( PDF ) Antígenos para a produção de soro contra o veneno do escorpião Tityus serrulatus

Download PDF

ads:

Thais Melo Mendes

Antígenos para a produção de soro

contra o veneno do escorpião

Tityus serrulatus

Universidade Federal de Minas Gerais

Instituto de Ciências Biológicas

Departamento de Fisiologia e Farmacologia

Belo Horizonte

2007

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

Thais Melo Mendes

Antígenos para a produção de soro

contra o veneno do escorpião

Tityus serrulatus

Tese submetida ao Programa de Pós-graduação em Fisiologia

e Farmacologia do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial

para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas

Área de concentração: Farmacologia

Orientador: Evanguedes Kalapothakis

O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de

Biotecnologia e Marcadores Moleculares

Universidade Federal de Minas Gerais

Belo Horizonte

2007

ads:

Este trabalho foi realizado com o apoio das seguintes

instituições:

- Departamento de Farmacologia – ICB – UFMG

- Departamento de Biologia Geral – ICB – UFMG

- Fundação Ezequiel Dias – FUNED

- Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais - FAPEMIG

- Conselho Nacional de Pesquisa – CNPq

- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível superior –

CAPES

Dedico esta dissertação ao Maurício

e à minha família

Agradecimentos

Ao meu orientador, Evanguedes Kalapothakis, que me ensinou quase tudo

que sei de pesquisa e convívio dentro de um laboratório. Você é uma pessoa de

muita moral e ética, e por causa de pessoas como você, ainda tenho esperança de

um Brasil melhor.

À pesquisadora e amiga, Jovita E. Madeira Gazzinelli, que me acolheu em

seu laboratório quando eu mais precisava. Você foi muito importante para mim.

Ao programa de Pós-Graduação em Fisiologia e Farmacologia,

principalmente a coordenadora Adelina Reis e a secretária Celinha, pela solicitude

no processo da minha transferência.

Às minha amigas de bancada e doutorado, Andréa e Tatiana, que muito me

ajudaram. Vocês são muito especiais, são pessoas muito prestativas e não vacilam

na hora de ajudar quem precisa.

Aos meus amigos e companheiros de laboratório, Ana Luíza, Ana Carolina,

Ana Paula, André, Denise, Flavinha, Gabriel, Isabela, Maria, Tatiana e

principalmente Carol, Anderson e Higgor, vocês me ajudaram muito e fizeram

meus dias mais alegres.

Aos meus amigos da FUNED, principalmente a Gaucinha, Nayara e Elizete,

ao pessoal do laboratório de Micologia e Micotoxinas, ao pessoal do IOM e do

curso de atualização, vocês foram muito importantes.

Aos meus amigos da Veterinária, principalmente Felipe, Katarina, Rodrigo e

Pricilla, que me agüentaram quando eu ia trabalhar lá. Ao Prof. Francisco Lobato

que me disponibilizou seu laboratório.

Às minhas ex-colegas de laboratório e grandes amigas, Lucila, Cibele,

Flávia, Juliana e Fabíola, pela ajuda e amizade.

Aos colegas dos laboratórios dos Professores Carlos Chávez e Alfredo

Góes, que sempre estavam dispostos a ajudar, principalmente a Lisa, que me

ajudou a sangrar os camundongos e ao Ricardo que me ajudou com as

purificações.

Aos meus amigos da Biologia, especialmente, Dani, Paty, Chabi, Ceça,

Fábio, Fred Mirandinha, Millen, Sérgio, Lú Compart, Marquinhos e Dudu pela

amizade e diversão que me proporcionam sempre que estou com eles.

Às minhas grandes amigas Rosana, Renata, Fê, e Simone pela amizade e

apoio. Vocês moram no meu coração.

Aos meus amigos Dani, Pri, Val e Vinício pela amizade e diversão que me

proporcionaram. Vocês sempre são bem vivos lá em casa para um filminho.

À minha grande família da rua Ligúria e à Diana e ao Willer pela amizade e

incentivo.

Ao Maurício pelo amor e toda ajuda que me deu com a bioinformática e

escrita da tese.

À minha família, Cida, Carlos, André, Bruno e Rodrigo, por todo amor,

incentivo, apoio e ajuda que me deram durante a realização da tese e por toda

minha vida.

Muito obrigada a todos vocês!

Sumário

Resumo................................................................................................................................... 1

Abstract………………………………………………………………………………………………. 2

Introdução............................................................................................................................... 3

1 - Os Escorpiões.......................................................................................................... 3

1.1 - Distribuição Geográfica e Classificação................................................................ 3

1.2 – Morfologia............................................................................................................ 5

1.3 – Habitat e Hábitos................................................................................................. 7

2 – Escorpionismo no Brasil e em Minas Gerais.......................................................... 8

2.1 – Introdução............................................................................................................ 8

2.2 – Epidemiologia...................................................................................................... 9

2.3 – Quadro Clínico.....................................................................................................10

2.4 – Classificação Clínica e Tratamento Específico................................................... 12

3 – Veneno, Estrutura das toxinas e Modo de Ação.................................................... 13

3.1 – Veneno................................................................................................................ 13

3.2 – Toxinas Escorpiônicas.........................................................................................15

3.2.1 – Toxinas que agem nos canais de sódio........................................................... 16

3.2.2 – Toxinas que agem nos canais de potássio...................................................... 20

3.2.3 – Toxinas que agem nos canais de cloro............................................................ 24

3.2.4 – Toxinas que agem nos canais de cálcio...........................................................25

3.2.5 – Peptídeos sem pontes dissulfeto......................................................................28

3.3 – Toxinas do Tityus serrulatus e sua nomeclatura................................................. 29

3.3.1 – Toxinas que agem em canais de sódio............................................................ 29

3.3.2 – Toxinas que agem em canais de potássio....................................................... 38

4 – Os avanços na Soroterapia.................................................................................... 41

Objetivo Geral.......................................................................................................................... 45

Objetivos Específicos............................................................................................................. 45

Justificativa.............................................................................................................................. 46

Materiais e Métodos................................................................................................................ 48

A – Reagentes, Meios de Cultura, Soluções............................................................... 48

B – Genótipo das linhagens de bactéria utilizadas.......................................................54

C – Animais Utilizados..................................................................................................55

D - Preparo do estoque de bactérias............................................................................55

E – Metodologia............................................................................................................56

 - Obtenção do DNA das toxinas............................................................................. 59

1 - Obtenção do DNA de toxinas a partir do DNA genômico do escorpião Tityus

serrulatus................................................................................................................... 59

1.1 - Extração de DNA genômico do escorpião Tityus serrulatus................................ 61

1.2 - Padronização da PCR e Amplificação dos DNAs das toxinas............................. 62

1.3 - Clonagem dos DNAs no vetor pGEM T Easy vetor............................................. 63

1.3.1- Purificação de DNA pelo método da Sílica/Guanidina....................................... 63

1.3.2 – Ligação dos DNAs da TsTx-I e TsTx em pGEM.............................................. 64

1.4 – Eletroporação...................................................................................................... 64

1.4.1 - Bactérias eletrocompetentes............................................................................. 64

1.4.2 – Protocolo de Eletroporação.............................................................................. 65

1.5 – PCR de Colônia................................................................................................... 66

1.6 – Purificação de plasmídeo por lise alcalina.......................................................... 67

1.7 - Corte com enzimas de restrição...........................................................................68

1.8 – Seqüênciamento..................................................................................................68

1.9 - Análise computacionais das seqüências obtidas................................................. 69

2 - Busca de DNAs de toxinas na biblioteca de cDNA da glândula de veneno do

escorpião Tityus serrulatus...................................................................................... 70

2.1 - Biblioteca de DNA da glândula de veneno do escorpião Tityus serrulatus......... 70

2.2 - Titulação da biblioteca..........................................................................................70

2.3 - Excisão em massa da sub-biblioteca 34.............................................................. 71

2.4 – Verificação da presença de insertos................................................................... 72

2.5 – Análise das ESTs obtidas....................................................................................74

 – Construção dos cassetes................................................................................... 75

1 - Construção de proteínas em tandem.................................................................. 75

1.1 - Clonagem do DNA da TsTx-I em pGEM.............................................................. 78

1.2 - Transformação química........................................................................................79

1.2.1. - Bactérias quimicamente competentes............................................................. 79

1.2.2 - Transformação química.................................................................................... 79

1.3 - Subclonagem do DNA da TsTx-I em pBluescript................................................. 80

1.3.1- Obtenção do pBluescript.................................................................................... 80

1.3.2 - Purificação do DNA TsTx-I................................................................................ 81

1.3.3 - Desfosforilação de plasmídeo........................................................................... 81

1.3.4 - Ligação do DNA da TsTx-I no vetor pBluescript............................................... 82

1.4 - Montagem da TsTx-I com 2 cópias de DNA........................................................ 86

1.5 - Montagem da TsTx-I com 4 cópias de DNA........................................................ 87

1.5.1 – Subclonagem no vetor pBluescript................................................................... 87

1.5.2 – Clonagem no vetor pET 11a.............................................................................87

2 - Construção da proteína quimérica...................................................................... 90

2.1 – Obtenção do DNA da TsNTxP............................................................................ 92

2.2 – Ligação do DNA da TsNTxP ao pBluescript+TsTx-I........................................... 92

2.3 – Obtenção do DNA da TsTx................................................................................. 93

2.4 - Ligação do DNA da TsTx ao pBluescript+TsTx-I+TsNTxP.................................. 94

 - Expressão............................................................................................................ 95

1 - Sistema de expressão............................................................................................. 95

2 - Expressão piloto e curva de expressão da proteína recombinante em células de

bactérias da linhagem BL21 DE 3................................................................................ 97

3 - Expressão em larga escala..................................................................................... 98

4 – Expressão no fermentador..................................................................................... 98

5 - Lise celular.............................................................................................................. 99

6 - Dosagem de proteínas.......................................................................................... 100

7 - Eletroforese em Gel de Poliacrilamida.................................................................. 101

8 – ELISA................................................................................................................... 101

9 - Western Blotting.................................................................................................... 102

IV- Produção de soros e teste de potência............................................................ 102

1 - Imunização dos animais........................................................................................ 102

1.1 – Imunização dos camundongos.......................................................................... 102

1.2 – Imunização dos coelhos.................................................................................... 103

2 - Titulação dos soros dos animais........................................................................... 103

3 – Determinação da DL

.......................................................................................... 104

4 - Neutralização in vitro............................................................................................. 104

5 - Capacidade de proteção após vacinação............................................................. 104

V - Análise dos dados..............................................................................................105

1 - Análise estatística................................................................................................105

Resultados............................................................................................................................... 106

 - Obtenção do DNA das toxinas............................................................................106

1 - Obtenção dos DNAs das proteínas TsTx e TsTx-I do DNA genômico do escorpião

Tityus serrulatus......................................................................................................... 106

2 - Busca de DNAs de toxinas na biblioteca de DNAs da glândula de veneno do

escorpião Tityus serrulatus.........................................................................................110

2.1 - Excisão em massa da biblioteca........................................................................ 110

2.2 - Seqüênciamento e análise dos dados............................................................... 110

 – Construção dos cassetes................................................................................. 120

1 - Construção de proteínas em tandem................................................................ 120

1.1 - Clonagem do DNA da TsTx-I em pGEM............................................................ 120

1.2 - Subclonagem do DNA da TsTx-I no vetor pBluescript II KS-............................. 122

1.3 – Clonagem do DNA da TsTx-I

(1)

no pET 11a...................................................... 126

1.4 – Montagem da TsTx-I

(2)

.......................................................................................131

1.5 – Montagem da TsTx-I

(4)

.......................................................................................135

2 - Construção da proteína quimérica.................................................................... 146

2.1 - Clonagem do DNA da TsNTxP (amplificado do pMAL) no vetor pGEM............ 146

2.2 - Subclonagem do DNA da TsNTxP no vetor pBluescript contendo o DNA da

TsTx-I......................................................................................................................... 148

2.3 - Clonagem do DNA da TsTx em pGEM.............................................................. 150

2.4 - Subclonagem do DNA da TsTx no vetor pBluescript contendo o DNA da TsTx-

I+TsNTxP................................................................................................................... 152

 – Expressão e Caracterização das proteínas recombinantes......................... 156

1 – Expressão piloto da TsTx-I

(2)

......................................................................... 156

2 – Expressão em larga escala da TsTx-I

(2)

............................................................... 159

3 – Teste de expressão TsTx-I

(2)

................................................................................ 160

4 – Expressão em Larga Escala e Lise Bacteriana TsTx-I

(2)

...................................... 161

5 – Western blotting da TsTx-I

(2)

…………………………………………………………. 165

6 – Tentativa para produzir a proteína recombinante TsTx-I

(2)

solúvel...................... 167

7 – Expressão da BL21 e BL21/pET.......................................................................... 169

8 – Tentativa de reduzir a formação da proteína de 14 kDa...................................... 170

9 – Teste de dissolução da proteína recombinante TsTx-I

(2)

......................................173

10 – ELISA da TsTx-I

(2)

.............................................................................................. 177

11 – Ensaio de Toxicidade da TsTx-I

(2)

...................................................................... 178

12- Expressão piloto da TsTx-I

(1)

................................................................................ 179

13 – Expressão em larga escala da TsTx-I

(1)

e lise bacteriana.................................. 180

14 – Western blotting da TsTx-I

(1)

………………………………………………………... 181

15 – Expressão da TsTx-I

(1)

no Fermentador............................................................. 182

16 – Purificação por cromatografia da TsTx-I

(1)

..........................................................184

17 – Teste de dissolução da proteína recombinante TsTx-I

(1)

....................................186

18 – ELISA da TsTx-I

(1)

.............................................................................................. 188

IV- Produção de soros e teste de potência............................................................ 190

1 – Determinação da DL

do veneno do Tityus serrulatus........................................ 190

2 – Titulação dos soros.............................................................................................. 192

2.1 – Titulação dos soros dos coelhos....................................................................... 192

2.2 – Titulação dos soros dos camundongos............................................................. 195

3 – Ensaios de neutralização..................................................................................... 196

3.1 – Neutralização in vitro......................................................................................... 196

3.2 – Capacidade de proteção após vacinação......................................................... 197

3.3 – Comparação da titulação dos soros dos camundongos antes e depois do desafio

....................................................................................................................................200

Discussão................................................................................................................................. 203

Conclusões.............................................................................................................................. 217

Pespectivas............................................................................................................................. 218

Referências…………………………………………………………………………………………… 219

Índice de Figuras

Figura 1 – Principais espécies brasileiras de escorpiões perigosos.............................4

Figura 2 – Desenho esquemático do escorpião. Vista dorsal e ventral do escorpião..6

Figura 3 – Toxinas que agem em canais de sódio.........................................................20

Figura 4 – Toxinas que agem em canais de potássio....................................................23

Figura 5 – Toxinas que agem em canais de cloro..........................................................24

Figura 6 – Toxinas que agem em canais de cálcio.........................................................27

Figura 7 – Toxinas do veneno do T. serrulatus que agem em canais de sódio..........35

Figura 8 – Seqüências do cDNA e DNA genômico da TsTx-I........................................36

Figura 9 – Seqüências do cDNA e DNA gênomico da TsTx. .........................................37

Figura 10 – Toxinas do veneno do T. serrulatus que agem em canais de potássio...40

Figura 11 – Esquema da metodologia utilizada..............................................................56

Figura 12 – Procedimentos utilizados nas etapas de clonagem...................................57

Figura 13 – Vetores de fácil clonagem. ...........................................................................58

Figura 14 – Primers construídos para clonagem das proteínas de interesse.............60

Figura 15 – Mapa do vetor pBluescript II KS +/-.. ...........................................................76

Figura 16 – Construção de proteínas em Tandem da TsTx-I.........................................77

Figura 17 - Construção da proteína quimérica..............................................................91

Figura 18 - Representação esquemática e mapa da região MCS do vetor pET 11a...96

Figura 19 - Extração do DNA genômico e obtenção do DNA das toxinas. ................108

Figura 20 – Corte com enzima de restrição dos clones da TsTx e TsTx-I em

pGEM.........................................................................................................................109

Figura 21 – Análise da seqüência da TsTx-I obtida na biblioteca...............................111

Figura 22 – Análise da seqüência da TsTx obtida na Biblioteca.. ..............................112

Figura 23 – Distribuição dos tamanhos das ESTs. ......................................................113

Figura 24 – Proporção relativa de cada categoria dos transcritos da biblioteca de

cDNA da glândula de veneno do Tityus serrulatus..............................................114

Figura 25 - Proporção relativa de cada categoria dos Uniques..................................115

Figura 26 – Anotação das ESTs com Gene Ontology..................................................116

Figura 27 – Anotação das Uniques com Gene Ontology.............................................117

Figura 28 – Construção das proteínas recombinantes a partir da seqüência da TsTx-I

no vetor pET 11a......................................................................................................120

Figura 29 – Amplificação e purificação do DNA da TsTx-I do clone obtido da

biblioteca..................................................................................................................121

Figura 30 – Purificação do DNA da TsTx-I e desfosforilação do plasmídeo cortado..

...................................................................................................................................123

Figura 31 – Corte com enzima de restrição Hind III dos clones da TsTx-I clonados no

pBluescript...............................................................................................................124

Figura 32 – Análise da seqüência do clone 14 no programa Blastx...........................125

Figura 33 – Construção dos primers para a clonagem da TsTx-I

(1)

no pET 11a........127

Figura 34 – Amplificação e purificação do fragmento de DNA TsTx-I

(1)

e verificação

da clonagem.............................................................................................................128

Figura 35 – Preparo para subclonagem do DNA da TsTx-I

(1)

no vetor pET 11a........129

Figura 36 – Confirmação da ligação TsTx-I

(1)

no pET...................................................130

Figura 37 – Clonagem da TsTx-I

(2)

nos vetores de fácil clonagem. ............................132

Figura 38 – Preparo para subclonagem do DNA da TsTx-I

(2)

no vetor pET 11a.........133

Figura 39 – Confirmação da ligação TsTx-I

(2)

no pET...................................................134

Figura 40 – Construção dos primers para a clonagem da TsTx-I

(2)

/Eco no clone 14.

...................................................................................................................................136

Figura 41 – Clonagem da TsTx-I

(2)

(Eco) nos vetores de fácil clonagem. ..................137

Figura 42 – Preparo para subclonagem do DNA da TsTx-I

(2)

(Eco) no clone 14........138

Figura 43 – PCR para confirmação da ligação da TsTx-I

(2)

(Eco) no clone 14.. .........139

Figura 44– Construção dos primers para a clonagem da TsTx-I

(4)

no pET 11a.........141

Figura 45 – Clonagem da TsTx-I

(4)

em pGEM.. ..............................................................142

Figura 46 – Preparo para subclonagem do DNA da TsTx-I

(4)

no pET 11a. .................143

Figura 47 – Corte com enzima de restrição para confirmação da ligação da TsTx-I

(4)

em pET......................................................................................................................144

Figura 48 – Seqüênciamento da TsTx-I

(4)

em tandem no vetor pET 11a.. .................145

Figura 49 – Construção da proteína recombinante quimérica no vetor pBluescript.

...................................................................................................................................146

Figura 50 – Amplificação, purificação e clonagem do DNA da TsNTxP em pGEM...147

Figura 51 – Clonagem do DNA da TsNTxP nos clones 14 e 16 da TsTx-I (di e mono)..

...................................................................................................................................149

Figura 52 – Clonagem do DNA da TsTx no pGEM........................................................151

Figura 53 – Clonagem do DNA da TsTx no vetor pBluescript contendo o DNA da

TsTx-I +TsNTxP........................................................................................................153

Figura 54 – Verificação da clonagem do DNA da TsTx no pBluescript contendo o

DNA da TsTx-I+TsNTxP...........................................................................................154

Figura 55 – Seqüênciamento das construções quiméricas.. ......................................155

Figura 56 – Expressão piloto da proteína recombinante TsTx-I

(2)

. .............................157

Figura 57 - Curva de expressão dos clones da proteína recombinante TsTx-I

(2)

BL21 (DE3)................................................................................................................158

Figura 58 - Expressão em larga escala da proteína recombinante TsTx-I

(2)

.. ............159

Figura 59 – Triagem das colônias recombinantes da TsTx-I

(2)

que estavam

expressando.............................................................................................................160

Figura 60 – As duas metodologias utilizadas para expressão em larga escala da

TsTx-I

(2)

.. ...................................................................................................................162

Figura 61 – Lise bacteriana após expressão em larga escala da TsTx-I

(2)

utilizando a

primeira metodologia.. ............................................................................................163

Figura 62 - Lise bacteriana após expressão em larga escala da TsTx-I

(2)

utilizando a

segunda metodologia..............................................................................................164

Figura 63 – Western blotting da TsTx-I

(2)

.......................................................................166

Figura 64 – Expressão da TsTx-I

(2)

em fermentador.....................................................168

Figura 65 – Expressão de proteínas nas bactérias BL21 e BL21/pET........................169

Figura 66 – Processos para tentar evitar o surgimento da proteína de 14 kDa.. ......172

Figura 67 – Solubilização das proteínas insolúveis do pellet da lise da expressão da

TsTx-I

(2)

.. ...................................................................................................................175

Figura 68 - Solubilização com SDS das proteínas insolúveis do pellet da lise da

expressão da TsTx-I

(2)

.............................................................................................176

Figura 69 – Reatividade da TsTx-I

(2)

frente ao soro anti-veneno de Tityus serrulatus.

...................................................................................................................................177

Figura 70 – Triagem de colônias que expressam a proteína recombinante TsTx-I

(1)

...................................................................................................................................179

Figura 71 – Expressão em larga escala e lise bacteriana da expressão da TsTx-I

(1)

...................................................................................................................................180

Figura 72 – Western blotting da proteína recombinante TsTx-I

(1)

...............................181

Figura 73 – Expressão da TsTx-I

(1)

no fermentador. Gel de SDS-PAGE 18% corado

com azul de coomassie...........................................................................................183

Figura 74 – Tentativa de purificação da TsTx-I

(1)

em coluna C8 no HPLC.. ...............185

Figura 75 – Solubilização da proteína TsTx-I

(1)

recombinante insolúvel....................187

Figura 76 – Reatividade da proteína recombinante TsTx-I

(1)

frente ao veneno do

Tityus serrulatus......................................................................................................188

Figura 77 – Titulação do soro anti-veneno total de Tityus serrulatus........................192

Figura 78 – Titulação dos soros dos animais imunizados com TsTx-I

(1)

e TsTx-I

(2)

.. 194

Figura 79 – Titulação dos soros dos camundongos imunizados...............................195

Figura 80 – Titulação do pool dos soros dos camundongos imunizados antes e

depois do desafio com veneno.. ............................................................................202

Índice de tabelas

Tabela 1 – Acidentes escorpiônicos: classificação, manifestações clínicas e

tratamento

................................................................................................................12

Tabela 2 - Principais trabalhos de purificação de toxinas do veneno do T. serrulatus,

nas décadas de 60 a 80.............................................................................................31

Tabela 3 – Uniformização dos nomes das toxinas de T. serrulatus.............................34

Tabela 4 – Identificação dos trancritos que possuem homologia com toxinas ou

componentes do veneno.........................................................................................118

Tabela 5 – Ensaio de Toxicidade da TsTx-I

(2)

................................................................178

Tabela 6 – Ensaio de Toxicidade da TsTx-I

(1)

................................................................189

Tabela 7 – Determinação da DL

do veneno bruto......................................................190

Tabela 8 - Determinação da DL

do veneno liofilizado ...............................................191

Tabela 9 - Determinação da DL

do veneno bruto que foi liofilizado ........................191

Tabela 10 – Neutralização in vitro..................................................................................196

Tabela 11 – Cálculo de quantidade de veneno a ser usada proporcional ao peso...198

Tabela 12 – Capacidade de neutralização após vacinação.........................................199

Lista de Abreviaturas

C

Graus Celsius

Amp Ampicilina

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

BSA Soro Albumina Bovino

Cols. Colaboradores

CIAP

Calf intestinal alkaline phosphatase

DAB 3,3’- diaminobenzidina

Dose letal de 50%

DNA Ácido dexosirribonucléico

DNA DNA fita simples (única)

dNTP Desoxi (nucleotídeo) 5’-trifosfato

DO Densidade Óptica

DTT Ditiotritol

eag Gene ether-a-go-go de Drosophila melanogaster

EDTA Ácido Etileno Diaminotetracético

ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay

EMBL

European Molecular Biology Laboratory

EST

Expressed Sequence Tag

Gene Ontology

GOA

Gene Ontology Annotation

HERG Gene humano homólogo ao gene eag

HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência

ICK

Inibidor cystine knot

IgG Imunoglobulina G

IPTG

Isopropil-tio--D-galactosídio

Kb Quilobase

KDa Quilo Dalton

LacZ

Gene que codifica a -galactosidase

Lb Meio de Cultura Luria-Bertani

M Molar

mAb Anticorpo monoclonal

MBP Proteína ligadora de maltose

MCS Sítio multiplo de clonagem

mM Mili-Molar

mg Mili-grama

mL Mililitro

F

microFaraday

g

Micrograma

l

Microlitro

m

Micrometro

mRNA RNA mensageiro

N Normal

NCBI

National Center for Biotechnology Information

ng Nanograma

OPD Ortofenilenodiamino

PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida

pb Pares de bases

PCR Reação em cadeia da polimerase

pH Potencial Hidrogenionte

PHRAP

PHRagment Assembly Program

PHRED

Phil’s Read Editor

PBS Tampão salina fosfato

PBST Tampão salina fosfato Tween 20

PMSF

Phenilmetilsulfonil fluoride

PSA Persulfato de Amônia

q.s.p Quantidade Suficiente Para

RNA Ácido ribonucléico

SDS Sódio Dudecil Sulfato

SDS-PAGE Gel de poliacrilamida com SDS

Swiss prot Protein knowledgebase of Swiss Institute

DNA ligase

DNA ligase do bacteriófago

TAE Tampão Tris, Ácido acético, EDTA

Taq

Thermus aquaticus

Taq DNA polimerase DNA polimerase termoestável do Thermus

aquaticus

TE Tampão Tris e EDTA

TEMED Tetrametiletilenodiamino

TrEMBL

Translated EMBL

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

TsNTxP

Tityus serrulatus non-toxic protein

U Unidade de enzima

UniProt

The Univesal Protein Resourse

U.V. Ultra Violeta

V Volts

x-Gal

5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactose

Lista de Abreviaturas de Nomes de Escorpiões

Abreviaturas Nomes completos

AaH

Androctonus australis Hector

Amm

Androctonus mauretanicus mauretanicus

Buthus eupeus

Buthotus judaicus

BmK

Buthus martensi Karsch

Buthus occitanus

Bom

Buthus occitanus mardochei

Buthus sindicus

Bot

Buthus occitanus tunetanus

Centruroides exilimanus

Cex

Centruroides exilicauda

Centruroides gracilis

Centruroides limbatus

Cll

Centruroides limpidus limpidus

Centruroides margaritatus

Centruroides noxius Hoffmann

CsE

Centruroides sculpturatus Ewing

Css

Centruroides suffusus suffusus

Hadrurus aztecus

Heterometrus fulvies

Heterometrus soubufer

Lqh

Leiurus quinquestriatus hebraeus

Lqq

Leiurus quinquestriatus quinquestriatus

Opistophthalmus carinatus

Opisthacanthus madagascariensis

Orthochirus scrobiculosus

Parabuthus granulatus

Pandinus imperator

Parabuthus schlechteri

Parabuthus transvaalicus

Parabuthus villosus

Scorpion maurus palmatus

Tityus bahiensis

Tityus cambridgei

Tco

Tityus costatus

Tityus serrulatus

Tst

Tityus stigmurus

Tityus zulianus

Lista de Abreviaturas de Nomes de Toxinas

A maioria das toxinas usam como abreviações as primeiras letras dos

nomes científicos dos escorpiões, seguido de um número romano ou arábico que

significa a ordem de purificação ou é relativo ao pico de purificação. Exemplo: AaH

II, Androctonus australis Hector, e esta toxina foi a segunda a ser purificada do

veneno deste escorpião. Algumas ainda trazem na abreviatura de seus nomes, as

letras IT que significa tóxicas para insetos. Exemplo: Aah IT 4. Outras ainda

especificam se as toxinas são do tipo  ou . Exemplos: Lqh  IT ou BmTx  .

Outras explicitam a ação da toxina, exitatória → xtr. Exemplo: Bjxtr IT. Outras

trazem as letras Tx para indicar toxina. Exemplo: TsTx V, toxina V do Tityus

serrulatus . As letras Erg indicam que estas toxinas agem em canais ERG.

Exemplo: Cn Erg 1. Mas muitas tem nome que não possuem relação direta com o

nome científico do escorpião e as usadas neste trabalho estão descritas na tabela

abaixo.

Abreviação Nome da toxina Escorpião

AgTx 1 e 2 Agitoxinas Lqh

BeKm Toxina do Be age em canais

de K tipo m

BmK CT Toxina do BmK homológa a

clorotoxina

BmK

BmKTx Toxinas do BmK inibidoras de

canais de K

BmK

BmP 01, 02, 05 Peptídeos do BmK que inibe

canais SKCa

BmK

ClTx Clorotoxina Lqh

CTx Caribdotoxina Lqh

CoTx 1 e 2 Cobatoxinas CnH

ErgTx Ergtoxina CnH

HgTx 1 Hongotoxina Cl

HfTx 1 e 2 Hefutoxinas Hf

I 1, 3, 4, 5 e 5A Insetotoxinas Be

IbTx Iberiotoxina Bt

IpTx A Imperatoxina ativador Pi

IpTx I Imperatoxina inibidor Pi

Is CT e 2 Peptídeos lineares citotóxicos Om

KL I e II Kurtoxia-like Pg

Ktx Kurtoxina Pt

KTx Kaliotoxina Amm

LbTx Limbatotoxina Cl

LeTx I Leiurotoxina Lqh

Lp I Leiuropeptideos Lqh

Mca Maurocalcina Sm

MgTx Margatoxina Cm

MTx Maurotoxina Sm

NTx Noxiustoxina CnH

Opc Opicalcina Oc

PB ITx 1 Peptideo tipo insetotoxina Ps

PBTx 1 Parabutoxinas Pv e Pt

Pi 1, 2 e 3 Pandinotoxinas Pi

P01 e 05 Peptideos inibidores SKCa Amm

TmTx Tamulotoxina Bt

Ts

Tityus kappa Ts

Tyk 

Tityustoxina II Ts

Resumo

Os escorpiões são animais que possuem veneno para capturarem

presas e se defender. Estes venenos possuem toxinas que agem em canais

iônicos de vários seres vivos. Algumas peçonhas são muito tóxicas para os

mamíferos, inclusive o homem, podendo levar até a morte. No Brasil, existem

algumas espécies de escorpiões perigosos à saúde e há uma grande

preocupação em relação aos acidentes. Desde a década de 60, pesquisadores

vêm estudando a peçonha dos escorpiões. E apesar de já existir um soro anti-

escorpiônico eficaz, ainda existem problemas na sua produção e uso. Portanto,

para o desenvolvimento de um soro de melhor qualidade ou até mesmo uma

vacina, é necessário um conhecimento maior sobre a composição e ação do

veneno.

Nosso grupo está envolvido na busca de novos imunôgenos para a

produção de soro. Com este objetivo, nós fizemos uma busca por novas

toxinas na biblioteca de cDNAs da glândula de veneno do escorpião Tityus

serrulatus, disponível em nosso laboratório. Como resultado obtivemos várias

seqüências de nucleotídeos codificando proteínas similares a toxinas. Os

cDNAs das duas principais toxinas do veneno do T. serrulatus, TsTx e TsTx-I,

foram obtidos. Em conjunto com a seqüência de nucleotídeos codificante para

a TsNTxP, eles foram usados para construções de cassetes de expressão.

Estes foram construídos através de inserção em um vetor plasmidial de cópias

de genes em série (em tandem) ou uma cópia de genes diferentes, codificando

proteínas diferentes (quimera).

Duas construções foram utilizadas para ensaios de expressão em

bactérias e as proteínas recombinantes obtidas foram inoculadas em animais,

para a produção de anticorpos. Estes foram testados e se mostraram capazes

de neutralizar os efeitos tóxicos do veneno total do T. serrulatus. Os resultados

obtidos neste trabalho abrem novas possibilidades para a produção de soro

anti-escorpiônico utilizando-se como antígeno às proteínas recombinantes

descritas aqui. O avanço mais importante obtido foi a determinação da

capacidade da toxina recombinante TsTx-I de produzir anticorpos com o poder

de neutralizar o veneno do Tityus serrulatus, uma vez que ainda não havia

estudos nesta área com esta toxina.

Abstract

Scorpions are animals that use venom to capture preys and to defend

themselves. These venoms possess toxins that act in ionic channels of many

organisms. Some poisons are very toxic for mammals, including man, and may

cause death. In Brazil, there are some species of scorpions dangerous to

human health and there is a great concern relative to accidents.

Since the decade of 60, researchers are studying scorpion venom.

Although already exist an effective anti-scorpionic serum, problems in its

production and use still exist. Therefore, for the development of a better quality

serum or even a vaccine, it is necessary a greater knowledge of the venom

composition and action.

Our group is involved in the search of new imunogens for anti-venom

production. To achieve such purpose, a search for new toxins in a cDNA library

of Tityus serrulatus venom gland was carried out. As result several nucleotide

sequences coding for toxin-like proteins were identified. cDNAs of two main

toxins of the T. serrulatus venom, TsTx and TsTx-I, were obtained and used

with the cDNA of TsNTxP, in the constructions of expression cassettes. These

were constructed by insertion into a plasmidial vector of copies of genes in

series (in tandem) or a copy of different genes, encoding proteins different

(chimera).

Two constructions were used for bacterial expression assays and the

obtained recombinant proteins inoculated in animals, for antibodies production.

The antibodies were tested and neutralized the toxic effects of the T. serrulatus

crude venom. The results obtained in this work open new possibilities for the

production of anti-scorpionic serum using the recombinant proteins described

here as antigen. The most important advancement was obtained to determine

the ability of the recombinant toxin TsTx - I to produce antibodies with the power

to neutralize the Tityus serrulatus venom since it had not yet studies in this area

with this toxin.

Introdução

1- Os Escorpiões

1.1- Distribuição Geográfica e Classificação

Existe a comprovação da existência dos escorpiões há mais de 400

milhões de anos. Foram os primeiros artrópodes a conquistar o ambiente

terrestre e desde então não passaram por modificações morfológicas

importantes.

Possuem ampla distribuição geográfica por todos os continentes, com

exceção da Antártica (Lourenço, 2004). Nas Américas, eles se distribuem do

Canadá até a Patagônia e na região Paleártica (Europa, Ásia até o Himalaia e

África sententrional até o Saara), se distribuem do leste e centro da Europa até

a Rússia e China. Eles são presentes em todas as regiões tropicais do mundo

e recentemente foram introduzidos na Nova Zelândia (Lourenço, 1988; Sissom,

1990).

Os escorpiões pertencem à classe Arachnida, ordem Scorpionidae,

distribui-se em nove famílias e existem 1500 espécies conhecidas. Todos os

escorpiões potencialmente perigosos ao homem pertencem à família Buthidae,

a única família que tem ampla distribuição pelo mundo, e é a maior em número

de gêneros (48) e espécies, com aproximadamente 500 (Lourenço, 2004).

Somente 25 espécies podem ser consideradas perigosas ao homem. A família

Buthidae inclui quatro subfamílias, que são responsáveis pelos casos sérios de

picadas por escorpiões pelo mundo: Isometrinae, Buthinae, Centrurinae e

Tityinae (Bürchel, 1971). Os gêneros Androctonus, Buthus, Leiurus, Buthotus e

Heterometrus pertencem à subfamília Buthinae e são originários da África,

principalmente no norte, Oriente Médio e Índia (Balozet, 1971). O gênero

Parabuthus tem sido relatado no Sul da África (Debont e cols., 1998). A

subfamília Centrurinae é composta por escorpiões da América do Norte e

Central (Bravo-Becherelle e Mazzotti, 1961; Dehesa-Davila e Possani, 1994),

enquanto escorpiões da subfamília Tityinae (Tityus) são originários da América

do Sul e Trinidade e Tobago (Bücherl, 1971). No Brasil ocorrem 5 cinco

gêneros de Buthidae: Isometrus, Ananteris, Microtityus, Rhopalurus e Tityus. A

esse último pertencem às espécies responsáveis pelos acidentes humanos:

Tityus serrulatus, o mais importante, seguido por T. bahiensis, T. stigmurus, T.

cambridgei e T. trivittatus (Figura 1).

Figura 1– Principais espécies brasileiras de escorpiões perigosos.

1.2 – Morfologia

O corpo dos aracnídeos é subdividido em duas regiões, o prossoma

(cefalotórax) que compreende a cabeça e os membros e o opistossoma

(abdômen). O prossoma é não-segmentado e o opistossoma é segmentado. O

abdômen do escorpião é dividido em uma região larga anterior chamada

mesossoma (pré-abdômen) de 8 segmentos e uma região longa posterior, o

metassoma (pós-abdômen) ou cauda de 5 segmentos com um ferrão, o telson,

na sua extremidade. O abdômen tem uma carapaça onde se fixam os

apêndices (Figura 2).

O primeiro par de apêndices consiste de quelíceras. Estas se

posicionam acima da boca, possuem não mais de três segmentos e na maioria

das ordens, tem a forma de garras. As quelíceras são pequenas nos

escorpiões e as presas são seguras pelas pinças dos pedipalpos que formam o

segundo par de apêndices. Depois dos pedipalpos, existem quatro pares de

pernas. O ferrão do escorpião é curvo e pontudo. Sua base é mais larga e

contém um par de glândulas de veneno. Na porção ventral do mesossoma,

imediatamente abaixo do opérculo genital, estão duas pectinas, órgãos

sensoriais parecidos com um pente, que não são achados em nenhum outro

animal além dos escorpiões. As pectinas têm uma musculatura complexa, os

dentes variam de três a mais de quarenta, dependendo do sexo e da espécie

do escorpião, e são ricamente inervadas (Cloudsley-Thompson, 1968). Os

olhos dos aracnídeos são simples ocelos, os escorpiões têm um par de olhos

medianos e dois a cinco pares de olhos laterais na borda da carapaça.

Os escorpiões são dióicos e os sexos são separados, porém muito

similares, exceto em algumas espécies, como Tityus serrulatus em que as

fêmeas são partenogênicas e os machos aparentemente ausentes.

Figura 2 – Desenho esquemático do escorpião. Vista dorsal e ventral do

escorpião. O mesossoma e o metassoma compõem o opistossoma. A cabeça e

os membros compõem o prossoma. Desenho de Guarnieri (1998) adaptado por

Thais Melo Mendes.

1.3 – Habitat e Hábitos

Os escorpiões têm sido capazes de ocupar os mais variados habitats e

microhabitats terrestres. Eles são encontrados desde desertos (para o qual

eles são muito bem adaptados) até florestas tropicais (onde chove muito),

incluindo todas as zonas vegetais intermediárias. Alguns têm habitat em matas

e florestas inundáveis, alojados no solo e em copas de árvores de mais de 40

metros de altura, como o Tityus cambridgei. Eles são encontrados em altitudes

altas como 5500 metros, nos Andes (ex. Orobothriurus crassimanus Maury –

Bothriuridae), e em cavernas com profundidades de 800 metros (ex. Alacran

tartarus Francke – Chactidae)(Lourenço e Francke, 1985; Lourenço, 1988).

Os escorpiões são subsociais, os jovens são levados nas costas da mãe

até a primeira muda. Algumas espécies de escorpiões têm vida solitária e

tendem a evitar uns aos outros, mas também podem ser encontrados em

grupos como é o caso do T. serrulatus. Eles são noturnos, passando os dias

em buracos e fendas sob rochas, pedras e troncos caídos, de onde saem à

noite à procura da presa (Ministério da Saúde, 2001). Encontram ainda

esconderijos junto às habitações humanas, em entulhos de construção e sob

dormentes dos trens (Guarnieri, 1998).

A atividade ao longo do ano também é variável. A maioria das espécies

de escorpiões são mais ativos durante os meses mais quentes do ano. Durante

os meses mais frios, a atividade é menor, especialmente nas espécies que

vivem em altas latitudes e grandes altitudes (Guarnieri, 1998).

Os escorpiões são carnívoros alimentando-se exclusivamente de

animais vivos. Quando não há alimento disponível, eles baixam o metabolismo

e ficam de jejum absoluto. Nem sempre a peçonha é utilizada para a captura

de presas, muitas vezes somente os palpos são utilizados para segurar a

vítima, normalmente insetos (Guarnieri, 1998).

Esses animais apesar de serem predadores ativos e possuírem

peçonha, não estão livres de inimigos naturais. Entre eles encontram-se vários

parasitas e predadores, como outros artrópodes, anfíbios, lagartos, serpentes,

aves e alguns mamíferos (Guarnieri, 1998).

2 – Escorpionismo no Brasil e em Minas Gerais

2.1 – Introdução

Escorpionismo é o processo de envenenamento causado pela picada de

escorpiões.

O T. serrulatus e o T. bahiensis são as espécies mais comuns e

responsáveis pela grande maioria dos acidentes escorpiônicos no Brasil

(Ministério da Saúde, 2001). São animais que podem atingir até 7 cm de

comprimento e possuem algumas diferenças morfológicas mais evidentes. A

cor predominante do T. serrulatus é o amarelo e no quarto segmento da cauda

possuem duas fileiras de serrilhas, o que caracteriza a espécie. Já a cor

predominante do T. bahiensis é o marrom escuro e as tíbias dos palpos

possuem manchas nítidas, também escuras.

Os escorpiões distribuem-se por todo país, e calcula-se por volta de

8000 casos anuais de acidentes, sendo que os estados de Minas Gerais e de

São Paulo concentram perto de 50% dos casos (Ministério da Saúde, 2001).

Em Minas Gerais, o escorpião T. serrulatus é responsável pela maioria

dos acidentes e dos óbitos que ocorrem em decorrência da picada de

escorpiões. O centro de referência de Belo Horizonte para acidentes com

animais peçonhentos é o Hospital João XXIII – Serviço de Toxicologia.

2.2 – Epidemiologia

No Centro de Toxicologia do Hospital João XXIII, no período de janeiro

de 1972 e a dezembro de 1987 foram admitidos 3660 pacientes picados pelo T.

serrulatus. Desses 73% eram adultos e 27% eram crianças com idade variando

entre 0 a 14 anos. A taxa de mortalidade entre esses pacientes foi baixa

(0,28%). Importante salientar que todos os pacientes mortos eram crianças que

haviam sido internadas no hospital com mais de três horas do acidente ter

ocorrido (Freire-Maia e Campos, 1989).

A partir da implantação da notificação dos acidentes escorpiônicos no

país, vem se verificando um aumento significativo no número de casos. Entre

janeiro de 1990 e dezembro de 1993 foram notificados 24.826 casos, sendo

que 0,4% eram crianças com menos de um ano (taxa de mortalidade de 4%) e

28% eram crianças entre 1 e 14 anos, taxa de mortalidade de 1,7% (Ministério

da Saúde, 2001).

A partir de 2001, houve um grande aumento no número de casos de

acidentes escorpiônicos atendidos no Hospital João XXIII: 2001 cerca de 7000

casos sem casos fatais, 2002 cerca de 6000 casos com 2 fatais e 2003 cerca

de 8000 casos com 1 fatal. O chefe do Centro de Toxicologia, Doutor Délio

Campolina, acredita que esse grande aumento se dá principalmente pelo

aumento das notificações e não pelo aumento do número de casos. Isso

porque está havendo muitas campanhas e propagandas alertando a população

sobre o risco que os escorpiões representam e a importância de procurar com

rapidez o atendimento hospitalar (comunicação pessoal).

2.3 – Quadro Clínico

Dado que os mediadores químicos liberados pelas toxinas escorpiônicas

atuam na maioria dos sistemas do organismo, os sinais e sintomas são

variados e o quadro clínico estabelecido vai depender da predominância dos

efeitos ora da acetilcolina, ora da adrenalina e noradrenalina. No sistema

nervoso autônomo, alguns dos efeitos da adrenalina são: aumento da

freqüência, da força e da automaticidade do coração; diminuição da motilidade

do trato gastrointestinal; secreção das glândulas salivares e gliconeogênese no

fígado. Já a acetilcolina causa diminuição da freqüência, da força e da

velocidade de condução do coração; aumento da motilidade do trato

gastrointestinal; secreção das glândulas salivares e lacrimais (Rang e cols.,

1997).

As manifestações podem ser divididas didaticamente em locais e

sistêmica, que vão definir o acidente como leve, moderado e grave.

- Sinais e Sintomas Locais

A dor é um sintoma sempre presente e a intensidade com que pode se

manifestar dependerá não só da sensibilidade individual como também da

quantidade de veneno inoculada nos tecidos (Hering e cols., 1992).

Pode ser muito leve, quase imperceptível nos casos benignos, até muito

intensa e quase insuportável nos casos mais severos. A dor pode estar limitada

ao ponto de inoculação, sob a forma de ardor, semelhante à queimação,

ferroadas ou agulhadas, pode aumentar de intensidade à palpação e pode

irradiar-se para grandes distâncias, como por exemplo até a raiz da

extremidade acometida, fazendo-se sentir nesse local contínua, latejante, e por

vezes mais intensa que no local da picada (Hering e cols., 1992).

Cessando a dor espontânea, pode permanecer, no local de inoculação,

dor à palpação ou compressão, durante algum tempo, variando de horas até

dias. Pode estar presente, além da hiperestesia (sensibilidade excessiva),

parestesia (prurido).

O ponto ou pontos da picada nem sempre são visíveis. Hiperemia e

edema, quando presentes, são geralmente discretos. Na maioria dos casos, a

hiperemia se manifesta por um halo róseo em torno da picada; raramente é

bastante pronunciada, estendendo-se como mancha avermelhada ao redor do

ponto da inoculação do veneno, aumentando de intensidade da periferia para o

centro (Hering e cols., 1992).

Pode-se observar sudorese e alterações do equilíbrio térmico, assim

como piloereção local ou mesmo no membro atingido pela picada.

- Sinais e Sintomas Sistêmicos

Os pacientes, principalmente as crianças, podem se apresentar muito

agitados. Podem surgir tremores generalizados e, com o agravamento do

quadro, os doentes podem passar da agitação psicomotora ao quadro de

profundo torpor ou coma (Hering e cols., 1992).

A sudorese é um dos sintomas que chama bastante a atenção no

escorpionismo humano, pois ela pode variar dependendo do caso. Pode ser

leve, quase imperceptível, até se manifestar com grande intensidade, sob a

forma de sudorese fria, generalizada e abundante. Pode vir acompanhada de

alterações de temperatura corpórea, provocando geralmente hipotermia,

causando sensação de frio.

Sialorréia (hipersalivação) e lacrimejamento são, junto com a dor,

sintomas que aparecem muito precocemente. A salivação pode se muito

abundante, assim como podem surgir lágrimas sem que o paciente esteja

chorando.

Rinorréia (corrimento nasal), também de aparecimento precoce, pode

atingir grande intensidade nos casos mais graves. Tosses e espirros aparecem

com maior freqüência nos casos mais graves, representando a hipersecreção

traqueal e faringeana (Hering e cols., 1992).

A náusea aparece cedo, minutos após a picada, podendo variar na

intensidade e freqüência. Os vômitos podem ser muito discretos nos casos

mais leves e profusos, contínuos e incoercíveis, nos casos mais graves. A

intensidade das náuseas e principalmente dos vômitos está diretamente

relacionada com a gravidade do acidente.

Podem estar presentes hipertensão ou hipotensão e arritmias variadas.

Nos casos mais severos, insuficiência cardíaca e edema agudo de pulmão

podem fazer parte do quadro clínico (Hering e cols., 1992).

2.4 – Classificação Clínica e Tratamento Específico

De acordo com a intensidade dos sintomas apresentados pelos

pacientes picados, podemos classificar o escorpionismo humano em graus

crescentes de gravidade, agrupando-os em casos leves, moderados ou graves,

para fins de diagnóstico, orientação terapêutica e prognóstico (Tabela 1).

Tabela 1 – Acidentes escorpiônicos: classificação, manifestações clínicas

e tratamento

Tratamento Classificação Manifestações Clínicas

Específico Geral

Leves Somente presentes sinais

e sintomas locais.

Dor em 100% dos casos.

Combate à dor.

Observação em

ambiente hospitalar

por 6-12 horas.

Moderados Sintomatologia local e

alguns sintomas

sistêmicos tais como:

agitação, sonolência,

sudorese, náuseas,

poucos vômitos,

hipertensão arterial,

taquicardia e taquipnéia.

2 - 3 ampolas de 5

mL com potência

de 1 mg/mL

principalmente para

crianças até 7 anos

de idade.

Combate à dor.

Tratamento

sintomático.

Observação

durante 12-24

horas

Graves Sinais e sintomas locais e

sistêmicos.

Vômitos profusos e

freqüentes.

Náuseas, sialorréia,

lacrimejamento, sudorese

profusa, agitação,

alteração de temperatura,

taquicardia, hipertensão

arterial, taquipnéia,

tremores, espasmos

musculares, paralisias

até convulsão.

Pode evoluir para

bradicardia, bradpnéia,

edema pulmonar agudo,

colapso

cardiocirculatório, coma e

morte.

4 – 6 ampolas para

todos pacientes.

Combate à dor.

Internação

hospitalar com

cuidados

intensivos.

Tratamento

sintomático.

Monitorização e

manutenção das

funções vitais.

*Ministério da Saúde, 2001

A gravidade depende de fatores, como a espécie e tamanho do

escorpião, a quantidade de veneno inoculado, região da picada, a massa

corporal do acidentado e a sensibilidade do paciente ao veneno. Influem na

evolução o diagnóstico precoce, o tempo decorrido entre a picada e a

administração do soro e a manutenção das funções vitais (Ministério da Saúde,

2001).

O prognóstico geralmente é bom, principalmente nos acidentes de grau

leve e moderado. No escorpionismo grave, as primeiras 24 horas são críticas,

pois as complicações surgem dentro desse período, assim como a maioria dos

óbitos.

3 – Veneno, Estrutura das toxinas e Modo de Ação

3.1 – Veneno

O veneno dos escorpiões é o resultado da secreção de um par de

glândulas de origem tegumentar situadas no telson. Este tem forma bulbar que

termina no aguilhão responsável pela inoculação do veneno.

A peçonha pode ser obtida por masceração da glândula ou estimulação

elétrica do telson do animal. É uma substância mucosa, oplascente, com

aspecto leitoso e solúvel em água. Por centrifugação pode-se obter uma fração

insolúvel, que pode conter toxinas (Guarnieri e cols., 1998). A parte solúvel é

uma mistura complexa, composta de muitas proteínas básicas de baixo massa

molecular, aminoácidos livres, sais inorgânicos, lipídeos, aminas biogênicas e

nucleotídeos, sendo desprovido de atividade proteolítica, hemolítica,

colinesterásica, fosfolipásica e fibrinolítica (Zlotkin, 1978; Possani, 1984).

Alguns venenos possuem outras substâncias, como os das espécies T.

serrulatus, T. bahiensis e Palamneus gravimanus que contém uma proteína de

alto massa molecular com atividade hialuronidase (Diniz e Gonçalves, 1960;

Possani e cols., 1977; Wright e cols., 1977). Essa proteína pode contribuir para

toxicidade do veneno e ajudar a distribuir as toxinas pelos tecidos (Wright e

cols., 1977). A peçonha do Leirus quinquestriatus possui serotonina (Adam e

Weiss, 1958) e a do P. gravimanus tem histamina (Ismail e cols., 1975).

Vários pesquisadores se dedicaram ao estudo do mecanismo de ação

dos venenos de escorpião. Magalhaes (1928) acreditava ser a toxina

escorpiônica neurotrópica e neurotóxica, realizou grande número de

experiências animais, demonstrando ação do veneno de Tityus serrulatus

sobre os núcleos vagais, postulando que o processo de intoxicação deveria se

caracterizar por lesões bulbares.

Barros (1937, 1938) seguindo a mesma linha de investigação, verificou

em experiências animais que as lesões provocadas pelo veneno situavam-se

preferencialmente no bulbo, mesencéfalo e protuberância, o que explicaria as

alterações nos sistemas gastrointestinal, circulatório e respiratório.

No entanto, estudos posteriores demonstraram que os locais de ação

dos venenos escorpiônicos não deveriam estar localizados no sistema nervoso

central, visto que a maioria dos seus efeitos ainda era observada em animais

espinalectomizados e em órgãos isolados (Hering e cols., 1992).

Somente após Gomez e Diniz (1966) isolarem, a partir do veneno bruto

de T. serrulatus, uma fração purificada (tityustoxina), foi realizada uma série de

pesquisas sistemáticas levando à demonstração da natureza periférica das

ações das toxinas.

Atualmente está bem estabelecido que as toxinas de escorpião agem

em canais iônicos no sistema nervoso periférico liberando mediadores

químicos como acetilcolina e catecolaminas.

3.2 – Toxinas Escorpiônicas

As toxinas de escorpião são de natureza básica e de baixo massa

molecular. Elas são divididas em quatro famílias diferentes de acordo com a

sua especificidade de ligação aos canais iônicos: as que agem em canais de

(Rochat e cols., 1979; Catterall, 1980), canais de K

(Carbone e cols.,

1982; Possani e cols., 1982; Miller e cols., 1985), canais de Cl

(Debin e cols.,

1993) e canais de Ca

(Valdivia e Possani, 1998).

As toxinas encontradas nos venenos de escorpião são compostas por

duas principais populações de polipeptídeos. O primeiro inclui os pequenos

peptídeos (menores que 40 aminoácidos) que afetam os canais de potássio

(Miller e cols., 1985) e de cloro (Debin e cols., 1993), e o segundo consiste de

várias classes de toxinas longas (60-70 aminoácidos) que afetam os canais de

sódio (Zlotkin e cols., 1978; Rochat e cols., 1979). As toxinas que bloqueiam

canais de cálcio são um grupo muito heterogêneo, composto por toxinas de

cadeia tanto longa e quanto curta (Valdivia e cols., 1992; Chuang e cols., 1998;

Fajloun e cols., 2000; Mosbah e cols., 2000; Olamendi-Portugal e cols., 2002).

Embora não exista similaridade de seqüência entre as toxinas longas e

curtas, todas elas compartilham uma estrutura similar composta de uma ou

duas -hélice e 2 a 3 fitas folha  (Fontecilla-Camps, 1989; Miller e cols., 1985).

Essa estrutura contém um motivo -hélice estabilizado por cisteína (CSH), que

envolve Cys-X-X-Cys na -hélice ligado por duas pontes dissulfeto com Cys-X-

Cys na folha  (Kobayashi e cols., 1991) . Algumas toxinas que agem em

canais de cálcio apresentam o motivo ICK, “inibidor cystine knot”, (Zhu e cols.,

2003).

3.2.1 – Toxinas que agem nos canais de sódio

As primeiras toxinas a serem purificadas pertenciam a esse grupo

(Gómez e Diniz, 1966; Miranda e cols., 1970). As toxinas que agem em canais

de sódio são pequenos peptídeos de 58 a 76 resíduos de aminoácidos (6,5 a

8,5 kDa). Possuem estrutura comum com a topologia , com voltas

altamente variáveis conectando os principais elementos da estrutura

secundária. A estrutura central é firmemente empacotada por três pontes

dissulfeto conservadas e uma quarta que pode ter no mínimo três arranjos

diferentes (Rodriguez De La Vega e Possani, 2005).

Até agora já foram descritas 230 estruturas primárias de toxinas de

escorpião que agem em canais de sódio que foram purificadas de 40 espécies

(Zhijian e cols., 2006).

Essas toxinas são divididas em dois grupos de acordo com seus efeitos

farmacológicos e suas propriedades de ligação (Jover e cols., 1980; Couraud e

cols., 1982; Gordon e cols., 1998). As toxinas  são aquelas que lentificam ou

bloqueiam a inativação dos canais de sódio ligando-se no sítio 3 e as toxinas 

são aquelas que afetam a ativação dos canais e agem ligando-se no sítio 4.

Antigamente, achava-se que as toxinas  só eram encontradas em venenos

de escorpiões do Velho Mundo (Eurafrásia) e que as  só eram encontradas

em escorpiões do Novo Mundo (Américas). Mas hoje já se sabe que ambos os

tipos de toxinas podem ser encontrados tanto nos venenos dos escorpiões do

Novo Mundo quanto do Velho Mundo.

Na tentativa de entender melhor o modo de ação das toxinas ativas em

canais de sódio, vários autores subdividiram as toxinas alfa e beta de acordo

com o alvo de ação ou preferência filética, seqüência primária de aminoácidos,

estrutura das toxinas, características de ligação (Gordon e cols., 1998;

(Possani e cols., 1999; Froy e Gurevitz, 2003; Gordon e Gurevitz, 2003; De La

Vega e Possani, 2007).

