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Daciene de Arruda Grossklaus
Caracterização imunoquímica de exoantígenos e análises preliminares
de genes relacionados à virulência de isolados clínicos de
Paracoccidioides brasiliensis em Mato Grosso.
Universidade Federal de Mato Grosso
Faculdade de Ciências Médicas
Programa de Pós-Graduação
Mestrado em Ciências da Saúde
Área de Concentração: Doenças Infecciosas e Tropicais
Cuiabá – Mato Grosso
2008
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Livros Grátis
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Universidade Federal de Mato Grosso
Faculdade de Ciências Médicas
Programa de Pós-Graduação
Mestrado em Ciências da Saúde
Área de Concentração: Doenças Infecciosas e Tropicais
Caracterização imunoquímica de exoantígenos e análises preliminares
de genes relacionados à virulência de isolados clínicos de
Paracoccidioides brasiliensis em Mato Grosso.
Dissertação apresentada ao Mestrado em Ciências da Saúde,
Programa de Pós-Graduação da Faculdade de Ciências
Médicas da Universidade Federal de Mato Grosso, como
requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em
Ciências da Saúde, Área de Concentração: Doenças
Infecciosas e Tropicais.
Orientadora: Profa. Dra. Rosane Christine Hahn
Cuiabá – Mato Grosso
2008
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FICHA CATALOGRÁFICA
G878c Grossklaus, Daciene de Arruda
Caracterização imunoquímica de exoantígeneos e
análises preliminares de genes relacionados à virulência
de isolados clínicos de Paracoccidioides brasiliensis
em Mato Grosso / Daciene de Arruda Grossklaus. –
2008.
xii, 77p. : il.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal
de Mato Grosso, Faculdade de Ciências Médicas,
Pós-graduação em Ciências da Saúde, Área de
Concentra- ção: Doenças Infecciosas e Tropicais,
2008.
“Orientador: Profª. Drª. Rosane Christine Hahn”.
CDU – 616.993.19
Índice para Catálogo Sistemático
1.
Paracoccidioides brasiliensis
2.
Fungos – Diagnóstico laboratorial
3.
Exoantígenos – Imunoquímica
4.
Paracoccidioidomicose – Tratamento
5.
Drogas antifúngicas
6.
Virulência – Genes – Análise
“Quando alguém está querendo aprender, o conselho de uma pessoa experiente vale
mais do que anéis de ouro ou jóias de ouro puro...”.
Provérbios 25:12
“Tudo quanto te vier à mão para fazer, faze-o conforme as tuas forças...”
Eclesiastes 9:10
Dedico esta dissertação:
Aos meus queridos pais, David e Áurea. Obrigada por todo amor e por cada esforço que
fizeram por mim! Sou muito feliz por ter sempre recebido o máximo de suas forças, as quais
foram primordiais para que eu chegasse até aqui.
Ao meu esposo Juscelino. Tê-lo ao meu lado foi e continua sendo fundamental para que
eu possa superar os obstáculos de minha jornada. Obrigada pelo apoio e compreensão.
A minha amada tia Nininha, obrigada por todo amor e carinho dedicados durante toda a
minha vida e em especial nos anos em que pude ter a alegria de conviver ao seu lado. Você é
minha inspiração de generosidade, alegria e amor. Adoro você!
A minha orientadora Dra. Rosane Christine Hahn. Muito obrigada pelo exemplo de vida,
pelos sábios conselhos e pela orientação profissional. Agradeço especialmente pela
oportunidade de realizar a pesquisa científica e por transformar a micologia em minha
paixão... Finalizo este trabalho, sentindo uma enorme alegria e satisfação por ter a certeza
que nossa parceria permanecerá... sempre com a perspectiva de promover a saúde e o bem
estar.
Aos meus amigos do LI, Naiana e Ricardo, Sara e Sebastião, Olívia e Katherine, Luciana e
Carmem, Marta e Marilana.
Ao tio Everaldo e às primas Karla, Katt e Kellen pelo companherismo e apoio.
A minha irmã Divaneide, ao Paulo Jr e aos meus sobrinhos Anna Júlia e Davi Henrique.
Ao meu irmão Divanildo pelo cuidado por mim.
À Célia, Amanda, Guilherme, Maricone, Bernadete, Dona Célia e Michael pelo incentivo.
À Marta, Ivan, Mariana e Dona Maria pelo carinho.
A todos meus amigos e familiares que sempre torceram por meu sucesso e aprendizado.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por todas as bênçãos concedidas, especialmente pelas oportunidades e pelas
pessoas maravilhosas que colocou em meu caminho.
A minha orientadora Drª Rosane Christine Hahn, pela confiança depositada em minha
pessoa, pelo desenvolvimento deste trabalho e por proporcionar o ensino micológico, bem como
a pesquisa científica, em nosso estado.
A Universidade Federal de Mato Grosso e ao Hospital Universitário Júlio Müller que
proporcionaram a execução deste trabalho.
A Universidade Federal de Goiás (UFG) – Instituto de Ciências Biológicas - Laboratório
de Biologia Molecular. Agradeço a Drª Célia Maria de Almeida Soares e ao doutorando Clayton
Luiz Borges pelo incondicional apoio e orientação durante as análises relacionadas à virulência
de Paracoccidoides brasiliensis apresentadas neste trabalho.
A UNIFESP – Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia – Laboratório
de Biologia celular. Agradeço ao Dr. Zoilo Pires de Camargo e sua equipe pelo suporte científico
e apoio durante as análises imunoquímicas dos exoantígenos.
Ao Instituto Adolfo Lutz (IAL) – especialmente a seção de Imunologia do serviço de
microbiologia, seção de imunodiagnóstico representadas pela Drª Adriana Moreira e sua equipe.
Muito obrigada pelos ensinamentos e pela dedicação durante meu aprendizado.
Ao Programa de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade
Federal de Mato Grosso (FCM/UFMT), pela oportunidade em conceder-me o mestrado em
Ciências da Saúde e às secretarias da pós-graduação e da FCM.
À Universidade de Cuiabá (UNIC) e ao Hospital Geral Universitário (HGU) em especial a
Profa. Ilza Martha e a Nicolina, Evelin e Janaína Sacco.
Aos meus professores: Dr. Francisco Souto, Dr. Cor Jesus e Drª Elisabeth Duarte, pela
imensa contribuição em meu aprendizado através das disciplinas da pós-graduação.
Aos meus mestres e amigos, Luciana Basili Dias e João Batista Júnior, que me instruíram
no diagnóstico da micologia e do imunodiagnóstico, respectivamente. Obrigada pelo
companheirismo e apoio dispensado a mim.
Aos pós-graduandos Naiana, Ricardo, Sebastião, Sara, Katherine, Olívia Suélem,
Maristela, Marcelo Sepúlveda, Vera, Márcia, Claudinéia, Thiago, Andréia e Adriana pela
parceria, amizade e experiências trocadas. Aos mestres: Gustavo, Marlene e Aparecida. Muito
obrigada pelos agradáveis momentos vividos durante estes anos!
Aos funcionários do Hospital Universitário Júlio Muller (HUJM) em especial à
Farmacêutica – Bioquímica Tomoko Tadano e aos funcionários do Ambulatório III: Maria
Celina, Ana, Lenita, Jaime e Xexel pela colaboração e pela amizade.
Aos médicos infectologistas Kennedy, Giovana Pazin, Soraia Rezende, Zamara e Yvelise.
Aos pacientes que voluntariamente se entregaram a ciência.
A Secretaria Estadual de Saúde do Estado de Mato Grosso, pela parceria e disponibilização
dos exames sorológicos no Estado aos pacientes acometidos por paracoccidioidomicose.
À Coordenação de Aperfeiçoamento em Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro
através da bolsa de mestrado.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT), pelo apoio
financeiro a este trabalho.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho.
i
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% - Porcento
α- Alfa
β - Beta
ºC - Graus Celsius
µg - Micrograma
µL - Microlitro
µm - Micrômetro
cDNA - DNA complementar
CDS - Credit default swap
CEP - Comitê de ética em pesquisa
CIE - Contraimunoeletroforese
CoA - coenzima A
CO2 – Dióxido de carbono
DTT - Dithiothreitol
DEPC – Diethylpyrocarbonate
DNA - Ácido desoxiribonucleico
dNTP - Desoxirribonucleosídeo trifosfato
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA - Enzyme-linked immunosorbent assay
erg9 - Esqualeno sintetase
ESTs - Expressed sequence tags
FC - Fixação de complemento
FCM - Faculdade de Ciências Médicas
g - Gramas
gp - Glicoproteína
gp43 - Glicoproteina de 43 kDa
gp70 - Glicoproteina 70 kDa
HGU - Hospital Geral Universitário
HUJM - Hospital Universitário Júlio Müller
H. capsulatum - Histoplasma capsulatum
HCO3 - bicarbonato
IAL - Instituto Adolfo Lutz
ii
IB - Immunoblot
ID - Imunodifusão dupla
IFI - Imunofluorescência indireta
IFN-γ - Interferon-γ
IgA - Imunoglobulina A
IgE - Imunoglobulina E
IgG -Imunoglobulina G
IgG1 - Imunoglobulina G isotipo 1
IgG2 - Imunoglobulina G isotipo 2
IgM - Imunoglobulina M
IL4 - Interleucina 4
kDa - Kilodalton
L - Litro
LACEN - Laboratório Central de Saúde Pública
LBM - Laboratório de Biologia Molecular
LI - Laboratório de Investigação
M - Molar
mA - Miliamper
MgCL2 – Cloreto de magnésio
MIPS - Munich Information Center for Protein Sequences
mL - Mililitro
mM - Milimolar
mm - Milímetros
MT - Mato Grosso
NK - Células natural killer
oxr1 - Proteína de resistência a oxidação 1
PA - Puro para análise
P. brasiliensis - Paracoccidioides brasiliensis
PCM - Paracoccidioidomicose
PCR - Polymerase chain reaction
pH - Concentração hidrogênio-iônica
PM - Peso molecular
q.s.p. - Quantidade suficiente para
RNA - Ácido ribonucléico
iii
rpm - Rotação por minuto
RNAse - Ribonuclease
RT – Tampão da transcriptase reversa
SDS - Sódio duodecil sulfato
SDS-PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida com sódio duodecil sulfato
SP- São Paulo
Th1 - Linfócitos T auxiliares subpopulação do tipo 1
Th2 - Linfócitos T auxiliares subpopulação do tipo 2
TP - Triplet repeat primed
UFG - Universidade Federal de Goiás
UFMT - Universidade Federal de Mato Grosso
UNIC - Universidade de Cuiabá
UniGenes - Seqüências agrupadas que representam um único gene
V - Volts
Y P D - Yeast Peptone Dextrose
xg - Gravidade
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Perfil eletroforético da análise SDS PAGE dos exoantígenos 31AMS, 11MFC e
29EE.....................................................................................................................................
48
Figura 2
– Immunoblot dos exoantígenos de P. brasiliensis - MT e do controle B339–SP
incubados com anticorpo monoclonal anti-gp43 e com o conjugado anti-IgG de
camundongo marcado com peroxidase...................................................................................
49
Figura 3
– Immunoblot com 8 amostras de soros de pacientes com PCM residentes em
MT (A) e 8 amostras de soros de pacientes com PCM procedentes de SP (B). O
exoantígeno utilizado neste teste foi obtido do isolado 31AMS............................................
49
Figura
4
– Perfil eletroforético do gene oxr1 e controle l34, observados nos isolados de
P. brasiliensis.........................................................................................................................
50
Figura
5
– Perfil eletroforético do gene patatin e controle l34, observados nos isolados de
P. brasiliensis.........................................................................................................................
51
Figura
6
– Perfil eletroforético do gene erg9 e controle l34, observados nos isolados de P.
brasiliensis.............................................................................................................................
51
Figura
7
– Perfil eletroforético do gene anidrase carbônica e controle l34, observados nos
isolados de P. brasiliensis......................................................................................................
51
v
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
–
Identificação e descrição das características dos pacientes e dos
isolados de P.
brasiliensis utilizados para obtenção e caracterização do perfil imunoquímicos de
exoantígenos..............................................................................................................................
33
Tabela 2
–
Identificação e descrição das características dos pacientes e dos
isolados de P.
brasiliensis utilizados na análise da expressão de genes relacionados à
virulência..................................................................................................................................
33
Tabela 3
– Descrição dos oligonucleotídeos selecionados para a RT-PCR.............................
41
Tabela 4
– Resultado da reação de ID, utilizando os três exoantígenos frente a dez soros de
pacientes com PCM procedentes de MT..................................................................................
47
Tabela 5
– Resultado da reação de ID, utilizando os três exoantígenos e dez soros de
pacientes com PCM procedentes de SP....................................................................................
47
Tabela 6
– Descrição dos perfis imunoquímicos dos três exoantígenos (MT)........................
50
Tabela 7
– Análise espectrofotométrica para quantificação da concentração do RNA,
realizada em comprimento de onda igual a 260 e do índice de pureza realizado com
comprimento de onda igual a 320...........................................................................................
50
Tabela 8
– Descrição da expressão gênica relativa à virulência e descrição das principais
características dos isolados de P. brasiliensis procedentes de MT...........................................
52
RESUMO
vii
Mato Grosso é um estado com vocação agropecuária e está localizado em uma região
endêmica para a paracoccidioidomicose. Esta doença é causada pelo fungo dimórfico
Paracoccidioides brasiliensis sendo que a maioria dos pacientes acometidos pertence ao sexo
masculino. Este microrganismo expressa in-vivo importantes genes que provavelmente
contribuem para a patogênese do fungo. Há indícios que Paracoccidioides brasiliensis apresente
peculiaridades regionais e que estas diferenças poderiam ser relevantes quanto aos aspectos
relacionados à: virulência, susceptibilidade a drogas antifúngicas e diferenças imunoquímicas
observadas em exoantígenos. Objetivamos neste estudo determinar o perfil imunoquímico de
exoantígenos obtidos de três isolados clínicos de Paracoccidioides brasiliensis, além de realizar
uma análise preliminar da expressão de quatro genes relacionados à virulência em outros
isolados de Paracoccidioides brasiliensis, recém obtidos de pacientes acometidos por distintas
formas clínicas e caso recidivante de paracoccidioidomicose. O perfil imunoquímico foi
caracterizado pela ausência da gp43 (marcador sorológico) nos exoantígenos obtidos. Embora
tenha sido observada a ausência de gp43, estes exoantígenos apresentaram positividade na reação
de imunodifusão dupla em gel de agarose e pôde ser verificado que a capacidade discriminatória
entre antígeno e anticorpo possivelmente está associada à procedência geográfica dos isolados,
além do alto grau de polimorfismo genético. Os genes selecionados para análise preliminar
foram: oxr1- proteína de resistência à oxidação pelo peróxido de hidrogênio, patatin - proteína
que promove a hidrólise de fosfolipídios; erg9 – esqualeno sintetase, proteína ativa na
biossíntese do ergosterol e anidrase carbônica, envolvida no metabolismo dos ácidos graxos. A
análise por transcriptase reversa da reação em cadeia da polimerase nos possibilitou observar que
os isolados representantes da forma crônica da paracoccidioidomicose apresentaram expressão
para todos os genes testados. O isolado referente ao caso recidivante não apresentou expressão
para patatin. O isolado procedente da forma aguda apresentou somente a expressão gênica da
erg9. Estes resultados serão posteriormente avaliados através da reação em cadeia da polimerase
em tempo real.
ABSTRACT
ix
Mato Grosso State is strongly agrobusiness oriented and is located in a region endemic for
paracoccidioidomycosis. The disease is caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides
brasiliensis and the majority of patients affected are males. This organism expresses important
genes in vivo that probably contribute to its pathogenesis. Indications exist that Paracoccidioides
brasiliensis presents regional peculiarities and the these differences could be relevant regarding
aspects related to virulence, antifungal drug susceptibility and immunohistochemical differences
observed in exoantigens. This study aimed set the immunochemical profiles of three exoantigens
obtained from three Paracoccidioides brasiliensis isolates. The preliminary analyze the
expression of four genes related to virulence in other Paracoccidioides brasiliensis clinical
isolates, recently obtained from patients infected by distinct clinical forms and a case of
paracoccidioidomycosis relapse were also performed. The immunological profile was
characterized by the absence of gp43 (serological marker) in the exoantigens obtained. Although
gp43 absence was observed, these exoantigens presented positive in the double immunodiffusion
reaction on agarose gel; thus verifying that the discriminatory capacity between antigen and
antibody is probably associated with isolate geographical origin, as well as the high degree of
genetic polymorphism. The genes selected for preliminary analysis were: oxr1, a protein that
resists oxidation by hydroperoxide; patatin, a protein that promotes phospholipid hydrolysis;
erg9, squalene synthetase, a protein active in the biosynthesis of ergosterol and carbonic
anhydrase, involved in fatty acid metabolism. Analysis by reverse transcriptase polymerase chain
reaction revealed that isolates representing the chronic form of paracoccidioidomycosis present
expression for all the genes tested. The isolate from the relapse case did not present patatin
expression. The isolate pertaining to the acute form only presented genic expression for erg9.
These results will be evaluated afterwards through the real time.
x
SUMÁRIO
1. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA..............................................................................
1
2. REVISÃO DA LITERATURA........................................................................................
5
2.1. Histórico da Paracoccidioidomicose............................................................................
6
2.2. Paracoccidioidomicose..................................................................................................
7
2.2.1. Aspectos Clínicos......................................................................................................
8
2.2.1.1. Paracoccidioidomicose subclínica.....................................................................
8
2.2.1.2. Paracoccidioidomicose clínica..........................................................................
9
2.3. Resposta Imunológica...................................................................................................
11
2.4. Diagnóstico Laboratorial..............................................................................................
12
2.4.1. Exame micológico direto..........................................................................................
12
2.4.2. Histopatológico.........................................................................................................
13
2.4.3. Isolamento in vitro....................................................................................................
13
2.4.4. Técnicas sorológicas.................................................................................................
14
2.5. Preparação antigênica a partir de Paracoccidioides brasiliensis...............................
16
2.6. Drogas antifúngicas utilizadas no tratamento da Paracoccidioidomicose...............
19
2.6.1. Compostos sulfanilamídicos....................................................................................
19
2.6.2. Polienos......................................................................................................................
19
2.6.3. Derivados azólicos....................................................................................................
20
2.7. Paracoccidioides brasiliensis..........................................................................................
21
2.7.1. Taxonomia ...............................................................................................................
22
2.7.2. Virulência .................................................................................................................
23
3. OBJETIVOS .....................................................................................................................
29
3.1. Objetivo geral ................................................................................................................
30
3.2. Objetivos específicos .....................................................................................................
30
4. METODOLOGIA ............................................................................................................
31
xi
4.1. Considerações éticas......................................................................................................
32
4.2. Isolamento, manutenção e seleção dos isolados de Paracoccidioides brasiliensis.....
32
4.3. Obtenção de exoantígenos de Paracoccidioides brasiliensis........................................
34
4.4. Caracterização imunoquímica dos exoantígenos (MT)..............................................
34
4.4.1. Dosagem proteica.....................................................................................................
34
4.4.2. Imunodifusão dupla em gel de agarose .................................................................
35
4.4.2.1. Amostras utilizadas.............................................................................................
35
4.4.2.2. A técnica de ID....................................................................................................
36
4.4.3. SDS-PAGE................................................................................................................
37
4.4.4. Immunoblot (IB).......................................................................................................
38
4.4.4.1. Determinação do Peso molecular......................................................................
40
4.5. Análise preliminar de genes relacionados à virulência de isolados de
Paracoccidioides brasiliensis .....................................................................................
40
4.5.1. Extração de RNA total.............................................................................................
40
4.5.2.
Descrição dos oligonucleotídeos utilizados na amplificação dos genes
relacionados à virulência.........................................................................................
41
4.6. RT – PCR.......................................................................................................................
42
4.6.1. Síntese da 1ª fita de cDNA.......................................................................................
42
4.6.2. Síntese da 2ª fita de cDNA.......................................................................................
43
4.6.3. Síntese da proteína ribossomal l34.........................................................................
43
4.6.4. Purificação do cDNA................................................................................................
43
4.6.5. Análise dos transcritos através da eletroforese em gel de agarose......................
44
4.6.6. Estabelecimento das condições exponenciais de amplificação dos transcritos
por RT-PCR............................................................................................................
44
4.6.7. Análise dos transcritos referentes aos potenciais genes de virulência de
Paracoccidioides brasiliensis .................................................................................
45
5. RESULTADOS.................................................................................................................
46
5.1. Análise imunoquímica de exoantígenos (MT).............................................................
47
xii
5.1.1. Dosagem proteica......................................................................................................
47
5.1.2. Imunodifusão dupla em gel de agarose..................................................................
47
5.1.3. Análise por SDS – PAGE.........................................................................................
48
5.1.4. Análise do Immunoblot.............................................................................................
48
5.2. Caracterização dos exoantígenos (MT)........................................................................
50
5.3. Análise de transcritos por RT – PCR..........................................................................
50
5.3.1. Análise dos transcritos relacionados à expressão de oxr1....................................
50
5.3.2. Análise dos transcritos relacionados à expressão de patatin................................
51
5.3.3. Análise dos transcritos relacionados à expressão de erg9.....................................
51
5.3.4. Análise da expressão dos transcritos relacionados à anidrase carbônica............
51
5.3.5. Avaliação entre as formas clínicas da PCM e os quatro genes.............................
52
6. DISCUSSÃO......................................................................................................................
53
7. CONCLUSÕES ................................................................................................................
62
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................................
64
9. ANEXOS ..........................................................................................................................
81
1. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
Relevância e Justificativa 2
O fungo Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) é o agente etiológico único da
paracoccidioidomicose (PCM), adquirida através da inalação de esporos da fase miceliana do
fungo, sendo a via respiratória a porta-de-entrada de P. brasiliensis no organismo humano [1, 2].
Estudos moleculares têm sido desenvolvidos para melhor avaliar e compreender as
estratégias que P. brasiliensis desenvolve durante o processo infeccioso no hospedeiro. A Rede
Genoma Centro-Oeste, compreende laboratórios brasileiros que objetivam elucidar os
mecanismos moleculares envolvidos no processo de transição morfológica de P. brasiliensis
(micélio ↔ levedura). Atualmente, tem sido desenvolvido o projeto Transcritoma de P.
brasiliensis, e neste contexto, trabalhos realizados têm apresentado uma visão mais completa do
metabolismo fúngico e das adaptações moleculares que P. brasiliensis desenvolve durante o
dimorfismo [3].
Os fatores de virulência correlacionados ao P. brasiliensis ainda são pouco conhecidos,
porém estes estudos estão descrevendo genes envolvidos em diversos processos biológicos, como
por exemplo, elaboração da resposta ao estresse celular, resistência a drogas, transdução de sinal,
biossíntese de aminoácidos, metabolismo de lipídios, entre outros processos [4-7].
