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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Avaliação da atividade farmacológica de
uma família de proteínas ligantes de
quimiocinas derivada da saliva de
carrapato
ALUNA: Ana Letícia de Oliveira Figueiredo Alessandri
Belo Horizonte
2007
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II
Avaliação da atividade farmacológica de uma família de
proteínas ligantes de quimiocinas derivada da saliva de
carrapato
Tese apresentada à comissão de Pós-
Graduação em Fisiologia e Farmacologia
do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais, para
obtenção do grau de doutor em ciências.
Aluna: Ana Letícia de Oliveira Figueiredo Alessandri
Orientador: Dr. Mauro Martins Teixeira
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Dedicatória
III
Dedico este trabalho á memória do meu avô Admildo
Agradecimentos
IV
Agradecimentos
Ao professor Mauro Martins Teixeira, por toda paciência, bom humor e generosidade. Por
fazer do Laboratório de Imunofarmacologia um ambiente tão agradável de trabalhar.
Agradeço imensamente pelos conselhos e por nos unir numa grande e diversificada família.
Ao professor André Klein, que tão pacientemente me instruiu nos meus primeiros
experimentos. Por ter meu acolhido e ter sido meu mentor, além, é claro, por ser meu querido
amigo.
À professora Denise Carmona do Departamento de Patologia do Instituto de Ciências
Biológicas da UFMG, por possibilitar a realização dos ensaios de microscopia intravital em
seu laboratório.
Ao professor Geovani Dantas Cassali do Departamento de Patologia do Instituto de Ciências
Biológicas da UFMG, por colaborar tão gentilmente nas preparações histopatológicas.
À professora Maria Salete de A. Castro do Departamento de Fisiologia e Farmacologia do
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG, por ser tão atenciosa e acolhedora. Por possibilitar
a realização de diversos experimentos em seu laboratório.
Às professoras Deborah Negrão Correa, Virgínia Soares Lemos e Walderez Ornelas Dutra do
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG, pelos proveitosos comentários feitos durante o
exame de qualificação.
Aos meus queridos amigos, que fizeram ou fazem parte do Laboratório de
Imunofarmacologia, Adriana Carvalho, Adriana Soares, Adriano, Aline, André Talvani,
Antônio, Caio, Caroline, Cris, Dani Sachs, Dani Souza, Daniel, David, Dora, Fernanda,
Fernando, Flávio Amaral, Flávio Lopes, Ester, Ildeu, Ilma, Kátia, Kênia Pompermayer,
Landa, Lucíola, Márcia, Marina, Michele, Norine, Rafael, Rodrigo, Tiça, Val, Vanessa
Mendonça e Vívian. Como eu agradeço a cada um de vocês, pelas várias horas que passamos
juntos, as brincadeiras e as colaborações despretensiosas. Aprendi com vocês o quanto é
importante trabalhar em equipe, ser tolerante e respeitar as particularidades de cada um.
Agradecimentos
V
Vocês contribuíram não só na execução de uma técnica, mas com uma palavra encorajadora
ou mesmo com uma idéia inusitada. Agradeço por vocês serem tão acolhedores de fazerem do
Laboratório de Imunofarmacolgia o meu segundo lar.
Em especial gostaria de demonstrar minha gratidão ao Remo, Vanessa e Angélica pela ajuda
direta e laboriosa nos experimentos. Pela amizade e disponibilidade.
Agradeço, mais uma vez, à Dani Souza e Vanessa, por terem lido o manuscrito da tese.
Ao Sr José Alves e sua esposa Edna por todo carinho ao longo de tanto anos. Por serem tão
acolhedores e divertidos. Os seus ensinamentos serão sempre guardados com zelo.
À família Goulart de Oliveira Costa por ter me acolhido com tanto amor. Por contribuírem na
minha formação científica e pessoal.
Às minhas amigas Alessandra, Carol, Elisa, e Geane. Por me acompanharem a tanto tempo,
por estarem sempre presentes, pelo apoio e carinho. Também agradeço ao Tutis, Anderson e
Neimar pela amizade.
À minha família, mãe, avó, tia Leila, tio Alcino, Júlia e Tiago por me encorajar e pelo amor
incondicional. Em especial à Claudinha por ter transformado a minha vida e, por me ter como
espelho e orgulho.
À Pós-Graduação em Fisiologia e Farmacologia.
Aos agentes financiadores desse projeto: CAPES, CNPq e FAPEMIG e Merck-Serono.
VI
Memória
“As coisas tangíveis tornam-se insensíveis à palma da mão.
Mas as coisas findas, muita mais que lindas essas ficarão”
Carlos Drummond de Andrade
Resumo
VII
Resumo
As quimiocinas participam de uma ampla série de eventos fisiológicos bem como do
processo patológico de várias doenças, apresentando-se, assim, como possíveis alvos para
novas estratégias terapêuticas. Alguns tipos de vírus e o Schistosoma mansoni burlam o
sistema imune do hospedeiro produzindo proteínas que seletivamente neutralizam as
quimiocinas que medeiam o processo inflamatório. Os carrapatos possuem em sua saliva uma
grande variedade de agentes como as proteínas ligantes de quimiocinas que permitem com
que eles se alimentem por logo período de tempo sem serem percebidos pelo sistema
imunológico do hospedeiro. Através de uma biblioteca de cDNA construída a partir da
glândula salivar do carrapato Rhipicephalus sanguineus foram identificadas três proteínas
ligantes de quimiocinas chamadas Evasinas que não apresentam homologia estrutural às
proteínas já descritas. Ao contrário das proteínas ligantes de quimiocinas virais e do
Schistosoma mansoni, esta família apresenta uma grande seletividade de seus membros
quanto aos ligantes. Estudos in vitro mostram que a Evasina-1 liga-se à MIP-1α/CCL3, MIP-
1β/CCL4 e PARC/CCL18. A Evasina-3 liga-se à IL-8/CXCL8 e GRO-α/CXCL1 e
homólogos murinos (KC/CXCL1-3 e MIP-2/CXCL1-2). Já a Evasina-4 liga-se à
eotaxina/CCL11 e RANTES/CCL5. No presente trabalho, nós avaliamos a atividade
farmacológica das evasinas em diferentes modelos de inflamação. A Evasina-1 inibiu o
recrutamento celular induzido por MIP-1α/CCL3, bem como diminuiu a inflamação em
modelos de hipersensibilidade do tipo tardia e fibrose pulmonar induzida pela bleomicina. De
maneira semelhante, a Evasina-3 e a Evasina-4 preveniram o influxo de neutrófilos ou
eosinófilos, respectivamente, induzido por fatores quimiotáticos ou por antígeno em animais
sensibilizados. Assim, essas novas proteínas ligantes de quimiocinas, que são menores que os
recentemente descobertos anticorpos naturais de camelos que possuem apenas a cadeia
pesada, apresentam atividade farmacológica in vivo e são eficazes em reduzir a inflamação em
modelos animais. As evasinas podem ser relevantes como estratégias antiinflamatórias no
futuro e úteis no planejamento de novos arcabouços estruturais através do planejamento
molecular racional.
Abstract
VIII
Abstract
The chemokines are involved in physiologic events and pathologic process of many
diseases. Then, they are potential targets to new therapeutics strategies. Several virus and
Schistosoma mansoni subvert their host immune system by producing proteins that selectively
neutralize the chemokines that mediate inflammatory process. The ticks present in their saliva
many agents, such as chemokines binding proteins that allow them to feed for long periods of
time without are detected by immunologic systems of host. Through cDNA library from the
salivary glands of the tick Rhipicephalus sanguineus were identificated three chemokines
binding proteins called, Evasins, that don’t have structural homology with any known
proteins. Unlike viral and Schistosoma mansoni chemokines binding proteins this family
present high selectivity to their ligands. In vitro studies showed that Evasin-1 binds to MIP-
1α/CCL3, MIP-1β/CCL4 and PARC/CCL18. The Evasin-3 binds to IL-8/CXCL8 and GRO-
α/CXCL1 and their murine homologous (KC/CXCL1-3 and MIP-2/CXCL1-2). The Evasin-4
binds to eotaxin/CCL11 and RANTES/CCL5. In the present work we evaluated the
pharmacological activity of evasins in different inflammation models. The Evasin-1 inhibited
the cellular recruitment induced by MIP-1α/CCL3 and decreased the inflammation in delayed
type hipersensiblity models and bleomycin induced pulmonary fibrosis. In a similar way,
Evasin-3 and Evasin-4 prevented the neutrophil and eosinophil influx, respectively, induced
by chemothatic factors or by antigen in sensibilized animals. Then, these chemokines binding
proteins, which are smaller than the natural camel antibodies that present only heavy chain,
have pharmacological activity in vivo and are effective in reducing inflammation in animal
models. The evasins could be relevant anti-inflammatory strategies in the future and useful for
the creation of new scafolls through rational design.
Sumário
IX
Sumário
Lista de figuras e tabelas.............................................................................................................1
Lista de abreviaturas...................................................................................................................4
I. Introdução
1) O processo inflamatório............................................................................................7
1.1) Mediadores inflamatórios......................................................................................8
1.2) Recrutamento celular ............................................................................................9
2) Quimiocinas.............................................................................................................11
2.1) Receptores de quimiocinas..................................................................................13
2.2) Funções biológicas das quimiocinas.....................................................................17
2.2.1) MIP-1α/CCL3........................................................................................18
2.2.2) Eotaxina/CCL11......................................................................................20
2.2.3) IL-8/CXCL8............................................................................................22
3) Estratégias utilizadas para interferir no sistema de quimiocinas.............................24
3.1) Pequenas moléculas como antagonistas de receptores de quimiocinas...........24
3.2) Proteínas modificadas......................................................................................28
3.3) Anticorpos........................................................................................................29
3.4) Proteínas ligantes de quimiocinas....................................................................30
II. Justificativa e objetivos........................................................................................................34
III. Material e Métodos
1) Animais...................................................................................................................37
2) Drogas e reagentes..................................................................................................37
3) Migração de leucócitos para a cavidade peritoneal induzida por MIP-
1α/CCL3.................................................................................................................37
4) Microscopia intravital.............................................................................................38
4.1) Análise histopatológica....................................................................................39
5) Reação de hipersensibilidade do tipo tardia na cavidade pleural induzida por
mBSA......................................................................................................................40
5.1) Citometria de fluxo...............................................................................................41
Sumário
X
5.2) Análise dos resultados de FACS...........................................................................42
6) Reação de hipersensibilidade do tipo tardia na pata................................................43
7) Sensibilização e indução de recrutamento celular do tipo TH2 para os
pulmões...................................................................................................................44
8) Modelo experimental de fibrose pulmonar induzida por bleomicina......................45
8.1) Lavado broncoalveolar.....................................................................................45
8.2) Retirada do pulmão e processamento das amostras.........................................46
8.3) Ensaio para detecção dos níveis de n-acetilglicosaminidase (NAG) tecidual.46
8.4) Ensaio para detecção dos níveis de mieloperoxidase (MPO) tecidual.............47
8.5) Citometria de fluxo................................................................................................47
8.5.1) Análise dos resultados de FACS.............................................................48
8.6) Detecção de citocinas e quimiocinas...............................................................48
8.7) Análise histopatológica e morfométrica..........................................................49
9) Indução do recrutamento celular para a cavidade articular induzido por KC.........50
10) Indução do recrutamento celular para a cavidade pleural induzido por lipopolissaca
rídeo (LPS) ou eotaxina/CCL11..............................................................................51
11) Sensibilização e indução do recrutamento celular para a cavidade pleural induzido
por ovalbumina (OVA)...........................................................................................52
12) Análise estatística...................................................................................................54
IV. Resultados
1) Efeito da Evasina-1 sobre o recrutamento de leucócitos induzido por MIP-
1α/CCL3.................................................................................................................56
2) Efeito da Evasina-1 sobre o processo de rolamento, adesão e migração de
leucócitos induzido por MIP-1α/CCL3..................................................................61
3) Efeito da Evasina-1 sobre a reação de hipersensibilidade do tipo tardia
convencional............................................................................................................64
4) Efeito da Evasina-1 sobre a reação de hipersensibilidade do tipo tardia
alternativa.................................................................................................................67
5) Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a lesão pulmonar induzida pela
bleomicina................................................................................................................69
5.1) Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento celular
induzido pela bleomicina..............................................................................................70
Sumário
XI
5.2) Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a produção de citocinas
induzido pela bleomicina..............................................................................................73
5.3) Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a produção de quimiocinas
induzido pela bleomicina..............................................................................................75
5.4) Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a lesão pulmonar e fibrose
induzida pela bleomicina...............................................................................................77
5.5) Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a sobrevida dos animais
instilados com a bleomicina.........................................................................................81
6) Efeito do tratamento tardio com a Evasina-1 sobre a lesão pulmonar induzida pela
bleomicina...............................................................................................................83
7) Efeito da Evasina-3 sobre o recrutamento de neutrófilos.......................................85
8) Efeito da Evasina-3 sobre o recrutamento de leucócitos induzido por antígeno....88
9) Efeito da Evasina-4 sobre o recrutamento de eosinófilos.......................................89
10) Efeito da Evasina-4 sobre o recrutamento de eosinófilos induzido por antígeno...91
V. Discussão.............................................................................................................................93
VI. Conclusão.........................................................................................................................108
VII. Referências......................................................................................................................110
VIII. Anexos...........................................................................................................................147
Lista de figuras e tabelas
1
Lista de figuras e tabelas
Figuras
Figura 1: Representação esquemática do mecanismo de recrutamento de leucócitos através do
endotélio.
Figura 2: Representação esquemática das estruturas secundárias das quatro famílias de
quimiocinas existentes.
Figura 3: Quimiocinas quanto a sua classificação e seus receptores.
Figura 4: Receptores de quimiocinas, seus ligantes, sua associação a doenças e fármacos
desenvolvidos que interferem no sistema de quimiocinas e fase de testes clínicos.
Figura 5: Perfil da distribuição celular no gráfico de tamanho versus granulosidade.
Figura 6: Efeito da administração intraperitoneal de MIP-1α/CCL3 humano sobre
recrutamento de granulócitos para a cavidade peritoneal.
Figura 7: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de granulócitos para
a cavidade peritoneal induzido pelo MIP-1α/CCL3 humano em camundongos Balb/C.
Figura 8: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de granulócitos para
a cavidade peritoneal induzido pelo MIP-1α/CCL3 humano em camundongos C57B6.
Figura 9: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de granulócitos para
a cavidade peritoneal induzido pelo MIP-1α murino em camundongos Balb/C.
Figura 10: Efeito da Evasina-1 sobre o rolamento, adesão e emigração de leucócitos no
músculo cremaster induzido por MIP-1α/CCL3 humano.
Lista de figuras e tabelas
2
Figura 11: Análise histopatológica do músculo cremaster de animais submetidos à
microscopia intravital à partir de cortes corados com hematoxilina & eosina.
Figura 12: Efeito do tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de granulócitos,
mononucleares, células CD3
+
, células CD3/CD4
+
, células CD3/CD8
+
e células CD11b
+
para a
cavidade pleural induzido pelo antígeno em animais sensibilizados.
Figura 13: Efeito do tratamento com a Evasina-1 sobre o volume da pata induzido pelo
antígeno em animais sensibilizados.
Figura 14: Efeito do tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de mononucleares e
eosinófilos para os pulmões induzido pelo antígeno em animais sensibilizados.
Figura 15: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de neutrófilos e
mononucleares para o espaço alveolar e quantidade de mieloperoxidase e N-
acetilglicosaminidase no pulmão induzido pela bleomicina.
Figura 16: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de células CD3
+
,
células CD3/CD4
+
, células CD3/CD8
+
e células CD11b
+
para o espaço alveolar induzido pela
bleomicina.
Figura 17: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a produção das citocinas TNF-α e
TGF-β mensuradas no espaço alveolar induzido pela bleomicina.
Figura 18: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a produção das quimiocinas MIP-
1α/CCL3, MCP-1/JE/CCL2 e RANTES/CCL5 mensuradas no espaço alveolar induzido pela
bleomicina.
Figura 19: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a lesão pulmonar avaliada através
de cortes histológicos corados com hematoxilina & eosina.
Figura 20: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a deposição de colágeno pulmonar
avaliada através de cortes histológicos corados Tricrômicro de Gomori.
Lista de figuras e tabelas
3
Figura 21: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a deposição de colágeno pulmonar
avaliada através da análise morfométrica de cortes histológicos corados com Tricrômicro de
Gomori.
Figura 22: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a letalidade dos animais
submetidos à fibrose pulmonar induzida pela bleomicina.
Figura 23: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-3 sobre o recrutamento de neutrófilos para
a cavidade articular induzido por KC/CXCL1-3.
Figura 24: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-3 sobre o recrutamento de neutrófilos para
a cavidade pleural induzido por LPS.
Figura 25: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-3 sobre o recrutamento de granulócitos
para a cavidade pleural induzido pelo antígeno em animais sensibilizados.
Figura 26: Efeito do pré-tratamento com a Evasina-4 sobre o recrutamento de eosinófilos para
a cavidade pleural induzido por eotaxina/CCL11 humana.
Figura 27: Efeito do tratamento com a Evasina-4 sobre o recrutamento de eosinófilos para a
cavidade pleural induzido pelo antígeno em animais sensibilizados.
Tabela
Tabela I: Nomenclatura atual e antiga para quimiocinas humanas.
Tabela II: Efeito do pós-tratamento com a Evasina-1 (10 µg por animal) sobre o recrutamento
celular, produção de citocinas e quimiocinas e deposição de colágeno induzidos pela instilação
intratraqueal de bleomicina 0,0625 U por animal.
Lista de abreviaturas
4
Lista de abreviaturas
AMPc: monofosfato cíclico de adenosina
AP-1: proteína ativadora-1
BSA: albumina de soro bovino
0
C: graus Celsius
C5a: fragmento 5a do complemento
Ca
2+
:
íon cálcio
CCR3: receptor de quimiocinas CCR 3
cDNA: ácido desoxirribonucléico codificante
CXCR2: receptor de quimiocinas CXCR 2
DAG: diacilglicerol
DNA: ácido desoxirribonucléico
EAE: esclerose auto-imune experimental
EDTA: ácido etilenodiaminotetracético
ELISA: ensaio de imunoadsorção ligado à enzima
g: gramas
GAG: glicosaminoglicano
GM-CSFR: receptor do fator estimulador de colônias de macrófagos-granulócitos
GRO: “growth-regulated oncongene”
h: horas
5-HETE: 5 hidroxieicosatetraenóico
15-HETE: 15 hidroxieicosatetraenóico
HIV-1: vírus da imunodeficiência humana 1
ICAM-1: molécula de adesão intercelular 1
Ig( ): imunoglobulina
IL-( ): interleucina
IFN-γ: interferon gama
i.p.: intraperitoneal
IP
3
: 1,4,5-inosiol trifosfato
i.pl.: intrapleural
i.v.: intravenosa
kDa: quilo Dalton
Lista de abreviaturas
5
LPS: lipopolissacarídeo
LTB
4
: leucotrieno B
4
LTC
4:
leucotrieno C
4
M: molar
MAPK: proteína quinase ativada por mitógeno
µg: microgramas
µL: microlitros
mg: miligramas
mBSA: albumina bovina metilada
min: minutos
mL: mililitros
mRNA: ácido ribonucléico mensageiro
NF-κB: fator nuclear κB
NKA: neurocinina A
NKB: neurocinina B
nm: nanômetros
OPD: o-fenilenediamino
OVA: ovalbumina
PAF: fator de ativação plaquetária
PBS: tampão fosfato de sódio
PECAM-1: molécula de adesão celular endotélio-plaqueta 1
pH: potencial hidrogeniônico
PI3K: fosfatidilinositol 3 quinase
PKC: proteína quinase C
PLC( ): fosfolipase C
s.c.: subcutânea
SCF: “stem cell factor”
SEA: antígeno do ovo do Schistosoma mansoni
SP: substância P
Th( ): “célula T helper”
TNF-α: fator de necrose tumoral α
VCAM-1: molécula de adesão de células vasculares 1
VLA-4: “very late antigen-4”
I. Introdução
Introdução
7
1) O processo inflamatório
A inflamação é uma designação geral para o conjunto de eventos que ocorre em
tecidos vascularizados após uma lesão (mecânica, física ou química), infecções ou
estimulação imunológica, a fim de eliminar o agente agressor e restabelecer a integridade
tecidual (Abbas et al., 2000). Embora, em geral, a inflamação constitua um mecanismo
defensivo muito importante contra inúmeras agressões, em muitos casos a reação instalada
pode ser maléfica, culminando em doenças debilitantes (ex: atrite reumatóide) ou mesmo
levando ao óbito (Filho, 1998; Gerard & Rollins, 2001).
Ao nível macroscópico, a resposta inflamatória é geralmente acompanhada pelos
sinais e sintomas cardinais: eritema, edema, sensação de calor, dor e alterações funcionais do
tecido acometido (Filho, 1998).
O processo inflamatório é um fenômeno multi-mediado, no qual ocorre uma
participação orquestrada de vários mediadores que se distribuem temporalmente e
espacialmente, a fim de promoverem a iniciação, amplificação e resolução do evento.
Quando ocorre lesão tecidual, uma série evolutiva de mecanismos é ativada. A reação
inflamatória local caracteriza-se primeiramente por uma vasoconstrição arteriolar passageira,
causada pela contração do músculo liso vascular. Subseqüentemente, ocorre vasodilatação
arteriolar que promove o aumento do fluxo de sangue para a área agredida, gerando hiperemia
e fluxo sanguíneo rápido. Este fenômeno é seguido por um período em que a vasodilatação é
mantida, mas a velocidade da circulação diminui. Já nas fases iniciais da hiperemia é possível
observar alterações no endotélio vascular culminando na exsudação de líquidos para o tecido
adjacente. Segue-se então, nas vênulas pós-capilares, a marginação leucocitária, processo em
que os leucócitos deixam a região central da corrente de sangue e começam a se deslocar na
margem do fluxo. Estes leucócitos rolam ao longo do endotélio e, posteriormente migram de
forma direcional e seletiva do leito vascular para o interstício, sendo este evento referido
como diapedese (Filho, 1998).
Após o recrutamento celular, os leucócitos presentes no tecido são ativados, tornando-
se fontes importantes de vários mediadores inflamatórios. Além de promoverem destruição de
um patógeno, podem contribuir para danificar os tecidos adjacentes e, portanto, aumentarem a
gravidade dos sinais e sintomas (Cara et al., 2000). Adicionalmente, alguns tipos celulares,
como macrófagos e neutrófilos exercem importante atividade fagocítica que contribui para a
destruição de patógenos, bem como na remoção de restos celulares e teciduais (Abbas et al.,
2000).
Introdução
8
Finalmente, são iniciados os eventos de reparação e remodelamento tecidual mediante
a substituição do tecido lesado por tecido conjuntivo vascularizado. O qual pode resultar em
regeneração do tecido danificado, em reparo tecidual funcional (normal), ou em casos
patológicos, pode resultar em cicatrização excessiva, insuficiente ou mesmo ausente, podendo
comprometer o funcionamento normal do órgão. (Filho, 1998).
1.1) Mediadores inflamatórios
Mediadores inflamatórios são moléculas solúveis que atuam de forma local ou
sistêmica, promovendo, controlando e modificando a inflamação. Estes mediadores podem se
originar do plasma, de células inflamatórias ou do próprio tecido lesado (Abbas et al., 2000).
Os primeiros mediadores liberados após a lesão tecidual são as aminas vasoativas (por
exemplo: histamina) liberadas a partir de grânulos pré-formados de mastócitos, basófilos e
plaquetas. Concomitantemente, sistemas enzimáticos derivados do plasma como o sistema do
complemento, a cascata de coagulação e as vias fibrinolíticas e das cininas são ativadas e seus
produtos de clivagem serão os mediadores propriamente ditos que promoverão as respostas
inflamatórias características do sistema (Rang et al., 2001).
Os mediadores lipídicos, (por exemplo: prostaglandinas, leucotrienos e fator ativador
plaquetário - PAF), os protéicos (citocinas e quimiocinas) e o óxido nítrico necessitam de
nova síntese quando requeridos. Além disso, os leucócitos recrutados para o sítio inflamatório
podem ser ativados e liberarem seus conteúdos granulares e espécies reativas de oxigênio e de
nitrogênio diretamente no interstício ou dentro dos fagossomos (Abbas et al., 2000).
Além dos mediadores da inflamação supracitados é também válido ressaltar a
participação da família de peptídeos chamada taquicininas, que inclui a substância P,
neurocinina A e neurocinina B. Quando estes mediadores são liberados de forma antidrômica
dos neurônios sensitivos sensíveis à capsaicina, produzem uma variedade de respostas
características da inflamação, sendo chamada de inflamação neurogênica (Harrison &
Geppetti, 2001). Assim, podemos observar que os mediadores inflamatórios contribuem tanto
para o desencadeamento, quanto para a perpetuação e a resolução do processo inflamatório.
Introdução
9
1.2) Recrutamento celular
No recrutamento dos leucócitos da medula óssea para os tecidos e manutenção desses
no sítio inflamatório é necessária uma participação orquestrada de moléculas de adesão e
mediadores inflamatórios. Conforme pode ser visualizado na Figura 1, este processo pode ser
dividido nas seguintes fases: contato inicial com a parede do vaso (“tethering”); rolamento ao
longo da parede do vaso; adesão firme do leucócito ao endotélio; transmigração.
Em resposta a um estímulo apropriado, os leucócitos circulantes interagem e rolam
sobre as células endoteliais ativadas das vênulas pós-capilares. Este processo é mediado,
predominantemente, por selectinas presentes sobre os leucócitos (L-selectinas) e células
endoteliais (P e E-selectinas) e seus ligantes carboidratos (PSGL-1, ESL-1 e CD34) (Sako et
al., 1993; Steegmaier et al., 1995; Kubes, 2002). Os leucócitos frouxamente ligados à célula
endotelial podem ser ativados por fatores quimiotáticos incluindo, fator 5 do complemento
(C5a), IL-8/CXCL8, PAF, eotaxina/CCL11 e leucotrieno B
4
(LTB
4
), o que acarreta no
aumento da regulação e da afinidade de integrinas (família CD11/CD18, “very late antigen-4”
VLA-4) presentes na superfície dos leucócitos. Essas moléculas promovem uma adesão firme
à célula endotelial devido a ligação aos seus ligantes, incluindo a molécula de adesão
intercelular 1 (ICAM-1) e a molécula de adesão de células vasculares 1 (VCAM-1) (Springer
et al., 1994). Subseqüentemente, os leucócitos migram para o interstício devido à participação
de integrinas e das moléculas de adesão celular endotélio-plaqueta 1 (PECAM-1) presentes na
junção intercelular. Quando estabelecidas no local da lesão, as células são ativadas por
mediadores que induzem a liberação de produtos do leucócito (Kita et al., 1992; Fujisawa et
al., 2000). Além disso, estas células podem sofrer ação de agentes que aumentam a sobrevida
da célula e, assim, contribuem para elevar o tempo de permanência desta no sítio inflamatório
(Walsh, 2000; Serhan & Savill, 2005).
Introdução
10
Quimiocinas na
superfície de células
endoteliais
Quimiocinas no tecido
Endotélio
Integrin
Selectin
Leucócito
Rolamento
Adesão
Firme
Transmigração
Leucócito
toca o
endotélio
Ativação progressiva
Figura 1
Representação esquemática do mecanismo de recrutamento de leucócitos através do
endotélio. Adaptado de http://bme.virginia.edu/ley/main.html
Introdução
11
2) Quimiocinas
As quimiocinas formam uma superfamília de pequenas citocinas (8-14 KDa) que
participam do recrutamento de leucócitos. As primeiras quimiocinas a serem identificadas,
MCP-1/CCL2, IL-8/CXCL8 e PF-4/CXCL4 foram isoladas na década de 1980 como fatores
secretados durante o processo inflamatório e, capazes de atrair subtipos específicos de
fagócitos e monócitos (Baggiolini, 1998; Rossi & Zlotnik, 2000; Loetscher et al., 2000).
Já foram identificadas cerca de 50 quimiocinas em seres humanos. Apesar da
seqüência de aminoácidos demonstrar baixa homologia entre algumas quimiocinas, uma
característica desta subfamília é a presença de uma estrutura terciária bastante conservada,
composta de três fitas beta-pregueadas seguidas de uma alfa-hélice, estabilizadas por alguns
resíduos de cisteína. Assim, dependendo da presença ou ausência de resíduos de aminoácidos
intercalados entre as cisteínas amino-terminais, as quimiocinas podem ser divididas em 4
grupos: CC (duas cisteínas ligadas diretamente), CXC (duas cisteínas separadas por um
resíduo de aminoácido), C (apenas uma cisteína na porção amino-terminal) ou CX
3
C (duas
cisteínas separadas por três resíduos de cisteína) (Lau et al., 2004a). A Figura 2 mostra uma
representação esquemática da estrutura secundária das quatro classes de quimiocinas
existentes.
Comumente, as quimiocinas são classificadas como “inflamatórias” (induzidas) ou
“homeostáticas” (constitutivas) (Campbell & Butcher, 2000). No entanto, as quimiocinas de
uma classe podem ser capazes de influenciar a expressão e localização da outra classe e,
algumas quimiocinas podem apresentar ambas as funções. (Moser & Loetscher, 2001). As
quimiocinas inflamatórias são produzidas por diferentes tipos celulares e seu papel principal é
a defesa do hospedeiro. Elas também podem ser expressas por leucócitos recrutados em
resposta às toxinas bacterianas e mediadores inflamatórios como interleucina 1 (IL-1) e fator
de necrose tumoral (TNF-α). Em contrapartida, as quimiocinas homeostáticas são
constitutivamente expressas em algumas áreas dos tecidos linfóides. Estas quimiocinas
controlam o transporte de linfócitos durante a maturação, diferenciação e ativação. Também
participam diretamente do “homing” destas células para os tecidos linfóides secundários.
(Campbell & Butcher, 2000).
Introdução
12
Figura 2
Representação esquemática das estruturas secundárias das quatro famílias de quimiocinas
existentes. Adaptado de Frederick & Clayman, 2001.
Introdução
13
2.1) Receptores de quimiocinas
O primeiro receptor de quimiocinas a ser isolado foi o receptor de IL-8/CXCL8 e,
diferentemente das outras citocinas, observou-se que as quimiocinas exercem seus efeitos
biológicos através da ativação de receptores com sete domínios transmembrana acoplados à
proteína G (Holmes et al., 1991; Murphy & Tiffany, 1991). Atualmente, já foram descritos
cerca de 20 tipos de receptores para as quimiocinas (Allen et al., 2007).
Na literatura são utilizados dois sistemas de nomenclaturas para nomear as
quimiocinas e seus receptores. As abreviações tradicionais são originárias da época da
descoberta de cada quimiocina. Na nomenclatura sistemática combina-se o número e o
espaçamento das cisteínas da porção N-terminal com a letra L ou R para designar ligante ou
receptor, respectivamente, acompanhados de uma numeração exclusiva para cada quimiocina
ou receptor (Murphy et al., 2000). A Tabela 1 mostra a nomenclatura atual e antiga para as
quimiocinas humanas.
A ligação da quimiocina ao seu receptor promove uma mudança conformacional que
culmina na dissociação das subunidades α e βγ da proteína G acoplada ao receptor.
Subseqüentemente, a liberação de G
βγ
ativa uma grande variedade de enzimas, incluindo
quinases de fosfolípides e lipases. Estas enzimas regulam a fosforilação de segundos
mensageiros lipídicos e a produção e liberação de segundos mensageiros como, (1,4,5-inosiol
trifosfato) IP
3
, (íon cálcio) Ca
2+
e (diacilglicerol) DAG. Por outro lado, a liberação da
subunidade G
α
pode regular a liberação e geração de monofosfato cíclico de adenosina
(AMPc) (Wong & Fish, 1998; Wong et al., 2001; Scandella et al., 2002; Johnson et al.,
2004).
Essas cascatas de transdução de sinal promovem rearranjo do citoesqueleto dos
leucócitos e aumento da regulação de moléculas de adesão dos mesmos, contribuindo para o
processo de quimiotaxia. Além disso, as quimiocinas podem promover o aumento da
explosão respiratória, desgranulação, fagocitose e aumento da produção de mediadores
lipídicos (Horuk, 2001a).
A Figura 3 mostra os receptores de quimiocinas e seus pares até então identificados.
Os receptores que são expressos constitutivamente são mostrados em azul, enquanto aqueles
que são induzidos por inflamação são mostrados em vermelho.
O sistema de quimiocinas é complexo, uma vez que já foram descritas mais de 50
quimiocinas e somente cerca de 20 receptores. Além disso, existe uma aparente sobreposição
Introdução
14
e redundância de ligantes e receptores. Uma quimiocina pode se ligar a diferentes receptores
e, um receptor pode interagir com várias quimiocinas (Murphy et al., 2000). Este fato pode
ser visualizado na Figura 3, onde, por exemplo, RANTES/CCL5 é capaz de se ligar e ativar
os receptores CCR1, CCR3 e CCR5. Por outro lado, CCR5 é ativado por MIP-1α/CCL3 e
MIP-1β/CCL4, RANTES/CCL5 e MCP-2/CCL8.
Introdução
15
Tabela 1
Nomenclatura atual e antiga para quimiocinas humanas.
Introdução
16
Figura 3
Quimiocinas quanto a sua classificação e seus receptores. Adaptado de Johnson et al., 2005.
