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Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia - INPA
Universidade Federal do Amazonas - UFAM
Programa de Pós-graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais
Mestrado em Agricultura no Trópico Úmido – ATU
Cultivo micelial in vitro e elaboração de “semente-inóculo” de Lentinus
strigosus, um cogumelo comestível isolado na Amazônia
RUBY VARGAS-ISLA
Manaus, Amazonas
Fevereiro, 2008
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RUBY VARGAS-ISLA
Cultivo micelial in vitro e elaboração de “semente-inóculo” de Lentinus
strigosus, um cogumelo comestível isolado na Amazônia
Orientadora: Noemia Kazue Ishikawa
Co-orientador: Rogério Eiji Hanada
Manaus, Amazonas
Fevereiro, 2008
Dissertação apresentada ao Programa Integrado de Pós
-
Graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais do
convênio INPA/UFAM, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em CIÊNCIAS AGRÁRIAS
,
área de concentração em AGRICULTURA NO TRÓP
ICO
ÚMIDO.
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V297 Vargas-Isla, Ruby
Cultivo micelial in vitro e elaboração de “semente-inóculo” de
Lentinus strigosus, um cogumelo comestível isolado na Amazônia /
Ruby Vargas-Isla .--- Manaus : [s.n.], 2008.
x, 67f. : il.
Dissertação (mestrado) --- INPA/UFAM, Manaus, 2008
Orientador : Noemia Kazue Ishikawa
Co-Orientador : Rogerio Eiji Hanada
Área de concentração : Agricultura no Trópico Úmido
1. Cultivo de cogumelos. 2. Basidiomiceto. 3. Fungos termófilos.
4. Serragem. 5. Panus rudis. I. Título.
CDD 19. ed. 589.22
Sinopse:
Estudaram as condições de crescimento micelial in vitro de Lentinus strigosus, um
cogumelo comestível termófilo isolado na Amazônia, para a elaboração de “semente-
inóculo” utilizando substratos a base de serragens de espécies florestais disponíveis
na Amazônia Central.
Palavras-chave:
Cultivo de cogumelos, Basidiomiceto, Fungos termófilos, Serragem, Panus rudis.
iv
Con mucho cariño
a mis amados
padres Angela y
Manolo y mis
queridos hermanos
Angela Vanessa y
Marcos Alberto
Daniel
v
AGRADECIMENTOS
À Deus
À Natureza
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) por abrir suas portas e
contribuir na minha formação profissional em Ciências Agrárias. À Coordenação de
Pesquisas em Tecnologia de Alimentos (CPTA) e à Coordenação de Pesquisas de
Produtos Florestais (CPPF) do INPA.
Ao curso de Agricultura no Trópico Úmido (ATU) pelo apoio efetivo na minha
formação como Mestre.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Amazonas (FAPEAM) pela
bolsa de estudos no mestrado.
À minha orientadora, Dra. Noemia Kazue Ishikawa, pela oportunidade, por
acreditar, pela orientação, responsabilidade, paciência, apoio e ajuda nos
ensinamentos e desenvolvimento de todas as fases deste trabalho, principalmente
pela confiança depositada.
Ao meu co-orientador, Dr. Rogério Eiji Hanada por ter partilhado conhecimentos
importantes à minha formação.
Aos professores do curso do ATU pelos conselhos, oportunidades e inúmeros
ensinamentos que contribuíram enormemente para minha formação profissional.
Ao Coordenador do Curso de Mestrado em Agricultura no Trópico Úmido Dr.
Rogério de Jesus pela convivência e incentivo em todos os momentos.
Agradeço aos Professores Doutores Luzia D. Paccola-Meirelles, Regina H.
Hassegawa, Cristina S. Maki, Rosalee A. C. Netto, Luiz A. de Oliveira, José S. do
Nascimento e Luiz A. Graciolli, por terem participado da avaliação do projeto de
dissertação, aula de qualificação e/ou banca de dissertação.
Aos Professores da Universidad Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP) por
terem me proporcionado a formação acadêmica em Agronomia.
Aos meus primeiros orientadores e amigos Eng. Miguel Perez Marín, Professor
principal da Faculdade de Agronomia-Universidad Nacional de la Amazonía Peruana e
ao Eng. Agustín Gonzales Corral, pesquisador do Instituto de Investigación de la
Amazonía Peruana, por suas valiosas orientações e por terem contribuído
significativamente para minha formação como agrônoma.
Ao Dr. Jomber Chota Inuma, pela confiança, pela ajuda na concretização dos
nossos sonhos e pelo abrigo oferecido desinteressadamente.
Aos meus amigos de turma de mestrado do ATU-2006, cujos momentos
compartilhados têm sido muito especiais.
Minha profunda gratidão aos familiares, amigos, colegas e pessoas que de uma
forma ou outra contribuíram na execução deste trabalho.
vi
Às Famílias Ishikawa e Komagome pelo carinho e ajuda na obtenção de material
para a elaboração de substratos.
Ao meu amigo e companheiro João Bosco André Gordiano, pelo carinho, amor,
amizade, apoio, compreensão e muita paciência que teve comigo durante o período
deste Mestrado.
À meus irmãos Vanessa e Marcos por estarem sempre acompanhando meus
avanços e compartilhado minhas alegrias.
Aos meus pais Angela e Manolo pelo amor e apoio constante e desmedido, pelos
conselhos, incentivo que me deram para continuar os estudos, por terem acreditado
em meus sonhos.
vii
PREFÁCIO
Neste manuscrito são apresentados os resultados obtidos durante o
curso de mestrado em Agricultura no Trópico Úmido, realizado no Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia, no período de março de 2006 a fevereiro
de 2008.
O texto está dividido em três capítulos: Capítulo 1 - Introdução,
abordando características gerais do fungo Lentinus strigosus, comestibilidade
da espécie, fungicultura, importância da “semente-inóculo”, substratos
disponíveis na região de Manaus e vantagens do fungo termófilo para a
fungicultura no Trópico Úmido; Capítulo 2 - Resultados sobre a avaliação das
condições ótimas de crescimento micelial in vitro de L. strigosus; e Capítulo 3 -
Resultados sobre a elaboração de “semente-inóculo” de L. strigosus com base
em serragens de espécies florestais da Amazônia Central.
O capítulo 1 está redigido na forma de texto, sob as normas da Revista
Acta Amazônica. Os capítulos 2 e 3 estão redigidos na forma de artigo
científico, de acordo com as normas das revistas a serem publicados.
viii
RESUMO
O Estado do Amazonas apresenta um cenário favorável para o
desenvolvimento da fungicultura, pois reúne a diversidade nativa de espécies de
cogumelos comestíveis e substratos lignocelulósicos em abundância. Entretanto, os
protocolos de cultivo geralmente são descritos para espécies de clima temperado,
sendo necessário o desenvolvimento de protocolos para as espécies de clima tropical.
A espécie Lentinus strigosus (Schwein.) Fr. (=Panus rudis Fr.) tem uma ampla
distribuição mundial apresentando vários ecotipos. A comestibilidade desta espécie
tem sido reportada em estudos etnomicológicos de povos indígenas da Amazônia. No
entanto, o seu potencial para a produção em escala comercial ainda tem sido pouco
explorada. Neste trabalho, reportam-se as condições ótimas de crescimento micelial,
in vitro, de L. strigosus. O isolado apresentou características de fungo filamentoso
termófilo, com crescimento em temperaturas de 25 a 45ºC, sendo a temperatura de
crescimento ótimo, 35ºC. Esta temperatura é uma importante vantagem para o
desenvolvimento da fungicultura nos trópicos, uma vez que é uma temperatura comum
na região. Quanto aos substratos para elaboração de “semente-inóculo”, em uma
primeira etapa, avaliou-se o crescimento micelial de L. strigosus em formulações a
base de serragens de 11 espécies florestais regionais: Hymenolobium petraeum
Ducke (Angelim pedra), Hura crepitans L. (Assacu), Bertholletia excelsa H.B.K.
(Castanheira), Cedrela odorata L. (Cedro), Bombacopsis quinata (Jacq.) Dugand.
(Cedro doce), Hymenaea courbaril L. (Jatobá), Ocotea cymbarum Kunth (Louro
canela), Simarouba amara Aubl. (Marupá), Astronium lecointei Ducke (Muiracatiara),
Aniba rosaeodora Ducke (Pau rosa) e Caryocar sp. (Piquiarana) em comparação com
Eucalyptus sp., principal substrato utilizado na fungicultura do Sul e Sudeste do Brasil
e Quercus acutissima Carr., muito utilizado na Ásia. As serragens foram
suplementadas com 20% (w/w) de farelo de arroz. Os substratos a base de serragem
de B. quinata e S. amara promoveram maiores crescimentos miceliais (p<0,05). Em
uma segunda etapa, avaliou-se o crescimento micelial em serragem de S. amara
suplementada com sete diferentes fontes de nitrogênio (20% w/w): farelo de arroz,
extrato de soja, levedura de cerveja, farinha da casca de maracujá, fibra de soja, fibra
de trigo e gérmen de trigo. Como controle utilizou-se, serragem pura. Todas as
suplementações favoreceram em diferentes níveis o crescimento micelial de L.
strigosus. Para a produção de “semente-inóculo” foram testados sacos e frascos de
polipropileno utilizando serragens de S. amara, H. petraeum e A. lecointei
suplementadas com farelo de arroz, após 25 dias de inoculação os substratos estavam
totalmente colonizados por L. strigosus em todas as embalagens testadas, para a
escolha da embalagem foram considerados aspectos como custos das embalagens;
tempo de colonização; viabilidade de transporte e praticidade de inoculação do micélio
no substrato. Mediante estes resultados, a “semente-inóculo” de L. strigosus foi
elaborada com sucesso, utilizando-se serragem de S. amara suplementado com 20%
(w/w) de farelo de arroz, a 35ºC por 25 dias, no escuro, em três embalagens com
características diferentes.
Palavras-chave: Cultivo de cogumelos, Basidiomiceto, Fungos termófilos, Serragem,
Panus rudis
ix
ABSTRACT
The Amazonas State presents favorable scenery for the development of the
fungiculture, because gathers the native diversity of species of edible mushrooms and
abundantly substrates lignocellulosics. However, the protocols of cultivation are usually
described for species of temperate climate habitat, being necessary the development
of protocols for species of tropical climate. The specie Lentinus strigosus (Schwein.) Fr.
