( PDF ) Papel e mecanismos da hiperreatividade brônquica na infecção causada por Strongyloides venezuelensis em ratos

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CAROLINE MARCANTONIO FERREIRA

PAPEL E MECANISMOS DA HIPERREATIVIDADE BRÔNQUICA

NA INFECÇÃO CAUSADA POR Strongyloides venezuelensis EM

RATOS

BELO HORIZONTE – MG

2007

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CAROLINE MARCANTONIO FERREIRA

PAPEL E MECANISMOS DA HIPERREATIVIDADE BRÔNQUICA

NA INFECÇÃO CAUSADA POR Strongyloides venezuelensis EM

RATOS

Tese apresentada como parte dos requisitos para

obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, área

de concentração Fisiologia: Programa de Pós-Graduação

em Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de

Minas Gerais.

Orientador: Prof. Dr. Mauro Martins Teixeira

Co-orientador: Profa. Dra. Deborah Negrão-Correa

BELO HORIZONTE – MG

2007

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Dedico este trabalho a Fernando

Augusto de Oliveira Ribeiro, meu

esposo, pela compreensão e incentivo

durante esta caminhada.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todas as pessoas que contribuíram para meu crescimento

profissional e pessoal, e de maneira especial:

À Deus e a minha família, pelo apoio e por ser a base de minhas conquistas.

Ao meu orientador Mauro Martins Teixeira, pelo estimulo, confiança e pelos

momentos engraçados (ele é naturalmente engraçado). Uma pessoa muito

humana e totalmente família, características que podem não ser fundamentais

para um orientador, mas com certeza são para uma pessoa de bem.

À professora Déborah pelos ensinamentos e competente orientação na área de

parasitologia.

Aos amigos do laboratório de parasitologia e imunofarmacologia, por toda ajuda

nos experimentos e criticas.

Agradeço também aos meus orientadores no exterior Lawrence H. Pinto e Julian

Solway por todo confiança, ensinamento e oportunidade.

Ao CNPq, que financiou grande parte do meu doutorado.

Às minhas eternas amigas Patrícia de Paula, Maria Camila Almeida e Daniela

Oliveira pelo incentivo desde o mestrado.

RESUMO

Alterações funcionais pulmonares e sintomas pulmonares têm sido descrito em

pacientes infectados por helmintos com ciclo pulmonar. Previamente foi

demonstrado que a infecção com nematódeo Strongyloides venezuelensis induz

um significante aumento na hiperreatividade brônquica em ratos infectados. O

objetivo do presente estudo foi testar a hipótese que a broncodilatação durante a

fase de migração da larva pelo pulmão favorece o ciclo parasitário e o numero

de vermes que alcança o intestino. Para este propósito, ratos infectados com S.

venezuelensis foram tratados com salbutamol durante as primeiras 48 horas

após a infecção. A dose de salbutamol utilizada (0.25 mg/mL por 10 min a cada

4 horas) preveniu mudanças na função pulmonar durante a migração

parasitária. Isto foi acompanhado por um aumento de parasitos nos pulmões e

intestino. Em seguida investigamos os mecanismos da hiperreatividade

brônquica e observamos que IL-13 não é essencial para essa alteração

funcional pulmonar, mas é importante para produção de ovos no intestino. Por

outro lado, as fibras nervosas sensoriais sensíveis a capsaicina mostram

relevante papel na hiperreatividade brônquica independente da inflamação

pulmonar.

Palavras Chaves: S. venezuelensis, hiperreatividade brônquica, infecção,

capsaicina, fibras C, inflamação neurogênica e IL-13

ABSTRACT

Alterations in lung function and pulmonary symptoms have been described in

patients infected with helminthes with a lung cycle. We have previously shown

that infection with the nematode Strongyloides venezuelensis induced a

significant increase in airway hyperreactivity in infected rats. The aim of the

present study was to test the hypothesis that bronchodilation during the lung

phase of parasite migration would favor completion of the life cycle and infection

indices. For this purpose, Strongyloides venezuelensis infected rats were treated

with salbutamol during the first 48 h after the nematode infection. At the dose

used (0.25 mg/mL for 10 min every 4 h), treatment with salbutamol prevented

changes in lung function during the parasite migration. This was accompanied by

a significant increase in parasite burden, as assessed in the lung and the small

intestine. We also investigated the mechanisms of airway hyperresponsiveness

and observed that IL-13 does not have effect on this lung alteration. On the other

hand, sensory C fibers have an important role in the airway hyperresponsiveness

independent of lung inflammation.

Keywords: Strongyloides venezuelensis; Airway responsiveness; inflammation;

infection, capsaicin, C Fibers, neurogenic inflammation and IL-13

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO

1. Parasito: Strongyloides venezuelensis e Strongyloides stercoralis...

2. Definição e avaliação da hiperreatividade brônquica.........................

3. Hiperreatividade brônquica e asma....................................................

4. Fase pulmonar da infecção e hiperreatividade brônquica causada

por helminto........................................................................................

5. Interleucina 13 e inflamação pulmonar..............................................

6. Interleucina 13 e infecção por nematódeos.......................................

7. Terminações nervosas sensitivas e sensíveis à capsaicina nas vias

aéreas................................................................................................

JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

1. Justificativa.........................................................................................

2. Objetivo geral.....................................................................................

3. Objetivos específicos.........................................................................

MATERIAL E MÉTODOS

1. Animais...............................................................................................

2. Parasito..............................................................................................

3. Obtenção da larva filarióide................................................................

4. Modelo experimental de asma...........................................................

5. Tratamento com salbutamol...............................................................

6. Tratamento com anticorpo monoclonal anti-IL-13..............................

7. Tratamento neonatal com capsaicina................................................

8. Resposta da dor à formalina sobre o tempo de resposta

comportamental (teste de “licking time”)............................................

9. Avaliação parasitológica da infecção.................................................

10. Cultura dos parasitos.........................................................................

11. Medida da função intestinal................................................................

12. Avaliação da função pulmonar...........................................................

13. Lavado broncoalveolar e contagens de células.................................

14. Contagem de diferencial de leucócitos..............................................

15. Quantificação da Peroxidase de eosinófilo (EPO).............................

16. Avaliação da expressão das citocinas...............................................

17. Analise histológica..............................................................................

18. Analise estatística..............................................................................

19. Grupos experimentais.......................................................................

RESULTADOS

1. A hiperreatividade brônquica em diferentes doses de larvas do S.

venezuelensis em ratos......................................................................

2. Papel da hiperreatividade brônquica na infecção causada por S.

venezuelesis.......................................................................................

3. Papel da IL-13 nas alterações funcionais pulmonares e na infecção

induzidas por S. venezuelensis em ratos...........................................

4. Papel das fibras sensitivas sensíveis a capsaicina nas alterações

funcionais pulmonares induzidas por S. venezuelensis em

ratos.........................................................................................................

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

1. Discussão...........................................................................................

2. Conclusão..........................................................................................

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................

Introdução

1) Parasito: Strongyloides venezuelensis e Strongyloides stercolaris.

O Strongyloides venezuelensis é um parasito com ciclo pulmonar, natural

de ratos (Takamure, 1995). A infecção experimental por S. venezuelensis tem

sido uma ferramenta importante para o estudo da estrongiloidíase humana e

também para a compreensão da relação parasito/hospedeiro. Os nematódeos

do gênero Strongyloides pertencem à classe Rabditea, ordem Rhabditida e

família Strongyloididae. O S. venezuelensis não afeta o homem; no entanto, o

S.stercoralis é o principal causador da estrongiloidíase humana, afetando de 30

a 100 milhões de pessoas em 70 países no mundo (GENTA, 1989; SIDDIQUI &

BERK, 2001; BOULWARE ET AL., 2007).

