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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia
de Sementes
DISSERTAÇÃO
Caracterização morfo-fisiológica e identificação de fragmentos de cDNA
diferencialmente expressos em tegumentos de sementes de soja com
permeabilidade contrastante
Liliane Marcia Mertz
Pelotas, 2007
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iv
LILIANE MARCIA MERTZ
Caracterização morfo-fisiológica e identificação de fragmentos de cDNA
diferencialmente expressos de tegumentos de sementes de soja com
permeabilidade contrastante
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Pelotas, sob orientação do
Professor Paulo Dejalma Zimmer, como
parte da exigências do Programa de Pós-
Graduação em Sementes, para obtenção
do título de Mestre em Ciências.
Orientador: Paulo Dejalma Zimmer
Pelotas, 2007
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iv
Dados de catalogação na fonte:
( Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744
M575c Mertz, Liliane Marcia
Caracterização morfo-fisiológica e identificação de
fragmentos de cDNA diferencialmente expressos de
tegumentos de sementes de soja com permeabilidade
contrastante / Liliane Marcia Mertz Pelotas, 2007.
44f. :il.
Dissertação ( Mestrado ) .–Programa de Pós-
Graduação em Sementes. Faculdade de Agronomia
Eliseu Maciel. Universidade Federal de Pelotas. -
Pelotas, 2007, Paulo Dejalma Zimmer, Orientador.
1. Glycine max 2. Tegumento preto 3. cDNA-
AFLP I ZImmer, Paulo Dejalma (orientador) II
.Título.
iv
Banca Examinadora:
Prof. Paulo Dejalma Zimmer Dr.
Prof. Francisco Amaral Villela Dr.
Prof. Beatriz Helena Gomes Rocha Dr.
Cláudia Roberta Damiani Ph.D
ii
Ao meu pai (in memorian)
A toda minha família
Ao meu namorado Fernando
Dedico
iii
iv
AGRADECIMENTOS
À Deus acima de tudo.
Ao Fernando meu namorado, amigo, companheiro de trabalho, que sempre esteve
ao meu lado, me dando amor e apoio. Você, mais do que ninguém, compartilhou
comigo cada conquista, cada obstáculo a ser vencido e principalmente me deu força
para continuar mesmo quando isso parecia impossível. A você a minha mais
profunda e sincera gratidão.
Aos meus pais por todo amor, apoio, incentivo e por todos os sacrifícios que fizeram
pra que eu pudesse estar aqui hoje.
Às minhas irmãs, meus cunhados e meus sobrinhos, com quem sempre encontrei
amor e apoio, por terem me acompanhado ao longo de toda essa caminhada.
Ao Ademar, Sueli e Mario Henning, aonde encontrei uma segunda família, que me
deu além de muitas alegrias, amor e dedicação.
Ao Doutor Ademir Henning, pelo incentivo e auxilio prestados, desde meu ingresso
até a conclusão do Mestrado.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Sementes, em especial
ao meu orientador e amigo Professor Paulo Dejalma Zimmer, pela amizade e pelos
valiosos ensinamentos durante o curso.
Ao professor Odir Dellagostin, por todos os conhecimentos que me foram
transmitidos.
Aos funcionários do Laboratório de Sementes do Departamento de Fitotecnia Ireni,
Alice, Silvio, Juliana e Bandeira pela amizade e convivência.
À CAPES e a FAPERGS, pela concessão da bolsa de estudos e pelos recursos
financeiros.
A todos os colegas do Programa de Pós-Graduação em Sementes em especial aos
amigos Marcus, Fabrício e Cibele.
iv
Aos colegas do laboratório de BioSementes Geri, Gaspar, Fernanda, Patrícia,
Guilherme e Hellen pela amizade e convivência.
A todos que de alguma forma contribuíram para concretização deste trabalho.
v
Caracterização morfo-fisiológica e identificação de fragmentos de cDNA
diferencialmente expressos em tegumentos de sementes de soja com
permeabilidade contrastante
Autora: Liliane Marcia Mertz
Orientador: Paulo Dejalma Zimmer
RESUMO
Alguns trabalhos têm evidenciado a existência de genótipos de soja contrastantes
para qualidade fisiológica de semente. Tais diferenças podem existir em virtude da
presença de sementes com total ou parcial impermeabilidade à penetração de água
no tegumento, o que as tornam menos susceptíveis aos danos mecânicos, as
adversidades climáticas e a deterioração por umidade. A característica de
tegumento semi-permeável pode ser utilizada nos programas de melhoramento de
soja para ser incorporada às cultivares de alta produção visando à qualidade
fisiológica da semente. Diante do exposto, os objetivos desse estudo foram:
identificar diferenças estruturais entre os tegumentos de sementes de soja dos
genótipos CD-202 (tegumento permeável) e TP (tegumento semi-permeável); obter
fragmentos de genes diferencialmente expressos entre os tegumentos dos dois
genótipos; avaliar a qualidade fisiológica das sementes produzidas. A caracterização
morfológica dos tegumentos foi realizada através de avaliações em microscópio
ótico BX 51 com aumento de 40x. Para obtenção dos fragmentos de genes
diferencialmente expressos entre os tegumentos dos dois genótipos, utilizou-se a
técnica cDNA – AFLP. A avaliação da qualidade fisiológica das sementes foi através
dos testes de germinação e vigor (condutividade elétrica e envelhecimento
acelerado). Na avaliação morfológica, foram observadas diferenças estruturais entre
os tegumentos de semente dos dois genótipos, sendo que, os tegumentos do
genótipo TP, apresentaram maior espessura nas camadas da epiderme e
vi
hipoderme, além de outras diferenças no formato e organização das células. Com
relação aos estudos genéticos moleculares, foram identificados 47 fragmentos de
genes diferencialmente expressos entre os tegumentos dos dois genótipos. Na
avaliação da qualidade fisiológica das sementes, o genótipo TP apresentou
qualidade fisiológica superior em relação ao genótipo CD-202.
Palavras chave: Glycine max, tegumento preto, genes, cDNA – AFLP.
vii
Morpho-physiologic characterization and identification of fragments of cDNA
distinguishing expressed in soybean seed coat with contrasting permeability
Author: Liliane Marcia Mertz
Adviser: Paulo Dejalma Zimmer
SUMMARY
Some works have reported the existence of contrasting soybean genotypes for
physiological quality of seeds. There are such differences because of the presence of
seeds with total or partial impermeability for water absorption into the coat that make
them less susceptible to mechanical damages, weather adversities, deterioration by
humidity and pathogen occurrence. The characteristic of semi-permeable coat can
be used in programs of soybean crop breeding to be incorporated in genotypes of
high production, aiming at the physiologic quality of the seed. The objectives of this
study were: Identify structural differences among the coat of the genotypes CD-202
(permeable) and TP (semi-permeable); obtain fragments of genes distinguishingly
expressed among the coat of those genotypes; characterize the physiological quality
of soybean seeds produced. Morphologic characterization of the coats was carried
out by optic microscope BX 51 with increase of 40x. In order to obtain the fragments
of genes distinguishingly expressed among the coats of the two genotypes, the
technique cDNA – AFLP was used. The physiological quality of the seeds was
obtained by germination tests and vigour (accelerated ageing and electrical
conductivity). Besides, structural differences were observed among the coats of the
two genotypes, however, the genotype TP presented higher thickness in the layers of
the epidermis and hypodermis of the coat in relation to the genotype CD – 202,
beside differences in the format and organization of the cells. Regarding the
molecular genetic studies, 47 fragments distinguishingly expressed in the coats in the
formation of genotypes CD - 202 and TP, were identified. In agreement with the
viii
results, soybean seeds with semi-permeable coat presented better physiological
quality in relation to the seeds with permeable coat.
Key words: Glycine max, black coat, genes, cDNA – AFLP.
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Tegumento de soja do genótipo TP, coletado 25 dias após a
antese em corte transversal com ultramicrótomo, corado com
azul de metileno e bórax 1%, e visualizado em microscópio
ótico com aumento de 40x. Pelotas, UFPel – 2007....................
31
Figura 2 Tegumento de soja do genótipo CD-202, coletado 25 dias
após a antese em corte transversal com ultramicrótomo,
corado com azul de metileno e bórax 1%, e visualizado em
microscópio, com aumento de 40x. Pelotas, UFPel – 2007.......
32
Figura 3 Tegumento de soja do genótipo TP, coletado 40 dias após a
antese em corte transversal com ultramicrótomo, corado com
azul de metileno e bórax 1%, e visualizado em microscópio
ótico com aumento de 40x. Pelotas, UFPel – 2007....................
32
Figura
4 Tegumento de soja do genótio CD – 202, coletado 40 dias
após a antese em corte transversal com ultramicrótomo,
corado com azul de metileno e bórax 1%, e visualizado em
microscópio ótico, com aumento de 40x. Pelotas, UFPel –2007
33
Figura
5 Tegumento de soja do genótipo TP, coletado 55 dias após a
antese em corte transversal com ultramicrótomo, corado com
azul de metileno e bórax 1%, e visualizado em microscópio
ótico, com aumento de 40x Pelotas, UFPel – 2007....................
33
Figura 6 Tegumento de soja do genótipo CD – 202, coletado 55 dias
após a antese em corte transversal com ultramicrótomo,
corado com azul de metileno e bórax 1%, e visualizado em
microscópio ótico com aumento de 40x. Pelotas, UFPel –2007.
34
x
Figura 7
Coloração do tegumento de sementes de soja do genótipo TP
em diferentes fases de desenvolvimento. Pelotas – UFPel,
2007............................................................................................
34
Figura 8
– Coloração do tegumento de sementes de soja do genótipo CD -
202 em diferentes fases de desenvolvimento. Pelotas –
UFPel, 2007..............................................................................
35
Figura 9
RNA total em gel de agarose 1,5%, extraído de tegumentos de
soja dos genótipos CD-202 e TP utilizando diferentes
protocolos de extração. Fig.8a – Protocolo utilizando o
reagente Trizol. Fig.8b – Protocolo estabelecido por Chang et
al. (1993). Fig.8c – Protocolo utilizando o reagente Plant RNA.
Pelotas, UFPel – 2007................................................................
36
Figura 10 Separação de fragmentos de cDNA-AFLP dos genótipos CD-
202 e TP em gel de poliacrilamida 5%, corado com Nitrato de
Prata. Os fragmentos foram obtidos através da técnica de
cDNA-AFLP utilizando as combinações de primers: 1-M-
CTC/E-AAG; 2-M-CTT/E-ACA. As setas indicam fragmentos
identificados e coletados. Pelotas, UFPel - 2007........................
38
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Combinações de primers utilizados nas r
eações de
amplificação seletiva na técnica de cDNA-AFLP........................
23
Tabela 2 Programação do termociclador utilizada na reação de
amplificação seletiva na técnica de cDNA-AFLP......................
24
Tabela 3 Qualidade Fisiológica de sementes de soja dos genótipos CD
– 202 e TP (Tegumento Preto), produzidas em casa de
vegetação, no ano agrícola 2005/06, município de Pelotas- RS
28
xii
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................... vi
SUMMARY.................................................................................................. iiix
1 INTRODUÇÃO................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................. 4
2.1 A Cultura da Soja .............................................................................
4
2.2 Tegumento da semente de soja - anatomia e funções......................
5
2.3 Características do tegumento e a qualidade de sementes............... 6
2.4 Marcadores moleculares................................................................... 7
2.4.1 Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição
(RFLP)
9
2.4.2 Amplificação Aleatória do Polimorfismo de DNA (RAPD)................. 10
2.4.3 Polimorfismo de
locus de seqüências simp
les repetidas ou
Microssatélite (SSR)..........................................................................