(=Panus rudis Fr.) has a wide world distribution presenting several ecotypes. The
edibility of this specie has been reported in ethnomycology studies of indigenous
groups in the Amazon. However, your potential production in commercial scale has still
been a little explored. In this study, reported the optimum conditions in vitro of mycelial
growth of L. strigosus. The isolated presented characteristics of thermophile
filamentous mushroom, with growth in temperatures from 25 to 45°C, being the
optimum growth temperature, 35°C. This temperature is an important advantage for the
development of the fungiculture in the tropics, since it is a common temperature for the
region. In relation to the substrates for spawn preparation, in a first phase, the mycelial
growth of L. strigosus was evaluated in based on sawdust formulations of 11 forestry
regional species: Hymenolobium petraeum Ducke (Angelim pedra), Hura crepitans L.
(Assacu), Bertholletia excelsa H.B.K. (Castanheira), Cedrela odorata L. (Cedro),
Bombacopsis quinata (Jacq.) Dugand. (Cedro doce), Hymenaea courbaril L. (Jatobá),
Ocotea cymbarum Kunth (Louro canela), Simarouba amara Aubl. (Marupá), Astronium
lecointei Ducke (Muiracatiara), Aniba rosaeodora Ducke (Pau rosa) and Caryocar sp.
(Piquiarana) and Eucalyptus sp. in comparison, main substratum used in the
fungiculture of the South and Southeast of Brazil and Quercus acutissima Carr., very
used in Asia. The sawdusts were supplemented with 20% (w/w) of rice bran. The
substrates formulated with sawdust of B. quinata and S. amara they promoted higher
mycelial growth (p<0.05). In the second phase, was evaluated the mycelial growth in
sawdust of S. amara supplemented with seven different nitrogen sources (20% w/w):
rice bran, soy extract, beer yeast, passion fruit shell flour, soy fiber, wheat fiber and
wheat germ. As control was utilized pure sawdust. All the supplements favored in
different levels the mycelial growth of L. strigosus. Bags and flasks of polypropylene
were tested for spawn production and utilizing sawdust of S. amara, H. petraeum and
A. lecointei supplemented with rice bran, after 25 days of inoculation the substrates
were totally colonized by L. strigosus in all the packings tested. For choice of the
packing other criteria should be considered aspects as costs of the packings; time of
colonization; transport viability and feasibility of mycelial inoculation on the substratum.
By these results, the spawn of L. strigosus was elaborated with success, being used
sawdust of S. amara supplemented with 20% (w/w) of rice bran, at 35°C during 25
days, in the dark, in three packings with different characteristics.
Key words: Mushroom culture, Basidiomycete, Thermophiles fungi, Sawdust, Panus
rudis
x
SUMÁRIO
Página
Prefácio vii
Resumo viii
Abstract ix
1. Introdução 1
O cogumelo: Lentinus strigosus 4
Comestibilidade da espécie 5
Fungicultura 7
Importância da “semente-inóculo” 8
Substratos: disponibilidades regionais 9
Fungo termófilo: vantagens para a fungicultura no Trópico Úmido 11
Objetivos 13
2. Avaliação das condições ambientais e nutricionais para o
crescimento e manutenção da cultura micelial in vitro 18
Artigo 1: Optimum conditions of in vitro mycelial growth of Lentinus
strigosus, an edible mushroom isolated in the Brazilian Amazon 19
Resumo 21
Abstract 22
Introdução 23
Material e métodos 25
Resultados e Discussão 28
Referências 31
3. Elaboração de “semente-inóculo” do fungo Lentinus strigosus com
base em serragens de espécies florestais da Amazônia 43
Artigo 2: Elaboração de “semente-inóculo” de Lentinus strigosus,
um cogumelo comestível termófilo isolado na Amazônia Brasileira 44
Resumo 46
Abstract 47
Introdução 48
Material e métodos 50
Resultados e Discussão 52
Referências 55
1
1. Introdução
2
INTRODUÇÃO
A diversidade de fungos tem sido estimada por diversos autores variando de 500 mil
a 2,7 milhões de espécies, sendo que a estimativa mais aceita é de 1,5 milhão de espécies
(Hawksworth, 2001). Entretanto, apenas cerca de 80 a 120 mil espécies estão descritas
atualmente (Webster e Weber, 2007). Deste modo, existe uma grande especulação em
relação aos locais onde poderiam ocorrer inúmeros fungos ainda desconhecidos (Hyde,
2001). Entre as diversas localidades possíveis estão os países com conhecimento escasso
de sua diversidade fúngica, hospedeiros, habitats ou nichos ainda poucos estudados
(Hawksworth, 2001; Hyde, 2001). De acordo com a opinião de diversos autores, florestas
tropicais abrigam grande número de espécies de fungos (Mueller et al., 2007). O que é
facilmente verificado ao caminhar na floresta Amazônica, onde é comum observar uma
grande diversidade de fungos, principalmente, em época chuvosa. Esse pouco
conhecimento sobre a biodiversidade de fungos em ecossistemas tropicais está em
descompasso com o enorme potencial biotecnológico dessas espécies (Hawksworth, 2001;
Schmit e Mueller, 2007; Mueller et al., 2007).
Dos fungos já descritos, cerca de 15 mil espécies formam cogumelos (Hawksworth,
2001) e pelo menos 2 mil apresentam vários graus de comestibilidade. Comercialmente, são
cultivadas cerca de 35 espécies de cogumelo, sendo, aproximadamente, 20 espécies
cultivadas em escala industrial. Dentre estas, as mais cultivadas no mundo são
predominantemente de ocorrência natural da Europa e Ásia: Agaricus bisporus (J.E. Lange)
Pilát, Lentinula edodes (Berk.) Pegler, Pleurotus spp. (Fr.) P. Kumm., Auricularia sp. Lloyd,
Flammulina velutipes (Curt.: Fr.) Singer e Volvariella volvacea (Bull.) Singer (Sánchez,
2004).
3
Além de gerar produtos com excelentes características gastronômicas, nutritivas e
medicinais, a produção de cogumelos (fungicultura) favorece o aproveitamento dos resíduos
gerados pelas agroindústrias como: serragens (Hanada, 2003; Philippoussis et al., 2007);
bagaço de cana-de-açúcar (Rossi et al., 2003; Soccol e Vandenberghe, 2003; Silva et al.,
2007); sabugo de milho (Salmones et al., 1999; Philippoussis et al., 2007); bainha de palmito
(Tonini et al., 2007); e gramíneas (Chaiyama et al., 2007). O processo de bioconversão
ajuda a prevenir a contaminação ambiental causada pela acumulação de resíduos
agroindustriais, sendo uma das melhores alternativas na conversão, por exemplo, de
resíduos madeireiros em alimentos (Mandeel et al., 2005; Silva et al., 2005). Os substratos
utilizados na fungicultura variam de acordo com as espécies de cogumelos e disponibilidade
nos locais onde são cultivados (Albertó e Gasoni, 2003).
O estado do Amazonas apresenta características favoráveis para o desenvolvimento
da fungicultura, pois reúne a diversidade nativa de espécies de cogumelos comestíveis e
substratos lignocelulósicos em abundância. No entanto, as condições climáticas no trópico
úmido são distintas dos locais onde a fungicultura é mais desenvolvida, ou seja, países de
climas temperados e subtropicais da Europa e Ásia, assim como no Sul e Sudeste do Brasil,
o que demanda grandes esforços e custos para adequação de metodologias para cultivar as
espécies tradicionalmente conhecidas, ou a domesticação de espécies regionais.
Mediante ao exposto, este trabalho aborda as primeiras etapas de estudo para
avaliar o potencial de uso de uma espécie de cogumelo comestível isolada na Amazônia,
Lentinus strigosus (Schwein.) Fr., para a fungicultura. Relata-se neste manuscrito as
condições ótimas de crescimento micelial in vitro, assim como a elaboração de “semente-
inóculo” utilizando substratos preparados, tendo como base serragens de espécies florestais
disponíveis na Amazônia Central.
4
O cogumelo: Lentinus strigosus
A espécie L. strigosus pertence ao gênero Lentinus Fr. (Polyporaceae tribo Lentineae
Fayod), tem ampla distribuição mundial, e espécies de ocorrência abundante nas regiões
tropicais. Os basidiocarpos, ou corpos de frutificação, do gênero Lentinus são de
consistência dura à coriácea e mais persistentes do que outros gêneros da ordem
Agaricales. Devido à natureza resistente a períodos adversos de seca destas espécies,
freqüentemente representam, o grupo dominante de fungos Agaricales em florestas tropicais
(Pegler, 1975). A morfologia geral de Lentinus sp. pode ser extremamente variável, com
basidiocarpos de crescimento lento, duradouro ou ambos e sujeitos à influência externa. Na
maioria dos casos, o basidiocarpo apresenta estipe central e desenvolvido continuamente
com o píleo. O basidiocarpo pode ser conspícuo, grande e robusto e o comprimento do
estipe é aproximadamente igual ao diâmetro do píleo. A superfície do píleo é formada
essencialmente por uma epiderme de hifa rastejante que se estende à margem e,
conseqüentemente, em muitos casos, o píleo aparece viloso a híspido-estrigoso. Os pêlos
da margem do píleo são característicos de muitas espécies deste gênero. O himênio
lamelado é apresso ao píleo e decorrente para o estipe (Pegler, 1983).
Os basidiocarpos de L. strigosus coletados neste trabalho (Fig. 1 A-C) apresentaram
píleo com 4-7 cm de diâmetro, convexo, subinfundibuliforme a infundibuliforme, circular a
flabeliforme; superfície clara a ocráceo pálido, marrom em direção ao centro, violáceo no
princípio, mudando de coloração depois para vermelho-violáceo e na maturidade para bege
ou marrom claro, densamente viloso a híspido-estrigoso; margem encurvada, fina, ondulada
a reta; coriáceo, duro e seco com a maturidade; contexto branco, carnoso. Himênio ou
lamelas decorrentes, branco, creme a ocráceo com a maturidade, com margens levemente
discolores em tom mais escuro, apressas, com duas a três séries de lamélulas, esporada de
coloração creme. Estipe central a subexcêntrica, cilíndrica ou ligeiramente mais espessa no
ápice; levemente arroxeada quando jovem escurecendo para bege ou marrom claro com a
5
maturidade, tomentoso, com tomento basal quando jovem. Os basidiocarpos coletados
encontravam-se em ambiente aberto em substrato lignícola. L. strigosus ocorre embaixo de
vegetação densa, assim como em habitats abertos (Castillo et al., 2004). Nas Figuras 1D e
1E, hifas com grampos de conexão e esporos, respectivamente.
