( PDF ) Estudo da co-infecção pelo HIV e HTLV em Angola

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MINISTÉRIO DA SAÚDE

FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária

ESTUDO DA CO-INFECÇÃO PELO HIV E HTLV EM ANGOLA

Dissertação submetida à Coordenação de Pós-

Graduação do Instituto Oswaldo Cruz para

obtenção do grau de Mestre em Biologia

Parasitária (Área de concentração: Genética)

Por

Rosa de Fátima Costa Ferreira da Silva

Orientadora: Ana Carolina Paulo Vicente

Rio de Janeiro

2008

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MINISTÉRIO DA SAÚDE

FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária

ESTUDO DA CO-INFECÇÃO PELO HIV E HTLV EM ANGOLA

Apresentada por: Rosa de Fátima Costa Ferreira da Silva

Orientadora: Ana Carolina Paulo Vicente

Aprovada em: _________/________________/_________

Examinadores:

_______________________________________________________________

Dr. José Carlos Couto Fernandez (presidente da banca)

_______________________________________________________________

Dr. Amílcar Tanuri (membro)

_______________________________________________________________

Dra. Monick Lindenmeyer Guimarães (membro)

_______________________________________________________________

Dr. Gonzalo José Bello Bentancor (suplente)

_______________________________________________________________

Dra. Luciana Jesus da Costa (suplente)

Dissertação defendida e aprovada em_______de __________________de 2008.

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iii

Ficha catalográfica elaborada pela

Biblioteca de Ciências Biomédicas/ ICICT / FIOCRUZ - RJ

S586

Silva, Rosa de Fátima Costa Ferreira da

Estudo da co-infecção pelo HIV e HTLV em Angola / Rosa de Fátima

Costa Ferreira da Silva. – Rio de Janeiro, 2008.

xvii, 87 f. : il. ; 30 cm.

Dissertação (mestrado) – Instituto Oswaldo Cruz, Biologia

Parasitária, 2008.

Bibliografia: f. 57-87

1. Subtipos genéticos. 2. HIV. 3. HTLV. 4. Co-infecção. 5. Angola I.

Título.

CDD 616.9792

Trabalho desenvolvido no Laboratório de Genética Molecular de Microorganismos

(LGMM), do Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, sob orientação da Dra. Ana Carolina

Paulo Vicente

“E as dúbias sombras tomavam forma

(...) e as linhas desenhavam-se nítidas e

tudo se ia esclarecendo e tudo se

aclarava”

(Aluísio de Azevedo, O cortiço)

Agradecimentos

Á Deus pelas oportunidades, inclusive por me ter permitido estar aqui, ter

aprendido e conhecido pessoas maravilhosas.

Á minha família pelo apoio incondicional. Á minha mãe, meus irmãos meus

amigos. Ao meu pai que acreditou na educação e formação como melhor meio de se

progredir. Descanse em paz.

Ao meu companheiro João Luz, pela presença constante (ou ausência mais

presente), dedicação e segurança que me transmite. Ao meu filho Álisson, pela

compreensão e carinho.

Á Dra. Ana Carolina Paulo Vicente, pela orientação, dedicação, incentivo a que

aprofundasse os conhecimentos, por me apontar o caminho, me ensinando a valorizar

os pontos mais relevantes e pelos mais variados assuntos sobre biologia parasitária

que aprendi durante as reuniões e apresentação dos seminários no Laboratório de

Genética Molecular de Microorganismos (LGMM). Muito obrigada.

Aos Drs. Alena Iñiguez, Koko Otsuki, Gonzalo Bello e Monick Guimarães, pela

disponibilidade e conselhos. Dra. Mariza Morgado que fez parte da banca da defesa do

projeto da tese, obrigada pelos conselhos.

Á Cristiane Thompson, Nancy Halkier e Fernanda dos Santos. Vocês são

pessoas maravilhosas, sempre dispostas a resolver qualquer situação que eu tivesse,

mesmo de questões fora do laboratório. Tudo que disser será pouco para exprimir

minha gratidão. Juliana, Daniela, Valdirene e Érica, Obrigada. Priscila da secretaria da

genética pela simpatia e disposição em ajudar.

Ao pessoal do LAVIMOAN da UFRJ. Dr. Amílcar Tanuri pelo incentivo a pesquisa

em e com amostras de Angola assim como disponibilidade à ajuda. Á Angélica

Nascimento pela ajuda, força e apoio, Não tenho palavras para agradecer. Dra. Luciana

Costa e Renato Santana pela dedicação nos trabalhos em Angola, que foram

importantes para que eu começasse a aprender sobre biologia molecular.

vii

Á Dra. Maria Genoveva von Hubinger do IMPPG da UFRJ, minha orientadora da

tese de monografia, Idem.

Aos meus colegas e amigos do Instituto Nacional de Saúde Pública de Angola

(INSP), em especial aos Drs. Emingarda Castelbranco, Antonica de Souza, Moisés

Francisco pela ajuda na entrega das amostras e contato permanente. Á Dra. Eugênia

Ramos, Beatriz Aleixo, Carolina Ferreira, Joana Samy, pela dedicação e amizade. Á

Diretora do INSP, Dra Filomena Gomes da Silva, minha chefe, pela consideração,

credibilidade e amizade.

Á Dra. Maria de Fátima Ferreira da Cruz pelo total apoio aos assuntos

relacionados ao convênio com Angola, à bolsa, transporte das amostras, etc.

Aos colegas José Vicente, Fátima Valente, Guilhermina Carvalho e Florbela Kosi,

pela união na resolução das questões relacionadas à nossa estadia e mestrado no

Brasil.

Ao Ministério da Saúde de Angola e Fundação Eduardo dos Santos pela bolsa e

apoio. Vice-Ministro da saúde, Dr. José Van-dúnem, pela credibilidade, apoio à

pesquisa e dedicação a Saúde pública de Angola. Dr. Ismael Diogo da Silva, João de

Deus e Sebastião Quiame da Fundação Eduardo dos Santos, pelo empenho na

resolução das questões relacionadas ao convênio e bolsa.

Instituto Nacional de Luta contra SIDA (INLS) pela autorização para utilização

das amostras na tese. Dras. Ducelina Serrano e Lúcia Furtado obrigada pelo apoio e

credibilidade.

Á Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz (IOC) e Programa de Pós-

Graduação em Biologia Parasitária do IOC, pelo apoio financeiro da pesquisa.

Por fim ao Dr. José Carlos Couto Fernandez pela revisão da tese, paciência em

justificar pessoalmente cada alteração, à luz da bibliografia e pela transmissão de

conhecimentos.

viii

Resumo

Os retrovirus HIV e HTLV emergiram como parasitos humanos na África em

conseqüência da transmissão entre-espécies dos vírus de primatas não humanos SIV e

STLV, repectivamente. Em 2005, a prevalência da infecção pelo HIV em Angola era de

3.7% considerando a população adulta, enquanto que, não há registros epidemiológicos

da infecção pelo HTLV no país. Nosso objetivo neste estudo foi investigar o tipo de HIV

e a presença da co-infecção HIV/HTLV em indivíduos HIV soropositivos de Angola e

determinar os subtipos diferentes dos retrovirus nesta população. Amostras de sangue

de 200 indivíduos foram coletadas em 2006 no Hospital Esperança em Luanda. Estas

amostras foram avaliadas quanto à sororeatividade para o HTLV-1/2, o que resultou em

5% (10/200) de amostras positivas. A tipagem molecular do HIV foi realizada, pelo

seqüenciamento do gene da Protease do HIV-1 e HIV-2. Sessenta das duzentas

amostras de HIV, incluindo as soropositivas para HTLV foram analisadas

geneticamente. Cinqüenta e três (53) amostras foram positivas para o HIV-1 e, deste

grupo, 10 (16%) estavam co-infectadas com HIV-2. O subtipo genético do HIV-1 foi

determinado pelo seqüenciamento e análise dos genes env (gp41) e protease e do HIV-

2 presente nas co-infecções determinado pela análise da seqüência do gene da

Protease. Foi encontrada uma grande diversidade de subtipos genéticos do HIV-1.

Considerando as duas regiões Protease/env (gp41) de 37 amostras, o subtipo

predominante foi o F1: (19,0%, n=7), seguido do subtipo G (10,8%, n=4), C (10,8%,

n=4), A1 e D (2,7% n=1). Subtipos discordantes foram encontrados em 20 amostras

(56,7%). apresentando 12 padrões distintos de recombinação entre Protease/env

(gp41): AG/G (10,8%, n=4), D/G (8,1%, n=3) e AG/A1, G/A1 e F/C (5,40%) e, F/D,

F/AE, F/GA, B/H, G/H, AG/H, J/? representados por 1 amostra (2,7% cada). Todas as

dez amostras do HIV-2 pertencem ao subtipo A. A tipagem do HTLV foi realizada pela

análise das seqüências de um segmento da região Tax do HTLV, o que revelou a

presença do HTLV-1. A subtipagem do HTLV-1 realizada pela análise das seqüências

relativas à região LTR e ao gene p12, Confirmou que as amostras pertencem ao

subtipo Cosmopolita/Transcontinental (HTLV-1aA), determinante da pandemia pelo

HTLV. Nosso estudo demonstra pela primeira vez a caracterização molecular dos

retrovírus HIV-2 e HTLV-1 circulando em Luanda, Angola.

Abstract

HIV and HTLV retrovirus emerged as human parasites in Africa due to

interspecies transmissions of the non-human primates virus SIV and STLV, respectively.

By the end of 2005, the HIV infection prevalence in Angola was 3.7% of adult population

while, there is no data about HTLV infection in the country. The aim of this work was: (1)

to investigate the type of HIV virus and the presence of HIV/HTLV co-infections in HIV

seropositive individuals from Angola and (2) to determine the virus subtypes. Blood

samples were collected, in 2006, from 200 HIV positive individuals of Esperança

Hospital in Luanda. These samples were screened for the presence of HTLV antibodies

resulting in 5% (10/200) of reactivity. The HIV molecular typing was performed, in

60/200 samples, including those HTLV reactive, using PCR targeting the HIV-1 and HIV-

2 protease gene. Fifty three samples were HIV-1 positive and, from this group, ten

(16%) were co-infected with HIV-2. The HIV-1 genetic subtype was determined by

sequencing the env (gp41) and protease (prt) genes. We found a HIV-1 high genetic

diversity. The predominant subtypes considering the two regions prt/env, from 37

samples, were: F1 (19%, n=7), G (10.8%, n=4), C (10.8%, n=4), A1 and D (2.7%, n=1).

Discordant subtype classifications were found in 20 (56.7%) samples. These were

twelve different recombination patterns prt/env: AG/G (10.8%), D/G (8.1%), AG/A1,

G/A1 and F/C (5.4%) and F/D, F/AE, F/GA, B/H, G/H, AG/H, J/? represented by 1

sample each. The HIV-2 present in the co-infections (10 samples) belonged to HIV-2A

subtype; it was defined by sequencing the protease gene. In order to type the HTLV, a

segment of Tax region was amplified and sequenced, revealing the presence of HTLV-

1. Based on the sequences of LTR and p12 gene, it was showed that HTLV-1 from this

sample belonged to subtype Cosmopolita/Transcontinental (1aA), the determinant of

HTLV pandemic. By the first time, was showed and characterized the HIV-2 and HTLV

virus circulating in Angola.

Lista de ilustrações

Pág.

Figura 1: Representação esquemática da Partícula viral dos retrovirus HIV-1 e

HTLV-1.

Figura 2: Representação esquemática do ciclo de vida dos retrovirus. 3

Figura 3: Chimpanzé da subespécie Pan troglodytes troglodytes e Macaco de

espécie Sooty mangabey .

Figura 4: estrutura do Genoma do HIV-1 e 2 7

Figura 5: Tipos de HIV e subtipos genéticos do HIV-1 do grupo M (A-K). 7

Figura 6: Distribuição Mundial do HIV. 11

Figura 7: Esquema da estrutura do genoma do HTLV-1 15

Figura 8: Co-infecções HTLV-1 e HIV. 16

Figura 9: Mapa da África 20

Figura 10: RFLP da região tax do HTLV 31

Figura 11: Alinhamento da região Tax do HTLV 32

Figura 12: Agrupamento genético da região LTR do HTLV-1 34

Figura 13: Agrupamento genético da Protease do HIV-1 37

Figura 14: Agrupamento genético da gp41 do HIV-1 38

Figura 15: Agrupamento genético da Protease do HIV-2. 41

Figura 16: Análise da presença de posições de mutações associadas à

resistência aos inibidores de Protease do HIV-1

Figura 17 (anexos) – Agrupamento genético da seqüência da gp41 56

Lista de tabela

Pág.

Tabela 1: HTLV na África. 21

Tabela 2: Lista de iniciadores utilizados nas reações de PCR. 29

Tabela 3 – Prevalência dos subtipos genéticos, considerando 37 amostras

com informações na Protease e gp41.

Tabela 4 – Subtipos genéticos por região: Protease e gp41. 40

Tabela 5 – Co-infecções HIV-1/2 e HIV-1/HTLV. 42

Tabela 6 - Resultado da Genotipagem da Protease e gp41 do HIV-1, por

diferentes ferramentas.

xii

Lista de abreviaturas, Siglas e símbolos

AIDS Síndrome de Imunodeficiência Adquirida

AVA-1 Enzima de restrição

ºC Graus Celsius

AZT Zidovudina

CA Capsídio

CDC Centro de Controle e Prevenção de Doenças

CPLP Comunidade dos Países de Língua Portuguesa

CRF Forma Recombinante Circulante

DNA Ácido Desoxiribonucleico

dNTP Deoxinucleotídeo Trifosfato

ELISA Ensaio Imunoenzimático

EDTAK3 Ácido Etileno Diamino Tetra Acético com potássio

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz

Hinf-1 Enzima de restrição

HIV Vírus da Imunodeficiência Humana

HTLV Vírus T Linfotrópico humano

IN Integrase

INTR Inibidores Nucleosídicos da Transcriptase Reversa

INNTR Inibidores Não-Nucleosídicos da Transcriptase Reversa

IOC Instituto Oswaldo Cruz

IP/PI Inibidor de Protease

K2P Kimura 2 Parâmetros

LGMM Laboratório de genética Molecular de Microorganismos

LAV Vírus associado à Linfadenopatia

MA Matriz

mM Milimolar

mRNA RNA mensageiro

ul Microlitros

Mgcl

Cloreto de Magnésio

NC Nucleocapsídeo

ng nanograma

NJ Neighbor-Joining

nm nanometro

nt Nucleotídio

pb Pares de bases

NVP Nevirapina

Pág Página

PR Protease

PTLV Vírus T Linfotrópico de Primatas

RDC República Democrática do Congo

Refª Referência

RFLP Restriction fragment lenght polymorphism /Polimorfismo do

comprimento do fragmento de DNA

RNA Ácido Ribonucléico

TR Transcriptase Reversa

PCR Reação da Polimerase em Cadeia

3TC Lamivudina

xiii

Índice

Pág.

