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MINISTÉRIO DA SAÚDE
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Atividade de amidinas reversas contra
Trypanosoma cruzi in vitro
Cristiane França da Silva
Dissertação apresentada com vistas à obtenção do grau de Mestre em
Ciências,
na área de concentração em Biologia Parasitária
Orientação: Dra. Maria de Nazaré Correia Soeiro
Dra. Maria de Nazareth Meirelles
RIO DE JANEIRO
Janeiro 2007
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ii
MINISTÉRIO DA SAÚDE
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Curso de Pós-graduação em Biologia Parasitária
Esta dissertação intitulada:
Atividade de amidinas reversas contra
Trypanosoma cruzi in vitro
apresentada por:
Cristiane França da Silva
foi avaliada pela Banca Examinadora composta pelos seguintes membros:
Dra. Solange Lisboa de Castro (revisor) - IOC/FIOCRUZ
Dra. Leonor Leon - IOC/FIOCRUZ
Dr. Marcelo Einicker Lamas – Inst. Biofísica Carlos Chagas Filho/UFRJ
Dra. Elen Melo de Souza - IOC/FIOCRUZ
Dr. Marcelo da Silva Genestra - IOC/FIOCRUZ
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iii
FICHA CATALOGRÁFICA
S586 Silva, Cristiane França da
Atividades de amidinas reversas contra Trypanosoma
cruzi in vitro /
Cristiane França da Silva. – Rio de Janeiro, 2007.
xi, 123 f. ; 30 cm.
Dissertação (mestrado) – Instituto Oswaldo Cruz,
Biologia
Parasitária, 2006.
Bibliografia: f. 55-67.
1. Trypanosoma cruzi. 2. Amidinas. 3. Diamidinas. I.
Título.
CDD: 616.9363
iv
Este trabalho foi desenvolvido sob orientação das Dras. Maria de Nazaré
Correia Soeiro e Maria de Nazareth Meirelles no Laboratório de Biologia
Celular do Dept. de Ultra-estrutura e Biologia Celular do Instituto Oswaldo Cruz,
Fundação Oswaldo Cruz.
Data de ingresso no curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária: Março de
2005
Matrícula: 05.03.37.005
v
Á minha mãe
Geralda e ao meu
pai, Joaquim,
pelo amor,
companheirismo e
apoio total.
vi
“Só aquele que têm paciência
para fazer coisas simples com perfeição
é que irão adquirir habilidade
para fazer coisas difíceis com facilidade.”
Johann Christoph Von Schiller
“Jamais desista de seus sonhos,
por mais que pareçam difíceis de consegui-los.
Se tiveres coragem,
conseguirás forças para alcançá-los.”
Autor desconhecido
vii
Agradecimentos
A Deus e a Nossa Senhora Aparecida, por iluminar a minha vida e por me dar
forças para continuar sempre em frente.
Aos meus pais, Geralda e Joaquim, pelas palavras de incentivo, pelo amor
dedicado, pelo carinho e paciência. As palavras nunca serão suficientes para
expressar a gratidão e o respeito. Foi por vocês que cheguei até aqui. E, é por
vocês que seguirei em frente.
Ao Renato, Letícia e Miguel, pela força e atenção em todos os momentos. E
também, pelo incontestável companheirismo e apoio.
A Kika, minha eterna companheira. Obrigada por ficar sempre ao meu lado em
todos os momentos.
A Dra. Maria de Nazaré Soeiro, pela excelente orientação e pelo ótimo
exemplo profissional. Obrigada, pela eterna paciência, pelo constante incentivo
e por confiar em mim. Sou eternamente grata!
A Dra. Maria de Nazareth Meirelles, pelo seu profissionalismo e constante
incentivo.
A Dra. Solange Lisboa De Castro, pela revisão da dissertação e pelas
excelentes sugestões.
A Dra. Miriam Pereira, Dra. Suzana Côrte Real, Dra. Andréa Henriques e
Dra. Helene Barbosa, pelo intenso apoio e incentivo durante o processo
seletivo e durante toda esta dissertação.
A Dra. Valeria Nacife, pelo apoio e por trazer-me para este departamento.
A Dra. Elen Mello, pelo apoio nas horas de mudanças radicais, nos
ensinamentos técnicos práticos e teóricos. Pela sua amizade, á cima de tudo.
Ao Marcos Meuser, pelo apoio técnico, pelos inúmeros momentos de conforto,
apoio e estímulo. Obrigado, por tudo! Você é maravilhoso!
A Denise, pelo apoio técnico e sentimental. Obrigada por sua amizade,
companheirismo e paciência em todos os momentos que passamos juntas e
que vamos passar. Você é uma ótima companheira de trabalho, e uma grande
amiga!
As minhas amigas Michele Longo e Ilana Salorenzo, por serem as melhores
amigas para todos os momentos e por sempre me apoiarem em todas as
minhas fases.
viii
As minhas amigas Ana Maria e Camila Coronel, pelo eterno apoio e amizade
desde jardim de infância.
A Renata Mota, pela participação no inicio deste trabalho, pela amizade e
apoio sempre quando necessários.
A Gladys, Mariana Ramos, Ingrid, Julia, Adriana, pela força e incentivo e
estarem sempre dispostas a ajudar.
Ao grupo de trabalho da Dra. Nazaré Soeiro, pelo apoio a esta dissertação. E
principalmente, a Patrícia Bernadino, por ser uma ótima companheira de
trabalho e muito competente.
A minha turma de mestrado da Biologia Parasitária de 2005, pelo eterno
apoio e companheirismo durante todo mestrado. Aos “Margalefs” (Marcelo
Meuser, Flávio Paixão, Jaline Coutinho e Thiago Belinato), sem vocês eu
não teria conseguido, vocês são ótimos!
Ao Bruno Ávila, por todo o capricho e apoio nos detalhes finais da dissertação.
A Cida e Sonia Farias, por toda a simpatia e ajuda para resolver as
burocracias da secretaria. E por serem, ótimas companhias e amigas durante
e após o expediente, juntamente com Lucia Ballester e Giani França. Adoro
vocês!
A Claudia Calvet e Daniel Adesse, pelo apoio e amizade quando precisei.
Nunca vou esquecer.
Aos meus amigos da experimentação animal, Gabriel e Wanderson, pelas
conversas e risadas do dia-a-dia.
Aos meus amigos do departamento, Sandra, Francisco Odencio, Kelly
Juliana Dias, Tatiana, Alanderson, Ângela, Danielle Vicente, Dayse,
Azzam, Renata Bambino, Erick, Renata Hespanhol, Vanessa, Wagner,
Cyntia, Cristiane Bani, Francisco Lopes, Mauricio Paiva, Mariana
Waghabi, José Côrrea, Carolina Spiegel; e aos que não foram citados aqui,
agradeço de coração.
Ao corpo técnico do departamento, Levi, Luciano e José; e ao grupo da
esterilização, André, Sonia Regina e Jose Amaro; pelo pedido nunca negado
e pelo apoio durante a dissertação.
A todos que fizeram parte da minha vida de alguma forma, a minha eterna
gratidão!
ix
Os dados referentes a presente dissertação geraram dois artigos
científicos que se encontram submetidos:
(i) C.F. Silva, M.B. Meuser, E.M. De Souza, M.N.L. Meirelles
, C.E. Stephens,
P.
Som,
D.W. Boykin, and M.N.C. Soeiro. Ultrastructural and flow cytometry findings of
Trypanosoma cruzi treated with reversed amidinas. Submetido a publicação,
Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
(ii) Cristiane França da Silva; Marcos Meuser Batista; Renata Alves Mota, Elen Mello
de Souza, Chad E. Stephens, Phanneth Som, David Wilson Boykin and Maria de
Nazaré C. Soeiro. Activity of “reversed” diamidines against Trypanosoma cruzi
"in vitro". Submetido a publicação, Biochemical Pharmacology.
ÍNDICE
RESUMO..........................................................................................................
x
ABSTRACT......................................................................................................
xi
INTRODUÇÃO................................................................................................. 01
1. Doença de Chagas.......................................................................................
01
1.1. Estado da Arte........................................................................................
01
1.2. O parasita...............................................................................................
03
1.3. A Doença e suas fases..........................................................................
05
1.4. Quimioterapia.........................................................................................
07
1.4.1. Nifurtimox...........................................................................................
08
1.4.2. Benznidazol.......................................................................................
08
1.4.3. Mecanismos de Ação de Nifurtimox e Benznidazol...........................
08
1.4.4. Potenciais Alvos do Parasita.............................................................
11
1.5 DNA como alvo de drogas......................................................................
12
1.5.1 Diamidinas aromáticas e análogos.....................................................
14
OBJETIVOS.....................................................................................................
19
MATERIAIS E MÉTODOS...............................................................................
20
3.1. Drogas....................................................................................................
20
3.2. Culturas de células de mamíferos..........................................................
21
3.2.1. Linhagens VERO...............................................................................
21
3.2.2. Culturas primárias de macrófagos peritoneais..................................
21
3.3. Parasitas................................................................................................
21
3.3.1. Formas tripomastigotas sangüíneas..................................................
22
3.3.2. Formas tripomastigotas de cultura (clone Dm28c e cepa Y).............
22
3.4. Efeito anti-parasítico...............................................................................
22
3.4.1. Efeito sobre tripomastigotas sangüíneos .........................................
22
3.4.2. Efeito sobre amastigotas intracelulares.............................................
23
3.5. Toxicidade..............................................................................................
23
3.6. Processamento de rotina para microscopia óptica................................
24
3.7. Análise ultra-estrutural......... 24
3.7.1. Formas tripomastigotas.....................................................................
24
3.7.2. Formas amastigotas intracelulares....................................................
25
3.8. Processamento para MET....................................................................
25
3.9. Processamento para análise por citometria de fluxo.............................
25
RESULTADOS.................................................................................................
27
DISCUSSÃO....................................................................................................
44
CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÕES...............................................
53
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................
56
ANEXO 1
ANEXO 2
x
RESUMO
A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é uma
parasitose relevante e negligenciada afetando 16-18 milhões de indivíduos em áreas
endêmicas da América Latina. A quimioterapia corrente, baseada em dois
nitroderivados (nifurtimox e benznidazol), é insatisfatória principalmente pela baixa
atividade na fase crônica, alta toxicidade e devido ao aumento de isolados
resistentes. Diamidinas aromáticas apresentam importante atividade anti-tumoral e
antiparasitária, e vêem sendo utilizadas no tratamento de doenças parasitárias
humanas e animais. Porém, devido à baixa biodisponibilidade oral e alta toxicidade,
estudos têm sido desenvolvidos de modo a sintetizar e avaliar a ação de novos
análogos dicatiônicos. Assim, a presente dissertação teve por objetivo caracterizar a
atividade de amidinas reversas (ARs) contra Trypanosoma cruzi in vitro,
comparando-a com a ação da diguanidina DB711. Nossos dados revelaram que ARs
exibem importante efeito antiparasitário sobre amastigotas e tripomastigotas de T.
cruzi em doses micro e nanomolares que não afetam a viabilidade de células de
mamíferos. As amidinas DB889 e DB702 apresentaram superior atividade na maioria
dos sistemas avaliados (diferentes formas evolutivas, diferentes condições de
temperatura, e adição de sangue) em relação às duas outras ARs testadas, DB786 e
DB811, sugerindo que pequenas variações na estrutura química resultam em
diferenças na potência antiparasitária. A análise das ARs sobre amastigotas não
revelou diferenças no perfil de susceptibilidade entre os dois estoques de T. cruzi
testados, cepa Y e clone DM28c. Observamos superior atividade das ARs sobre
tripomastigotas durante incubação a 37°C, e que a adição de sangue reduziu a
atividade tripanocida da maioria dos compostos testados à 4°C, possivelmente
devido à sua associação a componentes plasmáticos, como já relatado em outros
estudos. Ensaios de citotoxicidade in vitro revelaram perda viabilidade celular
somente frente à incubação com altas doses das drogas (>32 µM) havendo,
contudo, diferenças relacionadas ao perfil de susceptibilidade dependendo da fonte
de células de mamíferos, sendo células de cultivo primário muito mais susceptíveis
que linhagens, demonstrando a importância de se avaliar a toxicidade no primeiro
tipo celular. A análise por microscopia eletrônica de transmissão (MET) revelou
importantes alterações ultra-estruturais, principalmente no núcleo e mitocôndria dos
parasitas tratados com as ARs, corroborando dados anteriores referentes à ação de
diamidinas sobre tripanosomas. A análise do potencial de membrana mitocondrial
por citometria de fluxo confirmou o efeito das ARs sobre as mitocôndrias dos
parasitas. MET revelou que DB889 induziu um intenso “shedding” vesicular na
região da bolsa flagelar de amastigotas, sugerindo um incremento na atividade
exocítica destes parasitas. Esta amidina também gerou alterações na organização
de microtúbulos do T. cruzi, com perda parcial de microtúbulos subpeliculares em
amastigotas e aparecimento de múltiplos perfis de axonemas em tripomastigotas.
Todas as amidinas testadas revelaram-se mais efetivas quando comparadas à
diguanidina DB711, confirmando dados anteriores que revelaram a promissora ação
de amidinas reversas sobre tripanosomatídeos. O efeito de ARs contra o T. cruzi
reforça o rastreamento por novos análogos que possam ser usados sozinhos ou em
combinações com outras drogas para o tratamento da doença de Chagas, e a alta
atividade da DB889 associada à baixa toxicidade estimula estudos in vivo, que
serão em breve conduzidos.
xi
ABSTRACT
Chagas’ disease caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is an important
neglected disease affecting 16-18 million individuals in endemic areas of Latin
America. The current chemotherapy, mainly based on two nitroheterocyclic
compounds (nifurtimox and benznidazole) is mainly unsatisfactory mostly due to their
low activity upon the phase chronic, their high toxicity and the increased number of
drug-resistant parasite populations. Aromatic diamidines present important anti-
tumoral and anti-parasitic activities, and have being used in the therapy of human
and animal parasitic diseases. However, due to its low oral bioavailability and high
toxicity, studies have been developed in order to synthesize and evaluate the action
of new dicationic analogs. In this respect, the present dissertation aimed to
characterize the activity of reversed amidines (RAs) against Trypanosoma cruzi in
vitro, comparing them to the effect of one diguanidine DB711. Our data revealed that
RAs exhibit an important anti-parasitic in vitro effect upon both amastigotes and
trypomastigotes of T. cruzi in doses micro and nanomolar that don't affect the viability
of mammalian cells. The diamidines DB889 and DB702 presented superior activity in
most of the assayed systems (different evolutionary forms, different temperature
conditions, and blood addition) as compared to others RAs, DB786 and DB811,
suggesting that small variations in the chemical structure of the amidines may result
in differences in their anti-parasitic efficacies. The analysis of the effect of the RAs on
amastigotes didn't reveal differences in the susceptibility profile among the two
stocks of T. cruzi evaluated, the Y strain and the DM28c clone. In addition, we
noticed a superior activity of the RAs on trypomastigotes during its incubation at
37ºC, and that the addition of blood reduced the trypanocidal activity of the majority
of the compounds tested at 4ºC, possibly due to their binding to plasma component
as already reported by others studies. Cytotoxicity assays in vitro revealed loss of
cellular viability only when the incubation was performed with high doses of the drugs
(> 32µM), however, important differences were noticed according the mammalian cell
source, being primary cultures much more susceptible than lineages, demonstrating
the importance of evaluating in vitro cytoxicity employing the former cellular type. The
analysis by transmission electron microscopy (TEM) revealed important
ultrastructural alterations mostly in nucleus and in mitochondria of the ARs-treated
parasites, confirming previous data related to the effect of diamidines upon
trypanosomatids. The analysis of the mitochondrial membrane potential by flow
cytometry confirmed and reinforced the effect of the RAs upon the mitochondria of
the parasites. TEM revealed that DB889 induced an intense vesicular shedding at
the flagellar pocket of amastigotes, suggesting an increment of their exocytic activity.
This amidine also caused partial loss of sub-pellicular microtubules in amastigotes
besides inducing multiple axonems profiles in trypomastigotes. Our data also showed
that all assayed amidines were more effective as compared to diguanidine DB711,
corroborating previous data showing the promissory action of RA upon
trypanosomatids. The effect of RA against the T. cruzi stimulates the screening of
new dicationic analogs that can be used alone or in combinations with other drugs for
the treatment of Chagas’ disease, and the high activity of DB889 associated with its
low toxicity encouraged in vivo studies that will be soon conducted.
Introdução
1
INTRODUÇÃO
1. Doença de Chagas
1.1. Estado da arte
Em 1909, Dr. Carlos Chagas descreveu o parasita, o vetor, os reservatórios
naturais e o quadro clínico da doença de Chagas, uma relevante e negligenciada
parasitose causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi. Esta
doença tropical ocupa importante lugar entre as endemias rurais, inutilizando muitas
vidas em plena idade produtiva. Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS)
revelam que 16 a 18 milhões de indivíduos estão infectados por este parasita, com
50.000 mortes por ano e cerca de 100 milhões de pessoas expostas ao risco de
contrair a infecção em 21 países endêmicos da América Latina, o que corresponde a
25% de sua população (WHO 2002; Urbina & Do Campo, 2003; Faundez e cols.,
2005; Stewart e cols., 2005; Steverding & Tyler, 2005; Remme e cols., 2006).
A principal via de transmissão da doença é a vetorial (80-90% casos) na qual
ocorre a inoculação, em mucosas ou na pele não íntegra, de formas tripomastigotas
metacíclicas presentes nas fezes e urina excretadas pelo vetor durante o repasto
sangüíneo. No entanto, a infecção pode também ser adquirida por transfusão de
sangue, transmissão congênita, transplante de órgão, infecção acidental em
laboratório e ainda pela ingestão de comida ou bebida contaminada (Miles e cols.,
2003; Remme e cols., 2006). Na região da Amazônia e no estado do Pará foram
relatados casos de infecção através da contaminação de suco de frutas e cana de
açúcar (Valente e cols.,1999; Remme e cols., 2006).
Entre todas as doenças, as infecciosas e parasíticas (como a doença de Chagas)
representam as principais causas de mortalidade no mundo, correspondendo á
cerca de 25% do total global. Segundo definição em Hotez e colaboradores (2004),
compreende-se como: (i) controle: a redução de incidência, prevalência, morbidade
e mortalidade da doença em níveis aceitáveis determinados pelo país ou área em
questão; (ii) eliminação: a redução a zero da incidência da doença em uma
determinada área geográfica, requerendo ainda contínuas ações e políticas de
saúde pública de modo a prevenir sua re-emergência; (iii) erradicação: a redução da
incidência da doença a zero não havendo mais necessidade de intervenções e, (iv)
extinção: a erradicação do patógeno e destruição de todas amostras laboratoriais.
Concomitantemente ao controle da doença, a eliminação e erradicação dependem
da biologia do parasita e requerem uma determinação política e a garantia de
Introdução
2
recursos para implementação destas ações.
