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ANDRÉ LIMA DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA À QUIMIOTERAPIA PRIMÁRIA
EM MULHERES COM ADENOCARCINOMA DUCTAL DE MAMA
FRENTE AOS POLIMORFISMOS DOS
GENES GSTM1, GSTT1 E GSTP1
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-Graduação da Faculdade de
Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo para obtenção do título de Mestre
em Medicina
São Paulo
2007
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ANDRÉ LIMA DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA À QUIMIOTERAPIA PRIMÁRIA
EM MULHERES COM ADENOCARCINOMA DUCTAL DE MAMA
FRENTE AOS POLIMORFISMOS DOS
GENES GSTM1, GSTT1 E GSTP1
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-Graduação da Faculdade de
Ciências Médicas da Santa Casa de São
Paulo para obtenção do título de Mestre
em Medicina
Área de concentração: Ciências da Saúde
Orientadora: Mônica Barbosa de Melo
Co-Orientador: Roberto Euzébio dos Santos
São Paulo
2007
DEDICATÓRIAS
Aos meus pais Francisco e Maria
Aparecida,
alicerces de minha existência e formação, como
uma pequena retribuição pelo constante apoio em
todos os momentos pessoais e profissionais de
minha vida.
À minha filha Talita, grande amor de minha vida,
pelo constante apoio e compreensão em meus
momentos de ausência.
À minha noiva Carolina, pelo amor diuturno e pela
compreensão com a minha ausência.
Por fim, dedico este trabalho às pacientes que
participaram da elaboração deste estudo, por
doarem um pouco de si, em momento tão delicado
de suas vidas, e por colaborarem para o progresso
da ciência.
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, berço de minha formação
acadêmica.
À Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, responsável pelo meu
aprendizado acadêmico e por mostrar-me o verdadeiro sentido da misericórdia e respeito
pela vida.
À Profa. Dra. Mônica Barbosa de Melo, pela extrema paciência, interesse e
disponibilidade para o ensino e execução desta obra, revelou-me a verdadeira aplicabilidade
da ciência experimental em nosso cotidiano médico.
Ao Prof. Dr. Roberto Euzébio dos Santos, meu co-orientador e exemplo de ser humano;
norteou minha formação de residente e pós-graduando, ajudando-me a evoluir a cada dia.
Ao Dr. Fabio Francisco Oliveira Rodrigues, coordenador do Pronto Socorro do
Departamento de Obstetrícia e Ginecologia, eterno amigo e companheiro de estudo; sempre
me prestigiou e demonstrou grande confiança nos dezoito anos de convivência.
Ao Prof. Dr. José Júlio de Azevedo Tedesco (in memorian) pela sua constante lide para a
viabilização do Curso de Pós-Graduação do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da
Santa Casa de São Paulo.
Ao Prof. Dr. Tsutomu Aoki, Diretor do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da
Santa Casa de São Paulo, exemplo de carreira acadêmica; por confiar em meu trabalho e
pelo contínuo incentivo à titulação dos docentes do departamento.
Ao
Prof. Dr. Roberto Adelino de Almeida Prado
, coordenador do programa de Pós-
Graduação do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de São Paulo; por
incentivar nosso sonho de pós-graduação.
Ao Prof. Dr. Antônio Pedro Flores Auge, atual coordenador do programa de Pós-
Graduação do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de São Paulo; pelo
incentivo e confiança, acolhendo-me como um filho.
Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Longui, pela acolhida no Laboratório de Medicina Molecular,
permitindo a realização deste trabalho.
À Profa. Dra. Maria Antonieta Longo Galvão Silva, pela adequada avaliação anátomo-
patológica deste trabalho; sempre me recebeu com carinho e atenção.
Aos Prof. Dr. Décio Roveda Júnior e ao Dr. Eduardo Fleury, pela amizade e
disponibilidade em realizar os exames de imagem, fundamentais para o desenho de nosso
trabalho.
Aos residentes do setor de mastologia nos anos de 2004 e 2005; pelo carinho, cuidado e
empenho incansável na seleção e acompanhamento das pacientes fatores essenciais a
concretização deste trabalho.
Aos técnicos Milene Neves Rocha e Flávio Richeti; pela compreensão, paciência e
incansável solidariedade durante a realização da etapa prática deste estudo e por muito me
ensinarem.
ABREVIATURAS
ASK1: “Apoptosis Signal-Regulating Kinase”
CM: câncer de mama
CR: Resposta Completa
DNA: Ácido desoxirribonucleico
EDTA: ácido etilenodiaminotetraacético
GSH: Glutationa (γ-glu-cys-gly)
GSTs: Glutationa-S-Transferases
Ile: Isoleucina
JNK1: “c-Jun N-terminal Kinase 1”
MAP quinase: Mitogen-Activated Protein
N: Linfonodos axilares
NHI: National Institute of Health
NR: não respondedoras
NSABP: National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project
OMS: Organização Mundial da Saúde
PCR: “Polimerase chain reaction”
R: respondedoras
RC: resposta clínica
RECIST: Response Evaluation Criteria in Solid Tumors
RP: Resposta Parcial
Val: valina
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................................
4
1.1
- Revisão da Literatura ...............................................................................
4
1.1.1
- Tratamento do carcinoma mamário ...........................................................
4
1.1.1.1
- Tratamento cirúrgico .................. ...............................................................
4
1.1.1.2
- Quimioterapia .............................................................................................
4
1.1.1.2.1
- Tratamento adjuvante .................. ..............................................................
4
1.1.1.2.2
- Tratamento primário (neoadjuvante) ..........................................................
5
1.1.1.2.3
- Resistência celular à quimioterapia ............................................................
6
1.1.2
- As Glutathiona S-transferases (GSTs) .....................................................
8
1.1.2.1
- Glutathiona S-transferases (GSTs) e câncer de mama ...............................
11
2
OBJETIVOS .................................................................................................................
18
3
CASUÍSTICA E MÉTODOS ......................................................................................
20
3.1
- Pacientes .....................................................................................................
21
3.1.1
- Dados demográficos ...................................................................................
21
3.2
- Critérios e inclusão .....................................................................................
21
3.3
- Parâmetros avaliados ..................................................................................
22
3.4
- Classificação da resposta clínica ................................................................
23
3.5
- Extração de DNA .......................................................................................
24
3.6
- Avaliação dos genes GSTM1 e GSTT1 ......................................................
25
3.6.1
- Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ..................................................
25
3.7 - Avaliação do Gene GSTP1 .........................................................................
26
3.7.1
- Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) ...................................................
26
3.7.2
- Digestão Enzimática ...................................................................................
27
3.8
- Análise estatística .......................................................................................
27
4
RESULTADOS ............................................................................................................
29
4.1
- Dados clínicos ............................................................................................
30
4.2 - Dados laboratoriais .....................................................................................
31
4.3
- Avaliação molecular ...................................................................................
31
5
DISCUSSÃO .................................................................................................................
38
6.
CONCLUSÕES .............................................................................................................
44
7.
ANEXOS
.......................................................................................................................
46
8.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................
53
FONTES CONSULTADAS ........................................................................................
63
RESUMO .......................................................................................................................
65
ABSTRACT ..................................................................................................................
67
1. INTRODUÇÃO
Introdução
Oliveira AL – 2007
2
O câncer de mama (CM) é a neoplasia de maior incidência entre as mulheres,
atingindo altos índices de mortalidade ao redor do mundo. Nos Estados Unidos da América
(EUA), é a segunda causa de morte, com taxa mortalidade de 12,7 %, isto é, acomete uma em
cada oito mulheres (Parkin et al, 2005; National Institutes of Health - NHI, 2006). Estima-se
que, no ano de 2006, nos EUA, tenham sido diagnosticados 212.920 novos casos de câncer
mamário, com previsão de 40.970 mortes (Jemal et al, 2006).
No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer, em 2006, registrou 48.930 casos novos de
neoplasia mamária feminina, com previsão de risco de 52 casos por 100.000 mulheres. No
Estado de São Paulo, foram registrados 75,45 casos novos por 100.000 mulheres, totalizando
15.810 casos (Brasil. Ministério da Saúde, INCA, 2006).
A sobrevida semelhante entre as pacientes submetidas a abordagens cirúrgicas
radicais e conservadoras para carcinomas iniciais de mama foi demonstrada nos trabalhos de
Veronesi et al (1986) e nos estudos B04 e B06 do National Surgical Adjuvant Breast and
Bowel Project (NSABP) e alteraram a visão eminentemente anatômica do tratamento primário
do câncer mamário (Fisher et al, 1985; Veronesi et al, 1986; Fisher et al,1995).
O tratamento adjuvante quimioterápico assumiu, portanto, importância ímpar no
cenário de tumores de mama localmente avançados e apresentou uma grande evolução desde
os primeiros estudos em tumores sólidos (Shapiro, Fugmann, 1957).
A partir do conhecimento do ciclo celular e do mecanismo de ação das drogas
utilizadas no tratamento quimioterápico do carcinoma mamário, adotou-se uma estratégia de
tratamento com múltiplas drogas que agiam em diversas fases do ciclo celular e permitiam
maior sobrevida e tempo livre de doença após tratamento cirúrgico (Fisher et al, 1968).
Introdução
Oliveira AL – 2007
3
Paralelamente, observou-se que mulheres com tumores de mama biologicamente
semelhantes não respondiam da mesma forma ao mesmo tratamento e apresentavam
progressão da doença. As principais causas de falhas no tratamento quimioterápico de
pacientes portadoras de câncer são a doença disseminada e mecanismos de resistência a
drogas (Terek et al, 2003). Aspectos bioquímicos e moleculares deste processo de resistência
celular têm sido descritos com importante participação das enzimas codificadas pelos genes
da família das glutationa S-transferases (GSTs) (Hayes, Pulford, 1995; O’Brien, Tew, 1996;
Burg, Mulder, 2002; L’Ecuyer et al, 2004).
Introdução
Oliveira AL – 2007
4
1.1 Revisão da Literatura
1.1.1 Tratamento do carcinoma mamário
1.1.1.1 Tratamento Cirúrgico
Em 1894, Halsted propôs o conceito de tratamento radical loco-regional. Em meados
da década de 50, novos conceitos surgiram no mecanismo de instalação de metástase,
questionando os paradigmas Halstedianos de disseminação loco-regional do CM (Fisher,
Turnbull, 1955). Veronesi et al, em 1986, idealizaram um tratamento conservador loco-
regional (quadrantectomia com dissecção dos linfonodos axilares seguido de radioterapia para
carcinomas de mamas em estádio inicial), tratamento que determinava profundas mudanças
na terapêutica do carcinoma mamário. A melhor compreensão do comportamento biológico
dos tumores de mama permitiu não somente as transformações acima relatadas no campo
cirúrgico mas também na aplicação e evolução do tratamento quimioterápico.
1.1.1.2 Quimioterapia
1.1.1.2.1 Tratamento adjuvante
Em meados da década de 50, passou-se a ter uma melhor compreensão tanto dos
mecanismos biológicos de instalação das metástases como do papel dos linfonodos regionais
como uma barreira efetiva à disseminação tumoral, pois células malignas já haviam sido
observadas na corrente sangüínea (Fisher, Turnbull, 1955).
Os primeiros estudos com quimioterapia adjuvante após cirurgia em tumores sólidos
(adenocarcinoma de mama implantados em camundongos) iniciaram-se em 1957 (Shapiro,
Fugman, 1957). Baseados nestes achados, Bernard Fisher e colaboradores iniciaram, em
1958, o primeiro estudo colaborativo com o objetivo de avaliar a resposta à administração
Introdução
Oliveira AL – 2007
5
sistêmica de quimioterapia peri-operatória em pacientes com carcinoma de mama operável
(Fisher et al, 1958). Bons resultados foram obtidos em relação ao tempo livre de doença e
sobrevida global em mulheres na pré-menopausa (Fisher et al, 1968).
Resultados semelhantes também foram observados por outros autores, com a
utilização de poliquimioterapia (ciclofosfamida, metotrexate, fluorouracil (CMF) com ou sem
prednisona) em carcinoma mamário avançado (Canellos et al, 1974 e 1976; Bonadonna et al,
1976).
Portanto, a adição da poliquimioterapia adjuvante em CM demonstrou ganho de
sobrevida por meio do controle de micrometástases, em pacientes com linfonodos acometidos
ou não pela neoplasia (Fisher et al, 1975; Bonadonna et al, 1976; Early Breast Cancer
Trialists Collaborative Group (EBCTCG), 1988; Fisher et al, 1989; Bonadonna et al, 1995;
Mansour et al, 1998; Carlson et al, 2000 e NIH, 2000).
1.1.1.2.2 Tratamento primário
A quimioterapia primária é definida como modalidade terapêutica onde há
introdução da quimioterapia antiblástica, antes do tratamento local, quer seja radioterapia ou
cirurgia (Bear, 1998). Ela foi introduzida por De Lena et al (1978) que, utilizando adriblastina
e vincristina em 110 mulheres com CM avançado, obtiveram taxas de respostas completas
e/ou parciais de 70%; os resultados foram publicados em 1978.
Um dos principais estudos relacionados à quimioterapia primária foi o National
Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project B18 (NSABP B18) que demonstrou não haver
diferença significante entre as taxas de sobrevida livre de doença e as taxas de sobrevida livre
de doença à distância (entre os que receberam quimioterapia neo-adjuvante e os que
receberam quimioterapia pós-operatória adjuvante), porém, permitiu maiores taxas de
Introdução
Oliveira AL – 2007
6
cirurgias conservadoras e o estudo “in vivo” da biologia tumoral (Fisher et al, 1998).
Evidências clínicas demonstraram que regimes quimioterápicos contendo drogas
antracíclicas, sobretudo epirrubicina, em associação com outros agentes como ciclofosfamida
e 5-fluorouracil, são mais efetivos no tratamento adjuvante quando comparados com o
esquema CMF em pacientes pré-menopáusicas e apresentam significativo aumento das taxas
de sobrevida e intervalo livre de doença (Ormrod et al, 1999, Piccart et al, 2001).
1.1.1.2.3 Resistência celular a quimioterapia
Foram identificados dois tipos de resistência: resistência primária ou refratária que
corresponde à situação clínica na qual a doença não apresenta resposta à terapêutica e a
resistência secundária ou adquirida na qual, inicialmente, se observam resposta e,
posteriormente, falência do esquema de tratamento (Kroger et al, 1999).
Vários mecanismos podem causar o fenótipo de multi-resistência a drogas
quimioterápicas e estão bem caracterizados em experimentos in vitro, tais como: farmacologia
sistêmica (farmacocinética e metabolismo), mecanismos oncológicos supercelulares (meio
ambiente tumoral, resistência multicelular a drogas) e mecanismos oncológicos celulares:
farmacologia celular, ativação e inativação de drogas, alteração de alvos específicos e
regulação de vias de apoptose (Leonessa et al, 2003, Riddick et al, 2005).