Comestibilidade da espécie
Os fungos silvestres têm grande importância etnomicológica por ser um alimento
muito apreciado pelos indígenas de diversos grupos étnicos na América Central e, em geral,
pelos camponeses de regiões onde se desenvolvem os fungos em grandes quantidades,
principalmente, nos bosques úmidos (Herrera e Ulloa, 1990; Boa, 2004).
Fidalgo e Prance (1976), Fidalgo e Hirata, (1979) e Prance (1984) identificaram
diferentes espécies de fungos comestíveis do gênero Lentinus, consumidos por indígenas
Yanomami da Amazônia brasileira, entre os quais mencionam: L. crinitus (L.) Fr., L.
velutinus Fr., L. glabratus Mont., L. cubensis (Berk. & M.A.) Curtis, L. strigosus. Assim como
os indígenas Uitoto da região de Araracuara, Amazônia colombiana, consomem: L.
strigosus, L. concavus (Berk.) Corner, L. crinitus, L. scleropus (Pers.) Fr. (Vasco, 2002).
Os fungos silvestres têm grande importância etnomicológica por ser um alimento
muito apreciado pelos indígenas de diversos grupos étnicos na América Central e, em geral,
pelos camponeses de regiões onde se desenvolvem os fungos em grandes quantidades,
principalmente, nos bosques úmidos (Herrera e Ulloa, 1990; Boa, 2004).
Parte da coleta de basidiocarpos de L. strigosus realizada em março de 2007 foi
degustada por Vargas-Isla R. e Ishikawa N. K., após preparada ao sautéed com margarina e
um pouco de sal. As autoras relataram que o cogumelo apresenta sabor agradável, com
elevado umami* e textura ligeiramente fibrosa (Vargas-Isla e Ishikawa, in press).
6
Fig. 1
. Lentinus strigosus coletados na Amazônia Central. (A) e (B) Estágio jovem
do basidiocarpo, (C) estágio maduro dos basidiocarpos, (D) hifas e grampos de
conexão, (E) basidiósporos (400x).
7
Fungicultura
No comércio internacional, a FAO (Food and Agriculture Organization of the United
Nations) estimou, em 1999, um volume de 272 mil toneladas de fungos comercializados,
correspondendo a US$ 775 milhões. O maior exportador mundial de cogumelos naquele ano
foi a Holanda, com 63,7 mil toneladas seguida da China, com 50,1 mil toneladas, e os
maiores importadores foram Inglaterra, Alemanha e Japão, que importaram 59,4 mil, 43,5
mil e 35,2 mil toneladas, respectivamente (Boa, 2004).
O mercado dos fungos silvestres como L. strigosus é difícil de ser caracterizado
devido aos dados sobre o comércio agruparem espécies silvestres e cultivadas. Entretanto,
uma estimativa da quantidade de fungos silvestres comercializados no mundo pode ser feita
com os valores do mercado dos fungos desidratados que são registrados para exportação,
podendo chegar até 74.000 dólares/tonelada/ano (Methodus Consultora SC., 2003).
A fungicultura, além de contribuir para a manutenção do equilíbrio ecológico e
diminuição dos impactos sobre o meio ambiente, é uma das melhores formas de eliminar os
resíduos e convertê-los em produtos orgânicos de alto valor gastronômico e nutricional
(López, 1995; Regés, 1999).
De acordo com Dias et al. (2003), o consumo de cogumelos no Brasil é muito baixo.
A falta de tradição e o preço relativamente elevado dos cogumelos no mercado são fatores
determinantes dessa realidade. Entretanto, houve um aumento na produção de cogumelos
nas últimas décadas, mantendo como ponto estratégico para seu consumo a redução dos
custos de produção e baixos preços para o consumidor.
Os relatos dos primeiros povos a consumir cogumelos foram dos egípcios, romanos
e gregos, na antiguidade. Já, o cultivo de cogumelos como o shiitake teve seu início há 1500
8
anos a.C. na China (Chang e Miles, 1987). Assim como o cultivo de champignon iniciou-se
no século XVI na França, e em períodos mais recentes o cultivo de fungos difundiu-se pelos
Estados Unidos, Canadá, México, Argentina, Colômbia, Brasil e Chile; e na década de 50 o
cultivo de cogumelos foi introduzido no Brasil pelos asiáticos na região Mogi das Cruzes
(Abe, 2006), mas ainda não constitui commodity importante no país.
Importância da “semente-inóculo”
“Semente-inóculo”, spawn (em inglês), é o termo comumente utilizado pelos
produtores de cogumelos no Brasil para se referir ao micélio do fungo desenvolvido em
substratos como grãos e/ou serragens que são utilizados para iniciar o cultivo de
cogumelos.
Na fungicultura, a elaboração da “semente-inóculo” é o primeiro passo para se iniciar
o cultivo de uma espécie de cogumelo, assim como a produção e a qualidade das mudas
são importantes para o processo de reflorestamento.
A “semente-inóculo” constitui a base para o cultivo comercial dos fungos comestíveis
e sua elaboração e/ou obtenção é um dos principais problemas dos produtores comerciais
de fungos (Guzmán et al., 1993). Para garantir a alta qualidade da “semente-inóculo” são
necessárias condições estéreis e alto conhecimento do processo (Przybylowicz e
Donoghue, 1990). Segundo Chang e Hayes (1978) a manutenção e produção de “semente-
inóculo” de alta qualidade é o primeiro ponto crítico para o sucesso do cultivo de fungos
comestíveis.
Para o preparo da “semente-inóculo” de diferentes espécies de cogumelos, pode-se
utilizar uma grande variedade de substratos. Segundo Salmones et al. (1999), pode-se
utilizar material lignocelulósico como palha de arroz, palha de trigo, resíduos de algodão,
9
serragem de diversas madeiras, polpa de café, etc. Outros materiais utilizados são
sementes (grãos) e farelos de diversas gramíneas como trigo, sorgo, milho e arroz (Rafique,
1998; Chaiyama et al., 2007; Royse e Sanchez, 2007).
Philippoussis et al. (2001) e Silva et al. (2007) testaram substratos de sabugo de
milho, palha de milho e casca de cevada, e obtiveram uma rápida colonização de micélios
consistentes de Pleurotus eryngii e P. sajor-caju. Já Pedra e Marino (2006), utilizaram
serragem de casca de coco verde para o preparo de inóculo de P. ostreatus, obtendo
melhor crescimento micelial quando a serragem foi suplementada com farelo de trigo e/ou
de arroz.
Substratos: disponibilidades regionais
A fungicultura é desenvolvida em diferentes países utilizando substratos de origem
florestal e resíduos agroindustriais disponíveis localmente, considerando-se a espécie de
cogumelo.
Na Amazônia Central existe uma grande diversidade de espécies florestais Vianez e
Barbosa (2002) realizaram um estudo de alternativas de uso de resíduos gerados pela
indústria madeireira e uma dessas alternativas foi o uso de resíduos para o cultivo de
cogumelos. Pleurotus ostreatus e L. edodes foram cultivados em serragens de Maquira
coriacea
(Karsten) C.C. Berg (muiratinga), Simarouba amara Aubl. (marupá), Brosimum
parinarioides Ducke (amapá), Anacardium sp. L. (cajuí) e Protium sp. Burm. (breu) e os
melhores resultados foram obtidos com serragem de S. amara (Hanada, 2003).
Existe uma flexibilidade de uso de materiais na formulação de substratos para a
produção de fungos comestíveis, sem que estes materiais alterem as características e
qualidade das espécies (Royse e Sanchez, 2007). Assim, para a seleção do substrato, é
10
necessário conhecer os requerimentos para o melhor desenvolvimento do fungo e a
disponibilidade do substrato.
Nas últimas décadas, foram realizados muitos estudos sobre o potencial de materiais
diversos na formulação de substratos para o cultivo de fungos comestíveis, dos quais
podem-se mencionar: espécies madeireiras como Quercus serrata Murray., Q. glauca
Thunb., Acer palmatum Thunb., Cryptomeria japonica (L.f.) D. Don. e Paulownia tomentosa
(Thunb.) Steud. (Tokimoto et al., 1998; Hu et al., 2004), palha de trigo ou sabugo de milho
misturado com serragem de Q. rubra L. e Q. alba L. (Philippoussis et al., 2003; 2007; Royse
e Sanchez, 2007), resíduos de Eucalyptus sp. suplementados com farelo de trigo, arroz ou
soja, para produção de L. edodes e Pleurotus spp. (Silva et al., 2005).
Além das serragens de madeira foi testada a utilização de casca, polpa de café e
grãos de sorgo para a elaboração do inóculo secundário de L. edodes, que foi inoculado em
substratos de palha de cevada, sabugo de milho, farelo de arroz, brácteas da coroa de
abacaxi, casca de café, bagaço e folhas de cana-de-açúcar avaliando a melhor eficiência
biológica (Salmones et al., 1999; Morais et al., 2000; Eira et al., 2005).
Investigações sobre o uso de misturas de substratos vegetais, com leguminosas
como: Guadua angustifólia Kunth, Leucaena leucocephala (Lam.) De Wit. e casca de arroz,
no cultivo de L. edodes, forneceram indícios da melhor eficiência biológica (Sharma e
Madan, 1993); também foi testado o uso de gramíneas como Pennisetum purpureum
Schum. e Brachiaria sp. como substrato de P. ostreatus (Philippoussis et al., 2001; Donini et
al., 2006; Bernardi et al., 2007). Na região Sul de Minas Gerais foram avaliados diferentes
resíduos agrícolas disponíveis para o cultivo de P. sajor-caju e a palha de feijão foi
considerado o melhor resíduo para a produção deste cogumelo (Dias et al., 2003). O uso da
11
serragem da casca de coco verde com suplementação de farelo de arroz e/ou trigo no
cultivo de isolados de P. ostreatus foi favorável para a sua produção (Pedra e Marino, 2006).
Na Índia, Mandeel et al. (2005) testaram três espécies de Pleurotus spp. em resíduos
lignocelulósicos incluindo papel, papel carbono, serragem e fibras vegetais que
possibilitavam o cultivo comercial de Pleurotus sp., especialmente, P. columbinus, utilizando
diferentes resíduos recicláveis, fáceis de serem obtidos e baratos. Também, foram
realizados estudos sobre a possibilidade de uso de ervas daninhas como substrato para o
cultivo de P. ostreatus (Das e Mukherjee, 2007).
Com relação aos substratos oriundos de madeiras amazônicas há grande carência
de informações sobre os que melhor se adaptam ao processo de formação de “semente-
inóculo” do cogumelo L. strigosus, de ocorrência natural na Amazônia. Esta pesquisa
estabeleceu como prioridade identificar quais espécies madeireiras disponíveis na região
possibilitam a formulação de substrato para a elaboração de “semente-inóculo” com
potencial e uso para a produção deste cogumelo.
