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Florbela Josefina Isaac Lutucuta Kosi
INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO GÊNICO
DAS MOLÉCULAS POTENCIALMENTE VACINAIS
MSP-2 E SERA/p126 DO Plasmodium falciparum
EM ÁREAS ENDÊMICAS ANGOLANAS
Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz
Rio de Janeiro – Brasil
Julho de 2008
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i
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Florbela Josefina Isaac Lutucuta Kosi
INVESTIGAÇÃO DO POLIMORFISMO GÊNICO DAS MOLÉCULAS
POTENCIALMENTE VACINAIS MSP-2 E SERA/p126 DO
Plasmodium falciparum EM ÁREAS ENDÊMICAS ANGOLANAS
Orientadora: Prof.Dra. Maria de Fátima Ferreira da Cruz
Ministério da Saúde
Fiocruz
Fundação Oswaldo Cruz
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ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Tese submetida á coordenação dos cursos
da área de pesquisas do Instituto Oswaldo
Cruz para obtenção do Grau de Mestre em
Biologia Parasitária. Área de concentração:
biologia de agentes infecciosos e parasitários
e vetores.
Compuseram a banca examinadora os Professores Doutores,
Titulares
Professor Dr. Ricardo Lourenço de Oliveira – revisor/ presidente
Professora Dra. Myrna Cristina Bonaldo
Professor Dr. Mariano Gustavo Zalis
Suplentes
Professora Dra. Mariza Gonçalves Morgado
Professora Dra. Selma Lílian Sallenave Sales
Ministério da Saúde
Fiocruz
Fundação Oswaldo Cruz
.
iv
Trabalho desenvolvido no Laboratório de Pesquisas em
Malária do Instituto Oswaldo Cruz, sob orientação da Prof.
Dra. Maria de Fátima Ferreira da Cruz, com apoio da
Fundação Oswaldo Cruz ( IOC), do Ministério da Saúde de
Angola (MINSA), da Fundação Eduardo dos Santos (FESA)
e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq)
v
“Precisamos parecer um pouco com os outros para compreender
os outros, mas precisamos ser um pouco diferentes para amá-
los”.
Paul Géraldy
vi
Dedicatórias
vii
Ao meu amor André, dedico esta
dissertação por todo seu amor,
companheirismo, compreensão,
incentivo e paciência durante a
realização deste trabalho, não medindo
esforços para que eu pudesse alcançar
este objetivo.
Aos meus amados filhos Andréa e
Anderson, pelo amor, companheirismo,
e compreensão pela ausência da
mamã durante estes dois anos de
batalha, preenchendo completamente o
vazio causado pela saudade. Obrigada
filhos.
viii
Aos meus queridos pais Luis (em memória) e Dulce, que
me ensinaram o sentimento de amor ao próximo e sempre
me apoiaram e me incentivaram para conquista dos meus
objetivos, sem medir esforços e por seu amor
incondicional.
Aos meus irmãos: Cininho, Varito, Flávia, Quinto e Mica
por todo amor e carinho.
ix
Agradecimentos
À Deus pela nossa existência;
À Fundação Oswaldo Cruz pela possibilidade de realizar este
trabalho;
À FESA (Fundação Eduardo dos Santos) e ao MINSA
(Ministério da Saúde de Angola) pelo apoio financeiro;
Ao Departamento de Biologia da Faculdade de Ciências da
Universidade Agostinho Neto pela oportunidade de realização
do Curso de Mestrado;
À coordenação do Curso de Pós-Graduação em Biologia
Parasitaria da Fundação Oswaldo Cruz, pela oportunidade de
participar do Curso de Mestrado;
À minha orientadora Professora Dra. Maria de Fátima Ferreira
da Cruz, pela confiança, apoio e pela grande contribuição na
x
minha formação cientifica, pelo estímulo, carinho e pelo grande
apoio moral oferecido durante estes dois anos de formação;
Ao Prof. Dr. Cláudio Daniel Tadeu Ribeiro por me acolher em
seu Laboratório;
A toda turma do Laboratório de Pesquisas em Malária:
Bianca, Camille, César, Claudinha, Daiana, Dauto, Dra. Dalma,
Dra Evelyn, Dra. Joseli, Dra Lílian, Elisângela, Fabiana,
Fabrício, Francisco, Guilhermina, Juliana, Josué, Larissa,
Luciene, Natalia, Silvana, Vanessa, Vitor e Yuri por
conseguirem transformar um dia de trabalho em momentos de
puro companheirismo e camaradagem;
À amiga Guilhermina Carvalho por ter se tornado uma irmã
com a qual sempre pude contar durante estes dois anos;
À amiga Guilhermina Carvalho e ao pessoal dos Laboratórios
dos Centros de Saúde da Terra, Sambizanga e Ilha pelo
companheirismo no momento da colheita das amostras de
sangue;
Às amigas Bianca, Guilhermina, Lílian e Natalia pela
colaboração no processamento das amostras e na
interpretação dos resultados.;
Aos Dr. Orlando e Dra. Augusta pelo incentivo e pela
oportunidade que me deram em realizar o Curso de Mestrado;
Aos meus colegas angolanos, Fátima Valente, José Vicente,
Guilhermina Carvalho e Peliganga Luis Baião pelo
companheirismo durante estes 2 anos longe da nossa terra;
xi
Ao Dr. Moises, Dra. Filomena Gomes e Dr. Filomeno Fortes
pelo apoio prestado no ato da coleta e processamento das
amostras;
Aos responsáveis dos Centros de saúde do Rangel,
Sambizanga e da Ilha e dos chefes dos respectivos
laboratórios por nos permitirem a realização de coleta de
amostras e pelo apoio prestado durante este período;
À Aline, sempre prestativa e colaboradora para o
sequenciamento de DNA;
A todos os meus amigos que me deram muita força e coragem
para continuar e suportar a distância e as saudades de casa,
me proporcionando momentos agradáveis;
A todos que de forma direta e indireta contribuíram para a
minha formação;
&
Aos pacientes dos Centros de Saúde do Rangel,
Sambizanga, Hoje-ya-Henda e da Ilha que contribuíram
com sua história e voluntariamente nos cederam amostras
de seu sangue para a realização deste trabalho.
xii
Índice
Resumo...................................................................................................................... 1
Summary.................................................................................................................... 2
I) Introdução.............................................................................................................. 3
1.Situação da malária no mundo................................................................................ 3
2. Malária em Angola.................................................................................................. 4
3.O parasita da malária.............................................................................................. 6
4. Ciclo biológico do P. falciparum.............................................................................. 6
5. Polimorfismo gênico................................................................................................ 10
5.1. Estrutura genética e mecanismos de diversidade do P. falciparum.................... 11
6. Dificuldades de controle e desenvolvimento de uma vacina.................................. 13
7. MSP-2 ( merozoite surface protein / proteína 2 de superfície do merozoítas........ 15
8. SERA/p126............................................................................................................. 16
II) Justificativa e Objetivo......................................................................................... 19
III) Casuística e Métodos.......................................................................................... 20
1. Descrição da área estudada................................................................................... 20
2. Casuística............................................................................................................... 23
3. Avaliação da parasitemia........................................................................................ 25
4. Coleta e estocagem dos isolados........................................................................... 25
5. Extração de DNA (Acido desoxirribonucléico) ....................................................... 26
6. Reação de PCR ( Reação de polimerização em cadeia) MSP-2/ SERA/p126...... 26
7. Analise do produto amplificado por PCR................................................................ 29
7.1. Eletroforese em gel de agarose........................................................................... 29
7.2. Purificação e sequenciamento............................................................................. 30
7.3. Analise das seqüências nucleotidicas................................................................. 30
III) Resultados........................................................................................................... 31
1. Avaliação da parasitemia........................................................................................ 33
2. Analise do polimorfismo gênico pela PCR.............................................................. 32
2.1. MSP-2.................................................................................................................. 32
2.2. SERA/p126.......................................................................................................... 34
xiii
3. Complexidade das infecções.................................................................................. 36
4. Analise das seqüências alélicas............................................................................. 39
4.1. MSP-2.................................................................................................................. 40
4.2. SERA / p126........................................................................................................ 45
5. Dados epidemiológicos vs distribuição dos alelos MSP
-2 e
SERA/p126
.................
49
IV) Discussão............................................................................................................ 52
V) Conclusões .......................................................................................................... 59
VI) Perspectivas........................................................................................................ 60
VII) Referencias bibliográficas................................................................................. 61
VIII) Apêndices.................................................................................................. ....... 73
Anexo I........................................................................................................................ 73
Anexo II....................................................................................................................... 75
Anexo III...................................................................................................................... 77
Lista de abreviaturas.................................................................................................. 78
Lista de Figuras.......................................................................................................... 80
Lista de tabelas........................................................................................................... 82
1
RESUMO
Considerando-se a resistência do parasita às drogas e do mosquito vetor aos inseticidas,
aliada a falta de uma vacina, o controle da malária continua sendo um grande desafio,
resultando no número alarmante de casos de malária em Angola e no mundo em geral. Em
relação ao desenvolvimento de uma vacina, o conhecimento da diversidade gênica dos
parasitas tem sido um ponto crucial para melhor conhecer a resposta imune assim como a
imunidade adquirida contra este parasita. Consequentemente, esforços têm sido concentrados
para se investigar a diversidade gênica e antigênica do P. falciparum porque esta espécie é a
responsável pela maioria dos casos graves e letais de malária. Nessa óptica, nós decidimos
estudar a extensão da diversidade gênica da MSP-2 e da SERA/p126, duas moléculas
consideradas candidatas para compor uma vacina malária. Para este fim, o DNA plasmodial
de amostras de sangue de pacientes com malária não complicada residentes em áreas
endêmicas da província de Luanda/Angola foi analisado por nested-PCR. A amplificação das
regiões centrais da MSP-2 e da SERA/p126 gerou um total de 37 e 100 fragmentos,
respectivamente. Apesar da MSP-2 ter apresentado um número menor de fragmentos de
PCR, um número maior de alelos (9) foi observado. Em relação ao tipo de infecção, mais
infecções simples (87,5%) foram detectadas com a MSP-2, contrastando com o número maior
de infecções mistas (57%) observado com a SERA/p126. Com o intuito de se verificar as
heterogeneidades do DNA responsáveis por esses polimorfismos e também para tipificar as
famílias alélicas, os fragmentos de PCR foram submetidos ao sequenciamento de DNA. Todos
os 10 fragmentos de MSP-2 seqüenciados com sucesso pertenciam à família alélica 3D7 e a
região central denominada de R1 foi a mais polimórfica e era caracterizada por 3 repetições
em tandem de GSAG. Entre os 14 fragmentos de SERA/p126 seqüenciados com sucesso,
duas famílias alélicas foram identificadas: os alelos denominados SERA A (200 pb), SERA B
(300 pb) e SERA C (400 pb), reportados aqui pela primeira vez, pertencentes à família K1,
com um perfil do tipo PA/7 e o alelo SERA F (800 pb) pertencente à família Honduras, com um
perfil do tipo 3D7. O polimorfismo dos alelos SERA/p126 se caracterizou por mutações
causadas por substituições não sinônimas na OR. Em síntese, o polimorfismo encontrado nos
genes que codificam as proteínas MSP-2 e SERA/p126 sugere que as populações de
parasitas circulantes em Luanda possuem características diferentes daquelas presentes no
Brasil, na Ásia e, inclusive, em outros países africanos sugerindo, portanto, estratégias de
controle diferenciadas. Em vista desses achados, concluímos que o impacto desse
polimorfismo na resposta imune contra essas proteínas deve ser abordado antes de incluí-las
numa formulação vacinal destinada ao povo angolano.
2
SUMMARY
Having in account parasite resistance to antimalarial drugs and the mosquito vector to insecticides,
together with the lack of a vaccine, malaria control remains a great challenge, resulting in an
increasing number of malaria cases in Angola and worldwide. In respect to vaccine development,
the knowledge of parasites genetic diversity has been a crucial point for better understanding
immune response as well as the development of acquired immunity against this parasite. As a
consequence, efforts have been concentrated to investigate the genetic and antigenic parasite
diversity, especially in Plasmodium falciparum, since this species is responsible for the majority of
severe and lethal cases. On this view, we decided to study genetic diversity of MSP-2 and
SERA/p126 molecules - two potential P.falciparum blood stage vaccine candidates. For this
purpose, blood samples from patients with uncomplicated malaria living in endemic areas of
Luanda/Angola were analyzed by nested PCR. The amplification of central regions of MSP-2 and
SERA/p126 genes yielded a total of 37 and 100 fragments, respectively. Despite of a small number
of PCR fragments, MSP-2 allelic diversity was greater (9 alleles). In relation to the type of
infections, a large number of single infections (87, 5%) was observed in MSP-2, contrasting with
the high number of mixed ones (57%) observed in SERA/p126. Aiming to verify the DNA
heterogeneity responsible for these polymorphisms and also the type of allelic families, the PCR
fragments were submitted to DNA sequencing. All the 10 MSP-2 fragments that were successfully
sequenced belong to 3D7 allelic family, and the central region called R1 was the most polymorphic,
characterized by tandem GSAG 3 repeats. Among the 14 SERA/p126 DNA successfully
sequenced fragments two allelic families were identified: the alleles named SERA A (200 bp),
SERA B (300 bp) and SERA C (400 bp), for the first time here reported, identified as K1 family with
a profile PA/7 and SERA F (800 bp) belonging to Honduras family with a 3D7 profile. The
polymorphism of SERA alleles were characterized by mutations due to non-synonyms substitutions
in octamer region. In summary, the polymorphism on the genes coding to MSP-2 and SERA/p126
proteins suggest that circulating P. falciparum parasites in Luanda have distinct characteristics of
those circulating in Brazil, Asia or even in other African countries suggesting, therefore, different
control strategies. In view of these data we concluded that the impact of such polymorphisms in the
immune response against these proteins should be assessed before including them in a vaccine
formulation intended for the Angolan people.