A identificação dos fatores do metabolismo celular, que estão relacionados com a
resistência às drogas, possibilitará identificar quais pacientes estão sob particular risco de
falência terapêutica.
Dentre os fatores bioquímicos e moleculares de resistência às drogas, destacamos:
super-expressão da glicoproteína P; altas concentrações intracelulares de enzimas de
purificação do metabolismo celular, dentre elas as enzimas da família das glutationa S-
Introdução
Oliveira AL – 2007
7
transferases (GSTs); alterações nos mecanismos de sinalização da via “c-Jun N-terminal
kinase 1” (JNK1) e “apoptosis signal-regulating kinase” (ASK1) necessárias para ativação da
“mitogen-activated protein” (MAP quinase) no processo de apoptose e restauração celular.
Estas vias também são mediadas por proteínas codificadas pelos genes das GSTs. (O’Brien,
Tew, 1996; Burg, Mulder, 2002; L’Ecuyer et al, 2004).
Diferentes taxas de respostas a regimes similares de quimioterapia, observadas em
grupos de pacientes com as mesmas características biológicas e estadiamento, sugerem a
existência de diferentes mecanismos de resistência às drogas quimioterápicas, provavelmente
induzidas por alterações genéticas (Hayes, Pulford, 1995; O’Brien, Tew, 1996; Pakunlu et al,
2003).
Dentre os mecanismos de purificação do metabolismo celular envolvidos no
processo de inativação de substâncias tóxicas à célula, destaca-se a atuação das enzimas da
família das GSTs na fase II do metabolismo de purificação celular. As primeiras evidências
do seu envolvimento no processo de resistência às drogas usadas no tratamento
quimioterápico surgiram a partir de pesquisas científicas publicadas pelos grupos de
Schisswelbauer et al (1990), Tew (1994) e Hayes, Pulford, (1995). No entanto, a relação entre
as GSTs e a resistência à quimioterapia continua inconsistente (Riddick et al, 2005).
O mecanismo de resistência celular envolvendo as GSTs está relacionado à
capacidade de regular a ação de enzimas envolvidas na catalisação de compostos eletrofílicos
danosos às células provenientes da ativação pelo citocromo P-450 1A1 e 1B1 (Fase I). Estes
compostos, por sua vez, são substratos dos sistemas enzimáticos da fase II, aqui representados
pela família das GSTs, que estão envolvidas em duas frentes no processo de resistência às
drogas: produção de enzimas do metabolismo de proteção celular e inibição dos processos
apoptóticos via JNK1 e ASK1 (Townsed, Cowan, 1989; Hamada et al, 1994; Tew , 1994;
O’Brien, Tew, 1996; Gaudiano et al, 2000; O’Brien et al, 2000; Tashiro et al, 2001; Harbottle
Introdução
Oliveira AL – 2007
8
et al, 2001; Towsend, Tew, 2003b).
1.1.2 As Glutationa S- transferases (GSTs)
A família das GSTs é constituída por oito classes citosólicas denominadas e
simbolizadas pelo alfabeto grego: Alpha, Kappa, Mu, Omega, Pi, Sigma, Theta e Zeta; São
altamente polimórficas, com cerca de 30% de semelhança entre suas seqüências de bases.
Cada uma dessas classes possui vários alelos que chegam a 50% de semelhança entre suas
seqüências de bases e são capazes de produzir enzimas da fase II de purificação celular.
A purificação celular se dá por meio da capacidade de regulação da ação de
proteínas quinases envolvidas na catalisação de compostos eletrofílicos danosos às células
(xenobióticos), provenientes da ativação pelo citocromo P-450 1A1 e 1B1, tais como,
carcinógenos químicos genotóxicos e agentes citotóxicos quimioterápicos e seus metabólitos
por meio de ligação à glutationa (Fig. 1) (Townsed, Cowan, 1989; Shea et al, 1990; Tew,
1994; Shimada et al, 1996; Townsend, Tew, 2003a,b; Daly, 2003). As enzimas da família das
GSTs reunidas chegam a expressar cerca de 5 a 10 % de todas as proteínas celulares (Burg,
Mulder, 2002).
Introdução
Oliveira AL – 2007
9
NH²
COOH
O
O
NH
NH
SH
COOH
GLUTATIONA
+
XENOBIÓTICO (X)
O
O
O
COOH
COOH
NH
NH
S-X
GLUTATIONA CONJUGADO
FIGURA 1.
Conjugação da glutationa a um xenobiótico genérico (X) via catalisação pelas
GSTs formando um conjugado de GST.
Estudos têm demonstrado que o complexo enzimático das GSTs participa das vias
JNK1 e ASK1, necessárias para ativação da MAP quinase envolvida nos processos de
sinalização de apoptose e restauração celular. Estes participam ainda da catalisação e da
conjugação de compostos eletrofilicos e radicais livres ao tri-peptídeo glutationa (γ-glu-cys-
gly, ou GSH), produzida pela GSH-redutase. Desta forma, eles se tornam quimicamente
menos reativos e mais hidrossolúveis, tendo sua excreção facilitada por complexos
enzimáticos de membrana, dentre os quais se destaca a enzima gP1 codificada pelo gene
MRP1 da família dos transportadores ABC (Arrick, Nathan, 1984; Townsed, Cowan, 1989;
Hamada et al, 1994; Tew, 1994; O’Brien, Tew, 1996; Morrow et al, 1998, Gaudiano et al,
2000; Harbottle et al, 2001; Burg, Mulder, 2002; Towsend, Tew, 2003a, b; Parl, 2005).
A glutationa (GSH) é uma das principais substâncias intracelulares não-proteicas
presentes no processo de ativação e inativação de substratos tóxicos ao ciclo celular. Estas
reações ocorrem como resposta à presença de radicais livres e produtos de reações de óxido-
Introdução
Oliveira AL – 2007
10
redução liberados pelos fenômenos de estresse e inflamação a que as células sadias e tumorais
são submetidas (Arrick, Nathan, 1984; Russo, Mitchell, 1985; Asakura et al, 1999; Adler et
al, 1999; Burg, Mulder, 2002; McIlwain et al, 2006). Assim, a GSH exerce um importante
papel na sobrevivência celular, podendo ser encontrada em altas concentrações em tecido
tumorais, onde há alta atividade das enzimas da família das GSTs (O’Brien, Tew, 1996;
O’Brien et al, 2000).
A GSH pode apresentar-se de várias formas, sendo mais comum sua forma reduzida
sulfidril que está relacionada às reações com substâncias óxido-reduzidas ou às reações com
substâncias eletrofílicas. Estas reações podem ser reversíveis ou irreversíveis, espontâneas ou
mediadas pelas enzimas da família das GSTs (Arrick, Nathan, 1984; O’Brien, Tew, 1996;
Burg, Mulder, 2002).
Na terapia anti-neoplásica, a GSH tem quatro funções: proteção celular, por meio do
bloqueio de substâncias tóxicas à célula; mediação na formação de substâncias tóxicas às
células; direcionamento celular, permitindo o efluxo e influxo de substâncias através da
associação com sistemas enzimáticos de membrana e interação terapêutica, por meio de
modificações na efetividade de determinadas drogas (Arrick, Nathan, 1984).
Entre os substratos para as enzimas citosólicas da família das GSTs, estão drogas
anti-neoplásicas como melfalan, clorambucil, adriamicina, ciclofosfamida, sais da platina
entre outras (Tab. 1), as quais, na presença destas enzimas, apresentam uma menor
concentração intracelular (Dirven, 1994; Paumi et al, 2001; Townsend, Tew, 2003a, b).
Introdução
Oliveira AL – 2007
11
TABELA 1: Drogas anti-neoplásicas associadas com aumento dos níveis de GST e resistência
celular
.
Substratos diretos das GSTs
Clorambucil
Melphalan
Mustarda nitrogenada
Mustarda Fosforamida
Acroleína
Carmustina
Hidroxialquilantes
Ácido etacrínico
Esteróides
Substâncias não caracterizadas como substratos diretos das GSTs
Antimetabólicos*
Drogas antimicrotúbulos*
Inibidores das topoisomerases I e II*
Bleomicina
Hepsulfan
Mitomicina C*
Adriamicina*
Cisplatina*
Carboplatina
*Requerem ativação da JNK para citotoxidade
(Adaptado da Townsend, Tew, 2003b)
São ainda substratos para as enzimas da família das GST as substâncias
carcinogênicas e citotóxicas provenientes do meio ambiente como tabaco, álcool e carne
vermelha, que estão possivelmente relacionadas à carcinogênese em diversos órgãos como
mama, bexiga e cólon.
1.1.2.1 As glutationa S-transferases (GSTs) e câncer de mama
As classes das GSTs relacionadas ao CM são as classes Alfa, Theta, Mu e Pi. No
presente estudo, abordamos as três últimas por serem as mais freqüentemente estudadas e
cujas análises têm fornecido maior informação em relação à quimioterapia adjuvante e o CM.
As proteínas que pertencem à classe Mu são codificadas por um grupo de genes
Introdução
Oliveira AL – 2007
12
localizados no cromossomo 1 (GSTM 1-5). Estes genes estão relacionados a diversas doenças
e à suscetibilidade a diferentes formas de câncer (Townsend, Tew, 2003a).
O gene GSTM1 (número de acesso no Genbank AY532926) é o mais estudado e
possui quatro formas alélicas diferentes (GSTM 1*A, 1*B, 1*0 nulo e 1*Ax2 que estão
relacionadas a uma variedade de neoplasias, como de pulmão, de cólon e reto, de orofaringe,
de bexiga e o de mama (Bell et al, 1993; Ambrosone et al, 1995; Saarikoski et al, 1998;
Helzlsouer et al, 1998; Jourenkova-Mironova et al, 1999; Dunning et al, 1999; Ambrosone et
al, 2001; Loktionov et al, 2001 e Sgambato et al, 2002; Towsend, Tew, 2003a). No entanto
alguns autores não conseguiram demonstrar tal relação (Bailey et al, 1998; Lizard-Nacol et al,
1999; Garcia-Closas et al, 1999).
As enzimas codificadas pelo gene GSTM1 catalisam a conjugação de compostos
eletrofílicos e radicais livres ao GSH e exercem ainda, uma inibição da via ASK1 de
apoptose, independentemente de sua ação catalítica. Esta inibição ocorre enquanto os
complexos enzimáticos de GSTM1/ASK1 estão coligados. Na presença de altas
concentrações de substâncias óxido – reativas, este complexo se dissocia liberando as enzimas
de ASK1 para fosforilação e sinalização da apoptose (fig 2) (Cho et al, 2001). O genótipo
GSTM1 nulo representa o polimorfismo onde os dois alelos que determinam sua expressão
gênica estão ausentes. Assim, indivíduos que apresentem este genótipo não possuem a
capacidade de produzir as enzimas de catalisação necessárias ao processo de conjugação com
a GSH. Além disso, também não sintetizam as proteínas capazes de se coligarem às proteínas
da via ASK1, necessárias para a inibição desta via de apoptose (Cho et al, 2001; McIlwain et
al, 2006). O genótipo nulo chega a estar presente em 40 a 50% da população (Tew, 1994),
variando entre 22% nos nigerianos, 58% nos chineses, 45% no oeste europeu e em até 67%
nos australianos e está relacionado à melhor resposta ao uso de algumas classes de
quimioterápicos contra diversos tipos de câncer (Alpert et al, 1997; Ambrosone et al, 2001;
Introdução
Oliveira AL – 2007
13
Sgambato et al, 2002; Autrup et al, 2002; Townsend, Tew, 2003a; Khedhaier et al, 2003;
Parl, 2005). Contudo, esse polimorfismo também se encontra relacionado a um maior risco
para o desenvolvimento do CM quando associado ao tabagismo de longa duração, à ingestão
de carne e de álcool, ao número de gestações a termo e à idade da primeira gestação
(Ambrosone et al, 1995; Charrier et al, 1999; Mitrunen et al, 2001; Park et al, 2000; Zheng et
al, 2002; Zheng et al, 2003; Park et al, 2003). Alguns grupos, no entanto, não observaram tais
relações (Townsend et al, 1992; Bailey et al, 1998; Lizard-Nacol et al, 1999; Garcia-Closas et
al, 1999).
As proteínas da classe Theta são codificadas por dois genes (T1 e T2), que estão
localizados no cromossomo 22. A classe GSTT1 (número de acesso no Genbank AB057594)
possui três formas alélicas: T1*A; T1*B e T1*0 ou nulo, sendo que a última está presente
entre 10 e 30% nas populações africana, européia e americana e entre 10 e 64% na população
asiática (Townsend, Tew, 2003a). A presença do alelo T1 nulo está relacionada à
predisposição para alguns tipos de câncer (Townsend, Tew, 2003a; Saarikoski, 1998;
Helzlsouer et al, 1998; Jourenkova-Mironova et al, 1999 e Ambrosone et al, 2001), dentre
eles, o de mama em mulheres pós menopáusicas usuárias de grande quantidade de bebidas
alcoólicas e fumantes de longa data, bem como em mulheres pré-menopáusicas nulíparas ou
que gestaram após os 30 anos (Park et al, 2000; Zheng et al, 2002; Zheng et al, 2003; Park et
al, 2003), embora alguns trabalhos não tenham demonstrado esta relação (Bailey et al, 1998;
Garcia-Closas et al, 1999; Millikan et al, 2000). No entanto, a presença da forma GSTT1 nula,
que não produz as enzimas de purificação do metabolismo celular, foi associada a uma melhor
resposta à quimioterapia em pacientes com CM bem como a uma maior toxicidade a alguns
agentes quimioterápicos (Howells et al, 2001; Naoe et al, 2002; Khedhaier et al, 2003).
A classe Pi, por sua vez, é composta por apenas uma proteína codificada por um
gene localizado no cromossomo 11 e denominado GSTP1 (número de acesso no Genbank
Introdução
Oliveira AL – 2007
14
AY324387). O gene GSTP1 possui três formas alélicas sendo uma selvagem denominada
GSTP1*A (Ile105Ile/Ala113Ala) e duas formas polimórficas, GSTP1*B(105Ile Val) onde
ocorre a substituição de Ile por Val em pelo menos um dos aminoácidos no códon 105 e
GSTP1*C (105 Ile Val/113 Ala Val) onde, além da alteração observada em GSTP1B*,
também se observa a substituição de Ala por Val em pelo menos um dos aminoácidos do
códon 113. Estas formas estão presentes, respectivamente, em 68%, 26% e 7% da população
caucasiana (Townsend, Tew, 2003a).