Constitutivos: migração
basal ou “homing”
Indutíveis:inflamatórios
Introdução
17
2.2) Funções biológicas das quimiocinas
Além de apresentarem atividade quimiotática sobre diversos tipos celulares (Murphy,
1994; Sozzani et al., 1997; Takano et al., 1999), as quimiocinas e seus receptores estão
envolvidos em uma ampla série de outros fenômenos fisiológicos e patológicos, entre eles:
diferenciação celular, ativação celular, organogênese, hematopoiese, angiogênese, condições
auto-imunes (psoríase, artrite reumatóide e esclerose múltipla), doenças pulmonares (asma e
doença pulmonar obstrutiva crônica), formação de metástases e rejeição a transplantes
(Gerard & Rollins, 2001; Godessart & Kunkel, 2001; Luther & Cyster, 2001; Mackay, 2001;
Lukacs et al., 2001; Azenshtein et al., 2002; Robinson et al., 2003; Amin, et al., 2005; Allen
et al., 2007). O vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) também utiliza os
receptores de quimiocinas como cofatores essenciais durante a entrada do vírus na célula alvo
(Zaitseva et al., 2003; Lusso, 2006).
A seguir será abordado mais especificamente o papel das quimiocinas MIP-1α/CCL3,
eotaxina/CCL11 e IL-8/CXCL8 que foram o foco do nosso trabalho.
Introdução
18
2.2.1) MIP-1α/
α/α/
α/CCL3
MIP-1α (macrophage inflammatory protein α) é uma proteína da família CC de
quimiocinas que foi primeiramente identificada e purificada por Wolpe e cols. em 1988. De
acordo com a nomenclatura atual, essa quimiocina passa a ser chamada de CCL3 (Murphy et
al., 2000).
O gene que codifica MIP-1α/CCL3 é induzido na maioria das células hematopoiéticas
maduras. Monócitos, linfócitos T, linfócitos B, neutrófilos, células dendríticas, mastócitos e
células NK podem produzir grandes quantidades de MIP-1α/CCL3 (vários nanogramas/10
6
células), enquanto plaquetas, osteoblastos, astrócitos e microglia, células endoteliais,
fibroblastos e outras células produzem menor quantidade de quimiocina quando estimuladas.
A produção de MIP-1α/CCL3 pode ser induzida por vários agentes pró-inflamatórios
incluindo lipopolissacarídeo (LPS), substância P, infecções virais, TNF-α, interferon gama
(IFN-γ) e IL-1α/β. Entretanto, o tratamento com interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10)
ou dexametasona inibe a produção de MIP-1α/CCL3 (Hachicha et al., 1995; Rodenburg et
al., 1998; Teixeira et al., 1998; Becker & Soukup, 1999; Gosset et al., 1999; Sallusto et al.,
1999; Maurer & Von Stebut, 2004).
Os efeitos biológicos de MIP-1α/CCL3 são mediados pelos receptores CCR1 e CCR5,
que pertencem à família de receptores acoplados à proteína G e expressos em vários tipos
celulares, incluindo monócitos, linfócitos T, neutrófilos, eosinófilos e células dendríticas
(Alkhatib et al., 1996; Granelli-Piperno et al., 1996; Bleul et al., 1997; Sica et al., 1997;
Wong & Fish, 1998; Bonecchi et al., 1999; Elsner et al., 2000).
Concentrações aumentadas de MIP-1α/CCL3 têm sido observadas em várias
condições inflamatórias graves, incluindo artrite reumatóide, fibrose pulmonar idiopática,
sarcoidose, asma e dermatite atópica (Standiford, 1993; Koch, et al., 1994; Cruikshank, et al.,
1995; Hatano, et al., 1999).
In vitro, MIP-1α/CCL3 demonstra atividade quimiotática para linfócitos B, linfócitos
T ativados (CD8
+
> CD4
+
), células NK, basófilos, células dendríticas, eosinófilos e
neutrófilos (Rot et al., 1992; Bischoff et al., 1993; Schall et al., 1993; Taub et al., 1993;
Maghazachi et al., 1994; Sozzani et al., 1997; Takano et al., 1999). Vários estudos em
modelos animais têm demonstrado que o tratamento com anticorpo anti-MIP-1α/CCL3
promove diminuição do recrutamento e/ou ativação de linfócitos, monócitos, eosinófilos,
mastócitos e neutrófilos (Smith et al., 1994; Lukacs et al., 1995; Tedla et al., 1998; Wang et
Introdução
19
al., 1998; Das et al., 1999). Outra atividade importante desta quimiocina é a regulação da
resposta imune pela modulação da diferenciação de linfócitos T acessórios. Este fato é
confirmado pela polarização de “células T helper 2” (Th2) apresentada por animais
deficientes do gene que codifica o receptor CCR5, um dos receptores de MIP-1α/CCL3 e pela
maior produção de MIP-1α/CCL3 por linfócitos Th1 comparado aos linfócitos Th2 (Schrum
et al., 1996).
Pelo exposto acima podemos observar que MIP-1α/CCL3 participa da patogênese de
muitas condições inflamatórias e doenças, incluindo asma, formação de granuloma,
cicatrização, artrite reumatóide, esclerose múltipla, pneumonia e psoríase (Murdoch & Finn,
2000). Além disso, MIP-1α/CCL3 participa da resposta imune contra patógenos, como vírus
ou parasitas (Aliberti et al., 2000; Menten et al., 2002). Desta forma, o desenvolvimento de
fármacos capazes de neutralizar a ação de MIP-1α/CCL3 poderia ser uma útil estratégia
terapêutica no tratamento de doenças autoimunes, além de doenças inflamatórias.
No presente trabalho nós utilizamos modelos experimentais de doenças descritas como
dependentes da liberação e função de MIP-1α/CCL3, incluindo hipersensibilidade do tipo
tardia (Doyle et al., 1997) e fibrose pulmonar induzida por bleomicina (Standiford et al.,
1993; Smith et al., 1994; Ishida et al., 2007)
Introdução
20
2.2.2) Eotaxina/CCL11
A eotaxina/CCL11 é uma quimiocina da família CC que tem sido considerada uma
molécula quimioatraente relevante para o recrutamento de eosinófilos para locais de reação
alérgica (Jose et al., 1994; Gonzalo et al., 1996; Das et al., 1997; Humbles et al., 1997;
Teixeira et al., 1997; Rothenberg, 1999; Klein et al., 2001), bem como para a manutenção
basal dessas células em alguns tecidos (Humbles et al., 1997; Rothenberg et al., 1997;
Matthews et al., 1998). Diversos trabalhos têm demonstrado aumento local da expressão de
mRNA para eotaxina/CCL11 ou mesmo da proteína em reações alérgicas em modelos
experimentais ou em pacientes asmáticos (Gonzalo et al., 1996; Humbles et al., 1997;
Lamkhioued et al., 1997; Ying et al., 1997). Na verdade, esse aumento da eotaxina/CCL11
correlaciona-se à migração de eosinófilos para o sítio inflamatório (Gonzalo et al., 1996;
Humbles et al., 1997).
Os efeitos biológicos da eotaxina/CCL11 são mediados pelo receptor de quimiocinas
CCR 3 (CCR3) que é um receptor acoplado à proteína G e expresso em vários tipos celulares,
incluindo eosinófilos, basófilos, linfócitos Th2 e mastócitos (Uguccioni et al., 1997; Ochi et
al., 1999; Bandeira-Melo et al., 2001a). A ligação da eotaxina/CCL11 ao receptor CCR3
expresso na superfície dos eosinófilos ativa proteínas Gα inibitórias (G
αi
) e culmina no
influxo transiente de íons cálcio (Ca
2+
) seguido rapidamente pela polimerização da actina e
mudança de forma do granulócito (Elsner et al., 1996; Tenscher et al., 1996; Boehme et al.,
1999). Posteriormente, a sinalização de CCR3 para quimiotaxia envolve a fosforilação e
ativação de tirosinas quinase (El-Shazly et al., 1999) e proteínas quinase ativadas por
mitógeno (MAPK) (Boehme et al., 1999; Kampen et al., 2000). Além de promover
quimiotaxia, a ligação da eotaxina/CCL11 ao CCR3 ativa os eosinófilos. As respostas efetoras
mediadas por CCR3 em eosinófilos incluem produção de espécies reativas do oxigênio
(Elsner et al., 1996; Tenscher et al., 1996), produção de leucotrieno C
4
(LTC
4
) e formação de
corpos lipídicos (Bandeira-Melo et al., 2001b), liberação de grânulos contendo proteínas
catiônicas (El-Shazly et al., 1998; Kampen et al., 2000) e liberação de IL-4 pré-formada
(Bandeira-Melo et al., 2001c).
Além da eotaxina/CCL11, CCR3 possui outros ligantes, incluindo RANTES/CCL5,
MCP-3/CCL7, MCP-4/CCL13, eotaxina-2/CCL24, eotaxina-3/CCL26 (Bandeira-Melo et al.,
2001a). Entretanto, RANTES/CCL5, MCP-3/CCL7 e MCP-4/CCL13 não são seletivos para
CCR3 e podem agir em outros receptores (Rothenberg, 1999). De maneira similar à
Introdução
21
eotaxina/CCL11, o receptor CCR3 tem sido associado ao recrutamento de eosinófilos em
modelos murinos de reação alérgica e em pacientes com asma (Health et al., 1997; Ying et
al., 1997; Ma et al., 2002). Além disso, o antagonismo de CCR3 ou a depleção do gene que
codifica CCR3 diminui significativamente a migração de eosinófilos e a hiperreatividade das
vias aéreas em modelo murino de asma (Gonzalo et al., 1998; Ma et al., 2002).
No presente trabalho, nós utilizamos o modelo experimental de pleurisia alérgica
induzida por ovalbumina onde é possível avaliar o recrutamento de eosinófilos dependente de
eotaxina/CCL11 (Klein et al., 2001).
Introdução
22
2.2.3) Interleucina-8/CXCL8
A interleucina-8 (IL-8)/CXCL8 foi purificada e molecularmente clonada como um
fator quimiotático de neutrófilos originado do sobrenadante de células mononucleares
estimuladas com LPS (Matsushima et al., 1988; Yoshimura et al., 1987). Esta identificação
foi sucedida pela descoberta de outras proteínas da família CXC de quimiocinas.
As quimiocinas CXC podem ser subdivididas de acordo com a presença do motivo
ELR (glutamina-leucina-arginina) que precede a porção N-terminal destas proteínas. Essa
classificação correlaciona-se às diferenças funcionais. As quimiocinas CXC ELR+ (GRO-
α/CXCL1, GRO-β/CXCL2, GRO-γ/CXCL3, ENA-78/CXCL5, GCP-2/CXCL6, NAP-
2/CXCL7 e IL-8/CXCL8) ligam-se aos receptores CXCR1 e/ou CXCR2 com grande
afinidade e apresentam efeito quimiotático potente, particularmente sobre neutrófilos
(Murphy, 1994; Ahuja & Murphy, 1996) e, exibem potente atividade angiogênica (Strieter et
al., 1995). Já as quimiocinas CXC ELR- (PF-4/CXCL4, MIG/CXCL9, IP-10/CXCL10,
ITAC/CXCL11, SDF-1α/β/CXCL12, BCA-1/CXCL13 e BRAK/CXCL14) são mais seletivas
para linfócitos e monócitos e, inibem a angiogênese (Frederick & Clayman, 2001). Acredita-
se que proteínas relacionadas ao “growth-regulated oncongene” (GRO), como CXCL1, 2, e 3
funcionam como substitutos de IL-8/CXCL8 em ratos e camundongos, uma vez que estes
animais não produzem IL-8/CXCL8 e CXCR1 (Zagorski & Delarco, 1993; Zhang et al.,
2001).
A IL-8/CXCL8 pode ser produzida por vários tipos celulares, incluindo células
leucocitárias (monócitos, células T, neutrófilos e células NK) e células somáticas não
leucocitárias (células endoteliais, fibroblastos e células epiteliais) (Oppenheim et al., 1991;
Mukaida et al., 1992; Baggiolini et al., 1997; Mukaida, 2000). A produção de IL-8/CXCL8
não é constitutiva, mas induzida por citocinas pró-inflamatórias como IL-1 e TNF-α
(Matsushima et al., 1988). Além disso, a produção de IL-8/CXCL8 pode ser induzida por
bactérias (Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa) (DiMago et al., 1995; Aihara et al.,
1997), produtos bacterianos (LPS) (Oppenheim et al., 1991; Baggiolini et al., 1997), vírus
(adenovírus, rinovírus, vírus respiratório formador de sincício, citomegalovírus) (Johnston et
al., 1997; Casola et al., 2000; Murayama et al., 1997; Alcorn et al., 2001) e por produtos
virais (proteína X do vírus B de hepatite) (Mahe et al., 1991; Polyak et al., 2001). Fatores
ambientais também podem induzir a produção de IL-8/CXCL8 por diversos tipos celulares.
Condições de hipóxia estimulam vários tipos de células tumorais a produzir grande
Introdução
23
quantidade de IL-8/CXCL8 através da ativação cooperativa de fator nuclear κB (NF-κB) e
proteína ativadora-1 (AP-1) (Kunz et al., 1999; Xu et al., 1999). Devido ao fato de IL-
8/CXCL8 possuir uma atividade angiogênica (Koch et al., 1992; Strieter et al., 1995; Belperio
et al., 2000), condições de hipóxia podem promover neovascularização pela indução da
produção de IL-8/CXCL8.
Os efeitos biológicos de IL-8/CXCL8 são mediados pelos receptores CXCR1 e
CXCR2, que pertencem à família de receptores acoplados à proteína G e expressos em vários
tipos celulares, incluindo neutrófilos, monócitos, células NK e linfócitos (Chuntharapai et al.,
1994; Morohashi et al., 1995). In vitro, CXCR1 exibe uma menor afinidade por IL-8/CXCL8
e requer uma maior concentração da proteína para internalização e reciclagem, comparado à
CXCR2 (Chuntharapai & Kim, 1995).
Vários trabalhos têm evidenciado uma participação relevante de IL-8/CXCL8 na
migração de neutrófilos (Carveth et al., 1989; Huber et al., 1991; Burns et al., 1996; Mul et
al., 2000). Além disso, esta quimiocina pode ativar muitas funções dos neutrófilos, como
desgranulação e explosão respiratória (Oppenheim et al., 1991; Mukaida, 2000). IL-8/CXCL8
ativa 5-lipoxigenase com liberação de LTB
4
e ácido 5-hidroxieicosatetranóico na presença de
ácido araquidônico exógeno (Schroder, 1989) e, induz a síntese de PAF (Bussolino et al.,
1992). Embora as funções de IL-8/CXCL8 sejam muito citadas com relação aos neutrófilos,
esta citocina também exibe atividade quimiotática e ativadora sobre outros tipos celulares,
como basófilos, linfócitos e monócitos (Dahinden et al., 1989; Larsen et al., 1989; Bischoff
et al., 1991; Kuna et al., 1991; Geiser et al., 1993; Bacon et al., 1994; Gerszten et al., 1999).
Conforme ressaltado anteriormente, uma atividade angiogênica tem sido documentada
para todas as quimiocinas CXCL8 ELR+ (Koch et al., 1992; Strieter et al., 1995). Estas
quimiocinas podem induzir a migração de células endoteliais que expressam CXCR1 e
CXCR2. Além disso, IL-8/CXCL8 induz a perda de adesão dos fibroblastos e promove
quimiotaxia e quimiocinese dos mesmos (Dunlevy & Couchman, 1995).
Diversos estudos têm mostrado concentrações aumentadas de IL-8/CXCL8 em
algumas condições patológicas onde os neutrófilos representam um importante papel na
patogênese da doença como artrite reumatóide (Kraan et al., 2001), fibrose pulmonar
idiopática (Carre et al., 1991; Car et al., 1994; Ziegenhagen et al., 1998) e infecções
bacterianas (Mukaida, 2000).
No presente trabalho, nós utilizamos modelos experimentais onde é possível avaliar o
recrutamento de neutrófilos dependente de KC/CXCL1-3 e MIP-2/CXCL1-2, incluindo
migração celular para a cavidade articular e para a cavidade pleural.
Introdução
24
3) Estratégias utilizadas para interferir no sistema de quimiocinas
Uma vez que é notória a participação das quimiocinas no processo fisiopatológico de
várias doenças, o desenvolvimento de estratégias farmacológicas que interfiram no sistema de
quimiocinas apresenta grande potencial terapêutico. No entanto, existe uma freqüente
resistência quanto ao uso do sistema de quimiocinas como forma de terapia, devido à aparente
redundância e promiscuidade entre ligantes e receptores, o que poderia culminar em falta de
especificidade e ocorrência de efeitos indesejáveis. Em contrapartida, resultados obtidos
utilizando-se animais “knockout”, anticorpos monoclonais e antagonistas de receptores
(Kennedy et al., 1998; Balashov et al., 1999; Rottman et al., 2000; Izikson et al., 2000; Peters
et al., 2001) dão suporte para o entendimento de que o sistema de quimiocinas apresenta-se
“finamente” regulado in vivo tanto temporalmente quanto espacialmente para alcançar um
sofisticado grau de especificidade.
A seguir serão apresentadas as principais formas de intervenção no sistema de
quimiocinas utilizadas por companhias farmacêuticas.
3.1) Pequenas moléculas como antagonistas de receptores de quimiocinas
A estratégia mais amplamente utilizada para impedir a interação entre uma quimiocina
e seu receptor é administrar pequenas moléculas antagonistas. Os primeiros receptores de
quimiocinas CXC, CXCR1 e CXCR2, foram identificados em 1991 (Holmes et al., 1991;
Murphy & Tiffany, 1991), seguidos pelo primeiro receptor de quimiocinas CC, CCR1, em
1993 (Neote et al., 1993). O interesse em desenvolver antagonistas para os receptores de
quimiocinas ganhou impulso em 1996, após a demonstração do papel de CCR5 com um co-
receptor essencial para a infecção pelo vírus HIV-1 (Liu et al., 1996; Samson et al., 1996).
Em paralelo, muitos progressos foram feitos a respeito da criação de animais “knockouts” e
transgênicos, que contribuíram para mostrar a participação de quimiocinas e seus receptores
em doenças inflamatórias e auto-imunes (Cacalano et al., 1994; Cook et al., 1995; Boring et
al., 1998). Desta forma, várias indústrias farmacêuticas começaram a investir em programas
para desenvolver pequenas moléculas antagonistas de receptores de quimiocinas. Basta dizer
que os receptores com sete domínios transmenbrana acoplados à proteína G são os alvos mais
utilizados para o desenvolvimento de novos medicamentos e, que cerca de 30 % dos fármacos
atualmente comercializados interferem neste sítio. Entretanto, somente em 1998 é que foram
Introdução
25
relatadas as primeiras pequenas moléculas antagonistas (Hesselgesser et al., 1998; White et
al., 1998).
A identificação de antagonistas para os receptores de quimiocinas não foi uma tarefa
fácil, pois muitos dos ligantes destes receptores são pequenas moléculas como a histamina,
dopamina e outros peptídeos, enquanto as quimiocinas são relativamente grandes. Além disso,
grande parte dos receptores de quimiocinas interage com diferentes ligantes, logo, uma
pequena molécula que impede o sítio de ligação de uma quimiocina, não necessariamente
inibe os outros ligantes, demonstrando que uma inibição competitiva não é adequada para
impedir a ligação de todos os ligantes (Cox et al., 2001; Xanthou et al., 2003). Outro fator
agravante para a geração de antagonistas foi encontrar modelos animais apropriados para
testar a eficácia do fármaco, uma vez que estes apresentavam baixa afinidade por receptores
não humanos (Berger et al., 1999) e eram necessárias altas doses nos ensaios (Auten et al.,
2001; Horuk et al., 2001b, c).
Hoje existem diversas patentes e artigos sobre pequenas moléculas antagonistas. Além
disso, várias destas moléculas já estão sendo testadas em fases avançadas de ensaios clínicos.
A Figura 4 mostra os receptores de quimiocinas, seus ligantes, sua associação a algumas
doenças e fármacos que interferem nesse sistema em estágio de estudo clínico no ano de
2006. Os receptores mostrados em vermelho são induzidos por citocinas pró-inflamatórias e,
assim, são freqüentemente associados às doenças inflamatórias e auto-imunes. Os receptores
mostrados em azul são expressos constitutivamente e participam do tráfego basal de células.
A seguir serão apresentados três exemplos de alvos estudados atualmente em ensaios
clínicos: CCR1, CCR5 e CXCR4.
Alguns trabalhos têm evidenciado a participação do receptor CCR1 em doenças auto-
imunes como artrite reumatóide, doença inflamatória intestinal e esclerose múltipla (Schwarz
& Wells, 1999; Liang et al., 2000; Horuk et al., 2001b, c). Várias moléculas antagonistas do
receptor já foram descritas (Liang et al., 2000, Horuk et al., 2001b, Anders et al., 2002). O
membro mais promissor desta classe de compostos, BX 471, é capaz de se ligar com grande
afinidade ao receptor e impedir sua ativação pelas quimiocinas MIP-1α/CCL3,
RANTES/CCL5 e MCP-3/CCL7. Assim, os efeitos biológicos mediados por este receptor,
incluindo mobilização de cálcio, aumento da expressão de CD11b e migração celular são
inibidos (Liang et al., 2000). Em animais foi observado que esse antagonista é capaz de
diminuir a gravidade clínica em modelo de esclerose auto-imune experimental (EAE) (Liang
et al., 2000), retardar a rejeição de transplante cardíaco (Horuk et al., 2001b), bem como
reduzir acúmulo celular e a fibrose em modelo de obstrução unilateral do ureter (Anders et al.,
Introdução
26
2002). Ensaios farmacocinéticos mostram que BX 471 é ativo oralmente com uma
biodisponibilidade de 60 % em cães (Liang et al., 2000). No ano de 2006, o antagonista BX
471 encontrava-se na Fase II de estudo clínico para tratamento de esclerose múltipla.
Conforme ressaltado anteriormente, os receptores CXCR4 e CCR5 são muito
relevantes para a infecção pelo HIV-1, sendo que após a ligação da proteína viral gp120 ao
CD4 da célula alvo, ocorre a ligação ao correceptor CCR5 ou CXR4 celular promovendo
rearranjo molecular na membrana do envelope viral resultando na fusão das membranas da
célula e do vírus (Zaitseva et al., 2003; Lusso, 2006). Dessa maneira, torna-se notório o
interesse das indústrias farmacêuticas em desenvolver estratégias que regulem a ação desses
receptores. Embora ainda não tenha sido aprovado nenhum antagonista de receptor de
quimiocinas para o tratamento do HIV, muitas moléculas antagonistas de CXCR4 e CCR5
estam sendo desenvolvidas e testadas com potencial terapêutico (De Clercq, 2005; Goebel &
Juelg, 2005).
Em adição aos problemas usuais associados à geração novos fármacos (seletividade,
biodisponibilidade oral, toxicidade, etc), as tentativas de desenvolver inibidores da entrada do
HIV-1 são muitas vezes excluídas por questões associadas à rápida evolução do vírus,
acarretando em resistência aos fármacos. Por exemplo, ao impedir apenas um dos caminhos
utilizados pelo HIV-1 para entrar na célula, o outro caminho pode ser tornar dominante. Na
tentativa de resolver este problema, a AnorMed anunciou o desenvolvimento de um
antagonista que é capaz de agir sobre CCR5 e CXCR4 (Anormed Inc., 2002), mas pouco é
sabido sobre seu mecanismo de ação.
Introdução
27
Figura 4
Receptores de quimiocinas, seus ligantes, sua associação a doenças, fármacos desenvolvidos
que interferem no sistema de quimiocinas e fase de testes clínicos. Abreviações: AR, artrite
reumatóide; DPOC, doença pulmonar obstrutiva crônica; DII, doença inflamatória intestinal;
EM, esclerose múltipla. Adaptado de Wells et al., 2006.
Sepse
Aterosclerose
Psoríase
AR
DPOC
Transplante
EM
Psoríase
AR
AIDS
Câncer
Transplante de
medula óssea
EM
AR
Transplante
Asma
Aterosclerose
Neuropatia
Periférica
Nefrite
DII
AIDS
Câncer
Asma?
Asma
Doenças da
pele
Asma
DII
Aterosclerose
parado
Fase I
Fase II
Fase III
Fase I
Fase II
Fase III
Fase II
Fase I
Parado?
Desconhecido
Desconhecido
LIGANTE
RECEPTOR
DOENÇA
ASSOCIADA
FÁRMACO INDÚSTRIA
ESTÁGIO DE
DESENVOLVI
MENTO
Fase II
Fase II
EM
AR
Transplante
Fibrose renal
Fase II
Fase I
Desconhecido
Introdução
28
3.2) Proteínas modificadas
Uma segunda abordagem de bloqueio da interação quimiocina-receptor é a utilização
de quimiocinas modificadas, onde estas mantêm alta afinidade por seu receptor, mas não
promovem sinalização intracelular, tornando-se, assim, agentes antagonistas. Esta estratégia
foi criada a partir do fato que modificações na região N-terminal da quimiocina modificava a
sinalização intracelular (Proudfoot et al., 1996).
Em trabalhos desenvolvidos pela Merck-Serono é mostrado que quando
CCL5/RANTES é expressa em Escherichia coli, a metionina inicial da molécula é mantida. A
proteína resultante, nomeada Met-RANTES liga-se ao receptor CCR5 com potência de
nanomolar e é capaz de inibir o recrutamento de linfócitos T e monócitos induzido por MIP-
1α/CCL3 e RANTES/CCL5 (Proudfoot et al., 1996). Além disso, esta molécula se mostrou
eficaz vários modelos de doenças, como de inflamação das vias aéreas e artrite induzida por
colágeno (Plater-Zyberk et al., 1997; Gonzalo et al., 1998). Fenômeno similar foi visto com
MCP-1/CCL2, onde a remoção da região N-terminal preveniu a ativação do receptor CCR2
(Gong & Clark-Lewis, 1995; Zhang & Rollins, 1995). Embora aparentemente promissoras, o
desenvolvimento destas quimiocinas como agentes antiinflamatórios perdeu espaço,
provavelmente porque estas moléculas são descritas como agonistas parciais fracos e, assim,
podem apresentar efeitos pró-inflamatórios residuais (Proudfoot et al., 1999). Recentemente,
o foco de estudo de proteínas modificadas tem sido dado para aquelas que interfiram na
formação do gradiente de quimiocinas.
Além de se ligar aos receptores expressos nos leucócitos, tem sido sugerido que as
quimiocinas também se ligam aos glicosaminoglicanos (GAGs) imobilizados na superfície de
células endoteliais e matriz extracelular (Rot, 1993; Middleton et al., 1997). Esse seria um
mecanismo de retenção e possível apresentação das quimiocinas aos leucócitos circulantes.
Na ausência deste mecanismo, o gradiente de quimiocinas poderia dissipar-se por difusão,
especialmente na presença de forças de fluxo presentes nos vasos sanguíneos e nos linfonodos
(Rot, 1992; Rot, 1993; Hoogewerf et al., 1997; Middleton et al., 1997; Kuschert et al., 1999).
A interação com os GAGs também parece impedir uma clivagem proteolítica das quimiocinas
(Webb et al., 1993; Sadir et al., 2004).
Os GAGs são biomoléculas formadas pela fusão de um núcleo protéico a polímeros
lineares de carboidratos (Handel et al., 2005). Além disso, os GAGs usualmente se associam a
proteínas formando proteoglicanos (Johnson et al., 2004). Os mais importantes são: sulfato de
heparana, heparina, sulfato de dermatana, sulfato de condroitina e o ácido hialurônico
Introdução
29
(Sugahara et al., 2003; Lau et al., 2004b). A interação com os GAGs também parece
promover um outro nível de controle da migração celular, uma vez que a composição dos
proteoglicanos de superfície celular depende da localização e tipo de endotélio (Kuschert et
al., 1999). Além disso, as quimiocinas apresentam seletividade pelos diferentes subtipos de
GAGs (Witt & Lander, 1994; Hoogewerf et al., 1997; Kuschert et al., 1998; Kuschert et al.,
1999; Middleton et al., 2002; Shriver et al., 2002). Trabalhos têm demonstrado que esta
interação quimiocina-GAG pode interferir na oligomerização da mesma e, portanto, sua
atividade in vivo (Hoogewerf et al., 1997; Ali et al., 2000; Proudfoot et al., 2003).
Proudfoot e colaboradores (2001) evidenciaram que a mutação da região da
quimiocina RANTES/CCL5 que interage com os GAGs resulta em uma proteína que se liga
com usual afinidade ao receptor e induz ativação in vitro. No entanto, esta molécula
modificada atua como agente antiinflamatório in vivo e impede as ações biológicas da
quimiocina natural, como por exemplo, a indução do recrutamento celular para o peritônio,
bem como a migração de macrófagos induzida por um estímulo não específico como o
tioglicolato. Além disso, a variante reduz a gravidade clínica no modelo de EAE (Johnson et
al., 2004). O mecanismo de ação dessa quimiocina modificada ainda não está totalmente
elucidado, mas é sugerido que ela forme heterodímeros inativos e, assim, iniba a formação de
oligômeros da molécula natural que são necessários para a função biológica da quimiocina
(Proudfoot et al., 2003, Johnson et al., 2004). Desta forma, é sugerido que a utilização de
proteínas modificadas na região de ligação aos GAGs apresenta-se como uma promissora
estratégia antiinflamatória.
3.3) Anticorpos
Anticorpos neutralizantes contra as quimiocinas e seus receptores têm sido
extensivamente utilizados em modelos experimentais, principalmente para validar o papel
dessas proteínas nas doenças. Existem diversos estudos sobre o tema relatados na literatura,
entre eles podemos destacar o trabalho pioneiro de Gonzalo e colaboradores (1998) no qual
foi evidenciado o papel de várias quimiocinas como MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3,
eotaxina/CCL11, MCP-5/CCL12 e MDC/CCL22 no recrutamento celular em um modelo de
imunização induzido por ovalbumina.
Já existem anticorpos contra quimiocinas e seus receptores sendo testados em fases
clínicas. O MLN1202, um anticorpo monoclonal contra o receptor CCR2, foi desenvolvido
Introdução
30
pela Millenium para o tratamento de artrite reumatóide e se encontrava em fase II de
desenvolvimento a ano de 2006.
O anticorpo contra IL-8/CXCL8 chegou à fase II de ensaio de doença pulmonar
obstrutiva crônica, mas apesar de promover melhora do índice de dispnéia, não culminou na
melhora global da função pulmonar dos pacientes. Este mesmo composto também foi testado
em pacientes com psoríase, mas corroborando resultados anteriores também não apresentou
melhora clínica (Mahler et al., 2004).
3.4) Proteínas ligantes de quimiocinas
A co-evolução de hospedeiros e agentes infecciosos tem exercido no sistema
imunológico dos hospedeiros mecanismos para tentar controlar as infecções potencialmente
fatais. Concomitantemente, os patógenos têm desenvolvido várias estratégias para modular e
burlar a resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro, garantindo assim, o sucesso da
infecção. Nos últimos anos tem sido muito evidenciado que microorganismos como vírus e
protozoários apresentam estratégias de evasão do sistema imunológico do hospedeiro
baseadas na interferência de citocinas e quimiocinas.
Um dos mecanismos de evasão adotados por vírus da família herpesvírus e poxvírus é
codificar homólogos de citocinas, quimiocinas e receptores do hospedeiro, o que modula a
resposta à infecção (Alcami, 2003). Adicionalmente, têm sido identificadas e isoladas várias
proteínas ligantes de quimiocinas que apresentam a habilidade de inibir a atividade das
quimiocinas tanto in vitro, quanto in vivo (Alcami, 2003).
Três tipos de proteínas ligantes de quimiocinas originadas de vírus já foram
identificados: a proteína M-T7, liberada pelo mixomavírus, que se liga com baixa
especificidade a todas as subfamílias de quimiocinas (Mossman et al., 1996; Lalani et al.,
1997); a proteína M-T1, codificada por vários vírus da família pox, que se liga com alta
afinidade apenas às quimiocinas CC (Graham et al., 1997; Smith et al., 1997; Alcami et al.,
1998); e a proteína M3 que é a única liberada pelo gammaherpesvírus murino, que se liga com
grande afinidade a todas as subfamílias de quimiocinas (Parry et al., 2000; van Berkel et al.,
2000; Bridgeman et al., 2001).
Liu e colaboradores (2004) mostraram que no modelo de lesão arterial induzido por
angioplastia em ratos, uma única administração de doses entre 5 a 5000 pg de M-T7
promoveu uma importante redução de hiperplasia da camada íntima e vasculopatia associada
a uma inibição do infiltrado inflamatório. Estes resultados foram corroborados pelo uso de
Introdução
31
animais transgênicos para M3, que mostraram uma redução significativa da hiperplasia da
camada íntima, fundamental para o desenvolvimento da aterosclerose (Pyo et al., 2004).
A liberação de proteínas ligantes de quimiocinas também foi demonstrada em
helmintos através do trabalho de Smith e colaboradores (2005), no qual é evidenciado que os
ovos de Schistosoma mansoni secretam uma proteína nos tecidos do hospedeiro que se liga à
IL-8/CXCL8, MIP-1α/CCL3, fractalina/CX3CL1, MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5, inibindo
a ligação destas quimiocinas aos seus respectivos receptores. A proteína ligante de
quimiocinas purificada apresentou a habilidade de inibir a atividade biológica das quimiocinas
tanto in vitro, quanto em modelos de inflamação aguda. Por exemplo, no modelo murino de
bolha de ar subcutânea, os animais que receberam o recombinante apresentaram menor
infiltrado neutrofílico induzido por IL-8/CXCL8. Os resultados obtidos no modelo de lesão
pulmonar induzido por IL-8/CXCL8 reafirmaram esta habilidade da proteína em reduzir a
migração celular e alterações teciduais.