3
I) INTRODUÇÃO
1. Situação da malária no mundo
A malária humana permanece como a doença parasitária de maior
prevalência mundial, apesar de um grande número de estratégias de controle
dirigidas contra o parasito e contra o vetor. Causada por protozoários do filo
Apicomplexa, gênero Plasmodium, os quais são transmitidos pela picada da
fêmea do mosquito do gênero Anopheles, esta doença ocorre, massivamente,
em populações de países situados em regiões tropicais e subtropicais da África,
América Latina, Oceania e sudoeste Asiático, onde as condições sócio
ambientais favorecem a transmissão do mosquito transmissor e o contacto do
parasita com o homem . Essa região de alta endemicidade corresponde a 107
países (WHO, 2005).
Há estimativas de 300 a 500 milhões de caso de malária por ano bem
como 1,5 - 2,7 milhões de casos fatais anuais registrados em todo o mundo,
sendo cerca de um milhão dos óbitos em crianças menores de cinco anos de
idade (WHO, 2005).
Esses dados justificam o empenho no controle dessa endemia (WHO,
2005). Um dos principais agravantes no controle dessa endemia é a resistência
do parasito à maioria das drogas utilizadas comumente na terapia (Wernsdrof &
Kouzenetsov, 1980; Nyunt & Plowe, 2007) e a resistência do mosquito
transmissor aos inseticidas. A esses fatos associam-se as dificuldades
encontradas na produção de uma vacina eficaz, bem como a falta de
implantação, em muitas áreas, de políticas de controle que possam minimizar o
risco de infecção.
4
2. Malária em Angola
Apresentação do País
A República de Angola situa-se na costa ocidental da África Austral,
entre os paralelos 4º e 18º de latitude sul. É banhada a oeste pelo Oceano
Atlântico, faz fronteira ao Norte com a República do Congo e a República
Democrática do Congo, a Leste com a República da Zâmbia, e a Sul com a
República da Namíbia. A sua superfície é de 1.246.700 Km2 e a população está
estimada em cerca de 17 milhões de habitantes em 2007.
O clima de Angola é muito variado, influenciado por uma diversidade de
fatores, tais como a latitude, a altitude, a continentalidade e o regime de ventos.
A estação das chuvas vai de setembro a abril. Os restantes meses são secos ou
de baixa pluviosidade. A temperatura média anual diminui do norte para o sul,
indo de 24º C a 20
o
C.
O país divide-se em 18 províncias, 164 municípios e 532 comunas. A
maioria da população tem características bantu, praticando uma agricultura
rudimentar. Com a instabilidade reinante no país, verificou-se um êxodo massivo
de população do campo para a cidade. Uma das consequências deste
movimento foi a desorganização dos serviços de saúde.
Em Angola a malária representa a primeira causa de morte e de doença,
liderando assim a lista das doenças, sendo endêmica nas 18 províncias do país
com possibilidades de surtos epidêmicos em algumas delas. Em 2006, foram
notificados 2,2 milhões de casos através do sistema de vigilância epidemiológica.
A malária representa cerca de 35% da demanda de cuidados curativos, 20% de
internamentos hospitalares, 40% das mortes pré-natais e 25% de mortalidade
materna. Nos últimos anos tem-se verificado uma ligeira tendência para a
redução da incidência e mortalidade por malária no país. Esta redução do peso
da doença deve ser interpretada com cautela, pois estão em causa diversos
fatores que poderão contribuir para tal: deterioração do sistema de notificação
em 2005-06, estabilização das populações, determinada pelo fim da guerra,
5
melhoria da situação nutricional da população, melhoria da confirmação
laboratorial dos diagnósticos, etc.
Assim, a malária constitui um fator que reduz e inibe o desenvolvimento
sócio econômico, exemplificado pela importante causa de absenteísmo laboral
(26 dias por trabalhador por ano) e escolar (21 dias por estudante por ano).
Alguns indicadores globais indicam a gravidade da situação atual em
Angola:
• País em situação pós-guerra;
• 60% da população em condições de pobreza;
• Condições de saneamento do meio ambiente precárias e;
• Somente 32% da população têm acesso aos cuidados de saúde.
A transmissão ocorre o ano inteiro com o aumento de transmissão da
doença durante a estação chuvosa com um pico entre os meses de janeiro e
maio.
Em Angola foram identificadas três espécies de Plasmodium implicadas
na transmissão da malária: P. falciparum 92%, P. vivax 7%, P. malariae 1% e
suspeita-se da existência do P. ovale. O P. falciparum é o mais agressivo e o
responsável pela totalidade dos casos graves e complicados de malária em
Angola (MINSA, 2007).
6
3. O parasita da malária humana
O gênero Plasmodium apresenta cerca de 100 espécies que são capazes
de infectar mamíferos, aves e répteis (Rey, 2001). Entretanto, somente quatro
espécies infectam o homem em condições naturais: P. falciparum, P. vivax, P.
ovale e P. malariae. Recentemente, o P. knowlesi foi também incriminado como
causador de malaria humana (Cox-Singh et al., 2008; White, 2008). O P.
falciparum difere das outras espécies pela possibilidade de causar maior
morbidade e mortalidade nos indivíduos infetados.
Uma das características do P. falciparum que tem despertado grande
interesse cientifico é o alto grau de diversidade fenotípica e genotípica entre
amostras do parasito da mesma procedência geográfica ou não e, como tal,
iremos centralizar nessa espécie o nosso estudo.
4. Ciclo biológico do P. falciparum.
O ciclo evolutivo do P falciparum é complexo e compreende
basicamente duas fases: uma fase assexuada haplóide no hospedeiro humano e
uma fase sexuada que inicia no hospedeiro vertebrado com a formação dos
gametócitos, mas que só se completa na fêmea do mosquito do gênero
Anopheles - hospedeiro invertebrado (Figura 1).
A) Fase assexuada.
Ao hospedeiro vertebrado a malária é transmitida quando a fêmea do
mosquito Anopheles inocula, durante o repasto sanguíneo, formas esporozoítas
acumuladas nas glândulas salivares. Em um período que varia de 30 minutos à 1
hora, os esporozoítas alcançam o parênquima hepático onde evoluem. O
desenvolvimento nas células do fígado requer aproximadamente, cinco a sete
dias (Bruce-Chwatt, 1985). Após invadir os hepatócitos, os esporozoítas
7
multiplicam-se por esquizogonia, formando os esquizontes hepáticos (ciclo pré-
eritrocítico). Cada esquizonte hepático originará cerca de 30 mil merozoítas que
serão libertados na circulação após a ruptura do hepatócito (Bruce-Chwatt,
1985). Cada merozoíta é capaz de dar prosseguimento ao ciclo invadindo o
eritrócito iniciando, assim, o ciclo eritrocítico, que é o responsável pelas
manifestações clínicas da doença.
O processo de penetração do merozoíta no eritrócito é seqüencial e
compreende várias etapas. O merozoíta reconhece e se liga ao eritrócito e em
seguida reorienta sua extremidade apical (contendo róptrias e micronemas) em
direção a membrana da célula. Ligantes presentes na extremidade apical do
parasita são capazes de interagir com receptores específicos na membrana do
eritrócito. A interação ligante-receptor leva à formação de uma junção,
desenvolvida entre as membranas das células, que é necessária no processo de
invasão. Posteriormente, as roptrias liberam seu conteúdo e começa a se formar
uma reentrância no ponto de contato. A progressão antero-posterior isola o
merozoíta dentro do vacúolo parasitóforo, passando a ocupar posição
intracelular, porem, extra-citoplasmática. O parasita, então, se desenvolve
rodeado por duas membranas: a membrana plasmática do eritrócito e a
membrana do vacúolo parasitário (Winograd et al. 1999).
Uma vez dentro do eritrócito, os merozoítas desenvolvem-se em três
estágios sanguíneos sucessivos e morfologicamente distintos: a forma de anel
(trofozoíta jovem), trofozoíta maduro e esquizonte. Cada esquizonte contém de 8
a 24 merozoítas (Bruce-Chwatt, 1985). Completada a esquizogonia, os
merozoítas são liberados pela ruptura dos eritrócitos ou pela abertura formada
em conseqüência da fusão entre as membranas do vacúolo parasitário e do
eritrócito (Winograd et al. 1999).
Após vários ciclos eritrocitários, alguns parasitos diferenciam-se nas
formas sexuadas: gametócitos feminino (macrogametócitos) e masculino
(microgametócitos) que, ao serem ingeridos pelo hospedeiro invertebrado
durante o repasto sanguíneo, darão continuidade ao ciclo sexuado do parasita.
8
B) Fase sexuada
No estômago do mosquito os macrogametócitos originarão os
macrogametas e os microgametócitos os microgametas. Da fecundação se
originará a célula ovo ou zigoto. Algumas horas após, o zigoto se deslocará em
movimentos amebóides sendo chamado de oocineto. O oocineto migrará em
direção ao epitélio intestinal do mosquito onde se alojará entre o epitélio e a
membrana basal ou no próprio epitélio, secretando substâncias que formarão um
envoltório sendo, então, chamado de oocisto. Inicia-se, assim, o processo de
multiplicação esporogônica, mediante o qual se produzem, no interior do oocisto,
milhares de esporozoítas. O oocisto maduro se romperá liberando os
esporozoítas que migram para a glândula salivar do anofelino.
Quando a fêmea do anofelino fizer o repasto sanguíneo, injetará os
parasitas na corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado que, darão então
continuidade ao ciclo evolutivo.
9
Figura 1 - Ciclo biológico de um plasmódio de mamífero no hospedeiro
vertebrado (adaptado da revista Parasitology Today).
10
5. Polimorfismo gênico
Uma das características que tem despertado maior interesse no P.
falciparum é a sua extensa diversidade genotípica e fenótipica entre amostras do
parasito provenientes de diferentes áreas malarígenas, bem como a presença de
diferentes populações clonais em um mesmo isolado (Walliker et al., 1982; Foote
et al., 1989; Jimenez et al., 2005). Os primeiros estudos referentes à diversidade
genética demonstraram que as amostras de P.falciparum, mostravam diferenças
com relação à morfologia, padrão de infecção (Garnham, 1966), capacidade de
desenvolvimento em diferentes vetores (Shute & Maryon, 1951) e à resistência a
uma variedade de drogas utilizadas na quimioterapia (Wernsdorfer &
Kouznetsov, 1980).
Consequentemente, esforços têm sido empreendidos para o estudo de
proteínas com seqüências polimórficas de P. falciparum, dentre as quais se
destacam os genes das proteínas MSP-1 e 2 (merozoite surface protein /
proteínas 1 e 2 de superfície do merozoíta) (Kimura et al., 1990; Fenton et al.,
1991; Jiménez, Muskus & Vélez, 2005) e o da SERA (serine rich protein /
proteína rica em serina) (Li et al., 1989). Para os genes MSP-2 e SERA / p126
têm sido descrito dois tipos de polimorfismos: o de tamanho e o de seqüência.
As variações de tamanho dos produtos de amplificação podem distinguir-se
facilmente por meio de eletroforese em gel de agarose.
11
5.1. Estrutura genética e mecanismos de diversidade do P. falciparum
O genoma do P. falciparum compreende 14 cromossomos, com um
tamanho de 22,8 Mb, os quais codificam 5300 genes, sendo que 45% deste
genoma contem íntrons. Em geral, as regiões codificantes do genoma do P.
falciparum são mais longas do que as seqüências dos genomas de outros
eucariotos (2,3kb vs 1,4kb). A razão para o aumento da seqüência dessas
regiões não é conhecida, mas talvez possa ser devido às regiões de baixa
complexidade de aminoácidos (repetições/repeats) encontradas na maioria das
proteínas do P. falciparum (Waters & Jansen, 2004).
A região do centrômero é caracterizada pela expressiva predominância
(>97%) das bases adenina (A) e timina (T). Os telômeros representam muito
mais do que uma simples região final dos cromossomos: a região telomérica ,
que parece ser espécie específica, compreende uma região hexâmera repetitiva
que é precedida pela região subtelomérica que contém outras unidades
complexas de repetições e um grande número de famílias de genes envolvidas
na variação antigênica e escape imune do P. falciparum (Waters & Jansen,
2004).
A diversidade genética, em última instância, é passível de acontecer
graças à capacidade de mutação do parasito e à presença de uma fase sexual
obrigatória no vetor na qual ocorre a recombinação gênica que poderá gerar
novos genótipos do parasito (Babiker et al., 1998). Essa diversidade é em parte
responsável pelo êxito na sobrevivência da espécie, assim como pelo fracasso
das medidas empregues com objetivo de erradicação deste parasito. Entre
outras vantagens, a diversidade genética confere ao Plasmodium a capacidade
de evadir a resposta imune do hospedeiro e produzir variantes resistentes a
medicamentos e a vacinas.
Até a presente data as investigações feitas sugerem que a diversidade
genética das populações naturais do P. falciparum varia de acordo com as
características epidemiológicas da região. Deste modo, principalmente em zonas
com baixa transmissão, o mosquito vetor poderá ingerir sangue com gametócitos
pertencentes a um só clone; neste caso os eventos de fertilização ocorrem em
gametócitos geneticamente idênticos e, por conseguinte, originam zigotos
12
diplóides, homozigóticos em todos os loci e, portanto, com o genótipo do clone
original (“auto-entrecruzamento”) (Korenromp et al., 2004; Babiker et al., 1999;
Jiménez et al., 2005).
Por outro lado, em regiões com alto grau de transmissão da malária, um
indivíduo pode estar infectado com múltiplos clones de P. falciparum, pelo fato
do mosquito anofelino ter ingerido gametócitos pertencentes a clones
geneticamente distintos. Este processo conduzirá à formação de zigotos
heterozigotos pela produção de novas combinações de genes dentro da
progênie haplóide (esporozoítas) (Babiker et al., 1997;1999; Haddad et al., 1999;
Jiménez et al., 2005).