As enzimas produzidas pelo gene GSTP1*A prevalecem como um marcador da
carcinogênese, pois estão presentes em grande número de células tumorais (Townsend, Tew,
2003a). Sua relação com a proteção celular está mais relacionada à atuação no processo
apoptótico. Enquanto as proteínas codificadas pela forma “selvagem” GSTP1*A estiverem
coligadas às proteínas da via JNK, ocorrerá inibição desta via de apoptose. Esta ação poderá
cessar à medida que a intensidade dos fenômenos de estresse a que a célula é submetida
aumentarem (fig 2), fenômeno que ocorre independentemente da sua ação catalítica. Já as
formas polimórficas não têm a capacidade de síntese de proteínas capazes de se coligarem às
enzimas da via JNK e, portanto, não têm a capacidade de inibir esta via de apoptose (Adler et
al, 1999; Dang et al, 2005).
A participação das enzimas codificadas pelo gene GSTP1*A nos processos de
sobrevivência celular através da catalisação com a GSH parece ser uma reposta secundária ou
de conseqüência a fenômenos de estresse aos quais as células são submetidas e ocorrem em
duas vias de atuação. A primeira delas está relacionada principalmente a drogas
quimioterápicas antracíclicas e seus substratos quando associados aos transportadores de
membrana ABC, responsáveis por um dos mecanismos de efluxo celular dos complexos
GSH/droga. A segunda via de atuação está relacionada a uma ação inibitória dos complexos
GSH/droga sobre as enzimas da classe GSTP1*A, estimulando o processo apoptótico
Introdução
Oliveira AL – 2007
15
(Nakagawa et al, 1988,1990; Tew, 1994; Helzlsouer et al, 1998; Adler et al, 1999; Sweeney
et al, 2000; Tashiro et al, 2001; Wang et al, 2001; Autrup et al, 2002; Townsend, Tew,
2003a; Huang et al, 2003; McIlwain et al, 2006).
Substancias
oxido-reativas
Drogas anti-neoplásicas
GSTM1
ASK1
GSTP1
JNK
C-Jun
GSTP1
JNK
C-Jun
Apoptose
ASK1
GSTM1
P
P
P
P
+
FIGURA 2: Ação dos genes GSTM1 e GSTP1 nas vias de apoptose. Enquanto coligadas às
enzimas ASK1 e JNK1, as proteínas codificadas pelos genes GSTM1 e GSTP1
exercem uma ação de inibição das correspondentes vias de apoptose. Uma vez
expostas a substâncias oxido – reativas ocorre a dissociação dos complexos e
fosforilação das enzimas das vias ASK1 e JNK1 que passam a sinalizar para a
via de apoptose.
ASK1: “Apoptosis Signal-Regulating Kinase”
JNK/Cjun: “c-Jun N-terminal Kinase 1”
P: átomo de fósforo
A presença e distribuição dos genes que codificam a síntese de enzimas da família
das GSTs em seres humanos são variáveis. Alguns indivíduos não expressam os genes
GSTM1 e GSTT1, que determinam a produção das enzimas de purificação. Diz-se que estes
indivíduos apresentam “deletados” os referidos alelos, sendo denominados GSTs nulos. Estes,
por sua vez, são incapazes de promover a catalisação de substâncias tóxicas com a GSH,
impossibilitados de promover a inibição de proteínas-quinases necessárias ao processo
Introdução
Oliveira AL – 2007
16
apoptótico. Já a classe Pi apresenta uma substituição do aminoácido isoleucina (Ile) pela
valina (Val) no códon 105 (GSTP1*A →GSTP1*B) Esta mudança, seja em uma fita de DNA
(heterozigose) ou em ambas as fitas (homozigose), também torna a célula incapaz de produzir
as respectivas enzimas de catalisação com GSH, semelhante ao que ocorre aos GSTs nulos,
além de não mais inibir o sistema JNK 1 de apoptose ( McIlwain et al, 2006).
No Brasil, onde há uma grande miscigenação racial, estudos sobre a distribuição das
GSTs têm demonstrado que o genótipo GSTM1 nulo varia de 40 a 50 % entre brancos e de 20
a 42% entre não-brancos enquanto que o genótipo GSTT1 nulo varia de 18 a 25% entre
brancos e de 11 a 35% entre não-brancos (Arruda et al, 1998; Hatagima et al, 2000; Amorim
et al, 2002; Rossini et al, 2002).
Observam-se na literatura diferentes métodos de abordagem e diferentes desenhos de
pesquisa científica. Estudos em laboratório têm usado clones de células tumorais, como os
clones MCF-7 de CM os quais receberam transferência do gene capaz de determinar a
produção de algumas das enzimas da família das glutationa S-transferases em conjunto, ou
uma a uma, ou ainda associados a outros genes que participam do processo de proteção
celular (Moscow et al, 1989; Leyland-Jones et al, 1991; O’Brien et al, 2000; Paumi et al,
2001). Outros têm usado ratos que também apresentam expressão dos genes da família das
GSTs (Schecter et al, 1991). Existem ainda estudos com inibidores enzimáticos das GSTs
com a finalidade de demonstrar aumento da sensibilidade celular à terapia com drogas anti-
neoplásicas (Cole et al, 1990; Morgan et al, 1996). Por fim, trabalhos têm sido realizados em
mulheres com CM através da pesquisa imuno-histoquímica, utilizando-se anticorpos
monoclonais específicos das enzimas da família das GSTs em amostras de tecido tumoral ou
sadio de pacientes que foram ou serão submetidas à quimioterapia (Peters et al, 1993;
MacGrogan et al, 1996).
Mesmo estudos comparáveis têm demonstrado resultados variáveis na correlação
Introdução
Oliveira AL – 2007
17
entre GSTs e resposta quimioterápica em diversos campos da oncologia, dentre eles o CM.
Alguns autores têm encontrado uma relação positiva entre a presença destas enzimas e maior
resistência quimioterápica (Hamada et al, 1994; Dirven et al, 1994; Morrow et al, 1998;
Sweeney et al, 2000; O’Brien et al, 2000; Harbottle et al, 2001; Allan et al, 2001; Ambrosone
et al, 2001; Naoe et al, 2002; Dasgupta et al, 2003; Huang et al, 2003; Yang et al, 2005),
enquanto outros não conseguiram demonstrar tal relação (Moscow et al, 1989; Leyland-Jones
et al, 1991; Peters et al, 1993; Morrow et al, 1998; Alpert et al, 1997; Konishi et al, 1998;
Osmak et al, 1998; Allan et al, 2001; Yang et al, 2005).
Desta maneira, realizamos um trabalho observacional, longitudinal, durante o qual
foi pesquisada a presença ou não dos polimorfismos GST nulo dos genes GSTM1 e GSTT1 e o
polimorfismo A313G - 105Ile Val do gene GSTP1, pertencente às classes mu, theta e pi da
família das glutationa s-transferase, respectivamente, em pacientes com CM dos estádios II e
III sob tratamento quimioterápico primário.
18
2. OBJETIVOS
Objetivos
OLIVEIRA AL - 2007
19
Avaliar a resposta à quimioterapia primária em mulheres com adenocarcinoma
ductal invasivo de mama estádios II e III frente aos polimorfismos GSTM1/GSTM1 nulo,
GSTT1/GSTT1 nulo e GSTP1 Ile105Val (A303G) e suas combinações.
20
3. CASUÍSTICA E MÉTODOS
Casuística e Métodos
OLIVEIRA AL - 2007
21
3.1 Pacientes
Entre fevereiro de 2004 e dezembro de 2005, as primeiras 50 mulheres brasileiras
com suspeita clínica e mamográfica de CM, provenientes do ambulatório de Mastologia do
Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, as
quais apresentavam os critérios de inclusão propostos no protocolo foram convidadas a
participar do estudo.
3.1.1 Dados demográficos
Dentre as mulheres avaliadas em nosso trabalho 26 tinham pele branca e 14 pele
negra. A idade variou de 32 a 70 anos com média de 49,44 ± 9,93 anos.
O trabalho foi aprovado pela Comissão Científica do Departamento de Obstetrícia e
Ginecologia, pela Comissão Científica do Departamento de Ciências Fisiológicas e pelo
Comitê de Ética e Pesquisa da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo (Anexo
1).
3.2 Critérios de inclusão
- Mulheres portadoras de carcinoma ductal invasivo de mama estádios II e III
obedecendo aos critérios da União Internacional Contra o Câncer em sua 6
a
edição (UICC,
2003)
- Intervalo etário entre 35 e 75 anos
- Tumores únicos, unilaterais e primários de mama
Casuística e Métodos
OLIVEIRA AL - 2007
22
- Ausência de cardiopatia
As pacientes selecionadas foram comunicadas sobre a intenção e finalidade do
trabalho através de termo de consentimento livre e esclarecido, onde foi ressaltado que não
haveria interferência alguma com o fluxograma normal de atendimento, sendo necessária
apenas uma amostra (5 ml) de sangue periférico e de tecido neoplásico para realização do
trabalho (Anexo 2).
Das 50 pacientes inicialmente convidadas, excluímos dez pacientes devido às
seguintes situações: uma paciente com diagnóstico de mastite granulomatosa, três pacientes
com tumores metastáticos e seis pacientes com diagnóstico de carcinoma lobular invasivo. O
grupo que obedeceu a todos os critérios de elegibilidade foi composto por 40 pacientes.
3.3 Parâmetros avaliados
Foram avaliados os seguintes parâmetros:
- Idade
- Cor da pele
- Estado menopausal
- Estádio clínico
- Grau patológico - Grau histológico (GH) e nuclear (GN) antes e depois da
quimioterapia primária
- Linfonodos (N) clinicamente palpáveis antes e depois da quimioterapia neo-
adjuvante.
- Mensuração clínica, em centímetros, do diâmetro tumoral antes e depois da
quimioterapia
Casuística e Métodos
OLIVEIRA AL - 2007
23
- Mensuração da dimensão tumoral da peça cirúrgica à macroscopia
- Resposta clínica à quimioterapia
Procedemos com a confecção de tatuagem superficial em pele nos limites do tumor,
com tinta, para seu seguimento clínico.
O material para diagnóstico anátomo-patológico obtido por biópsia incisional
cirúrgica, sob anestesia geral, medindo cerca de um centímetro foi fixado em formaldeído e
que, posteriormente, foi montado em bloco de parafina. As lâminas obtidas a partir deste
material foram coradas com hematoxilina e eosina para classificação histopatológica segundo
a OMS (Tavassoli, 2003), bem como para a determinação dos graus histológico e nuclear
segundo os critérios de Scarff-Bloom, Richardson modificados por Elston e Ellis em 1991.
Após a confirmação do diagnóstico de carcinoma ductal invasivo, as pacientes foram
submetidas a três ciclos de quimioterapia primária a cada 21 dias, com as seguintes drogas: 5-
fluorouracil, epirrubicina e ciclofosfamida nas dosagens de 500mg/m
2
, 75mg/m
2
e 500mg/m
2
,
respectivamente, de acordo com protocolo de tratamento do Setor de Quimioterapia do
Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. O
acompanhamento da resposta clínica à infusão da medicação foi verificado a cada ciclo,
avaliando-se a resposta tumoral pela mensuração do maior diâmetro da neoplasia demarcada
previamente por tatuagem provisória e com auxílio de régua milimetrada, o paquímetro.
3.4 Classificação da resposta clínica
Para a classificação da resposta clínica tumoral (RC), levamos em consideração os
critérios adotados pelo “Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Group”- RECIST
(Therasse et al, 2000) que determinam os seguintes parâmetros:
a. Resposta completa (CR): quando ocorre desaparecimento completo da lesão alvo
Casuística e Métodos
OLIVEIRA AL - 2007
24
b. Resposta parcial (RP): quando há diminuição de pelo menos 30% do maior
diâmetro da lesão alvo
c. Progressão da doença: quando há aumento, no mínimo, de 20% do maior
diâmetro da lesão alvo
d. Doença estável: quando não ocorre alteração no tamanho da lesão ou não se
preenchem os critérios de RP e progressão da doença
Consideramos em nosso trabalho, como pacientes respondedoras (R), aquelas
classificadas como resposta completa e resposta parcial e, como não respondedoras (NR), as
que apresentaram progressão da doença ou doença estável.
Após três ciclos de quimioterapia primária, as pacientes foram submetidas à
terapêutica operatória baseada em cirurgias radicais modificadas (mastectomia total com
esvaziamento axilar e preservação dos músculos peitorais) ou conservadoras
(quadrantectomias com linfonodectomia axilar e análise de margens intra-operatórias).
A pesquisa de polimorfismos nos genes GSTM1, GSTT1, e GSTP1 foi realizada em
amostras de sangue periférico no Laboratório de Biologia Molecular do Departamento de
Ciências Fisiológicas da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo segundo
metodologia descrita a seguir.
3.5 Extração de DNA
Uma amostra de cinco mililitros de sangue venoso periférico foi coletada a partir da
veia ulnar antecubital das pacientes, em frasco estéril contendo EDTA 10% como agente
anticoagulante. A extração de DNA foi realizada por precipitação salina segundo o método de
Lahiri, Nurberger, 1991 – modificado por Cavalli, 1996 e Salazar, 1998 (Anexo 4).
Casuística e Métodos
OLIVEIRA AL - 2007
25
3.6 Avaliação dos genes GSTM1 e GSTT1
3.6.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
A PCR “multiplex” foi realizada com o intuito de se amplificarem, na mesma reação,
os genes GSTM1, GSTT1 e globina beta, sendo este último, utilizado como controle interno da
reação. Os iniciadores sintetizados e as condições da reação basearam-se no trabalho de
Wilson et al (2000).
A amplificação dos fragmentos dos genes GSTM1, GSTT1 e da globina beta foi
realizada utilizando-se os seguintes reagentes: 1,0 µl de cada iniciador na concentração de 20
pmoles (as seqüências encontram-se descritas na Tabela 2), 2,5 µl do tampão da enzima 10X
(Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, gelatina 0,01%), 1,5 µl de MgCl
2
50 mM, 0,5 µl da
mistura de nucleotídios 10X (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) e 0,1 unidade de Taq DNA
polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), somados a 2,0 µl de DNA genômico
(aproximadamente 100 ng) e 12,9 µl de água destilada. O volume final da reação de PCR foi
de 25
µ
l e esta foi realizada em aparelho ciclador de temperatura (Eppendorf MasterCycler EP
Gradient S, Hamburgo, Alemanha) sob as seguintes condições: desnaturação inicial por 15
minutos a 95ºC, seguida de 36 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 60ºC e 1 minuto a 72ºC,
sendo a reação finalizada após 1 ciclo de 10 minutos a 72ºC. Finalmente, os produtos da PCR
foram separados por meio de eletroforese em gel de agarose 2,0%, corado com brometo de
etídeo e foram examinados sob luz ultravioleta (Saiki et al, 1988). Na presença do fragmento
da globina beta, uma vez ausentes os fragmentos dos genes GSTT1 ou GSTM1, faz-se a
confirmação do polimorfismo GSTT1 nulo e GSTM1 nulo, respectivamente.