O Laboratório de Investigação (LI - Faculdade de Ciências Médicas da Universidade
Federal de Mato Grosso - FCM/UFMT) integra a Rede Genoma Centro-Oeste, em parceria com o
Laboratório de Biologia Molecular (Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de
Goiás – LBM/UFG) e pretende estudar, dentre outros aspectos os mecanismos associados a
possíveis fatores de virulência e resistência à drogas, tentando estabelecer correlações entre
isolados clínicos de P. brasiliensis.
O Hospital Universitário Júlio Muller (HUJM) e o LI, localizados na capital de MT, atuam
em conjunto e compõem o serviço de referência no estado para o diagnóstico clínico-laboratorial
e tratamento da PCM, respondendo pelos casos demandados do interior e da capital, bem como de
estados vizinhos, especialmente Rondônia.
Relevância e Justificativa 3
Os isolados clínicos de P. brasiliensis obtidos de pacientes procedentes de MT apresentam
possíveis peculiaridades regionais [8, 9]. Preocupados em compreender e mesmo rastrear estas
peculiaridades, julgamos relevante realizar estudos da expressão de genes relacionados à
virulência de P. brasiliensis nestes isolados.
Calcagno e colaboradores [10] registraram pela primeira vez, que os isolados distintos de P.
brasiliensis agruparam-se segundo diferentes procedências geográficas. Posteriormente outros
estudos foram desenvolvidos na tentativa de buscar relações entre procedência geográfica com:
virulência [11], susceptibilidade a drogas antifúngicas [9] e produção de exoantígenos [8]. Até o
momento, não existem evidências que justifiquem a procedência geográfica como fator
responsável pela diferenciação dos isolados. No entanto, julgamos importante avaliar outros
parâmetros, tais como a expressão de alguns genes relacionados à virulência utilizando-se
isolados provenientes de distintas formas clínicas da PCM e presença de quadros recidivantes. Em
MT, o abandono do tratamento é comum e muitos dos pacientes acometidos pela PCM retornam
ou são encaminhados de outros serviços ao HUJM (serviço de referência) apresentando quadros
recidivantes.
Entendemos que a utilização de isolados de P. brasiliensis com poucos subcultivos in vitro,
ou seja, isolados recentes, neste trabalho tenha sido fundamental, pois não há registros na
literatura referentes a esta abordagem. Recentemente Bailão e colaboradores [6] observaram que o
isolado Pb 01 apresentou diferentes expressões gênicas ao ser incubado com plasma humano
(mimetizando a infecção fúngica no homem), mostrando diferenças moleculares entre a infecção
que P. brasiliensis causa no homem e em camundongos.
Assim, objetivamos caracterizar imunoquimicamente três exoantígenos e realizar análises
preliminares da expressão de quatro genes relacionados à virulência em isolados clínicos de P.
brasiliensis no Mato Grosso.
Relevância e Justificativa 4
Até o presente momento, o HUJM não disponibiliza o imunodiagnóstico de micoses
sistêmicas. Freqüentemente os pacientes com diagnóstico clínico e micológico confirmados para
PCM apresentam resultados sorológicos negativos e indivíduos que se encontram na vigência de
tratamento apresentam títulos de anticorpos anti-P. brasiliensis incompatíveis com a evolução da
doença. Acredita-se que estas discrepâncias ocorram devido à baixa reatividade dos antígenos de
referência utilizados frente à resposta imune induzida pelos isolados de P. brasiliensis da nossa
região.
Batista Júnior [8] produziu os primeiros exoantígenos de P. brasiliensis a partir de isolados
clínicos de pacientes acometidos por PCM no MT. A freqüência de positividade para anticorpos
anti-P. brasiliensis nos soros dos 65 pacientes mato-grossenses foi de 92,3% para o exoantígeno
550B (MT) e de 26,2% para o exoantígeno B-339 (SP). Para os 46 soros de pacientes de SP, a
freqüência de positividade foi de 100% com o exoantígeno B-339 e, 41,3% quando o exoantígeno
utilizado foi o 550B. Estes resultados preliminares nos possibilitaram observar diferenças quanto
à reatividade dos soros de pacientes de MT, testados com os exoantígenos obtidos de isolados
clínicos de MT e da cepa referência (B-339) obtidas em SP. Estes resultados, embora importantes
para a compreensão das diferenças antigênicas, não nos permitiram obter a completa
caracterização imunoquímica dos exoantígenos (MT).
À luz dos resultados registrados por Hahn e colaboradores [9] e Batista Júnior [8]
percebemos a necessidade de melhor avaliar o perfil imunoquímico dos exoantígenos (MT) e dar
continuidade à linha de pesquisa intitulada – Imunodiagnóstico de infecções fúngicas, do
laboratório de micologia LI/FCM/UFMT, para que esta contribua com a implantação do
diagnóstico sorológico da PCM no estado de MT, possibilitando eleger um ou mais exoantígenos
destinados ao emprego dos mesmos, na rotina sorológica.
Diante de todo o exposto, ressaltamos a relevância deste estudo, pois Mato Grosso é uma
região
endêmica para PCM no Brasil, com economia basicamente agropecuária.
2.
REVISÃO DA LITERATURA
Revisão da literatura 6
2.1. Histórico da paracoccidioidomicose - PCM
A PCM foi descrita pela primeira vez no Brasil em 1908 por Adolpho Lutz. Os dois
primeiros casos de PCM foram observados em lesões bucais, onde foram encontrados fungos de
natureza dimórfica, entretanto distintos do fungo Coccidioides immitis. Vários estudos foram
desenvolvidos na tentativa de isolar e caracterizar o agente etiológico. Em 1930, Floriano Paulo
de Almeida identificou e estabeleceu as diferenças entre o agente etiológico da PCM e o
Coccidioides immitis, com o qual era freqüentemente confundido [12, 13].
Inicialmente a micose foi denominada como Blastomicose Sul Americana ou Doença de
Lutz-Splendore e Almeida [14]. Em uma reunião de Micologistas do Continente Americano foi
adotado o termo paracoccidioidomicose em 1971, na Colômbia. Foi também acordada a forma
de contágio da micose por inalação dos propágulos infectantes de P. brasiliensis, com
conseqüente lesão primária pulmonar que regridem espontaneamente. O pulmão é o órgão mais
acometido [2, 15].
A distribuição geográfica da PCM apresenta-se restrita aos países da América Latina,
acometendo desde o México até a Argentina. Os países da America do Sul apresentam a maior
prevalência, sendo o Brasil o principal representante, contribuindo com 80% de casos em todo
mundo [16]. Ainda não há relatos de casos autóctones da PCM no Chile, Guiana, Suriname e
Guiana Francesa [17]. Os casos relatados fora da área endêmica são de pacientes que visitaram
ou residiram por algum tempo em um país endêmico [18-24]. Estima-se que mundialmente
aproximadamente 10 milhões de pessoas estejam infectadas com o fungo, das quais 2% podem
desenvolver a doença [25].
Borelli e colaboradores [26] desenvolveram o conceito de “reservárea”, para definir “os
locais onde existem e atuam os fatores que condicionam a infecção”, ou seja, as áreas nas quais
os indivíduos se infectam. Sua identificação é importante e inúmeras tentativas de isolamento do
fungo do solo foram desenvolvidas para a delimitação de nichos ecológicos e na busca de
Revisão da literatura 7
possíveis animais reservatórios ou vetores [27-30]. Além disso, estas áreas estariam delimitadas
por fatores ligados ao ecossistema, tais como altitude, temperatura, regime de chuvas,
características do solo e da vegetação [31].
2.2. Paracoccidioidomicose
A PCM é uma doença dinâmica e polimórfica que apresenta manifestações clínicas
diversas, diferindo em intensidade, extensão, disseminação e características das lesões que
dependem basicamente de alterações da virulência do fungo e de flutuações da resposta
imunológica do hospedeiro [1]. A via de infecção ocorre através da inalação dos microconídeos
propagados pelo ar a partir da fase miceliana [32].
Ao longo das últimas décadas, têm sido observadas notáveis alterações na freqüência, nas
características demográficas da população atingida e na distribuição geográfica da PCM. Embora
não sejam conhecidas todas as causas destas alterações, supõe-se que o aumento da urbanização
e melhoria do diagnóstico mereça destaque como os principais contribuintes. Os fatores
ambientais decorrentes da abertura de novas fronteiras agrícolas, com a derrubada de florestas,
sobretudo nas regiões Centro-Oeste e Norte, atingindo marcadamente a Amazônia, também
contribuíram com o atual panorama da micose [15].
Coutinho e colaboradores [33] apresentaram dados referentes à mortalidade causada pela
PCM em regiões brasileiras no período de 1980 a 1995. A taxa de mortalidade média no Brasil é
de 1,45/milhão de habitantes por ano. A região Sul apresenta a maior taxa média anual de
mortalidade com 2,59/milhão de habitantes, seguida pela região Centro-Oeste com taxa média
anual de mortalidade de 2,35/milhão de habitantes, sendo o Mato Grosso do Sul o responsável
pelo maior coeficiente por milhão de habitantes (4,39) seguido por MT com coeficiente de 3,22
por milhão de habitantes.
Até o momento, existem poucos dados epidemiológicos sobre a real situação da PCM no
MT. Porém, o mesmo vem aparecendo no cenário nacional com alta incidência, e representando
Revisão da literatura 8
uma localização geográfica importante para a aquisição da doença [9]. Nas últimas décadas, a
PCM tem sido freqüentemente diagnosticada em nosso meio. Em revisão de prontuários
realizada no HUJM, foram constatados 440 pacientes atendidos no período de janeiro de 1996 a
setembro de 2006, sendo 96,8% do sexo masculino, com idade variando de 4 a 83 anos (média ±
DP = 43,3 ± 11,8 anos). A maioria (90,1%) desses pacientes foi procedente de MT e 59,2% dos
pacientes apresentaram ocupação relacionada à agricultura e lavoura [34].
2.2.1. Aspectos clínicos
Os propágulos infectantes de P. brasiliensis podem estar em solos, plantas ou água, e a sua
inalação constitui a porta de entrada para PCM [27, 29, 35-40]. Após penetrar em via área
superior, estes propágulos chegam aos alvéolos pulmonares, onde, sob o estímulo da temperatura
se transformam em leveduras e dão início ao processo infeccioso levando a formação do
complexo primário pulmonar [41-43]. Em hospedeiro imunologicamente competente, o
crescimento fúngico pode ser contido, levando a conseqüente regressão espontânea das lesões,
com desaparecimento total ou parcial do fungo. Neste último caso, pode permanecer sob a forma
de foco quiescente e viável [44-46].
De acordo com alguns fatores, como a resposta imune do indivíduo e da virulência de P.
brasiliensis, a doença será classificada em PCM subclínica e PCM clínica.Esta classificação foi
estabelecida em Medellín (1986) e atualmente é a classificação mais utilizada [1].
2.2.2.1. PCM subclínica
É a denominação referente ao período em que a doença se encontra silenciosa, sem sinais
ou sintomas aparentes. Apesar disso, o hospedeiro pode desenvolver resposta imunológica
específica contra o fungo e assim a intradermorreação com paracoccidioidina pode ser positiva.
Nessa fase, podem ocorrer três situações: regressão do foco infeccioso através da destruição do
fungo e formação de cicatrizes estéreis, regressão do foco infeccioso, mas com a manutenção dos
fungos viáveis com foco quiescente ou ainda ocorrer à progressão do foco infeccioso, levando ao
Revisão da literatura 9
aparecimento de sinais e sintomas da doença [2, 47]. Restrepo [48] observou que durante a
infecção ativa, as lesões do tecido do hospedeiro apresentam um elevado número de leveduras,
sendo que aproximadamente um terço destas apresenta múltiplos brotamentos.
2.2.1.2. PCM clínica
Esta forma é caracterizada pelo aparecimento de manifestações clínicas através da
evolução direta do complexo primário (lesão de inoculação e lesões linfáticas associadas), ou da
reativação de algum foco quiescente do complexo primário (re-infecção endógena) ou de re-
infecção exógena após uma infecção prévia [15]. Nesta forma, os tecidos já calcificados durante
a infecção, apresentam células leveduriformes com paredes celulares lesionadas, com contornos
irregulares, brotamentos escassos e as suas células são menores que as usuais [48]. A doença
pode evoluir de dois modos:
A) Forma aguda ou subaguda (tipo juvenil): Esta forma de apresentação clínica é
responsável por 3 a 5% dos casos da doença, predominando em crianças e adolescentes, mas
podendo eventualmente, acometer indivíduos até os 35 anos de idade. Acomete os dois gêneros
sexuais de igual forma. Esta forma clínica caracteriza-se por evolução mais rápida, onde o
paciente geralmente procura o serviço médico entre 4 a 12 semanas de instalação da doença.
Inicia com sintomas de infecção respiratória, porém, no curso da doença, as manifestações mais
óbvias são as do sistema retículo-endotelial. Em menores de 10 anos de idade, os sintomas
compõem um quadro de abdomen agudo, devido aos sinais gerais de infecção e às volumosas
linfadenomegalias mesentéricas; crianças de 10 a 12 anos apresentam quadros septicêmicos e
salientes manifestações ósseas (foco único ou múltiplo); entre 12 e 14 anos, o quadro clínico
simula o de uma septicemia ou linfoma, pelo intenso comprometimento dos linfonodos
superficiais. É presumível que as chamadas formas linfático-abdominais dos jovens que vivem
em áreas de colonização recente no Brasil possam ser incluídas nesta forma clínica. Em ordem
de freqüência, podemos destacar a presença de linfadenomegalia, manifestações digestivas,
Revisão da literatura 10
hepatoesplenomegalia, envolvimento ósteo-articular e lesões cutâneas como as principais formas
de apresentação desta forma da micose [15]. A partir de uma lesão primária, ocorre a rápida
progressão por disseminação linfática e hematogênica ao sistema mononuclear fagocitário (baço,
fígado, linfonodos e medula óssea), com disfunção dos órgãos acometidos, que pode ser
moderada ou intensa.
Na maioria dos casos, a resposta imunológica humoral tende a ser mantida com altos
títulos de anticorpos, enquanto a resposta celular mostra-se intensamente deprimida. Ao exame
histopatológico, observam-se granulomas frouxos com grande número de células leveduriformes
multiplicando-se ativamente [16, 47, 49].
B) Forma crônica (tipo adulto): Esta forma clínica responde por mais de 90% dos
pacientes, e apresenta-se principalmente em adultos entre os 30 e 60 anos, predominantemente,
do sexo masculino. Inicia-se a partir do complexo primário ou de um foco quiescente, a doença
progride lentamente para acometimento pulmonar progressivo ou disseminado (eventualmente
fatal). Clinicamente se manifesta com sintomas de infecção respiratória inespecífica, com curso
subagudo ou crônico, com ou sem remissão e recaídas. Os quadros radiológicos também são
inespecíficos, só tardiamente sugestivos, quando as lesões são bilaterais e ocupam a metade
inferior dos pulmões. A forma disseminada, resulta da reativação de lesão quiescente, com
generalização por via hematogênica. Ocorre em adultos, usualmente homens de mais de 30 anos.
As manifestações podem ser subdivididas em: unifocal ou multifocal
B.1) Unifocal: quando acomete um único órgão ou sistema. Essa forma é habitualmente
verificada nos pulmões, mas, eventualmente, verifica-se envolvimento mucocutâneo isolado
(forma unifocal tegumentar).
B.2) Multifocal: quando ocorre disseminação broncogênica (a partir de foco pulmonar
primário), linfática ou hematogênica. Nesse caso, a infecção torna-se disseminada, atingindo
especialmente o sistema nervoso central, a pele, os intestinos, os ossos, as adrenais e os órgãos
Revisão da literatura 11
genitais. A PCM apresenta um período residual onde se verifica a ausência das células viáveis do
parasito, porém nota-se presença de fibrose resultante do processo inflamatório granulomatoso
crônico que pode provocar várias disfunções sendo dependente do órgão acometido, como por
exemplo, a insuficiência pulmonar, adrenal, renal, e colestase.
A resposta imunológica humoral específica é variável, de acordo com a sua gravidade
clínica. Em relação à forma aguda, a histopatologia demonstra mais granulomas epitelióides
compactos, com menor número de células fúngicas [2, 15, 21, 47, 50].
2.3. Resposta Imunológica
Na PCM observa-se uma extensa variação da resposta imunológica celular. Estudos
demonstram que indivíduos com PCM infecção apresentam intensa resposta linfoproliferativa a
antígenos do fungo, ausência de anticorpos específicos e padrão de resposta T helper 1 (Th1). A
forma crônica da doença apresenta baixos níveis de anticorpos específicos, constituindo uma
resposta imune celular adequada. A forma aguda e disseminada da doença apresenta uma forte
supressão da resposta celular onde os níveis de anticorpos específicos estão elevados e as células
policlonais B estão ativadas [51-53].
A resposta imune mediada por células é o principal mecanismo de defesa contra a infecção
causada pelo P. brasiliensis, envolvendo macrófagos, monócitos, neutrófilos, linfócitos e células
natural killer (NK) [54-56]. A supressão da proliferação de linfócitos e da secreção de citocinas
tipo Th1 em resposta aos antígenos de P. brasiliensis são as principais disfunções imunológicas
descritas nos pacientes acometidos por PCM [57].
A resposta imune humoral, nas diversas formas clínicas da PCM, apresenta uma
exacerbação dos níveis de anticorpos específicos. Tais anticorpos não conferem proteção à
doença e seu aumento sugere a severidade da doença [51, 58]. A forma crônica (unifocal e
multifocal) da PCM apresenta maiores níveis de IgG1 e de anticorpos específicos isotipo IgG2
(regulados por IFN-
γ), quando comparada à forma aguda. Os pacientes que apresentam as
Revisão da literatura 12
formas mais severas da doença, apresentam os maiores níveis séricos da imunoglobulina G
isotipo 4 e de IgE, regulados pela IL-4 que é a citocina padrão T helper 2 [52, 59-61]. Observa-se
também que IgM possui maiores níveis séricos na forma aguda comparadas a forma crônica [62,
63]. A IgA
apresenta elevados níveis séricos, no entanto não observa-se correlação entre o nível
sérico e forma clínica da PCM [52, 57, 59, 64].
Assim a resposta imunológica celular e a formação de lesões granulomatosas, fornecem
uma resposta protetora máxima através da migração, diferenciação e ativação de macrófagos
contra os patógenos intracelulares [65]. Esse aspecto é particularmente importante para P.
brasiliensis, uma vez que esse fungo pode se apresentar como um patógeno intracelular
facultativo, capaz de sobreviver e se replicar no interior de células epiteliais e de macrófagos
murinos e humanos não ativados [56, 66].
2.4. Diagnóstico Laboratorial
É realizado através do isolamento e identificação de P. brasiliensis a partir do exame
microscópio direto, cultura ou exame histopatológico. A identificação do parasito em tecidos
constitui método diagnóstico de grande relevância para o uso clínico. A pesquisa de anticorpos
anti-Paracoccidioides, através de exames sorológicos, tem sido uma ferramenta importante no
prognóstico dessa micose, principalmente no que tange ao acompanhamento da resposta dos
pacientes ao tratamento [2, 21, 47].
O diagnóstico laboratorial das micoses se fundamenta no estudo de uma amostra obtida da
lesão. Nela deve ser visualizado o agente etiológico em sua forma parasitária ou invasiva, ao
exame microscópico e, demonstrada a presenτa do fungo, por seu isolamento e identificação em
substratos apropriados [50].
2.4.1. Exame micológico direto
É realizado através da visualização, em microscópio óptico, de elementos esféricos de
parede birefringentes medindo de 5 a 10 até 40 µm ou mais de diâmetro, apresentando um ou
Revisão da literatura 13
mais brotamentos, que se ligam à célula-mãe por fina ponte citoplasmática, a partir do preparo de
lâminas contendo material biológico como: secreções, raspados de lesões, escarro, lavado
brônquico ou broncoalveolar, pus e tecido biopsiado pelo método da potassa (onde são
fragmentados em pequenas partes sendo em seguida transferidos para em lâmina de vidro que é
recorberto com solução de KOH a 20%, após a digestão química das células é então realizada a
pesquisa em microscopia óptica para identificar as estruturas fúngicas) [2, 15, 50, 67].
2.4.2. Histopatológico
Os cortes histológicos devem ser corados com hematoxilina e eosina e por técnica de
impregnação de prata que permite a visualização de estruturas fúngicas patognomônicas. O
multibrotamento característico nem sempre pode ser observado, porém em cortes corados ao
Grocott, este modo de multiplicação é bem evidente. Com esta coloração é possível observar-se
elementos com dezenas de brotamentos de 1 a 2 µm de diâmetro, surgindo em toda a periferia do
fungo [47, 50].
2.4.3. Isolamento in vitro
Consegue-se o isolamento em cultura do fungo através da inoculação do material biológico
em meios de culturas específicos e por sua incubação em estufas reguladas a temperatura de
35°C e 23ºC, por até 40 dias, sendo o fungo caracterizado pelo dimorfismo.
De crescimento muito lento, as colônias filamentosas evidenciam-se 20 dias ou mais após a
semeadura em meio de Sabouraud-glicose 2%. Aveludadas ou algodoadas, são compostas de
uma trama de hifas e por vezes clamidoconídios. A fase leveduriforme é facilmente obtida,
bastando incubar o cultivo a 35°C; as colônias, então, de consistência cremosa, de cor creme-
clara, são compostas de conglomerados de elementos esféricos grandes e multibrotantes, com
número variável de brotos em elementos leveduriformes de tamanho muito variável. Os meios
utilizados no isolamento de P. brasiliensis são: Mycosel, Fava-Netto e Sabouraud Dextrose Agar
acrescido de cloranfenicol (100 mg/L). A adição do cloranfenicol ao meio Sabouraud Dextrose
Revisão da literatura 14
Agar objetiva inibir o crescimento bacteriano de materiais biológicos contaminados, como por
exemplo, o escarro [2, 47, 50].
2.4.4. Técnicas Sorológicas
Tem sido muito importante para o diagnóstico rápido da PCM a detecção de anticorpos
específicos anti-P. brasiliensis nos soros dos pacientes, constituindo um dos principais
indicadores diagnósticos da PCM, aparecendo em alguns casos, como a primeira indicação da
doença fúngica, especialmente nos indivíduos com lesões em órgãos internos e naqueles que
ainda não apresentam sinais clínicos aparentes [2]. Os testes sorológicos mais empregados para
confirmação da PCM são: imunodifusão dupla em gel de agarose (ID) [68-70];
imunofluorescência indireta (IFI) [71-73]; contraimunoleletroforese (CIE) [74, 75]; ensaios
imunoenzimáticos como ELISA, que são mais rápidos e mais indicados para grandes
quantidades de soros, porém com maior exigência na padronização e interpretação dos resultados
positivos [68, 76]; e ensaios tipo immunoblot (IB), os quais permitem especificar os tipos de
anticorpos séricos contra os diversos determinantes antigênicos do fungo [76, 77].