A diversidade genética no P. falciparum está também estreitamente
relacionada com a multiplicidade de infecções. Em regiões com transmissão
estável, a principal causa geradora de diversidade parece ser a multiplicidade de
infecções, gerada pela alta taxa de inoculações entomológicas, definidas pelo
numero de picadas infectantes por pessoa por ano (Beier et al., 1994; Jiménez et
al., 2005). Uma taxa de inoculação entomológica alta implica contínuas
inoculações infectantes e uma constante geração de novos genótipos do
parasito, produto de uma taxa alta de recombinação genética no mosquito vetor.
Neste sentido estudos que comparavam as infecções por P. falciparum em
regiões da África com diferentes graus de endemicidade, mostraram uma
associação entre a taxa de inoculação entomológica e o número de genótipos
detectados nas pessoas infectadas (Babiker et al., 1997; Jiménez et al., 2005).
Por conseguinte, para se desenvolverem medidas de controle efetivas em
regiões com diferentes graus de endemicidade se requer, entre outros aspectos,
o conhecimento da estrutura genética do P. falciparum.
Os primeiros estudos bioquímicos para diferenciar cepas de P. falciparum
foram realizados através da análise dos perfis isoenzimáticos, método que foi
substituído por eletroforese de proteínas de duas dimensões no qual, pelo
menos, 20 proteínas de P. falciparum foram diferenciadas pelo seu ponto
isoelétrico e seu peso molecular (Carter et al., 1973; Tait, 1981; Fenton et al.,
1991; Jiménez, et al., 2005).
13
Em 1985, foi empregada a técnica de imunofluorescência indireta para
se investigar a presença de diferenças antigênicas intra-espécie entre clones de
P.falciparum (McBride et al., 1985, revisto por Jiménez et al., 2005).
Na década de 90, o seqüenciamento de genes de Plasmodium, conduziu
ao uso de metodologias moleculares, particularmente, a Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR) que permitiu evidenciar diferenças genéticas dentro da
espécie (Babiker et al., 1997; Joshi, 2003). Esta reação, pela capacidade de
revelar polimorfismos de tamanho entre os amplicons, vem se mostrando como
método eletivo para estudos de polimorfismo gênico em amostras de campo
devido à sensibilidade e especificidade para amplificar marcadores genéticos,
assim como pela possibilidade do uso de pequenas quantidades de sangue.
Além disso, a PCR não necessita cultivo in vitro de parasitos, o que poderia
conduzir a uma seleção de clones.
6. Dificuldade de Controle e Desenvolvimento de uma Vacina
Considerando-se o número alarmante de casos de malária em Angola e
no mundo em geral e o aumento da incidência da resistência do parasita às
drogas e do mosquito vetor aos inseticidas, fica claro que controlar a transmissão
da doença continua sendo um grande desafio e um projeto a longo prazo. Em
conseqüência disso, nos últimos anos, esforços têm sido concentrados no
desenvolvimento de uma vacina principalmente contra o P. falciparum, a espécie
responsável pela grande maioria dos casos letais de malária.
Nesse sentido, um grande progresso vem sendo alcançado na
identificação de antígenos plasmodiais. Entre os antígenos identificados, a MPS-
2 e a proteína SERA - também conhecida como SERP ou p126 (Delplace et al.,
1985; Morimatsu et al., 1997) - são considerados alvos potenciais para compor
uma vacina antimalárica.
Diante das evidências da participação da MPS-2 no processo de invasão
do merozoíta revelada, sobretudo, pela inibição dessa invasão por anticorpos
monoclonais direcionados a um epítopo dessa proteína (Saul et al., 1989), além
de sua localização na superfície do parasita e, portanto, acessível ao sistema
imune do hospedeiro, começou-se a se cogitar no uso de unidades peptídicas
14
conservadas deste antígeno na constituição de uma vacina antimalárica. Além
de que anticorpos naturalmente adquiridos têm sido associados com a
imunidade clínica em África (Metzger et al., 2003, Polley et al., 2006; Ferreira &
Hartl, 2007).
A SERA/p126 apresenta características importantes que a qualificam
como excelente candidata a entrar na composição de uma vacina antimalárica,
tais quais: anticorpos monoclonais e/ou policlonais específicos para SERA
inibem o crescimento do parasita in vitro (Chulay et al., 1987; Bzik et al., 1988;
Horri, Bzik & Inselburg, 1988; Knapp et al., 1989); indução de uma resposta
imune protetora contra a infecção experimental de P. falciparum em macacos
Saimiri e Aoutus (Perrin et al.,1984; Delplace et al.,1985; Inselburg et al.,1991;
Knapp et al., 1992; Enders, Hundt & Knapp, 1992; Inselburg et al., 1993a;
Inselburg et al. 1993b; Fox et al. 1997); existência de uma associação positiva
entre a resposta anticorpo e o grau de resposta imune (Banic et al., 1998; Okech
et al., 2001, 2006) e; associação positiva entre a imunidade natural induzida por
resposta a anticorpos para o domínio de 47 kDa e a crescente proteção imune
em adultos no Uganda- África (Safriti et al, 2003).
15
7. MSP-2 (merozoite surface protein / proteína 2 de superfície do merozoíta)
O gene da MSP-2 é de cópia única e está localizado no cromossomo 2 do
parasita. Para este gene têm sido descritas seqüências polimórficas tanto em
isolados mantidos em laboratório como nos de campo/selvagem. A região mais
utilizada para estudos de polimorfismo gênico é a seqüência polimórfica
denominada bloco 3 que está localizada no bloco central. O bloco central
contém seqüências conservadas e não repetitivas que permitem classificar o
gene da MSP-2 em duas famílias alélicas denominadas FC27 (Papua-Nova-
Guiné) e IC/3D7 (Indonésia) (Smythe et al., 1988; 1990) (Figura 8). Essas
famílias alélicas da MSP-2 correspondem, respectivamente, a dois sorogrupos
antigenicamente distintos e denominados de A (FC27) e B (3D7) que são
frequentemente e fortemente reconhecidos por anticorpos de indivíduos
expostos a infecções maláricas por P.falciparum (Fenton et al., 1990; Ekala et
al., 2002; Sallenave-Sales et al., 2007).
Talvez como parte de um mecanismo de evasão do sistema imune, as
seqüências do DNA da MSP-2 possuem um bloco variável correspondente à
região central que gera formas com diversidade antigênica (Smythe et al., 1988;
1990; Aubouy et al., 2003).
O polimorfismo encontrado nestas duas famílias alelicas é
principalmente associado ao número de repetições (Smythe et al., 1988; Snewin
et al., 1991; Aubouy et al., 2003), que pode ser usado para distinguir o tamanho
de diferentes alelos depois da amplificação por PCR.
A MSP-2 apresenta propriedades de uma glicoproteína membranar de
aproximadamente 45 kDa com um segmento de aminoácidos hidrofóbicos na
extremidade N-terminal típica de um peptídeo sinal e uma ancora de glicosil-
fosfatidil-inositol (GPI) na extremidade C-terminal. Essa proteína é expressa
durante toda a fase assexuada do P. falciparum, embora atinja os maiores níveis
de expressão nos estágios de trofozoíta maduro e de esquizonte (Barron, 1992).
A extensiva diversidade de seqüências nucleotídicas observadas na MSP-
2 tem sido interpretada como resultante, principalmente, de eventos de
recombinação meiótica envolvendo clones do parasita geneticamente distintos
que infectam alguns mosquitos vetores (Babiker & Walliker, 1997; Hoffmann et
al., 2006). Assim como em muitos outros antígenos de superfície do P.
16
falciparum, a seqüência repetitiva de aminoácidos da MSP-2 pode ser reflexo de
eventos semelhantes de recombinação durante a meiose e a mitose (Rich &
Ayala, 2000; Hoffmann et al., 2006). Também é consenso que a proporção de
clones com infecções mistas (Anderson et al., 2000) e a taxa de recombinação
meiótica em populações naturais do parasito está possivelmente associada com
os níveis de transmissão de malária devido aos diversos cruzamentos existentes
em áreas com alto grau de endemicidade (Hoffmann et al., 2006).
SERA / p126
Essa proteína foi inicialmente chamada de p126 pelo seu tamanho (M
r
de
126000 Da) (Delplace et al., 1985). Em 1989, ela foi denominada de SERA por
Li e colaboradores, em função da seqüência de aminoácidos que a codifica e por
conter uma expressiva região de repetições de polisserina.
A SERA é o principal antígeno do vacúolo parasitário do P. falciparum
(Delplace et al., 1985; Bzik et al.,1988; Fox et al., 1997), sendo sintetizada entre
a 32ª e a 36ª hora do ciclo eritrocítico. No final desse ciclo esta proteína é
proteolisada em dois fragmentos de 73 e 50 kDa que podem ser detectados, in
vitro, no sobrenadante de cultura e, in vivo, como antígeno circulante ou
absorvido na membrana de superfície de merozoítas livres (Perekins & Ziefer,
1994).
O fragmento de 73 kDa é constituído por duas unidades de 47 e 18 kDa
unidas através de pontes de sulfeto. A unidade 47 kDa contém uma seqüência
de 6 octapeptídios repetidos que correspondem à extremidade N-terminal da
SERA /p126 (Figura 2) (Debrant et al. 1992). Essa unidade está associada com a
inibição do crescimento do parasito in vitro e in vivo (Fox et al., 1997; Fox et al.,
2002; Safirti et al., 2003).
Essa proteína contém domínios conservados localizados próximos á
extremidade carboxi-terminal, que apresenta homologias com cisteína protease
(Mottram et al., 1989; Higgins, Mcconnel & Sharp, 1989; McCoubrie et al., 2007),
sugerindo que esta proteína pode agir como uma protease envolvida no
processamento de proteínas de esquizontes maduros e/ou na clivagem de
proteínas do citoesqueleto durante os processos de ruptura e de invasão dos
eritrócitos (Gor & Rosental, 1980).
17
A análise do gene que codifica a SERA/P126 foi realizada utilizando-se
cepas FCR3 (Delplace et al. 1988; Li et al. 1989 ) e FCBR (Kanpp et al. 1989).
O gene da SERA/p126 (Figura 9) pertence a uma família multigênica que
consiste de 8 homólogos de SERA agrupados no cromossomo 2 e mais um
homólogo agrupado no cromossomo 9. Todos os homólogos de SERA são
transcritos mais ativamente nas fases de trofozoíta e esquizonte e o SERA 5 é o
homólogo mais preferencialmente transcrito. Geralmente, a estrutura do gene da
SERA/p126 é extremamente conservada entre os isolados de P.falciparum e
todas as substituições de nucleotídeos são encontradas no exon II do gene que
corresponde ao domínio de 47kDa da proteína (Horii et al., 1988; Knapp et al.,
1989; Li et al., 1989; Morimatsu et al., 1997). O éxon II compreende dois
domínios repetitivos: a região OR ou repetições de octapectídeo, e a região SR,
ou de repetições de serina. Nessas regiões ocorrem substituições sinônimas e
não-sinônimas que caracterizam a presença de polimorfismo (Morimatsu et al.,
1997; Liu, et al., 2000; Safitri et al. 2003). A região OR possui epítopos
conformacionais bem caracterizados; anticorpos monoclonais dirigidos a esses
epítopos podem inibir o crescimento do parasito (Fox, Horri & Bzik, 2002; Safitri
et al., 2003). Ela consiste basicamente de seis unidades de octâmeros que
podem ser identificadas em diferentes alelos e todas as substituições de
nucleotídeos na OR são substituições não sinônimas. A região SR é
caracterizada por longos resíduos de serina, seguida por um grupo de 17
resíduos variáveis de aminoácidos (Figura 2). Quatro locais de polimorfismo e
inserções de 13 resíduos de aminoácidos podem ser encontrados na SR
(Morimatsu et al.,1997; Liu et al., 2000; Safitri et al., 2003).
18
Figura 2 - Representação esquemática da SERA / p126 (adaptada de Riccio et
al., 2005)
19
II) Justificativa e Objetivo
Considerando que o conhecimento do polimorfismo gênico das proteínas
MSP-2 e SERA poderá ser de potencial interesse para o desenvolvimento de
vacinas contra estágios assexuados sanguíneos do P. falciparum, aliado à
inexistência de estudos relacionados a esse tema em áreas endêmicas
angolanas, nos propomos a realizar este trabalho com o objetivo de conhecer o
polimorfismo gênico de populações de parasitas dessa espécie circulantes neste
país africano.
Para alcançarmos esse objetivo usamos as seguintes estratégias:
Estudar a variabilidade alélica dos genes da MSP-2 e da SERA/p126 de
amostras de Plasmodium falciparum através da amplificação de regiões
polimórficas destes genes pela técnica de PCR;
Seqüênciar a região polimórfica para se localizarem possíveis pontos de
mutação;
Relacionar a presença de tais polimorfismos com idade, parasitemia e
número de infecções passadas dos pacientes e;
Comparar esses polimorfismos com os descritos em áreas malarígenas de
outros países africanos, asiáticos ou sul-americanos.
20
III) CASUÍSTICA E MÉTODOS
1. Área estudada
A província de Luanda, capital da República de Angola (Figura 3) possui
um clima tropical seco e fica situada na costa a 8
o
52´ 25´´S 13009´39´´E. Essa
província tem uma área de aproximadamente 2.257 Km
2
e uma população de
4.500.000 habitantes (Figura 4).
Nos últimos 31 anos, a cidade de Luanda sofreu com o êxodo rural muito
grande devido ao conflito armado que o país sofreu nestas três últimas décadas,
além de ter recebido um grande número de imigrantes vindos de países vizinhos
ou não que se deslocam para Angola em busca de emprego e rendimentos por
causa da situação sócio-político-econômica favorável na qual o país vive.
21
Figura 3 - Mapa de Angola (adaptado de Sou Turista, 2008).
22
Figura 4 – Mapa da província de Luanda (adaptado de MINSA-OMS 2008).