Fungo termófilo: vantagens para a fungicultura no Trópico Úmido
Kendrick (2000) define como fungos filamentosos termófilos, as espécies que
apresentam temperatura mínima de crescimento acima de 20°C, máxima acima de 50°C, e
temperatura ótima entre 35-50°C. Mswaka e Magan (1999), em estudos com
basidiomicetos, determinaram três grupos baseados nas temperaturas ótima e máxima para
o crescimento: (1) grupo de temperatura baixa com crescimento entre 25-30°C e sem
crescimento acima de 37°C; (2) grupo intermediário com temperatura ótima entre 30-37°C
sem crescimento a 45°C; e (3) grupo de temperatura alta com crescimento entre 37-40°C e
sem crescimento a 55°C.
12
Lentinus strigosus é uma espécie exposta a grandes variações de temperatura (Castillo
et al., 2004). Estudos de Vargas-Isla e Ishikawa (in press) indicam L. strigosus como uma
espécie termófila com crescimento micelial ótimo na temperatura a 35°C.
A busca pela domesticação de cogumelos comestíveis no Brasil tem grande potencial,
sendo que a domesticação destas espécies permitirá sua produção e exploração comercial,
levando o país a ter um produto nacional adaptado ao nosso clima e ambiente, competindo
no mercado externo (Maki e Paccola-Meirelles, 2002).
A domesticação de uma espécie inicia-se com o isolamento e manutenção do inóculo in
vitro. Entretanto, os protocolos de cultivo in vitro descritos na literatura são elaborados para
espécies de clima temperado, sendo necessário a determinação de protocolos para as
espécies de clima tropical.
No Brasil, a fungicultura é desenvolvida principalmente na região Sul e Sudeste,
utilizando espécies de clima temperado e subtropical originárias da Europa e Ásia, como A.
bisporus, L. edodes e Pleurotus spp. Já na região Norte, tropical, os custos para produção
destas espécies seriam muito elevados.
Deste modo, a domesticação de uma espécie com características termófilas vem a ser
uma grande vantagem para o desenvolvimento da fungicultura na Amazônia, uma vez que
temperaturas acima de 30ºC são comuns nos trópicos.
13
OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar as condições de crescimento micelial em laboratório de Lentinus strigosus e
elaborar formulações de substratos, utilizando como base serragens de espécies florestais
da Amazônia.
Objetivos específicos
- Avaliação das condições ambientais e nutricionais para o crescimento e manutenção da
cultura micelial in vitro.
- Elaboração de “semente-inóculo” do fungo L. strigosus utilizando como substrato
serragens de espécies florestais da Amazônia.
14
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2. Avaliação das condições ambientais e nutricionais para o
crescimento e manutenção da cultura micelial in vitro
19
ARTIGO 1
Vargas-Isla, R & Ishikawa, N K. Optimum conditions of in vitro mycelial growth of
Lentinus strigosus, an edible mushroom isolated in the Brazilian Amazon
Mycoscience, (in press).
Manuscrito aceito em 27 de novembro de 2007.
20
Optimum conditions of in vitro mycelial growth of Lentinus strigosus, an edible
mushroom isolated in the Brazilian Amazon
Condições ótimas de crescimento micelial in vitro de Lentinus strigosus, um
cogumelo comestível isolado na Amazônia Brasileira
Ruby Vargas-Isla, Noemia Kazue Ishikawa
Coordenação de Pesquisas em Tecnologia de Alimentos, Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia, Av. André Araújo, 2936, Manaus, Amazonas – CEP: 69060-020, Brasil.
Autor para correspondência: Ishikawa N. K. - Tel: +55-92-36431890 Fax: +55-92-36431846
E-mail: noemia@inpa.gov.br
21
Resumo
Os protocolos de cultivo in vitro, descritos em literatura para cogumelos estão
geralmente correlacionados com habitat de espécies de clima temperado, sendo necessário
o estudo de protocolos para as espécies de clima tropical. Neste trabalho foram coletadas,
isoladas e avaliadas as condições de crescimento micelial in vitro de Lentinus strigosus e
correlacionando com as características do seu habitat. Estes resultados indicaram o uso de
35°C para incubação, pH inicial entre 5 a 7, sem iluminação, meio Sabouraud dextrose ágar
e agitação para meio de cultura líquido como condições ótimas de crescimento micelial in
vitro de L. strigosus.
Palavras-chave Basidiomiceto. Alta temperatura. Lentinus strigosus. Fungo termófilo
22
Abstract
The protocols of in vitro cultivation, described in the literature for mushrooms are
usually correlated with temperate climate habitat, but it is necessary to study protocols for the
species of tropical climate. In this article, we collected, isolated and evaluated the conditions
of in vitro mycelial growth of Lentinus strigosus and correlated with the characteristics of its
habitat. These results indicate as optimum conditions of in vitro mycelial growth for L.
strigosus the use of 35°C for incubation, initial pH from 5 to 7, without illumination,
Sabouraud Dextrose Agar medium and agitation for culture in liquid medium.
Key words Basidiomycete. High temperature. Lentinus strigosus. Thermophiles fungi
23
Introdução
Existem mais de 200 gêneros de macrofungos que contêm espécies de uso popular,
devido a suas propriedades comestíveis. Estes são diferenciados entre os registros de
cogumelos considerados simplesmente “comestíveis” e os que são considerados alimentos.
Incluir todas as espécies comestíveis como alimento aumentaria o número de espécies
consumidas pelas populações de todo o mundo (Boa 2004). Existem, aproximadamente,
100 espécies de fungo que podem ser cultivados (Boa 2004). O mercado comercial está
dominado por Agaricus bisporus (J.E. Lange) Pilát, Pleurotus spp. (Fr.) P. Kumm., Lentinula
edodes (Berk.) Pegler, Volvariella volvacea (Bull.) Singer, Flammulina velutipes (Curt.:Fr.)
Singer e Pholiota nameko (T. Itô) S. Ito e S. Imai (Kendrick 2000; Sánchez 2004). Por outro
lado, os fungos silvestres ainda não cultivados comercialmente têm grande importância
etnomicológica porque constitui um alimento muito apreciado (Herrera e Ulloa 1990; Boa
2004). O potencial da diversidade de fungos nos ecossistemas tropicais vem sendo muito
discutido, mas pouco explorado cientificamente (Hawksworth 2001; Mueller e Schmit 2007;
Mueller et al., 2007).
O gênero Lentinus Fr. (Polyporaceae tribo Lentineae Fayod) tem ampla distribuição
mundial com espécies de ocorrência abundante nas regiões tropicais. Os basidiocarpos, ou
corpos de frutificação, do gênero Lentinus são de consistência dura à coriácea e mais
persistentes do que outros gêneros da ordem Agaricales. Devido à natureza resistente a
períodos adversos de seca destas espécies, freqüentemente, representam o grupo
dominante de fungos Agaricales em florestas tropicais (Pegler 1975). Estudos
etnomicológicos têm identificado diferentes espécies de fungos comestíveis do gênero
Lentinus, consumidos por grupos indígenas como os Yanomami na Amazônia brasileira:
Lentinus crinitus (L.) Fr., L. velutinus Fr., L. glabratus Mont., L. cubensis Berk. e M.A. Curtis,
L. strigosus (Schwein.) Fr. (Fidalgo e Prance 1976; Fidalgo e Hirata 1979; Prance 1984).
Assim como os indígenas Uitoto da região de Araracuara na Amazônia colombiana,
consomem: L. strigosus, L. concavus (Berk.) Corner, L. crinitus, L. scleropus (Pers.) Fr.
24
(Vasco 2002). Chang e Mao (1995) relatam que esta espécie pode ser cultivada. Nós
degustamos este fungo ao sautéed com margarina e um pouco de sal, e consideramos o
sabor agradável com elevado umami e ligeiramente fibroso.
A maioria dos cogumelos cultivados é originária de países de clima temperado, e os
protocolos in vitro descritos em literatura estão correlacionados com o habitat destas
espécies, entretanto, como as condições ambientais nos trópicos são diferentes, é
necessário o estudo de protocolos para as espécies de clima tropical. Como comentado por
Mswaka e Magan (1999), a temperatura ótima para o crescimento da maioria de fungos de
madeira em decomposição de regiões temperadas estão entre 25 e 30°C. Estudos
detalhados sobre a temperatura ótima de crescimento de espécies tropicais de fungos de
madeira em decomposição são escassos. No Brasil, as espécies de cogumelos comestíveis
cultivadas são originárias principalmente, da Europa e Ásia, como A. bisporus, L. edodes e
Pleurotus spp. A fungicultura é mais desenvolvida na Região Sul e Sudeste do Brasil, onde
o clima subtropical é mais adequado para a produção destas espécies. Na Região Norte de
clima Tropical, os custos de produção para estas espécies são muito elevados,
inviabilizando o seu cultivo em grande escala. Portanto, iniciamos pesquisas para
domesticar e cultivar espécies adaptadas ao clima tropical utilizando como base resíduos
agroflorestais da Amazônia, objetivando diminuir os custos de produção.
A domesticação de cogumelos comestíveis de ocorrência natural no Brasil permitirá sua
produção e exploração comercial levando o país a ter um produto nacional adaptado ao
nosso clima e ambiente competindo no mercado externo (Maki e Paccola-Meirelles 2002).
No presente trabalho, nós coletamos, isolamos e avaliamos as condições de
crescimento micelial in vitro da espécie L. strigosus e correlacionando os resultados com as
características do habitat deste cogumelo.
25
Material e métodos
Coleta, isolamento e identificação
Foram coletados basidiocarpos de L. strigosus em substrato lignícola no Campus III do
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) (3°5’31.6”S, 59°59’36.4”W), Manaus –
AM – Brasil. O isolamento do micélio foi realizado com a inoculação de fragmentos do
contexto do basidiocarpo em meio de cultura de batata dextrose ágar (BDA-Acumedia
Manufacturers, USA), incubados a 25°C, na ausência de luz. Com parte da coleta foi
confeccionada a exsicata para ser depositada na Coleção de Microrganismos de Interesse
Agrossilvicultural do INPA. A espécie foi identificada com ajuda de literatura disponível
(Stankovicová 1973; Pegler 1975; Pegler 1983).
Efeito da temperatura
Foi avaliado o crescimento micelial do isolado de L. strigosus nas temperaturas de 25,
30, 35, 40 e 45°C, em meio de cultura BDA. Em placas de Petri (90 mm de diâmetro)
contendo meio de cultura BDA foi inoculado com um disco de ágar com micélio (10 mm de
diâmetro) e incubados durante cinco dias a 25°C.