O desenvolvimento do S. stercolaris e S. venezuelensis ocorre no

ambiente (ciclo de vida livre) e no hospedeiro (ciclo de vida parasitária). A fase

parasitária inicia-se com a penetração das larvas filarióides (L3) através da

mucosa e da pele, e chegam ao intestino delgado onde atingem a maturidade. O

parasito é eliminado através das fezes do hospedeiro na forma de ovos e/ou

larvas rabditóides. Essa via de infecção é similar a vários parasitos que infectam

o homem tais como Ancylostoma duodenale e Necator americanus.

As infecções crônicas por S. stercoralis não apresentam sintomas. Porém, em

muitos casos, podem ocorrer manifestações cutâneas, gastrintestinais e

sintomas pulmonares (Genta, 1989). Os sintomas pulmonares muitas vezes não

são específicos, mas podem incluir hemoptise alveolar, hiperreatividade

brônquica (HRB) e dispnéia. O diagnóstico da estrongiloidíase é difícil na fase

pulmonar e, na maioria das vezes, é erroneamente tratado com altas doses de

corticóide, o que piora o processo da infecção (Boulware et al., 2007; Smith et

al., 1985; Woodring et al., 1994; Woodring et al., 1996).

2) Definição e avaliação da hiperreatividade brônquica

A hiperreatividade brônquica (HRB) é um excessivo estreitamento do

lúmen das vias aéreas causado por algum estímulo que ocasionaria pouco ou

nenhum efeito em indivíduos normais (Black & Johnson, 1996; Nadel & Busse,

1998; Woolcock et al., 1984). O estímulo usado para mensurar HRB pode ser

diferenciado em direto e indireto. O estímulo direto (acetilcolina, metacolina,

histamina) atua diretamente nos receptores da musculatura das vias aéreas

(muscarínicos e receptores H

respectivamente). Os indiretos atuam através de

mais de uma via de liberação de células inflamatórias (mastócitos, etc.) e

incluem os estímulos físicos (exercício, ar frio, hiperventilação) e certos

estímulos químicos, como por exemplo, manitol.

As técnicas para estudo da hiperreatividade brônquica diferem-se em

invasivas e não invasivas (Irvin & Bates, 2003). Os métodos invasivos são

usados em situações em que se necessita estudar a função pulmonar do animal

apenas uma vez, pois é uma técnica terminal. Os métodos invasivos requerem

que os animais sejam anestesiados cuidadosamente para prevenir esforços

ventilatórios, um fator que pode complicar a interpretação da HRB. Dentre as

desvantagens dessa técnica incluem-se o uso de anestésicos e de instrumentos

invasivos para vias aéreas. Por outro lado, técnicas não invasivas podem ser

realizadas mais de uma vez no mesmo animal, sem anestesia ou cirurgia. Um

exemplo é a pletismografia de corpo inteiro, em que o animal é colocado em

uma caixa, utilizando-se o Penh (pausa expiratória) como medida (Bates & Irvin,

2003). A desvantagem dessa técnica é a falta de acurácia, pois, muitas vezes,

alterações do Pehn não correspondem apenas à broncoconstrição (Lundblad et

al., 2002).

Os métodos invasivos vêm sendo de grande importância para os estudos

genéticos da hiperreatividade brônquica bem como para a análise das

alterações funcionais pulmonares em patologias inflamatórias.

3) Hiperreatividade Brônquica e Asma

A HRB vem sendo exaustivamente estudada na asma e correlacionada,

principalmente, com inflamação pulmonar. Há vários estudos que correlacionam

células inflamatórias, geralmente do lavado broncoalveolar (LBA), com HRB.

Esses estudos freqüentemente usando estímulos diretos, como a metacolina

(Ferguson & Wong, 1989; Jeffery, 1991), no entanto há estudos que

correlacionam a HRB com inflamação apenas quando usam estímulos indiretos

como AMP (Polosa et al., 1998; van den et al., 2001). Muitos estudos não

detectam relação entre células inflamatórias e HRB independente do estímulo

utilizado(Kirby et al., 1987).

Os indutores mais comuns de HRB são as respostas alérgicas mediadas

por IgE(Knisz & Rothman, 2007); a maioria dos pacientes com asma são

atópicos(Contopoulos-Ioannidis et al., 2007). Asma atópica é caracterizada por

eosinofilia e produção de citocinas CD4

2 (IL-4, IL-5, IL-9, IL-13). O papel dos

eosinófilos na indução da HRB pela alergia tem sido investigado no nível de

citocinas T

2, CD4

. A IL-5 esta dentre as citocinas que esteve em grande

evidência.

A interleucina 5 (IL-5) é responsável pelo crescimento, diferenciação e

ativação de eosinófilos. Há vários trabalhos mostrando que a IL-5 atua na HRB e

inflamação (Hamelmann et al., 1999; Shi et al., 1998). Por outro lado, há alguns

trabalhos mostrando que a HRB induzida por antígenos pode desenvolver-se

independentemente de IL-5 (Corry et al., 1996; Proust et al., 2003).Juntamente

com a IL-5, as IL-4 e IL-13, estão sendo alvo de estudos na inflamação

pulmonar e HRB (Nag et al., 2003; Perkins et al., 2006a; Yang et al., 2004).

Aliados aos estudos que relacionam inflamação e hiperreatividade

brônquica, os estudos genéticos da HRB nativa em animais laboratoriais vêm

trazendo importante conhecimento para este fenômeno(Chen et al., 2006).

Alguns estudos têm demonstrado que a HRB “intrínseca” está sob

controle genético, em camundongos e ratos. Um grande número de raças de

camundongos vem sendo estudado e observa-se que diferentes raças

apresentam distintos graus de HRB em resposta a broncoconstritores (De

Sanctis et al., 2001; De Sanctis et al., 1995; Ackerman et al., 2005; Ewart et al.,

1996). A raça dos ratos Fisher 344 apresenta maior grau de HRB inata quando

comparada a outras raças (Pauwels, 1989; Pauwels et al., 1985). É interessante

notar que raça de camundongos que são hiperreativas (AJ, Balb/c e DBA/J2),

quando expostas a alérgenos, desenvolvem mais inflamação pulmonar que as

linhagens hiporreativas (C57B/L6 e C3H/HeJ) (Ewart et al., 2000). De maneira

interessante, alguns estudos com gêmeos estimam a hereditabilidade da HRB a

metacolina em 66%. Muitos dados apontam para uma predisposição genética a

asma que pode ocorrer independente da atopia e que a hiperreatividade

brônquica pode ser necessária se não suficiente para o desenvolvimento da

doença clínica (Van Eerdewegh et al., 2002; Ewart et al., 2000). Isso levanta a

grande questão: Qual a importância da inflamação para a hiperreatividade

brônquica ou vice-versa?

Recentemente, tem sido demonstrado que a musculatura lisa das vias

aéreas vem mostrando um papel importante na inflamação pulmonar. Trabalhos

mostram que danos na contração e relaxamento da musculatura lisa causam

obstrução aguda e persistente do fluxo da vias aéreas. Isto contribui para a

inflamação das vias aéreas por expressar poderosas quimiocinas, tais como

eotaxina (CCL11) e RANTES (CCL5) (Oliver et al., 2007; Fredberg, 2000).

Muitos tratamentos já trazem alguns benefícios para musculatura lisa. Novas

terapias que atuam na musculatura lisa vêm sendo objeto de estudo de alguns

laboratórios (Solway & Irvin, 2007).

Em suma, há vários fatores envolvidos na HRB e na patogênese da

asma, tais como, inflamação, predisposição genética e alterações na

musculatura das vias aéreas.

Os estudos citados acima favorecem o conhecimento sobre HRB. No

entanto, os fatores relacionados a este fenômeno durante a infecção por

helminto podem ser completamente diferentes ou muito semelhantes aos fatores

envolvidos na asma. Em adição, o estudo da HRB em helmintos pode ser

modelo importante e interessante para entender a relação entre inflamação e

HRB.