Rangel - 8
Sambizanga - 5
Ingombotas – 35
Cazenga - 10
23
2. Casuística
As amostras de P.falciparum foram obtidas a partir de punção venosa em
58 indivíduos sintomáticos com malária aguda por P. falciparum residentes na
província de Luanda que recorreram para atendimento em Centros de Saúde de
quatro municípios desta província: Centro de Saúde da Terra Nova (n=8),
município do Rangel (Figura 7), Centro de Saúde do Sambizanga (5), município
do Sambizanga (Figura 5), Centro de Saúde da Ilha (35), município das
Ingombotas (Figura 6) e Centro de Saúde do Hoje-ya-Henda (11), município do
Cazenga. Após ciência através do "Termo de Consentimento Pós-informado"
(em anexo) dos objetivos do projeto, a parasitemia de cada indivíduo foi avaliada
através do exame microscópico direto da gota espessa corada pelo método May-
Grünwald Giemsa e a identificação da espécie de plasmódio pelo exame de
distensão sanguínea, corada através do mesmo método. Todos os indivíduos
responderam a um questionário padrão para a obtenção de dados
epidemiológicos.
Figura 5 - Centro de Saúde do Sambizanga
24
Figura 6 - Centro de Saúde da Ilha, em Ingombotas (minha colega Guilhermina
Carvalho ao microscópio).
Figura 7 - Centro de Saúde da Terra Nova, em Rangel
25
3. Avaliação da parasitemia
Em nosso laboratório, (Laboratório de Pesquisas em Malária) a
identificação da espécie plasmodial foi confirmada através do exame
parasitoscópico da distensão sanguínea corada pelo método de May-Grunwald
Giemsa, enquanto que a parasitemia foi avaliada através do exame microscópico
direito em gota espessa corada como citado acima. A leitura das lâminas
baseou-se na contagem de 100 campos e o resultado foi expresso em função do
numero de parasitas/µL de sangue utilizando-se uma tabela que converte
parasitas por campo para parasitas/µL. Não verificamos pelo exame
microscópico a presença de infecção mista (P.falciparum e P.vivax), nem de
infecção pelo P.vivax.
4. Coleta e estocagem das amostras de P.falciparum
A coleta do sangue foi obtida por punção venosa, utilizando tubos
Vacutainer contendo EDTA (Becton, Dickinson & Company). A amostra de
sangue foi centrifugada (3500 x g / 10 min) para remoção do plasma. Em
seguida, a papa de hemácias foi dividida em alíquotas de 500µL, que foram
estocadas (v/v) numa solução criopreservadora - “glicerolyte” (NaCl 0,9% sorbitol
4,2% glicerol 20%). O material devidamente acondicionado foi transportado para
a Fundação Oswaldo Cruz (Laboratório de Pesquisas em Malária), onde
permaneceu estocado a – 20ºC, até o momento do estudo.
26
5. Extração do DNA (Acido desoxirribonucléico)
A extração de DNA foi realizada utilizando-se kit de extração de DNA
QIAamp® DNA Blood Midi kit - Qiagen®, segundo instruções do fabricante .
6. Reação de PCR (Reação de polimerização em cadeia) MSP-2 / SERA/p126
O gene da MSP-2 é extremamente conservado nas extremidades 5’
(primeiros 129 nucleotídeos) e 3’ (últimos 222 nucleotídeos), entretanto a região
central é constituída de segmentos polimórficos. Esta região pode apresentar
unidades de repetições variáveis (R1 e R2) flanqueadas por regiões variáveis
não repetitivas (E1, E2 e E3), que definem as duas famílias alélicas da MSP-2
denominadas 3D7 / INDOC- I (Indochina) e FC27 (Papua Nova Guine) (Figura 8).
Apesar de existir entre as duas famílias uma conservação na composição geral
de aminoácidos, bem como de cargas hidrofóbicas da molécula, cada uma delas
representa uma estrutura gênica característica (Smythe et al., 1988; Smythe et
al., 1990; Thomas et al., 1990).
Em ambas as famílias (FC27 e 3D7) as unidades repetitivas são
altamente polimórficas, podendo variar nos tipos alélicos em termos de número,
tamanho e seqüência. A família FC27 apresenta a primeira região repetitiva (R1)
constituída freqüentemente de 1-3 cópias da unidade de 96 pb (12 aminoácidos)
(Smythe et al.,1988; Thomas et al., 1990). Já na família 3D7, a região R1 é
composta por múltiplas cópias de uma região rica em códons de aminoácidos
glicina, alanina e serina e a região R2 é formada por varias cópias de 9 pb (ACT-
ACC-ACA) que representam códons alternativos do aminoácido treonina
(Smythe et al.,1990).
27
Figura 8 – Representação esquemática das regiões da proteína MSP-2 das
cepas FC27 (Smythe et al, 1988) e 3D7 (Smythe et al, 1990), representando as
famílias alélicas. Os traços verdes e brancos correspondem à posição dos
oligonucleotídeos utilizados na PCR e no seqüenciamento
A região central polimórfica da MPS-2 foi amplificada utilizando-se
oligonucleotídeos situados nas porções conservadas que flanqueiam a região
central variável do gene (Hoffman et al. 2001). O oligonucleotídeo senso,
denominado P1f, apresenta a sequência 5’ – GAA GGT AAT TAA AAC ATT GCT
– 3’, enquanto que o oligonucleotídeo antisenso, P1r, apresenta a sequência 5’ –
GAG TAT AAG GAG AAG TAT G – 3’ (Hoffman et al., 2001). Para a segunda
reação foram utilizados oligonucleotídeos senso denominados de P2f, cuja
28
seqüência é 5’- GAG GGA TGT TGC TCC ACA G – 3’ e oligonucleotídeos
antisenso nomeados de P2r apresentando a sequência 5’ – CTA GAA CCA TGC
ATA TGT CC – 3’ (Hoffman et al. 2001). Cerca de 3µL de DNA foi amplificado
em uma solução contendo: tampão 1X; MgCl
2
2,5mM (Applied Biosystems);
200µM de cada nucleotídeo (dATP, dTTP, dCTP e dGTP) (Amersham); 20pmol
de cada “prime” (Invitrogen); 2,5 unidades de Taq polimerase (Applied
Biosystems, USA) e; água destilada para um volume final de 50µL. Para a
segunda reação, o mesmo procedimento foi realizado com 3µL do produto
amplificado da primeira reação.
As amplificações da primeira e da segunda reação foram realizadas em
um termociclador (Applied Biosystems, série 9700) nas seguintes condições:
primeira amplificação - 1hold: 95
0
C / 5 min, 3 ciclos de 94
0
C / 1 min, 55
0
C / 2
min, 32 ciclos 94
0
C / 30 seg , 50
0
C / 1min, 65
0
C / 2 min e 1 hold final de 72
0
C / 2
min; segunda amplificação - 35 ciclos de 94
0
C / 30 seg, 50
0
C / 1min, 72
0
C / 2 min
e um hold 72
0
C / 10 min.
Em relação à proteína SERA, a região repetitiva foi amplificada utilizando-
se dois pares de oligonucleotídeos que foram desenhados para hibridizar com as
regiões flanqueadoras desta região (Figura 9). Para 2,5µL de DNA de cada
amostra processada, foram adicionados 1,5 mM de MgCl
2
, 250µM de cada
desoxinucleotídeo trifosfatodo (dNTP) e 2.5 unidades de taq polimerase
(Applied Biosystem, USA) contendo os oligonucleotídeos iniciadores (100 pmol
cada). A reação de PCR foi realizada num volume de 50µL em dois estágios. O
primeiro estágio foi realizado com o seguinte par de iniciadores: p126 A (5’ –
AAT GAA GTC ATA AAT TTC CTT G – 3’) e p126 B ( 5’ CAA TGT TGT
TCT TAA TTC GAT A – 3’) para amplificar o fragmento de 660 bp que
correspondente à parte 5’ da região que codifica a SERA. Em seguida, 2,5µL
dessa primeira reação acrescidos de 1,5 mM de MgCl
2
, 250µM de cada
desoxinucleotídeo trifosfatodo (dNTP) e 2.5 unidades de taq polimerase
(Applied Biosystem, USA) foram amplificados num segundo estágio, agora com
os iniciadores p126 C ( 5’ – GTG TTA TAT TTA ACA AAA ATG – 3’) e p126
D (5’- CTT ACA GGA TTG CTT GGT TCG- 3’ ) para amplificar o fragmento de
199bp presente no primeiro produto da PCR. As condições de amplificação
29
foram: 30 ciclos(1 min / 95
o
C; 2 min / 47
o
C; 2 min / 72
0
C) (Wataya et al., 1993;
Riccio 2005).
Representa
Representa
ç
ç
ão esquem
ão esquem
á
á
tica do gene
tica do gene
da SERA (REGIÃO 5
da SERA (REGIÃO 5
’
’
)
)
660 bp
199bp
1ª Amplificação
2ª Amplificação
Região codificante
Intron
Região codificante de 6
octaptideos
Figura 9 - Representação esquemática do gene que codifica a SERA / p126
mostrando a posição dos oligonucleotídeos utilizados na PCR (1ª amplificação
PA e PB e 2ª amplificação PC e PD) e no seqüenciamento (PC e PD) (Wataya
et al., 1993; Riccio et al., 2005).
7. Análise do produto amplificado por PCR
7.1. Eletroforese em gel de agarose
Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose
2% (Sigma) contendo 2,4 µg/mL de brometo de etídeo (Sigma) e TAE (Tris-
acetato 0,04M e EDTA 0,001M) (Sigma); uma voltagem constante de 90V/cm
durante aproximadamente 90 minutos foi mantida.
Em cada poço do gel foram aplicados 15µL do produto amplificado
previamente homogeneizado em 3µL de tampão de amostra (azul de bromofenol
30
0,25%; xileno cianol 0,25% e glicerina 30%). Para a estimativa do peso
molecular dos fragmentos amplificados também foram aplicados no gel de
agarose 4 µL do marcador de peso molecular PUC MIX Marker 8 (0,1 µg / mL -
Fermentas).
Após a eletroforese, as bandas correspondentes aos fragmentos
amplificados foram visualizadas em um transluminador de ultravioleta (IBI) e o
gel fotografado com filme Polaroid (Polaroid 667 / Kodak).
7.2. Purificação e Seqüenciamento
O volume de 35 µL dos fragmentos amplificados selecionados em função
da nitidez das bandas, foi submetido á purificação pelo método de centrifugação
do kit Wizard® SV gel and PCR Clean-up system (Promega), de forma a serem
diretamente seqüenciados. Cada fragmento selecionado foi seqüenciado
utilizando-se oligonucleotídeos localizados em porções mais internas (2.3 e 2.4
para a MSP-2 e PC e PD para SERA/p126). A leitura das reações foi feita na
plataforma version 3.1 (Applied Biosytems), programada com as seguintes
condições: 40 ciclos nas temperaturas de 96
0
C / 10 segundos, 50oC / 5
segundos e 60
o
C / 4 minutos. A leitura das reações foi feita na plataforma PDTIS
/ Fiocruz, composta pelo seqüenciador capilar automático ABI Prism DNA
Analyzer 3730 (Applied Biosystems), e as seqüências foram analisadas
utilizando o software BioEdit .
7.3. Análise das seqüências nucleotidicas
As seqüências nucleotídicas foram analisadas e alinhadas com o auxílio
do software BioEdit Sequence Alignment Editor version 7.0.5.2; as seqüências
senso e anti-senso de cada uma das amostras foram editadas pelo método de
alinhamento pareado global.
31
III Resultados
1. Avaliação da parasitemia
Foram estudadas amostras de P.falciparum coletadas de 58 pacientes
em Luanda nos Centros de Saúde de Rangel, Sambizanga, Ilha e do Hoje-Ya-
Henda por ocasião do diagnóstico, antes do inicio do tratamento. A análise das
amostras de sangue pelo exame parasitológico da gota espessa mostrou que os
indivíduos apresentavam uma parasitemia que variou de 500 a 27500 parasitas
por µL de sangue (mediana = 2000)
Dessas 58 amostras cujos DNAs foram amplificados frente aos
ologonucleotídeos da SERA/p126, somente o DNA de 32 delas foi amplificado
com os oligonucleotídeos da MSP-2 (Tabela 1).
Tabela 1 – Resultados da Nested-PCR de 58 amostras de P.falciparum frente
aos oligonucleotídeos da SERA/p126 e da MSP-2.
Nested-PCR
SERA / p126
MSP-2
NT / NP (%)
58 / 58 (100)
NT / NP (%)
58 /
32 (55)
NT– número testado; NP - número de positivos
32
2. Análise do polimorfismo gênico pela PCR
2.1. MSP-2
A amplificação da região central variável da MSP-2 nas 32 (55%)
amostras gerou um total de 34 fragmentos pela Nested–PCR.
O tamanho aproximado desses fragmentos, estimado em gel de
agarose, permitiu a identificação de nove fragmentos diferentes que foram
denominados de tipos: A (500 pb), B (520pb), C (580 pb), D (600 pb), E (650 pb),
F (680 pb), G (700 pb), H (750 pb) e I (800 pb).
O fragmento mais freqüente nas amostras estudadas foi o do tipo D
(Tabela 2 e Figuras 10 e 11).
Tabela 2 – Tipos de fragmentos obtidos pela Nested–PCR frente aos
oligonucleotídeos de MSP-2 de 32 amostras de P.falciparum.
N - número de amostras
Tipos de Fragmentos (pb)
N / %
A (500)
B (520)
C (580)
D (600)
E (650)
F (680)
G (700)
H (750)
I (800)
3/ 9
1 / 3
4/ 13
15 / 47
4/ 13
3 / 9
1 / 3
1 / 3
2 / 6
33
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
500pb 520 pb 580b 600 pb 650pb 680pb 700 pb 750 pb 800 pb
Alelos
Frequências (%)
B
H
I
G
C
A
E F D
Figura 10 - Freqüência dos alelos da MSP-2 obtidos por Nested-PCR de 32
amostras de P. falciparum provenientes de Luanda – Angola.
F E I * D/F E D * E G D * * H
Figura 11 – Tipos de fragmentos amplificados por nested-PCR da região central
variável da MSP-2 nas amostras de P. falciparum provenientes de pacientes
angolanos moradores em Luanda. Foram amplificados os seguintes alelos: F
(680 pb); E (650 pb); E/D (600/650 pb); E (650pb); D (600 pb); G (700 pb); D
(600 pb), I (800 pb) e H (750 pb). * Controles negativos.