Avaliação do peso da massa seca micelial em meio de cultura sólido
Foi avaliado o crescimento micelial pela medida do diâmetro da colônia e o peso da
massa seca micelial no 5
o
e no 6
o
dia, respectivamente. As duas formas comuns de avaliar a
taxa de crescimento micelial são: (1) aumento radial da colônia em meio sólido; e (2)
aumento da massa seca de colônia cultivado em meio líquido. O primeiro tem a vantagem
de obter registros seqüenciais do crescimento de cada colônia. O segundo é uma medida
mais absoluta, mas só pode ser executado uma vez para cada colônia (Kendrick 2000).
Neste trabalho adotamos uma metodologia que permitiu a avaliação do diâmetro da colônia
e peso seco da mesma, cultivado em meio sólido. Para avaliação do peso da massa micelial
seca, após o crescimento da colônia nos respectivos meios de cultura, a placa de Petri foi
26
colocada em forno microondas por 20 segundos para derretimento do meio. Em seguida, o
micélio foi separado do meio por filtração e lavado com água destilada a uma temperatura
aproximada de 60°C. O micélio foi colocado em estufa a 105°C até manter peso constante.
Efeito da agitação
Foi avaliado o efeito da agitação em meio de cultura líquido sobre o crescimento
micelial de L. strigosus, utilizando batata dextrose (BD): infusão de 200 g de batata, 20 g de
glicose e água destilada até completar o volume de 1000 ml (pH=6,0), esterilizada a 121°C
durante 15 minutos. Foram inoculados cinco discos de micélio em frascos de Erlenmeyer
(250 ml) contendo 100 ml de BD. Para o tratamento de agitação, os frascos foram
colocados em mesa agitadora TECNAL TE-140 (SP, Brasil) a 75 rpm. Como controle, outros
frascos foram mantidos em condições estáticas. Ambos tratamentos foram incubados em
condições ambientais a 25 ± 2°C e iluminação natural. Depois de 15 dias de crescimento
micelial, o micélio foi separado por filtração. A massa obtida foi colocada em estufa a 105°C
até peso constante.
Efeito do pH inicial do meio de cultura
Para avaliação do efeito do pH inicial do meio de cultura, foram inoculados cinco discos
de micélio em frascos de Erlenmeyer (250 ml) contendo 100 ml de BD com os respectivos
pH (4, 5, 6 e 7). O pH foi ajustado antes da esterilização com soluções de HCl e NaOH. Os
frascos foram incubados a 35°C, com agitação, condições ótimas observadas em
experimentos prévios. Neste experimento o peso da massa seca foi obtido depois de dez
dias de crescimento micelial.
Efeito da composição do meio de cultura
Foi avaliado o crescimento micelial de L. strigosus em meios de cultura sólidos: BDA
(Acumedia Manufacturers), extrato de malte peptona ágar (EMPA) (3% extrato de malte
27
[Becton, Dickinson and Company, USA]; 0,3% peptona de soja [BIOBRÁS S.A., Brasil];
1,5% ágar [Becton, Dickinson and Company]), Sabouraud dextrose ágar (SDA) (Becton,
Dickinson and Company-BD), meio V8 (V8) (200 ml suco V8 [Campbell´s, USA]; 1,5% ágar,
800 ml H
2
O), e meio de cultura mínimo (MM) (Pontecorvo et al., 1953). Foram esterilizados
os frascos com o respectivo meio de cultura a 121°C durante 15 minutos e o meio foi vertido
em placas de Petri (90 mm de diâmetro), e inoculados com um disco de micélio. Este
experimento também foi incubado a 35°C. O crescimento micelial foi avaliado pela medida
do diâmetro da colônia no 5
o
dia. Foi avaliado o peso da massa micelial seca de acordo com
a metodologia descrita na avaliação do peso seco em meio de cultua sólido.
Efeito da influência da luz
Para avaliação do efeito da influência da luz, meio BDA contido em placas de Petri foi
inoculado com um disco de micélio e incubadas a 35°C, o tratamento com luz foi de 24
horas de luz (1250 lux). A emissão de luz foi medida através de Illuminance meter IM-5
(Topcon, Japão). O tratamento sem luz foi realizado em uma caixa coberta. O crescimento
de culturas no escuro foi avaliado apenas no término do experimento. Foi avaliado o
crescimento micelial pela medida do diâmetro da colônia no 5
o
dia, e o peso da massa seca
micelial foi medido usando o procedimento de avaliação da temperatura. Para avaliação do
crescimento micelial em meio líquido, cinco discos de micélio foram colocados em frascos
de Erlenmeyer (250 ml) contendo 100 ml de meio BD, incubados a 35°C e 75 rpm, durante
dez dias. Tratamento com luz foi de 24 horas de luz e tratamento sem luz foi desenvolvido
em frascos cobertos com folhas de papel alumínio. Após deste período, o micélio foi
separado por filtração, obtendo o peso seco.
28
Análise estatística
Os experimentos foram conduzidos em cinco replicatas e duas repetições. Para análise
estatística, os valores de peso e diâmetro de micélio foram submetidos a ANOVA e as
médias dos tratamentos comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância.
Resultados e discussão
Microrganismo
Os basidiocarpos (Fig. 1) apresentaram píleo 4-7 cm de diâmetro, convexo,
subinfundibuliforme a infundibuliforme, ou lateralmente espatulado; superfície clara a
ocráceo pálido, marrom em direção ao centro, violáceo ou matizes purpúreos no princípio
especialmente em direção das margens, densamente viloso a híspido-estrigoso; margem
encurvada, fina, ondulada; contexto carnoso, branco. Lamelas decorrentes, branca a
ocráceo com a maturidade, ou com matizes violáceos especialmente na borda, 1-2 mm
largo, apressas, com 2 a 4 séries de lamélulas. Estipe excêntrico a lateral, raramente
central, curto, cilíndrico ou ligeiramente mais espesso no ápice; levemente arroxeado
quando jovem escurecendo para bege ou marrom claro com a maturidade, tomentoso, com
tomento basal quando jovem, estas características nos levaram a identificar este fungo
como L. strigosus, considerando as descrições de Pegler (1983). L. strigosus é encontrado
embaixo de vegetação densa, assim como em habitat semi-abertos, e exposto a grandes
variações de temperatura (Castillo et al., 2004). O isolado utilizado neste trabalho foi
coletado no mês de novembro 2006 em habitat aberto sobre substrato lignícola.
Efeito da temperatura no crescimento
O efeito da temperatura no crescimento de L. strigosus em meio BDA nas temperaturas
entre 25 a 45ºC são mostradas na Fig. 2 e 3. Com base nos resultados da análise estatística
29
do diâmetro das colônias verificou-se que 35 e 40°C foram as melhores temperaturas para o
crescimento micelial, não diferindo a 5% de significância (Fig. 2A). No entanto, os resultados
do peso seco da massa micelial mostraram diferença significativa entre 35 e 40°C (Fig. 2B),
esta medida de crescimento micelial indicou que a temperatura de 35ºC proporcionou uma
colônia com maior massa. Este experimento demonstra a vantagem da avaliação da massa
seca da colônia em meio sólido por determinar o tamanho e a densidade da colônia sem a
necessidade do cultivo em meio líquido. Mswaka e Magan (1999) em estudos com
basidiomicetos determinaram três grupos, baseados na ótima e máxima temperatura para o
crescimento: (1) grupo de temperatura baixa com temperaturas ótimas entre 25-30°C e sem
crescimento acima de 37°C; (2) grupo intermediário com temperatura ótima entre 30-37°C
sem crescimento a 45°C e (3) grupo de temperatura alta com crescimento entre 37-40°C e o
crescimento cessa a 55°C. Kendrick (2000) define fungos termófilos as espécies com
temperatura de crescimento mínima acima de 20°C, máxima acima de 50°C, e temperatura
ótima entre 35-50°C. Uma vez que houve crescimento a 45°C, embora seja menor, a colônia
alcançou 2,5 cm de diâmetro em cinco dias a 45°C, deste modo consideramos este fungo no
grupo de temperatura alta ou fungo termófilo. O que é bastante compreensível, uma vez que
foi registrada a temperatura interna da tora onde o cogumelo foi coletado de 35 ± 3°C ao
meio dia. Este fato explica a correlação com a temperatura ótima obtida no laboratório.
Castillo et al. (2004), estudou a correlação entre o crescimento in vitro em resposta à
temperatura e o habitat de alguns fungos lignícolas da costa florestal de Papua Nova Guiné
e obtiveram resultados similares para L. strigosus.
Efeito da agitação, pH inicial e luz no crescimento micelial
Para espécies aeróbicas, a aeração é uma das condições de cultivo mais importantes.
Normalmente, basidiomicetos degradadores de madeira só crescem em madeiras onde o
conteúdo de umidade não é maior de 60% (w/v). Portanto, eles são mais sensíveis à
deficiência de oxigênio do que os fungos imperfeitos (Emelyanova 2005). Além disso, a
30
produção de biomassa, a intensidade da aeração e condições de agitação também
influenciaram a forma do crescimento micelial (filamentos miceliais difusos ou micélios
aglomerados: pelets) (Emelyanova 2005). Estes aspectos foram observados neste
experimento (Tabela 1), o tratamento com agitação apresentou maior crescimento micelial
comparado com a condição estacionária. Micélios aglomerados foram observados no
tratamento com agitação.
Não houve diferença significativa (p<0,05) entre pH 5, 6 e 7; no entanto, o pH 4
apresentou menor crescimento micelial (Tabela 2).
Existem muitos estudos sobre o efeito da luz no desenvolvimento de basidiomicetos,
sendo este um fator essencial para a formação de corpo de frutificação (Chang e Hayes
1978; Leatham e Stahmann 1987; Matsumoto e Kitamoto 1987; Kitamoto et al., 1999;
Sakamoto et al., 2004). Considerando que o lugar da coleta deste fungo foi totalmente
iluminado (média de 61120 lx ao meio dia), sugere-se que a luz tenha forte influência na
frutificação do mesmo. Porém, na avaliação da influência da luz no crescimento micelial em
meio sólido não apresentou diferença significativa e no meio líquido a produção de
biomassa foi maior na ausência de luz (Tabela 3).
Efeito do meio de cultura
O efeito do meio de cultura, o meio BDA mostrou maior diâmetro, considerando a
medida do diâmetro da colônia no 5
o
dia de incubação. No entanto, na avaliação do peso
seco da colônia, a maior produção de biomassa foi obtida no meio SDA (Fig. 4).