1– Introdução 1

1.1 - Classificação e características gerais dos retrovirus 1

1.2 – Ciclo de replicação dos retrovirus 3

1.3 – Vírus da imunodeficiência humana (HIV) 4

1.3.1 – Histórico do HIV 4

1.3.2 – Origem do HIV 5

1.3.3 – Organização genômica do HIV 6

1.3.4 – Epidemiologia Molecular do HIV 7

1.3.5 – Diversidade do HIV na África 12

1.4 – Vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV) 13

1.4.1 – Histórico do HTLV 13

1.4.2 – Origem do HTLV 13

1.4.3 – Organização genômica do HTLV 14

1.4.4 – Epidemiologia Molecular do HTLV 15

1.5 – 1.7 – Co-infecções HIV/HTLV e HIV-1/HIV- 16

1.6 – HIV em Angola 18

1.7 – Diversidade do HTLV na África e atual situação em Angola 21

2 – Objetivos 22

2.1 – Objetivo Geral 23

2.2 – Objetivos Específicos 23

3 – Materiais e métodos 24

3.1 – Casuística 24

3.2 – Diagnóstico sorológico da infecção pelo HIV 24

3.3 – Logística e transporte das amostras 24

3.4 – Detecção sorológica do HTLV nas amostras HIV positivas 25

3.5 – Extração de ácido nucléico-DNA 25

3.6 – Teste de ausência de inibidores de PCR 25

3.7 – “Nested” e tipagem do HTLV 26

3.8 – Subtipagem do HTLV-1 27

3.9 – PCR para tipagem do HIV – “nested PCR” 27

3.10 – Subtipagem do HIV pelo env 28

3.11 – Seqüenciamento dos amplicons 28

3.12 – Análise genética das seqüências do HIV e HTLV 28

3.13 – Resistência primária no gene da Protease das amostras do HIV-1 29

4 – Resultados 30

4.1 – Sorologia para o HTLV-1/2 30

4.2 – Tipagem do HTLV 30

4.3 – Sutipagem do HTLV-1 33

4.4 – Tipagem e Subtipagem do HIV 35

4.5 – Caracterização genética do HIV-2 40

4.6 – Co-infecções 42

4.7 – Mutações de resistência associadas aos diferentes subtipos 43

5 – Discussão 45

6 – Conclusões 53

7 – Anexos 54

8 – Referências bibliográficas 57

1 – INTRODUÇÃO

Os retrovírus, HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana) e HTLV (Vírus

Linfotrópico das Células T Humana), compartilham características genéticas, biológicas,

ecológicas e histórias evolutivas. Ambos emergiram como parasitos humanos na África,

em conseqüência da transmissão do vírus de primatas não humanos, SIV (Vírus da

Imunodeficiência dos Símios) e STLV (Vírus Linfotrópico das Células T dos Símios)

para humanos (Vandamme & Desmiter, 1998; Van dooren, 2005; Sharp et al., 2000;

Korber et al., 2000, Keele et al., 2006). Evidências apontam que o HTLV seja um vírus

ancestral e que esteja interagindo com os humanos há milhares de anos enquanto que,

o HIV foi introduzido nos humanos em 1940 (+/- 15-16 anos) (Korber et al., 2000;

Salemi et al, 2001; Sharp et al., 2001; Lemey et al., 2003). Possivelmente, em

conseqüência destes distintos tempos de interação com o hospedeiro, é que tenhamos,

como cenário atual, o HIV como um patógeno agressivo, agente etiológico da síndrome

da imunodeficiência adquirida (AIDS), que evolui, na maioria dos infectados sem

tratamento, para a morte. Por outro lado, apenas a minoria dos portadores do HTLV

evolui para as doenças associadas à infecção, sendo que a síndrome neurológica, que

é a prevalente, é uma doença crônica que, apesar de causar sérios comprometimentos,

não leva necessariamente à morte (Hisada et al., 1990; Olindo et al., 2005).

1.1 – Classificação e características gerais dos retrovirus

O HTLV e o HIV são membros da família Retroviridae e pertencem ao gênero

Deltaretrovirus e Lentivirus respectivamente.

Os retrovírus são envelopados, possuem um genoma diplóide, consistindo de

duas moléculas idênticas de RNA fita simples (Coffin et al., 1995) e a transcriptase

reversa (TR) que é uma enzima DNA polimerase RNA dependente, cuja função é

retrotranscrever o RNA (genoma viral) em DNA, o que permite sua integração no

genoma da célula do hospedeiro. Estudos de microscopia eletrônica indicam que a

partícula viral madura tem estrutura icosaédrica, um poliedro com 20 triângulos

eqüiláteros e 12 vértices (Nakai e Goto, 1996). Possuem aproximadamente 100nm de

diâmentro e uma proteína interna do core envolvido pelo envelope que é uma bicamada

lipídica na qual estão inseridas as glicoproteínas de superfície, representadas por SU e

TM na figura 1. No core estão contidas diversas cópias de trancriptase reversa (RT),

protease (PR) e integrase (IN) ligadas a duas moléculas de RNA fita simples. A

estrutura esquemática do vírus pode ser observada na Figura 1, que representa

simultaneamente o esquema de dois retrovirus (HIV-1 e HTLV-1).

Figura 1 - Representação esquemática da partícula viral dos retrovirus HTLV-1/ HIV-1.

Nas colunas os genes associados as respectivas proteínas/estruturas. (NC)

nucleocapsídio; (CA) proteínas do capsídio, imediatamente interna ao envelope viral;

(MA) as proteínas da matriz que forram internamente o capsídio viral; (PR) Protease;

(RT) transcriptase reversa; (IN) integrase; (SU) proteína de superfície; (TM) proteína

transmembrana. Adaptado de: (www.monografias.com

. /Image1331).

1.2 - Ciclo de Replicação dos Retrovirus

As etapas do ciclo de replicação comum aos retrovírus podem ser divididas em

diferentes etapas (Figura 2): 1) ligação do vírus a receptor específico da superfície

celular; 2) penetração do nucleocapsídeo na célula; 3) transcrição reversa, em que o

RNA se transforma em DNA; 4) passagem do DNA ainda associado às proteínas virais

até ao núcleo da célula; 5) integração do DNA proviral ao DNA celular; 6) síntese do

RNA viral pela RNA polimerase celular utilizando o DNA do provírus como molde; 7)

processamento do RNA transcrito em genoma e mRNA (RNA mensageiro); 8) síntese

de proteínas virais; 9) Processamento das proteínas do capsídeo; 10) montagem e

brotamento dos virions (Alan et al., 1987; Coffin et al., 1990; Hanada et al., 1985).

Figura 2 – Representação esquemática do ciclo replicativo dos retrovirus. Adaptado de:

Santos et al., 2005 (www.scielo.br/jbpm/v41n2/08

fig01)

Ao contrário do HIV, o HTLV-1 existe predominantemente como provirus

podendo ser transmitido como tal (Bangham, 2003). Em alguns casos células

naturalmente infectadas não produzem vírus. Por esta razão a carga viral no plasma é,

muitas vezes, indetectável. A infecção de novas células pelo vírus presume a existência

de um receptor celular que até hoje não foi identificado, todavia partículas virais podem

infectar novas células através de sinapses (Igakura et al., 2003). É presumido que na

infecção precoce a maioria de novas células com HTLV-1 sejam infectadas pelas

partículas virais. Nos estágios mais avançados, quando o equilíbrio entre a replicação

viral e a resposta imune é estabelecido, o HTLV-1 se expande por expansão clonal

dependente da mitose das células do hospedeiro contendo o provírus (Tanaka et al.,

2005). Esta multiplicação do HTLV-1, dependente de mitose, contribui para a sua

estabilidade genômica (Van Dooren et al., 2004).

1.3 – Vírus da imunodeficiência humana (HIV)

1.3.1 – Histórico do HIV

Os primeiros relatos de AIDS foram no início da década de 80. Homossexuais e

usuários de drogas injetáveis nos Estados Unidos da América com pneumonia por

Pneumocystis carini, candidíase extensa e um tumor raro denominado Sarcoma de

Kaposi (Gottlieb et al., 1981). Coincidentemente todos estes pacientes apresentavam

um quadro de imunodeficiência celular severa. Foi então introduzido o termo SIDA ou

do inglês AIDS (Síndrome de Imunodeficiência Adquirida) para definir clinicamente as

várias manifestações deste quadro que no final de 1982 foi registrada também em

pacientes hemofílicos, pacientes com história de transfusão e crianças nascidas de

mães contaminadas (CDC, 1982).

Em 1983 é sugerida a participação de um retrovírus, inicialmente denominado

LAV (Vírus Associado à Linfadenopatia) e após a observação de atividade da enzima

transcriptase reversa em cultura de células de linfonodos de um paciente com

linfoadenopatia, característica semelhante ao HTLV-I e II, foi denominado HTLV-III

(Barre-Sinousi et al., 1983 e Popovic et al, 1984).

Em 1986, o vírus foi classificado como um membro distinto da família

Retroviridae, os Lentivirus, os quais estão associados a infecções com longo período de

latência clínica, e adotou-se a terminologia HIV (Coffin et al., 1986).

1.3.2 - Origem do HIV

A AIDS está reconhecida como uma zoonose tendo sido introduzidos dois tipos

de vírus na população humana, HIV-1 e HIV-2 (Hanh et al., 2000; Sharp et al., 1995,

1999).

O HIV do tipo 1 se originou do SIVcpz (vírus da imunodeficiência símia do

chimpanzé) que infecta a subespécie Pan troglodytes troglodytes (Figura 3). A análise

genética de seqüências do HIV-1 grupo (M e N) e SIVcpz, sugerem que estes grupos

representam duas distintas transmissões a partir dos chimpanzé (Sharp et al., 2000;

Korber et al., 2000, Keele et al., 2006). O grupo M do HIV-1 é mais relacionado ao SIV

do Pan troglodytes troglodytes. O grupo N consiste em regiões genômicas com

cordância filogenética com respeito ao grupo M e SIVcpz, o que sugere eventos de

recombinação entre estes vírus (Gao et al., 1999; Hahn et al, 2000), sendo mais

provável ter se originado também do Pan troglodytes troglodytes (Keele et al 2006).

Ainda não há clareza quanto a história evolutiva do HIV do grupo O. O SIV mais

relacionado ao HIV do grupo O, foi recentemente isolado de gorilas da subespécie

Gorila gorila e é mais provável que assim como os humanos tenha sido adquirido do

Chimpanzé Pan troglodytes troglodytes (Van Heuversswyn et al., 2006). Calcula-se que

a introdução do HIV-1 do grupo M na população humana tenha se dado em 1930+/- 15

anos, na República Democrática do Congo, África Central (Salemi et al, 2001; Sharp et

al., 2001).

Já o HIV-2 se originou do SIVsm (vírus símio do macaco da espécie Sooty

mangabey (Figura 3) (Kuiken, et al., 2001) e foi introduzido nos humanos em 1940+/-16

anos (subtipo A) e 1945+/-15 anos (subtipo B), na Guiné-Bissau, oeste da África

(Lemey, et al 2003).

Figura. 3 – Chimpanzé da subspécie Pan troglodytes troglodytes (à esquerda) e

macaco da espécie Sooty mangabey (à direita).

1.3.3 – Organização genômica do HIV

O genoma viral é constituído de aproximadamente 10 kb, (Alizon et al., 1994)

apresentando 3 genes estruturais (Gag, Env e Pol) e seis genes acessórios e ou

regulatórios da replicação viral (Vif, Tat, Nef, Vpr, Rev e Vpu (ou Vpx no HIV-2)

(Guyader, 1987). O provírus é flanqueado por duas longas regiões repetidas (Long

Terminal Reapets - LTR) (O´Reilly et al., 1995, Varmus, 1988), onde encontram-se

também fases abertas de leitura que codificam para proteínas transativadoras da

replicação viral (Frankel & Young, 1999) (Figura 4).

Figura 4 – Esquema da organização dos genomas do HIV-1 e HIV-2. Adaptado de:

www.aids.havard.edu/research/discoveries.htlm.

1.3.4 – Epidemiologia Molecular do HIV

O HIV-1 possui três grupos principais: M (“major”), grupo O (“outlier”) e N (“new”)

(Figura 5) (Gultlier et al., 1994; Robertson et al., 2000). O grupo M do HIV-1 é o mais

prevalente no mundo (Yamaguchi et al., 2002; Yamaguchi et al., 2004) correspondendo

por 99.6% do total de infecções por HIV. Encontrando-se descrito em nove subtipos

genéticos de A-K (A, B,C.D,F,G,H,J e K), quatro sub-subtipos A (A1-A4) (Gao et al.,

2001; Meloni et al., 2004) dois sub-subtipos F (F1-F2) (Triques et al., 2000) e formas

recombinantes entre diferentes subtipos denominados CRFs (do inglês circulating

recombinants forms ou forma recombinante circulante) (Figura 5).

A1 – A4 F1 – F2

,C,D,E,F

Figura 5 – Tipos de HIV, grupos e subtipos genéticos do HIV-1 e do HIV-2 (Los Álamos

database, 2008, http:/www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs.html

Eventos de recombinação entre genomas de diferentes subtipos geram vírus

mosaicos que podem ser fixados na população humana (Mc Cutchan, 2000). Duas

denominações existem para as formas recombinantes do HIV-1: a forma recombinante

circulante (CRF) e a forma recombinante única (URF) (Thomson, et al., 2002). Formas

recombinantes identificadas em três ou mais indivíduos não epidemiologicamente

relacionados, são designadas CRFs. Recombinantes de diversos subtipos do HIV-1

compondo a estrutura de único mosaico têm sido identificadas em um único indivíduo

ou indivíduos epidemiologicamente relacionados são denominadas formas

recombinantes únicas (URFs) (Thomson, et al., 2002; McCutchan, 2000).

Atualmente pelo menos 43 CRFs foram descritas no mundo (Los Alamos, 2008),

sendo a CRF02_AG reponsável pelo maior número de infecções (Heyndrickx et al.,

2000; Osmanov et al., 2002). A maioria das URFs foram detectadas em regiões onde

múltiplos subtipos e CRFs co-circulam (Mandal et al., 2002; Takehisa et al., 1999). A

primeira CRF identificada foi a CRF01_AE na Tailândia em indivíduo heterossexual

usuário de droga intravenosa. Mosaico de genoma de CRFs contendo seqüências de

mais de dois subtipos são nomeados “cpx” denotando o complexo (Kostriks et al 1995;

Papa et al., 1998).

No grupo O do HIV-1, encontram-se isolados virais divergentes e não

classificados em subtipos (Nkengasong et al.; 1994; Jaffe & Schochetman, 1998) e

pertencem a 5 agrupamentos filogenéticos designados de I à V (Yamaguchi et al., 2002;

Yamaguchi et al., 2004). As proteínas dos genes env dos grupos M e O apresentam

uma variação de 30% (Spira et al., 2003). Os vírus do grupo N revelaram um perfil

intermediário entre os grupos M e O (Simon et al., 1998; Gao et al., 1999).