4) Fase pulmonar da infecção e hiperreatividade brônquica causada por

helminto

Os pulmões são órgãos alvos de muitos nemátodeos gastrointestinais –

incluindo Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Strongyloides

stercoralis, Ascaris lombricoides, os quais têm migração pulmonar em seu ciclo

de vida (Chan et al., 1994; Miller, 1979; Phills et al., 1972).

A fase pulmonar das infecções causadas por parasitos tem sido bastante

investigada desde o surgimento de importantes trabalhos científicos mostrando

que os parasitos com ciclo pulmonar são capazes de causar prolongadas

alterações imunológicas nos pulmões (Marsland et al., 2005; Pinelli et al., 2005).

Por exemplo, os níveis de inflamação pulmonar causada por alérgicos foram

menores em animais infectados previamente com Nippostrongylus brasiliensis

(N. brasiliensis) (Maizels et al., 2004).

Mudanças na função pulmonar e sintomas pulmonares, tais como

produção de muco e hiperresponsividade das vias aéreas, são descritos em

pacientes com infecções helmínticas com ciclo pulmonar (Coyle et al., 1998; Hall

et al., 1998; Wehner et al., 1994). O modelo de infecção por S. venezuelensis é

caracterizado por alterações imunológicas e patológicas tipicamente vistas em

modelos experimentais de asma alérgica, predominante resposta local Th2 que

resulta em inflamação pulmonar eosinofílica, aumento da concentração local de

IgE, exagerada produção de muco e hiperreatividade brônquica(Silveira et al.,

2002; Negrao-Correa et al., 2003).

Experimentalmente, HRB pode ser definida como um estreitamento

exagerado das vias aéreas em resposta a vários agentes broncoprovocativos

(Brusasco et al., 1998). É descrita na infecção experimental por Brugia malayi

(Hall et al., 1998) e Nippostrongylus brasiliensis (Coyle et al., 1998), em

camundongos, e S. venezuelensis (Silveira et al., 2002) em ratos. Esses e

outros helmintos de importância na saúde pública possuem fase obrigatória de

migração nos pulmões do hospedeiro durante a fase de desenvolvimento larval.

Alguns trabalhos mostram que a passagem pelos pulmões no início do ciclo

parasitário é extremamente importante para o desenvolvimento do parasito. Por

outro lado, existe pouco conhecimento sobre moléculas e alterações fisiológicas

que beneficiam (ou não) os parasitos nos pulmões. A HRB é uma alteração

fisiológica pulmonar intrigante quanto aos seus benefícios para o parasito, pois,

como demonstrado por Silveira et al. (2002), ela não coincide com a presença

de pico de larvas de S. venezuelesis nos pulmões (2°dia após infecção), porém

coincide com um aumento da produção de eosinófilos e TNF-α nos pulmões. A

infecção por S. venezuelensis induz um aumento na HRB ao 2° dia e pico ao 5°

dia após (Silveira et al., 2002). Demonstrou-se também que ratos imunizados e

desafiados com OVA apresentam HRB e, quando são infectadas com S.

venezuelensis concomitantemente á imunização e desafio com OVA, a HRB é

reduzida (ao tempo que a larva passa pelo pulmão). Teoricamente, a indução

da contração das vias aéreas ao redor da larva poderia prevenir e facilitar a

morte por mecanismos imunológicos.

O nosso estudo visa a compreender melhor as alterações funcionais

pulmonares, especialmente a HRB ocasionada por S. venezuelensis, além

disso, a mostrar a importância das alterações funcionais pulmonares para a

infecção. A maioria dos trabalhos que estuda a HRB causada pela infecção

parasitária não demonstra sua importância para infecção, focando apenas os

efeitos de interleucinas na hiperreatividade brônquica(Coyle et al., 1998; Hall et

al., 1998; Mehlotra et al., 1998; Mehlotra et al., 2001).

5) Interleucina 13 e inflamação pulmonar

A interleucina 13 (IL-13) é uma citocina imunomodulatória produzida por

células T e muitos outros tipos celulares, mastócitos e células dendríticas(Akiho

et al., 2002; Hershey, 2003; Kibe et al., 2003). Em humanos, os níveis de IL-13

são aumentados tanto sistemicamente quanto nos pulmões durante ataque

asmático (Prieto et al., 2000). Alguns polimorfismos da IL-13 são associados

com altos níveis de soro de IgE e ataque de asma (Vercelli, 2002).

Adicionalmente, a IL-13 exibe atividade estimulatória para múltiplos tipos de

células envolvidas na asma, incluindo células B, mastócitos, eosinófilos, células

epiteliais pulmonares, fibroblastos e células da musculatura lisa (Wynn, 2003).

Em estudos com animais, a administração de IL-13 recombinante ou o aumento

na expressão de IL-13 nos pulmões induz sintomas similares a asma, como

inflamação, produção de muco e remodelamento; sabe se que todos esses

fatores estão envolvidos com HRB.

A literatura apresenta dados interessantes a respeito da IL-13 em

modelos de asma alérgica em camundongos. A administração de anticorpo anti-

IL-13 (Yang et al., 2004) e receptor α2 de IL-13 (Leigh et al., 2004) diminuem a

HRB. Por outro lado, há evidências sugerindo que a HRB ocorre na ausência de

IL-13 (Proust et al., 2003).

O remodelamento das vias aéreas é uma característica importante da

asma. O remodelamento constitui de hiperplasia das células caliciformes e

fibrose subepitelial. A indução da hiperplasia das células caliciformes não é

devida à proliferação de células in vivo (Vargaftig & Singer, 2003) mas é devida

à diferenciação de células epiteliais em secretoras (Zuhdi et al., 2000). Muitos

estudos demonstram que a administração de um recombinante murino (rm) IL-

13 nos pulmões de camundongos induz hiperplasia de células caliciformes,

eosinofilia e HRB (Grunig et al., 1998; Kibe et al., 2003; Singer et al., 2002;

Vargaftig & Singer, 2003; Wills-Karp, 2000).

Em resumo, a IL-13 está envolvida em múltiplos processos fisiológicos e

patológicos nos pulmões, incluindo HRB. Essa interleucina poderia ter também

um papel importante na HRB e produção de muco causada por helminto.

6) Interleucina 13 e infecção por nematódeos

As citocinas T

2 são instrumentos protetores contra a infecção por

helmintos e alguns resultados demonstram um papel dominante para IL-13.

Estudos com Nippostrongylus brasiliensis foram os primeiros a revelar

que a IL-13 tem um papel importante e não redundante na imunidade do

hospedeiro (Kibe et al., 2003; McKenzie et al., 1998; Urban, Jr. et al., 1998).

Desde então vários vermes vêm sendo estudados: Trichuris muris, Heligmooides

polygyrus, Trichinella spiralis e N. brasiliensis.

Embora alguns estudos venham mostrando que a expulsão de parasitos

requer resposta celular T

2 CD4

(Katona et al., 1988), IL-4, sozinha, não é tão

importante devido ao fato de camundongos tratados com anti IL-4 e knockout

para essa citocina serem tão resistentes à infecção quanto animais selvagens

(Madden et al., 1991; Kopf et al., 1993). Esses estudos foram os primeiros a

sugerir que outro mediador da resposta celular T

2 poderia ser importante para

expulsão do verme. IL-13 foi um forte candidato devido ao fato de animais

deficientes de IL-4Rα-, deficientes em STAT6, IL-13 e IL-4 serem mais

susceptíveis do que animais deficientes em IL-4 apenas (Barner et al., 1998;

Kibe et al., 2003; McKenzie et al., 1998; Urban, Jr. et al., 1998).