11
2.4.4 Polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP)..
12
2.4.5 cDNA-AFLP....................................................................................... 13
3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................. 15
3.1 Locais de execução do trabalho........................................................
15
3.2 Obtenção do material vegetal............................................................
15
3.3 Coleta das sementes 16
3.4 Avaliação da qualidade fisiológica das sementes............................. 16
3.4.1 Teste de Germinação........................................................................
16
3.4.2 Teste de Condutividade elétrica........................................................ 17
3.4.3 Teste de Envelhecimento acelerado.................................................
17
3.4.4 Análise estatística...............................................................................
17
3.5 Caracterização estrutural dos tegumentos........................................
17
xiii
1
3.6 Obtenção dos fragment
os de cDNA diferencialmente expressos e
avaliação do polimorfismo genético pela técnica de cDNA-AFLP...
18
3.6.1 Extração do RNA total..................................................................... 18
3.6.1.1 Protocolo utilizando Trizol...............................................................
19
3.6.1.2 Protocolo de Chang et al. (1993) modificado.................................. 19
3.6.1.3 Protocolo utilizando Plant RNA Reagent.........................................
20
3.6.2 Obtenção do cDNA dupla fita........................................................... 20
3.6.2.1 Síntese da primeira fita do cDNA.................................................... 20
3.6.2.2 Síntese da segunda fita do cDNA................................................... 21
3.6.3 cDNA-AFLP..................................................................................... 22
3.6.3.1 Reação de digestão do cDNA......................................................... 22
3.6.3.2 Ligação de adaptadores.................................................................. 22
3.6.3.3 Pré-amplificação..............................................................................
23
3.6.3.4 Amplificação seletiva....................................................................... 23
3.6
.4 Detecção dos fragmentos de cDNA diferencialmente
expressos.........................................................................................
24
3.6.4.1 Preparo e montagem das placas.....................................................
25
3.6.4.2 Preparo da solução do gel de poliacrilamida (5%).......................... 25
3.6.4.3 Revelação do gel com Nitrato de Prata (BLEIDER, 1982 –
modificado)..................................................................................................
26
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................
27
4.1 Qualidade Fisiológica das Sementes.............................................. 27
4.2 Caracterização estrutural dos tegumentos......................................
28
4.3 Obtenção dos fragmentos de cDNA diferencialmente expressos
pela técnica de cDNA-AFLP..........................................................
35
4.3.1 Avaliação de protocolos de extração do RNA total......................... 35
4.3.2 Seleção dos fragmentos de cDNA diferencialmente expressos......
37
5 CONCLUSÕES……………………………………………………….....
40
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………….. 41
xiv
1
1. INTRODUÇÃO
A cultura da soja representa mais de 45% do total de grãos produzido no
Brasil, com uma produção que ultrapassa 55 milhões de toneladas, demonstrando a
importância econômica deste produto para o país (CONAB, 2006).
A evolução inicial da soja no Brasil foi fortemente amparada pelo
desenvolvimento de tecnologias que possibilitaram o aumento da área de cultivo. No
entanto, com a estabilização da área de cultivo, verificou-se um aumento
significativo na produtividade devido à utilização de novas tecnologias e ao
desenvolvimento de cultivares adaptadas às diversas regiões produtoras.
A utilização de sementes de alta qualidade é fator primordial para o sucesso
da produção, pois é por meio desta que as tecnologias introduzidas pelo
melhoramento genético são levadas até o agricultor. Por esse motivo, torna-se
necessário o estabelecimento de programas de melhoramento, onde o fator
qualidade de sementes também seja prioridade.
Estudos têm mostrado que apesar da alta tecnologia disponível, a qualidade
das sementes de soja proveniente de algumas regiões, tem sido severamente
comprometida em função dos elevados índices de deterioração por umidade e de
ruptura do tegumento (MESQUITA et al., 1999; COSTA et al., 2001).
Em trabalho realizado por Carraro & Peske (2005), constatou-se que 95% dos
lotes de sementes produzidos no estado do Paraná possuíam entre 2 e 20% de suas
sementes com tegumento danificado e que pelo menos metade das sementes
apresentavam-se com mais de 10% desse dano. Além disso, verificou-se que acima
de 15% dos lotes apresentavam danos por umidade, significando que as sementes
permaneceram por muito tempo no campo, expostas a chuva, orvalho e outras
adversidades, o que contribuiu para redução na qualidade fisiológica das mesmas.
2
A exposição das sementes de soja a ciclos alternados de elevada e baixa
umidades antes da colheita, devido à ocorrência de chuvas freqüentes, orvalho ou
às flutuações diárias da umidade relativa do ar, resulta na deterioração por umidade
a qual, pode ser apontada como a principal causa para a sua baixa qualidade.
Aliado à adversidade climática, a ocorrência de fungos de sementes, em
especial Phomopsis spp., é outro fator que contribui para acentuar a redução da
qualidade das mesmas (HENNING, 2005).
O tegumento é um dos principais condicionantes da capacidade de
germinação, do vigor e da longevidade das sementes de soja. Grande parte das
características do tegumento está associada a problemas específicos. Por exemplo,
a susceptibilidade a danos mecânicos está associada ao seu teor de lignina,
enquanto que longevidade e potencial de deterioração no campo têm sido
relacionados ao grau de permeabilidade do tegumento (SOUZA & MARCUS FILHO,
2001).
Alguns trabalhos têm evidenciado a existência de genótipos contrastantes
para qualidade fisiológica da semente (VIEIRA et al., 1987). Tais diferenças podem
existir em virtude da presença de sementes duras, as quais apresentam total ou
parcial impermeabilidade à penetração de água no tegumento e, conseqüentemente,
tornam-se menos susceptíveis aos danos mecânicos, as adversidades climáticas, a
deterioração por umidade e a ocorrência de patógenos.
A impermeabilidade total ou parcial de sementes de soja à penetração de
água é uma característica que pode ser usada, para produzir genótipos de soja com
maior tolerância às adversidades climáticas, presentes após a maturidade fisiológica
das sementes.
Nesse contexto, a biologia molecular é uma alternativa para identificação de
genes envolvidos nas respostas fisiológicas das sementes. O conhecimento sobre o
controle genético de características de importância econômica possibilita a
complementação dos métodos tradicionais de melhoramento, visando ganhos
genéticos adicionais. O desenvolvimento de pesquisas com enfoque genético
molecular, utilizando genótipos de soja com contraste fenotípico para características
do tegumento, possibilita ainda, a identificação de genes relacionados, sua
clonagem e caracterização.
A partir dos genes identificados é possível maior rapidez e eficiência no
desenvolvimento de variedades mais produtivas e de qualidade superior.
3
As respostas biológicas são controladas pela regulação precisa da expressão
gênica, ou seja, é através dela que as diferentes características são expressas em
um organismo, sendo necessário o estudo de seus padrões para o entendimento
dos diferentes processos. A grande maioria das células de um organismo contém os
mesmos genes, entretanto, dependendo do tecido, do estádio de desenvolvimento
ou ainda, das condições de ambiente que esse organismo se encontra, esses genes
poderão estar sendo expressos ou não.
A técnica de cDNA-AFLP (Polimorfismo do comprimento de fragmentos de
cDNA amplificados) é extremamente eficiente para o isolamento de genes
diferencialmente expressos, o qual fornece resultados reproduzíveis que foram
confirmados em vários estudos (HABU et al., 1997; MAO et al., 2004). Uma
população de cDNAs de um determinado tecido representa o conjunto de RNAm
presentes neste mesmo local e estádio de desenvolvimento, ou seja, constituem o
grupo de genes responsáveis pela expressão das características deste tecido.
Considerando a demanda por pesquisas com enfoque genético-molecular de
características relacionadas à fisiologia de sementes, realizou-se esse estudo com
os seguintes objetivos:
1 - Identificar através de estudos com microscopia eletrônica, diferenças estruturais
entre os tegumentos dos genótipos CD-202 (amarelo, permeável e susceptível a
deterioração) e TP (preto, semi-permeável e resistente a deterioração).
2 - Obter fragmentos de cDNA diferencialmente expressos, entre os tegumentos
desses dos genótipos.
3 – Avaliar a qualidade fisiológica de sementes de soja produzidas por esses
genótipos.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 – A Cultura da Soja
A soja é originária da Ásia, mais precisamente da China. A primeira referência
sobre a soja no Brasil data de 1882, relatando seu cultivo no estado da Bahia. No
Brasil, a soja encontrou condições edafo-climáticas favoráveis na região Sul,
expandindo-se posteriormente para outras regiões, principalmente para o Centro-
Oeste (ROESSING et al., 2000).
A soja pertence à classe Dicotyledoneae, família Fabaceae, subfamília
Papilionaceae , gênero Glycine, subgênero Soja e espécie Glycine max (L.) Merrill.
Essa espécie possui número de cromossomos diplóide 40. O germoplasma da soja
contém grande número de tipos de plantas, bem como, ampla forma de resistência a
pragas e caracteres morfológicos e fisiológicos distintos (GAZZONI, 1994).
A cultura da soja assume valor sócio-econômico, devido à importância de
seus produtos, principalmente farelo, óleo vegetal e seus derivados, tanto para o
mercado interno como externo. No Brasil, até meados dos anos 60 a soja não tinha
grande importância econômica, o maior aumento de produção ocorreu na década de
70 a 1980, passando de 1,5 para 15,2 milhões de toneladas (aumento de 25,9% ao
ano). Nos anos 80, os Cerrados brasileiros começaram a ter importância econômica
como região produtora (ROESSING et al., 2000).
A evolução inicial da soja no Brasil foi fortemente amparada pelo
desenvolvimento de tecnologias que possibilitaram o aumento da área de cultivo. No
entanto, com a estabilização da área de cultivo, verificou-se um aumento
significativo na produtividade, devido à utilização de novas tecnologias e ao
5
desenvolvimento de cultivares adaptadas às diversas regiões produtoras
(ROESSING et al., 2000).
A semente possui papel fundamental como agente transferidor de tecnologia,
uma vez que ao levar para a propriedade sementes de uma variedade, o produtor
está levando toda a moderna tecnologia existente nos programas de melhoramento
genético. Para que todos os esforços realizados na obtenção de uma variedade
sejam traduzidos em benefícios para a produção agrícola é fundamental a utilização
de sementes de alta qualidade (SHUSTER, 2003).
A qualidade das sementes pode ser afetada por diversos fatores durante todo
o processo de produção, iniciando pelos fatores genéticos; diferentes variedades de
uma mesma espécie podem apresentar maior ou menor vigor e longevidade. As
adversidades ocorridas no desenvolvimento das sementes e após a maturidade
fisiológica, expõem as sementes ao ataque de pragas e microorganismos, além
disso, os processos de colheita, beneficiamento e armazenamento, também têm se
revelado como os principais fatores na redução da qualidade das sementes. Todos
estes problemas que comprometem a qualidade fisiológica das sementes podem ser
relacionados, de uma forma ou de outra, às características do tegumento das
sementes (SOUZA & MARCOS-FILHO, 2001).
2.2 – Tegumento da semente de soja - anatomia e funções
O tegumento da semente de soja é a camada externa da semente, originado
a partir dos integumentos do óvulo (NEDEL, 2003).
Na soja, as cores do tegumento podem ser amarela, marrom (tonalidade clara
ou escura), preta e preta imperfeita. Estudos utilizando microscopia eletrônica
demonstraram que a estrutura básica do tegumento compreende quatro camadas:
cutícula, epiderme, hipoderme e parênquima (SWANSON et al., 1985).
A cutícula é a fina camada externa do tegumento, a qual apresenta estrutura
variável e representa a primeira barreira à embebição (RAGUS, 1987).
A epiderme é formada por células paliçádicas, as quais formam uma camada
contínua envolvendo a semente com exceção do hilo, onde aparece uma segunda
camada paliçádica proveniente do funículo. A camada paliçádica é constituída de
células esclerenquimatosas, chamadas macroesclerídeos. Essas células são
6
alongadas perpendicularmente à superfície do tegumento, possuindo paredes
celulares espessas e perfuradas na porção superior (PESKE & PEREIRA, 1983).