Adicionalmente aos patógenos supracitado, tem sido observado que os carrapatos
também apresentam mecanismos similares de evasão do sistema imune do hospedeiro para
garantir a sua sobrevivência. Os carrapatos são ectoparasitas que podem parasitar uma grande
variedade de mamíferos, incluindo seres humanos. Espécies da família Ixodidae são
caracterizadas por alimentar-se do sangue de seus hospedeiros por longos períodos de tempo,
variando entre poucos dias até 2-3 semanas. Ao perceber a entrada de um agente estranho em
sua pele, o hospedeiro desencadeia uma resposta imune na tentativa de neutralizar, ou mesmo
destruir o invasor. Para tentar burlar este mecanismo de defesa e garantir a perpetuação da
infestação, os carrapatos possuem em sua saliva uma grande variedade de agentes
vasodilatadores, anticoagulantes, anestésicos e antiinflamatórios (Wikel, 1999; Gillespie et
al., 2000). Muitos patógenos transmitidos por carrapatos, como a bactéria Borrelia
burgdorferi causadora da doença de Lyme, a bactéria causadora da febre das montanhas
rochosas e vírus (vírus causador da febre de Colorado e vírus causador da encefalite),
possivelmente também exploram essa habilidade dos carrapatos para facilitar a sua própria
transmissão e replicação.
Vários estudos mostraram os efeitos dos componentes da saliva de carrapatos sobre a
expressão ou atividade de citocinas (Fuchsberger et al., 1995; Ferreira & Silva, 1999;
Macaluso & Wikel, 2001), mas a primeira evidência de um inibidor específico de citocinas só
foi vista no trabalho de Gillespie e colaboradores (2001). Neste estudo observou-se que a
saliva do Ixodes scapularis continha uma proteína que se ligava à interleucina 12 (IL-12)
humana e murina, promovendo um mecanismo de supressão da proliferação de células T e
Introdução
32
outras respostas induzidas por IL-12. Hajnická e colaboradores (2001) evidenciaram a
presença de uma proteína anti-IL-8/CXCL8 na saliva de cinco espécies de carrapatos Ixodidae
e, recentemente foi mostrada que a saliva isolada de várias espécies de carrapatos contém uma
grande variedade de proteínas com atividade inibitória direcionada contra citocinas pró-
inflamatórias como IL-12 e IL-4, além das quimiocinas MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3,
RANTES/CCL5 e eotaxina/CCL11 (Hajnická et al., 2005).
Frauenschuh e colaboradores do grupo Merck-Serono (2007) publicaram recentemente
um trabalho onde foi descrita a clonagem e a caracterização de uma proteína ligante de
quimiocinas secretada na saliva de carrapatos. Uma biblioteca de ácido desoxirribonucléico
codificante (cDNA) foi preparada a partir das glândulas salivares do carrapato Ixodidae,
Rhipicephalus sanguineus (carrapato comum de cachorros). Os clones de cDNA da biblioteca
foram transfectados para células HEK293 e o meio destas células foi testado para avaliar se
havia atividade de se ligar a MIP-1α/CCL3 A partir deste método foi identificada uma
família de proteínas ligantes de quimiocinas distintas das conhecidas proteínas ligantes de
quimiocinas de origem viral e do Schistosoma mansoni, chamada evasinas. A primeira
evasina identificada foi a Evasina-1 (Frauenschuh et al., 2007) que se liga seletivamente à
MIP-1α/CCL3, MIP1-β/CCL4 e PARC/CCL18 com alta afinidade e, cujos valores de KD são
0,16; 0,81 e 3,21 nM, respectivamente. Além disso, a afinidade por MIP-1α/CCL3 e MIP-
1β/CCL4 foi confirmada por “ensaios de binding”. Subseqüentemente, foram identificadas
outras duas proteínas ligantes de quimiocinas chamadas Evasina-3 e Evasina-4. A Evasina-3
liga-se seletivamente à GRO-α/CXCL1, IL-8/CXCL8 e homólogos murinos (KC/CXCL1-3 e
MIP-2/CXCL1-2) com alta afinidade e, cujos valores de KD são 1,32; 1,43; 3,97 e 1,4 nM,
respectivamente. Já a Evasina-4 liga-se à eotaxina/CCL11 e RANTES/CCL5. No entanto os
valores de KD ainda não foram descritos.
II. Justificativa e Objetivos
Justificativa e Objetivos
34
Estudos recentes têm demonstrado que vários vírus, parasitas (Schistosoma mansoni) e
ectoparasitas (carrapatos) expressam proteínas ligantes de quimiocinas ou de citocinas que
parecem ser relevantes para a patogênese de doenças causadas por esses microorganismos
(Alcami, 2003; Hajnickà et al., 2005; Gillespe et al., 2001, Smith et al., 2005). Por outro lado,
proteínas ligantes de quimiocinas podem ser úteis para o tratamento de doenças inflamatórias
agudas e crônicas ou para o desenvolvimento de novas estratégias farmacológicas, uma vez
que desempenham papel imunomodulatório e antiinflamatório (Jonhoson et al., 2005).
A proposta do presente trabalho é avaliar a atividade farmacológica de uma família de
proteínas ligantes de quimiocina descoberta pela Merck Serono Pharmaceuticals derivada da
saliva do carrapato Rhipicephalus sanguineus chamada Evasinas. Ensaios in vitro mostram
que a Evasina-1 liga-se preferencialmente à MIP-1α/CCL3, MIP1-β/CCL4 e PARC/CCL18.
A Evasina-3 liga-se seletivamente à GRO-α/CXCL1, IL-8/CXCL8 e homólogos murinos
(KC/CXCL1-3 e MIP-2/CXCL1-2). Já a Evasina-4 liga-se à eotaxina/CCL11 e
RANTES/CCL5.
OBJETIVO PRINCIPAL:
Avaliar os efeitos farmacológicos da Evasina-1, Evasina-3 e Evasina-4 em modelos
animais de inflamação.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS E ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL:
1) Avaliar a eficácia da Evasina-1 em bloquear a função de MIP-1α/CCL3 in vivo e
definir o regime terapêutico que deverá ser usado nos modelos de inflamação aguda e
crônica descritos como dependentes de MIP-1α/CCL3.
2) Avaliar os efeitos da Evasina-1 sobre o processo inflamatório desencadeando em uma
reação de hipersensibilidade do tipo tardia induzida por albumina bovina metilada
(mBSA) ou pelo antígeno do ovo do Schistosoma mansoni (SEA)
3) Avaliar os efeitos da Evasina-1 sobre a lesão pulmonar e letalidade no modelo de
fibrose pulmonar induzida por bleomicina.
4) Avaliar a habilidade da Evasina-3 in vivo em interferir no recrutamento de neutrófilos
induzido por KC/CXCL1-3 e LPS.
5) Avaliar a habilidade da Evasina-3 em interferir no recrutamento de neutrófilos
induzido por ovalbumina (OVA) em animais previamente sensibilizados.
Justificativa e Objetivos
35
6) Avaliar a eficácia da Evasina-4 em prevenir in vivo o recrutamento de eosinófilos
induzido pela eotaxina/CCL11.
7) Avaliar a habilidade da Evasina-4 em inibir o recrutamento de eosinófilos induzido
por ovalbumina (OVA) em animais imunizados.
III. Material e Métodos
Material e Métodos
37
1) Animais
Foram usados camundongos Balb/C machos (18-25 g) ou C57BL/6 machos (18-25 g)
com 8-12 semanas de idade, provenientes do Centro de Bioterismo da Universidade Federal
de Minas Gerais. Os animais foram acondicionados em ambiente com temperatura controlada
e acesso livre à água e comida.
2) Drogas e reagentes
Albumina de soro bovino (BSA), albumina de soro bovino metilada (mBSA),
ovalbumina (OVA), 3,3’-5,5’-tetrametilbenzidina (TMB), p-nitrofenil-N-acetil-β-D-
glicosaminidina, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), lipopolissacarídeo (LPS), o-
fenilenediamino (OPD) e adjuvante completo de Freud foram comprados da Sigma (St Louis,
MO, U.S.A.). Hidróxido de alumínio foi comprado da Reheiss (Diblin, Ireland) e Tween 80 foi
adquirido da Difco (Detroit, MI, U.S.A.). A eotaxina/CCL11 humana, o MIP-1α/CCL3 murino e
o KC/CXCL1-3 foram comprados da PeproTech (Rocky Hill, NJ, U.S.A). As Evasinas-1, 3 e 4,
bem como o MIP-1α/CCL3 humano foram cedidos pela Merck Serono. Nos experimentos foram
usados xilazina (Rompum
), ketamina (Dopalen
), heparina sódica (Cellporin
) e sulfato de
bleomicina (Bonar
®
, Laboratório Biossintética). Para realização dos ensaios de FACS os
anticorpos anti-CD8-PE, anti-CD4-FITC, anti-CD3-APC, anti-CD11b-APC e anti-Fc foram
comprados da R&D systems (Minneapolis, U.S.A). Para detecção de citocinas e quimiocinas
foram utilizados kits murinos específicos TNF-α, TFG-β, MCP-1/JE/CCL2, MIP-1α/CCL3 e
RANTES/CCL5 (R&D Systems, Minneapolis, U.S.A). Os ovos de Schistosoma mansoni e o
antígeno do ovo de Schistosoma mansoni (SEA) foram cedidos pela professora Déborah Negrão
do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG.
3) Migração de leucócitos para a cavidade peritoneal induzida por MIP-
1α
αα
α/CCL3
Camundongos Balb/C ou C57BL/6 receberam uma injeção intraperitoneal com 200 µL
de salina tamponada (PBS, pH 7,4) ou MIP-1α/CCL3 humano (1-10000 ng por cavidade
peritoneal) ou MIP-1α/CCL3 murino (300 ng por cavidade peritoneal) diluído em 200 µL de
PBS. Para testar a inibição, doses de Evasina-1 variado de 3 a 100 µg por animal em 200 µL
de PBS foram administradas subcutaneamente 45 minutos antes da injeção de MIP-1α/CCL3
humano ou MIP-1α/CCL3 murino. Após 4, 18 ou 24 h horas, os animais foram sacrificados e
Material e Métodos
38
a cavidade peritoneal lavada 2 vezes com 3 mL de PBS gelado, sendo as lavagens reunidas
para um único animal. A contagem total foi realizada em câmara de Neubaur utilizando
corante de Turk. A contagem diferencial foi feita em preparações de citospin (Shandon II)
coradas com May Grunwald-Giemsa utilizando critérios morfológicos para identificar os tipos
celulares. Os resultados são apresentados como número de células por cavidade.
Delineamento experimental I
4) Microscopia intravital
Para cada experimento, 300 ng de MIP-1α/CCL3 humano diluido em 100 µL de PBS foi
administrado localmente através de uma injeção subcutânea abaixo da pele escrotal direita
utilizando uma agulha de 30G, 1 hora antes da exposição do tecido. Para testar a inibição, uma
solução de Evasina-1 (10 µg por animal) e MIP-1α/CCL3 humano (300 ng por animal) em 100
µL de PBS foi preparada 15 minutos antes da administração intraescrotal. O cremaster esquerdo
foi preparado para a microscopia intravital conforme descrito previamente (Cara & Kubes,
2004). Resumidamente, uma incisão foi feita na pele escrotal para exposição do músculo
cremaster esquerdo. Este foi então delicadamente removido da fascia associada. Uma incisão foi
feita na superfície ventral do músculo cremanster utilizando um cauterizador. O testículo e o
epidídimo foram separados do músculo que os envolvia e foram removidos para o interior da
cavidade abdominal. Subsequentemente, o músculo foi esticado sobre uma superfície translúcida
e preso nas bordas com uma sutura 4-0. Um microscópio intravital (Olympus BX50F4; Japão)
com lentes objetivas de 20X e a oculares de 10X foi utilizado para avaliação da microcirculação
do cremaster. Uma câmera de vídeo (5100 HS; Panasonic, Osaka, Japão) foi utilizada para
MIP-1
α/
CCL3 humano (10000 ng por cavidade)
ou MIP-1α/CCL3 murino (300 ng por cavidade)
intraperitoneal
Evasina-1 (3 - 100
µ
g por animal)
s.c. 45 min antes da administração
da quimiocina
4 ou 18 hr
hrs
Lavado peritoneal para coleta de células
Material e Métodos
39
projeção das imagens em um monitor e, as imagens foram gravadas para análise posterior
utilizando um fita de video cassete convencional.
Vênulas cremastéricas (25-40 µm de diâmetro) foram escolhidas e, para diminuir a
variabilidade, a mesma sessão da vênula cremastérica foi observada durante o experimento. O
número de leucócitos rolantes, aderentes e que emigraram para o tecido adjacente foi
determinado posterirmente durante a análise da fita de vídeo. Definiu-se como leucócitos
rolantes aquelas células que moviam-se a uma velocidade menor a dos eritrócitos do mesmo
vaso. O fluxo de leucócitos rolantes foi mensurado como o número de células rolantes que
passavam por um dado ponto da vênula por minuto. Definiu-se como leucócitos aderentes
aquelas células que se mantinham estacionárias por no mínimo 30 segundos e, a adesão total de
leucócitos foi quantificada como o número de células aderentes existentes em 100 µm de
comprimento da vênula. Definiu-se como leucócitos emigrantes aquelas células que se
encontravam no espaço extravascular dentro de uma área de 50 µm de distância do vaso. Apenas
as células adjacentes e visivelmente fora do vaso eram consideradas como emigrantes. No final
de cada experimento, o sangue total do animal era recolhido por punção do plexo braquial. A
contagem total foi realizada em câmara de Neubaur utilizando corante de Turk.
4.1) Análise histopatológica
Ao final de cada experimento de microscopia intravital, o músculo cremaster era
removido e fixado em uma solução contendo 10% de formalina tamponada neutra.
Posteriormente, o tecido era gradualmente desidratado em etanol, embebido em parafina,
cortado em sessões de 4 µm, corado com hematoxilina & eosina e examinado ao microscópio
óptico.
Material e Métodos
40
Delineamento experimental II
5) Reação de hipersensibilidade do tipo tardia na cavidade pleural induzida
por mBSA
Camundongos Balb/C foram imunizados com uma emulsão 1:1 de mBSA (5 mg/mL
em PBS) e adjuvante completo de Freud. Esta prepararação foi delicadamente emulsificada
até que uma mistura consistente foi obtida. A consistência da emulsão foi testada
periodicamente durante a preparação através da adição de uma gota da mistura sobre uma
superfície de água gelada. Quando a gota se manteve intacta, a emulsão foi acondicionda em
uma seringa de vidro e injetado o volume de 100 µL intradermicamente próximo do linfonodo
inguinal. Cada animal recebeu na imunização 250 µg de antígeno. Quatorze dias após a
sensibilização, 100 µL do veículo ou do antígeno (mBSA 10 µg por cavidade pleural) em 100
µL de PBS foi injetado intrapleuralmente nos animais imunizados. Para testar a inibição, a
Evasina-1 (10 µg por animal) em 200 µL de PBS foi administrada subcutaneamente 45
minutos antes do desafio e posteriormente à cada 12 horas. Os animais foram sacrificados 48
horas após o desafio com o antígeno. A cavidade pleural foi lavada 2 vezes com 1 mL de PBS
gelado, sendo as lavagens reunidas para um único animal. A contagem total foi realizada em
câmara de Neubaur utilizando corante de Turk. A contagem diferencial foi feita em
preparações de citospin (Shandon II) coradas com May Grunwald-Giemsa utilizando critérios
1 hr
Preparação do músculo cremaster
Injeção intraescrotal de MIP-1
α
/CCL3
(300 ng por animal) ou Evasina-1 (10 µg
por animal) + MIP-1α/CCL3 (300 ng por
animal)
1 hr
Observação da microcirculação do cremaster e
gravação da imagem em vídeo cassete para
análise subseqüente
A solução de Evasina-1 + MIP-1
α
αα
α
/CCL3 foi
preparada 15 min antes da injeção intraescrotal
Material e Métodos
41
morfológicos para identificar os tipos celulares. Os resultados são apresentados como número
de células por cavidade.
5.1) Citometria de fluxo
Quarenta e oito horas após o desafio, os animais foram sacrificados e a cavidade pleural
lavada com 200 µL de uma solução contendo 1% de mBSA em PBS. Os eritrócitos foram
lisados e as amostras centrifugadas por 5 minutos a 1500 rpm. O pellet foi ressuspendido em 200
µL de um tampão contendo 5% de albumina de soro bovino e 0,01% de azida sódica. As células
foram coradas com anticorpos marcados com isotiocianato de fluorescina (FITC) ou ficoeritrina
(PE) ou aloficocianina (APC) por 20 minutos a 4
O
C. Para prevenir ligações não específicas aos
receptores Fc um reagente de bloqueio foi adicionado à mistura de anticorpos monoclonais.
Posteriormente, as células foram lavadas com uma solução de 0,01% de azida sódica em PBS e
fixadas em uma solução contendo 2% de formaldeído em PBS. Os anticorpos utilizados para
marcação extracelular foram: anti-CD8-PE, anti-CD4-FITC, anti-CD3-APC e anti-CD11b-APC.
As células coradas foram analisadas utilizando um programa FACSVANTAGE ou FACScan
(Becton&Dickinson) e o programa da software Cell Quest.
Delineamento experimental III
Albumina de soro bovino metilada
(mBSA; 250 µg por animal) +
adjuvante completo de Freud i.d
14 dias
mBSA (10
µ
g por
cavidade) intrapleural
48 hr
Lavado pleural para
coleta de células
Evasina-1 (10
µ
g por animal)
s.c. 45 min antes e a cada 12 hr após o
desafio com o antígeno
Material e Métodos
42
5.2) Análise dos resultados de FACS
Os leucócitos foram analisados através do perfil de distribuição tamanho versus
granulosidade e pelas freqüências dos marcadores de superfície utilizando o programa Cell Quest
(Becton&Dickinson) conforme pode ser visualizado na Figura 5. Os limites para cada quadrante
de marcadores foram sempre analisados baseando-se nas populações negativas e nos isotipos
controles.
Figura 5
Perfil da distribuição celular no gráfico de tamanho versus granulosidade. Regiões contendo
linfócitos pequenos estão representadas por R1, células blásticas por R2, monócitos/macrófagos
por R3 e granulócitos por R4. Os resultados apresentados foram obtidos por análises da região
R1 (linfócitos) avaliando a expressão de moléculas de superfície (CD3, CD4 e CD8). Também
foi analisada a região R3 para avaliação da expressão da molécula de superfície CD11b.
GRANULOSIDADE
TAMANHO
R
4
R
2
R
1
R
3
Material e Métodos
43
6) Reação de hipersensibilidade do tipo tardia na pata
Camundongos Balb/C receberam uma injeção intradérmica na base da cauda de uma
emulsão 1:1 contendo 200 µL de 1,25 mg/mL de mBSA e adjuvante completo de Freud no dia 1
como descrito previamente (Sutherland et al., 2005). No dia 7, os animais foram desafiados em
uma das patas traseiras com uma injeção de 20 µL de 10 mg/mL de uma solução de mBSA, a
pata oposta recebeu 20 µL de PBS. Para testar a inibição, Evasina-1 (10 µg por animal) em 200
µL de PBS foi administrada subcutaneamente 45 minutos antes do desafio. O aumento de
volume da pata foi avaliado 14-72 horas após o desafio utilizando-se o pletismômetro (UGO
BASILE, MOD. 7140: ITALIA). O edema foi calculado como sendo a diferença (µL) entre o volume
da pata em diferentes tempos pelo valor basal a partir da equação seguite. Os resultados são
apresentados com a variação de volume.
volume da pata no tempo analisado (µL) – volume da pata antes do desafio (µL) X 100
volume da pata antes do desafio (µL)
Delineamento experimental IV
Evasina-1 (10
µ
g por animal) s.c.
45 min antes do desafio com o
antígeno
7 dias
14, 24, 48 ou 72 hr
hrs
Albumina de soro bovino metilada
(mBSA; 125 µg por animal) +
adjuvante completo de Freud i.d
mBSA (200
µ
g por
pata) intraplantar
Mensuração do
volume da pata
Material e Métodos
44
7) Sensibilização e indução de recrutamento celular do tipo TH2 para os
pulmões
Camundongos Balb/C foram imunizados intraperitonealmente com 2500 ovos de
Schistosoma mansoni nos dias 0 e 7 como descrito previamente (Lukacs et al., 1996). No dia
14 os animais receberam um desafio intranasal com 10 µg de antígeno de ovo de Schistosoma
mansoni (SEA) em 10 µL de PBS para localizar a resposta para as vias aéreas. Após 6 dias, os
animais foram desafiados novamente através da administração intratraqueal de 10 µg de SEA
em 25 µL de PBS ou somente PBS (veículo). Para testar a inibição, Evasina-1 (10 µg por
animal) foi administrada subcutaneamente 45 minutos antes do desafio intratraqueal e
posteriormente à cada 12 horas. Os animais foram sacrificados 24 ou 48 horas após a injeção
intratraqueal e, os pulmões foram lavados 3 vezes com 1 mL de PBS gelado através de uma
cânula traqueal. O fluido era recuperado dos pulmões após uma delicada massagem para
remover as células, sendo as lavagens reunidas para um único animal. A contagem total foi
realizada em câmara de Neubaur utilizando corante de Turk. A contagem diferencial foi feita
em preparações de citospin (Shandon II) coradas com May Grunwald-Giemsa utilizando
critérios morfológicos para identificar os tipos celulares. Os resultados são apresentados como
números de células por pulmões.
Delineamento experimental V
2500 ovos de S. ma
nsoni
intraperitoneal
7 dias
SEA (10
µ
g por
pulmões)
intratraqueal
Lavado broncoalveolar para
coleta de células
Evasina-1 (10
µ
g por animal)
s.c. 45 min antes e a cada 12 hr
após o desafio com o antígeno
Antígeno do ovo de S
mansoni (SEA)
intranasal
7 dias
6 dias
24 ou 48 hr
Material e Métodos
45
8) Modelo experimental de fibrose pulmonar induzida por bleomicina
Sulfato de bleomicina (Bonar
®
, Laboratório Biossintética) foi utilizado como estímulo
para a indução do modelo experimental de fibrose pulmonar (Izbicki et al., 2002).
Camundongos C57Bl/6 foram anestesiados por via intraperitoneal com 80 µL de uma solução
à base de ketamina e xilazina (respectivamente 3,2 mg e 0,16 mg por animal, em solução
salina 0,9%, em uma proporção 4:1:5, 4 mL de ketamina, 1 mL de xilazina e 5 mL de PBS)
para subseqüente traqueotomia. Cada animal recebeu uma injeção por via intratraqueal de 25
µL de veículo (salina 0,9% estéril) ou bleomicina (0,0625 U ou 0,125U). Para testar a
inibição, Evasina-1 10 µg por animal em 200 µL de PBS foi administrada subcutaneamente
45 minutos antes da instilação de bleomicina e posteriormente duas vezes ao dia. Para avaliar
o efeito do início tardio do tratamento com a Evasina-1, os animais começaram a ser tratados
somente no oitavo dia após a instilação com a bleomicina. Após 4, 8 ou 25 dias os animais
foram sacrificados com uma dose letal de anestésico ketamina e xilazina (500 µL por animal)
com subseqüente deslocamento cervical para posterior realização do lavado broncoalveolar e
retirada do pulmão. Foram realizados contagens celulares do lavado, ensaios enzimáticos com
o lavado broncoalveolar e pulmão, e análises morfológicas e morfométricas descritas abaixo.
8.1) Lavado broncoalveolar
O lavado broncoalveolar foi realizado para se obter leucócitos presentes no espaço
alveolar. Após sacrifício nos tempos determinados, a traquéia de cada animal foi exposta
novamente e canulada com um catéter de polipropileno de 1,7 mm. O lavado foi feito através
da injeção de duas alíquotas de 1 mL de PBS gelado, injetadas e recolhidas 3 vezes cada uma,
obtendo-se 1,7 – 2,0 mL de volume final recuperado do lavado. O líquido recolhido do lavado
foi centrifugado em tubos de 5 mL a 4
o
C, por 5 minutos, a uma velocidade de 1500 rpm,
formando um pellet de células utilizado para contagem total e diferencial de células. O
sobrenadante do centrifugado foi congelado para posteriores ensaios de detecção citocinas e
quimiocinas. A contagem total foi realizada em câmara de Neubaur utilizando corante de
Turk. A contagem diferencial foi feita em preparações de citospin (Shandon II) coradas com
May Grunwald-Giemsa utilizando critérios morfológicos para identificar os tipos celulares.
Os resultados são apresentados como número de células por pulmões.
Material e Métodos
46
8.2) Retirada do pulmão e processamento das amostras
Ao término do lavado broncoalveolar, os pulmões dos animais foram perfundidos com
5 mL de PBS pelo ventrículo direito do coração, para remoção de sangue do leito vascular
pulmonar, e imediatamente extraídos. O pulmão direito foi congelado para posterior dosagem
de NAG e MPO; o pulmão esquerdo foi utilizado para análise histopatológica. Foram pesados
100 mg do pulmão direito e homogeneizados em 0,9 mL de uma solução contendo NaCl 0,4
M, NaPO
4
10 mM, PMSF 0,1 mM, cloreto de benzetônio 0,1 mM, EDTA 10 mM, Tween 20
0,05%, 0,5% de BSA, 20 KI aprotinina, numa relação de 10% peso/volume, e posteriormente
centrifugados a 3000 rpm durante 15 minutos a 4ºC. A detecção das atividades de NAG e
MPO foi feita no pellet, após processamento das amostras para estes ensaios. Desta maneira, o
pellet foi ressuspenso em 2 mL de tampão fosfato (0,1 M NaCl, 0,02 M NaPO
4
, 0,015 M
NaEDTA; pH 4.7), homogeneizado por 1 minuto; 1,5 mL de NaCl 0,2% foi adicionado e
homogeneizado novamente; 1,5 mL de NaCl 1,6% com 5% de glicose foi adicionado,
homogeneizado e vortexado. Após esta etapa, o volume total (1,6 mL) foi dividido em dois
tubos, 0,8 mL para cada tubo, para determinação de NAG e MPO. Estas amostras foram
centrifugadas a 4ºC, por 15 minutos, a uma velocidade de 10.000 rpm e o sobrenadante foi
posteriormente descartado. Para o ensaio de NAG, as amostras foram ressuspensas e
homogeneizadas em 0.8 mL de salina 0,9% com 0,1% v/v de Triton X-100, centrifugadas a
4ºC, por 10 minutos a 1.500 rpm e o ensaio foi feito com o sobrenadante destas amostras.
Para o ensaio de MPO, as amostras foram ressuspensas e homogeneizadas em 0,8 mL de
tampão fosfato (0,05 M Na
3
PO
4
, 0,5% HETAB; pH 5,4), congeladas em nitrogênio líquido e
então descongeladas, sendo este processo repetido por 3 vezes. Após esta etapa, as amostras
para MPO foram centrifugadas à 4º C, por 15 minutos a 10.000 rpm e o sobrenadante
utilizado para o ensaio.
8.3) Ensaio para detecção dos níveis de n-acetilglicosaminidase (NAG)
tecidual
A quantidade de macrófagos acumulados nos pulmões foi mensurada pelo ensaio da
atividade de NAG conforme descrito anteriormente (Barcelos et al., 2005). A reação é
iniciada pela adição de 100 µL de p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glicosaminidina (Sigma), diluído
em tampão citrato/fosfato (acido cítrico 0,1 M; Na
2
HPO
4
0,1 M; pH 4,5) na concentração
final de 2,24 mM, a 100 µL de sobrenadante das amostras previamente processadas e diluídas
em tampão citrato/fosfato, em placas de 96 poços, por 10 minutos à 37ºC. Ao final desta etapa
Material e Métodos
47
adicionou-se 100 µL de tampão glicina 0,2 M (pH 10,6) para término da reação. As placas de
96 poços foram lidas em leitor de ELISA (Emax, Molecular Devices) a 405 nm. O conteúdo
de macrófagos foi calculado com base na curva-padrão de NAG, feita pela coleta de
macrófagos peritoneais recolhidos de animais estimulados com 3 mL de tioglicolato 3%
(dados não mostrados). Os resultados são apresentados como número relativo de células por
pulmões.
8.4) Ensaio para detecção dos níveis de mieloperoxidase (MPO) tecidual
A quantidade de neutrófilos acumulados nos pulmões foi mensurada pelo ensaio da
atividade de MPO conforme descrito anteriormente (Souza et al., 2002). O ensaio utiliza 25
µL de 3,3’-5,5’-tetrametilbenzidina (TMB, Sigma) dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO,
Merck) com concentração final de 1,6mM; 100 µL de tampão fosfato (0,05 M Na
3
PO
4;
0,5%
H-TAB; pH 5,4) com H
2
O
2
diluído numa concentração final de 0,003% v/v, e 25 µL de
sobrenadante das amostras de tecidos previamente processadas. A reação se inicia pela adição
de tetrametilbenzidina as amostras em placas de 96 poços, a 37ºC por 5 minutos. Após esta
etapa, adicionou-se H
2
O
2
diluída em tampão fosfato e encubou-se A 37ºC por 5 minutos. Ao
final desta etapa adicionou-se 100 µL de H
2
SO
4
4 M para término da reação. As placas de 96
poços foram lidas em leitor de ELISA (Emax, Molecular Devices) a 450 nm. O conteúdo de
neutrófilos foi calculado com base em curva padrão de MPO, feita pela coleta de neutrófilos
peritoneais recolhidos de animais estimulados com 3 mL de caseína 5% (dados não
mostrados). Os resultados são apresentados como número relativo de neutrófilos por pulmões.
8.5) Citometria de fluxo
Oito dias após a estimulação com a bleomicina, os animais foram sacrificados e realizado
um lavado broncoalveolar com 200 µL de uma solução contendo 1% de mBSA em PBS. Os
eritrócitos foram lisados e as amostras centrifugadas por 5 minutos a 1500 rpm. O pellet foi
ressuspendido em 200 µL de um tampão contendo 5% de albumina de soro bovino e 0,01% de
azida sódica. As células foram coradas com anticorpos marcados com isotiocianato de
fluorescina (FITC) ou ficoeritrina (PE) ou aloficocianina (APC) por 20 minutos A 4
O
C. Para
prevenir ligações não específicas aos receptores Fc um reagente de bloqueio foi adicionado à
mistura de anticorpos monoclonais. Posteriormente, as células foram lavadas com uma solução
de 0,01% de azida sódica em PBS e fixadas em uma solução contendo 2% de formaldeído em
PBS. Os anticorpos utilizados para marcação extracelular foram: anti-CD8-PE (R&D systems),
Material e Métodos
48
anti-CD4-FITC (R&D systems), anti-CD3-APC (R&D systems) e anti-CD11b-APC (R&D
systems). As células coradas foram analisadas utilizando um programa FACSVANTAGE ou
FACScan (Becton&Dickinson) e o programa da software Cell Quest.
8.5.1) Análise dos resultados de FACS
Os leucócitos foram analisados através do perfil de distribuição tamanho versus
granulosidade e pelas freqüências dos marcadores de superfície utilizando o programa Cell Quest
(Becton&Dickinson) conforme pode ser visualizado na Figura 5. Os limites para cada quadrante
de marcadores foram sempre analisados baseando-se nas populações negativas e nos isotipos
controles.
8.6) Detecção de citocinas e quimiocinas
Para a dosagem das citocinas TNF-α e TFG-β; e das quimiocinas MCP-1/JE/ CCL2,
MIP-1α/CCL3 e RANTES/CCL5 foram utilizados kits murinos específicos (R&D Systems,
Minneapolis) onde foram seguidas as instruções do fabricante. Basicamente, 100 µL/poço do
anticorpo de captura (5,5 µL/mL) diluído em PBS estéril foram adicionados a cada placa
(NUNC FLAT, 96-well, FALCON). Estas foram vedadas e incubadas a 4ºC “overnight”. O
conteúdo de cada placa foi retirado e esta foi lavada 3 vezes (300 µL/poço) com um tampão
de lavagem (PBS/Tween 20 0,05%). Após este procedimento, adicionou-se 300 µL/poço do
tampão de bloqueio (BSA 1% em PBS). As placas foram incubadas à temperatura ambiente
por no mínimo uma hora. Repetiu-se o procedimento de lavagem e adicionou-se 100 µL/poço
das amostras, lavado broncoalveolar e padrões, diluídos em tampão de diluição (BSA 0,1%
em PBS 1X). As placas foram novamente incubadas “overnight”. Repetiu-se o procedimento
de lavagem e foram adicionados 100µL/poço do anticorpo de detecção biotinilado (5,55
µL/mL) diluído em tampão de diluição (o mesmo das amostras e padrões). As placas foram
incubadas à temperatura ambiente por 2 horas. Após mais um procedimento de lavagem,
adicionou-se 100 µL/poço de estreptavidina – HRP 1:200 em tampão de diluição e incubou-se
as placas à temperatura ambiente por 20 minutos. Novamente as placas foram lavadas e
adicionou-se 100 µL/poço do substrato OPD (em tampão citrato pH 5 com adição de H
2
O
2
).
As placas foram incubadas por 20-30 minutos, à temperatura ambiente, protegidas da luz.