Negrão-Correa (2006) mostraram que a expressão do receptor de IL-4 em

células não derivadas da medula óssea é necessária para eliminação do S.

venezuelensis, mas não para a produção de IL-4 intestinal; e que animais IL-

4Rα KO infectados por S. venezuelensis excretam mais ovos quando

comparados a animais controle infectados. Somado a isso, demonstrou se

também que a indução de IL-13 é parcialmente dependente do receptor IL-4α.

Esse estudo foi o primeiro a demonstrar a relação da IL-13 com a infecção por

S. venezuelensis.

A IL-4 e IL-13 apresentam alguns efeitos que se sobrepõem, no entanto

muitos efeitos podem ser independentes. Essas interleucinas contribuem para

expulsão dos vermes, incluindo estimulação por IgE, mastócitos, eosinófilos,

produção de muco, indução de mudanças específicas nas células epiteliais e

células da musculatura lisa(Grunig et al., 1998; Kibe et al., 2003). Elas dividem

os mesmos componentes dos receptores. Há três tipos de receptores que se

ligam a IL-4 e/ou à IL-13. O receptor tipo 1 é composto de uma cadeia comum

IL-4Rα1. Já o receptor tipo 2 é composto das cadeias IL-4Rα1 e IL-13 Rα1. A

ligação da IL-4 ao receptor tipo1 ou tipo 2, e da IL-13 ao receptor tipo 2, leva à

fosforilação da IL-4 α1 e à ativação do fator de transcrição nuclear STAT6

(Morimoto et al., 2006). Uma segunda cadeia, liga-se à IL-13 com alta afinidade,

mas atua indpendentemente de STAT6; a ação deste receptor permanece

incerta. Há alguns trabalhos mostrando que ele inibe a ação da IL-13Rα2 in vivo

(Wood et al., 2003; Chiaramonte et al., 2003).

Há uma carência de trabalhos a respeito da importância da IL-13 para

fase pulmonar do ciclo parasitário de diversos helmintos. Por outro lado há

vários trabalhos mostrando o papel da IL-13 na fase intestinal do helminto. Ela é

importante para supressão da produção de ovos e expulsão de vermes do

intestino na infecção por N. brasiliensis (Finkelman et al., 2004). A defesa contra

o parasito pode ser desenvolvida pela ação da IL-13 em células não derivadas

da medula óssea como por exemplo,células da musculatura lisa intestinal,

epitélio e células caliciformes(Akiho et al., 2002). Em alguns helmintos a ação da

IL-13 sozinha não é tão eficaz para expulsão de verme quanto em ação conjunta

com IL-4.

7) Terminações nervosas sensitivas sensíveis à capsaicina nas vias aéreas

Estímulos nocivos à pele ou ao tecido subcutâneo, como articulações,

ativam classes de terminais nociceptivos, classificados como periféricos dos

neurônios sensitivos primários, cujos corpos celulares estão localizados nos

gânglios da raiz dorsal e nos gânglios do trigêmeo. Há três importantes tipos de

nociceptores: térmicos, mecânicos e polimodais. Os nociceptores térmicos são

ativados por temperaturas extremas e possuem fibras Aδ, que são fibras

mielinizadas. Os nociceptores polimodais são ativados por estímulos mecânicos,

químicos e térmicos, possuem fibras C de pequeno diâmetro e não mielinizadas

que conduzem sinais lentamente. As fibras aferentes nociceptivas terminam em

neurônios de projeção no corno dorsal da medula espinhal e transmitem a

informação dolorosa para centros superiores, como tálamo, amídala e córtex,

por cinco vias ascendentes. O papel das fibras sensórias sensitivas não

mielinizadas pode ser estudado pelo tratamento de capsaicina em ratos

neonatos, que ocasiona perda da capacidade desses neurônios, resultando em

diminuição da resposta inflamatória neurogênica e dor (Jancso et al., 1977).

A capsaicina é uma substância da pimenta vermelha, e é popularmente

usada como comida na Índia, América do Sul, sudoeste da Ásia e da África. Os

efeitos farmacológicos da capsaicina foram reportados pela primeira vez em

1878, quando foi notado que ela produzia uma sensação de queimadura quando

em contato com pele (Monsereenusorn et al., 1982). Desde então os efeitos da

capsaicina vêm sendo investigados. Esses efeitos são dependentes da rota de

aplicação, dosagem, idade, raça e espécies de animais. Quando a capsaicina é

aplicada em estágio neonatal, atua como uma neurotoxina e induz destruição

irreversível e específica de neurônios sensoriais primários. Em contraste,

quando aplicada em adultos causa perda reversível de estoques de

neuropeptídeos.

A depleção de neurocinina pelo tratamento neonatal com capsaicina

produz danos irreversíveis das fibras sensoriais, levando à perda permanente e

degeneração de 50 a 90% de todas as fibras não mielinizadas aferentes (Jancso

et al., 1977). Descobriu-se um novo receptor de capsaicina, chamado vaniloide

(VR) (Caterina et al., 1997). Ele tem facilitado o entendimento dos efeitos da

capsaicina nas fibras nervosas sensoriais aferentes primárias. As fibras

nervosas sensoriais são as maiores fontes de taquicininas (Holzer, 1998).

A inflamação resultou da liberação de substâncias de fibras nervosas

sensoriais primárias é denominada de inflamação neurogênica. Substância P e

neurocinina A são membros da família de peptídeos chamados de taquicininas

que são potentes vasodilatadores e vasoconstritores. As taquicininas estão

presentes nas terminações nervosas primárias. Estudos em roedores têm

demonstrado que as taquicininas são neurotransmissores que medeiam o

sistema nervoso não adrenérgico e não colinérgicos (NANC)(Barnes, 1996).

As taquicininas, podem também exercer numerosos efeitos nas células do

trato respiratório. Os efeitos broncoconstritores da substancia P exógena foram

reportados pela primeira vez em 1977 em porcos da índia e gatos. Desde então

as taquicininas vêm sendo exaustivamente estudadas. A neurocinina A (NKA)

causa constrição da musculatura das vias aéreas em humanos, in vivo, via

receptores NK2 (Frossard & Barnes, 1991). Na asma, a administração da

neurocinina A intravenosamente ou por inalação leva à broncoconstrição.

(Frossard & Barnes, 1991; Lundberg & Saria, 1982; Shore et al., 1988);

adicionalmente muitos estudos demonstram que a depleção de neuropeptídeos

pode influenciar a hiperreatividade brônquica causada por alérgeno (Warth et al.,

1995; Wu et al., 1997).

As taquicininas exercem outros efeitos no trato respiratório, tais como

secreção glandular, vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular,

estimulação dos nervos colinérgicos, estimulação de células mastócitos,

estimulação dos linfócitos T e B, estimulação de macrófagos, quimioatração de

eosinófilos e neutrófilos e adesão vascular de neutrófilos(Barnes, 1996).

Em resumo, muitos estudos demonstram o papel do neuropeptídeos na

vias aéreas e na asma, porém não há estudos a respeito do papel dos

neuropeptídeos na HRB causada por helminto.

Justificativa e objetivos

Justificativa:

Esse estudo visa a desvendar a importância e os mecanismos das

alterações funcionais pulmonares causadas por S. venezuelensis. A alergia

induz mudanças na função das vias aéreas que podem afetar a migração da

larva através dos pulmões em animais infectados por S. venezuelensis com

alergia experimental. Desta maneira, resposta funcional pulmonar induzida pela

larva, como a hiperreatividade brônquica, poderia ser um mecanismo protetor

importante para hospedeiro.

1) Objetivo geral:

Avaliar a importância e os possíveis mecanismos das alterações

funcionais pulmonares durante a infecção causada por S. venezuelensis em

ratos.

2) Objetivos específicos:

• Avaliar a hiperreatividade brônquica induzida por diferentes cargas de

larvas do parasito (150, 500, 1.500 e 4.500) inoculadas em ratos.

• Investigar se a hiperreatividade brônquica altera o curso da infecção

parasitária.