489 - 501
pb
34
2.2. SERA/p126
A amplificação da região central variável da SERA/p126 de 58 amostras
gerou um total de 100 fragmentos pela Nested–PCR. O tamanho aproximado
desses fragmentos, estimado em gel de agarose, permitiu a identificação de seis
alelos que foram denominados de tipos: SERA A (200pb), SERA B (300 pb),
SERA C (400pb), SERA D (500pb), SERA E (700 pb) e SERA F (800 pb), sendo
que o alelo SERA A estava presente em todas as amostras estudadas (Tabela 3
e Figuras 12 e 13).
Tabela 3 – Tipos de fragmentos obtidos pela Nested–PCR frente aos
oligonucleotídeos SERA/p126 de 58 amostras de P.falciparum.
Tipos de Fragmentos (pb) N (%)
SERA A (200)
SERA B (300)
SERA C (400)
SERA D (500)
SERA E (700)
SERA F (800)
58 (100)
1 (2)
26 (44)
4 (7)
2 (3)
9 (15)
35
Figura 12 - Freqüência dos 58 alelos da SERA/p126 obtidos através da
amplificação pela nested-PCR em amostras de P.falciparum provenientes de
Figura 12 - Freqüência alelos da SERA/p126 obtidos por Nested-PCR de 58
amostras de P. falciparum provenientes de Luanda – Angola.
A/C/F A A/B/E
Figura 13 – Tipos de fragmentos amplificados por nested-PCR da região do
éxon II da SERA em amostras de P. falciparum provenientes de pacientes
angolanos moradores em Luanda. SERA A (200pb); SERA B (300pb); SERA C
(400pb), SERA E (700pb) e SERA F (800pb).
489 - 501pb
36
3. Complexidade das infecções
Na área estudada, a complexidade das infecções nas amostras de P.
falciparum foi estimada considerando o número dos fragmentos (bandas)
verificados em cada amostra após amplificação pela nested-PCR. Assim, as
amostras que tinham apenas um fragmento apresentavam infecções simples
(IS), enquanto que aquelas que possuíam mais de um fragmento apresentavam
infecções mistas (IM).
Com relação à MSP-2, as IS corresponderam a 87,5% enquanto que as
IM a 12,5% (Tabelas 4 e 5). Já com relação à SERA/p126 as IS corresponderam
a 43% e as IM a 57% (Tabelas 6 e 7).
Tabela 4 - Infecções simples referentes à MSP-2 em 32 amostras de P.
falciparum.
* casas decimais omitidas
.
Tipos Fragmentos
Amostras
(pb) N / %
A (500)..
1 / 3
B (520) 1 / 3
C (580) 3 / 9
D (600)
15 / 47
E (650)
1 / 3
F (680) 4 / 13
H (750) 1 / 3
I (800)
2 / 6
TOTAL 28 / 87,5*
37
Tabela 5 - Infecções mistas referentes à MSP2 em 32 amostras de P. falciparum.
*casas decimais omitidas
Tabela 6 - Infecções simples referentes à SERA/p126 em 58 amostras de P.
falciparum.
Fragmentos Amostras
( pb ) N / %
A/C (500/580) 1/3
A/D (500/600) 1/3
D/E (600/650) 1/3
E/G (650/700) 1/3
TOTAL 4 / 12,5*
Fragmento (pb)
Nº de amostras / %
A (200) 25 / 43
TOTAL 25 / 43
38
Tabela 7- Infecções mistas referentes à SERA/p126 em 58 amostras de P.
falciparum.
Fragmentos ( pb ) Nº de amostras / %
A/B/D/F (200/300/500/800 1/2
A/C/F (200/400/8
00) 7/12
A/C/E (200/400/700) 1/2
A/B/E (200/300 700) 1/2
A/
D/E (200/500/700) 1/2
A/D/F (200/500/8000) 1/2
A/C (200/400) 21/36
TOTAL 33 / 57
39
4. Analise das seqüências alélicas
Com o intuído de se verificarem as heterogeneidades de DNA
responsáveis pelos polimorfismos da MSP-2 e da SERA/p126 encontrados na
área estudada e também para tipificar quanto à família alélica, os nove
fragmentos da MSP-2 (A, B, C, D, E, F, G H e I) e os seis fragmentos da
SERA/p126 (A, B, C, D, E e F) foram submetidos ao seqüenciamento. Com
relação à MSP-2, dos 19 fragmentos de amplificação cujos DNAs foram
purificados, 10 foram seqüenciados com sucesso (alelos tipos B, C, D, E, F e H)
enquanto que para a SERA/p126, dos 30 fragmentos apenas 14 foram
seqüenciados com sucesso (alelos tipos A, B, C e F). O sequenciamento de
todos os alelos foi feito diretamente sem clonagem.
4.1. MSP - 2
A diferença de tamanho entre os fragmentos identificados na nested-
PCR nos levou a considerá-los, inicialmente, como de famílias diferentes. Mas,
após o sequenciamento, verificamos que todos os alelos que foram possíveis de
serem identificados pelo sequenciamento B (1), C (2), D (3), E (1), F (2) e H (1)
pertenciam à família alélica 3D7.
A) Seqüências alélicas 3D7
As seqüências nucleotídicas e de aminoácidos dos alelos estudados (B,
C, D, E, F e H) e da “cepa” 3D7 (referência/protótipo) se mostraram bastantes
similares. A região R1 foi a que mostrou mais divergências entre os alelos
estudados e a “cepa” 3D7. Nos alelos estudados, esta região se iniciou por um
bloco de unidades repetitivas em tandem, com a presença de riqueza dos
códons alternativos de GSAG, diferente da cepa de referência 3D7 cuja R1 tem
riqueza de códons alternativos GGSA (Figura 14). Nos alelos angolanos esta
região iniciou com comprimento semelhante ao da “cepa” 3D7, mas a seqüência
40
de aa era diferente: ocorreram inserções de ácido aspartico (D) na posição 70
aa, valina (V) na posição 73 aa e arginina (R) na posição 77 aa.
Diferentemente do polimorfismo encontrado na R1, nos alelos angolanos
a região R2 se caracterizou por uma conservação estrutural representada pela
presença de códons alternativos do aminoácido treonina (T), havendo apenas
uma substituição não sinônima de uma treonina (T) por uma lisina (K) na posição
100 aa.
O limitado polimorfismo de seqüência encontrado num curto segmento
da região E1 dos alelos angolanos divergiu da cepa 3D7 por apresentarem uma
substituição de um resíduo de treonina (T) na posição 50 aa.
Entre as regiões família especifica, a região E2 foi a que apresentou
maior variabilidade, apresentando mutações por substituições não sinônimas nos
alelos estudados (A, B, C, D, E e F). As substituições incluíram a troca de: um
resíduo de ácido aspartico (D) por um resíduo de alanina (A) na posição 80 aa,
asparagina (N) por uma glicina (G) na posição 81 aa, e uma prolina (P) por uma
arginina (N) na posição 82 aa em todos os alelos sequenciados.
A região família especifica E3 mostrou uma pequena diversidade, sendo
comum, ao longo de toda sua extensão, em termos de número e tamanho,
havendo apenas uma substituição de um ácido glutâmico (E) por uma lisina (K)
na posição 139 aa dos alelos estudados.
Como exemplo ilustrativo, optamos por mostrar a comparação do alelo D
(600 pb) com a “cepa” de referência 3D7 (Smythe et al., 1990) porque todos os
alelos apresentaram a mesma seqüência de nucleotídeos e por ele ter sido o
mais freqüente (Figuras 15 e 16).
41
Alelo Protótipo 3D7
P1f
P2f
P2r
38 205
4X GGSA P1r
Alelo D
2X GSAG
Região família específica 1 (E1)
Região de 4 aa (R1)
Região família específica 2 (E2)
Região repetições de treonina (R2)
Região família específica
Regiões N e C terminal
Figura 14 – Esquema deduzido das regiões da proteína MSP-2
correspondentes aos alelos 3D7 protótipo (Smythe et al., 1989) e tipo D
detectado em amostras de P.falciparum coletadas em Luanda-Angola. Os
números P1f, P1r, P2f e P2r assinalam as posições dos oligonucleotídeos
utilizados na PCR e no sequenciamento (P2f e P2r).
42
3D7 122 ATG GCA GAA AGT AAG CCT TCT ACT GGT GCT
Alelo D 122 ATG GCA GAA AGT AAG CCT CCT ACT GGT ACT
3D7 157 GCT GGT GGT GGT ACT GCT GGT GGT AGT GCT GGT GGT AGT
Alelo D 157 GGT GCT AGT GGT AGT GCT GGT TCT GGT GCT GGT GCT AGT
3D7 166 GGT AGT GCT GGT GAT GGT AAT GGT GCA GGT GGT AGT GCT
Alelo D 166 GGT AGT GCT GGT GCT CCT AAT GGT GCA GGT GCT AGT GCT
3D7 215 GGT TCT GGT GAT GGT AAT GGT GCA GAT GCT GAG GGA AGT
Alelo D 215 CGT AAG GGT GCT AAT CCT GGT GCA GAT GCT GAG GGA AGT
3D7 253 TCA AGT ACT CCC GCT ACT ACC ACA ACT ACC AAA ACT ACC
Alelo D 253 TCA AGT ACT CCC GCT ACT ACC ACA ACT ACC ACA ACT ACC
3D7 292 ACA ACT ACC ACA ACT ACT AAT GAT GCA GAA GCA TCT ACC
Alelo D 292 ACA ACT ACC ACA ACT ACT AAT GAT GCA GAA GCA TCT ACC
3D7 331 AGT ACC TCT TCA GAA AAT CCA AAT CAT AAA AAT GCC GAA
Alelo D 331 AGT ACC TCT TCA GAA AAT CCA AAT CAT AAA AAT GCC GAA
3D7 400 ACA AAT CCA AAA GGT AAA GGA GAA GTT CAA GAA CCA AAT
Aleo D 400 ACA AAT CCA AAA GGT AAA GGA GAA GTT CAA AAA CCA AAT
3D7 439 CAA GCA AAT AAA GAA ACT CAA AAT AAC TCA AAT GTT CAA
Alelo D 439 CAA GCA AAT AAA GAA ACT CAA AAT AAC TCA AAT GTT CAA
3D7 478 CAA GAC TCT CAA ACT AAA TCA AAT GTT CCA CCC ACT CAA
Alelo D 478 CAA GAC TCT CAA ACT AAA TCA AAT GTT CCA CCC ACT CAA
3D7 517 GAT GCA GAC ACT AAA AGT CCT ACT GCA CAA CCT GAA CAA
Alelo D 517 GAT GCA GAC ACT AAA AGT CCT ACT GCA CAA CCT GAA CAA
3D7 556 GCT GAA AAT TCT GCT CCA ACA GCC GAA CAA ACT GAA TCC
Alelo D 556 GCT GAA AAT TCT GCT CCA ACA GCC GAA CAA ACT GAA TCC
3D7 595 CCC GAA TTA CAA TCT GCA CCA GAG AAT AAA GGT ACA GGA
Alelo D 595 CCC GAA TTA CAA TCT GCA CCA GAG AAT AAA G-- --- ---
Figura 15 - Comparação entre as seqüências nucleotídicas da “cepa” protótipo
3D7 (Smythe et al., 1990) e as do alelo tipo D detectado nas amostras de
P.falciparum de Luanda-Angola. As regiões de repetição R1 e R2 estão
representadas em amarelo e as regiões E1, E2 e E3 em verde, azul e vermelho,
respectivamente. As letras em vermelho no alelo D indicam a substituição de
uma base em relação à “cepa” 3D7. A localização dos oligonucleotideos P2f e
P2r está indicada em sublinhado. As seqüências foram alinhadas através do
programa BioEdit.
43
3D7 38 RSMAESKPSTGAGGTAGGSAGGSAGGSAG-G--AGGSAGS 51
Alelo D 38 --MAESKPPTGTGASGSAGSGAGASGSAGSGDGAVASARK 51
3D7 52 GDGNGADAEGSSSTPATTTTTKTTTTTTTTNDAEASTSTS 120
Alelo D 52 GANPGADAEGSSSTPATTTTTTTTTTTTTTNDAEASTSTS 120
3D7 121 SENPNHKNAE TNPKGKGEVQ EPNQANKETQ NNSNVQQDSQ 160
Alelo D 121 SENPNHKNAE TNPKGKGEVQ KPNQANKETQ NNSNVQQDSQ 160
3D7 161 TKSNVPPTQD ADTKSPTAQP EQAENSAPTA EQTESPELQS 200
Alelo D 161 TKSNVPPTQD ADTKSPTAQP EQAENSAPTA EQTESPELQS 200
3D7 201 APENKGTGQH 210
Alelo D 201 APENK----- 210
Figura 16 - Comparação entre as seqüências peptídicas deduzidas da “cepa”
protótipo 3D7 (Smythe et al., 1990) e as do alelo 3D7 tipo D detectado em
amostras de P.falciparum de Luanda-Angola. As regiões de repetição R1 e R2
estão representadas em amarelo e as regiões E1, E2 e E3 em verde, azul e
vermelho respectivamente. As letras em vermelho no alelo D indicam a
substituição de uma base em relação à cepa 3D7. As seqüências foram
alinhadas através do programa BioEdit.
44
4.2. SERA / p126
Diferentemente da MSP-2, na SERA/p126 a diferença de tamanho entre
os fragmentos revelou a presença de duas famílias alélicas diferentes, após o
sequenciamento. Assim, os alelos SERA A (amostra 44), SERA B (amostra 183)
e SERA C (amostra 31) foram identificados como pertencentes à família alélica
K1, com perfil compatível com o tipo PA/7, ao passo que o alelo SERA F
(amostra 34) foi considerado como pertencente a família Honduras, com perfil do
tipo 3D7 (Figura 18) .