A subdivisão mais usada para as toxinas  é a divisão em clássicas,

anti-inseto e tipo . Essa subdivisão leva em conta tanto preferência filética

como seqüência primária de aminoácidos (Figura 3). As toxinas alfa clássicas

são altamente ativas em mamíferos, tem pouca toxicidade para alguns insetos

e baixa afinidade por membranas neuronais de insetos (Aah 2, Lqh 2). As anti-

inseto tem alta toxicidade para alguns insetos, não compete com as toxinas

clássicas em sinaptossomas de cérebro de rato e exibem baixa toxicidade para

mamíferos quando injetadas intracerebroventricular (i.c.v), embora tenha alta

atividade por via subcutânea (LqhIT, Lqq 3). Já as toxinas tipo- mostram alta

toxicidade por injeção i.c.v em camundongos e ratos, enquanto baixa atividade

por via subcutânea, são moderadamente tóxicas para alguns insetos e elas

competem com as anti-inseto em membranas neuronais de inseto, mas não

competem com as clássicas em sinaptossomas de cérebro de rato (Lqh 3, Bom

3 e 4). Mas provavelmente, essas discrepâncias são devido às diferenças de

receptores envolvidos nesses ensaios (Rodríguez de la Veja & Possani, 2005).

Para classificarmos as toxinas de acordo com sua ação, é preciso testá-las nos

mesmos tipos de preparações.

Para as toxinas  a divisão mais comum compreende as clássicas, tipo-

Ts, anti-crustáceos, anti-insetos (depressoras e exitátorias). As clássicas são

toxinas ativas em mamíferos e são exclusivamente encontradas em escorpiões

do gênero Centruroides (Cn2, Css 2). As tipo-Ts são toxinas que tem alta

toxicidade tanto para mamíferos como para insetos e são encontradas em

escorpiões do gênero Tityus (Ts1, Tz1). As toxinas anti-crustáceos são aquelas

que são tóxicas para crustáceos e/ou insetos e são encontradas nos venenos

dos escorpiões do Novo Mundo (Cll 1, Cn 5, Cn 10). As toxinas depressoras e

exitátorias são especificas para insetos e são encontradas nos escorpiões do

Velho Mundo Setentrional. As toxinas depressoras (LqhIT 2, LqqIT 2) induzem

em insetos uma paralisia flácida com lenta depressão precedida por uma

pequena fase transitória de contração e produzem uma inibição da

excitabilidade devido à despolarização do axônio, e as exitátorias (AahIT, Bj-

xtrIT) induzem em insetos uma rápida excitação que leva a uma contração e

conseqüente paralisia e causa um disparo repetitivo nos axônios de baratas

acompanhado de uma pequena despolarização (Goudet e cols., 2002);

Rodríguez de la Vega & Possani, 2007).

Mas algumas toxinas não se enquadram corretamente em nenhuma

classe. A toxina Cn 11 do escorpião Centruroides noxius é uma toxina anti-

crustáceo, sua estrutura primária se assemelha com as toxinas , mas tem

similaridade de seqüência com as outras toxinas anti-crustáceo de apenas 40%

e com outras toxinas  similaridade entre 28-56%. Além disso, seu modo de

ação é diferente, ela não afeta o mecanismo de abertura do canal de sódio,

mas bloqueia a condutância dos íons Na

(Ramirez-Dominguez e cols., 2002).

Existem as toxinas que possuem seqüência típica de toxina , mas

atividade fisiológica tipo , como as toxinas CsE v1 e v3, Cn12, CsE V, TsIV e

TsTx V (Froy & Gurevitz, 2003; Bosmans & Tytgat, 2007). Ainda tem a toxina

AahSTR 1 que possui similaridade de seqüência com as toxinas  do Velho

Mundo, mas sua estrutura 3D assemelha-se as toxinas  do Novo Mundo (Froy

& Gurevitz, 2003). Outra toxina peculiar é a AahIT4, que compete tanto com as

toxinas  quanto com as  pelo sítio receptor em sinaptossomas de cérebro de

rato, mas é reconhecida apenas por anticorpos anti-toxina , Css2 (Loret e

cols., 1991). Temos ainda a birtoxina isolada do veneno do Parabuthus

trasvaalicus, que tem atividade tipo-, apenas 3 pontes dissulfeto e alta

similaridade com as toxinas  de Centruroides (Inceoglu e cols., 2001).

Vários peptídeos com estrutura típica de toxinas de cadeia longa

(toxinas que agem em canais de sódio) possuem efeitos divergentes e não se

enquadram nem como toxina  nem como . Kurtoxina (Chuang e cols., 1998;

Sidach e Mintz, 2002) e KL1 (Olamendi-Portugal e cols., 2002) modificam tanto

a ativação quanto à inativação de canais de cálcio, embora tenha um efeito-

típico em canais de sódio. Phaiodotoxina, um modulador de canais de sódio

isolado de um escorpião não-Buthide, afeta levemente o processo de abertura,

mas aumenta muito a “corrente de janela” de canais de sódio para/TipE da

mosca-da-fruta expressos em oócitos de Xenopus (Valdez-Cruz e cols., 2004).

BmKAngM1 bloqueia correntes de sódio e potássio dependentes de voltagem

em neurônios piramidais (Cao e cols., 2004). E mais impressionantes são as

toxinas BmP09 (Yao e cols., 2005) e KAaH1 (Srairi-Abid e cols., 2005) que

bloqueiam especificamente canais de potássio, apesar do fato de serem

estruturalmente mais semelhantes com as toxinas que afetam canais de sódio.

Portanto, é preciso mais estudos e uma padronização dos ensaios

farmacológicos e fisiológicos para o desenvolvimento de uma classificação

mais adequada para as toxinas que agem em canais de sódio.

Toxinas  clássicas

AaH II -VKDGYIVDDV-NCTYFCGR-----NAYCNEECTK--LKGESGYCQWASPYGNACYCYKLPDHVRTKGP-----GRCH

Lqq V -LKDGYIVDDK-NCTFFCGR-----NAYCNDECKK--KGGESGYCQWASPYGNACWCYKLPDRVSIKEK-----GRCN

Bot III -VKDGYIVDDR-NCTYFCGR-----NAYCNEECTK--LKGESGYCQWASPYGNACYCYKVPDHVRTKGP-----GRCN

Toxinas  anti-inseto

Lqq III -VRDAYIAKNY-NCVYECFR-----DSYCNDLCTK--NGASSGYCQWAGKYGNACWCYALPDNVPIRVP-----GKCH

LqhIT -VRDAYIAKNY-NCVYECFR-----DAYCNELCTK--NGASSGYCQWAGKYGNACWCYALPDNVPIRVP-----GKCR

Bot IT1 -VRDAYIAQNY-NCVYFCMK-----DDYCNDLCTK--NGASSGYCQWAGKYGNACWCYALPDNVPIRIP-----GKCHS

Toxinas tipo-

Bom III -GRDGYIAQPE-NCVYHCFP---G-SSGCDTLCKE--KGATSGHCGFLPGSGVACWCDNLPNKVPIVVG----GEKCH

Lqh III -VRDGYIAQPE-NCVYHCFP---G-SSGCDTLCKE--KGGTSGHCGFKVGHGLACWCNALPNDVGIIVE----GEKCHS

Toxinas ’ – tem seqüência de aminoácidos semelhante às toxinas  e modo de ação tipo 

CsEv1 -KEGYLVKKSD-GCKYDCFW--LGKNEHCNTECKAKNQGGSYGYCYA-----FACWCEGLPESTPTYPL-PN---KCS

CsEv2 -KEGYLVNKST-GCKYGCLK--LGENEGCDKECKAKNQGGSYGYCYA-----FACWCEGLPESTPTYPL-PN---KCSS

CsEv3 -KEGYLVKKSD-GCKYGCLK--LGENEGCDTECKAKNQGGSYGYCYA-----FACWCEGLPESTPTYPL-PN--KSC

Toxinas que tem estrutura semelhante às toxinas  e características farmacológicas tipo



CsE V -KKDGYPVDSG-NCKYECLK-----DDYCNDLCLE--RKADKGYCYWGK---VSCYCYGLPDNSPTKTS-----GKCNPA

Ts IV -KKDGYPVEYD-NCAYICWN---YDNAYCDKLCKD--KKADSGYCYWVH---ILCYCYGLPSDEPTKTN-----GKCKSGKK

TsTxV -KKDGYPVEGD-NCAFACFG---YDNAYCDKLCKD--KKADDGYCVWS----PDCYCYGLPEHILKEPTKTS--GRC

Toxinas  clássicas

Css II -KEGYLVSKST-GCKYECLK--LGDNDYCLRECKQQYGKSSGGYCYA-----FACWCTHLYEQAVVWPL-PNK--TCN

CsE I -KDGYLVEK-T-GCKKTCYK--LGENDFCNRECKWKHIGGSYGYCYG-----FGCYCEGLPDSTQTWPL-PNK--TC

Cn2 -KEGYLVDKNT-GCKYECLK--LGDNDYCLRECKQQYGKGAGGYCYA-----FACWCTHLYEQAIVWPL-PNK--RCS

Cn3 -KEGYLVELGT-GCKYECFK--LGDNDYCLRECKARYGKGAGGYCYA-----FGCWCTQLYEQAVVWPL-KNK--TCR

Toxinas  tipo Ts

Ts VII -KEGYLMDHE--GCKLSCFI---RPSGYCGRECGI--KKGSSGYCAW-----PACYCYGLPNWVKVWDRATN---KC

Tb 1 -KEGYLMDHE--GCKLSCFI---RPSGYCGSECKI--KKGSSGYCAW-----PACYCYGLPNWVKVWDRATN---KC

Tb 2 -KEGYAMDHE--GCKFSCFI---RPSGFCDGYCKT-HLKASSGYCAW-----PACYCYGVPSNIKVWDYATN---KC

Tst 1 -KEGYLMDHE--GCKLSCFI---RPSGYCGRECTL--KKGSSGYCAW-----PACYCYGLPNWVKVWDRATN---KC

Toxina com seqüência de aminoácidos semelhante às toxinas , mas estrutura 3D semelhante

as 

AaHSTR 1 --ARDGYIVHDTNCKYSCFG---SEYKYCGPLCE--KKKAKTGYCYL-----FACWCIEVPDEVRVWGE-DGF--MCWS

Toxina com 3 pontes dissulfeto e modo de ação tipo 

Birtoxina ADVPGNYPLDKDGNTYKCFL--LGGNEECLNVCKLHGV--QYGYCYASK-----CWCEYLEDDKDSV

Toxinas  anti-crustáceos e/ou anti-insetos

Cll 1 -KEGYLVNKST-GCKYGCFWL--GKNENCDKECKAKNQGGSYGYCYSF-----ACWCEGLPESTPTYPL--PNKS-CS

Cn 1 -KDGYLVDA-K-GCKKNCYKL--GKNDYCNRECRMKHRGGSYGYCYSF-----GCYCEGLSDSTPTWPL--PNKT-C

Cn 5 -KEGYLVNKST-GCKYGCLLL--GKNEGCDKECKAKNQGGSYGYCYAF-----GCWCEGLPESTPTYPL--PNKS-CS

Cn 10 -KEGYLVNKST-GCKYNCLIL--GENKNCDMECKAKNQGGSYGYCYKL-----ACWCEGLPESTPTYPI--PGKT-CRT

Toxina  anti-crustáceo com seqüência de aminoácidos semelhante as , mas modo de ação

diferente

Cn 11 -ARDGYPVDE-KGCKLSCLI----NDKWCNSACHSR--GGKYGYCYTG---GLACYCEAVPDNVKVWTY-ETN-T-C

Toxinas  depressoras

LqhIT 2 --DGYIKRRD--GCKVACLI---G-NEGCDKECKA--YGGSYGYCWTW---GLACWCEGLPDDKTWKSE--TN-T-CG

LqqIT 2 --DGYIRKRD--GCKLSCLF---G-NEGCNKECKS--YGGSYGYCWTWG---LACWCEGLPDEKTWKSE--TN-T-CG

BjIT 2 --DGYIRKKD--GCKVSCII---G-NEGCRKECVA--HGGSFGYCWTWG---LACWCENLPDAVTWKSS--TN-T-CG

BmK IT2 --DGYIKGKS--GCRVACLI---G-NQGCLKDCRA--YGASYGYCWTWG---LACWCEG-PDNKTWKSE--SN-T-CG

Toxinas  exitatórias

AaHIT 1 KKNGYAVDSS--GKAPECLL-----SNYCNNQCTK-VHYADKGYCCL-----LSCYCFGLNDDKKVLEISDTRKSYCDTTIIN

LqqIT 1 KKNGYAVDSS--GKAPECLL-----SNYCYNECTK-VHYADKGYCCL-----LSCYCFGLNDDKKVLEISDARKKYCDFVTIN

BjxtrIT KKNGYPLDRN--GKTTECSGVNAIAPHYCNSECTK-VYVAESGYCCW-----GACYCFGLEDDKPIGPMKDITKKYCDVQIIPS

BmK IT KKNGYAVDSS--GKVSECLL-----NNYCNINCTK-VYYATSGYCCL-----LSCYCFGLDDDKAVLKIKDATKSYCDVQIIN

Toxina que compete tanto com  quanto com ,mas só é reconhecida com anticorpos anti-

AaHIT 4 --EHGYLLNKYTGCKVWCVI----NNEECGYLCKRR--GGYYGYCYFWKL---ACYCQGARKSELWNY-K-TNK--CDL

Figura 3 – Toxinas que agem em canais de sódio. As cisteínas estão em

destaque.

3.2.2 – Toxinas que agem nos canais de potássio

A primeira toxina de escorpião que age em canais de potássio foi

identificada do veneno do escorpião Centruroides noxius e foi chamada de

noxiustoxina NTx (Possani e cols., 1982). Desde então, aproximadamente 140

estruturas primárias foram descritas (Rodriguez De La Vega & Possani, 2004).

As toxinas que agem em canais de potássio (KTx) são compostas de 20-

70 aminoácidos, mas a maioria tem menos que 40, possuem alta diversidade

de seqüência de aminoácidos e são compactadas por 3 ou 4 pontes dissulfeto.

A nomenclatura destas toxinas está bem consolidada e foi inicialmente

proposta por (Tytgat e cols., 1999). Ela se baseia no tamanho molecular,

localização de cisteínas e similaridade de suas estruturas primárias, sendo

assim as toxinas podem ser divididas em três famílias: -KTx, -KTx e -KTx

(Tytgat e cols., 1999). Recentemente, uma nova família de toxinas que agem

fracamente em canais de potássio foi identificada no veneno de escorpião e

foram designadas como -KTx (Nirthanan e cols., 2005). Essa classificação é

baseada mais na estrutura primária do que no perfil farmacológico, pois muitos

peptídeos não tiveram seus alvos farmacológicos definidos e somente alguns já

caracterizados possuem seletividade para somente um tipo de canal de

potássio (Goudet e cols., 2002).

A -KTx é uma família de toxinas de cadeia curta, que compreende a

maioria dos membros dos peptídeos de escorpião que agem em canais de

potássio e podem ser classificadas de acordo com sua estrutura primária em

19 subfamílias (Tytgat e cols., 1999; Wang e cols., 2000; Batista e cols., 2002;

Rodriguez De La Vega & Possani, 2004; Xu e cols., 2004; Olamendi-Portugal e

cols., 2005; Wang e cols., 2005). A divisão em subfamílias e alguns de seus

membros pode ser vista na Figura 4.

As -KTxs são compostas de 60-65 aminoácidos e são compactadas por

3 pontes dissulfeto. Essa família tem quatro membros: AaTxK, BmTxK,

BmTxK2 e TsTxK (Rogowski e cols., 1994; Legros e cols., 1996; Zhu e cols.,

1999). Somente TsTxK foi caracterizada farmacologicamente, as outras foram

isoladas através de clonagem molecular e pertencem a família -KTx baseado

nas estruturas primárias.

A toxina ErgTx, do Centruroides noxius, composta por 42 aminoácidos e

compactada por 3 pontes dissulfeto (Gurrola e cols., 1999) foi definida como -

KTx por causa de sua seqüência de aminoácidos e seu padrão de pontes

dissulfeto distintas. ErgTx pode bloquear especificamente canais de potássio

“delayed rectifier” em células musculares e nervosas e esses canais são

codificados por um gene humano homólogo ao gene “ether-a-go-go” de

Drosophila melanogaster (HERG) (Pardo-Lopez e cols., 2002). Esse gene foi

assim nomeado por William D. Kapla em 1960 porque drosófilas com mutações

neste gene quando anestesiadas com éter, mexiam suas pernas como as

dançarinas de strip-tease “Go Go Grils” de um famoso bar noturno de

Hollywood (www.en.wikipedia.org/wiki/HERG). Outras toxinas relacionadas

foram descritas (Korolkova e cols., 2001, 2002; Corona e cols., 2002).

As poucas toxinas de cadeia curta da família -KTx isoladas dos

venenos de Heterometrus fulvies, Heterometrus soubufer e Opisthacanthus

madagascariensis foram assim designadas por causa de sua nova estrutura

“bi-hélice” (Srinivasan e cols., 2002; Chagot e cols., 2005; Nirthanan e cols.,

2005).

-1.1 ChTx ---ZFTNVSCTTS-ECWSVCQRLHNTSRG-KCMN-KKCRCYS-- LqH

-1.3 IBTx ---ZFTDVDCSVSKECWSVCKDLFGVDRG-KCMG-KKCRCYQ-- Bt

-1.4 LbTx ---VFIDVSCSVSKECWAPCKAAVGTERG-KCMG-KKCRCY?-- Cl

-2.1 NTx ---TIINVKCTSPKQCSKPCKELYGSSAGAKCMN-GKCKCYNN- CnH

-2.2 MgTx ---TIINVKCTSPKQCLPPCKAQFGQSAGAKCMN-GKCKCYPH- Cm

-2.5 HgTX1 ---TVIDVKCTSPKQCLPPCKAQFGIRAGAKCMN-GKCKCYPH- Cl

-3.1 KTx --GVEINVKCSGSPQCLKPCKDA-GMRFG-KCMN-RKCHCTPK- Amm



-3.4 AgTx --GVPINVKCTGSPQCLKPCKDA-GMRFG-KCIN-GKCHCTPK- LqH

-3.6 BmKTx ---VGINVKCKHSGQCLKPCKDA-GMRFG-KCIN-GKCDCTPK- BmK

-4.1 TyK(TsII-9) ---VFINAKCRGSPECLPKCKEAIGKAAG-KCMN-GKCKCYP-- Ts

-4.2 Ts ---VVIGQRCYRSPDCYSACKKLVGKATG-KCTN-GRCDC---- Ts

-5.1 LeTxI (ScyTx) -------AFCN-LRMCQLSCRS-LGLL-G-KCIG-DKCECVKH- LqH

-5.2 PO5 -------TVCN-LRRCQLSCRS-LGLL-G-DCIG-VKCECVKH- Amm

-5.3 BmPO5 -------AVCN-LKRCQLSCRS-LGLL-G-KCIG-DKC

ECVKH- BmK

-6.1 Pi1 (PiTx-K) ------LVKCRGTSDCGRPCQQQTGCPNS-KCIN-RMCKCYG-C Pi

-6.2 MTx -------VSCTGSKECYAPCRKQTGCPNA-KCIN-KSCKCYG-C Sm

-6.3 HsTx1 -------ASCRTPKDCADPCRKETGCPYG-KCMN-RKCKCNR-C Hs

-7.1 Pi2 (PiTx-K) ------TISCTNPKQCYPHCKKETGYPNA-KCMN-RKCKCFGR- Pi

-7.2 Pi3 (PiTx-K) ------TISCTNEKQCYPHCKKETGYPNA-KCMN-RKCKCFGR- Pi

-8.1 P01 -------VS

C—--EDCPEHCSTQ---KAQAKCDN-DKCVCEPI- Amm

-8.2 BmP01 -------ATC---EDCPEHCATQ---NARAKCDN-DKCVCEPK- BmK

-8.3 LqII -------VSC---EDCPDHCSTQ---KARAKCDN-DKCVCEPI- LqH

-9.1 BmP02 -------VGC---EECPMHCKGK---NAKPTCDD-GVCNCNV-- BmK

-9.3 LpI -------VGC---EECPMHCKGK---NAKPTCDN-GVCNCNV-- LqH

-10.1 CoTx1 -------AVCV-YRTCDKDCKRRGY-RSG-KCIN-NACKCYPY- CnH

-10.2 CoTx2 -------VACV-YRTCDKDCTSRKY-RSG-KCIN-NACKCYPY- CnH

-11.1 PBTx1 --DEEPKES

CS-DEMCVIYCKGEEYSTGV--CDGPQKCKCSD-- Pt/Pv

-11.2 PBTx2 --DEEPKETCS-DEMCVIYCKGEEYSTGV--CDGPQKCKCSD-- Pt/Pv

-12.1 TsTxIV WCSTCLDLACGASRECYDPCFKAFGRAHG-KCMN-NKCRCYTN- Ts

-13.1 Tc1 --------ACG-S--CRKKCK-----GSG-KCIN-GRCKCY-- Tc

-13.2 OsK2 --------ACG-PG-CSGSCR--QKGDRI-KCIN-GSCHCYP- Os

-14.1 Bmkk1 ---TPFAIKCATDADCSRKCP---GNP-S--CRN-GFCACT-- BmK

-15.1 Aa1 --QNETNKKCQGGS-CASVCRRVIGVAAG-KCIN-GRC

VCYP- AaH

-15.2 BmTx3A --QVETNVKCQGGS-CASVCRKAIGVAAG-KCIN-GRCVCYP- BmK

-16.1 TmTX ---DLIDVKCISSQECWIACKKVTGRFEG-KCQN-RQCRCY-- Bt

-16.2 Martentoxina --FGLIDVKCFASSECWTACKKVTGSGQG-KCQN-NQCRCY-- Bm

-17.1 TXKs4 ------QTQCQSVRDCQQYCLT----PD--RCSY-GTCYCKTT Bm

-18.1 Tc32 ---TGPQTTCQAAM-CEAGCKGLGKSMES--CQGDT-CKCKA- Tc

-19.1 BmBKTx -------AACY-SSDCRVKCVA-MGFSSG-KCINSK-CKCYK- BmK

-1 TsTXK KLVALI-PNDQLRSILKAVVHKVAKTQFGCPAYEGYCNDHCNDIERKDGE

CHGFKCKCAKD

-2 AaTXK KLVKYAVPVGTLRTILQTVVHKVGKTQFGCPAYQGYCDDHCQDIKKEEGFCHGFKCKCGIPMGF

-3 BmTXK KNIKEK-LTEVKDKMKHSWNKLTSMSEYACPVIEKWCEDHCAA-KKAIGKCEDTECKCLKLRK

-4 BmTXK2 KLVKYAVPEGTLRTIIQTAVHKLGKTQFGCPAYQGYCDDHCQDIKKEEGFCHGFKCKCGIPMGF

-1.1 CnErg1 DRDSCVDKSRCAKYGYYQECQDCCKNAGHNGGTCMFFKCKCA

-1.2 CeErg1 -RDSCVDKSRCAKYGYYQECTDCCKKYGHNGGTCMFFKCKCA

-1.3 CgErg1 -RDSCVDKSRCAKYGHYQECTDCCKKYGHNGGTCMFFKCKCA

-1.4 CsErg1 -RDSCVDKSRCAKYGYYQECQDCCKKAGHNGGTCMFFKCKCA

-1.5 CllErg1 -RDSCVDKSRCSKYGYYQECQDCCKKAGHNGGTCMFFKCKCA

-1.6 CexErg1 -RDSCVDKSRCAKYGYYQECQDCCKKAGHSGGTCMFFKCKCA

-2.1 BeKm-1 PTDIKCSESYQ

CFPVCKSRFGKTNGRCVNGFCDCF

-3.1 CnErg2 -RDSCVNKSRCAKYGYYSQCEVCCKKAGHKGGTCDFFKCKCKV

-3.2 CeErg2 -RDSCVDKSRCAKYGYYQQCEICCKKAGHRGGTCEFFKCKCKV

-3.3 CsErg2 -RDSCVDKSRCAKYGYYGQCEVCCKKAGHRGGTCDFFKCKCKV

-3.4 CgErg2 -RDSCVDKSRCQKYGNYAQCTACCKKAGHNKGTCDFFKCKCT

-4.1 CllErg2 -RDSCVDKSKCSKYGYYGQCDECCKKAGDRAGNCVYFKCKCNP

-4.2 CnErg5 -RDSCVDKSKCGKYGYYQECQDCC

KNAGHNGGTCVYYKCKCNP

-4.3 CexErg2 -RDSCVDKSKCGKYGYYGQCDECCKKAGDRAGICEYYKCKCNP

-4.4 CexErg3 -RDSCVDKSKCAKYGYYYQCDECCKKAGDRAGTCEYFKCKCNP

-4.5 CexErg4 -RDSCVDKSQCAKYGYYYQCDECCKKAGDRAGTCEYFKCKCNP

-4.6 CllErg3 -RDSCVDKSKCSKYGYYGQCDKCCKKAGDRAGNCVYFKCKCNQ

-4.7 CllErg4 -RDSCVDKSKCAKYGYYGQCDECCKKAGDRAGNCVYLKCKCNQ

-4.8 CeErg3 -RDSCVDKSKCGKYGYYHQCDECCKKAGDRAGNCVYYKCK

CNP

-4.9 CsEErg3 -RDSCVDKSRCGKYGYYGQCDDCCKKAGDRAGTCVYYKCKCNP

-4.10 CsEErg4 -RDSCVDKSRCGKYGYYGQCDECCKKAGDRAGTCVYYKCKCNP

-4.11 CnErg4 -RDSCVDKSQCGKYGYYGQCDECCKKAGERVGTCVYYKCKCNP

-4.12 CsEErg1 -RDSCVEKSKCGKYGYYGQCDECCKKAGDRAGTCVYYKCKCNP

-4.13 CnErg3 -RDSCVDKSKCGKYGYYGQCDECCKKAGDRAGTCVYYKCKCNP

-5.1 CsEErg5 -RDSCVDKSRCAKYGYYGQCEVCCKKAGHNGGTCMFFKCMCVNSKMN

-5.1 CgErg5 -RDS

CVDKSRCQKYGPYGQCTDCCKKAGHTGGTCIYFKCKCGAESGR

k-1.1 HfTx1 -GHACY-RNCWREGNDEETCKERCd

k-1.2 HfTx2 -GHACY-RNCWREGNDEETCKERCG

Figura 4 – Toxinas que agem em canais de potássio. As cisteínas estão em

destaque. A primeira informação que vem antes das seqüências é família e o

número da toxina dentro da família. A segunda informação é o nome da toxina.

Após as seqüências das toxinas da família -KTx estão representadas as

abreviações dos nomes dos escorpiões.

3.2.3– Toxinas que agem nos canais de cloro

Toxinas que agem em canais de cloro são polipeptídeos de baixo massa

molecular, compostas por 35-38 aminoácidos e compactadas por 4 pontes

dissulfeto (Figura 5). A estrutura primária destas toxinas tem similaridade de

50-74% uma com as outras e a localização das cisteínas é conservada entre

elas. Até agora os membros das toxinas de escorpião que agem em canais de

cloro e peptídeos similares incluem: I1, Ammp2, I3, I4, I5, I5A, peptídeos IBs,

clorotoxina, Lqh-8/6, PBITx1, BmKCT, Bs8 e Bs14 (Tytgat e cols., 1998; Zeng e

cols., 2000a).

Seu membro mais notável é a clorotoxina com 36 aminoácidos,

purificada do veneno do escorpião Leiurus quinquestriatus quinquestriatus. Ela

pode bloquear canais de cloro em epitélio de camundongo e pode também se

ligar especificamente em canais de cloro em células gliais com efeitos

patológicos ligados a inibição da metástase (Zhijian e cols., 2006).

Clorotoxina MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCIGPQCLC-R

I1 MCMPCFTTRPDMAQQCRACCKGR--GKCFGPQCLCGYD

AmmP2 CGPCFTTDPYTESKCATCCGGR--GKCVGPQCLCNRI

I3 MCMPCFTTDHQTARRCRDCCGGRGR-KCFG-QCLCGYD

I4 MCMPCFTTDHNMAKKCRDCCGGN--GKCFGPQCLCNR

I5 MCMPCFTTDPNMANKCRDCCGG-GK-KCFGPQCLCNR

I5A MCMPCFTTDPNMAKKCRDCCGGN--GKCFGPQCLCNR

Lqh-8/6 RCSPCFTTDQQMTKKCYDCCGGKGKGKCYGPQCICAPY

BmKCT CGPCFTTDANMARKCRECCGGI--GKCFGPQCLCNRI

PBITX1 RCKPCFTTDPQMSKKCADxCGGx-Kx?

Bm12 CGPCFTTDANMARKCRECCGGI--GKCFGPQCKCNRI

Figura 5 – Toxinas que agem em canais de cloro. As cisteínas estão em

destaque.

3.2.4– Toxinas que agem nos canais de cálcio

Várias toxinas de escorpião específicas para canais de cálcio vêm sendo

isoladas: imperiotoxinas (IpTxA e IpTxi) do escorpião Pandinus imperator

(Valdivia & Possani, 1998) e maurocalcina (Mca) do escorpião Scorpion

maurus palmatus (Fajloun e cols., 2000), que ativam o receptor de rianodina

(Ryr), um canal de liberação de cálcio intracelular.

IpTxA e Mca são polipeptídeos de cadeia única ricos em aminoácidos

básicos, compostas de 33 aminoácidos e compactadas por três pontes

dissulfeto (Cys3-Cys17, Cys10-Cys21 e Cys16-Cys32), elas têm similaridade

de 82%. IpTxi é um heterodímero de 15 kDa com uma subunidade grande de

104 aminoácidos compactada por quatro pontes dissulfeto e covalentemente

ligada a uma subunidade pequena de 27 aminoácidos através da cisteína na

posição 100.

A nova toxina, Kurtoxina (KTX), do veneno do Parabuthus transvaalicus

se liga a canais de cálcio tipo T (subunidade 

) com alta afinidade e inibe o

canal por modificação na abertura dependente de voltagem. Kurtoxina também

interage com canais de sódio dependentes de voltagem e lentifica sua

inativação (Chuang e cols., 1998).

Em adição, as toxinas tipo-kurtotoxina I e II do escorpião Parabuthus

granulatus diminui a atividade de canais de cálcio do tipo-T em células

espermatogênicas de camundongo e inibe o AR (reação acrossômica) em

espermatozóides maduros (Lopez-Gonzalez e cols., 2003).

Recentemente, o comprimento total do cDNA codificador para

homólogos da Maurocalcina e IpTxA foi isolado do escorpião Opistophthalmus

carinatus, que é intimamente relacionado com os escorpiões Scorpion maurus

e Pandinus imperator, todos pertencentes à família Scorpionidae (Zhu e cols.,

2003). Os peptídeos maduros deduzidos da seqüência de cDNA compreendem

33 resíduos de aminoácidos e foram nomeados como Opicalcinas, que dividem

alto grau de homologia com Maurocalcina e IpTxA (91 e 88%,

respectivamente).

Mosbah e cols. (2000) mostraram que maurocalcina e IpTx A adotam o

motivo ICK (“inhibitory cystine knot”). Esse motivo conservado

evolucionalmente é compartilhado por um grande grupo de polipeptídeos com

diferentes seqüências e diversas bioatividades. Embora encontrado em vários

filos (animal, planta, fungo), peptídeos ICK são mais freqüentes em venenos de

caramujo marinho e aranhas. O motivo ICK é composto por três fitas

antiparalelas folha  estabilizadas por pontes de cisteína e com muitas voltas

(Norton & Pallaghy, 1998; Craik & Daly, 2005). Zhu e cols. (2003)

demonstraram que Opicalcina 1 e 2 também adotam essa estrutura.

Em contraste, duas toxinas do escorpião Buthus martensi Karsch, BmK

AS e BmK AS1, que são dois polipeptídeos de 66 aminoácidos compactado por

quatro pontes dissulfeto com 86,3% de identidade entre elas, tem ação em

receptores de rianodina (Ji e cols., 1997, 1999) e são capazes de inibir

correntes de sódio em células NG108-15 (Wu e cols., 2001) e deprimem

correntes de sódio resistentes e sensíveis a tetrodotoxina em pequenos

neurônios DRG de ratos (Tan e cols., 2001). Essas toxinas revelam pouca

similaridade com outras tipos conhecidos de toxinas de escorpião, tem

somente alta similaridade de seqüência com uma toxina anti-inseto isolada do

escorpião Androctonus australis Hector, AaH IT4, ativa em canais de sódio

(Loret e cols., 1991). BmK AS e AS1 não são tóxicas para mamíferos e tem

fraca toxicidade para insetos. Goudet e cols. (2002) sugerem que BmK AS e

AS1 e AaH IT 4 formem uma nova família de toxinas inseticidas de escorpião.

A família das toxinas que agem em canais de cálcio é muito

heterogênea, na Figura 6 podemos notar a diferença de seqüência de

aminoácidos, quantidade de pontes dissulfetos, tamanho e estrutura.

IpTxi

Subunidade maior

MHTPKHAIQRISKEEMEFFEGRCERMGEADETMWGTKWCGSGNEATDISELGYWSNLDSCCRTHDHCDNI

PSGQTKYGLTNEGKYTMMNCKCETAFEQCLRNVTGGMEGPAAGFVRKTYFDLYGNGCYNVQCPSQRRLAR

Subunidade menor

SEECPDGVATYTGEAGYGAWAINKLNG

IpTxA GDCLPHLKRCKADN-DCCGKKCKRRGTNAEKRCR

Maurocalcina GDCLPHLKLCK-ENKDCCSKKCKRRGTNIEKRCR

Opicalcina 1 GDCLPHLKRCK-ENNDCCSKKCKRRGTNPEKKCR

BmKASI AS

DNGYLLDKYTGCKVWCVINNESCNSECKIRGGYYGYCYFWKLACFCQGARKSELWNYNTNKCNGKL

BmKAS1 DNGYLLNKYTGCKIWCVINNESCNSECKLRRGNYGYCYFWKLACYCEGAPKSELWAYETNKCNGKM

KTX KIDGYPVDYWNCKRICWYNNKYCNDLCKGLKADSGYCWGWTLSCYCQGLPDNARIKRSG-RCRA

KTX-like I KIDGYPVDNWNCKRICWYNNKYCYDLCKGLKADSGYCWGWTLSCYCEGLPDNARIKRGG-RCN

KTX-like II KIDGYPVDYWNCKRICWYNNKYCNDLCKGLKADSGYCWGWTLSCYCQGLPDNARIKRSG-RCRA

Figura 6 – Toxinas que agem em canais de cálcio. As cisteínas estão em

destaque.

3.2.5– Peptídeos sem pontes dissulfeto

Comparando com as toxinas ricas em pontes dissulfeto, os peptídeos

sem pontes dissulfeto são um novo tipo de polipeptídeos bioativos. Elas variam

de tamanho entre 13-50 aminoácidos e compartilham baixos graus de

similaridade (Luo e cols., 2005; Zeng e cols., 2005b). Até o momento,

aproximadamente 26 peptídeos foram descritos: peptídeo T do Tityus

serrulatus (Ferreira e cols., 1993), peptídeo K12 do Buthus occitanus (Meki e

cols., 1995), Bs10 do Buthus sindicus (Ali e cols., 1998), pandinina 1 e 2 do

Pandinus imperator (Corzo e cols., 2001), Hadrurina do Hadrurus aztecus

(Torres-Larios e cols., 2000), IsCT e IsCT2 do Opisthacanthus

madagascariensis (Dai e cols., 2001, 2002), parabutoporina do Parabuthus

schlechteri (Verdonck e cols., 2000), opistoporina 1 e 2 do Opistophtalmus

carinatus (Moerman e cols., 2002), BmKbpp, BmKn1, BmKn2, BmKa1, Bmka2

e BmKb1 do Buthus martensii Karsch (Zeng e cols., 2000b, 2001, 2004),

Tco36.14-2, clones 4-10 do Tityus costatus (Diego-Garcia e cols., 2005).

Funcionalmente, os peptídeos de escorpião sem pontes dissulfeto são

envolvidos na potenciação da bradicinina, poder antimicrobiano, iniciação da

sinalização molecular da célula, modulação imune e muitas outras ações.

3.3 – Toxinas do Tityus serrulatus e sua nomenclatura

3.3.1 – Toxinas que agem em canais de sódio

A primeira purificação do veneno do Tityus serrulatus foi feita em 1966

por Gomez e Diniz. Eles combinaram gel filtração (Sephadex G-25) com

cromatografia de troca iônica (CM-52). Na primeira purificação, obtiveram

quatro picos, sendo que dois não eram tóxicos e dois eram. O segundo pico

tóxico (T

) foi recromatografado em coluna CM-52 e obtiveram somente um

pico após eluição com acetato de amônia 0,15 M. Esse pico se apresentou

homogêneo em eletroforese de papel. Esse componente tóxico foi chamado

posteriormente de “Tityustoxina”.

“Tityustoxina” foi então parcialmente caracterizada por Gomez (1967) e

isolada por Coutinho-Netto (1975) usando uma metodologia um pouco diferente

(Sephadex G-50 e CM-52). Ele a chamou de TsTx (sem aspas) e caracterizou-

a como uma proteína básica com ponto isoelétrico de 8,25, tendo apenas uma

cadeia polipeptídica e 61 resíduos de aminoácidos.

Depois disso vários pesquisadores dedicaram seus trabalhos na

caracterização dessa proteína. Os principais efeitos encontrados foram

liberação de acetilcolina e outros neurotransmissores, supersensibilização pré-

e pós-juncional, despolarização de membranas pré- e pós-sinápticas,

potencialização do influxo do íon sódio, ativação de canais de sódio

dependentes de voltagem (Gomez e cols., 1973; Diniz e cols., 1974; Warnick e

cols., 1976; Drumond e cols., 1995; Gomez e cols., 1995). Kirsch e cols. (1989)

através de estudos dos efeitos de TsTx em correntes de sódio em células e

canal único determinaram que esta toxina pertence à classe das toxinas .

Estudos subseqüentes do veneno do T. serrulatus realizados por Toledo

e Neves (1976) resultou na purificação de duas novas toxinas, nomeadas de

tityustoxina I, com N-terminal começando com lisina e massa molecular de

6932, e tityustoxina II, com glicina N-terminal e massa molecular de 8580.

O grupo do pesquisador Possani começou seus estudos com

fracionamento do veneno do T. serrulatus em 1977, isolando 5 proteínas

tóxicas. Uma delas, com massa molecular de 7000, 62 resíduos de

aminoácidos e lisina N-terminal foi chamada de toxina  e seus vinte e nove

primeiros aminoácidos foram seqüenciados. Em 1981, eles isolaram 10

componentes, sendo quatro purificados e parcialmente seqüenciados (Possani

e cols., 1981).

A toxina gama foi purificada por outros grupos e foi alvo de diversos

trabalhos que objetivaram determinar suas funções farmacológicas. Em 1982,

Barhanin e cols. através de ensaios de ligação em sinaptossomas mostraram

que toxina gama somente compete com toxinas do tipo . Esse resultado foi

comprovado por Yatani e cols. (1988) que verificaram que a toxina  afetava o

pico de permeabilidade do sódio em células cardíacas de maneira simalar às

toxinas . Outros trabalhos mostraram que esta toxina é capaz de liberar

diversos neurotransmissores em muitos órgãos (Sampaio e cols., 1983;

Drumond e cols., 1995). Foi mostrado também que toxina gama se liga com

alta afinidade tanto a canais de sódio de mamíferos (Barhanin e cols., 1984;

Lombet e Lazdunski, 1984; Vijverberg e cols., 1984) quanto nos canais de

sódio de insetos (Martin-Eauclaire e cols., 1985; Pauron e cols., 1985; De Lima

e cols., 1986, 1988, 1989).

A partir daí vários grupos de pesquisadores começaram a fracionar o

veneno deste escorpião por diferentes metodologias em busca de novas

toxinas. Na tabela 2, está resumido os principais trabalhos e as toxinas

isoladas,nas décadas de 60 a 80.

Tabela 2 - Principais trabalhos de purificação de toxinas do veneno do T. serrulatus, nas décadas de 60 a 80.

Pesquisadores Ano

Método de

purificação

Número de

Toxinas

Purificadas

Toxinas

Caracterizadas

Ações

das

Toxinas

Gomez e Diniz 1966

Sephadex G-25 e Celulose

CM-52

2 frações não tóxicas e 2

tóxicas

Tityustoxina

8,6g/20g

i.p.

Coutinho Netto 1975

Sephadex G-50 e Celulose

CM-52

TsTx

Seqüência parcial

Toledo e Neves 1976

Sephadex G-50 e Celulose

CM-52

2 toxinas

TsTx-I

PM 6932 e K N-terminal

TsTx-II

PM 8580 e G N-terminal

Possani e cols. 1977

Sephadex G-50 e Celulose

CM-52

5 toxinas

Gama Seq. Parcial

PM 7000 62 aa

Possani e cols. 1981

Sephadex G-50 e Celulose

CM-52 (2x pH 4,7 e 6)

10 toxinas

Frações I-IV

Subfrações

II 1-11

III 1-10

IV 1-8

tóxicas

II, III, IV

II 9-11

III 7-8

IV 5,6,8

II-11 e III-10=

II-11, III-10, III-8 e IV-5 seq. parciais

Sampaio e cols. 1983

Sephadex G-25 e Celulose

CM-52

2 Frações não tóxicas e 2

tóxicas

T1 → 8 ptns

T2 → 4 ptns

III 63aa PM 7216 s. parcial

VIII 61aa PM 6675 s.p.

72aa PM 7549 s.p.

45aa PM 5188 s.p.

IV = T

VIII

VIII em vaso deferente de

cobaio causa contração

espontânea e sensibilização

pré-juncional

Martin-Eauclaire

e cols.

1985 - 8 toxinas

5  (sítio 4)e 3  (sítio 3)

Canais de sódio

Arantes e cols. 1989 Celulose CM-52

8 frações I-VIII

subfrações

IX (5 toxinas)

X (4 toxinas)

XIII = T

VIII

= T

III

e X

= III-8

→ TsTx-IV

61aa PM 6885

Como nas décadas de 60 a 80 o seqüênciamento de proteínas era uma

técnica de difícil acesso, várias toxinas foram purificadas, mas poucas foram

seqüenciadas completamente ou parcialmente. Além disso, apenas algumas

foram caracterizadas, isso gerou uma grande confusão com relação à

nomenclatura das toxinas do escorpião T. serrulatus. Os maiores problemas

estão relacionados com os nomes das duas principais toxinas do veneno do

Tityus serrulatus, inicialmente chamadas de tityustoxina (toxina ) e toxina

gama (toxina ).

A toxina- foi nomeada pelos diversos grupos de pesquisadores que a

purificaram de TsTx, TsIV-5, TsIV, T

III

e X

(Tabelas 2 e 3). Pelos trabalhos de

Sampaio e cols. (1983) e Arantes e cols. (1989), TsTx, T

III

e X

são a mesma

toxina, mas elas não foram seqüenciadas, então eles se baseiam em suas

características químicas e farmacológicas. E entre TsIV-5 e TsIV (que foram

seqüenciadas) existe apenas uma diferença, a última possui extremidade C-

terminal amidada.

Mas Arantes e cols. (1992), levantaram uma questão importante com

relação a Tityustoxina. De acordo com eles, a expressão “Tityustoxina” foi

usada no passado por vários autores, que em regra, se referiam ao trabalho

inicial de Gomez e Diniz (1966). Mas na década de 90, esse nome designava

pelo menos três entidades: 1) fração tóxica reportada por Gomez e Diniz, nome

usado como “TsTx”, 2) neurotoxina TsTx (sem aspas) isolada por Coutinho

Netto (1975) e 3) fração T1 da cromatografia em gel filtração da primeira

purificação de Gomez e Diniz (Freire-Maia e cols., 1974; Almeida e cols., 1982;

Novaes e cols., 1982; Azevedo e cols., 1983).

Arantes e cols. (1992) repetiram os procedimentos metodológicos de

Gomez e Diniz para purificar “TsTx” e verificaram que a fração T2, que origina a

“TsTx”, desdobrou-se em 4 picos, ao invés de um, como inicialmente descrito. E

em gel de poliacrilamida a fração T2 mostrou-se muito heterogênea, assim

como os 4 picos eluídos com 0,15M de acetado de amônia (concentração que

“TsTx” foi eluída). Os autores concluíram que “TsTx” é uma mistura de proteínas

e que TsTx é um componente dessa mistura encontrado em pequena

quantidade. De acordo com suas características farmacológicas, parece certo

afirmar que TsTx (sem aspas), TsIV e TsIV-5 são a mesma toxina (Martin-

Eauclaire e cols., 1994). TsIV e TsIV-5 já tiveram suas seqüências de

aminoácidos e nucleotídeos determinada e realmente são a mesma toxina

(Martin-Eauclairee cols., 1994; Corona e cols., 1996), mas TsTx não tem a

seqüência de aminoácidos completa, então não é possível afirmar com certeza.

Com relação à toxina-, o problema começou com a purificação da

TsTx-I, realizada por Toledo e Neves (1976). Pois nesse trabalho foi

determinado apenas seu massa molecular e seu primeiro resíduo de

aminoácido N-Terminal, sendo assim, outros pesquisadores purificaram essa

toxina e a nomearam diferentemente: gama (Possani e cols., 1977),

VIII

(Sampaio e cols., 1983), TsVII (Bechis e cols., 1984) e XIII (Arantes e cols.,

1989). Mas hoje se sabe que todas elas são a mesma proteína (Arantes e

cols., 1992), existe uma pequena diferença entre a gama e a TsVII, a última

apresenta a cisteína C-Terminal amidada.

Outras toxinas também foram nomeadas de maneira diferente de acordo

com o grupo de pesquisadores que as purificaram, mas agora com a facilidade

do seqüênciamento de proteínas, clonagem e seqüênciamento de DNA, foi

possível determinar quais as toxinas eram iguais, mas com nomes diferentes

(Tabela 3).

Alguns grupos de pesquisadores estão propondo nomenclaturas para

essas toxinas (Sampaio e cols., 1991; Becerril e cols., 1997). Na tabela abaixo,

está descrita a nomenclatura que Sampaio e cols. (1991) sugerem; mas eles

não fazem distinção entre toxinas que possuem alvo de ação diferente. Neste

trabalho vamos adotar a nome que a toxina recebeu a primeira vez que foi

descrita. Sendo assim, a toxina  vai ser chamada de TsTx e a principal toxina

 vai ser chamada de TsTx-.

Tabela 3 – Uniformização dos nomes das toxinas de T. serrulatus

Toxinas Outros nomes Canal de ação

TsTx

“TsTx” (Gomez e Diniz, 1966)

TsTx (Coutinho Netto, 1975)

TsIV-5 (Possani e cols., 1981)

III

(Sampaio e cols., 1983)

(Arantes e cols., 1989)

TsIV (Martin-Eauclaire e cols., 1994)

sódio

TsTx- TsTx- (Toledo e Neves, 1976)

Gama (Possani e cols., 1981)

VIII (Sampaio e cols., 1983)

TsVII (Bechis e cols., 1984)

XIII (Arantes e cols., 1989)

sódio

TsTx- TsTx- (Toledo e Neves, 1976)

(Sampaio e cols., 1983)

(possivelmente sódio)

TsTx-

IV (Sampaio e cols., 1983)

TsIII-8 (Possani e cols., 1985)

TsII (Mansuelle e cols., 1992)

sódio

TsTx-IV

(Arantes e cols., 1989)

TsTx-IV (Novello e cols., 1999)

potássio

TsTx-V

(Arantes e cols., 1989)

(Arantes e cols., 1994)

sódio

TsTx-VI

CM I S

(Sampaio e cols., 1997)

TsTx-VI (Maragoni e cols., 1990)

TsTx-VII

CM I S

III

(Sampaio e cols.,1997) potássio ou cálcio

A partir de 1984, vários grupos conseguiram determinar a seqüência

completa de aminoácidos das principais toxinas do veneno do Tityus serrulatus:

TsTx- (Bechis e cols., 1984; Possani e cols., 1985), TsTx-

VI (Maragoni e

cols., 1990), TsTx- (Mansuelle e cols., 1992) e TsTx (Martin-Eauclaire e

cols., 1994). A seqüência de aminoácidos das toxinas de Tityus serrulatus que

agem em canais de sódio já descritas podem ser vistas na Figura 7.

TsTx KKDGYPVEYDNCAYICWNYDNAYCDKLCKDKKAD-SGYCYWVHILCYCYGLPDS-EP--TK-TNGKC

TsTx-I -KEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKG-SSGYCAWPA--CYCYGLPNWVKVWDR-ATN-KC

TsTx-II GHPGK...

TsTx-III –KEGYAMDHEGCKSFCFIRPAGFCDGYCKTHLKASSGYCAWPA--CYCYGVPDHIKVWDDYATN-KC

TsTx-V KKDGYPVEGDNCAFACFGYDNAYCDKLCKDKKADD-GYCVWSPD-CYCYGLPEHILKEPTK-TSGRC

TsTx-VI GREGYPADSKGCKITCFLTAAGYCNTECTLKKG-SSGYCAWPA--CYCYGLPESVKIW-TSETN-KC

TsTx-VII GHZGYGS...

Figura 7 – Toxinas do veneno do T. serrulatus que agem em canais de

sódio. As cisteínas estão em destaque.

Com o advento da Biologia Molecular, as duas principais toxinas do

veneno foram clonadas e tiveram seu gene amplificado do DNA genômico.

TsTx- é sintetizada como um precursor de 252 pares de base

codificando para 84 aminoácidos, dos quais 20 pertencem ao peptídeo sinal,

este e os últimos 3 resíduos C-terminais são removidos pós-traducionalmente

(Martin-Eauclaire e cols., 1992). Seu gene indica a presença de um intron de

475 pb que interrompe a região codificadora do peptídeo sinal do precursor,

ficando o primeiro exon (55 pb) separado do segundo exon (260 pb) (Becerril e

cols., 1993). A Figura 8 mostra o cDNA e o gene amplificado da TsTx-.

TsTx tem características semelhantes: precursor de 357 pb codificando

80 aminoácidos, sendo que 13 correspondem ao peptídeo sinal (que não está

completo), os 3 últimos resíduos sofrem processamento e são retirados (Figura

9). Uma diferença encontrada é que os autores purificaram 2 outras toxinas

muito similares a TsTx e seus resultados suportam a idéia de processamento

diferencial da região C-terminal do seu precursor (Martin-Eauclaire e cols.,

1994); o que pode explicar os problemas encontrados na purificação desta

toxina. Seu gene possui uma organização similar ao da TsTX-: dois exons

(28pb e 284pb) interrompidos por um intron (347 pb) (Corona e cols., 1996).

Essa organização já foi reportada para outras toxinas, como AaH I (Delabre e

cols., 1995) e KTx

(Laraba-Djebari e cols., 1994).

Figura 8 – Seqüências do cDNA e DNA genômico da TsTx-I. Em A,

seqüência de nucleotídeos do cDNA que codifica o precursor da TsTx-I, o

peptídeo sinal está sublinhado, o stop códon está designado com um asterisco.

Figura retirada do artigo de Martin-Eauclaire e cols., 1992. Em B, seqüência de

nucleotídeos do DNA genômico que codifica o precursor da TsTx-I, o peptídeo

sinal está sublinhado, o intron está em letra minúscula. Figura retirada do artigo

de Becherril e cols., 1993.

Figura 9 – Seqüências do cDNA e DNA genômico da TsTx. Em A,

seqüência de nucleotídeos do cDNA que codifica o precursor da TsTx, o

peptídeo sinal está sublinhado, o stop códon está designado com um asterisco.

Figura retirada do artigo de Martin-Eauclaire e cols., 1994. Em B, seqüência de

nucleotídeos do DNA genômico que codifica o precursor da TsTx, o peptídeo

sinal está sublinhado, o intron está em letra minúscula. Figura retirada do artigo

de Corona e cols., 1996.

3.3.2 – Toxinas que agem em canais de potássio

As toxinas que agem em canais de potássio começaram a serem

purificadas e descritas um pouco mais tarde do que as que agem em canais de

sódio. A primeira toxina descrita foi noxiustoxina (NTx) purificada do veneno do

escorpião Centruroides noxius (Carbone e cols., 1982). Neste mesmo ano,

duas toxinas homólogas a NTx foram purificadas do veneno do Tityus

serrulatus, e elas foram capazes de inibir corrente de K

em axônio gigante de

lula, mesma preparação testada para NTx (Possani e cols., 1982, 1985). Elas

foram chamadas de Ts II-9 e Ts II-10.2 e seus nucleotídeos foram parcialmente

seqüenciadas.

Em 1991, Blaustein e cols. testaram 5 venenos de escorpiões do Velho

Mundo e 2 do Novo Mundo quanto a sua capacidade de bloquear canais de K

ativados por Ca

, abertos por voltagem que não possuem a fase de inativação

(abertos  fechados) e que possuem fase de inativação (inativados  abertos

 fechados  inativados), que são também chamados de tipo-A. Eles

isolaram 5 componentes do veneno do T. serrulatus que bloqueavam a

atividade de canais de K. Quatro destes foram estudos com detalhes e

mostraram ter ação bloqueadora seletiva para canais de K “delayed rectifier”

em sinaptossomas de cérebro de rato. Eles também observaram que essas

toxinas não tinham ação em canais de K tipo-A. O peptídeo mais ativo tinha

massa molecular de 3900, assemelhando-se com as outras toxinas que agem

em canais de K. Também foi determinado o massa molecular de outro

peptídeo, como sendo de 8160, tamanho não usual para esse tipo de toxina,

sendo assim, deve ser um membro de uma nova classe estrutural de toxinas

bloqueadores de canais de K.

Em 1993, o mesmo grupo de pesquisadores (Werkman e cols. 1993)

investigaram a interação de TsTx k com -DTX (dendrototoxina - toxina de

serpente) em K

1.2 (canal de potássio dependente de voltagem) e verificaram

que as 2 toxinas devem se ligar em sítios intimamente relacionados. Rogowski

e cols. (1994) purificaram 2 peptídeos diferentes e os denominaram de TsTx

k (pequeno peptídeo) e de TsTx k (peptídeo grande).

Os autores verificaram

que as duas toxinas agem em canais de K não-inativadores, enquanto -DTx e

ChTx agem nos inativadores. TsTx k e ChTx, mas não TsTx k, deslocam -

DTx-I

125

do seu sítio de ligação em sinaptossomas de cérebro de rato. Mas as

três toxinas não compartilham o mesmo sítio. Mais tarde, Rodrigues e cols.

(2003) mostram que TsTx k também age em canais K

1.3 expressos em 2

sistemas: oócito de Xenopus e células de mamíferos.

Quanto à toxina TsTx k, Legros e cols. (1998) após clonar o cDNA

desta toxina e de uma toxina homóloga do veneno do escorpião Androctonus

australis, sugeriu que uma nova classe de toxinas ativas em canais de potássio

fosse criada (-KTxs). Essas toxinas possuem cadeia longa, 60 (TsTx k) e 64

(AaTx k) resíduos de aminoácidos, seus genes possuem peptídeo sinal, um

pequeno pro-peptídeo e não possuem intron. Esta característica é

compartilhada com as defensinas (proteínas da hemolinfa de escorpiões), que

possuem 40% de similaridade de seqüência de aminoácidos com estas toxinas

de cadeia longa. Através de uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno do

Buthus martensis, duas toxinas de cadeia longa bloqueadoras de canais de K

foram descritas, BmTxK com 61 aminoácidos e BmTxK2 com 64 (Zhu e

cols., 1999). Os genes destas duas toxinas também têm peptídeo sinal, um

pequeno pro-peptídeo e não possuem intron.

Após a descoberta da TsTx k e TsTx k no veneno do Tityus

serrulatus, outras toxinas que também eram bloqueadoras de canais de

potássio foram descritas. Legros e colaboradores (1996) purificaram e

caracterizaram uma nova toxina ligante do sítio de ligação da apamina em

sinaptossomas de cérebro de rato, a Ts , uma proteína com 35 resíduos de

aminoácido e 3 pontes dissulfeto. Ela age em canais de K ativados por Ca

, de

baixa condutância (SK

). Sua estrutura tridimensional foi determinada pela

técnica de ressonância magnética nuclear (NMR), mostrando a existência de

uma pequena -hélice (14-20) e 3 fitas de folha  (2-3, 27-29 e 32-34) (Blanc e

cols., 1997). Ts  adota a conformação clássica CS das toxinas de

escorpião, mas o motivo estrutural é menor e sua arquitetura é mais similar às

toxinas bloqueadoras de canais de K dependentes de voltagem. Lecomte e

cols. (1999) sintetizaram quimicamente a Ts  para identificar os pares de

cisteínas (C1-C4, C2-C5 e C3-C6) e verificaram que os pares tinham a

conformação típica para as toxinas de cadeia pequena.