Abaixo da epiderme encontra-se a hipoderme, camada unicelular formada por
osteoesclerídeos, células esclerenquimatosas com parede celular de espessura
desuniforme, constituindo uma camada de suporte com considerável espaço
intercelular. Essas células não são observadas no hilo, entretanto, os
osteoesclerídeos adjacentes ao hilo são maiores que nas áreas mais distanciadas
causando uma variação na espessura da camada de 30 a 70 mícrons (PESKE &
PEREIRA, 1983).
Além dessas estruturas, estudos comprovaram a existência de depósitos em
forma de material granular localizados na superfície do tegumento. Foram
encontradas evidências, que levam a concluir que esses depósitos são compostos
por material hidrofílico. Removendo-se esses compostos, foi possível ainda,
observar a presença de poros na superfície do tegumento, os quais se
apresentavam nas formas circular e alongada (MA et al.; 2004).
As principais funções do tegumento são: proteção do embrião contra
danificações mecânicas e ataque de microorganismos, regulação da troca de gases
entre o embrião e o ambiente externo e, em muitas espécies, participação no
processo de dispersão das sementes. Outra importante função do tegumento é a
regulação do intercâmbio de água. Em muitas famílias de plantas, o tegumento da
semente atua como regulador da absorção de água (CARVALHO & NACAGAWA,
1988).
2.3 – Características do tegumento e a qualidade de sementes
Entre os genótipos de soja existe variabilidade genética quanto à qualidade
fisiológica de sementes, a qual pode ser utilizada em programas de melhoramento
genético. Um exemplo é a diferença quanto à resistência ao dano mecânico e a
existência de métodos capazes de provocar e avaliar tais danos. Maior tolerância
aos danos mecânicos tem sido relacionada ao maior teor de lignina no tegumento da
semente de soja, enquanto a resistência à deterioração no campo tem sido
relacionada ao grau de permeabilidade do tegumento (ALVAREZ et al., 1997).
Segundo França Neto & Potts (1979), a inclusão das características de
tegumento presentes nas sementes semi-permeáveis, em cultivares modernas e de
7
boas características agronômicas, pode reduzir os índices de deterioração no
campo, além de outras vantagens como aumento no potencial de armazenamento
da semente, menores infestações de microorganismos e, possivelmente, menores
níveis de danos causados pela trilha mecânica.
A semi-permeabilidade do tegumento reduz o efeito das flutuações de
umidade sobre as sementes, tornando-as menos suscetíveis à deterioração a
campo. Além disso, propicia maior potencial de armazenamento, maior resistência
aos danos mecânicos durante a colheita, menor índice de ocorrência de danos
causados por percevejos, e maior tolerância à deterioração a campo, mesmo em
condições extremas de estresse (FRANÇA NETO et al., 2000).
Em estudos recentes com soja, Ma et al. (2004), relataram que a cutícula da
camada paliçádica é fator determinante na permeabilidade do tegumento, sendo que
a cutícula do tegumento permeável é mecanicamente frágil, desenvolvendo
rachaduras durante a embebição, enquanto que no tegumento semi-permeável a
cutícula é mecanicamente forte, não sofrendo rachaduras em condições normais.
Segundo Souza & Marcos-Filho (2001), nas Fabaceas o grau de
permeabilidade do tegumento da semente parece estar associado ao
comportamento de determinadas estruturas presentes na superfície do tegumento
(hilo, micrópila, cor, cerosidade e porosidade), que influenciam o vigor, potencial de
armazenamento, danos por embebição e resistência a patógenos.
A característica tegumento semi-permeável pode ser utilizada nos programas
de melhoramento de soja para ser incorporada às cultivares de alta produtividade,
visando à qualidade fisiológica da semente. No entanto, há necessidade de
caracterizar os genes ou as regiões genômicas envolvidas com o caráter.
2.4 – Marcadores moleculares
Os marcadores moleculares são biomoléculas que podem ser relacionadas
com uma característica genética fenotípica. As biomoléculas consideradas
marcadores moleculares podem ser proteínas (antígenos ou isoenzimas) ou DNA
(MALONE & ZIMMER, 2005).
Até meados da década de 1960, os marcadores utilizados em estudos de
genética e melhoramento eram controlados por genes associados a caracteres
morfológicos, em geral, fenotípicos e de fácil identificação visual, como nanismo, cor
8
de pétala ou morfologia foliar. Marcadores morfológicos contribuíram
significativamente para o desenvolvimento teórico da análise de ligação gênica e
para construção das primeiras versões de mapas genéticos. Entretanto, o pequeno
número de marcadores morfológicos distintos em uma mesma linhagem reduzia a
probabilidade de se encontrar associações significativas entre estes marcadores e
caracteres de importância econômica (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
São muitas as aplicações dos marcadores moleculares em plantas, sendo
principalmente utilizados em análises de diversidade genética, na caracterização de
germoplasma, no mapeamento de genes e QTLs (Locos de características
quantitativas) de interesse e na implantação da SAMM (Seleção Assistida por
Marcadores Moleculares).
Pelo fato dos marcadores moleculares discriminarem a contribuição genética
de cada genitor na sua descendência, podem ser utilizados para o controle da
pureza genética de híbridos ou de linhagens, tornando-se uma importante
ferramenta na certificação ou fiscalização de sementes. Outra grande aplicação dos
marcadores moleculares é na caracterização de variedades, linhagens ou híbridos
(fingerprintings), o que tem sido de grande importância na proteção do direito
intelectual do melhorista, sendo utilizada como prova legal em processos jurídicos
nos países em que vigoram as leis de proteção de cultivares (GUIMARÃES &
MOREIRA, 1999).
A área de maior impacto dos marcadores moleculares no melhoramento
vegetal é através do emprego da SAMM para identificação de genótipos superiores
em populações segregantes. O uso de marcadores moleculares na seleção de
genótipos superiores poderá incrementar a eficiência do melhoramento de plantas,
pois menor número de progênies por combinação será necessário, bem como,
menor número de gerações para a estabilização dos genótipos (FEDERIZZI, 1998).
Com o advento das técnicas de biologia molecular, surgiram metodologias
alternativas para detectar polimorfismo genético diretamente ao nível de DNA. As
enzimas de restrição foram empregadas para detectar polimorfismo de fragmentos
de restrição pela primeira vez em 1974. Mais tarde, essa estratégia seria combinada
com técnicas de hibridizações para criar a técnica de RFLP (Polimorfismo no
comprimento de fragmentos de restrição). Um salto extraordinário foi dado em 1987
com o desenvolvimento da metodologia in vitro para sintetizar moléculas de DNA a
partir de um molde. Esta metodologia é conhecida como Reação em Cadeia da
9
Polimerase, que vem do inglês Polymerase Chain Reaction – PCR. A partir desse
evento surgiu uma série de novas técnicas de marcadores moleculares, todas
utilizando PCR. Atualmente, as técnicas mais empregadas nos programas de
melhoramento e que utilizam a PCR são: a técnica de microssatélite ou SSR
(Seqüências simples repetidas); a técnica de RAPD (Polimorfismo de DNA
amplificado ao acaso) e a técnica AFLP (Polimorfismo de comprimento de
fragmentos amplificados) (MALONE & ZIMMER, 2005).
2.4.1 - Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP)
A técnica baseia-se na digestão do DNA genômico com a utilização de
diferentes enzimas de restrição (duas ou mais). A restrição produz quantidades
equimolares de fragmentos para uma determinada molécula de DNA. Os fragmentos
resultantes da digestão com enzimas de restrição são separados por eletroforese
em géis de agarose corado com brometo de etídeo e transferidos por capilaridade
para uma membrana de nylon ou nitrocelulose através da metodologia Southern
blot. Posteriormente esta membrana é hibridizada com sondas de DNA marcadas
radioativamente (sondas quentes) ou marcadas fluorescentemente (sondas frias). As
sondas RFLP podem variar de 500 a 1000 pb. O produto da hibridização é
visualizado mediante auto-radiografia, neste caso a radiação emitida pela marcação
da sonda sensibiliza o filme fotográfico apenas no local onde a sonda hibridizou com
o DNA (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
O polimorfismo gerado por RFLP deve-se a rearranjos no DNA ocasionados
principalmente por perdas, inserções ou substituições de seqüências ou
nucleotídeos individuais que ocasionam perdas ou surgimentos de sítios de
reconhecimento das enzimas de restrição. O polimorfismo é detectado através das
diferenças no peso molecular dos fragmentos homólogos de restrição do DNA
genômico, quando hibridizado com uma sonda especificamente selecionada. A
expressão destes marcadores é de natureza codominante, devido a esta
característica, todas as formas alélicas de um gene são distinguíveis no padrão de
bandas, permitindo detectar os locos heterozigotos ou estudar o fluxo gênico entre
diferentes populações (MALONE & ZIMMER, 2005).
10
Entre as principais vantagens dos marcadores RFLP, pode-se destacar: a
existência de um elevado número deles distribuídos pelo genoma; a inexistência de
efeito do ambiente; a ausência de efeitos pleiotrópicos; e, podem ser avaliados em
qualquer estádio do desenvolvimento da planta. A aplicação desta técnica é de
grande utilidade em estudos filogenéticos, diversidade genética e identificação de
constituições genéticas com propósitos de proteção de cultivares.
Entre as principais desvantagens da técnica RFLP pode-se destacar: a
necessidade de clonagem de sondas, a detecção de polimorfismo em filmes
fotográficos e, em muitos casos, o uso da radioatividade. São tarefas laboriosas,
demoradas e com custo elevado, embora nos últimos tempos, o desenvolvimento da
técnica não-radioativa (utilização de sondas frias marcadas fluorescentemente)
tenha simplificado notavelmente o procedimento.
2.4.2 - Amplificação Aleatória do Polimorfismo de DNA (RAPD)
Essa técnica foi desenvolvida concomitantemente por dois grupos nos
Estados Unidos (Welsh & McClelland, 1990; Williams, 1990). A técnica de RAPD
utiliza primers aleatórios de 10 nucleotídeos que são utilizados para amplificar
regiões genômicas ao acaso (aleatoriamente). O produto da amplificação é
separado em géis de agarose. As bandas geradas, de diferentes pesos moleculares,
representam diferentes loci dentro do genoma. A técnica permite a utilização de dois
ou mais primers dentro da mesma reação, permitindo assim, aumentar o número de
bandas e obter maior quantidade de informação em cada reação (WILLIANS et al.,
1990).
A técnica RAPD pode detectar regiões de DNA altamente variáveis (5-10 loci
por primer) e, embora venha sendo substituída por técnicas mais estáveis, ainda é
muito utilizada. Foi a primeira técnica de marcadores moleculares, baseada em
PCR, empregada para estudos de mapeamento gênico, identificação de raças,
estudos de hibridização inter e intra-específica e em estudos de variação gênica
entre populações aparentadas (MALONE & ZIMMER, 2005).
Os marcadores RAPD se comportam como marcadores genéticos
dominantes, ou seja, ao se observar uma banda RAPD no gel não é possível
distinguir se aquele segmento se originou a partir de uma ou de duas cópias da
seqüência amplificada, se é homozigoto dominante ou heterozigoto.
11
A rapidez na obtenção dos resultados, o baixo custo, a não utilização de
radioatividade (a visualização do DNA é feita utilizando coloração com brometo de
etídio), baixo investimento em equipamentos e, uma quantidade mínima de DNA é
requerida para a análise são as principais vantagens do RAPD.
