κB, porém no tipo I era necessária maior
concentração de LPS para a máxima ativação do fator transcricional.
Chen et al., 2007, examinando a resposta de células endoteliais e de macrófagos
do fígado à endotoxemia aguda, observaram que ambas as células apresentavam
ativação constitutiva de NF-κB e, que, após estímulo, ocorria rápido aumento da
ativação deste fator transcricional. No entanto, enquanto nos macrófagos a ativação
retornava a níveis basais após 3 horas, nas células endoteliais persistia ao menos por 24
horas.
Embora estudos anteriores tenham mostrado que P. aeruginosa é capaz de ativar
NF-κB em células epiteliais (Joseph et al., 2005, Reiniger et al., 2007) e monocíticas
(Lagoumintzis et al., 2003), nenhum trabalho mostrou o papel de ExoU na modulação
deste fator transcricional. Em estudo recente, Reiniger et al., 2007, relataram o papel
crítico da imunidade inata no combate a P. aeruginosa durante a infecção do trato
respiratório. Os autores concluíram que, para uma resposta eficiente, era necessária a
rápida translocação de NF-κB para o núcleo de células epiteliais respiratórias. Embora
essa translocação tenha sido independente dos receptores Toll, camundongos knockout
para MyD88 e para o receptor de IL-1(IL-1R) falharam na rápida translocação de NF-
39
κB. Segundo os autores a rápida liberação de IL-1 e a sinalização via IL-1R
representam etapas chaves para a imunidade inata frente a P. aeruginosa.
Deste modo, a identificação de fatores de virulência que possam estar envolvidos
na ativação de NF-κB representa um importante avanço na pesquisa dos mecanismos
patogênicos implicados na infecção por P. aeruginosa.
40
2. OBJETIVOS
O objetivo geral deste estudo foi avaliar o papel de ExoU na modulação da
expressão de moléculas de adesão em células endoteliais humanas infectadas por P.
aeruginosa.
Os objetivos específicos foram:
• Avaliar o efeito de ExoU na expressão de ICAM-1 na superfície celular;
• Avaliar o efeito de ExoU na secreção de ICAM-1 solúvel por células endoteliais;
• Avaliar o efeito de ExoU na expressão dos genes das moléculas de adesão ICAM-1,
VCAM-1 e E-selectina;
• Avaliar o efeito de ExoU na translocação nuclear do fator transcricional NF-κB.
41
3. MATERIAL E MÉTODOS
1. Amostras bacterianas.
As cepas de P. aeruginosa utilizadas em nossos ensaios foram selecionadas com
o objetivo de avaliar o efeito da proteína ExoU. Desta forma, utilizamos a cepa PA103,
capaz de produzir ExoU (Finck-Barbaçon et al.,1997), e sua cepa mutante isogênica,
PA103∆exoU, obtida por deleção de exoU (Saliba et al. 2005), sendo, portanto, incapaz
de produzir a proteína ExoU. Além destas, acrescentamos em alguns ensaios a cepa
PA103∆UT/S142A, uma mutante gentilmente cedida pelo Dr. A. Hauser (Northwestern
University, Califórnia), com deleção do gene exoU e complementação com o mesmo
gene, porém apresentando mutagênese sítio-específica no domínio catalítico de
atividade tipo fosfolipase A
2
de ExoU (Rabin & Hauser, 2005).
Para os estoques das bactérias, utilizou-se o meio “Luria Broth Base” (LB,
Invitrogen), contendo 20% de glicerol. Os estoques foram mantidos a -20°C.
2. Cultivo bacteriano e preparo das suspensões.
A cada teste realizado, alíquotas do estoque foram semeadas em meio LB
(Invitrogen), e incubadas a 37°C, sob agitação (Environ shaker, Lab-line) de 200 rpm,
por 16 a 18 horas. Em seguida, as culturas foram centrifugadas por 10 minutos a uma
velocidade de 1800 x g em centrífuga clínica (IEKE), para a sedimentação bacteriana e
descarte dos sobrenadantes. Os sedimentos bacterianos foram ressuspensos em meio
MCDB-131 (Sigma-Aldrich) complementado com 10% de SFB (Invitrogen), glutamina
a 250 µg/mL (Isofar), fator de crescimento epidérmico a 10 ng/mL (EGF; Sigma-
Aldrich) e hidrocortisona a 1 µg/mL (Sigma-Aldrich), e padronizados por
espectrofotometria (colorímetro B440, Micronal), de modo a serem produzidas
suspensões com absorbância igual a 0,1, em 600nm de comprimento de onda (A
660nm
=
42
0,1), que corresponde a uma concentração de aproximadamente 10
8
unidades
formadoras de colônias (UFC) por mililitro de meio.
3. Cultura de células endoteliais humanas.
Empregou-se, neste estudo, células endoteliais imortalizadas de microcapilares
da derme humana da linhagem HMEC-1 (Bouïs et al., 2002), gentilmente cedidas pela
Dra. Legrand (Unidade INSERM 359, Instituto Pasteur, França) entre a 25
a
e 40
a
passagens. Seu cultivo se procedeu em garrafas de cultura de células de 25 ou de 75
cm
2
, sob atmosfera com 5% de CO
2
,
a 37
o
C, em meio MCDB-131 contendo 10% de
SFB, glutamina a 250 µg/mL, EGF a 10 ng/mL, hidrocortisona a 1 µg/mL, gentamicina
a 50 µg/mL (Hipolabor) e anfotericina B a 2,5 µg/mL (Bristol-Myers Squilb) (meio
completo), até que as culturas se tornassem confluentes.
Para a realização dos experimentos, as células foram tripsinizadas para sua
dissociação das garrafas, através do seguinte procedimento: após o desprezo do meio de
cultura, os tapetes celulares foram lavados com solução salina tampão fosfato contendo
2% de glicose (PBS-G) e, posteriormente, tratados com solução contendo tripsina
(0,05%) e EDTA (0,005%) em salina tampão Dulbeco sem cálcio e magnésio com 1%
de vermelho de fenol (solução tripsina-EDTA). Após arredondamento das células, as
garrafas foram incubadas por 5 minutos em atmosfera com 5% de CO
2
, a 37
o
C. As
células dissociadas das garrafas foram ressuspensas em meio completo e uma alíquota
da suspensão celular foi diluída em azul de tripan a 0,4% e observada em câmara de
Neubauer, sob microscopia de luz invertida, para a estimativa da concentração de
células viáveis. Seguiu-se o ajuste do volume necessário para a obtenção da
concentração desejada (1,5 x 10
5
células/poço em microplacas de 24 poços ou 7,5 x 10
5
células/garrafa de 25 cm
2
). As células foram, então, incubadas por 48 horas em estufa
43
com 5% de CO
2
a uma temperatura de 37 °C, estando aptas à realização do
experimento.
4. Infecção.
Células endoteliais da linhagem HMEC-1, cultivadas em microplacas de 24
poços ou em garrafas de 25 cm
2
, foram submetidas à infecção com as suspensões
bacterianas das cepas de P. aeruginosa PA103 , PA103∆exoU e PA103∆UT/S142A, ou
a tratamento com meio MCDB-131 sem antibiótico. Em seguida, as placas ou garrafas
foram centrifugadas (1000 x g, por 10 minutos, a 4
o
C) para favorecer o contato entre as
bactérias e as células hospedeiras. Após incubação por 1 hora, a 37
o
C, em atmosfera
contendo cerca de 5% de CO
2
, as culturas foram tratadas com meio de cultura contendo
300 µg/mL de gentamicina, para eliminação dos microrganismos extracelulares. Em
seguida as culturas foram incubadas por diferentes períodos de tempo, de acordo com o
teste realizado.
5. Avaliação do efeito da proteína ExoU na expressão de ICAM-1 na
superfície de células endoteliais da linhagem HMEC-1.
5.1. Avaliação da modulação da expressão de ICAM-1 por citometria de
fluxo.