Outra nova toxina foi purificada e sua seqüência de aminoácidos

determinada (Novello e cols., 1999). A TsTx-IV tem 41 aminoácidos, massa

molecular de 4520 Da e 4 pontes dissulfeto. Ela é capaz de bloquear canais de

K ativados por Ca

de alta condutância (BK

) e apresenta alta similaridade de

seqüência primária com NTx (subfamília 2 – 68%), KTx (subfamília 2 – 65%) e

Pi4 (subfamília 2 – 62%).

Em 2000, a Butantoxina foi purificada do veneno de 3 escorpiões: Tityus

serrulatus, T. bahiensis e T. stigmurus (Holaday e cols., 2000). Essa toxina

bloqueia reversivelmente canais Shaker B e inibe a proliferação de linfócitos T

e produção de interleucina 2 de células T helper estimulados por antígeno. Sua

estrutura tridimensional também foi determinada: 40 resíduos de aminoácidos,

4 pontes dissulfeto (2-5, 10-31, 16-36 e 20-38), -hélice (15-23), 2 fitas de folha

 (29-32 e 35-38) e uma pseudo-fita (5-9). Os autores concluíram que

Butantoxina e TsTx-IV (descrita no trabalho de Novello e cols., 1999) eram a

mesma toxina.

Na figura abaixo, estão as seqüências de aminoácidos de todas as

toxinas bloqueadoras de canais de potássio do T. serrulatus descritas até o

momento. Podemos ver que a posição das cisteínas é mantida em todas as

toxinas.

TsTx k (-4.1) VFINAKCRGSPE-CLPKCKEAIGKAAGKCMNGKCKCYP

Ts II-9 VFINAKCRGSPE-CLPKCKEAIGKAAGKCMN...

Ts II-10.2 TFIDVKCGSSKE-CLP...

Ts  (-4.2) VVIGQRCYRSPD-CYSACKKLVGKATGKCTNGRCDC

TsTx-IV (-12.1) WCSTCLDLACGASRE-CYDPCFKAFGRAHGKCMNNKCRCYTN

Butantoxina WCSTCLDLACGASRE-CYDPCFKAFGRAHGKCMNNKCRCYT

TsTx k (-1)

KLVALIPNDQLRSILKAVVHKVAKTQFGCPAYEGYCNDHC-NDIERKDGECHGFKCKCAKD

Figura 10 – Toxinas do veneno do T. serrulatus que agem em canais de

potássio. As cisteínas estão em destaque.

4 – Os avanços na Soroterapia

São Paulo foi uma das primeiras cidades brasileiras a terem problemas

com acidentes escorpiônicos. Sendo assim, os primeiros estudos sobre

envenenamento por escorpiões no Brasil foram feitos no Instituto Butantan, por

Vital-Brazil (1919). Alguns anos antes, Maurano (1915) imunizou o primeiro

cavalo com o veneno do escorpião Tityus bahiensis, o mais encontrado em São

Paulo naquela época. Entretanto, ele obteve um soro com baixo poder

antitóxico.

No ano de 1917, na filial do Instituto Oswaldo Cruz em Belo Horizonte, o

Professor Eurico Vilela empregando uma metodologia semelhante à utilizada

por Maurano desenvolveu o primeiro soro escorpiônico (Vilela, 1917). Este foi

utilizado com sucesso pelo Dr. Octávio Magalhães em uma criança de 9

meses.

Como o escorpião Tityus serrulatus só foi descrito em 1922 por Mello

Campos e Dr. Lutz, os soros produzidos em Belo Horizonte até então eram

contra o T. bahiensis. Mas como o principal causador de acidentes nesta

cidade era o escorpião amarelo (T. serrulatus), os soros passaram a ser feitos

contra esta espécie.

No início da década de 90, o soro anti-escorpiônico para uso humano

era produzido em apenas três instituições no mundo: Instituto Lister em

Londres, Instituto Butantan em São Paulo e Instituto Oswaldo Cruz em Belo

Horizonte (Hassan, 1984). Mas pesquisadores de vários países com problemas

de escorpionismo estudaram e desenvolveram diversos soros (Hassan, 1984).

Hoje em dia, soros anti-escorpiônicos são produzidos rotineiramente por

diversas instituições do mundo. Sendo que diferentes espécies de animais são

usadas para a produção, tais como carneiros, cabras, camelos e cavalos, os

mais comuns (Theakston e cols., 2003). No Brasil, o Instituto Butantan (São

Paulo) e a Fundação Ezequiel Dias (Belo Horizonte) são os principais

fornecedores de soro anti-escorpiônico. O soro é produzido através da

imunização de cavalos com veneno bruto obtido por estimulação elétrica da

glândula (Barrio & Vital-Brazil, 1949).

Apesar do soro anti-escorpiônico ser eficaz, sua ação depende de sua

qualidade e da rapidez com que é iniciado o tratamento (Maria e cols., 2005).

Além disso, a produção do soro para tratamento de picadas de escorpiões

possui alguns problemas: 1) dificuldade em se obter o veneno que é a matéria

prima para a produção do soro anti-escorpiônico; 2) alto custo de produção do

soro, principalmente na manutenção dos cavalos utilizados para gerar o soro

neutralizante. O tempo de vida desses animais é reduzido drasticamente

devido à ação letal do veneno que é inoculado nos animais; 3) utilização de

componentes do veneno que não estão ligados ao processo neutralizante, pois

o que se utiliza é o veneno total e não frações específicas do veneno.

Sendo assim, pesquisadores de vários países discutem e estudam a

possibilidade de se produzir um soro de melhor qualidade ou até mesmo uma

vacina. Neste contexto, várias linhas experimentais estão sendo seguidas.

Estudos iniciais levaram os pesquisadores a estudar a possibilidade de

usar frações tóxicas ou até mesmo toxinas para imunizar animais. Mas a alta

toxicidade dessas moléculas dificulta o seu uso, sendo assim, vários métodos

para tirar a toxicidade destas proteínas foram criados. Possani e cols. (1981)

detoxificaram o veneno do C. noxius por polimerização com glutaraldéido. Neste

mesmo ano, Delori e cols. (1981) retiraram a toxicidade da fração AaH G-50 do

veneno do A. australis Hector por acetilação. Chavez-Olortegui e cols. (1991)

capturam a fração tóxica do veneno do T. serrulatus (TstFG50) em lipossomas,

abolindo sua toxicidade. Outros pesquisadores utilizaram métodos semelhantes

com outras toxinas ou frações de venenos (Fonseca e cols., 1997; Kharrat e

cols., 1997; Machado De Avila e cols., 2004). Em todos estes ensaios, verificou-

se que as moléculas detoxificadas eram capazes de induzir a produção de

anticorpos que neutralizavam os efeitos tóxicos dos venenos utilizados. Existem

três principais problemas com essa abordagem: 1) a duração e efetividade da

proteção eram limitadas; 2) dificuldade de se obter veneno suficiente para

proteger todas as pessoas que necessitam; 3) alto custo (Gazarian e cols.,

2005).

Com a facilidade de produzir peptídeos sintéticos, vários pesquisadores

começaram a utilizá-los para definir epitopos antigênicos das toxinas de

escorpião (Bahraoui e cols., 1986; El Ayeb e cols., 1986; Bahraoui e cols., 1988;

Granier e cols., 1989). Assim, esses epitopos definidos eram sintetizados e

usados para produzir anticorpos. Em muitos casos, esses anticorpos tinham a

capacidade de neutralizar os efeitos dos venenos (Calderon-Aranda e cols.,

1995; Zenouaki e cols., 1997; Calderon-Aranda e cols., 1999; Alvarenga e cols.,

2002; Chavez-Olortegui e cols., 2002).

Em 1996, uma nova possibilidade surgiu: Chavéz-Olórtegui e cols.

descobriram uma proteína no veneno do escorpião T. serrulatus que não era

tóxica para mamíferos e artrópodes, mas era capaz de produzir anticorpos que

neutralizavam os efeitos do veneno total desse escorpião (Chavéz-Olórtegui e

cols., 1996, 1997; Moreira-Ferreira e cols., 1998). Esta proteína foi chamada de

“Tityus serrulatus non toxic protein”, TsNTxP. Somente recentemente, uma

proteína com as mesmas características foi encontrada em um veneno de um

escorpião de outro gênero, a Amm VIII no veneno do Androctonus mauritanus

mauritanus (Alami e cols., 2003; Martin-Eauclaire e cols., 2006).

A possibilidade de produzir proteínas recombinantes utilizando a biologia

molecular trouxe grandes avanços na soroterapia. Bouhaouala-Zahar e cols.

(1996) clonaram uma toxina  do veneno do Buthus occitanus tunetanus, Bot

XIV, que foi expressa em E. coli fusionada com dois domínios Z da proteína A

de S. aureus. Essa proteína fusionada recombinante gerou anticorpos capazes

de reconhecer e neutralizar os componentes do veneno desse escorpião.

Resultados semelhantes foram obtidos por outros pesquisadores (Legros e

cols., 2002; Garcia e cols., 2003).

Com o advento da metodologia de “phage display” em 1988-1990, houve

um estímulo pela busca de epitopos antigênicos de toxinas de escorpião

utilizando essa metodologia. Anticorpos policlonais ou monoclonais foram

usados para encontrar mimotopos em biblioteca de fagos com seqüências

aleatórias de 7 a 12 resíduos. Mimotopos são peptídeos que mimetizam a

especificidade antigênica e imunológica de epitopos naturais.

Recentemente, a seleção de mimotopos por anticorpos monoclonais foi

usada para mapear epitopos de duas toxinas de C. noxius, NTX e Cn2, e

peptídeos imunogênicos neutralizantes foram obtidos (Herion e cols., 1995;

Gazarian e cols., 2000, 2003; Hernandez e cols., 2002).

Outra linha de pesquisa que vem gerando muitas informações é a

produção de anticorpos monoclonais (mAbs) contra alguma toxina do veneno

em estudo. Bahraoui e cols. (1988), selecionou dois mAbs que reconheciam a

toxina AaH II com alta afinidade; um deles (4C1) é um ótimo anticorpo

neutralizante tanto para a toxina quanto para o veneno bruto. Zamudio e cols.

(1992) produziram muitos monoclonais que reagiam com Cn2, mas apenas um

tinha capacidade neutralizante in vivo (BCF2). A partir de então outros mAbs

neutralizantes foram selecionados: 23C6 contra AaH II (Devaux e cols., 1997),

9C2 contra AaH I e III (Clot-Faybesse e cols., 1999; Devaux e cols., 2002),

BNTX 18 e 21 contra NTX (Hérion e cols., 1995), mAbTs1 contra fração tóxica

do T. serrulatus (Alvarenga e cols., 2005).

Esse intenso estudo possibilitou a produção de fragmentos de anticorpos

monoclonais recombinantes. O cDNA que codifica as regiões variáveis do mAb

4C1 (Mousli e cols., 1999) e do mAb 9C2 (Devaux e cols., 2001) foram isolados

e manipulados para se produzir fragmentos variáveis de cadeia única (scFv)

recombinantes com alta capacidade neutralizante. Aubrey e cols. (2003)

construíram um anticorpo scFv divalente (“diabody”) utilizando a seqüência de

nucleotídeos do mAb 9C2 que possuía estabilidade e atividade protetora. O Fab

recombinante foi outra construção que teve sucesso (Aubrey e cols., 2004;

Selisko e cols., 2004). Uma vez que monoclonais murinos tem um baixo valor

terapêutico (risco de gerar uma reação de hipersensibilidade) e monoclonais

humanos são difíceis de produzir, devido à instabilidade de linhagens celulares

de hibridomas humanos (Mousli e cols., 1999; Devaux e cols., 2001; Gazarian e

cols., 2005), estas novas moléculas são candidatas promissoras para a

produção de uma nova geração de antivenenos.

Ainda assim, as informações obtidas até agora são insuficientes para

gerar um quadro compreensivo sobre este assunto e propor soros alternativos e

vacinas contra venenos de escorpião.

Objetivo Geral

Busca e produção de novos imunógenos recombinantes para produção

de soro anti-Tityus serrulatus e estudo da potência dos soros obtidos.

Objetivos Específicos

- Buscar seqüências de toxinas do veneno na biblioteca de cDNA da

glândula do Tityus serrulatus que possam ser usadas para produção

de soro e ampliação do banco de dados de toxinas do laboratório;

- Produzir cassetes de expressão com as toxinas TsTx e TsTx-I e a

proteína TsNTxP;

- Produzir proteínas recombinantes em tandem da toxina TsVII;

- Imunizar coelhos e camundongos com as proteínas recombinantes

produzidas;

- Testar a potência dos soros obtidos;

- Verificar a proteção (in vivo) obtida pela imunização com as proteínas

recombinantes.

Justificativa

O nosso grupo está envolvido na pesquisa de novos imunógenos e vem

buscando entender melhor a produção de anticorpos neutralizantes.

A descoberta da TsNTxP deu um grande impulso em nossas pesquisas.

Inicialmente, estudamos os efeitos da proteína nativa, mas sua obtenção

possui alguns problemas, tais como: conseguir quantidade suficiente de

veneno para sua purificação e as várias purificações necessárias para se obter

à proteína pura, uma vez que ela representa menos que 1% do veneno total.

Esses fatores em conjunto tornam inviável a utilização da TsNTxP nativa para a

produção de um soro de uso comercial.

Sendo assim, foi feita uma busca do cDNA da TsNTxP em uma

biblioteca de cDNA de T. serrulatus construída a partir da glândula do veneno

deste escorpião (Guatimosim e cols., 1999). Uma vez clonada, essa proteína

foi expressa em grandes quantidades em bactérias e o seu poder neutralizante

testado (Guatimosim e cols., 2000); o soro obtido (100 µl) era capaz de

neutralizar até 3DL

Em paralelo, estudos com peptídeos sintéticos determinaram alguns

epitopos das toxinas de escorpião e da TsNTxP que eram reconhecidos por

soros anti-TsNTxP, anti-TsIV e anti-veneno total de Tityus serrulatus (Chavéz-

Olortegui e cols., 2002; Alvarenga e cols., 2002; Mendes e cols., 2004; Maria e

cols., 2005). Alguns desses epitopos foram sintetizados e a capacidade de

produção de soro neutralizante foi testada, entretanto o soro obtido protegia

95% dos animais inoculados com apenas 1DL

e 58% com 2DL

Mendes e cols. (2004) produziram a TsNTxP em bactérias E. coli como

proteína de fusão. A proteína recombinante foi utilizada para imunizar carneiro,

coelho e camundongos. O poder neutralizante dos soros e sua reatividade

frente a peptídeos sintéticos da TsNTxP foram testados. Verificamos que os

animais respondiam de maneira diferente a quantidades proporcionais de

proteína. Apesar do soro do carneiro e do coelho reagirem com epitopos

semelhantes, o soro do carneiro conferiu o dobro de proteção do que o do

coelho. E o soro dos camundongos que reagiu com um menor número de

epitopos (seqüências lineares de regiões específicas da proteína TsNTxP)

apresentou uma proteção intermediária, menor que o soro do carneiro e maior

que o soro do coelho. Nesses experimentos utilizamos 2DL

do veneno do T.

serrulatus.

Nossos resultados indicam que mais estudos devem ser realizados para

se obter um imunógeno mais eficaz. As proteínas utilizadas devem produzir um

soro com poder neutralizante suficiente para uso terapêutico e com poder

neutralizante superior daqueles obtidos atualmente. Uma ampola de 5 mL do

soro produzido pelo Instituto Butantan neutraliza no mínimo 7,5 DMM – doses

mínimas mortais – do veneno de T. serrulatus

(www.vacinas.org.br/vacinas26.htm). Uma ampola com o mesmo volume de

soro produzida pela FUNED neutraliza no mínimo 5 mg do veneno de

referência do escorpião amarelo (1 mg/mL) (www.funed.mg.gov.br/produtos

_servicos/imunobiologicos/bulas/Bula_Soro_Antiescorpionico_ver.04.pdf).

Como a utilização de toxinas nativas é inviável para produção em larga

escala de soro anti-escorpiônico, nós decidimos utilizar proteínas

recombinantes expressas em sistemas procariotos para obtermos novos

imunógenos a serem testados. O sistema procarioto foi o escolhido por ser o

mais simples, mais barato e com mais ferramentas disponíveis. O problema de

usar este tipo de sistema para expressar proteínas de baixo peso molecular

como as toxinas é que estas proteínas são facilmente degradadas no

citoplasma das células bacterianas. Para aumentar a estabilidade de pequenas

proteínas expressas em bactérias foi desenvolvida uma estratégia que permitia

a expressão de vários genes em série (em tandem) da mesma proteína,

aumentando assim o produto a ser expresso (Gigova e cols., 1989; Ishikawa &

Tamaoki, 1996). Desta estratégia surgiu a idéia de produzir proteínas

quiméricas para desenvolvimento de vacinas e soros (Bharaduraj e cols., 1998;

Soto e cols., 1998; Molano e cols., 2003). Para tal um DNA recombinante que

contivesse fragmentos de DNA codificante para diferentes regiões antigênicas

era construído e expresso.

Portanto, nosso intuito foi a utilização destas duas estratégias (proteínas

em tandem e quiméricas) para produzir proteínas recombinantes mais estáveis

no citoplasma de bactérias e com uma capacidade de gerar anticorpos com um

grande poder de neutralizar o veneno do Tityus serrulatus. Para a construção

das proteínas recombinantes utilizamos a seqüência de nucleotídeos das

principais toxinas do veneno (TsTx e TsTx-I) e da proteína TsNTxP.

Materiais e Métodos

A – Reagentes, Meios de Cultura, Soluções

Meios de Cultura

Lb-caldo: 10 g de NaCl; 10 g de bactotriptona e 5 g de extrato de levedura. O

pH foi ajustado para 7,0 com NaOH e o volume para 1 litro. O meio foi

autoclavado.

Lb-ágar: 10 g de NaCl; 10 g de bactotriptona e 5 g de extrato de levedura. O

pH foi ajustado para 7,0 com NaOH e o volume para 1 litro. Este meio foi

acrescido ágar na concentração final de 1,5% para cultura em meio sólido. O

meio foi autoclavado.

2xYT-caldo: 16 g de extrato de levedura, 10 g de bactotriptona, 5 g de NaCl

para 1 litro de água destilada. Autoclavar.

SOC-caldo: 10 g de bactotriptona (2%), 2,5 g de extrato de levedura (0,5%),

0,3 g de NaCl (10 mM), 0,093 g de KCl (2,5%), 1,07 g de MgCl

(10 mM), 0,6 g

de MgSO

(10 mM), 1,8 g de glicose (20 mM), foi acrescentado água para

volume final de 500 mL. O meio foi autoclavado.

NZY-caldo 5x: 25 g de NaCl, 10 g de sulfato de magnésio, 25 g de extrato de

levedura, 50 g de caseína hidrolisada, adicionar água deionizada e acertar o

pH para 7, 5. Autoclavar.

NZY-caldo: Diluir 5x o meio concentrado. Para 1 L usar 200 mL do NZY 5x.

Autoclavar.

NZY-Agar: Fazer o NZY-caldo e acrescentar 15 g de ágar para cada 1 litro.

Autoclavar.

NZY-Top Agar: Prepare 1 L de meio NZY e adicionar 0,7% (peso/volume) de

agarose. Autoclavar.

Antibióticos

Ampicilina: Ampicilina (MERCK) foi dissolvida em H

O estéril na concentração

de 100 mg/mL, filtrada (filtro 0,22 m) e estocada a –20

C. A solução foi

utilizada na concentração final de 100 g/mL.

Canamicina: Canamicina (MERCK) foi dissolvida em H

O estéril na

concentração de 50 mg/mL, filtrada (filtro 0,22 m) e estocada a –20

C. A

solução foi utilizada na concentração final de 50 g/mL.

Clorofenicol: Clorofenicol (MERCK) foi dissolvido em H

O estéril na

concentração de 30 mg/mL, filtrada (filtro 0,22 m) e estocada a –20

C. A

solução foi utilizada na concentração final de 30 g/mL.

Tetraciclina: Tetraciclina (MERCK) foi dissolvida em H

O estéril na

concentração de 12,5 mg/mL, filtrada (filtro 0,22 m) e estocada a –20

C. A

solução foi utilizada na concentração final de 12,5 g/mL.

Soluções de Extração de DNA Genômico

TEN 9: 50 mM de Tris pH 9,0, 100 mM de EDTA pH 8,0, 200 mM de NaCl

TE: 10 mM deTris-HCl pH 8,0, 1 mM de EDTA pH 8,0

RNase: Diluir em água destilada a RNAse A livre de DNAse (Invitrogen) para

concentração final de 100 µg/mL.

Proteinase K: Fazer uma solução estoque em água destilada na concentração

de 250 mg/ml. Estocar no freezer e usar ela na concentração final de 10

mg/mL.

SDS 20%: Pesar 20g de SDS e acrescentar água destilada para um volume

final de 100 mL.

Acetato de Amônia 10 M: Pesar 77,08 g de acetato de amônia e acrescentar

água destilada para um volume final de 100 mL.

SM Buffer: 5,8 g de NaCl, 2 g de sulfato de magnésio, 50 mL de Tris-HCl 1M

pH 7,5, 5 mL de 2% de gelatina (peso/volume), acrescentar água deionizada

para volume final de 1 mL. Autoclavar.

Soluções para Purificação com Sílica/Guanidina

Tiocianato de Guanidina 6 M: Pesar 120 g de tiocianato de guanidina para

100 mL de Tris 10 mM pH 6,4.

Etanol em Tris: Medir 20 mL de Tris 10 mM pH 6,4 e completar para 100 mL

com etanol absoluto.

Tris 10 mM pH 6,4: Pesar 1,21 g de Tris base e acrescentar 800 mL água

destilada, acertar o pH com HCl para 6,4. Completar o volume para 1 L.

Tris 10 mM pH 8,0: Pesar 1,21 g de Tris base e acrescentar 800 mL água

destilada, acertar o pH com HCl para 8,0. Completar o volume para 1 L.

Soluções para fazer Bactérias quimiocompetentes

Tfb I: 30 mM acetato de potássio, 50 mM de MnCl

, 100 mM de KCl, 10 mM de

CaCl

, 15% de glicerol, pH 5,8

Tfb II: 10 mM de Na-MOPS, 75 mM de CaCl

, 10 mM de KCl, 15% de glicerol,

pH 7,0

Soluções para fazer Bactérias eletrocompetentes

Glicerol 10%: Diluir 100 mL de glicerol em água destilada para volume final de

1 L. Autoclavar.

Soluções para Mini-Prep

Solução I: 50 mM de glicose, 25 mM de Tris-HCl pH 8,0 e 10 mM de EDTA pH

8,0

Solução II: 0,2 N de NaOH e 1% de SDS.

Solução III: 60 mL de uma solução de acetato de potássio 5 M, 11,5 mL de

ácido acético glacial e 28,5 mL de água destilada.

Soluções para fazer Gel de Agarose

Agarose: A agarose foi dissolvida por aquecimento, em TAE 1x de acordo com

a porcentagem de gel a ser preparado.

Brometo de etídio: Brometo de etídio foi dissolvido em água na concentração

de 10 mg/mL, sendo a solução estocada em um recipiente escuro. Importante:

usar luvas e máscara – substância mutagênica e teratogênica.

TAE: Tampão Tris-acetato-EDTA (solução estoque 50x): 242 g de Tris base,

57,1 mL de ácido acético e 100 mL de EDTA 0,5 M pH 8,0. Usar o tampão 1x.

Soluções para Expressão e Lise Bacteriana

IPTG (Isopropiltio--D-galactose): O IPTG foi dissolvido em água mili-Q

estéril na concentração de 600 mM, filtrado (filtro 0,22 m) e estocada a –20

Tampão de lise: 50 mM de Tris, 1mM EDTA, 50 mM de glicose pH8,0

Lisozima: Pesar 4 mg de lisozima para 1 mL de tampão de lise. Fazer a

solução na hora do uso.

Glicose: 20 g de D-glicose foram dissolvidas em 100 mL de água (solução

20%). A solução foi esterilizada por filtração (filtro 0,22 m) e estocada a 4C.

Soluções para Dosagem de proteínas pelo Método de Bradford

Reagente de Bradford: 10 mg de coomassie brilliant blue G-250, 5 mL de

etanol 95%, 10 mL de ácido fosfórico 85%, acrescentar água destilada para

volume final de 100 mL. Dissolver o corante em etanol, acrescentar 60 mL de

água e logo depois adicionar lentamente o ácido. Completar o volume com

água para 100 mL e filtrar em papel de filtro comum. Armazenar a 4C por

aproximadamente um mês.

BSA: Pesar 1 mg de soro albumina bovina e diluir em água destilada para

volume final de 1 mL. Estocar a -20C.

Soluções para fazer Gel de Poliacrilamida SDS-PAGE

Tampão de amostra 2x: 2 mL de Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; 1,6 mL de glicerol; 3,2

mL de SDS 10%; 0,8 mL de -mercaptoetanol; 500 mg de bromofenol blue e

ajustar o volume para 8 mL com água destilada e o pH foi acertado para 8,3.

Solução A de gel: 29,2 g de acrilamida, 0,8 g de bisacrilamida, água q.s.p 100

mL.

Solução B de gel: 18,15 g de Tris, acertar o pH com HCl para 8,8, água q.s.p.

100 mL.

Solução C de gel: 6,0 g de Tris, água q.s.p. 100 mL, acertar o pH com HCl

para 6,8, água q.s.p. 100 mL.

Solução D de gel: SDS 10% (10 g de SDS para 100 mL de solução).

Tampão de corrida 5x: 1,5% de Tris-Base, 7,2% de glicina e 0,5% de SDS.

Solução corante: 1,25 g de Comassie blue, 225 mL de metanol, 45 mL de

ácido acético glacial e 225 mL de água.

Solução descorante: 45 mL de etanol, 90 mL de ácido acético glacial e 850

mL de água.

Solução para secar gel de poliacrilamida: 25% de etanol e 1,5% de glicerol.

Soluções de Western Blot

Tampão de transferência para Western blot: 14,42 g/l de glicina, 3,03 g/l de

Tris e 200 mL/l de metanol. O pH deve estar em torno de 8,3.

Solução de PBST 0,3% para Western blot: PBS 1x, 0,3% de Tween 20.

Solução de PBST 0,05% para Western blot: PBS 1x, 0,05% de Tween 20.

Solução reveladora para Western blot: 10 mg de DAB + 10 mL PBST 0,05%,

5 mg de cloronaftol + 1,7 mL de metanol + 8,3 mL de PBST 0,05%, 10 l de

Soluções de ELISA

PBS 10x – Tampão fosfato salina (pH 7.4): Preparar 500 mL de uma solução

0,5 M de Na

HPO

e 200 mL de uma solução 0,5 M de NaH

. O pH da

solução de Na

HPO

foi acertado para 7.4 usando a solução de NaH

Medir o volume final e acrescentar para cada 100 mL de solução 9 g de NaCl.

A solução é então filtrada e estocada a 4C.

Tampão Carbonato: 15 mM de Na

, 35 mM de NaHCO

, pH da solução

9,6.

Tampão Citrato: 50 mM de Na

HPO

, 24 mM de ácido cítrico, pH da solução

5,0.

Tampão de Bloqueio: 2% caseína em PBS 1x.

Tampão de Incubação: 0,2% de caseína em PBS 1x e 0,05% de Tween 20.

Solução de Lavagem: 0,15 M de NaCl e 0,05% de Tween 20.

Solução reveladora de ELISA: 10 mL de tampão citrato, 2 mg de OPD, 2 l

de água oxigenada 30%.

Outras Soluções

CIAP stop buffer: 10 mM de Tris-HCl pH 7,5, 1 mM de EDTA pH 7,5, 200 mM

de NaCl, 0,5% de SDS

Sulfato de Magnésio 1M: 24,65 g de sulfato de magnésio para um litro de

água deionizada.

Maltose 20%: 20 g de maltose para 100 mL de água de deionizada. Filtrar com

filtro de 0,22 m.

B – Genótipo das linhagens de bactéria utilizadas

Linhagem XL1 Blue:  (mcrA) 183  (mcrCB-hsdSMR-mrr) 173 endA1 supE44

thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F’ proAB lacl

ZM15 Tn10 (Tet

)].

Linhagem XLOR:  (mcrA) 183  (mcrCB-hsdSMR-mrr) 173 endA1 recA1

gyrA96 relA1 lac [F’ proAB lacl

ZM15 Tn10 (Tet

)] Su

(não suprimido) 

Linhagem DH 5: 80dlacZM15 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 (r

, m

)

supE44 relA1 deoR (lacZYA-argF) U169

Linhagem Topo 10 F’: F’ {lacI

Tn10 (Tet

) mcrA (mrr-hsdRMS-

mcrBC).80dlacZM15 lacX74 recA1 deoR araD139 (ara-leu) 7697 galU

galK rpsL (Str

) endA1 nupG

Linhagem BL21: dcm ampT hsd(r

-m

-)gsl Lon

Linhagem Origami: (ara-leu) 7697 lacX74 phoA Pvu II phoR araD139

ahpC galE galK rpsL F’ [lac

lacl

pro] (DE3) gor522::Tn10 trxB pLysS (Cam

Str

, Tet

C – Animais Utilizados

Camundongos Swiss CF1 pesando entre 18 e 22 g foram obtidos no

biotério da Universidade Federal de Minas Gerais. Coelhos Nova Zelândia

pesando aproximadamente 2 Kg foram obtidos na Fazenda da Escola de

Medicina Veterinária/UFMG. Os coelhos e camundongos foram mantidos no

biotério da Escola de Medicina Veterinária. Todos os animais receberam água

e alimentação em condições controladas.

D - Preparo do estoque de bactérias

Todos os clones obtidos neste trabalho foram preparados para serem

estocados e guardados a -80 C, como descrito abaixo.

Células de bactérias BL21DE3 ou DH 5 foram transformadas com os

clones de interesse e plaqueadas em meio sólido LB-ágar com 100 l/mL de

ampicilina e incubadas a 37C por 16 horas. Foi então retirada uma colônia da

placa e adicionada ao meio líquido LB-ampicilina. Essa mistura foi crescida a

37C sob agitação. Após atingir a fase log tardia, foi feita uma mistura de

glicerol e cultura de baterias atingindo uma concentração de 30% de glicerol.

Alíquotas foram armazenadas em tubos estéreis a -80C.

E – Metodologia

Estratégia geral do trabalho

As etapas da metodologia utilizada estão resumidas no esquema abaixo.

Figura 11 – Esquema da metodologia utilizada.

Nas etapas que clonagem e montagem dos cassetes de expressão

seguimos sempre uma série de procedimentos que estão descritos no

esquema abaixo. A inserção do DNA inicialmente em vetores de fácil clonagem

foi uma estratégia utilizada para facilitar a subclonagem nos vetores pBluescript

e pET. Os vetores de fácil clonagem utilizados foram o pGEM e o TOPO TA

(Figura 13).

Figura 12 – Procedimentos utilizados nas etapas de clonagem.

Figura 13 – Vetores de fácil clonagem. Em A, o vetor pGEM T Easy e em B,

o vetor TOPO TA. Em ambas as figuras, o sítio múltiplo de clonagem está em

destaque.

Foram construídos vários cassetes de expressão, objetivando a

construção de novos sistemas de expressão (plasmídios ainda não testados no

nosso laboratório com toxinas de escorpião) e construções quiméricas com

DNA de duas ou mais toxinas e em tandem com mais de uma cópia de DNA de

uma mesma toxina (Figuras 16 e 17).

A.A.

B.B.

 - Obtenção do DNA das toxinas

A obtenção do DNA das toxinas utilizadas neste trabalho foi feita utilizando

duas metodologias: através do DNA genômico para as toxinas que tem

seqüência de nucleotídeos já determinada e através da biblioteca de cDNA da

glândula de veneno do escorpião Tityus serrulatus para obter novas toxinas e

proteínas.

1 - Obtenção do DNA de toxinas a partir do DNA genômico do

escorpião Tityus serrulatus

Para o desenvolvimento de etapas deste trabalho era necessário as

seqüências de nucleotídeos da TsNTxP, da TsTx e da TsTx-I.

A seqüência de nucleotídeos da TsNTxP já foi descrita por Guatimosim e

cols. (1999). E no meu trabalho de mestrado ela foi clonada em um plasmídeo

de expressão, o pMAL p2. Este clone foi utilizado para amplificação do DNA da

TsNTxP. Novos primers foram feitos para inserção do sítio de restrição da Xho

I ao DNA da TsNTxP, para sua posterior clonagem no pBluescript (Figura 14).

Já as seqüências da TsTx e da TsTx-I, como anteriormente foram descritas

(Martin-Eauclaire e cols., 1992; 1994) e depositadas no banco de dados do

NCBI, poderiam ser amplificadas a partir do DNA genômico do T. serrulatus.

Para isso foram construídos primers com os sítios de restrição adequados para

cada montagem (Figura 14).

Primers da TsNTxP

Senso

5’CTC GAG

GGT AGA GAA GGT TAT CCA G 3’

GGT AGA GAA GGT TAT CCA GCG GAT TCC AAG GGT TGC AAA

ATT ACT TGT TTT CTT ACA GCT GCA GGA TAC TGC AAT ACA GAA TGC ACA

CTC AAA AAG GGA TCA TCG GGT TAT TGC GCC TGG CCG GCG TGT TAC TGC

TAC GGG CTT CCA GAT TCA GTG AAA ATT TGG ACT AGT GAA ACG AAT AAA

TGT GGC

CC TGA TCA CTT TGC TTA TTT ACA CCG

GAG CTC

5’CTC GAG

GCC ACA TTT ATT CGT TTC ACT AGT CC 3’

Anti-senso

Primers da TsTx

Senso

5’ GTC GAC

AAG AAA GAC GGA TAC CCG 3’

AAG AAA GAC GGA TAC CCG GTG GAA TAC GAT AAC TGC GCC

TAC ATT TGC TGG AAC TAC GAC AAC GCT TAC TGC GAT AAG CTG TGC AAA

GAC AAG AAA GCC GAT AGC GGA TAT TGT TAC TGG GTT CAC ATC CTG TGC

TAC TGC TAC GGG CTT CCC GAT AGC GAA CCG ACC AAG ACC AAC GGA AAA

TGC AAA TCC GG TTG CCT TTT

ACG TTT AGG CAG CTG

5’ GTC GAC

GGA TTT GCA TTT TCC GTT GG 3’

Anti-senso

Primers da TsTx-I

Senso

5’ AAG CTT

AAA GAA GGT TAT CTC ATG 3’

AAA GAA GGT TAT CTC ATG GAT CAC GAA GGT TGC AAA CTT

AGT TGC TTT ATC AGA CCA TCG GGA TAC TGC GGC AGA GAA TGC GGA ATT

AAA AAG GGC TCA TCG GGC TAT TGC GCC TGG CCC GCG TGT TAC TGC TAC

GGG CTT CCA AAT TGG GTG AAA GTT TGG GAT AGA GCG ACG AAC AAA TGT

C CTA TCT CGC TGC TTG TTT ACA

TTC GAA

5’ AAG CTT

ACA TTT GTT CGT CGC TCT ATC C 3’

Anti-senso

Figura 14 – Primers construídos para clonagem das proteínas de

interesse. Os sítios de restrição estão sublinhados. Para TsNTxP, Xho I, para

TsTx, Sal I e para TsTx-I, Hind III.

1.1 - Extração de DNA genômico do escorpião Tityus serrulatus

O escorpião foi colocado no gelo seco e macerado em um gral com gelo

seco até virar pó. Este foi recolhido com uma espátula e colocado em um tubo

de 50 mL. Foram adicionados 10 mL de TEN 9 e 50 l de RNAse (100 mg/mL).

A mistura foi homogeneizada e agitada por 10 minutos a temperatura ambiente.

Foram adicionados 250 l de SDS 20%, e a mistura foi agitada por mais 10

minutos. Proteinase K (10 mg/mL) na mesma quantidade de SDS foi

adicionada e a solução foi agitada por 16 horas a 37C. No outro dia, um

volume de fenol:clorofórmio (1:1) foi adicionado e misturado por 1 hora. Foi

feita uma centrifugação 5 minutos a 5000g, à parte superior foi retirada e

passada para outro tubo. Um volume de clorofórmio foi acrescentado e agitado

por 10 minutos. Foi feita uma centrifugação novamente (5 minutos a 5000g) e a

parte de cima (fase aquosa que contém o DNA) foi guardada. A esta, foi

acrescentado 1/5 do volume de acetato de amônia 10 M e 1 volume de

isopropanol. O tubo foi invertido, deve-se observar a formação de um

precipitado filamentoso. O DNA foi recolhido com uma pipeta Pasteur com a

ponta selada e mergulhado em 5 mL de etanol 70% para lavar o DNA. Este foi

passado para outro tubo e deixado secar totalmente. O DNA seco foi

ressuspendido em 1 mL de TE contendo 2 l de RNAse (20 g/mL) e deixado

16 horas a 37C. No outro dia um gel de agarose 1% foi corrido para quantificar

o DNA genômico obtido.

1.2 - Padronização da PCR e Amplificação dos DNAs das toxinas

Testes foram feitos para padronizar a quantidade de DNA genômico a ser

usada na PCR. As reações de amplificação por PCR foram realizadas como

descrito por Saiki e cols., (1988) utilizando a enzima Taq DNA polimerase

(PHT). Os primers utilizados estão mostrados na Figura 14. A reação de PCR

foi montada da seguinte maneira:

Reação 1

Material Quantidade

Primer Senso (20 pmol/l)

0,5 l

Primer anti-senso (20 pmol/ul)

0,5 l

Taq PHT(1 l/5U)

0,2 l

DNA genômico diluído

2 l

dNTP (1 mM)

2,5 L

Tampão 1B ou 1C PHT (10x)

2,5 l

Água deionizada estéril

16,8 l

Vol. Final

25 l

Programa 1

1- 94

C por 3 minutos (desnaturação);

2- 94

C por 30 segundos (desnaturação);

3- 55

C por 1 minuto (anelamento);

4- 72

C por 1 minuto (extensão);

5- Repetir o ciclo 5 vezes a partir da etapa 2;

6- 94

C por 30 segundos (desnaturação);

7- 50

C por 1 minuto (anelamento);

8- 72

C por 1 minuto (extensão);

9- Repetir o ciclo 30 vezes a partir da etapa 6;

10- 72

C por 5 minutos ;

11- 4

C por tempo indefinido.

O DNA genômico foi diluído 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45,

1:50 e foram utilizados 2 l. Os tampões IB e IC (PHT) para a Taq polimerase

também foram testados.

1.3 - Clonagem dos DNAs no vetor pGEM T Easy vetor

1.3.1- Purificação de DNA pelo método da Sílica/Guanidina

O DNA das toxinas foi amplificado de 2 l de DNA genômico diluído 1:50,

sendo que foram feitas 20 reações para cada. Tampão de amostra Loading

Buffer foi adicionado às amostras de DNA amplificado. Este material foi então

submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0%.

O pedaço de gel contendo a banda de interesse foi cortado e triturado em

um tubo Falcon de 15 mL. Ao gel triturado foram acrescentados 2 volumes de

Tiocianato de Guanidina 6 M em Tris-HCl 10 mM pH 6,4. Se a cor não estiver

amarela, devem ser acrescentadas algumas gotas de acetato de sódio 3 M pH

5,2. O tubo foi deixado no banho a 70C por 10 minutos ou até o gel derreter.

Foram adicionados 50 l de sílica e o tubo deixado no banho a 70C por mais

10 minutos. Foi feita uma centrifugação à 3000g por 5 minutos e o

sobrenadante foi descartado. O pellet foi lavado com 1 mL de Etanol 80% em

Tris-HCl 50 mM pH 6,4, ressuspendendo o pellet. Foi feita uma centrifugação à

5000g por 2 minutos e o procedimento acima foi repetido mais duas vezes. O

pellet foi seco no banho a 56C por 30 minutos. Foram adicionados 50 l de

Tris-HCl 10 mM pH 8,0, o pellet foi ressuspendido e a solução resultante foi

deixada no banho a 56C por 30 minutos. Foi feita uma centrifugação a 2000 g

por 2 minutos e o sobrenadante foi guardado. Os 2 últimos passos foram

repetidos 2 vezes.

Após purificação, 2 l dos sobrenadantes obtidos foram aplicados em gel de

agarose 1%.

1.3.2 – Ligação dos DNAs da TsTx-I e TsTx em pGEM

As ligações em vetor pGEM foram realizadas de acordo com fabricante

(Promega



). A tabela abaixo mostra as quantidades que foram utilizadas.

Material Quantidade

Vetor pGEM

1 l

Produto de PCR

0,5/1,0/1,5/2,0 l

T4 DNA Ligase (3 U/l) 1 l

Tampão de ligação 2x

5 l

Água deionizada

2,5/2,0/1,5/1,0 l

Volume final

10 l

A reação foi homogeneizada e deixada incubando por 16 horas a 4C. Após

esse tempo, o DNA foi precipitado com 1/10 do volume de acetato de sódio 3 M

pH 5,2 e 2 volumes de etanol 96%. Em seguida, os tubos foram centrifugados a

12000 g durante 10 minutos. O precipitado foi lavado com etanol 70% e depois

de seco, ressuspendido em 4 l de água deionizada e mantido a 4ºC.

1.4 – Eletroporação

1.4.1 - Bactérias eletrocompetentes

Bactérias da linhagem Topo 10 F foram estriadas em uma placa

LB/Kanamicina. Uma colônia isolada foi crescida em 5 mL de meio LB em

frasco de 50 mL por 16 horas a 37

C sob agitação de 180 rpm.

A pré-cultura foi inoculada em 500 mL de meio LB e crescida até OD

600

0,5-0,7. A cultura foi transferida para tubos próprios de centrífuga gelados e

foram mantidos no gelo por 20 minutos.

Foi feita uma centrifugação das células a 4000g, por 15 minutos a 4C. O

sobrenadante foi descartado e então a massa de células foi ressuspendida

suavemente com 500 mL de glicerol 10% estéril e gelado.

Foi feita uma nova centrifugação, sobrenadante foi descartado e a massa

de células foi ressuspendida suavemente com 250 mL de glicerol 10% estéril e

gelado.

Os procedimentos de centrifugação foram repetidos e então a massa de

células foi ressuspendida suavemente com 20 mL de glicerol 10% gelado e

estéril.

Mais uma vez, os passos foram repetidos e a massa de células foi

ressuspendida suavemente com 1 a 2 mL de glicerol 10% gelado e estéril.

A DO

600

das células diluídas foi determinado (o valor deve ser de 0,15 se

necessário diluir a amostra). As células diluídas foram aliquotadas e

congeladas rapidamente em gelo seco/etanol. As células foram estocadas em

freezer –80C.

1.4.2 – Protocolo de Eletroporação

As bactérias competentes foram descongeladas no gelo. O produto de

ligação (2 l) a ser transformado foi incubado com 40 l de células

competentes no gelo por 5 minutos.

Na eletroporação, foram utilizados os seguintes parâmetros: choque de

1,8V, corrente de 25 F, e com resistência de 200 Ohms. O tempo de choque é

de 4,4 ms.

Após o choque foi adicionado 1 mL de meio SOC estéril e as células foram

incubadas a 37

C por 1 hora. Foram plaqueadas em 3 placas (contendo

antibiótico) com meio LB agar, 100-200 l de suspensão de bactérias por placa.

A incubação foi a 37

C por 16 horas.

Como controle foram feitos os mesmos procedimentos com bactérias sem

plasmídeo e plaqueadas 100 l de células em uma placa com antibiótico e em

outra sem antibiótico.

1.5 – PCR de Colônia

Após a eletroporação do produto da ligação e crescimento das bactérias,

foram selecionadas 20 colônias.

A reação de PCR foi preparada da seguinte maneira:

Reação 2

Material Quantidade

Primer Senso (20 pmol/l) 0,5 l

Primer anti-senso (20 pmol/l) 0,5 l

Taq (1 l/5U) (PHT) 0,2 l

DNA -

dNTP (1 mM)

2,5 L

Tampão 1C (10x) (PHT)

2,5 l

Água deionizada estéril

18,8 l

Vol. Final

25 l

O programa utilizado para a PCR de colônia foi o mesmo descrito no item I-

1.2.

Em um fluxo laminar, 100 l de meio LB contendo antibiótico (100 g/mL)

foram adicionados em cada poço de uma placa de cultura (96 wells). Uma

ponteira foi encostada em uma colônia de bactéria e em seguida lavada em um

poço da placa com meio. Todo meio de cultura foi retirado do interior da

ponteira e então esta foi lavada novamente em um tubo contendo a reação da

PCR. Este procedimento foi repetido para as demais colônias. Após a reação

de PCR a amplificação foi verificada em gel de agarose a 1%. As colônias

positivas tiveram seus plasmídeos extraídos.

1.6 – Purificação de plasmídeo por lise alcalina

Extração de plasmídeo de E. coli foi realizada segundo o método de lise

alcalina-SDS (Sambrook e cols., 1989). Segue o protocolo utilizado:

Uma colônia isolada foi colocada para crescer em 10 mL de meio LB broth

com ampicilina (100 g/mL), em um agitador a 180 rpm e à temperatura de

C, durante 16 horas, em tubo de 50 mL.

Após crescimento, a cultura foi mantida no gelo por 10 minutos e

centrifugada a 3000g por 10 minutos, a 4

C. Todo o sobrenadante foi

descartado. O precipitado foi ressuspendido em 300 l de solução I gelada,

transferido para um tubo de 1,5 mL e deixado por 5 minutos a temperatura

ambiente. Foram adicionados 300 l de solução II, preparada na hora do uso, o

conteúdo foi misturado cuidadosamente por inversão e deixado por 5 minutos

no gelo. Foram adicionados 30 l de solução III e a mistura foi homogeneizada

novamente por inversão. O tubo foi deixado no gelo por mais 5 minutos e

centrifugado a 12000g por 10 minutos a 4

C. O precipitado foi descartado e

foram adicionados ao sobrenadante 0,6 volumes de isopropanol 100%. O tubo

foi deixado em repouso por 12 minutos e centrifugado novamente (12000g por

10 minutos, à temperatura ambiente). O sobrenadante foi descartado e o

precipitado foi lavado com 1 mL de etanol 70%. Depois que o precipitado secou

foi dissolvido em um volume de 50 l de TE pH 8,0 com RNAse (20 g/mL). O

tubo foi deixado 1 hora a 37

C para a enzima agir. Um gel de agarose 1% foi

corrido para quantificar os plasmídeos purificados.

1.7 - Corte com enzimas de restrição

Os plasmídeos obtidos foram cortados com as enzimas apropriadas. Os

clones da TsTx-I foram cortados com a enzima Hind III, os clones da TsTx

foram cortados com a enzima Sal I.

A digestão dos plasmídeos foi realizada da seguinte maneira:

Material Quantidades

Vetor

1 g

Enzima 2,5 U

BSA 100 g/mL (quando necessário) 2 l

Tampão (10x)

2 l

Água deionizada estéril Variável

Volume final

10 l

A reação foi deixada por 1 hora a 37C e depois um gel de agarose 1% foi

corrido para verificar se houve digestão.

1.8 – Seqüênciamento

Os seqüenciamentos dos plasmídeos quantificados foram realizados no

aparelho MegaBACE DNA sequencer no Laboratório de Biodiversidade e

Evolução Molecular da UFMG. A reação de seqüênciamento foi feita utilizando-

se o kit DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing (Amersham).

Primers utilizados:

M13 anti-senso: GGAAACAGCTATGACCATG

M13-20: TGACCGGCAGCAAAATG

Reação de seqüênciamento:

Material Quantidade

ET kit

4 l

Primer (5 pmol/l) 1 l

DNA molde 200 ng

Água qsp

10 l

Volume final

10 l

Programa 2

1- 95

C por 20 segundos (desnaturação);

2- 55

C por 15 segundos (anelamento);

3- 60

C por 1 minuto e 20 segundos (extensão);

4- Repetir o ciclo 29 vezes a partir da etapa 1;

5- 4

C por tempo indefinido

1.9 - Análise computacionais das seqüências obtidas

As seqüências de nucleotídeos foram analisadas através do programa

“Basic Local Alingment Search tool prograrm for amino acids” – Blast – Gen

Bank (Altschul & Lipman, 1990) – www.ncbi.nlm.nih.gov).

2 - Busca de DNAs de toxinas na biblioteca de cDNA da glândula de

veneno do escorpião Tityus serrulatus

2.1 - Biblioteca de DNA da glândula de veneno do escorpião Tityus

serrulatus

Essa biblioteca foi construída pelo Professor Evanguedes Kalapothakis a

partir da extração total dos RNAs da glândula de veneno e da purificação dos

mRNAs em coluna oligo-dT. Essas moléculas foram usadas como moldes para

a síntese do DNA, usando o Zap DNA Synthesis Kit (Stratagene). Os DNAs

com tamanhos acima de 100 pares de bases (pb) foram selecionados e

subclonados no vetor Uni Zap XR

(Stratagene) entre os sítios de restrição

Eco RI e Xho I. Posteriormente foram empacotados em partículas viáveis de

fago, através do Gigapack II packing extracts (Stratagene). A biblioteca foi

titulada como descrito abaixo.

2.2 - Titulação da biblioteca

No dia anterior, 1 colônia de E. coli XL1-Blue foi crescida em 5 mL de NZY

(suplementado com 50 l de maltose 20% e 50 l de MgSO

1 M) a 37C por

16 horas. No outro dia os 5 mL foram inoculados em 50 mL de NZY

(suplementado com 50 l de maltose 20% e 50 l de MgSO

1M). A cultura foi

crescida por aproximadamente 3 horas. Foi feita uma centrifugação à 5000g

por 5 minutos e o pellet foi ressuspendido em MgSO

10 mM até se obter uma

600

=1,0. Foi usado 10 l da sub-biblioteca sem diluição e com diluições de

1x10

-1

e 1x10

-3

em SM Buffer. Os 10 l da biblioteca foram acrescentados a

200 l de bactérias XL1-Blue em MgSO

10 mM. Os fagos da biblioteca e as

bactérias foram incubados a 37C por 15 minutos. A mistura foi adicionado 2 a

3 mL de NZY Top Agar na temperatura de aproximadamente 48C. Logo em

seguida plaqueamos em placas NZY/agar e deixamos solidificar por 10

minutos. As placas foram invertidas e incubadas a 37C por 16 horas.

2.3 - Excisão em massa da sub-biblioteca 34

A biblioteca aqui utilizada é constituída por fagos lambda que possuem em

seu genoma o vetor Zap Express contendo o fagemídeo pBluescript II SK- com

insertos de DNA originados da glândula de veneno.

É importante salientar que o vetor Zap Express contém duas partes de uma

região de origem de replicação (o sítio de iniciação e o de terminação da

síntese de DNA) subclonadas separadamente em sua seqüência. Esses sítios

são reconhecidos por proteínas M13 expressas pelo fago helper que clivam

uma das fitas do DNA dessas regiões. A molécula de

DNA originada é então

circularizada por uma outra proteína do fago helper, formando uma molécula de

DNA circular contendo o DNA existente entre os sítios de iniciação e

terminação. No caso do vetor Zap Express, isso inclui toda a seqüência do

vetor fagemídeo pBluescript e o inserto de DNA clonado, quando presente. A

circularização recupera a região de origem de replicação, que está ligada ao

envio de sinais para o empacotamento do DNA circular e formação do

fagemídeo. Os passos para excisão em massa estão descritos abaixo:

No dia anterior, 1 colônia de XL1-Blue e uma colônia de XLOLR foram

crescidas em tubos separados contendo 5 mL de NZY (suplementado com 50

l de maltose 20% e 50 l de MgSO

1 M) a 37C por 16 horas. Após 16 horas,

os 5 mL foram inoculados em 50 mL de NZY (suplementado com 50l de

maltose 20% e 50l de MgSO

1 M) e a cultura foi crescida por

aproximadamente 3 horas. Foi feita uma centrifugação a 1000g por 10 minutos

e o pellet foi ressuspendido em MgSO

10 mM até se obter uma DO

600

=1,0.

Em tubos de 50 mL, a biblioteca de fago  foi combinada com as bactérias

XL1-Blue. Foram usados 10 l do fago sem diluição e nas diluições 1x10

-1

1x10

-2

e 1x10

-3

e todas as diluições foram combinadas com 600 l de bactérias.

O fago helper foi usado nas quantidades seguintes: 5, 10, 15, 20, 25, 30 e 35

l. As bactérias contendo os fagos  e helper foram incubadas a 37C por 15

minutos para permitir o ancoramento dos fagos às bactérias e infecção das

mesmas. Foram adicionados 5 mL de NZY e a mistura foi incubada a 37C por

2,5-3 horas sob agitação de 180 rpm. Durante esse período, a excisão do

pBluescript e a formação dos fagemídeos ocorrem nas bactérias XL1-Blue. O

tubo contendo as bactérias e os fagos foram aquecidos a 65-70C por 20

minutos para lisar as partículas do fago  e as células bacterianas, os

fagemídeos não são lisados. Foi feita uma centrifugação a 1000g por 10

minutos para baixar o debri celular, o sobrenadante foi guardado em tubos

estéreis. Para titular os fagos excisados, combinamos 5 l do sobrenadante

com 200 l de bactérias XLOLR em tubos de 1,5 mL. Os tubos foram

incubados 37C por 15 minutos. Ao tubo foram adicionados 40 l de meio NZY

5x (para concentração final de 1x) e incubamos a mistura por mais 45 minutos

a 37C, para permitir expressão do produto do gene de resistência a ampicilina.

Foram plaqueados 100 l da mistura em placas LB/Agar contendo ampicilina

(100 g/mL), e estas foram incubadas a 37C por 16 horas.

2.4 – Verificação da presença de insertos

As colônias obtidas foram coletadas e submetidas a uma PCR de colônia,

como descrito no item I-1.5, para verificação da existência e tamanho dos

insertos. A reação e o programa utilizados estão descritos abaixo. As colônias

que continham insertos foram submetidas à extração plasmidial (item I-1.6), os

plasmídeos foram quantificados, seqüenciados (item I-1.8) e as seqüências

obtidas foram analisadas de acordo com item descrito abaixo.

Reação 3

Material

Quantidades

Primer T7 (20 pmol/l) 0,25 l

Primer T3 (20 pmol/l) 0,25 l

Taq (1 l/5U) 0,2 l

DNA -

dNTP (1 mM)

2,5 L

Tampão 1B (10x)

2,5 l

Água deionizada estéril

19,3 l

Vol. Final

25 l

Programa 3

1- 94

C por 3 minutos (desnaturação);

2- 94

C por 30 segundos (desnaturação);

3- 60

C por 30 segundos (anelamento);

4- 72

C por 30 segundos (extensão);

5- Repetir o ciclo 5 vezes a partir da etapa 2;

6- 94

C por 30 segundos (desnaturação);

7- 56

C por 30 segundos (anelamento);

8- 72

C por 30 segundos (extensão);

9- Repetir o ciclo 25 vezes a partir da etapa 6;

10- 72

C por 5 minutos ;

11- 4

C por tempo indefinido

2.5 – Análise das ESTs obtidas

Esta etapa, foi um trabalho em colaboração com o Laboratório de

Biodados/ICB do Prof. Miguel Ortega, e foi realizada pelo aluno de doutorado

Maurício Mudado.

2.5.1 – Análises Bioinformáticas

As análises bioinformáticas foram feitas em computador de mesa

comum com sistema operacional Linox. Os cromatogramas providos de

seqüenciador automático (MegaBACE DNA sequencing - Amersham) foram

processados pelo pacote phred, phrap consed (http://www.phrap.org) foram

geradas 910 ESTs nomeadas com o programa phred com parâmetros default

(filtro de corte por qualidade desligado). Essas seqüências foram filtradas para

remoção de seqüência do plasmídeo pelo software cross-match e depois

agrupadas (clusterizadas) com phrap.

2.5.2 – Anotação Automática

Foi usado o pacote BLAST do NCBI para alinhar as seqüências obtidas

com o UniProt. As seqüências protéicas em formato FASTA do UniProt foram

obtidas do sítio do UniProt (http://www.uniprot.org

), que incluíam seqüências do

SwissProt e TrEMBL (total de 5.036.670). Foram obtidas anotações das

proteínas do UniProt com ontologias GO (Gene Ontology) via projeto GOA

(http://www.ebi.ac.uk/GOA

). As ontologias do GO foram baixadas do sítio

http://www.geneontology.org e populadas em um bando de dados relacional

MySQL. Foi feito um BLASTx com valor de corte de e-value a 1e

-5

e saída m8.