Após este período observou-se a formação de cor e foram adicionados 50 µL/poço de H
2
SO
4
1 M para interromper a reação. As placas foram lidas em leitor de ELISA (Emax, Molecular
Material e Métodos
49
Devices) a 492 nm. Os resultados são apresentados como quantidade de proteína por 100 mg
de tecido.
8.7) Análise histopatológica e morfométrica
O pulmão esquerdo foi retirado da cavidade torácica e colocado em PBS 1X com 10%
de formaldeído, para posterior inclusão em parafina. Estas amostras foram colocadas em uma
câmara de vácuo, com pressão negativa de 1.33 x 10
4
Pa (van Kuppevelt et al., 2000),
equivalentes a 99.758246 mmHg, durante 10 minutos, para que os pulmões fossem inflados,
restabelecendo sua estrutura morfológica normal. A lesão pulmonar e fibrose foram
analisadas qualitativamente, após coloração por hematoxilina & eosina e Tricrômicro de
Gomori respectivamente, em microscópios ópticos com objetiva de 20 e 40X. Para análise
quantitativa da área corada com Tricrômicro de Gomori, eram capturadas imagens
abrangendo 326.000 µm
2
de pulmão com uma câmera digital (Optronics DEI-470) conectada
a um microscópio (Olympus IX70). As áreas de colágeno (coradas em verde) eram
mensuradas com o software Image Pro-Plus. Pelo menos 20 imagens eram obtidas para cada
animal, sendo 6 animais por grupo. Os resultados são expressos com média de área verde por
µm
2
. Este índice morfométrico foi utilizado para descrever deposição de colágeno nos
pulmões.
Delineamento experimental VI
Bleomicina (0.0625 U por
animal) intratraqueal
Lavado broncoalveolar para coleta de
células e sobrenadante para ELISA;
pulmões para MPO, NAG, análise
morfológica e morfométrica
4 dias
4 dias
Evasina-1 10
µ
g por animal s.c. 45 min
antes e a cada 12 hr dos dias 0 a 25 após a
instilação com a bleomicina
17 dias
Material e Métodos
50
9) Indução do recrutamento celular para a cavidade articular induzido por
KC
Camundongos Balb/C receberam uma injeção na articulação tíbia-femural de
KC/CXCL1-3 (30 ng por cavidade articular) ou veículo (10 µL por cavidade articular). Para
testar a inibição, a Evasina-3 (0,001-1,0 µg por animal) em 200 µL de PBS foi administrada
subcutaneamente 45 minutos antes da injeção intraarticular de KC/CXCL1-3. Quatro horas
após a estimulação, os camundongos foram sacrificados e as células presentes na cavidade
foram recolhidas com 10 µL de uma solução contendo 3% de BSA em PBS. A contagem total
foi realizada em câmara de Neubauer usando corante de Turk. A contagem diferencial foi
feita em preparações de cytospin (Shandon III) coradas com May Grunwald-Giemsa
utilizando critérios morfológicos para identificar os tipos celulares. Os resultados são
apresentados como número de células por cavidade.
Delineamento experimental VII
Evasina-3 (0,001-1,0
µ
g por
animal) s.c. 45 min antes da
administração da
4
hr
KC/CXCL1-3
(30 ng por animal)
Lavado intraarticular para
coleta de células
Material e Métodos
51
10) Indução do recrutamento celular para a cavidade pleural induzido por
lipopolissacarídeo (LPS) ou eotaxina/CCL11
Camundongos Balb/C receberam uma injeção intrapleural de LPS (250 ng por
cavidade pleural) (Delineamento experimental VIII) ou eotaxina/CCL11 humana (300 ng por
cavidade pleural) (Delineamento experimental IX) ou veículo (100 µL por cavidade pleural).
Para testar a inibição, a Evasina-3 (1 µg por animal) em 200 µL de PBS foi administrada
subcutaneamente 45 minutos antes da injeção intrapleural de LPS. A Evasina-4 (0,01-10,0 µg
por animal) em 200 µL de PBS foi administrada subcutaneamente 45 minutos antes da injeção
intrapleural de eotaxina/CCL11. Após 8 horas (animais estimulados com LPS) ou 24 horas
(animais estimulados com eotaxina/CCL11) os camundongos foram sacrificados e as células
presentes na cavidade foram recolhidas com 2 mL de PBS. A contagem total foi realizada em
câmara de Neubauer usando corante de Turk. A contagem diferencial foi feita em preparações
de cytospin (Shandon III) coradas com May Grunwald-Giemsa utilizando critérios
morfológicos para identificar os tipos celulares. Os resultados são apresentados como número
de células por cavidade.
Delineamento experimental VIII
Evasina-3 (1
µ
g p
or animal) s.c. 45
min antes da administração do
estímulo
8
hr
Lipopolissacarídeo
(250 ng por cavidade)
intrapleural
Lavado intrapleural para
coleta de células
Material e Métodos
52
Delineamento experimental IX
11) Sensibilização e indução do recrutamento celular para a cavidade
pleural induzido por ovalbumina (OVA)
Camundongos Balb/C foram imunizados com ovalbumina (OVA) adsorvida em gel de
hidróxido de alumínio como descrito previamente (Das et al., 1997). Resumidamente, os
animais foram injetados subcutaneamente nos dias 1 e 8 com 0,2 mL de uma solução
contendo 100 µg de OVA e 70 µg de hidróxido de alumínio. Oito dias depois da última
imunização, o antígeno (OVA, 1,0 µg por cavidade pleural) ou veículo (100 µL por cavidade
pleural) foi injetado intrapleuralmente nos animais sensibilizados. Para testar a inibição, a
Evasina-3 (1 µg por animal) ou a Evasina-4 (0,1-1,0 µg por animal) em 200 µL de PBS foram
administradas subcutaneamente 45 minutos antes do desafio com OVA. Os animais que
receberam Evasina-4 foram novamente tratados 6 horas após o desafio. Após 8 horas (animais
tratados com Evasina-3) (Delineamento experimental X) ou 24 horas (animais tratados com
Evasina-4) (Delineamento experimental XI) os camundongos foram sacrificados e as células
presentes na cavidade foram recolhidas com 2 mL de PBS. A contagem total foi realizada em
câmara de Neubauer usando corante de Turk. A contagem diferencial foi feita em preparações
de cytospin (Shandon III) coradas com May Grunwald-Giemsa utilizando critérios
morfológicos para identificar os tipos celulares. Os resultados são apresentados como número
de células por cavidade.
Evasina-4 (0,01-10,0
µ
g por
animal) s.c. 45 min antes da
administração da quimiocina
24 hr
Eotaxina/CCL11 humana
(300 ng por cavidade)
intrapleural
Lavado intrapleural para
coleta de células
Material e Métodos
53
Delineamento experimental X
Delineamento experimental XI
8 dias
8 dias
Evasina-3 (1
µ
g por animal)
s.c. 45 min antes do desafio
com o antígeno
8
hr
OVA (1,0
µ
g por
cavidade)
intrapleural
Lavado intrapleural para
coleta de células
Ovalbumina (OVA; 100
µ
g por
animal) + hidróxido de alumínio
(Al(OH)
3
, 70 µg por animal)
s.c.
8 dias
8 dias
Evasina-4 (0,1-1,0
µ
g por
animal) s.c. 45 min antes e
6hr após o desafio com o
antígeno
48
hr
OVA (1,0
µ
g por
cavidade)
intrapleural
Lavado intrapleural para
coleta de células
Ovalbumina (OVA; 100
µ
g por
animal) + hidróxido de alumínio
(Al(OH)
3
, 70 µg por animal)
s.c.
Material e Métodos
54
12) Análise estatística
Os resultados são apresentados com média ± erro padrão da média. A diferença
estatística entre os grupos foi determinada pela one-way ANOVA e complementada pelo teste
Student-Newman-Keuls. O valor P < 0,05 foi considerado significativo.
IV. Resultados
Resultados
56
1) Efeito da Evasina-1 sobre o recrutamento celular induzido por MIP-
1α/
α/α/
α/CCL3
Os experimentos iniciais foram realizados com o objetivo de avaliar a habilidade do
MIP-1α/CCL3 humano, cedido pela Merck Serono, em induzir o influxo de leucócitos nas
condições do nosso laboratório e investigar o possível efeito da Evasina-1 sobre este evento.
A quimiocina MIP-1α/CCL3 humana induziu de maneira dose-dependente (Figura 6)
e tempo-dependente (dados não mostrados) um influxo de granulócitos quando injetada na
cavidade peritoneal. Assim, foi escolhida a dose de 10.000 ng de MIP-1α/CCL3 humano e o
tempo de 18 horas para a realização dos próximos ensaios, os quais desejávamos avaliar
migração de granulócitos.
O pré-tratamento com a Evasina-1 45 minutos antes da injeção de MIP-1α/CCL3
humano preveniu este aumento do recrutamento celular tanto em camundongos Balb/C
(Figura 7) quanto em animais C57BL/6 (Figura 8).
Corroborando os resultados obtidos com a quimiocina MIP-1α/CCL3 humana, o pré-
tratamento com a Evasina-1 45 minutos antes da injeção de MIP-1α/CCL3 murino reduziu a
migração de granulócitos para a cavidade peritoneal induzida pelo MIP-1α murino (Figura 9).
Resultados
57
Figura 6
Efeito da administração intraperitoneal de MIP-1α/CCL3 humano sobre recrutamento de granulócitos para a
cavidade peritoneal. Os animais receberam uma injeção intraperitoneal de MIP-1α/CCL3 humano (1-10000 ng
por cavidade) ou veículo (200 µL por cavidade) e 18 h após o estímulo o número de leucócitos foi avaliado. Os
resultados são apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6 animais em cada grupo. * P < 0,05
PBS 1 100 10000
0
1
2
3
h-MIP-1α/CCL3 (ng por cavidade)
*
*
*
Granulócitos X 10
5
por
cavidade
Resultados
58
Figura 7
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de granulócitos para a cavidade peritoneal
induzido pelo MIP-1α/CCL3 humano em camundongos Balb/C. Os animais receberam uma injeção
intraperitoneal de MIP-1α/CCL3 humano (10000 ng por cavidade) ou PBS (200 µL por cavidade) e 18 h após o
estímulo o número de leucócitos foi avaliado. Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com
Evasina-1 (3-100 µg por animal) 45 min antes do estímulo com MIP-1α/CCL3 humano. Os resultados são
apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6 animais em cada grupo. * P < 0,05 e ** P < 0,01.
PBS Veículo 3 10 30 100
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
**
Evasina-1 (µg por animal)
h-MIP-1α/CCL3 (10000 ng por cavidade)
Granulócitos X 10
5
por
cavidade
Todos diferentes do Veículo
Resultados
59
Figura 8
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de granulócitos para a cavidade peritoneal
induzido pelo MIP-1α/CCL3 humano em camundongos C57BL/6. Os animais receberam uma injeção
intraperitoneal de MIP-1α/CCL3 humano (10000 ng por cavidade) ou PBS (200 µL por cavidade) e 18 h após o
estímulo o número de leucócitos foi avaliado. Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com
Evasina-1 (3-30 µg por animal) 45 min antes do estímulo com MIP-1α/CCL3 humano. Os resultados são
apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6 animais em cada grupo. * P < 0,05 e ** P < 0,01.
PBS Veículo 3 10 30
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
**
Evasina-1 (µg por animal)
h-MIP-1α/CCL3 (10000 ng por cavidade)
Granulócitos X 10
5
por
cavidade
Todos diferentes do Veículo
Resultados
60
Figura 9
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de granulócitos para a cavidade peritoneal
induzido pelo MIP-1α/CCL3 murino em camundongos Balb/C. Os animais receberam uma injeção
intraperitoneal de MIP-1α/CCL3 murino (300 ng por cavidade) ou PBS (200 µL por cavidade) e 4 h após o
estímulo o número de leucócitos foi avaliado. Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com
Evasina-1 (3-10 µg por animal) 45 min antes do estímulo com MIP-1α/CCL3 murino. Os resultados são
apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6 animais em cada grupo. * P < 0,05 e *** P < 0,001.
PBS Veículo 3 10
0
10
20
Evasina-1 (µg por animal)
m-MIP-1α (300 ng por cavidade)
***
*
*
*
*
Granulócitos X 10
5
por
cavidade
Resultados
61
2) Efeito da Evasina-1 sobre o processo de rolamento, adesão e migração de
leucócitos induzido por MIP-1α/
α/α/
α/CCL3
O próximo experimento foi realizado utilizando-se microscopia intravital com o
objetivo de avaliar se a Evasina-1 poderia interferir nos processos de rolamento, adesão e
emigração de leucócitos induzido pelo MIP-1α/CCL3 humano. Utilizamos a dose de 300 ng
por animal de MIP-1α/CCL3 baseada em estudos prévios, que demonstraram ser esta dose
adequada para o estudo em microscopia intravital (Wan et al., 2003).
A administração intraescrotal de MIP-1α/CCL3 humano promoveu um aumento do
rolamento, adesão e emigração de leucócitos (Figura 10A, 10B e 10C). A pré-incubação da
Evasina-1 com o MIP-1α/CCL3 humano diminuiu de forma significativa o rolamento, adesão
e emigração de leucócitos (Figura 10A, 10B e 10C). Assim, a Evasina-1 preveniu a habilidade
de MIP-1α/CCL3 de facilitar o influxo celular.
Para identificar o tipo celular recrutado para o sítio inflamatório após a administração
intraescrotal de MIP-1α/CCL3, ao término do ensaio, o tecido foi corado com hematoxilina &
eosina. Nos animais que receberam apenas veículo, visualiza-se um número irrisório de
leucócitos aderidos ao endotélio, ou mesmo ao músculo (Figura 11A). Observa-se que nos
animais que receberam MIP-1α/CCL3 a maioria das células aderidas às células endoteliais,
bem como recrutadas para o tecido adjacente ao vaso, eram neutrófilos (Figura 11B). Além
disso, é possível visualizar através dos cortes histológicos um menor número de células
aderidas ao endotélio, bem como no tecido adjacente ao vaso nos animais que receberam
Evasina-1 conjuntamente ao MIP-1α/CCL3 (Figura 11C).
O número de leucócitos circulantes não era diferente nos animais que receberam
veículo ou MIP-1α/CCL3 ou Evasina-1 + MIP-1α/CCL3 (dado não mostrado).
Juntos, estes resultados descritos mostram uma boa evidência que nos possibilita
sugerir que a Evasina-1 é eficaz em bloquear a migração de leucócitos induzida por MIP-
1α/CCL3 em vários modelos in vivo. Desta maneira, os próximos ensaios foram realizados
com o objetivo de avaliar o efeito da Evasina-1 em modelos de inflamação aguda e crônica
descritos como dependentes de MIP-1α/CCL3.
Resultados
62
Figura 10
Efeito da Evasina-1 sobre o rolamento (A), adesão (B) e emigração (C) de leucócitos no músculo cremaster
induzido por MIP-1α/CCL3 humano. Os animais receberam uma injeção intraescrotal de MIP1α/CCL3 humano
(300 ng por animal) ou veículo (100 µL por animal) e 2 h após os parâmetros foram observados. Para testar a
inibição, os animais receberam uma solução de Evasina-1 (10 µg por animal) e MIP-1α/CCL3 humano (300 ng por
animal) em 100 µL de PBS preparada 15 minutos antes da administração intraescrotal. Os resultados são
apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6 animais em cada grupo. * P < 0,05.
PBS Veículo Evasina-1
0
50
100
150
h-MIP-1α/CCL3 (300 ng por animal)
(10 µg por animal)
*
*
Rolamento de
leucócitos (cels/min)
A
PBS Veículo Evasina-1
0
10
20
h-MIP-1α/CCL3 (300 ng por animal)
(10 µg por animal)
Adesão de
leucócitos (cels/
100
µ
µ
µ
µ
m)
B
*
*
PBS Veículo Evasina-1
0
10
20
30
40
*
*
h-MIP-1α/CCL3 (300 ng por animal)
(10 µg por animal)
Emigração de
leucócitos
(cels/campo)
C
Resultados
63
Figura 11
Análise histopatológica do músculo cremaster de animais submetidos à microscopia intravital a partir de cortes
corados com hematoxilina & eosina. Uma análise qualitativa foi realizada quanto à presença de células aderidas
ao endotélio e na região adjacente ao vaso. Os animais receberam uma injeção intraescrotal de veículo (A) ou
MIP1α/CCL3 humano (B) ou uma solução de Evasina-1 + MIP-1α/CCL3 humano (C). As fotos foram tiradas em
aumento de 60X
Resultados
64
3) Efeito da Evasina-1 sobre a reação de hipersensibilidade do tipo tardia
convencional (DTH com predominância de resposta Th1)
Como a dose de 10 µg de Evasina-1 foi adequada para a inibição do influxo de leucócitos
nos experimentos descritos acima, esta foi escolhida para a realização dos ensaios subseqüentes.
A meia-vida da Evasina-1 é de 12 horas (dado não mostrado). Desta forma, a droga foi
administrada a cada 12 horas por via subcutânea nos modelos os quais múltiplas administrações
eram necessárias.
Inicialmente nós avaliamos o efeito da Evasina-1 no modelo de hipersensibilidade do tipo
tardia convencional (delay tipe hipersensibility - DTH), ou seja aquele modelo onde é visto uma
predominância de resposta Th1. Nos experimentos de hipersensibilidade do tipo tardia clássica,
os animais são imunizados com antígeno (mBSA) em adjunte completo de Freud e, então
desafiados com o antígeno. No ensaio inicial foi utilizado o modelo intrapleural de influxo de
leucócitos .
A administração de Evasina-1 45 minutos antes e a cada 12 horas após o desafio preveniu
a migração de granulócitos induzido pelo antígeno nos animais sensibilizados (Figura 12A). Em
contraste, a Evasina-1 não afetou o recrutamento aumentado de mononucleares induzido por
mBSA (Figura 12B). Na verdade, a Evasina-1 foi capaz de promover a diminuição do influxo de
linfócitos, tanto do tipo CD4
+
quanto do tipo CD8
+
, induzido pelo antígeno (Figuras 12C e 12D),
mas não influenciou de forma significativa o recrutamento de macrófagos (Figura 12E). Como o
número de macrófagos era muito superior ao número de linfócitos, nós não visualizamos uma
diminuição global do número de mononucleares (Figura 12B).
Quando os animais foram imunizados de forma similar, mas desafiados subcutâneamente
na pata com o antígeno, o pré-tratamento com Evasina-1 promoveu uma inibição da resposta de
hipersensibilidade do tipo tardia nas primeiras 14 e 24 horas, avaliado pelo volume da pata
(Figura 13).
Resultados
65
Figura 12
Efeito do tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de granulócitos (A), mononucleares (B), células
CD3/CD4
+
(C), células CD3/CD8
+
(D) e células CD11b
+
(E) para a cavidade pleural induzido pelo antígeno em
animais sensibilizados. Animais imunizados foram desafiados com antígeno (mBSA, 10 µg por cavidade
pleural) ou com PBS (100 µL por cavidade pleural) e 48 h após o estímulo o número de leucócitos foi avaliado.
Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com Evasina-1 (10 µg por animal) 45 min antes do desafio
com mBSA e a cada 12 horas após. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6
animais em cada grupo. * P < 0,05 e ** P < 0,01.
PBS Veículo Evasina-1
0
1
2
3
4
**
**
Granulócitos X 10
5
por
cavidade
(10 µg por animal)
mBSA (10 µg por cavidade)
A
PBS Veículo Evasina-1
0
10
20
30
*
**
Mononucleares X 10
5
por
cavidade
(10 µg por animal)
mBSA (10 µg por cavidade)
B
PBS Veículo Evasina-1
0.0
0.5
1.0
1.5
mBSA (10 µg por cavidade)
*
**
(10 µg por animal)
CD3/CD4 X 10
5
por
cavidade
C
PBS Veículo Evasina-1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
**
*
CD3/CD8 X 10
5
por
cavidade
(10 µg por animal)
mBSA (10 µg por cavidade)
D
PBS Veículo Evasina-1
0
4
8
12
*
*
CD11b X 10
5
por
cavidade
(10 µg por animal)
mBSA (10 µg por cavidade)
E
Resultados
66
Figura 13
Efeito do tratamento com a Evasina-1 sobre o volume da pata induzido pelo antígeno em animais sensibilizados.
Animais imunizados foram desafiados com antígeno (mBSA, 200 µg por pata) ou com PBS (20 µL por pata) e
14, 24, 48 ou 72 h após o estímulo, o volume da pata foi avaliado. Para testar a inibição, os animais foram
injetados s.c. com Evasina-1 (10 µg por animal) 45 min antes do desafio com mBSA. Os resultados são
apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6 animais em cada grupo. * P < 0,05
PBS
Veículo
Evasina-1
Veículo
Evasina-1
Veículo
Evasina-1
Veículo
Evasina-1
0
100
200
14 h
24 h
48 h
72 h
mBSA (200 µg por pata)
∆
volume (
µ
L)
*
*
Resultados
67
4) Efeito da Evasina-1 sobre a reação de hipersensibilidade do tipo tardia
alternativa (DTH com predominância de resposta Th2)
Na reação de hipersensibilidade do tipo tardia alternativa, ou seja aquela onde é vista
uma predominância de resposta Th2, é possivel observar 24 a 48 horas após o desafio com
antígeno em indivíduos previamente sensibilizados, um infiltrado inflamatório formado
principalmente por mononucleares, bem como eosinófilos (Teixeira et al., 2001).
Corrobarando os resultados obtidos com os modelos de hipersensibilidade do tipo
tardia convencional, o tratamento com a Evasina-1 foi capaz de prevenir o recrutamento tanto
de mononucleares (Figuras 14A e 14B), quanto de eosinófilos (Figuras 14C e 14D) para os
pulmões 24 e 48 horas após o desafio com o antígeno em animais previamente sensibilizados.
Juntos, estes resultados nos permitem sugerir que a Evasina-1 apresenta significativo
efeito antiinflamatório em modelos de hipersensibilidade tardia, seja ele com predomínio de
linfócitos Th1 ou de Th2.
Resultados
68
Figura 14
Efeito do tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de mononucleares (A e B) e eosinófilos (C e D) para
os pulmões induzido pelo antígeno em animais sensibilizados. Animais imunizados foram desafiados com
antígeno (SEA, 10 µg por animal) ou com PBS (25 µL por animal) e 24 ou 48 h após o estímulo o número de
leucócitos foi avaliado. Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com Evasina-1 (10 µg por animal)
45 min antes do desafio com SEA e a cada 12 horas após. Os resultados são apresentados como média ± erro
padrão da média de 5-6 animais em cada grupo. * P < 0,05, ** P < 0,01 e *** P < 0,001.
PBS Veículo Evasina-1
0
1
2
3
4
**
**
24h
(10 µg por animal)
Mononucleares X 10
5
por
pulmões
SEA (10 µg por pulmões)
A
PBS Veículo Evasina-1
0
1
2
3
4
**
*
48h
(10 µg por animal)
Mononucleares X 10
5
por
pulmões
SEA (10 µg por pulmões)
B
PBS Veículo Evasina-1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
***
***
24h
(10 µg por animal)
EosinófilosX 10
5
por
pulmões
SEA (10 µg por pulmões)
C
PBS Veículo Evasina-1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
**
*
48h
(10 µg por animal)
Eosinófilos X 10
5
por
pulmões
SEA (10 µg por pulmões)
D
Resultados
69
5) Efeito da Evasina-1 sobre a lesão pulmonar induzida pela bleomicina
Uma vez visto o potencial terapêutico da Evasina-1 em modelos de inflamação aguda,
resolvemos avaliar o efeito da Evasina-1 em um modelo de inflamação crônica. O modelo de
lesão pulmonar induzido pela bleomicina é provavelmente o modelo experimental mais utilizado
para estudo da fibrose pulmonar. Estudos publicados sugerem que MIP-1α/CCL3 participa da
cascata de eventos que levam ao influxo de leucócitos e lesão pulmonar após a administração de
bleomicina em camundongos (Smith et al., 1994). Desta forma, avaliamos o efeito da Evasina-1
na migração celular, produção de quimiocinas e citocinas, alterações histopatológicas e letalidade
no modelo.
Para o estudo do efeito da Evasina-1 no processo de fibrose pulmonar induzido pela
bleomicina foi escolhida a dose de 10 µg por animal de Evasina-1, uma vez que esta foi eficaz
nos modelos de inflamação aguda. A dose de bleomicina utilizada foi de 0,0625 U por animal.
Esta dose foi baseada em trabalhos desenvolvidos em nosso laboratório que mostram que a
instilação intratraqueal de bleomicina na referida dose promove aumento significativo do
infiltrado celular no lavado brancoalveolar e no tecido pulmonar, bem como aumento dos níveis
de mediadores inflamatórios e alterações histopatológicas (dados não mostrados). Os animais
foram sacrificados nos dias 4, 8 e 25, pois nestes dias era possível observarmos diferentes
aspectos do processo inflamatório, incluido aumento do infiltrado neutrofílico, aumento dos
níveis de citocinas e quimiocinas e, tardiamente, um processo de fibrose instalado.
Resultados
70
5.1) Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento celular
induzido pela bleomicina
Nos animais instilados com bleomicina 0,0625 U por animal observa-se um aumento
gradativo do infiltrado neutrofílico no lavado broncoalveolar já no dia 4, que alcança um pico
marcante de resposta no dia 8, seguido de uma diminuição no dia 25 (Figura 15A). Através da
quantificação da mieloperoxidase no tecido pulmonar é possível visualizar um aumento marcante
da migração neutrofílica para o pulmão 8 dias após a instilação de bleomicina que persiste no dia
25 (Figura 15B). A administração de Evasina-1 45 minutos antes e a cada 12 horas após a
instilação de bleomicina preveniu de forma significativa o aumento do recrutamento de
neutrófilos para o espaço alveolar, bem como no pulmão induzido pela bleomicina em
comparação aos animais que receberam apenas o veículo (Figuras 15A e 15B).
Mononucleares são encontrados aumentados nos dias 8 e 25 no lavado broncoalveolar
(Figura 15C). Da mesma forma, os índices de N-acetilglicosaminidase indicam a presença
relativa de macrófagos no tecido pulmonar nos dias 8 e 25 (Figura 15D). A administração de
Evasina-1 45 minutos antes da instilação de bleomicina e a cada 12 horas após reduziu de forma
significativa o aumento do recrutamento de mononucleares para o espaço alveolar nos dias 8 e
25, bem como no pulmão no dia 8 induzido pela bleomicina em comparação aos animais que
receberam apenas o veículo (Figuras 15C e 15D).
No intuito de avaliarmos quais eram os tipos de células mononucleares diminuidos pelo
tratamento com a Evasina-1 no dia 8, que representa o pico de resposta inflamatória no modelo,
nós realizamos um ensaio de citometria de fluxo a partir das células recolhidas no lavado
broncoalveolar. O tratamento com a Evasina-1 foi capaz de promover a diminuição do influxo de
linfócitos, tanto do tipo CD4
+
quanto do tipo CD8
+
(Figuras 16A e 16B), bem como o
recrutamento de macrófagos (Figura 16C).
Resultados
71
Figura 15
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de neutrófilos (A) e mononucleares (C) para o
espaço alveolar e quantidade de mieloperoxidase (B) e N-acetilglicosaminidase (D) no pulmão induzido pela
bleomicina. Os animais receberam uma injeção intratraqueal de bleomicina (0,0625 U por animal) ou veículo (25
µL por animal) e 4, 8 ou 25 dias após o estímulo os parâmetros foram avaliados. Para testar a inibição, os
animais foram injetados s.c. com Evasina-1 (10 µg por animal) 45 min antes do estímulo com a bleomicina e à
cada 12 horas. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6 animais em cada
grupo. * P < 0,05, ** P < 0,01 e *** P < 0,001.
PBS Vec 10 PBS Vec 10 PBS Vec 10
0.0
0.5
1.0
1.5
Bleomicina 0,0625 U
PBS
Evasina -1
Evasina -1
Dia 8
Dia 25
**
**
*** ***
Evasina -1
Dia 4
A
Neutrófilos X 10
5
por
pulmões
PBS Vec 10 PBS Vec 10 PBS Vec 10
0
300
600
900
1200
*
*
*
*
Evasina -1
Evasina -1
Dia 8
Dia 25
Evasina -1
Dia 4
B
Número relativo de
neutrófilos X 10
4
por
100 mg de pulmões
PBS Vec 10 PBS Vec 10 PBS Vec 10
0
3
6
9
12
***
*
**
** *
Evasina -1
Evasina -1
Dia 8
Dia 25
Evasina -1
Dia 4
C
Mononucleares X 10
5
por pulmões
PBS Vec 10 PBS Vec 10 PBS Vec 10
0.0
0.3
0.6
0.9
1.2
***
**
**
***
***
Número relativo de
células X 10
4
por 100
mg de pulmões
Evasina -1
Evasina -1
Dia 8
Dia 25
Evasina -1
Dia 4
D
Resultados
72
Figura 16
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre o recrutamento de células CD3/CD4
+
(A), células CD3/CD8
+
(B) e células CD11b
+
(C) para o espaço alveolar induzido pela bleomicina. Os animais receberam uma injeção
intratraqueal de bleomicina (0,0625 U por animal) ou veículo (25 µL por animal) e 8 dias após o estímulo o
recrutamento de leucócitos foi avaliado. Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com Evasina-1
(10 µg por animal) 45 min antes do estímulo com a bleomicina e à cada 12 horas. Os resultados são apresentados
como média ± erro padrão da média de 5-6 animais em cada grupo. * P < 0,05 e *** P < 0,001.
PBS Veículo Evasina-1
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
(10 µg por animal)
Bleomicina (0,0625 U por animal)
***
***
A
CD3/CD4 x 10
5
por pulmões
PBS Veículo Evasina-1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
(10 µg por animal)
Bleomicina (0,0625 U por animal)
*** ***
B
CD3/CD8 x 10
5
por pulmões
PBS Veículo Evasina-1
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
(10 µg por animal)
Bleomicina (0,0625 U por animal)
CD11b x 10
5
por pulmões
*** ***
*
C
Resultados
73
5.2) Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a produção de
citocinas induzido pela bleomicina
Após a observação do efeito da Evasina-1 sobre o perfil celular, quantificamos o efeito
da droga estudada sobre a produção de TNF-α e TGF-β que são citocinas descritas como
participantes do processo inflamatório promovido pela bleomicina (Giri et al., 1993; Piguet et
al., 1997).
Nos animais instilados com bleomicina 0,0625 U por animal observa-se um aumento dos
níveis de TNF-α comparado ao controle no lavado broncoalveolar durante todos os pontos
estudados, dias 4, 8 e 25 (Figura 17A). De maneira semelhante, observamos concentrações
aumentadas de TGF-β nos animais instilados com bleomicina no lavado broncoalveolar nos dias
8 e 25, sendo que não conseguimos detectar níveis quantificáveis de TGF-β no dia 4 (Figura
17B).
A administração de Evasina-1 45 minutos antes da instilação de bleomicina e à cada 12
horas após reduziu a produção TNF-α encontrado no lavado broncoalveolar em todos os pontos
observados em relação ao grupo de animais tratados com veículo (Figuras 17A). De modo
similar, o pré-tratamento com Evasina-1 também preveniu o aumento da concentração de TGF-β
encontrado no lavado broncoalveolar no dia 25 em relação ao grupo de animais tratados apenas
com veículo (Figuras 17B).
Resultados
74
Figura 17
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a produção das citocinas TNF-α (A) e TGF-β (B) mensuradas
no espaço alveolar induzido pela bleomicina. Os animais receberam uma injeção intratraqueal de bleomicina
(0,0625 U por animal) ou veículo (25 µL por animal) e 4, 8 ou 25 dias após o estímulo os parâmetros foram
avaliados. Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com Evasina-1 (10 µg por animal) 45 min antes
do estímulo com a bleomicina e à cada 12 horas. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da
média de 5-6 animais em cada grupo. * P < 0,05, ** P < 0,01 e *** P < 0,001.
PBS Vec 10 PBS Vec 10 PBS Vec 10
0
60
120
180
240
Evasina -1
Evasina -1
Dia 8
Dia 25
***
***
***
***
***
***
***
***
Evasina -1
Dia 4
PBS
Bleomicina 0,0625 U
TNF-α
α
α
α
(pg por 100 mg
de tecido)
A
PBS Vec 10 PBS Vec 10 PBS Vec 10
0
700
1400
2100
2800
ND ND ND
*
*
** **
Evasina -1
Evasina -1
Dia 8
Dia 25
Evasina -1
Dia 4
B
TGF-ß (pg por 100 mg
de tecido)
Resultados
75
5.3) Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a produção de
quimiocinas induzido pela bleomicina
Nós também avaliamos a influência da Evasina-1 sobre a produção de quimiocinas
reconhecidamente importantes no modelo de fibrose pulmonar induzido pela bleomicina,
incluindo MIP-1α/CCL3, MCP-1/JE/CCL2 e RANTES/CCL5 (Smith et al., 1994; Zhang et
al., 1994; Keane et al., 1999a, b).
Nos animais instilados com bleomicina 0,0625 U por animal, MIP-1α/CCL3 apresentou
níveis elevados já observados no dia 4 persistindo durante os 25 dias de estudo (Figura 18A).
De maneira semelhante, a concentração de MCP-1/JE/CCL2 apresentou-se elevada durante
todos os dias avaliados (Figura 18B). RANTES/CCL5 apresentou aumento de seus níveis no
lavado broncoalveolar apenas no dia 25 (Figura 18C).