Células endoteliais da linhagem HMEC-1, cultivadas em microplacas de 24
poços, foram submetidas à infecção pelas cepas de P. aeruginosa PA103 e
PA103∆exoU ou a tratamento com meio MCDB-131 sem antibiótico, e incubadas com
meio contendo gentamicina por mais 5 ou 20 horas. Em seguida, as células foram
tripsinizadas e centrifugadas a 3000 x g, por 10 minutos, a 4
o
C, para descarte dos
sobrenadantes e ressuspensão dos sedimentos em 500 µL de PBS-G. Após nova
centrifugação e descarte do sobrenadante, as células foram fixadas em solução contendo
4% de paraformaldeído e 4% de sacarose em PBS 0,01M, por 20 minutos, a temperatura
44
ambiente. Seguiu-se centrifugação a 3000 x g, por 10 minutos, a 4 °C, e lavagem das
células com PBS-G. Após nova centrifugação, as células foram ressuspensas em PBS-G
contendo 3% de albumina sérica bovina (PBS-BSA 3%) e incubadas por 30 minutos à
temperatura ambiente. Seguiu-se adição de anticorpo anti-ICAM-1 conjugado a
ficoeritrina a 1/50 em PBS-BSA 1%. Para controle de marcações inespecíficas, algumas
células foram marcadas com o isotipo do anticorpo utilizado conjugado ao mesmo
fluoróforo. Após incubação por 1 hora, a 4 °C, as células foram centrifugadas, lavadas
com PBS-G e ressuspensas em 250 µL de PBS-BSA 1%. Seguiu-se a análise de 10 000
eventos em citômetro de fluxo (FACScalibur, BD). Os resultados obtidos foram
avaliados pelo “software” Windows Multiple Document Interface Flow Cytometry
Application (WinMDI), versão 2.8.
5.2. Análise da expressão de ICAM-1 na superfície de células endoteliais por
imunocitoquímica.
Suspensões celulares na concentração de 0,5 x 10
5
células/mL foram cultivadas
sobre lamínulas de vidro depositadas nos poços de microplacas de 24 poços, de modo a
serem obtidas, após 48 horas de cultivo a 37
o
C, culturas não confluentes. Seguiu-se a
infecção com suspensões das cepas PA103 e PA103∆exoU ou adição de meio de cultura
por 24 horas, lavagem com PBS-G e fixação com solução contendo 4% de
paraformaldeído e 4% de sacarose em PBS 0,01M. Após 3 lavagens com 500 µL de
PBS-G, as células foram tratadas por 30 minutos com PBS-BSA 3%, e, em seguida,
incubadas com solução de anticorpo primário anti-ICAM-1 conjugado à ficoeritrina em
PBS-BSA 1%, por 1 hora, em câmara úmida e à temperatura ambiente. Seguiram-se
lavagens com PBS, montagem das lamínulas sobre lâminas de microscopia com N-
propilgalato e observação em microscópio de fluorescência. Células marcadas com o
isotipo do anticorpo anti-ICAM-1 foram utilizadas como controle negativo da reação.
45
5.3 Avaliação da importância da atividade tipo fosfolipase A
2
de ExoU na
expressão de ICAM-1 por citometria de fluxo.
Buscando-se relacionar a atividade tipo fosfolipase A
2
de ExoU com a expressão
de ICAM-1 por células endoteliais humanas, foram realizados testes utilizando-se o
composto metil araquidonil fluorofosfonato (MAFP, Biomol), capaz de inibir as
fosfolipases A
2
citosólica e independente de Ca
2+
. Células HMEC-1 foram infectadas
com as cepas bacterianas PA103 e PA103∆exoU previamente tratadas ou não, com 100
µM de MAFP, por 30 minutos, ou tratadas com meio de cultura em presença ou não do
composto.
Para assegurar que o efeito do tratamento com MAFP observado não foi
decorrente da inibição da fosfolipase A
2
da célula hospedeira, as culturas também foram
infectadas com uma cepa que apresenta uma mutação pontual no sítio catalítico da
atividade fosfolipase A
2
de ExoU, denominada PA103UT/S142A.
A expressão de ICAM-1 na superfície das células endoteliais foi avaliada por
citometria de fluxo, como descrito no item 5.1.
5.4 Avaliação do papel das vias de cicloxigenase e lipoxigenase na
modulação da expressão de ICAM-1 por citometria de fluxo.
Nestes ensaios, células semeadas em microplacas de 24 poços foram tratadas ou
não com 100 µM do inibidor de cicloxigenases, ibuprofeno (Biomol, Plymouth
Meeting, PA), ou com 1,25 µM do inibidor de lipoxigenases, ácido nodihidroguaiarético
(NDGA- Biomol Plymouth Meeting, PA), por 1 hora, a 37
o
C e 5% de CO
2
. Em
seguida, as células foram infectadas com as suspensões bacterianas das cepas PA103 e
PA103∆exoU, ou tratadas com meio de cultura, na presença ou não do inibidor. A
expressão de ICAM-1 na superfície das células endoteliais foi avaliada por citometria de
fluxo, como descrito no item 5.1.
46
6 - Avaliação do efeito de ExoU na expressão dos genes de ICAM-1,
VCAM-1 e E-selectina por células endoteliais.
6.1 - Extração do RNA total.
O RNA total de células não-infectadas (controle) e infectadas por 4 e 18 horas,
pelas cepas PA103 e PA103∆exoU, foi isolado com o kit RNeasy (Qiagen), seguindo
recomendações do fabricante. As suspensões celulares foram lisadas, lavadas com
etanol, e o RNA retido na membrana de sílica-gel foi eluído em 30 µL de água livre de
RNase. A concentração e a pureza das amostras foram determinadas por
espectrofotometria em comprimentos de onda de 260nm e 280nm.
6.2 - Síntese de cDNA.
Uma amostra do RNA obtido, contendo cerca de 2 µg, foi utilizada para a síntese
de cDNA empregando-se o kit SuperScript III First-Strand Synthesis System
(Invitrogen). Após incubação de 8 µl de RNA com 1 µL de oligo (dT)
20
a 50 µM e 1 µL
da mistura de desoxirribonucleotídeo trifosfato (dNTP mix) a 10mM, a 65 °C, por 5
minutos, as amostras foram mantidas em gelo por 1 minuto. Em seguida, as amostras
foram acrescidas de 1 µl da enzima transcriptase reversa SuperScript III a 200 U/µL, 2
µl de tampão para a enzima 10x, 4 µl MgCl
2
a 25mM, 2 µl dithiothreitol (DTT) a 0,1M
e 1 µl de inibidor de RNase a 40 U/µL e incubadas durante 50 minutos, a 50 °C. A
reação foi interrompida por incubação a 85 °C, por 5 minutos, e resfriada em gelo.
Seguiu-se adição de 1µL de RNase H de E. coli a 2 U/µL e incubação por 20 minutos, a
37 °C.
6.3 - Amplificação dos genes das moléculas de adesão e de β-actina por PCR.
Nos ensaios de RT-PCR semi-quantitativo, o cDNA de cada amostra foi diluído
em água deionizada estéril (1/100) e 5 µL foram adicionados à mistura da reação,
composta por 0,5 µL de tampão para a enzima 5X, 0,5 µL de dNTP mix a 10mM, 0,5
47
µL de cada oligonucleotídeo a 10 ρmol/µL, 0,25 µL da enzima Go Taq Polimerase a
5U/µl e água deionizada para completar o volume total de 25 µL.
O gene que codifica β-actina, considerado um housekeeping gene, foi utilizado
para normalizar a expressão dos genes das moléculas de adesão. As seqüências de
oligonucleotídeos e as condições de termociclagem utilizadas para as reações de PCR
sucederam-se conforme as condições descritas na Tabela 2.
Gene Seqüências dos pares de oligonucleotídeos e condições de termociclagem
ICAM-1 Senso: 5’-CGT GCC GCA CTG AAC TGG AC -3’
Antisenso: 5’-CCT CAC ACT TCA CCT -3’
Termociclagem: desnaturação inicial a 94°C, por 2 min, seguida de 26 ciclos de
desnaturação a 94°C, por 45 s, anelamento a 50°C, por 1 min, alongamento a
72°C, por 45 s, e extensão final a 72°C, por 5 min.
VCAM-1 Senso: 5’- ATC CCT ACC ATT GAA GAT ACT GG -3’
Antisenso: 5’- TGA TGA CAG TGT CTC CTT CTT TG -3’
Termociclagem: desnaturação inicial a 94°C, por 2 min, seguida de 35 ciclos de
desnaturação a 94°C, por 45 s, anelamento a 50°C, por 1 min, alongamento a
72°C, por 45 s, e extensão final a 72°C, por 5 min.
E-selectina Senso: 5’- GCG AGG CTA GAA TTG TCT TC - 3’
Antisenso: 5’- GAG CTG CAG AGC CAT TGA GCG -3’
Termociclagem: desnaturação inicial a 94°C, por 2 min, seguida de 34 ciclos de
desnaturação a 94°C, por 45 s, anelamento a 50°C, por 1 min, alongamento a
72°C, por 45 s, e extensão final a 72°C, por 5 min.