Os melhores alinhamentos (scores) foram selecionados e populados em banco

de dados. Os resultados de anotação com GO foram feitos com ordenação das

ontologias pelos valores mais abrangentes das hierarquias de GO(nós mais

próximos dos componentes raiz: processos biológicos, componente celular e

função molecular).

 – Construção dos cassetes

Foram construídos cassetes de expressão com o DNA de três proteínas

do veneno do T. serrulatus: TsNTxP, proteína não tóxica, mas muito

imunogênica; TsTx, principal toxina  do veneno e TsTx-I, principal toxina  do

veneno.

Duas metodologias foram usadas: ligação de mais de uma cópia do DNA

da mesma proteína (proteínas em tandem) e ligação de DNA das diferentes

proteínas em um mesmo plasmídeo (proteína quimérica).

A proveniência do DNA das proteínas utilizadas está descrita na tabela

abaixo.

Tabela 2 – Origem do DNA das proteínas

Proteína Origem

TsNTxP Vetor de expressão pMAL

TsTx-I Clone da Biblioteca de cDNA

TsTx Clone da Biblioteca de cDNA

1 - Construção de proteínas em tandem

O plasmídeo que foi utilizado para a montagem das proteínas em

tandem é o pBluescript II KS-, por apresentar uma grande variedade de sítios

de enzimas de restrição o que permite a inserção de vários fragmentos (Figura

15). Foram clonados no pBluescript 1, 2 e 4 cópias de TsTx-I. A primeira cópia

foi inserida no sítio de restrição Hind III. Na segunda montagem (tandem de

duas seqüências - di), o vetor pBluescript que contém a seqüência da TsTx-I

inserida no sítio de restrição da Hind III foi utilizado para a clonagem de mais

um fragmento de DNA da TsTx-I no sítio de restrição Sal I. Na terceira

construção (tandem de quatro seqüências - tetra), os dois fragmentos de DNA

que codificam para TsTx-I foram amplificados juntos e inseridos no sítio de

restrição Eco RI (Figura 16). Todas estas etapas foram feitas pelo uso de

primers construídos para amplificar a seqüência da TsTx-I, mas que continham

os sítios de restrição a serem utilizados em cada montagem, permitindo assim

a inserção dos fragmentos de DNAs nos locais desejados.

Figura 15 – Mapa do vetor pBluescript II KS +/-. No quadro em destaque

podemos ver o sítio múltiplo de clonagem (MCS). Os sítios das enzimas de

restrição que foram utilizadas neste trabalho estão circulados.

Figura 16 – Construção de proteínas em Tandem da TsTx-I.

pBluescript

1.1 - Clonagem do DNA da TsTx-I em pGEM

Da biblioteca de cDNA foi isolado um clone (1D6) contendo a seqüência da

toxina TsTx-I. O DNA foi então amplificado (20 reações – reação e programa

estão descrito abaixo), misturado ao tampão de amostra Loading Buffer e

aplicado em gel de agarose 1%. Após coloração, a banda de interesse foi

cortada do gel e purificada como descrito no item I-1.3.1. O DNA purificado foi

ligado ao vetor pGEM T Easy (item I-1.3.2). O produto da ligação foi

transformado em bactérias DH5 como descrito abaixo (item II-2) e das

colônias provenientes foi feito uma PCR de colônia (item I-1.5). Algumas

colônias foram selecionadas e utilizadas para extração plasmidial (item I-1.6).

Os clones foram então cortados com a enzima de restrição Hind III para

comprovação da clonagem e os clones que apresentaram liberação da banda

de tamanho esperado foram seqüenciados (itens I-1.7 e 1.8).

Reação 4

Materiais Quantidades

Primer Senso (20 pmol/l)

0,25 l

Primer anti-senso (20 pmol/l)

0,25 l

Taq (1 l/5U)

0,2 l

DNA molde

100-200 g

dNTP (1 mM)

2,5 L

Tampão 1B (10x)

2,5 l

Água deionizada estéril

q.s.p 25

l

Programa 4

1- 94

C por 3 minutos (desnaturação);

2- 94

C por 30 segundos (desnaturação);

3- 58

C por 35 segundos (anelamento);

4- 72

C por 30 segundos (extensão);

5- Repetir o ciclo 5 vezes a partir da etapa 2;

6- 94

C por 30 segundos (desnaturação);

7- 54

C por 30 segundos (anelamento);

8- 72

C por 30 segundos (extensão);

9- Repetir o ciclo 25 vezes a partir da etapa 6;

10- 72

C por 5 minutos ;

11- 4

C por tempo indefinido

1.2 - Transformação química

1.2.1. - Bactérias quimicamente competentes

Foi feita uma estria nova das bactérias E. coli DH 5 em LB/ágar na noite

anterior. Foram coletadas 1-5 colônias e essas foram crescidas por 2-3 horas

em meio LB, até atingir uma DO

600

= 0,5-0,6. Foi feita uma centrifugação das

células a 1500g por 5 minutos a 4C. O sobrenadante foi retirado e o pellet

ressuspendido em 40 mL de tampão Tfb I gelado por 100 mL de cultura. Os

tubos contendo a cultura foram deixados no gelo por 5-10 minutos e

centrifugadas novamente. O pellet foi ressuspendido gentilmente com 4 mL de

Tfb II gelado por 100 mL de cultura. As bactérias foram aliquotadas em tubos

de 500 l (100-200 l) e estocadas a -80C.

1.2.2 - Transformação química

As células foram descongeladas no gelo. Foram acrescentados 2 l da

ligação a 40 l de células (as células ficam saturadas com a razão de 1 ng de

DNA por l de células). A mistura foi deixada por 30 minutos no gelo. E então

transferidas para banho a 42C por 90 segundos e imediatamente transferidas

para o gelo. Foram adicionados 800 l de meio SOC e as células foram

incubadas por 45 minutos a 37C. Foram plaqueadas em LB/ágar com

antibiótico (ampicilina 100 g/mL).

1.3 - Subclonagem do DNA da TsTx-I em pBluescript

1.3.1- Obtenção do pBluescript

A extração em grande escala do plasmídeo pBluescript II KS- contido em

E. coli DH5 foi feita de acordo com o método de lise alcalina-SDS descrito por

Sambrook e cols. (1989).

O plasmídeo foi purificado com fenol, como descrito a seguir. Ao

pBluescript foi adicionado o mesmo volume de fenol e misturado bem. Foi feita

uma centrifugação à 12000g por 5 minutos em temperatura ambiente. A fase

superior que contém o DNA foi recolhida e transferida para outro tubo, o fenol

que está na fase inferior foi descartado. À fase do DNA foi adicionado o mesmo

volume de fenol-clorofórmio (1:1), foi misturado e depois centrifugado a 12000g

por 5 minutos em temperatura ambiente. Novamente a fase superior foi

recolhida e transferida para outro tubo, e a esta foi adicionado o mesmo volume

de clorofórmio. Misturamos e centrifugamos a 12000g por 5 minutos em

temperatura ambiente. A fase superior foi recolhida e passada para um novo

tubo. A esta foi adicionados 1/10 de volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 e 2

volumes de etanol 99%. A mistura foi deixada em repouso por 10 minutos à

temperatura ambiente. E centrifugada a 12000g por 10 minutos a 4

C. O

sobrenadante foi descartado, o precipitado lavado com etanol 70% e depois de

seco, ressuspendido em TE pH 8,0.

O plasmídeo purificado com fenol foi cortado com as enzimas de

restrição Xho I, Sal I, Hind III e Eco RI como já descrito (item I-1.7) para

verificar se sua qualidade estava boa. O vetor foi seqüenciado e analisado

(itens I-1.8 e 1.9).

1.3.2 - Purificação do DNA TsTx-I

O clone A1 que contem o DNA da TsTx-I em pGEM (15 g) foi cortado

com a enzima Hind III (item I-1.7). Depois do corte, o clone A1 cortado foi

precipitado e submetido a gel de agarose 1%, a banda correspondente ao

fragmento de DNA da TsTx-I foi recortado do gel e o DNA purificado pelo

método da sílica (item I-1.3.1).

1.3.3 - Desfosforilação de plasmídeo

O vetor pBluescript (15 g) foi cortado com a enzima de restrição Hind III

(item I-1.7). Depois do corte, o vetor foi precipitado e desfosforilado, como

descrito abaixo.

Depois do corte com enzima de restrição, o DNA foi precipitado e

ressuspendido na proporção 10 pmols (end) para 40 l de Tris 10 mM pH 8,0 (1

g de 1000 pb de DNA = 1,52 pmols de DNA = 3,03 pmols end). A enzima

CIAP (calf intestinal alkaline phosphatase) foi diluída em tampão próprio (CIAP

buffer Reaction 1x) para concentração final de 0,01 U/l. Cada pmol de DNA

end requer 0,01 U de CIAP. A reação foi feita da seguinte maneira:

Material Quantidades

DNA (10 pmols end)

40 l

CIAP buffer Reaction 10x

5 l

CIAP (0,01 U/l) 5 l

Volume final

50 l

A reação foi incubada a 37C por 30 minutos. Foi adicionada outra

alíquota de CIAP diluída (5 l) e a incubação a 37C continuou por mais 30

minutos. Foram adicionados 300 l de CIAP stop buffer para 10 pmols end. A

purificação foi feita com fenol:clorofórmio (1:1) e o DNA foi precipitado com 0,5

volumes de acetato de amônia 7,5 M pH 5,5 e 2 volumes de etanol 99%. O

precipitado foi ressuspendido em TE 0,5x.

1.3.4 - Ligação do DNA da TsTx-I no vetor pBluescript

A reação de ligação do DNA purificado da TsTx-I em pBluescript

desfosforilado foi realizada da seguinte maneira:

Vetor

100 g/l

DNA 100 g/l

0,5 l

1,0 l

1,5 l

0,5 l

0,6 l de T4 U/l

1 l de tampão 10x

7,4 l de H

0,6 l de T4 U/l

1 l de tampão 10x

6,9 l de H

0,6 l de T4 U/l

1 l de tampão 10x

6,4 l de H

1,0 l

0,6 l de T4 U/l

1 l de tampão 10x

6,9 l de H

0,6 l de T4 U/l

1 l de tampão 10x

6,4l de H

0,6 l de T4 U/l

1 l de tampão 10x

5,9 l de H

1,5 l

0,6 l de T4 U/l

1 l de tampão 10x

6,4 l de H

0,6 l de T4 U/l

1 l de tampão 10x

5,9 l de H

0,6 l de T4 U/l

1 l de tampão 10x

5,4 l de H

A reação foi misturada bem e deixada incubando 16 horas a 16C. Após

esse tempo, o DNA foi precipitado com 1/10 do volume de acetato de sódio 3M

pH 5,2 e 2 volumes de etanol 96%. Em seguida, os tubos foram centrifugados a

12000g durante 10 minutos. O precipitado foi lavado com etanol 70%,

ressuspendido em 4 l de água deionizada e mantido a 4ºC.

O produto da ligação foi utilizado para transformar quimicamente bactérias

DH5 de acordo com item II-2.

As colônias obtidas foram submetidas a PCR de colônia (item I-1.5). A reação

e o programa utilizados estão descritos abaixo.

Reação 5

Materiais Quantidades

Primer Senso (20 pmol/l) 0,15 l

Primer anti-senso (20 pmol/l) 0,15 l

Taq 2(1 l/5U) 0,4 l

DNA -

dNTP (1 mM)

2,5 L

Tampão V(30) (10x)

2,5 l

Água deionizada estéril

19,3 l

Vol. Final

25 l

Programa 5

1- 94

C por 3 minutos (desnaturação);

2- 94

C por 30 segundos (desnaturação);

3- 58

C por 35 segundos (anelamento);

4- 72

C por 30 segundos (extensão);

5- Repetir o ciclo 5 vezes a partir da etapa 2;

6- 94

C por 30 segundos (desnaturação);

7- 54

C por 30 segundos (anelamento);

8- 72

C por 30 segundos (extensão);

9- Repetir o ciclo 25 vezes a partir da etapa 6;

10- 72

C por 5 minutos ;

11- 4

C por tempo indefinido.

Das colônias positivas, foram extraídos os plasmídeos (item I-1.6) e esses

foram cortados com a enzima Hind III (item I-1.7). Os clones foram seqüenciados

de acordo com item I-1.8.

1.3.5 – Clonagem do DNA da TsTx-I no vetor pET 11a

O clone 16 (vetor pBluescript+TsTx-I

(1)

) foi amplificado utilizando primers

novos que vão inserir o sítio de restrição da enzima Bam HI.

Primer pET-TsTx-I Senso 1 GGA TCC ATC GAT AAG CTT AAA GAA GGT

Primer pET-TsTx-I Anti-senso 1 GGA TCC TCA GAT ATC AAG CTT ACA TTT GTT

A PCR foi então padronizada. A temperatura de anelamento média dos

primers é 56,6C. Várias temperaturas foram testadas, o Programa 4 foi

utilizando, mas as duas temperaturas de anelamento foram modificadas:

56/52C, 54/52C, 58/54C, 60/56C. Três tampões foram testados: IB, IC e

V(30), todos da marca PHT.

Os melhores programa e tampão foram utilizados para uma amplificação

em larga escala. O amplicon foi precipitado e corrido em gel de agarose 1%. A

banda de interesse foi cortada e o DNA foi purificado pelo método da

Sílica/Guanidina (item I-1.3.1). Este foi ligado no vetor pGEM (item I-1.3.2) e o

produto da ligação foi transformado (item II-2). As colônias obtidas foram

passadas para uma placa com X-gal e IPTG e as colônias brancas e azuis

claras foram analisadas por PCR de colônia (item I-1.5). Das colônias positivas

o plasmídeo foi extraído por lise alcalina (item I-1.6).

Os plasmídeos obtidos foram purificados com resina Sephacryl S-400

para retirar impurezas. A resina (500 l) foi acrescentada no tubo apropriado,

que foi centrifugado 1 minuto a 1000g. O tampão (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 300

mM KCl, 5 mM MgCl

, 0,1 mM EDTA) foi acrescentado (500 l) e foi feita uma

nova centrifugação na mesma velocidade e tempo. O procedimento foi repetido

duas vezes o procedimento anterior. Acrescentar o plasmídeo (2 g) com 20 l

de água destilada. Centrifugar 2 minutos a 2000g. Usar o sobrenadante eluído

para o corte com a enzima Bam HI (item I-1.7). Os plasmídeos que liberaram

fragmento do tamanho esperado foram seqüenciados (item I-1.8).

O clone 31b continha o DNA da TsTx-I inserido corretamente no sítio da

Bam HI. Este clone foi utilizado para a clonagem da TsTx-I no vetor de

expressão pET 11a. Os dois vetores foram cortados com a enzima Bam HI

(item I-1.7). As pontas do vetor pET foram desforiladas (item II-1.3.3). O clone

31b cortado foi corrido em gel de agarose 1% e a banda de interesse foi

cortada e purificada pelo método descrito abaixo.

O protocolo “freezing squeeze” para purificação de fragmentos de DNA

de gel de agarose foi descrito por Tautz e Renz (1983). Esse método é muito

fácil de fazer, é rápido e não inclui nenhuma extração com reagentes tóxicos. É

barato, pois não precisa de agarose low melting. A recuperação do produto é

de aproximadamente 50% ou mais. O gel deve ser corrido em TAE novo. A

banda cortada deve ser colocada em um tubo com 10 mL de tampão acetato

(300 mM de acetato de sódio, 1 mM de EDTA pH 7,0). Incubar com leve

agitação por 30 minutos no escuro. Colocar o pedaço de gel em um tubo com

um filtro, esfriar por 30 minutos a -70C e centrifugar, sem prévio

descongelamento, por 15 minutos a 12000g. Ao eluído, adicionar 1/100 volume

de MgCl

1 M (em ácido acético glacial) e 2,5 volumes de etanol absoluto,

incubar por pelo menos 1 h a -20C. Centrifugar por 15 minutos a 12000 g,

lavar o pellet com etanol 70% e deixar secar. Ressuspender o pellet seco em

20 l de água destilada. O DNA purificado foi quantificado em gel de agarose

1%.

O DNA da TsTx-I purificado e o pET desfosforilados foram ligados como

descrito abaixo.

Material Quantidade

Vetor 100 ng

inserto *100/ 200/ 300 ng

T4 DNA Ligase (3 U/l) 1 l

Tampão de ligação 2x

5 l

Água deionizada

q.s.p 10 l

Volume final

10 l

*Cada uma das quantidades de inserto representam ligações individuais, ou

seja, realizadas em tubos diferentes.

A reação foi homogeneizada e deixada incubando por 16 horas a 4C. Após

esse tempo, o conteúdo dos três tubos foi transferido para um único tubo e o

DNA foi precipitado com 1/10 do volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 e 2

volumes de etanol 96%. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 12000g

durante 10 minutos. O precipitado foi lavado com etanol 70%, ressuspendido

em 4 l de água deionizada e mantido a 4ºC.

O produto da ligação foi transformado em bactérias DH5 (item I-1.4.2).

As colônias positivas foram verificadas por PCR de colônia (item I-1.5) e os

seus plasmídeos foram extraídos por lise alcalina (item I-1.6). Os clones

analisados por corte com enzima de restrição e PCR (item I-1.7 e reação e

programa 4). Os plasmídeos que continham o inserto foram seqüenciados (item

I-1.8).

1.4 - Montagem da TsTx-I com 2 cópias de DNA

Como no clone 14 foram inseridas 2 cópias do DNA da TsTx-I, foi

necessário apenas sua clonagem no vetor pET 11a.

Novos primers foram construídos para inserção do sítio de restrição da

Bam HI (onde o DNA devia ser inserido no pET). A reação com os primers

novos teve que ser padronizada como no item II-1.3.5. Todos os procedimentos

para clonagem do DNA da TsTx-I

(2)

no pET foram os mesmos descritos no item

II-1.3.5.

Primer pET-TsTx-I Senso 1 GGA TCC ATC GAT AAG CTT AAA GAA GGT

Primer pET-TsTx-I Anti-senso 1 GGA TCC

TCA GAT ATC AAG CTT ACA TTT GTT

1.5 - Montagem da TsTx-I com 4 cópias de DNA

1.5.1 – Subclonagem no vetor pBluescript

Novos primers foram construídos para inserção do sítio de restrição Eco

RI no DNA da TsTx-I

(2)

. Sendo assim, o DNA contendo 2 cópias da toxina após

amplificação com estes primers teria nas pontas do fragmento inseridos o sítio

da Eco RI. Este fragmento foi inicialmente inserido no vetor pGEM e depois ele

foi cortado e inserido no sítio da Eco RI do clone 14, que já continha 2 cópias

da TsTx-I no sítio de restrição da Hind III, ficando assim com 4 cópias da

toxina.

Primer TsTx-I

(4)

Senso 1 GAA TTC ATC GAT AAG CTT AAA GAA GGT

Primer TsTx-I

(4)

Anti-senso 1 GAA TTC GAT ATC AAG CTT ACA TTT GTT

Todos os procedimentos para padronização dos primers e clonagem do

fragmento de DNA da TsTx-I com 2 cópias no clone 14 foram os mesmos

descritos no item II-1.3.5.

1.5.2 – Clonagem no vetor pET 11a

Após a obtenção do vetor pBluescript com 4 cópias do DNA da TsTx-I,

fragmento de DNA TsTx-I

(4)

foi inserido no vetor de expressão pET 11a. Para

isso, foi necessário a inserção no fragmento do sítio de restrição da enzima

Bam HI. Então novos primers foram construídos. O clone A6 (com 4 cópias de

TsTx-I) foi amplificado com os primers descritos abaixo.

pBluescript Senso 1 5’ GGA TCC AGC TAT GAC CAT GAT TAC GCC 3’

pBluescript Senso 2 5’ GGA TCC GGG CCC CCC CTC GAG GTC GAC 3’

pBluescript anti-senso 1 5’ CGC TCT AGA ACT AGT GGA TCC CCC GGG TCA 3’

pBluescript anti-senso 2

5’ TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGA TCC TCA 3’

A PCR foi então padronizada. Inicialmente foi utilizado uma máquina de

PCR Eppendorf que faz gradiente, para tentar identificar qual a faixa de

temperatura seria melhor para o anelamento dos primers. O programa está

descrito abaixo. Depois várias temperaturas foram testadas, o programa 4 foi

utilizando, mas as duas temperaturas de anelamento (5 ciclos com uma

temperatura e 25 ciclos com outra) foram modificadas: 50/48, 54/52, 56/54C,

58/56C, 58/54C, 60/56C, 62/58C, 64/60C, 66/62C, 68/64C. Três tampões

foram testados: IB, IC e V(30), todos da marca PHT.

Programa 6

1- 94

C por 3 minutos (desnaturação);

2- 94

C por 30 segundos (desnaturação);

3- 60

C por 35 segundos (anelamento);

Gradiente 8,0

4- 72

C por 30 segundos (extensão);

5- 72

C por 5 minutos ;

6- 4

C por tempo indefinido

Well Temp. Well Temp.

1 52,1 7 61,8

2 52,7 8 63,9

3 53,8 9 65,7

4 55,5 10 67,2

5 57,4 11 68,2

6 59,6 - -

Os melhores programas e tampões foram utilizados para uma

amplificação em larga escala. O amplicon foi precipitado e corrido em gel de

agarose 1%. A banda de interesse foi cortada e o DNA foi purificado com kit da

promega “Wizard SV gel and PCR clean-up System” de acordo com as

instruções do fabricante. Este foi ligado no vetor pGEM (item I-1.3.2) e o

produto do produto da ligação foi transformado (item II-2). Vinte colônias foram

selecionadas e tiveram seus plasmídeos extraídos por lise alcalina (item I-1.6).

Destes 10 clones foram analisados por corte com enzima de restrição e PCR

(item I-1.7e reação e programa 4). Os plasmídeos que continham o inserto

foram seqüenciados (item I-1.8).

O clone 4.1 continha o DNA da TsTx-I

(4)

inserido corretamente no vetor.

Este clone foi utilizado para a clonagem no vetor de expressão pET 11a. Os

dois vetores foram cortados com a enzima Bam HI (item I-1.7). As pontas do

vetor pET foram desforiladas (item II-1.3.3). O clone 4.1 cortado foi corrido em

gel de agarose 1% e a banda de interesse foi cortada e purificada com kit da

promega “Wizard SV gel and PCR clean-up System” de acordo com as

instruções do fabricante.

O DNA da TsTx-I (4) purificado e o pET desfosforilados foram ligados

como descrito abaixo.

Material Quantidade

Vetor 100 ng

Inserto

100/ 200/ 400 ng

T4 DNA Ligase (3 U/l) 1 l

Tampão de ligação 2x

5 l

Água deionizada

q.s.p 10 l

Volume final

10 l

*Cada uma das quantidades de inserto representam ligações individuais, ou

seja, realizadas em tubos diferentes.

A reação foi homogeneizada e deixada incubando por 16 horas a 4C. Após

esse tempo, o conteúdo dos três tubos foi transferido para um único tubo e o

DNA foi precipitado com 1/10 do volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 e 2

volumes de etanol 96%. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 12000g

durante 10 minutos. O precipitado foi lavado com etanol 70% e depois de seco,

ressuspendido em 4 l de água deionizada e mantido a 4ºC.

O produto da ligação foi transformado em bactérias Topo 10 (item II-2).

Vinte colônias foram escolhidas e os seus plasmídeos foram extraídos por lise

alcalina (item I-1.6). Os clones foram analisados por corte com enzima de

restrição e PCR (item I-1.7e reação e programa 4). Os plasmídeos que

continham o inserto foram seqüenciados (item I-1.8).

2 - Construção da proteína quimérica

Nessa parte foram utilizadas a seqüência de nucleotídeo das proteínas

TsNTxP, TsTx e TsTx-I e a partir delas primers foram construídos para

amplificá-las (Figura 14). Para a montagem dessa proteína também foi utilizado

o vetor pBluescript II KS-. A seqüência de DNA que codifica para TsNTxP foi

inserida no sítio de restrição da Xho I, a da TsTx foi inserida em Sal I e a da

TsTx-I foi inserida em Hind III. As seqüências de nucleotídeos das três

proteínas já foram descritas, o que nos possibilitou a construção dos primers

para amplificar a região da proteína madura de cada uma delas. Os primers

das toxinas foram sintetizados com o sítio de restrição específico para cada

uma delas nas pontas, permitindo assim a inserção dos DNAs nos locais

desejados. Primeiramente os DNAs foram inseridos em um vetor de fácil

clonagem, o vetor pGEM T Easy e em seguida cortados e inseridos no

pBluescript II KS- (Figuras 12 e 17 ).

A seqüência de nucleotídeos da TsNTxP já tinha sido obtida da biblioteca

de cDNA da glândula de veneno do escorpião Tityus serrulatus e clonada no

vetor pMAL (Guatimosim e cols., 1999; Mendes e cols., 2004). Este vetor foi

amplificado com os primers que introduziram o sítio de restrição da enzima Xho

I ao DNA da TsNTxP.

Neste trabalho, através da busca de novas seqüências de proteínas na

biblioteca de cDNA da glândula de veneno do T. serrulatus, as seqüências de

nucleotídeos da TsTx-I e TsTx foram obtidas e usadas para as construções das

proteínas recombinantes.

Os primers utilizados são os descritos na Figura 14.

Figura 17 - Construção da proteína quimérica.

2.1 – Obtenção do DNA da TsNTxP

O clone 1 do vetor pMAL com o DNA da TsNTxP inserido foi usado

como molde para amplificar o DNA da proteína com os novos primers, que

inseriram o sítio da enzima Xho I nas pontas do fragmento. Os primers estão

descritos na Figura 14. O programa e reação 4 descritos anteriormente foram

usados para esta amplificação.

O amplicon foi corrido em um gel de agarose 1% e a banda de interesse

foi cortada e purificada pelo método da sílica/guanidina (item I-1.3.1). O DNA

da TsNTxP purificado foi ligado no vetor pGEM como descrito anteriormente

(item I-1.3.2). O produto da ligação foi transformado em bactérias DH5 (item I-

1.4.2) e 24 colônias foram selecionadas para a extração plasmidial (item I-1.6).

Destes 14 foram cortados com a enzima Xho I para verificar se a ligação

funcionou (item I-1.7) e os clones positivos foram seqüenciados (item I-1.8).

2.2 – Ligação do DNA da TsNTxP ao pBluescript+TsTx-I

Os clones 14 (pBluescript+TsTx-I

(2)

) e 16 (pBluescript+TsTx-I

(1)

) foram

cortados com Xho I e tiveram suas pontas desfosforiladas (itens I-1.7 e II-

1.3.3). O clone 50(5) – pGEM+TsNTxP – foi cortado com Xho I, corrido em gel

de agarose 1% e a banda de interesse cortada e purificada pelo método da

sílica guanidina (itens I-1.7 e I-1.3.1). Os vetores pBluescript cortados e o DNA

da TsNTxP purificado foram ligados com descrito anteriormente (item II-1.3.4).

O produto da ligação foi transformado em bactérias (item II-1.2.2), as colônias

obtidas foram analisadas por PCR de colônia (item I-1.5). As positivas tiveram

seus plasmídeos extraídos por lise alcalina (item I-1.6). Os clones foram

analisados por PCR e corte com as enzimas de restrição Xho I e Hind III

(Programa e reação 4 e item I-1.7), os que liberaram fragmentos do tamanho

esperado foram seqüenciados (item I.1.8).

2.3 – Obtenção do DNA da TsTx

O clone 3E9 da biblioteca de cDNA da glândula de veneno do Tityus

serrulatus contendo o DNA da TsTx inserido foi usado como molde para

amplificar o DNA desta toxina com os primers que inseriram o sítio da enzima

Sal I nas pontas do fragmento. Os primers estão descritos na Figura 14. O

programa e reação 4 descritos anteriormente foram usados para esta

amplificação.

O amplicon foi corrido em um gel de agarose 1% e a banda de interesse

foi cortada e purificada pelo método da sílica/guanidina (item I-1.3.1). O DNA

da TsTx purificado foi ligado no vetor pGEM como descrito anteriormente (item

I-1.3.2). O produto da ligação foi transformado em bactérias DH5 (item II-

1.4.2). Das colônias obtidas os plasmídeos foram extraídos (item I-1.6). Todos

os clones foram cortados com a enzima Sal I para verificar se a ligação

funcionou (item I-1.7) e os clones positivos foram seqüenciados (item I-1.8).

2.4 - Ligação do DNA da TsTx ao pBluescript+TsTx-I+TsNTxP

Os clones 14(1) - pBluescript+TsTx-I

(2)

+TsNTxP e 16(36) - pBluescript+

TsTx-I

(1)

+TsNTxP foram cortados com Sal I e tiveram suas pontas

desfosforiladas (itens I-1.7 e II-1.3.3).O clone 3 – pGEM+TsTx – foi cortado

com Sal I, corrido em gel de agarose 1% e a banda de interesse cortada e

purificada pelo método “freeze squeez“ (itens I-1.7 e II-1.3.5). Os vetores

pBluescript cortados e o DNA da TsTx purificado foram ligados com descrito

abaixo. O produto da ligação foi transformado em bactérias DH5 (item I-1.4.2),

as colônias obtidas foram analisadas por PCR de colônia (item I-1.5). As

positivas tiveram seus plasmídeos extraídos por lise alcalina (item I-1.6). Os

clones foram analisados por corte com as enzimas de restrição Sal I (item I-

1.7), os que liberaram fragmentos do tamanho esperado foram seqüenciados

(item I.1.8).

Material Quantidade

Vetor 100 ng

inserto 100 ng

T4 DNA Ligase (3 U/l) 1 l

Tampão de ligação 2x

5 l

Água deionizada

q.s.p 10 l

Volume final

10 l

 - Expressão

1- Sistema de expressão

A expressão das proteínas recombinantes foi realizada no vetor pET 11a

(Stratagene – Figura 18). O sistema de expressão pET é um dos sistemas mais

utilizados para clonagem de expressão in vivo de proteínas recombinantes em

E. coli. Isto devido à alta seletividade da RNA polimerase do bacteriófago T7

em reconhecer a seqüência do promotor T7; o alto nível de atividade da T7

polimerase e eficiente tradução mediada pelos sinais de iniciação da tradução

do gene 10.

O vetor de expressão pET é derivado do plasmídeo pBR322 e

desenvolvido com a característica do gene 10 do bacteriófago T7 que promove

altos níveis de transcrição e tradução.

No sistema pET, a seqüência da proteína de interesse codificada é

clonada após o promotor T7 e em frame com a seqüência líder do gene 10. A

T7 RNA polimerase integrada cromossomicamente no cassete pelo promotor

LacUV5 do plasmídeo DE que está dentro da E. coli BL21, é expressa

preferencialmente quando é acrescentado IPTG no meio de cultura. Sendo

assim a proteína de interesse começa a ser expressa após indução com IPTG,

uma característica que é muito importante se o gene a ser expresso é tóxico

para a célula.

Alternativamente, os vetores pET 11 contem sítios de clonagem para

Bam HI em todas três janelas de leitura relativa à janela de leitura ao gene 10.

A clonagem usando o sítio da Bam HI resulta na proteína de fusão contendo 14

aminoácidos N-terminal do gene 10 (Figura 18).

Figura 18 - Representação esquemática e mapa da região MCS do vetor

pET 11a. No retângulo, estão mostrados o sítio de ligação dos ribossomos

(RBS) e os sítios das enzimas de restrição que podem ser usadas para a

clonagem.

2 - Expressão piloto e curva de expressão da proteína recombinante

em células de bactérias da linhagem BL21 DE 3

Após a seleção do clone com corte de enzima de restrição e

seqüênciamento, este foi submetido à análise de expressão. Foi realizada uma

expressão piloto e uma curva de expressão com meio de cultura 2xYT broth.

Bactérias E. coli da linhagem BL21(DE3) e Origami foram transformadas (item

II-1.2.2) com o plasmídeo contendo a proteína recombinante clonada. As

bactérias foram crescidas em placa contendo meio LB/ágar e ampicilina 100

g/mL ou tetraciclina+Clorofenicol (12,5 e 30 g/mL) durante 18 horas a 37

Posteriormente uma colônia isolada foi crescida a 37

C em 3 mL de meio 2xYT

contendo antibiótico adequado durante 16 horas. Cem microlitros dessa cultura

foram adicionados em 10 mL de meio 2xYT contendo antibiótico nas mesmas

concentrações. As células foram mantidas à 37

C, 180 rpm até que atingirem

600

= 0.5. No momento em que a cultura atingiu essa densidade celular, foi

feita a indução da expressão da proteína recombinante através da adição de

IPTG para a concentração final de 0,6 mM. Alíquotas de 500 l foram retiradas

após 16 horas (expressão piloto) ou de 0, 2, 4, 6, 8, 12 e 24 horas de

incubação após a adição de IPTG (curva de expressão). Cada alíquota foi

centrifugada a 14000g por 2 minutos em microcentrífuga e ressuspendida com

tampão de amostra para SDS-PAGE 2x (25 l para o tempo 0 e 50 l para os

demais tempos de incubação) para posterior corrida eletroforética em gel de

poliacrilamida (item III-8).

3 - Expressão em larga escala

Uma colônia isolada foi inoculada em 40 mL de 2xYT com 100 g/mL de

ampicilina e crescida por 16 horas à 37

C, com agitação de 180 rpm. Essa

cultura foi adicionada a 2 L de 2xYT contendo 100 µg/mL de ampicilina em

elermeyer de 6 L. Após as células atingirem DO

600

=0,5 uma alíquota de 1 mL

era retirada (tempo sem indução) e então o IPTG era adicionado na

concentração final de 0,6 mM e as células continuaram crescendo por 4 horas

a temperatura de 37

C. Então, as células eram centrifugadas a 3000 g por 15

minutos. O pellet era ressuspendido em tampão de lise (materiais e métodos) e

as células ressuspendidas eram lisadas (item III-5). Uma alíquota de 10 l era

diluída em 10 l de tampão de amostra SDS-PAGE 2x (tempo 4 horas). Um gel

de poliacrilamida era corrido com estas amostras para verificar a expressão.

4 – Expressão no fermentador

Inicialmente, era feita uma triagem para verificar qual colônia estava

expressando. Então, o plasmídeo contendo o DNA da toxina de interesse era

transformado em bactérias E. coli da linhagem BL21(DE3)

como descrito no

item item II-1.2.2. Dez colônias eram coletadas e inoculadas em 1 mL de

2xYT/Ampicilina, em seguida era feito crescimento de 16 horas a 37

C com

180 rpm de agitação. Após este período, 10 l de cultura foram inoculados em

10 mL de 2xYT/Amp e as bactérias eram crescidas até DO

600

=0,5; quando

eram inoculadas com 0,6 mM de IPTG. Depois de 4 horas de expressão, as

células eram centrifugadas a 3000 g por 15 minutos. O pellet era

ressuspendido em 0,5 mL de tampão de lise (materiais e métodos). Uma

alíquota de 10 l era diluída em 10 l de tampão de amostra SDS-PAGE 2x.

Um gel de poliacrilamida era corrido com estas amostras para verificar qual

colônia estava expressando.

O pré-inóculo de uma dessas colônias que estavam expressando era

usado para fazer o pré-inóculo da expressão no fermentador. Cem microlitros

deste pré-inóculo era inoculado em 100 mL de 2xYT/Amp e crescidos 16 horas

a 37

C com 180 rpm de agitação.

O fermentador utilizado é da marca BioFlo



110 Bench-Top Fermentor

que possui dorna de 7 litros. Para os experimentos neste trabalho foram

expressos 5 litros de 2xYT/Amp, inoculados com 100 mL de cultura pré-

crescida. Os parâmetros que foram controlados foram pH (7,0  0,2),

temperatura (37

C  0,5), agitação (mínima de 300 rpm e máxima de 500 rpm)

e oxigênio dissolvido (35% 1). A cada 1 hora uma alíquota era retirada para

medir a absorbância e acompanhar a curva de crescimento da bactéria. As

bactérias eram crescidas até DO

600

=0,5; quando eram inoculadas com 0,6 mM

de IPTG. Depois de 4 horas de expressão, as células eram centrifugadas a

8000g por 15 minutos (centrífuga Sorvall). O sobrenadante era descartado e o

pellet era congelado a –80

C e mantido nesta temperatura por 18 horas.

Decorrido este tempo, os pellets eram ressuspendidos em tampão de lise e

lisozima na concentração de 4 mg/mL em tampão de lise era então adicionada.

Mais uma vez as células eram mantidas a –80

C por 18 horas. Em seguida era

realizada a lise bacteriana como descrito no item III-5, mas a sonicação era

realizada 10 vezes, ao invés de 3. Alíquotas de 10 l de todas as amostras

eram diluídas em 10 l de tampão de amostra SDS-PAGE 2x. Um gel de

poliacrilamida era corrido com estas amostras para verificar a expressão.

5 - Lise celular

Após o período de incubação ideal as células foram centrifugadas a

3000g por 15 minutos a 4ºC e congeladas para posterior lise celular. O

precipitado foi ressuspendido em tampão de lise contendo 4 mg/mL de

lisozima, e congelado em gelo seco/etanol e posteriormente incubada em

banho-maria à 37ºC por 10 minutos. Este procedimento foi repetido por 3 vezes

e então o extrato foi sonicado (três pulsos de 20 segundos a 40% de amplitude

por 3 vezes). Posteriormente o extrato foi centrifugado (15 minutos à 8000g) e

os sobrenadantes submetidos à dosagem de proteínas (item III-6).

100

6 - Dosagem de proteínas

As dosagens de proteína foram realizadas utilizando o método descrito por

Bradford (1976).

Deve-se usar uma placa de ELISA ou de cultura de células de 96 wells.

Separar a primeira coluna para o branco e a segunda para o padrão. Na

primeira coluna, adicionar em todos os wells 20 l de tampão no qual sua

amostra a ser dosada está diluída. Na segunda coluna, adicionar em duplicata,

o padrão: solução de BSA 1 mg/mL diluída 1:10, de acordo com o seguinte

protocolo:

- 5 l de padrão + 15 l de tampão (0,5 g)

- 10 l de padrão + 10 l de tampão (1,0 g)

- 15 l de padrão + 5 l de tampão (1,5 g)

- 20 l de padrão (2,0 g)

Fazer diluições seriadas em duplicata de sua amostra nas outras

colunas, sempre mantendo o volume final de amostra de 20 l. Recomenda-se

fazer diluições na base de 2 ou de 10, ou mesmo repetir as mesmas diluições

do padrão. Acrescentar a todos os wells 180 l de Reagente de Bradford.

Efetuar a leitura em leitor de ELISA a 600 nm.

Fazer a curva do padrão no Excel usando regressão linear e com a

equação da reta calcular a quantidade de amostra e posteriormente a sua

concentração. Usar somente as absorbâncias das diluições que se

encontrarem dentro do limite mínimo e máximo imposto pelo padrão.

Equação da reta: y = Bx + A Então, x = y – A/B

Sendo que y é a absorbância e o x é a quantidade de proteína

Colocar no eixo y as absorbâncias obtidas do padrão e no eixo do x

colocar as quantidades: 0,5, 1, 1,5 e 2 g. Após calcular a quantidade de

proteína da amostra (x = y – A/B), calcular a concentração em mg/mL e

multiplicar pelo fator de diluição.

101

7 - Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

Foi utilizado o sistema de gel desnaturante descrito por Laemmli (1970). O

gel de separação era constituído de 15 ou 18% (v/v) de uma solução de

acrilamida/bisacrilamida 29:1 (p/p); Tris-HCl 0,4 M pH 8,8; SDS 0,1% (p/v); 50

mM de persulfato de amônia (PSA) e 0.05 % (v/v) de TEMED. O gel de

concentração era constituído de 4 % (v/v) de acrilamida/bisacrilamida 29:1

(p/p); Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8; SDS 0.1% (p/v); (PSA) 50 mM e TEMED

0.025% (v/v). As amostras foram misturadas ao tampão de amostra SDS-

PAGE com redução e fervidas durante 5 minutos e aplicadas no gel.

A eletroforese foi desenvolvida verticalmente, em placas de dimensão 10,0

x 8,0 x 0.8cm, à 100V, 24 mA, durante 3 horas. Após eletroforese, os géis

foram revelados com a solução corante de Comassie Blue por 45 minutos

(25

C) e lavados em solução descorante até o desaparecimento da coloração

de fundo.

8 - ELISA

A placa de ELISA foi sensibilizada por 16 horas a 4C com 0,5 g/poço

dos antígenos diluídos em tampão carbonato. A placa foi então lavada 2 vezes

com solução de lavagem (Materiais e métodos/item B) e bloqueada com

solução bloqueio (Materiais e métodos/item B) por incubação a 37C por 1

hora. Após lavar a placa 2 vezes com solução de lavagem; ela foi incubada

com soro imune e soro pré-imune por 1 hora a 37C. A placa foi lavada 6 vezes

com solução de lavagem e incubada com conjugado anti-IgG de coelho ou

camundongo peroxidase diluído 1:10.000 em tampão de incubação por 1 hora

a 37C. A placa foi novamente lavada 6 vezes e foram adicionados 100 l/poço

de solução substrato (2 mg de OPD, 2 l de H

e 10 mL de tampão citrato)

(Materiais e métodos/item B). A placa foi deixada 15-20 minutos no escuro e a

reação foi interrompida com 20 l/poço de H

diluído 1:20. Os valores de

absorbância foram determinados no comprimento de onda de 492 nm no

aparelho “Titertek Multiscan plate spectrophotometer”. Toda amostra é feita em

duplicata.

102

9 - Western Blotting

As amostras de proteína de interesse foram fracionadas por SDS-PAGE e

transferidas para membrana de nitrocelulose (0,45 m - SIGMA), sob corrente

de 100 V 350 mA por 1 hora (Towbin e cols., 1979). As proteínas foram então

submetidas ao reconhecimento do anticorpo como descrito por Guatimosin e

cols. (2000). Resumidamente, ligações a sítios não específicos foram

bloqueadas por 1h em PBS contendo 0,3% de Tween 20. As membranas de

nitrocelulose foram lavadas três vezes em PBS contendo 0,05% de Tween 20

(PBST) e incubadas por uma hora e meia em temperatura ambiente com soro

imune de interesse. Três lavagens com PBST foram feitas e então o conjugado

foi acrescentado na diluição adequada em PBS 1x. A membrana foi incubada

por uma hora a temperatura ambiente. Após três lavagens com PBST e duas

lavagens com PBS 1x a reação foi revelada pela adição do substrato da

peroxidade contendo 0,5 mg/mL de diaminobenzidine e 0,25 mg/mL de 4-

cloronaftol, 8% de metanol e 0,042% de H

30% ou 0,3 mg/mL de 4-

cloronaftol, 20% de metanol e 75 l de H

30% em PBS 1x.

IV- Produção de soros e teste de potência

1- Imunização dos animais

1.1 – Imunização dos camundongos

Após coletar o soro pré-imune de 6 camundongos Swiss (fêmeas) de 5

semanas, estes foram injetados subcutameamente com 10 g de veneno total

de Tityus serrulatus, ou 20 g de proteínas recombinantes: TsTx-I

(1)

(mono),

TsTx-I

(2)

(di) e TsNTxP/MBP ou PBS (controle negativo) emulsificado em

adjuvante completo de Freund’s (dia 1). Injeções subseqüentes foram feitas

nos dias 21 e 35, com a mesma dose em adjuvante incompleto de Freund’s.

Foram administradas 3 injeções de reforço de 10 g (veneno), 20 g

(TsNTxP/MBP) ou 30 g (TsTx-I

(1)

e TsTx-I

(2)

) de imunógeno com sete dias de

intervalo entre elas nos respectivos animais. Sete dias após a última injeção, os

animais foram sangrados por via intraorbital. O soro foi titulado por ELISA como

103

descrito abaixo. Mais uma dose reforço foi dada antes do desafio com o

veneno do T. serrulatus.

1.2 – Imunização dos coelhos

Para este experimento foram utilizados coelhos (machos) da raça Nova

Zelândia pesando aproximadamente 2 Kg e com cerca de 4 meses. Antes da

primeira dose de imunógeno foi feita uma sangria para obtenção do soro

controle pré-imune. Após coleta do soro pré-imune, os coelhos receberam 100

g de imunógeno (veneno bruto, TsTx-I

(1)

, TsTx-I

(2)

) em adjuvante completo de

Freund’s (Sigma). As injeções foram aplicadas por via subcutânea em 4 pontos

diferentes no dorso do animal (dia 1). Nas doses seguintes, nos dias 15 e 30, o

adjuvante completo foi substituído pelo incompleto e a quantidade de

imunógeno foi a mesma. Sete dias após a última dose, os coelhos foram

sangrados e o soro foi titulado por ELISA. Foram ainda necessárias mais 4

injeções de reforço de 150 g para atingirmos uma titulação adequada. Após

uma semana da última dose o soro foi coletado e caracterizado por ELISA. No

caso, do coelho imunizado com veneno total, as imunizações inicialmente

foram feitas com hidróxido de alumínio (dia 1, 15 e 30 e 4 reforços),

posteriormente eles foram imunizados mais 2 vezes com adjuvante incompleto

de Freund´s.

2 - Titulação dos soros dos animais

Placas de microtitulação (Falcon – Becton Dickinson) foram

sensibilizadas durante 18 horas a 4C com 100 l/poço de uma solução 0,5

g/poço de veneno total de Tityus serrulatus em tampão bicarbonato 0,02 M pH

9,6. Os soros dos camundongos e dos coelhos imunizados com o veneno total

e as proteínas recombinantes foram diluídos de 1:100 até 1:12.800. Soros pré-

imunes dos animais imunizados foram adicionados na placa como controle.

Este ensaio foi conduzido como previamente descrito por Chavéz-Olórtegui e

cols. (1991) e no item III-8 deste trabalho. A absorbância foi determinada a 492

nm com espectrofotômetro. Todas as medidas foram feitas em duplicatas.

104

3 – Determinação da DL

Foram utilizados 5 grupos de 8 camundongos (fêmeas) Swiss CF1 pesando

entre 18 a 22 g com 4 a 5 semanas. A DL

do veneno de Tityus serrulatus foi

determinada de acordo com Karber (1937). Resumidamente, cada grupo

recebe uma quantidade de veneno e o fator de diluição é 1,2. Sendo assim, se

o grupo 1 recebe 5,2 g de veneno total de T. serrulatus, o grupo 2 recebe 5,2

g x 1,2 (6,25 g) e assim por diante. A dose de veneno é diluída em PBS/BSA

1%, volume final de 100 l, que é injetado subcutaneamente nos

camundongos. A contagem de mortos foi feita 24h após o desafio. A dose letal

para matar 50% dos camundongos (DL

) foi calculada pelo programa

“PROBITOS”, cedido gentilmente pelo laboratório de Química Orgânica da

Faculdade de Química.

4 - Neutralização in vitro

Foram utilizados camundongos (fêmeas) Swiss CF1 pesando entre 18 a 22

g. A DL

do veneno de Tityus serrulatus foi determinada de acordo com Karber

(1937) e com descrito anteriormente. Amostras do veneno (1 ou 2 DL

) foram

incubados durante 1 hora a 37

C com 100 ou 200 l de soro dos coelhos

imunizados. Após este tempo esta solução foi injetada via subcutânea em cada

um dos camundongos dos grupos (cada um com 4 animais). O soro pré-imune

também foi pré-incubado, nas mesmas condições, com o veneno. A contagem

de sobreviventes foi feita 24h após o desafio.

5 - Capacidade de proteção após vacinação

Os camundongos imunizados no item IV-1.1 foram utilizados neste

ensaio. Após o ciclo de imunizações, eles foram pesados para fazer o cálculo

de quanto de veneno que seria usado. Os animais foram desafiados com 2

50.

Como os animais já eram adultos no início das imunizações, o acréscimo

de peso será basicamente de gordura, e não massa corporal. Sendo assim,

consideramos para os cálculos 60% do acréscimo do peso (veja exemplo

abaixo). A contagem de sobreviventes foi feita 24 e 48 horas após o desafio.

105

Peso inicial = 20 g

Acréscimo do peso = 10 g

2 DL

= 12,14 g/20 g de camundongo

60% do acréscimo = 6 g

Quantidade de veneno usada:

12,14 g  20 g de camundongo

x  26g de camundongo

x = 15,78 g

V – Análise dos dados

1 - Análise Estatística

Os dados foram expressos como média  desvio padrão. As análises

estatísticas entre os diferentes grupos foram feitas usando o teste t-student

com nível de significância de  < 0,01.

106

Resultados

Duas metodologias foram usadas para obter a seqüência de

nucleotídeos de toxinas do veneno do escorpião Tityus serrulatus: a partir do

DNA genômico e a partir de uma biblioteca de cDNA da glândula deste

escorpião. A primeira metodologia é mais usada quando se conhece a

seqüência de aminoácidos ou de nucleotídeos da proteína que se quer obter e

a segunda metodologia normalmente é usada para se obter seqüências de

novas proteínas.

Como as seqüências de aminoácidos e de nucleotídeos das toxinas

TsTx e TsTx-I já foram descritas (Martin-Eauclaire e cols., 1992, 1994), primers

foram construídos para sua obtenção a partir do DNA genômico, pois seria uma

metodologia mais direcionada e rápida.

 - Obtenção do DNA das toxinas

1 - Obtenção dos DNAs das proteínas TsTx e TsTx-I do DNA

genômico do escorpião Tityus serrulatus

O DNA genômico foi extraído do escorpião Tityus serrulatus e uma amostra

foi corrida em gel de agarose 1% para quantificação e verificação da qualidade

do DNA. Na Figura 19a podemos ver que o DNA genômico está com uma

qualidade boa, sem apresentar arrastos, indicativo de DNA degradado, e sua

concentração estimada foi de 0,1 g/l.

Foi feita uma padronização da PCR para amplificação das seqüências da

TsTx-I e da TsTx. O melhor resultado foi obtido diluindo o DNA genômico 1:50

e utilizando o tampão para Taq polimerase 1C. Sendo assim os DNAs foram

amplificados utilizando 2 l de DNA genômico diluído 1:50 e tampão 1C (Figura

19b). Os amplicons foram purificados (Figura 19c) e ligados no vetor pGEM.

Das colônias positivas, 10 de cada uma das ligações feitas foram

selecionadas para a extração de plasmídeos. Os plasmídeos quantificados

foram cortados com as enzimas específicas. Nenhum dos clones da TsTx e da

TsTx-I foram cortados pelas enzimas Sal I e Hind III, respectivamente (Figuras

20 a e b). Esses clones foram cortados com a enzima Eco RI, que tem sítios

107

externos à região onde os DNAs estão inseridos. Dos clones da TsTx-I, cinco

cortaram (Figura 20c) e dos clones da TsTx quatro cortaram (Figura 20d).

Os quatro clones da TsTx (3, 5, 8 e 11) e cinco clones da TsTx-I (1, 3, 5,

6, 7) foram seqüenciados. As seqüências de alguns clones, que tinham boa

qualidade, mostraram que o DNA das proteínas foi clonado no vetor pGEM e

que foram inseridos corretamente.

108

Figura 19

- Extração do DNA genômico e obtenção do DNA das toxinas.

Em todas as fotos dos géis, na canaleta 1 foi aplicado 1 g de padrão de 100

pb (Invitrogen). Em A, na segunda canaleta foi aplicado 10 l de DNA

genômico. Em B, na canaleta 2 foi aplicado um controle positivo (DNA

amplificado da TsNTxP), nas canaletas 3 e 4, temos controle negativo (todos

reagentes, menos DNA) e produto da amplificação da TsTx e nas 5 e 6,

controle negativo (todos reagentes, menos DNA) e produto da amplificação da

TsTx-I, respectivamente. Em C, os amplicons da TsTx (canaletas 2 e 3) e da

TsTx-I (canaletas 4 e 5) purificados.

109

Figura 20 – Corte com enzima de restrição dos clones da TsTx e TsTx-I em

pGEM. Em A, os clones 3, 5, 7, 8 e 11 da TsTx, com o plasmídeo não cortado

(números pares) e cortado com Sal I (números ímpares). Em B, clones 1, 3, 5,

6 e 7 da TsTx-I, com o plasmídeo não cortado (ímpares) e cortado por Hind III

(pares). Em C, clones 3, 5, 7, 8 e 11 da TsTx, com o plasmídeo não cortado

(pares) e cortado com Eco RI (ímpares). Em D, os clones 1, 2, 3, 5, 6, 7 e 9 da

TsTx-I, com o plasmídeo não cortado (ímpares) e cortado com Eco RI (pares).

A. B.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

200 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

200 pb

A. B.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

200 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

200 pb

110

2 - Busca de DNAs de toxinas na biblioteca de DNAs da glândula de

veneno do escorpião Tityus serrulatus

2.1- Excisão em massa da biblioteca

A biblioteca foi titulada e se verificou que não havia a necessidade de

amplificá-la. Então partimos direto para a excisão em massa. Foram realizadas

duas excisões: na primeira obtivemos 114 colônias e na segunda obtivemos

520 colônias. As primeiras 114 colônias foram submetidas a PCR de colônia,

para verificar a existência ou não de inserto e para verificar o tamanho dos

insertos. Como a PCR de colônia evidenciou amplicons em todas as colônias,

decidimos extrair os plasmídeos das outras colônias e verificar o tamanho dos

insertos por PCR normal com primers do vetor. Muitos clones tinham insertos

de tamanho ideal (>200 pb) e todos foram seqüenciados.

2.2- Seqüênciamento e análise dos dados

Os 634 clones foram seqüenciados e geraram 920 cromatogramas. As

toxinas de interesse imediato TsTx (Tityustoxina) e TsTx-I (Tityustoxina I) foram

identificadas entre os primeiros 192 clones seqüenciados. A Figura 21 e 22

representam as seqüências obtidas e os resultados do BLASTx.

111

gg cac gag gaa caa tcg atc tga acg atg aaa gga atg atc ttg ttt att

M K G M I L F I

agc tgc tta ttg ctg atc ggc att gtc gta gaa tgt aaa gaa ggt tat ctc

S C L L L I G I V V E C K E G Y L

atg gat cac gaa ggt tgc aaa ctt agt tgc ttt atc aga cca tcg gga tac

M D H E G C K L S C F I R P S G Y

tgc ggc aga gaa tgc gga att aaa aag ggc tca tcg ggc tat tgc gcc tgg

C G R E C G I K K G S S G Y C A W

ccc gcg tgt tac tgc tac ggg ctt cca aat tgg gtg aaa gtt tgg gat aga

P A C Y C Y G L P N W V K V W D R

gcg acg aac aaa tgt ggc aaa aaa taa att tgt ttc gct gaa aat cct tta

A T N K C G K K

caa atg aac tgt aat aag ttt ggc aaa aat aaa aaa atg ttc cct taa aaa

aaa aaa aaa aaa aaa

gi|312022|emb|CAA46982.1| Ts VII; beta-neurotoxin precursor [Tityus

serrulatus]

gi|102802|pir||S21158 neurotoxin TsVII precursor - Brazilian scorpion

gi|453106|gb|AAB29128.1|

toxin gamma; toxin VII [Tityus serrulatus]

gi|401073|sp|P15226|SCX7_TITSE

Toxin VII precursor (TsTX-VII) (Tityustoxin

VII) (Ts VII) (Toxin

II-11) (Toxin III-10) (Ts1) (Toxin gamma) (Toxin T2-IV)

Length = 84

Score = 192 bits (489), Expect = 2e-48

Identities = 84/84 (100%), Positives = 84/84 (100%)

Frame = +3

Query: 27 MKGMILFISCLLLIGIVVECKEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKGSSGYCAWP 206

MKGMILFISCLLLIGIVVECKEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKGSSGYCAWP

Sbjct: 1 MKGMILFISCLLLIGIVVECKEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKGSSGYCAWP 60

Query: 207 ACYCYGLPNWVKVWDRATNKCGKK 278

ACYCYGLPNWVKVWDRATNKCGKK

Sbjct: 61 ACYCYGLPNWVKVWDRATNKCGKK 84

Figura 21 – Análise da seqüência da TsTx-I obtida na biblioteca. Em A,

seqüência obtida no MegaBace; em negrito o peptídeo sinal e sublinhado os

aminoácidos que sofrem modificações pós-traducionais. Em B, análise do

Blastx.

112

gg cac gag aat tac ttc att ctc ttg gtc gtc gtc tgc tta ttg acc gcg ggc

H E N Y F I L L V V V C L L T A G

acg gag ggc aag aaa gac gga tac ccg gtg gaa tac gat aac tgc gcc tac

T E G K K D G Y P V E Y D N C A Y

att tgc tgg aac tac gac aac gct tac tgc gat aag ctg tgc aaa gac aag

I C W N Y D N A Y C D K L C K D K

aaa gcc gat agc gga tat tgt tac tgg gtt cac atc ctg tgc tac tgc tac

K A D S G Y C Y W V H I L C Y C Y

ggg ctt ccc gat agc gaa ccg acc aag acc aac gga aaa tgc aaa tcc ggt

G L P D S E P T K T N G K C K S G

aag aag taa acc agc ctc cta ttg atc cca gat ccg ccc tgg cgg ata aaa

K K

tgt ttc tga aaa cca ttc ccg aaa taa aac tca tgc ctg caa aaa aaa aaa

aaa aaa a

Figura 22 – Análise da seqüência da TsTx obtida na Biblioteca. Em A,

seqüência obtida no MegaBace; em negrito o peptídeo sinal e sublinhado os

aminoácidos que sofrem modificações pós-traducionais. Em B, análise do

Blastx.