Com relação à doença de Chagas, sua transmissão foi significantemente
controlada em vários países do cone Sul através do controle da transmissão vetorial
e transfusional, tendo sido classificada como potencial candidata à eliminação e/ou
erradicação, segundo um workshop realizado na FIOCRUZ em 2003 sobre doenças
tropicais infecciosas (Hotez e cols., 2004). No Brasil, o programa de controle da
doença (1975-1995) custou 516 milhões de dólares, dos quais 78% foram gastos
com controle vetorial e 4% com a melhoria das habitações (Hotez e cols., 2004).
Este programa resultou na prevenção de 277.000 infecções e 85.000 mortes e, a
análise da relação custo-benefício mostrou que para cada dólar gasto no programa
de controle houve uma economia, no caso do controle vetorial de U$ 2,00 e, para o
transfusional de U$ 0,19 (Hotez e cols., 2004).
No entanto, a doença de Chagas bem como outras doenças parasíticas ainda não
poderão ser prontamente eliminadas com as ferramentas de controle atualmente
disponíveis, havendo necessidade de expandir e sustentar os esforços de controle e
desenvolver soluções mais definitivas, incluindo aquelas relacionadas à
quimioterapia. Adicionalmente, mesmo que a doença fosse hoje erradicada, ainda
haveria milhões de pessoas infectadas que dependeriam de cuidados médicos, no
mínimo, pelos próximos 30 anos (Araújo e cols., 2000). Outro ponto que tem levado
a uma intensa discussão sobre a necessidade de adoção e manutenção de medidas
de controle da doença. em especial através da transfusão de sangue, é a presença
de imigrantes infectados com o T. cruzi em países não considerados endêmicos,
como os Estados Unidos da América (Urbina, 2002). É também importante ressaltar
que embora a transmissão pelo Triatoma infestans, principal vetor desta doença
encontrado principalmente em casas e em áreas peridomiciliares, esteja controlada
no Uruguai, Chile, Brasil e em muitas regiões endêmicas na Argentina, varias outras
espécies da subfamília Triatominae, tais como Rhodnius prolixus, Triatoma
dimidiata, Triatoma pseudomaculata, Pastrongylus megistus, entre outras, são
também potenciais vetores da doença na América Latina (Urbina & Do Campo,
2003). Assim, apesar dos avanços alcançados nas últimas décadas através dos
controles vetorial e transfusional adotados pelo Brasil e por outros países do Cone
Sul (Moncayo, 2003), a doença de Chagas continua sendo considerada um sério
problema de saúde pública, principalmente em áreas endêmicas das Américas
Central e do Sul, justificando a busca por uma terapia mais efetiva e de menor
toxicidade.
Introdução
3
1.2. O parasita
A transmissão vetorial do T. cruzi envolve três ciclos: (i) o ciclo doméstico que é
responsável pela manutenção da doença em humanos, ocorrendo principalmente
áreas urbanas e peri-urbanas, sendo humanos, cães e gatos os principais
reservatórios do parasita; (ii) o ciclo silvestre, no qual triatomíneos silvestres
infectam roedores, marsupiais e outros mamíferos e, (iii), o ciclo peridomiciliar, que
representa um elo entre o ciclo doméstico e o silvestre, no qual se observa o fluxo de
mamíferos (roedores domésticos, marsupiais, gatos, cachorros, entre outros) entre
casas e áreas silvestres bem como a ocorrência de espécies de triatomíneos
silvestres infectados que acessam ás casas infectando diretamente pessoas,
animais e mesmo alimentos (Remme e cols., 2006).
Além dos diversos hospedeiros, o ciclo de vida do T. cruzi (Figura 1.1) inclui
também diferentes formas evolutivas: duas multiplicativas (amastigotas no
hospedeiro vertebrado e epimastigotas no hospedeiro invertebrado) e uma terceira,
não multiplicativa, mas altamente infectiva, que é a tripomastigota (Tyler & Engman,
2001). O hospedeiro invertebrado (ordem Hemíptera, família Reduviidae, subfamília
Triatominae), vetor do parasita, infecta-se a partir do repasto de sangue do
hospedeiro vertebrado infectado, ingerindo formas tripomastigotas sangüíneas. No
vetor, o parasita se desenvolve na luz do intestino, no qual ocorre a diferenciação de
tripomastigotas para epimastigotas, e sua multiplicação por divisão binária. Na
porção posterior do intestino ocorre a conversão para tripomastigotas metacíclicos,
que são as formas infectivas transmitidas através das fezes e/ou urina do inseto no
momento da picada. Estas formas invadem células do sistema fagocítico
mononuclear e células residentes no local de inoculação, e após a ruptura do
vacúolo parasitóforo (que abriga temporariamente o parasita), diferenciam-se em
amastigotas, multiplicando-se por divisão binária no citoplasma da célula hospedeira.
Após 2 a 9 ciclos de multiplicações, as formas amastigotas convertem-se para
tripomastigotas, que são as principais formas evolutivas liberadas com a ruptura da
célula no espaço intercelular, sendo capazes de invadir outras células vizinhas,
difundir-se pelos tecidos através das correntes sangüínea e linfática e/ou serem
ingeridos pelo inseto vetor, completando seu ciclo de vida (Brener, 1973; De Souza,
1984). Um ciclo alternativo pode ocorrer no hospedeiro vertebrado com a ruptura de
células hospedeiras e liberação de formas amastigotas, que podem invadir novas
células e manter o ciclo de vida do parasita (Ley e cols., 1988; Mortara, 1991; Tyler
Introdução
4
& Engman, 2001). No entanto, há evidências de que a interação de amastigotas com
as células hospedeiras envolva mecanismos e receptores diferentes daqueles
utilizados pelas formas tripomastigota (Mortara, 1991; Procópio e cols. 1998; Mortara
e cols., 2005).
Figura 1.1: O ciclo de vida do T. cruzi. Adaptado a partir de Urbina, 2002.
Hospedeiro invertebrado
Hospedeiro vertebrado
Epimastigotas
(multiplicativo, não infectivo)
Tripomastigotas
metacíclicos
(infectivo, não
multiplicativo)
Amastigota
s (multiplicativa)
Tripomastigotas
sanguíneos
(não multiplicativo)
Introdução
5
1.3. A doença e suas fases
A doença de Chagas apresenta uma fase aguda e uma crônica, sendo o coração
alvo de infecção e inflamação em ambas as fases (Rossi & Bestetti, 1995). A maioria
dos pacientes se infecta na infância (Punukollu e cols., 2006). Cerca de 7 a 15 dias
após a infecção, inicia-se a fase aguda da doença humana, caracterizada por
parasitemia patente. Esta fase apresenta baixa mortalidade (<10%), sendo mais
observada em crianças, é freqüentemente assintomática/oligosintomática (Urbina &
Do Campo, 2003; Remme e cols., 2006) e representa o início da resposta
inflamatória aguda, com ativação do sistema fagocítico mononuclear e produção de
citocinas inflamatórias (Silva e cols., 1995; Aliberti e cols., 1996; Revelli e cols.,
1998). Em conseqüência da resposta imune do hospedeiro observa-se a redução do
parasitismo circulante e tissular, característica do término da fase aguda. Logo,
controladas a inflamação e a carga parasitária aguda (em média de 2 a 5 meses
após infecção), o indivíduo infectado ingressa no período indeterminado da fase
crônica, onde não há evidências clínico-patológicas, ou seja, sem parasitemia
patente e sem sintomatologia evidente (ex. sem alterações eletrocardiográficas,
físicas, raios-X, etc), havendo apenas sorologia positiva (Rossi & Bestetti, 1995;
Dutra e cols., 2005). Caso o indivíduo não seja tratado, ele permanecerá infectado
de modo silencioso por toda vida, no entanto, após anos ou décadas, cerca de 20-
30% destes passam a apresentar sintomatologias crônicas importantes,
freqüentemente associadas a alterações cardíacas (principal manifestação) e/ou
digestivas, estas últimas denominadas de megasíndromes (Rossi & Bestetti, 1995;
Brener & Gazzinelli, 1997; Elizari, 1999).
Calcula-se que os pacientes que desenvolvem a sintomatologia crônica
apresentam redução de cerca de 9 anos na expectativa de vida (Punukollu e cols.,
2006). A primeira pessoa infectada foi identificada por Chagas, quando tinha nove
meses de idade, sendo que morreu já adulta e aparentemente de modo não
relacionado a esta doença. Ela não apresentava alterações cardíacas e/ou
digestivas, representando um típico caso de forma indeterminada (Bustamante e
cols., 2003).
Alguns fatores têm sido relacionados à evolução da fase crônica assintomática
para a forma sintomática incluindo (i) a genética do hospedeiro vertebrado e (ii) o
estoque do parasita, haja vista que diferentes isolados do T. cruzi possuem
diferentes perfis morfológicos, biológicos, patológicos (virulência, mortalidade,
tropismo celular, lesões teciduais etc), clínicos (formas indeterminadas a mega-
Introdução
6
síndromes), imunológicos, bioquímicos, moleculares e de resistência a drogas
(Martinez-Diaz e cols., 2001; Devera e cols., 2003), além da (iii) exposição do
hospedeiro vertebrado a re-infecções que vêm sendo avaliadas em diferentes
modelos experimentais (Bustamante e cols., 2003).
Na fase aguda, as lesões observadas estão diretamente relacionadas à ruptura
das células hospedeiras pelo parasita e/ou à ação de moléculas e células
citotóxicas. Já as lesões observadas no coração durante a fase crônica, bem como a
inflamação progressiva e multi-focal, podem ser fruto de: (i) contínuas invasões das
células cardíacas pelo parasita, (ii) liberação local de moléculas citotóxicas, (iii) ação
local de células citotóxicas, ou por uma concomitância destes mecanismos (Abel e
cols, 1997). De fato análises mais detalhadas demonstraram a presença do parasita
e de seus antígenos e DNA em infiltrados inflamatórios cardíacos durante a fase
crônica (Ben Younés-Chennoufi e cols., 1988; Higuchi e cols., 1993, 1997) sugerindo
uma estimulação antigênica persistente por toda esta fase. Por outro lado, a
discrepância entre a severidade das lesões e a baixa carga parasitária observada na
fase crônica sugere que outros fatores além do parasita possam estar relacionados
ao desenvolvimento da patologia chagásica (Dos Santos e cols., 2001; Higuchi e
cols., 2003). Neste sentido, vários estudos têm implicado o fenômeno da auto-
imunidade como fator desencadeador da patologia da doença de Chagas. Deste
modo, as seguintes hipóteses poderiam ser formuladas para justificar a patogênese
da cardiopatia chagásica crônica (CCC): (i) a persistência do parasita induzindo e
mantendo as reatividades inflamatórias crônicas, (ii) a infecção induzindo uma
resposta imune inicialmente direcionada somente contra o parasita, mas cuja
desregulação torna o próprio tecido do indivíduo alvo de citotoxicidade, levando
então ao dano tissular, independente da carga parasitária e/ou (iii) as duas
alternativas agindo em paralelo (Urbina, 2001; Urbina & Do Campo, 2003; Croft e
cols., 2005). Em todas as hipóteses, a resposta imune contribui fortemente para as
lesões dos tecidos (Zhang & Tarleton, 1999; Tarleton, 2001; Croft e cols., 2005; Dos
Reis e cols., 2005), mas o parasita é o principal fator desencadeador da doença.
Assim, a persistência do parasita (variável a depender de suas características
genéticas, incluindo sua virulência) associada a uma resposta imune desbalanceada
(dependente das características imunogenéticas do hospedeiro) e a cardiotoxicidade
como fatores críticos que determinarão a evolução da patologia chagásica crônica
(Gomes e cols., 2003, 2005; Higuchi e cols. 2003; Perez-Fuentes e cols., 2003; dos
Reis e cols., 2005; Marino e cols., 2005; Davila-Spinetti e cols., 2005; Hyland &
Introdução
7
Engman, 2006). Estes dados reforçam a necessidade do desenvolvimento de novas
estratégias profiláticas e terapêuticas, incluindo a identificação de novas drogas
tripanocidas e imunomoduladoras que proporcionem o controle do parasitismo e
contribuam para a modulação da inflamação crônica não benéfica. Vale ressaltar
que os pacientes se beneficiam com a redução da carga parasitária sendo que, a
maioria dos indivíduos infectados que apresenta uma resposta imune apropriada é
capaz de controlar a proliferação do parasita e conseqüentemente a evolução da
doença (Engman & Leon, 2002; Tarleton, 2003; Urbina & Do Campo, 2003).
1.4. Quimioterapia
Pelas razões acima discutidas, a doença de Chagas é ainda considerada uma
doença fatal e incurável por dispor de uma quimioterapia insatisfatória baseada
principalmente em compostos nitrofurânicos (nifurtimox, Lampit, Bayer 2502) e
nitroimidazólicos (benznidazol, Rochagan, Roche) (Amato Neto, 1999; Urbina & Do
Campo, 2003; Croft e cols., 2005). Além destes fármacos, outros compostos também
têm sido usados, de modo restrito, na clínica da doença de Chagas incluindo
derivados azólicos como o cetoconazol, e o alopurinol, sendo este último utilizado
para redução da reativação da parasitemia em pacientes iminossuprimidos, embora
haja ainda controvérsias quanto a sua aplicação por apresentar apenas efeito
tripanostático transitório (Stoppani, 1999).
Nifurtimox e benznidazol foram introduzidos na clínica nas décadas de 60-70,
sendo que o primeiro teve sua produção descontinuada na década de 80, tendo sido
recentemente re-introduzido na clínica (Urbina & DoCampo, 2003; Barret e cols.,
2003; Steverding & Tyler, 2005), mas atualmente indisponível comercialmente no
Brasil. Nenhum destes compostos é ideal porque (i) não são ativos durante a fase
crônica da doença e apresentam sérios efeitos colaterais, (ii) requerem
administração por longos períodos de tempo (30-60 dias) sob supervisão médica
especializada, (iii) diferentes isolados do parasita apresentam grande variação na
eficácia , (iv) populações de parasitas resistentes a ambos compostos têm sido
relatadas, (v) não há formulações pediátricas, apesar do fato de que crianças até 12
anos possuírem maiores chances de se beneficiarem com o tratamento por não
apresentarem ainda a sintomatologia crônica da doença, e (vi) por apresentarem alto
custo: o tratamento com nifurtimox custa cerca de 48 dólares, o equivalente ao
salário mensal de um mineiro boliviano (Neal & van Bueren, 1988; Coura & de
Castro, 2002; Stewart e cols., 2005). Violeta de genciana tem sido usada em bancos
Introdução
8
de sangue, mas sua principal desvantagem é a coloração azulada que confere ao
sangue tratado e conseqüentemente, aos tecidos dos pacientes transfundidos (Maya
e cols., 2006).
1.4.1. Nifurtimox
Os primeiros ensaios clínicos com nifurtimox foram realizados em 1965 em
pacientes chagásicos agudos oriundos de países endêmicos da América do Sul
(Argentina com 657 pacientes, Brasil com 14 pacientes e El Salvador, com 16
pacientes). O tratamento resultou no desaparecimento dos sintomas mais
rapidamente em relação ao grupo que recebeu placebo (Wegner & Rohwedder,
1972). Os efeitos colaterais mais freqüentes relatados neste estudo em outros
ensaios clínicos incluem anorexia, dor de cabeça, vômitos, perda de peso, insônia,
mialgia, manifestações cutâneas, cólicas intestinais, diarréia, entre outros (Castro e
cols., 2006).
Em geral, a administração da droga (oralmente, três vezes ao dia) segue os
seguintes esquemas terapêuticos: (a) crianças de 0-10 anos: 15-20 mg/kg/dia por
60-90 dias; (b) jovens de 11-16 anos: 12,5-15 mg/kg/dia, por 90 dias; e (c) adultos:
8-10 mg/kg/dia, por 60-90 dias (Amato Neto, 1999; Wegner & Rohwedder, 1972).
1.4.2. Benznidazol
Beznidazol é administrado por 60 dias na dose de 5-10 mg/kg/dia podendo ser
estendido por até cinco meses no caso de tratamento de pacientes
imunocomprometidos e abreviado, como ocorre frente ao tratamento de infecção
acidental em laboratório, com esquema profilático restrito á 10-15 dias (Amato Neto,
1999; Maya e cols., 2006). Os efeitos colaterais são semelhantes aos observados na
administração de nifurtimox, incluindo anorexia, dor de cabeça, vômitos, insônia,
mialgia, manifestações cutâneas (dermatites, edemas generalizados, febre,
depressão da medula óssea, trombocitopenia, e polineuropatias periféricas) (Castro
e cols., 2006; Maya e cols., 2006).
1.4.3. Mecanismo de ação de nifurtimox e benznidazol
Os mecanismos de ação destes compostos estão relacionados à geração de
radicais livres e/ou metabólicos eletrofílicos: sabe-se que o grupo nitro de ambos
compostos é reduzido a um grupo amino através da ação de nitroredutases do T.
cruzi, levando à formação de vários radicais e de metabólitos eletrofílicos que se
Introdução
9
ligam a lipídeos, proteínas e DNA do parasita (Stoppani, 1999; Maya e cols., 2006).
Dados in vitro sugerem que o principal mecanismo de ação do nifurtimox seja
através de sua nitroredução, com geração de radical nitroaniônico que em presença
de oxigênio leva a produção de íon superóxido (O
2
-.
) e peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
que são lesivos para o T. cruzi (Maya e cols., 2006). O parasita, diferentemente das
células de mamíferos, é deficiente em mecanismos de defesa contra o estresse
oxidativo, não possuindo, por exemplo, catalase e glutationa peroxidase, e
apresentando baixos níveis da enzima superóxido dismutase (Maya e cols., 2006).
Assim, sendo o parasita parcialmente deficiente nos mecanismos de detoxificação,
ele se torna mais susceptível que células de mamíferos aos produtos de redução do
oxigênio gerados pelo nifurtimox, particularmente o peróxido de hidrogênio e o
radical hidroxila.
Já o efeito tripanocida do benznidazol não parece estar relacionado à geração de
radicais livres, sendo mais provável que os metabólitos eletrofílicos gerados a partir
deste composto, como ocorre no caso de nifurtimox, estejam envolvidos na morte do
T. cruzi através de sua ligação covalente a macromoléculas dos parasitas e/ou
associação ao DNA, lipídeos e proteínas (Stoppani, 1999; Maya e cols., 2003, 2006;
Croft e cols, 2005; Murta e cols., 2006). Alternativamente, foi também descrita uma
ação inibitória direta do benznidazol sobre a atividade de topoisomerases do T. cruzi
(Maya e cols., 2003; Croft e cols, 2005; Murta e cols., 2006).
Nifurtmox e benznidazol têm sido principalmente utilizados no tratamento de
pacientes chagásicos agudos e crônicos recentes, nos quais se observam resultados
positivos, principalmente em crianças (≤ 15 anos), calculando-se um percentual
médio de cura em torno de 80% (Coura & De Castro, 2002; Pinto Dias, 2006).