Utilizando-se técnicas padronizadas e antígenos adequados, estes testes apresentam
sensibilidade entre 85% e 100%. O título de anticorpos específicos anti-P. brasiliensis apresenta
correlação com a gravidade das formas clínicas, sendo mais elevado na forma aguda-subaguda
da doença. Casos de PCM com resultados falso-negativos, observados com quaisquer dos testes
citados acima, na maioria das vezes se associam com lesões muito localizadas e com hospedeiros
imunodeprimidos. Reações falso-positivas podem ocorrer com soros de pacientes acometidos por
histoplasmose e aspergilose [15].
O primeiro teste amplamente utilizado no diagnóstico e acompanhamento de pacientes
com PCM foi a fixação de complemento, desenvolvido por Moses em 1916, empregando extrato
de P. brasiliensis em salina como antígeno [2].
Revisão da literatura 15
Atualmente a ID é o principal método de diagnóstico sorológico da PCM, tendo em vista a
maior simplicidade do teste, ausência da utilização de equipamentos de maior custo, os valores
de sensibilidade e especificidade superiores a 80% e a 90%, respectivamente, e finalmente pela
experiência acumulada nas últimas décadas [15].
A ID foi primeiramente utilizada no diagnóstico da PCM por Ferri em 1961. Esta técnica
permite que os clínicos realizem o acompanhamento sorológico dos pacientes, verificando a
diminuição dos títulos de anticorpos circulantes anti-P. brasiliensis, possibilitando também
avaliar a eficácia do tratamento anti-fúngico [77-80]. Os resultados da ID podem variar devido a
diferentes parâmetros entre os quais podemos citar: a preparação antigênica utilizada, a forma da
doença e o início do tratamento [81].
Del Negro e colaboradores [75] ao avaliarem a eficácia de diferentes provas sorológicas
empregando como antígeno filtrado de cultura, demonstraram que 95,3% dos soros de pacientes
com PCM apresentaram sorologia positiva pela prova de ID. Ao avaliarem o padrão de
reatividade destes soros pela prova de fixação do complemento, verificaram que 50% dos soros
não apresentaram reatividade ou apresentaram títulos de anticorpos circulantes anti-P.
brasiliensis próximos ao ponto de corte avaliados com o filtrado de cultura.
As técnicas imunoenzimáticas do tipo western blot ou IB possuem alta sensibilidade e
foram empregadas originalmente para caracterizar a resposta imune humoral aos antígenos de P.
brasiliensis [80, 82, 83]. Atualmente têm sido empregadas para comprovar a positividade da
PCM quando os testes de ID e/ou de CIE apresentarem-se falso-negativos [84].
Segundo Mendes-Giannini e colaboradores [85] a determinação da resposta IgG anti-gp 43
é utilizada não apenas para o diagnóstico confirmatório da PCM, mas também como uma forma
de acompanhar a eficácia da terapêutica antifúngica prescrita. Empregando-se provas mais
sensíveis como os ensaios imunoenzimáticos, verifica-se que todos os pacientes apresentam
anticorpos circulantes anti-gp43 no momento do diagnóstico clínico. Pacientes com a forma
Revisão da literatura 16
aguda da doença possuem índices elevados de IgG. Anticorpos da classe IgM anti-gp43 estão
presentes em 100 % dos pacientes portadores da forma aguda e em apenas 46,6% dos pacientes
com a forma crônica. Tem-se observado que a detecção de anticorpos circulantes anti-gp43
diminui com a melhora clínica promovida pelo uso de medicamentos específicos.
Os ensaios imunoenzimáticos da PCM são práticos e sensíveis, porém apresentam
reatividade cruzada com outras doenças, principalmente quando testados com os soros de
pacientes acometidos por histoplasmose, aspergilose, candidíase e doença de Jorge Lobo.
Recentemente, vem apresentando reatividade com soros de pessoas aparentemente sadias,
residentes em áreas endêmicas para PCM [81, 86-88]. A procura por determinantes antigênicos
purificados, visando excluir o problema da reatividade cruzada, tem sido objeto de pesquisa de
diferentes grupos envolvidos no estudo da PCM. Estes incluem a gp 43 e a fração de 70 kDa [80,
86, 89-91].
2.5. Preparações antigênicas a partir de Paracoccidioides brasiliensis
Os componentes antigênicos têm sido desenvolvidos a partir de ambas as fases de P.
brasiliensis, para serem utilizados no diagnóstico sorológico da PCM. Estes componentes são
muito variáveis quanto à qualidade, pois são dependentes da metodologia, do isolado de P.
brasiliensis, da fase morfológica do fungo, do tamanho inicial do inóculo, do meio de cultura e
do tempo de incubação que foram utilizados durante a sua produção [68, 92, 93]. As preparações
antigênicas ou antígenos de P. brasiliensis podem ser classificados segundo metodologia
utilizada em sua obtenção, sendo descritos quatro tipos: antígenos exocelulares ou metabólicos
ou filtrados de cultura [70, 94, 95], antígenos intracelulares ou somáticos ou citoplasmáticos [93,
96-99], antígenos de parede celular [100] e frações antigênicas purificadas [89, 101-104].
Camargo e colaboradores em 1988 [70] propuseram um protocolo para produção de
exoantígeno a partir do isolado leveduriforme de P. brasiliensis B-339, a ser empregado como
antígeno de referência na ID para o imunodiagnóstico da PCM. Estes autores monitoraram a
Revisão da literatura 17
curva de crescimento e, determinaram as melhores condições de crescimento para a fase de
levedura do isolado B-339, a fim de correlacioná-la com a secreção de gp43.
Em 2003, Camargo e colaboradores [68] propuseram a simplificação do protocolo descrito
em 1988 (produção de exoantígenos) para que os pequenos laboratórios latino-americanos
pudessem executar esta metodologia sem muito dispêndio financeiro. Análise dos exoantígenos
por western blot demonstrou a presença das frações antigênicas: 70, 52, 43 e 20-21 kDa, porém
quando comparados aos soros de pacientes portadores de PCM, somente a fração de 43kDa
apresentou alta reatividade com os anticorpos da classe IgG, sendo reconhecida por 100% destes
soros [68, 105].
A glicoproteína 43 kDa é considerada o componente antigênico específico de P.
brasiliensis e foi assim descrita pela primeira vez em por Puccia e colaboradores [106], após
observar que a fração 1, do antígeno E2, era a única fração reagente frente aos soros de pacientes
com PCM. Para melhor avaliá-la, esta fração foi eluída em coluna de afinidade empregando-se
lectina, os componentes obtidos desta eluição foram analisados por eletroforese em gel de
poliacrilamida com sódio duodecil sulfato e apresentaram as frações com os seguintes pesos
moleculares: 43, 55 e 70 kDa [102]. Porém, foi verificado que a fração antigênica de 43 kDa
descrita por Puccia e colaboradores [102] tratava-se do mesmo componente específico da banda
1 observado anteriormente por Restrepo [107] e compartilhavam os mesmos componentes
antigênicos do antígeno específico E descrita por Yarzabal e colaboradores [108].
A SDS-PAGE revela a grande complexibilidade de frações proteicas existentes nas
diferentes preparações antigênicas de P. brasiliensis, principalmente quando se usam amostras
fúngicas e meios de cultura distintos para a obtenção dos mesmos [109-113].
Apesar da gp43 ser considerada a fração antigênica dominante, Del Negro e colaboradores
[84] relatam a perda da reatividade do componente de 43 kDa de P. brasiliensis em teste de ID.
Uma das hipóteses para este fato, seria a existência de isoformas distintas na molécula de 43 kDa
Revisão da literatura 18
[114]. Souza e colaboradores [115] sugeriram que epítopos expressos pela molécula gp43 tem
diferentes maneiras de serem dispostos em sua conformação espacial não sendo uniformes em
todas as amostras de P. brasiliensis.
Em outro estudo foi observado que a expressão de gp43 não é constante e que a sua
secreção não é dependente dos clones de culturas de P. brasiliensis. Verificou-se que os clones
secretaram quantidades muito variáveis de gp43, alguns nem mesmo a secretaram. Os autores
acreditam que este fenômeno é devido a algum problema ocorrente a nível molecular no
mecanismo que regula a expressão da molécula de 43 kDa [116].
Estes estudos nos indicam a importância de avaliar não só a gp43, mas outras
glicoproteínas que tem se demonstrado importantes para o imunodiagnóstico da PCM como as
glicoproteínas: 70 kDa [80, 94, 105], 45 kDa e 48 kDa [109], 58 kDa [117], 27 kDa [118-120],
27 kDa associada a 87 kDa [104] e a 160 kDa [121].
Da Silva [122] avaliou a estabilidade de distintas preparações antigênicas que foram
armazenadas a 4ºC por até 15 anos. O autor observou que embora estas preparações tenham sido
estocadas por longos períodos, elas apresentaram um resultado semelhante a preparações mais
recentes e que estas continuaram apresentando as frações antigênicas 43 e 70 kDa. Este resultado
demonstra que mesmo após 15 anos as preparações antigênicas mantiveram-se estáveis.
Apesar das tentativas de padronização dos antígenos e das metodologias para a execução
da sorologia para PCM, ainda não há um consenso para estabelecer qual é o melhor protocolo a
ser utilizado na obtenção de antígenos e realização da reação de ID. Este fato gera preocupações,
pois as diferenças, existentes entre os protocolos, interferem diretamente na sensibilidade e
especificidade da técnica de ID [122], o que dificulta a correlação do diagnóstico clínico-
laboratorial e o acompanhamento da evolução da doença dos pacientes. Esforços estão sendo
desenvolvidos pelo Ministério da Saúde objetivando a padronização de um único antígeno para a
Revisão da literatura 19
execução dos exames de ID nos LACENS na tentativa de minimizar estes problemas (Moreira-
Vicentini, comunicação pessoal 2007).
2.6. Drogas antifúngicas utilizadas no tratamento da
paracoccidioidomicose
Existem três principais classes de drogas que são eficazes contra o P. brasiliensis:
2.6.1. Compostos sulfanilamídicos
São os compostos mais empregados na terapia da PCM por apresentar um baixo custo. É
importante salientar que estes compostos sulfanilamídicos são classificados como
antimicrobianos e não como antifúngicos, porém são usualmente empregados na terapia da PCM
por apresentar uma provável ação fungistática. O mecanismo de ação destes fármacos está
fundamentado na antagonização do ácido para-aminobenzóico e inibição da síntese do ácido
fólico do fungo. A associação com o trimetoprim aumenta a atividade fungistática dos
sulfanilamídicos, pois o trimetoprim atua sinergicamente na inibição da síntese de ácido fólico
da célula fúngica. O sulfametoxazol + trimetoprim (400mg + 80mg respectivamente) apresenta
uma larga e favorável experiência no tratamento da PCM com posologia inicial de 2
comprimidos a cada 8 horas, sendo mantida até a regressão dos sintomas. Após este período a
posologia é reduzida para 2 comprimidos a cada 12 horas sendo mantida por até 3 anos. O
insucesso terapêutico desta classe de drogas se deve principalmente a falta de aderência à
medicação, uma vez que o período para a cura clínica é muito longo. Pacientes virgens de
tratamento que aderem corretamente à terapia atingem em média 70% de cura clínica [47].
2.6.2. Polienos
A anfotericina B, a principal droga poliênica, tem como mecanismo de ação primária a
ligação aos esteróis de membrana, possuindo maior afinidade pelo ergosterol. Esta interação
resulta na alteração da permeabilidade da membrana, levando à formação de poros com
conseqüente perda de sódio, potássio e outros constituintes citoplasmáticos, causando
normalmente a morte da célula fúngica [123]. A anfotericina B produz freqüentes efeitos
Revisão da literatura 20
adversos, relacionados à infusão e aos efeitos tardios, por apresentar toxicidade celular e tecidual
[124].
Aparentemente a anfotericina B é o antifúngico mais eficaz contra P. brasiliensis, sendo
raros os pacientes que não melhoram significativamente em poucas semanas. A meta do
tratamento da anfotericina B é atingir a dose cumulativa de 2000mg (ou 30mg/Kg de peso) sendo
administrado diariamente de 0,7 a 1mg/Kg de peso. O uso clínico da anfotericina B é limitado
pelos efeitos adversos e pela via de administração que ainda é exclusivamente a endovenosa.
Portanto, ela é mais empregada em casos de infecções fúngicas mais invasivas e especialmente
nos pacientes imunossuprimidos [47, 125].
2.6.3. Derivados azólicos
As drogas azólicas são quimioterápicos que bloqueiam as enzimas do citocromo P-450 de
fungos impedindo a demetilação do lanosterol e conseqüentemente, a síntese do ergosterol,
danificando a membrana citoplasmática do fungo. Estas drogas vêm emergindo como uma
alternativa ao uso da anfotericina B, uma vez que apresentam menor toxicidade, espectro de ação
mais amplo e melhores propriedades farmacocinéticas [47, 126, 127].
Os derivados azólicos, especialmente o cetoconazol, apresentam toxicidade seletiva devido
à interação entre o citocromo P-450 do homem e seus constituintes farmacológicos. Os
triazólicos, itraconazol e fluconazol apresentam menor toxicidade por apresentar uma ligação
mais específica ao citocromo P-450 do fungo, demonstrando pouca ou nenhuma interação com o
sistema enzimático humano [128-130].
A terapêutica com o cetoconazol, empregado no tratamento da PCM, tem sua duração
variando de 6 meses a 24 meses e a dose de ataque para adultos é diária, com 400mg via oral em
ingestão única, até a diminuição significativa dos sintomas, sendo então neste momento reduzida
a dosagem para 200mg ao dia. Em 15% dos pacientes pode ocorrer falha terapêutica ou
reativação tardia das lesões [47, 125].
Revisão da literatura 21
O itraconazol é um derivado triazólico altamente lipofílico e insolúvel em água [126, 130].
Em comparação com os outros azólicos, tem maior afinidade pelas enzimas do citocromo P-450
dos fungos, além de possuir maior espectro antifúngico, melhor perfil farmacocinético e menor
toxicidade. Apresenta altas taxas de cura no curso de 6 a 12 meses e poucas recidivas, a
posologia utilizada na PCM varia de 100 a 200mg/dia via oral e apresenta absorção dependente
de ácido gástrico [2, 47].
O fluconazol é um composto triazólico que possui notável atividade antifúngica. É um
fármaco muito hidrossolúvel e uma de suas principais características é a elevada penetração nos
líquidos biológicos de todo o organismo. Seu uso na PCM é limitado, apresenta alto custo,
porém boa eficácia, poucas recidivas e raras falhas no tratamento. A posologia para PCM varia
de 200 – 400 mg/dia, administrados via oral, por no mínimo 6 meses. A dose de ataque pode ser
de 600mg/dia via oral ou via endovenosa com doses de 200 a 400 mg/dia Efeitos colaterais são
raros e geralmente ocorrem em nível hepático e gastrointestinal [123, 131, 132].
2.7. Paracoccidioides brasiliensis
P. brasiliensis, agente etiológico da PCM, é um fungo termo-dimórfico que se apresenta
sob forma miceliana a temperatura ambiente (23 a 28º C) e sob a fase leveduriforme em
temperatura média de 35º C [15, 97, 133, 134].
A fase miceliana apresenta hifas delgadas, hialinas, com comprimento variável e podem
apresentar propágulos infectantes [2, 12, 15]. Macroscopicamente, as colônias são de
consistência firme e irregulares que se aderem ao ágar, possuem coloração branca e seus
micélios são aéreos e curtos. Ao microscópio óptico, são observadas hifas hialinas, delgadas e
septadas, [16, 135, 136]. Ao microscópio eletrônico, as hifas apresentam um envoltório celular
constituído de três camadas: uma interna, a membrana plasmática; uma camada mais espessa; a
parede celular e uma camada mais externa de aspecto finamente granular; a membrana basal. As
hifas são multinucleadas, com fina cromatina dispersa no nucleoplasma. No citoplasma podem
Revisão da literatura 22
ser vistos ribossomos, mitocôndrias esféricas ou alongadas, retículo endoplasmático e vacúolos
[137].
A fase leveduriforme apresenta os seguintes aspectos macroscópicos: coloração creme,
aspecto cerebriforme, e não adere ao meio; apresenta um evidente crescimento após sete dias de
incubação a 37° C [47, 138]. Estas leveduras são esféricas ou ovais, exibem paredes bem
definidas, bi-refringentes, aparentemente duplas, que podem apresentar brotamento multipolar
característico (forma de roda de leme). O citoplasma contém escasso retículo endoplasmático
[16], gotas de lipídios proeminentes, ribossomos e mitocôndrias, as quais são reduzidas com a
idade e pela vacuolização citoplasmática [16, 47].
A parede celular dos fungos é composta essencialmente por carboidratos (quitina e
glucana), glicoproteínas, proteínas e lipídios que são essenciais para a viabilidade do
microrganismo, pois protegem as células fúngicas do meio externo [139]. Em P. brasiliensis, a
composição da parede celular varia entre as diferentes formas. A forma de levedura possui uma
maior quantidade de quitina (37 a 48%) e lipídios (11%) quando comparada à forma miceliana,
sendo 7 a 18% de quitina e 8% de lipídios. Em contrapartida, a parede celular da forma
miceliana é mais rica em proteínas (24 a 41%), enquanto a parede das leveduras possui apenas 7
a 14% de constituintes proteicos [2, 140, 141].
2.7.1. Taxonomia
Atualmente apenas a forma imperfeita do fungo é conhecida (anamórfica), pertence à
seguinte categoria taxonômica: divisão Eukaryota, reino Fungi, filo Ascomycota, classe
Pleomycetes, ordem Onigenales, família Onygeneceae, gênero Paracoccidioides e espécie
brasiliensis. Um estágio teleomórfico, ainda não foi determinado dificultando o conhecimento da
biologia do fungo por análise genética clássica [142-146].
Revisão da literatura 23
P. brasiliensis apresenta quatro ou cinco cromossomos que variam entre 2–10 Mb. O
tamanho estimado para o genoma de P. brasiliensis é de 23–30 Mb, indicando que P.
brasiliensis possui entre 10.000 a 15.000 genes [147, 148].
2.7.2. Virulência
A virulência é descrita como um evento altamente complexo, resultante da expressão de
múltiplos genes em diferentes estágios da infecção e cuja conseqüência poderia estar fortemente
associada ao estabelecimento da patogênese. Qualquer fator que contribua para a adaptação do
microrganismo nesse ambiente pode ser percebido como um determinante de virulência [149,
150].
Ao invadir o hospedeiro, os conídios de P. brasiliensis são expostos ao aumento da
temperatura, o que promove a sua transição morfológica, passando a assumir a forma de
levedura. A fase leveduriforme apresenta vantagem patogênica, acredita-se que por apresentar
forma mais compacta que a fase miceliana, ela consegue se replicar no interior dos macrófagos
com mais facilidade [151].
Durante a infecção por P. brasiliensis, a imunidade celular corresponde ao principal
mecanismo de defesa do hospedeiro. Células fagocíticas ativadas são fungicidas e leveduras que
escapam da destruição suscitam resposta inflamatória granulomatosa. A formação de granulomas
compactos colabora para a contenção do fungo e evita sua disseminação. O desencadeamento de
uma resposta imune celular adequada, caracterizada pela produção de citocinas de padrão Th1 e
formação de granulomas compactos é protetora na infecção por P. brasiliensis [152].
Os mecanismos de virulência de P. brasiliensis incluem também algumas estratégias para
combater as defesas pulmonares do hospedeiro. Nos alvéolos pulmonares existem macrófagos
que removem aproximadamente 95% de microrganismos e partículas estranhas através da
fagocitose, digestão pelas enzimas lisossomais e, pela produção de espécies reativas de oxigênio
e de nitrogênio. Para que P. brasiliensis consiga se instalar no hospedeiro, ele precisa
Revisão da literatura 24
desenvolver mecanismos de escape para a fagocitose, pela inativação dos macrófagos ou pela
redução da opsonização pelos componentes solúveis [151].
Leveduras de P. brasiliensis foram visualizadas no interior de macrófagos alveolares
durante a infecção pulmonar experimental em camundongos. As interações de P. brasiliensis
com células hospedeiras (células Vero), têm sido investigadas através de experimentos in vitro
que demonstram a adesão de P. brasiliensis às células epiteliais, seguida de endocitose. A
aderência é mediada por diferentes proteínas, sendo as principais representantes as proteínas de
massas moleculares de 30 e 43 kDa. Para que a endocitose de P. brasiliensis ocorra é necessário
que as células epiteliais estejam intactas (especificamente os microfilamentos e microtubulos) e
que o mecanismo de apoptose celular esteja ativo. Os receptores e as adesinas que se ligam ao P.
brasiliensis, ainda não estão bem definidos [153].
A fase parasitária de P. brasiliensis pode ser intra ou extracelular. Isto indica que P.
brasiliensis pode sobreviver e se replicar dentro de fagossomos de macrófagos não-ativos.
Tavares e colaboradores [154], avaliaram a primeira resposta transcricional de P. brasiliensis ao
ambiente peritoneal de macrófagos murinos, a fim de elucidar os mecanismos usados por P.
brasiliensis para sobreviver dentro de células fagocitóticas, locais onde as concentrações de
aminoácidos e outros nutrientes estão relativamente baixos. Estes pesquisadores puderam
observar a expressão de genes associados à síntese da parede celular, limitação de aminoácidos e
de glicose, associada ao estresse oxidativo. Estes resultados refletem a plasticidade transcricional
de P. brasiliensis em responder ao ambiente hostil macrofágico, onde este provavelmente
desenvolve sua adaptação e sobrevivência.
Os estudos moleculares estão sendo desenvolvidos para definir os fatores relacionados à
virulência de P. brasiliensis, atualmente os principais candidatos são: os constituintes da parede
celular (quitina, α-1,3-glucana e β-1,3-glucana), a proteína ligante de estrógeno e o antígeno
extracelular gp43, além do dimorfismo, da termotolerância, da aderência aos tecidos do
Revisão da literatura 25
hospedeiro e da produção enzimática do fungo. Ainda, vale destacar os fatores que são
relacionados ao hospedeiro, como idade, sexo, estado nutricional, patrimônio genético e
competência imune e os fatores relacionados às condições ambientais [155].
Para que o fungo consiga sobreviver no ambiente hostil, ele precisa desenvolver vias
metabólicas alternativas, como a remodelagem e síntese da parede celular, biossíntese de
lipídeos, aminoácidos entre outras [141].