β-actina
Senso: 5’- CCT CGC CTT TGC CGA TCC -3’
Antisenso: 5’- GGA TCT TCA TGA GGT AGT CAG TC -3’
Termociclagem: desnaturação inicial a 94°C, por 2 min, seguida de 19 ciclos de
desnaturação a 94°C, por 45 s, anelamento a 52°C, por 1 min, alongamento a
72°C, por 45 s, e extensão final a 72°C, por 5 min.
Tabela 2 - Oligonucleotídeos utilizados e condições de termociclagem das reações de amplificação de
ICAM-1, VCAM-1, E-selectina e β-actina..
Os produtos de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1% em
tampão tris-borato contendo EDTA a 1mM, pH 7,0 (TBE), corado com 0,5 µg/mL de
brometo de etídio. A densitometria das bandas obtidas foi realizada com o auxílio do
”software” LabImage (Kaplan GmbH, Germany).
48
7 - Dosagem de ICAM-1 solúvel no sobrenadante das culturas de células
endoteliais.
Culturas de células endoteliais semeadas em microplacas de 24 poços foram
expostas a meio de cultura ou às suspensões de PA103 ou PA103exoU por 1 hora e
incubadas com meio contendo gentamicina por período adicional de 20 horas, como já
descrito.
Após o período de infecção, seguiu-se a recuperação dos sobrenadantes,
centrifugação (4000 x g, por 10 min) e dosagem de ICAM-1 solúvel (sICAM-1)
por
teste de ensaio imunoenzimático (DuoSet ELISA; R&D Systems), seguindo instruções
do fabricante.
Desta forma, poços de microplacas de 96 poços (PolySorp, Nunc) foram
cobertos com 50 µL de anticorpo de captura (anticorpo de camundongo anti-ICAM-1
humano) a 4 µg/mL em PBS, e incubados “overnight”, a temperatura ambiente. Após
bloqueio de interações inespecíficas com PBS-BSA 1%, foram adicionados 50 µL de
sobrenadante diluído 10 vezes, assim como de sete diferentes diluições da molécula de
ICAM-1 humana recombinante, para a obtenção da curva padrão. Após 2 horas de
incubação, os poços foram lavados com PBS contendo 0,05% de Tween 20 e foram
adicionados 50 µL do anticorpo de detecção (anticorpo de carneiro anti-ICAM-1
humano biotinilado) a 100 ng/mL em PBS-BSA 1%. Após nova incubação de 2 horas,
os poços foram lavados e foram adicionados 50 µL de estreptavidina conjugada à
peroxidase a 1/200 por 20 minutos. Após lavagem, foram adicionados 50 µL de
substrato (H
2
O
2
e tetrametilbenzidina) por um período adicional de 20 minutos. As
reações foram interrompidas com H
2
SO
4
a 2N. Foram determinadas as densidades
ópticas geradas no comprimento de onda de 450nm, com sua correção obtida no
comprimento de 540nm.
49
Como a proteína ExoU possui um efeito citotóxico importante e a concentração
de células viáveis presentes em culturas infectadas com a cepa PA103 costuma ser
inferior à detectada nas demais culturas, paralelamente ao ensaio descrito acima,
algumas culturas celulares foram infectadas ou tratadas com meio de cultura por 1 hora
e tripsinizadas para a determinação do número de células presentes nos poços. Assim,
os resultados das dosagens de sICAM-1 foram expressos em picogramas (ρg) de
sICAM-1 produzidos por 10
4
células.
8. Avaliação do efeito de ExoU sobre a translocação nuclear do fator
transcricional NF-κB por Ensaio de Mudança de Mobilidade Eletroforética
(EMSA).
8.1 - Extração de proteínas nucleares.
Células endoteliais cultivadas em garrafas de 25 cm
2
foram submetidas à
infecção pelas cepas de P. aeruginosa PA103, PA103∆exoU e PA103UT/S142A ou a
tratamento com meio de cultura por 1 hora, lavadas e incubadas com solução de
gentamicina por 1 ou 11 horas adicionais, como já descrito.
Ao final da incubação, os sobrenadantes das culturas celulares foram
desprezados e foram adicionados 3 mL de PBS-G. As células foram, então,
mecanicamente dissociadas, transferidas para um tubo cônico e centrifugadas a 2500 x
g, por 10 min e a 10°C. O precipitado foi lavado três vezes com 2 mL de PBS-G nas
mesmas condições de centrifugação descritas anteriormente e ressuspenso em 900 µl de
tampão A gelado (10 mM de HEPES pH 7,9; 10 mM de KCl; 0,1 mM de EDTA; 0,1
mM de EGTA; 1 mM de DTT; em água deionizada) acrescido do coquetel de inibidores
de protease III (Calbiochem) em uma diluição de 1:1000. A suspensão, foi, então,
transferida para um tubo de 1,5 mL e incubada no gelo, por 15 min. Em seguida, foram
adicionados 100 µL de NP40 a 5%, a suspensão foi homogeneizada por inversão do
50
tubo e submetida à centrifugação a 2500 x g por 10 minutos, a 4 °C. Após remoção do
sobrenadante, o precipitado foi lavado com 1 mL de tampão A e centrifugado a 4500 x
g por 5 min, a 4 °C. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspenso em
40 µl de tampão C gelado (20 mM de HEPES pH 7,9; 0,4M de NaCl; 1 mM de EDTA;
1mM de EGTA; 1 mM de DTT e 20% de glicerol, em água deionizada), acrescido do
coquetel de inibidores de protease III (Calbiochem) diluído a 1:1000, e incubado no
gelo por 30 minutos. As amostras foram centrifugadas a 18000 x g, por 20 min, a 4 °C,
e o sobrenadante transferido para um tubo de 1,5 mL. Esse sobrenadante, contendo as
proteínas nucleares, foi aliquotado e armazenado a -70 °C.
8.2 - Dosagem de proteínas.
Para a dosagem das proteínas obtidas, foi utilizado o método descrito por
Bradford (1976).
A amostra protéica foi diluída 100 vezes em água deionizada e foram
adicionados 100 µL de solução de Bradford. A mudança de cor da solução decorrente
da reação com aminoácidos específicos foi quantificada em um leitor de ELISA, em
comprimento de onda de 595 nm.
Para relacionar os valores de absorbância obtidos com a concentração de
proteínas das amostras, foi realizada uma curva padrão. Para tal, os valores de
absorbância e concentração obtidos de concentrações conhecidas de albumina sérica
bovina foram inseridos em um gráfico de dispersão, utilizando o programa Microsoft
Excel.
8.3-Reação de marcação radioativa da sonda para NF-κB.
Para a reação de marcação da sonda, foram misturados 5,0 pmol de
oligonucleotídeos fita dupla contendo a seqüência consenso para a ligação de qualquer
51
dímero de NF-B (5’- AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’, Santa Cruz
Biotechnology) ou uma seqüência mutante para a ligação deste fator transcricional (5’-
AGT TGA GGC GAC TTT CCC AGG C-3’, Santa Cruz Biotechnology), tampão para a
enzima, 20U de T4 polinucleotídeo quinase (BioLabs), 40 µCi [
32
P] ATP e água
deionizada para a obtenção de um volume final de 30 µL. Essa mistura foi incubada a
37°C, por 1 hora, e a reação de fosforilação foi bloqueada com a adição de 1µl de
EDTA a 0,5M, pH 8,0. Após a marcação, a sonda foi purificada por cromatografia de
exclusão em uma coluna de Biogel 30. A sonda foi eluída por adição de 30 µL de
tampão Tris-EDTA (TE), seguida de centrifugação a 1500 x g, por 1 min. As frações
eluídas foram monitoradas em contador Geiger e a contagem da sonda foi determinada
pelo método de cintilação líquida, após a sonda ser diluída 10 vezes.
8.4 - Reação de ligação do complexo de NF-κB à sonda.
Em um tubo de 1,5 mL foram misturados 3 µg de extrato de proteínas nucleares,
4 µl de tampão de ligação 5X (50 mM de HEPES pH 7,9; 20% de glicerol; 5 mM de
DTT; 5 mM de EDTA e 0,5 µg de BSA), 1 µg de Poli (dI-dC): Poli (dI-dC) (Amersham
Pharmacia), 40.000 cpm de sonda para NF-B marcada e água deionizada para um
volume final de 20 µL.
A reação foi incubada em temperatura ambiente, por 30 minutos, sendo então
adicionados 2 µL de tampão de amostra (50% de glicerol e 0,25% de azul de
bromofenol em água deionizada). Em seguida, as amostras foram submetidas a
eletroforese em gel de poliacrilamida a 4% não desnaturante.
8.5 - Eletroforese em gel de poliacrilamida.