Os isolados do HIV-2 podem ser classificados em pelo menos 6 subtipos

genéticos de A-F. Todos em conseqüência de distintas passagens de vírus de macacos

para humanos

A distribuição do HIV-1 no mundo é bastante heterogênea (Figura 6). Mais de

70% de todas as infecções pelo HIV-1 são encontradas na África Sub-Sahariana. O

subtipo de maior prevalência no mundo é o C, circulando principalmente no Sul e este

da África e Índia (Kandathil et al., 2005), representando 48% das infecções pelo HIV-1

(Alaeus., 2000). Em contraste, o subtipo B, circula principalmente em países da Europa

e das Américas, porém, representa somente 12% das infecções a nível global

(Osmanov et al., 2002). O subtipo A, que apresenta uma diversidade intra-subtipo de

20%, encontra-se distribuído em toda a África e na Rússia (Bobkov et al., 2004).

Considerando a forma recombinante CF02_AG, o subtipo A é estimado como o

segundo subtipo mais freqüente (27%) na pandemia do HIV (Osmanov et al., 2002). O

subtipo D é mais freqüentemente encontrado na África (Jassens et al., 1997).

A extrema variabilidade genética do HIV-1 co-circulantes na África Central

sugere a origem da pandemia nesta região geográfica (Vidal et al., 2000). Com o

crescimento da migração das populações entre os países e a globalização, no mínimo

25% de novas infecções na Europa são presentemente de subtipos não-B Africanos e

variantes Asiáticas (Wainberg, 2004). Estudos mais avançados mostram que os

subtipos do grupo M do HIV-1 espalhados pelo mundo, resultaram da exportação de

cepas da República Democrática do Congo (Archer and Robertson., 2007). Em

contraste com o grupo M, o grupo O do HIV-1, é responsável por somente 1% das

infecções pelo HIV ao longo das províncias do norte dos Camarões (Yamaguchi et al.,

2006). Todos em conseqüência de distintas passagens de vírus de macacos para

humanos. O HIV-2 é predominantemente encontrado no Oeste da África (Kandathil et al

2005), e em escala menor na Índia, contribuindo, todavia, com 45% dos casos de

infecção pelo HIV, observados em Portugal e alguns na França, entre indivíduos de

origem Africana (Soriano et al., 2000; Damond et al., 2001). Os dois subtipos mais

prevalentes do HIV-2 são A e B. A maioria dos HIV-2 caracterizados, em estudos em

países do oeste da África, são do subtipo A (Xiang et al 1997; Sarr et al, 2000; Heredia

et al, 1998). O Grupo B parece ser mais geograficamente limitado, tendo sido mais

encontrado em Abdijan, Costa do Marfim, França e Portugal (Bennan et al, 1997;

Pieniazek et al 1999, Soriano et al, 2000; Damond et al, 2001). Os grupos C, D, E e F

foram designados baseados na análise de seqüências parciais do genoma. Grupos C e

D foram identificados na Libéria e E e F na Serra Leoa (Gao et al, 1994, Chen et al

1997). Um último subtipo H foi identificado em um paciente do sexo masculino da Costa

do Marfim (Damond et al., 2004).

Figura 6 – Distribuição do HIV no mundo (Ariën et al. Nature Reviews Microbiology 5

(February2007)doi:10.1038/nrmicro1594)

Figura 9 - Mapa da África, a seta indica a localização de Angola na África. Mapa de

Angola: (HIV-1) - % de infecções pelo HIV-1, (HIV-2/HIV-1) – % de co-infecções, (HIV-

1/2) - % de infecções pelo HIV-2. (?) – sem informação. informações com base no

estudo de 2004/2005.

1.3.5 – Diversidade do HIV na África

Na África Central, numerosos estudos têm mostrado a extensa diversidade genética do

HIV-1 do grupo M na República Democrática do Congo (RDC – ex Zaíre), a alta

diversidade intra-subtipo, recombinantes e cepas não classificadas, são consistentes

com o perfil de uma epidemia antiga, sugerindo esta região como epicentro do HIV-1 do

grupo M (Vidal et al., 2000), mostrando predominância dos subtipos G (ambas G puro e

CRF02_AG) e A (Figura 6). No Burundi há predominância do subtipo C e D (Ranjbar et

al., 1995, Koch et al., 2001). Rwanda tem predominantemente subtipo A, C e

recombinantes A/C (Gao et al., 1994; Costello et al., 1999; Roman et al., 2002).

Camarões é caracterizado por extensa variabilidade genética e pela presença dos três

grupos do HIV-1 (M, O e N), CRF01_AE e CRF02_AG, bem como a presença de outras

recombinantes (Heyndrickx et al., 2000; Morison et al., 2001; lasky et al., 1997; Holguin

et al., 2002). Este país é considerado o epicentro do HIV-1 do grupo O (Fonjungo et al.,

2000; Yamaguchi et al., 2002). Já foram relatados isolados recombinantes inter-grupos

(M e O) em pacientes camaronianos (Takehisa et al., 1999). Na Guiné Equatorial

fronteiras ao norte dos Camarões circulam diferentes subtipos do grupo M e O (Ortiz et

al., 2001). HIV-1 do grupo O (Peeters et al., 1997) e subtipo B (Lasky et al., 1997)

subtipo G, CRF02_AG e subtipos A, D e H são encontradas no Gabão (Montavon et al.,

2002; Pandrea et al., 2002; Delaporte et al., 1996). Na Nigéria foi identificado HIV-1 do

grupo O e HIV-2 (Peeters et al., 1997). A CRF02_AG (protótipo IbNG) foi primeiramente

caracterizada em amostras de Ibijan, Nigéria. Subtipos A e G são responsáveis pela

epidemia e em menor proporção ocorrem outros subtipos tais como C, J e não

classificáveis (Agwale et al., 2002), bem como mosaicos A/G/J (Montavon et al., 2002)

(Figura 6).

No Oeste da África foi demonstrado que o HIV-1 e HIV-2 co-circulam no Benin

(Gallin et al., 1993; Fourn and Duci., 1996), no Burkina Faso (Prazuck et al., 1995),

Costa do Marfim (Evans et al., 1988), Ghana (Chang et al., 2002), Gâmbia (Schim Van

Der Loeff et al., 2002), Senegal (Sarr et al., 2000), Mali (Peeters., 1998), Mauritânia

(Baidy Lo et al., 1993), Serra Leoa (Chen et al., 1997). E há predominância do HIV-1 do

subtipo A, G e CRF02_AG assim como, ocasionalmente, outros subtipos (B, C e D)

(Lasky et al., 1997) (Figura 6).

1.4 - Vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV)

1.4.1 - Histórico do HTLV

A descoberta do HTLV (Poiesz et al.,1980) é anterior a do HIV e o conhecimento

sobre sua biologia facilitou a identificação do HIV (Barre-Sinoussi et al, 1983).

O HTLV havia sido associado à leucemias e linfomas de células T do adulto em

1977, no Japão por Takatsuki e cols. No entanto foi descoberto e descrito, dois anos

mais tarde, em 1979, por Bernard J. Poiesz em um paciente com leucemia cutânea de

células T do adulto, no Instituto Nacional do Câncer (EUA). Em 1982, foi isolado a partir

de linhagem celular contínua, obtida de células do pâncreas de pacientes com uma

variedade de tricoleucemia, outro tipo de HTLV, o HTLV-2 (Kalyanaraman et al., 1982).

Em 1986, Osame e cols relataram a associação da sorologia para o HTLV-1 com

mielopatia e, em 1989, Roman e Osame constataram ser a já conhecida paraparesia

espástica tropical.

Os estudos iniciais envolvendo o HTLV eram restritos a exame de pacientes

infectados (Poiesz et al., 1980), a expressão de genes, principalmente tax (Slamon

1984, 1985), e a caracterização de linhagens de células infectadas pelo vírus (Poiesz et

al., 1981; Seiki et al., 1983). Esses estudos foram fundamentais para o entendimento da

biologia e patogênese do vírus. Subsequentemente análises de deleções, mutações

pontuais e mudanças nos domínios dos genes, permitiram aos pesquisadores definir o

número de proteínas codificadas (Albrecht and Lairmore, 2002; Nicot et al., 2005).

1.4.2 – Origem do HTLV

Autores sugerem que ocorreu uma transmissão inter-espécies a partir de

primatas não humanos para humanos na África e Ásia (Mahieux et al., 1997).

Investigações em primatas não humanos, identificaram a presença de vírus linfotrópicos

de células T dos símios do tipo 1 (STLV-I) em pelo menos, 19 espécies de primatas na

África e Ásia, enquanto que o STLV-2 estaria restrito a uma espécie de macaco da

África Central (Mahieux, 2000). Considerando estes achados e a não existência de

macacos do Novo Mundo, com sororeatividade e a distribuição geográfica atual do

HTLV nas populações humanas, determinou-se que o HTLV-2 seria um vírus ancestral

que tem estado presente nos humanos desde as migrações, a partir da África/Ásia, que

levaram ao povoamento das Américas via o estreito de Bering entre 10.000-40.000

anos atrás (Salemi et al., 1999). Enquanto que, o HTLV-1 teria se espalhado pelo

mundo através das migrações das populações africanas e asiáticas que ocorreram

tanto no passado, mas principalmente no intenso tráfico de escravos para as Américas,

a partir do século XVI e as migrações japonesas na década de 60 (Slaterry et al 1999).

Devido a suas semelhanças moleculares e relações filogenéticas o HTLV e

STLV, também são referidos como vírus linfotrópicos de células T de primatas (PTLV)

(Salemi et al., 1998). Mais de 25 espécies de primatas não humanos (NHP) são

infectados com vírus linfotrópicos de células T dos símios do tipo 1 (Koralnik et al.,

1994; Saksena et al., 1994; Ibrahim et al., 1995; Voevodin et al., 1996, 1997; Liu et al.,

1997; Mahieux et al., 2000; Nerrienet et al., 2001; Meertens et al., 2001). Seus habitats

naturais estão na África sub-Saariana e Ásia: da Índia ao Arquipélago da Indonésia e

Japão. Cada subtipo do HTLV resultou de transmissões independentes de símios para

humanos em suas respectivas regiões geográficas ao longo dos anos (Liu et al., 1996;

Salemi et al., 1998).

Um conjunto de evidências apontam para a origem do HTLV na África, (Mahieux

et al., 2000; Nerrienet et al., 2001; Meertens et al., 2001) A África é o único continente

onde todos os diferentes vírus linfotrópicos de células T de Primatas têm sido

encontrados. Estudos filogenéticos apontam a África como berço do PTLV (vírus

linfotrópico de células T de primatas) (Vandamme et al., 1998).

Os HTLV-1 e 2 são endêmicos em algumas áreas geográficas e entre alguns

grupos étnicos (Blattner et al., 1990). Porém a infecção pelo HTLV-1 está atualmente

presente em todo o mundo.

1.4.3

– Organização genômica do HTLV

O HTLV apresenta o genoma com cerca de 9Kb e com as seguintes regiões: O

genoma viral é flanqueado pelas LTR (repetições terminais longas) que desempenham

papel fundamental na integração ao genoma da célula hospedeira (Figura 7); Gag,

codifica para as proteínas do capsídeo viral; pol, codifica para as enzimas: transcriptase

reversa, protease e integrase e Env, que codifica para as proteínas do envelope. Como

característica partícular apresenta uma região denominada px, que codifica várias

proteínas reguladoras da expressão e replicação viral, sendo as mais estudadas Tax e

Rex (Felber et al., 1985).

Figura 7 – Esquema da estrutura do genoma do HTLV-1. Adaptado de: Cloyd

(gsbs.utmb.edu/microbook/images/ch062.htm)

1.4.4 – Epidemiologia Molecular do HTLV

Os subtipos genéticos do HTLV são definidos considerando a variabilidade

genética da região LTR.

Análises genéticas classificam o HTLV-1 em quatro principais grupos que

apresentam diferentes distribuições geográficas: Cosmopolita (subtipo 1a) espalhado

em todo o mundo, África Central (subtipo 1b), Melanesio (subtipo 1c) e subtipo 1d que

foi identificado na República dos Camarões e Centro Africana (Mahieux et al, 1997). O

subtipo Cosmopolita, é sub-classificado nos tipos genéticos: 1aA/Transcontinental;

1aB/Japonês; 1aC/Caribe e Oeste da África e 1aD/Norte da África. O HTLV-2 possui

quatro subtipos genéticos: 2a e 2b distribuídos entre os usuários de drogas

endovenosas de todo o mundo e grupos étnicos das Américas; 2c presente em grupos

indígenas e regiões urbanas do Brasil e 2d em pigmeus do Congo (Eiraku et al., 1996).

Até recentemente, somente HTLV-1 e HTLV-2 haviam sido identificados em

humanos. Em 2005, dois grupos independentes, identificaram a ocorrência de um

terceiro tipo, HTLV-3, em Camaroneses (Colattini et al., 2005 e Wolfe et al., 2005).

HTLV-3 é geneticamente relacionado com cepas do STLV-3 identificadas em várias

espécies de macacos nos Camarões. A organização genômica do HTLV-3 e STLV-3

são similares à dos outros HTLVs exceto que, não possuem uma das três repetições de

21pb presentes no LTR que interagem com a proteína reguladora Tax. Todavia esta

configuração parece não alterar a transcrição dos PTLV-3 (Chevalier et al., 2005, 2006).

1.5 - Co-infecções HIV/HTLV e HIV-1/HIV-2

HIV e HTLV compartilham as mesmas rotas de transmissão (sexual, parenteral e

vertical), em conseqüência co-infecções por estes dois agentes são comuns (Figura 8)

em certas áreas do mundo, assim como é relatado que tais interações podem modificar

as propriedades biológicas de ambos os vírus (Szabo et al., 1999; Daisley et al., 1999)

e parecem ser um co-fator de mortalidade entre pacientes HIV infectados (Brites et al.,

2001).

Figura 8 – Co-infecções HTLV-1 e HIV (fonte: www.commons.wikimedia.org/wiki:image

HTLV-1 and HIV).

As viroses pelo HIV-1 e 2, podem causar imunodeficiência e AIDS em

indivíduos infectados (Markovitz., 1993) e possuem sinais clínicos indistinguíveis

(Martinez-Steele et al., 2007).

HIV-1 e HIV-2 usam os mesmos receptores, co-receptores e população de

células alvo no hospedeiro. Isto enraíza a possibilidade de que os dois vírus possam

interagir um com outro em duplas infecções. Foi relatado que o HIV-2 interfere com a

expressão do HIV-1 à nível de transcrição por competir com a ligação da proteína

viral tat (Browning et al., 1999). Proteínas do HIV-1 podem empacotar RNA do HIV-2,

mas o contrário não acontece. Boyko et al.(2006), mostraram que proteínas Gag do

HIV-1 e HIV-2 podem ser agrupadas na mesma partícula viral e se complementam

nas suas funções, e tais partículas virais “mistas” podem ser infecciosas. Duas

conseqüências podem advir daí: a ocorrência da facilitação da replicação viral,

ajudando a expansão do vírus, (apesar de que, nem sempre tais interações são a

favor da replicação do vírus), outra conseqüência seria a pseudotipagem (mistura de

fenótipos) e recombinação. Genomas recombinantes HIV-1/HIV-2 não foram

relatados (Curlin et al., 2004). Todas as regiões que têm epidemia do HIV-2, também

têm prevalência de infecções pelo HIV-1 e aproximadamente 1 milhão de pessoas

estão duplamente infectadas pelo HIV-1 e HIV-2 (Arien et al., 2005; Kannangai et al.,

2003). Todavia muito pouco é conhecido sobre interações entre esses vírus.