A administração de Evasina-1 45 minutos antes da instilação de bleomicina e à cada 12
horas após inibiu a produção MIP-1α/CCL3 encontrado no lavado broncoalveolar em todos os
pontos observados em relação ao grupo de animais tratados com veículo (Figuras 18A). De
modo similar, o pré-tratamento com Evasina-1 também preveniu o aumento da concentração de
MCP-1/JE/CCL2 encontrado no lavado broncoalveolar no dia 4 e 25 (Figuras 18B) e
RANTES/CCL5 no dia 25 (Figura 18C) em relação ao grupo de animais tratados apenas com
veículo.
Resultados
76
Figura 18
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a produção das quimiocinas MIP-1α/CCL3 (A), MCP-
1/JE/CCL2 (B) e RANTES/CCL5 (C) mensuradas no espaço alveolar induzido pela bleomicina. Os animais
receberam uma injeção intratraqueal de bleomicina (0,0625 U por animal) ou veículo (25 µL por animal) e 4, 8
ou 25 dias após o estímulo os parâmetros foram avaliados. Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c.
com Evasina-1 (10 µg por animal) 45 min antes do estímulo com a bleomicina e à cada 12 horas. Os resultados
são apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6 animais em cada grupo. * P < 0,05, ** P < 0,01 e
*** P < 0,001.
PBS Vec 10 PBS Vec 10 PBS Vec 10
0
30
60
90
120
Evasina -1
Dia 25
** *
***
***
Evasina -1
Dia 8
Evasina -1
Dia 4
*** **
PBS
Bleomicina 0,0625 U
MIP-1
α
α
α
α
/CCL3 (pg por
100 mg de tecido)
A
PBS Vec 10 PBS Vec 10 PBS Vec 10
0
250
500
750
***
***
***
*
*
MCP-1/JE/CCL2 (pg por
100 mg de tecido)
Evasina -1
Dia 25
Evasina -1
Dia 8
Evasina -1
Dia 4
***
*
B
PBS Vec 10 PBS Vec 10 PBS Vec 10
0
800
1600
2400
3200
** **
RANTES/CCL5 (pg por
100 mg de tecido)
Dia 25
Evasina -1
Dia 8
Evasina -1
Dia 4
Evasina -1
C
Resultados
77
5.4) Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a lesão pulmonar e
fibrose induzida pela bleomicina
A análise histopatológica revelou diferenças nas alterações morfológicas do tecido
pulmonar observadas entre os grupos tratados com Evasina-1 ou veículo após adminstração
intratraqueal de bleomicina. Na avaliação do pulmão com vinte e cinco dias após a instilação de
bleomicina foi observado um quadro de fibrose interticial difusa grave com formações císticas
em forma de colméia alterando a arquitetura pulmonar (Figura 19B). O infiltrado inflamatório,
neste grupo era predominantemente mononuclear. No grupo de animais que receberam Evasina-
1 45 minutos antes da instilação de bleomicina e à cada 12 horas, adjacente às áreas de fibrose
eram observadas áreas de parênquima pulmonar mais preservadas, caracterizando um quadro de
fibrose difusa multifocal com discreto infiltrado inflamatório (Figura 19C).
A deposição de colágeno foi melhor evidenciada pela coloração de Tricrômico de
Gomori que cora o tecido conjuntivo em verde. Intensa deposição de colágeno foi observada no
dia 25 nos animais tratados apenas com veículo, bem como perda da arquitetura pulmonar
normal (Figura 20B). Também foi observada progressiva deposição de colágeno na parede
alveolar dos animais tratados com Evasina-1, mas de maneira menos acentuada e de forma
multifocal, apresentado ainda áreas preservadas próximas as áreas de comprometimento tecidual
pulmonar, causado pelo espessamento alveolar (Figura 20C).
Os resultados descritos anteriormente para a coloração de Tricrômico de Gomori podem
ser descritos de modo quantitativo através da análise morfométrica, onde é possível mensurar as
áreas de colágeno. Conforme podemos observar na Figura 20, os animais que foram instilados
com bleomicina 0,0625 U por animal apresentam no dia 25 uma maior área de colágeno
comparados aos animais que receberam PBS. A administração de Evasina-1 45 minutos antes da
instilação de bleomicina e à cada 12 horas após reduziu de modo significativo a elevação da
quantidade de colágeno no dia 25 em relação ao grupo de animais tratados apenas com veículo
(Figura 21).
Resultados
78
Figura 19
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a lesão pulmonar avaliada através de cortes histológicos corados
com hematoxilina & eosina. Os animais receberam uma injeção intratraqueal de bleomicina (0,0625 U por
animal) ou veículo (25 µL por animal) e 25 dias após o estímulo os parâmetros foram avaliados. Para testar a
inibição, os animais foram injetados s.c. com Evasina-1 (10 µg por animal) 45 min antes do estímulo com a
bleomicina e à cada 12 horas. Controle (A), Veículo + Bleomicina (B) e Evasina-1 + Bleomicina (C). As fotos
foram tiradas em aumento de 40X
Resultados
79
Figura 20
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a deposição de colágeno pulmonar avaliada através de cortes
histológicos corados Tricrômicro de Gomori. Os animais receberam uma injeção intratraqueal de bleomicina
(0,0625 U por animal) ou veículo (25 µL por animal) e 25 dias após o estímulo os parâmetros foram avaliados.
Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com Evasina-1 (10 µg por animal) 45 min antes do
estímulo com a bleomicina e à cada 12 horas. Controle (A), Veículo + Bleomicina (B) e Evasina-1 + Bleomicina
(C). As fotos foram tiradas em aumento de 20X
Resultados
80
Figura 21
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a deposição de colágeno pulmonar avaliada através da análise
morfométrica de cortes histológicos corados com Tricrômicro de Gomori. Os animais receberam uma injeção
intratraqueal de bleomicina (0,0625 U por animal) ou veículo (25 µL por animal) e 25 dias após o estímulo, a
área de colágeno foi quantificada. Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com Evasina-1 (10 µg
por animal) 45 min antes do estímulo com a bleomicina e à cada 12 horas. Os resultados são apresentados como
média ± erro padrão da média de 5-6 animais em cada grupo. * P < 0,05, ** P < 0,01 e *** P < 0,001.
PBS Veículo Evasina-1
0
50000
100000
150000
200000
250000
(10 µg por animal)
Bleomicina (0,0625 U por animal)
*** *
**
Área de colágeno
( µ
( µ
( µ
( µ
m
2
)
Resultados
81
5.5) Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a sobrevida dos
animais instilados com a bleomicina
Após verificármos a habilidade da Evasina-1 em diminuir o recrutamento celular para
o espaço alveolar e tecido pulmonar, diminuir a lesão pulmonar e deposição de colágeno
intertiscial, bem como a produção de citocinas e quimiocinas, estudamos o efeito do
tratamento com a Evasina-1 sobre a letalidade dos animais estimulados com bleomicina.
Nos animais instilados com bleomicina 0,0625 U por animal e tratados com a Evasina-1
45 minutos antes da instilação de bleomicina e à cada 12 horas observamos no dia 25 uma taxa
de sobrevida 17,76% maior em relação ao grupo de animais tratados apenas com veículo (Figura
22). Para certificarmos que este fato não ocorreu porque a dose de bleomicina era baixa,
realizamos um experimento onde os animais receberam uma dose de bleomicina de 0,125 U por
animal. Corrobarando os resultados anteriores, os animais que foram tratados com Evasina-1
apresentaram no dia 14 uma taxa de sobrevida 46% maior comparado ao grupo tratado apenas
com veículo (Figura 22). No entanto, é importante ressaltar que todos os animais instilados com
bleomicina na dose de 0,125 U por animal (tratados ou não com Evasina-1) morreram mais
precocemente em relação aos animais que receberam bleomicina na dose de 0,0625 U por
animal.
Resultados
82
Figura 22
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-1 sobre a letalidade dos animais submetidos à fibrose pulmonar induzida
pela bleomicina. Os animais receberam uma injeção intratraqueal de bleomicina (0,0625-0,125 U por animal) ou
veículo (25 µL por animal). Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com Evasina-1 (10 µg por
animal) 45 min antes do estímulo com a bleomicina e à cada 12 horas. * P < 0,05 com relação veículo + Bleo
0,125U
0 5 10 15 20 25 30
0
20
40
60
80
100
Bleo 0.0625 U
+ Evasina-1
Bleo 0.125 U
+ Evasina-1
Tempo (dias)
% Sobrevida
*
Resultados
83
6) Efeito do tratamento tardio com a Evasina-1 sobre a lesão pulmonar
induzida pela bleomicina
Conforme mostrado anteriormente, nossos resultados sugerem que a administração da
Evasina-1 45 minutos antes da instilação com a bleomicina e à cada 12 horas é capaz de
melhorar todos os aspectos inflamatórios, de remodelamento e sobrevida dos animais
submetidos ao modelo de fibrose pulmonar. Assim, nós posteriormente avaliamos qual seria o
efeito do tratamento com a Evasina-1 caso esta fosse implementada tardiamente, após a
instalação da resposta.
Os animais foram instilados com bleomicina 0,0625 U por animal e começaram a receber
Evasina-1 à cada 12 horas a partir do dia 8 após a instilação, sendo sacrificados no dia 25. Os
resultados foram compilados na Tabela 2. O tratamento com a Evasina-1 reduziu de forma
significativa o influxo de mononucleares para o espaço alveolar em relação aos animais que
receberam apenas o veículo. Em contrapartida, a Evasina-1 não interferiu na quantidade de
mieloperoxidase e de N-acetilglicosaminidase no tecido pulmonar. Em acordo com os resultados
obtidos com o pré-tratamento com a Evasina-1, esta quando dada a partir do dia 8, também foi
capaz de diminuir a produção TNF-α, TGF-β e MIP-1α/CCL3 encontrados no lavado
broncoalveolar em relação ao grupo de animais tratados apenas com veículo. De maneira
contrária, Evasina-1 não diminuiu as concentrações aumentadas de MCP-1/JE/CCL2 e
RANTES/CCL5 nos animais estimulados com a bleomicina. Apesar do pós-tratamento com a
Evasina-1 promover a diminuição de alguns parâmetros inflamatórios, essa foi incapaz de
melhorar a lesão tecidual em comparação ao grupo tratado com veículo, visualizada pela
quantificação das áreas de colágeno coradas pelo Tricrômico de Gomori.
Resultados
84
Tabela 2: Efeito do pós-tratamento com a Evasina-1 (10 µg por animal) sobre o recrutamento
celular, produção de citocinas e quimiocinas e deposição de colágeno induzidos pela instilação
intratraqueal de bleomicina 0,0625 U por animal.
Parâmetro avaliado PBS
Veículo + Bleomicina
0,0625U
Evasina-1 +
Bleomicina 0,0625U
Neutrófilos X 10
5
por
pulmões
Não detectado Não detectado Não detectado
MPO X 10
4
por 100
mg de pulmões
368,3 ± 22,7 508,8 ± 32,7 * 508,1 ± 51,6 *
Mononucleares X 10
5
por pulmões
0,8 ± 0,1 7,1 ± 0,5 * 5,5 ± 0,6 * #
NAG X 10
4
por 100
mg de pulmões
0,5 ± 0,0 1,3 ± 0,1 * 1,3 ± 0,1 *
TNF-α (pg por 100
mg de tecido)
0,0 ± 0,0 16,0 ± 4,4 * 5,0 ± 1,9 * #
TGF-β (pg por 100 mg
de tecido)
869,1 ± 113,0 4084,0 ± 548,0 * 2232,0 ± 143,3 * #
MIP-1α/CCL3 (pg por
100 mg de tecido)
15,9 ± 4,2 140,8 ± 9,1 * 79,0 ± 3,3 * #
MCP-1/JE/CCL2 (pg
por 100 mg de tecido)
195,4 ± 12,6 280,9 ± 25,8 260,9 ± 31,4
RANTES/CCL5 (pg
por 100 mg de tecido)
1380,0 ± 114,2 4146,0 ± 273,9 * 4065,0 ± 174,7 *
Área de colágeno
(mm2)
46450,0 ± 5568,0 141100,0 ± 29040,0 *
107500,0 ± 17250,0 *
* estatisticamente diferente do grupo PBS
# estatisticamente diferente do grupo Veículo + Bleomicina 0,0625U
Resultados
85
7) Efeito da Evasina-3 sobre o recrutamento de neutrófilos
Os experimentos iniciais foram realizados com o objetivo de avaliar in vivo a
habilidade da Evasina-3 de interferir no recrutamento de neutrófilos induzido por
KC/CXCL1-3 e LPS.
Conforme resultados obtidos anteriormente em nosso laboratório (dados não mostrados)
a administração intraarticular da quimiocina KC/CXCL1-3 induziu um influxo de neutrófilos
para a cavidade sinovial 4 horas após o estimulo. O pré-tratamento com a Evasina-3 45
minutos antes da injeção de KC/CXCL1-3 preveniu este influxo de neutrófilos (Figura 23).
Uma vez observado que a Evasina-3 na dose de 1 µg por animal foi capaz de inibir in
vivo uma resposta induzida por KC/CXCL1-3, nós avaliamos o efeito da Evasina-3 em um
modelo dependente da liberação agonistas do receptor CXCR2. Para isto, os animais
receberam uma injeção intrapleural de LPS que induziu o influxo de neutrófilos para a
cavidade pleural 8 horas após o estimulo. Corroborando o resultado descrito anteriormente, o
pré-tratamento com a Evasina-3 45 minutos antes da injeção de LPS preveniu o influxo de
neutrófilos (Figura 24).
Juntos, estes resultados descritos mostram uma boa evidência que nos possibilita
sugerir que a Evasina-3 é eficaz em bloquear a migração de leucócitos induzida por
KC/CXCL1-3 in vivo. Assim, o próximo ensaio foi realizado com o objetivo de avaliar o
efeito da Evasina-3 no modelo de recrutamento celular induzido por antígeno onde é
reconhecidamente sabido que há um influxo de neutrófilos no processo inflamatório (Klein et
al., 2000).
Resultados
86
Figura 23
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-3 sobre o recrutamento de neutrófilos para a cavidade articular induzido
por KC/CXCL1-3. Os animais receberam uma injeção intraarticular de KC/CXCL1-3 (30 ng por cavidade
articular) ou veículo (10 µL por cavidade articular) e 4 h após o estímulo o número de leucócitos foi avaliado.
Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com Evasina-3 (0,001-1,0 µg por animal) 45 min antes do
estímulo com KC/CXCL1-3. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6 animais
em cada grupo. * P < 0,05.
PBS Veículo 0,001 0,01 0,1 1
0.0
2.5
5.0
7.5
KC/CXCL1-3 (30 ng por cavidade)
Evasina-3 (µg por animal)
*
Todos diferentes do Veículo
Neutrófilos X 10
5
por
cavidade
Resultados
87
Figura 24
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-3 sobre o recrutamento de neutrófilos para a cavidade pleural induzido
por LPS. Os animais receberam uma injeção intrapleural de LPS (250 ng por cavidade) ou veículo (100 µL por
cavidade) e 8 h após o estímulo o número de leucócitos foi avaliado. Para testar a inibição, os animais foram
injetados s.c. com Evasina-3 (1 µg por animal) 45 min antes do estímulo com LPS. Os resultados são
apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6 animais em cada grupo. * P < 0,05 e ** P < 0,01.
PBS Veículo Evasina-3
0
10
20
30
40
(1 µg por animal)
LPS (250 ng por cavidade)
**
*
Neutrófilos X 10
5
por
cavidade
Resultados
88
8) Efeito da Evasina-3 sobre o recrutamento de leucócitos induzido por
antígeno
De acordo com nossos trabalhos prévios, a injeção intrapleural de antígeno (OVA) em
animais sensibilizados induziu a migração de granulócitos para a cavidade pleural após 8 h
(Figura 25). O pré-tratamento com Evasina-3 45 minutos antes do desafio reduziu o influxo
de granulócitos 8 h após o desafio com OVA em animais imunizados (Figura 25).
Figura 25
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-3 sobre o recrutamento de granulócitos para a cavidade pleural induzido
pelo antígeno em animais sensibilizados. Animais imunizados foram desafiados com antígeno (OVA, 1 µg por
cavidade pleural) ou com PBS (100 µL por cavidade pleural) e 8 h após o estímulo o número de leucócitos foi
avaliado. Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com Evasina-3 (1 µg por animal) 45 min antes do
desafio. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6 animais em cada grupo. ** P
< 0,01 e *** P < 0,001.
PBS Veículo Evasina-3
0
1
2
3
(1 µg por animal)
OVA (1 µg por cavidade)
***
**
**
Granulócitos X 10
5
por
cavidade
Resultados
89
9) Efeito da Evasina-4 sobre o recrutamento de eosinófilos
O experimento inicial foi realizado com o objetivo de avaliar in vivo a habilidade da
Evasina-4 de interferir no recrutamento de eosinófilos induzido por eotaxina/CCL11.
Como ainda não estão disponíveis os resultados dos ensaios farmacocinéticos da
Evasina-4, nós empiricamente escolhemos administrar a droga 45 minutos antes e 6 horas
após o estímulo escolhido.
Conforme já demonstrado anteriormente (Klein et al., 2001), a administração
intrapleural da quimiocina eotaxina/CCL11 induz um influxo de eosinófilos para a cavidade
pleural 24 horas após o estímulo. O pré-tratamento com a Evasina-4 45 minutos antes e 6
horas após a injeção de eotaxina/CCL11 humana preveniu este influxo de eosinófilos (Figura
26).
Este resultado mostra uma boa evidência que nos possibilita sugerir que a Evasina-4 é
eficaz em bloquear a migração de leucócitos induzida por eotaxina/CCL11 in vivo. Desta
forma, o próximo ensaio foi realizado com o objetivo de avaliar o efeito da Evasina-4 no
modelo de recrutamento celular induzido por antígeno onde é reconhecidamente sabido que
há um influxo de eosinófilos no processo inflamatório (Klein et al., 2000).
Resultados
90
Figura 26
Efeito do pré-tratamento com a Evasina-4 sobre o recrutamento de eosinófilos para a cavidade pleural induzido
por eotaxina/CCL11 humana. Os animais receberam uma injeção intrapleural de h-eotaxina/CCL11 (300 ng por
cavidade) ou veículo (100 µL por cavidade) e 24 h após o estímulo o número de leucócitos foi avaliado. Para
testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com Evasina-4 (0,001-10,0 µg por animal) 45 min antes do
estímulo com eotaxina/CCL11. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6
animais em cada grupo. *** P < 0,001.
PBS Veículo 0,01 0,1 1,0 10,0
0
2
4
6
Evasina-4 (µg per animal)
h-eotaxina/CCL11 (300 ng per cavity)
Eosinófilos X 10
5
por
cavidade
Todos diferentes do Veículo
***
Resultados
91
10) Efeito da Evasina-4 sobre o recrutamento de eosinófilos induzido por
antígeno
De acordo com nossos trabalhos prévios, a injeção intrapleural de antígeno (OVA) em
animais sensibilizados induziu a migração de eosinófilos para a cavidade pleural após 48 h
(Figura 27). O pré-tratamento com Evasina-4 45 minutos antes e 6 horas após o desafio
reduziu o influxo de eosinófilos 48 h após o desafio com OVA em animais imunizados
(Figura 27).
Figura 27
Efeito do tratamento com a Evasina-4 sobre o recrutamento de eosinófilos para a cavidade pleural induzido pelo
antígeno em animais sensibilizados. Animais imunizados foram desafiados com antígeno (OVA, 1 µg por
cavidade pleural) ou com PBS (100 µL por cavidade pleural) e 48 h após o estímulo o número de leucócitos foi
avaliado. Para testar a inibição, os animais foram injetados s.c. com Evasina-4 (0,1-1,0 µg por animal) 45 min e
6 horas após o desafio. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média de 5-6 animais em
cada grupo. * P < 0,05 e ** P < 0,01.
PBS Veículo 0,1 1,0
0
5
10
15
**
*
**
Evasina-4 (µg por animal)
OVA (1 µg por cavidade)
Eosinófilos x 10
5
por
cavidade
V. Discussão
Discussão
93
As quimiocinas formam uma superfamília de pequenas citocinas (8-14 KDa) que estão
envolvidas no recrutamento de vários tipos celulares. Além disso, as quimiocinas participam
de uma ampla série de eventos fisiológicos e patológicos, incluindo diferenciação e ativação
celular, angiogênese, condições auto-imunes, processos inflamatórios, metástases e rejeição à
transplantes (Gerard & Rollins, 2001; Luther & Cyster, 2001; Mackay, 2001; Lukacs et al.,
2001; Azenshtein et al., 2002; Robinson et al., 2003; Allen et al., 2007).
Considerando-se a relevante participação das quimiocinas no processo fisiopatológico
de diversas doenças, muito esforço tem sido feito para o desenvolvimento de estratégias
farmacológicas que interfiram no sistema de quimiocinas. A utilização de anticorpos
neutralizantes de quimiocinas e seus receptores é a forma mais antiga de intervir no sistema
de quimiocinas e foi muito importante para a validação do papel destas proteínas na
patogênese de várias doenças (Gonzalo et al., 1998). A abordagem atualmente mais utilizada
é a administração de pequenas moléculas antagonistas dos receptores de quimiocinas (Liang
et al., 2000; Horuk et al., 2001b). A criação de quimiocinas modificadas exerce efeito
semelhante, uma vez que estas mantêm alta afinidade pelo receptor, mas não promovem
sinalização intracelular, tornando-se, assim, agentes com ação antagonista (Proudfoot et al.,
1996). Algumas quimiocinas modificadas apresentam mutação na região de ligação da
quimiocina aos glicosaminoglicanos, logo, estes agentes impedem com que a quimiocina
natural forme gradientes biologicamente ativos (Proudfoot et al., 2001).
Nos últimos anos tem sido evidenciado que muitos tipos de vírus (pox e herpes vírus)
e parasitas (Schistosoma mansoni) apresentam estratégias de evasão do sistema imunológico
do hospedeiro baseadas na interferência no sistema de quimiocinas. Carrapatos também
apresentam mecanismos evasivos similares. Eles possuem em sua saliva uma grande
variedade de agentes vasodilatadores, anticoagulantes, anestésicos e antiinflamatórios, o que
permite com que eles se alimentem por logo período de tempo sem serem percebidos pelo
sistema imunológico do hospedeiro. Além disso, uma das estratégias de burlar o sistema
imune é a produção de proteínas ligantes que seletivamente neutralizam as quimiocinas que
normalmente recrutam células que protegem o hospedeiro, como neutrófilos e eosinófilos.
Nos trabalhos de Hajnická e colaboradores (1998 e 2001) é mostrado que na saliva de
carrapatos do gênero Ixodidae encontram-se proteínas inibidoras direcionadas às quimiocinas
MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3, RANTES/CCL5, eotaxina/CCL11 e IL-8/CXCL8.
Discussão
94
No presente trabalho nós realizamos ensaios pré-clínicos em modelos animais de uma
nova família de proteínas ligantes de quimiocinas, chamada evasinas, secretadas na saliva do
carrapato Rhipicephalus sanguineus.
As evasinas são moléculas pequenas, menores que os recentemente descobertos
anticorpos naturais de camelos que possuem apenas a cadeia pesada (Muyldermans, 2001).
Além disso, elas não apresentam homologia estrutural às proteínas já descritas, inclusive
proteínas ligantes de quimiocinas de origem viral ou do Schistosoma mansoni. Outra
característica interessante das evasinas que as distingue das outras proteínas ligantes de
quimiocinas é a grande seletividade de seus membros quanto aos ligantes. As proteínas
ligantes de quimiocinas de origem viral apresentam afinidade por muitas quimiocinas
diferentes. Por exemplo, a proteína M-T7, liberada pelo mixomavírus, se liga com baixa
especificidade a todas as subfamílias de quimiocinas (Lalani et al., 1997); a proteína M-T1,
codificada por vários vírus da família pox, se liga com alta afinidade às quimiocinas CC
(Graham et al., 1997); e a proteína M3 liberada pelo gammaherpesvírus murino, se liga com
grande afinidade à todas as subfamílias de quimiocinas (Bridgeman et al., 2001). A proteína
ligante de quimiocinas do Schistosoma mansoni também apresenta afinidade por quimiocinas
de famílias diferentes, uma vez que se liga à IL-8/CXCL8, MIP-1α/CCL3,
fractalkina/CX
3
CL1, bem com a MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5 (Smith et al., 2005). As
evasinas apresentam afinidade por um grupo limitado de quimiocinas conforme será abordado
posteriormente.
A primeira molécula estudada foi a Evasina-1 que se liga seletivamente à MIP-
1α/CCL3, MIP-1β/CCL3 e PARC/CCL18 com alta afinidade e, cujos valores de KD são
0,16, 0,81 e 3,21 nM, respectivamente (Frauenschuh et al., 2007). Ensaios in vitro mostram
que a Evasina-1 inibe a quimiotaxia de neutrófilos induzida por MIP-1α/CCL3 com IC
50
da
ordem de picomolares. Desta forma, para validar o potencial efeito inibitório da Evasina-1 in
vivo nós utilizamos o modelo de migração celular para o peritônio. Embora a habilidade de
MIP-1α/CCL3 em recrutar células para essa cavidade seja bem documentada (Johnson et al.,
2004b), nós realizamos experimentos de dose-resposta e tempo-resposta com a quimiocina
para avaliar estas respostas nas condições do nosso laboratório. MIP-1α/CCL3 promoveu
infiltrado celular máximo na dose de 10.000 ng por animal 18 horas após o estímulo. Uma
inibição celular significativa foi observada quando os animais receberam a Evasina-1 antes da
injeção de MIP-1α/CCL3.
Discussão
95
Os estágios iniciais do recrutamento celular envolvem o “tethering”, rolamento e
adesão dos leucócitos à parede do vaso antes do extravasamento através da membrana basal e
saída para o tecido adjacente. Na tentativa de visualizar o ponto sobre o qual a Evasina-1
interfere na ação quimioatraente de MIP-1α/CCL3, nós realizamos um ensaio de microscopia
intravital no músculo cremaster de camundongos. Os processos de rolamento, adesão e
subseqüente recrutamento para o tecido induzido pela quimiocina foram inibidos quando esta
era administrada concomitantemente à Evasina-1, sendo esta solução preparada 15 minutos
antes da injeção. Existem relatos de que MIP-1α/CCL3 promove o recrutamento de
neutrófilos (maioria celular observada) por uma via indireta de aumento de expressão de P-
selectinas. Na verdade, é sugerido que MIP-1α/CCL3 ative os mastócitos e estas células ao
liberar fatores como leucotrienos e TNF-α promova aumento da expressão de selectinas nas
células endoteliais culminando no influxo de neutrófilos (Wan et al., 2003).
Juntos, esses resultados evidenciaram que a Evasina-1 apresenta habilidade de inibir
MIP-1α/CCL3 in vivo. Assim, nós começamos a avaliar o efeito desta proteína em modelos
animais descritos como dependentes de MIP-1α/CCL3, incluindo reações de
hipersensibilidade do tipo tardia e fibrose pulmonar induzida pela bleomicina.
Reações de hipersensibilidade do tipo tardia (“delay type hipersensibility”, DTH)
representam respostas imunes mediadas por células que desempenham importantes efeitos
imunoprotetores (resistência contra vírus, bactérias e fungos) ou imunopatólogicos
(hipersensibilidade alérgica e doença autoimune). A resposta de hipersensibilidade do tipo
tardia pode ser mediada predominantemente por linfócitos T helper 1 (DTH clássica) ou por
linfócitos T helper 2 (DTH alternativa) que envolve ativação destas células por um antígeno
específico com subseqüente produção de citocinas (Teixeira et al., 2001). Observa-se 24 às 48
horas após o desafio com antígeno em animais previamente sensibilizados um
intumescimento local, além de um infiltrado inflamatório formado principalmente por
linfócitos T e macrófagos, bem como eosinófilos em reações de DTH alternativa (Gaga et al.,
1991; Yoshimoto et al., 2000; Teixeira et al., 2001; Sutherland et al., 2005). Além disso,
trabalhos mostram que quimiocinas e citocinas como MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3, IL-
8/CXCL8 e fator inibidor da migração de macrófagos (MIF) participam do recrutamento de
leucócitos para os locais de reação de DTH (Larsen et al., 1995; Bernhagen et al., 1996; Rand
et al., 1996; Doyle et al., 1997). A expressão de IP-10/CXCL10 e RANTES/CCL5 é
detectada em reações de contato e granulomas (Devergne et al., 1994; Gautam et al., 1994).
Assim, considerando-se que o modelo é mediado por linfócitos T helper e estes são atraídos
Discussão
96
por MIP-1α/CCL3 (Schall et al., 1993; Taub et al., 1993; Tedla et al., 1998) uma estratégia
terapêutica que diminua a ação de MIP-1α/CCL3 pode ser útil para minimizar a resposta de
DTH.
A albumina de soro bovina metilada (mBSA) é uma proteína antigênica muito versátil
que estimula uma resposta de hipersensibilidade do tipo tardia com predomínio de linfócitos
Th1 semelhante àquela induzida por tuberculina e que permite a indução de uma resposta
inflamatória na pele (Teixeira et al., 2001), articulações (Lewis et al., 1982) e cavidade
pleural (Dunn & Miller, 1986). Neste último caso, a reação está associada a um influxo de
leucócitos para o espaço pleural e a formação de um exsudato (Dunn & Miller, 1986).
Fine e colaboradores (2003) mostraram que granulócitos, macrófagos, células
dendríticas e células T migram para a cavidade pleural de maneira tempo dependente após o
desafio em animais sensibilizados, sendo que os neutrófilos representam a maior parte do
infiltrado nas primeiras 24 horas e o número de mononucleares aumenta posteriormente.
Além disso, o número de células T é consistentemente menor comparado ao número de
macrófagos. Corroborando estes dados já descritos na literatura, nós observamos que 48 horas
após a injeção de mBSA na pleura dos animais sensibilizados houve aumento do número de
granulócitos e mononucleares. Este aumento de mononucleares foi devido tanto ao aumento
de células T, quanto de macrófagos. A administração de Evasina-1 preveniu o aumento do
recrutamento de granulócitos, bem como a migração de células T, tanto linfócitos CD4
+
quanto CD8
+
. Não houve interferência sobre o influxo de macrófagos, o que não promoveu
diminuição global do número de mononucleares. Já foi descrito que nesse modelo ocorre
aumento local da concentração de MIP-1α/CCL3 já nas primeiras 6 horas que diminui com o
tempo, sugerindo que esta quimiocina contribui para a migração celular induzida por antígeno
(Fine et al., 2003). Assim, a Evasina poderia ter se ligado ao MIP-1α/CCL3 impedindo com
que esse exercesse seus efeitos biológicos.
No intuito de validarmos o potencial da Evasina-1 nas reações de DTH, nós utilizamos
outro modelo de resposta mediada por Th1. Alguns trabalhos descrevem que a injeção
intraplantar de mBSA em animais imunizados acarreta em um aumento do volume da pata
tempo dependente que já pode ser visualizado após 12 horas e, que se mantêm elevado após
24-48 horas e posteriormente decaí com o tempo (Sutherland et al., 2005; Yoshimoto et al.,
2000). Também é visto que este aumento do volume é coincidente com a elevação da
concentração de MIP-1α/CCL3 na pata (Yoshimoto et al., 2000), sendo possivelmente
induzido por IL-16 que é uma citocina quimioatraente para linfócitos CD4
+
(Cruikshank et
Discussão
97
al., 1994). Na verdade, a administração intraplantar de MIP-1α/CCL3 induz aumento do
volume da pata e desgranulação de mastócitos, bem como influxo de neutrófilos e de células
mononucleares (Alam et al., 1994).
Nossos resultados mostram aumento do volume da pata já nas primeiras 14 horas com
queda gradual ao longo do tempo. O pré-tratamento com a Evasina-1 antes do desafio com
mBSA nos animais sensibilizados preveniu o aumento do volume da pata após 14 e 24 horas,
coincidentemente com o pico de produção de MIP-1α/CCL3 observado por Fine e
colaboradores (2003). Assim, podemos sugerir que a Evasina-1 ao se ligar ao MIP-1α/CCL3
inibiu com que esta quimiocina promovesse recrutamento celular e desgranulação de
mastócitos que contribuem para a resposta local visualizada através do aumento de volume da
pata.
O modelo de resposta alérgica nas vias aéreas induzido pelo antígeno do ovo do
Schistosoma mansoni (SEA) é bem caracterizado como uma reação de hipersensibilidade do
tipo tardia mediada predominantemente por linfócitos T helper 2, onde se observa um
infiltrado eosinofílico nos pulmões que começa com 8 horas e se mantém elevado até cerca de
96 horas após o desafio com o antígeno. Lukacs e colaboradores (1995) mostraram que neste
modelo MIP-1α/CCL3 exerce um papel relevante sobre o influxo de eosinófilos. Na verdade,
a atividade quimioatraente para eosinófilos era praticamente abolida quando amostras de
pulmão de animais sensibilizados eram incubados com anticorpos anti-MIP-1α/CCL3
(Lukacs et al., 1996). Corroborando estes resultados, nós observamos que a administração de
Evasina-1 preveniu de forma significativa o recrutamento tanto de eosinófilos, quanto de
mononucleares para o pulmão, através da possível inibição da resposta biológica de MIP-
1α/CCL3 resultante da interação com os receptores CCR1 ou CCR5 presentes nas células
supracitadas, o que acarreta no rearranjo do citoesqueleto com subseqüente migração celular.