Atualmente foram descritos vários genes relacionados à virulência de P. brasiliensis,
entretanto a grande maioria está descrita apenas como genes candidatos a fatores de virulência
[151] e para consultá-los pode-se utilizar as ferramentas da bioinformática que armazenam dados
em bancos genômicos on line, sendo os principais bancos representados pelo GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e o (https://dna.biomol.unb.br/Pb/). Para avaliar as seqüências
gênicas, ainda não disponíveis nos bancos genômicos, deve-se comparar suas sequências com: a
base de dados do National Center for Biotechnology Information
(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/), com o Gene Ontology (http://www.geneontology.org/GO)
e com o InterPro (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/) que avalia a seqüência gênica e as agrupa
de acordo com suas características. Em seguida, utiliza-se o Munich Information Center for
Protein Sequences - MIPS (http://mips.gsf.de/) que é centro de informações para seqüências
proteicas. O KEGG, Kyoto of Gene and Genomes (http://www.kegg.com/) é útil para designar
enzimas e as suas vias metabólicas. Resumidamente, apresentamos os principais recursos de
bioinformática disponíveis e os passos necessários para realizar uma análise gênica [7, 151, 156-
158].
Ainda há poucos padrões de expressão de genes depositados em bancos genômicos para P.
brasiliensis, o que dificulta a comparação e a identificação de genes de virulência. Vale lembrar
que P. brasiliensis é um fungo fastidioso e que as observações, quanto aos aspectos referentes à
expressão gênica puderam ser realizadas através da comparação inicial com modelos existentes
Revisão da literatura 26
para outros fungos dimórficos e de outras leveduras, como as do gênero Candida e
Cryptococcus. Estudos moleculares estão possibilitando compreender os mecanismos da
patogenicidade de. P. brasiliensis, porém há muitas hipóteses a serem esclarecidas sobre este
microrganismo [151].
Felipe e colaboradores [3] analisaram os perfis transcricionais de P. brasiliensis durante a
fase miceliana, na transição morfológica e na fase de levedura. Eles estudaram aproximadamente
80% do genoma de P. brasiliensis (6022 ESTs) e separaram cDNA de cada fase e avaliaram a
micro organização da membrana fúngica. Eles identificaram 58 genes expressos na fase
miceliana, 328 genes diferencialmente expressos durante a transição de fase e 270 genes na fase
de levedura. Estes genes, super expressos, puderam ser relacionados ao ciclo celular, a resposta
ao estresse, à resistência a drogas e a transdução de sinal para algumas vias metabólicas.
A expressão gênica de P. brasiliensis (fase leveduriforme) foi avaliada em distintas
situações: infectando camundongos e incubando as células fúngicas em sangue humano, para
mimetizar os eventos hematológicos que ocorrem durante a sua disseminação no organismo.
Estes autores puderam observar que in vivo os genes relacionados à aquisição de ferro, síntese de
melanina e células de defesa, apresentaram-se super expressos. Já na análise in vitro foi
observada a super expressão dos genes relacionados à remodelagem e síntese da parede celular,
degradação de ácidos graxos, síntese proteica, fatores de osmolaridade e células de defesa
revelando o seu potencial papel no processo infeccioso [6, 157].
Bastos e colaboradores [158] descreveram novos genes de P. brasiliensis os quais foram
inseridos no banco genômico. Estes novos genes estavam super expressos na transição de
micélio a levedura e apresentaram atividade relacionada ao dimorfismo. Foram detectados 34
genes com função de remodelagem e síntese da parede e membrana fúngica, sendo que 10 genes
foram relacionados à transdução de sinal. Foram identificados também 12 fatores que codificam
Revisão da literatura 27
supostos genes de virulência na fase de transição morfológica, sugerindo a adaptação no
hospedeiro.
Costa e colaboradores [7] mimetizaram o processo infeccioso em camundongos a fim de
identificar novos genes de P. brasiliensis. Foi observado um total de 3184 ESTs descritas no
transcritoma de levedura e micélio de P. brasiliensis. Destes, 1172 ESTs estavam relacionadas
ao processo infeccioso. Foram identificadas pela primeira vez 659 seqüências UniGene que
foram avaliadas e, relacionadas a atividades de glicólise, biossíntese de aminoácidos e
metabolismo de esterol e lipídios. Os genes patatin; esqualeno sintetase – erg9 e anidrase
carbônica foram descritas pela primeira vez neste trabalho e apresentaram um nível elevado de
expressão. A proteína da resistência a oxidação – oxr1 também foi dectectada como super
expressa neste trabalho, porém já havia sido inserida no banco genômico de P. brasiliensis
anteriormente.
Mediante resultados obtidos por Costa e colaboradores, estes quatro genes foram
selecionados para serem avaliados neste trabalho utilizando isolados clínicos de P. brasiliensis,
recentes e com características clínicas distintas. As principais características e funções destas
proteínas são:
A oxr1 está envolvida no mecanismo de proteção da célula fúngica aos danos causados
pela atividade oxidativa por peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio atua na
degradação dos microrganismos [159]. O ânion superóxido é produzido em abundância pelas
células fagocitárias, compreendendo a primeira espécie reativa de oxigênio gerada no fagossomo
[160]. A produção de peróxido de hidrogênio está relacionada com a resistência em algumas
infecções, como tuberculose [161] e leishmaniose [162]. Em P. brasiliensis foi observada
expressão gênica desta proteína após infecção in vivo [7].
Patatin, uma proteína com suposta atividade fosfolipase A, está relacionada à hidrólise de
fosfolipídios que por sua vez está relacionada com o metabolismo de lipídeos. A relação com o
Revisão da literatura 28
metabolismo lipídico demonstra um importante mecanismo de virulência de P. brasiliensis, pois
durante a transição morfológica acontecem múltiplas mudanças na composição lipídica da
membrana plasmática, o que induz a sua reorganização e remodelação [163].
A erg9 atua catalisando a primeira fase da biossíntese do esterol. O ergosterol é o mais
importante esterol da membrana fúngica e seu aumento influi diretamente no fluxo e
permeabilidade das membranas, sugerindo que durante a infecção a super expressão de erg9
induz a alteração na composição da membrana fúngica [164-169].
Estudos têm demonstrado que a anidrase carbônica está envolvida na biossíntese dos
ácidos graxos de Cryptococcus neoformans [170]. Sabe-se que a anidrase carbônica é
responsável por gerar bicarbonato (HCO
3
) para a síntese da malonil-CoA para acetil CoA
carboxilase, a qual é uma enzima chave no metabolismo dos ácidos graxos e o ápice desta síntese
ocorre mediante a abundância de carboidratos e energia. O aumento do RNA mensageiro da
anidrase carbônica pode ser refletida nos altos níveis de CO
2
do tecido hospedeiro. Em mutantes
de Candida albicans, a anidrase carbônica não induz a formação de hifas verdadeiras em
resposta à alta concentração de CO
2
, uma condição indutora de filamentação [171]. A anidrase
carbônica também foi descrita como importante enzima na produção de bicarbonato, o qual é
sintetizado sempre que o meio apresentar baixas concentrações de CO
2
. Nestas situações, ocorre
a difusão do CO
2
para o interior da célula que é hidratado e se transforma em bicarbonato. O
bicarbonato é um precursor da via metabólica do cAMP. Este mecanismo foi descrito por
Mogensen e colaboradores [172] ao estudar o fungo Cryptococcus neoformans.
Assim, consideramos importante conhecermos a expressão gênica dos isolados de P.
brasiliensis obtidos de distintas formas clínicas da PCM para verificar se existem possíveis
diferenças entre a forma clínica da PCM em relação aos genes relacionados à virulência e
regionalidade dos isolados.
3. OBJETIVOS
Objetivos 30
3.1. Objetivo geral
Caracterizar imunoquimicamente três exoantígenos e realizar análises preliminares da
expressão de quatro genes relacionados à virulência em isolados clínicos de P. brasiliensis no
Mato Grosso.
3.2. Objetivos específicos
3.2.1. Obter e caracterizar imunoquimicamente três exoantígenos (MT) através das
técnicas de dosagem proteica, ID, SDS-PAGE e IB.
3.2.2. Verificar possíveis diferenças quanto à positividade em reações de ID face ao
emprego de soros procedentes dos estados de MT e SP.
3.2.3. Avaliar quatro isolados clínicos de P. brasiliensis, sendo pelo menos um isolado da
forma aguda e um caso recidivante de PCM, para verificar se há expressão dos genes patatin,
oxr1, erg9 e anidrase carbônica.
3.2.4. Verificar possíveis diferenças em relação à expressão destes genes considerando
formas clínicas distintas e caso recidivante da PCM.
4. METODOLOGIA
Metodologia 32
Nosso estudo pode ser caracterizado como descritivo de fenômeno biológico. Todos os
isolados foram obtidos de pacientes residentes em MT, atendidos no HUJM, após confirmação
da PCM através do isolamento de P. brasiliensis in vitro em meios de cultura, a saber:
Sabouraud Dextrose Agar, Mycosel e Fava-Netto. Foram utilizados os seguintes isolados:
38MHC, 28MND, 32AGC, 35JAA, 31AMS, 11MFC e 29EE. Somente o isolado 38MHC foi
obtido de um paciente acometido pela forma aguda da PCM. Já o isolado 32AGC foi o único
obtido de paciente caso recidivante da PCM.
O isolado B-339 foi obtido por Splendore e Almeida de paciente também acometido pela
forma crônica da doença, procedência brasileira, tendo sido enviado ao CDC-USA sob nº B-339,
e cedido à Drª Angela Restrepo, da Corporación de Investigaciones Biológicas (CIB), Medellín,
Colômbia, que, gentilmente, redistribuiu aos pesquisadores da América Latina. Este isolado foi
considerado referência devido ao fato de produzir exuberantes concentrações de exoantígenos
em curto intervalo de incubação [92]; pelos altos valores de sensibilidade e especificidade
apresentados (90 e 100% respectivamente) em testes de imunodifusão com exoantígenos obtidos
desse isolado; e finalmente, por expressar excelentes quantidades do componente antigênico
gp43 kDa, que é reconhecido por 100% dos soros dos pacientes acometidos por PCM [70, 92].
4.1. Considerações éticas
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HUJM, conforme Termo
de Aprovação Ética de Projeto de Pesquisa nº 390/CEP/HUJM/07, expedido em 08 de agosto de
2007 (anexo A).
4.2. Isolamento, manutenção e seleção dos isolados de Paracoccidoides
brasiliensis
Os isolados P. brasiliensis eleitos para a obtenção exoantígenos de foram distintos
daqueles utilizados na análise preliminar da expressão gênica.
Metodologia 33
Para a obtenção dos exoantígenos, os isolados deveriam apresentar características
macroscópicas favoráveis, como boa expansão de massa fúngica e colônias cerebriformes após
cinco dias de incubação a 35º C. Para tanto, os isolados necessitaram de maior tempo de cultivo
in vitro. A tabela 1 descreve os isolados empregados na obtenção de exoantígenos.
Porém, para a avaliação da expressão gênica foram selecionados isolados recentes, a fim
de afastar as possíveis alterações que P. brasiliensis possa desenvolver durante sua adaptação ao
subcultivo in vitro. Foram selecionados quatro isolados clínicos de P. brasiliensis sendo dois
isolados obtidos de pacientes acometidos pela forma crônica da PCM, um isolado referente à
forma aguda e um isolado obtido de caso recidivante da PCM. Foi utilizado também o isolado de
P. brasiliensis, Pb 01 como o controle positivo para a reação. A tabela 2 apresenta a relação dos
isolados selecionados para a análise da expressão gênica.
Após o isolamento das colônias de P. brasiliensis in vitro as amostras foram inseridas na
coleção de P. brasiliensis do laboratório de micologia do LI/FCM/UFMT e subcultivados em
intervalos de 7 a 15 dias, em meio de cultura Fava Netto, incubados a 35ºC em estufa Biological
Oxygen Demand. A fórmula e modo de preparo do meio Fava-Netto estão descritas no Anexo B.
Amostras de
P. brasiliensis
Material Clínico Sexo Idade Caso recidivante Forma clínica
31AMS Raspado de mucosa oral M 44 a Não Crônica
11MFC Raspado de mucosa oral M 41 a Não Crônica
29EE Lavado broncoalveolar M 68 a Não informado Crônica
Isolados de P.
brasiliensis
Material Clínico Sexo Idade Caso recidivante Forma clínica
38MHC Aspirado ganglionar M 3 a Não Aguda
28MND Aspirado ganglionar M 38 a Não Crônica
32AGC Secreção ganglionar M 25 a Sim Crônica
35JAA Aspirado ganglionar M 50 a Não Crônica
Tabela 1. Identificação e descrição das características dos pacientes e dos isolados de
P. brasiliensis utilizados para obtenção e caracterização do perfil imunoquímicos de
exoantígenos
Tabela 2. Identificação e descrição das características dos pacientes e dos isolados de P.
brasiliensis utilizados na análise da expressão de genes relacionados à virulência.
Metodologia 34
4.3. Obtenção de exoantígenos de Paracoccidioides brasiliensis
Foram utilizados os três isolados clínicos de P. brasiliensis. A produção de exoantígeno foi
iniciada pela seleção de dois tubos de cada isolado de P. brasiliensis com crescimento de cinco
dias em temperatura de 35ºC. Foi realizado o pré-inóculo através da transferência das células de
P. brasiliensis para um erlenmeyer (250 mL) com 20 mL de caldo YPD (Anexo B) que foi
incubado (35ºC e agitação de 50 rpm) durante três dias.
Após esse período foi realizado o inóculo, através da completa transferência do pré-inóculo
para outro erlenmeyer (500 mL) contendo 200 mL de caldo YPD, o qual foi incubado novamente
a 35º C e sob agitação de 50 rpm por um período de sete dias.
As células de P. brasiliensis foram então inativadas pela adição de timerosal (0,2 g/L) no
inóculo que foi mantido em repouso por 48 horas a 4º C. Após este período foi realizada a
filtragem da cultura. O filtrado obtido foi concentrado aproximadamente 100 vezes em aparelho
de evaporação rotativo a vácuo, sob temperatura de 40º C.
Após ter reduzido o volume inicial do filtrado em aproximadamente cem vezes, o
concentrado foi dialisado contra água destilada em membrana com ponto de corte de 12 kDa por
48 horas sob 4º C com trocas no banho de diálise a cada 8 - 12 horas. Somente então a
preparação antigênica foi finalizada. A metodologia utilizada na produção de exoantígenos foi
descrita por Camargo e colaboradores [68].
4.4. Caracterização imunoquímica dos exoantígenos (MT)
As concentrações proteicas dos exoantígenos foram dosadas e em seguida os três
exoantígenos foram caracterizados quanto aos perfis imunoquímico através das técnicas de ID,
SDS-PAGE e IB.
4.4.1. Dosagem proteica
Camargo e colaboradores [68] verificaram que para ser utilizado em testes de ID, um
exoantígeno deve apresentar uma concentração proteica igual ou superior a 350
µg/mL e que há
Metodologia 35
grandes variações na concentração proteica de exoantígenos, variando de 150 µg/mL a 900µg/mL.
Os exoantígenos que apresentarem concentrações inferiores a 350 µg/mL deverão ser
concentrados para aumento da concentração de proteínas.
As concentrações proteicas dos exoantígenos foram dosadas pelo micrométodo
colorimétrico de Bradford [173]. Foram utilizados, a solução padrão de proteína (soro albumina
bovina) em concentrações de 10 a 100 µg/mL e o corante de Comassie Brilliant Blue G-250
(fórmulas descritas no Anexo D).
Foram distribuídas alíquotas de 4, 8, 12, 16 e 20 µL da solução padrão nos orifícios das
microplacas (fundo chato). Nos orifícios subseqüentes foi adicionada uma alíquota de 10, 15 e
20 µL de cada exoantígeno nos quais foi adicionada água bidestilada em quantidade suficiente
para completar o volume de 20 µL.
O branco da reação foi o composto por 20 µL de água bidestilada. Não houve
necessidade de usar nenhum outro componente (ex., caldo YPD) na elaboração do branco, uma
vez que os exoantígenos haviam sido dialisados. Foram adicionados 200 µL do corante
Comassie Brilliant Blue G-250 em todos os orifícios da placa e levados para o leitor de ELISA
(filtro 620 nm).
A concentração proteica de cada exoantígeno foi determinada através da leitura das
absorbâncias e da análise da curva padrão (Absorbâncias x concentração de proteínas).
O princípio desta dosagem é a ligação que ocorre entre as proteínas com o corante, que
ao se ligarem promovem uma alteração na cor da solução.
4.4.2. Imunodifusão Dupla em gel de agarose (ID)
4.4.2.1. Amostras utilizadas
Foram testados os exoantígenos de P. brasiliensis com os seguintes soros:
Dez amostras de soros de pacientes com PCM residentes em MT, colhidos anteriormente
durante o projeto “Seguimento Sorológico dos pacientes acometidos por paracoccidioidomicose
Metodologia 36
no estado de Mato Grosso” (aprovação nº 154/CEP/HUJM/04, expedido em 12 de maio de 2004)
ou durante este projeto (aprovação no CEP/HUJM, expedido em 08 de agosto de 2007). Os soros
foram colhidos e armazenados a - 20º C no Laboratório de Micologia do LI/FCM/UFMT.
Dez amostras de soros de pacientes com PCM residentes em SP que foram demandados ao
Laboratório de Biologia Celular – Universidade Federal de São Paulo.
4.4.2.2. Técnica de ID
A técnica de ID utilizada neste trabalho foi descrita por Camargo e colaboradores [70],
baseada na técnica clássica de Ouchterlony [174].
Foram recobertas lâminas de vidro (26 x 76 mm) com 3 mL de gel de agarose a 1%. Após
a solidificação, o gel foi perfurado com um molde específico que produziu um orifício central
onde foram aplicados 10 µL do exoantígeno e outros seis orifícios periféricos que foram
aplicados 10 µL dos soros avaliados. Estes foram incubados em câmara úmida por 24 horas, à
temperatura ambiente.
Transcorrido o intervalo de 24 horas, foi realizada a lavagem com a solução de citrato de
sódio 5% sob agitação orbital de 50 rpm, durante 1 hora. A solução citrato foi substituída pela
solução salina 0,85% que foi mantida sob mesma agitação durante 24 horas com várias trocas.
As lâminas foram então envoltas em papel de filtro umedecido e colocadas para secar em estufa
à 35º C durante 24 horas.
As lâminas foram coradas com o corante Comassie Blue Brillant R-250 (Anexo D) com
auxílio de agitador orbital durante 5 minutos e foram descoradas na solução diluente do corante
(Anexo D) em agitação durante 15 minutos.
Os resultados foram revelados através da presença ou ausência de bandas
imunoprecipitadas entre os orifícios, central e periférico.
Metodologia 37
4.4.3. SDS-PAGE
A análise de SDS-PAGE utilizada neste trabalho foi proposta por Laemmli [175], com gel
de separação linear a 10% e gel de empilhamento a 3% de acrilamida com espessura de 1,0 mm;
empregando equipamento Mini-Protean II Electrophoresis Cell (Bio-Rad Laboratories, Inc.,
Hercules, Califórnia, USA). O gel de poliacrilamida foi montado no sistema de eletroforese e os
reagentes utilizados no preparo do gel de separação linear a 10% de acrilamida foram:
Solução Estoque de Bis-acrilamida 5,3 mL
Lower Buffer 4,0 mL
Temed 25 µL
APS 12,5 µL
Água Mill-q 6,7 mL
Após a polimerização do gel de separação linear a 10% de acrilamida, foi preparado o gel
de empilhamento a 3% de acrilamida com os seguintes reagentes:
Solução Estoque de Bis-acrilamida 0,8 mL
Upper Buffer 1,25 mL
Temed 15 µL
APS 5 µL
Água Mill-q 2,95 mL
O gel de empilhamento a 3% de acrilamida foi adicionado sobre o gel de separação linear,
foi em seguida colocado um pente formador de poços no sistema que foi mantido em repouso a
temperatura ambiente até a completa polimerização.
Foram aliquotadas 2 µg de proteína de cada exoantígeno obtidos e diluídos separadamente
em tampão de amostra. Foi adicionado β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich Co.,St. Louis,
Missouri, USA) a 5% nas amostras e foram aquecidas durante três minutos a 100ºC a fim de que
as proteínas se denaturassem.
Para cada corrida eletroforética foi utilizado padrão de baixo peso molecular (PM),
composto de: MBP-b-galactosidase (175.000 Da), MBP paramiosina (83.000 Da), desidrogenase
glutâmica (62.000 Da), aldolase (47.500 Da), triose-fosfato-isomerase (32.500 Da), b-
Metodologia 38
lactoglobulina A 88 (25.000 Da), lisozima (16.500 Da) e aprotinina (6.500 Da) (New England
Biolabs Inc., Woburn, Massachussetts, USA).
Com a cuba de eletroforese preparada com o tampão de corrida e logo após aquecimento
das amostras e do peso molecular padrão, estas foram aplicadas em cada poço do gel. A corrida
eletroforética foi realizada a 100 V e com a fonte Hoefer Power supply, modelo SX 250, Hoefer
Pharmacia Biotech Inc., São Francisco, Califórnia, USA. Após a corrida, o gel foi retirado do
sistema de eletroforese e foi submetido ao processo de coloração pelo Comassie Azul Brilhante.
Todas as soluções utilizadas durante a metodologia de SDS-PAGE estão descritas no
Anexo D.
4.4.4. Immunoblot (IB)
O IB é um método que identifica antígenos proteicos através do reconhecimento e ligação
com os anticorpos mono ou policlonais específicos. A técnica é baseada na transferência
eletroforética das proteínas para uma membrana de nitrocelulose, que é incubada com um
anticorpo primário que, por sua vez, se liga ao antígeno proteico, formando um complexo
antígeno-anticorpo. Os anticorpos secundários conjugados a enzimas são adicionados aos
complexos antígeno-anticorpo que os reconhecem e promovem a alteração de cor, quando
adicionados o substrato específico da enzima sendo então possível identificar o antígeno
desejado [175, 176].
Os exoantígenos foram submetidos a uma nova corrida por SDS-PAGE, para promover a
separação unidimensional dos compostos proteicos em um gel de acrilamida a 10%. Após a
separação eletroforética, os géis foram apostos sobre membrana de nitrocelulose 0,22µm
(Sigma-Aldrich Co.,St. Louis, Missouri, USA) de forma a não deixar bolhas; foram recobertos
com papel de filtro e com esponjas de poliuretano que foram encaixadas e prensadas nas placas
acrílicas. Todos estes materiais foram previamentes umedecidos em tampão de transferência (25
mM de Tris-HCl, 192 mM de Glicina e 20% de metanol, v/v).
Metodologia 39
As placas acrílicas foram imersas na cuba de eletroforese que estavam preenchidas com
tampão de transferência e foi iniciada a eletroforese em banho de gelo e sob amperagem
constante de 150 mA por três horas, no equipamento Trans-Blot System (Bio-Rad Laboratories,
Inc., Hercules, Califórnia, USA). Após a transferência, a membrana foi corada com Ponceau-S
(Sigma-Aldrich Co.,St. Louis, Missouri, USA) por 10 minutos e descoradas em água bidestilada
para verificar a eficácia do processo. Cada amostra de exoantígeno teve suas frações proteicas
impregnadas na membrana e estas foram recortadas em tiras, identificadas e incubadas com PBS
(pH 7,4) e leite desnatado (5%), durante uma hora à temperatura ambiente e em plataforma
agitadora para blot (Bioficina-Indústria e Comércio de Aparelhos Laboratoriais São Paulo-
Brasil) a fim de terem os sítios inespecíficos saturados.