Dados revistos por Amato Neto (1999) revelam, com base na sorologia (ensaios
de Elisa, fixação de complemento e imunofluorescência, etc) e no xenodiagnóstico,
percentuais de cura de 70, 60 e 20% para, respectivamente, o tratamento de casos
agudos, crônicos recentes e crônicos tardios.
Além de serem recomendados para quimioterapia dos casos agudos e de
crônicos recentes, benznidazol e nifurtimox têm sido também fortemente sugeridos
para tratamento de infecções congênitas, transplantes de órgãos de doadores
infectados, quadros de re-agudizacão de paciente iminossuprimidos, e como medida
de prevenção frente a acidentes de laboratório (Amato-Neto, 1999; Urbina, 2001,
2002;Coura & De Castro, 2002). E apesar da maioria dos estudos revelar uma baixa
eficiência destes fármacos durante a terapia de pacientes crônicos associada a
Introdução
10
ocorrência de múltiplos efeitos tóxicos que, em muitos casos leva á interrupção do
tratamento (Urbina & Do Campo, 2003), avaliações recentes têm indicado o
tratamento destes indivíduos uma vez que o tratamento pode retardar ou mesm
evitar a evolução da doença. Um estudo recentemente publicado por Viotti e
colaboradores (2006) com dados de 566 pacientes crônicos submetidos ou não ao
tratamento por benznidazol (283 em cada grupo) revelou que somente um pequeno
percentual de pacientes tratados evoluiu para a forma grave da CCC reforçando a
idéia de que o tratamento pode regular a evolução para a forma severa da
cardiomiopatia crônica (Pinto Dias, 2006). Contudo, há severas críticas relacionadas
a generalização desta recomendação para o tratamento de pacientes crônicos, e
pontuando-se a necessidade de se avaliar caso a caso (Amato Neto, 1999).
As variações observadas quanto à eficiência de cura devida ao tratamento clínico
estão, pelo menos em parte, relacionadas à diferenças na susceptibilidade dos
diversos estoques de T. cruzi às drogas (Amato-Neto, 1999; Coura & De Castro,
2002). De fato, estudos com diversos isolados do parasita mostram um espectro
variável (0-100%) de susceptibilidade in vitro e in vivo a diferentes fármacos,
incluindo o benznidazol e o nifurtimox (Martinez-Diaz e cols., 2001; Toledo e cols.,
2003; De Souza e cols., 2004; Campos e cols., 2005; Coronado e cols., 2006). Como
o T. cruzi apresenta uma população altamente heterogênea, caracterizada por
diferenças morfológicas, biológicas, patológicas, clínicas, imunológicas, bioquímicas
e moleculares (Devera e cols., 2003), supõem-se que a variável eficácia da
quimioterapia entre as diferentes regiões endêmicas possivelmente esteja
relacionada á diferenças no perfil de susceptibilidade das diferentes populações do
parasita (Urbina, 2001).
Com relação à toxicidade, alguns estudos fármacocinéticos têm sido propostos
visando uma melhor absorção e biodisponibilidade das drogas usadas para o
tratamento da doença de Chagas, em especial do benznidazol, levando
conseqüentemente, à redução das doses utilizadas e dos seus efeitos colaterais
(Lamas e cols., 2006).
Assim, (i) a baixa e variável eficiência destes fármacos em especial durante
tratamento de pacientes crônicos, (ii) a ocorrência de múltiplos efeitos tóxicos que
em muitos casos leva à interrupção do tratamento, e o (iii) desenvolvimento de
clones/isolados de parasitas resistentes a drogas (Coura & De Castro, 2002; Urbina
& Do Campo, 2003), são argumentos que justificam e reforçam a busca por
compostos mais efetivos e menos tóxicos para o tratamento da doença de Chagas,
Introdução
11
como por exemplo, de agentes quimioterápicos já utilizados na clínica contra outros
patógenos, como por exemplo, as diamidinas aromáticas e seus análogos (Barret e
cols., 2003; Soeiro e cols., 2005; Croft e cols., 2005) bem como o desenvolvimento
de estudos que identifiquem moléculas/vias metabólicas do parasito que possam
representar alvos para o desenvolvimento de novos agentes tripanocidas.
1.4.4. Potenciais alvos do parasita
Tripanosomatídeos, como o T. cruzi, apresentam características bioquímicas
peculiares, cujo estudo é fundamental quando se busca de alvos para o
desenvolvimento de quimioterápicos (Mäser e cols., 2003):
• Inibidores de biossíntese de lipídios: Esta via metabólica é essencial para o T.
cruzi, e suas etapas finais divergem da biossíntese de mamíferos (Steverding
& Tyler, 2005). O parasita requer esteróis específicos (em especial ergosterol)
para a manutenção de viabilidade e proliferação de seus estágios evolutivos,
sendo extremamente suscetível in vitro a inibidores desta via metabólica
(Urbina, 2001; Bernacchi e cols, 2002; Urbina & Do Campo, 2003; Croft e
cols, 2005). Posaconazol (SCH 56592), um análogo estrutural do itraconazol,
encontra-se atualmente na fase III da triagem clínica como um antifúngico
sistêmico, e frente a sua boa atividade in vivo sobre T. cruzi representa um
candidato potencial para ensaios com pacientes chagásicos (Urbina, 2001).
• Inibidores de cisteína proteases: O T. cruzi possui uma cisteina protease
catepsina L-“like” denominada de cruzipaína, também conhecida como
cruzaína ou gp51/57 (Meirelles e cols., 1992). Esta enzima é a principal
responsável pela atividade proteolítica de todos os estágios evolutivos do
parasita, localizando-se na superfície celular de amastigotas intracelulares e
no sistema lisossomal/endossomal de epimastigotas (Steverding & Tyler,
2005). Inibidores desta protease bloqueiam a proliferação de epimastigotas e
de amastigotas, e inibem a metaciclogênese e a invasão in vitro de células
hospedeiras por tripomastigotas, sugerindo importante papel desta enzima
nos processo de invasão, sobrevivência e proliferação do parasita (Urbina,
2001; Urbina & Do Campo, 2003). Inibidores de cruzipaína, como o N-metil-
piperazina-uréia-F-hF-vinil-sulfona-fenila, têm se revelado ativos e com baixa
toxicidade frente a modelos experimentais infectados pelo T. cruzi (Urbina,
2001; Croft e cols, 2005).
Introdução
12
• Inibidores do metabolismo de pirofosfato: Tripanosomatídeos como T. cruzi, T.
brucei e L. mexicana contêm organelas especiais, chamadas
acidocalcisomos, que estão envolvidas no estoque de cátions e pirofosfato,
possivelmente atuando na adaptação ao estresse ambiental e sobrevivência
destes parasitas (Urbina 2002; Urbina & Do Campo, 2003).
• Inibidores de captação de purina: Tripanosomatídeos são deficientes na
biossíntese de novo de purinas, mas apresentam a enzima hipoxantina-
guanina fosforibosiltransferase (HGFT) que permite a captação de purinas do
hospedeiro (Croft e cols, 2005). O alopurinol é um potente inibidor da xantina
oxidase, porém em tripanosomatídeos, deficientes nesta enzima, a droga atua
como um análogo de purina, e ao ser internalizada via HGFT, incorpora-se ao
DNA do parasita, inibindo a síntese de RNA e proteínas (Urbina 2002; Urbina
& Do Campo, 2003). Alopurinol é ativo contra a infecção experimental pelo T.
cruzi, embora haja diferenças quanto a sua atividade frente aos diferentes
estoques do parasita (Ávila & Ávila, 1981; Ávila e cols., 1981). Além disso,
ensaios clínicos revelaram resultados conflitantes quanto a sua eficácia
(Urbina, 2001).
Outros importantes alvos para o desenvolvimento de drogas contra o T. cruzi
incluem as enzimas toposoimerases (Steverding & Tyler, 2005), a enzima
tripanotiona redutase (Urbina, 2002), proteínas do citoesqueleto, como a tubulina
(Traub-Cseko e cols., 2001; Steverding & Tyler, 2005), entre outros.
1.5. DNA como alvo de drogas
Diferenças relativas às seqüências de DNA de seres humanos, parasitas e
células tumorais representam um atraente alvo para o desenvolvimento de novas
drogas. Um destes exemplos é o rico conteúdo de bases adenina/timina (AT)
presente no genoma do Plasmodium falciparum (cerca de 82%), o agente etiológico
da malária, em relação ao genoma humano (60%) (Turner & Denny, 2000).
O estudo e a descrição de ligantes que se associam à molécula de DNA teve
início na década de 60, logo após a descoberta da dupla hélice do DNA por Watson
& Crick. Desde então, a identificação, síntese e manipulação de propriedades de
associação de diferentes ligantes ao DNA representam interessantes estratégias
terapêuticas para o tratamento de várias doenças humanas incluindo câncer, bem
como daquelas causadas por vírus e parasitas (Bailly e cols., 2005). A associação
destes ligantes pode comprometer a íntima e específica associação de fatores de
Introdução
13
transcrição e mesmo de enzimas necessárias à expressão de genes, duplicação e
reparação do DNA (Turner & Denny, 2000).
Existem duas principais formas pelas quais os ligantes podem se associar não
covalentemente ao DNA: (i) via ligação à fenda menor – “minor groove binding
ligands” - MGBLs (preferencialmente em bases ricas em AT) e (ii) por intercalação,
que é a interseção do ligante entre dois pares de bases adjacentes da hélice do
DNA (Figura 1.2) (Haq, 2002). Entretanto, alguns ligantes, como por exemplo, DAPI
(diamidino-2-fenilindol, um agente anti-parasítico) e berenil (diminazeno), uma
diamidina de uso veterinário e que apresenta atividade tripanocida), podem se
associar ao DNA tanto pela ligação à fenda menor como pela intercalação a sítios
citosina e guanina (GC). Sabe-se que a estrutura e seqüência do DNA é que irá
determinar o tipo de associação do ligante, mas estudos têm revelado a
possibilidade de adaptar a estrutura do ligante de modo a modular suas
propriedades de associação ao DNA e conseqüentemente suas propriedades
farmacológicas. Por exemplo, alterações na estrutura de intercalantes podem torná-
los ligantes da fenda menor do DNA (Bailly e cols., 2005).
Figura 1.2: Associação de ligantes ao DNA por (A) intercalação entre as bases do
ácido nucléico (estabilizada por interações hidrofóbicas e forças van der Waals) e (B)
associação à superfície do DNA (nas regiões “minor groove” e “major groove”),
estabilizada por associações não covalentes, como forças van der Waals, interações
hidrofóbicas, e pontes de hidrogênio. Adaptado a partir de Haq, 2002.
Os MGBLs apresentam como características principais (i) a forma anular
composta por anéis aromáticos, que se encaixam na curvatura da fenda menor do
DNA, e (ii) a presença de cargas positivas que conferem afinidade ao potencial
eletrostático negativo da fenda (Turner & Denny, 2000). A grande maioria das
Introdução
14
MGBLs se associa seletivamente a seqüências de DNA ricas em AT, que são
aquelas de maior eletronegatividade das fendas menores. Por outro lado, estudos
realizados com drogas tripanocidas têm revelado que nem sempre há uma
correlação direta entre afinidade dos MGBLs ao DNA e atividade antiparasitária
(Ismail, 2004; Arafa e cols., 2005). No entanto, análogos de diamidinas aromáticas
que se ligam fracamente ao DNA geralmente exibem baixa atividade (Athri e cols.,
2006).
1.5.1. Diamidinas aromáticas e análogos
Diamidinas, alvo do nosso estudo, são exemplos de MGBLs, que além de um
amplo espectro de ação contra fungos, bactérias e outros parasitas, apresentam
considerável atividade anti-tumoral (Lansiaux e cols., 2002; Soeiro e cols., 2005).
Diamidinas aromáticas, como a pentamidina, foram inicialmente testadas na
tripanosomíase africana (Apted 1980, Bouteille e cols., 2003) e desde então sua
ação tem sido investigada em diversas infecções parasíticas (Soeiro e cols., 2005)
(Tabela 1.1) incluindo as patologias causadas por Pneumocystis jiroveci (Tidwell e
cols., 1990.), Saccharomyces cerevisiae (Lanteri e cols., 2004); vírus da diarréia viral
bovina (Givens e cols., 2003, 2004); Plasmodiun falciparum, Leishmania mexicana
amazonensis (Bell e cols., 1990; Macharia e cols., 2004), Toxoplasma gondii
(Lindsay e cols., 1991), Trypanosoma spp (Rowland e cols., 2003), Trichomonas
vaginalis (Crowell e cols., 2004) e Giardia lamblia (Bell e cols., 1993).
Tabela 1.1. Atividade de diamidinas aromáticas sobre parasitas: Ensaios in vitro e in
vivo. Adaptado a partir de Soeiro e cols., 2005.
Microorganismo IC
50
Referência
Trypanosoma brucei
rhodesiense
2,8 nM Ismail e cols., 2004
Trypanosoma cruzi 7,1 µM Stephens e cols., 2003
Plasmodium falciparum
129 nM (W2); 51 nM
(D6); 96 nM (K1)
Bell e cols., 1990
Ismail e cols., 2004
Leishmania donovani 2,6 µM Brendel e cols., 2002
Leishmania mex.
amazonensis
0,82 µM Bell e cols., 1990
Giardia lamblia 8,5 µM Bell e cols., 1993
Trichomonas vaginalis sem efeito Crowell e cols., 2004
Scedosporium prolificans 57 µg/ml Afeltra e cols., 2002a
Candida albicans 0,78 µg/ml Del Poeta e cols., 1998
Cryptococcus neoformans 3,12 µg/ml Del Poeta e cols., 1998
Plasmodium jiroveci 0,29 µg/ml Cushion e cols., 1997
Aspergillus species 8-32 µg/ml Afeltra e cols., 2002
Fusarium species 2-4 µg/ml lionakis e cols., 2003
Introdução
15
O mecanismo de ação das diamidinas aromáticas não está ainda totalmente
esclarecido, estando principalmente relacionado à formação de um complexo (não
covalente e não intercalante) com a fenda menor do DNA do microrganismo, em
seqüências ricas em AT, inibindo sua replicação e transcrição através da associação
direta ao ácido nucléico e/ou interferindo com enzimas associadas ao DNA como,
por exemplo, a toposoimerase II (Nguyen e cols., 2004). No entanto, dados têm
demonstrado que diamidinas, como a furamidina (DB75), podem também interagir,
menos freqüentemente, com seqüências GC, via intercalação na molécula de DNA
(Bailly e cols., 2005). Outros mecanismos de ação que têm também sido propostos
incluem: inibição de proteases, polimerases, proteína quinase A e inibição de síntese
de fosfolipídios, distúrbios no metabolismo de poliaminas (Soeiro e cols., 2005;
Werbovetz, 2006). A natureza dicatiônica da pentamidina permite sua acumulação
direta na mitocôndria levando ao colapso parcial do potencial da membrana interna,
resultando na permeabilização desta organela (Soeiro e cols; 2005; Werbovetz,
2006). A análise ultra-estrutural confirma a ação de diamidinas preferencialmente no
núcleo e mitocôndria (cinetoplasto) dos parasitos (Croft & Brazil, 1982; Fusai e cols.,
1997;De Souza e cols., 2004), sugerindo um mecanismo de ação universal.
Pentamidina e berenil induzem quebra do kDNA de tripanosomas, presumivelmente
mediada pela inibição de topoisomerases II (Webovetz, 2006; Jean-Moreno e cols.,
2006). Além de inicialmente localizadas no núcleo e cinetoplasto, diamidinas
aromáticas como a DB75 foram também identificadas em acidocalcisomos e em
outras organelas perinucleares de T. brucei. A localização de diamidinas em
organelas que não possuem DNA pode sugerir um novo mecanismo de ação ainda
desconhecido destas MGBLs ou alternativamente significar um sítio de estoque
destes compostos (Mathis e cols., 2006).
A pentamidina é usada na clínica para o tratamento de infecções causadas pelo
T. brucei, como droga de segunda escolha no tratamento de leishmanioses e no
tratamento da pneumonia causada pelo P. jiroveci em pacientes infectados pelo
vírus HIV (Soeiro e cols., 2005). Esta droga não apresenta boa biodisponibilidade
oral (possivelmente devido à presença dos grupamentos amidinas) requerendo
administração parenteral (intramuscular ou intravenosa), o que eleva o custo do
tratamento e dificulta sua aplicação em áreas rurais (Werbovetz, 2006).
Adicionalmente, apesar de sua comprovada atividade anti-parasítica, o tratamento
com pentamidina gera importantes efeitos colaterais, incluindo cardiotoxicidade,
Introdução
16
hepatoxicidade e diabete nos pacientes (Coyle e cols., 1996).
Assim, a síntese e análise do potencial anti-parasítico de novos análogos de
diamidinas bem como a de compostos relacionados, busca a substituição da
pentamidina injetável por uma droga menos tóxica, mas que guarde sua atividade e
possa ser administrada oralmente (Boykin, 2002). Alguns destes novos compostos
resultam de alterações nos grupamentos amidinas, que são os centros catiônicos de
diamidinas: nas amidinas reversas, nas quais o grupamento imino (elipse) encontra-
se diretamente associado a um nitrogênio do grupo anilino (quadrado), contrastando
com a amidina original, na qual o grupo imino está diretamente ligado a um anel arila
(quadrado) (Stephens e cols., 2001a, 2003). Apesar dos poucos estudos realizados,
dados da literatura têm sugerido que amidinas reversas exibem uma excelente
atividade in vitro, sendo algumas mais ativas contra amastigotas de L. donovani
(170X) e de T. cruzi (40X) do que a pentamidina (Stephens e cols., 2003), e
apresentando também boa atividade contra micobactérias e fungos (Stephens e
cols., 2001a).
O
N
H
N
H
N
N
NH
NH
O
NH
2
NH
2
H
2
N
NH
2
++
diamidina
(furamidina DB75)
amidina reversa
(estrutura geral)
O
N
H
N
H
N
N
NH
NH
O
NH
2
NH
2
H
2
N
NH
2
++
diamidina
(furamidina DB75)
amidina reversa
(estrutura geral)
O O
NH
2
H
2
N
NH NH
+
+
pentamidina
O O
NH
2
H
2
N
NH NH
+
+
pentamidina
Introdução
17
Outro exemplo de síntese é DB75 (furamidina) uma das diamidinas melhor
caracterizadas in vitro e in vivo. Este derivado difenilfurano bis-amidina apresenta
intensa atividade contra diversos microorganismos incluindo fungos, bactérias e
protozoários (Tidwell & Boykin 2003; Werbovetz, 2006). Atualmente, existe apenas
uma única prodroga, a amidoxima (DB289), derivada da furamidina, em fase III de
ensaio clínico na África (Angola e na Republica Democrática do Congo) para
tripanosomíase africana, na Tailândia para malária e no Peru para pneumonia
causada por P. jiroveci (Sturk e cols., 2004 ;Wilson e cols., 2005; Wang e cols.,
2006; Mathis e cols., 2006).