Para a eletroforese das amostras, em gel de poliacrilamida a 4% em condições
não desnaturantes, uma das placas de vidro que funciona como suporte do gel foi tratada
52
com Sigmacote (Sigma) a fim de facilitar a retirada do gel após o término da corrida
eletroforética.
Após eletroforese por aproximadamente 3 horas, a 4 °C e sob corrente elétrica de
6 V/cm, o gel foi adsorvido em papel de filtro e desidratado a 80 °C, por 2 horas, sob
pressão negativa (secador de gel, modelo SE 1160, Hoeffer Scientific Instruments). O
gel desidratado foi exposto ao PhosphoImage (Amershan-Pharmacia) e as imagens
foram analisadas através do Software ImageQuant.
8.6 – “Supershift”.
Para a identificação do dímero de NF-B ativado, os extratos de proteínas
nucleares foram incubados com 1 µg dos anticorpos específicos para as subunidades de
NF-B, por 1 hora, em gelo, antes da incubação com a sonda marcada radioativamente.
A corrida eletroforética foi realizada como já descrito anteriormente para o EMSA. Os
anticorpos utilizados nestes ensaios foram: anti-p50, anti-p65, anti-p52 e anti-c-Rel da
Santa Cruz Biotechnology.
9 - Análise estatística.
Os ensaios, que foram realizados no mínimo em triplicata, tiveram suas médias
aritméticas e erros padrões das médias calculados. Diferenças estatisticamente
relevantes entre os resultados foram determinadas com o uso do programa GraphPad
Prism 4 (GraphPad Software Inc.), após aplicação dos testes “one-way analysis of
variance” (ANOVA) e Bonferroni, tendo sido considerado significativo um valor de
p<0,05.
53
4. RESULTADOS
1. ExoU modula a expressão de ICAM-1 na superfície de células endoteliais.
1.1. Análises da expressão de ICAM-1 na superfície de células endoteliais foram
realizadas por citometria de fluxo. Estes ensaios mostraram que culturas infectadas com
a cepa PA103 por 6 e 21 horas apresentaram uma menor indução da expressão de
ICAM-1 quando comparadas a culturas infectadas com a mutante PA103∆exoU,
embora culturas infectadas por ambas as cepas tenham apresentado aumento do
percentual de células expressando ICAM-1 e das medianas das intensidades de
fluorescência (Figura 4).
0
10
20
30
40
50
∆
controle
PA103
PA103 exoU
% de células ICAM-1 positivas
***
***
***
***
***
***
0
10
20
30
40
50
∆
controle
PA103
PA103 exoU
controle
PA103
PA103 exoU
% de células ICAM-1 positivas
***
***
***
***
***
***
0
25
50
75
controle
PA103
PA103
∆
exoU
Mediana da intensidade de
fluorescência
***
**
***
***
***
***
0
25
50
75
controle
PA103
PA103
∆
exoU
controle
PA103
PA103
∆
exoU
Mediana da intensidade de
fluorescência
***
**
***
***
***
***
Figura 4. Percentual de células expressando ICAM-1 (A) e mediana da intensidade de fluorescência (B) após
tratamento com meio de cultura (controle) ou infecção com as cepas de P. aeruginosa por 6 e 21 horas. Dados
obtidos pela análise de 10.000 células em citômetro de fluxo. **p<0,01; ***p<0,001.
21 h 6 h
21 h 6 h
54
1.2. A pesquisa por imunocitoquímica confirmou o aumento da expressão de
ICAM-1 em decorrência da infecção por P. aeruginosa, assim como a inibição
mediada por ExoU (Figura 5).
Estes resultados sugerem que, embora um ou mais produtos comuns às duas
cepas bacterianas possam estimular a expressão de ICAM-1 na superfície celular, a
secreção de ExoU parece reduzir esta expressão.
(A) (B)
(C) (D)
(A) (B)
(C) (D)
Figura 5. Imunocitoquímica mostrando a expressão de ICAM-1 por células HMEC-1 tratadas com meio de
cultura (B) ou infectadas com as cepas PA103 (C) ou PA103exoU (D) de P. aeruginosa por 21 horas. (A)
Controle negativo da reação.
55
2. A atividade fosfolipase A
2
de ExoU é responsável pela redução da expressão
de ICAM-1.
Para avaliar a importância da atividade fosfolipase A
2
, as cepas bacterianas
foram tratadas com o inibidor de fosfolipase A
2
, MAFP, e a expressão de ICAM-1 foi
determinada por citometria de fluxo.
Foi observado que culturas infectadas com a cepa PA103 tratada com MAFP
apresentaram maior percentual de células expressando ICAM-1 e maior intensidade de
fluorescência do que culturas infectadas pela mesma cepa sem o tratamento com o
inibidor. Além disso, com o tratamento com MAFP, não houve diferença significativa
entre a expressão de ICAM-1 por células infectadas com a cepa parental e células
infectadas com a cepa mutante (Figura 6).
Para assegurar que o efeito observado após tratamento com MAFP não foi
decorrente de inibição da fosfolipase A
2
da célula hospedeira, as culturas foram
infectadas com uma cepa que apresenta uma mutação pontual no sítio catalítico da
atividade fosfolipase A
2
de ExoU, denominada PA103∆UT/S142A. Conforme mostrado
na figura 7, o percentual de células expressando ICAM-1 em culturas infectadas por esta
cepa foi similar ao observado em culturas infectadas pela mutante PA103∆exoU.
Estes resultados mostram que a atividade fosfolipase A
2
de ExoU foi
responsável pela redução da expressão de ICAM-1.
56
---+++
0
10
20
30
40
50
60
Controle
PA103
PA103∆exoU
mediana da intensidade
de fluorescência
MAFP
***
**
**
***
***
*
B
---+++
0
10
20
30
40
50
60
Controle
PA103
PA103∆exoU
mediana da intensidade
de fluorescência
MAFP
***
**
**
***
***
*
B
---+++
0
10
20
30
40
50
60
Controle
PA103
PA103∆exoU
mediana da intensidade
de fluorescência
MAFP
---+++
0
10
20
30
40
50
60
Controle
PA103
PA103∆exoU
mediana da intensidade
de fluorescência
MAFP
***
**
**
***
***
*
***
**
**
***
***
*
**
**
***
***
*
*
B
**
---+++
0
10
20
30
40
Controle
PA103
PA103∆exoU
% de células ICAM-1 positivas
MAFP
***
***
***
***
*
A
******
---+++
0
10
20
30
40
Controle
PA103
PA103∆exoU
% de células ICAM-1 positivas
MAFP
***
***
***
***
*
A
---+++
0
10
20
30
40
Controle
PA103
PA103∆exoU
% de células ICAM-1 positivas
MAFP
---+++
0
10
20
30
40
Controle
PA103
PA103∆exoU
% de células ICAM-1 positivas
MAFP
***
***
***
***
*
A
Figura 6. Percentual de células HMEC-1 expressando ICAM-1 (A) e mediana da intensidade de fluorescência
(B) em culturas expostas a meio de cultura (controle) ou infectadas com as cepas de P. aeruginosa tratadas
com MAFP por 21 horas. Dados obtidos pela análise de 10.000 células em citômetro de fluxo. *p<0,05;
**p<0,01; ***p<0,001.
57
0
25
50
75
Controle
PA103
PA103∆exoU
PA103∆UT/S142A
***
***
***
Percentual de células
ICAM-1 positivas
***
***
0
25
50
75
Controle
PA103
PA103∆exoU
PA103∆UT/S142A
***
***
***
Percentual de células
ICAM-1 positivas
***
***
Figura 7. Percentual de células HMEC-1 expressando ICAM-1 em culturas expostas a meio de cultura
(controle) ou infectadas com as cepas de P. aeruginosa por 21 horas. Dados obtidos pela análise de 10.000
células em citômetro de fluxo. ***p<0,001. Observa-se o padrão semelhante na expressão de ICAM-1 pelas
células infectadas por PA103exoU e PA103UT/S142A
58
3. As vias de cicloxigenase e lipoxigenase modulam a expressão de ICAM-1 na
superfície de células endoteliais.
A enzima fosfolipase A
2
hidrolisa glicerofosfolipídios, liberando
lisofosfolipídios e ácidos graxos insaturados, como ácido araquidônico. O ácido
araquidônico pode ser usado como precursor para a síntese de eicosanóides, pelas vias
da cicloxigenase ou da lipoxigenase. Como o efeito de ExoU resulta no aumento da
liberação do ácido araquidônico, culturas de células HMEC-1 foram tratadas com
inibidores das vias de cicloxigenase ou lipoxigenase na tentativa de se estabelecer uma
possível relação dos seus produtos com a expressão de ICAM-1.
Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com um inibidor de
cicloxigenase, ibuprofeno, foi responsável por um aumento significativo do percentual
de células expressando ICAM-1 em culturas infectadas com PA103 e aboliu a diferença
entre células infectadas com a cepa parental e células infectadas com a cepa mutante
(Figura 8).
59
---+++
0
10
20
30
40
50
Controle
PA103
PA103∆exoU
% de células ICAM-1 positivas
ibuprofeno
*
**
***
***
***
***
A
---+++
0
10
20
30
40
50
Controle
PA103
PA103∆exoU
% de células ICAM-1 positivas
ibuprofeno
---+++
0
10
20
30
40
50
Controle
PA103
PA103∆exoU
% de células ICAM-1 positivas
ibuprofeno
*
**
***
***
***
***
*
**
***
***
***
***
**
***
***
***
***
A
---+++
0
10
20
30
40
50
60
Controle
PA103
PA103∆exoU
Mediana da intensidade
de fluorescência
ibuprofeno
***
*
*
***
***
B
---+++
0
10
20
30
40
50
60
Controle
PA103
PA103∆exoU
Mediana da intensidade
de fluorescência
ibuprofeno
---+++
0
10
20
30
40
50
60
Controle
PA103
PA103∆exoU
Mediana da intensidade
de fluorescência
ibuprofeno
***
*
*
***
***
***
*
*
***
***
B
Figura 8. Percentual de células HMEC-1 expressando ICAM-1 (A) e mediana da intensidade de fluorescência
(B) em culturas pré-tratadas com ibuprofeno e expostas a meio de cultura (controle) ou infectadas com as
cepas de P. aeruginosa por 21 horas. Dados obtidos pela análise de 10.000 células em citômetro de fluxo.
*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.
60
No entanto, o tratamento com NDGA, um inibidor de lipoxigenase, não resultou
em aumento da expressão de ICAM-1 pelas culturas infectadas com a cepa PA103, mas
em redução da expressão desta molécula pelas culturas infectadas com a cepa mutante,
tanto em relação ao percentual de células positivas como à intensidade de fluorescência
(Figura 9).
---+++
0
10
20
30
40
Controle
PA103
PA103∆exoU
% de células ICAM-1 positivas
NDGA
A
***
***
***
***
**
*
---+++
0
10
20
30
40
Controle
PA103
PA103∆exoU
% de células ICAM-1 positivas
NDGA
---+++
0
10
20
30
40
Controle
PA103
PA103∆exoU
% de células ICAM-1 positivas
---+++
0
10
20
30
40
Controle
PA103
PA103∆exoU
% de células ICAM-1 positivas
NDGA
A
***
***
***
***
**
*
***
***
***
***
**
*
---+++
0
10
20
30
40
50
60
Controle
PA103
PA103∆exoU
Mediana da intensidade
de fluorescência
NDGA
B
***
*
*
**
*
*
---+++
0
10
20
30
40
50
60
Controle
PA103
PA103∆exoU
Mediana da intensidade
de fluorescência
NDGA
---+++
0
10
20
30
40
50
60
Controle
PA103
PA103∆exoU
Mediana da intensidade
de fluorescência
NDGA
B
***
*
*
**
*
****
*
*
**
*
*
Figura 9. Percentual de células HMEC-1 expressando ICAM-1 (A) e mediana da intensidade de fluorescência
(B) em culturas pré-tratadas com NDGA e expostas a meio de cultura (controle) ou infectadas com as cepas de
P. aeruginosa por 21 horas. Dados obtidos pela análise de 10.000 células em citômetro de fluxo. *p<0,05;
**p<0,01; ***p<0,001.
61
4. ExoU parece não exercer repressão transcricional sobre ICAM-1, mas é
responsável pela inibição da expressão de outras moléculas de adesão.
A análise do efeito de ExoU na modulação da expressão de moléculas de
adesão por células endoteliais, por RT-PCR semi-quantitativo, mostrou que a infecção
pelas duas cepas de P. aeruginosa levou ao aumento dos níveis de mRNA de ICAM-1,
VCAM-1 e E-selectina, sem existir diferença significativa na expressão de ICAM-1
entre culturas infectadas pela cepa parental e culturas infectadas pela cepa mutante
deficiente em ExoU. No entanto, a expressão das moléculas de VCAM-1 e E-selectina
foi menor em culturas infectadas pela cepa parental comparando-as às culturas
infectadas pela cepa mutante.
Estes resultados mostram que ExoU reduz a expressão da proteína de superfície,
mas não do mRNA de ICAM-1. Ao contrário, ExoU parece regular negativamente a
transcrição de E-selectina e VCAM-1.
A
C
o
n
t
r
o
l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
e
x
o
U
C
o
n
t
r
o
l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
e
x
o
U
4h 18h
A
C
o
n
t
r
o
l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
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x
o
U
C
o
n
t
r
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l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
e
x
o
U
4h 18h
B
C
o
n
t
r
o
l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
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x
o
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C
o
n
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r
o
l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
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x
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U
4h 18h
BB
C
o
n
t
r
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l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
e
x
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U
C
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r
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l
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P
A
1
0
3
P
A
1
0
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∆
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x
o
U
4h 18h
C
C
o
n
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l
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P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
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x
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U
C
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l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
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x
o
U
4h 18h
CC
C
o
n
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r
o
l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
e
x
o
U
C
o
n
t
r
o
l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
e
x
o
U
4h 18h
D
C
o
n
t
r
o
l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
e
x
o
U
C
o
n
t
r
o
l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
e
x
o
U
4h 18h
D
C
o
n
t
r
o
l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
e
x
o
U
C
o
n
t
r
o
l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
e
x
o
U
4h 18h
Figura 10. Eletroforese em gel de agarose representativa dos resultados obtidos em 3 ensaios de RT-PCR
semi-quantitativo, em que foram utilizados oligonucleotídeos específicos para ICAM-1 (A), VCAM-1 (B),
E-selectina (C) ou -actina (D) e amostras de cDNA sintetizadas a partir do RNA total de células HMEC-1
infectadas com as cepas PA103 e PA103exoU ou tratadas apenas com meio de cultura (Controle) por 4 e
18 horas .
62
5. ExoU aumenta a liberação de sICAM-1 no sobrenadante de células endoteliais
após 21 horas de infecção.
A dosagem de sICAM-1 no sobrenadante de células endoteliais infectadas pelas
cepas de P. aeruginosa PA103 e PA103∆exoU, por ELISA, demonstrou que, apesar de
ambas as cepas induzirem a liberação de sICAM-1, a cepa produtora de ExoU levou a
uma secreção significativamente maior do que a cepa mutante.
0
10
20
30
40
50
60
Controle
PA103
PA103∆exoU
sICAM-1 (
ρ
g/mL)/10
4
células
***
******
Figura 11. Concentração de ICAM-1 solúvel no sobrenadante de culturas tratadas com meio de cultura
(controle) ou infectadas com as cepas de P. aeruginosa por 21 horas. Dados obtidos por ELISA e expressos
em g/mL por 10
4
células. ***p<0,001.
63
6. ExoU aumenta a translocação nuclear de NF-κB em células endoteliais após 2 e
12 horas de infecção por P. aeruginosa.
Por EMSA, foi observada uma maior translocação nuclear de NF-κB em células
endoteliais infectadas com a cepa parental PA103, produtora de ExoU, do que em
células controle não infectadas ou em células infectadas com a mutante isogênica
PA103∆exoU, nos dois períodos de tempo pesquisados (Figura 12 e13).
NF-κB
C
ont
r
ol
e
P
A
10
3
P
A
1
0
3
∆
e
x
o
U
NF-κB
C
ont
r
ol
e
P
A
10
3
P
A
1
0
3
∆
e
x
o
U
Figura 12 ExoU aumenta a translocação nuclear de NF-kB após 2 horas de infecção com P. aeruginosa.
Autorradiografia mostrando um ensaio de mobilidade eletroforética em que foram utilizados extratos nucleares
obtidos após tratamento com meio de cultura (controle) ou infecção com as cepas PA103 ou PA103exoU.
64
NF-κB
C
o
n
t
r
o
l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
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∆
e
x
o
U
NF-κB
C
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n
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r
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P
A
1
0
3
P
A
1
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∆
e
x
o
U
NF-κB
C
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n
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r
o
l
e
P
A
1
0
3
P
A
1
0
3
∆
e
x
o
U
Figura 13. ExoU aumenta a translocação nuclear de NF-kB após 12 horas de infecção com P. aeruginosa.
Autorradiografia mostrando um ensaio de mobilidade eletroforética em que foram utilizados extratos nucleares
obtidos após tratamento com meio de cultura (controle) ou infecção com as cepas PA103 ou PA103exoU.