Assim, nós sugerimos como condições ótimas de crescimento micelial in vitro de L.
strigosus, o uso de meio SDA com pH inicial entre 5 a 7, temperatura de incubação de 35°C,
sem iluminação e com agitação para cultivo em meio líquido.
31
Agradecimentos Os autores agradecem ao MSc Ricardo Braga-Neto na descrição, como
também ao Dr Armando López Ramírez e Dr Eiji Nagasawa pelas discussões úteis na
identificação do cogumelo. Ao Dr José Antonio Alves Gomes e Dra Gislene Almeida
Carvalho-Zilse pelo suporte administrativo na aquisição de equipamentos utilizados neste
estudo. Vargas-Isla, R agradece à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do
Amazonas (FAPEAM) pela bolsa de estudo.
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34
Legendas das tabelas
Tabela 1. Efeito da agitação no crescimento micelial de Lentinus strigosus em meio líquido
de batata dextrose
*Peso seco da colônia no 15
o
dia de incubação a 25±2ºC e 75 rpm de agitação.
(a)
Médias
com a mesma letra(s) sobrescrita não diferem significativamente (p<0,05) pelo teste de
Tukey. Média de cinco replicatas.
Tabela 2. Efeito do pH inicial do meio de cultura no crescimento micelial de Lentinus
strigosus
*Peso seco da colônia no 10
o
dia em meio batata dextrose incubado a 35ºC e 75 rpm de
agitação.
(a)
Médias com a mesma letra(s) sobrescrita não diferem significativamente
(p<0,05) pelo teste de Tukey. Média de cinco replicatas.
Tabela 3. Efeito da luz no crescimento micelial de Lentinus strigosus em meio sólido e meio
líquido de batata dextrose
*Diâmetro da colônia em meio sólido no 5
o
dia de incubação. **Peso seco da colônia no 6
o
dia de incubação. ***Peso seco da colônia no 10
o
dia de incubação com 75 rpm de agitação.
A temperatura de incubação foi 35ºC.
(a)
Médias com a mesma letra(s) sobrescrita não
diferem significativamente (p<0,05) pelo teste de Tukey. Média de cinco replicatas.
35
Legendas de figuras
Fig. 1. Basidiocarpos de Lentinus strigosus coletados em substrato lignícola. (A) estágio
jovem, (B) estágio maturo de basidiocarpos.
Fig. 2. Crescimento micelial de Lentinus strigosus em batata dextrose ágar incubado em
diferentes temperaturas.
(a)
Médias com a mesma letra(s) sobrescrita não diferem
significativamente (p<0,05) pelo teste de Tukey. Média de cinco replicatas. (A) Diâmetro da
colônia (cm) no 5
o
dia, (B) Peso seco da colônia (mg/placa) no 6
o
dia.
Fig. 3. Colônia micelial de Lentinus strigosus no 5
o
dia de incubação nas temperaturas: (da
esquerda para a direita) 25, 30, 35, 40 e 45°C, em meio de cultura batata dextrose ágar.
Fig. 4. Crescimento micelial de Lentinus strigosus em diferentes meios de cultura incubados
a 35°C. BDA=batata dextrose ágar, EMPA=extrato de malte peptona ágar, SDA=Sabouraud
dextrose ágar, V8=meio suco V8, MM=meio mínimo.
(a)
Médias com a mesma letra(s)
sobrescrita não diferem significativamente (p<0,05) pelo teste de Tukey. Média de cinco
replicatas. (A) Diâmetro da colônia (cm) no 5
o
dia, (B) Peso seco da colônia (mg/placa) no 6
o
dia.
36
Tratamento Peso seco da colônia* (mg/frasco)
Com agitação 413,4 ± 22,9 a
Sem agitação 286,9 ± 54,7 b
Tabela 1. Efeito da agitação no crescimento micelial de
Lentinus strigosus em meio líquido de batata dextrose
*Peso seco da colônia no 15
o
dia de incubação a 25±2ºC e 75 rpm de
agitação. (a)Médias com a mesma letra(s) sobrescrita não diferem
significativamente (p <0,05) pelo teste de Tukey. Média de cinco
replicatas.
Vargas-Isla & Ishikawa
37
4
246,5 ± 21,2
b
5
324,6 ± 25,9
a
6
283,9 ± 31,3
ab
7
332,8 ± 39,1
a
Tabela 2. Efeito do pH inicial do meio de cultura no
crescimento micelial de Lentinus strigosus
pH
Peso seco da colônia*
(mg/frasco)
*Peso seco da colônia no 10
o
dia em meio batata dextrose
incubado a 35ºC e 75 rpm de agitação. (a)Médias com a mesma
letra(s) sobrescrita não diferem significativamente (p <0,05) pelo
teste de Tukey. Média de cinco replicatas.
Vargas-Isla & Ishikawa
38
meio sólido** meio líquido***
Com luz
7,49 ± 0,749
a
228,9 ± 13,9
a
369,44 ± 1,8
b
Sem luz
7,91 ± 0,252
a
203,5 ± 7,2
a
397,04 ± 1,1
a
*Diâmetro da colônia em meio sólido no 5o dia de incubação. **Peso seco da colônia no 6o dia de incubação.
***Peso seco da colônia no 10o dia de incubação com 75 rpm de agitação. A temperatura de incubação foi 35ºC.
(a)Médias com a mesma letra(s) sobrescrita não diferem significativamente (p
<0,05) pelo teste de Tukey. Média de
cinco replicatas.
Tratamento
Diâmetro da colônia*
(cm)
Peso seco da colônia (mg/placa ou frasco)
Tabela 3. Efeito da luz no crescimento micelial de Lentinus strigosus em meio sólido e meio
líquido de batata dextrose
Vargas-Isla & Ishikawa
39
Fig.1
Vargas-Isla & Ishikawa
40
Fig. 2
Vargas-Isla & Ishikawa
41
Fig. 3
Vargas-Isla & Ishikawa
42
Fig. 4
Vargas-Isla & Ishikawa
43
3. Elaboração de “semente-inóculo” do fungo Lentinus strigosus
com base em serragens de espécies florestais da Amazônia
44
ARTIGO
2
Vargas-Isla, R; Hanada, R E & Ishikawa, N K. Elaboração de “semente-inóculo”
de Lentinus strigosus, um cogumelo comestível termófilo isolado na
Amazônia Brasileira.
Manuscrito não publicado.
45
Elaboração de “semente-inóculo” de Lentinus strigosus, um cogumelo comestível
termófilo isolado na Amazônia Brasileira.
Ruby Vargas-Isla
1
, Rogério Eiji Hanada
2
, Noemia Kazue Ishikawa
1
1
Coordenação de Pesquisas em Tecnologia de Alimentos, Instituto Nacional de Pesquisas
da Amazônia, Av. André Araújo, 2936, Manaus, Amazonas – CEP: 69060-020, Brasil.
2
Coordenação de Pesquisas de Produtos Florestais, Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia, Av. André Araújo, 2936, Manaus, Amazonas – CEP: 69060-020, Brasil.
Autor para correspondência: Ishikawa N. K. - Tel: +55-92-36431890 Fax: +55-92-36431846
E-mail: noemia@inpa.gov.br
46
Resumo
A espécie de cogumelo comestível Lentinus strigosus (Schwein.) Fr. de ocorrência
natural na Amazônia apresenta características de fungo filamentoso termófilo, ou seja,
temperatura ótima de crescimento micelial a 35ºC. Este aspecto faz desta espécie uma
alternativa vantajosa para o cultivo em climas tropicais. Por outro lado, questões relativas ao
aproveitamento dos resíduos gerados pelas indústrias madeireiras na região Amazônica têm
sido abordadas, principalmente, com relação à poluição do meio ambiente. Uma das
possibilidades de obter produtos de qualidade a partir do aproveitamento de resíduos
madeireiros, como a serragem, é a fungicultura, considerada uma ótima alternativa de
bioconversão de resíduos lignocelulósicos em alimento de alto valor nutricional e
gastronômico. Neste estudo foi avaliado o potencial de uso de serragens de onze espécies
florestais da Amazônia para a elaboração se “semente-inóculo” L. strigosus. Para tanto,
avaliou-se o crescimento micelial de L. strigosus em formulações com as serragens de:
Hymenolobium petraeum Ducke (Angelim pedra), Hura crepitans L. (Assacu), Bertholletia
excelsa H.B.K. (Castanheira), Cedrela odorata L. (Cedro), Bombacopsis quinata (Jacq.)
Dugand. (Cedro doce), Hymenaea courbaril L. (Jatobá), Ocotea cymbarum Kunth (Louro
canela), Simarouba amara Aubl. (Marupá), Astronium lecointei Ducke (Muiracatiara), Aniba
rosaeodora Ducke (Pau rosa) e Caryocar sp. (Piquiarana) e duas espécies comumente
utilizadas na fungicultura (Eucalyptus sp. e Quercus acutissima Carr.) suplementadas com
20% (w/w) de farelo de arroz. Os substratos à base de serragem de B. quinata e S. amara
promoveram maiores crescimentos miceliais (p<0,05). Em uma segunda etapa, avaliou-se o
crescimento micelial em S. amara suplementado com sete diferentes fontes de nitrogênio
(20% w/w): farelo de arroz, extrato de soja, levedura de cerveja, farinha de casca de
maracujá, fibra de soja, fibra de trigo e gérmen de trigo. Como controle, serragem pura.
Todas as suplementações favoreceram o crescimento micelial de L. strigosus. Para a
produção de “semente-inóculo” foram testados sacos e frascos de polipropileno utilizando
serragens de S. amara, H. petraeum e A. lecointei suplementados com farelo de arroz, após
25 dias de inoculação os substratos estavam totalmente colonizados em todas as
embalagens testadas, para a escolha da embalagem foram considerados custos das
embalagens; tempo de colonização; viabilidade de transporte e praticidade de inoculação do
micélio no substrato. Mediante estes resultados, a “semente-inóculo” de L. strigosus foi
elaborada com sucesso, utilizando-se serragem de S. amara suplementado com 20% (w/w)
de farelo de arroz, incubados a 35ºC por 25 dias, no escuro, nas três embalagens testadas.
Palavras chave: Serragem. Basidiomiceto. Espécies florestais. “Semente-inóculo”. Panus
rudis.