Casuística e Métodos
OLIVEIRA AL - 2007
26
TABELA 2:
Seqüências dos iniciadores utilizados para a amplificação dos genes GSTM1,
GSTT1 e globina beta (controle interno da reação)
Gene Seqüência
Tamanho
do
Fragmento
GSTT1 direto
5’- CTT CCT TAC TGG TCC TCA CAT CTC-3’
GSTT1 reverso
5’- TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA-3’
480 pb
GSTM1
direto
5’- GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAG C-3’
GSTM1 reverso
5’- CTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G-3’
215 pb
Globina beta direto
5’- GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC-3’
Globina beta reverso
5’- CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC-3’
268 pb
3.7 Avaliação do gene GSTP1
3.7.1 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
A amplificação do fragmento de interesse do gene GSTP1 foi realizada utilizando-se
os seguintes reagentes: 2,0 µl de cada iniciador na concentração de 20 pmoles (as seqüências
encontram-se descritas na Tabela 3 – Wilson et al 2000), 2,5 µl do tampão da enzima 10X
(Tris-HCl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, gelatina 0,01%), 1,5 µl de MgCl
2
50 mM, 1,0 µl da
mistura de nucleotídios 10X (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) e 0,1 unidade de Taq DNA
polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), somados a 2,0
µ
l de DNA genômico
(aproximadamente 100 ng) e 13,9 µl de água destilada. O volume final da reação de PCR foi
de 25 µl e esta foi realizada em aparelho ciclador de temperatura (Eppendorf MasterCycler EP
Gradient S, Hamburgo, Alemanha) sob as seguintes condições: desnaturação inicial por 15
minutos a 95ºC, seguida de 36 ciclos de 15 minutos a 95ºC, 1 minuto a 55ºC e 1 minuto e 30
segundos a 72ºC, sendo a reação finalizada após 1 ciclo de 10 minutos a 72ºC. Finalmente, os
produtos da PCR foram separados por meio de eletroforese em gel de agarose 1,5 % corado
Casuística e Métodos
OLIVEIRA AL - 2007
27
com brometo de etídeo e examinado sob luz ultravioleta (UV) (Saiki et al, 1988).
TABELA 3: Seqüências dos iniciadores utilizados para a amplificação do gene GSTP1
Gene Seqüência
Tamanho do
Fragmento
GSTP1 direto
5’- ACC CCA GGG CTC TAT GGG AA- 3’
GSTP1 reverso
5’- TGA GGG CAC AAG AAG CCC CT-3’
176 pb
3.7.2 Digestão Enzimática
Com o objetivo de investigar a presença do polimorfismo Ile105Val no gene GSTP1,
o produto da PCR foi submetido à digestão com a enzima de restrição Alw26I (Fermentas Life
Sciences, Hanover, MD, EUA) segundo o seguinte protocolo: 10µl de produto da PCR, 5U de
enzima Alw26I, 1,5 µl de tampão e 3 µl de água destilada. Esta solução foi incubada a 37 ºC
por 2 horas e a enzima posteriormente inativada por 20 minutos a 65°C em aparelho ciclador
de temperatura (Eppendorf MasterCycler EP Gradient S, Hamburgo, Alemanha). O produto
da digestão foi separado por meio de eletroforese em gel de agarose 4%, corado com brometo
de etídeo e visualizado sob luz UV. Foram visualizados fragmentos de 176 pb na presença do
genótipo AA (Ile/Ile) e de 91 pb e 85 pb na presença da forma polimórfica AG (105Ile
Val), em heterozigose.
3.8. Análise estatística
A primeira parte da análise consistiu na realização de testes de hipóteses em que se
buscou avaliar a existência de associação entre a variável resposta clínica e os genes,
isoladamente. Devido às características de nossa amostra, representada por variáveis
Casuística e Métodos
OLIVEIRA AL - 2007
28
categóricas e não-categóricas, empregamos a correlação de Cramer, teste não-paramétrico,
com função estatística do qui-quadrado, e nível de significância abaixo de 0,05. O coeficiente
de Cramer tem valor máximo de 1 e mínimo de 0, sendo que a associação entre as variáveis
está correlacionada com a unidade e, quando as variáveis são independentes, a correlação
aproxima-se de zero. Para esta análise utilizou-se o software estatístico SPSS – Statistical
Package for Social Sciences, versão 10.0.
A segunda parte da análise buscou avaliar a proporção de resposta clínica entre dois
grupos de genes combinados dois a dois, utilizando-se o Teste de igualdade de proporções.
Para esta análise utilizou-se o software Microsoft Excell® versão 2003.
29
4. RESULTADOS
Resultados
OLIVEIRA AL - 2007
30
4.1 Dados clínicos
A avaliação clínica das 40 pacientes incluídas em nosso estudo, revelou que o maior
diâmetro tumoral mamário previamente à quimioterapia primária, variou de 2,5 a 15cm, com
média de 5,77 ± 2,45 cm e mediana de 5cm (Anexo 3).
A medida do maior diâmetro após o término da quimioterapia primária variou de
zero a 8,5 cm com média de 3,37 ± 1,86cm e mediana de 3,0cm (Anexo 3).
A resposta clínica, classificada pelos critérios de RECIST, apresentou a seguinte
distribuição: 24 (60,0%) pacientes respondedoras e 16 (40,0%) não respondedoras (Anexo 3).
A avaliação clínica linfonodal, revelou 13 pacientes N0, 18 pacientes N1 e 9 N2
antes do início da quimioterapia e 30 N0, 8 N1 e 2 N2 ao término da quimioterapia primária;
nenhuma paciente apresentou sinais clínicos, laboratoriais e de imagem sugestivos de doença
metastática (Anexo 3).
4.2 Dados laboratoriais
A medida do maior diâmetro tumoral residual, realizada através da análise anátomo-
patológica, demonstrou variação de 0,5 a 9,0 cm com média de 3,43 ± 2,22 cm, e mediana de
3,0 cm. Em cinco pacientes (12,19%) observamos resposta anátomo-patológica completa
(Anexo 3).
A análise patológica de acometimento neoplásico linfonodal demonstrou vinte
pacientes sem comprometimento, sete pacientes com até quatro linfonodos comprometidos e
treze pacientes com mais de quatro linfonodos acometidos. O número de linfonodos
Resultados
OLIVEIRA AL - 2007
31
dissecados variou de seis a 29, com média de 14,76 ± 4,80 e mediana de 14 (Anexo 3).
Quanto à distribuição por grau histológico verificamos que, antes do início do
estudo, uma paciente apresentou grau 1, trinta e uma pacientes apresentaram grau 2 e oito
pacientes apresentaram grau 3. Após o término do estudo obtivemos 17 pacientes com grau 2,
dezoito pacientes com grau 3 e em cinco pacientes não foi possível estabelecer o grau
histológico devido à ausência de tumor (Anexo 3).
Analisando o grau nuclear antes do início da quimioterapia primária, notamos que,
das quarenta pacientes, vinte e oito foram classificados como grau 2 e doze como grau 3.
Após seu término, verificamos que uma paciente apresentava grau 1, catorze pacientes
apresentavam grau 2, vinte pacientes apresentavam grau 3 e, em cinco pacientes, não foi
possível sua determinação devido à ausência de tumor residual (Anexo 3).
4.3 Avaliação molecular
Em nosso trabalho, a distribuição isolada dos genótipos revelou: das quarenta
pacientes estudadas 22 (55%), 26 (65%) e 18 (45%) apresentaram a forma selvagem dos
genes GSTT1, GSTM1 e GSTP1 respectivamente, enquanto que 18 (45%) e 14 (35%)
apresentaram o polimorfismo nulo dos genes GSTT1 e GSTM1 respectivamente e 22 (55%)
pacientes apresentaram a forma polimórfica em heterozigose 105 Ile Val do Gene GSTP1
(Tab. 4). A representação destes achados encontra-se nas figuras 3 e 4.
Resultados
OLIVEIRA AL - 2007
32
TABELA 4
: Freqüências das formas selvagem e polimórfica dos genes GSTT1, GSTM1 e
GSTP1 em pacientes portadoras de câncer de mama estádio II e III em nosso
estudo
.
Gene nº de casos Freqüência (%)
GSTT1
"Null" 18 45,00
selvagem 22 55,00
Total 40 100,00
GSTM1
"Null" 14 35,00
selvagem 26 65,00
Total 40 100,00
GSTP1
Ile105Val 22 55,00
Ile105Ile 18 45,00
Total 40 100,00
M 1 2 3 4 5
480 pb
268 pb
215 pb
FIGURA 3: Representação da análise dos polimorfismos dos genes GSTT1 e GSTM1 por
PCR multiplex em gel da agarose 2%.
M: marcador de peso molecular (“100bp DNA Ladder”)
1: pacientes portadoras do genótipo GSTT1/GSTM1
2: pacientes portadoras do genótipo GSTT1”null”/GSTM1”null”
3,4 e 5: pacientes portadoras do genótipo GSTT1”null”/GSTM1
GSTT1: 480pb
GSTM1: 215pb
β-globina: 268pb (controle interno da reação)
Resultados
OLIVEIRA AL - 2007
33
Quando analisada a distribuição das formas selvagem e polimórficas dos genes
da família das GSTs isoladamente, em relação à variável respondedora e não respondedora
segundo análise V de Cramer, não observamos valores de p significantes para o gene GSTT1
(p = 0,622178); para o gene GSTM1 (p = 0,068842) e para o gene GSTP1 (p = 0,143526),
com intervalo de confiança de 95% (Tab. 5).
FIGURA 4: Representação da análise do polimorfismo do gene GSTP1
Ile105Val por meio de digestão com enzima Alw26I em gel de agarose 4%
M: Marcador de peso molecular (“50bp DNA Ladder”)
1,2,4,7,9 e 10: Pacientes portadoras do genótipo GSTP1Ile105Val
3,5,6,8 e 11: Pacientes portadoras do genótipo GSTP1Ile105Ile
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
176 pb
91 pb
85 pb
Resultados
OLIVEIRA AL - 2007
34
Resultados
OLIVEIRA AL - 2007
35
Quando analisadas as combinações duas a duas, as formas selvagens e as respectivas
formas polimórficas das GSTs, em relação à variável RECIST (respondedora e não
respondedora), observaram-se as distribuições demonstradas na tabela 6.
TABELA 6: Freqüências das combinações das formas selvagens e suas respectivas formas
polimórficas duas a duas segundo a variável RECIST.
As correlações, entre as combinações das formas polimórficas com suas respectivas
formas selvagens em função da variável RECIST (respondedora) segundo a técnica estatística
da Análise de Igualdade de Proporções, não se mostraram significantes, com correlação de
0,6364 para a associação GSTT1/GSTM1 (p = 06037) e com correlação de 0,8 para a
associação GSTM1/GSTP1
(p = 0,4936);
porém, mostrou-se significante para a associação
GSTT1/GSTP1, com correlação de 0,75 (p= 0,0209) (Tab. 7).
TABELA 7: Correlações entre as associações polimórficas dos genes GSTT1, GSTM1 e GSTP1 e suas
respectivas formas selvagens, duas a duas, e a variável RECIST.
Grupo 1 NA R Grupo 2 NA R valor-p
GSTT1”null”/GSTM1“null” 7 5 GSTT1/GSTM1 15 9 0,6037
GSTT1“null”/GSTP1Ile105Val
8 4 GSTT1/GSTP1Ile105Ile 8 8 0,0209
GSTM1“null”/GSTP1Ile105Val
8 7 GSTM1/GSTP1Ile105Ile
12 9 0,4936
NA: número absoluto de casos
R: número de respondedoras
Genes combinados NA R (%) NR (%)
GSTT1 “null” / GSTM1“null” 7 5 (71,4) 2 (28,6)
GSTT1/GSTM1 15 9 (60,0) 6 (40,0)
GSTT1 “null” / GSTP1 Ile105Val
8 4 (50,0) 4 (50,0)
GSTT1 / GSTP1Ile105Ile 8 8 (100,0) 0 (0,0)
GSTM1 “null” / GSTP1 Ile105Val
8 7 (87,5) 1 (12,5)
GSTM1 / GSTP1 Ile105Ile 12 9 (75,0) 3 (25,0)
NA: número absoluto de casos
R: respondedoras
NR: não respondedoras
Resultados
OLIVEIRA AL - 2007
36
Quando realizada a análise cruzada entre as diferentes formas de associação, duas a
duas, avaliando-se as polimórficas e selvagens entre si, em função da variável RECIST
(respondedora), não se observou diferença estatística, segundo Análise de Igualdade de
Proporções, para algumas das correlações demonstradas na tabela 8, exceto entre as
combinações GSTT1“null”/GSTP1Ile105Val e GSTT1/GSTP1Ile105Ile, com correlação de
0,7391 (p = 0,0376).
TABELA 8: Correlações entre as possíveis associações polimórficas e selvagens, entre si, e a
variável RECIST.
Grupo 1 NA
R (%) Grupo 2 NA
R (%) valor-p
GSTT1“null”/GSTM1“null” 7
5 (71,4)
GSTT1”null”/GSTP1Ile105Val 8 4 (50,0)
0,3960
GSTT1/GSTM1 15
9 (60,0)
GSTT1/GSTP1Ile105Ile 8 8 (100,0)
0,0376
GSTT1“null/GSTP1Ile105Val
8
4 (50,0)
GSTM1“null/GSTP1Ile105Val 8 7 (87,5)
0,1052
GSTT1/GSTP1Ile105Ile 8
8 (100,0)
GSTM1/GSTP1Ile105Ile 12
9 (75,0)
0,1260
GSTT1“null”/GSTM1“null” 7
5 (71,4)
GSTM1“null”/GSTP1Ile105Val
8 7 (87,5)
0,4412
GSTT1/GSTM1 15
9 (60,0)
GSTM1/GSTP1Ile105Ile 12
9 (75,0)
0,4122
NA: número absoluto de casos
R: número de respondedoras
Quando analisadas as associações dos genes estudados, dois a dois, sejam eles
polimórficos e/ou selvagens, em função do número de pacientes que apresentaram resposta à
quimioterapia primária, segundos os critérios RECIST (R), observaram-se os resultados
demonstrados na tabela 9.