1.6 – HIV em Angola

Angola está localizada no sudoeste da África sub-Saariana (Figura 9) e registrou

o primeiro caso de AIDS, em 1985, quando a infecção por HIV caracterizava-se

principalmente pela transmissão homossexual e havia relatos de transmissão por via

sanguínea (CDC, 1982). Estudo de 2005 mostra que, a soroprevalência geral no país

era de 3.7%, considerando uma população de aproximadamente 16 milhões, enquanto

que nos países vizinhos as prevalências da infecção são: República Democrática do

Congo 3,2% da população adulta, Zâmbia 17% e Namíbia 19,6% em 2005

(www.who.org

, countries, HIV epidemiological fact sheet/2003-2005).

São poucos os trabalhos sobre a epidemiologia molecular do HIV-1 em Angola.

Referência da alta variabilidade genética do HIV-1 em Angola foi do estudo em

Portugal, onde foi encontrada alta prevalência de subtipos não B (49.8%), entre

imigrantes africanos. Os imigrantes Angolanos (25/205) estavam infectados com todos

os subtipos documentados no estudo (B, G, A, F, C, D, H e J), (Esteves et al., 2002).

Em um estudo publicado em 2005, com o objetivo de determinar as variantes

genéticas do HIV-1, circulantes na região Norte de Angola, foram analisadas 37

seqüências pol, originadas de pacientes da capital Luanda e Cabinda, uma província ao

norte do país que faz fronteira com República do Congo Brazzaville, sendo identificados

vários subtipos (alta diversidade genética). O resultado mostra predominância do

subtipo F (18,9%), seguido do subtipo C (16,2%), entretanto foram identificados

também subtipos D (10,8%), A (5,4%) e G e H (2,7%) e ainda 13 seqüências

recombinantes (Abecasis et al., 2005).

Outro trabalho publicado em 2005, onde foram analisadas as regiões gag e/ou env do

HIV-1 de 48 amostras, coletadas em 2001, de pacientes que vivem nas mesmas

regiões do trabalho anterior. Foram identificados os seguintes subtipos: A1 (18

amostras, 38%), C (7amostras, 15%), H (5 amostras, 10%), J (3 amostras, 6%), G

(2,4%), A2 (2.4%), F1 (1,2%) e D (1,2%) e 5 diferentes formas recombinantes gag/env,

tais como: A1/H (3,6%), A1/G (1,2%), C/A2 (1,2%), F1/B (1,2%), G/B (1,2%) e G/H

(1,2%). Foi relatado que A1/H encontrada representa uma nova CRF (Bártolo et al.,

2005). Em recente trabalho, dos mesmos autores, mas com amostra expandida,

coletadas também no ano de 2001 (~150 indivíduos), analisando as regiões: Gag (P17),

Pol (protease e transcriptase reversa) e Env (C2C3), foram identificados os subtipos: A1

(8,8%), A2 (4,4%), A3 (0.6%) C (11,3%), D (5%), F1 (8,2%), G e H (5,7%) (Bártolo et

al., 2008).

Com relação ao HIV-2, um estudo sorológico mostrou a infecção pelo HIV-2 em 3

Angolanos residentes em Portugal, (Saal et al 1997). Outro estudo sorológico, utilizando

soros coletados em 1985, nas províncias do Zaire, Lunda-Norte, Luanda, Huambo e

Namibe revelou prevalência de 8.4% e a co-infecção com HIV-1 foi de 2.2% (Santos-

Ferreira et al, 1990). O mais recente estudo sorológico (ELISA e Western-Blot) revelou

que as infecções pelo HIV-2 estão predominantemente em co-infecções com HIV-1,

representando 8.61% das co-infecções pelo HIV-1, enquanto que infecções

monotípicas pelo HIV-2 foram de 0.28%. (Serrano, Instituto Nacional de Luta contra

SIDA de Angola, Anais I Congresso CPLP sobre ITS e VIH/SIDA/2005).

O estudo dos casos diagnosticados em Angola de 1985-2005 indicou que a

principal forma de transmissão do HIV é a heterossexual com 51% dos casos (Arquivo,

Instituto Nacional de Luta Contra a SIDA, Ministério da Saúde de Angola). A taxa de

3.7% do HIV de Angola (2005) é uma das mais baixas quando comparada aos demais

países da África sub-Sahariana. Porém, contrastando com outros países africanos com

altas prevalências para a infecção, os dois estudos publicados sobre o HIV-1 de

Angola, revelaram alto grau de variabilidade genética do HIV-1 do grupo M no país

(Bártolo et al., 2005; Abecasis et al., 2005). Países como Zâmbia, África do Sul e

Moçambique (Bredell et al., 1998, Engelbrecht et al., 1995; Papathanasopoulos et al.,

2002)., que possuem altas taxas de prevalência (WWW.who.org

), mas

predominantemente 1 único subtipo. Os atuais testes de diagnóstico de rotina para a

detecção da infecção pelo HIV em Angola não fazem discriminação entre HIV-1 e HIV-

2. A caracterização molecular do HIV-2 não é conhecida.

Figura 9 - Mapa da África, a seta indica a localização de Angola na África. Mapa de

Angola: (HIV-1) - % de infecções pelo HIV-1, (HIV-2/HIV-1) – % de co-infecções, (HIV-

1/2) - % de infecções pelo HIV-2. (?) – sem informação. informações com base no

estudo de 2004/2005.

Dados Epidemilógicos

16.000000 de habitantes

Taxa de

soroprevalência/2005: 3.7%

HIV-1 – 91,11%

HIV-1/HIV-2 – 8.61

HIV-2 - 0.28

HTLV - ?

1.7 - HTLV na África e atual situação em Angola

Na África, o HTLV-1 é prevalente na população em geral da Guiné-Bissau

(Holmgren B et al., 2003), em pacientes da consulta pré-natal do Ghana (Apea-Kubi KA

et al., 2006). Mulheres grávidas, doadores de sangue do Burkina Faso, Guiné-Bissau

(Collenberg E et al., 2006) e população de áreas rurais dos Camarões (Machuca A et

al., 2005), Gabão (Perret JL et al., 2003) e Foi comprovada sorologicamente e

molecularmente a presença do HTLV-1 (cosmopolita) e 2 em Dakar, Senegal (Diop S et

al., 2006) (Tabela 1).

Tabela 1 – Dados sobre HTLV na África

País População

testada

HTLV-1

Sorologia

HTLV-2

Sorologia

HTLV-1/2

Sorologia

Dados

moleculares

Burkina Faso

MDS 1.4 e 0.5

Ghana

PN: 2.7%,

G: 2.1%

Gâmbia

MF 1.2%

Guiné Bissau

I, PA, MFR,MG I: 7.1%

PA: 3.6%

PA: 1 MFR: 4.3 e

1.1%

MG: 2.6%

10 HTLV-1a e 1

HTLV-1b

Camarões TS, PP, VR TS: 3/332

VR: 49/747

TS: 1/332

VR: 6/747

‘

RDC ex

Zaíre

MFZ

TSG

MFZ: 15/84 TSG: 7.3% e

3.7%

MFZ: PCR +

Namíbia

H WB – 3/8

Tunísia

DSP _ _

Etiópia

DS, DST DS: 0.19

DST: 0.54

DS: 0.25

DST: 0.75

Moçambique

G, DST G: 0.7

DST: 2.3.

DST: HTLV-1a

África do

Sul

CA, CAS A: 0.38% B: HTLV-1a

Senegal

DS 0.16% HTLV-1a

Uganda

SK A: 3.2% A: 8.5%

MDS: Mulheres e doadores de sangue da área rural e urbana

PN: Pré-natal e clínica ginecológica. G: Mulheres gestantes em Accra

MF: Mãe e filho

I: Indivíduos acima de 35 anos, PA: População adulta, MFR: Mães e filhos em áreas

rurais, MG: Mulheres gestantes em 10 centros de Bissau.

TS: Trabalhadoras do sexo de Douala, PP: População de pigmeus VR: 4 vilas de área

rurais.

MFZ: Mãe e filho HAM/TSP, TSG: Trabalhadoras de sexo e mulheres grávidas de

Kinshassa.

H - homens

DSP: Doadores de Sangue e politransfundidos

DS: Dadores de Sangue, DST: área urbana e pacientes em clínica DST.

CA: Casos autopsiados DST, CAS: Cepas da África do Sul.

SK: Pacientes com Sarcoma de Kaposi.

Referência da tabela 1: Holmgren B et al., 2003; Larsen O et al., 2000; Olaleye D O et

al., 1999; Mauclere P et al., 1995, Liu H; Steele A D et al., 1994; Mojaat et al., 1994;

Vrielink H et al., 1995; Melo J et al., 2000, Engelbrecht S et al., 1999; Apea-Kubi K A et

al., 2006; Machuca A et al., 2005; Collenberg et al., 2006; Zehender G et al., 2008);

Diop S et al., 2006; Del Mistro et al., 1994 (WB) – Western Blot. (HTLV-1/2) (-) negativo

(Em branco) – Não testada.

Angola não possui registro da infecção pelo HTLV e não faz diagnóstico,

sorológico ou molecular, para este vírus. Assim, não se tem nenhum dado até ao

momento, a respeito do HTLV no país. Usamos como alvo de estudo a população

soropositiva para o HIV, porque co-infecções por estes retrovírus ocorrem em locais

onde eles co-circulam e é justificada por similares rotas de transmissão (Lefrere et al

1990). Dois importantes modos de transmissão do HIV e HTLV na África são: a via

heterossexual e vertical (Gessain, 1996).

2 - OBJETIVOS

2.1 – Objetivo Geral

-Identificar a infecção pelo HTLV e HIV, em indivíduos HIV soropositivos e

determinar a diversidade genética destes vírus em Luanda, Angola.

2.2 – Objetivos Específicos

-Proceder o diagnóstico sorológico para o HTLV em amostras sororeativas para o

HIV

-Tipar e subtipar o HTLV, molecularmente, através da região tax e LTR

respectivamente.

-Tipar e subtipar o HIV molecularmente através da região pol (protease) e/ou env

(gp41), respectivamente.

-Analisar o genótipo da protease (gene pol) do HIV-1 quanto à presença de

mutações de resistência primária aos antiretrovirais.

3 - MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 - Casuística

Amostras de sangue de 200 (duzentos) indivíduos soropositivos para o HIV

foram utilizadas para o presente estudo, provenientes do hospital de referência para

soropositivo em Angola (Hospital Esperança) localizado na capital Luanda, coletadas

em Março de 2006. O sangue foi colhido em tubo vacuntainer contendo anticoagulante

EDTA K3. O soro foi obtido na mesma coleta em tubo sem anticoagulante e separado

por centrifugação. O soro foi utilizado para a sorologia do HIV e HTLV e o sangue total

para a extração de DNA para a tipagem e subtipagem do HTLV e HIV. Todas as

análises moleculares foram realizadas a partir do provírus. A realização deste estudo foi

aprovada pelo Instituto Nacional da Luta Contra a SIDA e Ministério da Saúde de

Angola. Nenhum dado sócio-demográfico, clínico ou laboratorial foi obtido para estes

pacientes.

3.2 – Diagnóstico sorológico da infecção pelo HIV

Este procedimento foi realizado em Angola. Inicialmente todas as amostras

foram submetidas a testes rápidos para o HIV-1 e 2 no laboratório do Hospital

Esperança em Luanda, Angola e/ou no Laboratório de Referência no Instituto Nacional

de Saúde Pública. Foram utilizados dois testes que fazem parte do algoritmo para o

diagnóstico do soropositivo em Angola, que é feito utilizando Determine e Uni-Gold

(Abbott Laboratories e Trinity Biotech, USA respectivamente). A opção de uso destes

testes em Angola foi com base em estudos em parceria com o CDC/ Atlanta, onde

foram testados 9 tipos de reagentes na população soropositiva Angolana. Os testes

Determine e Unigold mostraram a maior sensibilidade e especifidade.

3.3 - Logística e Transporte das Amostras

Após os procedimentos de coleta e obtenção do sangue e soro, as amostras

foram armazenadas em –70

C e transportadas para o Brasil em caixas térmicas,

contendo gelo artificial e se mantiveram congeladas à – 20°C até ao procedimento do

estudo.

3.4 - Detecção sorológica do HTLV-I/II nas amostras HIV positivas

O diagnóstico sorológico da infecção pelo HTLV nas amostras HIV positivas foi

feito pelo teste ELISA/Vironostika HTLV-I/II (Organon Teknika) no laboratório de

Genética Molecular de Microorganismos do Departamento de Genética/IOC/FIOCRUZ.

O protocolo de realização do teste para as 200 amostras foi realizado conforme

orientação do kit. Foi realizado teste pareado em duas diluições (soro puro e diluição

1/5).

3.5 - Extração de ácido nucléico – DNA

A extração do ácido nucléico foi feita a partir do sangue total e realizada em 60

amostras (incluíndo as amostras com sorologia positiva para o HTLV), a partir de 200uL

e/ou 400uL de sangue. Foi utilizado o kit de extração comercial Qiamp DNA Blood

(Qiagen Inc., Chatsworth, CA, USA) e observadas as instruções do protocolo. O ácido

nucléico extraído foi eluído em 150 uL do tampão de eluição ou de água pura. Os DNAs

extraídos foram utilizados para “Nested” PCR, visando detecção do HIV-1 e 2 e HTLV-1

e 2.

3.6 - Teste de ausência de inibidores de PCR

Para testar a presença de inibidores e eficiência da extração de DNA, todas as

amostras foram submetidas à reação de PCR, utilizando como alvo um gene

constitutivo humano (HLA). Para tal foi utilizado: 0.2 mM de dNTPs, 2.5 mM de MgCl

tampão (promega) 1X, 200ng de cada iniciador, 1.5U de Taq DNA (Promega), 3 ul do

produto da extração de DNA por tubo de reação, e água pura para um volume total de

50 ul. O programa de amplificação consistiu em uma desnaturação inicial à 94°, por 5

minutos, seguidos de 39 cíclos (94°C, 30 segundos (desnaturação), 50°C, 30 segundos

(pareamento), 72°C, 30 segundos (polimerização). A leitura foi feita em gel de agarose

3%, previamente corado com Brometo de Etídio.

3.7 – “Nested” PCR e tipagem do HTLV

A reação de PCR para o HTLV-1 e 2 foi realizada para as 60 amostras (todas

nas quais foi realizada a reação de PCR para o HIV) incluíndo as amostras

sorologicamente positivas para o HTLV. Foram utilizados iniciadores que permitiram a

amplificação das regiões tax para tipagem entre 1 e 2 e LTR (Long Terminal Repeat)

para subtipagem do HTLV-1. Foi feito também PCR para amplificacação da região P12

e envelope. Estes iniciadores são rotineiramente utilizados no laboratório de Genética

Molecular de Microorganismos da FIOCRUZ (LGMM).