• Investigar o papel da IL-13 na inflamação induzida pela infecção,

avaliando seus efeitos na hiperreatividade brônquica e infecção,

utilizando-se de anticorpo monoclonal anti-IL-13.

• Investigar se a hiperreatividade brônquica causada por S. venezuelensis

em ratos tem como mecanismo a ativação das fibras sensoriais sensitivas

capsaicina.

Material e Métodos

1) Animais:

Ratos Wistar machos pesando entre 250-300 gramas foram

obtidos do Centro de Bioterismo da Universidade Federal de Minas Gerais-

UFMG e Fundação Oswaldo Cruz na Bahia (Fiocruz-BA). Os animais receberam

água e ração (Nuvilab, Brasil). Os protocolos experimentais foram aprovados

pelo Comitê de Ética Animal da UFMG (019/05). Todos os animais tiveram suas

fezes examinadas e foram rotineiramente vermifugados. O tratamento foi

realizado com Ivermectina, via oral, durante uma semana (0,8 ml de Ivermectina

1% - Chemitac ® / litro de água, fornecida ad libidum). Depois do tratamento, os

ratos foram mantidos em um local isolado, em gaiolas contendo maravalha e

ração autoclavada, assim como água filtrada, para evitar uma reinfecção.

Antes de serem infectados com S.venezuelensis, os ratos ficaram em

descanso por 10 dias, para evitar qualquer efeito residual da Ivermectina, e

passaram por um novo exame de fezes para garantir que estivessem sem

nenhuma infecção.

2) Parasito:

S. venezuelensis foi usado em todos os experimentos. O

nematódeo foi isolado de Rattus norvegicus (BRENER & CHAIA, 1960), sendo

posteriormente separado do S. ratti em ciclos de passagem em ratos Wistar

machos no Biotério do Departamento de Parasitologia da Universidade Federal

de Minas Gerais da UFMG.

3) Obtenção das larvas filarióides:

As larvas filarióides (L3) usadas na infecção dos ratos foram obtidas por

coprocultura das fezes de ratos Wistar infectados experimentalmente com S.

venezuelensis. Para a coleta das fezes, ratos com 7-21 dias de infecção foram

transferidos para uma gaiola de arame e as fezes foram coletadas numa caixa

coletora encaixada no fundo da gaiola fisiológica. Esta caixa foi coberta com

jornal molhado, que evitava o ressecamento das fezes. As fezes coletadas foram

misturadas com vermiculita, na proporção de 1:2. A coprocultura era umedecida

e mantida em estufa a 28°C, onde permanecia por 72h, para que se

desenvolvessem as larvas filarióides (L3). As larvas filarióides foram

recuperadas pela técnica de Baerman-Moraes (Neves et al., 2003), lavadas em

solução fisiológica 0,85% (NaCL) e quantificadas através da contagem das

larvas vivas em 3 amostras de volume conhecido da solução de larvas. Para a

infecção dos ratos, foram utilizadas 1.500 larvas filarióides para cada animal,

que foram inoculados subcutaneamente na região abdominal.

4) Modelo experimental de asma - Modelo de imunização e desafio com

ovalbumina:

Para imunização os animais foram anestesiados levemente, realizou-se

uma incisão na região dorsal, para implantação subcutânea da ovalbumina

coagulada. Após o implante suturou-se o local. O desafio foi feito pela

aerolização com 2% de ovalbumina (Sigma), como descrito por Silveira et al.

(2002).

5) Tratamento com Salbutamol:

Verificamos o efeito broncodilatador do Aerolin

(Sulfeto de Salbutamol

solução para nebulização-GlaxoWellcom) em ratos imunizados e desafiados

com ovalbumina. Os animais infectados foram então tratados com salbutamol

via inalação (0.25 mg/mL; veículo solução fisiológica durante 10 minutos, de 4

em 4 horas). O aerosol com Salbutamol foi realizado dentro de uma câmera

adaptada acoplada a um nebulizador ultra-sônico (Pulmosônic Star-Marc:

Sonicler).

6) Tratamento com anticorpo monoclonal anti –IL13:

Ratos Wistar foram tratados intraperitonealmente com 500 uL de

anticorpo monoclonal anti-IL13 ou mesmo volume do veículo (anti-soro de

carneiro), durante os seguintes dias de infecção: 2°, 4°, 6°, 8°, 10°.

7) Tratamento neonatal com capsaicina:

Ratos Wistar foram tratados no segundo dia de vida com capsaicina (50

mg/Kg, s.c) ou veículo (10% de etanol e 10% de tween 80 em 0.9% w/v solução

de NaCl), como previamente descrito (Jancso et al., 1977). Os animais foram

infectados com S. venezuelensis na idade adulta (aproximadamente 3 meses

após tratamento com capsaicina).

8) Resposta comportamental à dor pela injeção de formalina sobre o tempo

(teste de “licking time”):

Para confirmar a eficácia da depleção das terminações nervosas

sensitivas sensíveis à capsaicina, os animais receberam uma injeção

intraplantar de formalina (3% em PBS, 100 µL por pata) e o efeito

comportamental foi avaliado por 10 min (fase inicial) e de 20 a 30 min (fase

tardia) (Jancso et al., 1977). Anotava-se o tempo no qual o animal lambia a pata

e/ou permanecia com esta suspensa ou não apoiada completamente no piso.

9) Avaliação parasitológica da infecção:

Os dias escolhidos para avaliação parasitológica foram de acordo com o

ciclo do parasito e o objetivo dos tratamentos. Em geral os ratos infectados

foram sacrificados no 2° dia pós-infecção para a recuperação de larvas do

pulmão; e no 12° dia pós-infecção para recuperação de vermes adultos do

intestino delgado e coleta de porções do intestino delgado para análise

imunológica. A coleta de fezes foi realizada 5, 7 e 10 dias após infecção no

protocolo de tratamento com anti-IL13. Em cada período da infecção foram

examinados 4 a 5 animais de cada grupo experimental, e cada experimento foi

repetido pleo menos 2 vezes.

Para a recuperação das larvas, os pulmões de cada rato foram lavados

com salina e o tecido foi fragmentado para facilitar a saída das larvas durante a

incubação do material a 37°C por 4h. Para a recuperação dos vermes adultos, a

região anterior do intestino delgado, que compreende o duodeno e a porção

proximal do jejuno, foi separada, aberta longitudinalmente e limpa com salina.

Tanto na recuperação de larvas quanto na recuperação de vermes adultos, o

pulmão ou intestino delgado foi individualmente colocado num cálice contendo

salina e uma rede de malha fina, o que permitia que o parasito, ao ser atraído

pelo calor do banho-maria (37°C/4h), saísse do tecido e sedimentasse no fundo

do cálice. Depois disso, tanto as larvas como os vermes adultos recuperados no

fundo do cálice, assim como os vermes que permaneciam no intestino delgado

foram quantificados em microscópio esteroscópico.

Os ovos de S. venezuelensis eliminados nas fezes de cada animal

necropsiado foram quantificados nos sedimentos de fezes coletados na região

do reto. As fezes formadas recolhidas do reto de cada animal foram pesadas e

homogeneizadas com 1mL de salina, e, posteriormente, conservadas com a

adição de 4mL de solução de formalina tamponada a 10%. A contagem dos

ovos foi feita em 100 µL da solução, em 02 lâminas, para que fosse estimado o

número de ovos por grama de fezes (OPG). A partir do OPG e da contagem de

vermes adultos de cada rato infectado, estimou-se a quantidade de ovos

produzidos por cada verme/grama de fezes naquele período da infecção:

considerado como índice de fecundidade.

A região posterior do intestino delgado recolhido dos ratos necropsiados

foi dividida em dois segmentos e lavada com solução fisiológica, acondicionada

em microtubos e imediatamente armazenada em freezer a –20°C, até a

utilização. Este material foi utilizado para quantificação de citocinas (jejuno

distal) e do nível de peroxidase no tecido – EPO (íleo), conforme descrição

detalhada abaixo.