2.4.3 - Polimorfismo de locus de seqüências simples repetidas ou
Microssatélite (SSR)
Os microssatélites constituem-se de seqüências de um a cinco nucleotídeos
repetidos em tandem e se apresentam de forma abundante, principalmente nas
plantas. Mediante a análise do polimorfismo dos microssatélites é possível avaliar a
dissimilaridade genética entre diferentes genótipos, amplificando, via PCR, a região
genômica que corresponde às seqüências repetitivas. A amplificação é feita
utilizando primers específicos de 20 – 30 bases, complementares as seqüências que
flanqueiam uma determinada seqüência repetitiva. Os segmentos amplificados a
partir destes sítios de anelamento dos primers apresentam um elevado polimorfismo,
produto da presença de diferenças no número de elementos repetidos. Desta forma,
cada seqüência repetitiva, independentemente do elemento repetitivo (CA, GC, TG,
ATC, etc...), constitui-se num loci gênico altamente variável, multialélico e de grande
conteúdo informativo em relação a uma espécie. Cada segmento amplificado de
tamanho diferente representa um alelo diferente do mesmo locus dentro da
população.
O uso da técnica de microssatélite tem aumentado nos últimos anos,
principalmente devido à construção de bibliotecas de primers e aos avanços obtidos
no sequenciamento automático, o que permitiu identificar as seqüências que
flanqueiam os sítios repetitivos, para o desenho de primers complementares
(MALONE & ZIMMER, 2005).
Os fragmentos gerados da amplificação podem ser visualizados tanto em géis
de agarose, corados com brometo de etídio, quanto em géis de poliacrilamida,
visualizados radioativamente ou mediante coloração com nitrato de prata. Os
microssatélites são atrativos para os geneticistas, pois combinam várias vantagens:
i) são codominantes (é possível separar homozigotos e heterozigotos); ii)
multialélicos e altamente heterozigotos; iii) o elevado nível de polimorfismo
detectável permite uma separação precisa de indivíduos aparentados; e, iv) além de
12
serem polimórficos, os microssatélites requerem quantidades mínimas de DNA
(FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
As principais desvantagem da técnica de microssatélites são o tempo e o
custo envolvidos no desenho de cada primer, embora com o advento do
sequenciamento de genomas e novas ferramentas de bioinformática, seja possível
desenhar grande número de primers e testa-los em PCR in silico.
2.4.4 - Polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP)
A técnica de AFLP consiste essencialmente em quatro etapas. Na primeira o
DNA é clivado com enzimas de restrição. Na segunda, adaptadores específicos são
ligados aos terminais dos fragmentos de DNA gerados pela clivagem. Na etapa, uma
fração dos fragmentos gerados é amplificada seletivamente via PCR utilizando
primers especificamente desenhados para reconhecer a seqüência dos
adaptadores. Na quarta e última, a subpopulação de fragmentos amplificados é
separada em gel de alta resolução como, por exemplo, géis de poliacrilamida
revelados com auto-radiografia ou coloridas com nitrato de prata (ZABEAU, 1993).
A análise de AFLP combina a especificidade, resolução e poder de
amostragem da digestão com enzimas de restrição, preconizados na técnica de
RFLP, com a aleatoriedade, a velocidade e praticidade da detecção do polimorfismo
via PCR, preconizados pela técnica de RAPD. O polimorfismo genético ao nível de
DNA detectado pela técnica de AFLP é resultado de mutações pontuais, inversões,
deleções e inserções no DNA, as quais geraram modificações (perdas ou ganhos)
nos sítios reconhecidos pelas enzimas de restrição, alterações na seqüência
reconhecida pelas bases seletivas no extremo 3’ dos primers utilizados para a
amplificação, ou alteraram o tamanho do fragmento gerado. Todas estas
modificações ao nível de DNA foram acumuladas ao longo do tempo de evolução de
cada espécie (MALONE & ZIMMER, 2005).
Como no caso da técnica RAPD, descrita anteriormente, a técnica AFLP é de
herança dominante, ou seja, não é possível distinguir se uma banda presente no gel
é originária de um indivíduo homozigoto ou heterozigoto para o locus. As bandas
provenientes de indivíduos heterozigotos apresentam a metade da intensidade que
as bandas provenientes de indivíduos homozigotos, mas sem uma excelente
13
padronização das concentrações iniciais de DNA, não é recomendado fazer este tipo
de inferência.
A vantagem que mais destaca esta tecnologia das demais é indiscutivelmente
o grande número de fragmentos que são gerados em um único gel. O índice
multiplex do ensaio AFLP, ou seja, o número de marcadores simultaneamente
gerados é o mais alto entre todas as tecnologias de marcadores hoje disponíveis,
além de não haver necessidade de conhecimento prévio sobre a seqüência de DNA
(FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998). Entretanto, o número de marcadores obtidos
em determinado população é diretamente proporcional à diversidade ou
dissimilaridade da população (MALONE & ZIMMER, 2005).
2.4.5 - cDNA-AFLP
As respostas biológicas são controladas pela regulação precisa da expressão
gênica, sendo necessário o estudo de seus padrões para o entendimento dos
diferentes processos. Uma variedade de técnicas moleculares está disponível para a
identificação e clonagem de genes diferencialmente expressos, incluindo differential
display (DD ou RT-PCR, coletivamente referidas como RNA-fingerprinting). Esses
métodos apresentam, entretanto, limitações tais como reprodutibilidade, dificuldade
em expressar mensagens muito raras e geração de falsos positivos. Esses
problemas surgem primeiramente devido ao uso de primers com oligonucleotídeos
arbitrários e pela necessidade de temperaturas de anelamento relativamente baixas
para obter os produtos de amplificação (BACHEM et al., 1998).
O método do cDNA-AFLP (BACHEM et al., 1996) supera amplamente essas
limitações e possibilita uma simples e rápida verificação da identidade da banda.
Além disso, é possível a avaliação sistemática de quase todos os transcritos em um
dado sistema biológico utilizando pequenas quantidades de material inicial.
A síntese do cDNA é realizada com a enzima transcriptase reversa, uma
enzima de origem viral que tem a capacidade de produzir uma molécula de DNA
dupla fita a partir da cópia de uma molécula de RNA mensageiro. Ou seja, como o
nome diz, a transcriptase reversa faz o caminho contrário daquele percorrido pela
RNA polimerase, que a partir de uma molécula dupla fita de DNA produz RNA. A
técnica de cDNA-AFLP consiste nas mesmas etapas da técnica de DNA-AFLP, a
14
única mudança é a substituição do DNA genômico pelo cDNA (BACHEM et.al,
1998).
Atualmente, há grande interesse na incorporação de genes específicos no
tegumento de soja, associados com o controle da embebição, com o aumento do
potencial de armazenamento, redução da deterioração a campo e ainda redução na
suscetibilidade a danos mecânicos (FRANÇA NETO & POTTS, 1979).
A identificação de genes relacionados a contrastes fenotípicos tem se
mostrado extremamente eficiente através do isolamento de fragmentos de cDNA
diferencialmente expressos fornecendo resultados confiáveis e reproduzíveis. Além
disso, a principal vantagem dessa técnica é o fato de que ela não necessita de
prévio conhecimento da seqüência e, dessa forma, é útil para a descoberta de genes
ainda desconhecidos (BACHEM et al., 1996).
15
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 – Locais de execução do trabalho
- Cultivo das sementes: casa-de-vegetação situada na Estação Terras Baixas da
Embrapa Clima Temperado (CPACT) - Pelotas/RS.
- Caracterização estrutural dos tegumentos: Laboratório de Imunologia e
Microscopia Eletrônica da Embrapa Clima Temperado.
- cDNA – AFLP: Laboratório de BioSementes do Departamento de Fitotecnia –
FAEM/UFPel.
- Análises da qualidade fisiológica das sementes: Laboratório de Sementes do
Departamento de Fitotecnia - FAEM/UFPel.
3.2 – Obtenção do material vegetal
Nesse estudo foram utilizados dois genótipos de soja contrastantes para as
características de tegumento: 1 - CD 202 (tegumento amarelo, permeável e
suscetível à deterioração); 2 - TP (tegumento preto, semi-permeável e duro).
O experimento foi instalado em casa-de-vegetação, no dia 17 de novembro
de 2005. As plantas foram cultivadas em condições homogêneas no interior de
baldes de plástico preenchidos com solo. Foram semeadas cinco sementes por
balde e após a emergência realizou-se o raleio deixando-se apenas duas plântulas
por recipiente.
Para cada genótipo utilizaram-se quatro repetições de oito plantas resultando
em um total de dezesseis baldes por genótipo.
A partir da antese iniciou-se a marcação de flores para que todas as
sementes amostradas estivessem no mesmo estádio de desenvolvimento.
16
3.3 – Coleta das sementes
A coleta das sementes foi realizada em épocas diferentes para cada uma das
avaliações:
Caracterização estrutural dos tegumentos: as sementes foram coletadas aos 25,
40 e 55 dias após a antese, cobrindo assim, todo período de formação do
tegumento.
Análise de cDNA-AFLP: realizaram-se sete amostragens em intervalos de 5 dias
(25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 dias após a antese). Depois da coleta das sementes, o
material vegetal foi encaminhado ao Laboratório de BioSementes do Departamento
de Fitotecnia, FAEM/UFPel. Os tegumentos foram separados das sementes com
auxilio de lâminas esterilizadas, tomando-se o cuidado de manter o tecido vegetal
puro, ou seja, sem nenhum resquício de cotilédone ou qualquer outro tecido vegetal
que não fosse tegumento. O material permaneceu estocado em ultra freezer a uma
temperatura de -80
o
C até o momento da extração do RNA.
Qualidade fisiológica das sementes: foram coletadas sementes aos 70 dias após
antese.
3.4 – Caracterização da qualidade fisiológica das sementes
A qualidade fisiológica das sementes de soja dos genótipos CD-202 e TP foi
determinada através de testes de germinação e vigor (condutividade elétrica e
envelhecimento acelerado).
3.4.1 - Teste de germinação
Foram utilizadas 400 sementes semeadas em rolos de papel toalha Germitest
(com 25 sementes por rolo), umedecidos com uma quantidade de água de 2,5 vezes
o peso do papel e colocados em temperatura constante (25°C). A avaliação foi
realizada após o sétimo dia da semeadura de acordo com os critérios das Regras
para Análise de Sementes (BRASIL, 1992).
17
3.4.2 – Teste de condutividade elétrica
Utilizaram-se quatro sub-amostras de 25 sementes (sem presença de
sementes deformadas), as quais foram pesadas e em seguida, imersas em 75mL de
água deionizada. As amostras foram mantidas em repouso a temperatura de 25ºC.
Após período de embebição de 24 horas, foram realizadas leituras da condutividade
elétrica em condutivímetro digital expressando os resultados em (µS.cm
-1
.g
-1
)
(KRZYZANOWSKI et al., 1999).
3.4.3 – Teste de envelhecimento acelerado
‘
Utilizou-se o método descrito por Krzyzanowski et al. (1999), conduzido com
três repetições de 200 sementes (12 subamostras de 50), dispostas sobre uma
bandeja de tela de arame galvanizado, fixado no interior de caixas plásticas (gerbox)
as quais continham 40mL de água destilada. As amostras foram incubadas a
temperatura constante de 41ºC por 48 horas. Transcorrido esse período, as
sementes foram colocadas para germinar seguindo os mesmos procedimentos
utilizados no teste de germinação, realizando-se uma única contagem ao sétimo dia
após a semeadura.
3.4.4 – Análise estatística
Utilizou-se delineamento inteiramente casualizado. Os dados foram
submetidos a análise de variância utilizando o programa WINSTAT. As médias foram
comparadas pelo teste Duncan 5% de significância.
3.5 – Caracterização estrutural dos tegumentos
As diferenças estruturais entre os tegumentos dos genótipos CD-202 e
TP foram avaliadas através de microscopia ótica, realizada no Laboratório de
Imunologia e Microscopia Eletrônica da CPACT. Os fragmentos de tegumentos
foram retirados das sementes e afixados em resina, em seguida, realizaram-se
18
cortes transversais na região oposta ao hilo, utilizando ultramicrótomo “Leica”, com
1µm de espessura. O tecido vegetal foi corado com azul de metileno 1% e bórax 1%,
e visualizado em microscópio ótico BX 51, em aumento de 40x.