A) Seqüência alélica K1
As seqüências nucleotídicas e de aminoácidos dos alelos angolanos
(SERA A, SERA B e SERA C) e da “cepa” K1 de referência, considerada o
protótipo (Morimatsu et al.,1997), mostraram-se bastantes similares. A região SR
(repetições de serina) não foi identificada no sequenciamento porque os primers
utilizados neste processo (PC e PD) amplificam apenas as OR (repetição de
octapetídeos). A região OR dos alelos angolanos discordou da do protótipo K1 e
esses alelos divergiram entre si.
A região OR nos alelos SERA A, SERA B e SERA C tal como na cepa
K1 iniciou com uma unidade de octâmeros SQTGNTGG (1ª OR). Verificamos
divergência dos alelos SERA A, SERA B e SERA C com a cepa KI pela presença
de mutações por substituições não sinônimas nas seguintes posições: alelo
SERA A na posição 2ª aa da 1ª OR glicina (G) por alanina (A) e na posição 1ª
aa da 3ª OR valina (V) por ácido aspartico (D); alelo SERA B na posição 7ª aa
da 2ª OR valina (V) por glicina (G) e na 1ª aa da 3ª RO também uma valina (V)
por glicina (G) (além destas mutações, o alelo B diferiu do alelo K1, por ter
havido deleção da 6ª RO) e; no alelo SERA C posição 1ª aa da 3ª OR valina
(V) por ácido aspartico (D) (além destas mutações também houve deleção da
última (6ª) OR sendo, portanto, este alelo diferente do K1 também em termos de
tamanho) (Figura 18).
45
Protótipo K1
GGAGAAAGTCAAAGC
AGGTAATACAGGAGGAGGTCAAGCAGGTAATACAGTAGGAGTACAAGCAGGTAATACAGT
AGGAGATCAAGCAGGTAGTACAGGAGGAAGTCCACAAGGTAGT
Alelo SERA A
GGAGAAAGTCAAGC
AGGTAATACAGGAGGAGGTCAAGCAGGTAATACAGTAGGAGATCAAGCAGGTAATACAGT
AGGAGATCAAGCAGGTAGTACAGGAGGAAGTCCACAAGGTAGT
Alelo SERA B
GGAGAAAGTCAACG
ACAGGTAATACAGGAGGAGGTCAAGCAGGTAATACAGGAGGAGGTCAAGCAGGTAATACA
GTAGGAGATCAAGCAGGTAGTACAGGAGGAAGTCCACAAGGTAGTAC
Alelo SERA C
AATGTACAGGAGAAAGTCAA
ACAGGTAATACAGGAGGAGGTCAAGCAGGTAATACAGTAGGAGATCAAGCAGGTAATACA
GTAGGAGATCAAGCAGGTAGTACAGGAGGAAGTCCACAAGGTAGTACGGGAGCAAGTCAA
CCCGGAA
Figura 17 - Comparação entre as seqüências nucleotídicas do protótipo K1
(Morimatsu et al.,1997) e as dos alelos tipos SERA A, SERA B e SERA C
detectados nas amostras de P. falciparum de Luanda-Angola. As seqüências
foram alinhadas através do programa BioEdit.
46
Protótipo K1
1ªOR 2ªOR 3ªOR 4ªOR 5ªOR 6ªOR
SQTGNTGGGQAGNTVGVQAGNTVGDQAGSTGGSPQGSTGASQPGSSEPSN
Alelo SERA A
SQAGNTGGGQAGNTVGDQAGNTVGDQAGSTGGSPQGSTGASQPGSSEPSN
Alelo SERA B
SQTGNTGGGQAGNTGGGQAGNTVGDQAGSTGGSPQGS
Alelo SERA C
SQTGNTGGGQAGNTVGDQAGNTVGDQAGSTGGSPQGSTGAS
Figura 18 - Comparação entre as seqüências peptídicas do protótipo K1
(Morimatsu et al.,1997) e as dos alelos tipos A, B e C detectados nas amostras
de P. falciparum de Luanda-Angola. As seqüências foram alinhadas através do
programa BioEdit. OR/RO: região de octapeptídeo.
47
B) Seqüência alélica Honduras / tipo 3D7
Embora na primeira OR tenha ocorrido a perda de 6 aa., o alelo SERA
F (amostra 34) foi o único alelo angolano da SERA/p126 que apresentou
identidade de 100% com o protótipo 3D7 (Morimatsu et al.,1997), em relação à
composição de aa da OR. Não podemos discernir se a perda desses 6 aa
corresponde a uma deleção ou se ela é decorrente de uma possível falha
durante o processo de sequenciamento porque, embora o base-calling (análise
computacional para converter a imagem do gel para uma seqüência de base
inferida para cada molde – template) gerasse um parâmetro de qualidade (Q) de
20 (99% de probabilidade de acuidade), essa deleção estava localizada na
extremidade do alelo (Figura 19).
Protótipo 3D7
GGAGGAGGTCAAGCAGGTAATACAGGAGGAGATCAAGCAGGTAGTACAGGA
GGAAGTCCACAAGGTAGTACGGGAGCAAGTCCACAAGGTAGTACGGGAGCAAGTC
Alelo SERA F
GGAGGAGGTCAAGCAGGTAATACAGGAGGAGATCAAGCAGGTAGTACAGGA
GGAAGTCCACAAGGTAGTACGGGAGCAAGTCCACAAGGTAGTACGGGAGCAAGTC
Protótipo 3D7
1ªOR 2ªOR 3ªOR 4ªOR 5ª OR 6ªOR
SQTGNTGGGQAGNTGG------DQAGSTGGSPQGSTGAPQGSTGA
Alelo SERA F
------GGGQAGNTGG------DQAGSTGGSPQGSTGAPQGSTGA
Figura 19 - Comparação entre as seqüências nucleotídicas e peptídicas do
protótipo Honduras/3D (Morimatsu et al.,1997) e as do alelo tipo F detectado em
amostras de P.falciparum de Luanda-Angola. As seqüências foram alinhadas
através do programa BioEdit. OR/RO: região de octapeptídeo.
48
5. Dados epidemiológicos vs distribuição dos alelos MSP-2 e SERA/p126
Em relação à MSP-2, o alelo mais freqüente foi o de 600 pb (47%),
enquanto que na SERA/p126 o alelo de 200 pb estava presente em todas as
amostras analisadas. Porém, a distribuição dos alelos da MSP-2 e da
SERA/p126 não estava relacionada com a faixa etária dos pacientes (Tabelas
8 e 11), a parasitemia (Tabelas 9 e 12), bem como com o número de infecções
maláricas anteriores (Tabelas 10 e 13).
Tabela 8 – Distribuição dos alelos da MSP-2 em 32 amostras de P.falciparum
provenientes de Luanda (Angola) de acordo com a faixa etária (anos).
Alelos (pb)
Infecções simples
Infecções Mistas
Faixa
Etária
(anos)
500
520
580
600
650
680
750
800
500 - 580
500 - 600
600 - 650
650 - 700
1 – 10
1 1 1 6 1 1 1 1
13 – 20
2 5 1 1 1 1
21 – 30
4 2 1 1
49
Tabela 9 – Distribuição dos alelos da MSP-2 em 32 amostras de P.falciparum
provenientes de Luanda (Angola) de acordo com o número (n) de infecções.
Alelos (pb)
Infecções simples
Infecções Mistas
N Infecções
500
520
580
600
650
680
750
800
500 - 580
500 - 600
600 - 650
650-700
1
1 1 2 1 1
2–3
1 1 1 1 1
>3
1 2 13 1 1 2 1
Tabela 10 – Distribuição dos alelos da MSP-2 em 32 amostras de P.falciparum
provenientes de Luanda (Angola) de acordo com a parasitemia (µL)
Alelos (pb)
Infecções simples
Infecções Mistas
Parasisitemia
500
520
580
600
650
680
750
800
500 - 580
500 - 600
600 - 650
650 - 700
500
à
1000
1 3 10 1 3 1 1 1 1
1500
à
2000
2 1 1
18500
à
100000
1 3 1 1
50
Tabela 11 – Distribuição dos alelos da SERA/p126 em 58 amostras de
P.falciparum provenientes de Luanda (Angola) de acordo com a faixa etária.
Faixa
Etária
(anos)
Alelos
(pb)
200
200/
400
200/300
/800
200/300/
500/800
200/400/
800
200/400/
700
200/500/
800
200/500/
700
1 – 9
3
6
1
3
1
13 – 20
9
4
1
2
21 – 30
10
7
2
1
32 – 58
3
4
1
Tabela 12 – Distribuição dos alelos da SERA/p126 em 58 amostras de
P.falciparum provenientes de Luanda (Angola) de acordo com a parasitemia.
Parasit
emia
(µL)
Alelos
(pb)
200
200/
400
200/300
/800
200/300/
500/800
200/400/
800
200/400/
700
200/500/
800
200/500/
700
500
à
1000
13
6
1
3
1
1500
à
2000
12
4
1
2
18500
à
100000
10
7
2
1
51
Tabela 13 – Distribuição dos alelos da SERA/p126 em 58 amostras de
P.falciparum provenientes de Luanda (Angola) de acordo com o número (n) de
infecções.
N
Infecçõe
s
Alelos
(pb)
200
200/
400
200/300/
800
200/300/
500/800
200/400/
800
200/400/
700
200/500/
800
200/500/
700
1
2
1
2
1
2 – 3
2
2
>3
21
18
1
1
5
1
1
52
IV. DISCUSSÃO
No presente trabalho os resultados da análise das amostras de P.
falciparum coletadas em quatro Centros de Saúde de Luanda-Angola mostraram
um polimorfismo gênico da MSP-2 e da SERA/p126, possível de ser detectado
com a utilização das técnicas de caracterização molecular “nested-PCR” e
sequenciamento.
A distribuição dos alelos da MSP-2 e da SERA não dependeu dos locais
nos quais as amostras foram coletadas (dados não mostrados) mostrando,
assim, que as populações plasmodiais que carreiam esses alelos estão
igualmente distribuídas em Luanda, já que esses quatro Centros de Saúde são
os que oferecem o melhor atendimento médico e os pacientes neles atendidos
além de moradores das vizinhanças de cada Centro de Saúde também eram
provenientes dos outros cinco municípios da província de Luanda.
O DNA de um número menor de amostras foi amplificado pela ‘nested-
PCR’ frente aos primers da MSP-2, quando comparado ao amplificado quando
os primers da SERA/p126 foram utilizados. Em relação à MSP-2, este resultado
não nos surpreendeu porque em trabalhos anteriores de nosso laboratório, nos
quais utilizamos metodologia similar para identificarmos o polimorfismo gênico da
MSP-2 em amostras de P.falciparum brasileiras, obtivemos resultados similares
(Faria, 2004; Sallenave-Sales et al., 2005) reforçando, assim, à baixa eficiência
desse alvo molecular para a detecção da infecção malárica. Por outro lado,
fomos surpreendidos com um percentual significativo de amostras (cerca de
40%; resultados não mostrados) cujos DNAs não foram amplificados frente aos
primers da SERA/p126, já que esse mesmo set de primers foi padronizado em
nosso laboratório para o diagnóstico da malária (Zalis et al., 1996) e, desde
então, tem sido empregado com sucesso para a identificação da malária
falciparum em nosso Laboratório que, inclusive, é de Referência para o
53
diagnóstico da malária. Também nos estudos que o nosso laboratório
desenvolveu para a identificação do polimorfismo gênico da SERA/p126 em
amostras brasileiras, esses primers se mostraram eficazes para essa
caracterização molecular (Riccio et al., 2005; Pratt-Riccio et al., 2007).
Descartamos a possibilidade de que a não amplificação tenha sido resultante da
qualidade do DNA que poderia ter sido danificada pelo transporte e estocagem,
porque em trabalhos paralelos realizados em nosso laboratório com as mesmas
amostras, mas utilizando alvos de genes associados à quimiorresistência, o DNA
da maioria dessas amostras foi amplificado com sucesso. Consequentemente,
esses achados sugerem que as populações de parasitas de P.falciparum que
circulam em Angola apresentam um polimorfismo significativo na seqüência
mesmo na região desse gene considerada como conservada, que seria capaz de
impedir a amplificação do DNA de um número expressivo de amostras. De
maneira análoga, também não tivemos muito sucesso na amplificação durante o
sequenciamento dos fragmentos, motivo pelo qual o numero de amostras
sequenciadas foi menor do que o número de amostras amplificadas pela
“nested-PCR”. Mesmo quando repetimos três vezes o procedimento de
sequenciamento, lamentavelmente, não obtínhamos resultados satisfatórios.
Uma possível causa para esse resultado poderia estar associada, pelo menos
para o gene SERA/p126, à temperatura de anelamento utilizada durante o
sequenciamento (50
0
C), que é diferente da utilizada na “nested-PCR” para a
SERA/p126 (47
0
C).
A MSP-2 apresentou um maior número de fragmentos diferentes /
amplicons (9) do que a SERA/p126 (6) embora as infecções mistas por três
alelos só tenham sido identificadas para o gene SERA/p126. Devido a maior
endemicidade da malária nos países africanos era esperado um percentual
significativo de infecções mistas, muito provavelmente, em decorrência de uma
alta taxa de inoculação entomológica e de contínuas inoculações infectantes, o
que conduz a uma constante geração de novos genótipos do parasito, por
fertilização cruzada no mosquito vetor, devido a uma taxa alta de recombinação
genética (Babiker et al., 1997; Jiménez, et al., 2005). Por sua vez, uma taxa
expressiva de inoculação pelo mosquito vetor seria o reflexo das deficientes
condições sanitárias do país, associada às condições climáticas da província de
54
Luanda, que facilitam a transmissão da malária o ano inteiro. Porém, tal fato não
aconteceu no caso da MSP-2 cuja freqüência de infecções mistas foi até menor
do que a encontrada no Brasil (Hoffman et al., 2001, Faria, 2004; Sallenave-
Sales et al., 2005; Ferreira et al,. 2007). Dessa maneira, estudos envolvendo um
número maior de amostras serão realizados para podermos chegar a uma
conclusão definitiva sobre este achado.