Resultados
OLIVEIRA AL - 2007
37
TABELA 9
: Freqüência por ordem decrescente do percentual de respondedoras existentes nas
associações dos genes estudados, dois a dois.
Associações de genes NA R
Nº respondedoras
% Respondedoras
GSTT1/GSTP1 Ile105Ile 8 8 100
GSTM1"null"/GSTP1Ile105Val 8 7 87,5
GSTT1/GSTM1"null" 7 6 85,7
GSTM1/GSTP1Ile105Ile 12 9 75
GSTT1"null"/GSTM1"null 7 5 71,4
GSTM1"null"/GSTP1Ile105Ile 6 4 66,7
GSTT1/GSTM1 15 9 60
GSTT1/GSTP1Ile105Val 14 7 50
GSTT1"null/GSTP1Ile105Val 8 4 50
GSTT1"null"/GSTP1Ile105ILe 10 5 50
GSTM1/GSTT1"null" 11 4 36,4
GSTM1/GSTP1Ile105Val 14 4 28,6
NA: Número absoluto de pacientes observadas naquela associação
R: número de pacientes respondedoras dentro da associação
38
5. DISCUSSÃO
Discussão
OLIVEIRA AL - 2007
39
Múltiplas drogas são utilizadas atualmente no tratamento quimioterápico do
adenocarcinoma de mama. Ainda assim, resultados pouco satisfatórios têm sido observados,
principalmente nos casos localmente avançados. Tal fato se dá, em parte, pelos mecanismos
de resistência celular nos quais a família das GSTs tem importante participação, atuando
diretamente na produção de enzimas de catalisação de drogas quimioterápicas, bem como,
indiretamente, na regulação das vias ASK1 e JNK de apoptose. As primeiras evidências da
participação das GSTs nos mecanismos de resistência surgiram na década de 90 com os
estudos de Schisswelbauer e colaboradores em 1990 e Hayes & Pulford, em 1995. Sendo
assim, este estudo teve como objetivo analisar a resposta clínica à quimioterapia primária na
presença dos polimorfismos dos genes GSTT1, GSTM1 e GSTP1, membros da família das
Glutationa S- transferase.
Analisando isoladamente os genes selvagens GSTT1, GSTM1 e GSTP1 e suas
formas polimórficas em função das variáveis respondedoras e não respondedoras, observamos
que não houve diferenças estatísticas significantes de redução clínica da dimensão tumoral
frente à quimioterapia neo-adjuvante. Tal resultado é consistente com dados de literatura,
demonstrando não haver diferenças na resistência às drogas anti-neoplásicas na presença de
formas selvagens ou polimórficas dos genes estudados (Moscow et al, 1989; Leyland-Jones et
al, 1991; Peters et al, 1993; Morrow et al, 1998; Alpert et al, 1997; Konishi et al, 1998;
Osmak et al, 1998; Allan et al, 2001; Yang et al, 2005).
Lizard-Nacol, em 1999, estudando 92 pacientes com CM submetidas à
quimioterapia primária não encontrou associação com a presença da forma selvagem ou
polimórfica do gene GSTM1. Yang, em 2004, estudando 1602 casos de CM submetidos à
quimioterapia adjuvante, também não observou diferença estatística de resposta frente às
Discussão
OLIVEIRA AL - 2007
40
formas selvagens ou polimórficas dos genes GSTM1 e GSTT1. Allan, em 2001, estudando a
ocorrência de leucemia mielóide aguda em pacientes submetidos à quimioterapia não
observou maior ocorrência daquela afecção quando comparados indivíduos que apresentavam
as formas selvagens ou polimórficas dos genes GSTT1 e GSTM1.
Por outro lado, nossos dados se contrapõem a alguns outros trabalhos que
demonstraram relação positiva de resposta à quimioterapia em diversos tipos de câncer frente
aos polimorfismos estudados (Hamada et al, 1994; Dirven et al, 1994; Morrow et al, 1998;
O’Brien et al, 2000; Sweeney et al, 2000; Harbottle et al, 2001; Howells et al, 2001; Autrup
et al, 2002; Naoe et al, 2002; Sgambato et al, 2002; Dasgupta et al, 2003; Huang et al, 2003;
Townsend, Tew, 2003a; Parl, 2004).
Ambrosone, em 2001, em estudo retrospectivo de pacientes com CM submetidos à
quimioterapia, observou maior tempo livre de doença entre mulheres que apresentavam a
forma polimórfica dos genes GSTT1 e GSTM1 quando comparadas às mulheres que
apresentavam as formas selvagens. Allan, em 2001, observou que a ocorrência de LMA foi
significantemente maior entre indivíduos que apresentavam a forma polimórfica do gene
GSTP1 em comparação a indivíduos que possuíam a forma selvagem. Khedhaier, em 2003,
estudando 309 pacientes com CM submetidas à quimioterapia primária observou maior
período livre de doença entre pacientes que apresentavam as formas polimórficas dos genes
GSTT1 e (GSTM1 separadamente ou quando associados, em comparação a indivíduos que
apresentavam as formas selvagens destes genes. Yang, em 2004, estudando 1602 casos de
câncer de mama submetidos à quimioterapia adjuvante, também observou maior tempo livre
de doença entre indivíduos que apresentavam a forma polimórfica do gene GSTP1.
Frente a estes resultados procedemos à análise dos referidos genes comparando as
associações de formas selvagens com suas respectivas associações de formas polimórficas.
Observamos que não houve diferença estatística entre a maioria das associações de pares de
Discussão
OLIVEIRA AL - 2007
41
genes quando avaliados pelo Teste de Igualdade de Proporções, porém observamos diferenças
estatísticas quando comparado GSTT1/GSTP1Ile105Ile com sua respectiva forma polimórfica
GSTT1“null”/GSTP1Ile105Val (p = 0,0209) e quando comparado GSTT1/GSTM1 com a
associação das formas GSTT1/GSTP1Ile105Ile (p = 0,0376). Tais resultados sugerem que
possa existir alguma relação com melhor resposta à quimioterapia primária na combinação
selvagem de genes GSTT1/GSTP1Ile105Ile.
É interessante notar que, em ambos os pares de associações de genes comparados, há
a presença da associação das formas selvagens dos genes GSTT1/GSTP1Ile105Ile. Esta
combinação foi observada em oito das 40 pacientes estudadas. Após três ciclos de
quimioterapia primária, as oito pacientes apresentaram resposta clínica satisfatória permitindo
classificá-las como respondedoras dentro do critério RECIST. Tal resultado se opõe a
determinados trabalhos da literatura visto que as formas selvagens dos genes GSTT1 e GSTP1
têm a capacidade de produzir enzimas de catalisação de substâncias tóxicas às células,
protegendo-as (Dirven et al, 1994; Tew, 1994; Howells et al, 2001; Paumi, 2001; Naoe et al,
2002; Khedhaier et al, 2003; Townsend, Tew, 2003a, b). Além disto, o gene GSTP1 na sua
forma selvagem (Ile105Ile) determina a inibição da via JNK1 do processo apoptótico, o que
dificultaria a destruição celular pelo quimioterápico (Adler et al, 1999; Dang et al, 2005;
McIlwain et al, 2006). Talvez este resultado se explique pelo reduzido número de pacientes
presentes naquela amostra de associação de genes ou por fatores não controlados (genéticos
ou não) que possam estar relacionados ao metabolismo celular ou apoptose. Scheneider e
colaboradores, em 2005, publicaram estudo de radioquimioterapia primária em câncer de
esôfago. O objetivo do estudo foi estudar na expressão intratumoral dos genes da timidilato-
sintetase, epidermal growth factor receptor, HER2 e GSTP1, genes relacionados à resistência
celular. Os resultados demonstraram uma redução da expressão destes genes três semanas
após o tratamento, portanto, uma menor capacidade de atuação nos mecanismos de proteção
Discussão
OLIVEIRA AL - 2007
42
celular facilitando a destruição das células tumorais frente ao tratamento empregado.
Quando analisamos os genes associados, dois a dois, e o número de respondedoras
presentes nestas associações, podemos observar que, entre os seis maiores percentuais de
respondedoras, a forma polimórfica do gene GSTM1 está presente em quatro e a forma
selvagem do gene GSTP1 está presente em três, enquanto, entre as seis associações com
menores percentuais de respondedoras, a forma selvagem do gene GSTM1 não está presente e
a forma selvagem do gene GSTP1 está presente uma única vez.
Tais achados são concordantes com a literatura para o gene GSTM1 e discordantes
com a literatura para o gene GSTP1, pois, enquanto as formas polimórficas dos genes GSTT1,
GSTM1 e GSTP1 não produzem suas respectivas enzimas de desintoxicação celular, as formas
selvagens produzem-nas. Assim, as pacientes portadoras da forma polimórfica apresentam
maior sensibilidade aos agentes anti-neoplásicos, ao contrário das portadoras da forma
selvagem. Ainda, segundo a literatura, o gene polimórfico GSTM1 não inibe a via ASK1 de
apoptose liberando o processo de morte celular, enquanto o gene selvagem GSTP1 inibe a via
JNK1 de apoptose bloqueando o processo de apoptose (Nakagawa et al, 1988,1990; Tew,
1994; Alpert et al, 1997; Helzlsouer et al, 1998; Adler et al, 1999; Sweeney et al, 2000;
Ambrosone et al, 2001; Cho et al, 2001; Howells et al, 2001; Tashiro et al, 2001; Wang et al,
2001; Autrup et al, 2002; Naoe et al, 2002; Sgambato et al, 2002; Autrup et al, 2002; Huang
et al, Khedhaier et al, 2003; 2003; Townsend, Tew, 2003a; Parl, 2004; McIlwain et al, 2006).
Os mecanismos de resistência às drogas anti-neoplásicas estão entre as principais
causas de falhas no tratamento quimioterápico de pacientes portadoras de CM. Portanto, o
estudo de fatores do metabolismo celular, relacionados com os mecanismos de resistência
possibilitará identificar quais pacientes estão sob particular risco de falência terapêutica.
Neste sentido, embora haja a necessidade de avaliação de um número maior de pacientes, este
Discussão
OLIVEIRA AL - 2007
43
trabalho tem importância na prática clínica diária, pois tenta desvendar uma possível relação
entre polimorfismos nos genes estudados e resposta clínica à quimioterapia.
44
6 CONCLUSÕES
Conclusões
OLIVEIRA AL - 2007
45
1. Quando avaliadas as combinações das formas polimórficas com suas respectivas
formas selvagens em função da variável RECIST (respondedora) a combinação
GSTT1/GSTP1Ile105Ile mostrou associação estatisticamente significante em relação à
respectiva combinação polimórfica (GSTT1“null”/GSTP1Ile105Val) quanto à resposta
quimioterápica, sugerindo que esta combinação de genes selvagens (GSTT1/GSTP1Ile105Ile)
seja a mais sensível à quimioterapia empregada neste estudo.
2. Quando realizada a análise cruzada entre as diferentes formas de associação,
duas a duas, avaliando-se as polimórficas e selvagens entre si, em função da variável RECIST
observamos que houve associação estatisticamente significante quando comparada a
combinação GSTT1/GSTP1Ile105Ile com a combinação GSTT1/GSTM1 quanto à resposta
quimioterápica, sugerindo que esta combinação de genes selvagens (GSTT1/GSTP1Ile105Ile)
seja a mais sensível à quimioterapia empregada neste estudo.
3. Não houve correlação estatisticamente significante entre a resposta
quimioterápica e a presença individual das formas selvagens e polimórficas dos genes GSTT1,
GSTM1 e GSTP1.
46
7 ANEXOS
Anexos
OLIVEIRA AL - 2007
47
ANEXO 1
Cópia do parecer emitido pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Santa Casa de
Misericórdia de São Paulo.
Anexos
OLIVEIRA AL - 2007
48
ANEXO 2
Copia do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido entregue às pacientes
envolvidas no trabalho.
POR MEIO DESTE , VENHO CONVIDAR A SENHORA PARA PARTICIPAR
DE UM ESUDO CUJO NOME É “Avaliação dos polimorfismos genéticos das classes
GSTM1, GSTT1 e GSTP1 da família das Glutationa-S-Transferases em pacientes com
câncer de mama, estádios II e III, submetidas à quimioterapia neoadjuvante”.
PARA SEU TRATAMENTO, SERÁ NECESSÁRIO INICIALMENTE O USO DE
UMA MEDICAÇÃO DADA POR SUA VEIA CHAMADA QUIMIOTERAPIA QUE
SERVE PARA DIMINUIRMOS O TAMANHO DE SEU TUMOR PARA QUE POSSA
MOS OPERÁ-LO.
NESTE ESTUDO, GOSTARÍAMOS DE OBTER UMA AMOSTRA DE 5 ML DE
SEU SANGUE E UM PEDAÇO DE SEU TUMOR PARA CONGELARMOS E
PESQUISARMOS ALGUMAS ALTERAÇÕES EM GENES ALÉM DE SABERMOS
QUAL É O TIPO ESPECÍFICO DE SEU TUMOR.
PARA QUE ISTO OCORRA, NÓS FAREMOS UMA BIÓPSIA NO CENTRO
CIRÚRGICO ONDE A SENHORA ESTARÁ SOB SEDAÇÃO E, NESTE MOMENTO,
NÃO SENTIRÁ NENHUMA DOR. TAMBÉM, FAREMOS A APLICAÇÃO DE UMA
TINTA EM ALGUNS PONTOS DA PELE DA MAMA COMPROMETIDA PARA
MARCARMOS O TAMANHO DO TUMOR E ASSIM ACOMPANAHARMOS SE HA OU
NÃO DIMINUIÇAO DO TAMANHO DO TUMOR DURANTE A QUIMIOTERAPIA.
ALÉM DISSO, PARA ACOMPANHARMOS O TAMANHO DO TUMOR,
FAREMOS ALGUNS EXAMES QUE SÃO: MAMOGRAFIA, ULTRASSONOGRAFIA
DAS MAMAS E RESSONÂNCIA NUCLEAR MAGNÉTICA DAS MAMAS ANTES E
APÓS O USO DE QUIMIOTERAPIA.
DEPOIS DE 3 TOMADAS DA QUIMIOTERAPIA, REPETIREMOS OS EXAMES
PARA AVALIARMOS A RESPOSTA DE REDUÇAO DE TAMANHO DE SEU TUMOR
AO USO DA MEDICAÇÃO E, APÓS A FINALIZAÇÃO DESTA ETAPA,
REALIZAREMOS O TRATAMENTO CIRÚRGICO.
Anexos
OLIVEIRA AL - 2007
49
NESTE TRABALHO NÃO ESTAMOS UTILIZANDO NENHUMA DROGA
EXPERIMENTAL NEM ATRASAREMOS O SEU TRATAMENTO.