113

Os 920 cromatogramas foram submetidos a análises bioinformáticas. Foi

usado o pacote phred phrap consed via script phredPhrap para gerar as ESTs

(etiquetas de seqüências expressas). Assim foram obtidas 910 ESTs, que

foram filtradas com o cross-match para remoção do vetor e agrupadas com

phrap. O comprimento médio das ESTs foi de 734 pares de bases (Figura 23).

Das 910 ESTs, quinze representam vetor sem inserto (1,6%) e 4,4% são

seqüências com menos de 200 pares de base.

Figura 23 – Distribuição dos tamanhos das ESTs.

As ESTs foram anotadas com UniProt e GOA, 57% delas não

apresentaram homologia (e-value > 10

-5

) com nenhuma seqüência depositada

nos bancos de dados usados, 43% apresentaram homologia com UniProt e

destas 34% tinham anotação com GO (Figura 24a).

As 910 ESTs foram agrupadas pelo software phrap e geraram 400

uniques (grupos). Os uniques são o conjunto de contigs (agrupamento de

seqüências de um mesmo transcrito - redundantes) e singlets (seqüências não

redundantes). Os uniques obtidos foram igualmente anotados com UniProt e

114

GOA e 66% deles não apresentaram homologia. O restante (34%) apresentou

homologia com UniProt e destas 29% tinham anotação com GO (Figura 24b).

Figura 24 – Proporção relativa de cada categoria dos transcritos da

biblioteca de cDNA da glândula de veneno do Tityus serrulatus. Em A, a

proporção dos transcritos e em B, a dos uniques. No Hit, inclui as ESTs ou

uniques que não tem homologia com nenhuma seqüência conhecida. UniProt

Hits (GO), inclui os transcritos que tem homologia no UniProt e tinham

anotação no GO. UniProt Hits (no GO), inclui os transcritos que tem homologia

no UniProt e não tinham anotação no GO.

Os uniques se dividiram em 135 contigs e 265 singlets. Dos contigs,

39% das seqüências não apresentaram homologia com proteínas já descritas

nos bancos de dados usados e 61% apresentaram homologia com UniProt.

Destas apenas 17% não tinham anotação no GO (Figura 25a). Para os

singlets, temos 80% das seqüências sem homologia e apenas 20% com

homologia, sendo que 3% não tinham anotação com GO (Figura 25b).

Uniprot Hits

(GO)

34%

Uniprot Hits

(no GO)

No Hit

57%

Uniques (total 400 seqs.)

Uniprot Hits

(GO)

29%

Uniprot Hits

(no GO)

No Hit

66%

EST (total 910 seqs.)

Uniprot Hits

(GO)

34%

Uniprot Hits

(no GO)

No Hit

57%

Uniques (total 400 seqs.)

Uniprot Hits

(GO)

29%

Uniprot Hits

(no GO)

No Hit

66%

Uniprot Hits

(GO)

34%

Uniprot Hits

(no GO)

No Hit

57%

Uniprot Hits

(GO)

34%

Uniprot Hits

(no GO)

No Hit

57%

Uniques (total 400 seqs.)

Uniprot Hits

(GO)

29%

Uniprot Hits

(no GO)

No Hit

66%

Uniques (total 400 seqs.)

Uniprot Hits

(GO)

29%

Uniprot Hits

(no GO)

No Hit

66%

Uniprot Hits

(GO)

29%

Uniprot Hits

(no GO)

No Hit

66%

EST (total 910 seqs.)

115

Figura 25 - Proporção relativa de cada categoria dos Uniques. Em A, a

proporção dos contigs e em B, a dos singlets. No Hit, inclui as ESTs ou uniques

que não tem homologia com nenhuma seqüência conhecida. UniProt Hits (GO),

inclui os transcritos que tem homologia no UniProt e tinham anotação no GO.

UniProt Hits (no GO), inclui os transcritos que tem homologia no UniProt e não

tinham anotação no GO.

Contigs (total 135 seqs.) Singlets (total 265 seqs.)AB

Uniprot Hits

(GO)

17%

Uniprot Hits

(no GO)

No Hit

80%

Uniprot Hits

(GO)

44%

Uniprot Hits

(no GO)

17%

No Hit

39%

Contigs (total 135 seqs.) Singlets (total 265 seqs.)AB

Uniprot Hits

(GO)

17%

Uniprot Hits

(no GO)

No Hit

80%

Uniprot Hits

(GO)

44%

Uniprot Hits

(no GO)

17%

No Hit

39%

Uniprot Hits

(GO)

44%

Uniprot Hits

(no GO)

17%

No Hit

39%

116

As ESTs que apresentaram homologia com alguma seqüência

depositada no UniProt (309) foram anotadas com GOA para classificá-las

funcionalmente com ontologias do GO: função molecular, processo biológico e

componente celular. Uma mesma EST pode ser classificada em mais de uma

ontologia do GO, sendo assim, 240 seqüências foram classificadas como

função molecular (FM), 242 como processo biológico (PB) e 150 como

componente celular (CC). Das ESTs anotadas como FM (Figura 26a), 30%

foram classificadas como inibidores de canais iônicos e aproximadamente 4%

foram classificadas como atividade metaloendopeptidase. Já as ESTs anotadas

como PB (Figura 26b), a maioria foi classificada como: patogênese (20%),

defesa anti-bacteriana (20%) e resposta de defesa (10%). Quanto as ESTs

anotadas em CC (Figura 26b), as principais categorias foram: região

extracelular (16%), mitocôndria (10%), membrana (7%) e intracelular (5%).

Figura 26 – Anotação das ESTs com Gene Ontology. Classificação funcional

de todas as ESTs que tinham homologia com o UniProt. As abscissas mostram

as categorias dentro de cada uma das três ontologias: função molecular,

processo biológico e componente celular.

ESTs Molecular Function

(240 seqs – total)

ESTs Biological Process

(242 seqs – total)

ESTs Cellular Component

(150 seqs – total)

ESTs Molecular Function

(240 seqs – total)

ESTs Biological Process

(242 seqs – total)

ESTs Cellular Component

(150 seqs – total)

117

Das 400 uniques, 116 tinham anotação no GO. Destas, 98 seqüências

foram classificadas como função molecular (FM), 88 como processo biológico

(PB) e 66 como componente celular (CC). As categorias nas quais as uniques

foram mais anotadas são praticamente as mesmas mais anotadas para as

ESTs nas três ontologias (Figuras 26 e 27). Para função molecular e processo

biológico houve uma redução, que possivelmente se deve a redundância

encontrada na biblioteca.

Figura 27 – Anotação das Uniques com Gene Ontology. Classificação

funcional de todas as uniques que tinham homologia com o UniProt. As

abscissas mostram as categorias dentro de cada uma das três ontologias:

função molecular, processo biológico e componente celular.

Uniques Molecular Function

(98 seqs total)

Uniques Biological Process

(88 seqs total)

Uniques Cellular Component

(66 seqs total)

ACB

Uniques Molecular Function

(98 seqs total)

Uniques Biological Process

(88 seqs total)

Uniques Cellular Component

(66 seqs total)

ACB

118

Das uniques que tinham anotação com GO, fizemos uma busca manual

pelas seqüências que tinham homologia com toxinas ou componentes do

veneno (Tabela 4). Todas as seqüências homólogas a toxinas foram agrupadas

em contigs e obtivemos 24 seqüências consensos descritas na tabela abaixo.

Na anotação das uniques também anotamos com e-value liberado, para

aumentar a chance de encontrarmos toxinas com pouca similaridade com as já

descritas. Desta maneira obtivemos mais cinco contigs similares a toxinas.

Tabela 4 – Identificação dos transcritos que possuem homologia com

toxinas ou componentes do veneno

Identificador interno Identificador do

UniProt

Descrição

esds_25082007|Contig2 AP4_TITCO Putative antimicrobial peptide

clone 4 precursor

esds_25082007|Contig4 KIK3_TITTR Potassium channel toxin TtrKIK

precursor

esds_25082007|Contig5 AP4_TITCO Putative antimicrobial peptide

clone 4 precursor

esds_25082007|Contig8 SCKP2_TITSE Peptide TsPep2 precursor

esds_25082007|Contig15 KBX1_TITSE Potassium channel toxin beta-KTx

1 precursor (Fragment)

esds_25082007|Contig18 Q45R47_BOOMI MP5: Salivary gland

metalloprotease

esds_25082007|Contig26 MMEL1_HUMAN MMEL1, MELL1, MMEL2,

NEP2: Membrane metallo-

endopeptidase-like 1

esds_25082007|Contig32 SCX4_TITSE Alpha-toxins precursor [Contains:

Toxin-5 (Fragment)

esds_25082007|Contig35 SCX7_TITSE Toxin VII precursor

esds_25082007|Contig38 SCX4_TITSE Alpha-toxins precursor [Contains:

Toxin-5 (Fragment)

esds_25082007|Contig40 KBX1_TITSE Potassium channel toxin beta-KTx

1 precursor (Fragment)

esds_25082007|Contig48 Q45R47_BOOMI MP5: Salivary gland

metalloprotease

esds_25082007|Contig49 DISF_TRIFL Zinc metalloproteinase flavoridin

precursor

esds_25082007|Contig61 KA122_TITTR Potassium channel toxin alpha-

KTx 12,2

esds_25082007|Contig68 KA201_TITTR Potassium channel toxin alpha-

KTx 20,1

esds_25082007|Contig81 SCX2_TITST Toxin II

119

esds_25082007|Contig102 SCKP2_TITSE

Peptide TsPep2 precursor

esds_25082007|Contig104

Q2PGH5_HAELO

met: Metalloprotease (Fragment)

esds_25082007|Contig116 SCX7_TITSE Toxin VII precursor

esds_25082007|Contig119 AP9_TITCO Anionic peptide clone 9 precursor

esds_25082007|Contig121 KBX1_TITSE Potassium channel toxin beta-KTx

1 precursor (Fragment)

esds_25082007|Contig122 AP6_TITCO Putative antimicrobial peptide

clone 6 precursor

esds_25082007|Contig123 NTXP_TITSE NTXP: Non-toxic protein NTxP

precursor

esds_25082007|Contig124 AP6_TITCO Putative antimicrobial peptide

clone 6 precursor

esds_25082007|Contig125 A1YAC8_MESMA LVP1a: Venom lipolysis-

activating peptide alpha subunit

esds_25082007|Contig128 NTXP_TITSE NTXP: Non-toxic protein NTxP

precursor

esds_25082007|Contig129 KIK3_TITTR Potassium channel toxin TtrKIK

precursor

esds_25082007|Contig130 KB1_MESMA Kb1: Peptide BmKb1 precursor

esds_25082007|Contig135 AP4_TITCO Putative antimicrobial peptide

clone 4 precursor

120

 – Construção dos cassetes

1 - Construção de proteínas em tandem

Nesta etapa, foram construídos três cassetes de expressão no pET 11a

como está ilustrado na figura abaixo.

Figura 28 – Construção das proteínas recombinantes a partir da

seqüência da TsTx-I no vetor pET 11a.

1.1 - Clonagem do DNA da TsTx-I em pGEM

O DNA da TsTx-I foi amplificado do clone 1D6 da biblioteca (Figura 29a)

utilizando-se os primers descritos na Figura 14. O DNA purificado (Figura 29b)

foi ligado ao vetor pGEM. Das colônias positivas obtidas, oito colônias foram

escolhidas para extração plasmidial. Esses clones foram cortados com a

enzima de restrição Hind III e apenas 3 foram cortados e liberaram uma banda

de 183 pb, tamanho esperado para o DNA da TsTx-I (dados não mostrados).

Os clones A1, B1 e G1, positivos para o corte, foram seqüenciados. Os

resultados de seqüênciamento mostraram que todos os clones tinham os

insertos inseridos corretamente no vetor.

121

A. B.

Figura 29 – Amplificação e purificação do DNA da TsTx-I do clone obtido

da biblioteca. Em A, na canaleta 1 temos o produto de PCR da TsTx-I e na

canaleta 2 temos o padrão de massa molecular de 100 pb (Invitrogen). Em B,

na canaleta 1 temos o padrão de massa molecular de 100 pb (Invitrogen) e nas

canaletas 2 e 3 temos 1ª e 2ª eluições da purificação do DNA da TsTX-I,

respectivamente.

200 pb

1 2

200 pb

1 2

200 pb

1 2 3

200 pb

1 2 3

122

1.2- Subclonagem do DNA da TsTx-I no vetor pBluescript II KS-

O vetor pBluescript II KS- foi transformado quimicamente em bactérias

DH5 e essas foram submetidas à extração em larga escala do vetor. O

plasmídeo extraído foi purificado com fenol. Controle de qualidade foi realizado

através de cortes com as enzimas Xho I, Sal I, Hind III e Eco RI. O plasmídeo

foi cortado por todas as enzimas testadas, indicando apresentar boa qualidade.

O clone A1 cortado com a enzima Hind III foi purificado pelo método da

sílica (Figura 30a). O pBluescript foi cortado com Hind III e desfosforilado

(Figura 30b). O DNA da TsTx-I purificado e o vetor desfosforilado foram ligados

de acordo com item III.5.2. e transformados quimicamente em bactérias DH5.

Das colônias obtidas, apenas 6 colônias se apresentaram positivas (dados

não mostrados). Essas colônias sofreram lise alcalina para extração dos seus

plasmídeos.

Os clones 9, 11, 16, 17, 14 e 20 foram cortados com a enzima Hind III

(Figura 31). Todos os clones foram cortados e apresentaram uma banda de

aproximadamente 200 pb, com exceção dos clones 14 e 20 que tiveram duas

bandas: uma de aproximadamente 200 pb e outra de 400 pb.

Todos os clones foram seqüenciados. Os clones 9, 11, 16 e 17 só tinham

um DNA da toxina inserido no vetor de maneira correta como o esperado. Mas

os clones 14 e 20, inesperadamente, continham dois DNAs da TsTx-I inseridos

um atrás do outro, pelos seus sítios de restrição da Hind III (Figura 32). Essa

ligação ocorreu por acaso.

123

Figura 30 – Purificação do DNA da TsTx-I e desfosforilação do plasmídeo

cortado. Em A, na canaleta 1, temos padrão de massa molecular de 25 pb

(Invitrogen). Nas canaletas 2, 3 e 4 temos o DNA da TsTx-I das 1ª, 2ª e 3ª

eluições da purificação. Em B, na canaleta 1, temos padrão de massa

molecular  Hind (Gibco) e na canaleta 2 temos o plasmídeo cortado e

desfosforilado.

cDNA da TsTx-I

1 2 3 4

pBluescript

desfosforilado

2 Kb

1 2

200 pb

A. B.

124

Figura 31 – Corte com enzima de restrição Hind III dos clones da TsTx-I

clonados no pBluescript. Na figura, o plasmídeo não cortado sempre aparece

primeiro e vem seguido do plasmídeo cortado. Abaixo do gel está indicado o

clone correspondente.

9 11 16 14

17 20

200 pb

125

AAA GAA GGT TAT CTC AGT GAT CAC GAA GGT TGC AAA CTT AGT TGC TTT ATC AGA CCA

K E G Y L S D H E G C K L S C F I R P

TCG GGA TAC TGC GGC AGA GAA TGC GGA ATT AAA AAG GGC TCA TCG GGC TAT TGC GCC

S G Y C G R E C G I K K G S S G Y C A

TGG CCC GCG TGT TAC TGC TAC GGG CTT CCA AAT TGG GTG AAA GTT TGG GAT AGA GCG

W P A C Y C Y G L P N W V K V W D R A

ACG AAC AAA TGT AAG CTT AAA GAA GGT TAT CTC AGT GAT CAC GAA GGT TGC AAA CTT

T N K C K L K E G Y L S D H E G C K L

AGT TGC TTT ATC AGA CCA TCG GGA TAC TGC GGC AGA GAA TGC GGA ATT AAA AAG GGC

S C F I R P S G Y C G R E C G I K K G

TCA TCG GGC TAT TGC GCC TGG CCC GCG TGT TAC TGC TAC GGG CTT CCA AAT TGG GTG

S S G Y C A W P A C Y C Y G L P N W V

AAA GTT TGG GAT AGA GCG ACG AAC AAA TGT A T N K C

K V W D R

>gi|312022|emb|CAA46982.1| Ts VII; beta-neurotoxin precursor [Tityus

serrulatus]

gi|102802|pir||S21158

neurotoxin TsVII precursor - Brazilian scorpion

gi|453106|gb|AAB29128.1|

toxin gamma; toxin VII [Tityus serrulatus]

gi|401073|sp|P15226|SCX7_TITSE

Toxin VII precursor (TsTX-VII) (Tityustoxin

VII) (Ts VII) (Toxin

II-11) (Toxin III-10) (Ts1) (Toxin gamma) (Toxin T2-IV)

Length = 84

Score = 146 bits (368), Expect = 2e-34

Identities = 61/64 (95%), Positives = 61/64 (95%)

Frame = +1

Query: 1 KEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKGSSGYCAWPACYCYGLPNWVKVWDRATNK 180

KEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKGSSGYCAWPACYCYGLPNWVKVWDRATNK

Sbjct: 21 KEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKGSSGYCAWPACYCYGLPNWVKVWDRATNK 80

Query: 181 CKLK 192

C K

Sbjct: 81 CGKK 84

Score = 145 bits (367), Expect = 3e-34

Identities = 61/61 (100%), Positives = 61/61 (100%)

Frame = +1

Query: 190 KEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKGSSGYCAWPACYCYGLPNWVKVWDRATNK 369

KEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKGSSGYCAWPACYCYGLPNWVKVWDRATNK

Sbjct: 21 KEGYLMDHEGCKLSCFIRPSGYCGRECGIKKGSSGYCAWPACYCYGLPNWVKVWDRATNK 80

Query: 370 C 372

Sbjct: 81 C 81

Figura 32 – Análise da seqüência do clone 14 no programa Blastx. Em A, a

seqüência obtida pelo MegaBace, em azul está o sítio da enzima Hind III. Em

B, resultado obtido pelo Blastx.

126

1.3 – Clonagem do DNA da TsTx-I

(1)

no pET 11a

Para esta clonagem, novos primers (descritos item I-1.4) foram

construídos para a inserção do sítio da Bam HI no fragmento de DNA da TsTX-

I (Figura 33). O clone 16 (pBluescript+TsTx-I

(1)

) foi utilizado como DNA molde

para esta amplificação.

Foi feita uma padronização da PCR para amplificação da seqüência da

TsTx-I com os novos primers. A melhor amplificação foi obtida quando a

temperatura de anelamento era 58/54C (5 ciclos a 58C e 25 ciclos a 54C) e

o tampão usado era o 1C (Figura 34a).

O DNA amplificado e purificado (Figura 34b) foi ligado ao vetor pGEM. Os

plasmídeos das colônias positivas obtidas foram extraídos. Eles foram

passados em colunas com resina Sephacryl S-400 para retirar impurezas, após

o tratamento eles foram cortados com Bam HI e apenas 3 deles não liberaram

a banda esperada de 183 pb (Figura 34c). Todos os clones foram

seqüenciados, mostrando que apenas um clone não continha inserto.

O clone 31b foi escolhido para a ligação no vetor pET. Os dois plasmídeos

foram cortados com Bam HI. O pET teve suas pontas cortadas desfosforiladas

e o fragmento de DNA da TsTx-I foi purificado pelo método, “freeze squeeze”

(Figura 35). Da ligação resultaram várias colônias e destas 8 foram positivas.

Os plasmídeos extraídos das colônias positivas foram analisados por PCR,

mostrando que todos os clones amplificaram o fragmento de DNA de interesse

(Figura 36a). O seqüênciamento confirmou o resultado da PCR (Figura 36b).

127

5’ 3’

GGG CCC CCC CTC GAG GTC GAC GGT ATC GAT AAG CTT AAA GAA GGT ---- AAC AAA TGT AAG CTT GAT ATC GAA TTC CTG CAG CCC GGG GGA

5’ GGA TCC ATC GAT AAG CTT AAA GAA 3’

3’ 5’

CCC GGG GGG GAG CTC CAG CTG CCA TAC CTA TTC GAA TTT CTT CCA ---- TTG TTT ACA TTC GAA CTA TAG CTT AAG GAC GTC GGG CCC CCT

3’ TTG TTT ACA TTC GAA CTA TAG CTT AAG 5’

3’ TTG TTT ACA TTC GAA CTA ACT CCT AGG 5’

5’ GGA TCC TCA ATC AAG CTT ACA TTT GTT 3’

PRIMERS

pET TsTx-I Forward 1 5’ GGA TCC ATC GAT AAG CTT AAA GAA 3’

pET TsTx-I Anti-senso 1 5’ GGA TCC TCA ATC AAG CTT ACA TTT GTT 3’

Figura 33 – Construção dos primers para a clonagem da TsTx-I

(1)

no pET 11a. A seqüência do pBluescript está

representada pelas letras em preto, a da TsTx-I em vermelho e o códon terminador em verde. As letras realçadas pela cor

amarela representam o sítio de restrição da enzima Hind III e em azul o sítio de restrição da enzima Bam HI

128

Figura 34 – Amplificação e purificação do fragmento de DNA TsTx-I

(1)

verificação da clonagem. Em A, na canaleta 1, temos padrão de massa

molecular de 100 pb (Invitrogen); na canaleta 2 temos o DNA da TsTx-I

amplificado. Em B, na canaleta 1, temos padrão de massa molecular de 100 pb

(Invitrogen); nas canaletas 2, 3, 4 temos o DNA da TsTx-I das 1ª, 2ª e 3ª

eluições da purificação. Em C, temos os clones 4a não cortado e cortado nas

canaletas 1 e 2; e o clone 31b não cortado e cortado, nas canaletas 3 e 4,

respectivamente. A seta branca indica o fragmento liberado.

200 pb

1 2 3 4

4a 31b

1 2

200 pb

1 2 3 4

129

Figura 35 – Preparo para subclonagem do DNA da TsTx-I

(1)

no vetor pET

11a. Em A, na canaleta 1, 2 e 3 temos o clone 31b não cortado, cortado com

Bam HI e cortado com Hind III, respectivamente. As setas brancas indicam os

fragmentos liberados pelo corte. Em B, na canaleta 1 e 2 temos o vetor pET

11a não cortado e cortado com Bam HI, respectivamente; na canaleta 3 temos

padrão de massa molecular 1 Kb (Invitrogen). Em C, temos na canaleta 1, 100

ng do padrão  íntegro (Gibco); nas canaletas 2 e 6 temos o padrão 1 Kb plus

(Invitrogen); nas canaletas 3, 4 e 5 temos o vetor pET não cortado, cortado

com Bam HI e desfosforilado, respectivamente; na canaleta 7 temos o DNA da

TsTx-I

(1)

purificado.

1 2 3 1 2 3 1 2 3 4 5 6 7

200 pb

5 Kb

200 pb

130

>F04 well F04 EKThais2701_23032007 Run01 Cimarron 3.12 665

GGNGTANCGCGCGCAGANCGGTGCATGAAAGGAGATGGCGCCCAACAGTC

CCCCGGCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGA

GCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAG

GCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCC

GGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTAT

AGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTA

ACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA

TGGGTCGCGGATCCATCGATAAGCTTAAAGAAGGTTATCTCAGTGATCAC

GAAGGTTGCAAACTTAGTTGCTTTATCAGACCATCGGGATACTGCGGCAC

GAGAATGCGGAATTAAAANAGGGCTCATCGGGCTATTGCGCCTGGCCCGC

GCTGTTACTGCTACGGGCTTCCAAATTGGGTGAAAGTTCTGGGATAGAGC

GACGAACAAATGTAACGCTTGATATCTGAGGATCCGGCTGCTAACAAAGC

CCGAAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCA

ATAACCCCTTGGCGGCCTCTAAACGGCGTCTTGAGGGGGTTCACACANGG

CTGAACAGTGCAGGAACTATATACCGGAATATCCCCGCAAGAAGCCCNGG

CACAAGTTACCCGGGCACTAAACCCAAAGCCCTAATGGCTTACCAGGCAT

CCAAGCGGTCTGCAACGGCTGGCCCGACGGATGACGATTGGAGCCGCATG

GACAANATTNCATAACACACGGGGGACTGACACGGCCGTCNANCACAANT

Figura 36 – Confirmação da ligação TsTx-I

(1)

no pET. Em A, a PCR dos

clones obtidos a partir da ligação; os controles positivo (C+) e negativo (C-), o

nome dos clones e o padrão (pd) de 25 pb (Invitrogen) estão indicados. O

controle positivo é o produto da amplificação do DNA da TsTx-I clonado em

pGEM e o controle negativo é a reação de PCR sem DNA. Em B, o

seqüênciamento do clone E4. Os sítios de restrição da Hind III estão

sublinhados de verde e os da Bam HI estão sublinhados de vermelho.

C+ C- E3 E4 E6 E9 E11 F1 F5 F7 F10 F12 pd

200 pb

131

1.4 – Montagem da TsTx-I

(2)

Esta etapa foi facilitada pela clonagem ao acaso de duas cópias do DNA

da TsTX-I no sítio de restrição Hind III do vetor pBluescript. Então foi

necessário, apenas, inserir o sítio de restrição da enzima Bam HI no fragmento

de DNA e posterior clonagem no pET 11a.

Os primers utilizados para a clonagem do DNA de 1 cópia (Figura 33)

foram também usados nesta etapa e a reação de PCR também teve que ser

padronizada. Neste caso, a padronização apresentou maiores dificuldades

técnicas porque os primers amplificavam tanto 1 cópia quanto 2 cópias,

originando 2 principais bandas de 200 e 400 pares de bases, além de outras

acima da banda de 400 pb.

Vários testes foram feitos até se obter o melhor resultado. A estratégia

que melhor funcionou, consistia de iniciar a PCR com 20 vezes menos DNA e

10 vezes menos primers, dez ciclos eram feitos assim, isto foi feito para tentar

diminuir amplificações inespecíficas. Depois acrescentava mais Taq e primers

nas concentrações normais. Sendo assim, a amplificação da banda de 400 pb

era mais favorecida do que a de 200 pb (Figura 37a).

O produto da melhor amplificação foi aplicado em um gel de agarose 1%

e corrido por tempo suficiente para as duas bandas se separarem o máximo

possível para cortamos o fragmento de 400 pb do gel sem contaminação com a

banda de 200 pb ou outras bandas inespecíficas.

O fragmento de 400 pb foi purificado (Figura 37b) e inserido em dois

vetores de fácil clonagem: Topo TA e pGEM. Cinco colônias positivas de cada

ligação foram submetidas à lise alcalina para extração de seus plasmídeos. Os

clones foram purificados com Sephacryl S-400 e depois cortados com a enzima

Bam HI (Figura 37c). Todos plasmídeos cortados liberam um fragmento do

tamanho esperado (400 pb) e foram seqüenciados. Os clones 24, 43b, e 11b

apresentaram seqüências de boa qualidade revelando que a clonagem tinha

sido realizada com sucesso.

O clone 43b foi escolhido para a clonagem no pET. Ele foi cortado com

Bam HI, purificado e ligado ao pET cortado e desfosforilado (Figura 38). Desta

ligação resultaram várias colônias, as positivas foram submetidas à extração

plasmidial. Os plasmídeos foram analisados por PCR e todos os clones

132

amplificaram uma banda de 400 pb, tamanho esperado para o inserto clonado

(Figura 39a). Todos os clones foram seqüenciados e confirmaram o resultado

obtido pela PCR (Figura 39b).

Figura 37 – Clonagem da TsTx-I

(2)

nos vetores de fácil clonagem. Em A, na

canaleta 1, temos o controle positivo da reação de PCR (amplicon da TsTx-I);

na canaleta 2 temos o produto da amplificação do clone 14; na canaleta 3

temos padrão de massa molecular (pd) de 100 pb (Invitrogen). Em B, na

canaleta 1, temos padrão de massa molecular de 1 Kb plus (Invitrogen); nas

canaletas 2, 3, 4 temos o DNA da TsTx-I

(2)

das 1ª, 2ª e 3ª eluições da

purificação. Em C, temos o clone 43b não cortado e cortado, respectivamente.

As setas brancas indicam a banda de DNA obtida.

pd 1 2 3

500 pb

43b

C+ 1 pd

400 pb

133

Figura 38 – Preparo para subclonagem do DNA da TsTx-I

(2)

no vetor pET

11a. Em A, na canaleta 1, 2 e 3 temos o clone 43b não cortado, cortado com

Bam HI e cortado com Hind III, respectivamente. As setas brancas indicam os

fragmentos liberados. Em B, na canaleta 1 e 2 temos o vetor pET 11a não

cortado e cortado com Bam HI, respectivamente; na canaleta 3 temos padrão

de massa molecular 1 Kb (Invitrogen). Em C, temos na canaleta 1, 100 ng do

padrão  íntegro (Gibco); nas canaletas 2 e 6 temos o padrão 1 Kb plus

(Invitrogen); nas canaletas 3, 4 e 5 temos o vetor pET não cortado, cortado

com Bam HI e desfosforilado, respectivamente; na canaleta 7 temos o DNA da

TsTx-I

(2)

purificado.

1 2 3 1 2 3 1 2 3 4 5 6 7

200 pb

400 pb

5 Kb

400 pb

134

>A08 well A08 barbaraEK23_311006 Run01 Cimarron 3.12 730

AGAGACGCGCGCAGAAGTGTGANCATGCAAGGAGATGGGCCAACAGTCCC

CCGGACACGGGGCCTGCCACCATACCCACAGCCGAAACAAGCGCTCATGA

GCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAG

GCGCCAGCAACCTGCACCTGTGGCGCCGGTGACTGCCGGCCAACGATGCG

TCCGGCGTAGAGGATCGAAGAATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTC

ACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTT

GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTAGCATGACTGGTGGACA

GCAAATGGGTCGCGGATCCATCGATAAGCTTAAAGAAGGTTATCTCAGTG

ATCACGAAGGTTGCAAACTTAGTTGCTTTATCAGACCATCGGGATACTGC

GGCAGAGAATGCGGAATTAAAAAGGGCTCATCGGGCTATTGCGACCTGGC

CCGCGTGTTACTGCTACGGGCTTCCAAATTGGGTGAAAGTTTGGGATAGA

GCGACGAACAAATGTAAGCTTAAAGAAGGTTATCTCAGTGATCACGAAGG

TTGCAAACTTAGNTTGCTTTATCAGACCATCGGGATACTGCGGCAGAGAA

TGCGGAATTAAAAAGGGCTCAATCGGGCTATTTGCGACCTGGACCGAGTG

TAACTGNTACGGGCTTCCAACATTGGGTGAAAGTTNGGGATAGAGCGACG

GAACAAATGTAAGCTTGATATCTGAGGATCCAGGGCTGCTTAACAAAGCC

CGGCAAAGGAAGCTGAGTTGGGCTGGATGACAACCGTGAGCAATAACTTA

AGACATNAACCCNTTGGGAGGGAGACCNCTAAAAAACAGGAGTCCTCAGA

ACNAGGAGGACACAAAAGGCNNNAAAAGGAGAGGAACATCATAACAGNAA

AAATCCCGAAAAAAGCCCAGGAAAAAACCAGGGANTACCAAAGCTAAANC

ACTACAAGACATTCACANGGNGAACAGAGAGACCAGANGAANACAGATAA

Figura 39 – Confirmação da ligação TsTx-I

(2)

no pET. Em A, a PCR da

ligação; os controles positivo (C+) e negativo (C-), o nome dos clones e o

padrão (pd) de 25 pb (Invitrogen) estão indicados. O controle positivo é o

amplicon do clone 14 e o negativo é a reação da PCR sem DNA. Em B, o

seqüênciamento do clone A4. Os sítios de restrição da Hind III estão

sublinhados de verde e os da Bam HI estão sublinhados de vermelho.

C+ C- A4 A9 A11 B3 B5 B10 C7 C12 D7 D8 pd

400 pb

135

1.5 – Montagem da TsTx-I

(4)

A primeira etapa deste item foi a construção de um fragmento de DNA

com 4 cópias do DNA da TsTx-I. Para isto, foi inserido no pBluescript que já

continha 2 cópias da toxina (clone 14) mais duas cópias. Primers contendo o

sítio de restrição da Eco RI e seqüências das extremidades N- e C-Terminal da

TsTx-I foram desenhados e construídos para amplificar as duas cópias da

toxina e inseri-las no clone 14 no sítio da Eco RI (Figura 40).

A reação de PCR foi padronizada e o mesmo problema do item anterior

se repetiu: os primers amplificavam 2 bandas, uma de 200 pb e outra de 400

pb (banda de interesse). As mesmas estratégias foram testadas, com

resultados similares. E do mesmo modo, o melhor produto de amplificação

(Figura 41a) foi usado para obtermos a banda de 400 pb que foi purificada

(Figura 41b) e ligada nos vetores de clonagem Topo TA e pGEM usando os

mesmos métodos.

Os plasmídeos das colônias positivas foram extraídos, purificados em

Sephacryl S-400 e cortados com a enzima Eco RI. Dentre os clones que

liberaram um fragmento do tamanho esperado, o clone 38b foi escolhido para a

montagem (Figura 41c).

Os plasmídeos (38b e 14) foram cortados com Eco RI. O clone 14 teve

suas pontas desfosforiladas e a banda de interesse liberada do corte do clone

38b foi purificada (Figura 42). Foi feita a ligação, após análise obtivemos cinco

clones positivos (clone A6, B1, B9, B12 e C8 – Figura 43). Todos eles foram

seqüenciados e confirmamos que o fragmento de interesse foi clonado com

sucesso.

136

5’ 3’

CCC CTC GAG GTC GAC GGT ATC GAT AAG CTT AAA GAA GGT -- AAC AAA TGT AAG CTT –TsTx-I- AAG CTT GAT ATC GAA TTC CTG CAG CCC G

5’ GAA TTC ATC GAT AAG CTT AAA GAA GGT 3’

3’ 5’

GGG GAG CTC CAG CTG CCA TAC CTA TTC GAA –TsTx-I-TTC GAA TTT CTT CCA --- TTG TTT ACA TTC GAA CTA TAG CTT AAG GAC GTC GGG

3’ TTG TTT ACA TTC GAA CTA TAG CTT AAG 5’

5’ GAA TTC GAT ATC AAG CTT ACA TTT GTT 3’

PRIMERS

TsTx-I

(4)

Forward 5’ GAA TTC ATC GAT AAG CTT AAA GAA GGT 3’

TsTx-I

(4)

Anti-senso 5’ GAA TTC GAT ATC AAG CTT ACA TTT GTT 3’

Figura 40 – Construção dos primers para a clonagem da TsTx-I

(2)

/Eco no clone 14. A seqüência do pBluescript está

representada pelas letras em preto e a da TsTx-I em vermelho. As letras realçadas pela cor amarela representam o sítio de

restrição da enzima Hind III e em cinza o sítio de restrição da enzima Eco RI

137

Figura 41 – Clonagem da TsTx-I

(2)

(Eco) nos vetores de fácil clonagem. Em

A, na canaleta 1, temos o controle negativo da reação (todos reagentes, com

exceção do DNA); na canaleta 2 temos o produto amplificação; na canaleta 3

temos o controle positivo da reação de PCR (amplicon da TsTx-I); na canaleta

4 temos padrão de massa molecular de 100 pb (Invitrogen). Em B, na canaleta

1, temos padrão de massa molecular de 1 Kb plus (Invitrogen); nas canaletas

2, 3, 4 temos o DNA da TsTx-I

(2)

(Eco) das 1ª, 2ª e 3ª eluições da purificação.

As setas brancas indicam a banda de DNA obtida. Em C, temos o clone 38b

não cortado e cortado, respectivamente. A seta branca indica o fragmento

liberado

400 pb

1 2 3 4

38b

500 pb

1 2 3 4

400 pb

138

Figura 42 – Preparo para subclonagem do DNA da TsTx-I

(2)

(Eco) no clone

14. Em A, nas canaletas 1 e 2 temos o clone 14 não cortado e cortado com Eco

RI, respectivamente; nas canaletas 3 e 4 temos o clone 38b cortado e não

cortado com Eco RI; o padrão usado foi 1 Kb plus (Invitrogen). A seta branca

indica o fragmento de DNA liberado. Em B, na canaleta 1 e 2 temos o vetor 14

cortado e cortado e desfosforilado, respectivamente; o padrão de massa

molecular utilizado foi o  Hind (Gibco). Em C, temos na canaleta 1 e 2 o

padrão  íntegro (Gigco) nas concentrações de 100 e 200 ng, respectivamente;

na canaleta 3 temos o DNA da TsTx-I

(2)

(Eco) purificado.

A. B. C.

1 2 pd 3 4 pd 1 2 1 2 3

400 pb

3 Kb

4 Kb

400 pb

139

Figura 43 – PCR para confirmação da ligação da TsTx-I

(2)

(Eco) no clone

14. Em A, temos os produtos da PCR dos clones de A1 a A10. O controle

positivo é o amplicon do clone 16 e o negativo é a reação de PCR sem DNA. O

padrão de massa molecular utilizado é o 100 pb (Invitrogen). Em B, temos os

produtos da PCR dos clones A11 a C8. O controle negativo é a reação de PCR

sem DNA. Os produtos da amplificação do clone 16 e do clone 14 foram

utilizados como controles positivos. O padrão de massa molecular utilizado é o

1 Kb plus (Invitrogen).

pd C+ C- A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10

pd C- 16 14 A11 A12 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8

1000 pb1000 pb

650 pb

500 pb

140

O clone 38A6 foi escolhido para continuarmos com as próximas etapas.

Novos primers foram construídos para inserirmos o sítio de restrição da enzima

Bam HI no fragmento de DNA com 4 cópias de TsTx-I para sua posterior

clonagem no vetor de expressão pET 11a.

Visto os problemas encontrados nas outras clonagens, decidimos

construir novos primers que anelasse no vetor, pois se o primer contivesse

alguma seqüência da TsTx-I, mesmo que pequena, poderíamos ter

amplificações inespecíficas. Na Figura 44, podemos ver como foi feita a

construção deste primers.

Vários testes foram feitos para padronizar esta nova amplificação e o

melhor procedimento foi usado. Sendo assim, utilizamos o produto da

amplificação com o primers F1/R1, utilizando a temperatura de anelamento de

58/54C, para a clonagem no pGEM (Figura 45a e b).

Obtivemos várias colônias e 10 foram selecionadas para a extração

plasmidial e corte com Bam HI. Os clones 4.2, 4.3 e 4.10 cortaram, mas não

liberaram fragmento; o clone 4.5 cortou e liberou um fragmento de tamanho

menor do que o esperado; os outros clones liberaram o fragmento de tamanho

esperado (Figura 45c). Todos os clones foram seqüenciados, os clones 4.1,

4.4, 4.6, 4.7, 4.8 e 4.9 apresentavam o fragmento com 4 cópias clonado de

maneira correta no vetor, clone 4.5 tinha 2 cópias e os outros não tinham o

inserto clonado.

O clone 4.1 foi cortado com Bam HI, o fragmento liberado foi purificado e

ligado ao vetor pET cortado e desfosforilado (Figura 46). Vinte clones foram

selecionados e analisados. Três deles liberaram um fragmento do tamanho

esperado (Figura 47) e tinham o fragmento clonado corretamente. Na Figura 48

podemos ver o seqüênciamento de um dos clones positivos, o clone 11.

141

5’

3’

M13 anti-senso

GGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTT 2 TSVII -AAGCTT

GGATCCAGCTATGACCATGATTACGCC GGATCCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGAC

3´ 5’

CCTTTGTCGATACTGGTACTAATGCGGTTCGCGCGTTAATTGGGAGTGATTTCCCTTGTTTTCGACCCATGCGCCGGGGGGGAGCTCCAGCTGCCATAGCTATTCGAA 2 TSVII -AAGCTT

5’ Bam HI 3’

ATATCGAATTC- 2 TSVII -GAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGC

3 Bam HI 5

TATAGCTTAAG- 2 TSVII -GACGTCGACGTCGGGCCCCCTAGGTGATCAAGATCTCGCCGGCGGTGGCGCCACCTCGAGGTTAAGCGGGATATCACTCAGCATAATGCGCGCGAGTGACCG

M13 -20

GGGCCCCCTAGGGATCAAGATCTCGCC CCTAGGCGGGATATCACTCAGCATAAT

pBluescript Senso 1 (F1) 5’ GGA TCC

AGC TAT GAC CAT GAT TAC GCC 3’ tm 61

C 52% de G/C

pBluescript Senso 2 (F2) 5’ GGA TCC

GGG CCC CCC CTC GAG GTC GAC 3’ tm 72

78% de G/C

pBluescript Anti-senso 1 (R1) 5’ TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGA CCT

TCA 3’ tm 60

48% de G/C

pBluescript Anti-senso 2 (R2) 5’ CCG CTC TAG AAC TAG GGA TCC

CCC GGG TCA 3’ tm 67

67% de G/C

Figura 44– Construção dos primers para a clonagem da TsTx-I

(4)

no pET 11a. A fita 5’-3’ do pBluescript está

representada pelas letras em preto e a fita 3’-5’ em cinza, a da TsTx-I em vermelho e o códon terminador em verde. As letras

realçadas pela cor amarela representam o sítio de restrição da enzima Hind III, em verde o sítio da Eco RI, em azul o sítio de

restrição da enzima Bam HI. As letras sublinhadas representam o sítio de restrição da enzima Bam HI

142

Figura 45 – Clonagem da TsTx-I

(4)

em pGEM. Em A, na canaleta 1, temos o

produto da amplificação da TsTx-I

(4)

; o padrão de massa molecular usado foi o

1 Kb plus (Invitrogen). Em B, na canaleta 1, temos padrão de massa molecular

de 1 Kb plus (Invitrogen); nas canaletas 2, 3, 4 temos o DNA da TsTx-I

(4)

das

1ª, 2ª e 3ª eluições da purificação. Em C, temos os clones 4.1, 4.2, 4.4, 4.5,

4.6, 4.7, 4.8 e 4.9 não cortado e cortado, respectivamente. As setas brancas

indicam o fragmento de DNA liberado.

4.1 4.2 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9

1 pd pd 1 2 3

1000 pb

800 pb

143

Figura 46 – Preparo para subclonagem do DNA da TsTx-I

(4)

no pET 11a.

Em A, nas canaletas 1, 2 e 3 temos o pET 11a não cortado, cortado com Bam

HI e cortado e desfosforilado, respectivamente; o padrão usado foi 1 Kb

(Invitrogen). Em B, na canaleta 1, 2 e 3 temos o DNA da TsTx-I

(4)

das 1ª, 2ª e

3ª eluições da purificação de DNA. O padrão usado foi 1 Kb plus (Invitrogen).

As setas indicam o fragmento de DNA purificado.

pd 1 2 3 pd 1 2 3

5 Kb

800 pb

144

Figura 47 – Corte com enzima de restrição para confirmação da

ligação da TsTx-I

(4)

em pET. Alguns clones foram cortados com Bam HI. Os

números indicam os clones, os plasmídeos estão na ordem: não cortado e

cortado. As setas brandas indicam os fragmentos de DNA liberados.

11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

800 pb

145

>F12 well F12 EKThais2701_23032007 Run01 Cimarron 3.12 777

AAGGGGGGCCCGAGTCGCATGCTCCGGCCGCATGGCGGCGCGGGAATCGA

TTGGATCCAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCAC

TAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTAT

CGATAAGCTTAAAGAAGGTTATCTCAGTGATCACGAAGGTTGCAAACTTA

GTTGCTTTATCAGACCATCGGGATACTGCGGCAGAGAATGCGGAATTAAA

AAGGGCTCATCGGGCTATTGCGCCTGGCCCGCGTGTTACTGCTACGGGCT

TCCAAATTGGGTGAAAGTTTGGGATAGAGCGACGAACAAATGTAAGCTTA

AAGAAGGTTATCTCAGTGATCACGAAGGTTGCAAACTTAGTTGCTTTATC

AGACCATCGGGATACTGCGGCAGAGAATGCGGAATTAAAAAGGGCTCATC

GGGCTATTGCGCCTGGCCCGCGTGTTACTGCTACGGGCTTCCAAATTGGG

TGAAAGTTTGGGATAGAGCGACGAACAAATGTAAGCTTGATATCGAATTC

ATCGATAAGCTTAAAGAAGGTTATCTCAGTGATCACGAAGGTTGCAAACT

TAGTTGCTTTATCAGACCATCGGGATACTGCGGCAGAGAATGCGGAATTA

AAAAGGGCTCATCGGGCTATTGCGCCTGGCCCGCGTGTTACTGCTACGGG

CTTCCAAATTGGGTGAAAGTTTGGGATAGAGCGACGAACAAATGTAAAGC

TTAAGAAGGTTATCTCAGTGATCACGAAGGTTGCAAACTTAAGTTGCTTT

ATCAGACCATCGGGATACTGNCGGGCCAGAGAAATGGCGGGAATTTCAAC

AAAGGGGGGCTCCAATAACCAGGGGGACATATTTNCCCCATTGTACCCCC

ACCACAAATTGTATAACACAAAGCAAACACACGGGNCTTTATCCCACAAA

TCGGGGGGGAGAAAAAAACTTTATNGGACAAACAAAACACACACCAAACA

CACAAATTTTAAAACCTCGAACAAACCAAAACN

Figura 48 – Seqüênciamento da TsTx-I

(4)

em tandem no vetor pET 11a.

Seqüênciamento do clone 11. Os sítios de restrição da Hind III estão

sublinhados em verde e o sítio da Bam HI está em vermelho.

146

2 - Construção da proteína quimérica

Nesta etapa, foi construída uma proteína recombinante no pET 11a

utilizando as seqüências da proteína TsNTxP e toxinas TsTx e TsTx-I, como

está ilustrado na figura abaixo.

Figura 49 – Construção da proteína recombinante quimérica no vetor

pBluescript.

2.1 - Clonagem do DNA da TsNTxP (amplificado do pMAL) no vetor

pGEM

O fragmento de DNA da TsNTxP foi amplificado do vetor pMAL já

subclonado com a seqüência de nucleotídeos desta proteína (Figura 50a).

O DNA amplificado foi purificado (Figura 50b) e ligado no vetor pGEM como

descrito na metodologia. As colônias positivas foram submetidas à extração

plasmidial. Os clones obtidos foram cortados com a enzima Xho I e todos

plasmídeos sofreram corte e liberaram uma banda de 189 pb (tamanho

esperado – Figura 50c). Destes clones, quatro foram seqüenciados. Todos os

clones apresentaram o DNA da TsNTxP clonado na janela de leitura correta.

BlueScrip

Xho Xho

HindIII

Sal1

HindIII

TsNTxP

TsTx

TsTx-I

Xho Xho

HindIII

Sal1

HindIII

TsNTxP

BlueScrip

Xho Xho

HindIII

Sal1

HindIII

TsNTxP

TsTx

TsTx-I

Xho Xho

HindIII

Sal1

HindIII

TsNTxP

Xho Xho

HindIII

Sal1

HindIII

TsNTxP

TsTx

TsTx-I

Xho Xho

HindIII

Sal1

HindIII

TsNTxP

147

Figura 50 – Amplificação, purificação e clonagem do DNA da TsNTxP em

pGEM. Em A, na canaleta 1 temos o padrão de massa molecular de 100 pb

(Invitrogen); na canaleta 2 controle negativo da reação (todos reagentes,

menos DNA) e na canaleta 3 temos o produto de amplificação do DNA da

TsNTxP. Em B, na canaleta 1, temos padrão de massa molecular de 100 pb

(Invitrogen); nas canaletas 2 e 3 temos o DNA da TsNTxP das 1ª e 2ª eluições

da purificação de DNA. Em C, temos dois clones obtidos da ligação cortados

com a enzima Xho I, na ordem não cortado e cortado. As setas brancas

indicam os fragmentos de DNA obtidos.

50(5) 25(5)

A. B. C.

200 pb

1 2 3

200 pb

1 2 3 4

148

2.2 - Subclonagem do DNA da TsNTxP no vetor pBluescript

contendo o DNA da TsTx-I

O clone 50(5) contendo o DNA da TsNTxP (em pGEM) e os clones 14 (2

cópia) e 16 (1 cópia) contendo o DNA da TsTx-I (em pBluescript) foram

cortados com a enzima Xho I (Figura 51a). O inserto do clone 50(5) foi

purificado pela sílica e os clones 14 e 16 foram desfosforilados (Figura 51b). A

ligação e a transformação foram feitas de acordo com metodologia já descrita.

Das colônias obtidas, as positivas foram submetidas à extração plasmidial e os

plasmídeos foram cortados com Xho I, os clones 14(1), 14(2), 14(3), 14(6),

14(17) e 16(4), 16(5), 16(24), 16(29), 16(36) e 16(43) foram cortados e

liberaram uma banda de 189 pb, que é o tamanho esperado para o DNA da

TsNTxP (Figura 51c). Todos os clones foram seqüenciados e verificou-se que o

DNA da TsNTxP foi clonado corretamente.

149

Figura 51 – Clonagem do DNA da TsNTxP nos clones 14 e 16 da TsTx-I (di

e mono). Em A, nas canaletas 1 e 2, clone 14 não cortado e cortado com Xho

I, respectivamente; nas canaletas 3 e 4, clone 16 não cortado e cortado com

Xho I, respectivamente; nas canaletas 5 e 6, clone 50(5) não cortado e cortado

com Xho I, respectivamente. Em B, nas canaletas 1 e 8, padrões de massa

molecular  Hind (Gibco) e 100 pb (Invitrogen), nas canaletas 2 e 3 clones 14 e

16 cortados com Xho I e desfosforilados, respectivamente, nas canaletas 4, 5,

6 e 7, DNA da TsNTxP purificado pelo método da sílica, 1ª e 2ª eluições da

purificação de DNA, de duas purificações diferentes, respectivamente. Em C,

primeiro o plasmídeo cortado e depois plasmídeo não cortado pela enzima Xho

I, nas canaletas 1 e 2 temos o clone 14(1) e nas canaletas 3 e 4 temos o clone

16(36). Abaixo estão os nomes dos clones e as setas brancas indicam os

fragmentos de DNA obtidos.

14(1) 16(36)

A. B. C.

Clone

50(5)

14 16

pBluescript +

TsTx-I

DNA TsNTxP

200 pb

1 2 3 4

1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6

150

2.3 - Clonagem do DNA da TsTx em pGEM

O DNA da TsTx foi amplificado do clone 3E9 da biblioteca (Figura 52a).

Este DNA amplificado foi purificado pelo método da sílica e ligado ao vetor

pGEM (Figura 52b). As colônias positivas tiveram seus plasmídeos extraídos e

cortados com a enzima de restrição Sal I. Todos os clones cortaram e liberam

um fragmento de 192 pb (Figura 52c). Eles foram seqüenciados e a clonagem

correta foi confirmada.

151

Figura 52 – Clonagem do DNA da TsTx no pGEM. Em A, na canaleta 1

temos o padrão de massa molecular de 100 pb (Invitrogen), na canaleta 2

controle negativo da reação (todos reagentes, menos DNA) e na canaleta 3

temos o produto da amplificação do DNA da TsTx. Em B, na canaleta 1, 2 e 3

temos o DNA da TsTx das 1ª, 2ª e 3ª eluições da purificação de DNA,

respectivamente. Em C, dois clones positivos da ligação da TsTx no pGEM

cortados com Sal I. As setas brancas indicam os fragmentos de DNA obtidos.

200 pb

1 2 3 4

2 3

A. B. C.

200 pb

1 2 3

200 pb

1 2 3 4

152

2.4 - Subclonagem do DNA da TsTx no vetor pBluescript contendo o

DNA da TsTx-I+TsNTxP

Os clones 14(1), pBluescript+TsTx-I

(2)

+TsNTxP e o clone 16(36),

pBluescript+TsTx-I

(1)

+TsNTxP, foram cortados com a enzima Sal I e tiveram

suas pontas desfosforiladas (Figura 53a). O clone 3 da TsTx em pGEM foi

cortado com Sal I e o fragmento liberado foi purificado (Figura 53b) e ligado aos

vetores já cortados. Os plasmídeos foram obtidos por lise alcalina das colônias

positivas.

Um PCR usando os primers do vetor (M13-40 e M13 anti-senso) foi feito

após a ligação e um clone da construção com o clone 16(36) e dois clones da

construção com o clone 14(1) apresentaram banda maior do que os

respectivos clones antes da clonagem (Figura 54). Então os 3 clones positivos

foram seqüenciados. O clone 3+36 C7 continha a seqüência de nucleotídeos

da TsNTxP, TsTx e TsTx-I inseridas no vetor pBluescript nos sítios certos e em

janela de leitura correta. O clone 3+1 G2 e E8 continham a seqüência de

nucleotídeos da TsNTxP, TsTx e duas TsTx-I inseridas no vetor pBluescript nos

sítios certos e em janela de leitura correta (Figura 55).

153

Figura 53 – Clonagem do DNA da TsTx no vetor pBluescript contendo o

DNA da TsTx-I +TsNTxP. Em A, o clone 16(36) não cortado, cortado com Hind

III, cortado com Xho I e cortado com Sal I, respectivamente; o clone 14(1) não

cortado, cortado com Hind III, cortado com Xho I e cortado com Sal I,

respectivamente; o clone 3 não cortado e cortado com Sal I, respectivamente.

Em B, na canaleta 1 temos o DNA da TsTx liberado do pGEM pelo corte com

Sal e purificado; na canaleta 2 temos 100 ng do padrão  íntegro (Gibco); na

canaleta 3 temos o clone 16(36) cortado e desfosforilado e na canaleta 4 temos

o clone 14(1) cortado e desfosforilado. As setas brancas indicam os fragmentos

de DNA obtidos.

Clone

16(36)

Clone

14(1)

Clone 3

1 2 3 4

A. B.

200 pb

3 Kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

154

Figura 54 – Verificação da clonagem do DNA da TsTx no pBluescript

contendo o DNA da TsTx-I+TsNTxP. Em A, estão mostrados o controle

positivo (C+), o controle negativo (C-), o produto de amplificação do clone

16(36) e os produtos de amplificação dos clones obtidos na ligação. Em B,

estão mostrados o controle positivo (C+), o controle negativo (C-), o produto de

amplificação do clone 14(1) e os produtos de amplificação dos clones obtidos

na ligação. Em ambos os casos, o controle positivo é o produto da amplificação

do pBluescript com os primers M13 reverso e forward e o controle negativo é a

reação de PCR feita sem DNA.