Por outro lado, no gene SERA/p126 infecções mistas por mais de dois
alelos nunca tinham sido reportadas em trabalhos anteriores realizados no Brasil
(Ricco et al.,2005; Pratt-Riccio et al., 2007) ou na Indonésia, Myanmar e
Tailândia (Safitri et al. 2003) e mesmo com amostras de laboratório provenientes
de Honduras, Serra Leoa, Uganda e Tailândia (Morimatsu et al., 1997). Essa
expressiva diversidade do gene SERA/p126 em Luanda pode ser devido ao fato
desta cidade ter recebido um grande número de imigrantes, devido ao conflito
armado que o país sofreu nestas três últimas décadas, o que permitiu um fluxo
contínuo de indivíduos de outras áreas malarígenas e, por conseguinte, a
circulação de novas populações parasitárias.
Curiosamente, apesar de não termos conseguido seqüênciar a
totalidade dos alelos encontrados, não encontramos em Luanda alelos da família
FC27 da MSP-2 em nenhuma das amostras seqüenciadas, o que difere
significativamente de outros trabalhos realizados em nosso laboratório com
amostras brasileiras, nos quais os alelos da família FC27 foram os prevalentes
(Faria, 2004; Sallenave-Sales et al., 2005; Hoffman et al., 2006; Ferreira et al,.
2007).
A distribuição geográfica das famílias alélicas da MSP-2 em diferentes
áreas parece ocorrer aleatoriamente. Além dos trabalhos realizados no Brasil,
um trabalho similar a este nosso estudo realizado em Papua Nova Guiné, oeste
da Oceania, a família alélica 3D7 também foi a única família da MSP-2 detectada
nas amostras de P. falciparum (Cortes et al., 2003). Paralelamente, no Gabão,
África, a família alélica 3D7 foi a prevalentemente encontrada (Aubouy et al.,
2003). Como Angola, Papua Nova Guiné e Gabão, diferentemente do Brasil, são
áreas malarígenas consideradas de alta endemicidade, pode ser que a presença
majoritária da família alélica 3D7 seja um reflexo do perfil de endemicidade de
55
uma região. De fato, no Weste Bengal, Índia, uma região do sudoeste asiático
que apresenta cerca de 10% dos casos de malária desta região, embora ambas
as famílias alélicas da MSP-2 tenham sido detectadas, a grande maioria das
amostras de P.falciparum era pertencente à família 3D7 (Joshi et al., 2007).
Posteriormente, em outros países africanos (Gana, Gâmbia, Gabão, Senegal e
Nigéria) a família alélica 3D7 foi mais uma vez a majoritariamente encontrada
(Ferreira et al., 2007), reforçando a associação entre alelos da família 3D7 e a
intensidade de transmissão.
Além da exclusividade de presença da família 3D7 nas amostras de
P.falciparum angolanas, a região R1 apresentou repetições em tandem do tipo
GSAG, com uma inserção do aa ácido aspartico (D) na posição 73, o que difere
do alelo 3D7 brasileiro descrito por Hoffman et al., (2006) que, nessa mesma
região, apresentava códons alternativos em tandem do tipo GGSGSA. Do
mesmo modo, inserções não foram descritas nas amostras brasileiras. Em outros
países africanos, como Tanzânia, Gana, Gabão e Senegal, a R1 foi
caracterizada por repetições do tipo GGSA (Ferreira et al., 2007). Diferentemente
da R1, nas amostras angolanas que analisamos, a R2 se manteve constante
com a presença de múltiplas cópias de treonina (T) do mesmo modo que nos
países africanos, sul-americanos e asiáticos.
Os alelos da MSP-2 tipificados como 3D7 - 600pb, 520pb, 500pb e 700p
- em amostras de áreas endêmicas brasileiras também foram identificados nas
amostras angolanas, embora somente nas áreas endêmicas brasileiras tenham
sido achados os alelos de 400 pb, 450 pb, 460 pb, 550 pb, 570 pb, 620 pb e 640
pb (Hoffmann et al., 2001; Faria, 2004; Sallenave-Sales et al., 2005; Hoffmann et
al., 2006; Ferreira et al., 2007). Entretanto, tal como em amostras de outras
regiões de maior endemicidade da África, como a Tanzânia, Gana, Gabão e
Senegal, onde o alelo mais freqüente também foi o do tipo 3D7, neste nosso
trabalho os fragmentos encontrados foram os de 500 pb, 520 pb, 580 pb, 600
pb, 650pb, 700 pb, 750pb, e 800 pb. Mas, também nesses países, alelos
diferentes dos observados nas amostras angolanas tais como 720 pb, 760pb,
640 pb, 780 pb, 820 pb e 900pb também foram contatados (Hoffmann et al.,
2001; Aubouy et al., 2003; Hoffmann et al., 2006; Ferreira & Hartl, 2007). Já no
Vietnam e na Índia, os alelos detectados semelhantes aos angolanos foram os
56
de 520 pb, 580 pb, 600pb, 680 pb, 700 pb e 800 pb, enquanto que os alelos de
420 pb, 440 pb, 480 pb, 560 pb, 640 pb, 720pb e 760 pb foram encontrados
apenas nas amostras asiáticas (Hoffmann et al 2001; Joshi et al., 2007).
Portanto, dentre os 25 alelos descritos da 3D7, somente os de 520pb, 600pb e
700pb foram comuns em amostras de P.falciparum dos três continentes.
Em relação à SERA/p126, encontramos circulando as famílias alélicas
K1 - com um perfil da subfamília PA/7 - que se mostrou bastante diferente da já
identificada em nosso laboratório (FCR3) por Riccio et al., (2005) e a família
Honduras com predominância da subfamília 3D7. Um fato digno de nota foi o
achado também de novos alelos do gene da SERA/p126 ainda não descritos no
Brasil, Indonésia, e Myanmar. Através da ferramenta BLAST P, comprovamos
que os alelos SERA A, SERA B e SERA C não apresentaram identidade de
100% com os ali cadastrados. Não existem relatos prévios na literatura
semelhantes aos nossos achados. Os resultados anteriores de nosso laboratório
(Riccio et al., 2005; Pratt-Riccio et al., 2007) relativos às amostras brasileiras da
região amazônica, onde houve a prevalência dos fragmentos de 175 pb e de 199
pb e ausência de infecções mistas, diferiram substancialmente dos resultados
com as amostras angolanas. Porém, os alelos angolanos diferiram tanto em
relação ao perfil dos alelos encontrados como pela presença de infecções
mistas. Além disso, em todos os alelos angolanos a OR apresentava sempre ou
cinco ou seis repetições de octapeptídeos, enquanto que nos trabalhos de Riccio
et al., (2005) e Pratt-Riccio et al., (2007), o tamanho da OR variava em função do
tamanho do fragmento/alelo: alelos de 175 pb tinham uma OR com 5 repetições
e os de 199 pb uma OR de 6 repetições. Como nestes outros relatos, não
analisamos a região SR porque a OR é que corresponde à região de maior
imunogenicidade (Banic et al., 2003).
É sabido que nas amostras de P.falciparum de diferentes origens
geográficas, o polimorfismo da região OR compreende eventos de deleções,
inserções e substituições (Bizik et al., 1988; Knapp et al., 1989; Morimatsu et al.,
1997; Safitri et al. 2003). Assim, no estudo realizado por Liu et al., (2000) com
amostras provenientes de áreas endêmicas da África (Nigéria, Gabão, Tanzânia,
Guiné-Bissau) sudoeste da Ásia (Vietnam, Indonésia, Tailândia, e Myanmar),
América do Sul (Brasil) e da Oceania (Sólon Islândia), foi verificado que,
57
independente da família alélica, todas as amostras apresentam nesta região,
inserções, deleções e substituições não-sinônimas. Como no nosso estudo, não
foi descrito nenhum alelo pertencente à família FCR-3 nos outros países da
África, diferentemente do que foi relatado para as amostras brasileiras por esses
autores e pelo grupo de nosso laboratório (Riccio et al., 2005; Pratt-Riccio et al.,
2007), o que nos leva a concluir que este alelo, além de predominante nas
populações de P.falciparum circulantes no Brasil, está ausente nos parasitas que
circulam nos países africanos. Por outro lado, as famílias alélicas K1 e 3D7
estavam presentes nas amostras analisadas da África, tanto no nosso trabalho
quanto no de Liu e colaboradores, e não foram detectadas nas amostras
brasileiras (Liu et al., 2000; Pratt-Riccio et al., 2007), o que nos leva a crer que
estes alelos estão associados a regiões de alta endemicidade.
Interessantemente, a família alélica K1 das amostras angolanas que
estudamos diferiu da dos outros países africanos. Nos outros países africanos
estudados pelo grupo de Liu (2000), houve mutações por substituições não-
sinônimas na posição 3ª aa da 1ª OR de uma glicina (G) por um ácido aspartico
(D), ao passo que em Angola, a substituição não-sinônima que identificamos
nesta mesma posição foi a troca de treonina (T) por uma alanina (A), e na
posição 1ª da 3ª OR um ácido glutâmico (E) por uma lisina (K), enquanto que a
substituição não-sinônima nesta mesma posição foi a troca de valina (V) por um
ácido aspartico (D).
Não obstante o gene em estudo, a presença de cópias repetitivas
idênticas em um mesmo alelo, como se verificou nas nossas amostras
angolanas, poderia ser resultado de um processo de amplificação gênica alelo-
específica. Já a formação de crossing-over durante a meiose e de slippage
durante a reprodução assexuada são eventos que podem permitir a extensiva
variação que ocorre nas repetições da R1 do alelo 3D7 e na OR (Felger et al.,
1997; Rich & Ayala, 2000; Safitri et al 2003; Ferreira & Hartl, 2006). Por exemplo,
o polimorfismo existente na OR do gene SERA/p126 pode gerar mecanismos de
diversidade genética em populações naturais do parasita; estes mecanismos,
juntamente com a presença de mais de uma forma alélica no hospedeiro
(infecções multiclonais) como por nós evidenciado, sugere um potencial com
bases genéticas de adaptação do parasita ao sistema imune do hospedeiro,
58
facilitando, assim a evasão à resposta imune induzida por esta molécula
cogitada a compor uma vacina antimalárica.
Alguns fatores têm sido indicados como de importância crucial para a
expressiva diversidade gênica encontrada em populações plasmodiais
circulantes em áreas de alta endemicidade, como é o caso da cidade de Luanda.
Assim, o polimorfismo gênico observado nas amostras angolanas de P.
falciparum pode estar relacionado a fatores como: i) ao comportamento
antropofílico das espécies de anofelinos transmissoras (An. gambiae s.s., An.
arabinensis, An. melas e anofelinos do complexo funestus) ; ii) ao alto número de
picadas infectantes por pessoa; iii) a alta taxa de recombinação genética no
mosquito e; iv) ao alto êxodo rural que a cidade vive, o que permite que os novos
habitantes gametóforos carreiem novas populações plasmodiais (MINSA, 2007).
Em suma, o polimorfismo gênico encontrado neste trabalho nas regiões
R1 da MSP-2 e OR da SERA/p126 sugere que as populações de P. falciparum
circulantes em Luanda-Angola possuem alelos distintos das populações
circulantes deste parasita em outros países africanos, sul-americanos, asiáticos
e oceânicos. Como esse polimorfismo é passível de ocorrer em regiões que
codifiquem epítopos destas proteínas, ele poderá representar um entrave ao
desenvolvimento de vacinas antimaláricas utilizando estes alvos moleculares que
sejam eficazes em Angola e, assim, estratégias diferentes deverão ser adotadas
para o desenvolvimento de uma vacina eficaz neste país.
59
V) CONCLUSÕES
As populações de P.falciparum que circulam em Angola parecem ter
características próprias, pelo achado de alelos ainda não descritos em outros
países sul-americanos e asiáticos ou mesmo africanos, o que sugere que este
país possui particularidades epidemiológicas e, portanto, abordagens de controle
diferentes das utilizadas nos outros países deveriam ser implementadas.
O grau de polimorfismo da MSP-2 e da SERA/p126 sugere que essas
moléculas poderão desencadear uma resposta imune deficiente e, como tal, não
deveriam ser utilizadas para compor uma vacina antimalárica em Angola.
60
VI) PERSPECTIVAS
Realizar um estudo com um número maior de amostras de P.falciparum
para confirmar esses achados e, paralelamente, estudar a resposta imune a
essas proteínas em pacientes angolanos, visando ao melhor conhecimento do
impacto de tais polimorfismos na eficiência de formulações vacinais contendo
esses alvos moleculares.
61
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73
VIII) APÊNDICES
ANEXO I
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO - MALÁRIA
Instituições: Fundação Oswaldo Cruz (IOC), Instituto Nacional de Saúde
Pública (INSP) e Ministério de Saúde de Angola.
Título do Projeto de Pesquisa para a População: Estudo das mudanças no
parasita da malária que podem atrapalhar a produção de uma vacina
antimalárica.
Título Oficial do Projeto de Pesquisa: Investigação do polimorfismo gênico das
moléculas potencialmente vacinais MSP-2 e SERA/p126 do Plasmodium
falciparum em áreas endêmicas angolanas.
Investigadora Principal do Projeto: Dra. Maria de Fátima Ferreira da Cruz
(IOC, Fiocruz, Brasil)
Mestranda: Florbela Josefina Isaac Lutucuta Kosi
Colaboradores: Dr. Cláudio Tadeu Daniel Ribeiro (IOC, Fiocruz)
Dra. Filomena Gomes da Silva (INSP, Angola)
Dr. Filomemo Fortes (Direção Nac. de Saúde Publica de
Angola)
Dra. Leila Mendonça (IOC, Fiocruz)
Endereço: Laboratório de Pesquisas em Malária - Departamento de Imunologia -
IOC/Fiocruz. Avenida Brasil 4365 - Manguinhos - Rio de Janeiro - RJ - CEP
21.045-900.