Para tipar HTLV, foram feitas duas reações de PCR consecutivas (“nested

PCR”), as quais permitem amplificar um segmento de 368 pb da região tax. Para a

reação de PCR foi utilizado 0.4 mM de dNTPs, 2.0 mM de MgCl

, tampão (promega)

1X, 200ng de cada iniciador: Stlvf1/Stlvrl na primeira reação e Stlvf2/Stlvr2 na segunda

reação), 1.5 U/ul de taq DNA polimerase (promega), 4 ul de DNA por tubo de reação, e

água pura para um volume total de 50 ul na primeira reação. Na segunda reação

diminuiu-se o DNA, foi transferido 3 ul de DNA da primeira reação para a segunda

reação. O programa de amplificação consistiu em uma desnaturação inicial à 96° C, por

5 minutos, seguidos de 39 ciclos (96° C, 30 segundos (desnaturação), 50° C, 30

segundos (pareamento dos iniciadores), 72° C, 30 segundos (polimerização). Em todas

as segundas reações a temperatura de pareamento dos primers foi alterada para 55° C.

A leitura do fragmento de 368 foi feita em gel de agarose 2.5%, previamente corado

com Brometo de Etídio.

As amostras que tiveram reação de amplicação positiva foram posteriormente

tipadas por enzimas de restrição (RFLP) ou realizados seqüenciamento de nucleotídios.

Para discriminar HTLV-1 e HTLV-2, o produto de PCR da região tax foi digerido

com duas enzimas de restrição, Hinf-1 e Ava-1 (LGMM). As amostras digeridas com

Hinf-1 são consideradas HTLV-1 positivas e as que digerem com Ava-1, HTLV-2. Para

a reação de digestão, um volume total de 15 ul, contendo 10 ul de DNA (produto de

amplificação do segundo round de PCR), 3,5 ul de água pura, 1,5 ul de tampão para as

respectivas enzimas e no final adicionada 1.5 unidades das enzimas Hinf-1 ou Ava-1,

para cada respectivo tubo. O produto de digestão foi submetido à corrida de

eletroforese em gel de agarose 3%. A Leitura do gel previamente corado com Brometo

de etídio foi feita em transiluminador.

3.8 – Subtipagem do HTLV-1

Para a subtipagem, as amostras caracterizadas como HTLV-1, tiveram a região

LTR amplificadas por “Nested” PCR, utilizando os iniciadores na primeira amplificação

Hfl1/Hf16 e na segunda etapa HFL9/Hfl10. Foram utilizadas a mesmas condições de

amplificação já referidas, com a exceção do tempo de extensão, foi aumentado para 45

segundos. Com estas mesmas condições foi feita a amplificação de outras regiões tais

como: P12 (iniciadores: HFL75/TR104 e ORF1/PXA1s) e envelope (iniciadores:

HFL71/HFL72 e HFL75/HFL76). A visualização do fragmento genômico foi feita em gel

de agarose 2.5%, previamente corado com Brometo de Etídio.

3.9 - PCR para Tipagem do HIV - “Nested PCR”

A reação de PCR específica para a discriminação entre o HIV-1 e 2 foi realizada

nas mesmas 60 amostras, nas quais foi feita a PCR para o HTLV. A tipagem molecular

do HIV utilizou como alvo o gene da protease e os iniciadores DP10/DP11 e

DP16/DP17 específicos para HIV-1 e DP20/DP21 e DP26/DP27 para o HIV-2

(Pieniazek D et al, 1991). Na reação de PCR foi utilizado 0.4 mM de dNTPs, 2.5 mM de

MgCl

, tampão (promega) 1X, 200ng de cada iniciador (DP10/DP11) na primeira reação

e (DP16/ DP17) na segunda reação, 1.5 U/ul de Taq DNA polimerase (Promega), 3 ul

de DNA por tubo de reação, e água pura para um volume total de 50 ul. O programa de

amplificação consistiu em uma desnaturação inicial de 95 ou 96°C, por 5 minutos,

seguidos de 39 ciclos (95 ou 96° C, 30 segundos (desnaturação), 50°C, 30 segundos

(pareamento), 72°C, 30 segundos (polimerização). Na segunda etapa de amplificação a

temperatura de pareamento dos iniciadores foi alterada para 55°C. A leitura foi feita em

gel de agarose 3%, previamente corado com Brometo de Etídio. Esta região também foi

utilizada para subtipagem do HIV.

3.10 - Subtipagem do HIV pelo Env

Utilizamos as regiões env (gp41=398nt) para determinação dos subtipos

genéticos do HIV-1 (grupo M). Os iniciadores estão listados na tabela 2

(JH41OF/JH38OR na primeira reação e Env27F/Env19 na segunda reação). As

condições de PCR foram as mesmas descritas acima para a tipagem. As alterações

foram: o aumento da concentração dos iniciadores para 300 ng, polimerização por 45

minutos e a utilização dos reagentes da platinum em lugar dos da Promega.

3.11 - Seqüênciamento dos Amplicons

Os produtos genômicos amplificados foram purificados com o kit WIZARD PCR

Clean-UP (PROMEGA). A reação de seqüenciamento foi realizada utilizando o kit de

reação Big Dye terminator v3.1 e foram utilizados para cada reação: 1ul de Big dye

terminator v3.1 (ready reaction mix), 1.5 ul de tampão 5X (Big Dye terminator v3.1

sequencer buffer), 3.2 pmol de iniciador (utilizado na respectiva reação de PCR), 100

ng de DNA. A água Milli-Q foi adicionada à reação para completar um volume total de

10 ul. A ciclagem utilizada compreendem: 96º C, 10 segundos, 50º C, 5 segundos e 60º

C, 4 minutos por 25 ciclos. Os fragmentos foram diretamente seqüenciados nas duas

fitas, utilizando seqüenciador automático ABI PRISM 3100 DNA Sequencer (Applied

Biosystem). As seqüências obtidas foram editadas e analisadas com auxílio do

programa computacional Chromas e/ou DNASTAR (DNASTAR Inc., EUA).

3.12 - Análise genética das seqüências do HIV e HTLV

As seqüências geradas para o HIV, foram alinhadas no Clustal X e analisadas

geneticamente por comparação com as seqüências de referência correspondentes aos

distintos subtipos do HIV existentes no banco de dados do “Los Alamos National

Laboratory” (http://hiv-web.lanl.gov). A análise genética foi feita no MEGA usando o

método Neighbor-Joining, modelo Kimura dois parâmetros e a análise por Neighbor-

joining no REGA. Enquanto que para o HTLV foi utilizada a mesma abordagem

metodológica e as seqüências referência disponíveis no GenBank. Para o HIV foi feita

também a análise de subtipos no programa viral genotyping tool disponível no domínio

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov

- NCBI), e jphMM disponível no domínio do Los Alamos

Database, para corroborar os resultados.

3.13 - Resistência Primária no Gene da Protease das amostras do HIV-1

Seqüências genômicas derivadas da região da protease do HIV-1 foram

analisadas para a presença de mutações associadas aos inibidores de protease do

HIV-1 com auxílio do programa HIV DRUG RESISTANCE DATABASE (HIVdb,

STANFORD UNIVERSITY (http://hivdb.stanford.edu), para verificação da presença

de posições de aminoácidos relacionados a resistência primária.

Tabela 2 – Lista de iniciadores utilizados nas reações de PCR

Iniciadores Ancoragem sequência Região /Retrovírus

Stlvf1 1 7210-7226 tcagcccayttyccagg

Tax (HTLV-1/2) A

Stlvrl 1 7781-7802 attttrtakagkarttcytcca

Tax (HTLV-1/2) A

Stlvf2 1 7276-7295 tgtgtwcargscgaytggtg

Tax (HTLV-1/2) A

Stlvr2 1 7622--7644 ggtgtasabgttttggggycgga

Tax (HTLV1/2) A

Hfl1 4 24-39 gacaatgaccatgagc

LTR (HTLV-1) B

Hf16 4 4546-4570 gttaagccagtgatgagcggc

LTR (HTLV-1) B

HFl9 4 124-144 aaggctctgacgtctcccccc

LTR (HTLV-1) B

Hfl10 4 779-796 tcccggacgagcccccaa

LTR (HTLV-1) B

HFL71 4 5111-5129 ccagtggatcccgtggaga Env (HTLV-1)

HFL72 4 6729-6747 aggaggatttgatgggaga Env (HTLV-1)

HFL75 4 6049-6065 gctatagtctcctcccc Env (HTLV-1)

HFL76 4 6591-6610 ggtgtcgtagctgacggagg Env (HTLV-1)

Tr104 4 7497-7517 gagccgataacgcgtccatcg P12 (HTLV-1)

ORF1 1 6788-6805 cacctcgccttccaactg P12 (HTLV-1)

PX1As 1 7162-7180 gctgtgcttgacggtttgc P12 (HTLV-1)

DP10 1 1420-1444 caactccctctcagaagcaggagcc

Protease (HIV-1) AB

DP11 2

ccattcctggctttaattttactggta

Protease (HIV-1) AB

DP16 2 1681-1700 cctcaaatcactctttggcaac

Protease (HIV-1) AB

DP17 2

aaaatttaaagtgcagccaat

Protease (HIV-1) AB

DP20 2 2620-2637 gacagaggacttgctgca

Protease (HIV-2) AB

DP21 2 2436-2454 ggccattgtctcagttttg

Protease (HIV-2) AB

DP26 2 2641-2657 caattctctctttgga

Protease (HIV-2) AB

DP27 2 2914-2935 tagatttaatgacatgcctaa

Protease (HIV-2) AB

JH38 (OR) 3 8382-8363 ggtgartatccctkcctaac

gp41 (HIV-1) B

JH 41 (OF) 3 7815-7833 cagcaggwagcackatggg

gp41 (HIV-1) B

Env 27F 3 7878-7896 ctggyatagtgcarcarca

gp41 (HIV-1) B

Env19 3 8316-8297 aarcctcctactatcattatra

gp41 (HIV-1) B

Referência: 1 (LGMM), 2 (Pieniazek D et al, 1991), 3 (CDC), 4 (Vandamme A M).

A – tipagem, B – Subtipagem, AB – tipagem e subtipagem

4 – RESULTADOS

4.1 - Sorologia para o HTLV-1/2

A triagem sorológica para HTLV-1/2, utilizando a diluição de 1/5, nas 200

amostras de soro de pacientes HIV positivos, submetidas no teste ELISA, foi negativa,

segundo o valor cut off (DO=0.305), considerado no teste. No segundo teste ELISA

realizado para todas as amostras utilizando o soro sem diluição, 10 (5%) das 200

(duzentas) amostras foram reativas para o HTLV-1/2.

4.2 – Tipagem do HTLV

Entre as 10 amostras sorologicamente positivas para o HTLV-1/2, 8 (oito) foram

positivas na reação de amplificação da região Tax.

Os amplicons da região Tax, foram submetidos a digestão com as enzimas de

restrição Hinf-1 e Ava-1, cujo perfil de digestão permitem discriminar o HTLV-1 do 2

respectivamente ou seja a reação é considerada positiva para o HTLV-1 se o amplicon

digerir com a enzima Hinf-1 e positiva para o HTLV-2 na digestão com a enzima Ava-1.

Na Figura 10, a banda na pista 1 do gel corresponde ao fragmento de 368 nucleotídios

da região Tax sem digestão.

O perfil de digestão dos fragmentos de 368 nucleotídios da região Tax produz

três fragmentos genômicos (189+155+24 nucleotídios), com a enzima de restrição Hinf-

1 como observado na Figura 10, que representa a corrida de electroforese em gel de

agarose 2.5% do produto digerido, que mostra o resultado de 5 amostras (47, 106, 125,

128 e 172) nas pistas: 2a, 3a, 4a, 5a e 6a respectivamente, determinou que o vírus

HTLV presente nas oito amostras é do tipo HTLV-1. O resultado se mostrou negativo

para o HTLV-2, pela não digestão das mesmas amostras com a enzima Ava-1 como

mostrado nas pistas: 2b, 3b, 4b, 5b, 6b respectivamente.

1 2a 2b 3a 3b 4a 4b 5a 5b 6a 6b

Figura 10 – Corrida de electroforese em gel de agarose (2.5%) do produto de digestão

(RFLP) dos fragmentos de 368 nt correspondentes a região Tax do HTLV, submetidos a

reação de digestão com as enzimas de restrição Hinf e Ava. Pista 1: fragmento da

região Tax do HTLV sem digestão (controle negativo da digestão). Pistas 2a, 3a, 4a, 5a

e 6a digestão com a enzima Hinf-1; pistas 2b, 3b, 3b, 4b, 5b e 6b digestão com a

enzima Ava-1. O resultado mostra positividade para o HTLV-1 e resultado negativo para

HTLV-2.

O sequenciamento e análise das seqüências da região Tax, confirmou que, o

virus presente nas oito amostras, é do tipo HTLV-1. Considerando o genoma completo

dos 2 vírus, a região Tax é a que possui maior identidade entre eles. As seqüências da

região Tax de Angola mostram identidade de 98% com sequências do HTLV-1 e 81%

com as do HTLV-2.

Curiosamente nas seqüências da região Tax de Angola, as duas posições G9A e

C363G (diferenças em relação ao HTLV-1aA, B, C) presentes em todas as sequências,

que seriam as assinaturas para o HTLV de Angola nesta região estudada, são idênticas

ao HTLV-2 (MO). Estas posições estão marcadas com o circulo oval na Figura 11, que

mostra o alinhamento das sequências de Angola com seqüências protótipos do HTLV-

1aA (BOI), HTLV-1aB (ATK1), HTLV-1aC (HS35), HTLV-1b (ITIS) HTLV-1c (Mel 5) e

HTLV-2 (MO) A posição G9A, também está presente na seqüência protótipo do subtipo

HTLV-1b.

368 nt

189 nt

24 nt

155 nt

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

HTLV-1aA BOI TGTGTACAAGGCGACTGGTGCCCCATCTCTGGGGGACTATGTTCGGCCCGCCTACATCGTCACGCCCTACTGGCCACCTGTCCAGAGCATCAGATCACCT

HTLV-1aB ATK1 ....................................................................................................

HTLV-1aC HS35 ....................................................................................................

HTLV-1b ITIS ........G.........................................T.................................................

HTLV-1c Mel5 ....................................................................................................

HTLV-2 MO ........G

.C...T.....T...G....A..T..T........CA.............A..T.....C....................C..AC......

047angTax ........G...........................................................................................

106angTax ........G...........................................................................................

143angTax ........G...........................................................................................

156angTax ........G...........................................................................................

172angTax ........G...........................................................................................

178angTax ........G...........................................................................................

110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

HTLV-1aA BOI GGGACCCCATCGATGGACGCGTTATCGGCTCAGCTCTACAGTTCCTTAT

CCCTCGACTCCCCTCCTTCCCCACCCAGAGAACCTCTAAGACCCTCAAGGT

HTLV-1aB ATK1 ....................................................................................................

HTLV-1aC HS35 ..............................................................................................T.....

HTLV-1b ITIS ....................................................................................................

HTLV-1c Mel5 A......................................................G................................A...........

HTLV-2 MO .......................G..A....TC....C..A.A............C.............................A.G............

047angTax ....................................................................................................

106angTax ..........................................................................................T.........

143angTax ....................................................................................................

156angTax ....................................................................................................

172angTax ....................................................................................................

178angTax ....................................................................................................