As fitas de nitrocelulose foram então acondicionadas em canaletas e incubadas (sob mesmas
condições anteriores) durante duas horas com o 1 mL de anticorpo policlonal anti-exoantígeno de
P. brasiliensis que foi diluído previamente em tampão PBS (pH 7,4) na proporção de 1:100. As
fitas de nitrocelulose foram então acondicionadas em canaletas e incubadas (sob mesmas
condições anteriores) durante duas horas com 1mL de anticorpo específico. Em seguida as fitas de
nitrocelulose foram submetidas a seis incubações de dez minutos em solução PBS e Tween 20
(0,1 %) para lavagens.
Foram incubadas novamente com soro anti-IgG conjugado à peroxidase espécie-específico
(Sigma-Aldrich Co.,St. Louis, Missouri, USA), diluído a 1:1000 por duas horas sob agitação, ao
abrigo da luz e a temperatura ambiente. As fitas foram lavadas seis vezes em imersões de 10
minutos na solução PBS-T (Sigma-Aldrich Co.,St. Louis, Missouri, USA). Foi adicionado a
solução 4-cloro-1naftol e 5-Bromo-4Chloro-3-Indolyphosphate (BCIP) (Sigma-Aldrich Co.,St.
Louis, Missouri, USA) que foi responsável pela produção de cor na fita. O bloqueio desta reação
foi realizado pelas lavagens sucessivas em água bidestilada.
Metodologia 40
4.4.4.1. Determinação do Peso molecular
Os pesos moleculares das bandas proteicas foram determinados colocando as distâncias em
mm da migração de cada padrão ou amostra na curva de calibração construída com os padrões de
PM (New England Biolabs Inc., Woburn, Massachussetts, USA). A curva foi traçada em papel
monolog, colocando-se os valores dos padrões de PM no eixo das ordenadas e os valores
calculados no eixo das abscissas.
4.5. Análise preliminar de genes relacionados à virulência de isolados de
Paracoccidioides brasiliensis
4.5.1. Extração de RNA total
Foram selecionados quatro tubos de cada isolado de P. brasiliensis na forma de levedura
que estavam incubadas por sete dias em meio de cultura Fava Netto. Foi transferida toda a massa
fúngica de cada isolado para um tubo Falcon previamente identificado e em seguida foi
adicionada água Milli-Q na proporção de 5 a 10 vezes o volume de massa fúngica obtida. A
seguir centrifugou-se por 10 minutos a 5º C e 600xg. Foi desprezado todo o sobrenadante e
adicionado 3,5 mL de Trizol (Invitrogen) para cada 1,5 mL de amostra fúngica.
Pérolas de vidro foram adicionadas, em igual proporção ao volume inicial de célula
fúngica e em seguida foi agitado em vórtex durante 20 minutos mantendo-se esta solução em
repouso por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida a mesma foi centrifugada durante
10 minutos (2 - 8º C, 600xg). A fase superior foi transferida para um novo tubo e foi adicionado
0,2 mL de clorofórmio para cada 0,75 mL de Trizol recuperado, sendo a mistura agitada
vigorosamente em vórtex por 5 minutos. O material foi mantido em repouso à temperatura
ambiente por 10 minutos e centrifugado por 15 minutos (2 - 8º C, 600xg). Após aspiração, com
pipeta, da fase superior do centrifugado, a mesma foi adicionada em outro falcon que continha a
mesma proporção de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico 25:24:1 (GE Healthcare). Esta nova
Metodologia 41
mistura foi agitada gentilmente e em seguida a solução repousou em temperatura ambiente por
10 minutos.
Após este tempo, foi centrifugada por 15 minutos a 600xg (2 - 8º C), procedeu-se a
precipitação do RNA, sendo a fase superior transferida para outro falcon com adição de 0,25 mL
da solução de citrato de sódio 0,4 M, cloreto de Sódio 0,8 M e Isopropanol para cada 0,75 mL de
Trizol inicial. A mistura foi agitada gentilmente e mantida em repouso por 10 minutos à
temperatura ambiente. Posteriormente foi centrifugada por 30 minutos (2 - 8º C, 600xg) sendo
desprezado o sobrenadante.
Em seguida foi adicionado 1mL de Etanol a 75% para cada 0,75 mL de Trizol inicial e a
solução foi centrifugada por 05 minutos (2 - 8º C, 600xg) descartando-se o sobrenadande. O
RNA precipitado foi colocado para secar e após esta etapa, foi ressuspenso em água bidestilada
tratada com diethylpyrocarbonate - DEPC. O RNA extraído foi mantido em gelo e estocado a –
70 ºC. A concentração e o índice de pureza do RNA de cada isolado foram quantificados por
espectrofotometria.
4.5.2. Descrição dos oligonucleotídeos utilizados na amplificação dos genes
relacionados à virulência
Foram selecionados oligonucleotídeos específicos para os potenciais fatores de virulência
identificados no transcriptoma de P. brasiliensis, que foram descritos na tabela 3. A proteína
ribossomal l34 foi utilizada como controle para análise da expressão gênica.
Nome da sequência Primer sense (5’
3’) Primer antisense (5’
3’)
Tamanho do
produto
amplificado
Patatin
GGATCATGTGTCTGCGCTAC GGGAAGAGATCGATTTGAGG 468
Proteína de resistência à oxidação 1
(oxr1)
TCCCAGTCCGAATCTCAATC CTGCTCGCAAATGCCTTACA 410
Esqualeno sintetase (erg9)
GCTGACTATTGCCGAAAGG GTTCGAGGGTTGCAATGGC 460
Anidrase carbônica
ACACGGGACGAAAGCACTAT AAACCTGCTGGCATTGTGGC 322
Proteína Ribosomal l34 (l34)
ATTCCTGCCCTCCGACCC CCCGCCATTCTCGTCCCGC 750
Tabela 3. Descrição dos oligonucleotídeos selecionados para a RT-PCR
Metodologia 42
4.6. RT-PCR
Foram sintetizadas fitas de DNA complementar (cDNA) dos quatro isolados clínicos de P.
brasiliensis.
4.6.1. Síntese da 1ª Fita do cDNA
Foram utilizados 2 µg de RNA (diluídos em 4 µL de água Milli-Q) e 2 µL do iniciador
CDS 10 pmol para a amplificação de cada isolado, a qual foi realizada através da incubação
durante 2 minutos a 72º C. Imediatamente foi adicionada 12,6 µL da mix da 1ª Fita (descrição
abaixo) e foram incubados novamente por uma hora e meia a 42º C. Após esse período, a reação
foi interrompida adicionando-se 80 µl de TE (10 mM TRIS e 1 mM de EDTA) por 7 minutos a
72° C.
Mix da 1ª Fita:
Iniciador cDNA Smart 10pmol 2µL
TP primeira fita 5X 4µL
dNTP 10mM 2µL
RNA out 40U/uL 1µL
RT 200 U/uL 2µL
DTT 100mM 0,4µL
MgCl
2
50mM 1,2µL
4.6.2. Síntese da 2ª Fita do cDNA
Foram adicionados 3µL da 1ªfita de cDNA à mix da 2ª fita.
Mix da 2ª Fita:
TP PCR 10X da HiFi 1µL
dNTP 10mM 2µL
iniciador PCR II 10 pmol 2µL
Taq HiFi 50U/µL 2µL
MgCl
2
50mM da HiFi 5µL
Agua Milli-Q 76,5µL
Metodologia 43
As condições de amplificação para a síntese da 2ª fita foram: 95° C por 1 minuto; 95° C
por 15 segundos, 55° C por 30 segundos, por 40 ciclos, 68° C por 5 minutos; 68° C por 5
minutos e 4°C por 18 horas.
4.6.3. Síntese da proteína ribossomal l34
Foi realizada uma reação de PCR com 2 µg de cada amostra de cDNA e quantidades
suficientes de mix ribossomal foram adicionadas até atingir o volume total de 25µL.
Mix – Ribossomal:
TP PCR 10X da platinum 2,5µL
dNTP 2,5mM 2µL
Iniciador L34 Sense 50mM. 0,5µL
Iniciador L34 Antisense 50mM 0,5µL
Taq platinum 5U/µL 0,2µL
MgCl
2
50mM 1µL
Agua Milli-Q 17,25µL
A termociclagem foi realizada sob as seguintes condições: 94° C por 2 minutos, seguidos
de 94° C por 45 segundos, 58° C por 45 segundos, por 30 ciclos, 72° C por 45 segundos e 72° C
por 7 minutos.
4.6.4. Purificação do cDNA
Após a síntese da segunda fita, foi realizada a purificação dos cDNAs através de
cromatografia. Foram adicionados 500 µL de tampão de captura na coluna GFX (GE Healthcare)
e em seguida foi adicionado todo o volume do cDNA 2ªfita. Após homogeneização, o material
foi centrifugado por 30 segundos a 11.000xg. Foi desprezado o líquido do tubo coletor e
montada novamente a coluna GFX. Após adição de 500 µL do wash buffer na GFX, o material
foi novamente centrifugado por 30 segundos. O tubo coletor foi então desprezado e um
microtubo de 1,5 mL foi encaixado na coluna GFX. Foram adicionados 50 µL de água Milli-Q
sobre o filtro da GFX e este foi incubado durante 1 minuto à temperatura ambiente. Foi
centrifugado por 1 minuto a 11.000xg e em seguida o cDNA foi então transferido para um
microtubo menor e sua concentração foi quantificada através da espectrofotometria.
Metodologia 44
4.6.5. Análise dos transcritos através da eletroforese em gel de agarose
O gel de agarose na concentração desejada foi feito em tampão TEB 0,5X sendo
empregado o corante brometo de etídeo na concentração final de 0,5 µg/mL. As amostras a
serem analisadas foram preparadas adicionando-se tampão de amostra para uma concentração
final de 1X. Após a aplicação das amostras, o gel foi submetido à eletroforese em tampão de
corrida TEB 0,5X utilizando-se uma voltagem de aproximadamente 5 V/cm. A visualização dos
produtos da amplificação foi realizada através de transluminador de luz ultravioleta (UV). As
soluções, utilizados na eletroforese em gel de agarose, estão descritos no anexo C.
4.6.6. Estabelecimento das condições exponenciais de amplificação dos transcritos por
RT-PCR
Determinou-se o número de ciclos correspondente à fase exponencial de amplificação e o
número ideal de ciclos adotado foi o mesmo para a amplificação do gene em estudo e do controle
interno. Foi realizada uma reação de PCR utilizando-se os pares de oligonucleotídeos para
amplificação dos genes oxr1, patatin, erg9 e anidrase carbônica; e do gene controle l34 em uma
alíquota correspondente a 2 µg do RNA total de P. brasiliensis.
Com o objetivo de identificar a ciclagem ideal para cada oligonucleotídeo, foi realizada
uma PCR com diferentes ciclos para cada enzima (oxr1, patatin, erg9 e anidrase carbônica). Foi
preparada uma mix para cada ciclo, utilizando-se as seguintes proporções:
Mix para ciclagem das enzimas:
Controle de cDNA 2µg
TP PCR 10X 2,5µL
dNTP 2,5mM 2µL
MgCl
2
50mM 1µL
Agua Milli-Q 17,25µL
Oligo Sense específico* 0,5µL
Oligo Antisense específico* 0,5µL
Taq platinum 5U/µL 0,2µL
*
realizado com: oxr1, patatin, erg9 e anidrase
carbônica
Metodologia 45
Foram testados quatro diferentes programas para cada gene, variando com relação ao
número de ciclos utilizados para amplificação. Assim, após um ciclo de denaturação a 94°C por
2 minutos, 94°C por 45 segundos, 58°C por 45 segundos por 10-25 ciclos de amplificação, 72°C
por 45 segunds, finalizando com 72°C por 7 minutos. O resultado da PCR foi analisado por
eletroforese em gel de agarose 1,5%.
4.6.7. Análise dos transcritos referentes aos potenciais genes de virulência de
Paracoccidioides brasiliensis
Foram realizadas amplificações dos genes oxr1, patatin, erg9 e anidrase carbônica, com
2µg de cada cDNA dos isolados de P. brasiliensis com a mix para expressão.
Mix para expressão
TP PCR 10X 2,5µL
dNTP 2,5mM 2µL
Iniciador Sense* 0,5µL
Iniciador Antisense* 0,5µL
Taq platinum 5U/µL 0,2µL
MgCl
2
50mM 1µL
Agua Milli-Q 17,25µL
As condições de amplificação foram: 94°C por 2 minutos, a 94°C por 45 segundos, 58°C
por 45 segundos, sendo os ciclos regulados para oxr1 e patatin em 22 ciclos; erg9 em 20 ciclos e
anidrase carbônica em 17 ciclos; 72°C por 45 segundos, finalizando a 72°C por 7 minutos.
As amplificações da RT-PCR foram reveladas na eletroforese em gel de agarose à 1,5%.
*
realizado com: oxr1, patatin, erg9 e anidrase carbônica
5. RESULTADOS
Resultados 47
5.1. Análise imunoquímica de exoantígenos (MT)
Foram obtidos três exoantígenos dos isolados clínicos de P. brasiliensis, 31AMS, 11MFC
e 29EE.
5.1.1. Dosagens proteicas
O isolado 31AMS apresentou a concentração de 640 µg/mL, o isolado 29EE apresentou a
concentração de 520 µg/mL. Somente o isolado 11MFC apresentou uma baixa concentração
proteica, apresentando valor igual a 180µg/mL.
5.1.2. Imunodifusão dupla em gel de agarose
A tabela 4 apresenta os resultados obtidos utilizando-se a técnica de ID. Foram utilizados
os exoantígenos (MT) e os soros de pacientes acometidos por PCM residentes no MT.
Os resultados da reação de ID com os soros de pacientes acometidos por PCM residentes
em SP e com os exoantígenos (MT) estão apresentados na tabela 5.
Exoantígenos
Soros humanos com PCM procedentes de MT
Positividade
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
31AMS + - + + - - + - - - 40%
11MFC + - + + - - - + - - 40%
29EE - - - - - - + + + + 40%
Exoantígenos
Soros humanos com PCM procedentes de SP
Positividade
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
31AMS + + - - + - - - - - 30%
11MFC - - - - + - - - - - 10%
29EE + + + - - - - - - - 30%
Tabela 5. Resultado da técnica de ID, utilizando os três exoantígenos e dez soros
de pacientes com PCM procedentes de SP.
Tabela 4. Resultado da técnica de ID, utilizando os três exoantígenos frente a dez
soros de pacientes com PCM procedentes de MT.
Resultados 48
5.1.3. Análise por SDS-PAGE
A figura 1 apresenta os resultados obtidos por SDS-PAGE referente aos três exoantígenos,
os quais apresentaram a gp50 como principal molécula. O exoantígeno 29EE evidenciou um
antígeno de alto peso molecular, (130 kDa). O exoantígeno 31AMS apresentou o maior número
de frações - 18 moléculas de pesos moleculares de 20 a 130 kDa.
5.1.4. Análise do Immunoblot
A figura 2, apresenta o resultado da análise de IB, dos três exoantígenos incubados com o
anticorpo primário (anticorpo monoclonal anti-gp43) e com o anticorpo secundário (anti-IgG de
camundongo marcado com peroxidase). A ausência de imunoprecipitados nos três exoantígenos
demonstra a ausência de gp43.
Os resultados da técnica de IB, obtidos com a utilização do exoantígeno de P. brasiliensis
31AMS e soros de pacientes acometidos pela PCM, foram apresentados na figura 3. A imagem
A, refere-se ao resultado de IB utilizando soros de pacientes residentes em MT e a imagem B
Figura 1. Perfil eletroforético da análise
SDS-PAGE dos exoantígenos 31AMS,
11MFC e 29EE.
Resultados 49
refere-se à avaliação dos soros de pacientes residentes em SP. Nenhum antígeno foi reconhecido
pelos soros dos pacientes acometidos por PCM residentes em MT e em SP.
Figura 3. Immunoblot com 8 amostras de soros de pacientes com PCM
residentes em MT (A) e 8 amostras de soros de pacientes com PCM
procedentes de SP (B). O exoantígeno utilizado neste teste foi obtido do
isolado 31AMS.
Figura 2. Immunoblot dos exoantígenos de P.
brasiliensis - MT e do controle B 339 – SP,
incubados com anticorpo monoclonal anti-gp43
e com o conjugado anti-IgG de camundongo
marcado com peroxidase.
Resultados 50
5.2. Caracterização dos exoantígenos (MT)
A tabela 6 apresenta os perfis imunoquímicos dos exoantígenos selecionados.
5.3. Análise de transcritos por RT – PCR.
Após a extração do RNA, foi realizada a análise espectofotométrica que possibilitou
determinar as concentrações e os índices de pureza dos RNAs. A tabela 7 apresenta os valores
espectrofotométricos do RNA extraído de cada isolado de P. brasiliensis avaliados neste estudo.
5.3.1. Análise dos transcritos relacionados à expressão de oxr1
A figura 4 demonstra a presença de expressão da oxr1 nos isolados referentes à forma
crônica 28MND e 35JAA e no isolado caso recidivante, 32AGC. Não foi observada expressão
no isolado 38MHC.
Exoantígenos
de P.
brasiliensis
Concentração de
proteínas
(µg/µL)
Média de
positividade na
ID
SDS-PAGE
Frações (kDa)
IB (gp 43)
31AMS 640 35% 20, 30, 50 e 130 Não reagente
11MFC 180 25% 50 Não reagente
29EE 520 35% 50 e 130 Não reagente
Isolado de P.brasiliensis Concentração de RNA (µg/µL) Índice de pureza
38MHC 3,440 2,183
28MND 1,704 2,185
35JAA 2,060 2,137
32AGC 4,936 2,137
Tabela 7. Análise espectrofotométrica para quantificação da concentração do
RNA, realizada em comprimento de onda igual a 260 e do índice de pureza
realizado com comprimento de onda igual a 320.
Tabela 6. Descrição dos perfis imunoquímicos dos três exoantígenos (MT).
Figura 4. Perfil eletroforético do gene oxr1 e controle l34,
observados nos isolados de P. brasiliensis.
Resultados 51
5.3.2. Análise dos transcritos relacionados à expressão de patatin
A figura 5 demonstra que apenas os isolados 28MND e 35JAA apresentaram-se expressos.
Não foi possível observar expressão de patatin para os isolados 32AGC e 38MHC.
Observou-se expressão de patatin somente nos isolados da forma crônica da PCM.
5.3.3. Análise dos transcritos relacionados à expressão de erg9
Todos os isolados de P. brasiliensis apresentaram expressão para erg9, conforme
demonstra a figura 6.
5.3.4. Análise dos transcritos relacionados à expressão de anidrase carbônica
A expressão da anidrase carbônica foi evidente nos isolados 32AGC, 28MND e 35JAA,
demonstrada na figura 7.
Figura . Perfil eletroforético do gene patatin e controle l34,
observados nos isolados de P. brasiliensis.
Figura 6. Perfil eletroforético do gene erg9 e controle l34,
observados nos isolados de
P. brasiliensis
.
Figura 7. Perfil eletroforético do gene anidrase carbônica e
controle l34, observados nos isolados de P. brasiliensis.
Resultados 52
5.3.5. Avaliação entre as formas clínicas da PCM e os quatro genes
A análise da expressão dos genes relacionados à virulência demonstrou que os isolados de
P. brasiliensis provenientes da forma crônica da PCM apresentaram expressão em todos os
genes testados neste trabalho (orx1, patatin, erg9 e anidrase carbônica). A tabela 8 sintetiza os
resultados da análise da expressão gênica e reapresenta as características clínicas em que foram
obtidos os isolados de P. brasiliensis.
Isolados de P.
brasiliensis
Idade Forma clínica
Tratamento prévio
Expressão dos genes
oxr1 patatin erg9
anidrase
carbônica
38MHC 3 anos Aguda Não Não Não Sim Não
28MND 38 anos Crônica Não Sim Sim Sim Sim
32AGC 25 anos Crônica Sim (recidivante) Sim Não Sim Sim
35JAA 50 anos Crônica Não Sim Sim Sim Sim
Tabela 8. Descrição da expressão gênica relativa à virulência e descrição das principais
características dos isolados de P. brasiliensis procedentes de MT.
6. DISCUSSÃO
Discussão 54
Os resultados apresentados neste trabalho mostram a caracterização imunoquímica de três
exoantígenos e análises preliminares da expressão de quatro genes relacionados à virulência em
isolados clínicos de P. brasiliensis no Mato Grosso.
As preparações antigênicas têm sido desenvolvidas em pesquisas científicas e em rotinas
laboratoriais. Essas preparações têm sido elaboradas com o objetivo de promover o
monitoramento da resposta terapêutica para a PCM. Há diferentes modos de obter estas
preparações antigênica e de acordo com o isolado fúngico selecionado, da fase morfológica do
fungo, do meio de cultura utilizado, do tamanho do inóculo inicial, do tempo de incubação, e das
técnicas utilizadas durante a obtenção dos antígenos, as preparações irão apresentar perfis
imunoquímicos distintos [70, 92, 93].
Ricci e colaboradores [177] conseguiram estabelecer, através da genotipagem de P.
brasiliensis, a origem geográfica da infecção da PCM utilizando cortes histológicos e nested
PCR, os quais possibilitaram propor esta metodologia para ampliar os recursos para investigação
epidemiológica da PCM.
As concentrações proteicas obtidas a partir dos exoantígenos mato-grossenses foram
variáveis. O exoantígeno 11MFC, apresentou a menor concentração (180 µg/µL), enquanto que
os exoantígenos 31AMS e 29EE apresentaram valores aproximados, respectivamente 640 e 520
µg/µL.
Os nossos resultados referentes à dosagem proteica não apresentaram relações com a
positividade na ID, como havia sido proposto por Camargo e colaboradores [68, 70].
Observamos que o exoantígeno 11MFC com concentração proteica igual a 180 µg/mL
apresentou valores iguais quanto a positividade na ID (utilizando-se soro de MT) quando
comparados aos outros dois exoantígenos que apresentaram concentrações proteicas superiores a
350 µg/µL.
Discussão 55
Contudo, foi observada diferença quanto à positividade deste exoantígeno 11MFC (10%)
comparando-se aos outros dois exoantígenos que apresentaram 30%, quando da utilização de
soros procedentes do estado de São Paulo.
À luz destes resultados, foi possível observar que ao testarmos 20 amostras de soros (10
amostras para soros de MT e 10 amostras para soros de SP) foram encontradas algumas
diferenças associadas à procedência geográfica dos isolados de P. brasiliensis empregados na
obtenção de exoantígenos frente à procedência regional dos soros de pacientes acometidos pela
PCM.
Os três exoantígenos apresentaram a positividade de 40% para os soros de MT; entretanto
quando testados com soros de pacientes procedentes de SP apresentaram redução da
positividade, sendo igual a 30% para dois exoantígenos (31AMS e 29EE) e a 10% para o
exoantígeno 11MFC.