Telefones: (21) 3865-8185
Fax: (21) 3865-8145
EU, _________________________________________________________
fui informado que esse estudo é para obter mais conhecimento sobre minha
doença, que se chama malária. A minha participação será apenas para doar
sangue antes e/ou durante o meu tratamento. O tratamento será igual ao
normalmente usado para casos desse tipo. Os resultados desse estudo não me
beneficiarão diretamente, mas poderão, no futuro, beneficiar outras pessoas.
O procedimento será o seguinte: um volume de 5 ml de sangue será coletado
em tubo vacutainer através da punção da veia do antebraço podendo, em algum
outro momento da pesquisa, eu ser solicitado para uma nova coleta de sangue.
74
A retirada do meu sangue poderá ser feita por um médico, farmacêutico ou
biólogo da equipe de investigadores. Os possíveis desconfortos e riscos, se
ocorrerem, são aqueles relacionados com a retirada de sangue, como dor local
e/ou hematoma (“rouxidão”) no local da punção, com duração de 3 a 4 dias.
Todos os cuidados apropriados serão tomados, como o uso de seringa, agulha e
gaze descartável assim como álcool para assepsia local, entre outros. Quanto
aos procedimentos de coleta não foram identificados riscos até o momento.
Os resultados desse estudo serão relatados à minha pessoa e considerados
confidenciais, podendo ser divulgados na forma de comunicação científica.
Entretanto, não será permitida a minha identificação, o que garante a minha
privacidade.
A pesquisadora responsável colocou-me a par dessas informações estando à
disposição para responder minhas perguntas sempre que eu tiver novas dúvidas.
Também tenho toda a liberdade para contatar os demais pesquisadores
envolvidos nesse estudo.
Minha participação nesse estudo é inteiramente voluntária e sou livre para
recusar a participar do estudo ou me retirar em qualquer fase da pesquisa sem
que isto possa afetar ou prejudicar o cuidado médico a que devo receber.
Recebi uma cópia desse termo de consentimento, e pela presente consinto
voluntariamente em participar no estudo, permitindo que os procedimentos
descritos acima sejam realizados em minha pessoa.
Assinatura:
_____________________________________
RG (BI): __________________
Testemunha:
_____________________________________
RG (BI): __________________
Pesquisador: _____________________________________
Data:____________________
75
ANEXO II
REGISTRO N°
°°
° Data:
PROJETO: Investigação do polimorfismo gênico das moléculas
potencialmente vacinais MSP-2 e SERA/p126 do Plasmodium falciparum
em áreas endêmicas angolanas.
DADOS PESSOAIS
NOME:
SEXO: F M
IDADE: NATURALIDADE: PROCEDÊNCIA:
ENDEREÇO ATUAL:
NÚMERO DE RESIDENTES NO ENDEREÇO ATUAL:
PROFISSÃO: ONDE TRABALHA:
QUANTO TEMPO:
TEM CASO DE MALÁRIA? SIM NÃO
TEMPO DE RESIDÊNCIA (ANOS):
Área endêmica (anos) :
HISTÓRIA PREGRESSA DE MALÁRIA
INFECÇÕES ANTERIORES DE MALÁRIA: SIM NÃO
QUANTAS:
QUANTAS COMPROVADAS POR EXAME PARASITOLÓGICO:
Espécies: P. falciparum P. vivax P. malariae Nenhuma Não
lembra
NÚMERO DE INFECÇÕES NO ANO 2006:
Espécies: P. falciparum P. vivax P. malariae Nenhuma Não
lembra
DATA DA ÚLTIMA INFECÇÃO:
Espécies: P. falciparum P. vivax Nenhuma Não lembra
LOCAL PROVÁVEL DE INFECÇÃO:
FEZ O TRATAMENTO COMPLETO?: Sim Não
ESTÁ EM TRATAMENTO?
Sim
Não
QUANDO TERMINOU DE TOMAR O MEDICAMENTO? / /
JA FOI HOSPITALIZADO COM MALÁRIA: Sim Não Data:
MALÁRIA GRAVE NA FAMÍLIA: Sim Não Data: OBS:
RECENTEMENTE TEM OU TEVE ALGUEM NA FAMÍLIA COM MALÁRIA? Sim Não
Data:
76
EXPOSIÇÃO A INFECÇÃO MALÁRICA
LOCALIZAÇÃO DA CASA
Cidade Periferia Floresta Coleção d’água
Nenhuma
TIPO DE CASA (PROTEÇÃO EM RELAÇÃO AO CONTATO COM MOSQUITO)
Boa Parcial Nenhuma
ATIVIDADES AO AMANHECER:
ATIVIDADES AO ANOITECER:
SABE COMO A MALÁRIA É TRANSMITIDA?
Sim Não Foi informado Foi informado, mas não acredita
COMO?:
USO DE MEDIDAS PROFILÁTICAS
Mosquiteiro Inseticida Antimaláricos Outras Nenhuma
Data da última borrifação de inseticida (FNS):
MALÁRIA ATUAL
SINTOMAS
Febre Cefaléia Calafrios Náusea/Vômito Mialgia Dor
abdominal Sudorese
Artralgias Diarréia Dispnéia Nenhum
DATA DO INICIO DOS SINTOMAS:
DIAGNÓSTICO: P. falciparum P. vivax P. malariae Nenhuma
PARASITEMIA:
LOCAL PROVÁVEL DE INFECÇÃO:
RECEBEU TRANSFUSÃO DE SANGUE?: Sim Não Data:
É DOADOR DE SANGUE?: Sim Não Data da última doação:
COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO
Gota espessa Distensão sangüínea Plasma Célula Parasitas
OBS:
77
ANEXO III
DECLARAÇÃO
DECLARO para os devidos fins que todo material biológico oriundo dos
indivíduos que participarem do projeto intitulado “Avaliação do polimorfismo
gênico das moléculas potencialmente vacinais MSP-2 e SERA/p126 do
Plasmodium falciparum em áreas endêmicas angolanas” será utilizado para as
finalidades descritas neste projeto e em outros projetos correlatos desde que
aprovados pelo comitê de ética da Fiocruz. O critério de inclusão compreenderá
pacientes com diagnóstico parasitológico de malária falciparum, que concordem
em participar do estudo. Declaro ainda para a realização do estudo de que os
indivíduos serão informados e que qualquer procedimento só será instituído após
consentimento dos mesmos. Em particular, será esclarecido que eles poderão se
retirar da pesquisa a qualquer momento sem prejuízo de seu acompanhamento
clínico e que terão direito a toda informação adicional que julgarem necessárias.
Os resultados obtidos durante o trabalho serão divulgados junto à comunidade
científica e poderão ser objeto de publicações resumidas (congressos) ou
detalhadas (artigo científicos), sempre resguardada a identificação e a
privacidade dos voluntários. Cabe ressaltar que os resultados obtidos neste
projeto não vão mudar o curso ou a evolução da doença nem causar qualquer
prejuízo ou dano aos indivíduos envolvidos.
Dra. Maria de Fátima Ferreira da Cruz
Vice-Chefe
Laboratório de Pesquisas em Malária
Departamento de Imunologia
Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz
78
Lista de Abreviaturas
A Adenina
C Citosina
º
C Graus Celsius
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
DNA Ácido desoxirribonucléico
dNTPs Desoxinucleotídeos trifosfatados
g gravidade
G Guanina
GPI Glicosilfosfatidilinositol
KB
Kilobase
KDa Kilodalton
Mb Megabase
MgCl
2
Cloreto de Magnésio
M
L Mililitros
µL Microlitros
µM Micromolar
MIN
Minutos
MINSA Ministério da saúde de Angola
MSP-2 Merozoite Surface Protein/Proteína 2 de Superfície do Merozoíta
Mr/
MOLECULAR
RANGE
Peso molecular aproximado
NaCl Cloreto de Sódio
nM Nano molar
OMS Organização Mundial da Saúde
% Percentagem
pb Pares de bases
PCR Reação de Polimerização em Cadeia
SERA/P126/
SERP
Serine Rich Protein / Proteína Rica em Serina
T Timina
TAE Tris-Acetato-EDTA
U Unidade
UV Ultravioleta
V Volume
V
/
V
Volume a volume
K
M
2
Quilômetros quadrados
R1 1ª região de repetição variável
R2 2ª região de repetição variável
E1 1ª região variável não repetitiva
E2 2ª região variável não repetitiva
E3 3ª região variável não repetitiva
Ct Carboxi -terminal
Nt Amino - terminal
3D7 “Cepa” de P.falciparum isolado de paciente da Indochina e protótipo
79
da família específica da MSP-2
FC27 “Cepa” de P.falciparum isolada de paciente de Papua Nova Guiné e
protótipo da família específica da MSP-2
FCR3 “Cepa” de P.falciparum isolada de paciente da Gâmbia e protótipo da
SERA/p126
K1
“Cepa” de
P.falciparum isolada de paciente da Tailândia e protótipo da
SERA/p126
PA/7 “Cepa” de P.falciparum isolada de paciente do Uganda e protótipo da
SERA/p126
SEG
Segundo
NT Número total testado
NP Número de positivos
IS Infecções simples
IM Infecções mistas
G Glicina
S Serina
A Alanina
D Ácido aspartico
V Valina
R Arginina
T Treonina
K Lisina
N Asparragina
P Prolina
R Arginina
OR repetição de octapeptídeo
SR repetição de serina
Q Glutamina
80
Lista de Figuras
Figura 1- Ciclo biológico de um plasmódio de mamífero no hospedeiro
vertebrado.
Figura 2 - Representação esquemática da SERA / p126.
Figura 3 - Mapa de Angola.
Figura 4 – Mapa da província de Luanda.
Figura 5 - Centro de Saúde do Sambizanga, município de Sambizanga.
Figura 6 - Centro de Saúde da Ilha, município das Ingombotas.
Figura 7 - Centro de Saúde da Terra Nova, município do Rangel.
Figura 8 – Representação esquemática das regiões da proteína MSP-2 das
cepas FC27 e 3D7 representando as famílias alélicas.
Figura 9 - Representação esquemática do gene que codifica a SERA /p126.
Figura 10 - Freqüência dos 32 alelos da MSP-2 obtidos através da nested-PCR
em amostras de P. falciparum provenientes de Luanda – Angola.
Figura 11 – Tipos de fragmentos amplificados por nested-PCR da região central
variável da MSP-2 nas amostras de P. falciparum provenientes de pacientes
angolanos moradores em Luanda.
Figura 12 - Freqüência dos 58 alelos da SERA/p126 obtidos através da
amplificação pela nested-PCR em amostras de P.falciparum provenientes de
Luanda – Angola.
81
Figura 13 - Tipos de fragmentos amplificados por nested-PCR da região do éxon
II da SERA nas amostras de P. falciparum provenientes de pacientes angolanos
moradores em Luanda.
Figura 14 – Esquema deduzido das regiões da proteína MSP-2 correspondentes
aos alelos 3D7 protótipo (Smythe et al., 1990) e tipo D detectado nas amostras
de P.falciparum coletados em Luanda-Angola.
Figura 15 - Comparação entre as seqüências nucleotídicas da “cepa” protótipo
3D7 (Smythe et al., 1990) e do alelo tipo D detectado nas amostras de
P.falciparum de Luanda-Angola.
Figura 16 - Comparação entre as seqüências peptídicas deduzidas da “cepa”
protótipo 3D7 (Smythe et al., 1990) e do alelo 3D7 tipo D detectado nas amostras
de P.falciparum de Luanda-Angola.
Figura 17 - Comparação entre as seqüências nucleotídicas do protótipo K1
(Morimatsu et al., 1997) e as dos alelos tipos A, B e C detectados nas amostras
de P.falciparum de Luanda-Angola.
Figura 18 - Comparação entre as seqüências peptídicas do protótipo K1
(Morimatsu et al.,1997) e as dos alelos tipos A, B e C detectados nas amostras
de P.falciparum de Luanda-Angola.
Figura 19 - Comparação entre as seqüências nucleotídicas e peptídicas do
protótipo Honduras/3D (Morimatsu et al.,1997) e as do alelo tipo F detectado
nas amostras de P.falciparum de Luanda-Angola.
82
Lista das tabelas
Tabela 1 – Resultados da Nested-PCR de 58 amostras de P.falciparum frente
aos oligonucleotídeos da SERA/p126 e da MSP-2.
Tabela 2 – Tipos de fragmentos obtidos pela Nested–PCR frente aos
oligonucleotídeos de MSP-2 de 32 amostras angolanas de P.falciparum.
Tabela 3 – Tipos de fragmentos obtidos pela Nested–PCR frente aos
oligonucleotídeos SERA/p126 de 58 amostras de P.falciparum.
Tabela 4 - Infecções simples referentes à MSP-2, encontradas em 32 amostras
angolanas de P. falciparum.
Tabela 5 - Infecções Mistas nas 32 amostras de P. falciparum referentes à
MSP-2.
Tabela 6 - Infecções Simples referentes à SERA/p126 encontradas nas 58
amostras de P. falciparum.
Tabela 7- Infecções mistas referentes à SERA/p126 encontradas nas 58
amostras de P. falciparum.
Tabela 8 – Distribuição dos alelos da MSP-2 nas 32 amostras de P.falciparum
provenientes de Luanda (Angola) de acordo com a faixa etária (anos).
Tabela 9 – Distribuição dos alelos da MSP-2 nas 32 amostras de P.falciparum
provenientes de Luanda (Angola) de acordo com o número (n) de infecções.
83
Tabela 10 – Distribuição dos alelos da MSP-2 nas 32 amostras de P.falciparum
provenientes de Luanda (Angola) de acordo com a parasitemia (µL).
Tabela 11 – Distribuição dos alelos da SERA/p126 nas 58 amostras de
P.falciparum provenientes de Luanda (Angola) de acordo com a faixa etária.
Tabela 12 – Distribuição dos alelos da SERA/p126 nas 58 amostras de
P.falciparum provenientes de Luanda (Angola) de acordo com a parasitemia.
Tabela 13 – Distribuição dos alelos da SERA/p126 nas 58 amostras de
P.falciparum provenientes de Luanda (Angola) de acordo com o número (n) de
infecções.
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