C+ C- 36 B1 B2 B3 B4 B5 C4 C5 C6 C7 C8

C+ 1 E5 E6 E7 E8 E9 C- G2 G3 G4 G1

C+ C- 36 B1 B2 B3 B4 B5 C4 C5 C6 C7 C8

C+ C- 36 B1 B2 B3 B4 B5 C4 C5 C6 C7 C8C+ C- 36 B1 B2 B3 B4 B5 C4 C5 C6 C7 C8

C+ 1 E5 E6 E7 E8 E9 C- G2 G3 G4 G1

400 pb

600 pb

800 pb

250 pb

155

>A11 well A11 EKThais2701_23032007 Run01 Cimarron 3.12 778

AANTCCCAGCATACCTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGGTACGGGCCCCC

CCTCGAGGGTAGAGAAGGTTATCCAGCGGATTCCAAGGGTTGCAAAATTA

CTTGTTTTCTTACAGCTGCAGGATACTGCAATACAGAATGCACACTCAAA

AAGGGATCATCGGGTTATTGCGCCTGGCCGGCGTGTTACTGCTACGGGCT

TCCAGATTCAGTGAAAATTTGGACTAGTGAAACGAATAAATGTGGCCTCG

AGGTCGACAAGAAAGACGGATACCCGGTGGAATACGATAACTGCGCCTAC

ATTTGCTGGAACTACGACAACGCTTACTGCGATAAGCTGTGCAAAGACAA

GAAAGCCGATAGCGGATATTGTTACTGGGTTCACATCCTGTGCTACTGCT

ACGGGCTTCCCGATAGCGAACCGACCAAGACCAACGGAAAATGCAAATCC

GTCGACGGTATCGATAAGCTTAAAGAAGGTTATCTCAGTGATCACGAAGG

TTGCAAACTTAGTTGCTTTATCAGACCATCGGGATACTGCGGCAGAGAAT

GCGGAATTAAAAAGGGCTCATCGGGCTATTGCGCCTGGCCCGCGTGTTAC

TGCTACGGGCTTCCAAATTGGGTGAAAGTTTGGGATAGAGCGACGAACAA

ATGTAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTA

GAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTA

TTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGG

>B11 well B11 EKThais2701_23032007 Run01 Cimarron 3.12 866

CAGCGCATACCTCACTAACNGGAACAATAGCTGGGTACGGGCCCCCCCTC

GAGGGTAGAGAAGGTTATCCAGCGGATTCCAAGGGTTGCAAAATTACTTG

TTTTCTTACAGCTGCAGGATACTGCAATACAGAATGCACACTCAAAAAGG

GATCATCGGGTTATTGCGCCTGGCCGGCGTGTTACTGCTACGGGCTTCCA

GATTCAGTGAAAATTTGGACTAGTGAAACGAATAAATGTGGCCTCGAGGT

CGACAAGAAAGACGGATACCCGGTGGAATACGATAACTGCGCCTACATTT

GCTGGAACTACGACAACGCTTACTGCGATAAGCTGTGCAAAGACAAGAAA

GCCGATAGCGGATATTGTTACTGGGTTCACATCCTGTGCTACTGCTACGG

GCTTCCCGATAGCGAACCGACCAAGACCAACGGAAAATGCAAATCCGTCG

ACGGTATCGATAAGCTTAAAGAAGGTTATCTCAGTGATCACGAAGGTTGC

AAACTTAGTTGCTTTATCAGACCATCGGGATACTGCGGCAGAGAATGCGG

AATTAAAAAGGGCTCATCGGGCTATTGCGCCTGGCCCGCGTGTTACTGCT

ACGGGCTTCCAAATTGGGTGAAAGTTTGGGATAGAGCGACGAACAAATGT

AAGCTTAAAGAAGGTTATCTCAGTGATCACGAAGGTTGCAAACTTAGTTG

CTTTATCAGACCATCGGGATACTGCGGCAGAGAATGCGGAATTAAAAAGG

GCTCATCGGGCTATTGCGCCTGGGCCCGCGTGTTACTGCTACGGGCTTCC

AAATTGGGTGAAAGTTTGGGGATAGAGCGACGAAACAAATGTAAGCTTGA

TATCGAATTTCCTGCGCCNGGGGATTCCCCTTGTTCTAGAAGCGGGCGCC

ACCGCCGGTGAGCCTCCATTTCGGCCTTTTTGGTCGNTTACGCGCCCACG

GGCGCGTTTCACGTCTGCACTGGGAAACC

Figura 55 – Seqüenciamento das construções quiméricas. Em A, o clone

3+36 C7 e em B, o clone 3+1 G2. Os sítios das enzimas de restrição estão

sublinhados: amarelo para Xho I, azul para Sal I e verde para Hind III. As

seqüências das toxinas estão em letras coloridas: amarelo para TsNTxP, azul

para TsTx e verde para TsTx-I.

156

 – Expressão e Caracterização das proteínas recombinantes

Duas construções foram escolhidas para a expressão: a construção com

1 (mono: representada por TsTx-I

(1)

) e 2 cópias (di: representada por TsTx-I

(2)

)

da TsTx-I.

1 – Expressão piloto da TsTx-I

(2)

Utilizou-se os clones 43 A4, C7 e C12 que foram transformados em 2

linhagens de bactérias E. coli BL21 (DE3) e Origami. Os tempos de expressão

de 0 h (antes da indução), 2, 4, 6 e 24 h (após indução) foram coletados. Na

Figura 56 pode-se notar que os três clones expressaram uma proteína de 17

kDa correspondente ao peso da proteína recombinante na bactéria BL21, mas

apenas 2 expressaram na Origami. Também pode-se notar que a BL21

expressou mais proteína em um mesmo período de tempo. Para todos os

clones, observou-se que há um pequeno aumento da expressão do tempo de

2h para o tempo de 4h, o mesmo ocorrendo no tempo de 6h para 24h. Não há

diferença detectável de expressão dos clones entre os tempos de 4h e 6h

(Figura 57). O clone 43 A4 e a bactéria BL21 foram escolhidos para dar

continuidade aos experimentos. O tempo de expressão escolhido foi o de 4h.

157

Figura 56 – Expressão piloto da proteína recombinante TsTx-I

(2)

. Gel de

SDS-PAGE 18% corado com azul de coomassie. Alíquotas de 1 mL eram

retiradas da cultura de expressão, centrifugadas e o pellet de bactérias era

ressuspendido em 100 l de tampão de amostra com redução; destes 10 l

eram aplicados no gel. Nas canaletas 1, 2 e 3 estão os extratos bacterianos da

expressão de 4 horas dos clones C12, C7 e A4 em BL21 (DE3),

respectivamente; na canaleta 4 temos o extrato antes da indução do clone A4

expresso na BL21. Na canaleta 5 temos o extrato antes da indução do clone A4

expresso na Origami; e nas canaletas 6, 7 e 8 estão os extratos bacterianos da

expressão de 4 horas dos clones A4, C7 e C12 na Origami, respectivamente. O

padrão de peso usado foi SeeBlue Plus2 pre-stained standard (Invitrogen).

16 kDa

1 2 3 4 pd 5 6 7 8

16 kDa16 kDa

1 2 3 4 pd 5 6 7 8

158

Figura 57 - Curva de expressão dos clones da proteína recombinante

TsTx-I

(2)

em BL21 (DE3). Gel de SDS-PAGE 15% corado com azul de

coomassie. Alíquotas de 1 mL eram retiradas da cultura de expressão,

centrifugadas e o pellet de bactérias era ressuspendido em 100 l de tampão

de amostra com redução; destes 10 l eram aplicados no gel. Em A, temos nas

canaletas 1, 2, 3, 4 e 5 os tempos de expressão 0, 2, 4, 6 e 24 horas do clone

A4, respectivamente; nas canaletas 6, 7, 8 e 9, os tempos de expressão 0, 2, 4

e 6 horas do clone C7, respectivamente. Em B, temos na canaleta 1 o tempo

de 24 horas de expressão do clone C7; nas canaletas 2, 3, 4, 5 e 6 temos os

tempos de expressão 0, 2, 4, 6 e 24 horas do clone C12, respectivamente. O

padrão utilizado foi SeeBlue Plus2 pre-stained standard (Invitrogen).

1 2 3 4 5 pd 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 pd

16 kDa

1 2 3 4 5 pd 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 pd

16 kDa16 kDa

159

2 – Expressão em larga escala da TsTx-I

(2)

Foi feita uma expressão em larga escala com um litro de cultura. Usou-

se o clone 43 A4 já transformado anteriormente. Mas não houve expressão

como podemos ver na Figura 58.

Figura 58 - Expressão em larga escala da proteína recombinante TsTx-I

(2)

Gel de SDS-PAGE 15% corado com azul de coomassie. Alíquotas de 1 mL

eram retiradas da cultura de expressão, centrifugadas e o pellet de bactérias

era ressuspendido em 100 l de tampão de amostra com redução; destes 10 l

eram aplicados no gel. Na canaleta 1 temos o padrão de peso Protein

Molecular Weight Marker (Jena Bioscience); na canaleta 2 e 3 temos os

tempos de 0 e 4 horas da expressão do clone A4.

14 kDa

1 2 3

14 kDa14 kDa

1 2 3

160

3 – Teste de expressão TsTx-I

(2)

Para se verificar qual era o problema com a expressão, primeiramente o

ensaio da expressão em larga escala foi repetido com bactérias recém

transformadas. Não se obteve sucesso. Na segunda tentativa, 15 colônias

recém transformadas foram coletadas e expressas individualmente cada uma.

Como pode-se observar na Figura 59 algumas colônias não estavam

expressando. Então, uma colônia mesmo tendo o plasmídeo de expressão

recombinante, pode não expressar a proteína recombinante. Sendo assim toda

vez que um experimento era iniciado, havia a necessidade de se verificar

anteriormente qual colônia estava expressando.

Figura 59 – Triagem das colônias recombinantes da TsTx-I

(2)

que estavam

expressando. Gel de SDS-PAGE 15% corado com azul de coomassie.

Alíquotas de 1 mL eram retiradas da cultura de expressão, centrifugadas e o

pellet de bactérias era ressuspendido em 100 l de tampão de amostra com

redução; destes 10 l eram aplicados no gel. Na canaleta 1 temos o tempo de

expressão 0 horas do clone A4 e nas demais canaletas temos os tempos de 4

horas de expressão de várias colônias do clone A4. O padrão de peso utilizado

foi Protein Molecular Weight Marker (Jena Bioscience).

14 kDa

pd 1 2 3 4 5 6 7 8

14 kDa14 kDa

pd 1 2 3 4 5 6 7 8

161

4 – Expressão em Larga Escala e Lise Bacteriana TsTx-I

(2)

Duas metodologias foram testadas para verificar qual produzia mais

proteína recombinante. A primeira consistiu em expressar 10 colônias

individuais em 10 mL de meio e analisar a expressão em gel de poliacrilamida

para ver qual estava expressando; e usar o pré-inoculo desta colônia para

inocular uma nova alíquota de meio de cultura, que foi o pré-inoculo da

expressão em larga escala (1 L ou mais). A outra consistiu em expressar 50

colônias individuais em 10 mL e após análise, as colônias produtoras da

proteína recombinante foram lisadas em conjunto (Figura 60).

Depois de 4h de indução, as culturas foram centrifugadas e os pelletes

ressuspendidos em tampão de lise. Após a lise, uma alíquota de cada uma das

amostras foi corrida em gel de poliacrilamida SDS-PAGE.

Pode-se observar nas Figuras 61 e 62 que a banda de expressão obtida

com a primeira metodologia é muito mais fraca do que a banda usando a

segunda. Em termos de peso seco de células existe pouca diferença (1

– 3,7

g/L de células e 2

– 3,36 g/L de células).

A banda correspondente à proteína recombinante ficou retida no pellet

indicando que ela foi expressa de maneira insolúvel em corpúsculos de

inclusão. O volume do pellet da TsTx-I

(2)

dissolvido em tampão de lise (1

– 2

mL e 2

– 1 mL) e a quantidade de proteínas contida neles (Figuras 58 e 59 )

foram muito similares para as duas metodologias usadas para a expressão.

Verificou-se também o aparecimento de uma banda de 14 kDa tanto no

sobrenadante quanto no pellet, que pode ser um fragmento da proteína

recombinante ou de uma outra proteína. Essa banda difere da recombinante

que esta ligeiramente acima.

162

Figura 60 – As duas metodologias utilizadas para expressão em larga

escala da TsTx-I

(2)

. Em A, a primeira metodologia usada, o pré-inóculo de uma

das colônias positivas era utilizado para a expressão de 1 litro. Em B, a

segunda metodologia, onde todas as colônias positivas eram lisadas em

conjunto.

Expressão de 10 colônias

Pré-inóculo



Expressão



Gel de poliacrilamida



Colônias positivas

Expressão em larga escala de 1 colônia +

Pré-inóculo



Expressão de 1litro



Gel de poliacrilamida



Lise bacteriana

Expressão de 50 colônias

Pré-inóculo



Expressão



Gel de poliacrilamida



Colônias positivas



Lise bacteriana

A. B.

Expressão de 10 colônias

Pré-inóculo



Expressão



Gel de poliacrilamida



Colônias positivas

Expressão em larga escala de 1 colônia +

Pré-inóculo



Expressão de 1litro



Gel de poliacrilamida



Lise bacteriana

Expressão de 50 colônias

Pré-inóculo



Expressão



Gel de poliacrilamida



Colônias positivas



Lise bacteriana

A. B.

163

Figura 61 – Lise bacteriana após expressão em larga escala da TsTx-I

(2)

utilizando a primeira metodologia. Gel de SDS-PAGE 15% corado com azul

de coomassie. Em A, temos na canaleta 1 e 2 os tempos de expressão de 0 e

4 horas (10 l). Em B, temos nas canaletas 1, 2, 3, 4, 5, e 6 os seis

sobrenadantes (10 l) e nas canaletas 7 e 8 os pellets (10 l), todos obtidos da

lise. O padrão utilizado foi Protein Molecular Weight Marker (Jena Bioscience).

O círculo vermelho indica a proteína recombinante e o retângulo amarelo indica

a proteína de 14 kDa.

pd 1 2 3 4 5 6 7 8

14 kDa

pd 1 2

14 kDa

A. B.

pd 1 2 3 4 5 6 7 8

14 kDa

pd 1 2

14 kDa

A. B.

pd 1 2 3 4 5 6 7 8

14 kDa14 kDa

pd 1 2

14 kDa14 kDa

A. B.

164

Figura 62 - Lise bacteriana após expressão em larga escala da TsTx-I

(2)

utilizando a segunda metodologia. Gel de SDS-PAGE 15% corado com azul

de coomassie. Em A, temos na canaleta 1 e 2 os tempos de expressão de 0 e

4 horas (10 l). Em B, temos nas canaletas 1, 2, 3 e 4 os quatro sobrenadantes

(10 l) e na canaleta 5 o pellets (10 l), todos obtidos da lise bacteriana. O

padrão utilizado foi Protein Molecular Weight Marker (Jena Bioscience). O

círculo vermelho indica a proteína recombinante e o retângulo amarelo indica a

proteína de 14 kDa.

pd 1 2

14 kDa

pd 1 2 3 4 5

pd 1 2

14 kDa

pd 1 2 3 4 5

pd 1 2

14 kDa14 kDa

pd 1 2 3 4 5

165

5 – Western blotting da TsTx-I

(2)

A proteína TsTx-I

(2)

recombinante foi caracterizada por ensaio

imunológico utilizando a técnica de Western blotting.

Em dois géis de 15% foram aplicadas as seguintes amostras: padrão de

massa molecular, extrato bacteriano no tempo 0h e 4h, sobrenadante e pellet

da lise (Figura 63). Um gel foi corado com coomassie blue e descorado e o

outro foi transferido durante 1h para uma membrana de nitrocelulose. Esta foi

incubada primeiro com anticorpos anti-veneno total de T. serrulatus e depois

com o respectivo anticorpo secundário (conjugado).

Observou-se que o anticorpo anti-veneno reconhece bem a proteína

recombinante, tanto no tempo de 4h de expressão, quanto no pellet da lise.

Mas não houve resolução suficiente para determinar se a proteína de 14 kDa

(proteína que surge no extrato bacteriano após lise) contida no pellet também

está sendo reconhecida. No sobrenadante, existe muito pouco reconhecimento

do anticorpo frente à proteína de 14 kDa.

166

Figura 63 – Western blotting da TsTx-I

(2)

. Em A, gel de poliacrilamida a 18%

corado com azul de coomassie e em B, Westing blotting em membrana de

nitrocelulose, foi utilizado soro de coelho anti-veneno de Tityus serrulatus na

diluição de 1:100. Nas canaletas 1, 2, 3 e 4 temos o tempo de expressão de 0

horas, o sobrenadante e o pellet da lise bacteriana e o tempo de expressão de

4 horas, respectivamente. O padrão utilizado foi Kaleidoscope Prestained

Standard (Bio-Rad). Foram aplicados 10 l dos extratos de expressão e 20 g

do sobrenadante e do pellet da lise bacteriana.

17,5 kDa

pd 1 2 3 4 pd 1 2 3 4

17,5 kDa17,5 kDa

pd 1 2 3 4 pd 1 2 3 4

167

6 – Tentativa para produzir a proteína recombinante TsTx-I

(2)

solúvel

Algumas condições da expressão foram mudadas para verificar se era

possível conseguir produzir a proteína recombinante solúvel. As variações

foram a utilização de temperaturas mais baixas que 37C (25 e 30C) para

expressão, diminuição na concentração de IPTG (0,1 mM, 0,05 mM), utilização

de um meio mais rico (2% de bactotriptona, 1,5% de extrato de levedura, 0,2%

de Na

HPO

, 0,1% de KH

, 0,8% NaCl). Nos três casos, não foi obtido

sucesso em produzir a proteína solúvel.

Desta forma, uma expressão com as bactérias BL21 em fermentador foi

feita para analisar a interferência do oxigênio dissolvido na solubilização da

proteína recombinante. Mesmo com uma quantidade de oxigênio adequada e

controlada, as bactérias produziram praticamente toda a proteína de interesse

de forma insolúvel. Nos sobrenadantes uma banda muito fraca do tamanho da

proteína recombinante foi identificada, mas em quantidade inadequada para

ser purificada (Figura 64).

168

Figura 64 – Expressão da TsTx-I

(2)

em fermentador. Gel de SDS-PAGE

15% corado com azul de coomassie. Em A, a expressão piloto para verificar

as colônias que estavam expressando, os números indicam as colônias.

Foram usadas alíquotas de 10 l do tempo de expressão de 4 horas. Em

B, temos nas canaletas 1, 2 e 3, 10 l dos tempos de 0, 2 e 4 horas de

expressão no fermentador do clone A4. Em C e D temos a lise

bacteriana, os números de 1 a 10 indicam os dez sobrenadantes obtidos

e P indica o pellet obtido. Foram aplicadas no gel alíquotas de 10 l. O

padrão utilizado foi

Kaleidoscope Prestained Standard (Bio-Rad).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

17,5 kDa

1 2 3 pd

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

17,5 kDa17,5 kDa

1 2 3 pd

pd 1 2 3 4 5 6

17,5 kDa

7 8 9 10 P pdpd 1 2 3 4 5 6

17,5 kDa17,5 kDa

7 8 9 10 P pd

169

7 – Expressão da BL21 e BL21/pET

Para verificarmos a origem da proteína de 14 kDa, a BL21 sem

plasmídeo e com plasmídeo (pET sem inserto) foram expressas e o extrato das

culturas foram lisados. A banda de 14 kDa não foi expressa nem na BL21 nem

na BL21/pET, mas após sonicação ela apareceu em ambos (Figura 65). Visto

que a proteína de 14 kDa não estava presente no extrato de bactérias

expressos, ela não deve ser uma proteína expressa. Ela apareceu após a lise,

sendo assim algum procedimento durante este processo deve ser o

responsável por sua origem e como ela estava presente tanto na lise das

bactérias sem plasmídeo como na lise das bactérias com o pET sem inserto,

possivelmente ela é um fragmento de alguma proteína da bactéria. É

necessário saber porque está acontecendo quebra de proteínas durante a lise.

Duas possibilidades podem estar envolvidas: quebra por ação de proteases e

quebra por ação mecânica do sonicador.

Figura 65 – Expressão de proteínas nas bactérias BL21 e BL21/pET. Gel de

SDS-PAGE 15% corado com azul de coomassie. Nas canaletas 1, 2, 3 e 4

temos os tempos de expressão de 0 e 4 horas e o sobrenadante e o pellet da

lise da expressão da BL21, respectivamente. Nas canaletas 5, 6, 7 e 8 temos

os tempos de expressão de 0 e 4 horas e o sobrenadante e o pellet da lise da

expressão da BL21/pET, respectivamente. Foram aplicadas no gel alíquotas

de 10 l.

O padrão utilizado foi Kaleidoscope Prestained Standard (Bio-Rad).

1 2 3 4 pd 5 6 7 8

17,5 kDa

1 2 3 4 pd 5 6 7 8

17,5 kDa17,5 kDa

170

8 – Tentativa de reduzir a formação da proteína de 14 kDa

Nestes ensaios foram usados os extratos da expressão do pET sem

inserto na BL21 (DE3).

Para verificar se o aparecimento da proteína de 14 kDa é causado por

proteases duas técnicas foram testadas. A primeira foi utilizar um inibidor de

protease (PMSF) em todas as etapas da lise (Figura 63a). A outra técnica foi a

utilização de temperatura (80C por 1h) para desnaturar qualquer enzima

(Figura 63b). Foi verificado também se o tratamento com lisozima tem alguma

ação (Figura 66b). Após o tratamento com inibidor de protease e com a

temperatura e lisozima, o extrato bacteriano foi sonicado e então a banda de 14

Kda podia ser observada no gel de poliacrilamida.

Sendo assim, parece que o tratamento mecânico foi o responsável pela

quebra da proteína. A lise das bactérias com homogeneizador de tecidos e

poter, também foi avaliada, mas eles também causavam o aparecimento da

proteína de 14 kDa (Figura 66c e d).

A possibilidade de estar acontecendo um processo oxidativo que levasse

ao aparecimento de proteína de 14 kDa foi cogitada. Várias concentrações de

DTT foram testadas sem sucesso (Figura 66e e f).

171

1 2 3 4 5 6 7 pd

14 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 pd

14 kDa

pd 1 2 3 4 5 6 pd 1 2 3 4 5

C. D.

1 2 3 4 5 6 7 pd

14 kDa14 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 pd

14 kDa14 kDa

pd 1 2 3 4 5 6 pd 1 2 3 4 5

C. D.

1 2 3 4 pd

14 kDa

1 2 3 4 5

1 2 3 4 pd

14 kDa14 kDa

1 2 3 4 5

172

Figura 66 – Processos para tentar evitar o surgimento da proteína de 14

kDa. Gel de SDS-PAGE 15% corado com azul de coomassie. Em A, nas

canaletas 1 a 4 temos os quatro sobrenadantes da lise feita com PMSF e nas

canaletas 5 a 7 temos os pellets obtidos da lise. Em B, nas canaletas 1 e 2

temos o pellet e sobrenadante após 1h a 80C; na canaleta 3 temos o pellet

após tratamento com lisozima e nas canaletas 4 a 6 temos os sobrenadantes e

o pellet da lise; nas canaletas 7 e 8 temos sobrenadante e pellet após 16h a

25C. Em C, lise com homogeneizador de tecidos, nas canaletas 1

a 5 os

sobrenadantes e na 6 o pellet da lise. Em D, temos a lise com poter, nas

canaletas 1 a 4 temos os sobrenadantes e na 5 o pellet da lise. Em E, temos a

lise com 0,5 mM de DTT, nas canaletas 1 a 3 temos os sobrenadantes e na 4

temos o pellet. Em F, temos a lise com várias concentrações de DTT, nas

canaletas 1 a 5 temos, pellet sem DTT, com 0,5 mM, com 1 mM, com 2 mM e 4

mM de DTT, respectivamente. Nos géis A a C o padrão utilizado foi o Protein

Molecular Weight Marker (Jena Bioscience) e nos géis de D a F o padrão

utilizado foi Low Range (Promega).

173

9 – Teste de dissolução da proteína recombinante TsTx-I

(2)

Uma alíquota de pellet insolúvel foi tratada com os seguintes reagentes:

6 M de Tiocianato de Guanidina, 6 M de Uréia, SDS 10%, Triton X-100 25%,

Tween-20 25%, 4 N NaOH, 3 M de Acetato de Sódio pH 5,2 e 1 M de Tris ácido

pH 4,0. Os detergentes Triton X-100 e o Tween 20 falharam em dissolver a

proteína insolúvel. Já o SDS dissolveu grande parte dela. O desnaturante

Tiocianato de Guanidina não foi muito bom para solubilizar a proteína, uma vez

que a maioria das proteínas contaminantes foram dissolvidas, mas a proteína

de interesse ficou retida no pellet. A Uréia também dissolveu grande parte das

proteínas insolúveis, inclusive a proteína recombinante. As proteínas tratadas

com NaOH, não correram bem no gel de poliacrilamida SDS-PAGE, dificultado

a análise e a avaliação do seu efeito. O Tris ácido basicamente só dissolveu a

proteína de 14 kDa e o acetato dissolveu um pouco a proteína de interesse

juntamente coma proteína de 14 kDa (Figura 67).

A concentração mínima de SDS que podíamos usar para dissolver uma

quantidade de proteína adequada foi testada. As concentrações de 5%, 1%,

0,5%, 0,1%, 0,05% e 10% como controle foram utilizadas. Na Figura 65, pode-

se observar que as concentrações de 0,05% e 0,1% não conseguiram diluir a

proteína recombinante, mas todas as outras concentrações conseguiram e de

forma bastante eficiente. O efeito da temperatura na dissolução do SDS

também foi avaliado. O aumento da temperatura solubilizou mais proteínas

contaminantes que ficam juntamente com a proteína TsTx-I

(2)

no sobrenadante,

portanto este procedimento não foi utilizado (Figura 68).

A proteína solubilizada em SDS 0,5% foi dialisada contra tampão fosfato

0,05 M com 0,15 M de NaCl. A diálise durou 3 dias e foram feitas três trocas,

ao final havia um precipitado. Um gel de poliacrilamida foi corrido com o

sobrenadante e com o precipitado, e verificamos que a TsTx-I

(2)

estava no

precipitado. Duas possibilidades podem ter acontecido: como a diálise é feita a

4C, o SDS precipitou levando consigo a proteína de interesse ou a proteína

precipitou porque voltou a ficar em uma conformação inadequada e ficou

insolúvel. Foi feita uma diálise à temperatura ambiente e outros tampões foram

testados, mas o mesmo ocorria.

Então, a dissolução da proteína em uréia 6 M foi feita e uma diálise com

174

trocas sucessivas; onde a cada troca a concentração de uréia no tampão foi

sendo reduzida, até não ter mais uréia no tampão, foi testada. Mas com a

redução da concentração de uréia, formou-se um precipitado na membrana de

diálise, que foi confirmado ser a proteína TsTx-I

(2)

Todas estas tentativas de dissolver a proteína solúvel e retirar o

desnaturante, foram feitas na tentativa de se obter a TsTx-I

(2)

solúvel, mas sem

substâncias que poderiam interferir na purificação e/ou utilização da proteína.

Mas isso não foi possível, sendo assim tentamos outras alternativas para se

purificar a proteína.

175

Figura 67 – Solubilização das proteínas insolúveis do pellet da lise da

expressão da TsTx-I

(2)

. Gel de SDS-PAGE 18% corado com azul de

coomassie. Em A, nas canaletas 1 e 2 sobrenadante (S) e pellet (P) do

tratamento com SDS 10%; nas canaletas 3 e 4, S e P do tratamento com

Triton-X 100; nas canaletas 5 e 6, S e P do tratamento com Tween 20,

respectivamente. Em B, nas canaletas 1 e 2 temos o sobrenadante e o pellet

do tratamento com tiocianato de guanidina. Em C, nas canaletas 1 e 2 temos

sobrenadante e pellet do tratamento com uréia. Em D, nas canaletas 1 e 2

temos S e P do tratamento com NaOH; na canaleta 3 temos o pellet da TsTx-

(2)

sem tratamento; nas canaletas 4 e 5 temos S e P do tratamento com

acetato de sódio e nas canaletas 6 e 7 temos S e P do tratamento com Tris

ácido. Nos dois primeiros géis, o padrão utilizado foi Protein Molecular Weight

Marker (Jena Bioscience) e nos dois últimos o padrão Kaleidoscope Prestained

Standard (Bio-Rad).

pd 1 2 3 4 5 6 7

14 kDa

1 2 pd 3 4 5 6 7

pd 1 2 pd 1 2

17,5 kDa

pd 1 2 3 4 5 6 7

14 kDa14 kDa

1 2 pd 3 4 5 6 7

pd 1 2 pd 1 2

17,5 kDa17,5 kDa

176

Figura 68 - Solubilização com SDS das proteínas insolúveis do pellet da

lise da expressão da TsTx-I

(2)

. Gel de SDS-PAGE 15% corado com azul de

coomassie. Nas canaletas 1 a 6, temos os sobrenadantes (Em A) e os pellets

(Em B) do tratamento com 0,05%, 0,1%, 0,5%, 1%, 5% e 10% de SDS,

respectivamente. O padrão utilizado foi o Protein Molecular Weight Marker

(Jena Bioscience). Em C, temos nas canaletas 1 a 4 sobrenadante e pellet do

tratamento com 0,5% de SDS a 25C e sobrenadante e pellet com o mesmo

tratamento, mas a 65C, respectivamente; nas canaletas 5 a 8 sobrenadante e

pellet do tratamento com 0,25% de SDS a 25C e sobrenadante e pellet com o

mesmo tratamento, mas a 65C, respectivamente.

18 kDa

pd 1 2 3 4 5 6 pd 1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6 7 8

18 kDa18 kDa

pd 1 2 3 4 5 6 pd 1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6 7 8

177

10 – ELISA da TsTx-I

(2)

A proteína recombinante TsTx-I

(2)

foi caracterizada por ELISA com

anticorpos anti-veneno total de Tityus serrulatus. Na figura abaixo, pode-se

notar que o soro imune reage moderadamente com as três fontes de antígenos

utilizados. O sobrenadante da lise contém pouca proteína de interesse, por isso

sua reação foi mais fraca. De toda forma a diferença de reatividade entre a

proteína recombinante e as proteínas da bactéria sem e com inserto foram

significantes adotando o nível de significância de 0,01.

Reatividade da TsTx-I (2) recombinante frente ao

soro anti-veneno de Tityus serrulatus

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

extrato sobrenadante pellet

Absorbância a 492 nm

Figura 69 – Reatividade da TsTx-I

(2)

frente ao soro anti-veneno de Tityus

serrulatus. O soro de coelho anti-veneno de T. serrulatus foi utilizado na

diluição 1:100. Os extratos, sobrenadantes e pellets da expressão da BL 21, da

BL21/pET e da TsTx-I

(2)

foram usados para sensibilizar a placa de ELISA (5

g/mL). Os valores da reação inespecífica foi deduzido dos valores

apresentados pelos extratos da proteína recombinante.

178

11 – Ensaio de Toxicidade da TsTx-I

(2)

Como a TsTx-I

(2)

foi obtida praticamente purificada com tratamento com

Tiocianato de Guanidina, foi decidido usar o pellet insolúvel após este

tratamento para imunizar os animais.

Sendo assim, a toxicidade da proteína recombinante foi testada, para

verificar a quantidade a ser usada para as imunizações. Na tabela abaixo,

pode-se ver que quantidades muito maiores da proteína recombinante do que a

da TsTx-I ( 7,5 g/20g) e do veneno de T. serrulatus, ( 12 g/20g) não

causaram nenhum morte ou sintoma de envenenamento.

Tabela 5 – Ensaio de Toxicidade da TsTx-I

(2)

Grupos Mortes Sintomas

A – 2 DL

do veneno do

Tityus serrulatus (24 g)

4/4 Sudorese, lacrimejação, salivação,

prostação.

B – extrato de bactéria da

expressão do pET sem

inserto (300 g)

0/4 Sem sintomas.

Após alguns dias desenvolveram

reação inflamatória no local da

inoculação

C – sobrenadante da lise da

expressão da TsTx-I

(2)

(300 g)

0/4 Sem sintomas

Após alguns dias desenvolveram

reação inflamatória no local da

inoculação

D - pellet da lise da

expressão da TsTx-I

(2)

(150 g)

0/4 Sem sintomas

Após alguns dias desenvolveram

reação inflamatória no local da

inoculação

E – pellet da TsTx-I

(2)

tratado

com tiocianato de guanidina

(150 g)

0/4 Sem sintomas

179

12- Expressão piloto da TsTx-I

(1)

Devido à instabilidade da expressão observada nos clones contendo o

vetor de expressão, foi necessário fazer um piloto para verificar qual colônia

expressava a proteína recombinante. Utilizou-se o clone 31 E4 e toda vez que

a proteína recombinante foi expressa, ele era transformado um dia antes em

bactéria E. coli BL21 (DE3). A expressão dessa proteína foi mais difícil, visto

que poucas colônias expressavam (Figura 70) e na maioria das vezes que a

expressão em larga escala foi feita como na primeira metodologia utilizada para

a TsTx-I

(2)

, a expressão não funcionava. Por isso neste caso a curva de

expressão não foi feita e o tempo de 4h que foi utilizado para a proteína

recombinante TsTx-I

(2)

, foi escolhido.

Figura 70 – Triagem de colônias que expressam a proteína recombinante

TsTx-I

(1)

. Gel de SDS-PAGE 18% corado com azul de coomassie. Alíquotas de

1 mL foram retiradas das culturas de expressão e centrifugadas, os pellets

bacterianos eram ressuspendidos em 100 l de tampão de amostra com

redução, destes 10 l eram aplicados no gel. Os números indicam as colônias

utilizadas para a expressão piloto. O padrão utilizado foi o Protein Molecular

Weight Marker (Jena Bioscience). Os quadrados vermelhos indicam a proteína

recombinante expressa.

14 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 pd 9

14 kDa14 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 pd 9

180

13 – Expressão em larga escala da TsTx-I

(1)

e lise bacteriana

Na maioria das vezes foi feita usando 50 colônias que eram expressas

em 10 mL de meio de cultura (Figura 71a). Os extratos bacterianos que

continham a proteína expressa foram utilizados para fazer a lise bacteriana

(Figura 71b). Pode-se observar que também nessa lise houve o surgimento da

proteína de 14 kDa. E que a proteína de interesse foi novamente expressa de

forma insolúvel, ficando em sua maioria no pellet, mas uma quantidade

razoável ficou solúvel nos sobrenadantes.

Figura 71 – Expressão em larga escala e lise bacteriana da expressão da

TsTx-I

(1)

. Gel de SDS-PAGE 18% corado com azul de coomassie. Alíquotas de

1 mL foram retiradas das culturas de expressão e centrifugadas, os pellets

bacterianos eram ressuspendidos em 100 l de tampão de amostra com

redução, destes 10 l eram aplicados no gel. Em A, um gel ilustrativo da

expressão de 10 colônias das 50; as bactérias após expressão eram

centrifugadas, ressuspendidas em tampão de lise e uma alíquota de 10 l era

retirada e misturada ao tampão de amostra 2x com redução. Em B, a lise

bacteriana, nas canaletas 1 a 4 temos os quatro sobrenadantes obtidos e na

canaleta 5 temos o pellet. O padrão utilizado foi o Protein Molecular Weight

Marker (Jena Bioscience). Os círculos vermelhos indicam a proteína

recombinante e o retângulo amarelo indica a proteína de 14 kDa.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 pd

14 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 pd

14 kDa

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 101 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 pd

14 kDa

1 2 3 4 5 pd

14 kDa

1 2 3 4 5 pd

14 kDa14 kDa

181

14 – Western blotting da TsTx-I

(1)

A proteína TsTx-I

(1)

recombinante foi caracterizada inicialmente por

ensaio imunológico utilizando a técnica de Western blotting (Figura 69). Os

anticorpos anti-veneno total reconheceram a banda de 7 kDa no tempo de 4h

de expressão, no sobrenadante e no pellet da lise, mas parece que também

reconheceram a banda de 14 kDa. As proteínas do extrato bacteriano da

expressão sem indução (tempo de zero hora), praticamente não foram

reconhecidas pelo anticorpo. Além disso, no tempo de 4 horas, a banda de 7

kDa (correspondente ao tamanho da TsTx-I) foi reconhecida com alta afinidade

e quase não houve reação cruzada com outras proteínas.

Figura 72 – Western blotting da proteína recombinante TsTx-I

(1)

. Em A, a

membrana de nitrocelulose após Western blotting, onde foi utilizado soro de

coelho anti-veneno de Tityus serrulatus na diluição 1:100 e em B, o gel de

poliacrilamida a 18% corado com azul de coomassie. Nas canaletas de 1 a 4

temos tempo de expressão 0 e 4 horas e sobrenadante e pellet após lise

bacteriana, respectivamente. O padrão utilizado foi o Kaleidoscope Prestained

Standard (Bio-Rad). Foram aplicados 10 l dos extratos de expressão e 20 g

do sobrenadante e do pellet da lise bacteriana.

pd 1 2 3 4 pd

7 kDa

A. B.

pd 1 2 3 4 pdpd 1 2 3 4 pd

7 kDa

A. B.

pd 1 2 3 4 pd

182

15 – Expressão da TsTx-I

(1)

no Fermentador

A TsTx-I

(1)

não foi expressa somente como proteína insolúvel, pois após

a lise pode-se observar que a banda correspondente à proteína recombinante

também estava presente no sobrenadante da lise (Figura 71b). Sendo assim,

seria interessante expressar a proteína em grande escala, para conseguir uma

quantidade adequada para purificação. Portanto, a TsTx-I

(1)

foi expressa em 5

litros de meio de cultura em um fermentador, com várias condições

controladas.

Como o problema de expressão de algumas colônias já era conhecido,

foi feita uma expressão piloto para verificar qual colônia expressava a

recombinante. A colônia 7 foi escolhida por apresentar a maior banda de

expressão (Figura 73a). O pré-inóculo desta colônia foi inoculado em 100 mL

de meio que foi crescido 16h a 37C. Essa cultura foi usada como pré-inóculo

para os 5 L de meio que foram usados no fermentador. Foram tiradas alíquotas

do tempo 0h e dos tempos 2h e 4h. Como pode-se ver na Figura 73b a

proteína TsTx-I

(1)

foi expressa com sucesso no fermentador. Após as 4h de

expressão essa cultura foi centrifugada e submetida à lise bacteriana. A

proteína de expressão aparece tanto nos sobrenadantes quanto no pellet da

lise, indicando que uma parte dela foi expressa de maneira solúvel (Figura 73c

e d).

183

Figura 73 – Expressão da TsTx-I

(1)

no fermentador. Gel de SDS-PAGE 18%

corado com azul de coomassie.

Em A, a expressão piloto para verificar as

colônias que estavam expressando a recombinante. Os números indicam

as colônias. Em B, temos nas canaletas 1, 2 e 3 os tempos de 0, 2 e 4

horas de expressão. Em C e D temos a lise bacteriana, os números de 1

a 10 indicam os dez sobrenadantes obtidos. P indica o pellet obtido e M

indica uma fração de bactérias não lisadas que precipita junto com o

pellet. O padrão utilizado foi

Kaleidoscope Prestained Standard (Bio-Rad).

Em todos os géis foram aplicados 10 l de cada amostra.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

7 kDa

A. B.

7 kDa

pd 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 pd

10 P M pd

C. D.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

7 kDa7 kDa

A. B.

7 kDa7 kDa

pd 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 pd

10 P M pd

C. D.

184

16 – Purificação por cromatografia da TsTx-I

(1)

O sobrenadante do fermentador que continha a TsTx-I

(1)

foi purificado

por cromatografia por HPLC. A coluna semi-preparativa C8 foi utilizada e os

tampões usados foram as soluções A (0,1% de ácido trifluoracético em água) e

B (0,1% de ácido trifluoracético em acetonitrila). A amostra (10 mL) foi passada

na coluna e apenas três picos foram obtidos (Figura 74a). Estes foram

agrupados da seguinte maneira: 1 – frações 5 a 7 (0% de acetonitrila); 2 –

frações 20 a 33 (35%) e 3 – frações 50 a 77 (75%). Os picos foram liofilizados,

ressuspendidos em um volume menor e corridos em gel de poliacrilamida. Na

Figura 74b e c, pode-se ver que não houve separação suficiente dos

componentes da amostra para se obter a TsTx-I

(1)

totalmente purificada.

185

Figura 74 – Tentativa de purificação da TsTx-I

(1)

em coluna C8 no HPLC.

Em A, cromatograma da purificação em coluna C8, as setas indicam os picos

obtidos. Em B, gel de poliacrilamida 15%, nas canaletas 1, 2 e 3 temos os três

picos obtidos na purificação. O padrão utilizado é o Kaleidoscope Prestained

Standard (Bio-Rad). Em C, gel de poliacrilamida 18%, na canaleta 1, temos o

terceiro pico da purificação. O padrão utilizado é o Low Range Marker

(Promega).

1 2 3 pd

7 kDa

18 kDa

14 kDa

6 kDa

1 2 3 pd

7 kDa7 kDa

18 kDa

14 kDa

6 kDa

18 kDa

14 kDa

6 kDa

pd 1

186

17 – Teste de dissolução da proteína recombinante TsTx-I

(1)

Seguindo os testes realizados com a recombinante TsTx

(2)

, uma alíquota

de pellet insolúvel da TsTx-I

(1)

foi tratado com os seguintes reagentes: 6 M de

Tiocianato de Guanidina, 6 M de Uréia, SDS 10%, 4 N NaOH, 3 M de Acetato

de Sódio pH 5,2 e 1 M de Tris ácido pH 4,0. As proteínas dissolvidas com

NaOH correram muito mal no gel de poliacrilamida SDS-PAGE, não sendo

possível tirar nenhuma conclusão a respeito. Já o SDS e uréia dissolveram

grande parte da proteína de interesse. O desnaturante Tiocianato de Guanidina

parece que solubilizou a proteína, mas a visualização da banda de 7 kDa no

sobrenadante foi difícil, mas como ela não estava presente no pellet que correu

bem, pode-se concluir que ela estava solubilizada no sobrenadante. O Tris

ácido só dissolveu a proteína de 14 kDa. Mas o acetato de sódio dissolveu a

proteína de interesse e a proteína de 14 kDa (Figura 75).

Como foi obtido um grau de pureza do sobrenadante do tratamento com

acetato de sódio da TsTx-I

(1)

melhor que a fração purificada pela coluna C8, ele

foi utilizado para imunizar os animais. Mas como o acetato pode prejudicar a

imunização, primeiro o sobrenadante foi dialisado e liofilizado, para depois ser

usado nas imunizações. Durante a diálise grande parte da proteína

recombinante precipitou, sendo assim, este material que continha proteínas

insolúveis e solúveis foi utilizado para imunização.

187

Figura 75 – Solubilização da proteína TsTx-I

(1)

recombinante insolúvel. Gel

de SDS-PAGE 18% corado com azul de coomassie. Em A, na canaleta 1

temos o pellet da TsTx-I

(1)

sem tratamento; em 3 e 2 sobrenadante (S) e pellet

(P) do tratamento com uréia 6 M; nas canaletas 4 e 5, S e P do tratamento com

tiocianato de guanidina 6 M; nas canaletas 6 e 7, S e P do tratamento com SDS

10%, nas canaletas 8 e 9, S e P do tratamento com acetato de sódio 3 M, nas

canaletas 10 e 11 temos S e P do tratamento com NaOH 4 N, respectivamente.

Em B, na canaleta 1 temos o pellet da TsTx-I

(1)

sem tratamento; nas canaletas

2 e 3 temos S e P do tratamento com acetato de sódio e nas canaletas 4 e 5

temos S e P do tratamento com Tris ácido 1M. Nos dois primeiros géis, o

padrão utilizado foi Low Range Marker (Promega) e no último gel o padrão

Kaleidoscope Prestained Standard (Bio-Rad).

pd 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pd

1 2 3 4 5 pd

20 kDa

7 kDa

pd 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pd

1 2 3 4 5 pd

20 kDa20 kDa

7 kDa7 kDa

188

18 – ELISA da TsTx-I

(1)

A proteína recombinante TsTx-I

(1)

também foi caracterizado por ELISA

com anticorpos anti-veneno total de Tityus serrulatus. Na figura abaixo, pode-

se notar que todos os antígenos utilizados reagiram moderadamente com o

soro imune. A diferença dos valores de reatividade entre a proteína

recombinante e as proteínas da bactéria sem e com inserto foram

significantes, adotando o nível de significância de 0,01.

Reatividade da TsTx-I (1) recombinante frente ao

soro anti-veneno de

Tityus serrulatus

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

extrato sobrenadante pellet

Absorbância a 492 nm

Figura 76 – Reatividade da proteína recombinante TsTx-I

(1)

frente ao

veneno do Tityus serrulatus. O soro de coelho anti-veneno de T. serrulatus

foi utilizado na diluição de 1:100. Os extratos, sobrenadantes e pellets da

expressão da BL 21, da BL 21/pET e da TsTx-I

(1)

foram usados para

sensibilizar a placa de ELISA (5 g/mL). Os valores de reações inespecíficas

foram deduzidos dos valores absolutos obtidos para os extratos da proteína

recombinante.

189

19 – Ensaio de Toxicidade da TsTx-I

(1)

Como o grau de pureza obtido com o tratamento com acetato de sódio

foi considerado satisfatório, a decisão de usar o sobrenadante dialisado e

liofilizado para imunizar os animais foi tomada.

Sendo assim, a toxicidade da proteína recombinante foi avaliada, para

verificar a quantidade que seria usada para as imunizações. Na tabela abaixo,

pode-se ver que quantidades muito maiores da proteína recombinante do que a

da TsTx-I ( 7,5 g/20g)) ou do veneno de T. serrulatus ( 12 g/20g), não

causaram morte ou sintoma de envenenamento.

Tabela 6 – Ensaio de Toxicidade da TsTx-I

(1)

Grupos Mortes sintomas

A – 2 DL

do veneno do

Tityus serrulatus (30 g)

4/4 Sudorese, lacrimejação,

salivação, prostação.

B – sobrenadante da lise

da expressão da TsTx-I-

(1)

(200 g)

0/4 Sem sintomas

Após alguns dias

desenvolveram reação

inflamatória no local da

inoculação

C - pellet da lise da

expressão da TsTx-I

(1)

(150 g)

0/4 Sem sintomas

Após alguns dias

desenvolveram reação

inflamatória no local da

inoculação

D – pellet da TsTx-I

(1)

tratado com acetato de

sódio (150 g)

0/4 Sem sintomas

190

IV- Produção de soros e teste de potência

1 – Determinação da DL

do veneno do Tityus serrulatus

Tínhamos dois venenos em nosso poder, um liofilizado (a mais de três

anos) e um bruto (recém extraído). Sendo assim, a determinação da dose letal

suficiente para matar 50% dos indivíduos (DL

) foi determinada para os dois

venenos. Foi verificado que a DL

para o veneno bruto era muito menor que

para o veneno liofilizado (Tabelas 7 e 8). Portanto, este fato foi investigado.

Uma parte do veneno bruto foi liofilizada, depois ressuspendida e utilizada para

se determinar à dose letal 50%. Uma queda pequena na toxicidade do veneno

após liofilização foi observada (Tabela 9).

Tabela 7 – Determinação da DL

do veneno bruto

Mortes após 24 horas (n=8) Quantidade de

veneno (g)

Primeira

repetição

Segunda

repetição

3,0 0 0

3,6 0 0

4,3 1 1

5,2 3 3

6,25 5 5

6,07g/20g 6,07g/20g

Media = 6,07g/20g

191

Tabela 8 - Determinação da DL

do veneno liofilizado

Mortes após 24 horas (n=8) Quantidade de

veneno (g)

Primeira

repetição

Segunda

repetição

9,0 0 2

10,8 1 3

13,0 1 4

15,6 4 6

18,7 6 8

16, 4 g/20g 11,7 g/20g

Media = 14,07g /20g

Tabela 9 - Determinação da DL

do veneno bruto que foi liofilizado

Mortes após 24 horas (n=8) Quantidade de

veneno (g)

Primeira

repetição

Segunda

repetição

4,3 0 0

5,2 1 1

6,25 2 4

7,5 5 5

9,0 7 7

7,12 g/20g 6,8 g/20g

Media = 6,9 g/20g

192

2 – Titulação dos soros

2.1 – Titulação dos soros dos coelhos

Os animais foram imunizados de acordo com o descrito na metodologia.

Um ciclo de imunização (3 doses) não foi suficiente para se obter um bom título

de anticorpos, todos os coelhos precisaram de doses reforços. O coelho

imunizado com veneno total, só obteve uma boa resposta após o terceiro

booster (terceira sangria), esta foi aumentada um pouco com os boosters

subseqüentes (Figura 77).

Titulação do soro anti-veneno total do escorpião

Tityus serrulatus

0,5

1,5

2,5

1:50

100

200

400

1:800

1600

1:3200

1:6400

1:12800

Diluições do soro

Absorbância a 492 nm

soro pré-imune

após ciclo de imunização

após segundo booster

após terceiro booster

após quarto boooster

após quinto booster

após sexto booster

Figura 77 – Titulação do soro anti-veneno total de Tityus serrulatus. A

placa foi sensibilizada com 5 g/mL veneno de Tityus serrulatus.

193

Já os animais imunizados com as proteínas recombinantes, mesmo

após 3 ou 4 boosters, ainda não tinham uma boa resposta contra o veneno de

T. serrulatus (Figura 78a e b). O problema parece não ser com os coelhos, pois

a reatividade dos soros frente aos imunógenos utilizados (proteínas

recombinantes), foi verificada e observou-se que ela estava adequada. De toda

maneira, estes soros foram testados quanto a sua capacidade de conferir

proteção a camundongos desafiados com o veneno do Tityus serrulatus.

194

Titulação do soro anti-TsTx-I (1) recombinante

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

1:100

200

1:400

1:8

1:1

1:6

Diluições dos soros

Absorbância a 492 nm

soro pré-imune

após ciclo de imunização

após segundo booster

após terceiro booster

Titulação do soro anti-TsTx-I (2) recombinante

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

1:50

1:200

:40

1:8

:16

200

:64

2800

Diluições dos soros

Absorbância a 492 nm

soro pré-imune

após primeiro booster

após terceiro booster

após quarto booster

Figura 78 – Titulação dos soros dos animais imunizados com TsTx-I

(1)

TsTx-I

(2)

. A placa de ELISA foi sensibilizada com 5 g/mL veneno de Tityus

serrulatus.

195

2.2 – Titulação dos soros dos camundongos

Os camundongos imunizados foram utilizados no ensaio de

neutralização in vivo. Sendo assim, antes de desafiá-los com o veneno do T.

serrulatus, o título de anticorpos devia ser verificado para determinar se ele

estava adequado. Então os animais foram sangrados por via intraorbital e o

soro foi titulado por ELISA. Na Figura 79, pode-se observar que os

camundongos imunizados com veneno total e os imunizados com

TsNTxP/MBP produziram anticorpos com boa reatividade frente ao veneno de

T. serrulatus. Os imunizados com as proteínas recombinantes, TsTx-I

(1)

e TsTx-

(2)

, produziram anticorpos com uma reatividade suficiente para o ensaio, mas

que poderia ser aumentada. Todos os grupos de animais receberam mais uma

dose de imunógeno e sete dias depois eles foram desafiados com 2 DL

veneno.

Titulação dos soros dos camundongos imunizados

0,5

1,5

2,5

Veneno TsNTxP TsTx-I (1) TsTx-I (2)

Antígenos

Absorbância a 492 nm

Figura 79 – Titulação dos soros dos camundongos imunizados. A placa de

ELISA foi sensibilizada com 5 g/mL veneno de Tityus serrulatus. Na legenda

está indicado os números dos animais. A diluição dos soros foi 1:100.

196

3 – Ensaios de neutralização

3.1 – Neutralização in vitro

O soro hiperimune obtido da última sangria de cada coelho foi incubado

1 hora a 37 com 1 ou 2 DL

do veneno de Tityus serrulatus. Após este

período camundongos foram injetados com a mistura e a sobrevivência foi

verificada após 24 horas. Os resultados estão na tabela abaixo.

Tabela 10 – Neutralização in vitro

Grupos Descrição DL

Sobrevivência Porcentagem

Veneno + PBS 1

2/4

0/4

50%

Veneno + soro

pré-imune

2/4

0/4

50%

Veneno + soro

anti-veneno

4/4

100%

Veneno + soro

anti-TsTx-I (1)

4/4

2/4

100%

50%

Veneno + soro

anti-TsTx-I (2)

4/4

3/4

100%

75%

Os ensaios foram feitos com 100 e 200 l de soro anti-recombinante

sem alterar a quantidade de veneno (ou seja 1 ou 2 DL50), mas não foram

observadas alterações nos resultados. Os animais dos grupos 1 e 2 com 1 ou 2

, apresentaram todos os sintomas de envenenamento (sudorese,

lacrimejação, salivação, prostação, dificuldade de coordenação e respiração) e

morreram dentro de 0,5 a 1 hora após a inoculação.

Os animais do grupo 3 não apresentaram praticamente nenhum sintoma.

Já os camundongos dos grupos 4 e 5, mostraram muitos efeitos do

envenenamento, mas em menor grau, e os animais que morreram

sobreviveram por um período maior do que os camundongos dos grupos 1 e 2,

pelo menos umas oito horas.

197

Utilizando-se 1 DL

, inicialmente foi observada uma sobrevivência de

100% no grupo 2 (com soro pré-imune). Mas este ensaio foi repetido muitas

vezes, mostrando que na maioria das vezes a sobrevivência ficava em torno de

50%, como é o esperado. É possível que a variação individual esteja

influenciando o ensaio, sendo assim, é mais prudente utilizar um número maior

de camundongos quando 1 DL

for usada.

3.2 – Capacidade de proteção após vacinação

Visto os problemas de se utilizar uma dose letal 50%, decidimos usar

duas (12,14 g) para o experimento de neutralização in vivo. Como os animais

ficaram mantidos por um tempo grande até a obtenção de um título adequado,

eles aumentaram de peso. Sendo assim, os animais foram pesados para o

cálculo da quantidade de veneno que seria necessário utilizar (Tabela 11).

Como foi explicado na metodologia consideramos apenas 60% do aumento do

peso para calcular o acréscimo de veneno a ser utilizado.

Apenas os camundongos imunizados com PBS+adjuvante morreram

com 24 horas do desafio (Tabela 12). Mas após 30 horas morreram dois

animais do grupo 3 (1 e 2), os mais obesos de todos os grupos, o que pode

indicar correta a nossa decisão de não considerar o valor total do acréscimo do

peso dos camundongos. Todos os outros animais sobreviveram.

198

Tabela 11 – Cálculo de quantidade de veneno a ser usada proporcional ao peso

Grupo Peso

(g)

Acréscimo de

peso (g)

60% do

acréscimo (g)

Peso

total (g)

Quantidade

veneno (g)

Quantidade

veneno (l)

G1- 1 36,5 16,5 10 30 18 4,7

G1- 2 46,6 36,5 16 36 22 5,7

G1- 3 38,6 18,5 11 31 19 4,9

G1- 4 42,7 23 14 34 20,5 5,3

G1- 5 41,2 21 12,5 32,5 20 5,2

G1- 6 42,0 22 13 33 20 5,2

G2- 1 44,0 24 14,5 34,5 21 5,4

G2- 2 34,0 14 8,5 28,5 17 4,4

G2- 3 46,0 26 15,5 35,5 21,5 5,6

G2- 4 50,5 30,5 18 38 23 6,0

G2- 5 39,0 19 11 31 19 4,9

G2- 6 43,0 23 14 34 20,5 5,3

G3- 1 54,6 34,5 21 41 25 6,5

G3- 2 63,5 43,5 26 46 28 7,3

G3- 3 45,6 25,5 15 35 21 5,4

G3- 4 39,0 19 11 31 19 4,9

G3- 5 40,0 20 12 32 19,5 5,1

G3- 6 42,6 22,6 13,5 33,5 20 5,2

G4- 1 44,0 24 14,5 34,5 21 5,4

G4- 2 38,0 18 11 31 19 4,9

G4- 3 38,0 18 11 31 19 4,9

G4- 4 38,0 18 11 31 19 4,9

G4- 5 43,6 23,5 14 34 20,5 5,3

G4- 6 45,5 25,5 15 35 21 5,4

199

Tabela 11 - Cálculo de quantidade de veneno a ser usada proporcional ao peso

Grupo Peso

(g)

Acréscimo de

peso (g)

60% do

acréscimo (g)

Peso

total (g)

Quantidade

veneno (g)

Quantidade

veneno (l)

G5- 1 38,5 18,5 11 31 19 4,9

G5- 2 40,0 20,0 12 32 19,5 5,1

G5- 3 46,0 26,0 15,6 35,5 21,5 5,6

G5- 4 34,0 14,0 8,5 28,5 17 4,4

G5- 5 42,7 23,0 14 34 20,5 5,3

G5- 6 44,0 24 14,5 34,5 21 5,4

Tabela 12 – Capacidade de neutralização após vacinação

Grupos Descrição Sobrevivência

24 horas

Porcentagem

Veneno de Tityus

serrulatus

6/6 100%

TsNTxP/MBP 6/6 100%

TsTx-I (1)

recombinante

6/6 100%

TsTx-I (2)

recombinante

6/6 100%

PBS 0/6 0%

200

3.3 – Comparação da titulação dos soros dos camundongos antes e

depois do desafio

Os animais que sobreviveram ao desafio com o veneno foram sangrados

72 horas depois. Foi feita uma comparação do título de anticorpos no pool de

soros dos camundongos antes e depois do desafio. Para isso os dados foram

analisados pelo teste de hipóteses, a distribuição amostral foi considerada

normal e o nível de significância adotado foi de 0,01.

Para os animais imunizados com veneno total de Tityus serrulatus pode-

se observar uma pequena queda na quantidade de anticorpos depois do

desafio, que é significante até a diluição de 1:1600 (Figura 80a). Em relação

aos animais imunizados com TsNTxP/MBP não houve diferença significativa

até a diluição de 1:1600, com exceção da diluição de 1:800 (Figura 80b). Já

com os animais imunizados com as toxinas recombinantes TsTx-I

(1)

e TsTx-I

(2)

o título de anticorpos depois do desafio foi maior do que o título antes do

desafio para todas as diluições (Figura 80c e d).