Estes resultados demonstram que se fizéssemos uma mistura destes três exoantígenos
poderíamos alcançar até 70% de positividade para os soros (MT) e de 40% de positividade para
os soros (SP). Interessante observar que mesmo com a mistura antigênica, três soros (MT)
continuariam negativos (os soros 2, 5 e 6) e seis soros (SP) continuariam sendo negativos (os
soros 4, 6, 7, 8, 9 e 10). Estes resultados reforçam a hipótese de que possam existir diferenças
regionais em relação às preparações antigênicas obtidas de isolados de MT e SP. Batista Júnior
[8] avaliou 65 soros (MT) e 46 soros (SP) utilizando dois exoantígenos (MT e SP). A
positividade encontrada ao testar o exoantígeno MT com soros foi de: 92,3% (MT) e 41,3%
(SP), porém ao testar o exoantígeno SP, com estes mesmos soros, encontrou positividade de
26,2% (MT) e de 100% (SP).
A análise realizada através da utilização da técnica de SDS – PAGE possibilitou observar
as frações proteicas dos exoantígenos (MT). A principal glicoproteína observada nos três
exoantígenos (MT) foi caracterizada como de peso molecular igual a 50kDa. O exoantígeno
Discussão 56
31AMS foi o que apresentou o maior número de frações, porém de baixa intensidade, sendo
observadas as frações de pesos moleculares iguais a 20, 30 e 130kDa. O exoantígeno 29EE
apresentou uma fração referente a 130 kDa bem evidente.O exoantígeno 11MFC apresentou
somente a fração correspondente à 50kDa. Estes resultados demonstram a importância de avaliar
o perfil imunoquímico de exoantígenos devido ao fato de apresentarem frações antigênicas
pouco freqüentes em outros estudos. Casotto e colaboradores [109] descreveram a presença de
uma fração de 48 kDa e Camargo e colaboradores [68] registraram a presença da fração de
55kDa, sendo as descrições mais semelhantes à observada neste estudo (50kDa). A presença da
fração 130kDa não havia sido descrita e, as frações de 87kDa [104] e 160kDa [121] foram
aquelas que apresentaram pesos moleculares próximos aos nossos achados.
Os resultados obtidos a partir do emprego da técnica de IB foram confirmatórios aos
encontrados previamente utilizando-se a técnica de SDS-PAGE. Foi evidenciado que os três
isolados de P. brasiliensis não secretaram gp43 durante a obtenção dos exoantígenos. Este fato já
foi descrito anteriormente por Berzaghi e colaboradores [116]. Estes autores relataram sobre a
inconstância (qualitativa e quantitativa) da secreção de gp43 durante a produção de
exoantígenos. Alterações moleculares relacionadas ao mecanismo regulador da expressão de
gp43 foi a hipótese aventada para justificar este fato.
As diferenças metodológicas empregadas na obtenção de antígenos e na execução do
próprio teste sorológico são discutidas na literatura, e determinam a obtenção de resultados
muitas vezes distintos e/ou discrepantes. Carvalho e colaboradores [89] sugeriram utilizar a gp43
recombinante, especialmente as isoformas D e E, em substituição ao antígeno quando da
utilização da técnica de ID. Nosso estudo foi desenvolvido sob as mesmas condições propostas
por Camargo e colaboradores [68, 70]; entretanto foram observadas significativas diferenças nos
exoantígenos de MT e de SP, sugerindo que o possível emprego de um único exoantígeno para
todo o país possa comprometer a detecção de anticorpos em reações clássicas de ID devido a
Discussão 57
peculiaridades antigênicas. Devido a presença de frações proteicas distintas, sugerimos também a
realização de outros estudos objetivando a melhor caracterização das glicoproteínas, talvez em
estágio preliminar à substituição dos antígenos empregados na reação de ID por isoformas de
gp43.
Muito recentemente, um grupo de pesquisadores da Universidade de Brasília, apresentou
resultados envolvendo estudos moleculares sobre filogenia em P. brasiliensis. Neste trabalho,
foram utilizados vários isolados clínicos de MT e foram registradas evidências genéticas
apontando a possibilidade de especiação deste fungo, fato este que corrobora as particularidades
supostamente regionais, justificando diferenças antigênicas e outras relacionadas à expressão
gênica de distintos isolados (Teixeira - comunicação pessoal, 2008).
Futuros estudos, incluindo a caracterização de fração de 130 kDa e análises sobre
diferenças de positividade a partir do emprego de novos exoantígenos obtidos em MT, para a
avaliação de soros de regiões geográficas distintas serão úteis à compreensão das características
preliminarmente detectadas neste trabalho.
Considerando a análise preliminar da expressão gênica, selecionamos isolados clínicos
recentes de P. brasiliensis, a fim de evitar possíveis alterações que o fungo possa desenvolver
durante a adaptação in vitro. Realizamos este estudo preliminar para avaliarmos se haveria
expressão diferenciada destes genes nos diferentes isolados clínicos provenientes das formas
clínicas aguda e crônica, além de avaliarmos um caso recidivante da PCM. Porém estes
resultados serão aprimorados e caracterizados através da confirmação pela RT-PCR real time.
Buscaremos também, aumentar o número amostral destes isolados (representantes das formas
clínicas da PCM e casos recidivantes) a fim de possibilitar inferências para os resultados
encontrados e promover a reprodutibilidade experimental.
Análises realizadas com o emprego da técnica de Random Amplified Polymorphic DNA já
demonstraram que o subcultivo in vitro altera o genótipo de P. brasiliensis. Diferenças na
Discussão 58
expressão gênica in vitro, in vivo (camundongos) e após incubação em sangue humano foram
observadas [6, 7, 157, 178]. Sabe-se, que após P. brasiliensis penetrar no organismo, inicia-se o
complexo processo de invasão e adaptação do fungo no hospedeiro, porém simultaneamente, o
hospedeiro responde a esta invasão através da ativação dos múltiplos fatores da resistência contra
o fungo [13, 16, 151]. Os diferentes graus de supressão da resposta imune dos pacientes podem
ser correlacionados com as formas clínicas da PCM. Indivíduos com a forma aguda ou a forma
crônica disseminada apresentam freqüentemente alto grau de supressão da resposta imune
celular, altos níveis de anticorpos específicos e ativação policlonal de células B, enquanto que
indivíduos com a forma crônica da doença apresentam imunidade celular adequada e baixos
níveis de anticorpos específicos [51, 53, 54]. O isolado obtido de caso recidivante da PCM foi
incluído por considerarmos importante avaliar as possíveis diferenças de expressão face à
instituição de terapêutica prévia com possível modificação dos isolados [9].
Os genes foram selecionados de acordo com as atividades relacionadas à virulência
associadas a cada gene; devido à descrição anterior no transcritoma de P. brasiliensis e por
resultados prévios de expressão obtidos no trabalho desenvolvido por Costa e colaboradores [7].
A oxr1 atua protegendo a célula fúngica dos danos oxidativos que macrófagos produzem
como resposta a invasão fúngica [179, 180]. Assim, oxr1 protege as células danificadas durante a
ação oxidativa do peróxido de hidrogênio [159]. Observamos a expressão do gene oxr1 somente
nos isolados 28MND e 35JAA (ambos isolados da forma crônica não recidivante da PCM). Já
nos isolados 38MHC (forma clínica aguda) e 32AGC (caso recidivante) não observamos
expressão.
Patatin promove a hidrólise de fosfolipídios e que possivelmente apresente função
semelhante às enzimas hidrolíticas denominadas fosfolipase A. Estas fosfolipases permitem o
rompimento de membranas celulares do hospedeiro e da matriz extracelular, facilitando a
disseminação e a invasão de outros tecidos pelo microrganismo, estudos indicam que
Discussão 59
provavelmente estas enzimas estão relacionadas à patogênese da PCM [5]. Tavares e
colaboradores [181] relataram o gene da fosfolipase no transcritoma de P. brasiliensis. O papel
da fosfolipase B como um fator de virulência também foi relatado em Cryptococcus neoformans.
As enzimas hidrolíticas são necessárias para a conversão de polímeros em açúcares simples para
o metabolismo fúngico [182, 183]. No isolado da forma aguda não houve expressão do gene
patatin. Acredita-se que os genes da família patatin, codificam a atividade lipolítica em plantas e
esta atividade é muito explorada pelos patógenos, especialmente por fungos e bactérias, durante
a colonização do hospedeiro [184]. O gene patatin foi expresso somente nos isolados de P.
brasiliensis obtidos da forma crônica da PCM (não recidivante), ou seja, nos isolados 28MND e
35JAA. Não foi possível observar expressão de patatin nos isolados 32AGC (caso recidivante) e
38MHC (forma clínica aguda).
Um dos mecanismos de virulência exibidos por P. brasiliensis pode estar associado à
composição da membrana fúngica. Leveduras de P. brasiliensis apresentam 11% de lipídios em
sua membrana plasmática e o metabolismo lipídico também, parece estar relacionado à patatin
[7, 141, 185]. Lipídios e polissacarídios de P. brasiliensis provavelmente estimulam a resposta
inicial para o processo inflamatório da PCM [186]. Desta forma, para que P. brasiliensis se
adapte ao hospedeiro, ele necessita desenvolver mecanismos que remodelem e reorganizem a sua
membrana plasmática. A parede celular fúngica está em contato com o hospedeiro e serve de
barreira contra mecanismos de defesa do hospedeiro. A conversão de morfogenética foi
correlacionada às mudanças na composição de parede celular, organização e estrutura. Os
mecanismos de biossíntese da parede celular são essenciais para a viabilidade fúngica e, além
disso, é o alvo dos antifúngicos [139, 187, 188].
A erg9 foi o único gene expresso por todos os isolados clínicos de P. brasiliensis. Este
gene atua catalisando a primeira fase da biossíntese do ergosterol. O ergosterol é o mais
importante esterol da membrana fúngica e o aumento, do nível de ergosterol, afeta diretamente o
Discussão 60
fluxo e permeabilidade da membrana, sugerindo que, durante a infecção a expressão de erg9 é
responsável por modular os níveis de ergosterol para que ocorra a adaptação de leveduras em
situações de estresse oxidativo. Este resultado condiz com os dados da literatura, indicando a
existência de importantes alterações na membrana fúngica durante a fase parasitária de P.
brasiliensis [7, 169, 189]
Nesse sentido, observamos a importância da parede e membrana fúngica no processo de
virulência e dimorfismo de P. brasiliensis. Os componentes da parede celular puderam ser
correlacionados e, foi demonstrado que o menor conteúdo de α-glucana apresenta uma
diminuição da virulência. Neste contexto pode ser justificado também o dimorfismo pois α-
glucana não apresenta a capacidade para estimular a produção de vários mediadores
inflamatórios, fato perceptível em β-glucana (micélio) [141, 154, 190]. O silenciamento de
alguns genes pode ser um importante mecanismo de adaptação de P. brasiliensis para diminuir a
resposta inflamatória que β-glucana produz [154]. Tal mecanismo pode estar relacionado com a
habilidade de P. brasiliensis permanecer oculto por períodos longos de tempo [191].
Anidrase carbônica é uma proteína importante para o metabolismo fúngico, pois ela auxilia
a síntese de ácidos graxos, componentes intrínsecos à constituição morfológica de P.
brasiliensis. Costa e colaboradores [7] sugerem que durante o processo de infecção, P.
brasiliensis utiliza múltiplas fontes de carbono, inclusive a glicose e substratos do ciclo
glioxalato, especialmente sempre que encontra quantidades insuficientes de componentes
intrínsecos à sua sobrevivência. Nestes casos, P. brasiliensis provavelmente ativaria a
biossíntese destes compostos através da ativação de genes específicos. Dentre as vias
metabólicas relacionadas com a virulência de organismos patogênicos destaca-se o ciclo do
glioxalato, que já foi relatado em bactérias, plantas e fungos. Este ciclo permite a utilização de
compostos de dois carbonos como fonte para síntese de glicose [192].
Discussão 61
Foi evidenciado que a anidrase carbônica está envolvida na biossíntese dos ácidos graxos.
O bicarbonato é um substrato chave para carboxilação de várias enzimas e em muitos processos
metabólicos. A ativação do ciclo do glioxalato ocorre como um desvio do ciclo do ácido cítrico
que disponibiliza substratos para as reações de biossíntese. Em um primeiro passo, a enzima
isocitrato liase catalisa a clivagem do isocitrato em succinato e glioxalato. Posteriormente, ocorre
uma reação de condensação do glioxalato com acetil-CoA para a formação de malato pela ação
da enzima malato sintase [193]. Acredita-se que após ser fagocitado, P. brasiliensis induz a
expressão de genes relacionados a estas enzimas. A ativação destas enzimas permitiria a
produção de energia a partir de compostos de dois carbonos como, por exemplo, o acetato,
produto da degradação de ácidos graxos, uma vez que o interior de macrófagos é um ambiente
pobre em carboidratos [192, 194]. Ainda, em modelo murino de infecção, isolados mutantes de
Candida albicans tiveram seu caráter virulento extremamente reduzido, fortificando a correlação
entre a expressão desse gene e a virulência do fungo [171, 192].
O isolado 38MHC referente à forma aguda da PCM, apresentou expressão gênica
observada apenas para o gene erg9, precursor da biossíntese da parede e membrana fúngica. Não
foi possível detectar a expressão de patatin ao avaliar o isolado 32AGC, obtido de paciente caso
recidivante de PCM. Em contrapartida, os isolados da forma crônica (28MND e 35JAA),
apresentaram expressão para todos os genes avaliados neste estudo, indicando diferenças entre as
formas clínicas da PCM quanto à expressão gênica para oxr1, patatin e anidrase carbônica.
Desta forma, entendemos que várias lacunas do conhecimento referentes à interação do
fungo P. brasiliensis e o homem, poderão ser elucidadas a partir de uma melhor compreensão
sobre os mecanismos moleculares e imunoquímicos, à luz de informações clínicas dos pacientes
acometidos por este importante problema de saúde pública - a PCM.
7. CONCLUSÕES
Conclusões 63
1. Os perfis imunoquímicos de três exoantígenos foram caracterizados pela presença
da fração de peso molecular igual a 50kDa e pela ausência da fração 43kDa (marcador
antigênico da PCM). Nossos achados correspondem ao primeiro relato sobre a caracterização
imunoquímica de exoantígenos, a partir de isolados clínicos de P. brasiliensis no estado de Mato
Grosso e sugerem possíveis peculiaridades antigênicas associadas aos mesmos.
2. As análises preliminares das expressões gênicas de oxr1, patatin e anidrase
carbônica nos indicaram diferenças nos transcritos dos isolados procedentes das distintas formas
clínicas da PCM e caso recidivante. Já o gene erg9, precursor da biossíntese da parede e
membrana fúngica, não apresentou diferenças nos transcritos uma vez que todos os isolados
avaliados em nosso estudo preliminar apresentaram-se expressos.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referências Bibliográficas 65
1. Franco M, Montenegro MR, Mendes RP, Marques SA, Dillon NL, Mota NG:
Paracoccidioidomycosis: a recently proposed classification of its clinical forms. Rev Soc
Bras Med Trop 1987, 20:129-132.
2. Lacaz CS, Porto E, Martins JEC, Heins-Vaccari EM, N.T. M: Tratado de Micologia
Médica. São Paulo: Savier 2002.
3. Felipe MS, Andrade RV, Arraes FB, Nicola AM, Maranhao AQ, Torres FA, Silva-
Pereira I, Pocas-Fonseca MJ, Campos EG, Moraes LM, et al: Transcriptional profiles of
the human pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis in mycelium and yeast cells.
J Biol Chem 2005, 280:24706-24714.
4. Felipe MS, Torres FA, Maranhao AQ, Silva-Pereira I, Pocas-Fonseca MJ, Campos EG,
Moraes LM, Arraes FB, Carvalho MJ, Andrade RV, et al: Functional genome of the
human pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis. FEMS Immunol Med Microbiol
2005, 45:369-381.
5. Derengowski LS: Análise da expressão gênica de potenciais fatores de virulência do
fungo Paracoccidioides brasiliensis submetido a diferentes condições experimentais.
Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular do Instituto de Ciências
Biológicas; 2006.
6. Bailao AM, Shrank A, Borges CL, Parente JA, Dutra V, Felipe MS, Fiuza RB, Pereira M,
de Almeida Soares CM: The transcriptional profile of Paracoccidioides brasiliensis yeast
cells is influenced by human plasma. FEMS Immunol Med Microbiol 2007, 51:43-57.
7. Costa M, Borges CL, Bailao AM, Meirelles GV, Mendonca YA, Dantas SF, de Faria FP,
Felipe MS, Molinari-Madlum EE, Mendes-Giannini MJ, et al: Transcriptome profiling of
Paracoccidioides brasiliensis yeast-phase cells recovered from infected mice brings new
insights into fungal response upon host interaction. Microbiology 2007, 153:4194-4207.
8. Batista Junior J: Exoantígenos obtidos de isolados clínicos de Paracoccidioides
brasiliensis procedentes do estado de Mato Grosso e sua importância regional no
imunodiagnostico da paracoccidioidomicose. Dissertação. Universidade Federal do Mato
Grosso, Ciências da Saúde; Doenças Infecciosas e Parasitárias; 2006.
9. Hahn RC, Macedo AM, Fontes CJ, Batista RD, Santos NL, Hamdan JS: Randomly
amplified polymorphic DNA as a valuable tool for epidemiological studies of
Paracoccidioides brasiliensis. J Clin Microbiol 2003, 41:2849-2854.
10. Calcagno AM, Nino-Vega G, San-Blas F, San-Blas G: Geographic discrimination of
Paracoccidioides brasiliensis strains by randomly amplified polymorphic DNA analysis.
J Clin Microbiol 1998, 36:1733-1736.
Referências Bibliográficas 66
11. Molinari-Madlum EE, Felipe MS, Soares CM: Virulence of Paracoccidioides
brasiliensis isolates can be correlated to groups defined by random amplified
polymorphic DNA analysis. Med Mycol 1999, 37:269-276.
12. Lacaz CS: Paracoccidioides brasiliensis: morfology; Evolutionary cycle; Maitenance
during Paprophytic Life; Biology; Virulence; Taxonom. In Paracoccidioidomycosis.
Edited by Franco MF LC, Restrepo A, Del Negro G. Boca Raton, USA: CRC Press;
1994: PP. 13-25
13. Palmeiro M, Cherubini K, Yurgel LS: Paracoccidioidomycosis – Literature Review.
Scientia Medica 2005, 15:274-278.
14. Lacaz CS, Porto E, Martins JEC: Micologia Médica. In Paracoccidioidomicose. Volume
8ª. Edited by Lacaz CS, Porto E, Martins JEC. São Paulo Brasil: Editora Sarvier; 1991:
248-261
15. Shikanai-Yasuda MA, Telles Filho Fde Q, Mendes RP, Colombo AL, Moretti ML:
Guideliness in paracoccidioidomycosis. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical 2006, 39:297-310.
16. Brummer E, Castaneda E, Restrepo A: Paracoccidioidomycosis: an update. Clin
Microbiol Rev 1993, 6:89-117.
17. Wanke B, Londero ATIE: Epidemiology and paracoccidioidomycosis infection. In
Paracoccidioidomycosis. Edited by Franco M, Lacaz CS, Restrepo A, Del negro G. Boca
Raton: CRC Press; 1994:109-117
18. Horre R, Schumacher G, Alpers K, Seitz HM, Adler S, Lemmer K, De Hoog GS, Schaal
KP, Tintelno K: A case of imported paracoccidioidomycosis in a German legionnaire.
Med Mycol 2002, 40:213-216.
19. Ginarte M, Pereiro M, Jr., Toribio J: Imported paracoccidioidomycosis in Spain.
Mycoses 2003, 46:407-411.
20. Kamei K, Sano A, Kikuchi K, Makimura K, Niimi M, Suzuki K, Uehara Y, Okabe N,
Nishimura K, Miyaji M: The trend of imported mycoses in Japan. J Infect Chemother
2003, 9:16-20.
21. Bousquet A, Dussart C, Drouillard I, Charbel EC, Boiron P: [Imported mycosis: a review
of paracoccidioidomycosis]. Med Mal Infect 2007, 37 Suppl 3:S210-214.
22. Fujio J, Nishimura K, Miyaji M: Epidemiological survey of the imported mycoses in
Japan. Nippon Ishinkin Gakkai Zasshi 1999, 40:103-109.
23. Mayayo E, Lopez-Aracil V, Fernandez-Torres B, Mayayo R, Dominguez M: Report of
an imported cutaneous disseminated case of paracoccidioidomycosis. Rev Iberoam Micol
2007, 24:44-46.
Referências Bibliográficas 67
24. Van Damme PA, Bierenbroodspot F, Telgtt DS, Kwakman JM, De Wilde PC, Meis JF: A
case of imported paracoccidioidomycosis: an awkward infection in The Netherlands.
Med Mycol 2006, 44:13-18.
25. McEwen JG, Garcia AM, Ortiz BL, Botero S, Restrepo A: In search of the natural habitat
of Paracoccidioides brasiliensis. Arch Med Res 1995, 26:305-306.
26. Borelli D: Concepto de reservárea. La reducida reservárea de La paracoccidioidomicosis.
Dermatologia Venezolana 1964:71-77.
27. Tercarioli GR, Bagagli E, Reis GM, Theodoro RC, Bosco Sde M, Macoris SA, Richini-
Pereira VB: Ecological study of Paracoccidioides brasiliensis in soil: growth ability,
conidia production and molecular detection. BMC Microbiol 2007, 7:92.
28. Ferreira MS, Freitas LH, Lacaz Cda S, del Negro GM, de Melo NT, Garcia NM, de Assis
CM, Salebian A, Heins-Vaccari EM: Isolation and characterization of a Paracoccidioides
brasiliensis strain from a dogfood probably contaminated with soil in Uberlandia, Brazil.
J Med Vet Mycol 1990, 28:253-256.
29. Conti Dias IA: On the unknown ecological niche of Paracoccidioides brasiliensis: our
hypothesis of 1989: present status and perspectives. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 2007,
49:131-134.
30. Corte AC, Svoboda WK, Navarro IT, Freire RL, Malanski LS, Shiozawa MM, Ludwig
G, Aguiar LM, Passos FC, Maron A, et al: Paracoccidioidomycosis in wild monkeys
from Parana State, Brazil. Mycopathologia 2007, 164:225-228.
31. Marques SA, Franco MF, Mendes RP, Silva NC, Baccili C, Curcelli ED, Feracin AC,
Oliveira CS, Tagliarini JV, Dillon NL: [Epidemiologic aspects of
paracoccidioidomycosis in the endemic area of Botucatu (Sao Paulo - Brazil)]. Rev Inst
Med Trop Sao Paulo 1983, 25:87-92.
32. Restrepo A, McEwen JG, Castaneda E: The habitat of Paracoccidioides brasiliensis: how
far from solving the riddle? Med Mycol 2001, 39:233-241.