65
A regulação transcricional dependente de NF-κB implica na translocação de
homo ou heterodímeros formados por membros desta família, a saber, p50, p52, p65,
RelB e c-Rel, e sua subseqüente ligação a seqüências polinucleotídicas consenso
localizadas na região promotora do gene a ser regulado. Como mostrado na figura 14,
foi identificada a translocação nuclear do heterodímero p65/p50 em células endoteliais
infectadas com a cepa PA103.
C
o
n
t
r
o
l
e
p
5
0
p
5
2
p
6
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c
-
R
e
l
C
o
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r
o
l
e
p
5
0
p
5
2
p
6
5
c
-
R
e
l
Figura 14. Autorradiografia mostrando o “supershift” de extrato nuclear de células HMEC-1 infectadas pela
cepa PA103, utilizando anticorpo anti-p50, anti-p52, anti-p65 e anti-c-Rel, em que é possível observar a
translocação nuclear do dímero p65/p50.
66
5. DISCUSSÃO
Considerando-se a relevância clínica das infecções mediadas pela bactéria P.
aeruginosa, especialmente nos casos de pacientes imunocomprometidos hospitalizados
com risco de desenvolvimento de sepse, este estudo buscou avaliar a interação deste
patógeno com células endoteliais humanas. O papel do endotélio como regulador de
processos que envolvem coagulação, adesão plaquetária, homeostase de fluidos,
cicatrização, extravazamento leucocitário e tônus vascular é bem estabelecido (Behling-
Kelly & Czuprynski, 2007). Essa regulação mediada pelo endotélio é essencial para a
eficácia da resposta do hospedeiro, uma vez que uma resposta inflamatória anormal
pode gerar inúmeras complicações. A ativação de leucócitos e sua adesão ao endotélio
possuem um papel chave na defesa do hospedeiro e no reparo tecidual. Entretanto, sob
algumas condições, a adesão de leucócitos ao endotélio pode contribuir para o dano
vascular e tecidual, acarretando a falência de órgãos (Chandra et al., 2006). Assim
sendo, o adequado entendimento do comportamento de células endoteliais frente à
infecção por P. aeruginosa pode representar um expressivo auxílio na conduta
terapêutica a ser empregada.
Na patogênese da bactéria P. aeruginosa, destaca-se a contribuição das proteínas
transportadas pelo sistema de secreção do tipo III; dentre as quais ExoU. Além de ser
objeto de estudo de diversos autores devido ao seu potencial citotóxico, ExoU apresenta
similaridade funcional com a enzima fosfolipase A
2
(Sato et al., 2003), indicando uma
possível participação desta proteína no processo inflamatório observado durante a
infecção por P. aeruginosa.
A relação entre inflamação e ExoU foi pesquisada em estudos realizados por
Saliba et al., 2005, que demonstraram a atividade pró-inflamatória desta proteína in
vitro e in vivo. Utilizando células endoteliais da linhagem HMEC-1, estes autores
67
observaram que as culturas celulares infectadas pela cepa PA103 exibiam uma potente
liberação de ácido araquidônico quando comparadas às culturas infectadas pela cepa
mutante, PA103exoU. O ácido araquidônico liberado é precursor para a síntese de
eicosanóides, pelas vias da cicloxigenase e da lipoxigenase, fato que se refletiu nos
resultados obtidos com as células infectadas pela cepa PA103, que apresentaram maior
liberação de prostaglandina E
2
(PGE
2
) e prostaciclina em relação às células controle e às
infectadas pela cepa mutante. Os modelos in vivo mostraram que ExoU levou à
formação de edema e ao aumento da concentração de PGE
2
e de células inflamatórias.
Em análises histopatológicas, foi possível observar que ExoU estava associada a um
intenso infiltrado inflamatório, constituído predominantemente de neutrófilos e
linfócitos (Saliba et al., 2005).
Como a migração de células de defesa para o sítio de infecção depende de
moléculas de adesão expressas na superfície apical de células endoteliais, no presente
estudo, nós avaliamos o efeito de ExoU na modulação da expressão destas moléculas
por células HMEC-1.
Embora alguns estudos já tenham pesquisado a importância das moléculas de
adesão na infecção por P. aeruginosa, nenhum deles avaliou o papel de ExoU.
Utilizando camundongos knockout para ICAM-1, Hobden et al., 1999, sugeriram que
esta molécula de adesão contribui para agravidade da queratite por P. aeruginosa. Já
outros autores mostraram que a infecção por P. aeruginosa foi capaz de induzir a
expressão de E-selectina e ICAM-1 por células endoteliais derivadas de veias umbilicais
humanas (HUVECs) (Darveau et al., 1995, Lin et al., 2002).
Nosso estudo está de acordo com os relatos da literatura, já que, tanto por
citometria de fluxo como por imunocitoquímica, também foi observado o aumento da
expressão de ICAM-1 na superfície de células endoteliais HMEC-1 após infecção pelas
68
cepas PA103 e PA103∆exoU de P. aeruginosa. No entanto, os ensaios revelaram que a
proteína ExoU modula negativamente a expressão de ICAM-1 induzida pela bactéria.
Embora o aumento da expressão de ICAM-1 em decorrência da infecção por P.
aeruginosa fosse esperado, foi surpreendente a inibição mediada por ExoU, uma
proteína com atividade pró-inflamatória.
Buscando-se compreender os fundamentos do efeito inibitório de ExoU na
expressão de ICAM-1, a etapa seguinte deste trabalho foi avaliar a importância da
atividade tipo fosfolipase A
2
deste fator de virulência. Observou-se que culturas
infectadas com a cepa PA103 tratada com o inibidor de fosfolipase A
2
, MAFP,
apresentaram maior expressão de ICAM-1 que culturas infectadas pela mesma cepa não
tratada. Além disso, com o tratamento, não houve diferença significativa entre a
expressão de ICAM-1 por células infectadas com a cepa parental e células infectadas
com a cepa mutante.
Diferentemente dos nossos achados, estudos anteriores demonstraram que a
inibição da fosfolipase A
2
hospedeira promove a inibição da expressão de ICAM-1.
Thommesen et al., 1998, avaliaram o envolvimento das formas de fosfolipase A
2
,
citosólica e secretada, na ativação de NF-κB e na expressão de ICAM-1 em
queratinócitos da linhagem HaCaT estimulados por TNF-. Os autores mostraram que a
expressão de ICAM-1 e a translocação nuclear de NF-κB induzidas por TNF- foram
significativamente inibidas pelo tratamento com MAFP. A adição de ácido araquidônico
às culturas não foi capaz de reduzir a inibição mediada por MAFP, sugerindo que o
efeito observado não foi decorrente da diminuição da concentração deste substrato.
Utilizando metodologia semelhante, Barnett et al., 2001, observaram que o
inibidor de fosfolipase A
2
, AACOCF3, e o inibidor de cálcio intracelular, BAPTA
A.M., reduziram a expressão de ICAM-1 em culturas de HUVEC estimuladas com
69
TNF- ou LPS. Além disso, por cromatografia, os autores mostraram que o tratamento
com o inibidor de cálcio intracelular reduziu a atividade da fosfolipase A
2
em resposta
ao LPS.
Como nós observamos o aumento da expressão de ICAM-1 tanto em culturas
tratadas com MAFP e infectadas pela cepa selvagem PA103, produtora de ExoU, como
em culturas infectadas pela cepa mutante PA103∆UT/S142A, produtora de ExoU sem
atividade fosfolipase A2, a maior expressão de ICAM-1 provavelmente se deu pela
inibição da atividade tipo fosfolipase A
2
de ExoU e não da célula hospedeira. Este fato
pode representar uma justificativa que diferencia nossos resultados dos relatos na
literatura apresentados acima.
Considerando-se as ações da enzima fosfolipase A
2
nas vias metabólicas
celulares, o próximo questionamento deste trabalho foi inferir o papel das vias da
cicloxigenase e lipoxigenase na modulação da expressão de ICAM-1 dependente de
ExoU. Nossos resultados mostraram que o tratamento com um inibidor de
CICLOXIGENASE, ibuprofeno, foi responsável pelo aumento significativo da
expressão de ICAM-1 na superfície de células infectadas com a cepa PA103, abolindo a
diferença entre estas e células infectadas com a cepa mutante. No entanto, para nossa
surpresa, o tratamento com o inibidor de lipoxigenase, NDGA, não resultou em
aumento da expressão de ICAM-1 pela cepa PA103, mas em redução da expressão desta
molécula pela cepa mutante.