10) Cultura in vitro de vermes adultos de S. venezuelensis:

Vermes adultos foram obtidos da porção superior do intestino delgado ao

7° dia após infecção em ratos. Os vermes que emergiram do tecido foram

lavados várias vezes com PBS 1X, pH=7.2 contendo 500U/mL de penicilina e

500 mg/mL de estroptomicina (Sigma), ressuspendido em RPMI 1640 (Sigma,

St. Louis MO, USA) e suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco BRL,

Rockville MD, USA), 100U/mL de penicilina, 100U/mL de estreptomicina, e

plaqueado em placa de cultura de tecido contendo Salbutamol em

concentrações diferentes (10

-4

e10

-6

M Sigma); cultura controle sem Salbutamol

foi realizada. Cada tratamento com droga foi testado em triplicata. A cultura foi

incubada a 37°C em estufa contendo 5% de CO

por 48 horas. O número de

vermes e sua mobilidade, juntamente com os números de ovos, foram

quantificados após incubação de 24 e 48 horas.

11) Medida da função intestinal:

Segmento duodenal (1 cm) foi suspendido longitudinalmente em um

recipiente de vidro preenchido com 10 mL de solução de Tyrode mantido a 37° e

continuamente ventilado com 95% de O

e 5% CO

. Uma das porções finais do

tecido foi fixada a um transdutor de tensão isométrica (World Precision

Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA) e outra a uma superfície mais baixa da

solução de banho. Tecidos foram estendidos a uma forca de 9.9 mN (2 g). Os

tecidos permaneciam na solução de banho durante 30 minutos iniciais e depois

o banho era renovado a cada 15 minutos. O sinal de tensão foi processado em

um amplificador (TBM-4; World Precision Instruments, Inc.). Os dados foram

expressos como porcentagem de aumento da tensão em comparação à linha

basal depois de cada dose de acetilcolina (10

-6

a 10

-2

M-Sigma).

12) Avaliação da função pulmonar:

Avaliamos a hiperreatividade brônquica das vias aéreas em ratos

imunizados e desafiados com OVA e em ratos infectados com S. venezuelensis

ao 2º e 5º dia após a infecção e em ratos normais (sem infecção ou tratamento).

Os ratos foram anestesiados com uretana (1.400 mg/Kg ip., Sigma) e a variação

da pressão intratraqueal a doses crescentes de acetilicolina (10, 100 e 300

ug/Kg) foi avaliada como descrito por Silveira et al. (2002) usada como medida

indireta da resistência pulmonar. Dados foram expressos como porcentagem de

aumento da pressão da pressão intratraqueal em comparação à linha basal.

13) Lavado broncoalveolar (LBA) e Contagem total de células:

Após a avaliação da função pulmonar, os animais foram eutanaziados

para realização do lavado broncoalveolar (LBA) através da instilação na traquéia

de 6 mL de PBS( pH=7.4) acrescido de 0.1 % de albumina bovina (BSA-Sigma)

e de inibidor de proteases (Complete Protease Inibidor Coktail-Boeringer

Mannheim Biochemical-1 tablete em 25 mL de PBS). Essa solução foi injetada e

aspirada por 3 vezes, através de uma cânula inserida na traquéia. O LBA obtido

foi centrifugado (1.200 rpm – 7 min), as células foram separadas do

sobrenadante, que foi estocado (-20°C) para dosagem de citocinas. O sedimento

de células foi ressuspendido em 0.1 mL de PBS, acrescido de 0.3% de BSA e

utilizado para a contagem de total e diferencial de células, como descrito por

Silveira et al. (2002).

14) Contagem diferencial de leucócitos:

A amostra de células presentes no LBA, suspensas em 100 µL de

albumina 3%, foi depositada (20 µL de cada suspensão) em lâminas de vidro,

previamente preparadas com papel de filtro, contendo 2 poços com 0,5 cm de

diâmetro. Posteriormente as lâminas foram coradas pelo método de May-

Grunwald-Giemsa.

Foram contadas 100 células por 3 vezes em cada lâmina e realizada uma

média para se obter o número das células diferenciadas por critérios

morfológicos. O número de cada tipo celular foi calculado a partir da

porcentagem encontrada em relação ao número total de células.

15) Quantificação da Peroxidase de eosinófilo (EPO):

A quantificação dos níveis de peroxidase de eosinófilos no tecido foi

utilizada como uma maneira indireta de estimar a eosinofilia pulmonar e

intestinal. Para tanto, aproximadamente 100 mg de tecido foi pesado e

homogeneizado em PBS (pH 7.2), usando um homogeinizador de tecido;

obtendo-se um volume final de 2ml. O homogenato foi centrifugado a 3.000g por

10 minutos e o sobrenadante foi desprezado. O sedimento foi sujeito à lise

hipotônica em salina 0,2%, seguido pela adição de salina 1,6% e glicose 5%.

Depois disso, o material foi novamente centrifugado a 3.000g por 10 minutos,

para que o sobrenadante fosse desprezado e o sedimento ressuspenso em PBS

(pH 7.4), contendo HTAB (Hexadecyl trimethyl ammonium bromide; Sigma)

0,5%. Essa solução foi novamente homogeneizada, e o homogenato foi

separado em alíquotas de 1 ml/eppendorf, congelado 3 vezes em nitrogênio

líquido e centrifugado a 3.000g por 15 minutos. Apenas o sobrenadante foi

utilizado para quantificar a peroxidase (Silveira et al., 2002).

O ensaio foi realizado em placas de 96 poços, sendo que em cada poço

75µl de amostra ou branco (PBS) foi incubada com 75µl de substrato (1,5µm de

OPD em tampão Tris-HCl 0,075µM pH 8 acrescida de H

6,6µM). A placa foi

incubada no escuro por aproximadamente 30 minutos, e a reação foi

interrompida pela adição de 50µl de H

1M e a leitura era realizada em leitor

de Elisa com filtro de 492 nm.

Os níveis de EPO no tecido correlacionam com a quantidade de

eosinófilos no mesmo; utilizamos o método descrito por Silveira et al. (2002)

para sua detecção. O pulmão direito foi utilizado e o processo de preparo do

tecido para quantificação foi de acordo com a descrição feita em publicações

(Silveira et al., 2002).

16) Avaliação da expressão de citocinas:

As concentrações de IL-4, IL-6, IL-10 e TNF e IFN-γ foram estimadas no

homogenato do pulmão e intestino delgado reservado para a análise de

citocinas, através da técnica de ELISA. Pares de anticorpos foram gentilmente

doados por Stephen Poole (National Institute for Biological Standards and

Control, England) e os ensaios foram avaliados como descrito por Silveira et

al.2002.

17) Análise histológica:

Ao final de cada experimento os pulmões foram lavados para remover o

sangue, em seguida, o pulmão foi inflado, via cânula inserida na traquéia, com

10% de formoldeído em PBS, sendo fixado na mesma solução. Após

desidratação em álcool e diafanização em xilol, o tecido foi incluído em parafina

e foram obtidas sessões de 4 µm. As sessões foram coradas com periodic acid-

Schiff (PAS) e/ou hematoxilina eosina. Para avaliar a freqüência de coloração, a

razão da área do parênquima por área corada foi analisada sob microscópio

com uma régua microscopia em quadrantes.

18) Análise estatística:

Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média.

Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas utilizando-se

análise de variância (ANOVA), seguida do teste de Student-Newman-Keuls.

Valores de P< 0,05 foram considerados significativos

19) Grupos experimentais:

Protocolo experimental 1: Avaliar hiperreatividade brônquica em diferentes

doses de larvas do S. venezuelensis em ratos

Para esse objetivo os animais foram separados em 5 grupos:

Grupo1: Animais não foram infectados com larvas. Esse grupo foi

denominado grupo controle (n=5).