A atividade tripanocida das diamidinas aromáticas, como pentamidina e berenil,
está estreitamente relacionada ao seu transporte através de membranas, uma vez
que falhas ou mesmo ausência deste podem induzir resistência a estas drogas (Bray
e cols., 2003). Em tripanosomatídeos, o principal mecanismo de captação de
diamidinas como pentamidina, DB75 e berenil (o único transporte envolvido), é
através do transportador P2 (de Koning, 2001; Wilson e cols., 2005). Adicionalmente,
outras vias foram sugeridas, incluindo um transportador de purina de alta afinidade,
identificado como P1 (Carter e cols., 1999), além de um transportador de
pentamidina de alta afinidade (HAPT1), que indica ser próton dependente, e outro de
baixa afinidade (LAPT1) (Maser e cols., 2003; Matovu e cols., 2003). Cátions
divalentes inorgânicos, como Ca
2+
, inibem a internalização de pentamidina,
sugerindo que canais para os mesmos possam também estar envolvidos no
transporte da droga (Werbovetz, 2006).
Apesar de intensamente investigado na tripanosomíase africana, poucos estudos
têm sido realizados sobre o efeito de diamidinas sobre o T. cruzi (Werbovetz, 2006).
Nosso grupo tem analisado o efeito destes compostos contra este parasita, em
especial de DB75 (furamidina) e de seu análogo substituído por um grupamento
fenila, denominado DB569, realizando inicialmente uma triagem sobre o parasita, em
especial sobre forma sangüínea, seguido pela análise do seu efeito sobre a
infecção in vitro de células mamíferas (De Souza e cols., 2004, 2006a). Em nossos
estudos temos também avaliado por ensaios ultra-estruturais, bioquímicos e por
citometria de fluxo, os alvos destas drogas no parasita e a forma de morte celular
induzida por estes análogos (De Souza e cols., 2004, 2006b). Nossos resultados
revelaram (i) o potente efeito dose e tempo-dependente de alguns análogos (como o
Introdução
18
DB569) sobre as diferentes formas evolutivas do T. cruzi, (ii) a maior atividade da
DB569 em relação a furamidina, sendo significativamente mais efetiva mesmo em
doses micromolares (IC
50
2 µM) após curtos períodos de tratamento (2 horas), (iii)
diferentes níveis de susceptibilidade em relação aos diferentes estoques do T. cruzi,
sendo o clone Dm28c (representante biodema I) mais resistente em relação a cepa
Y (representante biodema II); além da (iv) baixa toxicidade dos compostos sobre
células de mamíferos (De Souza e cols., 2004; Soeiro e cols., 2005).
Adicionalmente, devido às características fluorescentes dos compostos, foi possível
localizá-los no núcleo e cinetoplasto dos parasitas, sendo este último um importante
alvo intracelular, sendo capaz de induzir morte celular programada do tipo I
(apoptose) em parte da população de parasitas submetidos ao tratamento com as
diamidinas (De Souza e cols., 2006a). Nossos resultados nos levaram a eleger o
análogo DB569 como alvo para investigações em modelos experimentais
(camundongos Suíços e cepa Y) cujos resultados revelaram que esta diamidina é
capaz de (i) reduzir a mortalidade e o parasitismo intracelular cardíaco in vivo, em
níveis semelhantes ao observado no grupo tratado com benznidazol, e (ii) proteger
de lesões cardíacas e de alterações eletrocardiográficas evidenciadas na fase aguda
final e crônica da infecção (De Souza e cols., 2006b, 2007). A proteção dos danos
na freqüência cardíaca associada ao menor parasitismo no miocárdio e aumento da
sobrevida dos animais tratados com DB569 foi diretamente relacionada à menor
expressão de células T CD8
+
sugerindo um possível papel imunomodulador da
diamidina além da sua atividade tripanocida (De Souza e cols., 2007).
O conjunto de dados da literatura reafirmando a grande potencialidade dos
compostos aromáticos justifica a continuidade deste estudo, explorando a atividade
de outros análogos in vitro e in vivo.
Objetivos
19
OBJETIVOS
Assim, como a quimioterapia atual da doença de Chagas é ainda insuficiente
para assegurar a erradicação do parasitismo nos indivíduos infectados, sobretudo
nos pacientes crônicos (Coura & De Castro, 2002), o que representa um pré-
requisito para o controle da evolução da doença (Urbina, 2001), o objetivo da
presente dissertação foi: caracterizar a atividade in vitro das amidinas reversas
(DB889, DB811, DB786 e DB702) e da diguanidina (DB711) sobre Trypanosoma
cruzi.
Objetivo específico 1: Avaliar a atividade tripanocida in vitro de amidinas reversas,
comparando-a com a ação de DB711, uma diguanidina, sobre formas
tripomastigotas sangüíneas e amastigotas intracelulares do T. cruzi. Para este
objetivo realizamos a análise qualitativa e quantitativa ao microscópio óptico de
parasitas tratados.
Objetivo especifico 2: Determinar o limiar de toxicidade in vitro de cada análogo
contra células de mamíferos (linhagem Vero ou cultivo primário de macrófagos
peritoniais). Para este objetivo analisamos a viabilidade celular por: (i) teste de
exclusão de azul de tripan e (ii) pela análise da morfologia ao microscópio óptico.
Objetivo específico 3: Avaliar, por microscopia eletrônica de transmissão e por
citometria de fluxo, os alvos de ação dos compostos contra formas tripomastigotas
sanguíneas e amastigotas intracelulares do T. cruzi frente ao tratamento in vitro.
Para este objetivo, após avaliação da atividade tripanocida e da citotoxicidade contra
células de mamíferos, tripomastigotas ou culturas infectadas (ricas em amastigotas)
foram tratadas e processadas para análise ultra-estrutural ou por citometria de fluxo.
Materiais e Métodos
20
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Drogas
Na presente dissertação, utilizamos os seguintes compostos (Figura 3.1): (i)
amidinas reversas (DB702, DB786, DB811,DB889), e (ii) uma diguanidina (DB711)
que apresenta guanidina como grupamento catiônico. As drogas foram sintetizadas
no laboratório do Dr. David W. Boykin (Departamento de Química da Universidade
do Estado da Geórgia, Atlanta, EUA). As soluções estoques das drogas foram
preparadas em 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) (Merck, Darmstadt, Alemanha) na
concentração de 5 mM e armazenadas à 4ºC até a realização dos experimentos.
Figura 3.1: Estrutura química das amidinas reversas (DB889, DB811, DB786,
DB702) e da diguanidina (DB711).
O
N
H
N
H
NHNH
D
B
8
8
9
NN
DB889
O
N
H
N
H
NHNH
D
B
8
1
1
NN
Cl
Cl
DB811
O
N
H
N
H
O
NHNH
O
NN
CH
3
H
3
C
CH
3
H
3
C
H
3
C
CH
3
DB786
O
N
H
N
H
OCH
3
NH
NH
2
H
2
N
NH
H
3
CO
DB711
O
N
H
N
H
C
H
3
NHNH
H
3
C
D
B
7
0
2
NN
DB702
O
N
H
N
H
NHNH
D
B
8
8
9
NN
DB889
O
N
H
N
H
NHNH
D
B
8
1
1
NN
Cl
Cl
DB811
O
N
H
N
H
O
NHNH
O
NN
CH
3
H
3
C
CH
3
H
3
C
H
3
C
CH
3
DB786
O
N
H
N
H
OCH
3
NH
NH
2
H
2
N
NH
H
3
CO
DB711
O
N
H
N
H
C
H
3
NHNH
H
3
C
D
B
7
0
2
NN
DB702
Materiais e Métodos
21
3.2. Culturas de células de mamíferos
3.2.1. Linhagem VERO
Esta linhagem, obtida a partir de células renais isoladas de Macaco Verde da
África e criopreservada em nitrogênio líquido, foi descongelada, quantificada em
câmara de Neubauer, plaqueadas (2x10
6
) em garrafas de 75 cm
3
(Falcon, Franklin
Lakes, New Jersey, EUA) e mantida em meio de cultivo (RPMI-1640, Sigma. St.
Louis, EUA) suplementado com 5% de soro fetal bovino e 2% de L-glutamina
(RPMIS). Para a realização dos experimentos, após confluência, as células foram
dissociadas enzimaticamente com 0,01% tripsina + 0,01% verseno diluídos em 0,1
M salina tamponada com fosfato pH 7,2 (PBS) por 3 min, e plaqueadas em garrafas
de 75 cm
3
(5x10
5
/garrafa) para obtenção de parasitas, ou em placas de 24 poços
(Falcon) sobre lamínulas de vidro (10
5
/poço), para ensaios com as drogas.
3.2.2. Culturas primárias de macrófagos peritoneais
As células foram obtidas a partir de lavagem peritoneal de camundongos suíços
(18-20 g), utilizando-se meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). A medida de
sua obtenção, as células foram analisadas ao microscópio óptico com a finalidade de
verificar a viabilidade e ausência de contaminação, sendo mantidas em gelo até a
finalização de todo procedimento. A seguir, as células foram centrifugadas,
ressuspensas em DMEM, quantificadas em câmara de Neubauer e plaqueadas
(5x10
4
/poço) em microplacas de 96 poços (Falcon) por 1 h a 37ºC. Após esse
período, as células não aderidas foram removidas e as culturas mantidas por 24 h
em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 2 ml de L-glutamina
(DMEMS). Todas as culturas foram mantidas a 37°C em atmosfera de 5% CO
2
e o
meio substituído a cada 48 h.
3.3. Parasitas
Utilizamos dois estoques do T. cruzi: cepa Y, representante do biodema II
(principalmente relacionado a parasitas do ciclo domiciliar) e o clone Dm28c, e
representante do biodema I (principalmente relacionado a parasitas do ciclo
silvestre).
Materiais e Métodos
22
3.3.1. Formas tripomastigotas sangüíneas
Os parasitas da cepa Y foram obtidos por punção cardíaca de camundongos
suíços imunosuprimidos no pico da parasitemia, que corresponde a sete dias pós
infecção (dpi) (Meirelles e cols., 1986). A imunosupressão dos animais foi induzida
no 2 dpi através da administração 200 mg/kg de ciclofosfamida (Genuxal 200 mg®,
Asta Medica) por via intraperitoneal. Após obtenção, o sangue dos animais foi
centrifugado (167g/20 min) para eliminação de células sangüíneas, o sobrenadante
novamente centrifugado (2054g/15 min), e o sedimento rico em parasitas foi
ressuspenso em DMEM (suplementado por 10% de soro fetal bovino) e mantido por
20 min a 37ºC. O coágulo resultante da agregação plaquetária foi removido, e o
sobrenadante centrifugado (2054g/15 min) para sedimentação dos parasitas, que
foram finalmente ressuspensos em 2 mL DMEM e quantificados em câmara de
Neubauer.
3.3.2. Formas tripomastigotas de cultura (clone Dm28c e cepa Y)
Os parasitas foram obtidos a partir do sobrenadante de linhagem Vero
previamente infectadas (4-5 dpi). O sobrenadante foi inicialmente centrifugado
(107g/10 min) para remoção de restos celulares e/ou células Vero dispersas no meio
e o sobrendante resultante rico em parasitas, foi centrifugado (2054g/15 mim). O
sedimento final foi ressuspenso em RPMIS, sendo o número total de parasitas
determinado por quantificação em câmara de Neubauer.
3.4 Efeito anti-parasítico
3.4.1. Sobre tripomastigotas sangüíneos
Formas tripomastigotas foram incubadas em microplacas de 96 poços, sendo
100 µL de uma suspensão contendo 10 x 10
6
parasitas/ml adicionados a igual
volume das drogas no dobro da concentração final desejada (0,33 a 32 µM). Após 2-
24 h de tratamento, o percentual de parasitas mortos foi determinado por
quantificação em câmara de Neubauer. Os ensaios foram realizados a 4ºC e 37ºC
em DMEM (De Souza e cols, 2004).
Alternativamente, os ensaios foram realizados com tripomastigotas
ressuspensos em sangue de camundongo (5 x 10
6
parasitas/ml), sendo 196 µl da
suspensão adicionados a microplacas de 96 poços seguidos de 4 µL de cada
composto (50x da dose final desejada). Os ensaios foram realizados a 4°C por 2-
Materiais e Métodos
23
24h.
Os controles foram realizados com parasitas mantidos sob as mesmas
condições, na ausência das drogas ou em presença de 0,64% DMSO, que
representa a maior dose do diluente, utilizada na concentração de 32 µM. A
atividade de cada composto foi expressa pelo cálculo do valor de IC
50
/24 h, que
representa a dose mínima de cada droga capaz de matar 50% dos parasitas.
3.4.2. Sobre amastigotas intracelulares
Para analisar o efeito das drogas, após 24 h de plaqueamento, culturas de
células Vero foram infectadas a 37ºC por 24 com a cepa Y ou por 2 horas com o
clone Dm28c, na razão 10:1 (parasita:célula hospedeira). Após esta etapa de
interiorização, as culturas foram lavadas com RPMIS para remoção de parasitas
livres e então incubadas por 2-72 h a 37°C com as drogas nas concentrações de
0,33, 1,0, 3,5 e 10,6 µM, sendo o meio trocado a cada 24 h, como descrito em De
Souza e cols. (2004). Os controles foram realizados com culturas infectadas
mantidas sob as mesmas condições, porém na ausência das drogas ou em meio
acrescido por 0,64% de DMSO. Após os diferentes tempos de tratamento, as
culturas foram lavadas com PBS, fixadas por 5 min com Bouin (71% de solução
aquosa de ácido pícrico, 25% de formalina ou formaldeído e 4% ácido acético
glacial) e processadas para rotina em microscopia óptica. A seguir, foi realizada a
quantificação do percentual de células hospedeiras infectadas e do número de
parasitas por célula infectada. Foi utilizado o parâmetro índice endocítico (IE), que
representa a multiplicação do percentual de infecção pelo número de parasitas por
célula infectada. Os resultados foram expressos pelo valor do IC
50
(concentração
necessária para reduzir 50% do IE) após cada dia de tratamento.
Todos os ensaios foram realizados no mínimo de três vezes e em duplicatas. A
análise estatística foi realizada pelo teste t de Student (p≤0,05).
3.5. Toxicidade
Para identificar o nível de toxicidade de cada composto, avaliamos a morfologia
e a viabilidade das células de mamíferos (células Vero e macrófagos peritoniais)
frente ao tratamento com as drogas. Nestes ensaios, as células foram cultivadas a
37ºC por 24 h em placas de 96 poços (5x10
4
células/poço), lavadas por duas vezes
com PBS e incubadas por 24 h a 37ºC com as drogas preparadas em meio RPMIS
nas concentrações de 10,6, 32 e 96 µM.
Materiais e Métodos
24
As culturas tratadas foram lavadas por duas vezes com PBS e analisadas
segundo a morfologia e a viabilidade. Para análise morfológica as culturas foram
fixadas por 5 min com Bouin, processadas para rotina em microscopia óptica e
analisadas ao microscópio óptico (Axioplan, Zeiss, Alemanha). Para análise da
viabilidade, após lavagem com PBS, as culturas eram incubadas por 5 min com
0.2% de solução de azul de tripan (Sigma-Aldrich) diluído em PBS e o percentual de
células coradas (não viáveis) determinado ao microscópio invertido (Axiovert 135,
Zeiss, Alemanha). Os controles foram realizados pela omissão das drogas ou pela
adição de 1,9 % DMSO (concentração de solvente na dose de 96 µM). Todos os
ensaios foram realizados no mínimo de três vezes e com duplicatas. A análise
estatística foi realizada pelo teste t de Student (p≤0.05).
3.6. Processamento de rotina para microscopia óptica
Após fixação em Bouin, as culturas foram lavadas com álcool a 70% (para
remoção do fixador), e a seguir com água deionizada. As amostras foram então
coradas por 45 min com solução de Giemsa (Merck) na diluição de 10:1 em água,
em seguida desidratadas em concentrações decrescentes de acetona e crescentes
de xilol, e montadas em Permount (Fisher Scientific, Litho, EUA).
3.7. Análise ultra-estrutural
Para identificar possíveis estruturas-alvo das drogas, os parasitas tratados foram
analisados por microscopia eletrônica de transmissão (MET) (De Souza e cols.,
2004).
3.7.1. Formas tripomastigotas
Os parasitas foram tratados a 37°C por 24 h com a dose de cada droga
equivalente ao seu valor de IC
50
/24 h, previamente calculado com base nos ensaios
descritos no item 3.4.1. Após incubação, os parasitas foram lavados por 3 vezes
com 0,1 M PBS, fixados por 1 h a 4°C com 2,5% de glutaradeído diluído em 0,1M de
tampão cacodilato de sódio, e processados para rotina em MET (ver item 3.8) (De
Souza e cols., 2004).
Materiais e Métodos
25
3.7.2. Formas amastigotas intracelulares
Células Vero (2x 10
6
células/placa) foram aderidas por 24 h em placas de Petri
(100 mm, Nunclon Surface-Roskilde, Dinamarca) e infectadas por 24 h a 37°C com
tripomastigotas sangüíneas da cepa Y, na razão de 10:1 (parasita:célula
hospedeira). Após esta etapa de interiorização, as culturas foram tratadas por 24 h a
37ºC com a dose de cada droga equivalente ao seu valor de IC
50
/24 h, como
descrito no item 3.4.2. Após tratamento, as culturas foram lavadas por 3 vezes com
0,1M PBS, fixadas por 1 h a 4ºC com 2,5% de glutaradeído diluído em 0,1M de
tampão cacodilato de sódio e processadas para rotina em MET (ver item 3.8).
Todos os ensaios foram realizados no mínimo de três vezes e os controles foram
realizados em meio sem adição das drogas.
3.8. Processamento para MET
Após fixação com glutaraldeído, as amostras foram lavadas por duas vezes em
0,1 M de tampão cacodilato de sódio sendo em seguida realizada a pós-fixação por
15 min à temperatura ambiente com 1% tetróxido de ósmio diluído no mesmo
tampão acrescido de 0,8% ferricianeto de potássio e 0,5 mM cloreto de cálcio
(CaCl
2
). Em seguida, as amostras foram lavadas por 3 vezes em tampão cacodilato
e desidratadas em série crescentes de acetona (30, 50, 70, 90, 100%), por duas
vezes/5 min cada concentração. O material foi impregnado com uma mistura de
acetona 100%:resina epoxi (v/v) “overnight” a 4°C, sendo então realizada a
substituição para resina pura (4 h/temp. ambiente). Após esta etapa, as amostras
foram incluídas em resina pura e polimerizadas por 3 dias a 60 °C. Após obtenção
de cortes ultrafinos com ultramicrótomo (Leica Ultracuts, UCT, Viena, Áustria), as
grades foram contrastadas por 25 minutos em acetato de uranila e observadas ao
microscópio eletrônico de transmissão (Zeiss EM10C).