Juntos estes resultados nos permite afirmar que a Evasina-1 apresenta significativo efeito
antiinflamatório em modelos de hipersensibilidade tardia, seja ele com predomínio de
linfócitos Th1 ou de linfócitos Th2.
Outro modelo dependente de MIP-1α/CCL3 que nós estudamos foi de fibrose
pulmonar induzida por bleomicina. A fibrose pulmonar é uma doença pulmonar crônica
caracterizada histologicamente por uma inflamação interticial difusa e fibrose (American
Thoracic Society, 2000; Gross & Hunninghake, 2001). A fibrose pulmonar frequentemente se
desenvolve devido a fatores bem estabelecidos como danos traumáticos, infecções, indução
por fármacos, autoimunidade ou exposição a produtos tóxicos. Contudo, cerca de metade dos
Discussão
98
casos são idiopáticos. A fibrose pulmonar idiopática é uma doença pulmonar crônica
progressiva e irreversível, sendo que a maioria dos pacientes em estados avançados da doença
apresentam grave hipoxemia e cianose. No presente momento, não existem esquemas
terapêuticos satisfatórios para esta condição patológica e, o manejo se dá apenas pelo suporte
primário e algumas vezes o transplante de pulmões (American Throracic Society, 2000; Gross
& Hunninghake, 2001).
Bleomicina é uma família de peptídeos quelantes que rompem o ácido
desoxirribonucléico (DNA). São amplamente utilizadas como drogas anti-tumorais para o
tratamento de vários tipos de tumores, incluindo carcinoma e linfomas, pois, ao contrário de
vários agentes, raramente causam mielossupressão (Hecht, 2000; Chen & Stubbe 2005).
Entretanto, o tratamento com bleomicina freqüentemente provoca lesão pulmonar e uma
fibrose pulmonar irreversível (Sleijfer, 2001). Devido ao fato das mudanças patológicas
provocadas pela bleomicina serem similares àquelas observadas na fibrose pulmonar
idiopática, o modelo de fibrose pulmonar induzido pela bleomicina é muito utilizado para
estudar a patogênese celular e molecular da doença fibrose pulmonar idiopática.
Em resposta à administração de bleomicina, os animais desenvolvem uma alveolite
aguda e uma inflamação intersticial, caracterizada pelo recrutamento seqüencial de
neutrófilos, linfócitos e macrófagos na primeira semana. Subseqüentemente, respostas
fibróticas caracterizadas pela proliferação de fibroblastos e síntese de matriz extracelular
ocorrem na segunda semana (Smith et al., 1995), o que acarreta em deposição desordenada de
colágeno (Bowden, 1984).
Várias citocinas e quimiocinas e seus respectivos receptores têm sido avaliados com o
objetivo de elucidar os mecanismos de patogênese da fibrose pulmonar. Diversos trabalhos
mostram que quimiocinas, incluindo MIP-1α/CCL3, MCP-1/JE, RANTES/CCL5, MIP-
2/CXCL1-2, e IP-10/CXCL10 contribuem para o processo inflamatório, fibrótico e de
angiogênese no modelo de fibrose pulmonar induzido pela bleomicina (Smith et al., 1994;
Zhang et al., 1994; Keane et al., 1999a, b).
A análise do lavado broncoalveolar e biópsias de pacientes com fibrose pulmonar
idiopática demonstrou uma quantidade aumentada de MIP-1α/CCL3, MCP-1/JE,
RANTES/CCL5 comparado às amostras de voluntários sadios (Standiford et al., 1993;
Boomars et al., 1998; Kodama et al., 1998). Além disso, o tratamento do lavado
broncoalveolar com anticorpos anti-MIP-1α/CCL3 inibiu em 18% a atividade quimiotática
para células mononucleares (Standiford et al., 1993). O tratamento com o anticorpo anti-MIP-
Discussão
99
1α/CCL3 em animais instilados com bleomicina reduz o acúmulo de mononucleares e a
fibrose pulmonar (Smith et al., 1994). Uma vez que MIP-1α/CCL3 parece participar de modo
relevante da patogênese da fibrose pulmonar, nós avaliamos o efeito da Evasina-1 sobre a
resposta inflamatória e a fibrose pulmonar induzida pela bleomicina.
Em nosso modelo, a resposta inflamatória aguda é caracterizada pela presença precoce
de neutrófilos no pulmão e espaço alveolar que vai sendo substituído por um infiltrado de
mononucleares (Izbicki et al., 2002). A destruição tecidual que precede à fibrose parece estar
correlacionada à liberação de produtos tóxicos das células inflamatórias ativadas presentes no
tecido após a lesão ser causada (Shimabukro et al., 2003). Esta ativação celular pode ser
visualizada pelo aumento da liberação de mieloperoxidase pelos neutrófilos e n-
acetilglicosaminidase pelos macrófagos mensurados no pulmão. O tratamento com a Evasina-
1 conseguiu prevenir o aumento da liberação enzimática, bem como o influxo celular para o
parênquima pulmonar e espaço alveolar.
Com o objetivo de avaliar o efeito da Evasina-1 sobre as sub-populações que
compõem os mononucleares no oitavo dia que é o pico da resposta inflamatória, nós
realizamos um ensaio de citometria de fluxo. Corroborando dados da literatura observamos
que a instilação de bleomicina promove um aumento do número tanto de células T quanto de
macrófagos (Izbicki et al., 2002). Desta forma, a diminuição global de mononucleares nos
animais tratados com a Evasina-1 se deu pela redução do número de células CD4
+
, CD8
+
e
CD11b. Uma vez observado que a Evasina-1 é capaz de modificar o influxo celular, nós
começamos a estudar por quais mecanismos essa promovia diminuição. Assim, avaliamos o
efeito da proteína ligante de quimiocina sobre a concentração de citocinas e quimiocinas
relevantes no processo recrutamento celular e indução de fibrose.
Primeiramente nós avaliamos o perfil de TNF-α e TGF-β. Já é bem caracterizado que
TNF-α desempenha papel chave no modelo de fibrose pulmonar induzida pela bleomicina
(Piguet et al., 1997). A neutralização de TNF-α através da administração de anticorpos anti-
TNF-α ou com a utilização de receptores solúveis diminui o influxo celular e
subseqüentemente o desenvolvimento de fibrose em camundongos (Piguet & Vesin, 1994;
Zhang et al., 1997). Em nosso modelo, observamos que os níveis de TNF-α se mantiveram
maiores ao basal em todos os tempos avaliados e, o tratamento com a Evasina-1 reduziu de
forma significativa esta elevação induzida pela bleomicina. Na verdade, Smith e
colaboradores (1998) propõem que após a instilação com a bleomicina as células epiteliais e
macrófagos alveolares residentes começam a liberar TNF-α e IL-6. Estas citocinas agiriam
Discussão
100
sinergicamente estimulando a expressão de MIP-1α/CCL3 pelas células alveolares. Além
disso, mais tardiamente os macrófagos recrutados poderiam liberar TNF-α que estimularia
nova expressão de MIP-1α/CCL3 e outras quimiocinas como MCP-1/CCL2. Estas por sua
vez atrairiam macrófagos adicionais e linfócitos para o sítio de lesão. Uma vez que MIP-
1α/CCL3 é capaz de ativar CCR5 e recrutar macrófagos (Ishida et al., 2007), a administração
da Evasina-1 poderia inibir a ação autócrina de MIP-1α/CCL3 sobre os macrófagos, bem
como a ação de MIP-1α/CCL3 sobre outros tipos celulares que liberam TNF-α. Os
macrófagos alveolares além de liberarem TNF-α, também possuem a habilidade de secretar
LTB
4
(Martin et al., 1984), sendo estes dois mediadores importantes fatores quimioatraentes
para neutrófilos. Embora MIP-1α/CCL3 seja capaz de recrutar neutrófilos diretamente através
da ativação do receptor CCR1, parece que no nosso modelo MIP-1α/CCL3 promova a
migração indireta desses leucócitos, mediante ativação dos receptores CCR5 presentes em
macrófagos. É descrito que a deleção do gene que codifica CCR5 altera de forma relevante o
influxo de granulócitos após a instilação de bleomicina, sendo este efeito não observado em
animais “knockout” para CCR1 (Ishida et al., 2007). Os neutrófilos recrutados são fontes de
mediadores quimioatraentes para mononucleares, bem como mais MIP-1α/CCL3 para o meio
(Scapini et al., 2000).
O fator de crescimento transformante (TGF-β) é uma importante citocina
multifuncional, com alto poder pró-fibrogênico. O TGF-β é secretado em uma forma latente e
se torna ativado em seguida para desempenhar suas funções biológicas, incluindo
angiogênese, primagem de neutrófilos humanos, quimiotaxia de monócitos e macrófagos.
Além disso, esta citocina é uma poderosa estimuladora de fibroblastos para a produção de
componentes da matriz extracelular, incluindo colágeno, fibronectina, fibrinas e
proteoglicanos (Khalil et al., 1989; Bartram & Speer, 2004). Desta forma, TGF-β participa
principalmente da resposta fibrótica subseqüente à inflamação (Giri et al., 1993; Munger et
al., 1999). Em modelo murino, a utilização de anticorpos anti-TGF-β reduz a fibrose
pulmonar (Giri et al., 1993). Em nosso modelo, a estimulação com a bleomicina promoveu
um aumento das concentrações de TGF-β após o oitavo dia e o tratamento com a Evasina-1
foi capaz de prevenir o aumento desta citocina de forma significativa. Ishida e colaboradores
(2007) recentemente mostraram que o acúmulo de colágeno induzido por bleomicina é menor
em animais “knockout” para o gene que codifica MIP-1α/CCL3 ou CCR5. Além disso, esses
animais apresentam menor infiltrado de macrófagos e fibrócitos, bem como uma reduzida
Discussão
101
expressão de TGFβ1. Desta forma, este trabalho sugere que MIP-1α/CCL3 ao interagir
principalmente com CCR5, participa da migração de fibrócitos e macrófagos, (principais
produtores de TGFβ1). Assim, o aumento da quantidade de TGFβ culminaria no
desenvolvimento subseqüente de fibrose pulmonar.
Nós avaliamos as quimiocinas MCP-1/CCL2, MIP-1α/CCL3 e RANTES/CCL5 que
são mediadores reconhecidamente importantes para o recrutamento e ativação de monócitos,
linfócitos e células natural killer (NK). Desta maneira, eles contribuem de forma relevante
para a instalação da inflamação e a sua cronificação, que pode acarretar em uma resposta
fibrótica pulmonar (Jiang et al., 1992; Taub et al., 1993; Maghazachi et al., 1994; Appay &
Rowland-Jones, 2001).
No modelo de fibrose pulmonar induzido pela bleomicina é reportado um aumento
inicial da expressão de MCP-1/CCL2 (Smith et al., 1995) no lavado broncoalveolar que,
embora diminua ao longo do tempo, continua elevado em relação ao basal. Ishida e
colaboradores (2007) também mostram aumento precoce da expressão de mRNA de MIP-
1α/CCL3 no tecido que se mantêm elevado até 21 dias e, ao contrário, a expressão do mRNA
de RANTES/CCL5 é aumentada somente 14 dias após a estimulação. De acordo com estes
dados, nós observamos um padrão similar de cinética das quimiocinas MCP-1/CCL2, MIP-
1α/CCL3 e RANTES/CCL5. O tratamento com a Evasina-1 conseguiu prevenir a elevação
dos níveis encontrados. Estes resultados sugerem que MIP-1α/CCL3 medeia direta ou
indiretamente a sua própria liberação, bem como de MCP-1/CCL2 e RANTES/CCL5.
Todavia, também é possível que ao se ligar ao MIP-1α/CCL3 a Evasina-1 impossibilite com
que a proteína seja detectada pelo ensaio de ELISA. Na verdade, é plausível que MIP-
1α/CCL3 aja precocemente sobre células epiteliais e macrófagos alveolares residentes
(Abonyo et al., 2006; Ishida et al., 2007) promovendo a liberação de MCP-1/CCL2 que
antecede o recrutamento de mononucleares. Tardiamente, tanto os mononucleares quanto os
fibrócitos podem continuar liberando MCP-1/CCL2. Os fibroblastos e os linfócitos também
são capazes de liberar RANTES/CCL5 (Appay & Rowland-Jones, 2001) contribuindo para o
aumento tardio desta quimiocina na lavado broncoalveolar, o que mantem a perpetuação de
estímulos para a migração de linfócitos para o pulmão (Petrek et al., 1997). É interessante
ressaltar que as células recrutadas, como por exemplo, os macrófagos, podem liberar mais
MIP-1α/CCL3, o que culmina em uma alça de amplificação da resposta inflamatória que
contribui para a expansão do processo fibrótico.
Discussão
102
A modulação da resposta inflamatória nos animais submetidos à fibrose pulmonar
induzida pela bleomicina e tratados com a Evasina-1 promoveu uma melhora do quadro
fibrótico. Contribuindo, assim, para uma menor deposição de colágeno e uma maior
preservação da arquitetura pulmonar. Esta habilidade antiinflamatória da Evasina-1 culminou
na maior sobrevida dos animais tratados comparados ao grupo que recebeu apenas veículo.
Quando o tratamento com a Evasina-1 foi iniciado somente após o dia 8 (pico inflamatório),
observamos que, embora houvesse diminuição de algumas citocinas e do influxo de
mononucleares no dia 25, não ocorreu melhora da lesão tecidual. Este resultado é semelhante
ao observado por Chaudhary e colaboradores (2006), onde o tratamento com a prednisolona
no modelo de fibrose pulmonar só promove efeito antiinflamatório e antifibrótico eficaz
quando iniciado antes da instalação do processo inflamatório. Juntos, estes resultados
descritos mostram uma boa evidência que nos possibilita dizer que a Evasina-1 apresenta-se
como uma boa estratégia antiinflamatória em modelos de inflamação aguda e crônica
dependentes de MIP-1α/CCL3. No entanto, é importante ressaltar que a imunogenicidade
pode ser um problema para a utilização da proteína ligante de quimiocinas no tratamento de
doenças crônicas. Em estudos posteriores nós avaliaremos esse potencial imunogênico da
Evasina-1, o que contribuirá para a sua validação como agente terapêutico.
A outra evasina estudada foi a Evasina-3 que se liga seletivamente à GRO-α/CXCL1,
IL-8/CXCL8 e homólogos murinos (KC/CXCL1-3 e MIP-2/CXCL1-2) com alta afinidade e,
cujos valores de KD são 1,32; 1,43; 3,97 e 1,4 nM, respectivamente (Déruaz et al., 2007,
manuscrito anexo). Ensaios in vitro mostram que a Evasina-3 inibe a quimiotaxia de
neutrófilos induzida por IL-8/CXCL8 com IC
50
da ordem de nanomolares. Uma vez que IL-
8/CXCL8 é um importante quimioatraente para neutrófilos, vários trabalhos sugerem a
participação de IL-8/CXCL8 em condições patológicas que são caracterizadas por uma
presença marcante desses leucócitos, incluindo atrite reumatóide, fibrose pulmonar idiopática
e infecções bacterianas (Ziegenhagen et al., 1998; Mukaida, 2000; Kraan et al., 2001). Nos
pacientes com artrite reumatóide é observado um aumento dos níveis de IL-8/CXCL8 nas
articulações dos joelhos, sendo associada à presença desta citocina ao desenvolvimento dos
sintomas clínicos, incluindo edema e dor (Kraan et al., 2001). Para avaliarmos a habilidade da
Evasina-3 em inibir in vivo os efeitos biológicos promovidos por KC/CXCL1-3 e MIP-
2/CXCL1-2, uma vez que camundongos não produzem IL-8/CXCL8 bem como CXCR1, nós
realizamos modelos de recrutamento de neutrófilos estimulado por agentes quimiotáticos ou
por antígeno.
Discussão
103
Já é bem descrito na literatura que tanto KC/CXCL1-3 quanto MIP-2/CXCL1-2
promovem quimiotaxia (Call et al., 2001), bem como o recrutamento de neutrófilos para o
peritônio e bolha de ar subcutânea (McColl & Clark-Lewis, 1999). Zhang e colaboradores
(2001a, b) mostraram através de microscopia intravital no músculo cremaster de
camundongos que as duas quimiocinas supracitadas possuem a habilidade de promover de
forma dose dependente o rolamento, adesão e migração de neutrófilos para o tecido adjacente,
sendo este processo dependente de selectina-P. Além disso, a utilização de antagonistas do
receptor CXCR2 foi capaz de prevenir o acúmulo dos neutrófilos na cavidade peritoneal
induzido por KC/CXCL1-3 ou MIP-2/CXCL1-2 (McColl & Clark-Lewis, 1999).
Corroborando os resultados já obtidos em nosso laboratório (dados não mostrados), a
injeção intraarticular de KC/CXCL1-3 promoveu o aumento do influxo de neutrófilos para a
cavidade, sendo que a Evasina-3 diminuiu este acúmulo. Assim, Evasina-3 ao se ligar ao
KC/CXCL1-3 inibiu com que este ativasse os receptores CXCR2 e promovesse o subseqüente
recrutamento celular.
Trabalhos utilizando diferentes modelos de recrutamento como a bolha de ar
subcutânea, peritonite e pleurisia mostram que a administração de LPS acarreta em uma
consistente migração de neutrófilos, dependente da ação de agonistas do receptor CXCR2
como IL-8/CXCL8, KC/CXCL1-3 e MIP-2/CXCL1-2 (Broaddus et al., 1994; McColl &
Clark-Lewis, 1999). Ensaios in vitro mostram que o LPS é capaz de estimular macrófagos
(Call et al., 2001), bem como neutrófilos (Armstrong et al., 20004) para que esses possam
secretar tanto KC/CXCL1-3 quanto MIP-2/CXCL1-2.
Em experimentos realizados em nosso laboratório, visualizamos que a injeção
intrapleural de LPS promove em recrutamento de neutrófilos de forma dose e tempo
dependente, sendo o pico de resposta 8 horas após o estímulo (dados não mostrados). O pré-
tratamento com a Evasina-3 preveniu de maneira significativa o aumento do número de
neutrófilos na cavidade pleural 8 horas após a injeção de LPS, sugerindo que esta proteína
ligante de quimiocina ao se ligar aos agonistas de CXCR2 impediu a ativação deste receptor e
a subseqüente migração de neutrófilos para o sítio de inflamação.
O próximo modelo que nós utilizamos para avaliar o papel da Evasina-3 foi o de
pleurisia alérgica em camundongos. O modelo de pleurisia em roedores é amplamente
utilizado pelo nosso grupo para o estudo do processo de migração, ativação e sobrevida de
leucócitos. Caracteriza-se pela indução de uma reação inflamatória na cavidade pleural de
Discussão
104
camundongos por agentes quimiotáticos ou por uma resposta alérgica em animais
previamente sensibilizados (Klein et al., 2000; Alessandri et al., 2003; Pinho et al., 20003).
A injeção intrapleural do antígeno (ovalbumina, OVA) em animais sensibilizados
promove após 4 horas uma migração significativa de eosinófilos, sedo que este infiltrado
atinge um pico 24-48 horas após o desafio e decai a níveis basais em 72 horas. O desafio com
OVA também induz um precoce recrutamento de neutrófilos que atinge o pico em 4 horas e
diminui rapidamente ao valor basal em 24 horas. Uma migração tardia de mononucleares
alcança o valo máximo após 14 horas (Klein et al., 2000). De acordo com esse perfil celular já
caracterizado, observamos que 8 horas após o desafio com ovalbumina houve consistente
influxo de neutrófilos para a cavidade pleural, sendo este processo prevenido pela
administração da Evasina- 3 45 minutos antes da injeção intrapleural de OVA.
No modelo de peritonite alérgica foi mostrado que o desafio com o antígeno em
animais imunizados induz a expressão de CXCR2 e a produção de KC/CXCL1-3 e MIP-
2/CXCL1-2, sendo a migração de neutrófilos para o peritônio inibida por um antagonista de
CXCR2 ou por um anticorpo anti-MIP-2/CXCL1-2, mas não por um anticorpo anti-
KC/CXCL1-3. Na verdade, a administração de MIP-2/CXCL1-2 foi capaz de promover a
liberação MIP-1α/CCL3, TNF-α e LTB
4
, sendo a liberação dos dois últimos mediadores
inibida pelo tratamento com um anticorpo anti-MIP-1a/CCL3. Através destes trabalhos foi
possível vislumbrar uma cascata de eventos que culmina no recrutamento de neutrófilos uma
vez liberado agonistas de CXCR2 após o desafio com antígeno em animais sensibilizados.
Desta forma, é possível sugerir que MIP-2/CXCL1-2 promova a liberação de MIP-1α/CCL3
que por sua vez ao agir sobre CCR1, induza a liberação seqüencial de TNF-α e LTB
4
(Ramos
et al., 2005; Ramos et al., 2006). Assim, a administração da proteína ligante de quimiocinas
impediu com que MIP-2/CXCL1-2 promovesse a seqüencial liberação dos mediadores
inflamatórios que participam da migração de neutrófilos induzida por antígeno. Juntos, estes
resultados descritos mostram uma boa evidência que nos possibilita dizer que a Evasina-3
apresenta-se com uma boa estratégia antiinflamatória em modelos dependentes da liberação
de agonistas do receptor CXCR2.
A última evasina estudada foi a Evasina-4, que se liga seletivamente à
eotaxina/CCL11 e RANTES/CCL5. Já é bem descrito na literatura que a eotaxina/CCL11 é
um importante agente quimiotático para eosinófilos (Jose et al., 1994; Humbles et al., 1997;
Klein et al., 2001). Assim, é documentada uma quantidade aumentada desta quimiocina em
condições patológicas que são caracterizadas por uma presença marcante desses leucócitos,
Discussão
105
como nas reações alérgicas em modelos experimentais ou em pacientes asmáticos (Gonzalo et
al., 1996; Humbles et al., 1997; Lamkhioued et al., 1997; Ying et al., 1997). Para avaliarmos
a habilidade da Evasina-4 em inibir in vivo os efeitos biológicos promovidos por
eotaxina/CCL11 nós realizamos o modelo de recrutamento de eosinófilos para a cavidade
pleural.
Klein e colaboradores (2001) mostraram que a injeção intrapleural de eotaxina
promove um aumento precoce do influxo de eosinófilos para a cavidade pleural, já detectado
nas primeiras 4 horas. Esse infiltrado atinge um pico 24-48 horas após o desafio e se mantêm
elevado mesmo após 72 horas. Em acordo com este resultado prévio, nós observamos um
aumento do número de eosinófilos na cavidade pleural 24 horas após a estimulação com
eotaxina/CCL11, sendo que o tratamento dos animais com Evasina-4 preveniu de maneira
significativa o recrutamento de eosinófilos para a cavidade pleural 24 horas após o desafio.
Desta forma, é possível sugerir que a proteína ligante de quimiocinas ao se ligar à
eotaxina/CCL11, impediu com que esta se ligasse ao seu receptor CCR3 culminado na
sinalização intracelular para o processo de recrutamento do granulócito.
Uma vez observado que a Evasina-4 apresenta a habilidade in vivo de se ligar à
eotaxina/CCL11, nos estudamos o efeito da Evasina-4 em um modelo experimental
dependente de eotaxina/CCL11. Klein e colaboradores (2000, 2001, 2002) mostraram que o
pré-tratamento com anticorpo anti-eotaxina/CCL11, mas não anti-RANTES/CCL5 ou anti-
MIP1a/CCL3, inibi o recrutamento de eosinófilos após o desafio com OVA em animais
previamente imunizados. Além disso, foi evidenciado que a eotaxina/CCL11 (induzida por
PAF) e LTB
4
(induzido por ”stem cell factor” - SCF) cooperam para a migração de
eosinófilos para locais de inflamação alérgica. Conforme ressaltado anteriormente, o pico de
influxo eosinófilico ocorre 24-48 horas após o desafio com OVA. Assim, observamos que o
aumento do recrutamento de eosinófilos para a cavidade 48 horas após foi diminuido nos
animais tratados com a proteína ligante de quimiocinas. Os resultados descritos nos possibilita
dizer que a Evasina-4 apresenta-se com uma boa estratégia antiinflamatória em modelos
dependentes da eotaxina/CCL11.
Observamos através do ensaios realizados que as Evasinas administradas
sistemicamente apresentam ampla distribuição, uma vez que alcançaram diferentes
compartimentos corporais (cavidades, pulmões, pata, etc) onde foram induzidas reação
inflamatórias. Além disso, as proteínas ligantes de quimiocinas atingiram esses sítios em
Discussão
106
concentrações suficientemente eficazes para promover a diminuição de parâmetros
inflamtórios, incluindo migração celular, níveis de citocinas, edema e deposição de colágeno.
VI. Conclusão
Conclusão
108
Em conclusão, nossos resultados mostram que as evasinas apresentam atividade
farmacológica in vivo e são eficazes em reduzir a inflamação em modelos animais. Os
membros desta nova família de proteínas ligantes de quimiocinas, além de muito seletivos
com relação aos seus ligantes, são menores que os recentemente descobertos anticorpos
naturais de camelos que possuem apenas a cadeia pesada. Podem ser relevantes como futuras
estratégias para o estudo do papel de quimiocinas especificas ou mesmo terapeuticamente
para o tratamento de doenças inflamatórias associadas a uma produção aumentada de seus
ligantes. Além disso, as evasinas podem ser úteis para o planejamento de novos arcabouços
estruturais através do planejamento molecular racional.
VII. Referências
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VIII. Anexos
1
Immune evasion by blood sucking parasites is mediated by
a family of highly selective chemokine binding proteins
with anti-inflammatory activity
Maud Déruaz
1
, Achim Frauenschuh
1#
, Ana L. Alessandri
2
, João M. Dias
1
, Fernanda M.
Coelho
2
, Remo C. Russo
2
, Beatriz R. Ferreira
3
, Gerard J. Graham
4
, Jeffrey P. Shaw,
Timothy N.C. Wells
1
, Mauro M. Teixeira
2
, Christine A. Power
1
and Amanda E.I. Proudfoot*
1
.
1
Merck Serono Geneva Research Centre, 9 Chemin des Mines, 1202
Geneva, Switzerland.
2
Departamento de Bioquimica e Imunologia, Instituto de Ciencias Biologicas, Universidade
Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brazil.
3
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, SP, Brazil.
4
Division of Immunology, Infection and Inflammation, University of Glasgow, 120 University
Place, Glasgow, G12 8TA, UK.
#
Current address: Novartis Pharma AG, Lichtstrasse 35, 4056 Basel, Switzerland.
Correspondence should be addressed to A.E.I.P (amanda.proudfoot@merckserono.net) or
C.A.P. (christine.pow[email protected])
2
Abstract
Blood sucking parasites such as hard ticks have evolved a wide variety of immuno-
modulatory mechanisms to evade the host immune response. We have cloned three
members of a new family of chemokine binding proteins (CHBPs) which we have called
Evasins. Here we report the characterization of Evasin-1 and Evasin-3, which have distinct
chemokine binding selectivities and are unrelated to each other at the sequence and
structural level. Administration of Evasin-1 and Evasin-3 in animal disease models
demonstrates that they have potent anti-inflammatory activity. The Evasins are distinguished
from viral CHBPs in terms of sequence, specificity, size and structure. They are even smaller
than single domain antibodies and may prove to be therapeutically useful as novel anti-
inflammatory agents in the future.
Many pathogenic organisms including viruses have developed strategies to evade the host
immune system based on interference with host cytokine and chemokine pro-inflammatory
mediators
1-3
. Inhibitory binding proteins for pro-inflammatory cytokines, including TBP,
IFNAR and IL-18 BP, have also been described in humans but no secreted chemokine
binding proteins have so far been identified in vertebrates. However, internal and external
parasites have evolved chemokine evasion strategies which allow them to productively
suppress the mammalian immune response in order to maintain their presence in/on their
host. Ticks are blood sucking parasites whose role in the transmission of pathogens such as
Borrelia burgdorferi which causes Lyme disease, has been the subject of intensive research
4
. Ticks feed on their hosts for relatively long periods of time, ranging from several days to
weeks, and provided that they do not carry infectious agents, can remain essentially
undetected by their hosts. In order to achieve this, they have evolved an arsenal of anti-
inflammatory, anti-coagulant, and analgesic agents which are used to render the ticks
invisible to the immune system
5-7
. Currently little is known about the molecular nature of
such agents but the cloning and characterization of these factors may yield novel proteins of
potential therapeutic use in human inflammatory pathologies.
Successful prevention of the activity of family of small chemoattractant proteins called
chemokines has been shown by viral CHBPs, and more recently by a CHBP isolated from
the parasitic worm, Schistosoma mansoni
8
. Deletion of the gene encoding the broad
3
spectrum chemokine binding protein, T1 from the rabbit poxvirus, myxoma virus, resulted in
extensive leukocyte infiltration in the dermis of the infected animal, which was absent upon
infection by the wild type virus
9
. This study elegantly demonstrated that the virus had
evolved a mechanism which prevented the recruitment of leukocytes to the site of infection.
Recently, the presence of anti-chemokine activities in tick saliva has been reported
10;11
. Tick salivary gland extracts were shown to contain an activity that neutralized CXCL8,
and in a later study, neutralization of other chemokines was also demonstrated. Our own
analyses of tick saliva harvested during feeding also demonstrated the presence of
molecules that bound to CXCL8, CCL3 and CCL5. Using an expression cloning strategy to
identify the protein(s) in tick saliva which bind to chemokines, we initially cloned a chemokine
binding protein, which we called Evasin-1, that specifically binds to the CC chemokines
CCL3, CCL4 and CCL18
12
. Subsequent rescreening of the tick salivary gland cDNA library
with a selection of chemokines and cytokines enabled us to identify two further CHBPs. Here
we report the cloning of a CXC chemokine binding protein, named Evasin-3, and a second
CC chemokine binding protein, distinct from Evasin-1, named Evasin-4. Interestingly, Evasin-
3 bears no sequence homology to Evasins -1 and -4, which appear to belong to the same
structural family. The three proteins are all surprisingly small compared to the chemokine and
cytokine binding proteins described to date. Evasins-1 and -3 were crystallized and their
three-dimensional structures have been solved, revealing novel folds with binding modes
distinct from that of viral CHBPs. Investigations of their specificity in vitro and their efficacy in
vivo in animal models of chronic inflammatory diseases such as pulmonary fibrosis, arthritis
and psoriasis have demonstrated that the Evasins have potent anti-inflammatory activities,
providing tantalizing new insights into scaffolds evolved by nature to inhibit inflammation.
Results
We analyzed the ability of saliva from Rhipicephalus sanguineus (common brown dog tick) to
inhibit the binding of I
125
- labelled chemokines CCL2, CCL5 and CXCL8, as well as CCL3, to
their respective receptors using a scintillation proximity assay (SPA). As shown in Fig 1a,
inhibition of binding was achieved for CCL3, CCL5 and CXCL8, with the most potent effect
on CCL3. No inhibition was observed for CCL2 although saliva harvested from another tick
species, Amblyomma cajenes, appeared to have anti-CCL2 activity (data not shown). The
possibility that the inhibition was due to degradation of the radiolabelled chemokines by a
4
proteolytic activity in the saliva was addressed by incubation of the radiolabelled chemokines
in the saliva for 4 h. Subsequent analysis by SDS-PAGE revealed that no degradation of the
chemokine had occurred (data not shown). We next addressed the question of whether there
was more than one binding protein present in the saliva, by testing whether an excess of
CXCL8 was able to block the activity of the CCL3 binding protein. As shown in Fig 1a, a 500-
fold excess of CXCL8 had no effect on the ability of the saliva to inhibit CCL3 binding to
CCR5, therefore suggesting the presence of at least two binding proteins.
Incubation of
125
I-CCL3 with tick saliva followed by chemical cross-linking produces a clear
band shift when the reaction products were analysed on SDS PAGE and this method was
adopted as a screening assay during our attempts to clone the tick CHBPs. We therefore
used the band shift assay to screen supernatants from HEK293 cells transfected with a tick
salivary gland cDNA library, to identify a cDNA encoding a CCL3 binding protein which we
called Evasin-1
12
. Surface plasmon resonance (SPR) performed with immobilized CCL3
and CCL5 demonstrated the presence of binding proteins for these two chemokines in tick
saliva (Fig 1b), and Surface Enhanced Laser Desorption Ionization (SELDI) identified peaks
that bound to immobilized CXCL8 and CCL5 (Fig 1c), but surprisingly, no peak was observed
for CCL3 (data not shown). The masses identified by SELDI indicated very small proteins,
with a mass of 7,133 Da binding to CXCL8 and a mass of 11,052 Da binding to CCL5 –
masses very close to those of the predicted protein cores as discussed below.
We therefore re-screened the cDNA library using a cocktail of chemokines and cytokines,
containing iodinated CXCL8, IL-1β and IL-2. IL-2 was included as an anti-IL-2 activity has
previously been reported in tick salivary gland extracts
10
. In the first round of screening, we
identified a band shift in one pool of 270 clones. After deconvolution of the positive pool, and
cross-linking to the individual iodinated proteins present in the cocktail, we identified a cDNA
encoding a CXCL8 binding protein. As we initially identified a putative CHBP which we
named Evasin-2 the function of which remains to be elucidated, we called the CXCL8 binding
protein Evasin-3 (Fig 1d, Lane 3). Competition experiments using a selection of chemokines
(CCL3, CXCL1, CXCL4, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10,CXCL11, CXCL12 and CXCL13)
indicated that only CXCL1 was able to compete with radiolabelled CXCL8 for binding to
Evasin-3 (results not shown). We then screened the expression library with a second
cocktail consisting of iodinated CCL5, CCL11 and CXCL10. On analysis of supernatants
from HEK cells transfected with the pools of clones from the cDNA expression library we
5
observed a band shift migrating around 50 kDa in several pools. This band was almost
masked by a non-specific band migrating at around 60 kDa detected in all experiments.