Sabe-se que, embora ExoU seja responsável por grande parte da liberação de
ácido araquidônico por células endoteliais infectadas por P. aeruginosa, outros fatores
de virulência parecem contribuir para a síntese de eicosanóides, já que a secreção destes
produtos é maior em culturas infectadas pela cepa mutante do que em culturas não
infectadas (Saliba et al., 2005).
70
A secreção de eicosanóides por culturas infectadas tanto pela cepa parental como
pela mutante e a relação entre produtos da via de lipoxigenase ou cicloxigenase e
aumento ou redução da expressão de ICAM-1, respectivamente, podem representar uma
possível explicação para os nossos achados.
Por esta hipótese, a maior liberação de ácido araquidônico decorrente da ação de
ExoU poderia levar ao aumento da atividade de COX-2, com conseqüente inibição da
expressão de ICAM-1. Já culturas infectadas com a cepa mutante poderiam apresentar
maior ativação da via de lipoxigenase e, assim, aumento da expressão de ICAM-1.
Desta forma, a inibição de COX-2 seria responsável pelo aumento do ácido
araquidônico disponível para consumo pela via da lipoxigenase, resultando no aumento
da expressão de ICAM-1 em células tratadas com este inibidor e infectadas por PA103.
Já a inibição de lipoxigenase levaria ao aumento do consumo de ácido araquidônico
pela via da cicloxigenase e à conseqüente redução da expressão de ICAM-1 em células
tratadas com este inibidor e infectadas pela cepa mutante.
Esta hipótese está de acordo com os resultados apresentados por Sultana et al.,
1996, que demonstraram que metabólitos da lipoxigenase induzem a expressão de
moléculas de adesão em culturas de HUVEC.
Similarmente, Wang et al., 2004, descreveram o efeito inibitório de NDGA
sobre a expressão de ICAM-1 em células de melanoma humano. ICAM-1 é expresso em
altos níveis nestas células, sugerindo um importante papel desta molécula na progressão
e metástase do melanoma. Após tratamentos com inibidores de cicloxigenase e
lipoxigenase, as células foram submetidas a ensaios de adesão e imunoensaios, que
confirmaram a inibição da expressão de ICAM-1 após o tratamento com inibidores de
lipoxigenase, enquanto nenhum efeito foi observado pelo tratamento com inibidor de
71
cicloxigenase. Entretanto, os autores não souberam explicar o mecanismo pelo qual a
droga afeta a expressão de ICAM-1.
Relatos da inibição da expressão de ICAM-1 por produtos da via das
cicloxigenases também podem ser encontrados na literatura. Empregando fibroblastos
gengivais humanos pré-estimulados por IL-1, Noguchi et al., 2000, demonstraram que
os inibidores de cicloxigenases, NS-398 e indometacina, foram capazes de anular
completamente a produção de PGE
2
e estimular a expressão de ICAM-1 pelos
fibroblastos. Com base nestes achados, os autores sugeriram que PGE
2
inibe a
expressão de ICAM-1 por fibroblastos estimulados por IL-1.
Bishop-Bailey et al., 1998, também relataram a inibição de ICAM-1 mediada
por COX-2 em células vasculares da musculatura lisa humana. Após inibição de COX-2
em células estimuladas por IL-1, os autores observaram o aumento da expressão de
ICAM-1. Além disso, demonstraram que esse aumento é revertido pela adição de PGE
2
exógena. Segundo os autores, COX-2 limita a expressão de moléculas de adesão por
células vasculares da musculatura lisa humana, sugerindo que esta enzima pode possuir
um papel de proteção nas doenças cardiovasculares e inflamatórias.
Contudo, este efeito de COX-2 sobre a expressão de ICAM-1 ainda é
controverso. O resultado do presente estudo, que indica aumento da expressão de
ICAM-1 após tratamento com ibuprofeno, não está de acordo com os achados de
Kapiotis et al., 1996. Ao avaliar a expressão de VCAM-1, ICAM-1 e E-selectina em
HUVECs estimuladas por IL-1 e TNF- e tratadas com drogas antiinflamatórias, estes
autores observaram que o ibuprofeno inibia a expressão de VCAM-1 e ICAM-1.
Entretanto, as autores empregaram doses da droga que variaram entre 0,2 e 2,0 mM e
observaram que o efeito inibitório é dose-dependente e que, somente na concentração
máxima empregada, foi possível notar a inibição da expressão de ICAM-1. Assim
72
sendo, esta pode ser uma importante diferença de metodologia entre este estudo e nosso
trabalho, no qual foi empregada a concentração de 100 µM da droga.
Seok et al., 2006, também correlacionaram a expressão de ICAM-1 à via das
cicloxigenases, sugerindo que o aumento da expressão de COX-2 estimulado por
cádmio levaria ao aumento de PGE
2
e que esta protaglandina estaria envolvida na
regulação da expressão de ICAM-1. Para esta proposição, os autores estimularam com
cádmio células endoteliais cerebrais de camundongos, elemento que estimula a
expressão de ICAM-1 e, em seguida, trataram as células com as drogas
antiinflamatórias NS-398 e indometacina. Observaram que a inibição da expressão de
ICAM-1 pelas drogas antiinflamatórias foi revertida pela adição exógena de PGE
2
.
Além disso, PGE
2
exógena também foi capaz de estimular a expressão de ICAM-1 na
ausência de cádmio. Baseados nestes resultados, os autores propuseram que COX-2
estimula a expressão de ICAM-1 em células endoteliais cerebrovasculares.
Para avaliar se a redução da expressão de ICAM-1 na superfície celular por
ExoU era decorrente de uma modulação transcricional, foram realizados ensaios de RT-
PCR semi-quantitativo. Estas análises mostraram que ambas as cepas de P. aeruginosa
levaram ao aumento dos níveis de mRNA de ICAM-1, sem apresentar diferenças
significativas entre elas, sugerindo que ExoU parece não exercer repressão
transcricional sobre ICAM-1.
Como os níveis de mRNA de ICAM-1 não foram modulados por ExoU, avaliou-
se no presente estudo, a concentração de sICAM-1 nos sobrenadantes de culturas
infectadas e não infectadas para investigar se a redução de ICAM-1 na superfície celular
se devia à clivagem desta molécula. Nossos resultados mostraram que, diferentemente
de ICAM-1 de superfície, ExoU aumenta significativamente a secreção de sICAM-1 em
resposta à infecção por P. aeruginosa.
73
ICAM-1 e sua forma circulante estão implicadas no desenvolvimento de inúmeras
patologias e alguns autores sugerem que a forma solúvel da molécula pode ser utilizada
como marcador de diagnóstico e progressão de doenças associadas à inflamação de
paredes vasculares. Este fato destaca a importância da investigação de sICAM-1 na
patogênese da infecção por cepas de P. aeruginosa produtoras de ExoU, já que esta
proteína também é conhecida por sua ação pró-inflamatória.
Em adição, altos níveis de sICAM-1 foram demonstrados em pacientes com sepse,
apresentando correlação positiva com a intensidade e agravidade do choque séptico e
com a subseqüente falência múltipla dos órgãos (Sessler et al., 1995). Mais
recentemente, Briassoulis et al., 2007, sugeriram que o aumento dos níveis de sICAM-1
poderia ser valioso no prognóstico de sepse, trauma cerebral agudo e síndrome do
estresse respiratório agudo.
Raros estudos avaliaram a associação entre moléculas de adesão circulantes e a
infecção por P. aeruginosa e nenhum deles abordou diretamente esta relação. De Rose
et al., 1998, observaram que pacientes fibrocísticos, dentre os quais 65% colonizados
por P. aeruginosa, apresentavam concentração plasmática de sICAM-1 e sE-selectina
superior à encontrada em pessoas saudáveis. Estes autores também observaram maiores
níveis destas moléculas em quadros de agudização pulmonar, assim como declínio da
concentração plasmática após terapia antimicrobiana, sugerindo a importância do
componente infeccioso.
Em estudo semelhante, Froon et al., 1998, avaliaram a concentração de sICAM-1
e sE-selectina em 42 pacientes com pneumonia associada à ventilação, sendo a maioria
com cultura positiva para P. aeruginosa. A correlação entre os níveis séricos das
moléculas de adesão solúveis e a severidade da infecção foi estudada, comparando-se
aos resultados obtidos com as predições do exame fisiológico diário simplificado (SAPS
74
II), que pontua agravidade da doença. No entanto, a concentração de sICAM-1 não foi
um bom marcador quando comparada ao sistema de pontuação clínica.
O mecanismo que promove a geração de sICAM-1 ainda não é bem esclarecido.