SUA PARTICIPAÇÃO É TOTALMENTE VOLUNTÁRIA E A QUALQUER
MOMENTO A SENHORA PODE DESISTIR DESTE ESTUDO NÃO HAVENDO
PREJUÍZO ALGUM AO SEU TRATAMENTO.
OS DADOS COLETADOS ESTARÃO SOB SIGILO ABSOLUTO EM PODER
DOS PESQUISADORES E A SENHORA PODE EXAMINÁ-LOS A QUALQUER
MOMENTO.
O MATERIAL COLETADO, SEJA O SEU SANGUE, SEJA O MATERIAL DE
BIÓPSIA, ESTARÁ DISPONIVEL PARA USO NESTA PESQUISA POR PERÍODO DE
CINCO ANOS. APÓS ESTE PERÍODO, QUALQUER OUTRO TIPO DE PESQUISA
QUE VENHA A SER FEITA COM ESTE MATERIAL, SERÁ AVISADO E SERÁ
SOLICITADA À SENHORA UMA NOVA AUTORIZAÇÃO.
O PESQUISADOR RESPONSÁVEL CHAMA-SE ANDRÉ LIMA DE OLIVEIRA,
MÉDICO DO SETOR DE MASTOLOGIA DA SANTA CASA DE SÃO PAULO E SEUS
TELEFONES DE CONTATO SÃO: 32240122 RAMAL 5554, 5555, 5435, 5622 E
50872915/50823039.
DECLARO QUE FUI ESCLARECIDA DE TODAS AS MINHAS DÚVIDAS E
CONCORDO EM PARTICIPAR DESTE ESTUDO VOLUNTARIAMENTE.
Ass.______________________________________________________
ENDEREÇO: _____________________________________________
NOME:__________________________________________________
RG:_____________________
SÃO PAULO ____/_____/_____
PESQUISADOR RESPONSÁVEL:
________________________________________________________
DR ANDRÉ LIMA DE OLIVEIRA – CRM 81911
Anexos
OLIVEIRA AL - 2007
50
ANEXO 3
Distribuição das 40 pacientes submetidas à quimioterapia primária segundo cor da pele,
mensuração clínica inicial (TI) e final (TF) em centímetros, avaliação clínica axilar inicial
(NI) e final (NF), estadiamento clínico (EC), mensuração anátomo-patológica (T.AP),
grau nuclear inicial (GNI) e final (GNF), grau histológico inicial (GHI) e final (GHF),
resposta clínica(RC) e alelos identificados
Registro
Nome Pele
Tl TF NI NF
EC
T.AP
GNI
GHI
GNF
GHF
RC
GSTT1
GSTM1
GSTP1
938897
ACFS B 7 5 0 0 IIB
6 2 2 2 2 NR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105VAL
952542
AMJP B 5 3 0 0 IIA
0,5 2 2 2 2 PR
SELVAGEM
“NULL” ILE105VAL
778441
ALO B 4,5 2 0 0 IIA
1,5 2 2 3 3 PR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105ILE
971248
BAC B 8 7 1 1 IIIA
3 2 2 2 2 NR
SELVAGEM
“NULL” ILE105VAL
940807
CRN N 5 3 2 0 IIIA
4 3 3 3 3 PR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105ILE
933704
DAA B 6 2 0 0 IIB
5 2 2 2 2 PR
“NULL” SELVAGEM
ILE105ILE
944267
DFM N 7 5,5 2 2 IIIA
8 2 2 3 2 NR
SELVAGEM
“NULL” ILE105ILE
953478
EL B 4 2 1 0 IIB
3 2 2 2 2 PR
“NULL” SELVAGEM
ILE105VAL
962828
ERCM N 5 3,5 1 0 IIB
5,5 3 3 3 3 PR
SELVAGEM
“NULL” ILE105ILE
967134
EMFS B 4,5 2 1 0 IIB
2 2 2 3 3 PR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105VAL
977002
ESN N 6 2 2 1 IIIA
3,5 2 2 2 2 PR
“NULL” SELVAGEM
ILE105ILE
959994
FGG B 4,5 3,5 1 0 IIB
5 2 2 3 3 NR
“NULL” SELVAGEM
ILE105VAL
971006
GMS B 4 4 1 1 IIB
3 3 2 3 3 NR
“NULL” SELVAGEM
ILE105ILE
938065
GMS N 5,5 2 2 0 IIIA
4 2 2 2 2 PR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105ILE
932700
IMF N 9 4,5 2 0 IIIA
6 3 3 3 3 PR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105VAL
964611
IAS N 8 6 0 0 IIB
9 2 2 3 2 NR
“NULL” “NULL” ILE105ILE
957012
JSS N 4 4 1 1 IIB
5 2 2 3 3 NR
SELVAGEM
“NULL” ILE105VAL
972627
JP B 4 3,5 0 0 IIA
2,2 2 3 3 3 NR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105ILE
959487
LSB B 8 6 0 0 IIB
6 3 2 3 3 NR
“NULL” “NULL” ILE105ILE
957590
MAEN B 10 8 2 1 IIIA
4 3 2 3 3 NR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105VAL
953276
MCRA B 5 2,5 1 0 IIB
2 2 1 2 2 PR
“NULL” SELVAGEM
ILE105ILE
975353
MAA B 8 7 0 0 IIB
4,5 2 2 3 3 NR
“NULL” “NULL” ILE105ILE
944773
MFG B 4 3 0 0 IIA
2 2 3 2 2 NR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105VAL
964187
MGS N 3 1,5 1 0 IIB
2 3 2 3 3 PR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105VAL
945889
NMP B 10 4,5 0 0 IIB
2 3 2 3 3 PR
“NULL” SELVAGEM
ILE105VAL
936934
NOSS B 8 2 1 0 IIIA
4 2 2 2 2 PR
“NULL” SELVAGEM
ILE105VAL
973003
OFS N 3,5 2 1 0 IIB
0,8 2 2 2 2 PR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105VAL
875245
RR B 4 3 0 0 IIA
0 2 2 0 0 NR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105VAL
973184
SM N 2,5 0 1 0 IIB
0 2 3 0 0 CR
“NULL” SELVAGEM
ILE105ILE
743631
TR B 4 2,5 1 0 IIB
3 2 2 3 2 PR
“NULL” SELVAGEM
ILE105VAL
855334
ZLJ B 5,5 3 1 0 IIIA
0 3 3 0 0 PR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105ILE
988720
MPA N 5 6 1 1 IIB
3,5 2 2 2 3 NR
“NULL” “NULL” ILE105VAL
995878
MNA B 4 0 1 0 IIB
0 2 2 0 0 CR
“NULL” “NULL” ILE105ILE
1000311
VOM B 6 0 0 0 IIB
0 3 2 0 0 CR
“NULL” SELVAGEM
ILE105ILE
1007867
MJSA B 5 3 1 0 IIB
2,5 2 2 3 3 PR
SELVAGEM
“NULL” ILE105VAL
563890
FPS B 6 7 1 1 IIIA
4,5 2 2 1 2 NR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105ILE
978375
CMS B 2,5 1,5 0 0 IIA
2 2 2 2 2 PR
SELVAGEM
“NULL” ILE105VAL
310708
EBSP N 8 6 2 1 IIIA
2 2 2 2 2 NR
“NULL” “NULL” ILE105VAL
1028856
DFS N 15 8,5 2 2 IIIA
7,5 3 2 2 3 PR
“NULL” “NULL” ILE105VAL
950377
NCC B 4 2 2 0 IIIA
0,5 3 3 3 3 PR
SELVAGEM
SELVAGEM
ILE105VAL
Média NA 5,77
3,37
NA
NA
NA
3,43
NA NA NA NA NA
Mediana
NA 5 3 NA
NA
NA
3 NA NA NA NA NA
DP NA 2,45
1,86
NA
NA
NA
2,22
NA NA NA NA NA
Nota: NR: pacientes não-respondedoras, CR: resposta completa, PR: resposta parcial, NA: não aplicável
Anexos
OLIVEIRA AL - 2007
51
ANEXO 4
Extração DNA de sangue periférico
Preparo:
•
Sangue colhido em tubo com EDTA (tampa roxa )
• Estabilizar sangue à temperatura ambiente
• Ligar banho seco, fixando temperatura em 65
o
C
1. Adicionar 600 µl de sangue em tubo Eppendorf e adicionar 900 µl solução TTKM1
(repetir este ítem ao redor de 2X, até que não haja mais hemácias no precipitado).
Agitar suavemente até a lise das hemácias pelo triton. Centrifugar a 5000 rpm (5min, RT)
e descartar o sobrenadante.
2. Lavar o precipitado com 1 ml solução TKM1 ( retirada do triton ), pipetando
suavemente. Centrifugar a 5000 rpm ( 5min, RT ).
3. Ressuspender o precipitado em 200µl de TKM2 e adicionar 20µl SDS 10%.
4. Incubar à 65
o
C por 15 min.
5. Adicionar 60µl NaCl 5M ( precipitar proteinas ). Aplicar vortex por 30 segundos
6. Centrifugar a 12000 rpm ( 10 min, RT ).
7. Recuperar cuidadosamente o sobrenadante (desprezar o precipitado)
8. Adicionar 2 volumes ( ~ 1ml ) Etanol Absoluto invertendo tubo até precipitar DNA.
9. Centrifugar a 13000 rpm ( 10 min, RT ). Descartar o sobrenadante e lavar DNA
precipitado com 500 µl Etanol 70%.
10. Centrifugar novamente à 13000rpm (10 min, RT). Descartar sobrenadante e deixar
precipitado secar (RT, 5 min , tubo invertido sobre papel filtro ).
Ressuspender DNA em 100µl ddH2O ou TE ( Tris-HCl 10 mM / EDTA 1mM, pH 8 )
Anexos
OLIVEIRA AL - 2007
52
TKM1
Concentração final Para 1 litro
Tris-HCl , pH 7,6………………… 10 mM 1.58 g
KCl ……………………………….. 10 mM 0.75 g
MgCl ……………………………… 10 mM 0.95 g
EDTA …………………………….. 2 mM 4 mL
TTKM1
Concentração final Para 1 litro
Tris-HCl , pH 7,6………………… 10 mM 1.58 g
KCl ……………………………….. 10 mM 0.75
MgCl ……………………………… 10 mM 0.95 g
EDTA …………………………….. 2 mM 4 mL
Triton-X …………………………... 0,27% 2.7 mL
TKM2
Concentração final Para 1 litro
Tris-HCl , pH 7,6……………… 10 mM 1.58 g
KCl …………………………….. 10 mM 0.75 g
MgCl …………………………… 10 mM 0.95 g
EDTA ………………………….. 2 mM 4 mL
NaCl …………………………… 400 mM 23.40 g
(método de Lahiri & Nurberger, 1991 – modificado por Cavalli 1996 e Salazar 1997)
53
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referências Bibliográficas
OLIVEIRA AL - 2007
54
Adler V, Yin Z, Fuchs SY, Benezra M, Rosario L, Tew KD, et al. Regulation of JNK signaling
by GSTp. EMBO J. 1999; 18:1321-34.
Allan JM, Wild CP, Rollinson S, Willett EV, Moorman AV, Dovey GJ, et al. Polymorphism in
glutathione S-transferase P1 is associated with susceptibility to chemotherapy-induced
leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98:11592-7.
Alpert LC, Schecter RL, Berry DA, Melnychuk D, Peters WP, Caruso AJ, et al. Relation of
Glutathione S-Transferase α and µ isoforms to response to therapy in human breast cancer. Clin
Cancer Res. 1997; 3:661-7.
Ambrosone CB, Freudenhein JL, Graham S, Marshall JR, Vena JE, Brasure JR, et al.
Cytochrome P4501A1 and Glutathione S-Transferase (M1) genetic polymorphisms and
postmenopausal breast cancer risk. Cancer Res. 1995; 55:3483-5.
Ambrosone CB, Sweeney C, Coles BF, Thompson PA, Mcclure GY, Korourian S, et al.
Polymorphism in glutatione S-transferases (GSTM1 and GSTT1) and survival after treatment
for breast cancer. Cancer Res. 2001; 61:7130-5.
Amorim LMF, Rossini A, Mendonça G, Lotsch PF, Simão TA, Gallo CVM, et al. CYP1A1,
GSTM1, and GSTT1 polymorphisms and breast cancer risk in Brazilian women. Cancer Lett.
2002; 181:179-86.
Arrick BA, Nathan CF. Glutatione metabolism as a determinant of therapeutic efficacy: a
review. Cancer Res. 1984; 44:4224-32.
Arruda VR, Grignolli CE, Gonçalves MS, Soares MC, Menezes R, Saad ST, et al. Prevalence
of homozygosity for the deleted alleles of glutatione S-transferase mu (GSTM1) and theta
(GSTM1) among distinct ethnic groups from Brazil: relevance to environmental
carcinogenesis? Clin Genet. 1998; 54:210-4.
Asakura T, Sawai T, Hashidume Y, Ohkawa Y,Yokoyama S, Ohkawa K. Caspase-3 activation
during apoptosis caused by glutathione-doxorubicin conjugate. Br J Cancer. 1999; 80:711-5.
Autrup JL, Hokland P, Pedersen L, Autrup H. Effect of glutathione S-transferases on the
survival of patients with acute myeloid leukaemia. Eur J Pharmacol. 2002; 438:15-8.
Bailey LR, Roodi N, Verrier CS, Yee CJ, Dupont WD, Parl FF. Breast cancer and CYPIA1,
GSTM1, and GSTT1 polymorphisms: evidence of a lack of association in Caucasians and
African Americans. Cancer Res. 1998; 58:65-70.
Bear HD. Indications for neoadjuvante chemotherapy for breast cancer. Semin Oncol. 1998;
25(2 Suppl. 3):3-12.
Bell DA, Taylor JA, Paulson DF, Robertson CN, Mohler JL, Lucier GW. Genetic risk and
carcinogen exposure: a commom inherited defect of the carcinogen-metabolism gene
Referências Bibliográficas
OLIVEIRA AL - 2007
55
glutathione S-transferase M1(GSTM1) that increases susceptibility to bladder cancer. J Nat
Cancer Inst. 1993; 85:1159-64.
Bonadonna G, Brusamolino E, Valagussa P, Rossi A, Brugnatelli L, Brambilla C, et al.
Combination chemotherapy as an adjuvant treatment in operable breast cancer. N Engl J Med.
1976; 294:405-10.
Bonadonna G, Valagussa P, Moliterni A, Zambetti M, Brambilla C. Adjuvant
cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil in node-positive breast cancer- the results of
20 years of follow-up. N Engl J Med 1995; 332:901-6.