Deconvolution of the positive pools revealed a cDNA clone which was able to mediate cross-
linking to both CCL5 and CCL11 (Fig 1d, Lanes 4 and 5), but not CXCL10 when tested in
HEK293 cells. The CCL5 and CCL11 binding protein was named Evasin-4.
The cDNA for Evasin-3 encoded an open reading frame (ORF) of 92 amino acids
which, after signal peptide cleavage gives rise to a mature protein of 66 amino acids with a
predicted molecular mass of 7,005 Da. The cDNA for Evasin-4 encoded an ORF of 117
amino acids. Cleavage of the signal peptide sequence predicted using the Signal P algorithm
would generate a mature protein of 110 amino acids with a predicted molecular mass of
12,032 Da (Fig 2a). Analyses of the amino acid sequences of Evasin-3 and Evasin-4
revealed that Evasin-3 was unrelated to Evasin-1, whereas the Cys residues of the mature
Evasin-4 sequence demonstrated an almost perfect alignment with those of Evasin-1 (Fig
2a). This indicates an identical disulfide topology suggesting that these two proteins are
structurally related, despite their relatively low level of identity at the amino acid level (27%
identity over 91 amino acids). Conservation of a homologous fold, despite a low level of
identity at the primary sequence level is well known in protein families such as cytokines and
chemokines.
Transient expression of C-terminal 6-His tagged Evasin-3 and Evasin-4 in HEK293 cells
revealed that unlike Evasin-1, these two proteins were poorly secreted. We were able to
obtain a small amount of purified Evasin-3 (150 µg) which was extensively glycosylated in
order for in vitro characterization. SPR analysis revealed that Evasin-3, similar to Evasin-1, is
a highly selective chemokine binding protein in that it was only able to bind to CXCL1 and
CXCL8 and their murine counterparts, KC and MIP-2 (Fig 1e). The kinetic parameters as
determined by SPR are shown in Table 1. It has proven difficult to produce recombinant 6His
tagged Evasin-4 in HEK293 cells thus the identification of the N terminus of the mature
protein has not yet been experimentally verified. Using the Signal P program to predict the
cleavage site of the putative signal peptide sequence indicates that the mature protein
sequence would commence with WLSTKC (Fig 2a). However, secondary structure
predictions show that these amino acids are contained in a helix, suggesting that the N-
terminus may be EVPQM. Nevertheless, alignment of the amino acid sequences of Evasin-4
and Evasin-1 shows that Evasin-4 has an extended N-terminus compared to Evasin-1, which
6
may be an important determinant of ligand binding specificity. We are currently testing
different expression strategies in order to obtain sufficient Evasin-4 for N-terminal sequence
verification and for in vitro and in vivo studies.
Since the yield of Evasin-3 was poor in the HEK293 expression system, we attempted
expression in the prokaryotic host, E. coli., Although the probability was extremely high that
Evasin-3 would be directed into inclusion bodies based on a formula predicting solubility for
recombinant expression in E. coli
13
, we were surprised to obtain high level expression of
soluble protein which could be purified to homogeneity in two chromatographic steps.
Although the E.coli produced protein is not glycosylated, it had equivalent activity to Evasin-3
produced in HEK 293 cells (Table 1 and Fig 6a).
Evasin-3, produced in the procaryotic expression system crystallized readily, and the
crystallographic structure revealed a novel fold, totally unrelated to that of Evasin-1 (Fig 2c).
The crystallographic structure of Evasin-1, described in detail elsewhere (Dias et al,
manuscript in preparation), also revealed a novel protein fold (Fig 2b). Neither protein has a
structural homologue in the PDB database. So while both Evasin-1 and Evasin-3 are of
similar size and function, they are completely unrelated at amino acid sequence level, as well
as in the secondary and tertiary structure (Figure 2b and 2c).
Evasin-1 has previously been shown to inhibit binding of CCL3 and CCL4 to CCR1
and CCR5 with affinities of 0.015 nM for CCL3 and 3 nM for CCL4
12
. This was confirmed by
its ability to inhibit the activity of these chemokines in vitro and in vivo. As shown in Fig 3a,
Evasin-1 inhibited ligand-induced chemotaxis of L1.2/CCR5 transfectants, with IC
50
values of
1 pM for the inhibition of CCL3 and 4 nM for CCL4. In order to test the ability of Evasin-1 to
inhibit inflammation in disease models, we have determined its ability to bind murine MIP-
1α and MIP-1β. As shown in Table 1, it has slightly higher affinity for the murine
chemokines, with K
D
values of 0.08 nM and 0.15 nM respectively, compared to 0.12 nM for
human CCL3 and 0.5 nM for CCL4. We then tested Evasin-1 in in vivo recruitment models in
mice. CCL3 was administered into the peritoneal cavity and the ability of systemically
administered Evasin-1 to block leukocyte recruitment was assessed after 18 h. Significant
inhibition of granulocyte recruitment was observed at doses of 3-30 µg (Fig 3b) with little
effect on other cell types (results not shown). The inhibition of granulocyte recruitment by
Evasin-1 was then further investigated in a murine model of a Th1-predominant delayed-type
hypersensitivity and a Th2-predominant, late phase reaction. In the Th1 sensitization model
7
using methylated BSA (mBSA), recruitment of leukocytes into the pleural cavity was
significantly impaired (Fig 3c). Whilst the inhibition of neutrophil recruitment was most
striking, inhibition of CD3+ lymphocytes was also observed, but not of CD11b+ monocytes as
determined by FACS (results not shown). In the Th2 sensitization model, Evasin-1 inhibited
eosinophil recruitment induced by antigen challenge into the lungs of mice immunized with S.
mansoni eggs. An analysis of naïve mice by intravital microscopy demonstrated that Evasin-
1 was able to block adhesion and emigration of leukocytes induced by injection of mCCL3
(Fig 3d).
The ability of Evasin-1 to prevent CCL3/CCL4 dependent cellular recruitment
translated into potent anti-inflammatory effects in animal models of disease. Skin
inflammation in D6-/- mice sensitized with TPA gives rise to a phenotype closely resembling
that of the human inflammatory skin disorder, psoriasis, and has been shown to be
dependent on the induction of several CC chemokines including CCL3 and CCL4, which are
high affinity ligands for D6
14
. Evasin-1 was able to cause a significant reduction in the skin
inflammation observed in these mice (Fig 4a and 4b) but not complete abrogation as
observed with an anti-TNF antibody. This is in accordance with our previous observations
and indicates that whilst several CC chemokines are implicated in this model, targeting CCL3
and CCL4 is sufficient to ameliorate pathology.
CCL3 has previously been demonstrated to play a role in mediating pulmonary fibrosis
15
. We
therefore tested the effect of Evasin-1 in a lung injury model induced by intra-tracheal
instillation of bleomycin. Mild or severe disease was induced with 0.0625 or 0.125 units of
bleomycin. Evasin-1 reduced lethality in both cases (Fig 5a). Reduction in lethality was
associated with a decrease in neutrophil accumulation at 2 and 8 days after bleomycin
challenge (Fig 5b), which resulted in a net decrease in the ensuing fibrosis observed at later
stages after the bleomycin challenge. Histopathological analysis of lung tissue confirmed
decreased leukocyte infiltration in the lung (Fig 5c), which was corroborated by a decrease in
the number of CD3
+
CD4
+
and CD3
+
CD8
+
lymphocytes and GR1
+
leukocytes in the
bronchoalvelar lavage fluid of mice challenged with bleomycin. In bleomycin-instilled mice
which did not receive Evasin-1, there was a considerable deterioration of normal pulmonary
architecture with loss of alveolar structure and collagen deposition (Fig 5c). Treatment with
Evasin-1 resulted in the preservation of lung architecture and a decrease in collagen
8
deposition. Morphometric analysis of Gomori’s trichrome stained areas showed that Evasin-1
treatment reduced collagen deposition by 40%.
Evasin-3 has also been shown to have potent anti-inflammatory properties. In accordance
with the nanomolar affinities observed by SPR analysis (Table 1), Evasin-3 produced in
HEK293 cells and in E. coli, inhibited binding of
125
I-CXCL8 to CXCR1 with IC
50
values of 0.7
nM and 1 nM respectively (Fig 6a), demonstrating that glycosylation does not affect activity
similar to Evasin-1
12
. CXCL8 induced chemotaxis of neutrophils in vitro was inhibited by
Evasin-3 with an IC
50
of 3.35 nM (Fig 6b). In vivo, Evasin-3 inhibited KC induced neutrophil
recruitment into the knee joint in a dose dependent manner (Fig 6c). Evasin-3 was highly
potent in vivo, with significant inhibition after systemic administration of as little as 10 ng of
protein.
Evasin-3 was also tested in a mouse model of antigen-induced arthritis. In this model rapid
upregulation of KC and MIP-2 precedes the recruitment of neutrophils into the knee joint.
This is followed by CXCR2 upregulation and TNF-α production, culminating in synovial
hyperplasia and inflammatory hypernociception
16
. Administration of Evasin-3 resulted in a 50
% decrease in the total number of leukocytes in the synovial cavity (Fig 6d).The major
leukocyte population affected were neutrophils which were reduced by 70% in the knee joint
(Fig 6e). Moreover, Evasin-3 treatment significantly reduced the inflammatory
hypernociception associated with this model (Fig 6f), and interestingly, the treatment resulted
in decreased local production of TNF-α (Fig 6g). Intravital microscopy studies of the synovial
microvasculature showed that administration of Evasin-3 prevented the adhesion of
leukocytes to the synovial endothelium (Fig 6h), providing a direct demonstration of the
efficacy of Evasin-3 in the prevention of neutrophil influx in an inflammatory setting.
Consistent with the findings above, histo-pathological analysis of tissue demonstrated overall
inhibition of leukocyte influx into the joint and periarticular tissues, decreased edema, and
decreased synovial hyperplasia (Fig 6i and 6j).
Discussion
Since the identification of the first members of chemokine family almost 20 years ago,
it has become clear that the interaction of these small proteins with their cognate receptors
are important targets for therapeutic intervention in a number of inflammatory, autoimmune
and infectious diseases. Indeed, there are currently many intense drug discovery programs
9
in this area. However, although there are numerous reports of the efficacy of small molecule
antagonists
17-19
, neutralizing antibodies
20;21
and other antagonists
22
in animal models of
disease, it has proved to be more of a challenge to translate these molecules into medicines
in the clinic. Although molecules are currently progressing into late stage clinical trials, it is
possible that alternative approaches may be needed to successfully target the chemokine-
chemokine receptor interaction. Through evolution, natural anti-chemokine strategies have
arisen in the guise of chemokine binding proteins, which enable certain pathogens to avoid
the host immune response, thus confirming that the blockade of the chemokine system is an
effective anti-inflammatory strategy. Unraveling the molecular nature of these pathogen
associated CHBPs, is likely to produce novel insights in the design of therapeutically useful
chemokine blocking agents.
Here we describe the cloning and characterization of a family of chemokine binding proteins
from tick saliva. In vitro characterization of the family members identified to date indicates
that these CHBPs are considerably different from the known viral chemokine binding proteins
in terms of chemokine selectivity. Viral CHBPs tend towards broad selectivity; the Evasins
described here have restricted selectivity. In the studies presented here we have confirmed
that Evasins are able to bind and inhibit specific chemokines in vitro, and inhibit leukocyte
recruitment induced by their respective ligands in simple models of leukocyte recruitment in
mice. Furthermore, the anti-inflammatory properties of Evasins were confirmed
mechanistically by intra-vital microscopy where their administration both in naïve and
inflamed mice abrogated leukocyte adhesion to, and transmigration across the endothelium.
Altogether, these experiments clearly demonstrated the potential of Evasins to prevent
leukocyte recruitment.
We evaluated the Evasins in more complex animal models of human diseases. Evasin-1
which is highly selective for CCL3 and CCL4, reduced the symptoms, in a murine model of
skin inflammation which resembles psoriasis in humans, in which several CC chemokines
are upregulated
14
. Since both Evasin-1 and Evasin-3 were shown to prevent neutrophil
influx, they were subsequently tested in disease models in which neutrophils have previously
been shown to play an important role. Thus in the CCL3 dependent bleomycin-induced lung
injury, Evasin-1 reduced leukocyte influx, fibrosis and lethality, an effect qualitatively and
quantitatively similar to experiments in CCL3-deficient mice (
15
23
). Blockade of CXCR2 has
been reported to prevent leukocyte influx and joint damage in several models of experimental
10
arthritis in rats and mice (Barsante et al., 2007; Cunha et al., 2007). Evasin-3 which binds to
both human and murine CXCR2 ligands prevented neutrophil influx into the joint in a model
of antigen-induced arthritis. This treatment prevented the local production of TNF-α, a
cytokine which has been shown to play an important role in the pathogenesis of arthritis, and
which is associated with hypernociception or inflammatory pain in experimental animals.
Indeed, blockade of TNF-α with biologicals has been successful in the treatment of
rheumatoid arthritis and other rheumatologic conditions
24;25
.
Our initial expectation was that identification of CHBPs in primitive eukaryotic species such
as ticks may allow us to identify orthologues in mammalian genomes, based on either
primary sequence or on the three dimensional folds of the CHBPs. However it is clear that
there are no human or mammalian orthologues or structural counterparts to the Evasins.
Thus it appears that ticks have developed protective CKBPs as they co-evolved with their
chemokine producing vertebrate hosts. Although mammals do have molecules that can bind
and block chemokine function, they are molecularly and structurally distinct from the Evasins.
For example, the atypical chemokine receptors such as D6, CCX-CKR and Duffy
26;27
are
non-signalling GPCRs that appear to be able to function as mammalian equivalents of the
soluble CKBPs expressed by pathogens and parasitic worms. This suggests that
interestingly, with the exception of the CMV US28 which has been hijacked from the
mammalian genome, pathogens have evolved CKBPs through a ‘convergent’ evolution
mechanism. This makes particular sense in the context of eukaryotic parasites, such as the
ticks, which evolved prior to vertebrates in which chemokine dependent inflammation first
appeared.
The leukocytes involved in the first line of defense against pathogens and parasites
are neutrophils and eosinophils. The CHBPs described here specifically inhibit the
chemokines that recruit these cell types; Evasin-1 (in rodents) and Evasin-3 prevent
neutrophil accumulation, and preliminary results indicate that Evasin-4 binds the eosinophil
recruiting chemokines, CCL5 and CCL11. Moreover, their selectivity profiles highlight the
issue of species specificity in the chemokine system. The common brown dog tick feeds on
dogs and other domestic animals as well as rodents, deer and humans. We have carried out
our studies using human chemokines, and in some cases their murine counterparts, and
have shown that the Evasins are able to bind to chemokines in both species. This may be an
advantage in the development of these molecules as potential therapeutic agents as one of
11
the pitfalls in developing small molecule antagonists of human chemokine receptors has
been their lack of cross-reactivity with rodent chemokine receptors, which has hampered
testing in animal models of disease, PK/PD and toxicological studies. However results
obtained from in vivo testing of Evasins still needs to be interpreted with caution as there are
known differences in specific chemokine receptor expression on immune cells between the
human and murine system, particularly on neutrophils. In humans, the principal mediators of
neutrophil recruitment are CXC chemokines 1-8, acting through CXCR2, and CXCL8 which
acts on both CXCR1 and CXCR2. On the contrary, recruitment of murine neutrophils is
mediated by both CCR1 and CXCR2, and perhaps also the recently identified murine
CXCR1
28
although little is known about the role of the latter in vivo. However, CCR1 is not
normally expressed on human neutrophils although it can be induced by IFNγ
29
and
interestingly CCL3 has been shown to recruit neutrophils when injected into human skin
30
.
Thus Evasin-1 shows activity against CCL3 mediated neutrophil recruitment rather than
monocyte recruitment in the mouse, whereas the ability of Evasin-3 to recruit neutrophils is
predictable from its binding profile. It should also be noted that whilst Evasin-1 has a higher
affinity for its ligands than Evasin-3, the latter is more efficacious in the murine models we
have tested. Saliva from ticks harvested at different times during their feeding periods has
differential chemokine inhibitory activity suggesting that different chemokine binding proteins
are produced at different times during feeding, with the aim of selectively inhibiting specific
cell populations
31
. It is possible that the most potent inhibitor of neutrophil recruitment
produced by the tick is Evasin-3, whereas Evasin-1 may be produced to inhibit (later)
monocyte recruitment in non-rodent hosts as well as T lymphocytes, as was observed in the
bleomycin lung inflammation model. Unfortunately the expression profile of chemokine
receptors on leukocytes in the dog, which although its name implies is the preferred host,
may simply be the most easily available food source, is unknown and hence we cannot
substantiate this hypothesis. Lastly, the availability of recombinant Evasin-4 will enable us to
address the ability of this CHBP to modulate eosinophil trafficking, since both CCL5 and
CCL11 have been extensively described to recruit this cell type.
A striking feature of these proteins is their small size. Both viral and mammalian
chemokine and cytokine binding proteins, have been shown to be much larger, generally
around 30-40 kDa. On the other hand, R. sanguineus has developed very small, highly
selective CHBPs. Interestingly, these proteins are similar in size, if not smaller, than the
12
naturally occurring single chain antibodies such as shark V-NAR domains (15 kDa) or
camelid VhH domains (15kDa). Large efforts are currently being undertaken to produce small
proteins known as nanobodies, minibodies or microproteins, created by rational design in
silico, that will mimic the binding properties of natural single domain antibodies
32
. The two
proteins described here represent highly potent, miniaturized scaffolds that have evolved to
selectively bind certain proteins, pivotal to the immune response, and which could be useful
in the creation of new scaffolds, paving the way for development of these molecules as novel
anti-inflammatory agents.
One of the important issues surrounding the use of any protein as a potential
therapeutic agent concerns immunogenicity which could be particularly pertinent for non-
human proteins. There are already examples of xeno-proteins in the clinic
4
33
and others are
entering clinical trials. However as these proteins are generally administered in a single dose
for acute indications, potential immunogenicity is not a major concern. However, treatment of
inflammatory and autoimmune diseases with therapeutic proteins such interferon beta or
antibodies eg. Raptiva and Etanercept, requires chronic administration, and even fully human
proteins can elicit an antibody response which may reduce the efficacy of the treatment. By
their very nature, anti-inflammatory proteins in tick saliva do not appear to be immunogenic.
It is still unclear if this is entirely due to the inhibition of immune cell recruitment to the
attachment site, or indeed whether the protein structure itself or through glycosylation,
minimizes exposure of antigenic epitopes. Furthermore, bioinformatic analysis of T cell
epitopes on Evasins using software developed by Biovation (EMD Serono) revealed that the
tick Evasins have relatively few potential immunogenic epitopes compared to other
therapeutic proteins currently in the clinic such as interferon beta. It is interesting to note that
only one mouse out of the 6 treated for 25 days had an IgG response to Evasin-1 (results not
shown). So whilst immunogenicity in the murine system will not predict the outcome in
humans, further evaluation of Evasins in pre-clinical models is warranted for their
development as potential protein therapeutic agents.
13
ACKNOWLEDGMENTS
We thank M. de Tiani, S. Jaconi, F. Borlat, V. Dechavanne, L. Glez, L. Friedli, F. Bollin, C.
Losberger and L. Chevalet for advice in protein expression and purification, and the
European Union FP6 (INNOCHEM, grant number LSHB-CT-2005-518167) for support.
Methods
Biochemical analysis of anti-chemokine activity in saliva.
Collection of saliva from the tick R. sanguineus and analysis for chemokine binding
proteins by inhibition of receptor binding and SPR was performed as previously described
12
with the following modifications. For the screening of tick saliva by SPR, an RNaseA-coated
cell was used as negative control instead of a blank cell. In addition, 3 successive injections
of Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) containing 2% heat-inactivated fetal calf
serum were performed, followed immediately by regeneration of the surface prior to the
measurements, to remove non-covalently bound protein. Tick saliva was diluted 25-fold
and/or 10-fold in 25 mM degassed Tris-HCl buffer, pH 7.5, supplemented with 1 mM CaCl
2
, 5
mM MgCl
2
and 1 g/l bovine serum albumin for 2.5 min at 10 µl/min. Measurements were
made in duplicate, and between each measurement, the surfaces were regenerated by
injecting of 10 mM glycine-HCl, pH 2.5, at 20 µl/min for 30 s and re-equilibrated in HBS-P
buffer for 1 min at 20 µl/min. The sensograms were analyzed using Biacore®3000 evaluation
software and represent binding of diluted tick saliva to CCL5(E66A) or to CCL3 after
subtraction of non-specific binding to the control protein RNase A, and normalization to the
buffer-induced diffraction.
Direct visualization of the binding proteins by chemical cross-linking was performed as
previously described
12
and by Retentate chromatography surface-enhanced laser
desorption/ionisation mass spectrometry (RC-SELDI-TOF-MS). The chemokines CCL5,
CCL3, and CXCL8 or the control protein, equine myoglobin, were diluted to 0.1 µg/µl in PBS
and immobilized at 4 °C in a humidified chamber overnight, by applying 5 µl onto separate
spots of a PS-20 ProteinChip™ array (Ciphergen Biosystems Inc., Fremont, CA). Non-
specific binding sites were blocked by addition 1 µl of 1 M Tris pH 8 to the samples and
incubating in a humidified chamber at room temperature for 30 min. Unbound protein was
removed by washing the array three times with 7 ml PBS, pH 7.2, containing 1 % Triton X-
14
100. The spots were equilibrated for 5 min in 25 mM Tris-HCl buffer, pH 7.5, containing 5
mM MgCl
2
, 1 mM CaCl
2
, 1 mg/ml BSA, supplemented with 0.1% Triton X-100. Tick saliva
was diluted 5-fold in the same buffer and 5 µl was applied to each spot. The array was
incubated for 2 h at room temperature and then each spot was washed individually 3 times
with 5 µl of ice-cold buffer supplemented with 0.05% Triton X-100. The array was rinsed in 5
mM HEPES pH 7.5 and air-dried. The matrix, sinapinic acid, was dried onto each spot on the
array and mass analysis was performed by SELDI-TOF-MS, using a calibrated
ProteinChip™ Biology System IIc reader. Spectra were generated using an automated
protocol and a positive ion mode with a laser intensity of 220 and deflector sensitivity of 10.
The mass optimization range was set between 10 and 50 kDa with a mass focus set to 18
kDa. In order to obtain quantitative data, the mass spectra from each spot were accumulated
from 155 laser shots over 31 different and non-overlapping positions.
Molecular cloning
Expression cloning was performed by transient transfection of HEK293 cells with a cDNA
library constructed from the salivary glands of R.sanguineus as previously described
12
.
Supernatants from transfected cells were screened using two cocktails of radio-labelled [I-
125
]
chemokines and cytokines containing CXCL8, IL-1 and IL-2, or CCL5, CCL11 and CXCL10
respectively followed by cross-linking and analysis by SDS-PAGE. Following deconvolution
of the cDNA pools and sequencing of the positive clones, a C terminal 6His tagged version of
the cDNA encoding the relevant CHBP was subcloned into the mammalian cell expression
vector pEAK12d (Edge Biosystems) using the Gateway
TM
cloning system (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) for transient expression in HEK293 cells. Purification of the CHBP from
supernatants from 500 ml cultures was performed by Ni-chelate chromatography. The cDNA
encoding Evasin-3 was subcloned into the pET30a vector (Novagen) for expression in E.
coli strain BL21(DE3) under the control of a T7 promoter, and produced in a 5 litre fermenter.
The protein was purified from the soluble cytosolic fraction by cation exchange
chromatography on Fractogel SO
3
in 50 mM sodium acetate, pH 4.5 with a linear gradient of
0 - 0.7 M NaCl, using an Äkta purifier system, followed by size exclusion chromatography on
an SX75 16/60 column in PBS, after concentration with a centrifugal 3.5 kDa cut-off filter
device. The purified protein was dialyzed against 50 mM NH
4
HCO
3
, aliquoted, lyophilized,
and stored at –20°C.
15
In vitro characterization
The selectivity of Evasin-3 was determined by surface plasmon resonance (SPR) as
described
12
. Kinetic measurements were performed to determine the binding constants. The
kinetic values k
a
and k
d
shown in Table 1 are the mean of three independent experiments
performed in triplicate on three different chips. The affinity constant K
D
was calculated from
theses mean values. Equilibrium competition receptor binding assays were performed using
CHO/CXCR1 transfectants using
125
I-CXCL8 as described (
34
). Inhibition of chemotaxis in
vitro was measured using L1.2/CCR5 transfectants for Evasin-1 or neutrophils purified from
buffy coats as previously described (
35
).
Inhibition of cell recruitment in vivo
Male Balb/C or C57Bl/6 mice (18-22 g) were used throughout these experiments.
Animals were housed in a temperature-controlled room and had free access to food and
water. All experiments received prior approval by the local animal ethics committee. To
test
the effect of Evasin-1 on cellular recruitment in vivo, mice were administered 3, 10 or 30 µg
Evasin-1
in 200 µl PBS s.c. 45 min prior to the administration of 10 µg CCL3 in
200 µl PBS
i.p. After 18 h, the
mice were sacrificed. The peritoneal cavity was washed twice with 3 ml of
ice-cold PBS, and the cells enumerated in a modified Neubauer counting chamber using
Turk’s stain. Differential cell counts were performed on cytospin preparations (Shandon III)
stained with May Grunwald-Giemsa using standard morphologic criteria to identify cell types.
The effect of Evasin-3 on neutrophil recruitment into the knee joint was assayed as
follows:.KC (30 ng/cavity) was injected into the left knee joint of the mouse and recruitment
evaluated 4 h later. Evasin-3 (0.01 to 100 µg/mouse) was given s.c. 45 min prior to KC
administration. The knee cavity was washed with PBS (2 x 5µl) and leukocyte numbers
assessed as described above.
Intravital microscopy was performed in the cremaster of C57Bl/6 mice, as previously
described
36
. For each experiment, 0.3 µg of human CCL3 in 100 µL of PBS was
administered locally by s.c. injection beneath the
right scrotal skin, 1 h before exteriorization.
To
test inhibition, a solution of Evasin-1 (10 µg per animal) plus CCL3 (0.3 µg) in 100 µl PBS
was prepared 15 min before intrascrotal injection. Single, unbranched cremasteric venules
(25–40 µm
in diameter) were selected. To minimize variability, the
same section of
16
cremasteric venule was observed throughout the
experiment. The number of rolling,
adherent, and emigrated leukocytes
was determined off-line during video playback analysis.
Rolling
leukocytes were defined as those cells moving at a velocity
less than that of
erythrocytes within a given vessel. The flux
of rolling cells was measured as the number of
rolling cells
passing by a given point in the venule, per minute. A leukocyte was
considered to
be adherent if it remained stationary for at least 30
s. Total leukocyte adhesion was
quantified as the number
of adherent cells within a 100 µm length of venule. Leukocyte
emigration was defined as the number of cells in the extravascular
space within an area of 50
µm from the venule.
Methylated BSA-induced DTH reaction in pleural cavity
C57Bl/6 mice were immunized subcutaneously with a 1:1 emulsion of mBSA (5mg/mL in
saline) and complete Freund’s adjuvant (Sigma), as previously described
37
. Fourteen days
after the immunization, antigen (mBSA 10 µg per pleural cavity), or vehicle, was injected into
the pleural cavity. Animals sacrificed 48 h after injection of antigen, and cells present in the
pleural cavity were harvested. Cells were enumerated as described above. The results are
presented as the number of cells per cavity.
Sensitization and induction of Th2 cellular recruitment into the lungs
Balb/c mice were immunized i.p. with 2500 isolated S. mansoni eggs at days 0 and 7 of the
protocol, as described previously
38
. On day 14, mice were given an intranasal challenge of
10 µg soluble egg antigens (SEA) in 10 µl of PBS to localize the response to the airway. Mice
were then rechallenged 6 days later by intratracheal administration of 10 µg SEA in 25 µl of
PBS or with PBS alone. To
test inhibition, Evasin-1 (10 µg per animal) was administered s.c.
45 min before, and 24 h after antigen challenge. At 24 or 48 h post injection,
mice were
sacrificed, and lungs were
filled in situ with 1 ml of sterile PBS via a tracheal
cannula. Fluid
was withdrawn from the lungs after gentle massage
to remove cells and collected in a plastic
tube, on ice. This
procedure was repeated three times, and the cell suspensions
recovered
from each animal were pooled for individual mice. The results are presented as the number
of cells per lung.
17
Induction of skin inflammation in D6 -/- mice
Skin inflammation was induced as previously described
14
. Briefly, the phorbol ester, TPA,
was applied three times, at 24 h intervals, to the shaved dorsal skin of 6-8 week old D6 (-/-)
mice and the mice were left for 4 days to allow the exaggerated cutaneous inflammation to
develop. In addition, mice were administered either PBS or Evasin-1 daily (30 µg/mouse pr
day) by i.p. injection or were given daily doses of anti-TNF as previously described. Mice
were sacrificed at day 4 after TPA treatment and the skin harvested for histological
assessment. Skin samples were collected into neutral-buffered formalin and processed for
H&E staining as described.
Bleomycin-Induced Lung Injury
Blenoxane, (Bristol-Meyers Squibb Co., Princeton, New Jersey, USA) 0.0625U or 0.125 U in
25 µl PBS was instilled under anesthesia into the trachea of C57Bl/6j mice. Control animals
received PBS alone. The tracheotomy site was sutured, and the animals were allowed to
recover. To
test inhibition, Evasin-1 (3 or 10 µg per animal) was administered s.c. 45 min
before, and every 12 h after bleomycin instillation. At 4, 8 or 25 days after instillation,
mice
were sacrificed and lungs were
filled in situ with 1 ml of sterile PBS via a tracheal
cannula.
Fluid was withdrawn from the lungs after gentle massage
to remove cells, and collected into
a plastic tube place on ice. This
procedure was repeated three times, and the cell
suspensions
recovered from each animal were pooled for individual mice. Right lung lobes
were collected and inflated with 10% formaldehyde for histological analysis of tissue sections
stained with H&E. For localization of collagen within the lung tissues, Gomori’s trichrome-
specific staining was used. Cell counts were performed as described above. The results are
presented as the number of cells per lung.
Antigen-induced arthritis
Animals were immunized intradermally (i.d.) at the base of the tail with 500 µg of methylated
bovine serum albumin (mBSA; Sigma) in 100 µl of an emulsion of saline and an equal
volume of complete Freund’s adjuvant (CFA; Sigma) on day 0 as described
39
. Challenge of
mice was performed 14 days later. Each mouse received an injection of 10 µg of mBSA in
10µl sterile saline in the left knee joint. The knee cavity was washed 24 h later with PBS (2 x
18
5 µl) and the periarticular tissues removed for the evaluation of TNF-α and MPO activity.
Cells were enumerated as described above.
Intravital microscopy of knee joint
Intravital microscopy was performed in the synovial microcirculation of the mouse knee as
previously described
40
. Briefly, the left hind limb was placed on a stage with the knee slightly
flexed and the patellar tendon mobilized and partly ressected. The intra-articular synovial
tissue of the knee joint was then visualized and used for the determination of leukocyte
rolling and adhesion. A 20X objective was used to select 2-4 regions of interest in each
animal. To measure the leukocyte-endothelial cell interactions, the fluorescent marker
rhodamine 6G (Sigma) was injected intravenously in a single bolus of 0.15 mg/kg
immediately before measurements. Rhodamine epi-illumination was achieved with a 150 W
variable HBO mercury lamp in conjunction with Zeiss filter set 15 (BP 546./12, FT 580, LP
590). The microscopic images were captured with a with an Optronics DEI470 CCD video
camera (Goleta, CA) and recorded on S-VHS videotape using both filter blocks
consecutively. Data analysis was performed off-line. Rolling
leukocytes were defined as
those cells moving
slower than those cells at a regular flux in a given vessel. The flux
of
rolling cells was measured as the number of rolling cells
passing by a given point in the
venule per minute (expressed as cells/min). A leukocyte was
considered to be adherent if it
remained stationary for at least 30
seconds. Total leukocyte adhesion was quantified as the
number
of adherent cells within a 100 µm length of venule (expressed as cells/mm
2
).
Evaluation of hypernociception
Mice were placed in a quiet room, 15–30 min before testing for environmental adaptation, in
acrylic cages (12 × 10 × 17 cm high) with a wire grid floor. Stimulations were performed only
when animals were calm, without exploratory movements or defecation and not resting on
their paws. An electronic pressure-meter was used in these experiments consisting of a
hand-held force transducer fitted with a polypropylene tip (Insight Instruments, Ribeirão
Preto, SP, Brazil). In these experiments, a large tip (4.15 mm
2
) was attached to the probe. An
increasing perpendicular force was applied to the central area of the plantar surface of the
hind paw to induce the dorsal flexion of the femur-tibial joint, followed by paw withdrawal. A
19
tilted mirror below the grid provided a clear view of the animal's hind paw. The electronic
pressure-meter apparatus automatically recorded the intensity of the force applied when the
paw was withdrawn. The test was repeated until 3 subsequent consistent measurements (i.e.
the variation among these measurements was less than 1 g). The flexion-elicited withdrawal
threshold is expressed in grams (g).