201

Pool de soros dos camundongos imunizados

com veneno de Tityus serrulatus

0,5

1,5

2,5

1:100

1:20

400

:800

1:1600

1:3200

1:6

1:128

Diluições dos soros

Absorbância a 492 nm

Pré-imune

Antes

Depois

Pool de soros dos camundongos imunizados

com TSNTxP/MBP

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1:100

800

1:3200

1:6400

Diluições dos soros

Absorbância a 492 nm

Pré-imune

Antes

Depois

202

Pool de soros dos camundongos imunizados

com TsTx-I (1) recombinante

0,2

0,4

0,6

0,8

1:200

1:4

1:1

:6400

1:12800

Diluições dos soros

Absorbância a 492 nm

Pré-imune

Antes

Depois

Pool de soros dos camundongos imunizados

com anti-TsTx-I (2) recombinante

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1:20

1:400

1:3200

400

Diluições dos soros

Absorbância a 492 nm

Pré-imune

Antes

Depois

Figura 80 – Titulação do pool dos soros dos camundongos imunizados

antes e depois do desafio com veneno. As placas foram sensibilizadas com

5 g/mL veneno total de Tityus serrulatus.

203

Discussão

Apesar do problema com os escorpiões ter surgido décadas atrás e de já

existir um soro anti-escorpiônico, ainda existem conseqüências graves

decorrentes dos acidentes com estes animais.

Existe uma necessidade grande de se estudar mais os venenos dos

escorpiões para entendermos melhor todos os processos envolvidos no seu

mecanismo de ação e suas conseqüências nos organismos dos envenenados.

Só assim, vamos poder desenvolver um soro de melhor qualidade ou até

mesmo uma vacina.

Tendo em vista este objetivo, o presente trabalho aborda dois temas

importantes neste contexto. O primeiro é gerar um conhecimento melhor dos

componentes do veneno do Tityus serrulatus, o principal responsável por

acidentes no Brasil, através de uma busca de novas toxinas na biblioteca de

cDNA da glândula de veneno deste escorpião. O outro tema está relacionado

com o desenvolvimento de novos imunógenos que possam ser usados para a

produção de um soro escorpiônico de melhor qualidade.

Este trabalho teve início com a biblioteca de cDNA da glândula de

veneno do T. serrulatus. Foram obtidos 634 clones que foram seqüenciados

gerando 910 ESTs (Expressed Sequence Tags) ou etiquetas de seqüências

expressas. Destas, apenas quinze seqüências (1,6%) eram referentes ao vetor

de clonagem sem inserto, mostrando a boa qualidade da biblioteca, uma vez

que não houve pré-seleção dos clones com inserto antes do seqüênciamento.

As seqüências foram anotadas com o banco de dados de seqüências de

proteínas UniProt. Foram obtidas 43% das seqüências com similaridade com

alguma proteína e 57% não apresentaram similaridade com nenhuma proteína

do banco de dados analisado. Estes resultados estão de acordo com outros

estudos de transcriptoma de animais peçonhentos, com valores de seqüências

não anotadas entre 13 a 56% (Kozlov e cols., 2005; Cidade e cols., 2006;

Magalhaes e cols., 2006; Pi e cols., 2006; Wagstaff e Harrison, 2006; Zhang e

cols., 2006; Schwartz e cols., 2007).

As 910 seqüências foram então agrupadas pelo programa phrap e 400

uniques (44% das ESTs) foram obtidas. Castro (2005) obteve uma

porcentagem um pouco superior, mas outros trabalhos apresentaram

204

resultados semelhantes (Zhang e cols., 2006; Schwartz e cols., 2007). Dos

uniques obtidos 66% não possuíram similaridade, 29% teve similaridade com

Uniprot e GOA e 5% teve similaridade com Uniprot, mas não com GOA. Os

valores encontrados para as seqüências que apresentam similaridade com os

bancos de dados estudados variam entre os estudos de transcriptomas,

podendo ser mais que 50% (Junqueira-De-Azevedo e cols., 2002; Cidade e

cols., 2006; Zhang e cols., 2006), próximo a 50% (Castro, 2005; Schwart e

cols., 2007) ou até mesmo menores que 50% (Silvestre. 2005). Vários fatores

podem estar envolvidos: qualidade da biblioteca, banco de dados usados, tipo

de análise bioinformática que foi feita, número de seqüências já descritas para

o animal em estudo.

Além da anotação dos uniques, também foi realizada uma anotação das

seqüências sem agrupá-las, devido à possibilidade da montagem errada de

contigs pelo uso de poucas seqüências (Mudado, 2007).

Dentre os uniques, cerca de 66,3% (265) não apresentavam seqüências

idênticas ou similares o suficiente para que fossem reunidos em um grupo de

mais de duas seqüências (singlets). O restante foi agrupado em 135 grupos ou

contigs (33,7%). Shwartz e cols. (2007) trabalhando com transcriptoma da

glândula de veneno do escorpião Hadrurus gertschi obtiveram resultados

bastante similares (70,6% de singlets e 29,4% de contigs).

Apenas 39% dos contigs não tinham similaridade com nenhuma proteína

do banco de dados, indicando que a maioria dos consensos obtidos são similares

a proteínas já descritas. Entretanto, 80% dos singlets não tem similaridade,

indicando que muitas informações novas podem ser obtidas destas seqüências.

Além disso, resultados obtidos foram bem anotados, ou seja as

seqüências parecem ser bem descritas, pois em todas as análises o valor de

seqüências que não tinham anotação no GO ficou entre 3-9%.

Comparando as Figuras 23 e 24 (distribuição das ESTs e uniques nas

classes do Gene Ontology), observou-se uma redução da porcentagem das

seqüências anotadas em uma dada categoria entre anotação das ESTs e

uniques. Por exemplo, houve uma diferença de 15% das ESTs para as uniques

classificadas na função molecular – inibidores de canais iônicos. Este fato se deve

à redundância das seqüências, ou seja, existe muitos transcritos de uma mesma

205

proteína (principalmente toxinas), indicando a tendência de expressão de toxinas

e outros componentes da peçonha pela glândula de veneno.

Das seqüências anotadas 45% das ESTs e 21,5% dos uniques foram

toxinas. Valores semelhantes foram encontrados por Schwartz e cols. (2007)

que também trabalharam com transcriptoma de escorpião. Entretanto,

transcriptomas de serpentes mostram valores maiores (Junqueira-De-Azevedo

e cols., 2002; Cidade e cols., 2006; Zhang e cols., 2006). Isto pode ocorrer

porque os venenos de serpentes são muito mais estudados, sendo assim,

existe muito mais seqüência de toxinas anotadas. No caso da aranha

Lasiodora sp, muito pouco estudada, a porcentagem de ESTs com similaridade

com toxinas foi muito baixa, cerca de 10% (Silvestre, 2005). Portanto, nossos

resultados indicam que devem existir ainda muitas toxinas novas no veneno do

Tityus serrulatus que ainda não foram anotadas.

Os resultados obtidos com esta análise parcial da biblioteca de cDNA da

glândula de veneno do T. serrulatus foram muito promissores, tendo em vista a

alta porcentagem de toxinas identificadas dentre os transcritos anotados.

Sendo assim, foi tomada a decisão de continuar a análise do transcriptoma de

T. serrulatus e mais 10.000 clones já foram obtidos e estão sendo

seqüenciados para realização de novas análises bioinformáticas.

A segunda parte deste trabalho consistiu no desenvolvimento de novos

imunógenos para produção de soro. Sendo assim, foram construídos vários

cassetes de expressão que podem gerar proteínas recombinantes com

capacidade de induzir a produção de anticorpos neutralizantes contra o veneno

do T. serrulatus.

Para montar os cassetes de expressão foram selecionadas três

proteínas do veneno deste escorpião: TsTx, a principal toxina do tipo  do

veneno; TsTx-I, principal toxina do tipo  e a TsNTxP, uma proteína não-tóxica,

mas que induz produção de anticorpos neutralizantes.

Sendo assim, havia a necessidade de se obter as seqüências de DNA

destas proteínas. O cDNA da TsNTxP já havia sido obtido em nosso laboratório

(Guatimosim e cols., 1999). Portanto, faltava obter o DNA da TsTx e da TsTs-I.

Como suas seqüências de nucleotídeos já haviam sido descritas (Martin-

Eauclaire e cols., 1992, 1994), foi possível a construção de primers para tentar

obtê-las a partir do DNA genômico do T. serrulatus.

206

Vários trabalhos já descreveram a obtenção de DNA de proteínas

seguindo está metodologia (Corona e cols., Xu e cols., 2005; Silvestre, 2005;

Valdez-Cruz e cols., 2007). Mas apesar das seqüências de nucleotídeos das

toxinas terem sido obtidas a partir do DNA genômico, houve problemas

técnicos com os clones obtidos. Não houve um aprofundamento na resolução

destes problemas porque em concomitante a biblioteca de cDNA da glândula

de veneno do T. serrulatus estava sendo utilizada para a busca de novas

seqüências de toxinas. Portanto, as seqüências das toxinas de interesse

também foram obtidas por meio desta metodologia. E os clones obtidos não

apresentaram problemas de manipulação e por isso foram usados nas etapas

seguintes.

Durante os processos de clonagem ocorreu um fato interessante: a

ligação de 2 cópias do DNA da TsTx-I por meio dos seus sítios de restrição e

sua posterior ligação no vetor de clonagem pBluescript, o que facilitou o

trabalho de construção dos cassetes. Apesar deste fenômeno parecer raro, a

sua ocorrência pode ser freqüente, mas pouco relatado, porque normalmente

não é um resultado que busca-se obter.

Dos cassetes construídos, duas construções foram selecionadas para a

expressão: a TsTx-I com 1 e 2 cópias. A utilização dos demais cassetes não foi

iniciada devido ao fator limitante “tempo/prazo”, porém, um importante material

foi construído e se encontra disponível no Laboratório de Biotecnologia e

Marcadores Moleculares.

A lógica em se expressar duas cópias da mesma toxina juntas é devido

a seu pequeno tamanho (7 kDa). É conhecido que proteínas pequenas

expressas no citoplasma de bactérias tendem a ser instáveis principalmente

por causa da sua rápida degradação por enzimas proteolíticas da bactéria

hospedeira (Rabbani e cols., 1988; Parsell e cols., 1984).

Para evitar esse problema, os peptídeos e proteínas pequenas têm sido

freqüentemente produzidos como proteínas de fusão. Entretanto, a principal

desvantagem desta técnica para a produção em larga escala é que o produto

desejado constitui somente uma pequena porção das proteínas de fusão, uma

vez que nos sistemas comerciais disponíveis as proteínas utilizadas como

carreadoras são muito grandes com 30-50 kDa (Ishikawa & Tamaoki, 1996).

207

Por isso, a fusão de várias cópias de uma mesma proteína vem sendo

usada para suplantar este problema. Este método traz mais estabilidade para a

proteína a ser expressa, sem precisar de uma proteína carreadora; e vem

obtendo muitos resultados positivos com a expressão da calcitonina (Gigova e

cols., 1989; Ishikawa & Tamaoki, 1996).

O sistema de expressão escolhido foi o bacteriano, por ser barato,

simples e ter muitas ferramentas disponíveis (Villaverde & Currió, 2003). O

vetor escolhido foi o pET 11a por já possuirmos no laboratório e por apresentar

bons resultados em expressão anterior de toxina feita pelo nosso grupo

(Araújo, 2004) e pelo fato de 90% das publicações sobre proteínas

recombinantes, usarem o vetor pET (Sorensen & Mortensen, 2005a). A

linhagem BL21(DE3) foi selecionada por possuir deficiência de dois genes de

proteases citoplasmáticas e por ter se mostrado eficiente em expressões de

diversas proteínas (Cho e cols., 2007; Medynski e cols., 2007; Yang e cols.,

2007; Warner e cols., 2007).

Inicialmente, houve problemas para expressar as proteínas

recombinantes, pois algumas colônias não expressavam. Isto pode ter ocorrido

devido à instabilidade do plasmídeo de se manter na bactéria devido à

toxicidade do produto a ser expresso ou mesmo mutações nas regiões

reguladoras do plasmídeo, perda e/ou redução na expressão da RNA

polimerase T7, dentre outros. Dumon & Seignover (2004) expressando 26

produtos diferentes, demonstraram que 96% deles foram tóxicos para a

BL21(DE3).

Uma solução para este problema é o uso de bactérias mutantes, tais

como a C41(DE3) e C43(DE3) mutantes da BL21(DE3) que são citadas como

sendo muito mais eficientes na expressão de produtos tóxicos (Dumon &

Seignover, 2004). Mas seu uso requer um considerável investimento (custo

para compra). Além disso, como havia um prazo a cumprir, não seria possível

esperar os trâmites da importação, que estão sendo demasiadamente

demorados. Sendo assim, a expressão de colônias recém-transformadas e a

verificação de quais delas estavam expressando foi a solução dada para o

problema.

As proteínas recombinantes foram expressas como corpos de inclusão.

Existem diversos trabalhos descrevendo este tipo de expressão tanto com o

208

vetor pET 11a como para outros tipos de pET (Turkov e cols.,1997; Roberto e

cols., 2004; Zhao e cols., 2007; Kou e cols., 2007). Os corpos de inclusão

ocorrem por deposição de polipeptídeos com enovelamento errados ou

parciais, que expõe regiões hidrofóbicas e permite interações intermoleculares

(Villaverde & Carrió, 2003).

Dois tipos de estratégias podem ser usados para tentar obter a proteína

recombinante solúvel: modificações das condições durante a expressão e re-

enovelamento dos corpos de inclusão (Sorensen & Mortensen, 2005a).

Como a obtenção de proteínas recombinantes solúveis durante a

expressão é um processo mais barato e rápido, esta estratégia foi utilizada

inicialmente.

Tanto a TsTx-I

(1)

como a TsTx-I

(2)

foram expressas como corpos de

inclusão, mas com algumas diferenças. Uma fração da TsTx-I

(1)

foi expressa de

maneira solúvel dentro das células. O manual do sistema pET (2005) afirma

que em casos de proteínas expressas como corpos de inclusão é comum que

uma parte seja solúvel. Já a TsTx-I

(2)

não expressou de maneira solúvel

perceptível por análise em gel de poliacrilamida. Sendo assim, as tentativas de

obter uma proteína solúvel se concentraram nesta proteína.

A agregação pode ser minimizada por controle de parâmetros do

processo de expressão, tais como, redução da temperatura, redução da taxa

de expressão do gene recombinante, expressão em meios mais ricos,

modificações nos níveis de oxigênio e fonte de carbono, linhagens bactérias

diferentes, baixos níveis de indução, dentre outros (Moore e cols., 1993;

Weickert e cols., 1996; Villaverde & Carrió, 2003; Sorensen & Mortersen,

2005a).

A TsTx-I

(2)

foi expressa a 25C e 30C, mas as proteínas ainda

continuavam insolúveis e além disso o nível de expressão caiu muito. Liu e

colaboradores (2006) relataram a produção de corpos de inclusão a 25C.

Também foi testado diminuir a produção da proteína expressa, pois a

redução da concentração celular pode favorecer seu enovelamento e diminuir a

agregação. Isto pode ser conseguido utilizando níveis de indução baixos,

diminuindo a concentração final do IPTG. Utilizando concentrações de 0,1 mM

e 0,05 mM de IPTG não foi obtida nenhuma melhora na solubilização da

209

proteína recombinante, mesmos com a redução da expressão. Resultados

similares foram obtidos por Liu e cols. (2006).

A utilização de um meio de cultura mais rico também não favoreceu a

formação da proteína TsTx-I

(2)

solúvel. Moore e cols.(1993) demonstraram que

meios mais ricos favorecem a produção de proteínas solúveis, mas há relatos

que indicam que o uso de meios mínimos reduz a expressão da proteína

recombinante, diminuindo assim a agregação (Manual pET Systems, 2005).

Condições dos meios de cultivos, tais como o requerimento de nutrientes

é um controle limitante do crescimento durante o processo de expressão, esta

limitação freqüentemente leva a mudanças no meio de crescimento, tais como

alterações de pH e concentração de oxigênio dissolvido (Sorensen & Mortense,

2005a). Estas alterações podem ter influência na expressão e afetar a

solubilidade dos produtos a serem expressos (Weickert e cols., 1996).

Portanto, foi feita uma expressão da TsTx-I

(2)

em fermentador com as

condições controladas, mas mesmo assim não houve alteração significativa na

solubilidade da proteína recombinante.

Villaverde e Carrió (2003) afirmam que este tipo de estratégia não

resulta em um mesmo grau de sucesso para diferentes proteínas, devido às

características bioquímicas de cada uma e que este é um processo de tentativa

e erro.

Como não foi possível obter a proteína recombinante de maneira solúvel

com a primeira estratégia, um processo diferente foi testado: a obtenção da

proteína solúvel a partir dos corpos de inclusão. Estes podem ser solubilizados

por uso de desnaturantes, como uréia e guanidina-HCl; uso de pH extremo e

temperatura adequada ou uso de detergentes, tais como SDS e CTAB (Clark e

cols., 2001; Villaverde & Carrió, 2003).

A TsTx-I

(2)

foi solubilizada efetivamente pelo uso de uréia 6 M e SDS

10%. Resultados semelhantes foram obtidos para outras proteínas

recombinantes expressas no mesmo sistema (Cho e cols., 2007; Afzal e cols.,

2007; Galluccio e cols., 2007; Zhao e cols. 2007).

O SDS foi escolhido como agente solubilizante, pois seu uso tem a

vantagem de obter a proteína de maneira ativa em muitos casos (Clark e cols.,

2001). Mas como o detergente pode atrapalhar nos passos de purificação por

cromatografia ele deve ser removido. Portanto, após solubilização foi feita uma

210

diálise para tentar remover o SDS, mas em todas as condições testadas a

proteína recombinante voltava para a forma insolúvel durante o processo.

Sendo assim, a solubilização com uréia foi testada, mas o uso da diálise

para sua posterior remoção, apresentou o mesmo problema descrito acima.

Resultados semelhantes foram obtidos por Zhao e cols. (2007). Em dois

trabalhos, os pesquisadores obtiveram sucesso em remover a uréia,

diminuindo sua concentração como foi feito neste trabalho, mas como as

proteínas expressas tinham cauda de histidina, elas foram imobilizadas na

resina de níquel durante o processo, o que pode ter levado aos bons resultados

apresentados (Kou e cols., 2007; Kirabakaran e cols., 2007).

Em muitos trabalhos, a proteína recombinante solúvel e muitas vezes

funcional só foi obtida após um processo de re-enovelamento in vitro (Afzal e

cols., 2007; Medynski e cols., 2007; Warner e cols., 2007). Porém, a otimização

deste processo para uma dada espécie de proteína envolve empenho muito

grande com resultados irregulares que nem sempre conduzem para processos

úteis para o fluxo conveniente de produção de grandes quantidades de

proteína recombinante (Villaverde & Carrió, 2003). Além de ser um processo de

alto custo (Sorensen e Mortensen, 2005b)

Harlow e Lane (1988) mostraram que se pode usar os corpos de

inclusão para a produção de anticorpos e posteriormente, Vuillard e Freeman

(http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/www.nwfsc.noaa.gov/protocols/

inclusion.html) confirmaram este resultado. Como a produção de proteínas

recombinantes neste trabalho tem essa finalidade, decidiu-se utilizar os corpos

de inclusão para as imunizações.

Os corpos de inclusão (CI) podem conter de 50 a 96% da proteína

recombinante de interesse. Eles podem conter proteínas de membrana e debris

celulares que precipitam juntamente com os CI, mas também tem outras

proteínas que são parte integral dos agregados (Villaverde & Carrió, 2003).

No nosso caso, havia muitas proteínas contaminantes junto com a

proteína de interesse. A utilização de detergentes pode retirar as proteínas que

precipitam junto. Os CI foram lavados com 0,5% de Triton X-100, e foi

observado que uma parte pequena das proteínas contaminantes era removida.

Este resultado indicou que a maioria das proteínas que estavam nos CI era

211

parte integral deles e deviam estar ligadas com a proteína de interesse por

ligações intermoleculares.

De acordo com os resultados obtidos anteriores de solubilização dos CI,

o tiocianato de guanidina não solubilizava a TsTx-I

(2)

, mas solubilizava a

maioria das proteínas contaminantes. O pellet insolúvel resultante mostrou um

grau de pureza da TsTx-I

(2)

suficiente para as imunizações. E tinha uma

vantagem adicional, não apresentava toxicidade.

No caso da TsTx-I

(1)

, como uma fração foi expressa solúvel, inicialmente

tentou-se obtê-la pura por meio de cromatografia em HPLC. Mas a

solubilização dos CI com acetato de sódio pH 5,2 se mostrou uma metodologia

mais rápida e eficiente. A fração solúvel obtida por este processo foi dialisada

para remoção do acetato, mas durante a diálise uma parte da TsTx-I

(1)

tornou insolúvel, o que não impossibilitou o seu uso para as imunizações.

Sendo assim, a TsTx-I

(1)

solúvel/insolúvel foi usada como imunógeno, e

também não foi tóxica, indicando que a fração que estava solúvel não devia

estar na conformação ideal da toxina TsTx-I.

Um resultado que deve ser discutido é o surgimento da proteína ou

fragmento contaminante de 14 kDa durante a lise bacteriana. Analisando os

resultados obtidos, parece que o seu surgimento se deve ao processo

mecânico, uma vez que a lisozima e inibidores de protease e de oxidação não

têm efeito.

Nos extratos de todas as expressões feitas, existe uma proteína de

aproximadamente 30 kDa que foi muito expressa. Como a proteína de 14 kDa

aparece em grandes quantidades e como a única outra proteína que está

representada no extrato bacteriano em quantidades grandes é a proteína de 30

kDa, pode ser que seja esta proteína que está sendo quebrada durante a lise e

o fragmento resultante é a proteína de 14 kDa. A proteína de 30 kDa pode ser

a -lactamase, que em sistemas pET que utilizam ampicilina é expressa em

quantidades apreciáveis e tem tamanho de aproximadamente 32 kDa (Manual

pET Sistems, 2005). Para se ter certeza sobre a origem da proteína de 14 kDa

seria necessário um seqüenciamento de proteína, para se determinar sua

seqüência de aminoácidos.

Outro ponto a ser discutido é a diferença na expressão das duas

proteínas recombinantes. A TsTx-I

(2)

foi expressa em quantidades maiores (30

212

mg/L) que a TsTx-I

(1)

(20 mg/L), cerca de 30% a mais. Isto pode ser devido ao

aumento do tamanho da proteína expressa que levou a uma maior

estabilidade. Para o gene da calcitonina, uma proteína de 32 aminoácidos (a

metade de aminoácidos da TsTx-I), foi demonstrado que a expressão de genes

multiméricos (em tandem), estabiliza a proteína e consequentemente gera uma

quantidade maior de proteína expressa (Gigova e cols., 1989; Ishikawa &

Tamaoki, 1996).

Após a imunização de coelhos e camundongos, eles foram sangrados e

o soro foi titulado por ELISA. O coelho imunizado com o veneno de Tityus

serrulatus produziu uma quantidade suficiente de anticorpos específicos após 6

doses de 100 g de veneno. Já os coelhos imunizados com a TsTx-I

(1)

e TsTx-

(2)

, que receberam uma quantidade de proteína semelhante ao coelho

imunizado com veneno, não apresentaram uma boa resposta contra o veneno

de T. serrulatus. Legros e colaboradores (2002) produziram uma proteína

quimérica com toxinas do veneno do Androctonus australis Hector, MBP-AaH I

+ AaH II, e os anticorpos produzidos com ela reconheceram bem a proteína

quimérica, mas não as proteínas nativas.

Alguns pontos devem ser ponderados. Primeiramente, as proteínas

utilizadas para as imunizações não estão completamente puras, sendo assim,

anticorpos contra as proteínas bacterianas contaminantes também vão ser

produzidos. Portanto, o soro vai ter uma proporção menor de anticorpos contra

a proteína recombinante, que teria se ela estivesse pura, levando a um menor

reconhecimento do veneno de T. serrulatus pelos anticorpos anti-toxinas

recombinantes do que o esperado.

Existe outro ponto relevante que é a composição do veneno, a TsTx-I é

apenas um componente dele, sendo assim anticorpos feitos utilizando ela

como imunógeno podem não ser capazes de um reconhecimento total do

veneno.

Além disso, no veneno de Tityus serrulatus, existem toxinas que agem

em canais de sódio do tipo  e  (a TsTx-I pertence ao segundo grupo) e De

Lima e cols. (1993) demonstraram que anticorpos anti-toxinas  não

reconhecem toxinas do tipo  e vise-versa . Entretanto, anticorpos anti-TsNTxP

reconhecem os dois tipos de toxinas e possuem um reconhecimento do veneno

213

total de T. serrulatus muito similar ao apresentado pelos anticorpos anti-

veneno. Anticorpos anti-TsNTxP também reconhecem muito bem a TsTx, mas

reconhecem 2 vezes menos a TsTx-I (Moreira-Ferreira e cols., 1998).

Também para os camundongos foi obtido um baixo título dos soros anti-

toxinas recombinantes frente ao veneno total. Mas eles foram imunizados com

uma quantidade menor de proteínas (o número de doses foi menor) e os soros

obtiveram um título melhor do que os soros dos coelhos. Isto pode ser devido

às diferenças do sistema imune das duas espécies e das características dos

imunógenos utilizados. Calderon-Aranda e colaboradores (1999) imunizando

coelhos e camundongos com peptídeos sintéticos demonstraram que os

últimos responderam pior aos imunógenos usados. Já Mendes e colaboradores

(2004) demonstraram que os camundongos respondiam melhor que os coelhos

quando a TsNTxP/MBP foi utilizada como imunógeno.

Apesar do baixo título dos soros dos coelhos imunizados com TsTx-I

(1 e

, eles foram capazes de proteger in vitro, animais desafiados com 1 e 2 DL

do veneno do Tityus serrulatus. Outros trabalhos também demonstraram que

apesar do título dos soros obtidos estar baixo frente ao veneno ou toxina usado

para o desafio; os soros foram capazes de neutralizar seus efeitos tóxicos

(Calderon-Aranda e cols., 1995; Garcia e cols., 2003). Isto se deve a qualidade

dos anticorpos. Foram feitos poucos anticorpos (título baixo), mas com uma

qualidade boa, ou seja, com grande especificidade ao veneno total.

O soro anti-TsTx-I

(2)

foi mais eficiente na proteção dos animais

desafiados com 2DL

do veneno do que o soro anti-TsTx-I

(1)

. Isto pode ser

devido à diferença de reconhecimento dos soros frente ao veneno, o soro anti-

TsTx-I

(2)

apresentou um título melhor, indicando que havia uma concentração

maior de anticorpos específicos para o veneno.

Outro resultado interessante obtido na neutralização in vitro foi a

obtenção do mesmo nível de proteção quando quantidades diferentes dos

soros foi utilizada (100 e 200 l), indicando que os epitopos que são

bloqueados já tinham sido saturados de anticorpos com a primeira dose

(Tabela 10).

Esse resultado gera novas perguntas em relação aos mecanismos de

neutralização do veneno de Tityus serrulatus. Mendes e cols. (2004)

demonstraram que animais de espécies diferentes imunizados com uma

214

mesma proteína (TsNTxP recombinante) produzem anticorpos que

reconhecem epitopos diferentes (peptídeos sintéticos imobilizados). Portanto, a

realização de novos ensaios é necessária para um entendimento melhor deste

processo.

Quanto à neutralização in vivo, foram obtidos melhores resultados de

proteção neste ensaio. Todos animais foram protegidos com 2 DL

. Em

trabalhos utilizando toxinas ou derivados delas como imunógenos normalmente

os melhores resultados são obtidos com a neutralização in vitro (Calderon-

Aranda e cols., 1995, 1999; Garcia e cols., 2003). Já Morreira-Ferreira e cols.

(1998) utilizando a TsNTxP também obtiveram melhores resultados in vivo. Isto

sugere que os nossos imunógenos têm grande potencial para produção de

vacina.

Na neutralização in vivo, dois camundongos do grupo imunizado com a

TsTx-I

(1)

morreram 30 horas após o desafio. Estes animais eram os mais

pesados e como eles eram adultos no início do experimento; o aumento de

peso se deve principalmente ao aumento de gordura corporal.

Segundo a farmacodinâmica, substâncias circulantes no sangue têm

pouca penetração no tecido adiposo, por este possuir poucos vasos

sanguíneos. Por isso, para fins práticos, a distribuição ao tecido adiposo

corporal após administração aguda só é importante para algumas substâncias

altamente lipossolúveis (Rang e cols., 1997). Sendo assim, não devemos levar

em conta o aumento de peso global do camundongo, pois grande parte é

gordura, e esta não terá influência na ação do veneno. Como não encontramos

um meio seguro para calcular quanto do aumento de peso devia-se a aumento

de gordura, escolhemos um valor aleatório (60%), mas que pode não ter sido

suficiente. Portanto, o fato dos animais mais pesados morrerem pode ser

conseqüência dos animais obesos ter recebido uma quantidade maior do

veneno do que 2 DL

ou dos aspectos da obesidade que dificultaram o

metabolismo e eliminação das toxinas. Santana e colaboradores (1996)

estudaram alguns parâmetros farmacocinéticos do veneno do T. serrulatus e

demonstraram que o veneno tem taxa de absorção rápida, alta e rápida

distribuição pelos tecidos, grande afinidade para os tecidos e lenta meia-vida

de eliminação.

215

Um resultado que vale a pena ser comentado é o título dos soros dos

camundongos 72 horas após o desafio em comparação com o título antes do

desafio. Para os camundongos imunizados com o veneno, o título é menor

depois do desafio, o que está de acordo com o pensamento lógico que uma

parte dos anticorpos são perdidos por se ligarem às toxinas do veneno durante

o desafio. Mas para os animais imunizados com a TsNTxP/MBP recombinante,

o título se manteve inalterado e para as proteínas recombinantes, TsTx-I

(1)

TsTx-I

(2)

ocorreu o contrário. No segundo caso, o que pode ter ocorrido é que

uma semana antes do desafio todos os animais receberam mais uma dose de

imunógeno, mas no caso dos imunizados com TsTx-I

(1)

e TsTx-I

(2)

como o título

estava um pouco baixo, foi injetado 2 vezes mais imunógeno. Sendo assim, o

aumento da dose do imunógeno pode ter refletido em um aumento do título

após o desafio, mas como o sangue dos camundongos não foi retirado depois

do último reforço, não há como se concluir sobre o fato. Assim este aumento

pode ter ocorrido devido a uma produção maior de anticorpos anti-TsTx-I

(1 e 2)

causada pelo último reforço ou a uma produção de anticorpos anti-veneno

causada pela injeção de veneno no desafio. Novos ensaios devem ser

realizados para a confirmação do fato e para se determinar sua causa.

Neste trabalho, mais de um veneno de Tityus serrulatus, que seria

utilizado nos ensaios de neutralização, foi analisado. Inicialmente, um pool de

veneno bruto (sem liofilizar) foi caracterizado. Este veneno apresentou uma

mais baixa do que normalmente é encontrado: 6,07 g/20g. Um outro pool

de veneno já liofilizado há algum tempo foi testado e uma DL

de 14,07 g

/20g foi obtida. Vários trabalhos que usaram venenos de T. serrulatus

liofilizados apresentaram resultados similares ao obtido (Chávez-Olórtegui e

cols., 1997; Mendes e cols., 2004). Kalapothakis e Chávez-Olórtegui (1997)

demonstraram que venenos que continham mais toxinas do tipo  eram mais

tóxicos, com DL

de 6,19 g/20g. Segundo este trabalho venenos com alta ou

moderada concentração de toxina  e moderada ou baixa quantidade de toxina

 possuem valor de DL

próximo ao veneno bruto liofilizado há mais tempo,

12,48 g/20g. O que pode justificar os resultados obtidos.

Entretanto, para verificar se o processo de liofilização acarreta alguma

alteração na toxicidade do veneno, uma quantidade determinada de veneno

216

bruto foi liofilizada e ressuspendida em água para se obter a mesma

concentração de antes. O veneno liofilizado foi dosado e se observou que

proteínas foram perdidas durante o processo, cerca de 30%. Isto pode ser

devido a perdas durante a manipulação. A DL

para o veneno bruto liofilizado

foi de 6,9 g/20g, ligeiramente maior que para o veneno bruto in natura. Sendo

assim, a liofilização tem pouca ação na toxicidade global do veneno, mas o

tempo que o veneno já está liofilizado tem grande influência.

Os resultados obtidos neste trabalho, mostram que a toxina TsTx-I

recombinante tem capacidade de gerar anticorpos que neutralizam as ações do

veneno total do Tityus serrulatus. A grande homologia apresentada por todas

as toxinas escorpiônicas (Figuras 3 a 6) pode explicar, ao menos em parte,

como uma única toxina pode gerar anticorpos que possam neutralizar os

efeitos do veneno total. As toxinas mais potentes do T. serrulatus apresentam

uma similaridade de estrutura primária de 40 a 70% (Figura 7). A determinação

da estrutura tridimensional das proteínas recombinantes TsTx-I obtidas neste

trabalho seria fundamental para entender melhor esta capacidade de gerar

anticorpos neutralizantes.

217

Conclusões

- A biblioteca da glândula de veneno do Tityus serrulatus está com uma boa

qualidade e nos forneceu grande quantidade de informações a respeito de

novas toxinas ainda não descritas, determinação de seqüência de nucleotídeos

de toxinas que só tem conhecida à seqüência de aminoácidos e novas

informações sobre as toxinas mais conhecidas, como a existência de

isoformas;

- As construções TsTx-I

(1)

e TsTx-I

(2)

foram expressas com sucesso no sistema

pET e a estratégia de tandem trouxe mais estabilidade para a proteína

recombinante;

- As proteínas foram expressas de maneira insolúvel em corpos de inclusão,

mas elas podem ser usadas desta maneira para produzir anticorpos;

- As proteínas recombinantes produziram anticorpos neutralizantes que

protegiam tanto in vitro quanto in vivo, animais desafiados com 2 DL

veneno de T. serrulatus;

- O avanço mais importante obtido a partir deste trabalho foram as informações

acerca da capacidade de produção de anticorpos neutralizantes da toxina

TsTx-I, que ainda não tinha sido estuda neste contexto;

- Os resultados de neutralização trouxeram novas informações a respeito deste

processo e demonstraram que as pesquisas nesta área deve continuar;

- Os resultados promissores descritos neste trabalho reforçam a importância da

geração de novos imunógenos para produção de soro anti-escorpiônico.

218

Perspectivas

- Finalização do transcriptoma da biblioteca da glândula de veneno do T.

serrulatus;

- Avaliar e testar novas toxinas obtidas da biblioteca para uso na produção de

anticorpos neutralizantes;

- Produção de proteínas recombinantes com os outros cassetes construídos;

- Verificação se os efeitos de proteção dos anticorpos anti-TsNTxPrec e anti-

TsTx-Irec são somatórios;

- Produção das proteínas TsTx-I

(1)

e TsTx-I

(2)

de maneira solúvel e com

enovelamento o mais próximo do correto para verificar se existe diferença na

produção de anticorpos (anticorpos contra estruturas terciárias);

- Determinar a estrutura tridimensional das proteínas recombinantes obtidas

neste trabalho;

- Testar as atividades biológicas das proteínas recombinantes obtidas.

219

Referências

ADAM, K. R. e WEISS, C. The occurrence of 5-hidroxytriptamine in scorpion

venom. J. Exp. Biol, v.35, p.39-41. 1958.

AFZAL, A. J. e LIGHTFOOT, D. A. Soybean disease resistance protein RHG1-

LRR domain expressed, purified and refolded from Escherichia coli inclusion

bodies: preparation for a functional analysis. Protein Expr Purif, v.53, n.2, Jun,

p.346-55. 2007.

ALAMI, M.; VACHER, H.; BOSMANS, F.; DEVAUX, C.; ROSSO, J. P.;

BOUGIS, P. E.; TYTGAT, J.; DARBON, H. e MARTIN-EAUCLAIRE, M. F.

Characterization of Amm VIII from Androctonus mauretanicus mauretanicus: a

new scorpion toxin that discriminates between neuronal and skeletal sodium

channels. Biochem J, v.375, n.Pt 3, Nov 1, p.551-60. 2003.

ALI, S. A.; STOEVA, S.; SCHUTZ, J.; KAYED, R.; ABASSI, A.; ZAIDI, Z. H. e

VOELTER, W. Purification and primary structure of low molecular mass

peptides from scorpion (Buthus sindicus) venom. Comp Biochem Physiol A Mol

Integr Physiol, v.121, n.4, Dec, p.323-32. 1998.

ALMEIDA, A. P.; ALPOIM, N. C. e FREIRE-MAIA, L. Effects of a purified

scorpion toxin (tityustoxin) on the isolated guinea pig heart. Toxicon, v.20, n.5,

p.855-65. 1982.

ALTSCHUL, S. F. e LIPMAN, D. J. Protein database searches for multiple

alignments. Proc Natl Acad Sci U S A, v.87, n.14, Jul, p.5509-13. 1990.

ALVARENGA, L. M.; DINIZ, C. R.; GRANIER, C. e CHAVEZ-OLORTEGUI, C.

Induction of neutralizing antibodies against Tityus serrulatus scorpion toxins by

immunization with a mixture of defined synthetic epitopes. Toxicon

, v.40, n.1,

Jan, p.89-95. 2002.

ALVARENGA, L. M.; MACHADO DE AVILA, R. A.; AMIM, P. R.; MARTINS, M.

S.; KALAPOTHAKIS, E.; DE LIMA, M. E.; SANTOS, R. G.; GRANIER, C. e

CHAVEZ-OLORTEGUI, C. Molecular characterization of a neutralizing murine

monoclonal antibody against Tityus serrulatus scorpion venom. Toxicon, v.46,

n.6, Nov, p.664-71. 2005.

ARANTES, E. C.; PRADO, W. A.; SAMPAIO, S. V. e GIGLIO, J. R. A simplified

procedure for the fractionation of Tityus serrulatus venom: isolation and partial

characterization of TsTX-IV, a new neurotoxin. Toxicon

, v.27, n.8, p.907-16.

1989.

ARANTES, E. C.; RICCIOPPO NETO, F.; SAMPAIO, S. V.; VIEIRA, C. A. e

GIGLIO, J. R. Isolation and characterization of TsTX-V, a new neurotoxin from

Tityus serrulatus scorpion venom which delays the inactivation of Na+ channels.

Biochim Biophys Acta, v.1199, n.1, Jan 5, p.69-75. 1994.

220

ARANTES, E. C.; SAMPAIO, S. V.; VIEIRA, C. A. e GIGLIO, J. R. What is

tityustoxin? Toxicon, v.30, n.7, Jul, p.786-9. 1992.

ARAÚJO, S. C. Clonagem, expressão e caracterização de toxinas das aranhas

Phoneutria nigriventer e Loxosceles intermedia. Departamento de

Farmacologia, UFMG, Belo Horizonte, 2005. 183 p.

AUBREY, N.; DEVAUX, C.; SIZARET, P. Y.; ROCHAT, H.; GOYFFON, M. e

BILLIALD, P. Design and evaluation of a diabody to improve protection against

a potent scorpion neurotoxin. Cell Mol Life Sci, v.60, n.3, Mar, p.617-28. 2003.

AUBREY, N.; MUZARD, J.; CHRISTOPHE PETER, J.; ROCHAT, H.;

GOYFFON, M.; DEVAUX, C. e BILLIALD, P. Engineering of a recombinant Fab

from a neutralizing IgG directed against scorpion neurotoxin AahI, and

functional evaluation versus other antibody fragments. Toxicon, v.43, n.3, Mar

1, p.233-41. 2004.

AZEVEDO, A. D.; SILVA, A. B.; CUNHA-MELO, J. R. e FREIRE-MAIA, L.

Cardiovascular and respiratory effects induced by a purified scorpion toxin

(tityustoxin) in unanesthetized rats. Toxicon, v.21, n.6, p.753-9. 1983.

BAHRAOUI, E.; EL AYEB, M.; VAN RIETSCHOTEN, J.; ROCHAT, H. e

GRANIER, C. Immunochemistry of scorpion alpha-toxins: study with synthetic

peptides of the antigenicity of four regions of toxin II of Androctonus australis

Hector. Mol Immunol, v.23, n.4, Apr, p.357-66. 1986.

BAHRAOUI, E.; PICHON, J.; MULLER, J. M.; DARBON, H.; ELAYEB, M.;

GRANIER, C.; MARVALDI, J. e ROCHAT, H. Monoclonal antibodies to scorpion

toxins. Characterization and molecular mechanisms of neutralization. J

Immunol, v.141, n.1, Jul 1, p.214-20. 1988.

BALOZET, L. Scorpionism in the old world. In: W. Bücherl e E. E. Buckley (Ed.).

Venomous Animals and Their Venoms. New York: Academic Press, v.3, 1971.

Scorpionism in the old world, p.349-371

BARHANIN, J.; GIGLIO, J. R.; LEOPOLD, P.; SCHMID, A.; SAMPAIO, S. V. e

LAZDUNSKI, M. Tityus serrulatus venom contains two classes of toxins. Tityus

gamma toxin is a new tool with a very high affinity for studying the Na+ channel.

J Biol Chem

, v.257, n.21, Nov 10, p.12553-8. 1982.

BARHANIN, J.; ILDEFONSE, M.; ROUGIER, O.; SAMPAIO, S. V.; GIGLIO, J.

R. e LAZDUNSKI, M. Tityus gamma toxin, a high affinity effector of the Na+

channel in muscle, with a selectivity for channels in the surface membrane.

Pflugers Arch

, v.400, n.1, Jan, p.22-7. 1984.

BARRIO, A. e VITAL-BRAZIL, G. Ein neues Verfahren der Giften Nahme ber

Spinnen. Experientia, v.6, p.112-113. 1949.

BARROS, E. F. Aspectos anatomopatológicos do sistema nervoso central na

intoxicaçã escorpiônica. O Hospital, n.3, p.423. 1937.

221

BARROS, E. F. Aspectos clínicos da intoxicação escorpiônica. Mem. Inst. Biol.

Ezequiel Dias, n.Tomo II, p.103. 1938.

BATISTA, C. V.; GOMEZ-LAGUNAS, F.; RODRIGUEZ DE LA VEGA, R. C.;

HAJDU, P.; PANYI, G.; GASPAR, R. e POSSANI, L. D. Two novel toxins from

the Amazonian scorpion Tityus cambridgei that block Kv1.3 and Shaker B K(+)-

channels with distinctly different affinities. Biochim Biophys Acta, v.1601, n.2,

Dec 16, p.123-31. 2002.

BECERRIL, B.; CORONA, M.; MEJIA, M. C.; MARTIN, B. M.; LUCAS, S.;

BOLIVAR, F. e POSSANI, L. D. The genomic region encoding toxin gamma

from the scorpion Tityus serrulatus contains an intron. FEBS Lett, v.335, n.1,

Nov 29, p.6-8. 1993.

BECERRIL, B.; MARANGONI, S. e POSSANI, L. D. Toxins and genes isolated

from scorpions of the genus Tityus. Toxicon

, v.35, n.6, Jun, p.821-35. 1997.

BECHIS, G.; SAMPIERI, F.; YUAN, P. M.; BRANDO, T.; MARTIN, M. F.; DINIZ,

C. R. e ROCHAT, H. Amino acid sequence of toxin VII, a beta-toxin from the

venom of the scorpion Tityus serrulatus. Biochem Biophys Res Commun

, v.122,

n.3, Aug 16, p.1146-53. 1984.

BLANC, E.; LECOMTE, C.; RIETSCHOTEN, J. V.; SABATIER, J. M. e

DARBON, H. Solution structure of TsKapa, a charybdotoxin-like scorpion toxin

from Tityus serrulatus with high affinity for apamin-sensitive Ca(2+)-activated

K+ channels. Proteins, v.29, n.3, Nov, p.359-69. 1997.

BLAST. Basic alignmente Search Tool. NCBI: Disponível em:

<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/>. Acessado em janeiro de 2005 e agosto

de 2007.

BLAUSTEIN, M. P.; ROGOWSKI, R. S.; SCHNEIDER, M. J. e KRUEGER, B. K.

Polypeptide toxins from the venoms of Old World and New World scorpions

preferentially block different potassium channels. Mol Pharmacol, v.40, n.6,

Dec, p.932-42. 1991.

BOSMANS, F. e TYTGAT, J. Voltage-gated sodium channel modulation by

scorpion alpha-toxins. Toxicon

, v.49, n.2, Feb, p.142-58. 2007.

BOUHAOUALA-ZAHAR, B.; DUCANCEL, F.; ZENOUAKI, I.; BEN KHALIFA, R.;

BORCHANI, L.; PELHATE, M.; BOULAIN, J. C.; EL AYEB, M.; MENEZ, A. e

KAROUI, H. A recombinant insect-specific alpha-toxin of Buthus occitanus

tunetanus scorpion confers protection against homologous mammal toxins. Eur

J Biochem, v.238, n.3, Jun 15, p.653-60. 1996.

BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.

Anal Biochem

, v.72, May 7, p.248-54. 1976.

222

BRAVO-BECHERELLE, M. A. e MAZZOTTI, L. [Geographic distribution of

mortality from scorpion stings in Mexico.]. Rev Inst Salubr Enferm Trop, v.21,

Dec, p.129-40. 1961.

BÜRCHEL, W. Venomous animals and their venoms. In: W. Burcherl e E.

Buckley (Ed.). New York: Academic Press, v.111, 1971. Venomous animals and

their venoms, p.317-348

BUTANTAN. Soro anti-escorpiônico. Disponível em:

<http://www.vacinas.org.br/vacinas26.htm>. Acesso em: agosto de 2007.

CALDERON-ARANDA, E. S.; OLAMENDI-PORTUGAL, T. e POSSANI, L. D.

The use of synthetic peptides can be a misleading approach to generate

vaccines against scorpion toxins. Vaccine, v.13, n.13, Sep, p.1198-206. 1995.

CALDERON-ARANDA, E. S.; SELISKO, B.; YORK, E. J.; GURROLA, G. B.;

STEWART, J. M. e POSSANI, L. D. Mapping of an epitope recognized by a

neutralizing monoclonal antibody specific to toxin Cn2 from the scorpion

Centruroides noxius, using discontinuous synthetic peptides. Eur J Biochem,

v.264, n.3, Sep, p.746-55. 1999.

CAO, Z. Y.; MI, Z. M.; CHENG, G. F.; SHEN, W. Q.; XIAO, X.; LIU, X. M.;

LIANG, X. T. e YU, D. Q. Purification and characterization of a new peptide with

analgesic effect from the scorpion Buthus martensi Karch. J Pept Res, v.64,

n.1, Jul, p.33-41. 2004.

CARBONE, E.; WANKE, E.; PRESTIPINO, G.; POSSANI, L. D. e MAELICKE,

A. Selective blockage of voltage-dependent K+ channels by a novel scorpion

toxin. Nature, v.296, n.5852, Mar 4, p.90-1. 1982.

CATTERALL, W. A. Neurotoxins that act on voltage-sensitive sodium channels

in excitable membranes. Annu Rev Pharmacol Toxicol

, v.20, p.15-43. 1980.

CASTRO, C. S. Análises bioinformáticas de transcritos da glândula de veneno

da aranha-marrom Loxoceles intermedia e construção de baculovírus

recombinantes como vetores de toxinas inseticidas. Departamento de Ciências

Biológicas, UFOP, Ouro Preto, 2005. 181 p.

CHAGOT, B.; PIMENTEL, C.; DAI, L.; PIL, J.; TYTGAT, J.; NAKAJIMA, T.;

CORZO, G.; DARBON, H. e FERRAT, G. An unusual fold for potassium

channel blockers: NMR structure of three toxins from the scorpion

Opisthacanthus madagascariensis. Biochem J, v.388, n.Pt 1, May 15, p.263-71.

2005.

CHALLA, S.; BARRETTE, R.; ROOD, D.; ZINCKGRAF, J.; FRENCH, R. e

SILBART, L. Non-toxic Pseudomonas aeruginosa exotoxin A expressing the

FMDV VP1 G-H loop for mucosal vaccination of swine against foot and mouth

disease virus. Vaccine, v.25, n.17, Apr 30, p.3328-37. 2007.

223

CHAVES-OLORTEGUI, C.; FERREIRA, A. M.; CORDEIRO, M. N.; MARIA, W.

S.; RICHARDSON, M. e DINIZ, C. R. Immunological and chemical properties of

a non-toxic protein purified from the venom of the scorpion Tityus serrulatus

(Lutz & Mello Campos, 1922). In: C. Bon e M. Goyffon (Ed.). Envenoning and

their treatment. Paris: Fundation Marcel Mérieux, 1996. Immunological and

chemical properties of a non-toxic protein purified from the venom of the

scorpion Tityus serrulatus (Lutz & Mello Campos, 1922), p.183-195

CHAVEZ-OLORTEGUI, C.; AMARA, D. A.; ROCHAT, H.; DINIZ, C. e

GRANIER, C. In vivo protection against scorpion toxins by liposomal

immunization. Vaccine, v.9, n.12, Dec, p.907-10. 1991.

CHAVEZ-OLORTEGUI, C.; KALAPOTHAKIS, E.; FERREIRA, A. M.;

FERREIRA, A. P. e DINIZ, C. R. Neutralizing capacity of antibodies elicited by a

non-toxic protein purified from the venom of the scorpion Tityus serrulatus.

Toxicon, v.35, n.2, Feb, p.213-21. 1997.

CHAVEZ-OLORTEGUI, C.; MOLINA, F. e GRANIER, C. Molecular basis for the

cross-reactivity of antibodies elicited by a natural anatoxin with alpha- and beta-

toxins from the venom of Tityus serrulatus scorpion. Mol Immunol, v.38, n.11,

Mar, p.867-76. 2002.

CHO, D.; SHIN, S. J.; TALAAT, A. M. e COLLINS, M. T. Cloning, expression,

purification and serodiagnostic evaluation of fourteen Mycobacterium

paratuberculosis proteins. Protein Expr Purif, v.53, n.2, Jun, p.411-20. 2007.

CHUANG, R. S.; JAFFE, H.; CRIBBS, L.; PEREZ-REYES, E. e SWARTZ, K. J.

Inhibition of T-type voltage-gated calcium channels by a new scorpion toxin. Nat

Neurosci, v.1, n.8, Dec, p.668-74. 1998.

CIDADE, D. A.; SIMAO, T. A.; DAVILA, A. M.; WAGNER, G.; JUNQUEIRA-DE-

AZEVEDO IDE, L.; HO, P. L.; BON, C.; ZINGALI, R. B. e ALBANO, R. M.

Bothrops jararaca venom gland transcriptome: analysis of the gene expression

pattern. Toxicon

, v.48, n.4, Sep 15, p.437-61. 2006.

CLARK, E. D. Protein refolding for industrial processes. Curr Opin Biotechnol

v.12, n.2, Apr, p.202-7. 2001.

CLOT-FAYBESSE, O.; JUIN, M.; ROCHAT, H. e DEVAUX, C. Monoclonal

antibodies against the Androctonus australis hector scorpion neurotoxin I:

characterisation and use for venom neutralisation. FEBS Lett, v.458, n.3, Sep

24, p.313-8. 1999.

CLOUDSLEY-THOMPSON, J. L. Spider, scorpion, centipedes and mites.

Oxford: Pergamon Press. 1968. 278 p.

CORONA, M.; GURROLA, G. B.; MERINO, E.; CASSULINI, R. R.; VALDEZ-

CRUZ, N. A.; GARCIA, B.; RAMIREZ-DOMINGUEZ, M. E.; CORONAS, F. I.;

ZAMUDIO, F. Z.; WANKE, E. e POSSANI, L. D. A large number of novel

224

Ergtoxin-like genes and ERG K+-channels blocking peptides from scorpions of

the genus Centruroides. FEBS Lett, v.532, n.1-2, Dec 4, p.121-6. 2002.

CORONA, M.; ZURITA, M.; POSSANI, L. D. e BECERRIL, B. Cloning and

characterization of the genomic region encoding toxin IV-5 from the scorpion

Tityus serrulatus Lutz and Mello. Toxicon, v.34, n.2, Feb, p.251-6. 1996.

CORZO, G.; ESCOUBAS, P.; VILLEGAS, E.; BARNHAM, K. J.; HE, W.;

NORTON, R. S. e NAKAJIMA, T. Characterization of unique amphipathic

antimicrobial peptides from venom of the scorpion Pandinus imperator.

Biochem J, v.359, n.Pt 1, Oct 1, p.35-45. 2001.

COURAUD, F.; JOVER, E.; DUBOIS, J. M. e ROCHAT, H. Two types of

scorpion receptor sites, one related to the activation, the other to the

inactivation of the action potential sodium channel. Toxicon, v.20, n.1, p.9-16.

1982.

COUTINHO-NETTO, J. Purificação e caracterização parcial da tityustoxina

Departamento de Bioquímica e Imunologia, UFMG, Belo Horizonte, 1975.

CRAIK, D. J. e DALY, N. L. Oxidative folding of the cystine knot motif in

cyclotide proteins. Protein Pept Lett

, v.12, n.2, Feb, p.147-52. 2005.

DAI, L.; CORZO, G.; NAOKI, H.; ANDRIANTSIFERANA, M. e NAKAJIMA, T.

Purification, structure-function analysis, and molecular characterization of novel

linear peptides from scorpion Opisthacanthus madagascariensis. Biochem

Biophys Res Commun, v.293, n.5, May 24, p.1514-22. 2002.

DAI, L.; YASUDA, A.; NAOKI, H.; CORZO, G.; ANDRIANTSIFERANA, M. e

NAKAJIMA, T. IsCT, a novel cytotoxic linear peptide from scorpion

Opisthacanthus madagascariensis. Biochem Biophys Res Commun, v.286, n.4,

Aug 31, p.820-5. 2001.

DE LA VEGA, R. C. e POSSANI, L. D. Novel paradigms on scorpion toxins that

affects the activating mechanism of sodium channels. Toxicon

, v.49, n.2, Feb,

p.171-80. 2007.

DE LIMA, M. E.; COURAUD, F.; HUE, B.; MARTIN-EAUCLAIRE, M. F.;

LAPIED, B.; PELHATE, M.; DINIZ, C. R. e ROCHAT, H. "Insect toxins" from

scorpion venoms as tools for the study of the sodium channel of insects.

Pesticide Sci.

, v.24, n.3, p.284. 1988.

DE LIMA, M. E.; MARTIN-EAUCLAIRE, M. F.; HUE, B.; LORET, E.; DINIZ, C.

R. e ROCHAT, H. On the binding of two scorpion toxins to the central nervous

system of the cockroach Periplaneta americana. Insect Biochemistry, v.19,

p.413. 1989.

DE LIMA, M. E.; MARTIN, M. F.; DINIZ, C. R. e ROCHAT, H. Tityus serrulatus

toxin VII bears pharmacological properties of both beta-toxin and insect toxin

from scorpion venoms. Biochem Biophys Res Commun

, v.139, n.1, Aug 29,

p.296-302. 1986.

225

DE LIMA, M. E.; MARTIN-EAUCLAIRE, M. F.; CHAVEZ-OLORTEGUI, C.;

DINIZ, C. R. e GRANIER, C. Tityus serrulatus scorpion venom toxins display a

complex pattern of antigenic reactivity. Toxicon, v.31, n.2, Feb, p.223-7. 1993.

DEBIN, J. A.; MAGGIO, J. E. e STRICHARTZ, G. R. Purification and

characterization of chlorotoxin, a chloride channel ligand from the venom of the

scorpion. Am J Physiol, v.264, n.2 Pt 1, Feb, p.C361-9. 1993.

DEBONT, T.; SWERTS, A.; VAN DER WALT, J. J.; MULLER, G. J.;

VERDONCK, F.; DAENENS, P. e TYTGAT, J. Comparison and characterization

of the venoms of three Parabuthus scorpion species occurring in southern

Africa. Toxicon, v.36, n.2, Feb, p.341-52. 1998.

DEHESA-DAVILA, M. e POSSANI, L. D. Scorpionism and serotherapy in

Mexico. Toxicon, v.32, n.9, Sep, p.1015-8. 1994.

DELABRE, M. L.; PASERO, P.; MARILLEY, M. e BOUGIS, P. E. Promoter

structure and intron-exon organization of a scorpion alpha-toxin gene.

Biochemistry, v.34, n.20, May 23, p.6729-36. 1995.

DELORI, P.; VAN RIETSCHOTEN, J. e ROCHAT, H. Scorpion venoms and

neurotoxins: an immunological study. Toxicon, v.19, n.3, p.393-407. 1981.

DEVAUX, C.; CLOT-FAYBESSE, O.; JUIN, M.; MABROUK, K.; SABATIER, J.

M. e ROCHAT, H. Monoclonal antibodies neutralizing the toxin II from

Androctonus australis hector scorpion venom: usefulness of a synthetic, non-

toxic analog. FEBS Lett, v.412, n.3, Aug 4, p.456-60. 1997.

DEVAUX, C.; MOREAU, E.; GOYFFON, M.; ROCHAT, H. e BILLIALD, P.