3.6 – Obtenção dos fragmentos de cDNA diferencialmente expressos e
avaliação do polimorfismo genético pela técnica de cDNA-AFLP
Partindo-se do pressuposto de que as diferenças estruturais existentes entre
os tegumentos do genótipo CD-202 (permeável) e do genótipo TP (semi-permeável),
são responsáveis por uma maior ou menor susceptibilidade a deterioração das
sementes, análisou-se através de técnicas de biologia molecular, a identificação dos
fragmentos de cDNA diferencialmente expressos entre os tegumentos desses
genótipos, os quais possuem permeabilidade contrastante.
A técnica para obtenção dos fragmentos consistiu em extração do RNA total;
obtenção do cDNA dupla fita; avaliação do polimorfismo genético pela técnica de
cDNA-AFLP.
3.6.1 – Extração do RNA total
Para extração do RNA total dos tegumentos das sementes de soja, foram
testados três protocolos de extração:
1 – Protocolo utilizando o reagente Trizol (Invitrogen®);
2 - Protocolo estabelecido por CHANG et al. (1993);
3 - Protocolo utlizando o reagente Pure Link Plant RNA Reagent (Invitrogen®).
Em cada um dos protocolos testados, realizou-se primeiramente o tratamento
de todas as vidrarias, cadinhos, pistilos e demais utensílios necessários com água
contendo 0,01% de dietilpirocarbonato (H
2
O
DEPC
), para evitar a ação de enzimas que
degradam o RNA (RNases).
Cabe ressaltar que a extração do RNA total foi realizada separadamente para
cada época de amostragem. No momento da síntese do cDNA dupla fita essas
amostras de RNA foram misturadas e homogeneizadas, formando um mix de RNA.
19
3.6.1.1 – Protocolo utilizando Trizol
Acrescentou-se 1mL de Trizol em 100mg de tecido vegetal realizando a
desestruturação da amostra com auxílio de um bastão de vidro. As amostras foram
incubadas por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, realizou-se uma
centrifugação (12.000g/15 minutos a 4°C). Após a centrifugação, a amostra separou-
se em quatro fases: uma com coloração vermelha, outra com fenol/clorofórmio, uma
interfase e uma fase aquosa superior transparente, nessa fase superior é que estava
presente o RNA. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo de microcentrífuga
onde precipitou-se o RNA acrescentando 0,5mL de isopropanol. As amostras foram
incubadas a temperatura ambiente por 10 minutos, e em seguida, centrifugadas
(12.000g/10 minutos a 4°C). No próximo passo, descartou-se o sobrenadante e
lavou-se o RNA misturando a amostra em vortex com 1mL etanol 75%. Realizou-se
uma nova centrifugação (7.500g/5 minutos a 4°C) e descartou-se o sobrenadante.
Depois de secar, o RNA foi dissolvido em 25µL de água H
2
O
DEPC
e incubado a 60°C
por 10 minutos.
A pureza e a integridade do RNA extraído foram mensuradas através de
análise de absorbância (260/280nm) e eletroforese em gel de agarose 1,5%
(SAMBROOK et al., 2001).
3.6.1.2 – Protocolo de Chang et al. (1993) - modificado
A desestruturação do material vegetal foi realizada com auxílio de nitrogênio
líquido, acrescentando-se 400µL de tampão de extração CTAB em 100mg de tecido.
Para precipitação das proteínas e demais componentes celulares foi adicionada uma
solução de 500µL de clorofórmio, incubando-se à temperatura ambiente por 15
minutos e em seguida centrifugando (6.500g/10 minutos). O sobrenadante foi
transferido para um novo tubo com 300µL de clorofórmio e centrifugado novamente
(7.000g/10 minutos). No próximo passo, foi adicionado cerca de 1/3 do volume do
sobrenadante de cloreto de lítio (10M). Após precipitar over-night a (4ºC), a amostra
foi centrifugada (8.000g/45 minutos) e o sobrenadante removido. O pellet foi lavado
com etanol 70% e ressuspendido em 25µL de H
2
O
DEPC
.
20
A pureza e a integridade do RNA extraído foram mensuradas através de
análises de absorbância (260/280nm) e eletroforese em gel de agarose 1,5%
(SAMBROOK et al., 2001).
3.6.1.3 – Protocolo utilizando Pure Link Plant RNA Reagent
Realizou-se a desestruturação de aproximadamente 100mg do tecido vegetal
(tegumentos), com auxílio de nitrogênio líquido. Esse material foi transferido para um
tubo de microcentrífuga onde adicionou-se 0,5mL do Pure Link Plant RNA Reagent
gelado (4°C). A mistura foi obtida em vortex e incubada por 5 minutos a temperatura
ambiente, mantendo-se o tubo na posição horizontal. Centrifugou-se a amostra
(12.000g/15 minutos) em temperatura ambiente. Transferiu-se o sobrenadante para
um novo tubo de microcentrífuga e adicionou-se 0,1mL de NaCl (5M). Em seguida,
foram acrescentados 0,3mL de clorofórmio, centrifugando novamente as amostras
(12.000g/10 minutos a 4°C). Transferiu-se a fase aquosa para um novo tubo de
microcentrífuga e adicionou-se igual volume de isopropanol. Deixou-se a mistura em
repouso, por 10 minutos a temperatura ambiente. Realizou-se uma nova
centrifugação nas mesmas condições descritas anteriormente. Removeu-se o
sobrenadante sem perder o pellet e adicionou-se 1mL de etanol 75%. Centrifugou-se
temperatura ambiente (12.000 x g/1 minuto) e removeu-se o líquido tomando
cuidado para não perder o pellet. A seguir, realizou-se uma centrifugação breve
retirando-se o líquido residual com auxílio da micropipeta. O RNA extraído foi
ressuspendido em 20µL de H
2
O
DEPC
e estocado a temperatura de – 80°C até o
momento da sua utilização.
A pureza e a integridade do RNA foram mensuradas através de análises de
absorbância (260/280nm) e eletroforese em gel de agarose 1,5% (SAMBROOK et
al., 2001).
3.6.2 – Obtenção do cDNA dupla fita
3.6.2.1 - Síntese da primeira fita do cDNA
O cDNA dupla fita foi sintetizado utilizando o SuperScript Double Stranded
cDNA Synthesis kit (Invitrogen®).
21
Para síntese da primeira fita de cDNA foram acrescentados 9µL de H
2
O
DEPC
em 50µg de RNA total (contendo RNA extraído de tegumentos coletados nas
diferentes épocas). Em seguida, adicionou-se a cada amostra, 1µL de primer Oligo
dT (concentração de 100pmol/µL). Incubou-se essa mistura (70°C por 10 minutos), e
em seguida, colocou-se rapidamente o tubo no gelo. Na etapa seguinte, realizou-se
uma centrifugação breve e adicionaram-se os seguintes componentes: 4µL de
tampão de reação da primeira fita 5x [Tris-HCl 250mM (pH 8,3), KCl 375mM, MgCl
2
15mM], 2µL de DTT (1M) e 1µL de dNTP (10Mm). Essa mistura foi obtida em
vortex, coletando-se a amostra por centrifugação breve. Em seguida, incubou-se a
amostra (45°C por 2 minutos) e depois, acrescentou-se 2µL de SuperScript II RT,
incubando-se novamente a amostra (45°C por 1h). O último passo foi manter a
amostra no gelo para finalizar a reação.
3.6.2.2 - Síntese da segunda fita do cDNA
Em banho de gelo, acrescentou-se 20µL de reação da primeira fita, com os
seguintes componentes: 91µL de H
2
O
DEPC
, 30µL de tampão de reação da segunda
fita 5x [Tris-HCl 250mM (pH 6,9), MgCl
2
β-NAD
+
450mM, (NH
4
)
2
SO
4
50mM], 3µL de
dNTP (10Mm) (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1µL de DNA Ligase da E. coli (10U/µL),
4µL DNA Polimerase da E. coli (10U/µL), 1µL RNase H da E. coli (2u/µL). A mistura
foi obtida em vortex e incubada (16°C por 2h). Em seguida, adicionou-se 2µL (10
unidades) de T4 DNA Polimerase e incubou-se-se por mais 5 minutos. Transferiu-se
a amostra para o gelo e adicionou-se 10µL de EDTA 0,5M e 160µL de
fenol:clorofórmio: álcool isoamilico (25:24:1). Homogeneizou-se a amostra em vortex
e centrifugou-se (14.000g em temperatura ambiente). Removeu-se 140µL do
sobrenadante e transferiu-se para um novo tubo de microcentrífuga. No passo
seguinte, adicionaram-se 70µL de NH
4
OAc e 0,5mL de etanol absoluto gelado. A
mistura foi obtida em vortex e imediatamente centrifugou-se por 20 minutos nas
mesmas condições descritas anteriormente. Removeu-se o sobrenadante lavando-
se o pellet em etanol 70%. Centrifugou-se novamente (14.000g/2 minutos) e
descartou--se o sobrenadante. Finalmente o cDNA foi incubado a 37°C para
evaporar o resíduo de etanol e depois, dissolveu-se o pellet em 6 µL de água
ultrapura
.
22
3.6.3 - cDNA-AFLP
A técnica de cDNA-AFLP é composta pelas etapas de digestão do cDNA com
enzimas de restrição (EcoR I e Mse I), ligação de adaptadores específicos aos
terminais dos fragmentos de cDNA gerados pela clivagem, pré-amplificação dos
fragmentos de restrição utilizando os primers (EcoR I +A e Mse I +C), amplificação
seletiva de fragmentos utilizando três bases seletivas (Tabela 2 ) e eletroforese dos
fragmentos de cDNA amplificados em gel de poliacrilamida. Para execução dessa
técnica utilizou-se o AFLP Starter Primer Kit (Invitrogen®). Nos próximos parágrafos,
estão detalhados os passos que compõem cada uma dessas etapas.
3.6.3.1 - Reação de digestão do cDNA
Em um tubo de microcentrífuga foram adicionados os seguintes
componentes: 3µL de tampão de reação 5x [Tris-HCl 50mM (pH 7,5), acetato de
magnésio 250mM, acetato de potássio 50mM], 3µL de cDNA (150ng), 1,2µL EcoR
I/Mse I [1,25u/µL em Tris-HCl 10mM (pH 7,5), NaCl 50mM, EDTA 0,1mM, DTT 1mM,
0,1mg/µL BSA, glicerol 50% (v/v), 0,1% Triton® x-100], 7,8µL de água ultrapura.
Essa mistura foi homogeneizada e o conteúdo coletado através de centrifugação
breve. Em seguida incubou-se a amostra (37°C por 2h) e depois, incubou-se
novamente (70°C por 15 minutos) para inativar a restrição por endonucleases. O
último passo foi colocar o tubo no gelo e coletar o conteúdo por centrifugação breve.
3.6.3.2 - Ligação de adaptadores
Ao cDNA digerido proveniente da etapa anterior, adicionou-se 14,4µL de
solução de ligação de adaptadores [adaptadores EcoR I/Mse I, ATP (0,4mM), Tris-
HCl 10mM (pH 7,5), acetato de magnésio 10mM, acetato de potássio 50mM] e 0,6µL
de T4 DNA Ligase [1u/µL em Tris-HCl 10mM (pH 7,5), DTT 1mM, KCl 50mM,
glicerol 50% (v/v)]. Homogeneizou-se a mistura, coletou-se o conteúdo da reação
através de centrifugação breve e incubou-se amostra (20°C por 2h). Em seguida,
realizou-se uma diluição da solução de ligação de 1:10 colocando 10µL da reação
de ligação e acrescentando 90µL de tampão TE [Tris-HCl 10mM (pH 8,0), EDTA
0,1mM ].