Brasil. Ministério da Saúde. Taxa de mortalidade por câncer no país. [on line] Disponível em:
http://www.saude.gov.br [05 setembro de 2006]
Burg D, Mulder GJ. Glutatione conjugates and their synthetic derivates as inhibitors of
glutatione-dependent enzymes involved in cancer and drug resistance. Drug Metab Rev. 2002;
34:821-63.
Canellos GP, DeVita VT, Gold GL, Chabner BA, Schein PS, Young RC. Cyclical combination
chemotherapy for advanced breast carcinoma. Br Med J. 1974; 1:218-20.
Canellos GP, DeVita VT, Gold GL, Chabner BA, Schein PS, Young RC. Combination
chemotherapy for advanced breast cancer: response and effect on survival. Ann Intern Med.
1976; 84:389-92.
Carlson RW, Anderson BO, Bensinger W, Cox CE, Davidson NE, Edge SB, et al. NCCN
Practice Guidelines for Breast Cancer. Oncology. (Williston Park) 2000; 14:33-49.
Cavalli SA, Otta MI, Hirata RDC, Nguyen NY, Hirata MH. Apolipoprotein E genotyping in
Brazilian normocholesterolemic individuals. Clin Chem 1996;42(Suppl): S298.
Charrier J, Maugard CM, Le Mevel B, Bignon YJ. Allelotype influence at Glutathione S-
Transferase M1 locus on breast cancer susceptibility. Br J Cancer. 1999; 79:346-53.
Cho SG, Lee YH, Park HS, Ryoo K, Kang KW, Park J, et al. Glutatione S-transferase mu
modulates the stress-activated signals by suppressing apoptosis signal-regulating kinase 1. J
Biol Chem. 2001; 276:12749-75.
Cole SP, Downes HF, Mirski SE, Clements DJ. Alterations in glutathione and glutathione-
related enzymes in a multidrug-resistant small cell lung cancer cell line. Mol Pharmacol. 1990;
37:192-7.
Daly A K. Pharmacogenetics of the major polymorphic metabolizing enzymes. Fundam Clin
Pharmacol. 2003; 17:27-41.
Dang DT, Chen F,Kohli M, Rago C, Cummins JM, Dang LH Glutathione S- transferase π1
promotes tumorigenicity in HCT116 colon cancer cells. Cancer Res. 2005; 65:9485-94.
Dasgupta RK, Adamson PJ, Davies FE, Rollinson S, Roddam PL, Ashcroft AJ, et al.
Polymorphic variation in GSTP1 modulates outcome following therapy for multiple myeloma.
Blood. 2003; 102:2345-50.
Referências Bibliográficas
OLIVEIRA AL - 2007
56
De Lena M, Zucali R, Viganotti G, Valagussa P, Bonadonna G Combined chemotherapy-
radiotherapy approach in locally advanced (T3b – T4) breast cancer. Cancer
Chemother.Pharmacol.1978; 1:53-9.
Dirven HA, van Ommen B, van Bladeren PJ. Involvement of human glutathione S-transferase
isoenzymes in the conjugation of cyclophosphamide metabolites with glutathione. Cancer Res.
1994; 54:6215-20.
Dunning AM, Healey CS, Pharaoah PD, Teare MD, Ponder BA, Easton DF. A systematic
review of genetic polymorphisms and breast cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.
1999; 8:843-4.
Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group. Effects of adjuvant tamoxifen and of
cytotoxic therapy on mortality in early breast cancer: an overview of 61 randomized trials
among 28,896 women. N Engl J Med. 1988; 319:1681-92.
Elston CW, Ellis IO. Pathological prognostic factors in breast cancer. I. the value of histoligical
grade in breast cancer: experience from a large study with long-term follow-up. Histopatology
1991;19:403-10.
Fisher ER, Turnbull RB Jr. The cytolologic demonstration and significance of tumor cells in
the mesenteric venous blood in patients with colorectal carcinoma. Surg Gynecol Obstet. 1955;
100:102-8.
Fisher B, Ravdin RG, Ausman RK, Slack NH, Moore GE, Noer RJ. Surgical adjuvant
chemotherapy in cancer of the breast: results of a decade of cooperative investigation. Ann
Surg. 1968; 168:337-56.
Fisher B, Carbone P, Economou SG, Lerner H, Frelick R, Glass A, et al. 1-Phenylalanine
mustard (L-PAM) in the management of primary breast cancer. A report of early findings. N
Engl J Med 1975; 292:117-22.
Fisher B, Bauer M, Margolese R, Poisson R, Pilch Y, Reymond C, et al. Five year results of a
randomized clinical trial comparing total mastectomy and segmental mastectomy with or
without radiation in the treatment of breast cancer. N Engl J Med. 1985; 312:665-73.
Fisher B, Redmond C, Dimitrov NV, Bowman D, Legault-Poisson, S, Wickerham DL, et al. A
randomized clinical trial evaluating sequential methotrexate and fluorouracil in the treatment of
patients with node-negative breast cancer who have estrogen-receptor negative tumors. N Engl
J Med. 1989; 320:473-8.
Fisher B, Anderson S, Redmond CK, Wolmark N, Wickerham DL, Cronin WM. Reanalysis
and results after 12 years of follow-up in a randomized clinical trial comparing total
mastectomy with lumpectomy with or without irradiation in the treatment of breast cancer. N
Engl J Med 1995; 333:1456-61.
Fisher B, Bryant J, Wolmark N, Mamounas E, Brown A, Fisher ER, et al. Effect of
preoperative chemotherapy on the outcome of women with operable breast cancer. J Clin
Oncol. 1998; 16:2672-85.
Referências Bibliográficas
OLIVEIRA AL - 2007
57
Garcia-Closas M, Kelsey KT, Hankinson SE, Spiegelman D, Springer K, Willett WC, et al.
Glutathione S-transferase mu and theta polymorphisms and breast cancer susceptibility. J Natl
Cancer Inst 1999; 91:1960-4.
Gaudiano G, Koch, TH, Lo Bello M, Nuccetelli M, Ravagnan G, Serafino A, et al. Lack of
glutathione conjugation to adriamycin in human breast cancer MCF-7/DOX cells. Biochem
Pharmacol. 2000; 60:1915-23.
Halsted WS. The results of operation for the cure of cancer of the breast performed at the Johns
Hopkins Hospital from June 1889 to January 1894. Ann Surg [periodical on line] 1894;
20:497-555. Available: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1493925
[2006Aug 16]
Hamada S, Kamada M, Furomoto H, Hirao T, Aono T. Expression of Glutatione S-transferase-
π in human ovarian cancer as an indicator of resistance to chemotherapy. Gynecol Oncol.
1994; 52:313-9.
Harbottle A, Daly AK, Atherton K, Campbell FC- Role of glutathione S-transferase P1, P-
glycoprotein and multidrug resistance-associated protein 1 in acquired doxorubicin resistance.
Int J Cancer. 2001; 92:777-83.
Hatagima A, Klatau-Guimaraes MN, Silva FP, Cabello PH. Glutatione S-transferase M1
(GSTM1) polymorphism in two Brazilian populations. Genet Mol Biol. 2000; 23:709-13.
Hayes JD, Pulford DJ The glutathione S-transferase supergene family: regulation of GST* and
the contribution of the isoenzymes to cancer chemoprotection and drug resistence. Crit Rev
Biochem Mol Biol. 1995; 30:445-600.
Helzlsouer KJ, Selmin O, Huang H, Strickland PT, Hoffman S, Alberg AJ, et al. Association
between glutatione S-transferase M1, P1, and T1 genetic polymorphism and development of
breast. J Natl Cancer Inst. 1998; 90:512-8.
Howells RE, Holland T, Dhar KK, Redman CW, Hand P, Hoban PR, et al. Glutathione S-
transferase GSTM1 and GSTT1 genotypes in ovarian cancer: association with p53 expression
an survival. Int J Gynecol Cancer. 2001; 11:107-12.
Huang J, Tan PH, Thiyagarajan J, Bay B. Prognostic significance of glutathione S-transferase-
Pi in invasive breast cancer. Mod Pathol. 2003; 16:558-65.
Instituto Nacional do Câncer. Estimativas em câncer de mama.
2003. [on line] Disponível em:
< http://www.inca.gov.br/estimativas/2003/index.asp?link=mapa.asp&ID=13>
Instituto Nacional do Câncer. [on line] Estimativa de câncer no Brasil para 2006. Brasília
(D.F.): INCA; 2006. Disponível:
http://www.inca.gov.br/estimativas/2004/tbregioes_consolidado.asp?ID=1 [10/09/2006]
Jemal A, Siegel R, Ward E, Murray T, Xu J, Smigal C et al. Cancer statistics, 2006. CA Cancer
J Clin. 2006; 56:106-130.
Jourenkova-Mironova N, Voho A, Bouchardy C, Wikman H, Dayer P, Benhamou S, et al.
Glutathione S-transferase GSTM1, GSTM3, GSTP1 and GSTT1 genotypes and the risk of
smoking-related oral and pharyngeal cancers. Int J Cancer. 1999; 81:44-8.
Referências Bibliográficas
OLIVEIRA AL - 2007
58
Khedhaier A, Remadi S, Corbex M, Ahmed SB, Bouaouina N, Mestiri S, et al. Glutathione S-
Transferases (GSTT1 and GSTM1) gene deletions in tunisians: susceptibility and prognostic
implications in breast carcinoma. Br J Cancer. 2003; 89:1502-7.
Konishi I, Nambu K, Mandai M, Tsuruta Y, Kataoka N, Nagata Y, et al. Tumor response to
neoadjuvant chemotherapy correlates with the expression of P-glycoprotein and PCNA but not
GST-π in the tumor cells of cervical carcinoma Gynecol Oncol. 1998; 70:365-71.
Kroger N, Acterrath S, Hegewisch-Becker K, Mross K, Zander AR. Current options in
treatment of anthracycline-resistant breast cancer. Cancer Treat Rev. 1999; 25:279-91.
Lahiri DK, Nurnberger JI Jr. A rapid non-enzymatic method for preparation of HMW DNA
from blood for RFLP studies. Nucleic Acids Res1991;19:5444.
L’Ecuyer T, Allebban Z, Thomas R, Vander Heide RV. Glutathione S-transferase over
expression protects against anthracycline-induced H9C2 cell death. Am J Physiol Heart Circ
Phisiol. 2004; 286:H2057-64.
Leonessa F, Clarke R. ATP binding cassette transporters and drug resistance in breast cancer.
Endocr Relat Cancer. 2003; 10:43-73.
Leyland-Jones BR, Towsend AJ, Tu CD, Cowan KH, Goldsmith ME. Antineoplastic drug
sensitivity of human MCF-7 breast cancer cells stably transfected with a human α class
glutathione S-transferase gene. Cancer Res. 1991; 51:587-94.
Lizard-Nacol S, Coudert B, Colosetti P, Riedinger JM, Fargeot P, Brunet-Lecomte P.
Glutathione S-transferase M1 null genotype: lack of association with tumour characteristics
and survival in advanced breast cancer. Breast Cancer Res. 1999;1:81-7.
Loktionov A, Watson MA, Gunter M, Stebbings WS, Speakman CT, Bingham SA.
Glutathione-S-transferase gene polymorphisms in colorectal cancer patients: interaction
between GSTM1 and GSTM3 allele variants as a risk-modulating factor. Carcinogenesis. 2001;
22:1053-60.
MacGrogan G, Mauriac L, Durand M, Bonichon F, Trojani M, de Mascarel I, et al. Primary
chemotherapy in breast invasive carcinoma: predictive value of the immunohistochemical
detection of hormonal receptors, p53, c-erbB-2, MiB1, pS2 and GST pi. Br J Cancer. 1996;
74:1458-65.
Mansour EG, Gray R, Shatila AH, Tormey DC, Cooper MR, Osborne CK, et al. Survival
advantage of adjuvant chemotherapy in high-risk node-negative breast cancer: ten-year
analysis--an intergroup study. J Clin Oncol. 1998;16:3486-92.
McIlwain CC, Townsend DM, Tew KD. Glutathione S-transferase polymorphisms: cancer
incidence and therapy. Oncogene. 2006; 25:1639-48.
Millikan R, Pittman G, Tse CK, Savitz DA, Newman B, Bell D. Glutathione S-transferases
M1, T1, and P1 and breast cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2000; 9:567-73.
Mitrunen K, Jourenkova N, Kataja V, Eskelinen M, Kosma V, Benhamou S, et al. Glutatione
S-transferase M1, M3, P1 and T1 genetic polymorphisms and susceptibility to breast cancer.
Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2001; 10:229-36.
Referências Bibliográficas
OLIVEIRA AL - 2007
59
Morgan AS, Ciaccio PJ, Tew KD, Kauvar LM. Isozyme specific glutathione S-transferase
inhibitors potentiate drug sensitivity in cultured human tumor cell lines. Cancer Chemother
Pharmacol. 1996; 37:363-70.
Morrow CS, Smitherman PK, Diah SK, Schneider E, Townsend AL. Coordinated action of
glutathione S-transferases (GSTs) and multidrug resistance protein 1 (MRP1) in antineoplastic
drug detoxification. Mechanism of GST A1-1- and MRP1-associated resistance to
chlorambucil in MCF7 breast carcinoma cells. J Biol Chem. 1998; 273:20114-20.
Moscow JA, Townsend AJ, Cowan KH. Elevation of π class glutathione S-transferase activity
in human breast cancer cells by transfection of the GSTπ gene and its effect on sensitivity to
toxins. Mol Pharmacol. 1989; 36:22-8.
Nakagawa K, Yokota J, Wada M, Sasaki Y, Fujiwara Y, Sakai M, et al. Levels of glutathione
S-transferase π mRNA in human lung cancer cell lines correlate with the resistance to cisplatin
and carboplatin. Jpn J Cancer Res; 1988; 79:301-4.
Nakagawa K, Saijo N, Tsuchida S, Sakai M, Tsunokawa Y, Yokota J, et al. Glutathione-S-
transferase π as a determination of drug resistance in transfectant cell lines. J Biol Chem. 1990;
265:4296-301.
Naoe T, Tagawa Y, Kiyoi H, Kodera Y, Miyawaki S, Asou N, et al. Prognostic significance of
the null genotype of Glutathione S-Transferase-T1 in patients with acute myeloid leukemia:
increased early death after chemotherapy. Leukemia. 2002; 16:203-8.