Assim, enquanto alguns autores mostram que há clivagem proteolítica de ICAM-1 da
membrana celular, outros relatam a existência de moléculas de mRNA específicas para
sICAM-1 (Witkowska & Borawska, 2004). Desta forma, deverão ser realizados ensaios
de RT-PCR utilizando oligonucleotídeos capazes de diferenciar os dois tipos de
moléculas de mRNA descritos.
Dada a importância de sICAM-1 na sepse e em doenças inflamatórias, o
aprofundamento do estudo desta molécula pode contribuir para a compreensão da
patogênese de cepas de P. aeruginosa produtoras de ExoU.
Além disso, como a adesão de leucócitos às células endoteliais depende de
diversos fatores, incluindo outras moléculas de adesão, neste estudo, foi avaliada a
modulação da expressão de VCAM-1 e E-selectina por ExoU. Os resultados obtidos
mostraram que um ou mais produtos bacterianos comuns às duas cepas de P.
aeruginosa estimulam a expressão destes genes, já que células infectadas exibiram
maiores níveis de mRNA de VCAM-1 e E-selectina do que células controle não
infectadas. No entanto, como a transcrição destas moléculas foi menor em culturas
infectadas pela cepa parental do que em culturas infectadas pela cepa mutante, ExoU
parece regular negativamente a expressão de VCAM-1 e E-selectina.
Apesar da maioria dos relatos apresentar um comportamento semelhante na
resposta das moléculas de adesão frente ao mesmo estímulo, essa diferença entre as
respostas das moléculas de VCAM-1 e E-selectina com a resposta de ICAM-1 a um
mesmo estímulo também foi encontrada por Lu et al., 1999, que avaliaram a resposta de
células endoteliais de capilares cerebrais humanos tratadas com o fator de crescimento
75
vascular do endotélio (VEGF). Estes autores descreveram que apenas a expressão da
molécula de ICAM-1 foi estimulada no modelo testado, enquanto nenhum efeito foi
observado sobre as moléculas de VCAM-1, E-selectina e P-selectina.
Assim como para a molécula de ICAM-1, não se encontra na literatura nenhuma
descrição que relacione as moléculas de VCAM-1 e E-selectina à proteína ExoU e
poucos estudos abordam a relação destas moléculas com a infecção por P.aeruginosa.
Darveau et al., 1995, avaliaram a habilidade de bactérias associadas a
inflamações crônicas em estimular a expressão de E-selectina e promover a adesão de
neutrófilos. Este estudo incluiu as cepas ATCC 27313 e ATCC 27316 de P.aeruginosa
e os resultados encontrados demonstraram que estas cepas foram capazes de estimular
fracamente a expressão de E-selectina, diferentemente das cepas de E.coli, que
obtiveram níveis máximos de expressão, e das cepas de P. gingivalis e H. pylori, que
foram incapazes de induzir a expressão da molécula de adesão nas condições testadas.
Segundo os autores, a não indução de E-selectina por P. gingivalis e H. pylori e a baixa
indução da molécula por P. aeruginosa podem contribuir diretamente para o sucesso da
colonização persistente, favorecendo a cronicidade da doença. Esta proposição, não
poderia ser agregada ao nosso estudo, pois o objetivo de se avaliar a proteína ExoU nos
remete aos casos agudos da infecção por P. aeruginosa.
VCAM-1 também exerce um importante papel na aterogênese e na adesão
leucocitária, estando envolvida na adesão de linfócitos, eosinófilos, basófilos e
monócitos ao endotélio vascular e sendo considerada a molécula marcadora dos eventos
iniciais da arteriosclerose. Liu et al., 2005, demonstraram que uma proteína de HIV foi
capaz de estimular a expressão de VCAM-1, sendo relacionada ao mecanismo pelo qual
o vírus contribui para o desenvolvimento da arteriosclerose e da vasculopatia pulmonar.
Segundo os autores, a expressão de VCAM-1 estimulada por HIV pode ser mediada
76
pela produção de radicais reativos do oxigênio, pela ativação de p38 MAPK e pela
ativação de NF-kB, que podem representar excelentes alvos terapêuticos para as
vasculopatias em pacientes HIV positivos.
Os resultados obtidos com os ensaios de RT-PCR de VCAM-1 e E-selectina nos
levaram a pesquisar o papel de NF-kB na modulação da expressão destas moléculas de
adesão. Os membros da família NF-κB são importantes fatores transcricionais que
regulam a expressão de mais de 150 genes, a maioria envolvida na resposta imune, onde
se incluem as moléculas de adesão (Pahl, 1999).
Kim et al., 2005, pesquisaram os mecanismos através dos quais o VEGF
estimula a expressão de ICAM-1, VCAM-1 e E-selectina em células endoteliais de
cordão umbilical humanas. Estes autores empregaram diversos inibidores buscando
mapear as vias metabólicas envolvidas e concluíram que a indução da expressão das
moléculas de adesão, neste modelo de estudo, se dava principalmente pela ativação de
NF-κB, através da translocação nuclear do dímero p65/p50.
Vários outros modelos também relacionaram a infecção de células endoteliais à
translocação nuclear de NF-κB. Contudo, embora estudos anteriores já tenham
demonstrado que P. aeruginosa é capaz de ativar NF-κB em células epiteliais (Joseph et
al., 2005, Reiniger et al., 2007) e monocíticas (Lagoumintzis et al., 2003), nenhum
trabalho mostrou o papel de ExoU na modulação deste fator transcricional.
A análise das proteínas nucleares por EMSA mostrou uma maior translocação
nuclear de NF-κB em células endoteliais infectadas com a cepa parental PA103 do que
em células controle não infectadas ou em células infectadas com a mutante isogênica
PA103∆exoU. Como a ativação de NF-kB pode estar implicada tanto no estímulo como
na repressão da expressão dos genes que estão sob sua regulação, procedeu-se um
ensaio de supershift do extrato nuclear de HMEC-1 infectada pela cepa PA103 para a
77
detecção das subunidades que constituem o complexo de NF-κB ativado. Neste ensaio,
foi identificada a translocação nuclear do heterodímero p65/p50, envolvido na ativação
transcricional de genes pró-inflamatórios, fato que está de acordo com os achados
clínicos da infecção mediada por ExoU, mas não com os dados do RT-PCR de VCAM-
1 e E-selectina.
Entretanto, a completa avaliação da expressão gênica regulada por p65/p50
depende de ensaios utilizando um gene repórter, já que a infecção pode inibir a ligação
de NF-κB ao DNA. Este fenômeno foi observado por Lesner et al., 2005, que mostrou
que células T podem ser resistentes ao HIV através da inativação da ligação do dímero
p65/p50 ao DNA, mecanismo que impede a transcrição do vírus.
Além disso, é possível que a repressão da expressão destes genes por ExoU seja
dependente de outro fator transcricional. Assim, estudos complementares deverão ser
conduzidos para elucidar estes mecanismos.
Por fim, é importante ressaltar que a pesquisa da modulação de proteínas
envolvidas na infiltração de leucócitos significa um grande avanço no estudo da sepse
causadas por P. aeruginosa, já que este processo não apenas leva à perda da integridade
das barreiras endoteliais, favorecendo a disseminação bacteriana, como também
aumenta o dano tecidual em decorrência da inflamação. Assim, a descoberta de
mecanismos celulares alterados durante o processo infeccioso pode contribuir para a
identificação de novos alvos terapêuticos, visando ao controle da resposta inflamatória e
da disseminação bacteriana.
78
6. CONCLUSÕES
• ExoU modula negativamente a expressão de ICAM-1 na superfície de células
endoteliais da linhagem HMEC-1, através de sua atividade tipo fosfolipase A
2
.
• As vias de cicloxigenase e lipoxigenase modulam a expressão de ICAM-1 na
superfície de células endoteliais. A redução da expressão de ICAM-1 na membrana
de células infectadas, em resposta a ExoU, foi revertida pela inibição de
cicloxigenase. Já a inibição de lipoxigenase levou à redução da expressão de ICAM-
1 na superfície de células infectadas com a cepa mutante.
• ExoU parece não exercer repressão transcricional sobre ICAM-1, mas é responsável
pela inibição da expressão de E-selectina e VCAM-1.
• ExoU aumenta a liberação de sICAM-1 no sobrenadante de células endoteliais
infectadas. Este dado sugere que a menor expressão de ICAM-1 na membrana, em
resposta a ExoU, pode ser decorrente da clivagem desta molécula de adesão da
superfície celular.
• ExoU aumenta a translocação nuclear do heterodímero p65/p50 de NF−κB em
células endoteliais após 2 e 12 horas de infecção por P. aeruginosa.
79
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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