3.9. Processamento para análise por citometria de fluxo
Tripomastigotas sangüíneos (5 x 10
6
cel/ml) foram lavados em PBS e tratadas
por 24 h a 37ºC com a dose de cada composto equivalente ao IC
50
/24 h previamente
determinado (item 3.4.1). Após o tratamento, as amostras foram incubadas por 15
min a 37ºC com 10 g/ml de rodamina 123 (Rh123). A seguir, as amostras foram
imediatamente colocadas no gelo até análise (Santa-Rita e cols., 2006). A aquisição
dos dados e a análise foram realizadas usando o citômetro de fluxo (FACSCalibur -
Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) equipado com Cell Quest software (Joseph
Materiais e Métodos
26
Trotter, Scripps Research Institute, San Diego, CA, EUA). Um total de 10,000
eventos foi adquirido em regiões correspondentes a população de parasitas,
previamente estabelecidas. Os dados, como os histogramas e “dot plots” foram
obtidos usando o software WinMDI 2.8. O resultado expresso por histograma que
mostra a intensidade de fluorescência nos parasitas tratados ou não pelas drogas.
Nestes gráficos podemos observar o pico de alta intensidade através do marcador
M1, e a perda de fluorescência podendo ser observada pelo marcador M2. Todos os
ensaios foram feitos pelo menos de três a cinco vezes, em duplicata, e o teste t de
Student foi aplicado para a análise estatística das diferenças observadas (p<0.01).
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com manual estabelecido
pelo Comitê de Ética para Uso de Animais da FIOCRUZ, resolução 242/99.
Resultados
27
RESULTADOS
Frente a alta e promissora ação anti-parasítica in vitro e in vivo de diamidinas e
análogos (Soeiro e cols., 2005; De Souza e cols., 2006a; Webovetz, 2006), iniciamos
nosso estudo avaliando a atividade das amidinas reversas (ARs) DB889, DB702,
DB786 e DB811, comparando-as com a diguanidina DB711, sobre formas
tripomastigotas sangüíneas do T. cruzi, que representam a principal forma infectiva
presente no hospedeiro vertebrado. Nossos ensaios foram realizados sob diferentes
condições de tratamento (diferentes temperaturas) e em presença ou não de sangue
(Tabela 4.1).
Tabela 4.1. Valores de IC
50
/24 h (µM) para o efeito dos compostos sobre formas
tripomastigotas sangüíneas de Trypanosoma cruzi
Compostos 0% sangue 100% sangue
37°C 4°C 4°C
2h 24h 2h 24h 2h 24h
DB889 0,9 0,09 6,89 0,089 2,03 0,97
DB702 0,93 0,45 17,7 3,8 2,7 1,18
DB786 0,1 0,028 8,3 0,28 > 32 > 32
DB811 nr nr nr nr > 32 16,5
DB711 > 32 19,4 > 32 > 32 > 32 >32
nr: não realizado
Os ensaios realizados a 37ºC com as ARs diluídas em meio de cultura
mostraram um potente efeito tripanocida dose e tempo-dependente (Fig.4.1),
levando à alterações morfológicas (inchaço) e perda de motilidade dos parasitas
(dados não mostrados).
Para DB889, o tratamento por 2 h apresentou um valor de IC
50
/2 h igual 0,9 µM,
sendo que na dose 32 µM o percentual de morte dos parasitas foi de 78%. Para esta
diamidina, o valor de IC
50
/24 h foi de 0,09 µM, sendo que após este tempo houve lise
total dos parasitas na dose 3,5 µM (Fig. 4.1A e Tabela 4.1.).
Resultados semelhantes foram observados com DB702, com um IC50/2h =
0,93µM e IC
50
/24 h = 0,45 µM sendo que após 24 h na dose 3,5 µM houve lise de
Resultados
28
95% dos parasitas (Fig. 4.1B e Tabela 4.1).
O tratamento com DB786 (37ºC/RPMIS) resultou em um maior efeito
tripanocida em relação as duas amidinas testadas anteriormente. Após 2 h, o valor
de IC
50
foi de 0,1 µM, e com a dose de 1,18 µM houve 79% de morte dos
tripomastigotas (Fig. 4.1C). Após 24 h, a droga teve atividade em nível nanomolar,
com IC
50
28 nM (Tabela 4.1), ou seja, atividade cerca de 3,2 e 16 vezes maior que,
respectivamente, DB889 e DB702, sendo observada lise total dos parasitas após 24
h na dose de 0,39 µM (Fig. 4.1C e Tabela 4.1).
Por outro lado, o tratamento com a diguanidina DB711 foi o menos efetivo
resultando em valores de IC
50
> 32 µM após 2 h e 19,4 µM após 24 h de incubação,
quando também na dose 32 µM o percentual de lise foi 84% (Fig. 4.1D e Tabela
4.1).
Resultados
29
Figura 4.1: Atividade in vitro de DB889 (A), DB702 (B) e DB786 (C), e da
diguanidina DB711 (D) sobre formas tripomastigotas de T. cruzi. após tratamento por
2 e 24 h a 37ºC em ensaios realizados em meio de cultura.
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
B
C D
A
0 4 8 12 16 20 24 28 32 0 4 8 12 16 20 24 28 32
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
B
C D
A
0 4 8 12 16 20 24 28 32 0 4 8 12 16 20 24 28 32
Resultados
30
Analisamos também os efeitos destas drogas em ensaios a 4°C em meio de
cultura. Mesmo a esta temperatura mais baixa, o tratamento também resultou em
alterações morfológicas (inchaço) (dados não mostrados), com importante perda de
motilidade e viabilidade dos parasitas, de modo dose e tempo dependente (Fig. 4.2).
Porém, a 4°C, observamos que a maioria das drogas testadas foi menos ativa em
relação ao tratamento a 37ºC (Figs. 4.1 e 4.2 e Tabela 4.1).
A DB889 apresentou significativa atividade tripanocida a 4°C, alcançando um
IC
50
/2h = 6,89 µM e IC
50
/24 h = 0,089µM, sendo que, com 24 h na dose de 10,6 µM,
o índice de morte foi de 89% (Fig. 4.2A e Tabela 4.1).
A incubação de tripomastigotas por 2 h a 4°C com as diamidinas DB702 e
DB786 resultou em valores de IC
50
de, respectivamente, 17,7 e 8,3 µM (Fig. 4.2B-C).
Após 24 h de tratamento, o IC
50
foi de 3,8 µM para DB702 e 0,28 µM para DB786,
sendo ambos compostos menos efetivos que DB889 (Fig. 4.2A-C e Tabela 4.1).
Nestas condições, em meio de cultura e a 4°C, a diguanidina DB711 também
reduziu parcialmente o número de parasitas viáveis, apresentando IC
50
/24 h de
cerca de 32µM (Fig. 4.2D). Vale ressaltar que mesmo esta diguanidina quando
ensaiada a 37ºC, resultou em níveis de 84% quando os parasitas foram tratados
pelo mesmo tempo e dose acima descritos (Fig. 4.1D).
Resultados
31
Figura 4.2: Atividade in vitro de DB889 (A), DB702 (B) e DB786 (C), e da
diguanidina DB711 (D) sobre formas tripomastigotas de T. cruzi. após tratamento por
2 e 24 h a 4ºC em ensaios realizados em meio de cultura.
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
A B
C
D
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
A B
C
D
Resultados
32
A seguir, frente (i) ao já conhecido efeito inibitório de algumas drogas por
componentes do sangue (Santa-Rita e cols., 2000, 2006), a (ii) presença de formas
tripomastigotas no sangue de hospedeiros vertebrados, e (iii) a necessidade de
drogas para uso em bancos de sangue em áreas endêmicas, nossa próxima
abordagem foi avaliar à 4ºC, a atividade tripanocida destes compostos em ensaios
realizados não mais em meio de cultura, mas em presença de sangue de
camundongo (Fig. 4.3).
A atividade tripanocida da DB889, a semelhança do observado na ausência de
sangue, manteve-se alta após 2 h de tratamento com IC
50
= 2 µM (Fig. 4.3). Porém
após 24 h, a presença de sangue levou a um valor de IC
50
= 0,97 µM, ou seja, houve
uma importante diminuição da atividade da droga (10,9 X) em relação ao tratamento
também a 4°C, porém na ausência de sangue (Figs. 4.3A e 4.2A e Tabela 4.1).
Com relação a DB702, sua atividade se manteve em presença de sangue, com
IC
50
/2 h = 2,7 µM e IC
50
/24 h = 1,18 µM (Fig. 4.3B; Tabela 4.1), sendo sua atividade
tripanocida maior em relação ao tratamento sem adição de sangue (Fig. 4.2B e 4.3B,
Tabela 4.1). Por outro lado, nossos dados mostram que a adição de sangue durante
o tratamento dos parasitas com a DB786 por 2 e 24 h resultou em profunda inibição
da atividade desta droga, sendo nos dois tempos, o valor de IC
50
superior a 32 µM
apesar de sua alta atividade no tratamento sem adição de sangue (Figs. 4.2C, 4.3C,
Tabela 4.1) .
Como observado frente ao tratamento na ausência de sangue, a diguanidina
DB711 apresentou baixa atividade tripanocida em relação às diamidinas testadas,
com IC
50/
2h >32µM, e alcançando nesta mesma dose (32 µM), 28% de morte dos
parasitas após 24 h (Fig. 4.3D; Tabela 4.1).
A análise do efeito de outra amidina, a DB811, na presença de sangue sobre
tripomastigotas sangüíneos revelou uma atividade intermediaria quando comparada
às outras amidinas reversas, ou seja, o valor de IC
50
/24 h foi de 16,5 µM (Fig. 4.3E;
Tabela 4.1).
Resultados
33
Figura 4.3: Atividade in vitro de DB889 (A), DB702 (B), DB786 (C), DB811(D) e da
diguanidina DB711 (E) sobre formas tripomastigotas de T. cruzi. após tratamento por
2 e 24 h a 4ºC em ensaios realizados na presença de sangue de camundongo.
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
D
20 24 28 32
C
16 20 24 28 32
A B
E
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
D
20 24 28 32
0
50
100
0 4 8 12 16
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
D
20 24 28 32
C
16 20 24 28 32
A B
E
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
E
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
E
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Concentração (µM)
% parasitas mortos
2h 24h
Resultados
34
A seguir, considerando que (i) dados na literatura apontam variações na
atividade de quimioterápicos frente às diferentes formas do parasita (Menna-Barreto
e cols., 2005), e que (ii) amastigotas representam a forma multiplicativa do T. cruzi
em células hospedeiras de mamíferos (De Souza, 2002), nossa próxima etapa foi
avaliar o efeito das ARs e da diguanidina DB711 sobre formas amastigotas
intracelulares. Porém, antes de testar a atividade dos compostos sobre culturas
infectadas, analisamos o potencial citotóxico de cada composto sobre culturas não
infectadas, através da (i) análise morfológica ao microscópio óptico (Fig. 4.4A) e da
(ii) quantificação de viabilidade celular pelo método de exclusão pelo corante azul
tripan (Fig. 4.4B-C).
No caso de células Vero, a incubação com DB889, DB711 e DB786 somente
resultou em perda de viabilidade de 10 a 20% a partir de 32µM (Fig. 4.4A-B). No
caso da DB702, nesta mesma dose, observamos uma redução de cerca de 44% na
viabilidade das culturas tratadas (Fig. 4.4A-B).
No caso de culturas primárias de macrófagos peritoneais, observamos uma
maior toxicidade, sendo que na dose de 32µM a perda de viabilidade foi de 13, 55,
58 e 38%, para, respectivamente, DB889, DB702, DB786 e DB711 (Fig. 4.4C). Com
base nestes resultados, nossos ensaios de análise da atividade anti-parasítica dos
compostos contra as formas de intracelulares do T. cruzi, foram realizados
utilizando-se somente doses que não exerceram toxicidade para as células
hospedeiras, ou seja, ≤ 10,6µM.
Resultados
35
Figura 4.4: Efeito in vitro de DB889, DB702, DB786 e da diguanidina (DB711) sobre
células de mamíferos. Análise morfológica ao microscópio óptico do efeito citotóxico
sobre células Vero (A), e quantificação de viabilidade celular de linhagens de células
Vero (B) e de culturas primárias de macrófagos peritoneais (C) através do método de
exclusão pelo corante azul de tripan.
B C
0
20
40
60
80
100
DB889 DB702 DB786 DB711
% células viáveis
0
20
40
60
80
100
DB889 DB702 DB786 DB711
% células viáveis
0 10,6 32 960 10,6 32 96
Controle
DB 786
DB889
DB 702
DB 711
10µM
96µM
32µM
A
Resultados
36
O tratamento das culturas infectadas com as ARs reduziu tanto o percentual de
células infectadas quanto o número de parasitas por célula (Fig. 4.5A-E e G-I; Fig.
4.6A-E). Por outro lado, a incubação somente com DMSO (diluente das soluções
estoque das drogas) não interferiu nos ensaios (Fig. 4.5B).
A determinação do índice endocítico (IE) revelou que o tratamento com DB889,
DB702 e DB786 induziu uma importante redução tempo-dependente na infecção das
culturas (Fig. 4.5G-I). A análise ao microscópio óptico revelou que, a semelhança do
que foi observado com formas tripomastigotas, a DB889 foi muito efetiva contra
amastigotas, com ICs
50
na faixa de 0,17 a 0,19 µM após 24, 48 e 72 h de tratamento
(Figs. 4.5C e G, Fig. 4.6 e Tabela 4.2). A DB702 também exibiu importante atividade
contra os parasitas intracelulares, com valores de IC
50
de 0,25, 0,18 e 0,16 µM após,
respectivamente, 24, 48 e 72 h (Tabela 4.2). O tratamento por 24 h com 10,6 µM de
DB889 ou DB702 inibiu o IE em aproximadamente 83% (Fig. 4.5 G-H), alcançando
índices superiores de 98% com a dose de 3,5 µM (DB702 ou DB889) após 72 h (Fig.
4.5 G-H).
Tabela 4.2. Valores de IC
50
(µM) para o efeito dos compostos sobre formas
amastigotas intracelulares dos estoques Y e Dm28c.
cepa Y clone Dm28c
24 h 48 h 72 h 24 h 48 h
DB889 0,18 0,19 0,17 0,22 0,21
DB702 0,25 0,18 0,16 0,29 0,21
DB786 1,10 1,0 0,25 1,40 1,46
DB711 >32 >32 >32 >32 >32
DB786, também apresentou uma alta atividade sobre amastigotas intracelulares,
exibindo IC
50
de 1,1; 1,0 e 0,25 µM após, respectivamente 24, 48 e 72 h, alcançando
neste último tempo de tratamento, níveis superiores a 94% na dose de 10,6 µM
(Tabela 4.2; Fig. 4.5I). Por outro lado, como já observado nos ensaios realizados
com tripomastigotas, a diguanidina DB711 foi a menos ativa dos quatro compostos
testados, com o valor de IC
50
superior a 32µM mesmo após 72 h (Tabela 4.2, Fig.
4.5J).
Dada a conhecida diferença na susceptibilidade de estoques do T. cruzi frente a
drogas (De Souza e cols., 2004), a seguir avaliamos o efeito das ARs e da
Resultados
37
diguanidina DB711 sobre formas intracelulares do estoque DM28c do parasita.
Nossos dados não revelaram diferenças significativas quanto à atividade dos
compostos testados (medido pelo IC
50
) em relação aos dados obtidos com a cepa Y
(Tabela 4.2).
Resultados
38
Figura 4.5: Análise do efeito das ARs e diguanidina sobre culturas infectadas pelo T.
cruzi. (A-F) Análise morfológica ao microscópio óptico de culturas infectadas não
tratadas (A) ou após tratamento por 24 h com DMSO (B); DB889 (C), DB702 (D),
DB786 (E) e DB711 (F). Barra = 10 µm. (G-J) Atividade de DB889 (G); DB702 (H);
DB786 (I) e DB711 (J) determinada pela inibição do índice endocítico (IE).
A
D
B
E
C
F
G
H
Concentração (µM)
Inibição do Índice Endocítico
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2h 24h
48h 72h
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentração (µM)
Inibição do Índice Endocítico
2h 24h
48h 72h
I
J
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentração (µM)
Inibição do Índice Endocítico
2h 24h
48h 72h
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentração (µM)
Inibição do Índice Endocítico
2h 24h
48h 72h
A
D
B
E
C
F
A
D
B
E
C
F
G
H
Concentração (µM)
Inibição do Índice Endocítico
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2h 24h
48h 72h
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentração (µM)
Inibição do Índice Endocítico
2h 24h
48h 72h
G
H
Concentração (µM)
Inibição do Índice Endocítico
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2h 24h
48h 72h
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2h 24h
48h 72h
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentração (µM)
Inibição do Índice Endocítico
2h 24h
48h 72h
2h 24h
48h 72h
I
J
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentração (µM)
Inibição do Índice Endocítico
2h 24h
48h 72h
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentração (µM)
Inibição do Índice Endocítico
2h 24h
48h 72h
I
J
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentração (µM)
Inibição do Índice Endocítico
2h 24h
48h 72h
0
50
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Concentração (µM)
Inibição do Índice Endocítico
2h 24h
48h 72h
Resultados
39
Figura 4.6: Análise ao microscópio óptico de cultura de células Vero infectadas pelo
T. cruzi e tratadas ou não por 24 h com diferentes doses da DB889. Culturas
controle (A) e tratadas com 0,33µM (B); 1,18µM (C); 3,5µM (D) e 10,6µM (E).
Seta: parasita intracelular. Barra = 20 µm
B
C
D
E
A
B
C
D
E
A
Resultados
40
Por fim, visando avaliar os alvos dos compostos estudados, realizamos ensaios
de microscopia eletrônica (Figs. 4.7 e 4.8) e de citometria de fluxo (Fig. 4.7)
baseados nos valores de IC
50
/24h acima estabelecidos para cada droga (Tabelas
4.1 e 4.2). A análise ultra-estrutural de formas tripomastigotas não tratadas revelou
organelas características como reticulo endoplasmático, núcleo, mitocôndria e
flagelo (Fig.4.7A). Foi possível identificar a mitocôndria única do parasita que se
ramifica ao longo do seu corpo, e que contém uma região de condensação do DNA
mitocondrial, denominada de cinetoplasto, com uma estrutura em forma de cesta,
característica desta forma (Fig. 4.7B).
O tratamento com DB889, DB702 e DB786 causou alterações semelhantes nos
tripomastigotas incluindo (i) dilatações no reticulo de endoplasmático (Fig. 4.7C) e
Golgi (Fig. 4.7D, inset); (ii) considerável inchaço mitocondrial com presença de
estruturas membranosas (Fig. 4.7C-D, F-H) e marcante desorganização do
cinetoplasto (Fig. 4.7C, F e G), (iii) profundas alterações na morfologia nuclear
inclusive com dilatações de sua membrana (Fig. 4.7C, D e H), e (iv) intensa
vacuolização no citoplasma (Fig.4.7H). Um achado interessante foi que em parasitas
tratados com a DB889, houve profundas alterações relacionadas à organização de
microtúbulos com a identificação de múltiplos axonemas (Fig. 4.7C e H).