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

HTLV-1aA BOI CCTTA

CCCCGCCAATCACTCATACAACCCCCAACATTCCACCCTCCTTCCTCCAGGCCATGCGCAAATACTCCCCCTTCCGAAATGGATACATGGAACCC

HTLV-1aB ATK1 ....................................................................................................

HTLV-1aC HS35 ....................................................................................................

HTLV-1b ITIS ............G.C...C.................................................................C...............

HTLV-1c Mel5 .........A..G.C..................................T........G.A...C..C...................G.G......G...

HTLV-2 MO .........T..C.C.....C.GTCT.......GG.......TG.....T.T..AT.A.....A..GC..A......A...........G.C.......A

047angTax ......................................................................C............................T

106angTax ...................................................................................................T

143angTax .............................................................G.............................T.......T

156angTax ....................................................................................................

172angTax ....................................................................................................

178angTax ...................................................................................................T

310 320 330 340 350 360

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....

HTLV-1aA BOI ACCCTTGGGCAGCACCTCCCAACCCTGTCTTTCCCAGACCCC

GGACTCCGGCCCCAAAACCTGTACACC

HTLV-1aB ATK1 ................................T....................................

HTLV-1aC HS35 ................................T....................................

HTLV-1b ITIS ................................T...........C...............T........

HTLV-1c Mel5 ..............G.......G......C.....C........C........................

HTLV-2 MO .....C...G.T..G.....CT....CG.C.....C..A..T..C.....T.........A.C......

047angTax ..........G.....................T.............................C......

106angTax ................................T....G........................C......

143angTax

................................T............T..............T.C......

156angTax ................................T.............................C......

172angTax ................................T.............................C......

178angTax ................................T.............................C......

Figura 11 – Alinhamento das seqüências correspondentes a região Tax do HTLV, com

seqüências dos protótipos do HTLV-1aA (BOI) e HTLV-1aB (ATK1), HTLV-1aC (HS35),

HTLV-1b (ITIS) HTLV-1c (Mel 5) e HTLV-2 (MO). As seqüências de Angola estão

referenciadas com o número da amostra mais sufixo angtax.

4.3 - Subtipagem do HTLV-1

Das 8 amostras sorologicamente positivas e caracterizadas como HTLV-1 na

região Tax, 5 amostras tiveram a região LTR amplificada, 4 a região P12 e 3 a região

env, que foram seqüenciadas e analisadas.

As seqüências da região LTR foram utilizadas para subtipagem. A análise

genética dos fragmentos de 645 nucleotídios correspondentes a região LTR,

determinou que o HTLV-1 é do subtipo HTLV-1aA, Cosmopolita/Transcontinental. Na

árvore de agrupamento genético pelo método Neighbor-Joining com Kimura 2

parâmetros, as seqüências de Angola se agrupam num braço principal (amostras 106

ang, 125 ang e 128 ang) (Figura.12).

Figura 12 - Agrupamento genético por Neighbor-Joining (NJ) com Kimura 2 parâmetros

(K2P) do fragmento LTR de 645 nt. As seqüências de Angola em azul.

Me l5 c

H23d

pyg19d

MOM J b

ITISb

MWMGb

GAB7b

12503b

H24b

GB233b

StDenb

PH236b

T49b

GH78aC

HS35aC

ODaD

BOa D

Pr52aD

Pr144aD

Bl1aE

RKI4aE

Bl3aB

ATMa B

MT 4 a B

TBH5a B

ATK1 aB

AMAa A

TBH4a A

TBH6aA

Nara

Me 3 aA

AINUaA

73RMaA

MT2 a A

CR1aA

TBH7aA

Boia A

TBH3a A

TBH1a A

Afs911aA

TBH2aA

WHP

CH26aA

BEL1

Ca ma A

CMCaA

Bl2a A

Qu3 a A

Qu1a A

Qu2a A

Me 1 a A

Me 2 a A

JCPaA

128ang

106ang

125Ang

MAQSa A

FCRaA

MAS Ua A

0.01

HTLV-1c

HTLV-1d

HTLV-1b

HTLV-1aC

HTLV-1aD

HTLV- 1aE

HTLV-1aB

Me l5 c

H23d

pyg19d

MOM J b

ITISb

MWMGb

GAB7b

12503b

H24b

GB233b

StDenb

PH236b

T49b

GH78aC

HS35aC

ODaD

BOa D

Pr52aD

Pr144aD

Bl1aE

RKI4aE

Bl3aB

ATMa B

MT 4 a B

TBH5a B

ATK1 aB

AMAa A

TBH4a A

TBH6aA

Nara

Me 3 aA

AINUaA

73RMaA

MT2 a A

CR1aA

TBH7aA

Boia A

TBH3a A

TBH1a A

Afs911aA

TBH2aA

WHP

CH26aA

BEL1

Ca ma A

CMCaA

Bl2a A

Qu3 a A

Qu1a A

Qu2a A

Me 1 a A

Me 2 a A

JCPaA

128ang

106ang

125Ang

MAQSa A

FCRaA

MAS Ua A

0.01

Me l5 c

H23d

pyg19d

MOM J b

ITISb

MWMGb

GAB7b

12503b

H24b

GB233b

StDenb

PH236b

T49b

GH78aC

HS35aC

ODaD

BOa D

Pr52aD

Pr144aD

Bl1aE

RKI4aE

Bl3aB

ATMa B

MT 4 a B

TBH5a B

ATK1 aB

AMAa A

TBH4a A

TBH6aA

Nara

Me 3 aA

AINUaA

73RMaA

MT2 a A

CR1aA

TBH7aA

Boia A

TBH3a A

TBH1a A

Afs911aA

TBH2aA

WHP

CH26aA

BEL1

Ca ma A

CMCaA

Bl2a A

Qu3 a A

Qu1a A

Qu2a A

Me 1 a A

Me 2 a A

JCPaA

128ang

106ang

125Ang

MAQSa A

FCRaA

MAS Ua A

Me l5 c

H23d

pyg19d

MOM J b

ITISb

MWMGb

GAB7b

12503b

H24b

GB233b

StDenb

PH236b

T49b

GH78aC

HS35aC

ODaD

BOa D

Pr52aD

Pr144aD

Bl1aE

RKI4aE

Bl3aB

ATMa B

MT 4 a B

TBH5a B

ATK1 aB

AMAa A

TBH4a A

TBH6aA

Nara

Me 3 aA

AINUaA

73RMaA

MT2 a A

CR1aA

TBH7aA

Boia A

TBH3a A

TBH1a A

Afs911aA

TBH2aA

WHP

CH26aA

BEL1

Ca ma A

CMCaA

Bl2a A

Qu3 a A

Qu1a A

Qu2a A

Me 1 a A

Me 2 a A

JCPaA

128ang

106ang

125Ang

MAQSa A

FCRaA

MAS Ua A

0.01

HTLV-1c

HTLV-1d

HTLV-1b

HTLV-1aC

HTLV-1aD

HTLV- 1aE

HTLV-1aB

4.4 – Tipagem e Subtipagem do HIV

A amplificação do DNA proviral, foi positiva para 53 (88.3%) das 60 amostras,

considerando a região da protease e/ou env (gp41) do HIV-1 e em 10 (16%) das 60

amostras para o HIV-2, considerando a região da Protease.

Os amplicons correspondentes às duas regiões foram sequênciados e as

sequências editadas utilizando-se os programas CHROMAS e DNASTAR (software

SeqMan, DNASTAR Inc., EUA).

Inicialmente 42 seqüências da protease e 46 da gp41 do HIV-1, foram

submetidas à análise para determinação de subtipos genéticos pelas ferramentas de

subtipagem viral disponível no domínio (http://www.ncbi.nlm.nih.gov

- NCBI), e jphMM

disponível no domínio do Los Alamos Database (Tabela 6, anexos).

Os subtipos genéticos do HIV-1 foram determinados considerando as seqüências

da Protease (42 amostras) e gp41 (46 amostras), utilizando o método Neighbor-Joining

com Kimura 2 parâmetros (N-J com K2P) no programa MEGA v3.1.

Considerando os resultados da análise de agrupamento genético (por N-J com

K2P) para as duas regiões, Protease e gp41 do HIV-1 (Figuras 13 e 14), temos a

presença de 17 isolados pertencentes à 5 subtipos “puros” ou seja concordantes nas

duas regiões: F1 (7 amostras: 41,0%), G (4 amostras: 23,5%), C (4 amostras: 23,5), A

(1 amostra: 6%), D (1 amostra: 6,0%), correspondentes a 43,3%.

Analizando as 37 amostras do HIV-1 com informação na Protease e gp41,

verificamos que os 17 isolados que apresentavam subtipos concordantes nas duas

regiões tiveram a seguinte frequência: F1 (19,0%), G (10.8%), C (10.8%) A (2,7%), D

(2,7%). (Tabela 3). Os demais 20 isolados (56,7%) apresentavam 12 perfis mosaicos:

AG/G (n=4), D/G (3), AG/A1 (2), G/A1 (2), F1/C (2), F1/D (1) F1/GA (1), G/H (1), AG/H

(1), F1/AE (1), B/H (1) e J/? (1).

A prevalência dos subtipos via análise das seqüências da protease (42

sequências) é: F1: 32,0% (n=13), G: 21,0% (9); AG: 19,0% (8); C: 12,0% (5); D: 10,0%

(4), e A1/B/J/?: 2% cada um (1 de cada). (Figura 13, Tabela 4).

A prevalência dos subtipos via análise da gp41 (46 sequências) é: G: 27,0%

(n=12), F1: 22,0% (10); A1 e C: 15,0% (7 e 7); H: 9,0% (4); D: 4,0% (2), e A2/AE/GA/?:

2% cada um (1 de cada) (Figura 14 e 17 anexos, Tabela 4).

O subtipo H só foi encontrado no envelope (gp41) e a única seqüência do J na

protease. Foi observada uma única amostra do subtipo B na Protease que possui o

subtipo H na gp41. Esta seqüência (amostra 16angpro) se mostra com o braço mais

longo na árvore (Figura 13). Quando se analisa as mutações dos aminoácidos desta

seqüência, o perfil mutacional do vírus é compatível com o de um indivíduo já tratado

com IP, O que pode explicar o comportamento desta sequência na árvore.

Observação: Uma das seqüências da gp41, classificada como F1 (amostra

43ang) não está na árvore apresentada na figura 14, Devido ao tamanho menor que as

demais seqüências de Angola, o agrupamento genético desta foi feita em árvore

separada pelo mesmo método, o que perfaz 10 de 46 amostras do subtipo F1 na gp41

(vide anexos Figura 17).

Figura 13 – Agrupamento genético correspondente ao gene da protease (240 nt) por

Neighbor-Joining com Kimura 2 parâmetros.

s seqüências de protease de Angola

estão referenciadas com número da amostra+sufixo angpro.

100 angpro

102 angpro

128 angpro

29 angpro

134 angpro

123 angpro

GNG92

GSE93

54 angpro

31 angpro

GFI93

142 angpro

23 angpro

41 angpro

4 angpro

UGR99

122 angpro

8 angpro

28 angpro

56 angpro

150 angpro

UCD83

UCD90

A1UG85

A2CD9797

A2CDAF286238

A2CY94

2 angpro

A1KE94

A1SE94

A1UG92

13 angpro

CBR92

CET86

26 angpro

97 angpro

14 angpro

CBW96

126 angpro

CIN95

KCD97

KCM96

BFR83HXB2

BUS86JRFL

16 angpro

BUS90

BUS83RF

DCD83NDK

DCD83ELI

DUG94

172 angpro

156 angpro

143 angpro

DCD84

7 angpro

161 angpro

F1BR93

F1BE93

F1FI93

120 angpro

F2CM249236

F2CM249237

F1FR96

20 angpro

43 angpro

91 angpro

58 angpro

106 angpro

32 angpro

40 angpro

124 angpro

125 angpro

121 angpro

104 angpro

HBE93

HBE190128

HCF90

73 angpro

JSE93

JSE94

CPZGA

0.02

Figura 14 – Agrupamento genético gene env do HIV-1 (gp41 - 398 nt) utilizando o

método Neighbor-Joining com Kimura 2 parâmetros. Sequências dentro do círculo preto

são C recombinantes. As seqüências deste trabalho com cor azul e número da

amostra+sufixo ang.

CZM53ZM

97a

F2CMMP257

102an

6165

0.01

↑

CZM53ZM

97a

F2CMMP257

102an

6165

0.01

CZM53ZM

97a

F2CMMP257

CZM53ZM

97a

F2CMMP257

102an

6165

102an

6165

0.01

↑

N° da

amostra

Protease Envelope (GP41) Percentagem

7 F1 F1 19.0

4 G G 10.8

4 C C 10.8

4 AG G 10.8

3 D G 8.10

2 AG A1 5.40

2 G A1 5.40

2 F1 C 5.40

1 F1 D 2.70

1 F1 GA 2.70

1 F1 AE 2.70

1 D D 2.70

1 A1 A1 2.70

1 B H 2.70

1 G H 2.70

1 AG H 2.70

1 J ? 2.70

Tabela 3 – Prevalência dos subtipos genéticos, considerando os 37 isolados que

possuem informação para as duas regiões: protease e gp41.

N° de

amostras

Subtipo genético na

Protease

% Subtipo genético

na gp41

F1 13 32 10 22

G 9 21 12 27

AG 8 19 1 2

C 5 12 7 15

D 4 10 2 4

B 1 2 _ _

A1 1 2 7 15

J 1 2 _ _

H _ _ 4 9

A2 _ _ 1 2

? _ 1 2

AE _ _ 1 2

Tabela 4 - Subtipos genéticos por região: protease (42 seqüências) e gp41 (46

seqüências) do HIV-1, com base no agrupamento genético por Neighbor-Joining com

Kimura 2 parâmetros.

4.5 - Caracterização Genética do HIV-2

Do total de 60 amostras, utilizadas para a tipagem molecular do HIV, 10 foram

positivas para HIV-1 e HIV-2, representando 16% de co-infecção com HIV-1. Não

detectou-se infecções isoladas pelo HIV-2. A sequência do gene da protease foi

utilizada para a determinação do subtipo genético do HIV-2. Das 10 seqüências do HIV-

2 de Angola analizadas todas foram caracterizadas como subtipo A (Figura 15).

Figura 15 - Agrupamento genético do gene da protease (240pb) por Neighbor-

Joining com Kimura 2 parâmetros. As seqüências de Angola estão nomeadas

com número+sufixo ang.

100ang

98ang

67ang

56ang

97ang

58ang

84ang

7ang

54ang

23ang

A.GW .86.FG J03654

A.GW.87.CAM2CG D00835

A.GW .x.MDS Z48731

A.SN.85.ROD M15390

A.GM.x.MCN13 AY509259

A.G M .x.IS Y J04498

A.DE.x.PEI2 U22047

A.GW .x.ALI AF082339

A.GM.87.D194 J04542

A.DE.x.BEN M 30502

A.G H.x.G H1 M 30895

A.CI.88.UC2 U38293

B.JP.01.KR020 AB100245

AB.CI.90.7312A L36874

B.CI.x.EHO U27200

B.CI.88.UC1 L07625

B.GH.86.D205 X61240

G.CI.x.ABT96 AF208027

U.FR.96.12034 AY530889

STM .US.x.STM M 83293

SMM.US.x.PGM53 AF077017

MAC.US.x.85013 AY611490

MNE.US.x.MNE027 U79412

0.02

HIV-2

de Angola

Subtipo A

4.6 - Co-infecções

Das 60 amostras HIV positivas analisadas, 10 foram sorologicamente positivas

para o HTLV. Sendo 8 destas confirmadas na reação de PCR, em dupla infecção com

HIV-1.