National Institutes of Health. Adjuvant therapy for breast cancer. [on line] NIH Consensus
Program. Consensus Development Program Statements. November 1-3, 2000. Available from:
http://consensus.nih.gov/HISTORICALSTATEMENTS.htm [2006 Sep 12]
National Institutes of Health. National Cancer Institute. Lifetime risk [percent] of being
diagnosed with cancer by site / race / ethnicity and sex – 17 SEER areas, 2001-2003. [ on line]
Available from: http://seer.cancer.gov/csr/1975_2003/results_merged/topic_lifetime_risk.pdf
[2006 Sep 12]
National Institutes of Health. National Cancer Institute. Lifetime risk of developing breast
cancer. [on line] Available from:
http://surveillance.cancer.gov/statistics/types/lifetime_risk.html [2006 Sep 12]
O’Brien ML, Tew KD. Glutathione and related enzymes in multidrug resistance. Eur J Cancer
.
1996; 32A:967-78.
O’Brien M, Kruh GD, Tew KD. The influence of coordinate overexpression of glutathione
phase II detoxification gene products on drug resistance. J Pharmacol Exp Ther. 2000;
294:480-7.
Ormrod D, Holm K, Goa K, Spencer C. Epirubicin: a review of its efficacy as adjuvant therapy
and in the treatment of metastatic disease in breast cancer. Drugs Aging. 1999; 15:389-416.
Osmak M, Brozovic A, Ambriovic-Ristov A, Hadzija M, Pivcevic B, Smital T. Inhibition of
apoptosis is the cause of resistance to doxorubicin in human breast adenocarcinoma cells.
Neoplasma. 1998; 45:223-30.
Referências Bibliográficas
OLIVEIRA AL - 2007
60
Pakunlu R, Cook T, Minko T. Simultaneous modulation of multidrug resistance and
antiapoptotic cellular defense by MDR-1 and BCL-2 targeted antisense oligonucleotides
enhances the anticancer efficacy of doxorubicin. Pharm Res 2003; 20:351-9.
Parl FF. Glutathione S-transferase genotypes and cancer risk. Cancer Lett. 2005; 221:123-9.
Park SK, Yoo KY, Lee SJ, Kim SU, Ahn SH, Noh DY, et al. Alcohol consumption, glutathione
S-transferase M1 and T1 genetic polymorphisms and breast cancer risk. Pharmacogenetics.
2000; 10:301-9.
Park SK, Kang D, Noh DY, Lee KM, Kim SU, Choi JY, et al. Reprodutive factors, glutathione
S-transferase M1 and T1 genetic polymorphism and breast cancer risk. Breast Cancer Res
Treat. 2003; 78:89-96.
Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin. 2005;
55:74-108.
Paumi CM, Ledford BG, Smitherman PK, Townsend AJ, Morrow CS. Role of multidrug
resistance protein 1 (MRP1) and glutathione S-transferase A1-1 in alkylating agent resistance.
Kinetics of glutathione conjugate formation and efflux govern differential cellular sensitivity to
chlorambucil versus melphalan toxicity. J Biol Chem. 2001; 276: 7952-6.
Peters WH, Roelofs HM, van Putten WL, Jansen JB, Klijn JG, Foekens JA. Response to
adjuvant chemotherapy in primary breast cancer: no correlation with expression of glutathione
S- transferases. Br J Cancer. 1993; 68:86-92.
Piccart MJ, Di Leo A, Beauduin M, Vindevoghel A, Michel J, Focan C, et al. Phase III trial
comparing two dose levels of epirrubicin combined with cyclophosphamide, methotrexate and
fluorouracil in node positive breast cancer. J Clin Oncol. 2001; 19:3103-10.
Riddick DS, Lee C, Ramji S, Chinje EC, Cowwen RL, Willians KJ, et al. Cancer
chemotherapy and drug metabolism. Drug Metab Dispos. 2005; 33:1083-96.
Rossini A, Rapozo DC, Amorim LM, Macedo JM, Medina R, Neto JF, et al. Frequencies of
GSTM1, GSTT1 an GSTP1 polymorphisms in a Brazilian population Genet Mol Res. 2002;
1:233-40.
Russo A, Mitchell JB. Pontentiation and protection of doxorubicin cytotoxicity by cellular
glutathione modulation. Cancer Treat Rep. 1985; 69:1293-96.
Saarikoski ST, Voho A, Renikainen M, Antilla S, Karjalainen A, Malaveille C, et al.
Combined effect of polymorphic GST genes on individual susceptibility to lung cancer. Int J
Cancer. 1998; 77:516-21.
Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, et al. Primer – directed
enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. Science. 1988; 239:487-
91.
Salazar LA, Hirata MH, Cavalli A, Machado MO, Hirata RD. Optimized procedure for DNA
isolation from fresh and cryopreserved clottes human blood useful in clinical molecular testing.
Clin Chem1998; 44:1748-50
Referências Bibliográficas
OLIVEIRA AL - 2007
61
Schecter RL, Woo A, Duong M, Batist G. In vivo and in vitro mechanisms of drug resistance in
rat mammary carcinoma model. Cancer Res. 1991; 51:1434-42.
Schisselbauer JC, Silber R, Papadopoulos E, Abrams K, LaCreta FP, Tew KD.
Characterization of glutathione S-transferase expression in lymphocytes from chronic
lymphocytic leukemia patients. Cancer Res. 1990; 50:3562-8.
Schneider S, Uchida K, Brabender J, Baldus SE, Yochim J, Danenberg KD, et al.
Downregulation of TS, DPD, ERCC1, GST-Pi, EGFR, and HER2 gene expression after
neoadjuvant three-modality in patients with esophageal cancer. J Am Coll Surg. 2005 200(3):
336-44.
Sgambato A, Campisi B, Zupa A, Bochicchio A, Romano G, Tartarone A, et al. Glutathione S-
transferase (GST) polymorphism as risk factors for cancer in a highly homogeneous population
from southern Italy Anticancer Res. 2002; 22:3647-52.
Shapiro DM, Fugmann RA. A role for chemotherapy as an adjunct to surgery. Cancer Res.
1957; 1098-101.
Shea TC, Claflin G, Comstok KE, Sanderson BJ, Burstein NA, Keenan EJ, Glutathione
transferase activity and isoenzyme composition in primary human breast cancer Cancer Res.
1990; 50:6848-53.
Shimada T, Hayes, CL, Yamazaki H, Amin S, Hecht SS, Guengerich FP, et al. Activation of
chemically diverse procarcinogens by human cytochrome P-450 1B1. Cancer Res. 1996;
56:2979-84.
Swenney C, McLure GY, Fares MY, Stone A, Coles BF, Thompson PA, et al. Association
between survival after treatment for breast cancer and Glutathione S-transferase P1 Ile105Val
polymorphism Cancer Res. 2000; 60:5621-4.
Tashiro K, Asakura T, Fujiwara C, Ohkawa K, Ishibashi Y. Glutathione-S-transferase-π
expression regulates sensitivity to Glutathione-doxorubicin conjugate. Anti-Cancer Drugs.
2001; 12:707-12.
Tavassoli FA. Pathology of the breast. 2
nd
ed. Mc Graw Hill; 2003.
Terek MC, Zekioglu O, Sendag F, Akercae F, Ozsaran A, Erhan Y. MDR-1 Gene expression in
endometrial carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 2003; 13:673-7.
Tew KD. Glutahione-associated enzymes in anticancer drug resistance. Cancer Res. 1994;
54:4313-20.
Therasse P, Arbuck SG, Eisenhauer EA, Wanders J, Kaplan RS, Rubinstein L, et al. New
guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for
Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National
Cancer Institute of Canada. J Natl Cancer Inst. 2000; 92:205-16.
Townsend AJ, Cowan KH. Glutathione S-transferases and antineoplastic drug resistance.
Cancer Bull. 1989; 41:31-6.
Referências Bibliográficas
OLIVEIRA AL - 2007
62
Townsend AJ, Tu CP, Cowan KH. Expression of human µ or α class glutathione S-transferase
in stably trasfected human MCF-7 breast cancer cells: effect on cellular sensitivity to cytotoxic
agents. Mol Pharmacol. 1992; 41:230-6.
Townsend D, Tew K. Cancer drugs, genetic variation and the glutathione-S-transferase gene
family. Am J Pharmacogenomics. 2003a; 3:157-72.
Townsend D, Tew KD. The hole of glutathione-S-transferase in anti-cancer drug resistance.
Oncogene. 2003b; 22:7369-75.
Veronesi U, Banfi A, DelVecchio M, Saccozzi R, Clemente C, Greco M, et al. Comparison of
Halsted mastectomy with quadrantectomy, axillary dissection and radiotherapy in early breast
cancer: long term results. Eur J Cancer Clin Oncol. 1986; 22:1085-9.
Yang G, Shu XO, Ruan ZX, Cai QY, Jin F, Gao YT, et al. Genetic polymorphisms in
glutathione-S-transferase genes (GSTM1, GSTT1, GSTP1) and survival after chemotherapy for
invasive breast carcinoma. Cancer. 2005; 103:52-8.
Wang T, Arifoglu P, Ronai Z, Tew KD. Glutathione S-transferase P1-1 (GSTP1-1)Inhibits c-
Jun N-terminal Kinase (JNK1) Signaling through Interaction with the C Terminus. J Biol
Chem. 2001; 276:20999-1003.
Wilson MH, Grant PJ, Hardie LJ, Wild CP. Glutathine S-transferase M1 null genotype is
associated with a decreased risk of myocardial infarction. The FASEB Journal. 2000; 14:791-6.
Zheng T, Holford TR, Zahm SH, Owens PH, Boyle P, Zhang Y, et al. Cigarette smoking,
glutathione-S-transferase M1 and T1 genetic polymorphisms, and breast cancer risk(United
States). Cancer Causes Control. 2002; 13:637-45.
Zheng W, Wen WQ, Gustafson DR, Gross M, Cerhan JR, Folsom AR. GSTM1 and GSTT1
polymorphisms and postmenopausal breast cancer risk. Breast Cancer Res Treat. 2002; 74:9-
16.
Zheng T, Holford TR, Zahm SH, Owens PH, Boyle P, Zhang Y, et al. Glutathione S-
transferase M1 and T1 genetic polymorphism, alcohol consumption and breast cancer risk. Br J
Cancer. 2003; 88:58-62.
63
FONTES CONSULTADAS
Fontes consultadas
OLIVEIRA AL - 2007
64
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo. Pós-Graduação.
Normatização para apresentação de dissertações e teses.São Paulo: Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo.Pós-Graduação; 2004, 26p.
Houaiss A. Dicionário Houaiss da Língua Portuguesa. 1º. Ed. Rio de Janeiro: Editora
Objetiva, 2001.
Genbank - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=nucleotide
65
RESUMO
Resumo
OLIVEIRA AL - 2007
66
OLIVEIRA AL. Avaliação da resposta à quimioterapia primária em mulheres
com adenocarcinoma de mama estádios II e III frente aos polimorfismos dos
genes GSTM1, GSTT1 E GSTP1. 2007. Tese de Mestrado. Faculdade de Ciências
Médicas da Santa Casa de São Paulo.
O câncer de mama é uma das neoplasias de maior incidência entre as mulheres e atinge
altos índices de mortalidade ao redor do mundo. A quimioterapia primária é uma
importante estratégia no tratamento das neoplasias mamárias localmente avançadas, pois
permite a avaliação in vivo da ação das drogas citotóxicas, a possibilidade de realização
de cirurgias conservadoras e tratamento precoce de metástases. Entre as principais causas
de falhas no tratamento quimioterápico de pacientes portadoras de câncer estão
mecanismos de resistência a drogas. Aspectos bioquímicos e moleculares deste processo
de resistência celular têm sido descritos, com importante participação das enzimas
codificadas pelos genes da família das Glutationa-S-Transferases. A presença de
polimorfismos pode determinar diferentes ações fisiológicas destas enzimas interferindo
na resposta à ação das drogas. Avaliamos a presença dos polimorfismos
GSTT1/GSTT1“null”, GSTM1/GSTM1“null” e GSTP1Ile105Ile/GSTP1Ile105Val da
família das Glutationa S-transferases e sua correlação com a resposta à quimioterapia
primária, utilizando os critérios de RECIST, em 40 mulheres brasileiras portadoras de
carcinoma de mama estádios II e III, por meio de PCR multiplex e PCR-RFLP. O
genótipo polimórfico foi observado em 18, 14 e 22 pacientes para os respectivos genes
GSTT1, GSTM1 e GSTP1 e o genótipo selvagem em 22, 26 e 18 pacientes para os
respectivos genes GSTT1,GSTM1 e GSTP1. Não houve correlação estatisticamente
significante entre resposta clínica e os diversos genótipos quando analisados
individualmente. Porém, analisando os genes dois a dois, observou-se correlação
estatisticamente significante quando comparadas as associação selvagem
GSTT1/GSTP1Ile105Ile e a sua respectiva associação polimórfica
GSTT1“null”/GSTP1Ile105Val e quando comparada a associação selvagem
GSTT1/GSTP1Ile105Ile e a associação selvagem GSTT1/GSTM1, sugerindo que a
combinação de genes selvagens GSTT/GSTP1Ile105Ile proporcione uma maior
sensibilidade à quimioterapia empregada neste estudo.
67
ABSTRACT
Abstract
OLIVEIRA AL - 2007
68
Breast cancer is one of the most prevalent neoplasm in women and it reaches high
mortality rates all over the world. Primary chemotherapy is an important strategy to treat
locally advanced breast cancer, because it enables in vivo assessment of cytotoxic drug
action, the possibility to perform conservative surgeries and early treatment of metastases.
Among the key causes of chemotherapic treatment failure of breast cancer cases we can
include drug resistance mechanisms. Biochemical and molecular aspects of the process of
cell resistance have been described, especially the participation of enzymes codified by
genes of Glutathione-S-Transferase family. The presence of polymorphism can determine
different physiological actions of these enzymes, interfering in the response to drugs
actions. We assessed the presence of polymorphism GSTT1/GSTT1"null",
GSTM1/GSTM1"null" and GSTP1Ile105Ile/ GSTP1Ile105Val of Glutathione-S-
Transferase family and their correlations with response to primary chemotherapy using
RECIST criteria in 40 Brazilian women with stages II and II breast carcinoma employing
PCR multiplex and PCR-RFLP methodologies. Polymorphic genome was observed in 18,
14 and 22 patients for the respective genes GSTT1, GSTM1 and GSTP1. There was no
statistically significant correlation between clinical response and the different genotypes
when they were individually analyzed. However, when we analyzed the genes in two-by-
two comparisons, we observed statistically significant correlation when comparing the
association wild GSTT1/GSTP1Ile105Ile and the respective polymorphic association
GSTT1"null"/GSTP1Ile105Val, and wild GSTT1/GSTP1Ile105Ile and wild association
GSTT1/GSTM1. The results suggested that the combination of wild genes
GSTT/GSTP1Ile105Ile could provide greater sensitivity to the chemotherapy regimen
used in the study.
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