A análise de tripomastigotas tratados com a DB711 também mostrou alterações
relacionadas ao complexo mitocôndria-cinetoplasto (Fig. 4.7G), além da evidência de
estruturas vacuolares enriquecidas em inclusões membranares (Fig. 4.7E).
Considerando que os achados ultra-estruturais revelaram extensos e freqüentes
danos mitocondriais nos tripomastigotas, nosso próximo passo foi avaliar por
citometria de fluxo, a ação destas drogas sobre o potencial da membrana
mitocondrial (PMM) de tripomastigotas, como já havia sido relatado frente ao
tratamento do T. cruzi com outras diamidinas (De Souza e cols., 2006b). Nossos
dados mostram um importante e estatisticamente significante aumento no percentual
de parasitas com redução do PMM frente ao tratamento. Com a DB889, o percentual
de parasitas com perda de PMM foi de 59,0±11,0 (p = 0,014), com DB702 de
54,0±5,0 (p =0,011), e com DB786 de 55,0±4,5% (p =0,009) (Fig. 4.7J-L),
contrastando com o grupo controle, que somente apresentou um percentual de
17,0±13,0 de parasitas com perda no PMM (Fig. 4.7I). Por outro lado apesar de se
observar redução no PMM de parasitas tratados com a diguanidina DB711, a análise
estatística não revelou significância (p = 0.31) (Fig. 4.7M).
Resultados
41
Finalmente, também investigamos as alterações ultra-estruturais após
tratamento de culturas infectadas tratadas com os compostos. Culturas não tratadas
apresentaram amastigotas com núcleo, mitocôndria (com cinetoplasto característico
na forma de barra), bolsa flagelar e curto flagelo com características típicas destes
parasitas intracelulares (Fig. 4.8A-B). A semelhança do que foi observado com
formas tripomastigotas, a incubação das culturas infectadas com as ARs induziu
diversas modificações morfológicas nos parasitas como (i) importantes alterações na
mitocôndria (inchaço e presença de estruturas eletrondensas próximas ao
cinetoplasto), (Fig. 4.8D-E) e no núcleo (Fig. 4.8C), (ii) vacuolização e perda de
componentes citoplasmáticos (Fig. 4.8C), além de (iii) desorganização de
microtúbulos subpeliculares (ausentes em áreas de expansão de membrana
plasmática) (Fig. 4.8H) e (iv) presença de perfis vesiculares no interior da bolsa
flagelar (Fig. 4.8F-G).
Figura 4.7: Análise por microscopia eletrônica de transmissão (A-H) e por citometria
de fluxo (I-M) da ação de ARs e diguanidina sobre formas tripomastigotas de T. cruzi
in vitro. Parasitas não tratados (A-B) e tratados por 24 h a 37°C com o respectivo
IC
50
de DB889 (C, D e H); de DB702 (G) e de DB711 (E-F). Os compostos
induziram: inchaço na mitocôndria e desarranjo no cinetoplasto (C - F e H),
alterações na morfologia nuclear (C, D e H), e na organização de microtubulos (F,
inset). Múltiplas estruturas de axonemas (flagelo) (C e F, seta); perfis intracelulares
de membrana dilatada (G, asterisco). I-M: Análise por citometria de fluxo do
potencial de membrana mitocondrial (pela marcação com rodamina 123) de
parasitas controle (I) e submetidos ao tratamento descrito acima com DB889 (J),
DB702 (K) e DB786 (L) e DB711 (M). A alta intensidade de fluorescência foi
demarcada com M1, considerando que a baixa intensidade de fluorescência,
representa a redução do potencial de membrana mitocondrial demarcada por M2.
Cinetoplasto (c); mitocôndria (m); núcleo (n); retículo endoplasmático (re) e Golgi (g).
Barra = A-H: 1 µm e H (detalhe): 0,5 µm.
Resultados
42
I
J K
L M
A
B
C
D
F
G
H
E
±
±
±
±
±
*
I
J K
L M
A
B
C
D
F
G
H
E
±
±
±
±
±
*
Resultados
43
Figura 4.8: Microscopia eletrônica de transmissão de culturas infectadas com T.
cruzi e tratadas com ARs. Amastigotas presentes em culturas de células Vero não
tratadas (A e B) ou frente ao tratamento por 24 h a 37°C com o respectivo IC
50
de
DB889 (F e G), DB702 (E) e DB786 (C, D e H). Notar as alterações na morfologia
nuclear (C), vacuolização e perda de componentes plasmáticos (C, asterisco);
desorganização do cinetoplasto (D), inchaço e presença na mitocôndria de
estruturas de baixa eletrodensidade (E), vesículas na bolsa flagelar (F-G - seta) e
desorganização de microtubulos subpeliculares (H – cabeça de seta).
Núcleo (n), mitocôndria (m); cinetoplasto (c) e bolsa flagelar (bf).
Barra = A: 0,5µm; B-H: 1 µm.
A
B
C
D E
F
G
H
A
B
C
D E
F
G
H
Discussão
44
DISCUSSÃO
O controle da transmissão da doença de Chagas inclui várias estratégias como:
(a) a interrupção da transmissão vetorial e transfusional, (b) a detecção e o
tratamento da transmissão congênita, e (c) o tratamento de casos agudos e de
crianças. Estas intervenções têm contribuído efetivamente para a interrupção da
doença em diversas áreas endêmicas, entretanto ainda há desafios a serem
enfrentados, tais como: (i) a falta de um claro entendimento sobre a sustentabilidade
dos controles de transmissão e o real risco oferecido por vetores silvestres e
peridomiciliares; (ii) a ocorrência de um crescimento de populações de pacientes ou
de indivíduos em risco de infecções em áreas não endêmicas como resultado de
migrações humanas (em especial pela transmissão transfusional); (iii) o
desconhecimento da incidência global ou prevalência de infecção e doença bem
como dos fatores determinantes de progressão da doença; (iv) a carência de
cuidados médicos e terapia efetiva para os indivíduos infectados, em especial dos
casos crônicos, e (v) a falta de conhecimento sobre a real interferência dos correntes
fármacos na progressão da doença, entre outros desafios (WHO, 2005; Pinto Dias,
2006).
Como discutido na Introdução da presente dissertação, a quimioterapia corrente
usada para tratamento da doença de Chagas, principalmente baseada em dois
nitroderivados, nifurtimox e benznidazol, é insatisfatória devido a vários fatores
incluindo baixa atividade em especial na fase crônica, alta toxicidade e/ou
desenvolvimento de isolados do parasito resistentes a drogas (Pinto Dias, 2006). De
fato, extensas e recentes revisões sobre o tema têm revelado que a efetividade do
tratamento com ambos compostos apresenta pontos controversos, pois os
resultados variam com a fase da doença, o período de tratamento e a dose, a idade
e a origem geográfica dos pacientes (Coura & De Castro, 2002; Urbina & Do Campo,
2003; Croft e cols., 2005). Outros problemas incluem (i) os sérios efeitos colaterais
destes compostos, levando em alguns casos a interrupção do tratamento (ii), a falta
de formulações pediátricas, (iii) a descontinuidade da comercialização de nifurtimox
(desde década de 80) e (iv) a interrupção da produção de benznidazol pela Roche
(Stewart cols., 2005). Neste último caso, embora os direitos de produção do
benznidazol tenham sido transferidos para o LAFEPE (Laboratório Farmacêutico do
Estado de Pernambuco), este composto é ainda indisponível para comercialização.
Discussão
45
Assim, os dados acima relatados reforçam a urgente necessidade pela busca e
identificação de novas estratégicas terapêuticas para o tratamento dos milhões de
pacientes chagásicos. Neste sentido, frente à conhecida atividade de diamidinas
sobre vários agentes parasíticos in vivo e in vitro, estes compostos têm sido
considerados como drogas potenciais para o tratamento de infecções causadas por
tripanosomatídeos, como, por exemplo, pelo T. cruzi (De Souza e cols., 2004; Soeiro
e cols., 2005).
Como citado na Introdução, diamidinas aromáticas têm sido usadas na terapia
de doenças humanas e veterinárias causadas por vários parasitas (Soeiro e cols.,
2005). No entanto, desde a descrição inicial da atividade da pentamidina sobre a
tripanosomíase africana, o relato de diferentes efeitos colaterais associados á baixa
biodisponibilidade e exigência de administração parenteral têm fomentado a síntese
e o estudo da ação antiparasítica de novos análogos dicatiônicos de diamidinas
(Werbovetz, 2006). A baixa biodisponibilidade oral destes compostos deve-se ao fato
de que o pK de amidinas aromáticas (assim como das guanidinas), ser superior a
10, resultando na carga positiva destas moléculas em pH fisiológico (Arafa e cols.,
2005). Recentemente a síntese de prodrogas, como é o caso da DB289, tem sido
realizada de modo a sobrepor estes problemas físico-químicos, uma vez que o
tratamento via oral é preferencial sobre as outras vias de administração (Arafa e
cols., 2005).
A síntese de vários análogos/ derivados de diamidinas tem sido realizada por
alguns grupos, em especial pelo laboratório do Dr. D. Boykin (Universidade de
Atlanta, EUA), nosso colaborador que nos cedeu os compostos testados nesta
dissertação. O desenho e a síntese de novas diamidinas incluem a modificação/
substituição de seus centros catiônicos (ex. por amidinas reversas e por guanidinas)
(Stephens e cols., 2001a; Arafa e cols., 2005). Contudo, a maioria dos estudos
enfoca a ação destes compostos sobre tripanosomas africanos, sendo ainda poucos
projetados para investigar sua ação contra o T. cruzi (De Souza e cols., 2004; Soeiro
e cols., 2005; Werbovetz, 2006), que foi o alvo do presente estudo.
Os estudos in vitro realizados com amidinas reversas sugerem um potencial
efeito sobre T. cruzi, T. brucei rhodesiense e L. donovani (Werbovetz e cols., 2001;
Stephens e cols., 2001a, 2003), incentivando uma maior análise da ação desta
classe de compostos sobre estes parasitas.
Outro grupo de compostos dicatiônicos que tem sido sintetizado e avaliado pelo
grupo do Dr. Boykin é o das diguanidinas, que apresentam promissora atividade in
Discussão
46
vitro contra T. brucei rhodesiense e P. falciparum, com valores de IC
50
na faixa
nanomolar (2 a 40nM) (Arafa e cols., 2005). No entanto, a ação in vitro de
diguanidinas sobre a L. donovani e sobre T. cruzi revelou-se inferior àquela
observada com a pentamidina (Stephens e cols., 2003), embora apresente
considerável atividade contra micobactérias e fungos (Stephens e cols., 2001a). Em
um outro estudo in vivo demonstrou-se que diguanidinas apresentam uma alta
atividade antiparasitária contra tripanosomas africanos, associada à baixa toxicidade
para células de mamífero (Arafa e cols, 2005).
Assim, frente (i) a também promissora atividade de diguanidinas contra fungos,
bactérias (e micobactérias) e tripanosomas africanos, e (ii) aos poucos estudos
desenvolvidos sobre a ação destes compostos contra o T. cruzi, na presente
dissertação investigamos o efeito de amidinas reversas contra este
tripanosomatídeo, avaliando comparativamente sua atividade á aquela exercida pela
diguanidina DB711.
Deste modo, lançamos mão de diferentes metodologias para avaliar a atividade
de quatro amidinas reversas e de uma diguanidina sobre as formas do T. cruzi
relevantes para a infecção de mamíferos, como o homem: os tripomastigotas
sangüíneos e as amastigotas intracelulares. Estes estudos foram conduzidos através
de ensaios de (i) efeito direto sobre o parasita extracelular (frente a diferentes
condições de temperatura, e na presença ou não de sangue) e sobre culturas
infectadas, e pela (ii) determinação da toxicidade destes compostos sobre células de
mamíferos. Adicionalmente, os alvos da ação dos diferentes compostos foram
avaliados através de ensaios por microscopia eletrônica e citometria de fluxo,
visando a identificação de organelas-alvo dos parasitas.
Nosso estudo foi realizado com parasitas (a) da cepa Y de T. cruzi (isolada de
um caso agudo em 1950) classificada como biodema II, associada ao ciclo domiciliar
e referida como candidata para ensaios de triagem inicial de drogas frente a sua alta
susceptibilidade a ação de nifurtimox e benznidazol (Martinez-Dias e cols., 2001), e
(b) do clone Dm28c, classificado como biodema I e associado ao ciclo silvestre do
parasita (De Souza e cols., 2003).
Nossos dados confirmaram que pequenas variações na estrutura química podem
resultar em diferenças significativas na potência antiparasitária de compostos
estruturalmente relacionados. As ARs DB889 e DB702 apresentaram alta atividade
na maioria dos sistemas testados (diferentes formas evolutivas, estoques do
parasita, sob diferentes temperaturas e frente a adição de sangue), sendo todas as
Discussão
47
amidinas testadas mais efetivas (doses micro e mesmo nanomolares) quando
comparadas a ação da diguanidina. Nossos dados corroboram dados anteriores da
literatura que demonstraram que diguanidinas são menos efetivas contra
tripanosomatídeos em relação a amidinas reversas, e confirmam a significativa
atividade tripanocida desta última classe de compostos sobre o T. cruzi (Stephens e
cols., 2001a,b, 2003).
Nosso estudo realizado sob diferentes temperaturas demonstrou, como já
observado frente a outras drogas (Santa-Rita e cols., 2000), que o tratamento a 37ºC
potencializou a ação tripanolítica dos compostos, resultando na grande maioria dos
ensaios, em maiores níveis de morte dos tripomastigotas em relação ao tratamento á
4ºC . A análise do efeito das drogas contra tripomastigotas na presença de sangue,
visando seu potencial uso em bancos de sangue, mostrou uma diminuição na
atividade tripanocida dos compostos DB889 e DB786, possivelmente devido à sua
associação á componentes plasmáticos, como já relatados frente ao tratamento de
parasitas com outros fármacos – ex. T. cruzi com lisofosfolipidios (Santa-Rita e cols.,
2000, 2006). Por outro lado, não observamos efeitos inibitórios da DB702 frente aos
constituintes plasmáticos possivelmente devido as suas características estruturais. A
inibição pelo sangue, em especial da DB786, foi mais evidente frente ao tratamento
por 24h, possivelmente em função da maior imobilização/inativação de modo tempo-
dependente dos fármacos por proteínas plasmáticas e outros constituintes do
sangue.
Nossos dados também mostraram que somente em altas concentrações da
drogas (>32µM) houve considerável perda de viabilidade celular das células de
mamíferos. Porém, observamos diferenças relacionadas à susceptibilidade entre
células de linhagem e células de cultivo primário frente ao tratamento pelas drogas,
o que aponta a importância de se avaliar citoxicidade in vitro utilizando-se culturas
primárias.
Nossos resultados demonstram que além de apresentarem considerável
atividade tripanocida, as amidinas reversas mostraram-se também efetivas contra as
formas intracelulares do T. cruzi (cepa Y), sendo as DB889 e DB702 as mais
potentes apresentando IC
50
após 24h de tratamento de 0,18 e 0,25µM,
respectivamente. Como observado em tripomastigotas, a diguanidina DB711 não foi
capaz de reduzir a carga parasitária de culturas infectadas pelo T. cruzi, não sendo,
portanto, efetiva contra amastigotas intracelulares in vitro. Nossos dados confirmam
resultados prévios realizados em T. brucei rhodesiense e T. cruzi que demostraram
Discussão
48
um maior potencial tripanocida de amidinas reversas em relação às diguanidinas
(Stephens e cols., 2001b; 2003). No presente estudo não identificamos diferenças
significativas do efeito das amidinas reversas sobre amastigotas intracelulares dos
estoques Y e DM28c, apesar de dados anteriores terem revelado diferenças no perfil
de susceptibilidade frente à ação de outras diamidinas aromáticas (De Souza e cols.,
2004).
Após avaliarmos a atividade dos compostos, tivemos por objeto de estudo a
análise dos alvos de ação dos compostos contra os parasitas. A avaliação por
microscopia eletrônica de transmissão (MET) revelou que o tratamento com as
amidinas reversas induziu importantes alterações principalmente no núcleo e
mitocôndria de amastigotas e tripomastigotas, como já observado frente ao
tratamento de tripanosomas com diamidinas aromáticas (Croft & Brazil 1982; Fusai e
cols., 1997; De Souza e cols., 2004).
A MET também mostrou que a DB889 foi capaz de induzir um intenso “shedding”
de membranas na região da bolsa flagelar de amastigotas, o que sugere uma maior
atividade exocítica nestes parasitas frente ao tratamento pela amidina, haja vista que
esta estrutura representa um dos principais sítios de endocitose e exocitose em
tripanosomatídeos. Semelhantes alterações foram também relatadas em T. cruzi e
em outros tripanosomatídeos durante o tratamento com drogas (Santa-Rita e cols.,
2004; Braga & De Souza, 2006).
Os membros da família Tripanosomatidae exibem um flagelo que emerge da
bolsa flagelar, e que apresenta uma estrutura (9 + 2) padrão de microtubulos em
axonemas. Estes parasitas também apresentam microtúbulos localizados abaixo da
membrana plasmática, denominados de subpeliculares (De Souza, 2002). A análise
por MET revelou que a DB889 gerou alterações na organização de microtúbulos do
parasita, levando a perda parcial destas estruturas em amastigotas intracelulares,
além de induzir em tripomastigotas (formas não proliferativas) o aparecimento de
múltiplos flagelos. Dada a sua alta estabilidade, alterações na estrutura e
organização de microtúbulos subpeliculares e do axonema não são eventos
freqüentemente observados nestes parasitas, mesmo frente ao tratamento com
diferentes drogas (como a colchicina, a vimblastina; o taxol e herbicidas do tipo
dinitroanilina como a trifluralina e a chloralina) capazes de interferir nestas estruturas
em organismos superiores (Traub-Cseko e cols., 2001; Silva e cols., 2006), e assim,
os presentes dados de MET serão futuramente profundamente investigados por
outras ferramentas.
Discussão
49
Como a MET revelou importantes alterações nas mitocôndrias de parasitas
tratados, nossa última abordagem foi avaliar por citometria de fluxo as alterações
mitocondriais. Nossa análise confirmou os dados da MET que demonstraram que
amidinas reversas atuam sobre o complexo mitocôndria-cinetoplasto, induzindo
interferências no potencial de membrana mitocondrial dos parasitas, como já
descrito durante o tratamento de tripomastigotas com outras diamidinas (De Souza e
cols., 2006b; Mukherjee e cols., 2006). As alterações observadas no núcleo e
mitocôndria dos parasitas tratados possivelmente resultam da associação das
moléculas dicatiônicas ao DNA, em especial, ao kDNA que apresenta um rico
conteúdo de bases AT (Baselin e cols., 1998). Nossos resultados reforçam dados
anteriores que mostram a associação e interferência desta classe de MGBLs ao
kDNA de tripanosomatídeos (Werbovetz, 2006, Jean-Moreno e cols., 2006). Foi
proposto que a morte destes parasitas induzida por diamidinas, provavelmente é
resultado de uma série de eventos mitocondriais que incluem sua dilatação, como
presentemente observamos por MET, levando a dissipação do potencial de
membrana mitocondrial (como também presentemente observamos por citometria de
fluxo) e culminado pela fragmentação e destruição final do kDNA (Werbovetz, 2006).