A análise molecular mostrou que 10 amostras HIV-1 positivas estavam co-

infectadas com HIV-2. Os subtipos envolvidos nas co-infecções estão listados na tabela

5. A maior associação da infecção pelo HIV-2 foi com HIV-1 do subtipo G, enquanto

que a associação do HTLV foi com perfil recombinante D/G.

Amostra HIV-2

Subtipo na

Protease

HIV-1

Subtipo na

Protease

HIV-1

Subipo na

gp41

HTLV

Tipo na

regiãoTax,

HTLV-1

Subtipo

regiãoLTR

HTLV-1

Subtipo

na região

Env

HTLV-1

Subtipo

na região

P12

7 A D D

23 A AG G

47 _ A1 1 _ _ _

54 A G G

56 A AG G

58 A F F1

67 A _ F1

84 A _ A1

97 A C C

98 A2

100 A G G

106 F _ 1 aA _ aA

143 D G 1 _ _ _

125 F F1 1 aA aA aA

128 G _ 1 aA aA aA

156 D G 1 _ _ _

172 D G 1 _ aA aA

178 ? ? 1 _ _ _

Tabela 5 – Co-infecções HIV1/2 e HIV1/HTLV. (-) sem informação. (?) – não

classificada

4.7 - Mutações de resistência associadas aos diferentes subtipos

A análise de mutações, associadas à resistência primária, presentes na

sequência do gene da protease, dos diferentes subtipos do HIV-1 de Angola, em

comparação com a cepa padrão HXB2 foi feita para 42 seqüências previamente

subtipadas e está especificada na figura 4.6. As mutações associadas à resistência

primária estão evidenciadas em vermelho (negrito) e as secundárias em cinza.

Apenas duas seqüências pertencentes ao subtipo D (2 (4.7%) de 42) não

apresentaram a mutação na posição 36 (predominantemente M36I) (Figura 16).

A única seqüência do subtipo B encontrada no estudo possui o maior número de

mutações associadas à resistência primária. Nesta seqüência estão presentes as

mutações primárias (D30N, V82A, N88D) e secundárias (L10I, K20R, L24I, L63P e

A71T). O perfil mutacional é de um indivíduo já tratado com inibidores de protease,

sugerindo transmissão da resistência ou indivíduo já tratado. uma vez que as amostras

são de indivíduos virgens de tratamento com inibidores de protease, essas mutações

não foram consideradas mutações primárias de resistência.

1 (uma) seqüência do subtipo F1 e 1 (uma) AG apresentaram mutações de

resistência na posição do aminoácido 46 (M46I e M46L respectivamente).

O subtipo F1 apresentou mais frequentemente mutações secundárias. 10/13

(dez das treze) seqüências do subtipo F1 possuem mutações de resistência secundária

na posição 10, ((9) L10V e (1) L10I). 6/13 seqüências na posição 20 (K20R) e 2/13 na

posição 77 (V77I).

A única seqüência de J possui também as mutações L10I e K20R. Nas

seqüências do subtipo D, 3 das 4 possuem a mutação secundária L63P. Duas das

quatro seqüências do subtipo C, possuem também esta mutação que os outros

subtipos não possuem (com excepção a seqüência do subtipo B) (Figura 16).

Subt

o_Amostr

L10I/R/V

K20R

L24I

D30N

V32I

L33F

M36I

M46I/L

I47V/A

G48V

I50L/V

F53L

I54M/L

L63P

A71V/T

G73S/C/T/A

V77I

V82A/F/T/L/S

I84V

N88S

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|

BFR83HXB2

PLVT I K I GGQLKEALLDTGADDTVLEEMSLPGRWKPKMI GG I GGF I KVRQYDQ I L I E I CGHKA I GTVLVGPTPVN I I GRN

B_016

.I.P.RV....R...I.....N....DVE.Q...Q.R................VP.......TV.........A.....D

F1_020

.I..V.VE...R..............DIN...K...R...........K.....T.D...N..T................

F1_032

.V..V..E...R..............DIN...K.....................T.D...C..T................

F1_040

.V..V.VE...R.............D.IN...K....I..........K.....T.D.......................

F1_043

.V...R.E..................DIN...K...............K.....T.D......T....I...........

F1_058 .V..V.VE...R..............DIN...K...............K.....T.D.......................

F1_091

.V.....E..................DIN.Q.K...............K.....T.D......T....I...........

F1_104

.V..VRVE..................DIN...K...............K.....T.D......V................

F1_106

.V..V..E...R............V.DIN...K...............K.....T.D....R..................

F1_120

...P.RV....R..............DIN...K...............K...H.......Q...................

F1_121

.V..V.VE..................DIN...K...............K.....T.D...C..V................

F1_124

....V.V...................DIN...K..................ED.....E.K..V................

F1_125

.V..V.VE..................DIN...K...............K.....T.D.......................

F1_161

.....RV...................DIN...K...............K...S........R..................

G_029

....VR.....I...............I....K.R.......................E.KR...........I......

G_031

....V......I..............DIN...K...................N.....S.K............I......

G_054 ...........I...............IN...K...........................K............I......

G_100

....V......I..............QIN...K.........................E.R...R........I...R..

G_102

....VR.....I...............IN...K.........................E.K............I......

G_123

....A.V....V...............IN.T.K....................V......K............I......

G_128

....V.V....I..............DIN...K......................M..E.K...................

G_134

....VR.....I..............DIN...K.........................H.K............I......

A/G_023

..IKV......I..............DIE...............................KR..................

A/G_028

....VR.....I..............NIE...............................K.......I...........

A/G_041

.V..V.....PI...............ID...K.....................V.D...KR..................

A/G_056

...KVR.E...I..............DIN...K......................V....K.......I...........

A/G_122 .I..VR.E..SV...............IN...K...........................K...................

A/G_142

...KVR.....I...............IN...K.....................VL....K............I......

A/G_150

.V.NV.VE...I..............GIN...K.....................C.....K.......I...........

C_014

......V...I................IH.T.K.....................P.....K...................

C_026

.....RVE..I................IN...K...........................K...................

C_097

...S..V...V................LN...K.....................SM....K............I......

C_126

...S..V...I................LN...K.....................P.....K...................

D_007

..........................DIN...K...................N.C.........................

D_143

..........................DIN...K..................E..P.....Q...................

D_156

....V...E.................D.N...K.....................PV........................

D_172

....V...E.................D.N...K.R...................PV........................

CRF_02_004 ....V..E...I..............DIN...K...........................K.G.S...............

CRF_02_008

....VR.....I..............DIN...K....L......................K...................

A1_002

..........................DIN...K..............I......S.....K...................

J_073

.I..V..E..IR..............DID...K..................ND.S...E.K...................

desc_013

...A.RV....................IE.........................T.....K...................

XXX

mutção primária nas amostras

mutção secundária nas amostras

mutação primária de resistência

Figura 16 – Alinhamento das 42 seqüências

de aminoácidos, distribuídas de acordo com

os subtipos genéticos do HIV-1 circulante

em Angola. Região da Protease no gene pol,

analisadas neste estudo: aminoácido 9-88. As

posições de mutações primárias estão

evidenciadas na figura em cor vermelha e as

secundárias marcadas em cor cinza. As

posições de mutação relacionadas à

resistência foram levadas em consideração da

comparação com a seqüência padrão

BHXB2, descritas pela Sociedade

Internacional de AIDS

(http://www.iasociety.org

) e Ferramenta HIV

DRUG RESISTANCE DATABASE

(STANFORD UNIVERSITY), disponível no

domínio: http://www.ncbi.nlm.nih.gov

–

NCBI.

5 – Discussão

Até a realização deste trabalho não existiam dados relativos à infecção do vírus

linfotrópico das células T de humanos (HTLV) em Angola. Portanto, nossos resultados

são a primeira evidência experimental da presença da infecção no país e da

caracterização genética do vírus. Demonstramos a prevalência do HTLV-1 em 5% de

indivíduos HIV-1 positivos. A co-infecção HIV-1/HTLV-1 ocorre em vários países do

mundo e está associada a fatores de risco que incluem transfusão sanguínea, uso de

drogas intravenosas e contato sexual com múltiplos parceiros (Brites et al., 1997;

Vallinoto et al., 1998). A prevalência da co-infecção é variável indo de 0.8% na

Inglaterra, 8% na Noruega até 20-30% no Brasil (Eskild 1996, Brites et al, 2001).

A presença do HTLV-1 em Angola era previsível já que espécies de primatas

não humanos, que são infectados com o virus linfotrópico de células T dos símios do

tipo 1 (STLV-1) e que, em decorrência a transmissão inter-espécies, evoluiu para o

HTLV-1, tem seus habitats naturais na África subSaariana, onde se situa Angola

(Saksena et al., 1994; Ibrahim et al., 1995; Mahieux et al 1997, 1998, 2000; Nerrienet et

al., 2001; Meertens et al., 2001). Dados da Guiné-Bissau e Togo, sugerem que mais de

1% da população em geral está infectada com HTLV-1 (Holmgren et al., 2003; Wolf et

al., 2005). Nos países ao redor de Angola como Congo Brazzaville, República

Democrática do Congo, e Namíbia, a presença de anticorpos do HTLV-1 têm sido

relatados em vários grupos da população (Tshala et al., 1999; Steele et al., 1994;

Salemi et al., 1998; Garin et al., 1994), assim como em outros países da África.

A caracterização genética do HTLV-1 de Angola revelou a presença do subtipo

cosmopolita HTLV-1aA Cosmopolita/Transcontinental. Todos os subtipos genéticos do

HTLV-1, exceto o HTLV-1c identificado na Melanésia, foram identificados na África. A

maior parte deles ocorre nos países do norte e oeste da África sub-Saariana, onde

prevalecem os subtipos Cosmopolitas HTLV-1aC e HTLV-1aD e os HTLV-1b, 1d, 1e e

1f (Zehender, 2008). O subtipo Cosmopolita/Transcontinental (HTLV-1aA), que

determina a pandemia atual de HTLV-1, só foi identificado, até o momento, em países

do sul da África: Moçambique e África do Sul (Engelbrecht et al., 1999, Zehender et al.,

2007).

Estudos sugerem que o HTLV-1aA do grupo Cosmopolita/Transcontinental foi

levado da África para países das Américas, através do tráfico de escravos a 400 anos

atrás (Vandamme et al., 1994; Van Dooren et al., 1998). A maioria dos escravos

trazidos para o Brasil, onde este subtipo de HTLV-1 é o prevalente, vieram de regiões

do oeste da África, atuais Benin, Nigéria e Norte de Angola. Portanto nossos achados

seriam a ligação mais forte entre a presença deste subtipo nas Américas e o tráfico de

escravos.

A epidemia pelo HIV-1 que tem prevalência em Angola de 3,7% (2005), ou seja,

considerando 16 milhões de habitantes (www.who.org

), existiriam 592.000 pessoas

infectadas atualmente, parece ter sido consequência da guerra colonial, que teve início

em 1961. Durante os primeiros anos da guerra colonial, devido ao conflito armado,

grupos de angolanos emigraram para os países vizinhos especialmente para a

República do Congo e República Democrática do Congo (RDC). O HIV-1 circula na

RDC provavelamente desde 1940 (Zhu et al., 1998; Lemey et al., 2006), este país é

considerado o epicentro da pandemia do HIV-1 e é onde se encontra circulando os

diversos subtipos genéticos e formas recombinantes do virus (Archer and Robertson.,

2007). Portanto indivíduos angolanos infectaram-se na República do Congo e na RDC

nos anos 60 e retornaram para Angola levando os diferentes subtipos genéticos

(Santos-Ferreira et al., 1990; Bártolo et al., 2008). Nossos resultados demonstram a alta

variabilidade genética do HIV-1 em Angola, o que já havia sido mostrado nos dois

únicos trabalhos feitos no país (Abecasis et al., 2005; Bártolo et al., 2005). Em

particular, nossos achados sobre a prevalência dos subtipos do HIV-1, estão em

concordância com Abecasis e cols (2005). Encontramos a maior prevalência do subtipo

F, sub-subtipo F1 “puro” (19%), o que contrasta com todos os países da África, inclusive

RDC, onde a infecção por este subtipo é de baixa prevalência: Camarões (Delaporte et

al., 1996; Triques et al., 1999), República Democrática do Congo (Mokili et al., 1999),

Gabão e República Centro Africana (Triques et al., 1999), variando de 3-10% (Jassens

et al., 1997; Takehisa et al., 1998). Rara. Considerando o mundo a prevalência da

infecção pelo subtipo F é de 0,59%, sendo encontrado na América Latina (Brasil)

principalmente (Hemelaar et al., 2006, Morgado et al., 1994)

No mundo, o HIV-1 do subtipo F, é principalmente encontrado na África Central,

América do Sul (Brasil e Argentina) (Morgado et al., 1994, Compadonico et al., et al.,

1996; Marquina et al., 1996; Sabino et al., 1996) e Romênia (foi encontrado num surto,

entre crianças na Romênia) (Dumitrescu et al., 1994; Apetrei et al., 1997; Brandea et al.,

1995). Em baixa prevalência o subtipo F é encontrado em países africanos como:

Camarões (Delaporte et al., 1996; Triques et al., 1999), República Democrática do

Congo (Mokili et al., 1999), Gabão e República Centro Africana (Triques et al., 1999),

variando de 3-10% (Jassens et al., 1997; Takehisa et al., 1998). Em alguns países

europeus casos esporádicos do subtipo F foram reportados, principalmente entre

indivíduos epidemiologicamente ligados a África Central ou América do Sul (Op de Coul

et al., 2000). O sub-subtipo F1 inclui cepas da Romênia, América do Sul e RDC.

Todavia F2 e K (muito próximo ao subtipo F1 e F2) são representadas por cepas

africanas dos Camarões e K também foi relatado na RDC.

Foi feito o BLAST, disponível no domínio (http://www.ncbi.nlm.nih.gov

– NCBI).

Em comparação com seqüências africanas, as de F1 de Angola possuem maior

identidade genética com amostras da RDC de 1985, em profissionais do sexo (Yang et

al., 2001), assim como seqüências F1 do trabalho de Yang e cols., 2005, também da

RDC (amostras coletadas em 1999-2000). A prevalência de 12,5% de F1 na análise de

C2V3 e gp41 do trabalho de Yang e Cols., 2001, representa uma exceção, pois na

população em geral da RDC a F1 representa apenas de 2-4% dependendo da região

estudada (Mokili et al., 1999). Esta maior identidade das seqüências de F1 de Angola

(coletadas em 2006) com seqüências da RDC, coletadas próximo ao início da epidemia,

aponta para um possível efeito fundador de linhagem F1 da RDC em Angola. O que

corrobora com a possível origem da epidemia HIV-1 de Angola a partir da RDC.