23
3.6.3.3 - Pré-amplificação
Em um microtubo de 0,2mL, foram adicionados 3µL do cDNA diluído da etapa
anterior, 20µL do primer mix pré-amplificação, 2,5µL de tampão da PCR 10x+Mg
[Tris-HCl 200mM (pH 8,4), MgCl
2
15mM, KCl 500mM] e 0,5µL da enzima Taq DNA
Polimerase (5u/µL). Em seguida, a amostra foi levada ao termociclador utilizando-se
a seguinte programação: 20 ciclos de (94°C por 30s; 56°C por 60s e 72°C por 60s).
Após a PCR, Realizou-se uma diluição dessa amostra pré-amplificada transferindo-
se 3µL da amostra e adicionando-se 147µL de tampão TE [Tris-HCl 10mM (pH 8,0),
EDTA 0,1mM].
3.6.3.4 - Amplificação seletiva
Na reação de amplificação seletiva foram testadas 64 combinações de
primers as quais estão assinaladas na Tabela 1.
Tabela 1 - Combinações de primers utilizados nas reações de amplificação
seletiva na técnica de cDNA-AFLP.
Para cada par de primer escolhido foi necessário o preparo das seguintes soluções:
Mix 1: 1,0µL do primer EcoR I
9,0µL do primer Mse I (contendo dNTPs)
Total = 10µL (suficiente para 2 reações de amplificação)
M-CAA M-CAC M-CAG M-CAT M-CAT M-CTC M-CTG M-CTT
E-AAC
E-AAG
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
E-ACA
E-ACC
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
E-ACG
E-ACT
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
E-AGC
E-AGG
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
+
24
Mix 2: 15,8µL de água ultrapura
4,0µL de tampão de PCR (10X+Mg)
0,2µL de Taq DNA Polimerase (5u/µL)
Total = 20µL (suficiente para 2 reações de amplificação)
Mix 3: 5,0µL de cDNA diluído
5,0µL de mix 1
10,0µL de mix 2
Total = 20µL (suficiente para 2 reações de amplificação)
Após o preparo das reações de amplificação seletiva, as amostras foram
levadas ao termociclador (PTC 100–MJ Research) com a programação apresentada
na Tabela 2.
Tabela 2 – Programação do termociclador utilizada na reação de amplificação
seletiva na técnica de cDNA-AFLP.
3.6.4 - Detecção dos fragmentos de cDNA diferencialmente expressos
Para visualização dos fragmentos de cDNA diferencialmente expressos,
realizou-se a eletroforese em gel de poliacrilamida (5% de concentração) revelado
com nitrato de prata. Essa metodologia é a mais utilizada para separação de
Programa T(°C) Tempo(s) T(°C) Tempo (s) T(°C) Tempo (s) N°ciclos
1 94 60 65 60 72 90 1
2 94 60 64 60 72 90 1
3 94 60 63 60 72 90 1
4 94 60 62 60 72 90 1
5 94 60 61 60 72 90 1
6 94 60 60 60 72 90 1
7 94 60 59 60 72 90 1
8 94 60 58 60 72 90 1
9 94 60 57 60 72 90 1
10 94 60 56 60 72 90 1
11 94 30 56 30 72 60 23
+
+
25
proteínas e moléculas de pequeno tamanho. No caso da técnica de AFLP, utilizam-
se géis do tipo desnaturante, que realizam a separação de fragmentos de cDNA de
fita simples.
3.6.4.1 – Preparo e montagem das placas
O gel de acrilamida foi preparado entre duas placas de vidro de comprimentos
diferentes, utilizando-se espaçadores com 2mm de espessura. A placa maior
recebeu um tratamento com uma solução de Bind silane que faz com que o gel
permaneça aderido à placa no momento da revelação, enquanto a placa menor
recebeu tratamento com uma solução repelente de Repel silane que permite que a
placa menor descole com facilidade do gel após a eletroforese.
3.6.4.2 – Preparo da solução do gel de poliacrilamida (5%)
A solução do gel foi preparada utilizando-se os seguintes componentes:
- 22,5g de uréia;
- 10mL de TBE 5x (54g Tris-Base, 27,5g Acido Bórico, 20mL EDTA 0,5M (pH 8,0),
completou-se com água deionizada até 1L e ajustou-se o pH do tampão até próximo
a 8,3);
- 7,5mL de acrilamida:bisacrilamida 19:1 (38g de acrilamida, 2g de bisacrilamida
completar até 100mL);
- Água deionizada quantidade suficiente para 50mL.
Os componentes foram dissolvidos em agitador magnético até a diluição total
da uréia. Depois de a solução esfriar, acrescentou-se 360µL de APS (Persulfato de
Amônio 10%) e 72µL de TEMED, e imediatamente verteu-se a solução no molde do
gel.
Após a polimerazação do gel, realizou-se uma pré-corrida em potência
constante (60W) por aproximadamente 30 minutos. Em seguida procedeu-se a
lavagem da região superior do gel injetando tampão com o auxilio de uma seringa.
Antes da aplicação das amostras no gel, realizou-se uma desnaturação a 94°C por 5
minutos, utilizando igual volume de tampão de desnaturação (loading buffer). Após a
desnaturação, as amostras foram imediatamente resfriadas a 4°C e aplicadas no
26
gel. Após 2 horas de corrida (60W), retirou-se a placa da cuba de eletroforese e
iniciou-se o processo de revelação.
3.6.4.3 – Revelação do gel com Nitrato de Prata (BLEIDER, 1982 – modificado)
Esse método de revelação é baseado na oxidação do nitrato de prata ligado
aos fragmentos de cDNA amplificados, presentes no interior do gel. Primeiramente
retirou-se a placa menor na qual foi aplicada a solução repelente. Colocou-se a
placa maior na qual o gel estava aderido em solução fixadora I (100mL de etanol
(PA), 10mL de ácido acético (PA), completou-se o volume até 2L com água
destilada), durante 20 minutos sob agitação orbital leve. Eliminou-se a solução
fixadora I e realizou-se 2 lavagens de 5 minutos com água destilada . Descartou-se
a água de lavagem e em seguida foi acrescentada a solução fixadora II (15mL de
ácido nítrico e completou-se o volume até 2L com água destilada) deixando sob
agitação orbital leve durante 3 minutos. A solução fixadora II foi eliminada
procedendo-se em seguida, 2 lavagens de 5 minutos com água destilada.
Acrescentou-se a solução de nitrato de prata (4g de nitrato de prata em água
destilada, aprox. 200mL, depois se completou o volume até 2L com água destilada),
deixando sob agitação orbital leve durante 30 minutos. Eliminou-se essa solução e
procedeu-se uma lavagem rápida de 30 segundos com água destilada. Após
eliminar a água de lavagem foram acrescentados 500mL da solução reveladora
gelada (4ºC) (60g de carbonato de sódio dissolvidos em 500mL de água destilada,
sob agitação constante, completando-se o volume até 2L com água destilada
gelada). Imediatamente antes da utilização da solução reveladora, acrescentou-se
1mL de formaldeído) até adquirir uma coloração preta. Eliminou-se os 500mL e
adicionou-se o restante da solução reveladora deixando sob agitação orbital
constante até o aparecimento das bandas. Retirou-se a solução reveladora e
acrescentou-se a solução finalizadora (200mL de ácido acético 10% e completou-se
o volume até 2L com água destilada), deixando sob agitação orbital leve até parar de
formar bolhas. Eliminou-se a solução finalizadora e adicionou-se água destilada até
a total cobertura do gel. Esperou-se o gel secar e finalmente foram identificadas as
bandas polimórficas entre os genótipos CD – 202 e TP.
27
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 – Qualidade Fisiológica das Sementes
Conforme observado na tabela 3, comparando-se a qualidade fisiológica das
sementes de soja dos genótipos CD – 202 e TP observa-se que não houve diferença
significativa na germinação. Entretanto, em relação ao vigor, o genótipo TP
apresentou desempenho superior ao genótipo CD – 202. No teste de
envelhecimento acelerado, o genótipo TP apresentou 82% das plântulas normais,
enquanto no genótipo CD – 202 esse valor foi apenas 52%. Com relação à
condutividade elétrica, o valor obtido no genótipo CD – 202 foi 70µS.cm
-1
.g
-1
,
superior ao do genótipo TP com 42µS.cm
-1
.g
-1
, demonstrando que as sementes com
tegumento preto sofreram maior desestruturação das membranas celulares
resultando em maior quantidade de íons lixiviados para a solução de embebição na
execução do teste.
Isso pode ser atribuído à alta susceptibilidade do tegumento das sementes
provenientes do genótipo CD – 202, pois nesse caso, as sementes foram produzidas
em casa de vegetação e colhidas manualmente e ainda assim, o tegumento desse
genótipo mostrou-se altamente frágil, com grande parte das sementes apresentando
rachaduras no tegumento. Esses resultados corroboram com dados obtidos por
França Neto & Potts (1979), ao constatarem que sementes de soja com tegumento
permeável, apresentam maior incidência de danos mecânicos quando
comparativamente a sementes de soja com tegumento semi-permeável. Além disso,
esses pesquisadores afirmam que sementes com características de tegumento
semi-permeável sofrem menos danos por umidade durante o processo de secagem.
Estudos realizados por VIEIRA et al. (1987) também evidenciaram a existência de
genótipos contrastantes para qualidade fisiológica da semente. Essas diferenças
28
podem existir em virtude da presença de sementes duras, as quais apresentam total
ou parcial impermeabilidade à penetração de água no tegumento e,
conseqüentemente, tornam-se menos susceptíveis aos danos mecânicos, às
adversidades climáticas, à deterioração por umidade e ao ataque de patógenos.
Tabela 3 - Qualidade fisiológica de sementes de soja dos genótipos CD – 202 e TP
(Tegumento Preto), produzidas em casa de vegetação, no ano agrícola
2005/06, município de Pelotas – RS. Pelotas, UFPel – 2007.
TESTES
Genótipo TP
Genótipo CD-202
Germinação (%) 86 a 84 a
Condutividade (µS.cm
-1
.g
-1
) 42,60 a 70,06 b
Envelhecimento (%) 82 a 52 b
Letras que diferem na linha significam diferenças significativas pelo teste Duncan 5%
de probabilidade.
4.2 – Caracterização estrutural dos tegumentos
Através da microscopia obteve-se um aumento de 40x no tamanho das
imagens, permitindo visualizar de forma clara as diferenças estruturais entre os
tegumentos dos genótipos CD-202 e TP.
Observando-se a estrutura do tegumento das sementes de soja, pôde-se
identificar a presença de três camadas: epiderme, hipoderme e células
parenquimatosas (figuras 1 a 6). Neste estudo não foi possível avaliar a primeira
camada do tegumento, ou seja, a cutícula. Essa estrutura já foi detalhadamente
estudada por Ma et al. (2004) que afirmaram que a cutícula da camada paliçádica
está relacionada à permeabilidade do tegumento, sendo que a cutícula do
tegumento permeável seria mecanicamente frágil, desenvolvendo rachaduras
durante a embebição, enquanto que no tegumento semi-permeável seria
mecanicamente forte, não sofrendo rachaduras em condições normais.
Neste trabalho, foram observadas outras diferenças existentes, além da
cutícula, entre a estrutura dos tegumentos de sementes de soja com permeabilidade
contrastante, as quais podem interferir na deterioração das sementes.
29
Na parte externa do tegumento encontra-se a epiderme, camada formada por
células paliçádicas chamadas macroesclerídeos (figuras 1 a 6). No genótipo TP, as
células paliçádicas da epiderme apresentam-se mais alongadas (figura 1), enquanto
que no genótipo CD-202 essas células possuem forma globulosa e justaposta (figura
2). Segundo Peske & Pereira (1983), a camada paliçádica é importante para
absorção de água pela semente, pois, dependendo da sua constituição química,
arranjo e substâncias intercelulares, a semente pode embeber água ou não.