Interessantemente, dados recentes do nosso grupo revelaram que um análogo da
furamidina, a DB569, é também capaz de induzir profundas alterações na
mitocôndria de tripomastigotas de T. cruzi, conduzindo-o a morte por um mecanismo
semelhante ao da morte programada do tipo I, ou apoptose (De Souza e cols.,
2006b).
Em resumo, na presente dissertação, observamos uma alta atividade das
amidinas reversas contra ambas formas do parasita presentes no hospedeiro
vertebrado (amastigotas intracelulares e tripomastigotas sangüíneos), em doses
(micromolares) que não afetam a viabilidade de células do mamífero. Nossos dados
corroboram estudos anteriores que avaliaram a atividade antileishmanicida de 71
moléculas dicatiônicas (contra formas promastigotas e amastigotas intracelulares de
L. donovani) e observaram uma superior atividade in vitro de amidinas reversas (em
doses sub-micromolares) em relação aos outros compostos estudados, alcançando
também excelentes resultados frente a infecções em camundongos, sendo mais
efetivas que pentamidina (Werbovetz e cols., 2001). Estudos semelhantes realizados
in vitro com T. brucei rhodesiense e T. cruzi também revelaram uma superior
atividade tripanolítica de amidinas reversas em relação a outras diamidinas, como
pentamidina e a DB75 (Stephens e cols., 2001b, 2003). Ensaios feitos com a cepa
Discussão
50
Brasil de T. cruzi também mostraram uma considerável atividade antiparasitária
destes fármacos contra tripomastigotas e amastigotas intracelulares, sendo DB709 a
mais efetiva, com IC
50
/4 d de 0,05 e 0,016µM, respectivamente, não apresentando,
contudo, toxicidade para células de mamíferos (Rowland e cols., 2003). Nos nossos
ensaios observamos que DB889 e DB702 foram as mais efetivas sobre amastigotas
intracelulares e tripomastigotas (frente à adição de sangue total). No entanto os
ensaios sobre células de mamíferos revelaram que o tratamento com a DB889
induziu menor índice de toxicidade, o que ressalta a promissora atividade tripanocida
da DB889 a ser testada em ensaios in vivo.
Assim, nossos dados sobre o efeito de amidinas reversas contra o T. cruzi
reforçam a busca e rastreamento de novos análogos que possam ser usados
sozinhos ou em combinações com outras drogas para o tratamento da doença de
Chagas. A alta atividade da DB889, efetiva em doses micromolares, estimula
estudos in vivo que serão em breve conduzidos.
Conclusões
53
CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÕES
Estima-se que cerca de dois bilhões de pessoas (aproximadamente 40% da
população mundial) estejam sob o risco de contrair doenças infecciosas como a
malária, leishmaniose e tripanossomíases, e que mais 300 milhões possam adquirir
infecções concomitantes (WHO, 2001; Watkins e cols., 2003). Sabe-se que a maioria
dos tratamentos em uso corrente contra agentes parasitários possui importantes
limitações devido ao elevado custo, baixa efetividade contra as diferentes formas
evolutivas do patógeno e/ou da doença, necessidade de múltiplas doses (em geral
por injeção), alta toxicidade com diversos efeitos colaterais, e perda de efetividade
frente a um grande número de cepas de parasitas resistentes a drogas (Coura & De
Castro, 2002; Wilson e cols., 2005). Apesar disso, ainda poucos recursos são
destinados para o desenvolvimento de novas drogas e/ou tratamento para doenças
negligenciadas, das quais a doença de Chagas faz parte. Menos de 10% dos
recursos financeiros no mundo são direcionados ás pesquisas referentes ás doenças
negligenciadas que atingem majoritariamente as populações menos favorecidas de
países em desenvolvimento e que representam 90% do crescimento das doenças
globais (Remme e cols., 2002). Segundo estes autores, o problema predominante da
grande maioria das doenças negligenciadas refere-se à ausência de efetivas
ferramentas de controle, pois a maioria das drogas disponíveis possui alta
toxicidade, elevado custo e baixa efetividade devido a crescente resistência dos
parasitas, além das limitações quanto ao diagnóstico e ausência de vacinas
eficazes. Assim, estudos têm sido desenvolvidos de modo a identificar vias
metabólicas e moléculas dos parasitas que possam representar importantes alvos
para o desenho e desenvolvimento de novos agentes tripanocidas (De Souza, 2002;
Nwaka & Hudson, 2006).
Alternativamente, outra importante estratégia relativa ao desenvolvimento e
descoberta de novas terapias contra doenças tropicais, refere-se ao teste de drogas
já usadas na clínica para outras doenças. Esta última estratégia é ainda a mais
freqüente e tem por principal vantagem a redução de custos e de tempo para o se
uso clínico, haja vista que nas últimas três décadas poucas foram as iniciativas e
programas financiados pelas industrias farmacêuticas visando o tratamento de
doenças tropicais (Nwaka & Hudson, 2006).
Conclusões
54
Com relação à doença de Chagas, os milhões de indivíduos infectados justificam
e reforçam o estudo e a identificação de novos compostos tripanocidas naturais ou
sintéticos que possam ser efetivos contra o parasita, e que apresentem baixa ou
mesmo ausência de toxicidade. Este tema foi o objetivo principal da presente
dissertação relativa a atividade in vitro de amidinas reversas contra T. cruzi, cujos
resultados nos permitem destacar as seguintes conclusões:
1. Amidinas reversas, resultantes de alterações nos grupamentos amidinas
(centros catiônicos) de diamidinas, exibem excelente atividade sobre formas
amastigotas e tripomastigotas de T. cruzi in vitro, em doses micromolares,
que não afetam a viabilidade de células de mamíferos.
2. Pequenas variações na estrutura química das amidinas resultaram em
diferenças significativas na sua potência anti-parasítica: as ARs DB889 e
DB702 apresentaram superior atividade anti-parasítica na maioria dos
sistemas testados (diferentes formas evolutivas, estoques do parasita, sob
diferentes temperaturas e frente a adição de sangue) em relação as outras
amidinas testadas (DB786 e DB811)..
3. Não houve diferenças significativas sobre o efeito in vitro das ARs sobre os
dois estoques de T. cruzi testados (Y e DM28c) apesar de dados anteriores
terem revelado diferenças no perfil de susceptibilidade frente a ação de outras
diamidinas aromáticas.
4. A análise do efeito das drogas contra tripomastigotas em presença de sangue
total, visando seu potencial uso em bancos de sangue, mostrou uma
diminuição na atividade tripanocida dos compostos (em especial das amidinas
DB889 e DB786) possivelmente devido à sua associação a componentes
plasmáticos, como já relatado frente ao tratamento de parasitas com outros
fármacos.
5. Ensaios de citotoxicidade in vitro revelaram perda da viabilidade celular
somente frente a altas doses das drogas (>32 µM) havendo, contudo,
diferenças relacionadas ao perfil de susceptibilidade entre células de
Conclusões
55
linhagem e células de cultivo primário, demonstrando a importância de se
avaliar citoxicidade utilizando-se este último tipo celular.
6. Como já observado frente à incubação de tripanosomas com diamidinas
aromáticas, a análise por microscopia eletrônica de transmissão (MET)
revelou que o tratamento com as amidinas reversas induziu importantes
alterações ultra-estruturais em amastigotas e tripomastigotas de T. cruzi,
principalmente no núcleo e mitocôndria dos parasitas tratados.
7. A MET demonstrou que a amidina DB889 foi capaz de induzir um intenso
“shedding” de membranas na região da bolsa flagelar de amastigotas de T.
cruzi, o que sugere uma maior atividade exocítica frente ao tratamento pela
amidina, como já relatado frente à incubação destes parasitas com outros
compostos.
8. A análise por MET também revelou que a DB889 induziu alterações na
organização de microtúbulos do T. cruzi, gerando aparecimento de múltiplos
perfis de axonemas em tripomastigotas.
9. A análise por citometria de fluxo corroborou os dados de MET revelando
alterações em mitocôndrias (perda do potencial de membrana mitocondrial)
do T. cruzi frente ao tratamento com as ARs.
10. Todas as amidinas testadas revelaram-se mais efetivas (doses micro e
mesmo nanomolares) quando comparadas a diguanidina, corroborando dados
anteriores realizados em tripanosomatídeos que revelaram a promissora ação
de amidinas reversas sobre estes parasitas.
11. O efeito de amidinas reversas contra o T. cruzi reforça a busca e
rastreamento de novos análogos que possam ser usados sozinhos ou em
combinações com outras drogas para o tratamento da doença de Chagas.
12. A alta atividade da amidina DB889 sobre tripomastigotas (mesmo em
presença de sangue) e amastigotas de T. cruzi, associada a sua baixa
toxicidade, estimula estudos in vivo que serão em breve conduzidos.
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ANEXO I
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Dear Dr. Soeiro,
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Thank you for choosing Biochemical Pharmacology.
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Lynn LeCount
Managing Editor
Biochemical Pharmacology Editorial Office
.$ 0
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Ref.: Ms. No. BCP-D-07-00053
Activity of "reversed" diamidines against Trypanosoma cruzi
"in vitro"
Dear Dr. Soeiro,
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Biochemical Pharmacology.
Sincerely,
Lynn LeCount, CMA
Managing Editor
Biochemical Pharmacology Editorial Office
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ANEXO II
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1
1
Cellular Effects of Reversed Amidines on Trypanosoma cruzi 2
3
4
Running title: T. cruzi treatment with reversed amidine 5
6
7
C.F. Silva
1
, M.B. Meuser
1
, E.M. De Souza
1
, M.N.L. Meirelles
2
, C.E. Stephens
3
,
P. Som
3
,
8
D.W. Boykin
3
, and M.N.C. Soeiro
1*
. 9
10
11
12
13
Lab. Biologia Celular
1
, Lab. Ultra-estrutura Celular
2
- Instituto Oswaldo Cruz, 14
FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil and Department of Chemistry
3
, Georgia State 15
University, Atlanta, GA,30303 USA.
16
17
18
19
20
21
*Corresponding author. Mailing address: Lab. de Biologia Celular, Dept. de Ultra-22
estrutura e Biologia Celular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Av. Brasil 4365, 23
21040-900, Rio de Janeiro, RJ, Brazil. Phone: 0055 21 2598-4331. Fax: 00 55 21 24
2260-4434. email: [email protected] 25
26
27
2
Abstract 28
Aromatic diamidines represent a class of DNA minor groove-binding ligands that 29
exhibit high antiparasitic activity. Since the chemotherapy for Chagas disease is still 30
an unsolved problem, and previous reports for diamidines and related analogues 31
show high activity against both in vitro and in vivo T. cruzi infection, our present aim 32
was to evaluate the effect in vitro of three reversed amidines (DB889, DB 702 and 33
DB 786) and one diguanidine (DB711), against both amastigotes and bloodstream 34
trypomastigotes of T. cruzi, the aetiological agent of Chagas disease. Our data 35
shows higher activity for the reversed amidines compared to the diguanidine with the 36
following order of trypanocidal activity: DB889 > DB 702 > DB 786 > DB711. 37
Transmission electron microscopy analysis showed that the reversed amidines 38
induced many alterations in the nuclear morphology, dilatations of the endoplasmatic 39
reticulum and Golgi structures and consistent damages in the mitochondria and 40
kinetoplasts of the parasites. Interestingly, in trypomastigotes treated by the reversed 41
amidine DB889, multiple axoneme structures (flagellar microtubules) were curiously 42
noted. Flow cytometry analysis confirmed that the treated-parasites presented an 43
important loss of the mitochondrial membrane potential revealed by a decrease in the 44
Rh123 fluorescence. Our results show promising activity for reversed amidines 45
against the relevant mammalian forms of T. cruzi, displaying high trypanocidal effect 46
at very low doses especially for DB889, which merits further in vivo evaluation. 47
48
49
50
3
INTRODUCTION 51
Aromatic diamidines are DNA minor groove-binding ligands (MGBLs), which 52
present striking broad-spectrum antimicrobial effects (26). Although this class of 53
compounds displays significant in vitro and in vivo activity against fungi, amoeba, 54
bacteria and especially protozoan parasites, certain structures can show toxicity 55
towards mammalian cells (21). In addition, aromatic diamidines in general lack oral 56
bioavailability, which limits their use (26). To overcome these limitations, prodrugs 57
such as the methamidoxime prodrug of furamidine (DB289), which is currently 58
undergoing phase III clinical trials against human African trypanosomiasis, have 59
been developed (27). Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas’ disease, 60
a zoonosis considered a major public health problem in the developing countries of 61
Central and South America (14). The disease is widespread in endemic areas of 62
Latin America and it has been estimated that the overall prevalence of human 63
infection is about 17 million cases and that approximately 120 million people are at 64
risk of contracting the infection (28). However, up to now there is neither an effective 65
vaccine nor a satisfactory treatment for the disease. Drug therapy depends mostly 66
upon nitrofurans and nitroimidazoles such as nifurtimox and benznidazole (4, 24, 25). 67
Our previous studies revealed that furamidine and its N-phenyl substituted 68
analogue (DB569) display activity against two kinetoplastid haemoflagellate 69
members of the family Trypanosomatidae: T. cruzi and L. (L) amazonensis. Although 70
both compounds have equivalent DNA binding properties, the phenyl-substituted 71
analog exhibited higher activity against both parasites (8). DB569 was found to 72
reduce the cardiac parasitism of T. cruzi-infected mice and also displayed increased 73
survival rates (9). In the present study we analyze the trypanocidal efficacy of three 74
reversed amidines and one diguanidine against both intracellular amastigotes as well 75
as bloodstream trypomastigotes of T. cruzi in vitro. Furthermore, by employing 76
4
transmission electron microscopy and flow cytometry we identify possible targets of 77
the drugs in the treated parasites. 78
79
5
MATERIALS AND METHODS 80
Drugs. The syntheses of DB702 and the diguanidine DB711 have been reported 81
(22) and the synthesis of DB786 and DB889 was achieved by the same approach 82
(Fig. 1). Stock solutions (5 mM) of the drugs were prepared in DMSO 83
(dimethylsulphoxide) and fresh dilutions were prepared extemporaneously. 84
Parasites and cell cultures. Y stock of Trypanosoma cruzi was used throughout 85
the experiments. Cell culture-derived trypomastigotes were isolated from the 86
supernatant of Vero lineage cells (from green monkey kidney), which have been 87
previously infected with trypomastigote forms (8). Bloodstream trypomastigotes were 88
harvested by heart puncture from T. cruzi-infected Swiss mice at the parasitaemia 89
peak day (17). For the analysis of drug effect upon intracellular amastigotes, Vero 90
cells were seeded at a density of 10
5
cell/well into 24-well culture plates and 91
sustained in RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute- Sigma Aldrich. – USA) 92
medium supplemented with 5% fetal bovine serum and 1 mM L-glutamine. After 24 93
hours of plating, the cultures were infected for 24 hours at 37°C with tissue-cultured 94
trypomastigotes, employing parasite: host cell ratio of 10:1. To determine the toxicity 95
of the drugs towards mammalian cells, Vero cells were seeded at a density of 5 x10
4
96
cell/well into 96-well culture plates and sustained in RPMI 1640 medium 97
supplemented with 5% fetal bovine serum and 1 mM L-glutamine. All the cell cultures 98
were maintained at 37°C in an atmosphere of 5% CO
2
and air and the assays were 99
run 3 times at least in duplicates. All procedures were carried out in accordance with 100
the guidelines established by the FIOCRUZ Committee of Ethics for the Use of 101
Animals (CEUA 0099/01), resolution 242/99. 102
Drug assays. For the analysis of the effect of the drugs upon the bloodstream 103
trypomastigote forms, the isolated parasites were incubated at 37°C for 2 and 24 104
6
hours in the presence or not of increasing doses (0.0016-32 µM) of each compound 105
diluted in Dulbecco’s modified medium supplemented with 5% fetal bovine serum 106
and 1 mM L-glutamine (DMES). After drug incubation, the trypomastigote death 107
rates were determined by light microscopy through the direct quantification of the 108
number of live and viable parasites (displaying typical motility and morphology as 109
well) using a Neubauer chamber. For the analysis of the effect of the drugs upon 110
intracellular amastigotes, after the initial host cell-parasite contact (24 hours), the 111
cultures were washed to remove free parasites and treated or not for 24 hours at 112
37°C with graded concentrations (0.0014-10.6 µM) of the drugs. All the cell cultures 113
were maintained at 37°C in an atmosphere of 5% CO
2
and air. Following the 114
treatment, the infected cultures were fixed and processed as above described for 115
ultrastructural analysis, or fixed in Bouin’s, stained with Giemsa solution as 116
previously reported (1) and the mean number of infected host cells and of parasites 117
per infected cells was then scored. Only characteristic parasite nuclei and 118
kinetoplasts were counted as surviving parasites since irregular structures could 119
mean parasites undergoing death. The drug activity was estimated by calculating the 120
endocytic index (EI - percentage of infected cells versus mean number of parasite 121
per infected cell). 122
Flow cytometry analysis. Bloodstream trypomastigotes (2×10
6
cells/ml) were 123
washed in phosphate buffered-saline and treated for 24 hours at 37°C with the 124
respective IC 50 (previously determined) of each compound diluted in DMES. After 125
treatment, the parasite suspension was incubated for 15 min at 37°C with 10 g/ml 126
rhodamine 123 (Rh123). Then the samples were immediately kept on ice until 127
analysis, as reported (20). Data acquisition and analysis were performed in a 128
FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, US) equipped with 129
the Cell Quest software (Joseph Trotter, Scripps Research Institute, San Diego, CA, 130
7
US). A total of 10,000 events were acquired in the region established as that 131
corresponding to the bloodstream trypomastigotes and the alterations in the Rh123 132
fluorescence were quantified by calculating the mean percentage of treated and 133
untreated parasite population that displayed depolarization of the mitochondrial 134
membrane (marked as M2). All assays were run 3 times at least in duplicates and 135
Student's t-test was applied to ascertain the statistical significance of the observed 136
differences (p<0.05). 137
Cytotoxicity assays. Uninfected Vero cells were incubated for 24h/37ºC in 138
presence or not of increasing doses (10-96 µM) of the drugs, and then their 139
morphology and viability were evaluated by light microscopy using the trypan blue 140
exclusion assay. 141
Ultrastructural analysis. 10
8
bloodstream trypomastigotes were treated or not 142
for 24 h at 37°C with the corresponding IC50 concentration of each drug. After 143
incubation, the parasites were fixed for 60 min at 4 °C with 2.5% glutaraldehyde
and 144
2.5 mM CaCl
2
in 0.1 M cacodylate buffer, pH 7.2 and post-fixed