A epidemia do HIV-1 nos países vizinhos a Angola, República Democrática do

Congo (RDC) e República do Congo, é dominada pelo subtipo A1 com (46-70%) e 41%

respectivamente e o subtipo G e CRF02_AG. Na Zâmbia predomina o subtipo C (95%)

e o recombinante C/A2 (Heyndrickx et al., 2000; Handema et al., 2001; Morison et al.,

2001 Trask et al., 2002).

Abecasis e cols (2005) mostram as frequências: pol: F (19%), C (16%), D (10%),

A (5%), G e H (3%), enquanto que Bártolo e col (2005) mostraram para gag/env o

subtipo mais prevalente o A1 (18 amostras, 38%), e também C (7amostras, 15%), H (5

amostras, 10%), J (3 amostras, 6%), G (2,4%), A2 (2.4%), D (1,2%) enquanto que F1%

Nossos resultados quanto à freqüência de 10,8% para o subtipo G “puro” e, 21%

e 27% respectivamente, considerando as regiões da protease e gp41, contrastam com

os valores dos dois trabalhos (3% e 2,4%). Nossas seqüências da gp41 do subtipo G

possuem maior identidade (93-95%) com sequências da RDC coletadas em 1985, em

que os autores mostraram uma predominância do subtipo G em profissionais do sexo

(Yang et al., 2001). Do mesmo modo, em amostras selecionadas na população em

geral da RDC, considerando os genes env e gag, há predominância do subtipo G

(ambos G puro e CRF02_AG) (Vidal et al ., 2000). No Congo Brazzaville, um estudo

realizado, de 104 amostras, considerando a região Env (V3-V5) o G representou

21,25% das amostras sendo o segundo mais frequente subtipo no país (Niama et al.,

2005).

A grande diferença na prevalência do subtipo G está provavelmente relacionada

com uma mudança no perfil de subtipos no país, com o término do conflito armado em

2003 e, o retorno em massa de refugiados angolanos oriundos dos dois Congos,

Namíbia e Zâmbia (Congresso CPLP-AIDS, Luanda 2005), países que possuem alta

prevalência de subtipo G e mosaicos AG (Congos). Lembramos que nossas amostras

foram coletadas em 2006 enquanto que às dos demais trabalhos foram obtidas em

2001. Além disso, o crescimento da economia e comércio em Angola tem atraído

estrangeiros Africanos que fixaram residência em Angola, principalmente: Nigerianos e

eventualmente Malianos. Em um estudo recente na Nigéria, considerando a região env,

o subtipo G representou 42.7% e 39.3%,CRF02_AG (Sankalé et al., 2007). Porém não

poderíamos afirmar uma vez que as amostras utilizadas (anônimas e não relacionadas)

podem não refletir a epidemia de 2003. Não sabemos há quanto tempo os pacientes

estão infectados.

O subtipo C foi encontrado em 10,8% das seqüências considerando as duas

regiões estudadas, e em 15% das seqüências da gp41, de nosso estudo. Abecasis e

cols encontraram 16% considerando a região pol. Este subtipo é, atualmente, o mais

prevalente do mundo, em particular na India, e países do sul e leste da África

(Hemelaar et al., 2006). As seqüências do subtipo C possuem maior identidade com

seqüências da África do Sul, 94-96% na protease e 95% na gp41, e Zâmbia 93-94%

gp41. Zâmbia faz fronteira com Angola enquanto que a África do Sul faz fronteira com

Namíbia que faz fronteira com o Sul de Angola e da onde há uma ponte de migração

para Angola.

Quanto ao subtipo B, que é o prevalente nas Américas, Europa e Oceania,

apenas identificou-se uma protease que estava relacionada a uma gp41 do subtipo H.

Portanto, nenhuma alteração quanto a rara presença deste subtipo na África foi

observada.

Um total de 56.7% das seqüências apresentou um perfil mosaico considerando a

protease e gp41. Houve maior predominância de recombinantes envolvendo os

subtipos A e G, seguido do F, que são os 3 mais frequentes no país (Tabela 3).

Interessantemente CRF02_AG é responsável por aproximadamente 31% de novas

infecções no Oeste da África e 6.7% na África Central (Osmanov et al., 2002;

Heyndrickx et al., 2000) e dados de estudos claramente sugerem que a predominância

do recombinante CRF02_AG pode ser favorecida no seu espalhamento em relação aos

parentais A e G, como resultado da alta capacidade replicativa em células dendríticas,

(uma das células alvo da infecção) (Njai et al., 2006).

Não descartamos a possibilidade das amostras com subtipos discordantes nas

duas regiões estudadas representarem co-infecção com dois subtipos.

Em estudo de Saal e cols (1987), surge uma primeira evidência da presença do

HIV-2 em Angola já que, o vírus foi detectado em 1 Moçambicano e 3 Angolanos

residentes em Portugal. Assim, tem sido sugerido que, a infecção pelo HIV teve

expansão a partir das colônias portuguesas na África através de soldados portugueses

que serviram na guerra e residiram em Moçambique e Angola. Estudo sorológico, com

material coletado em 1985 relatou a prevalência de 8.4% do HIV-2 e de 2.2% da co-

infecção HIV-1 e 2 (Santos Ferreira et al., 1990). Estudo sorológico em 2004 revelou

que co-infecções HIV-1 e 2 representavam 8.61% das infecções pelo HIV, enquanto

que monotípicas infecções pelo HIV-2 foram de 0.28%. (Serrano, 2005).

Em nosso estudo o HIV-2 foi prevalente em 16% das infecções pelo HIV-1.

Comparado aos estudos anteriores, observa-se o crescimento das duplas infecções e o

desaparecimento das infecções simples pelo HIV-2, em um intervalo de 09 anos, em

Angola. Além da questão da temporalidade os estudos diferem na metodologia já que,

os demais tiveram como base resultados de sorotipagem enquanto que, o nosso,

baseou-se na detecção do provírus.

Na África as infecções pelo HIV-2 ocorrem, predominantemente, em duplas

infecções com o HIV-1 (Grez et al., 1994), como decorrência destes vírus

compartilharem as mesmas vias de transmissão e grupos de exposição. Como a grande

maioria dos trabalhos considera em, utiliza, principalmente, reagentes para o HIV-1 é

possível que, os números relativos à infecção pelo HIV-2, estejam abaixo do real.

O subtipo genético dos HIV-2 de Angola, considerando o gene da protease, é o

subtipo A. Este é o subtipo prevalente de HIV-2 tanto na África, quanto nos demais

continentes, onde o vírus é encontrado (Xiang et al 1997; Sarr et al, 2000; Heredia et al,

1998). A predominância do subtipo A ocorre na: Costa do Marfim (Jassens et al., 1994;

Ellenberger et al., 1999); Benin (Heyndrickx et al., 1996); Gana (Ishigkawa et al., 1996)

e Guiné-Bissau (Esteves et al., 2000). Considerando os 09 subtipos, o A e o B, são os

mais prevalentes, mas o subtipo B é geograficamente limitado, sendo encontrado na

Costa do Marfim e com relatos na França e Portugal (Brennan et al, 1997; Pieniazek et

al 1999, Soriano et al, 2001; Damond et al, 2001). Os demais subtipos são casos únicos

sendo C e D identificados na Libéria e E e F na Serra Leoa (Gao et al, 1994, Chen et al

1997).

O HIV-2 de Angola possui maior identidade (98%) com vírus da Guiné-Bissau

identificado em 1993. Guiné-Bissau é considerado o epicentro da epidemia pelo HIV-2.

Angola e Guiné-Bissau foram colônias Portuguesas com conseqüente migrações de

populações entre os países, alguns Angolanos são descendentes de Guinenses e vice-

versa.

Curiosamente no presente estudo, enquanto que as seqüências do HIV-1,

presentes nas co-infecções, apresentavam alta variabilidade genética e relação com

vários subtipos genéticos, as seqüências dos HIV-2 eram quase idênticas. Isto sugere a

possibilidade de uma única e recente introdução do vírus na população alvo do estudo.

As amostras utilizadas em nosso estudo são de pacientes virgens de tratamento

com os inibidores de protease (IP). Angola iniciou o tratamento na população de

soropositivos do país segundo um consenso que incluem, no tratamento de primeira

linha, 2 inibidores nucleosídicos da transcriptase reversa (ITRN) + 1 inibidor não

nucleosídico da transcriptase reversa (ITRNN), nomeadamente: Zidovudina (AZT),

Lamivudina (3TC) e Nevirapina (NVP), e que, no caso de falha terapêutica, o consenso

prevê a substituição do ITRNN por um inibidor de protease (IP). Os inibidores de

protease que existem atualmente disponíveis no país e no hospital Esperança

(referência de onde provêm nossas amostras) são o Indinavir/Ritonavir. É possível

também, no esquema, o uso do Nelfinavir e há proposta para aquisição do Lopinavir

(Kaletra). Então IPs estão como alternativas à falha aos esquemas acima citados.

A estratégia de Angola é uniformizar, de forma a não generalizar a resistência

dos vírus circulantes aos ARV para garantir alternativas, quando com o passar do

tempo de utilização haver resistência aos de 1ª linha (AZT+3TC+NVP). Todos os

pacientes recebem os ARV gratuitamente e só devem usar as combinações permitidas.

Em subtipos não-B, mutações podem existir como um natural polimorfismo do

vírus levando à resistência primária aos ARVs (Poveda et al ., 2008). Das 42

sequencias analisadas, apenas 3 apresentaram posições primárias de resistência a PIs.

40 das 42 (95%) seqüências da Protease de Angola analisadas possuem a mutação na

posição 36 (M36I), ou seja, a substituição do aminoácido Metionina por Isoleucina, em

todos os subtipos encontrados.

A única seqüência do subtipo B possui o maior número de mutações de

resistência primária e secundárias (figura 4.6). O subtipo B é raro na África, nesta

amostra faz parte de um genoma recombinate: B na protease e H na gp41. O subtipo B

é o prevalente nas Américas e Europa, regiões onde há amplo uso de inibidores de

protease, portanto o parental B, que participou deste evento de recombinação, poderia

já ter esta variação incorporada a seu genoma. Portanto pode ser transmissão de

resistência ou um paciente já tratado.

A outra seqüência a apresentar uma posição primária de resistência a IP, M46I, é

do subsubtipo F, possivelmente um F puro já que, sua gp41 apresenta o mesmo

subtipo. Proteases F possuem mais frequentemente mutações de resistência: L10VI/L,

K20R, M36I (Couto-Fernandez et al., 2005). Estas são mutações para o novo PI

Tipranavir (TPV) que é um dos mais recentes PIs aprovados e têm demonstrado

significante eficácia na redução do RNA viral do HIV em pacientes com resistência a IP

(Hicks et al., 2006; Clotet et al., 2007) e mostra potente atividade antiretroviral contra a

maioria dos vírus IP resistentes (Poveda et al ., 2008). Na seqüência da protease

associada a forma CRF-02 também foi encontrada a posição primária M46L. Este

conhecimento é extremamente importante para o tratamento de pacientes infectados

com subtipos não B, particularmente agora que o tratamento ARV está sendo

implementado pela Organização Mundial da Saúde na África sub-Sahariana e a

prevalência de subtipos não B vem crescendo na Europa (Deroo., 2002; Snoeck et al.,

2004).

Os dados do presente trabalho são importantes para o conhecimento da

diversidade do HIV e primeira referência sobre a ocorrência do HTLV-1 em Angola.

Dados que podem servir para nortear campanhas de monitoramento epidemiológico

Molecular, condição de terapêutica antiretroviral com inibidores de protease e reflexão

sobre a necessidade de se instituir no País o diagnóstico/monitoramento da infecção

pelo HTLV.

6 - CONCLUSÕES

-Em relação aos retrovirus HIV e HTLV caracterizados em amostras de Luanda/Angola

podemos concluir que:

-Os dois tipos de HIV, HIV-1 e 2, estão presentes na epidemia. Sendo que 88,3%

(53/60) das amostras foram positivas para o HIV-1, enquanto que, o HIV-2, só estava

presente em 16% (10/60 amostras).

-Todas as infecções com HIV-2 eram co-infecções com HIV-1.

-O retrovírus HTLV-1 está presente em co-infecções com o HIV-1.

-Considerando, a presença de múltiplos subtipos genéticos e formas

recombinantes, a epidemia do HIV-1 em Luanda/Angola é comparável a dos países da

África Central e distinta da dos países do sul e leste do continente Africano.

A alta prevalência do subtipo F em Angola contrasta com a encontrada na África.

-O HIV-2, nesta região (ou população de estudo), parece ter sido resultado de

uma única e recente introdução já que, é muito baixa a variabilidade identificada no

gene da protease.

-Considerando a presença do subtipo HTLV1aA , Transcontinental/Cosmopolita,

Angola está inserida na pandemia do HTLV.

7 - ANEXOS

Tabela 6 – Genotipagem, comparando as 3 abordagens metodológicas

N° da amostra Protease

jphMM

gp41

jphMM

Protease

MEGA

gp41

MEGA

Protease

V. Gen. Tool

Gp41

V. Gen. Tool

A1 A1 A1 A1 A1 A1

- C - H - H

G A1 AG A1 AG AG

D D D D D DF

AE/G - AG - AG -

- G - G - A,G,J,K

11 - C - C - BC

C - C - AG, A,U -

C C C C C C

B CH B H B H

F1 F1 F1 F1 BF F1

AE/G A1G AG G AG A,AE, G, J

C C C C C BC

A1 A1 AG A1 AG AG

G H G H G H

G - G - G -

F1 F1 F1 F1 H F1

- F1 - F1 F1 BF

F1 F1 F1 F1 F1 BF

G G AG G AG A,G,J,K

F1 F1 F1 F1 F1 BF

- A1 - A1 - A1

G G G G G G

A1 G AG G AG G

F1 F1 F1 F1 BF BF

- F1 - F1 - F1

A1/J A1 J ? AG, A, U A, AE, G, J

- A1 - A1 - AG

F1 A1/G F1 GA? BF BG

C C C C C C

- A2 - A2 - A2

100

G G G G G G

101

- C - C - C

102

G A1 G A1 G A1

104

F1 C F1 C BF C

106

F1 - F1 - BF -

120

F1 D F1 D BF D

121

F1 F1 F1 F1 BF BF

122

AE/G G A/G G AG AG

123

G A1 G A1 G A1

124

F1 AE F1 AE F1 AE

125

F1 F1 F1 F1 BF BF

126

C C C C BC BC

128

G - G - - G

134

G G G G BG G

142

G G G G G A, AE, G, J

143

D G D G D G

150

A1 H AG H AB H

156

D A1 D G D A,AE, G, J

161

F1 C F1 C F1 BC

172

D A1 D G D A, AE, G, J

178

- - ? H -

43 (42+1) seqüências correspondentes a protease e 46 sequências da gp 41 do HIV-1 circulante

em Angola. (?) seqüência não classificada.

Figura 17 - Agrupamento genético da seqüência da gp41 da amostra 43ang

previamente subtipada como F1 por Neighbor-Joining com Kimura 2 Parâmetros.

Árvore em pdf feita no programa Rega. Esta seqüência de F1 mais 9 na figura 4.4

perfazem 10 sequências de F1 de 46 amostras amplificadas na gp41.

8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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