47
Abstract
The edible mushroom Lentinus strigosus (Schwein.) Fr. presents characteristics of
thermophile filamentous fungus, in the other words, optimum temperature of micelial growth
at 35°C. This aspect makes of this specie an advantageous alternative for the cultivation in
the tropical climate. On the other hands, questions relatives to the use of the wastes
generated by the woody industries in the Amazon have been approached, mainly, with
relationship to the pollution of the environment. A possibility to obtaining high quality products
starting from the use of forestry residues, as sawdust, the fungiculture considered a great
alternative of bioconversion of residues lignocelulolitics in food of high nutritional and
gastronomic value. In this study, the potential of use of sawdust of eleven forestry species of
the Amazon was evaluated for the elaboration of spawn of L. strigosus. Therefore, the
micelial growth of L. strigosus was evaluated in sawdust with bran rice formulations of:
Hymenolobium petraeum Ducke (Angelim pedra), Hura crepitans L. (Assacu), Bertholletia
excelsa H.B.K. (Castanheira), Cedrela odorata L. (Cedro), Bombacopsis quinata (Jacq.)
Dugand. (Cedro doce), Hymenaea courbaril L. (Jatobá), Ocotea cymbarum Kunth (Louro
canela), Simarouba amara Aubl. (Marupá), Astronium lecointei Ducke (Muiracatiara), Aniba
rosaeodora Ducke (Pau rosa) and Caryocar sp. (Piquiarana) and two species commonly
used in fungiculture (Eucalyptus sp. and Quercus acutissima Carr.), they were supplemented
with 20% (w/w) of rice bran. The substrates formulated with sawdust of B. quinata and S.
amara promoted higher mycelial growth (p<0.05). In the second phase, the mycelial growth
in S. amara supplemented with seven different sources of nitrogen (20% w/w) was
evaluated: rice bran, soy extract, beer yeast, passion fruit shell flour, soy fiber, wheat fiber
and wheat germ. As control was utilized pure sawdust. All the supplements favored the
mycelial growth of L. strigosus. Bags and flasks of polypropylene were tested for spawn
production and utilizing sawdust of S. amara, H. petraeum and A. lecointei supplemented
with rice bran, after 25 days of inoculation the substrates were totally colonized in all the
packings tested. For choice of the packing should be considered costs of the packings; time
of colonization; transport viability and feasibility of mycelial inoculation on the substratum. By
these results, the "spawn" of L. strigosus was elaborated with success, being used sawdust
of S. amara supplemented with 20% (w/w) of rice bran, incubated at 35°C during 25 days, in
the dark, , in three tested packings.
Key words Sawdust. Basidiomycete. Forestry species. Spawn. Panus rudis
48
Introdução
A Amazônia apresenta um cenário favorável para o desenvolvimento da fungicultura,
pois reúne a diversidade nativa de espécies de cogumelos comestíveis e substratos
lignocelulósicos em abundância. No entanto, as poucas tentativas de desenvolver esta
atividade na região foram realizadas com espécies tradicionalmente cultivadas em climas
temperados e subtropicais, o que demanda altos custos com a climatização e inviabilizando
a atividade. Sendo assim, a domesticação de espécies regionais vem a ser uma alternativa
para viabilizar a produção de cogumelos na Amazônia.
Em novembro de 2006, foi coletado basidiocarpo e isolado micélio da espécie
Lentinus strigosus (Schwein.) Fr. (=Panus rudis Fr.) no Campus III do Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus - AM – Brasil, o qual apresentou características de
fungo filamentoso termófilo, com crescimento em temperaturas de 25 a 45ºC, sendo a
temperatura de crescimento ótima, 35ºC (Vargas-Isla e Ishikawa, in press). A domesticação
de uma espécie com características termófilas vem a ser uma grande vantagem para o
desenvolvimento da fungicultura na Amazônia, uma vez que temperaturas acima de 30ºC
são comuns nos trópicos. Além disso, o fato de ser uma temperatura atípica para fungos
conhecidamente prejudiciais na fungicultura, como algumas espécies de Trichoderma spp.
que têm crescimento ideal a 20-25ºC e cessa o crescimento a 35ºC, esta condição poderá
ser uma vantagem do L. strigosus em relação aos fungos competidores.
A espécie L. strigosus tem uma ampla distribuição mundial apresentando vários
ecotipos. A comestibilidade desta espécie tem sido reportada em estudos etnomicológicos
de povos indígenas da Amazônia (Fidalgo e Prance 1976; Fidalgo e Hirata 1979; Prance
1984; Vasco 2002). Parte da coleta de basidiocarpos de L. strigosus realizada em março de
2007 foi degustada por Vargas-Isla R e Ishikawa NK, após preparada ao sautéed com
49
margarina e um pouco de sal. As autoras relataram que o cogumelo apresenta sabor
agradável com elevado umami e consistência ligeiramente fibrosa.
Além dos aspectos gastronômicos, nutritivos e medicinais de algumas espécies de
fungos macroscópicos, o cultivo de cogumelos (fungicultura) favorece o aproveitamento dos
resíduos gerados pelas indústrias agroflorestais como: serragens (Hanada 2003; Silva et al.,
2005; Philippoussis et al., 2007); bagaço de cana (Soccol e Vandenberghe 2003; Rossi et
al., 2003; Silva et al., 2007); sabugo de milho (Salmones et al., 1999; Philippoussis et al.,
2003, 2007); bainha de palmito (Tonini et al., 2007) e gramíneas (Philippoussis et al., 2001).
O processo de bioconversão ajuda a prevenir a contaminação ambiental causada pelo
acúmulo de resíduos agroflorestais, sendo umas das melhores alternativas de conversão de
resíduos madeireiros em alimentos (Silva et al., 2005; Mandeel et al., 2005). Os substratos
utilizados na fungicultura variam de acordo com as espécies de cogumelos e a
disponibilidade nos locais onde são cultivados (Albertó e Gasoni 2003).
“Semente-inóculo”, spawn (em inglês), é o termo comumente utilizado pelos
produtores de cogumelos no Brasil para se referir ao micélio do fungo desenvolvido em
substratos como grãos e/ou serragem, que é utilizado como inóculo inicial do cultivo de
cogumelo.
A produção e manutenção de “semente-inóculo” de alta qualidade é o primeiro ponto
crítico para o sucesso do cultivo de fungos comestíveis (Chang e Hayes, 1978; Guzmán et
al., 1993; Przybylowicz e Donoghue, 1990). No Brasil, o limitado número de consumidores
de cogumelos, a reduzida e descontinua produção de cogumelos e a carência de mão de
obra especializada, são aspectos que agravam os problemas de elaboração de “semente-
inóculo”.
50
O presente trabalho objetivou avaliar o crescimento micelial em serragens de onze
espécies florestais regionais e a influência de sete diferentes suplementações como fonte de
nitrogênio para a elaboração de “semente-inóculo” utilizando três tipos de embalagens.
Material e métodos
Microrganismo
O isolado de L. strigosus (CCA-01) utilizado neste estudo foi coletado em substrato
lignícola no Campus III do INPA, Manaus-AM. A cultura estoque foi mantida em meio de
cultura Sabouraud Dextrose Ágar (SDA- Becton, Dickinson and Company-BD, USA) em
tubos de ensaio, a 25°C e na ausência de luz. O micélio da cultura estoque foi cultivado a
35°C em placas de Petri (90 mm de diâmetro) contendo meio SDA. Após cinco dias de
crescimento, discos miceliais de 10 mm de diâmetro foram retirados e utilizados como
inóculo dos experimentos (Vargas-Isla e Ishikawa, in press).
Crescimento micelial em serragens
As serragens de espécies florestais da Amazônia utilizadas neste trabalho foram
selecionadas entre as espécies apontadas como as principais geradoras de resíduos
madeireiros da Amazônia Central (Vianez e Barbosa, 2002). Serragem de Eucalyptus sp. foi
incluída por se tratar da espécie florestal comumente utilizada para o cultivo do cogumelo
comestível L. edodes no Sul e Sudeste do Brasil (Paula et al., 2001; Queiroz et al., 2004;
Silva et al., 2005; Shiomi et al., 2007), assim como Quercus acutissima, que é utilizada na
Ásia (Quimio et al., 1990; Przybylowicz e Donoghue 1990) (Tabela 1). A formulação do
substrato foi composta por 100 g de serragem, acrescida de 20% (w/w) de farelo de arroz
(Oryza sativa L.) e água destilada para umidecer até aproximadamente 60% (w/v). Em
placas de Petri (90 mm de diâmetro), 15 g do substrato foram esterilizados duas vezes por 1
hora a 121°C, com intervalo de 24 horas. O substrato foi inoculado com um disco de ágar
51
com micélio (10 mm de diâmetro), depositado no centro da placa, e incubado a 35°C na
ausência de luz. O crescimento micelial foi avaliado pelo cálculo do Índice de Velocidade de
Crescimento Micelial (IVCM) = ∑ (D-Da)/N (onde D = diâmetro atual da colônia; Da =
diâmetro da colônia no dia anterior; N = número de dias após a inoculação) (Oliveira apud
Dias et al., 2005).
Suplementações
Utilizando-se a metodologia descrita acima para estimar o crescimento micelial em
diferentes serragens, avaliou-se o desenvolvimento micelial de L. strigosus em serragem de
S. amara suplementada com 20% (w/w) de: farelo de arroz, farelo de soja (Glycine max (L.)
Merrill), extrato de soja, fibra de trigo (Triticum aestivum (L.) Thell.), gérmen de trigo, levedo
de cerveja e farinha de casca de maracujá (Passiflora edulis Sims) e como controle,
serragem pura.
Elaboração de “semente-inóculo”
Em uma primeira etapa, o micélio foi multiplicado em grãos de trigo. Para tanto, 250
g de grãos de trigo lavadas e imersos em água durante 24 horas foram colocados em
frascos de vidro de 500 ml e esterilizados em autoclave a 121°C por 1 hora, conforme
metodologia descrita por Stamets (1993). Dez discos miceliais (10 mm de diâmetro) de L.
strigosus foram transferidos para cada frasco contendo os grãos de trigo que foram
incubados a 35°C por 15 dias.
Em uma segunda etapa, as serragens das espécies florestais Simarouba amara,
Hymenolobium petraeum e Astronium lecointei onde se obtiveram os melhores resultados
de crescimento micelial foram utilizadas para elaboração de “semente-inóculo”. As
serragens suplementadas com 20% (w/w) de farelo de arroz foram colocadas em três tipos
de embalagens descritas na Tabela 2. Os substratos foram esterilizados duas vezes por 1
52
hora a 121°C, com intervalo de 24 horas. Para cada 100 g de substrato foram colocados 3,5
g de grãos de trigo colonizados. Estes foram incubados a 35°C durante 25 dias, na ausência
de luz. Após este período, os substratos colonizados foram retirados das embalagens e os
blocos foram cortados para observação da colonização do substrato.