for 1 h at 4 °C with 145
1% OsO
4
, 0.8% potassium ferricyanide
and 2.5 mM CaCl
2
using this same buffer. 146
Then, the samples were routinely processed for transmission electron microscopy 147
(TEM) and examined in a Zeiss EM10C electron microscope (Oberkochen, 148
Germany). 149
150
8
RESULTS 151
Our previous report showed the trypanocidal effect of furamidine and its N-152
phenyl-substituted analog (DB569) upon T. cruzi in vitro as well as in vivo (8,9). Due 153
to the activity of these aromatic diamidines, especially that of DB569, our first 154
approach in the present study was to evaluate the activity of three different reversed 155
amidines (DB889, DB702 and DB786), and one structurally related diguanidine 156
(DB711) against bloodstream trypomastigotes of T. cruzi. Our results showed that 157
DB889 displayed a dose and time-dependent trypanocidal effect: as early as after 2 158
hours of incubation with 1.18 µM we found about 55% of parasite lysis, reaching a 159
100% of death after 24 hours of treatment with 3.5 µM (Fig. 2A). Similar data were 160
noted when the trypomastigotes were incubated for 2 hours with the other two 161
reversed amidines: 55 and 50% parasite death for DB702 and DB786, respectively. 162
However, when the parasites were incubated for 24 hours with 3.5µM, both drugs 163
reduced the number of viable parasites by about 95% (Fig. 2B and 2C). In fact, 164
DB786 was extremely effective even under nanomolar doses: the treatment of 165
bloodstream forms for 24 hours with 0.014µM DB786 lead to about 49% of parasite 166
death (Fig.2C Inset). DB711 was the less effective, presenting 23 and 84% of death 167
with 32 µM after 2 and 24 hours of parasite drug exposure, respectively (Fig. 2D). 168
Based on the IC
50
/24h values established for each drug (Table), the bloodstream 169
trypomastigotes were treated and processed for transmission electron microscopy to 170
investigate morphological damage induced by the compounds studied at the 171
ultrastructural level. Untreated parasites presenting typical organelles such as the 172
endoplasmatic reticulum, nucleus, mitochondria and flagellum (arrow) can be easily 173
identified (Fig. 3A). Note the single giant mitochondrion that branches throughout the 174
parasite and contains a large condensation of mitochondrial DNA, called the 175
9
kinetoplast, which has a basket-like shape characteristic of the trypomastigotes (Fig. 176
3B). The treatment of the bloodstream trypomastigotes for 24 h with the reversed 177
amidines (DB889, DB702 and DB786) caused several alterations mostly related to: 178
dilatations of the endoplasmatic reticulum (Fig. 3C) and Golgi (Fig. 3D, inset); 179
mitochondrial swelling with presence of membranous structures and disorganization 180
of the kinetoplast (Fig. 3C, 3D, 3E and 3F), profound alterations in the nuclear 181
morphology including membrane dilatations (Fig. 3C, 3D and 3F), and in addition 182
intense vacuolization of the cytoplasm (Fig. 3F). An interesting finding was that 183
parasites treated with DB889, the most effective compound, presented profound 184
alterations related to the microtubule organization (Fig. 3F, inset) including showing 185
multiple axoneme structures (flagellar microtubules) (Fig. 3C and 3F, arrow). The 186
analysis of DB711-treated trypomastigotes also showed alterations related to the 187
mitochondria-kinetoplast complex (Fig. 3H), besides intracellular dilated membrane 188
profiles (Fig. 3G). 189
As the ultrastructural findings revealed frequent and extensive mitochondrial damage, 190
we next assayed by flow cytometry analysis if these drugs could interfere with the 191
mitochondrial membrane potential of the parasites as reported after treatment of T. 192
cruzi by other aromatic diamines (10). The incubation of bloodstream trypomastigotes 193
with the reversed amidines resulted in an important decrease of the mitochondrial 194
membrane potential (MMP), as noticed by the low fluorescence intensity peaks 195
marked as M2 (Fig.3I-L). The mean and standard deviation analysis of three 196
independent assays confirmed that the treatment with DB889, DB702 and DB786 197
statistically reduced the MMP in about 59±11 (p<0.014), 54±5 (p<0.011), and 198
55±4.5% (p<0.009) of the bloodstream forms, contrasting to the untreated group, 199
where only about 17±13% of the parasites already displayed decreased MMP. On 200
the other hand, the treatment of the parasites with the diguanidine DB711 did not 201
10
result in statistically significant (p<0.31) reduction of MMP (data not shown). 202
Since amastigotes represent the multiplicative intracellular forms of T. cruzi found 203
in the mammalian hosts and literature data points to variations in chemotherapic 204
activity towards different forms of the parasite (18), we then investigated the effect of 205
these reversed amidines as well as the diguanidine on amastigotes lodged within cell 206
cultures. However, in order to rule out toxic effects of the drugs on the host cell, 207
different doses of the compounds were incubated with uninfected host cells and the 208
cell viability was determined. Since our data (data not shown) only showed 209
mammalian cell toxicity when the cultures were treated with doses higher than 32 210
µM, the assessment of the antiparasitic activity of the compounds against the 211
intracellular forms of the parasites was performed at <32 µM for each drug. 212
In addition, as the compounds were solubilized in dimethylsulphoxide (DMSO), we 213
also evaluated the direct effect of DMSO on the T. cruzi infection. Our results 214
showed that the incubation with 0.64% DMSO (highest final concentration) neither 215
altered the percentage of infected host cells nor the number of parasites per infected 216
cell (Fig. 4B). Our data showed that after 24 hours of treatment with DB889, the EI 217
was reduced by about 46 and 83% with the doses of 0.0014 and 0.33 µM (Fig. 4C 218
and 4G). The incubation of the infected cultures with DB702 also reduced the EI but 219
was less effective as compared to DB889: The dose of 0.33 µM reduced the EI by 220
61.5% (Fig. 4D and 4H), reaching about 82% of reduction in doses ≥ than 3 µM (Fig. 221
4H). DB786 was the least effective reversed amidine tested: with 0.33 µM we noted 222
only 15% of EI reduction (Fig. 4E and 4I), and only doses ≥ 10 µM inhibited about 223
86% of the EI of the infected and treated cultures (Fig. 4I). The diguanidine DB711 224
was even less effective only displaying about 10% of EI reduction even after 225
treatment with the higher dose (10.6 µM) (Fig. 4F and 4J). 226
11
We next evaluated by transmission electron microscopy the alteration induced 227
by the compounds, with doses corresponding to the IC50 values (Table), upon 228
intracellular amastigotes localized within the host cells. Ultrastructural image of 229
untreated intracellular amastigote shows typical structures such as nucleus, 230
mitochondria (within the characteristic kinetoplast in the shape of bar), flagellar 231
pocket and flagellum (Fig. 5A and 5B). As noted during the treatment of the 232
bloodstream trypomastigotes (Fig. 3), alterations related to the amastigotes nuclei 233
and mitochondria were always the most common and frequent effects induced by the 234
reversed amidine (Fig. 5). Besides these alterations in the mitochondria (swelling, 235
disorganization of the kinetoplast and presence of low eletrodense structures) (Fig. 236
5D and 5E), and in the nuclear morphology (Fig. 5C), other effects also included the 237
vacuolization and loss of the cytoplasm components (Fig. 5C, asteriks), 238
disorganization of the subpellicular microtubules, which are absent in distended 239
membrane areas (Fig. 5H), and an intense vesicular profiles in the flagellar pocket 240
(Fig. 5F and 5G). 241
242
12
DISCUSSION 243
The protozoan parasite Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas 244
disease, an illness that kills at least 50000 individuals every year in endemic areas of 245
Latin America (24). The conventional treatment of Chagas’ disease depends upon 246
nitrofurans and nitroimidazoles (Nifurtimox and beznidazole) that are not satisfactory 247
due to their inefficiency in the chronic phase, their serious side effects and the need 248
of administration under medical supervision (4, 24). These arguments justify an 249
urgent search for new compounds for the treatment of the Chagasic patients and 250
diamidines are considered potential drugs since they present broad-spectrum activity 251
against several parasitic agents both in vivo and in vitro (21). In the present study we 252
explored the effects on the parasite targets for three “reversed” amidines and one 253
diguanidine, which display related structures. Our data suggest that small variation in 254
chemical structure can result in significant differences in the antiparasitic potency: 255
even after short periods of incubation (2 hours) the three amidines displayed much 256
higher potency (with very low micromolar doses) against both forms of T. cruzi as 257
compared to the diguanidine-treated parasites. 258
In our present transmission electron microscopy (TEM) analysis, all reversed 259
amidines, and to a lesser extent the diguanidine, induced marked and frequent 260
alteration in the nuclei and mitochondria of both amastigotes and trypomastigotes. 261
These ultrastructural alterations corroborate previous reports with pentamidine and 262
analogues for in vitro treatments of L. (L) amazonensis (5), L. tropica (13), L. major 263
(11), T. cruzi (8) as well as in vivo treatment of L. donovani and L. major in mouse 264
models (16), suggesting a common mechanism of action, at least with part, for these 265
dicationic compounds. 266
13
The flow cytometry analysis corroborated the TEM confirming that reversed 267
amidines act on the mitochondria-kinetoplast complex. The alterations indicate an 268
interference with the proton electrochemical potential gradient of the mitochondrial 269
membrane of the parasites as previously reported during the treatment of 270
trypomastigotes with other diamidine compounds (10). The perturbations of the 271
kinetoplast may result from dication binding to catenated kDNA, which has a high AT 272
content (2) reinforcing the concept that this class of MGBLs interferes with the kDNA 273
of the trypanosomatids. In fact, the exact mode (s) of action of the diamidines 274
towards trypanosomatids is still unclear but strong evidence indicates that these 275
MGBLs interfere in the kinetoplast function through selective association to the 276
unique AT rich regions of the kinetoplastids minicircle kDNA, perhaps involving DNA-277
processing enzymes (26). Recent reports show that at least part of the 278
antileishmanial activity of pentamidine can also be related to the selective action of 279
drug against Leishmania kinetoplast and/or nuclear toposoimerase I, which may 280
represent some of the drug’s targets (15). It has been proposed that although the 281
lethal event has not been fully determined, the death of diamidine-treated 282
kinetoplastids is probably a result of a series of occurrences, which involves the 283
mitochondrial dilatation, as we presently noted, caused by the dissipation of the 284
membrane potential leading to the final destruction of the kDNA (26). A recent report 285
showed that a N-phenyl-substituted analog of furamidine induces profound 286
mitochondrial alteration in the drug-treated trypomastigotes of T. cruzi leading to the 287
parasite apoptosis-like death (10). 288
A curious and unique finding was that DB889 lead to profound alteration in T. 289
cruzi microtubules’ organization: the drug provoked partial loss of the subpellicular 290
microtubules in the intracellular amastigotes and induced an unusual organization of 291
multiple flagella in the non proliferative stage, trypomastigote. It is known that the 292
14
microtubules in trypanosomes are the main component of the flagellar axoneme and 293
of the subpellicular microtubule corset, whose relative positions determine the 294
morphology of each cell stage of the life cycle of these parasites (12). All members of 295
the Trypanosomatidae family display a flagellum that emerges from the flagellar 296
pocket, showing a basic structure of 9 + 2 axonemal microtubules (7). Alterations in 297
the structure and organization of microtubules are not a common event noted in 298
these parasites even after treatment with different types of drugs. Since, the 299
development of strategies to interfere with these important structures represent a 300
unique chance of providing a new chemotherapeutic approach, further investigations 301
are under way to seek to more fully understand this observation. 302
TEM also showed that DB889 induced a shedding of membranes near the 303
flagellar pocket of the intracellular amastigotes suggestive of higher exocytic activity 304
of the parasites since the flagellar pocket is one of the main sites where endocytosis 305
and exocytosis take place in trypanosomatids. Similar alterations have been reported 306
in T. cruzi (3) and other kinetoplastids (19) when subjected to treatment with other 307
drugs. This issue deserves further investigation. 308
Due to well-known side effects, low bioavailability and the requirement of 309
parenteral administration of the aromatic diamidines, the search for novel aromatic 310
dications has been intensively investigated (26). However, these previous studies 311
have largely focused on African trypanosome infections and few studies have been 312
designed to investigate the potential effect of aromatic diamidines against T. cruzi 313
(21, 26). As already reported by others (23), we also found a high activity of the 314
“reversed” amidines against T. cruzi upon the parasite forms present in the vertebrate 315
hosts (intracellular amastigotes and bloodstream trypomastigotes), at very low 316
micromolar doses that do not affect the mammalian cells viability. The mechanism by 317
15
which these dicationic molecules reach the intracellular milieu remains largely 318
unknown and it is possible that the nuclear membrane of the parasite (presently 319
found with striking alterations), as well as the mitochondrial membrane, may be more 320
permeable to dications than the nuclear membrane of mammalian cells. In fact, 321
specific transporters have been characterized for pentamidine in trypanosomatids 322
such as T. brucei (6). 323
The high activity of DB889, effective at low micromolar doses, warrants further 324
in vivo studies in experimental models with the goal of establishing an effective 325
scheme of therapy of T. cruzi infection. 326
16
ACKNOWLEDGMENTS 327
The financial support of FIOCRUZ, PAPES IV, CNPq, DECIT/SCTIE/MS and MCT, 328
by CNPq, and FAPERJ is gratefully acknowledged. Support by the Bill and Melinda 329
Gates Foundation to DWB is gratefully acknowledged. The authors thank Dr. Mirian 330
Claudia de Souza Pereira (LUC/IOC/FIOCRUZ) for the careful revision of the 331
manuscript. 332
333
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424
20
LEGEND TO FIGURES 425
Fig. 1: Structures of the four drugs used in this study. 426
Fig. 2: Activity of DB889 (A), DB702 (B), DB786 (C) and DB711 (D) on 427
trypomastigote forms of T. cruzi. The percentage of dead parasites was measured 428
after 2 and 24 hours of treatment by light microscopy. 429
Fig. 3: Transmission electron micrographs (A-H) and flow cytometry (I-M) analysis of 430
trypomastigote forms of T. cruzi submitted to drugs treatment. A-B: Untreated 431
parasites; C, D and F: DB889-treated parasites, E: DB702-treated parasites; G-H: 432
DB711-treated parasites. Note the swelling mitochondria and kinetoplast (C- F and 433
H), the alterations of the morphology nuclear (C, D and H) and in the microtubule 434
organization (F, inset). Multiple flagellar structures (C and F, arrow); dilated 435
membrane profiles (G, asteriks) can be found. I-M: Histograms show a representative 436
assay displaying the fluorescence intensity of untreated (I) and diamidine treated-437
parasites after their incubation with Rh123: (J) DB889, (K) D702; (L) DB786; and (M) 438
DB711. The high fluorescence intensity peaks are marked as M1, whereas the low 439
fluorescence intensity peaks, which represent decreased mitochondrial membrane 440
potential, are marked as M2. kinetoplast (k); mitochondria (m); nucleus (n); 441
endoplasmatic reticulum (er) and Golgi (g). Bar = A-H: 1 µm, H inset: 0.5µm. 442
Fig. 4: Analysis of the effect of drug treatment in T. cruzi-infected cultures. Light 443
microscopy view of T. cruzi-infected Vero cells (A-F): untreated (A) or treated for 24 444
hours with (B) DMSO; (C) DB889, (D) DB702, (E) DB786 and (F) DB711. G-J: Mean 445
values of the endocytic index (EI) in (G) DB889, (H) DB702, (I) DB786 and (J) 446
DB711- treated cultures exposed to increasing doses of the drugs. A-F: Arrow: 447
intracellular parasites. Bar = 10 µm 448
21
Fig. 5: Transmission electron micrographs of intracellular amastigotes of T. cruzi. 449
Untreated parasites (A and B) or treated with (C) DB889, (E) DB702 and (G and H) 450
DB786. Note alterations in the nuclear morphology (C), vacuolization and loss of the 451
cytoplasm components (C, asterisk); disorganization of the kinetoplast (D), swelling 452
and presence of low eletrondense structures in the mitochondria (E), intense 453
vesicular profiles in the flagellar pocket (F-G - arrow) and disorganization of the 454
subpellicular microtubules (H - arrowhead). Nucleus (n), mitochondria (m); 455
kinetoplast (k) and flagellar pocket (fp). Bar = A: 0.5µm; B-H: 1 µm. 456
457
O
N
H
N
H
O
NHNH
O
NN
CH
3
H
3
C
CH
3
H
3
C
H
3
C
CH
3
O
N
H
N
H
CH
3
NHNH
H
3
C
D
B
7
0
2
NN
O
N
H
N
H
NHNH
D
B
8
1
1
NN
Cl
Cl
O
N
H
N
H
NHNH
D
B
8
8
9
NN
O
N
H
N
H
OCH
3
NH
NH
2
H
2
N
NH
H
3
CO
DB889
DB811
DB786
DB711
DB702
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Drug concentration (µM)
% parasite death
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Drug concentration (µM)
% parasite death
2h 24h
0
50
100
Drug concentration (µM)
% parasite death
2h 24h
0
50
100
Drug concentration (µM)
% parasite death
2h 24h
B
C D
A
0 4 8 12 16 20 24 28 32 0 4 8 12 16 20 24 28 32
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Drug concentration (µM)
% parasite death
2h 24h
0
50
100
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Drug concentration (µM)
% parasite death
2h 24h
0
50
100
Drug concentration (µM)
% parasite death
2h 24h
0
50
100
Drug concentration (µM)
% parasite death
2h 24h
B
C D
A
0 4 8 12 16 20 24 28 32 0 4 8 12 16 20 24 28 32
I
J K
L M
A
B
C
D
F
G
H
E
±
±
±
±
±
G
I
A
D
B
E
C
F
0
50
100
150
200
250
300
350
Drug concentration (µM)
EI
0
50
100
150
200
250
300
350
Drug concentration (µM)
EI
0
50
100
150
200
250
300
350
0 0.33 1.18 3.5 10.6
Drug concentration (µM)
EI
0
50
100
150
200
250
300
350
Drug concentration (µM)
EI
H
J
0 0.33 1.18 3.5 10.6
0 0.33 1.18 3.5 10.6
0 0.33 1.18 3.5 10.6
G
I
A
D
B
E
C
F
0
50
100
150
200
250
300
350
Drug concentration (µM)
EI
0
50
100
150
200
250
300
350
Drug concentration (µM)
EI
0
50
100
150
200
250
300
350
0 0.33 1.18 3.5 10.6
Drug concentration (µM)
EI
0
50
100
150
200
250
300
350
Drug concentration (µM)
EI
H
J
0 0.33 1.18 3.5 10.6
0 0.33 1.18 3.5 10.6
0 0.33 1.18 3.5 10.6
A
B
C
D E
F
G
H
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