33. Coutinho ZF, Silva D, Lazera M, Petri V, Oliveira RM, Sabroza PC, Wanke B:
Paracoccidioidomycosis mortality in Brazil (1980-1995). Cad Saude Publica 2002,
18:1441-1454.
34. Assis DR, Carvalho J, Rezende SB, Hahn RC, Tadano T, Fontes CJF:
Paracoccidioidomicose em Mato Grosso: Revisão clínico-laboratorial da demanda do
Hospital Universitário da UFMT. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical
2007, 40:94.
35. Franco M, Bagagli E, Scapolio S, da Silva Lacaz C: A critical analysis of isolation of
Paracoccidioides brasiliensis from soil. Med Mycol 2000, 38:185-191.
Referências Bibliográficas 68
36. Negroni R: Paracoccidioidomycosis (South American blastomycosis, Lutz's mycosis). Int
J Dermatol 1993, 32:847-859.
37. De Albornoz MB: Isolation of Paracoccidioides brasiliensis from rural soil in
Venezuela. Sabouraudia 1971, 9:248-253.
38. Restrepo A: The ecology of Paracoccidioides brasiliensis: a puzzle still unsolved.
Sabouraudia 1985, 23:323-334.
39. Montenegro MR, Miyaji M, Franco M, Nishimura K, Coelho KI, Horie Y, Mendes RP,
Sano A, Fukushima K, Fecchio D: Isolation of fungi from nature in the region of
Botucatu, state of Sao Paulo, Brazil, an endemic area of paracoccidioidomycosis. Mem
Inst Oswaldo Cruz 1996, 91:665-670.
40. Silva-Vergara ML, Martinez R, Chadu A, Madeira M, Freitas-Silva G, Leite Maffei CM:
Isolation of a Paracoccidioides brasiliensis strain from the soil of a coffee plantation in
Ibia, State of Minas Gerais, Brazil. Med Mycol 1998, 36:37-42.
41. Giraldo R, Restrepo A, Gutierrez F, Robledo M, Londono F, Hernandez H, Sierra F,
Calle G: Pathogenesis of paracoccidioidomycosis: a model based on the study of 46
patients. Mycopathologia 1976, 58:63-70.
42. McEwen JG, Bedoya V, Patino MM, Salazar ME, Restrepo A: Experimental murine
paracoccidiodomycosis induced by the inhalation of conidia. J Med Vet Mycol 1987,
25:165-175.
43. Franco L, Najvar L, Gomez BL, Restrepo S, Graybill JR, Restrepo A: Experimental
pulmonary fibrosis induced by Paracoccidioides brasiliensis conidia: measurement of
local host responses. Am J Trop Med Hyg 1998, 58:424-430.
44. Melo IS, Londero AT: Spontaneously resolving pulmonary lesions in
paracoccidioidomycosis. Case report and review. Mycopathologia 1983, 82:57-59.
45. Bethlem EP, Capone D, Maranhao B, Carvalho CR, Wanke B: Paracoccidioidomycosis.
Curr Opin Pulm Med 1999, 5:319-325.
46. Iabuki K, Montenegro MR: Experimental paracoccidioidomycosis in the Syrian hamster:
morphology, ultrastructure and correlation of lesions with presence of specific antigens
and serum levels of antibodies. Mycopathologia 1979, 67:131-141.
47. Martinez R: Paracoccidioidomicose. In Micologia Médica à luz de autores
contemporâneos. Guanabara Koogan edition. Edited by Sidrim JJC, Rocha MFG. Rio de
Janeiro - RJ Brasil; 2004: 202-221.[Sidrim JJC (Series Editor)
48. Restrepo A: Morphological aspects of Paracoccidioides brasiliensis in lymph nodes:
implications for the prolonged latency of paracoccidioidomycosis? Med Mycol 2000,
38:317-322.
Referências Bibliográficas 69
49. Londero AT, Del Negro G: Paracoccidioidomicose. J Pneumol 1986, 12:41-60.
50. Wanke B, Lazéra MS, Monteiro PCF, Londero AT: Apostila de Micologia Médica. Rio
de Janeiro: Serviço de Micologia do IPEC-FIOCRUZ (RJ): Laboratório de Referência
Nacional para Micoses Sistêmicas, SVS/MS; 2006:1-56.
51. Biagioni L, Souza MJ, Chamma LG, Mendes RP, Marques SA, Mota NG, Franco M:
Serology of paracoccidioidomycosis. II. Correlation between class-specific antibodies
and clinical forms of the disease. Trans R Soc Trop Med Hyg 1984, 78:617-621.
52. Mamoni RL, Nouer SA, Oliveira SJ, Musatti CC, Rossi CL, Camargo ZP, Blotta MH:
Enhanced production of specific IgG4, IgE, IgA and TGF-beta in sera from patients with
the juvenile form of paracoccidioidomycosis. Med Mycol 2002, 40:153-159.
53. Oliveira SJ, Mamoni RL, Musatti CC, Papaiordanou PM, Blotta MH: Cytokines and
lymphocyte proliferation in juvenile and adult forms of paracoccidioidomycosis:
comparison with infected and non-infected controls. Microbes Infect 2002, 4:139-144.
54. Mota NG, Rezkallah-Iwasso MT, Peracoli MT, Audi RC, Mendes RP, Marcondes J,
Marques SA, Dillon NL, Franco MF: Correlation between cell-mediated immunity and
clinical forms of paracoccidioidomycosis. Trans R Soc Trop Med Hyg 1985, 79:765-772.
55. Jimenez BE, Murphy JW: In vitro effects of natural killer cells against Paracoccidioides
brasiliensis yeast phase. Infect Immun 1984, 46:552-558.
56. Moscardi-Bacchi M, Brummer E, Stevens DA: Support of Paracoccidioides brasiliensis
multiplication by human monocytes or macrophages: inhibition by activated phagocytes.
J Med Microbiol 1994, 40:159-164.
57. Kashino SS, Fazioli RA, Cafalli-Favati C, Meloni-Bruneri LH, Vaz CA, Burger E, Singer
LM, Calich VL: Resistance to Paracoccidioides brasiliensis infection is linked to a
preferential Th1 immune response, whereas susceptibility is associated with absence of
IFN-gamma production. J Interferon Cytokine Res 2000, 20:89-97.
58. Calich VL, Vaz CA, Burger E: Immunity to Paracoccidioides brasiliensis infection. Res
Immunol 1998, 149:407-417; discussion 499-500.
59. Baida H, Biselli PJ, Juvenale M, Del Negro GM, Mendes-Giannini MJ, Duarte AJ,
Benard G: Differential antibody isotype expression to the major Paracoccidioides
brasiliensis antigen in juvenile and adult form paracoccidioidomycosis. Microbes Infect
1999, 1:273-278.
60. Biselli PJ, Juvenale M, Mendes-Giannini MJ, Duarte AJ, Benardi G: IgE antibody
response to the main antigenic component of Paracoccidioides brasiliensis in patients
with paracoccidioidomycosis. Med Mycol 2001, 39:475-478.
Referências Bibliográficas 70
61. Mamoni RL, Rossi CL, Camargo ZP, Blotta MH: Capture enzyme-linked immunosorbent
assay to detect specific immunoglobulin E in sera of patients with
paracoccidioidomycosis. Am J Trop Med Hyg 2001, 65:237-241.
62. Mendes-Giannini MJ, Moraes RA, Ricci TA: Proteolytic activity of the 43,000 molecular
weight antigen secreted by Paracoccidioides brasiliensis. Rev Inst Med Trop Sao Paulo
1990, 32:384-385.
63. Bueno JP, Mendes-Giannini MJ, Del Negro GM, Assis CM, Takiguti CK, Shikanai-
Yasuda MA: IgG, IgM and IgA antibody response for the diagnosis and follow-up of
paracoccidioidomycosis: comparison of counterimmunoelectrophoresis and complement
fixation. J Med Vet Mycol 1997, 35:213-217.
64. Biagioni LM, Sadatsune T, Franco MF, Mattos MC: A comparative study of the
immunoantigenicity of eight Paracoccidioides brasiliensis isolates. Rev Inst Med Trop
Sao Paulo 1986, 28:281-286.
65. Rumbley CA, Sugaya H, Zekavat SA, El Refaei M, Perrin PJ, Phillips SM: Activated
eosinophils are the major source of Th2-associated cytokines in the schistosome
granuloma. J Immunol 1999, 162:1003-1009.
66. Brummer E: The role of neutrophils and macrophages in host resistance to systemic
fungal infections. Immunol Ser 1989, 47:273-289.
67. Moreira AP, Campanelli AP, Cavassani KA, Souto JT, Ferreira BR, Martinez R, Rossi
MA, Silva JS: Intercellular adhesion molecule-1 is required for the early formation of
granulomas and participates in the resistance of mice to the infection with the fungus
Paracoccidioides brasiliensis. Am J Pathol 2006, 169:1270-1281.
68. Camargo ZP, Berzaghi R, Amaral CC, Silva SH: Simplified method for producing
Paracoccidioides brasiliensis exoantigens for use in immunodiffusion tests. Med Mycol
2003, 41:539-542.
69. da Silva MI, Chamma LG, Franco M: [Agar gel microdiffusion reaction in the serologic
diagnosis of paracoccidioidomycosis]. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1989, 31:40-43.
70. De Camargo Z, Unterkircher C, Campoy SP, Travassos LR: Production of
Paracoccidioides brasiliensis exoantigens for immunodiffusion tests. J Clin Microbiol
1988, 26:2147-2151.
71. Mistreta T, Souza MJ, Chamma LG, Pinho SZ, Franco M: Serology of
paracoccidioidomycosis. I. Evaluation of the indirect immunofluorescent test.
Mycopathologia 1985, 89:13-17.
Referências Bibliográficas 71
72. Restrepo A, Moncada LH: Indirect fluorescent-antibody and quantitative agar-gel
immunodiffusion tests for the serological diagnosis of paracoccidioidomycosis. Appl
Microbiol 1972, 24:132-137.
73. Chamma LG, Fabio WF, Bacchi MM, Franco MF: Indirect fluorescent test for detection
of anti-Paracoccidioides brasiliensis antibodies using coated bentonite particles as
antigen. Trans R Soc Trop Med Hyg 1983, 77:181-184.
74. Conti-Diaz IA, Somma-Moreira RE, Gezuele E, De Gimenez AC, Pena MI, Mackinnon
JE: Immunoelectroosmophoresis-immunodiffusion in paracoccidioidomycosis.
Sabouraudia 1973, 11:39-41.
75. Del Negro GM, Pereira CN, Andrade HF, Palacios SA, Vidal MM, Charbel CE, Benard
G: Evaluation of tests for antibody response in the follow-up of patients with acute and
chronic forms of paracoccidioidomycosis. J Med Microbiol 2000, 49:37-46.
76. da Silva SH, Grosso Dde M, Lopes JD, Colombo AL, Blotta MH, Queiroz-Telles F, de
Camargo ZP: Detection of Paracoccidioides brasiliensis gp70 circulating antigen and
follow-up of patients undergoing antimycotic therapy. J Clin Microbiol 2004, 42:4480-
4486.
77. Do Valle AC, Costa RL, Fialho Monteiro PC, Von Helder J, Muniz MM, Zancope-
Oliveira RM: Interpretation and clinical correlation of serological tests in
paracoccidioidomycosis. Med Mycol 2001, 39:373-377.
78. Cano LE, Restrepo A: Predictive value of serologic tests in the diagnosis and follow-up
of patients with paracoccidioidomycosis. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1987, 29:276-
283.
79. Ferreira-da-Cruz MF, Francesconi-do-Vale AC, Espinera MC, Wanke B, Galvao-Castro
B: Study of antibodies in paracoccidioidomycosis: follow-up of patients during and after
treatment. J Med Vet Mycol 1990, 28:151-157.
80. Elias Costa MR, Da Silva Lacaz C, Kawasaki M, De Camargo ZP: Conventional versus
molecular diagnostic tests. Med Mycol 2000, 38 Suppl 1:139-145.
81. Siqueira AM, Lacaz CS: Serologic characterization of Paracoccidioides brasiliensis E2
antigen. Braz J Med Biol Res 1991, 24:807-813.
82. Mendes-Giannini MJ, Ricci LC, Uemura MA, Toscano E, Arns CW: Infection and
apparent invasion of Vero cells by Paracoccidioides brasiliensis. J Med Vet Mycol 1994,
32:189-197.
83. Camargo ZP, Gesztesi JL, Saraiva EC, Taborda CP, Vicentini AP, Lopes JD: Monoclonal
antibody capture enzyme immunoassay for detection of Paracoccidioides brasiliensis
antibodies in paracoccidioidomycosis. J Clin Microbiol 1994, 32:2377-2381.
Referências Bibliográficas 72
84. del Negro GM, Benard G, de Assis CM, Vidal MS, Garcia NM, Otani C, Shikanai-
Yasuda MA, da SLC: Lack of reactivity of paracoccidioidomycosis sera in the double
immunodiffusion test with the gp43 antigen: report of two cases. J Med Vet Mycol 1995,
33:113-116.
85. Mendes-Giannini MJ, Camargo ME, Lacaz CS, Ferreira AW: Immunoenzymatic
absorption test for serodiagnosis of paracoccidioidomycosis. J Clin Microbiol 1984,
20:103-108.
86. de Camargo ZP, Guesdon JL, Drouhet E, Improvisi L: Enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA) in the paracoccidioidomycosis. Comparison with
counterimmunoelectrophoresis and erythro-immunoassay. Mycopathologia 1984, 88:31-
37.
87. Botteon FA, Camargo ZP, Benard G, Coelho RF, Chamone DA, Itano EN:
Paracoccidioides brasiliensis-reactive antibodies in Brazilian blood donors. Med Mycol
2002, 40:387-391.
88. Maluf ML, Pereira SR, Takahachi G, Svidzinski TI: [Prevalence of
paracoccidioidomycosis infection determined by sorologic test in donors' blood in the
Northwest of Parana, Brazil]. Rev Soc Bras Med Trop 2003, 36:11-16.
89. Carvalho KC, Vallejo MC, Camargo ZP, Puccia R: Recombinant gp43 Isoforms
Expressed in Pichia pastoris Can Be Used in the Diagnosis of Paracoccidioidomycosis.
Clin Vaccine Immunol 2008:622-629
90. Cisalpino PS, Puccia R, Yamauchi LM, Cano MI, da Silveira JF, Travassos LR: Cloning,
characterization, and epitope expression of the major diagnostic antigen of
Paracoccidioides brasiliensis. J Biol Chem 1996, 271:4553-4560.
91. Diniz SN, Carvalho KC, Cisalpino PS, Silveira JF, Travassos LR, Puccia R: Expression
in bacteria of the gene encoding the gp43 antigen of Paracoccidioides brasiliensis:
immunological reactivity of the recombinant fusion proteins. Clin Diagn Lab Immunol
2002, 9:1200-1204.
92. Blumer SO, Jalbert M, Kaufman L: Rapid and reliable method for production of a
specific Paracoccidioides brasiliensis immunodiffusion test antigen. J Clin Microbiol
1984, 19:404-407.
93. McGowan KL, Buckley HR: Preparation and use of cytoplasmic antigens for the
serodiagnosis of paracoccidioidomycosis. J Clin Microbiol 1985, 22:39-43.
94. Blotta MH, Camargo ZP: Immunological response to cell-free antigens of
Paracoccidioides brasiliensis: relationship with clinical forms of
paracoccidioidomycosis. J Clin Microbiol 1993, 31:671-676.
Referências Bibliográficas 73
95. Gago J, Godio C, Ochoa L, Negroni R, Nejamkis MR: [Isolation of an Paracoccidioides
brasiliensis exoantigen from solid culture media]. Rev Argent Microbiol 1995, 27:139-
145.
96. Restrepo A, Tabares Cde B: In vitro susceptibility of Paracoccidioides brasiliensis yeast
form to antifungal agents. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1984, 26:322-328.
97. Restrepo A, Cano LE, Ochoa MT: A yeast-derived antigen from Paracoccidioides
brasiliensis useful for serologic testing. Sabouraudia 1985, 23:23-29.
98. Casotto M: Characterization of the cellular antigens of Paracoccidioides brasiliensis
yeast form. J Clin Microbiol 1990, 28:1188-1193.
99. da Silva MI, de Carvalho IM, Franco TN, Cunha MA, Chamma LG, Fogaca J, Fecchio
D, Franco M: The use of a mixture of somatic and culture filtrate antigens in the
evaluation of the immune response to Paracoccidioides brasiliensis. J Med Vet Mycol
1991, 29:331-334.
100. San-Blas G, San-Blas F: Antigenic structure of Paracoccidioides brasiliensis. Immunol
Ser 1989, 47:171-192.
101. Mendes-Giannini MJ, Bueno JP, Shikanai-Yasuda MA, Ferreira AW, Masuda A:
Detection of the 43,000-molecular-weight glycoprotein in sera of patients with
paracoccidioidomycosis. J Clin Microbiol 1989, 27:2842-2845.
102. Puccia R, Travassos LR: The 43-kDa glycoprotein from the human pathogen
Paracoccidioides brasiliensis and its deglycosylated form: excretion and susceptibility to
proteolysis. Arch Biochem Biophys 1991, 289:298-302.
103. Ferreira-da-Cruz MF, Galvao-Castro B, Daniel-Ribeiro C: Isolation and antigenicity of a
45-kilodalton Paracoccidioides brasiliensis immunodominant antigen. Infect Immun
1992, 60:2667-2671.
104. Diez S, Gomez BL, McEwen JG, Restrepo A, Hay RJ, Hamilton AJ: Combined use of
Paracoccidioides brasiliensis recombinant 27-kilodalton and purified 87-kilodalton
antigens in an enzyme-linked immunosorbent assay for serodiagnosis of
paracoccidioidomycosis. J Clin Microbiol 2003, 41:1536-1542.
105. Camargo ZP, Unterkircher C, Travassos LR: Identification of antigenic polypeptides of
Paracoccidioides brasiliensis by immunoblotting. J Med Vet Mycol 1989, 27:407-412.
106. Puccia R, Schenkman S, Gorin PA, Travassos LR: Exocellular components of
Paracoccidioides brasiliensis: identification of a specific antigen. Infect Immun 1986,
53:199-206.
107. Restrepo A, Moncada LH: Characterization of the precipitin bands detected in the
immunodiffusion test for paracoccidioidomycosis. Appl Microbiol 1974, 28:138-144.
Referências Bibliográficas 74
108. Yarzabal LA, Bout D, Naquira F, Fruit J, Andrieu S: Identification and purification of the
specific antigen of Paracoccidioides brasiliensis responsible for immunoelectrophoretic
band E. Sabouraudia 1977, 15:79-85.
109. Casotto M, Paris S, Camargo ZP: Antigens of diagnostic value in three isolates of
Paracoccidioides brasiliensis. J Med Vet Mycol 1991, 29:243-253.
110. Mendes-Giannini MJ, Toscano E, del Negro GB, Assis CM, Garcia NM:
Immunochemical study of a Paracoccidioides brasiliensis polysaccharide-like antigen. J
Med Vet Mycol 1995, 33:379-383.
111. Franco M, Bagagli E, Cunha M, Chamma LG, Fecchio D: Paracoccidioides brasiliensis
antigen batches from the same isolate show immunological and biochemical differences.
Mycopathologia 1996, 135:13-19.
112. da Fonseca CA, Jesuino RS, Felipe MS, Cunha DA, Brito WA, Soares CM: Two-
dimensional electrophoresis and characterization of antigens from Paracoccidioides
brasiliensis. Microbes Infect 2001, 3:535-542.
113. Vicentini AP, Fazioli Rdos A, da silva DF, Zamboni IM, Kloth VR, Matano G, Assis
CM: Production and characterization of Paracoccidioides brasiliensis antigens. Rev Soc
Bras Med Trop 2001, 34:179.
114. Moura-Campos MC, Gesztesi JL, Vicentini AP, Lopes JD, Camargo ZP: Expression and
isoforms of gp43 in diferent strain of Paracoccidioides brasiliensis. J Med Vet Mycol
1995, 33:227.
115. Souza MC, Gesztesi JL, Souza AR, Moraes JZ, Lopes JD, Camargo ZP: Differences in
reactivity of paracoccidioidomycosis sera with gp43 isoforms. J Med Vet Mycol 1997,
35:13-18.
116. Berzaghi R, da Silva SH, de Camargo ZP: Variable gp43 secretion by Paracoccidioides
brasiliensis clones obtained by two different culture methods. J Clin Microbiol 2005,
43:491-493.
117. Figueroa JI, Hamilton AJ, Allen MH, Hay RJ: Isolation and partial characterization of a
Paracoccidioides brasiliensis 58 kDa extracellular glycoprotein which is recognized by
human immune sera. Trans R Soc Trop Med Hyg 1995, 89:566-572.
118. Ortiz BL, Garcia AM, Restrepo A, McEwen JG: Immunological characterization of a
recombinant 27-kilodalton antigenic protein from Paracoccidioides brasiliensis. Clin
Diagn Lab Immunol 1996, 3:239-241.
119. Ortiz BL, Diez S, Uran ME, Rivas JM, Romero M, Caicedo V, Restrepo A, McEwen JG:
Use of the 27-kilodalton recombinant protein from Paracoccidioides brasiliensis in
serodiagnosis of paracoccidioidomycosis. Clin Diagn Lab Immunol 1998, 5:826-830.
Referências Bibliográficas 75
120. Correa MM, Bedoya AM, Guerrero MP, ndez J, Restrepo A, McEwen JG: Diagnosis of
paracoccidioidomycosis by a dot blot assay using a recombinant Paracoccidioides
brasiliensis p27 protein. Mycoses 2007, 50:41-47.
121. Panunto-Castelo A, Freitas-da-Silva G, Bragheto IC, Martinez R, Roque-Barreira MC:
Paracoccidioides brasiliensis exoantigens: recognition by IgG from patients with
different clinical forms of paracoccidioidomycosis. Microbes Infect 2003, 5:1205-1211.
122. da silva DF: Análise da estabilidade de exoantigenos de Paracoccidioides brasiliensis.
Dissertação Mestrado. Secretaria de Estado da Saude de Sao Paulo, Programa de Pos
Graduaçao em Ciencias da Coordenadoria de Controle de Doenças 2005.
123. Ferrari TCA, Hamdan JS: Drogas antifúngicas. In Terapêutica Clínica. Edited by Rocha
MOC, Pedroso ERP, Fonseca JGM, Silva AO. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 1998:
251-266
124. Pathak A, Pien FD, Carvalho L: Amphotericin B use in a community hospital, with
special emphasis on side effects. Clin Infect Dis 1998, 26:338.
125. Martinez R: An update on the use of antifungal agents. J Bras Pneumol 2006, 32:449-
460.
126. Negroni R, Arechavala AI: Itraconazole: pharmacokinetics and indications. Arch Med
Res 1993, 24:387-393.