Construction and functional evaluation of a single-chain antibody fragment that

neutralizes toxin AahI from the venom of the scorpion Androctonus australis

hector. Eur J Biochem, v.268, n.3, Feb, p.694-702. 2001.

DEVAUX, J.; GOLA, M.; JACQUET, G. e CREST, M. Effects of K+ channel

blockers on developing rat myelinated CNS axons: identification of four types of

K+ channels. J Neurophysiol

, v.87, n.3, Mar, p.1376-85. 2002.

DIEGO-GARCIA, E.; BATISTA, C. V.; GARCIA-GOMEZ, B. I.; LUCAS, S.;

CANDIDO, D. M.; GOMEZ-LAGUNAS, F. e POSSANI, L. D. The Brazilian

scorpion Tityus costatus Karsch: genes, peptides and function. Toxicon

, v.45,

n.3, Mar 1, p.273-83. 2005.

DINIZ, C. R. e GONCALVES, J. M. Separation of biologically active

components from scorpion venoms by zone electrophoresis. Biochim Biophys

Acta, v.41, Jul 15, p.470-7. 1960.

DINIZ, C. R.; PIMENTA, A. F.; NETTO, J. C.; POMPOLO, S.; GOMEZ, M. V. e

BOHM, G. M. Effect of scorpion venom from Tityus serrulatus (Tityustoxin) on

226

the acetylcholine release and fine structure of the nerve terminals. Experientia,

v.30, n.11, Nov 15, p.1304-5. 1974.

DUMON-SEIGNOVERT, L.; CARIOT, G. e VUILLARD, L. The toxicity of

recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in

BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3). Protein Expr Purif, v.37, n.1, Sep, p.203-

6. 2004.

DRUMOND, Y. A.; COUTO, A. S.; MORAES-SANTOS, T.; ALMEIDA, A. P. e

FREIRE-MAIA, L. Effects of toxin Ts-gamma and tityustoxin purified from Tityus

serrulatus scorpion venom on isolated rat atria. Comp Biochem Physiol C

Pharmacol Toxicol Endocrinol, v.111, n.2, Jun, p.183-90. 1995.

EL AYEB, M.; DARBON, H.; BAHRAOUI, E. M.; VARGAS, O. e ROCHAT, H.

Differential effects of defined chemical modifications on antigenic and

pharmacological activities of scorpion alpha and beta toxins. Eur J Biochem,

v.155, n.2, Mar 3, p.289-94. 1986.

FAJLOUN, Z.; FERRAT, G.; CARLIER, E.; FATHALLAH, M.; LECOMTE, C.;

SANDOZ, G.; DI LUCCIO, E.; MABROUK, K.; LEGROS, C.; DARBON, H.;

ROCHAT, H.; SABATIER, J. M. e DE WAARD, M. Synthesis, 1H NMR

structure, and activity of a three-disulfide-bridged maurotoxin analog designed

to restore the consensus motif of scorpion toxins. J Biol Chem, v.275, n.18, May

5, p.13605-12. 2000.

FERREIRA, L. A.; ALVES, E. W. e HENRIQUES, O. B. Peptide T, a novel

bradykinin potentiator isolated from Tityus serrulatus scorpion venom. Toxicon,

v.31, n.8, Aug, p.941-7. 1993.

FONSECA, S. G.; FERREIRA, A. M.; DINIZ, C. R. e CHAVEZ-OLORTEGUI, C.

Induction of neutralizing antibodies in mice immunized with scorpion toxins

detoxified by liposomal entrapment. Braz J Med Biol Res

, v.30, n.7, Jul, p.883-

6. 1997.

FONTECILLA-CAMPS, J. C. Three-dimensional model of the insect-directed

scorpion toxin from Androctonus australis Hector and its implication for the

evolution of scorpion toxins in general. J Mol Evol, v.29, n.1, Jul, p.63-7. 1989.

FREIRE-MAIA, L. e CAMPOS, J. A. Phathophisiology and treatment of scorpion

poisoning. In: (Ed.). Natural toxins

. Oxford: Pergamon Press, 1989.

Phathophisiology and treatment of scorpion poisoning, p.139-159

FREIRE-MAIA, L.; PINTO, G. I. e FRANCO, I. Mechanism of the cardiovascular

effects produced by purified scorpion toxin in the rat. J Pharmacol Exp Ther,

v.188, n.1, Jan, p.207-13. 1974.

FROY, O. e GUREVITZ, M. New insight on scorpion divergence inferred from

comparative analysis of toxin structure, pharmacology and distribution. Toxicon,

v.42, n.5, Oct, p.549-55. 2003.

227

FUNED. Fundação Ezequiel Dias: Soro Anti-Escorpiônico - Disponível em:

<http://www.funed.mg.gov.br/produtos_serviços/imunobiologicos/bulas/Bula_So

ro_Antiescorpionico_ver.04.pdf>. Acesso em: agosto de 2007.

GALLUCCIO, M.; BRIZIO, C.; TORCHETTI, E. M.; FERRANTI, P.; GIANAZZA,

E.; INDIVERI, C. e BARILE, M. Over-expression in Escherichia coli, purification

and characterization of isoform 2 of human FAD synthetase. Protein Expr Purif,

v.52, n.1, Mar, p.175-81. 2007.

GARCIA, C.; CALDERON-ARANDA, E. S.; ANGUIANO, G. A.; BECERRIL, B. e

POSSANI, L. D. Analysis of the immune response induced by a scorpion venom

sub-fraction, a pure peptide and a recombinant peptide, against toxin Cn2 of

Centruroides noxius Hoffmann. Toxicon, v.41, n.4, Mar, p.417-27. 2003.

GAZARIAN, K. G.; GAZARIAN, T.; HERNANDEZ, R. e POSSANI, L. D.

Immunology of scorpion toxins and perspectives for generation of anti-venom

vaccines. Vaccine

, v.23, n.26, May 16, p.3357-68. 2005.

GAZARIAN, T.; SELISKO, B.; HERION, P. e GAZARIAN, K. Isolation and

structure-functional characterization of phage display library-derived mimotopes

of noxiustoxin, a neurotoxin of the scorpion Centruroides noxius Hoffmann. Mol

Immunol, v.37, n.12-13, Aug-Sep, p.755-66. 2000.

GAZARIAN, T. G.; SELISKO, B.; GURROLA, G. B.; HERNANDEZ, R.;

POSSANI, L. D. e GAZARIAN, K. G. Potential of peptides selected from

random phage-displayed libraries to mimic conformational epitopes: a study on

scorpion toxin Cn2 and the neutralizing monoclonal antibody BCF2. Comb

Chem High Throughput Screen, v.6, n.2, Mar, p.119-32. 2003.

GIGOVA, L.; WISHART, P.; USCHEVA, A.; IVANOVA, M.; BARDAROV, S.;

JAY, E. e IVANOV, I. Expression of repetitive human calcitonin genes in

Escherichia coli. Biotechnol Appl Biochem

, v.11, n.4, Aug, p.401-12. 1989.

GO. Gene Ontology: Disponível em: <http://www.geneontology.org>. Acesso

em: agosto e setembro de 2007.

GOA. Gene Ontology Annotation - EBI: Disponível em:

<http://www.ebi.ac.uk/GOA>

. Acesso em: agosto e setembro de 2007.

GOMEZ, M. V. Purificação e caracterização da toxina do escorpião Tityus

serrulatus. Departamento de Bioquímica e Imunologia, UFMG, Belo Horizonte,

1967.

GOMEZ, M. V.; DAI, M. E. e DINIZ, C. R. Effect of scorpion venom, tityustoxin,

on the release of acetylcholine from incubated slices of rat brain. J Neurochem,

v.20, n.4, Apr, p.1051-61. 1973.

GOMEZ, M. V. e DINIZ, C. R. Separation of toxic components from the

brazillian scorpion Tityus serrulatus venom. Mem Inst Butantan

, v.33, n.3,

p.899-902. 1966.

228

GOMEZ, R. S.; CASALI, T. A.; ROMANO-SILVA, M. A.; CORDEIRO, M. N.;

DINIZ, C. R.; MORAES-SANTOS, T.; PRADO, M. A. e GOMEZ, M. V. The

effect of PhTx3 on the release of 3H-acetylcholine induced by tityustoxin and

potassium in brain cortical slices and myenteric plexus. Neurosci Lett, v.196,

n.1-2, Aug 18, p.131-3. 1995.

GORDON, D. e GUREVITZ, M. The selectivity of scorpion alpha-toxins for

sodium channel subtypes is determined by subtle variations at the interacting

surface. Toxicon, v.41, n.2, Feb, p.125-8. 2003.

GORDON, D.; SAVARIN, P.; GUREVITZ, M. e ZINN-JUSTIN, S. Functional

anatomy of scorpion toxins affecting sodium channels. J. Toxicol - Toxin Rev.,

v.17, p.131-159. 1998.

GOUDET, C.; CHI, C. W. e TYTGAT, J. An overview of toxins and genes from

the venom of the Asian scorpion Buthus martensi Karsch. Toxicon

, v.40, n.9,

Sep, p.1239-58. 2002.

GRANIER, C.; NOVOTNY, J.; FONTECILLA-CAMPS, J. C.; FOURQUET, P.;

EL AYEB, M. e BAHRAOUI, E. The antigenic structure of a scorpion toxin. Mol

Immunol, v.26, n.6, Jun, p.503-13. 1989.

GUARNIERI, M. C. XXII Congresso Brasileiro de Zoologia. Ação deletéria e

benéfica das peçonhas de serpentes, aranhas, escorpições e insetos. Recife,

1998. 16-21 p.

GUATIMOSIM, S. C.; PRADO, V. F.; DINIZ, C. R.; CHAVEZ-OLORTEGUI, C. e

KALAPOTHAKIS, E. Molecular cloning and genomic analysis of TsNTxp: an

immunogenic protein from Tityus serrulatus scorpion venom. Toxicon, v.37, n.3,

Mar, p.507-17. 1999.

GUATIMOSIM, S. C.; KALAPOTHAKIS, E.; DINIZ, C. R. e CHAVEZ-

OLORTEGUI, C. Induction of neutralizing antibodies against Tityus serrulatus

toxins by immunization with a recombinant nontoxic protein. Toxicon, v.38, n.1,

Jan, p.113-21. 2000.

GURROLA, G. B.; AREVALO, C.; SREEKUMAR, R.; LOKUTA, A. J.; WALKER,

J. W. e VALDIVIA, H. H. Activation of ryanodine receptors by imperatoxin A and

a peptide segment of the II-III loop of the dihydropyridine receptor. J Biol Chem,

v.274, n.12, Mar 19, p.7879-86. 1999.

HARLOW, E. e LANE, D. Antibodies. In: C. S. H. Laboratory (Ed.). A Laboratory

Manual. New York: Cold Spring Harbor, 1988. Antibodies

HASSAN, F. Production of Scorpion Antivenin. In: A. T. Tu (Ed.). Handbook of

Natural Toxins. New York: Marcel Dekker, INC., v.2, 1984. Production of

Scorpion Antivenin, p.577-605

229

HERING, S. E.; AZEVEDO-MARQUES, M. M. e CUPO, P. Escorpionismo. In:

S. Schvartsman (Ed.). Plantas venenosas e animais peçonhentos. São Paulo:

Sarvier, 1992. Escorpionismo, p.216-227

HERION, P.; GURROLA-BRIONES, G.; DEL ROCIO SANCHEZ, M.;

SAAVEDRA, R. e POSSANI, L. D. Monoclonal antibodies against noxiustoxin.

Hybridoma, v.14, n.3, Jun, p.247-51. 1995.

HERNANDEZ, R.; GAZARIAN, T. G.; HERION, P. S. e GAZARIAN, K. G.

Molecular localization and crossreactivity of two epitopes of noxiustoxin from

scorpion Centruroides noxius, identified by a panel of monoclonal antibodies

and peptide mimotopes. Immunol Lett, v.80, n.2, Feb 1, p.97-103. 2002.

HOLADAY, S. K., JR.; MARTIN, B. M.; FLETCHER, P. L., JR. e KRISHNA, N.

R. NMR solution structure of butantoxin. Arch Biochem Biophys, v.379, n.1, Jul

1, p.18-27. 2000.

ISHIKAWA, H. e TAMAOKI, H. Production of human calcitonin in Escherichia

coli from multimeric fusion protein. Journal of Fermentation and Bioengineering,

v.82, n.2, p.140-144. 1996.

INCEOGLU, B.; LANGO, J.; WU, J.; HAWKINS, P.; SOUTHERN, J. e

HAMMOCK, B. D. Isolation and characterization of a novel type of neurotoxic

peptide from the venom of the South African scorpion Parabuthus transvaalicus

(Buthidae). Eur J Biochem, v.268, n.20, Oct, p.5407-13. 2001.

ISMAIL, M.; EL-ASMAR, M. F. e OSMAN, O. H. Pharmacological studies with

scorpion (Palamneus gravimanus) venom: evidence for the presence of

histamine. Toxicon, v.13, n.1, Feb, p.49-56. 1975.

JI, Y. H.; HUANG, H. Y.; ZHOU, C. W.; HOSHINO, M.; MOCHIZUKI, T. e

YANAIHARA, N. BmK AS, an active scorpion polypeptide, enhancer [3H]-

noradrenaline realease from rat hyppocamppal slices. Biochem. Res., v.18,

p.257-260. 1997.

JI, Y. H.; LI, Y. J.; ZHANG, J. W.; SONG, B. L.; YAMAKI, T.; MOCHIZUKI, T.;

HOSHINO, M. e YANAIHARA, N. Covalent structures of BmK AS and BmK AS-

1, two novel bioactive polypeptides purified from Chinese scorpion Buthus

martensi Karsch. Toxicon

, v.37, n.3, Mar, p.519-36. 1999.

JOVER, E.; COURAUD, F. e ROCHAT, H. Two types of scorpion neurotoxins

characterized by their binding to two separate receptor sites on rat brain

synaptosomes. Biochem Biophys Res Commun

, v.95, n.4, Aug 29, p.1607-14.

1980.

JUNQUEIRA-DE-AZEVEDO IDE, L. e HO, P. L. A survey of gene expression

and diversity in the venom glands of the pitviper snake Bothrops insularis

through the generation of expressed sequence tags (ESTs). Gene, v.299, n.1-2,

Oct 16, p.279-91. 2002.

230

KALAPOTHAKIS, E. e CHAVEZ-OLORTEGUI, C. Venom variability among

several Tityus serrulatus specimens. Toxicon, v.35, n.10, Oct, p.1523-9. 1997.

KARBER, C. Karber's method of determining LD50. In: J. H. Burn (Ed.).

Biological Standardization. London: Oxford University Press, 1937. Karber's

method of determining LD50

KHARRAT, R.; ZENOUAKI, I.; BEN LASFAR, Z.; MILED, K. e EL AYEB, M.

Molecular characterization, antigenicity and immunogenicity of anatoxic

polymeric forms conferring protection against scorpion venoms. Toxicon, v.35,

n.6, Jun, p.915-30. 1997.

KIRSCH, G. E.; SKATTEBOL, A.; POSSANI, L. D. e BROWN, A. M.

Modification of Na channel gating by an alpha scorpion toxin from Tityus

serrulatus. J Gen Physiol, v.93, n.1, Jan, p.67-83. 1989.

KIRUBAKARAN, S. I. e SAKTHIVEL, N. Cloning and overexpression of

antifungal barley chitinase gene in Escherichia coli. Protein Expr Purif, v.52, n.1,

Mar, p.159-66. 2007.

KOBAYASHI, Y.; TAKASHIMA, H.; TAMAOKI, H.; KYOGOKU, Y.; LAMBERT,

P.; KURODA, H.; CHINO, N.; WATANABE, T. X.; KIMURA, T.; SAKAKIBARA,

S. e ET AL. The cystine-stabilized alpha-helix: a common structural motif of ion-

channel blocking neurotoxic peptides. Biopolymers, v.31, n.10, Sep, p.1213-20.

1991.

KOROLKOVA, Y. V.; BOCHAROV, E. V.; ANGELO, K.; MASLENNIKOV, I. V.;

GRINENKO, O. V.; LIPKIN, A. V.; NOSYREVA, E. D.; PLUZHNIKOV, K. A.;

OLESEN, S. P.; ARSENIEV, A. S. e GRISHIN, E. V. New binding site on

common molecular scaffold provides HERG channel specificity of scorpion toxin

BeKm-1. J Biol Chem, v.277, n.45, Nov 8, p.43104-9. 2002.

KOROLKOVA, Y. V.; KOZLOV, S. A.; LIPKIN, A. V.; PLUZHNIKOV, K. A.;

HADLEY, J. K.; FILIPPOV, A. K.; BROWN, D. A.; ANGELO, K.; STROBAEK,

D.; JESPERSEN, T.; OLESEN, S. P.; JENSEN, B. S. e GRISHIN, E. V. An

ERG channel inhibitor from the scorpion Buthus eupeus. J Biol Chem, v.276,

n.13, Mar 30, p.9868-76. 2001.

KOU, G.; SHI, S.; WANG, H.; TAN, M.; XUE, J.; ZHANG, D.; HOU, S.; QIAN,

W.; WANG, S.; DAI, J.; LI, B. e GUO, Y. Preparation and characterization of

recombinant protein ScFv(CD11c)-TRP2 for tumor therapy from inclusion

bodies in Escherichia coli. Protein Expr Purif, v.52, n.1, Mar, p.131-8. 2007.

KOZLOV, S.; MALYAVKA, A.; MCCUTCHEN, B.; LU, A.; SCHEPERS, E.;

HERRMANN, R. e GRISHIN, E. A novel strategy for the identification of

toxinlike structures in spider venom. Proteins, v.59, n.1, Apr 1, p.131-40. 2005.

LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the

head of bacteriophage T4. Nature

, v.227, n.5259, Aug 15, p.680-5. 1970.

231

LARABA-DJEBARI, F.; LEGROS, C.; CREST, M.; CEARD, B.; ROMI, R.;

MANSUELLE, P.; JACQUET, G.; VAN RIETSCHOTEN, J.; GOLA, M.;

ROCHAT, H. e ET AL. The kaliotoxin family enlarged. Purification,

characterization, and precursor nucleotide sequence of KTX2 from Androctonus

australis venom. J Biol Chem, v.269, n.52, Dec 30, p.32835-43. 1994.

LECOMTE, C.; FERRAT, G.; FAJLOUN, Z.; VAN RIETSCHOTEN, J.;

ROCHAT, H.; MARTIN-EAUCLAIRE, M. F.; DARBON, H. e SABATIER, J. M.

Chemical synthesis and structure-activity relationships of Ts kappa, a novel

scorpion toxin acting on apamin-sensitive SK channel. J Pept Res, v.54, n.5,

Nov, p.369-76. 1999.

LEGROS, C.; SCHULZE, C.; GARCIA, M. L.; BOUGIS, P. E.; MARTIN-

EAUCLAIRE, M. F. e PONGS, O. Engineering-specific pharmacological binding

sites for peptidyl inhibitors of potassium channels into KcsA. Biochemistry, v.41,

n.51, Dec 24, p.15369-75. 2002.

LEGROS, C.; CEARD, B.; BOUGIS, P. E. e MARTIN-EAUCLAIRE, M. F.

Evidence for a new class of scorpion toxins active against K+ channels. FEBS

Lett, v.431, n.3, Jul 24, p.375-80. 1998.

LEGROS, C.; OUGHUIDENI, R.; DARBON, H.; ROCHAT, H.; BOUGIS, P. E. e

MARTIN-EAUCLAIRE, M. F. Characterization of a new peptide from Tityus

serrulatus scorpion venom which is a ligand of the apamin-binding site. FEBS

Lett, v.390, n.1, Jul 15, p.81-4. 1996.

LIU, X. Q.; YANG, X. Q.; XIE, F. H.; SONG, L. Y.; ZHANG, G. Q. e QIAN, S. J.

On-column refolding and purification of transglutaminase from Streptomyces

fradiae expressed as inclusion bodies in Escherichia coli. Protein Expr Purif,

v.51, n.2, Feb, p.179-86. 2007.

LOMBET, A. e LAZDUNSKI, M. Characterization, solubilization, affinity labeling

and purification of the cardiac Na+ channel using Tityus toxin gamma. Eur J

Biochem, v.141, n.3, Jun 15, p.651-60. 1984.

LOPEZ-GONZALEZ, I.; OLAMENDI-PORTUGAL, T.; DE LA VEGA-BELTRAN,

J. L.; VAN DER WALT, J.; DYASON, K.; POSSANI, L. D.; FELIX, R. e

DARSZON, A. Scorpion toxins that block T-type Ca2+ channels in

spermatogenic cells inhibit the sperm acrosome reaction. Biochem Biophys Res

Commun, v.300, n.2, Jan 10, p.408-14. 2003.

LORET, E. P.; MARTIN-EAUCLAIRE, M. F.; MANSUELLE, P.; SAMPIERI, F.;

GRANIER, C. e ROCHAT, H. An anti-insect toxin purified from the scorpion

Androctonus australis Hector also acts on the alpha- and beta-sites of the

mammalian sodium channel: sequence and circular dichroism study.

Biochemistry, v.30, n.3, Jan 22, p.633-40. 1991.

LOURENÇO, W. R. Humicolous microcharmid scorpions: a new genus and

species from Madagascar. C R Biol

, v.327, n.1, Jan, p.77-83. 2004.

232

LOURENÇO, W. R. Peut-on parter d'une biogeography du scorpionisme? C. R.

Soc. Biogéogr., v.64, p.137-143. 1988.

LOURENÇO, W. R. e FRANCKE, O. F. Révision des connaissances sur lês

scorpions cavernicoles (troglobies) (Arachnida, Scorpiones. Mêm. Biospéol.,

v.12, p.3-7. 1985.

LUO, F.; ZENG, X. C.; HAHIN, R.; CAO, Z. J.; LIU, H. e LI, W. X. Genomic

organization of four novel nondisulfide-bridged peptides from scorpion

Mesobuthus martensii Karsch: gaining insight into evolutionary mechanism.

Peptides, v.26, n.12, Dec, p.2427-33. 2005.

MACHADO DE AVILA, R. A.; ALVARENGA, L. M.; TAVARES, C. A.; MOLINA,

F.; GRANIER, C. e CHAVEZ-OLORTEGUI, C. Molecular characterization of

protective antibodies raised in mice by Tityus serrulatus scorpion venom toxins

conjugated to bovine serum albumin. Toxicon, v.44, n.3, Sep 1, p.233-41. 2004.

MAGALHAES, G. S.; JUNQUEIRA-DE-AZEVEDO, I. L.; LOPES-FERREIRA,

M.; LORENZINI, D. M.; HO, P. L. e MOURA-DA-SILVA, A. M. Transcriptome

analysis of expressed sequence tags from the venom glands of the fish

Thalassophryne nattereri. Biochimie, v.88, n.6, Jun, p.693-9. 2006.

MAGALHAES, O. Contribuição para o conhecimento da intoxicação pelo

veneno dos escorpiões. Mem. Inst. Osw. Cruz, v.Tomo XX1, n.fasc. I. 1928.

MANSUELLE, P.; MARTIN-EAUCLAIRE, M. F.; CHAVEZ-OLORTEGUI, C.; DE

LIMA, M. E.; ROCHAT, H. e GRANIER, C. The beta-type toxin Ts II from the

scorpion Tityus serrulatus: amino acid sequence determination and assessment

of biological and antigenic properties. Nat Toxins, v.1, n.2, p.119-25. 1992.

MARANGONI, S.; GHISO, J.; SAMPAIO, S. V.; ARANTES, E. C.; GIGLIO, J.

R.; OLIVEIRA, B. e FRANGIONE, B. The complete amino acid sequence of

toxin TsTX-VI isolated from the venom of the scorpion Tityus serrulatus. J

Protein Chem, v.9, n.5, Oct, p.595-601. 1990.

MARIA, W. S.; VELARDE, D. T.; ALVARENGA, L. M.; NGUYEN, C.; VILLARD,

S.; GRANIER, C. e CHAVEZ-OLORTEGUI, C. Localization of epitopes in the

toxins of Tityus serrulatus scorpions and neutralizing potential of therapeutic

antivenoms. Toxicon, v.46, n.2, Aug, p.210-7. 2005.

MARTIN-EAUCLAIRE, M. F.; ALAMI, M.; GIAMARCHI, A.; MISSIMILLI, V.;

ROSSO, J. P. e BOUGIS, P. E. A natural anatoxin, Amm VIII, induces

neutralizing antibodies against the potent scorpion alpha-toxins. Vaccine

, v.24,

n.12, Mar 15, p.1990-6. 2006.

MARTIN-EAUCLAIRE, M. F.; BECHIS, G.; EL AYEB, M.; SAMPIERI, F.;

BRANDO, T.; DINIZ, C. R. e ROCHAT, H. Purification and characterization of

eight toxins from the Brazilian scorpion Tityus serrulatus. Toxicon, v.23, p.594.

1985.

233

MARTIN-EAUCLAIRE, M. F.; CEARD, B.; RIBEIRO, A. M.; DINIZ, C. R.;

ROCHAT, H. e BOUGIS, P. E. Molecular cloning and nucleotide sequence

analysis of a cDNA encoding the main beta-neurotoxin from the venom of the

South American scorpion Tityus serrulatus. FEBS Lett, v.302, n.3, May 18,

p.220-2. 1992.

MARTIN-EAUCLAIRE, M. F.; CEARD, B.; RIBEIRO, A. M.; DINIZ, C. R.;

ROCHAT, H. e BOUGIS, P. E. Biochemical, pharmacological and genomic

characterisation of Ts IV, an alpha-toxin from the venom of the South American

scorpion Tityus serrulatus. FEBS Lett, v.342, n.2, Apr 4, p.181-4. 1994.

MAURANO, H. R. Do Escorpionismo. Rio de Janeiro, 1915.

MEDYNSKI, D.; TUAN, M.; LIU, W.; WU, S. e LIN, X. Refolding, purification,

and activation of miniplasminogen and microplasminogen isolated from E. coli

inclusion bodies. Protein Expr Purif, v.52, n.2, Apr, p.395-402. 2007.

MEKI, A. R.; NASSAR, A. Y. e ROCHAT, H. A bradykinin-potentiating peptide

(peptide K12) isolated from the venom of Egyptian scorpion Buthus occitanus.

Peptides, v.16, n.8, p.1359-65. 1995.

MENDES, T. M.; MARIA, W. S.; GRANIER, C.; CHAVEZ-OLORTEGUI, C. e

KALAPOTHAKIS, E. Epitope mapping of the antigenic protein TsNTxP from

Tityus serrulatus scorpion venom using mouse, rabbit and sheep antibodies.

Toxicon, v.44, n.6, Nov, p.617-24. 2004.

MILLER, C.; MOCZYDLOWSKI, E.; LATORRE, R. e PHILLIPS, M.

Charybdotoxin, a protein inhibitor of single Ca

-activated K

channels from

mammalian skeletal muscle. Nature, v.313, p.316-318. 1985.

MINISTÉRIO DA SAÚDE. Escorpionismo. In: Comed/Asplan/Fns (Ed.). Manual

de diagnóstico e tratamento de acidentes por animais peçonhentos. Brasília:

Fundação Nacional de Saúde, 2001. Escorpionismo, p.39-47

MIRANDA, F.; KUPEYAN, C.; ROCHAT, H.; ROCHAT, C. e LISSITZKY, S.

Purification of animal neurotoxins. Isolation and characterization of eleven

neurotoxins from the venoms of the scorpions Androctonus australis hector,

Buthus occitanus tunetanus and Leiurus quinquestriatus quinquestriatus. Eur J

Biochem, v.16, n.3, Nov, p.514-23. 1970.

MOERMAN, L.; BOSTEELS, S.; NOPPE, W.; WILLEMS, J.; CLYNEN, E.;

SCHOOFS, L.; THEVISSEN, K.; TYTGAT, J.; VAN ELDERE, J.; VAN DER

WALT, J. e VERDONCK, F. Antibacterial and antifungal properties of alpha-

helical, cationic peptides in the venom of scorpions from southern Africa. Eur J

Biochem, v.269, n.19, Oct, p.4799-810. 2002.

MOORE, J. T.; UPPAL, A.; MALEY, F. e MALEY, G. F. Overcoming inclusion

body formation in a high-level expression system. Protein Expr Purif, v.4, n.2,

Apr, p.160-3. 1993.

234

MOREIRA-FERREIRA, A. M.; KALAPOTHAKIS, E.; DINIZ, C. R. e CHAVEZ-

OLORTEGUI, C. In vivo protection against Tityus serrulatus scorpion toxins by

immunization of mice with a non-toxic protein. Toxicon, v.36, n.2, Feb, p.333-9.

1998.

MOSBAH, A.; KHARRAT, R.; FAJLOUN, Z.; RENISIO, J. G.; BLANC, E.;

SABATIER, J. M.; EL AYEB, M. e DARBON, H. A new fold in the scorpion toxin

family, associated with an activity on a ryanodine-sensitive calcium channel.

Proteins, v.40, n.3, Aug 15, p.436-42. 2000.

MOUSLI, M.; DEVAUX, C.; ROCHAT, H.; GOYFFON, M. e BILLIALD, P. A

recombinant single-chain antibody fragment that neutralizes toxin II from the

venom of the scorpion Androctonus australis hector. FEBS Lett, v.442, n.2-3,

Jan 15, p.183-8. 1999.

MUDADO, M. A. Uso da base de dados secundária KOG como ferramenta para

caracterização de expressão gênica e mineração de dados em projetos

transcriptomas. Departamento de Bioquímica e Imunologia, UFMG, Belo

Horizonte, 2007. 134 p.

NCBI. National Center for Biotechnology: Disponível em:

<http://www.ncbi.nlm.nih.gov>. Acesso em: janeiro de 2005 e setembro de

2007.

NIRTHANAN, S.; PIL, J.; ABDEL-MOTTALEB, Y.; SUGAHARA, Y.;

GOPALAKRISHNAKONE, P.; JOSEPH, J. S.; SATO, K. e TYTGAT, J.

Assignment of voltage-gated potassium channel blocking activity to kappa-

KTx1.3, a non-toxic homologue of kappa-hefutoxin-1, from Heterometrus

spinifer venom. Biochem Pharmacol, v.69, n.4, Feb 15, p.669-78. 2005.

NORTON, R. S. e PALLAGHY, P. K. The cystine knot structure of ion channel

toxins and related polypeptides. Toxicon

, v.36, n.11, Nov, p.1573-83. 1998.

NOVAES, G.; CATANZARO, O. L.; BERALDO, W. T. e FREIRE-MAIA, L. Effect

of purified scorpion toxin (tityustoxin) on the pancreatic secretion of the rat.

Toxicon

, v.20, n.5, p.847-53. 1982.

NOVAGEN, Ed. pET System Manual: the gold standard for protein

expressioned. 2005.

NOVELLO, J. C.; ARANTES, E. C.; VARANDA, W. A.; OLIVEIRA, B.; GIGLIO,

J. R. e MARANGONI, S. TsTX-IV, a short chain four-disulfide-bridged

neurotoxin from Tityus serrulatus venom which acts on Ca2+-activated K+

channels. Toxicon

, v.37, n.4, Apr, p.651-60. 1999.

OLAMENDI-PORTUGAL, T.; GARCIA, B. I.; LOPEZ-GONZALEZ, I.; VAN DER

WALT, J.; DYASON, K.; ULENS, C.; TYTGAT, J.; FELIX, R.; DARSZON, A. e

POSSANI, L. D. Two new scorpion toxins that target voltage-gated Ca2+ and

Na+ channels. Biochem Biophys Res Commun

, v.299, n.4, Dec 13, p.562-8.

2002.

235

OLAMENDI-PORTUGAL, T.; SOMODI, S.; FERNANDEZ, J. A.; ZAMUDIO, F.

Z.; BECERRIL, B.; VARGA, Z.; PANYI, G.; GASPAR, R. e POSSANI, L. D.

Novel alpha-KTx peptides from the venom of the scorpion Centruroides elegans

selectively blockade Kv1.3 over IKCa1 K+ channels of T cells. Toxicon, v.46,

n.4, Sep 15, p.418-29. 2005.

PARDO-LOPEZ, L.; GARCIA-VALDES, J.; GURROLA, G. B.; ROBERTSON, G.

A. e POSSANI, L. D. Mapping the receptor site for ergtoxin, a specific blocker of

ERG channels. FEBS Lett, v.510, n.1-2, Jan 2, p.45-9. 2002.

PARSELL, D. A. e SAUER, R. T. The structural stability of a protein is an

important determinant of its proteolytic susceptibility in Escherichia coli. J Biol

Chem, v.264, n.13, May 5, p.7590-5. 1989.

PAURON, D.; BARHANIN, J. e LAZDUNSKI, M. The voltage-dependent Na+

channel of insect nervous system identified by receptor sites for tetrodotoxin,

and scorpion and sea anemone toxins. Biochem Biophys Res Commun, v.131,

n.3, Sep 30, p.1226-33. 1985.

PHRAP. PHRagment Assembly Program: Disponível em:

<http://www.phrap.org>. Acesso em: agosto e setembro de 2007.

PI, C.; LIU, J.; PENG, C.; LIU, Y.; JIANG, X.; ZHAO, Y.; TANG, S.; WANG, L.;

DONG, M.; CHEN, S. e XU, A. Diversity and evolution of conotoxins based on

gene expression profiling of Conus litteratus. Genomics, v.88, n.6, Dec, p.809-

19. 2006.

POSSANI, L.; STEINMETZ, W. E.; DENT, M. A.; ALAGON, A. C. e

WUTHRICH, K. Preliminary spectroscopic characterization of six toxins from

Latin American scorpions. Biochim Biophys Acta, v.669, n.2, Jul 28, p.183-92.

1981.

POSSANI, L. D. Structure of scorpion toxins. In: A. T. Tu (Ed.). Handbool of

Natural Toxins. New York: Marcel Dekker, INC., v.2, 1984. Structure of scorpion

toxins, p.513-550

POSSANI, L. D.; ALAGON, A. C.; FLETCHER, P. L., JR. e ERICKSON, B. W.

Purification and properties of mammalian toxins from the venom of Brazilian

Scorpion Tityus serrulatus Lutz and Mello. Arch Biochem Biophys, v.180, n.2,

Apr 30, p.394-403. 1977.

POSSANI, L. D.; BECERRIL, B.; DELEPIERRE, M. e TYTGAT, J. Scorpion

toxins specific for Na+-channels. Eur J Biochem, v.264, n.2, Sep, p.287-300.

1999.

POSSANI, L. D.; MARTIN, B. M. e SVENDSEN, I. The primary structure of

noxiustoxin:a K

channel blocking peptide, purified from the venom of the

scorpion Centruroides noxius Hoffmann. Carlsberg Res. Commun.

, v.47, p.285-

289. 1982.

236

POSSANI, L. D.; MARTIN, B. M.; SVENDSEN, I.; RODE, G. S. e ERICKSON,

B. W. Scorpion toxins from Centruroides noxius and Tityus serrulatus. Primary

structures and sequence comparison by metric analysis. Biochem J, v.229, n.3,

Aug 1, p.739-50. 1985.

RABBANI, S. A.; YASUDA, T.; BENNETT, H. P.; SUNG, W. L.; ZAHAB, D. M.;

TAM, C. S.; GOLTZMAN, D. e HENDY, G. N. Recombinant human parathyroid

hormone synthesized in Escherichia coli. Purification and characterization. J

Biol Chem, v.263, n.3, Jan 25, p.1307-13. 1988.

RAMIREZ-DOMINGUEZ, M. E.; OLAMENDI-PORTUGAL, T.; GARCIA, U.;

GARCIA, C.; ARECHIGA, H. e POSSANI, L. D. Cn11, the first example of a

scorpion toxin that is a true blocker of Na(+) currents in crayfish neurons. J Exp

Biol, v.205, n.Pt 6, Mar, p.869-76. 2002.

RANG, H. P.; DALE, M. M. e RITTER, J. M. Farmacologia

. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan. 1997. 692 p.

ROBERTO, P. G.; KASHIMA, S.; SOARES, A. M.; CHIOATO, L.; FACA, V. M.;

FULY, A. L.; ASTOLFI-FILHO, S.; PEREIRA, J. O. e FRANCA, S. C. Cloning

and expression of an acidic platelet aggregation inhibitor phospholipase A2

cDNA from Bothrops jararacussu venom gland. Protein Expr Purif

, v.37, n.1,

Sep, p.102-8. 2004.

ROCHAT, H.; BERNARD, P. e COURAUD, F. Scorpion toxins: chemistry and

mode of action. Adv Cytopharmacol, v.3, p.325-34. 1979.

RODRIGUES, A. R.; ARANTES, E. C.; MONJE, F.; STUHMER, W. e

VARANDA, W. A. Tityustoxin-K(alpha) blockade of the voltage-gated potassium

channel Kv1.3. Br J Pharmacol, v.139, n.6, Jul, p.1180-6. 2003.

RODRIGUEZ DE LA VEGA, R. C. e POSSANI, L. D. Current views on scorpion

toxins specific for K+-channels. Toxicon

, v.43, n.8, Jun 15, p.865-75. 2004.

RODRIGUEZ DE LA VEGA, R. C. e POSSANI, L. D. Overview of scorpion

toxins specific for Na+ channels and related peptides: biodiversity, structure-

function relationships and evolution. Toxicon

, v.46, n.8, Dec 15, p.831-44. 2005.

ROGOWSKI, R. S.; KRUEGER, B. K.; COLLINS, J. H. e BLAUSTEIN, M. P.

Tityustoxin K alpha blocks voltage-gated noninactivating K+ channels and

unblocks inactivating K+ channels blocked by alpha-dendrotoxin in

synaptosomes. Proc Natl Acad Sci U S A, v.91, n.4, Feb 15, p.1475-9. 1994.

SAIKI, R. K.; GELFAND, D. H.; STOFFEL, S.; SCHART, S. J.; HIGUCHI, R.;

HORN, G. T.; MULLIS, K. B. e ERLICH, H. A. Primer-directed enzymatic

amplification of DNA with a Termostable DNA polymerase. Science, v.239,

p.487-491. 1988.

237

SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F. e MANIATIS, T. Molecular Cloning: A

Laboratory Manual: Col Spring Harbor Laboratory Press, v.1, 2 e 3. 1989

SAMPAIO, S. V.; ARANTES, E. C.; PRADO, W. A.; RICCIOPPO NETO, F. e

GIGLIO, J. R. Further characterization of toxins T1IV (TsTX-III) and T2IV from

Tityus serrulatus scorpion venom. Toxicon, v.29, n.6, p.663-72. 1991.

SAMPAIO, S. V.; COUTINHO-NETTO, J.; ARANTES, E. C.; TOYAMA, M. H.;

NOVELLO, J. C. e GIGLIO, J. R. TsTX-VII, a new toxin from Tityus serrulatus

scorpion venom able to induce the release of neurotransmitters from rat brain

synaptosomes not blocked by tetrodotoxin. Biochem Mol Biol Int, v.41, n.6,

May, p.1255-63. 1997.

SAMPAIO, S. V.; LAURE, C. J. e GIGLIO, J. R. Isolation and characterization of

toxic proteins from the venom of the Brazilian scorpion Tityus serrulatus.

Toxicon, v.21, n.2, p.265-77. 1983.

SANTANA, G. C.; FREIRE, A. C.; FERREIRA, A. P.; CHAVES-OLORTEGUI,

C.; DINIZ, C. R. e FREIRE-MAIA, L. Pharmacokinetics of Tityus serrulatus

scorpion venom determined by enzyme-linked immunosorbent assay in the rat.

Toxicon, v.34, n.9, Sep, p.1063-6. 1996.

SCHWARTZ, E. F.; DIEGO-GARCIA, E.; RODRIGUEZ DE LA VEGA, R. C. e

POSSANI, L. D. Transcriptome analysis of the venom gland of the Mexican

scorpion Hadrurus gertschi (Arachnida: Scorpiones). BMC Genomics, v.8,

p.119. 2007.

SELISKO, B.; COSIO, G.; GARCIA, C.; BECERRIL, B.; POSSANI, L. D. e

HORJALES, E. Bacterial expression, purification and functional characterization

of a recombinant chimeric Fab derived from murine mAb BCF2 that neutralizes

the venom of the scorpion Centruroides noxius hoffmann. Toxicon, v.43, n.1,

Jan, p.43-51. 2004.

SIDACH, S. S. e MINTZ, I. M. Kurtoxin, a gating modifier of neuronal high- and

low-threshold ca channels. J Neurosci, v.22, n.6, Mar 15, p.2023-34. 2002.

SILVESTRE, F. G. Caracterização parcial bioquímica, imunológica e molecular

do veneno das aranhas Loxoceles similis, L. gaucho, L. anomala e Lasiodora

sp. Departamento de Farmacologia, UFMG, Belo Horizonte, 2005. 183 p.

SISSOM, W. D. Systematics, biogeography and paleontology. In: G. A. Pous

(Ed.). The Biology of Scorpion

. Stanford: Stanfor University Press, 1990.

Systematics, biogeography and paleontology, p.64-160

SORENSEN, H. P. e MORTENSEN, K. K. Soluble expression of recombinant

proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb Cell Fact, v.4, n.1, Jan 4,

p.1. 2005a.

238

SORENSEN, H. P. e MORTENSEN, K. K. Advanced genetic strategies for

recombinant protein expression in Escherichia coli. J Biotechnol, v.115, n.2, Jan

26, p.113-28. 2005b.

SOTO, M.; REQUENA, J. M.; QUIJADA, L. e ALONSO, C. Multicomponent

chimeric antigen for serodiagnosis of canine visceral leishmaniasis. J Clin

Microbiol, v.36, n.1, Jan, p.58-63. 1998.

SRAIRI-ABID, N.; GUIJARRO, J. I.; BENKHALIFA, R.; MANTEGAZZA, M.;

CHEIKH, A.; BEN AISSA, M.; HAUMONT, P. Y.; DELEPIERRE, M. e EL AYEB,

M. A new type of scorpion Na+-channel-toxin-like polypeptide active on K+

channels. Biochem J, v.388, n.Pt 2, Jun 1, p.455-64. 2005.

SRINIVASAN, K. N.; SIVARAJA, V.; HUYS, I.; SASAKI, T.; CHENG, B.;

KUMAR, T. K.; SATO, K.; TYTGAT, J.; YU, C.; SAN, B. C.; RANGANATHAN,

S.; BOWIE, H. J.; KINI, R. M. e GOPALAKRISHNAKONE, P. kappa-Hefutoxin1,

a novel toxin from the scorpion Heterometrus fulvipes with unique structure and

function. Importance of the functional diad in potassium channel selectivity. J

Biol Chem, v.277, n.33, Aug 16, p.30040-7. 2002.

TAN, Z. Y.; MAO, X.; XIAO, H.; ZHAO, Z. Q. e JI, Y. H. Buthus martensi Karsch

agonist of skeletal-muscle RyR-1, a scorpion active polypeptide: antinociceptive

effect on rat peripheral nervous system and spinal cord, and inhibition of

voltage-gated Na(+) currents in dorsal root ganglion neurons. Neurosci Lett,

v.297, n.2, Jan 12, p.65-8. 2001.

TAUTZ, D. e RENZ, M. An optimized freeze-squeeze method for the recovery

of DNA fragments from agarose gels. Anal Biochem, v.132, n.1, Jul 1, p.14-9.

1983.

THEAKSTON, R. D.; WARRELL, D. A. e GRIFFITHS, E. Report of a WHO

workshop on the standardization and control of antivenoms. Toxicon

, v.41, n.5,

Apr, p.541-57. 2003.

TOLEDO, D. e NEVES, A. G. Purification and partial characterization of a

second toxin from the scorpion Tityus serrulatus. Comp Biochem Physiol B

v.55, n.2, p.249-53. 1976.

TORRES-LARIOS, A.; GURROLA, G. B.; ZAMUDIO, F. Z. e POSSANI, L. D.

Hadrurin, a new antimicrobial peptide from the venom of the scorpion Hadrurus

aztecus. Eur J Biochem, v.267, n.16, Aug, p.5023-31. 2000.

TOWBIN, H.; STAEHELIN, T. e GORDON, J. Electrophoretic transfer of

proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some

applications. Proc Natl Acad Sci U S A, v.76, n.9, Sep, p.4350-4. 1979.

TURKOV, M.; RASHI, S.; NOAM, Z.; GORDON, D.; BEN KHALIFA, R.;

STANKIEWICZ, M.; PELHATE, M. e GUREVITZ, M. In vitro folding and

functional analysis of an anti-insect selective scorpion depressant neurotoxin

produced in Escherichia coli. Protein Expr Purif, v.10, n.1, Jun, p.123-31. 1997.

239

TYTGAT, J.; CHANDY, K. G.; GARCIA, M. L.; GUTMAN, G. A.; MARTIN-

EAUCLAIRE, M. F.; VAN DER WALT, J. J. e POSSANI, L. D. A unified

nomenclature for short-chain peptides isolated from scorpion venoms: alpha-

KTx molecular subfamilies. Trends Pharmacol Sci, v.20, n.11, Nov, p.444-7.

1999.

TYTGAT, J.; DEBONT, T.; ROSTOLL, K.; MULLER, G. J.; VERDONCK, F.;

DAENENS, P.; VAN DER WALT, J. J. e POSSANI, L. D. Purification and partial

characterization of a 'short' insectotoxin-like peptide from the venom of the

scorpion Parabuthus schlechteri. FEBS Lett, v.441, n.3, Dec 28, p.387-91.

1998.

UNIPROT. UniProt - The Universal Protein Resource: Disponível em:

<http://www.pir.uniprot.org>. Acesso em: agosto e setembro de 2007.

VALDEZ-CRUZ, N. A.; BATISTA, C. V.; ZAMUDIO, F. Z.; BOSMANS, F.;

TYTGAT, J. e POSSANI, L. D. Phaiodotoxin, a novel structural class of insect-

toxin isolated from the venom of the Mexican scorpion Anuroctonus

phaiodactylus. Eur J Biochem, v.271, n.23-24, Dec, p.4753-61. 2004.

VALDEZ-CRUZ, N. A.; SEGOVIA, L.; CORONA, M. e POSSANI, L. D.

Sequence analysis and phylogenetic relationship of genes encoding

heterodimeric phospholipases A2 from the venom of the scorpion Anuroctonus

phaiodactylus. Gene, v.396, n.1, Jul 1, p.149-58. 2007.

VALDIVIA, H. H.; KIRBY, M. S.; LEDERER, W. J. e CORONADO, R. Scorpion

toxins targeted against the sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-release channel of

skeletal and cardiac muscle. Proc Natl Acad Sci U S A, v.89, n.24, Dec 15,

p.12185-9. 1992.

VALDIVIA, H. H. e POSSANI, L. D. Peptide toxins as probes of ryanodine

receptor structure and function. TCM

, v.8, n.3, p.111-118. 1998.

VERDONCK, F.; BOSTEELS, S.; DESMET, J.; MOERMAN, L.; NOPPE, W.;

WILLEMS, J.; TYTGAT, J. e VAN DER WALT, J. A novel class of pore-forming

peptides in the venom of Parabuthus schlechteri Purcell (Scorpions: Buthidae).

Cimbebasia, v.16, p.247-260. 2000.

VIJVERBERG, H. P.; PAURON, D. e LAZDUNSKI, M. The effect of Tityus

serrulatus scorpion toxin gamma on Na channels in neuroblastoma cells.

Pflugers Arch

, v.401, n.3, Jul, p.297-303. 1984.

VILELA, E. Soroterapia anti-escorpiônica. Brasil Médico, v.Ano XXXI, n.46.

1917.

VILLAVERDE, A. e CARRIO, M. M. Protein aggregation in recombinant

bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol Lett, v.25, n.17, Sep,

p.1385-95. 2003.

240

VIULLARD, L. e FREEMAN, A. Molecular Biology Protocols: Preparation of

ative proteins from inclusion bodies. University de St. Andrews U. K.: Disponível

em:

<http://dwb.unl.edu/Teacher/NSF/C08/C08Links/www.nwfsc.noaa.gov/protocols

/inclusion.html>. Acesso em: junho de 2006.

VITAL-BRAZIL, G. Soro anti-escorpiônico. Mem Inst Butantan, v.1, n.1, p.47-

52. 1919.

WAGSTAFF, S. C. e HARRISON, R. A. Venom gland EST analysis of the saw-

scaled viper, Echis ocellatus, reveals novel alpha9beta1 integrin-binding motifs

in venom metalloproteinases and a new group of putative toxins, renin-like

aspartic proteases. Gene, v.377, Aug 1, p.21-32. 2006.

WANG, C. G.; CAI, Z.; LU, W.; WU, J.; XU, Y.; SHI, Y. e CHI, C. W. A novel

short-chain peptide BmKX from the Chinese scorpion Buthus martensi Karsch,

sequencing, gene cloning and structure determination. Toxicon

, v.45, n.3, Mar

1, p.309-19. 2005.

WANG, C. Y.; TAN, Z. Y.; CHEN, B.; ZHAO, Z. Q. e JI, Y. H. Antihyperalgesia

effect of BmK IT2, a depressant insect-selective scorpion toxin in rat by

peripheral administration. Brain Res Bull

, v.53, n.3, Oct, p.335-8. 2000.

WARNER, L. R.; BLASICK, C. M.; BROWN, R. J. e OXFORD, J. T. Expression,

purification, and refolding of recombinant collagen alpha1(XI) amino terminal

domain splice variants. Protein Expr Purif, v.52, n.2, Apr, p.403-9. 2007.

WARNICK, J. E.; ALBUQUERQUE, E. X. e DINIZ, C. R. Electrophysiological

observations on the action of the purified scorpion venom, tityustoxin, on nerve

and skeletal muscle of the rat. J Pharmacol Exp Ther, v.198, n.1, Jul, p.155-67.

1976.

WEICKERT, M. J.; DOHERTY, D. H.; BEST, E. A. e OLINS, P. O. Optimization

of heterologous protein production in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol

v.7, n.5, Oct, p.494-9. 1996.

WERKMAN, T. R.; GUSTAFSON, T. A.; ROGOWSKI, R. S.; BLAUSTEIN, M. P.

e ROGAWSKI, M. A. Tityustoxin-K alpha, a structurally novel and highly potent

K+ channel peptide toxin, interacts with the alpha-dendrotoxin binding site on

the cloned Kv1.2 K+ channel. Mol Pharmacol

, v.44, n.2, Aug, p.430-6. 1993.

WIKIPEDIA. A Enciclopédia Livre: Canais HERG. Disponível em:

<http://www.wikipedia.org/wiki/HERG>. Acesso em: agosto de 2007.

WRIGHT, R. P.; CHAN, T. K.; HONETSCHLAGER, L.; HOWELL, D. E. e

ODELL, G. V. Enzymes and toxins of the scorpion venom Palamneus

gravimanus. Toxicon, v.15, n.3, p.197-205. 1977.

241

WU, Y.; JI, Y. H. e SHI, Y. L. Sodium current in NG108-15 cell inhibited by

scorpion toxin BmKAS-1 and restored by its specific monoclonal antibodies. J

Nat Toxins, v.10, n.3, Aug, p.193-8. 2001.

XU, C. Q.; BRONE, B.; WICHER, D.; BOZKURT, O.; LU, W. Y.; HUYS, I.; HAN,

Y. H.; TYTGAT, J.; VAN KERKHOVE, E. e CHI, C. W. BmBKTx1, a novel

Ca2+-activated K+ channel blocker purified from the Asian scorpion Buthus

martensi Karsch. J Biol Chem, v.279, n.33, Aug 13, p.34562-9. 2004.

XU, X.; CAO, Z.; SHENG, J.; WU, W.; LUO, F.; SHA, Y.; MAO, X.; LIU, H.;

JIANG, D. e LI, W. Genomic sequence analysis and organization of

BmKalphaTx11 and BmKalphaTx15 from Buthus martensii Karsch: molecular

evolution of alpha-toxin genes. J Biochem Mol Biol, v.38, n.4, Jul 31, p.386-90.

2005.

YANG, J.; ZHANG, W.; LIU, K.; JING, S.; GUO, G.; LUO, P. e ZOU, Q.

Expression, purification, and characterization of recombinant human interleukin

24 in Escherichia coli. Protein Expr Purif, v.53, n.2, Jun, p.339-45. 2007.

YAO, J.; CHEN, X.; LI, H.; ZHOU, Y.; YAO, L.; WU, G.; CHEN, X.; ZHANG, N.;

ZHOU, Z.; XU, T.; WU, H. e DING, J. BmP09, a "long chain" scorpion peptide

blocker of BK channels. J Biol Chem, v.280, n.15, Apr 15, p.14819-28. 2005.

YATANI, A.; KIRSCH, G. E.; POSSANI, L. D. e BROWN, A. M. Effects of New

World scorpion toxins on single-channel and whole cell cardiac sodium

currents. Am J Physiol, v.254, n.3 Pt 2, Mar, p.H443-51. 1988.

ZAMUDIO, F.; SAAVEDRA, R.; MARTIN, B. M.; GURROLA-BRIONES, G.;

HERION, P. e POSSANI, L. D. Amino acid sequence and immunological

characterization with monoclonal antibodies of two toxins from the venom of the

scorpion Centruroides noxius Hoffmann. Eur J Biochem, v.204, n.1, Feb 15,

p.281-92. 1992.

ZENG, X. C.; CORZO, G. e HAHIN, R. Scorpion venom peptides without

disulfide bridges. IUBMB Life, v.57, n.1, Jan, p.13-21. 2005.

ZENG, X. C.; LI, W. X.; PENG, F. e ZHU, Z. H. Cloning and characterization of

a novel cDNA sequence encoding the precursor of a novel venom peptide

(BmKbpp) related to a bradykinin-potentiating peptide from Chinese scorpion

Buthus martensii Karsch. IUBMB Life, v.49, n.3, Mar, p.207-10. 2000.

ZENG, X. C.; LI, W. X.; ZHU, S. Y.; PENG, F.; ZHU, Z. H.; WU, K. L. e YIANG,

F. H. Cloning and characterization of a cDNA sequence encoding the precursor

of a chlorotoxin-like peptide from the Chinese scorpion Buthus martensii

Karsch. Toxicon, v.38, n.8, Aug, p.1009-14. 2000.

ZENG, X. C.; WANG, S. X.; ZHU, Y.; ZHU, S. Y. e LI, W. X. Identification and

functional characterization of novel scorpion venom peptides with no disulfide

bridge from Buthus martensii Karsch. Peptides

, v.25, n.2, Feb, p.143-50. 2004.

242

ZENG, X. C.; ZHU, Z. H.; LI, W. X.; ZHU, S. Y.; PENG, F.; MAO, X. e LIU, H.

Molecular cloning and genomic organization of a K(+) channel toxin from the

Chinese scorpion Buthus martensii Karsch. Toxicon, v.39, n.2-3, Feb-Mar,

p.407-10. 2001.

ZENOUAKI, I.; KHARRAT, R.; SABATIER, J. M.; DEVAUX, C.; KAROUI, H.;

VAN RIETSCHOTEN, J.; EL AYEB, M. e ROCHAT, H. In vivo protection

against Androctonus australis hector scorpion toxin and venom by immunization

with a synthetic analog of toxin II. Vaccine, v.15, n.2, Feb, p.187-94. 1997.

ZHANG, B.; LIU, Q.; YIN, W.; ZHANG, X.; HUANG, Y.; LUO, Y.; QIU, P.; SU,

X.; YU, J.; HU, S. e YAN, G. Transcriptome analysis of Deinagkistrodon acutus

venomous gland focusing on cellular structure and functional aspects using

expressed sequence tags. BMC Genomics, v.7, p.152. 2006.

ZHAO, D. X.; DING, Z. C.; LIU, Y. Q. e HUANG, Z. X. Overexpression and

purification of single zinc finger peptides of human zinc finger protein ZNF191.

Protein Expr Purif, v.53, n.1, May, p.232-7. 2007.

ZHIJIAN, C.; FENG, L.; YINGLIANG, W.; XIN, M. e WENXIN, L. Genetic

mechanisms of scorpion venom peptide diversification. Toxicon, v.47, n.3, Mar,

p.348-55. 2006.

ZHU, S.; DARBON, H.; DYASON, K.; VERDONCK, F. e TYTGAT, J.

Evolutionary origin of inhibitor cystine knot peptides. Faseb J, v.17, n.12, Sep,

p.1765-7. 2003.

ZHU, S.; LI, W.; ZENG, X.; JIANG, D.; MAO, X. e LIU, H. Molecular cloning and

sequencing of two 'short chain' and two 'long chain' K(+) channel-blocking

peptides from the Chinese scorpion Buthus martensii Karsch. FEBS Lett, v.457,

n.3, Sep 3, p.509-14. 1999.

ZLOTKIN, E. Chemistry and pharmacology of buthinae scorpion venoms. In: S.

Bettini (Ed.). Arthropd Venoms

, 1978. Chemistry and pharmacology of buthinae

scorpion venoms, p.317-369

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 