Histological assessment
Sections were graded as previously described
41
. Briefly, the histogical score (0-8)
was the sum of the synovial hyperplasia, cellular exudate and cartilage depletion/bone
erosion ranging from 0 (normal) to 3 (severe), and the degree of synovial infiltrate ranging
from 0 (normal) to 5 (severe).
Statistical analysis
All results are presented as the means ± SEM. Normalized data were analyzed by one-way
ANOVA, and differences between groups were assessed using Student-Newman-Keuls
post-test. A p value < 0.05 was considered to be significant.
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24
Table 1. Binding characteristics of Evasin-1 and Evasin-3 determined by Surface Plasmon
Resonance
CKBP
Chemokine
k
a
x10
6
(M
-1
s
-1
)
k
d
x10
-3
(s
-1
)
K
D
x 10
-9
(nM)
Evasin-1 CCL3
13.8 + 3.54 2.43 + 0.61
0.12
mMIP-1α
15.6 + 16 1.18 + 1.07 0.08
CCL4 4.29 + 2.58 2.2 + 0.18 0.51
mMIP-1β
3.84 + 1.42 0.58 + 0.12 0.15
Evasin-3 (HEK) CXCL1 3.95 + 4.23 1.42 + 0.36 0.34
CXCL8 0.41 + 0.30 0.29 + 0.14 0.7
KC 0.64 + 0.58 1.44 + 0.35 2.25
MIP-2 0.79 + 0.9 0.33 + 0.11 0.4
Evasin-3 (E.coli)
CXCL1 2.61 + 0.69
2.22 + 0.49
0.85
CXCL8 0.84 + 0.33 0.36 + 0.05 0.43
KC 0.32 + 0.17 1.85 + 0.43 5.78
MIP-2 1.02 + 0.56 0.65 + 0.25 0.64
25
Figure legends:
Fig.1. Chemokine binding activity of the tick saliva and identification of Evasin-3 and
Evasin-4. (a) Tick saliva inhibits the binding of CCL3, CCL5 and CXCL8 to their cognate
receptors. Radio-labeled chemokines were incubated with CHO cell membranes expressing
CCR1 for CCL3 and CCL5, and CXCR2 for CXCL8, in the presence of 1 µl, 10 µl or in the
absence of tick saliva. The anti-chemokine activity is due to the presence of more than one
binding protein since an excess of CXCL8 did not abolish the inhibition of CCL3 binding. (b)
Detection of chemokine binding proteins in tick saliva by surface plasmon resonance.
Sensograms demonstrated binding to CCL5(E66A) and CCL3 immobilized on a CM4 chip.
(c) Detection of distinct chemokine binding proteins to CCL5 and CXCL8 by Retentate
chromatography surface-enhanced laser desorption/ionization of flight mass spectrometry
(RC-SELDI-TOF-MS). Tick saliva was incubated on a PS-20 Proteinchip array coated with
either CCL5 (lower panel), CXCL8 (middle panel) or the control protein, equine myoglobin
(upper panel). Specific peaks indicated by arrows corresponding to a protein with a mass of
11052 Da binding to CCL5 and of 7133 Da for the binding to CXCL8 were observed. (d)
Identification of Evasin-3 and Evasin-4 by cross-linking to radio-labeled chemokine in
conditioned medium harvested from HEK293 cells transfected with cDNAs identified from
deconvoluted pools from the tick salivary gland cDNA library. Supernatant from HEK293 cells
expressing viral CHBP p35 incubated with [
125
I]-CCL2 in the presence (lane 1) or absence
(lane 2) of the cross-linker BS
3
; supernatant from HEK293 cells expressing the clone 69.19.1
incubated with [
125
I]-CXCL8 and BS
3
(lane 3); supernatant from HEK293 cells expressing the
clone 10.27.1 incubated with [
125
I]-CCL5 and BS
3
(lane 4) or [
125
I]-CCL11 and BS
3
(lane 5).
(e) Determination of the selectivity of recombinant Evasin-3 produced in E.coli by surface
plasmon resonance. The selectivity of Evasin-3 immobilized on a CM4 chip was analysed as
described in the text. Sensograms corresponding to CXCL8 (bold black lines) CXCL1 (dotted
black lines), MIP-2 (grey lines) and KC (dotted grey lines) showed strong binding of these
chemokines to Evasin-3. The sensograms corresponding to CCL1, CCL2, CCL3, CCL4,
CCL5, CCL11, CCL18, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CCL27, CXCL13 and CX
3
CL1
(black lines) indicated no binding of these chemokines to Evasin-3.
26
Fig.2. Primary amino acid sequences of Evasin-1, -3 and -4 and crystal structures of
Evasin-1 and Evasin-3. (a) Alignment of the predicted protein sequences of Evasin-1 and
Evasin-4. Conserved residues are highlighted in grey and cysteines are shown in bold type,
The predicted protein sequence of Evasin-3 which is unrelated to Evasin-3 and -4 is shown
below the alignment. The signal peptides of Evasin-1 and Evasin-3 are shown in italics.
Possible signal peptides of Evasin-4 are shown as follows: based on SignalJ prediction,
black underline; based on secondary structure prediction, dotted underline; based on
similarity to Evasin-1, dashed line. (b) Ribbon diagram of Evasin-1 with the amino acid
sequence depicting residues in loops (green), α-helix (red) or ß-sheet (blue). (c) Ribbon
diagram of Evasin-3 with the amino acid sequence colored as in (b).
Fig.3. Evasin-1 and Evasin-3 inhibit cell recruitment in vitro and in vivo. (a) Inhibition of
CCL3 () and CCL4 () mediated chemotaxis of L1.2/CCR5 transfectants. The IC
50
values
are 1.04 x10
-12
M for CCL3 and 4.12 x10
-9
M for CCL4. Data are shown as the mean + s.d as
a percentage of maximal recruitment and are representative of three to five individual
experiments. (b) Evasin-1 inhibits granulocyte recruitment induced by CCL3 in mice. Evasin-
1 was administered s.c. 45 min prior to the injection of 10 µg of CCL3 i.p. Cells in the
peritoneal cavity were counted 18 h after the injection of CCL3. One representative
experiment of three is shown, with 8 mice per group. (c) Evasin-1 inhibits granulocyte
recruitment induced by antigen challenge of immunized mice in models of Th1-predominant
delayed type hypersensitivity and Th2-predominant late phase response. In the Th1 model,
Evasin-1 was administered s.c. 45 min prior to intrapleural injection of 10 µg of methylated
bovine serum albumin (mBSA) in mice immunized with mBSA in Freund´s complete
adjuvant. Cells in the pleural cavity were counted 48 h after the injection of antigen. In the
Th2 model, Evasin-1 was administered s.c. 45 min prior to the intra-tracheal injection of 10
µg of Schistosoma manosni egg antigen (SEA) in mice immunized with S. mansoni eggs.
Cells in the bronchoalveolar lavage fluid were counted 48 h after the injection of antigen.
There were 6 mice per group in each experiment. *: p< 0.05; **: p< 0.01 when compared to
PBS-treated group. (d) Evasin-1 blocks adhesion and emigration of leukocytes induced by
CCL3 as assessed by intravital microscopy performed in the cremaster vein of C57Bl/6 mice.
Evasin-1 was injected s.c. in the right scrotal skin 1 h prior to exteriorization. Normalized data
27
were analyzed by one-way ANOVA, and differences between groups were assessed using
Student-Newman-Keuls post-test. *,p< 0.05; **, p< 0.01; ***, p< 0.001.
Fig. 4. Evasin-1 inhibits cellular recruitment in models of Th1 and Th2 inflammation
and in an animal model of psoriasis. (a) Dermal and epidermal thickness of the skin of
wild-type (WT) and D6-deficient (KO) mice after a single cutaneous application of TPA.
Evasin-1 (30 µg/mouse) and anti-TNF-α were given daily and tissues collected on day 4 for
histological assessment. ***: p< 0.001 when compared to PBS-treated group. (b)
Hematoxylin and eosin staining of sections from untreated skin of sham and TPA-injected
D6-deficient mice treated with PBS, Evasin-1 or anti-TNF-α. Skin sections were obtained on
day 4 after TPA application and are representative of 10 mice per group per experiment.
Original magnification, 200X.
Fig. 5. Evasin-1 inhibits lethality, cellular recruitment and fibrosis in a model of
bleomycin-induced pulmonary injury. (a) Evasin-1 inhibits lethality associated with
pulmonary instillation of bleomycin in C57Bl/6 mice. Bleomycin was instilled intra-tracheally
at doses of 0.0625 U (circles) or 0.125 U (squares) and survival rates were evaluated for 25
days. PBS (open symbols) or Evasin-1 (10 µg per animal, closed symbols) were
administered s.c. 45 min before and every 12 h after initial bleomycin instillation. * p <0.05
when comparing PBS and Evasin-1-treated animals at 0.125 U. (b) Evasin-1 inhibits
neutrophil recruitment induced by bleomycin. Neutrophil recruitment was evaluated at 2 and
8 days after bleomycin (0.125U) and Evasin-1 (10 µg per animal) was administered s.c. 45
min before and every 12 h after initial bleomycin instillation. (c) Evasin-1 inhibits pulmonary
inflammation and fibrosis induced by instillation of bleomycin. Hematoxylin and eosin (upper
panels) and Gomori’s trichrome (lower panels) stained sections from animals instilled with
sodium chloride (0.9% NaCl, 25 µl) or bleomycin (0.125 U). Evasin-1 (10 µg per animal) was
administered as previously described and lungs were removed on day 16. Original
magnification, 200X.
Fig. 6. Evasin-3 inhibits neutrophil recruitment and ameliorates inflammation and functionality
in a mouse model of antigen-induced arthritis. (a) Inhibition of
125
I-CXCL8 binding to CXCR2
by Evasin-3 produced in HEK 293 cells () and by Evasin-3 produced in E. coli (). (b)
28
Inhibition of CXCL8 induced neutrophil chemotaxis in vitro. (c) Inhibition of KC induced
neutrophil recruitment into the knee joint. (d-j) Reduction of inflammation in mBSA induced
arthritis by Evasin-3. (d) Inhibition of total cell accumulation in the synovial cavity. (e)
Inhibition of neutrophil infiltration into the knee joint. (f) Reduction of hypernociception
induced by intra-articular antigen challenge of immunized mice. (g) Reduction of TNF-α
production in periarticular tissues. (h) Inhibition of adhesion of leukocytes to synovial
microvessels as assessed by intravital microscopy. (i-j) Histological evaluation of the tissue
sections form the knee joint. All parameters were evaluated 24 h after antigen challenge and
there were 6 mice per group in each experiment. *: p< 0.05, **: p< 0.01, ***:P<0.001
a
c
d
e
f
CCL3 CCL5 CXCL8
CCL3
CCL5
28
38
49
62
17
28
38
49
62
17
1 2 3 4 5
M
r
(kDa)
-10
0
10
20
30
40
50
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450
Time (s)
Response (RU)
-10
0
10
20
30
40
50
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450
Time (s)
Response (RU)
0
100
200
300
400
500
0
250
500
750
1000
0
250
500
750
125
I-chemokine (cpm)
1 µl 10 µl 10 µl +
1 µM CXCL8
1 µl 10 µl 1 µl 10 µl
Fig 1
1 EDDEDYGDLGGCPFLVAENKTGYPTIVACKQDCNGTTETAPNGTRCFSIGDEGLRRMTANLPYDCPLGQCSNGDCIPKET
YEVCYRRNWRDKKN 94
Evasin-1
Evasin-4
Evasin-3
MRALLARLLLCVLVVSDSKGLVSTIESRTSGDGADNFDVVSCNKNCTSGQNECPEGCFCGLLGQNKKGHCYKIIGNLS
GEPPVVRR
a
b
c
MTFKACIAIITALCAMQVIC----------------EDDEDYGDLGGCPFLVAENKTGYPTIVACKQDCNGTT----
MAFKYWFVFAAVLYARQWLSTKCEVPQMTSSSAPDLEEEDDYTAYAPLTCYFTNSTLGLLAPPNCSVLCNSTTTWFN
ETAPNGTRCFSIGDEGLRR--MTANLPYDCPLGQCSNGDCIPKETYEVCYRRNWDKKN
ETSPNNASCLLTVDFLTQDAILQENQPYNCSVGHCDNGTCAGPPRHAQCW--------
Evasin-1
Evasin-4
1
LVSTIESRTSGDGADNFDVVSCNKNCTSGQNECPEGCFCGLLGQNKKGHCYKIIGN
LSGEPPVVRR : 66
Fig 2
Fig 3
a
b
c
-20 -18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4
0
20
40
60
80
100
120
Log[Evasin-1] (M)
Fluorescence
Sham PBS 3 10 30
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Evasin-1 (µ
µµ
µg)
**
*
*
Granulocytes X 10
5
per cavity
Th1 Th2
Sham PBS Evasin-1 Sham PBS Evasin-1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
**
*
24 h
48 h
Eosinophils X 10
5
per cavity
Sham PBS Evasin-1
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
**
Granulocytes X 10
5
per cavity
d
Sham PBS Evasin-1
0
50
100
150
*
Leucocytes Rolling
(cells/min)
Sham PBS Evasin-1
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
*
Leucocytes Adhesion
(cells/ 100
µ
µ
µ
µ
m)
Sham PBS Evasin-1
0
10
20
30
40
*
Leucocytes Emigration
(cells/field)
Fig 4
a
D6-/-, untreated
Evasin-1
Anti-TNFα
αα
αPBS
b
Sham PBS Evasin-1 anti-T NF
0
100
200
300
400
500
600
***
***
Dermal and epidermal
thickness (
µ
µ
µ
µ
m)
Fig 5
a
b
c
d
NaCl
Bleomycin
Evasin-1
NaCl
Bleomycin
Evasin-1
0 5 10 15 20 25
0
20
40
60
80
100
Time (days)
% survival
Day 2
Sham PBS Evasin-1
0.0
0.5
1.0
*
Neutrophils X 10
5
per lungs
Day 8
Sham PBS Evasin-1
0
2
4
6
8
10
12
14
*
Neutrophils X 10
5
per lungs
Fig 6
a
b
d fe
0
1
2
3
4
*
PBS
Vehicle
Evasin-3
Intensity of Hypernociception
∆
∆
∆
∆
reaction (g)
0.0
4.5
9.0
13.5
18.0
Evasin-3
PBSSham
*
Adhesion ( cells/100
µ
µ
µ
µ
m )
Sham PBS Evasin-3
0
5
10
15
20
*
Neutrophils x 10
4
per joint
g
Normal
Arthritis
Treated with Evasin-3
-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5
0
20
40
60
80
100
120
Log[Evasin-3] (M)
Fluorescence
0
15
30
45
60
Sham
PBS Evasin-3
*
TN F-
α
α
α
α
(pg/m l)
0
5
10
15
20
25
30
35
*
Sham PBS Evasin-3
Total cells x10
4
per synovial cavity
h
i
-13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6
0
20
40
60
80
100
120
Log(ligand) [M]
%
125
I-IL-8 binding
c
Sham PBS 0.01 0.1 1
0.0
1.5
3.0
4.5
6.0
Evasin-3 (µ
µµ
µg)
***
***
***
Neutrophils x 10
4
per joint
Infl amm. res. 55 (2006) 528–533
1023-3830/06/120528-6
DOI 10.1007/s00011-006-5136-9
Infl ammation Research
© Birkhäuser Verlag, Basel, 2006
Concentrations of CXCL8, CXCL9 and sTNFR1 in plasma of
patients with pulmonary tuberculosis undergoing treatment
A. L. Alessandri
1
, A. L. Souza
1
, S. C. Oliveira
1
, G. C. Macedo
1
, M. M. Teixeira
1
and A. L. Teixeira
1,2
1
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antonio Carlos,
6627-Pampulha, 31270-901 Belo Horizonte, Brazil, Fax: ++55 31 3441 5963, e-mail: [email protected]
2
Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brazil
Received 12 September 2005; returned for revision 18 November 2005; returned for fi nal revision 30 January 2006;
accepted by M. Parnham 23 May 2006
Published Online First 13 October 2006
Abstract. Background: Chemokines are a class of cytokines
with chemotactic properties shown to be induced by M. tu-
berculosis or its antigens in vitro and in experimental infec-
tion in vivo. A few studies have also demonstrated the ex-
pression of chemokines in clinical samples of patients with
active tuberculosis (TB). In the present work, we measured
the concentration of chemokines in plasma samples of HIV-
negative patients with pulmonary tuberculosis at different
stages of chemotherapy. For comparison, we also evaluated
the levels of sTNFR1 and TNF-α.
Methods: Cytokines and chemokines were measured by
ELISA in healthy individuals and patients with active pul-
monary TB at different stages of treatment.
Results: The concentrations of CXCL8, CXCL9 and sTNFR1
were elevated in patients with active pulmonary TB but re-
turned to background levels at 4–6 months of chemotherapy.
The concentration of CCL11 was elevated in patients with ac-
tive pulmonary tuberculosis when compared to control and re-
mained elevated throughout the specifi c therapy. There was no
difference in the plasma concentration of CCL2 and CXCL10
between pulmonary TB patients and control subjects.
Conclusion: Measurement of the CXCL8, CXCL9 and
sTNFR1 may be useful to assess response to treatment in
pulmonary TB patients.
Key words: Pulmonary tuberculosis – Chemokines – In-
fl ammation – Chemotherapy of tuberculosis – Cytokine,
soluble TNFR
Introduction
Tuberculosis (TB), a chronic mycobacterial infection caused
by Mycobacterium tuberculosis, is the leading infectious
cause of mortality in the world. Approximately one-third of
world’s population is infected with the organism, and two
million people die of the disease each year [1]. The protec-
tive immune response against M. tuberculosis is character-
ized by a polarized production of type 1 cytokines including
tumor necrosis factor α (TNFα), interferon γ (IFN-γ) and in-
terleukin-12 (IL-12) and development of granulomatous le-
sions [2–8]. Granulomatous infl ammation may be followed
by tissue fi brosis and marked dysfunction.
Chemokines are a class of cytokines with chemotactic
properties and appear to be essential mediators of leukocyte
migration and activation [9]. Several studies have now shown
that M. tuberculosis or its antigens can induce the expres-
sion of chemokines in macrophages and monocytes in vitro
[10–12] and in experimental animals [2, 3, 5, 13]. Moreover,
a few studies have demonstrated the expression of chemok-
ines in clinical samples of patients with active tuberculosis
[11, 12, 14–16].
Sputum culture following 8 weeks of treatment has been
used to assess the response of patients to anti-tuberculous
therapy [17]. However, there is much delay in obtaining the
results (up to 6 weeks) and the technique is laborious and
costly. Thus, the development of clinical and/or laboratory
parameters that would allow a rapid and non-invasive evalu-
ation of the effectiveness of medical treatment would be of
great interest. For example, sTNFR1, a soluble receptor for
TNF-α, may be elevated in plasma samples of patients with
pulmonary TB or tuberculous meningitis and levels may de-
crease after chemotherapy [18, 19]. We have recently dem-
onstrated that the measurement of chemokines in plasma
samples may be useful markers of disease severity in patients
with Schistosoma mansoni [20, 21] and may associate with
disease activity in patients with Sydenham chorea [22].
In the present work, we investigated whether levels of
chemokines were elevated in plasma samples of HIV-nega-
tive patients with pulmonary tuberculosis as compared to
uninfected individuals and whether levels of these mediators
modifi ed after specifi c treatment. To this end, chemokines
were measured in processed plasma samples of infected
patients at different stages of chemotherapy. The chemok-
ines CCL2, CCL11, CXCL8, CXCL9 and CXCL10 that are
Correspondence to: A. L. Teixeira
Vo l. 55, 2006 Concentrations of CXCL8, CXCL9 and sTNFR1 in plasma of patients with pulmonary tuberculosis undergoing treatment 529
induced by M. tuberculosis infection and are able to attract
cellular types involved in formation of granuloma reaction
were selected [3, 13–15]. For comparison, we also evaluated
the levels of the following cytokines: TNF-α, sTNFR1, IFN-
γ, IL-6.
Materials and methods
Subjects
Historical plasma samples were obtained from 15 patients (M/F 8/7;
mean age ±SD years, range [min–max], 36.7 ± 11.0 [20–55]) with pul-
monary TB at diagnosis and before treatment was initiated, 18 patients
at regular treatment after 0–3 months of treatment (M/F 12/6; mean age
±SD years, range [min–max], 37.7 ± 12.1 [22–65]) and 18 patients after
4–6 months of chemotherapy (M/F 8/10; mean age ±SD years, range
[min–max], 34.1 ± 11.1 [19–52]), from the Center of Health Oswaldo
Cruz, Belo Horizonte-Minas Gerais, Brazil. The diagnosis of TB was
based on typical clinical history (of slowly progressive constitutional and
pulmonary symptoms) and fi ndings in chest radiograph (such as pneu-
monic infi ltrates or cavitary lesions), and confi rmed by the presence of
acid-fast bacilli in three consecutive morning sputum samples. None of
the subjects were infected with the human immunodefi ciency virus (HIV)
or had been under steroid treatment in the previous year. All selected pa-
tients had a positive response to treatment and had a complete clinical
remission after treatment. None of the individuals had evidence of acute
infections (other than TB) at the time of sample collection. The remission
was assessed by clinical examination and conversion of sputum smears
to negative. Twelve uninfected subjects were used as controls (M/F 7/5;
mean age ±SD years, range [min–max], 35.3 ± 6.0 [28–46]). The study
protocol was approved by the local ethics review board.
Serum processing for chemokine analysis
Blood was collected aseptically in lipopolysaccharyde-free/siliconised
tubes with EDTA 2 % by an experienced technician and plasma was
isolated within 2 h of bleeding and stored at –70 °C until required. For
analysis, samples were thawed, and excess of proteins was removed by
acid/salt precipitation as routinely performed in our laboratory [20–22].
Briefl y, equal volume of plasma and 1.2 % trifl uoracetic acid/1.35 M
NaCl were mixed and left at room temperature for 10 min. After the
samples were centrifuged for 5 min at 10,000 rpm. The supernatants
were then adjusted for salt content (0.14 M sodium chloride and 0.01 M
sodium phosphate) and pH (7.4), for the determination of chemokine
concentration.
Chemokine and cytokine analysis
The concentration of chemokines and cytokines in plasma of patients
and controls was measured using sandwich ELISAs with matched anti-
body pairs for CXCL8, CXCL9 and CXCL10 (Pharmigen, San Diego,
CA), and ELISA kits for CCL2, CCL3, CCL11, TNFα, IFNγ, sTNFR1
(R&D Systems, Minneapolis, MN).The human IL-6 detection kit was a
kind gift of Dr Stephen Poole, National Institute of Biological Standards
and Control, England. All samples were assayed on duplicate and on the
same plate.
The detection limits for these assays were 4 pg/mL for CXCL8;
12 pg/mL for sTNFR1; 16 pg/mL for CCL2, CCL3, CCL11, IL-6
and IFNγ; 20 pg/mL for CXCL10; 30 pg/mL for TNFα; 40 pg/mL for
CXCL9.
Statistical analysis
Data are presented as medians and were compared by using Kruskal-
Wallis test, and differences between groups were assessed using Dunns
pot-test. Statistical signifi cance was set at p < 0.05. All calculations were
performed using GraphPad Prism computer program (GraphPad Soft-
ware Inc., San Diego, CA, USA).
Results
There was no difference in the plasma concentration of CCL2
(Fig. 1A) and CXCL10 (Fig. 1B) between pulmonary TB pa-
tients and control subjects. The concentration of CCL11 was
elevated in patients with active pulmonary tuberculosis when
compared to control and remained elevated throughout the
specifi c therapy (Fig. 1C). Concentrations of CXCL8 (Fig.
1D) and CXCL9 (Fig. 1E) were greater in patients with active
pulmonary TB than normal individuals. The concentration
of the latter chemokines were still elevated at 0–3 months
but returned to background levels at 4–6 months of chemo-
therapy (Fig. 1D and Fig. 1E). The concentration of CCL3
was below the detection limit of the assay (<16 pg/mL) in all
pulmonary TB patients and controls (data not shown).
For comparison, we evaluated the concentration of the
following cytokines in plasma of TB patients and control sub-
jects: TNF-α, sTNFR1, IFN-γ and IL-6. The concentration of
sTNFR1 had a profi le similar to that of CXCL8 and CXCL9.
Indeed, levels of sTNFR1 were greater in patients with TB at
diagnosis and at 0–3 months of treatment than in healthy con-
trols. However, concentrations dropped to background levels
at 4–6 months of treatment (Fig. 2). TNF-α levels in plasma
did not differ signifi cantly between pulmonary TB patients
and control subjects (median [25–75 percentiles] pg/mL):
uninfected individuals (4,1 [0–210]); patients before treat-
ment (139.5 [3.2–302] pg/mL); patients at 0–3 months of
treatment (220 [13.2–440.5] pg/mL); patients at 4–6 months
of treatment (103 [0–478] pg/mL). The concentrations of
IL-6 and IFN-γ were below the detection limit of the assay
(<16 pg/mL) in all TB pulmonary patients and controls (data
not shown).
Discussion
Chemokines, a subgroup of cytokines with selective chem-
oattractant properties, are thought to play a pivotal role in
the pathogenesis of tuberculosis. Chemokines may recruit
leucocytes from vessels into tissue resulting in establishment
and maintenance of granulomatous lesions [23, 24]. The
granulomatous response is essential to control M. tubercu-
losis spread but may lead to signifi cant tissue fi brosis and
dysfunction [25].
In our study, we assessed the concentration of chem-
okines and cytokines in plasma of healthy individuals and
patients with newly diagnosed pulmonary tuberculosis and
patients at 0–3 or 4–6 months of regular chemotherapy. In
Brazil, the treatment recommendation by the Ministry of
Health consists of 2 months of rifampicin, pyrazinamide and
isoniazid followed by 4 months of the latter 2 drugs. In or-
der to avoid any confounding effect of lack of response to
treatment, all patients whose plasma was used in the present
study had a positive response to treatment and underwent
complete clinical remission.
530 A. L. Alessandri et al. Infl amm. res.
healthy without treat treat 0-3 treat 4-6
0
100
200
300
400
500
900
8000
*
pulmonary tuberculosis patients
A
CCL2 (pg/mL)
healthy without treat treat 0-3 treat 4-6
0
2500
5000
7500
pulmonary tuberculosis patients
B
CXCL10 (pg/mL)
healthy without treat treat 0-3 treat 4-6
0
500
1000
1500
All different from healthy
pulmonary tuberculosis patients
C
CCL11 (pg/mL)
healthy without treat treat 0-3 treat 4-6
0
1500
3000
7500
15000
pulmonary tuberculosis patients
**
*
***
CXCL8 (pg/mL)
D
healthy without trea
t
treat 0-3 treat 4-6
0
10000
20000
20000
100000
**
**
pulmonary tuberculosis patients
E
CXCL9 (pg/mL)
Fig. 1. Concentration of CCL2 (A), CXCL10 (B), CCL11 (C), CXCL8 (D) and CXCL9 (E) in plasma of patients with active tuberculosis at diagnosis
and before treatment (n = 15), patients after 0–3 months of treatment (n = 18), patients after 4–6 months of treatment (n = 18) and healthy controls (n
= 12). Horizontal lines indicate median values. Statistical analysis was conducted using Kruskal-Wallis followed by Dunn’s post test. * p < 0.05, ** p
< 0.01 and *** p < 0.001.
Vo l. 55, 2006 Concentrations of CXCL8, CXCL9 and sTNFR1 in plasma of patients with pulmonary tuberculosis undergoing treatment 531
We found that the concentrations of CCL2 and CXCL10
in plasma of patients with pulmonary TB were similar to
those of healthy individuals. Furthermore, the amount of
these chemokines did not differ among all stages of treat-
ment. In agreement, Juffermans and colleagues [14] demon-
strated that CCL2 and CXCL10 concentration in sera from
HIV-negative TB patients did not differ before, during or af-
ter treatment. This is in contrast with the fi nding of Azzurri
and colleagues [26] that showed increased CXCL10 plasma
levels in active pulmonary TB, while these levels decreased
after treatment.
CCL11 concentration was increased in patients with ac-
tive TB compared with uninfected individuals and continued
elevated throughout the anti-microbial treatment. One previ-
ous study failed to detect CCL11 in bronchoalveolar lavage
fl uid (BALF) of TB patients [27], but macrophages infected
with M. tuberculosis have been shown to express CCL11
message [28]. It is possible that the alveolar macrophages
infected with M. tuberculosis expressed CCL11 and this
mediator gained quick access into the blood where it could
contribute to balance the excessive recruitment of activated
Th1 cytokine-producing lymphocytes that express CXCR3
receptors. Indeed, CCL11 can antagonize CXCR3 recep-
tor and antagonize the binding of CXCR3 ligands (CXCL9,
CXCL10 and CXCL11) [28]. Further investigations in ani-
mal models will be necessary to confi rm this hypothesis.
We found that the concentrations of CXCL8 and CXCL9
were greater in patients with active pulmonary TB than in
normal subjects. Moreover, the concentrations of these
chemokines declined to background levels after 4–6 months
of successful chemotherapy. Several studies have now re-
ported high CXCL8 quantities in samples of active pulmo-
nary TB [11–16]. In contrast with our results, a previous
work showed that the enhanced levels of CXCL8 in serum
of active pulmonary TB patients were still increased during
and after chemotherapy [14]. It is unclear why the study by
Juffermans et al. [14] failed to detect a fall in CXCL8 after
chemotherapy. Whereas CXCL8 was measured in serum in
the latter study, we measured the protein in processed plas-
ma. Serum preparation is associated with platelet activation
and platelets may release certain CXC chemokines [30, 31].
Whether the use of different methodologies could account
for the results observed is unclear. Nevertheless, our results
demonstrate a consistent elevation of CXCL8 during pul-
monary TB infection and a consistent fall after treatment.
We are not aware of other studies that measured CXCL9 on
plasma samples of patients with TB. Studies in experimen-
tal models of TB infection or granuloma have demonstrated
the enhanced expression of CXCL9 at the site of infection
[3,5,13]. It appears that the increase of this cytokine in the
lung is refl ected in the general circulation and decline fol-
lowing treatment.
Our studies were not conducted to evaluate possible
mechanisms of action of chemokines in infected patients.
However, as both CXCL8 and CXCL9 are capable of at-
tracting activated T cells, including CXCR3
+
T cells, it is
reasonable to suggest the enhanced concentration of these
chemokines may play a role in inducing T cell recruitment
to the granuloma and helping in the control of infection. On
the other hand, 4–6 months after chemotherapy the decline
in levels of CXCL8 and CXCL9 appears to mirror a success-
ful control of parasite growth and consequent diminution of
granulomatous infl amation.
TNF-α is thought to be relevant for the pathophysiology
of tuberculosis and is induced by M. tuberculosis at the site
of infection [32–35]. A few studies have demonstrated el-
evated concentrations of TNF-α in the circulation [16, 18].
In the present study, there was no signifi cant difference in
the concentration of TNF-α in plasma samples of healthy
subjects and individuals with pulmonary TB. One possibility
to explain the differences between the studies is that we used
an ELISA assay with low sensitivity and many healthy indi-
viduals and infected patients were below the detection limit
of the assay. Alternatively, elevated concentrations of TNF-
α could not be detected because this cytokine may bind to
soluble TNF-α receptors, such as sTNFR1, preventing its de-
termination. Indeed, concentrations of sTNFR1 were greater
in plasma samples of subjects with active TB than in plasma
of healthy controls. Moreover, treatment with tuberculostatic
drugs was accompanied by a decline to baseline levels. These
results are similar to those of Kawaguchi and colleagues [18]
who showed that sera concentrations of both sTNFR type I
and II were enhanced in pulmonary TB and declined with
chemotherapy. The levels of sTNFR1 and sTNFR2 were also
increased in cerebrospinal fl uid samples of patients with tu-
berculous meningitis and decreased to undetectable values
4 to 8 months after the beginning of specifi c treatment [19].
Overall, these studies demonstrated that the concentration of
sTNFR1 (and sTNFR2) is elevated during TB and that levels
fall after specifi c treatment.
In conclusion, of the many chemokines and cytokines
evaluated in the present study, CXCL8, CXCL9 and sTNFR1
were consistently elevated during pulmonary TB infection
healthy without treat treat 0-3 treat 4-6
0
500
1000
1500
2000
2500
5000
***
*
*
***
sTNFR1 (pg/mL)
pulmonary tuberculosis patients
Fig. 2. Concentration of sTNFR1 in plasma of patients with active tu-
berculosis at diagnosis and before treatment (n = 15), patients after 0–3
months of treatment (n = 18), patients after 4–6 months of treatment (n =
18) and healthy controls (n = 12). Horizontal line indicates median val-
ues. Statistical analysis was conducted using Kruskal-Wallis followed
by Dunn’s post test. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001.
532 A. L. Alessandri et al. Infl amm. res.
and dropped to baseline levels after specifi c treatment. The
present study did not measure chemokines and sTNFR1 in a
longitudinal manner and lacked a longer follow-up period.
Moreover and due to our selection of HIV-negative patients,
it only included patients who responded to conventional tu-
berculostatic chemotherapy. Despite the latter limitations, it
is apparent that measurement of these proteins may be useful
to assess response to treatment in pulmonary TB patients.
Further studies in the general population and in patients who
fail treatment are necessary to support this possibility.
Acknowledgments. This investigation received fi nancial support from the
UNICEF/UNDP/World Bank/WHO Special Programme for Research
and Training in Tropical Diseases (TDR A20748), Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científi co e Tecnológico (CNPq, Brazil) and Fundação
do Amparo a pesquisas do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG, Brazil).
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