Ainda na figura 1, observa-se que as células da epiderme do tegumento do
genótipo TP apresentaram-se com um aspecto serrilhado, enquanto que no genótipo
CD - 202 essas células permaneceram com a estrutura lisa (figura 2). Isso pode ser
explicado pelo fato de que no genótipo TP, as células da epiderme são altamente
lignificadas (Alvarez, 1997), conferindo ao tegumento desse genótipo maior
resistência aos impactos mecânicos e consequentemente ao corte com
ultramicrótomo. Já no genótipo CD – 202 as células da epiderme do tegumento
cederam facilmente ao corte, por serem menos estruturadas e mais frágeis aos
impactos mecânicos.
Comparando-se a estrutura da epiderme do genótipo TP (figuras 1, 3 e 5)
com a do genótipo CD-202 (figuras 2, 4, e 6), observa-se que as células paliçádicas
no genótipo TP apresentam alta quantidade de uma pigmentação escura. Essa
coloração escura pode ser atribuída a um acúmulo de pró-antocianina ou
antocianina, as quais estão presentes na epiderme de sementes de soja com
tegumento preto, desde os estádios iniciais do desenvolvimento do tegumento (Todd
& Vodkin, 1993). No entanto, nas fases iniciais da formação da semente essa
pigmentação ainda não é visível, pois as sementes de soja do genótipo TP passam
a adquirir coloração apenas a partir dos 50 dias após a antese (figura 7). Já o
genótipo CD – 202, não acumula esses pigmentos e quando maduro, apresenta-se
na coloração amarela (figura 8). Segundo Asiedu & Powell (1998), a cor do
tegumento das sementes é uma característica associada com a permeabilidade à
água. A pigmentação do tegumento das sementes também está correlacionada com
a baixa taxa de absorção de água das sementes em algumas espécies de
Fabaceas. Comparando-se tegumentos com e sem pigmentação, esses autores
observaram uma maior taxa de embebição nas sementes que não apresentavam
acúmulo de pigmentos.
30
Dados obtidos por Todd & Vodkin (1993) sugerem que sementes de soja com
tegumento amarelo apresentam o alelo dominante do gene I, gene responsável pela
coloração do tegumento. A presença desse alelo dominante inibe o acúmulo de
antocianina nas paredes da epiderme do tegumento amarelo. Sementes de soja com
tegumento preto não possuem esse alelo dominante e, portanto, apresentam
acúmulo de antocianina nas paredes da epiderme. Segundo esses pesquisadores,
em tegumentos pretos nos estádios iniciais de desenvolvimento, há presença de
antocianinas vacuolares como cyanidin e pelargonidin. Já em tecidos de tegumentos
maduros verifica-se a presença dos flavonóides cyanidin, pelargonidin e delphinidin.
Abaixo da epiderme encontra-se a hipoderme (figuras 1 a 6), camada
unicelular formada por osteoesclerídeos, células esclerenquimatosas com parede
celular de espessura desuniforme, as quais constituem uma camada de suporte com
considerável espaço intercelular. A espessura da camada da hipoderme do
tegumento do genótipo TP, apresentou-se maior que no tegumento do genótipo CD-
202. Essa diferença foi mais evidente aos 40 dias de formação do tegumento, onde
as células da hipoderme do genótipo TP apresentaram em torno de 11µm (figura 3)
ao passo que no genótipo CD-202, essa camada mediu aproximadamente 6µm
(figura 4), o que corresponde a uma diferença de 45%.
Avaliando-se a espessura das camadas da epiderme e hipoderme, observa-
se que em todas as épocas avaliadas, essas camadas apresentaram-se mais
espessas no genótipo TP que no genótipo CD-202. Esses resultados corroboram
com o trabalho realizado por Horlings et al. (1991), onde sementes de soja de
genótipos com tegumento preto apresentam maior espessura do tegumento quando
comparado a genótipos com tegumento amarelo. Os autores afirmam que a maior
espessura do tegumento confere à semente maior resistência à deterioração no
campo.
Comparando-se os tegumentos jovens, (figuras 1 e 2), com os tegumentos já
maduros (figuras 5 e 6), constata-se que as estruturas que compõem o tegumento
das sementes de soja já estão presentes aos 25 dias após a antese. Nos
tegumentos mais maduros, ou seja, 55 dias após a antese (figuras 5 e 6), observa-
se que há uma diminuição na espessura das camadas da epiderme e hipoderme, o
que pode ser atribuído a uma compressão dessas camadas provocada pelo
crescimento dos cotilédones.
31
A terceira e última camada visualizada no tegumento das sementes de soja é
uma camada formada de células parênquimatosas (figura 1). Estas células possuem
forma mais ou menos cilíndrica e parede celular fina, formando uma estrutura com a
sobreposição de 6 a 8 camadas de células. Nessa camada, foram observadas
diferenças no formato e organização dessas células. Entretanto, não foram
encontrados na bibliografia dados que afirmem existir relação dessa camada com
características de resistência do tegumento.
Figura1 – Tegumento de soja do genótipo TP, coletado 25 dias após a antese em
corte transversal com ultramicrótomo, corado com azul de metileno e
bórax 1%, e visualizado em microscópio ótico, com aumento de 40x.
Pelotas, UFPel – 2007.
Epiderme
Hipoderme
Células Parenquimatosas
32
Figura 2 – Tegumento de soja do genótipo CD-202, coletado 25 dias após a antese
em corte transversal com ultramicrótomo, corado com azul de metileno e
bórax 1%, e visualizado em microscópio, com aumento de 40x. Pelotas,
UFPel – 2007.
Figura 3 – Tegumento de soja do genótipo TP, coletado 40 dias após a antese em
corte transversal com ultramicrótomo, corado com azul de metileno e
bórax 1%, e visualizado em microscópio ótico com aumento de 40x.
Pelotas, UFPel – 2007.
Epiderme
Hipoderme
Células Parenquimatosas
Epiderme
Hipoderme
Células Parenquimatosas
33
Figura 4 – Tegumento de soja do genótipo CD – 202, coletado 40 dias após a antese
em corte transversal com ultramicrótomo, corado com azul de metileno e
bórax 1%, e visualizado em microscópio ótico, com aumento de 40x.
Pelotas, UFPel – 2007.
Figura 5 – Tegumento de soja do genótipo TP, coletado 55 dias após a antese em
corte transversal com ultramicrótomo, corado com azul de metileno
bórax 1%, e visualizado em microscópio ótico, com aumento de 40x.
Pelotas, UFPel – 2007.
Epiderme
Epiderme
Hipoderme
Hipoderme
Células Parenquimatosas
Células Parenquimatosas
34
Figura 6 – Tegumento de soja do genótipo CD – 202, coletado 55 dias após a
antese em corte transversal com ultramicrótomo, corado com azul de
metileno e bórax 1%, e visualizado em microscópio ótico com aumento
de 40x. Pelotas, UFPel – 2007.
Figura 7 - Coloração do tegumento de sementes de soja do genótipo TP em
diferentes fases de desenvolvimento. Pelotas – UFPel, 2007.
Epiderme
Hipoderme
Células Parenquimatosas
DIAS APÓS
A ANTESE
25 30 35 40 45 50 55 60
35
Figura 8 – Coloração do tegumento de sementes de soja do genótipo CD - 202 em
diferentes fases de desenvolvimento. Pelotas – UFPel, 2007.
4.3 - Obtenção dos fragmentos de cDNA diferencialmente expressos pela
técnica de cDNA-AFLP
4.3.1 – Avaliação de protocolos de extração do RNA total
Um dos requisitos fundamentais para obter-se sucesso com a técnica de
cDNA-AFLP, consiste na obtenção de RNAs com qualidade e em quantidade
suficiente.
O método do Trizol é recomendado para extração de RNA total de tecidos e
células de humanos, plantas, animais e bactérias, mantendo o RNA extraído íntegro
e livre de DNA e proteínas. Esse método, entretanto, foi eficiente apenas para
extração de RNA dos tegumentos provenientes do genótipo CD-202 enquanto que
para o genótipo TP esse protocolo não funcionou (Figuras 8A e 8B).
A dificuldade de extrair RNA desses tecidos pode ser explicada por estudos
realizados por Tood & Vodkim (1993), os quais demonstram que proteínas e RNA de
sementes com tegumento preto são difíceis de serem extraídos. A presença de pró-
antocianinas e antocianinas em tegumentos de sementes de soja de coloração preta
DIAS APÓS A ANTESE
25 30 40 45 50 60
36
ou marrom, interage com o RNA formando um complexo que altera o espectro de
absorbância, a migração do RNA e a capacidade de hibridização do RNA com DNA.
Com base neste resultado foram testados outros protocolos de extração
recomendados para tecidos que possuem alta quantidade de fenóis, como o
protocolo estabelecido por Chang et al. (1993). Esse protocolo extraiu RNA de
ambos os genótipos, porém, a quantidade de RNA extraído foi insuficiente para a
síntese do cDNA (Figura 8C e 8D).
O terceiro método testado foi o protocolo do Purê
Link Plant RNA Reagent, esse reagente é recomendado para isolamento de RNA
total de alta qualidade, de tecidos de plantas, especialmente aqueles que
apresentam alto conteúdo de polifenóis (como o caso das sementes com tegumento
preto). A utilização desse reagente foi extremamente eficiente para extração de RNA
total de tegumentos em ambos os genótipos (Figuras 8E e 8F). A quantidade de
RNA extraído por esse método foi bem superior em relação aos demais protocolos
testados, sendo suficiente para a síntese do cDNA dupla-fita, originando um cDNA
de qualidade, adequado para a utilização na técnica de cDNA-AFLP.
25 40 55 25 40 55 25 40 55 25 40 55 25 40 55
25 40 55
a
c
b
A
C
D
F
B
Figura 9 - RNA total em gel de agarose 1,5%, isolado de tegumentos de sementes de soja (Glycine
max) em três estádios de desenvolvimento (25, 40 e 55 dias após a antese), utilizando
três protocolos de extração (Trizol (Invitrogen); Chang et al. (1993) modificado; Pure Link
Plant RNA (Invitrogen)). A - Genótipo TP (tegumento preto) Trizol; B - Genótipo CD-202
Trizol; C- Genótipo TP Chang; D- Genótipo CD-202 Chang; E- Genótipo TP Pure Link
Plant RNA; F- Genótipo CD-202 Pure Link Plant RNA.
A
C
D
E
F
B
37
4.3.2 – Seleção dos fragmentos de cDNA diferencialmente expressos
Na figura 9, estão os resultados obtidos através da eletroforese em gel de
poliacrilamida, de três dos 64 pares de primers testados.
Os fragmentos selecionados foram os que se apresentaram diferencialmente
expressos entre os tegumentos dos dois genótipos, os quais estão indicados na
figura através de setas.
Comparando-se o padrão de bandas obtidos com o primer um é possível
observar a presença de seis bandas polimórficas entre os dois genótipos, quatro no
genótipo TP e três no genótipo CD-202.
Já a segunda combinação de primers testada, apesar de ter gerado um bom
padrão de bandas, não apresentou nenhum fragmento de cDNA diferencialmente
expresso.
38
PA PA PA M
P1 P2 P3 M
330 pb
100 pb
200 pb
30 pb
50 pb
Figura 10- cDNA-AFLP em gel de poliacrilamida 5%, corado com nitrato de prata, em
tegumentos de sementes de soja (Glycine max) de dois genótipos, (P) genótipo
com tegumento preto e (A) genótipo CD-202, utilizando três diferentes
combinações de primers (P1-EcoRI-AAG/MseI-CTC, P2-EcoRI-ACA/MseI-CTT
and
P3
-
EcoR
I
-
AGG/
Mse
I
-
CTC,
M
-
30
-
330 DNA
ladder).