Análise estatística
Os experimentos foram conduzidos com cinco replicatas por tratamento. Os dados
foram submetidos a ANOVA e as médias dos tratamentos comparadas pelo teste de Tukey
a 5% de significância.
Resultados e discussão
Crescimento micelial em serragens
Os substratos formulados com S. amara e B. quinata proporcionaram os melhores
IVCM (p<0,05) e a colônia atingiu a borda da placa de Petri em apenas cinco dias (Fig. 1 e
2), após a inoculação. Entretanto, pode-se considerar que todas as espécies de madeira
avaliadas permitiram o crescimento micelial apresentando potencial de uso para a
formulação da “semente-inóculo” de L. strigosus, uma vez que mesmo nas serragens de O.
cymbarum e H. crepitans com IVCM menores (p<0,05), a colônia atingiu a borda da placa de
Petri (90 mm de diâmetro) em dez dias, apresentando ótimo vigor. Ishikawa e Paccola-
Meirelles (1995) relatam o diâmetro da colônia de Lentinula edodes de 7±1 cm em nove dias
de incubação utilizando serragem de Eucalyptus sp., suplementada com 10% (w/w) de
farelo de arroz.
Este resultado indica que a amplitude de espécies florestais da Amazônia possíveis
de serem utilizados como substratos lignocelulósicos para o cultivo de L. strigosus é grande,
53
sendo mais um fator favorável ao estudo desta espécie para a fungicultura no Trópico
Úmido.
Diferentes suplementações no substrato à base de serragem de S. amara
Uma vez que serragem de S. amara foi uma das espécies que se destacou no
crescimento e também por ser encontrada com maior freqüência nas serrarias, esta foi
utilizada para a avaliação da influência da suplementação. A serragem desta espécie
suplementada com 20% (w/w) de farelo de arroz foi a melhor formulação de substrato para a
elaboração de “semente-inóculo” de L. strigosus. Entretanto, todas as espécies florestais
analisadas demonstraram potencial de uso para a fungicultura, assim como todas as
suplementações utilizadas podem ser consideradas para melhorar o vigor micelial e/ou
IVCM (Fig. 3 e 4) para a elaboração de “semente-inóculo”.
Na Fig. 3 é apresentada a diferença no aspecto de L. strigosus cultivado em
serragem pura de S. amara (Fig. 3A) em relação aos demais tratamentos suplementados
com diferentes fontes de nitrogênio. Indicando que, embora o IVCM não tenha apresentado
diferença significativa (p<0,05) (Fig. 4), as suplementações dos substratos melhoraram
consideravelmente o vigor da colônia.
Por outro lado, a suplementação com farinha de casca de maracujá apresentou
IVCM significativamente menor em relação aos demais tratamentos (Fig. 4). Entretanto, o
melhor vigor da colônia, em relação ao controle, indica que essa suplementação também foi
positiva.
Elaboração de “semente-inóculo”
No mercado existem diferentes embalagens que podem ser adaptadas para
produção de inóculos de cogumelos. Sacos de polipropileno e frascos autoclaváveis foram
54
testados para a produção de inóculo de L. strigosus utilizando serragens de S. amara, H.
petraeum e A. lecointei que apresentaram maiores IVCM e alta disponibilidade nas serrarias.
Aos 25 dias da inoculação constatou-se que os substratos estavam totalmente
colonizados por L. strigosus em todas as embalagens testadas (Fig. 5).
Deste modo devem ser considerados para a elaboração de “semente-inóculo”
aspectos como: custo das embalagens; tempo de colonização; viabilidade de transporte e
praticidade de inoculação do micélio no substrato.
A embalagem E1 proporcionou maior praticidade para inoculação e é de fácil
transporte, entretanto, apresentou maior custo (Tabela 2) e a opacidade da embalagem,
dificultou a visualização da colonização e a observação de contaminantes durante a
incubação. A embalagem E2 apresentou custo intermediário e boa visibilidade da
colonização, entretanto, a embalagem é frágil, necessitando a utilização de dois sacos,
assim como foi necessário a confecção de respirador com um anel de tubo de PVC e
algodão hidrofóbico. A embalagem E3 comportou maior quantidade de substrato, o que
resultou em menor custo. Por ser uma embalagem específica para a produção de “semente-
inóculo” de shiitake, contém filtro para troca gasosa, é resistente ao transporte e possibilita a
visualização da colonização. Por outro lado, a venda deste material é restrita.
Vale ressaltar que devido à rápida colonização de L. strigosus no substrato, na
temperatura ótima de 35°C, não foram observados problemas de contaminação.
Os resultados obtidos para elaboração de “semente-inóculo” serão utilizados como
base para futuros estudos de produção deste cogumelo.
55
Em experimento preliminar, obteve-se a formação do basidiocarpo de L. strigosus em
formulação de serragem de H. petraeum suplementado com 20% (w/w) de farelo de arroz,
após 150 dias incubados em condições naturais. Completando o ciclo de vida deste fungo.
No entanto mais estudos sobre as estratégias de indução da frutificação são necessárias.
Agradecimentos
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) pela bolsa de
estudo concedida a Ruby Vargas-Isla.
Referências*
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58
Legendas das tabelas
Tabela 1. Espécies florestais das serragens testadas para formulações de substratos de
"semente-inóculo" de Lentinus strigosus
Tabela 2. Características das embalagens utilizadas para a produção de "semente-inóculo"
de Lentinus strigosus
59
Legendas das figuras
Fig. 1. Colônia micelial de Lentinus strigosus no quinto dia de incubação em serragens de
espécies florestais: (A) Hymenolobium petraeum Ducke (angelim pedra), (B) Hura crepitans
L. (assacu), (C) Bertholletia excelsa H.B.K. (castanheira), (D) Cedrela odorata L. (cedro), (E)
Bombacopsis quinata (Jacq.) Dugand. (cedro doce), (F) Eucalyptus sp. (eucalipto), (G)
Hymenaea courbaril L. (jatobá), (H) Ocotea cymbarum Kunth (louro canela), (I) Simarouba
amara Aubl. (marupá), (J) Astronium lecointei Ducke (muiracatiara), (K) Aniba rosaeodora
Ducke (pau rosa), (L) Caryocar sp. (piquiarana), (M) Quercus acutissima Carr. (carvalho),
suplementadas com 20% (w/w) de farelo de arroz e ±60% de umidade, incubadas a 35°C.
Fig. 2. Índice de Velocidade de Crescimento Micelial (IVCM) de Lentinus strigosus em
serragens de 13 espécies florestais, suplementadas com 20% (w/w) de farelo de arroz
(Oryza sativa) e ±60% de umidade, incubadas a 35°C. Cálculo do IVCM= ∑ (D-Da)/N (onde
D = diâmetro atual da colônia; Da = diâmetro da colônia no dia anterior; N = número de dias
após a inoculação).
(a)
Colunas com letra(s) iguais não diferem significativamente (p<0,05)
pelo teste de Tukey. Média de cinco replicatas.
Fig. 3. Colônia micelial de Lentinus strigosus em substrato de (A) serragem de Simarouba
amara (marupá) pura (controle), e suplementação de 20% (w/w) de: (B) farelo de arroz, (C)
extrato de soja, (D) levedo de cerveja, (E) farinha de casca de maracujá, (F) fibra de soja,
(G) fibra de trigo, (H) gérmen de trigo. Colônia micelial no sexto dia de incubação a 35°C. A
umidade de todos os tratamentos foi de 60% (w/v).
60
Fig. 4. Índice de Velocidade de Crescimento Micelial (IVCM) de Lentinus strigosus em
substrato de serragem de Simarouba amara (marupá), suplementada com 20% (w/w) de
diferentes sublementações e serragem pura (controle), incubadas a 35°C. Cálculo do
IVCM=∑ (D-Da)/N (onde D = diâmetro atual da colônia; Da = diâmetro da colônia no dia
anterior; N = número de dias após a inoculação).
(a)
Colunas com letra(s) iguais não diferem
significativamente (p<0,05) pelo teste de Tukey. Média de cinco replicatas.
Fig. 5. “Semente-inóculo” de Lentinus strigosus elaborado em serragem de Simarouba
amara (marupá) suplementada com 20% (w/w) farelo de arroz em diferentes embalagens.
E1=frasco plástico, E2=sacos de polipropileno, E3=sacos de polipropileno com filtro. Abaixo,
corte transversal dos blocos colonizados no 25
o
dia de incubação a 35°C. Barras 2 cm.
61
Nome científico Nome comum
Hymenolobium petraeum Ducke
Angelim pedra
Hura crepitans L.
Assacu
Bertholletia excelsa H.B.K.
Castanheira
Cedrela odorata L.
Cedro
Bombacopsis quinata (Jacq.) Dugand.
Cedro doce
Eucalyptus sp.
Eucalipto
Hymenaea courbaril L.
Jatobá
Ocotea cymbarum Kunth
Louro canela
Simarouba amara Aubl.
Marupá
Astronium lecointei Ducke
Muiracatiara
Aniba rosaeodora Ducke
Pau rosa
Caryocar sp. Piquiarana
Quercus acutissima Carr.
Carvalho
Tabela 1. Espécies florestais das serragens testadas
para formulações de substratos de "semente-inóculo" de
Lentinus strigosus
Vargas-Isla et al.
62
E1
Frascos
polipropileno +
esparadrapo
15x9 cm 600 g R$ 1,60
E2
Sacos
polipropileno +
PVC + algodão
23x36 cm 800 g R$ 1,12
E3
Sacos
polipropileno +
clips
32x45 cm 1200 g R$ 0,62
Custo da
embalagem/1 kg de
"semente-inóculo "
Tabela 2. Caraterísticas das embalagens utilizadas para a produção de
"semente-inóculo" de Lentinus strigosus
Tratamento Forma/material
Tamanho/
volume
Quantidade de
substrato
Vargas-Isla et al.
63
Fig. 1
Vargas-Isla et al.
64
Fig. 2
de
b
Espécies florestais
Índice de Velocidade de Crescimento Micelial
Vargas-Isla et al.
65
Fig. 3
Vargas-Isla et al.
66
Fig. 4
a
b
a
a
a
a
a
a
Suplementos
Índice de Velocidade de Crescimento Micelial
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
Controle Farelo de
arroz
Extrato de
soja
Levedura de
cerveja
Farinha casca
maracujá
Fibra de
soja
Fibra de
trigo
Germen de
trigo
Vargas-Isla et al.
67
Fig. 5
Vargas-Isla et al.
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