127. Yasuda MA: Pharmacological management of paracoccidioidomycosis. Expert Opin
Pharmacother 2005, 6:385-397.
128. Silva MR, de Paiva e Rosalia LF, Jesuino SA: [The evaluation of ketoconazole in mice
inoculated with Paracoccidioides brasiliensis by liver and spleen histopathology and by
the intradermal paracoccidioidin reaction]. Rev Soc Bras Med Trop 1994, 27:11-14.
129. Borgers M, Van de Ven MA: Mode of action of itraconazole: morphological aspects.
Mycoses 1989, 32 Suppl 1:53-59.
130. Espinel-Ingroff A: In vitro antifungal activities of anidulafungin and micafungin, licensed
agents and the investigational triazole posaconazole as determined by NCCLS methods
for 12,052 fungal isolates: review of the literature. Rev Iberoam Micol 2003, 20:121-136.
131. de Moura LP, Raffin CN, del Negro GM, Ferreira MS: [Paracoccidioidomycosis
evidencing spinal cord involvement treated with success by fluconazole]. Arq
Neuropsiquiatr 1994, 52:82-86.
132. Diaz M, Negroni R, Montero-Gei F, Castro LG, Sampaio SA, Borelli D, Restrepo A,
Franco L, Bran JL, Arathoon EG, et al.: A Pan-American 5-year study of fluconazole
therapy for deep mycoses in the immunocompetent host. Pan-American Study Group.
Clin Infect Dis 1992, 14 Suppl 1:S68-76.
Referências Bibliográficas 76
133. Carbonell LM: Ultrastructure of dimorphic transformation in Paracoccidioides
brasiliensis. J Bacteriol 1969, 100:1076-1082.
134. Salazar ME, Restrepo A: Morphogenesis of the mycelium-to-yeast transformation in
Paracoccidioides brasiliensis. Sabouraudia 1985, 23:7-11.
135. Shikanai-Yasuda MA, Telles Filho Fde Q, Mendes RP, Colombo AL, Moretti ML:
[Guidelines in paracoccidioidomycosis]. Rev Soc Bras Med Trop 2006, 39:297-310.
136. Franco M, Sano A, Kera K, Nishimura K, Takeo K, Miyaji M: Chlamydospore formation
by Paracoccidioides brasiliensis mycelial form. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1989,
31:151-157.
137. Samsonoff WA, Salazar ME, McKee ML, Restrepo A, Cano LE, Edwards MR: Scanning
electron microscopy of the conidia produced by the mycelial form of Paracoccidioides
brasiliensis. Mycopathologia 1991, 114:9-15.
138. Carbonell LM, Rodriguez J: Transformation of Mycelial and Yeast Forms of
Paracoccidioides brasiliensis in Cultures and in Experimental Inoculations. J Bacteriol
1965, 90:504-510.
139. Selitrennikoff CP, Nakata M: New cell wall targets for antifungal drugs. Curr Opin
Investig Drugs 2003, 4:200-205.
140. Kanetsuna F, Carbonell LM, Moreno RE, Rodriguez J: Cell wall composition of the yeast
and mycelial forms of Paracoccidioides brasiliensis. J Bacteriol 1969, 97:1036-1041.
141. San-Blas F, San-Blas G, Gil F: Production and regeneration of protoplasts from the Y-
phase of the human pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis. J Med Vet Mycol
1994, 32:381-388.
142. Peterson SW, Sigler L: Molecular genetic variation in Emmonsia crescens and Emmonsia
parva, etiologic agents of adiaspiromycosis, and their phylogenetic relationship to
Blastomyces dermatitidis (Ajellomyces dermatitidis) and other systemic fungal
pathogens. J Clin Microbiol 1998, 36:2918-2925.
143. Taylor JW: Molecular Phylogenetic classification of fungi. Arch Med Res 1995, 26:307-
314.
144. Bialek R, Ibricevic A, Fothergill A, Begerow D: Small subunit ribosomal DNA sequence
shows Paracoccidioides brasiliensis closely related to Blastomyces dermatitidis. J Clin
Microbiol 2000, 38:3190-3193.
145. Herr RA, Tarcha EJ, Taborda PR, Taylor JW, Ajello L, Mendoza L: Phylogenetic
analysis of Lacazia loboi places this previously uncharacterized pathogen within the
dimorphic Onygenales. J Clin Microbiol 2001, 39:309-314.
Referências Bibliográficas 77
146. San-Blas G, Niño-Vega G, Iturriaga T: Paracoccidioides brasiliensis and
paracoccidioidomycosis: Molecular approaches to morphogenesis, diagnosis,
epidemiology, taxonomy and genetics. Medical Mycology 2002, 40:225-242.
147. Cano MI, Cisalpino PS, Galindo I, Ramirez JL, Mortara RA, da Silveira JF:
Electrophoretic karyotypes and genome sizing of the pathogenic fungus Paracoccidioides
brasiliensis. J Clin Microbiol 1998, 36:742-747.
148. Montoya AE, Alvarez AL, Moreno MN, Restrepo A, McEwen JG: Electrophoretic
karyotype of environmental isolates of Paracoccidioides brasiliensis. Med Mycol 1999,
37:219-222.
149. Mahan MJ, Heithoff DM, Sinsheimer RL, Low DA: Assessment of bacterial
pathogenesis by analysis of gene expression in the host. Annu Rev Genet 2000, 34:139-
164.
150. Rezende TCV: Identificação de um novo antígeno de Paracoccidioides brasiliensis
(lumazina sintase) através da técnica de IVIAT. Patologia molecular, dissertação; 2006.
151. Rappleye CA, Goldman WE: Defining virulence genes in the dimorphic fungi. Annu Rev
Microbiol 2006, 60:281-303.
152. Ruas LP: Interferência da galectina-3 no curso da infecção por Paracoccidioides
brasiliensis. USP FMRP; 2005.
153. Filler SG, Sheppard DC: Fungal invasion of normally non-phagocytic host cells. PLoS
Pathog 2006, 2:e129.
154. Tavares AH, Silva SS, Dantas A, Campos EG, Andrade RV, Maranhao AQ, Brigido
MM, Passos-Silva DG, Fachin AL, Teixeira SM, et al: Early transcriptional response of
Paracoccidioides brasiliensis upon internalization by murine macrophages. Microbes
Infect 2007, 9:583-590.
155. Kurokawa CS, Sugizaki MF, Peracoli MT: Virulence factors in fungi of systemic
mycoses. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1998, 40:125-135.
156. Brigido MM, Walter ME, Oliveira AG, Inoue MK, Anjos DS, Sandes EF, Gondim JJ,
Carvalho MJ, Almeida NF, Jr., Felipe MS: Bioinformatics of the Paracoccidioides
brasiliensis EST Project. Genet Mol Res 2005, 4:203-215.
157. Bailão AM, Schrank A, Borges CL, Dutra V, Walquiria Ines Molinari-Madlum EE,
Soares Felipe MS, Soares Mendes-Giannini MJ, Martins WS, Pereira M, Maria de
Almeida Soares C: Differential gene expression by Paracoccidioides brasiliensis in host
interaction conditions: representational difference analysis identifies candidate genes
associated with fungal pathogenesis. Microbes Infect 2006, 8:2686-2697.
Referências Bibliográficas 78
158. Bastos KP, Bailao AM, Borges CL, Faria FP, Felipe MS, Silva MG, Martins WS, Fiuza
RB, Pereira M, Soares CM: The transcriptome analysis of early morphogenesis in
Paracoccidioides brasiliensis mycelium reveals novel and induced genes potentially
associated to the dimorphic process. BMC Microbiol 2007, 7:29.
159. Elliott NA, Volkert MR: Stress induction and mitochondrial localization of Oxr1 proteins
in yeast and humans. Mol Cell Biol 2004, 24:3180-3187.
160. Fridovich I: Superoxide radical and superoxide dismutases. Annu Rev Biochem 1995,
64:97-112.
161. Denis M, Forget A, Pelletier M, Skamene E: Pleiotropic effects of the Bcg gene: III.
Respiratory burst in Bcg-congenic macrophages. Clin Exp Immunol 1988, 73:370-375.
162. Blackwell JM, Toole S, King M, Dawda P, Roach TI, Cooper A: Analysis of Lsh gene
expression in congenic B10.L-Lshr mice. Curr Top Microbiol Immunol 1988, 137:301-
309.
163. Klein BS, Tebbets B: Dimorphism and virulence in fungi. Curr Opin Microbiol 2007,
10:314-319.
164. Parks LW, Casey WM: Physiological Implications of Sterol Biosynthesis in Yeast. vol.
49. pp. 95-116; 1995:95-116.
165. Kennedy MA, Barbuch R, Bard M: Transcriptional regulation of the squalene synthase
gene (ERG9) in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 1999,
1445:110-122.
166. Pichler H, Gaigg B, Hrastnik C, Achleitner G, Kohlwein SD, Zellnig G, Perktold A,
Daum G: A subfraction of the yeast endoplasmic reticulum associates with the plasma
membrane and has a high capacity to synthesize lipids. vol. 268. pp. 2351-2361;
2001:2351-2361.
167. Agnew WS, Popjak G: Squalene synthetase. Stoichiometry and kinetics of presqualene
pyrophosphate and squalene synthesis by yeast microsomes. vol. 253. pp. 4566-4573;
1978:4566-4573.
168. Barrero AF, Oltra JE, Robinson J, Burke PV, Jimenez D, Oliver E: Sterols in erg mutants
of Phycomyces: metabolic pathways and physiological effects. Steroids 2002, 67:403-
409.
169. Zhang D, Jennings SM, Robinson GW, Poulter CD: Yeast squalene synthase: expression,
purification, and characterization of soluble recombinant enzyme. Arch Biochem
Biophys 1993, 304:133-143.
Referências Bibliográficas 79
170. Bahn YS, Cox GM, Perfect JR, Heitman J: Carbonic anhydrase and CO2 sensing during
Cryptococcus neoformans growth, differentiation, and virulence. Curr Biol 2005,
15:2013-2020.
171. Klengel T, Liang WJ, Chaloupka J, Ruoff C, Schroppel K, Naglik JR, Eckert SE,
Mogensen EG, Haynes K, Tuite MF, et al: Fungal adenylyl cyclase integrates CO2
sensing with cAMP signaling and virulence. Curr Biol 2005, 15:2021-2026.
172. Mogensen EG, Janbon G, Chaloupka J, Steegborn C, Fu MS, Moyrand F, Klengel T,
Pearson DS, Geeves MA, Buck J, et al: Cryptococcus neoformans senses CO2 through
the carbonic anhydrase Can2 and the adenylyl cyclase Cac1. Eukaryot Cell 2006, 5:103-
111.
173. Bradford MM: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quatities
of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976, 72:254.
174. Ouchterlony O: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis. In Handbook of
immunodiffusion and immunoelectrophoresis. Edited by Ouchterlony O. Ann Arbor: Ann
Arbor Science publishers; 1968: 1-132
175. Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
baactheriophage T4. Nature 1970, 227:685.
176. Towbin H, Staehelin T, Gordon J: Transfer of proteins from polyacrylamide gels to
nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 1979,
76:4354.
177. Ricci G, Da Silva ID, Sano A, Borra RC, Franco M: Detection of Paracoccidioides
brasiliensis by PCR in biopsies from patients with paracoccidioidomycosis: correlation
with the histopathological pattern. Pathologica 2007, 99:41-45.
178. Andreotti PF, Monteiro da Silva JL, Teixeira EC, Bertolini MC, Soares CP, Benard G,
Mendes-Giannini MJ: Identification of a gene encoding adaptin-like protein in the
Paracoccidioides brasiliensis genome by random amplified polymorphic DNA analysis.
J Med Microbiol 2007, 56:884-887.
179. Bordon AP, Dias-Melicio LA, Acorci MJ, Calvi SA, Serrao Peracoli MT, Victoriano de
Campos Soares AM: Prostaglandin E2 inhibits Paracoccidioides brasiliensis killing by
human monocytes. Microbes Infect 2007, 9:744-747.
180. Campos EG, Jesuino RS, Dantas Ada S, Brigido Mde M, Felipe MS: Oxidative stress
response in Paracoccidioides brasiliensis. Genet Mol Res 2005, 4:409-429.
181. Tavares AH, Silva SS, Bernardes VV, Maranhao AQ, Kyaw CM, Pocas-Fonseca M,
Silva-Pereira I: Virulence insights from the Paracoccidioides brasiliensis transcriptome.
Genet Mol Res 2005, 4:372-389.
Referências Bibliográficas 80
182. Benoliel B, Arraes FB, Reis VC, Siqueira SJ, Parachin NS, Torres FA: Hydrolytic
enzymes in Paracoccidioides brasiliensis--ecological aspects. Genet Mol Res 2005,
4:450-461.
183. Cox GM, McDade HC, Chen SC, Tucker SC, Gottfredsson M, Wright LC, Sorrell TC,
Leidich SD, Casadevall A, Ghannoum MA, Perfect JR: Extracellular phospholipase
activity is a virulence factor for Cryptococcus neoformans. Mol Microbiol 2001, 39:175.
184. La Camera S, Geoffroy P, Samaha H, Ndiaye A, Rahim G, Legrand M, Heitz T: A
pathogen-inducible patatin-like lipid acyl hydrolase facilitates fungal and bacterial host
colonization in Arabidopsis. Plant J 2005, 44:810-825.
185. San-Blas G: Paracoccidioides brasiliensis: cell wall glucans, pathogenicity, and
dimorphism. Curr Top Med Mycol 1985, 1:235-257.
186. Alves LM, Figueiredo F, Brandao Filho SL, Tincani I, Silva CL: The role of fractions
from Paracoccidioides brasiliensis in the genesis of inflammatory response.
Mycopathologia 1987, 97:3-7.
187. Amaral AC, Fernandes L, Galdino AS, Felipe MS, Soares CM, Pereira M: Therapeutic
targets in Paracoccidioides brasiliensis: post-transcriptome perspectives. Genet Mol Res
2005, 4:430-449.
188. Tomazett PK, Cruz AH, Bonfim SM, Soares CM, Pereira M: The cell wall of
Paracoccidioides brasiliensis: insights from its transcriptome. Genet Mol Res 2005,
4:309-325.
189. Tafforeau L, Le Blastier S, Bamps S, Dewez M, Vandenhaute J, Hermand D: Repression
of ergosterol level during oxidative stress by fission yeast F-box protein Pof14
independently of SCF. Embo J 2006, 25:4547-4556.
190. Anjos AR, Calvi SA, Ferracini R, Peracoli MT, Silva CL, Soares AM: Role of
Paracoccidioides brasiliensis cell wall fraction containing beta-glucan in tumor necrosis
factor-alpha production by human monocytes: correlation with fungicidal activity. Med
Mycol 2002, 40:377-382.
191. Franco M, Peracoli MT, Soares A, Montenegro R, Mendes RP, Meira DA: Host-parasite
relationship in paracoccidioidomycosis. Curr Top Med Mycol 1993, 5:115-149.
192. Lorenz MC, Fink GR: The glyoxylate cycle is required for fungal virulence. Nature 2001,
412:83-86.
193. Lehninger AL, Nelson DL, M.M. C: Princípios de bioquímica Sao Paulo - Brasil: Savier;
2000.
194. Finlay BB, Falkow S: Common themes in microbial pathogenicity revisited. Microbiol
Mol Biol Rev 1997, 61:169.
9. ANEXOS
ANEXOA
ANEXO B
Fórmula e modo de preparo do Meio ágar Fava-Netto
Proteose peptona 3,0 g
Peptona de caseína 10,0 g
Extrato de carne 5,0 g
Extrato de levedura 5,0 g
Dextrose 40,0 g
Cloreto de sódio 5,0 g
Ágar 18,0 g
Cloranfenicol 150,0 mg
Água destilada q. s. p. 1.000 mL
O meio foi homogeneizado, o pH ajustado para 7,2 – 7,4, distribuído em alíquotas de 10
mL em tubos de ensaio (18 x 180 mm) e esterilizado em autoclave a 121º C, por 15 minutos.
Após autoclavação, os tubos foram inclinados sobre a bancada para solidificação do meio. Em
seguida, os tubos contendo meio de cultura foram utilizados no processo de transferência de
massa dos isolados.
Fórmula e modo de preparo do caldo YPD
Extrato de levedura 5,0 g
Peptona de caseína 5,0 g
Dextrose 15,0 g
Água destilada q. s. p 1.000 mL
O meio foi homogeneizado e seu o pH ajustado para 7,2 – 7,4. Em seguida foram
autoclavados a 121º C, por 15 minutos. Após serem retirados da autoclave, foram mantidos por
24 horas sobre a bancada, à temperatura ambiente, para confirmar o processo de esterilização.
Em seguida foram estocados em geladeira a 4ºC.
ANEXO C
Protocolo para eletroforese em gel de agarose
1. Preparar o gel de agarose de acordo com a concentração desejada (0,8%, 1% ou 1,2%).
2. Montar a base da cuba para a eletroforese, colar uma fita crepe nas laterais vedando-as
bem, encaixe o pente adequado para a cuba.
3. Preencher a cuba com o gel de agarose e aguardar a sua completa polimerização;
4. Lavar a base de corrida com NaOH a 0,5% para eletroforese.
5. Após polimerizado, acondicionar a base na cuba de corrida;
6. Adicionar o tampão de corrida TBE 0,5x até cobrir o gel de agarose.
7. Retirar o pente;
8. Preparar as amostras com o seu tampão de amostra e aplicar a mistura no gel.
9. Encaixar uma extremidade do cabo na fonte energética e a outra na base de eletroforese;
10. Correr o gel inicialmente a 30 V até que a amostra tenha saído do slots, a partir de então
poderá aumentar a corrida para 75 V, no máximo.
11. Quando a corrida atingir a altura desejada, deve-se desligar a fonte e retirar a base da
cuba. O gel deverá ser acondicionado em um recipiente para ser transportado até o
sistema de fotodocumentação onde será revelado sob a luz UV.
Preparo das soluções utilizadas na eletroforese em gel de agarose
Solução de EDTA 0,5 M (pH 8,8)
Pesar 9,306g de EDTA em um becker e adicionar aproximadamente 45mL da água.
Homogeneizar com auxílio de barra magnética e verificar o pH, se necessário corrigir com
adição de NaOH 4M até atingir o valor de 8,8. Completar o volume desta solução para 50mL.
Solução de TEB 5X
TRIS 54g
Acido bórico 27,5g
Solução de EDTA a 0,5M 20mL
Água bidestilada q.s.p. 1000mL
Pesar os componentes da solução e adicioná-los em um becker. Dissolver em 600mL de
água e aferir o volume em uma proveta até completar o volume de 1L. Homogeneizar bem.
Recomenda-se preparar 1 litro de solução TEB 0,5X para uso em eletroforese, para tanto
deve-se diluir a solução de TEB 5x pela adição de 900mL de água bidestilada em 100mL de
TEB 5X.
Gel de agarose a 1%:
Agarose para eletroforese 1g
TEB 0,5 X 100mL
Brometo de etídio q.s.p.
Pesar a agarose colocá-la em um erlenmeyer e adicionar a solução de TEB 0,5X. Fundir
em microondas até sua completa homogeneização. Em um copinho descartável colocar uma
pequena gota de brometo de etídio.
Aguardar o gel atingir a temperatura média de 65ºC e adicioná-los aos pouco no brometo
promovendo uma boa homogeneização. Verter na cuba já preparada com as fitas adesivas e com
o pente.
ANEXO D
Componentes e modo de preparo de soluções utilizadas na dosagem proteica:
Solução proteica padrão
Soro albumina bovina (BSA): diluir a concentação da solução de estoque de 10mg/mL
para 100 µg/mL e utilizar como a solução proteica padrão.
Corante Comassie Brilliant Blue G-250:
Dissolver 100 mg do corante em 50 mL de etanol a 95%. Adiconar 100 mL de ácido
fosfórico a 85% nesta mistura. Completar o volume para 1000 mL com água bidestilada e filtrar
a solução resultante em papel de filtro. Armazenar a solução obtida a 4º C.
Componentes e modo de preparo de soluções utilizadas na reação de ID:
Solução descorante
Ácido acético glacial 20 mL
Etanol 40 mL
Água destilada 40 mL
Solução corante
Solução descorante para ID 100 mL
Corante Comassie Blue Brilliant R-
250
0,15g
Componentes e modo de preparo de soluções utilizadas na técnica de SDS-PAGE:
Solução Estoque de bis – acrilamida
Acrilamida 30% 30 g
Bis - Acrilamida 0,8 g
Água bidestilada qsp 100 mL
Homogenizar a acrilamida e bis-acrilamida em 50,0 mL de água bidestilada em um
becker envolto com papel alumínio. Acertar o volume para 100,0 mL e filtrar a solução.
Estocar a 4
o
C em frasco âmbar envolto em papel alumínio.
Lower Gel Buffer
Trizma base 18,2 g
SDS 0,4 g
Água bidestilada qsp 100 mL
Adicionar 50,0 mL de água bidestilada ao trizma base, homogenizar em agitador
magnético, até completa dissolução do sal. Acertar o pH da solução para 8,8. Acrescentar o
SDS, completar o volume e filtrar a solução. Estocar a 4
o
C em frasco âmbar.
Upper Gel Buffer
Trizma base 3 g
SDS 0,2 g
Água bidestilada qsp 50 mL
Adicionar 25,0 mL de água bidestilada ao trizma base, homogenizar em agitador
magnético, até completa dissolução do sal. Acertar o pH da solução para 6,8.
Acrescentar o SDS, completar o volume e filtrar a solução. Estocar a 4
o
C em frasco
âmbar envolto em papel alumínio.
Solução de Persulfato de Amônia a 10%
Persulfato de sódio 0,5 g
Água bidestilada 5 mL
Pesar o reagente colocar em bequer de 20,0 mL e homogenizar com o auxílio de
bastão de vidro até completa dissolução do mesmo. Distribuir em alíquotas e manter
congelado a –20 °C.
Solução de Duodecil Sulfato de Sódio (SDS) a 20%
SDS (Sigma) 10,0 g
Água bidestilada 50 mL
Tampão de Amostra Redutor 5X Concentrado
Tris pH 6.8 0,6 mL
Glicerol 2,5 mL
SDS 20% 1 mL
2-Mercaptoetanol 0,5 mL
H
2
O bidestilada 4,4 mL
Os componentes devem ser homogeneizados e distribuídos em alíquotas para a
conservação à –20 °C.
Tampão de Corrida 10 vezes Concentrado
Glicina 144 g
Trizma 30,3 g
SDS 10 g
Água bidestilada qsp 1 L
Dissolver em 600 mL de água destilada a glicina e o trizma, homogenizar em agitador
magnético até completa dissolução dos reagentes. Acertar o pH da solução para 8,3. Adicionar as
10,0 g de SDS, homogenizar até completa dissolução.
Para uso, diluir na seguinte proporção:
Tampão de transferência 10 vezes concentrado 100 mL
Água bidestilada 900 mL
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