Grupo 2: Animais infectados com 150 larvas (n=5).

Grupo 3: Animais infectados com 500 larvas (n=5).

Grupo 4: Animais infectados com 1.500 larvas (n=5).

Grupo 5: Animais infectados com 4.500 larvas (n=5)

EPO no tecido pulmonar de cada grupo descrito acima foi realizado e o

número de vermes recuperados no intestino dos grupos 2, 3,4 e 5 foi

determinado.

Protocolo experimental 2: Avaliar se a hiperreatividade brônquica altera o

curso da infecção causada por S. venezuelensis em ratos

Para esse objetivo os animais foram separados em 4 grupos:

Grupo 1: Animais não infectados com larvas sem tratamento com

salbutamol. Esse grupo foi denominado grupo controle (n=6).

Grupo 2: Animais infectados com larvas tratados com salbutamol durante

as primeiras 48 horas após infecção (n=6).

Grupo 3: Animais infectados com 1.500 larvas e sem tratamento com

salbutamol. Esse grupo foi denominado infectado (n=8).

Grupo 4: Animais infectados com 1.500 larvas tratados com salbutamol

durante as primeiras 48 horas após infecção. Esse grupo foi denominado

infectado mais salbutamol (n=8)

Ao 2° e 5° dias após infecção foram avaliados HRB e células inflamatórias

do BAL, EPO e citocinas no tecido pulmonar de cada grupo. A presença de

ovos e vermes foi avaliada nos grupos infectados no 12º dia após a infecção. A

contratilidade intestinal foi avaliada aos 2° e 12° dias após infecção. Animais

tratados com OVA foram utilizados para provar à eficácia do salbutamol em

broncodilatar as vias aéreas na dose de 0.25 mg/mL.

Protocolo experimental 3: Avaliar o papel da IL-13 nas alterações

funcionais pulmonares e na infecção induzida por S. venezuelensis em

ratos

Para esse objetivo os animais foram separados em 3 grupos:

Grupo 1: Animais não infectados e sem tratamento com anticorpo

monoclonal anti-IL13. Esse grupo foi denominado controle (n=5).

Grupo 2: Animais infectados sem tratamento com anticorpo monoclonal

anti-IL13. Esse grupo foi denominado infectado (n=5).

Grupo 3: Os animais infectados tratados com anticorpo monoclonal anti-

IL13. Esse grupo foi denominado infectado mais anti-IL-13 (n=5).

O tratamento com anticorpo monoclonal anti-IL-13 foi realizado durante os

seguintes dias de infecção: 2°, 4°, 6°, 8° e 10° dia.

Ao 5° dia após infecção foram avaliados HRB, presença de células

inflamatórias do LBA, atividade de EPO e detecção de citocinas no tecido

pulmonar de cada grupo. A presença de ovos nas fezes foram avaliados ao 5°,

7°, 10°, 12° dia após infecção. O número de vermes foi avaliado ao 12° dia após

infecção.

Protocolo experimental 4: Avaliar o papel da fibras nervosas sensoriais

sensitivas à capsaicina nas alterações funcionais pulmonares e na

induzida por S. venezuelensis em ratos

Para esse objetivo os animais foram separados em 3 grupos:

Grupo 1: Animais não infectados e sem tratamento com capsaicina. Esse

grupo foi denominado controle (n=5).

Grupo 2: Animais infectados e tratados com capsaicina no 2° dia de vida.

Esse grupo foi denominado infectado mais capsaicina (n=5).

Grupo 3: Animais não infectados tratados com capsaicina no 2° dia de

vida (n=5).

Ao 5° dia após infecção foram avaliados HRB, presença de células

inflamatórias do LBA, atividade de EPO e detecção de citocinas no tecido

pulmonar de cada grupo. A presença de ovos nas fezes foram avaliadas ao 5°

para confirmar a infecção. O teste de analgesia foi realizado para confirmar a

eficácia do tratamento com capsaicina.

Resultados

OBJETIVO 1: AVALIAR A HIPERREATIVIDADE BRÔNQUICA INDUZIDA

POR DIFERENTES CARGA DE LARVAS DO PARASITO (150, 500, 1.500 e

4.500) DO S. venezuelensis EM RATOS

1) As via aéreas de ratos infectados com 1500 larvas apresentaram maior

responsividade à acetilcolina

Experimentos iniciais foram realizados para avaliar a melhor dose de

larvas utilizada para os estudos das alterações funcionais pulmonares causadas

por S. venezuelensis. A administração i.v. de doses crescentes de acetilcolina

induziu aumento na resistência das vias aéreas em ratos infectados e ratos

normais. Ratos infectados com 1.500 e 4.500 larvas apresentaram-se mais

responsivos ao tratamento quando comparados a ratos infectados com 150 e

500 larvas. No entanto, a dose de 1.500 larvas apresentou aumento significativo

da resistência das vias aéreas quando comparado aos animais que receberam

4.500 larvas infectivas (Figura 1).

Figura 1: Efeito da dose de larvas na hiperreatividade brônquica ao 5°dia após a

infecção. Variação da pressão intratraqueal em resposta a acetilcolina (10, 30,

100, 300 ug/kg) em animais normais (sem infecção) e infectados com 150, 500,

1500 e 4500 larvas de S. venezuelensis (5 dias após infecção). Os resultados

foram expressos como média ± erro padrão de 5 animais.* p<0,05, comparando-

se infectado com 4.500 e 1.500 em relação aos demais grupos e # p<0,05,

comparando-se grupo infectado com 1.500 aos demais grupos.

10 100 1000

120

150

500

1500

4500

normais

Acetilcolina (µg/Kg)

Variação da pressão

intratraqueal (%)

2) Infecção pulmonar em ratos infectados com 150, 500, 1.500 e 4.500

larvas de

S. venezuelensis

A migração das larvas através dos pulmões induziu um aumento

significativo de número total de células no lavado broncoalveolar ao 5° dia após

a infecção nos animais infectados com 4.500 larvas quando comparado a

animais não infectados. Por outro lado, o número de células totais não aumentou

significativamente em animais infectados com 150, 500, 1.500 (Figura 2A). O

número de eosinófilos no lavado broncoalveolar aumentou a partir da infecção

com 500 larvas, acentuando-se com a infecção de 1.500 e 4.500 larvas (Figura

2B). Apenas a dose de 4.500 larvas produziu significativo aumento da

peroxidase eosinofílica no lavado broncoalveolar (Figura 2C).

500 1500 4500

de larvas

nº de larvas

Controle

150

Células (X 10

mL)/LBA/mL

Figura 2: Efeito da dose de larvas na inflamação pulmonar. O número de células

totais (A) e eosinófilos (B) no lavado broncoalveolar (LBA) e nível de peroxidase

eosinofílica (EPO) no tecido pulmonar de ratos foram avaliados 5 dias após

infecção com 150, 500, 1500, 4500 larvas de

S. venezuelensis. Os resultados

foram expressos como média ± erro padrão de 5 animais. * p<0,05,

comparando-se grupo infectado com 4500 de

S. venezuelensis em relação aos

grupos infectados com 150, 500 e 1500 larvas de S.venezuelensis e animais

normais.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Controle

150

1500

4500

500

nº de larvas

Eosinófilos (X10

mL)/LBA

0.0

0.5

1.0

1.5

Controle

nº de larvas

150

500 1500 4500

Unidade Arbitrária

(492 nm)

3) Vermes recuperados no intestino após a infecção de doses crescentes

de larvas

A Figura 3 mostra um aumento no número de vermes do intestino de

ratos infectados com 1.500 e 4.500 larvas quando comparados com ratos

infectados com 150 e 300 larvas (Figura 3).