39
A terceira combinação de primers possibilitou a seleção de quatro fragmentos
no genótipo CD-202.
Das 64 combinações de primers testadas, foi possível identificar um total de
47 bandas polimórficas, o que pode ser considerada uma quantidade satisfatória, já
que essas bandas selecionadas representam fragmentos de genes diferencialmente
expressos entre os dois genótipos e dessa forma são promissores para o
desenvolvimento de marcadores relacionados a caracteres do tegumento. Dentre 64
as combinações, 36 destas não permitiram a seleção de nenhum fragmento
diferencialmente expresso, algumas, por não apresentarem polimorfismo e outras,
por não permitirem uma amplificação adequada o que impossibilitou a seleção de
fragmentos, já que esse fator levaria a um processo de seleção com maior
subjetividade.
O tamanho dos fragmentos selecionados foi variável. Foram obtidos desde
fragmentos maiores com mais de 330 pb (pares de bases) até fragmentos menores
em torno de 50 pb o que pode ser observado na figura 9.
Para validação desses marcadores será necessário, além do
seqüenciamento, a utilização de ferramentas adicionais que confirmem a expressão
diferencial desses fragmentos selecionados. Técnicas como de hibridização com
sondas específicas ou análise de PCR em tempo real podem ser alternativas
adequadas para este fim.
Aoki et al. (2005) utilizou a técnica de cDNA-AFLP visando a identificação de
genes relacionados a característica de resistência ao estresse salino em soja. Esses
pesquisadores obtiveram resultados positivos utilizando técnicas de hibridização e
confirmando se os fragmentos obtidos expressavam-se em outros órgãos da planta
além das folhas, como nas raízes e haste.
A partir da identificação dos fragmentos de genes mediante estudos de
seqüenciamento com posterior caracterização, será possível identificar genes
relacionados a características do tegumento e indiretamente relacionados com a
qualidade fisiológica das sementes. Além disso, o sequenciamento desses
fragmentos poderá auxiliar o entendimento dos processos fisiológicos relacionados a
características do tegumento das sementes, assim como a construção de
marcadores moleculares para seleção assistida em programas de melhoramento o
que resultará em maior rapidez e eficiência no desenvolvimento de variedades em
que o fator qualidade de sementes apresente alta prioridade.
40
5. CONCLUSÕES
- Existem diferenças entre as estruturas dos tegumentos de soja de coloração
amarela e coloração preta as quais podem estar relacionadas à permeabilidade do
tegumento e indiretamente relacionadas à qualidade das sementes.
- A técnica de cDNA-AFLP é eficiente para identificação de fragmentos de genes
diferencialmente expressos entre os tegumentos de sementes de soja com
características de permeabilidade contrastantes.
- Sementes com tegumento preto apresentaram qualidade fisiológica superior em
relação às sementes com tegumento amarelo.
41
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALVAREZ, P.J.C. Relationship between soybean seed coat lignin content and
resistence to mechanical damage. Seed Science & Technology, v.25, p.209-214,
1997.
AOKI, A.; KANEGAMI, A.; MIHARA, M.; KOJIMA, T.; SHIRAIWA, M.; TAKAHARA, H.
Molecular cloning and characterization of a novel soybean gene encoding a leucine-
zipper-like protein induced to salt stress. Science Direct, v.356, p.135-145, 2005.
ASIEDU, E.A.; POWELL, A.A. Comparisons of storage potential of cultivar of cowpea
(Vigna unguiculata) differing in seed coat pigmentation. Seed Science and
Technology, v. 26, p. 211-221, 1998.
BACHEM, C.W.; OOMEN, R.J.F.; VISSER, R.G. Transcript imaging with cDNA-
AFLP: a step-by-step protocol. Plant Molecular Biology Reporter, v.16, p.157-173,
1998.
BACHEM, C.W.; VAN DER HOEVEN, R.S.; de BRUJIN, S.M.; VREUGDENHIL, D.;
ZABAEU M, VISSER R.G. Visualization of differential gene expression using a novel
method of RNA fingerprinting based on AFLP: analysis of gene expression during
potato tuber development. The Plant Journal, v.9, p.745-753, 1996.
BEIDLER, J.L.; HILLIARD, P.R.; RILL, R.L.; Ultra sensitive staining of nucleic acids
with silver nitrate. 1982.
BRASIL. Ministério da Agricultura. Regras para Análise de Sementes. Brasília:
Departamento Nacional de produção Vegetal. 1992. 365p.
CARRARO, I.M.; PESKE, S.T. Uso de sementes de soja no estado do Paraná.
Revista Brasileira de Sementes, Pelotas, v.27, n.2, p.75-80, 2005.
CARVALHO, N. M. & NACAGAWA, J. Sementes: ciência, tecnologia e produção.
3º edição. Campinas, S.P.: Fundação Cargill, 1988. 424p.
42
CHANG, S.; PURYEAR, J.; CAIRNEY, J. A simple and efficient method for isolation
RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Repórter, v.11, p.113-116, 1993.
COSTA, N.P.; MESQUITA, C.M.; MAURINA, A.C.; FRANÇA-NETO, J.B.; PEREIRA,
J.E.; BOURDINGNON, J.R.; KRZYZANOWSKI, F.C.; HENNING, A.A. Efeito
dacolheita mecânica da soja nas características físicas, fisiológicas e químicas das
sementes em três estados brasileiros. Revista Brasileira de Sementes, v.23, n.1,
p.140-145, 2001.
FEDERIZZI, L.C. Estrutura de um programa de melhoramento de plantas e possíveis
aplicações de marcadores moleculares: visão do melhorista. In: MILACH, S.C.K.,
Marcadores Moleculares em Plantas, 1998. p.3-15
FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores
moleculares em análise genética. 3.ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN, 1998.
p.220. (EMBRAPA-CENARGEN. Documentos, 20).
FRANÇA-NETO, J. B.; HENNING, A. A.; KRYZANOWSKI, F. C.; COSTA, N. P.
Tecnologia de produção de sementes. In: A cultura da soja no Brasil. Londrina:
EMBRAPA-CNPSo, 2000 – CD - Rom.
FRANÇA NETO, J.B.; POTTS, H.C. Efeitos da colheita mecânica e da secagem
artificial sobre a qualidade da semente dura em soja. Revista Brasileira de
Sementes, v.01, n.2, p.64-77, 1979.
GAZZONI, D.L. Botany. In: Embrapa-CNPSo. Tropical soybean improvement and
production. Plant Production and Protection Series n°27. Rome: Food and
Agriculture Organization of the United Nation, 1994. p.1-12.
GUIMARÃES, C.T.; MOREIRA, M.A. Genética molecular aplicada ao melhoramento
de plantas. In: BORÉM, A. (Ed.). Melhoramento de espécies cultivadas. Editora
UFV, 1999. p. 715-740.
HABU, Y.; FUKUDA-TANAKA, S.; HISATOMI, Y.; IIDA. Amplified restriction fragment
length polymorphism based mRNA fingerprinting using a single restriction enzyme
that recognizes a 4-pb sequence. Biochem. Biophys. Res. Commum. n.234, p.516-
521, 1997.
HENNING, A.A. Patologia e tratamento de sementes: noções gerais. 2 ed. –
Londrina: Embrapa Soja, 2005. 52p.
HORLINGS, G.; GAMBLE, E.E.; SHANMUGASUNDARAM, S. The influence of seed
size and seed coat characteristics on seed quality of soybean in the tropics:field
weathering. Seed Science and Technology , v.9, p.665-685, 1991.
KRZYZANOWSKI, R.D.V.; VIEIRA, R.D. & FRANÇA NETO, J.B. Vigor de
sementes: conceitos e testes. Londrina: ABRATES, 1999. 218p.
43
MA, E.; CHOLEWA, E.; MOHAMED, T.; PETERSON, C.A.; GIJZEN, M. Cracks in the
Palisade Cuticle of Soybean Seed Coats Correlate with their Permeability to Water.
Annals of Botany Company, v.94, p.213-228, 2004.
MALONE, G.; ZIMMER, P.D. Marcadores Moleculares. In: Ferramentas da
biotecnologia no melhoramento genético vegetal. Pelotas: UFPel, 2005, p.78-
114.
MAO, C.; YI, K.; YANG, L.; ZHENG, B.; WU, Y.; LIU, F.; WU, P. Identification of
aluminium-regulated genes by cDNA-AFLP in rice (Oryza sativa L.): aluminium-
regulated genes for the metabolism of cell wall components. Journal of
Experimental Botany, v.55, n.394, p.137-143, 2004.
MESQUITA, C.M.; COSTA, N.P.; PEREIRA, J.E.; MAURINA, A.C.; ANDRADE,
J.G.M. Colheita mecânica da soja: avaliação das perdas e da qualidade física da
qualidade física do grão. Engenharia Agrícola, Jaboticabal, v.18, n.3, p.44-53,
1999.
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. CONAB, 2005.
Acesso em fevereiro de 2007. On-line. Disponível na Internet: http:// www.
conab.gov.br/safras.asp.
MILLER, S.S.; BOWMAN, L.A.; GIJZEN, M.; MIKI, B.L.A. Early development of the
seed coat of soybean. Annals of Botany, n.84, p.297-304, 1999.
NEDEL, J.L. Fundamentos da qualidade de sementes. In: Sementes fundamentos
científicos e tecnológicos. Pelotas: UFPel, 2003, p.95-138.
PESKE, S. T. & PEREIRA, L. A.G. Tegumento da semente de soja. Tecnologia de
sementes, v. 6, p. 23-34, 1983.
RAGUS, L.N. Role of water absorbing capacity in soybean germination and seedling
vigour. Seed Science and Technology, v15 p. 285-296, 1987.
ROESSING, A.C.; TOLEDO, J. F. F.; GALERANI, P. B. Histórico e desenvolvimento.
In: A cultura da soja no Brasil. Londrina: EMBRAPA-CNPSo, 2000 – CD - Rom.
SAMBROOK, J.; RUSSEL, D. W.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA, 2001.
SHUSTER I. O DNA da semente, 2003. Acessado em fevereiro de 2007. On-line.
Disponível na Internet: http:// www.coodetec.com.br/artigos.
SOUZA, F. H. D.; MARCOS-FILHO, J. The seed coat as a modutator of seed-
environment relationships in Fabaceae. Revista Brasileira de Botânica, v. 24, p.
365-375, 2001.
44
SWANSON, B.G., HUGHES, J.S.; RASMUSSEN, H. Seed microestruture: rewien of
water imbibition in legumes. Food Microestruture, v.4, p. 115-153, 1985.
TAVARES, D.Q.; MIRANDA, M.A.C.; UMINO, C.Y.; DIAS, G.M. Características
estruturais do tegumento de sementes permeáveis e impermeáveis de linhagens de
soja. Revista Brasileira de Botânica, São Paulo, v.10, p. 147-153, 1987.
TODD, J. J.; VODKIN, L.O.; Pigmented soybean (Glycine max) seed coats
accumulate proanthocyanidins during development. Plant Physiol. v.102, p.663-670,
1993.
WELSH, J.; MCCLELLAND, M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary
primers. Nucleic Acid Res. v.18, p.7213-7218, 1990.
WILLIANS, J.G.K.; KUBELIK, A.R.; LIVAK, K.J.; RAFALSKI, J.A.; TINGEY, S.V. DNA
polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic
Acids Research, v.18, p.6531-6535, 1990.
VIEIRA, R.D; ARANHA, L.R.S.; ATHAYDE, M.L.F.; BANZATTO, D.A. Produção,
características agronômicas e qualidade fisiológica de sementes de cultivares de
soja [Glycine max (L.) Merrill]. Científica, São Paulo, v.15, n.1, p.127-136, 1987.
ZABEAU, M. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA
fingerprinting. European Patent Application, publication 0 534 858 A1, bulletin 93/13,
1993.
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