Figura 3: Efeito da dose de larvas no número de vermes recuperados do

intestino. O número total de vermes adultos no intestino foi avaliado ao 5° dia

após infecção com 150, 500, 1500, 4500 larvas de

S. venezuelensis. Os

resultados foram expressos como média ± erro padrão de 5 animais. # p<0,05,

comparando-se infectado com 1500 em relação a de 4.500 larvas de

venezuelensis. * p<0,05 comparando-se o grupo infectado com 4.500 e 1.500 de

S. venezuelensis em relação aos grupos infectados com 150, 500 larvas de S.

venezuelensis.

100

200

300

400

500

600

700

150 500 1.500

4.500

de larvas

Número de vermes/intestino

OBJETIVO 2 : INVESTIGAR SE A HIPERREATIVIDADE BRÔNQUICA AFETA

O CURSO DA INFECÇÃO CAUSADA POR

S. venezuelensis EM RATOS

1) Salbutamol preveniu o aumento da HRB induzida por acetilcolina após a

infecção por

S.venezuelensis em ratos

Experimentos iniciais foram realizados para confirmar se a dose usada de

salbutamol foi suficiente para prevenir mudanças nas funções das vias aéreas. A

administração i.v. de doses crescentes de acetilcolina induziu aumento

significativo na resistência das vias aéreas em ratos que foram previamente

imunizados e desafiados com OVA. O tratamento desses animais com

salbutamol reduziu a HRB induzida restaurando os níveis de pressão

intratrauqueal àqueles dos animais não imunizados e desafiados por OVA

(Figura 4).

Nosso grupo mostrou previamente que a infecção por

S.venezuelensis

causou uma alteração significante da HRB em resposta à acetilcolina que se

iniciou ao 2° dia após a infecção com pico ao 5°dia após a infecção (Silveira

al., 2002). A broncodilatação induzida pelo tratamento com salbutamol preveniu

significativamente o aumento da responsividade das vias aéreas à acetilcolina

no 2° dia após a infecção (Figura 5). Por outro lado, ocorreu um aumento

significativo da HRB no 5° dia após infecção em animais infectados tratados e

não tratados com salbutamol (Figura 6).

Figura 4: Efeito do tratamento com salbutamol em ratos imunizados e

desafiados com ovalbumina. Para avaliarmos a eficácia da dose utilizada de

salbutamol em provocar broncodilatação, investigamos a variação da pressão

intratraqueal em resposta à acetilcolina (10, 30, 100, 300 ug/kg) em animais

desafiados e imunizados com OVA (ovalbumina) e tratados ou não com

salbutamol. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão de 6 a 8

animais. * p<0,05 e ***p<0, 01, comparando-se grupo OVA em relação ao grupo

OVA tratado com salbutamol e controle.

10 100 1000

OVA

OVA + Salbutamol

Controle

Acetilcolina(µg/Kg)

Variação da pressão

intratraqueal (%)

Figura 5: Efeito do tratamento com salbutamol na hiperreatividade brônquica

durante o 2° dia após infecção. Os dados reapresentam a variação da pressão

intratraqueal em resposta à acetilcolina (10, 30, 100, 300 ug/kg) de animais

normais (sem infecção), infectados (2 dias após infecção) e infectados (2 dias

após infecção) mais tratados com salbutamol (4 em 4 horas) durante o período

de 48 horas após infecção. Os resultados foram expressos como média ± erro

padrão de 6 a 8 animais.; * p<0.05, comparando-se grupo infectado

em relação

grupo infectado tratado com salbutamol e controle.

10 100 1000

Infectado + Salbutamol

Infectado

Controle

Acetilcolina (µg/Kg)

Variação da pressão

intratraqueal (%)

Figura 6: Efeito do tratamento com salbutamol na hiperreatividade brônquica

durante o 5° dia após infecção com

S.venezuelensis. Avaliamos a variação da

pressão intratraqueal em resposta à acetilcolina (10, 30, 100, 300 ug/kg) em

animais normais (sem infecção), infectados (5 dias após infecção) e infectados

(5 dias após infecção) mas tratados com salbutamol durante o período de 48

horas após infecção. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão

de 6 a 8 animais. # p<0,05, comparando-se grupo infectado em relação grupo

normal; * p<0,05, comparando-se o grupo infectado em relação grupo infectado

mas tratado com salbutamol.

10 100 1000

100

120

lnfectado + Salbutamol

Infectado

Controle

Acetilcolina (µg/Kg)

Variação da pressão

intratraqueal (%)

2) Efeito do tratamento com salbutamol na infecção

Houve um aumento do número de larvas nos pulmões de ratos tratados

com salbutamol quando comparado ao controle (Figura 7). Além disso, o número

de vermes recuperados do intestino delgado ao 12° dia apos infecção com

venezuelensis nos ratos tratados com salbutamol foi significativamente maior do

que o de animais controle (Figura 7). Por outro lado, ratos tratados com

salbutamol eliminaram um reduzido número de ovos quando comparados aos

animais não tratados (Figura 8). O reduzido número de ovos recuperados foi

devido à significante redução da fecundidade (Figura 8).

Devido ao fato de o tratamento com salbutamol afetar a recuperação de

larvas nos pulmões e de vermes no intestino, avaliou-se os efeitos da droga no

parasito. Salbutamol nas concentrações de 10

-6

a 10

-2

não alterou

significativamente a sobrevida dos vermes e sua habilidade de depositar ovos.

Observou-se, também, que os vermes permaneceram vivos durante e depois de

48 horas em cultura com salbutamol e eliminaram números similares de ovos,

independentemente da concentração de salbutamol (Figura 9).

Para testar a hipótese de que o tratamento com salbutamol poderia influenciar a

contratilidade intestinal, foi realizada ao 2°dia após infecção (dados não

apresentados) e 12° dias após infecção. O tratamento com salbutamol foi capaz

de abolir, a uma pequena resposta, a acetilcolina observada ao 2° dia após

infecção. Por outro lado, infecção induziu um aumento na tensão (

P<0,05) que

foi similar nos animais controle e tratados com salbutamol ao 12° dia de infecção

(Figura 10).

Figura 7: Efeito do tratamento com salbutamol no número de larvas

recuperadas nos pulmões e de vermes recuperados no intestino após infecção

com

S. venezuelensis. Resultados expressam o total de números de larvas no

pulmão (A) ao 2° dia após infecção e vermes adultos no intestino (B) ao 12° dia

após infecção. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão de 6 a

8 animais. * p<0.05, comparando-se o grupo infectado em relação

ao grupo

infectado tratado com salbutamol.

120

Infectado

Infectado + Salbutamol

2 dias após infecçao

Larvas/pulmão

100

200

300

400

500

600

12 dias após infecção

número de vermes/intestino

Figura 8: Efeito do tratamento com salbutamol no número de ovos e

fecundidade de animais infectados com

S.venezuelensis. O número de ovos nas

fezes (A) ao 12° dia após infecção foi avaliado. Número de ovos por vermes

adultos (fecundidade) foi avaliado ao12° (B) dia após infecção. Os resultados

foram expressos como média ± erro padrão de 6 a 8 animais. * p<0.05,

comparando-se o grupo infectado em relação grupo infectado tratado com

salbutamol.

1000

2000

3000

4000

Infectado

Infectado + Salbutamol

12 dias após infecçao

Ovos/g Fezes

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

12 dias após infecçao

Fecundidade

Figura 9: Efeito direto do tratamento com salbutamol em diferentes

concentrações (10

-2

, 10

-3

, 10

-4

, 10

-5

, 10

-6

M) na fecundidade dos parasitos. A

fecundidade foi calculada dividindo-se o número de vermes vivos pelo número

de ovos. Os parasitos em cultura sem salbutamol foram comparados com os que

tiveram tratamento com salbutamol.

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

não

salb

-2

-3

-4

-5

-6

Fecundidade in vitro

Figura 10: Efeitos do tratamento com salbutamol na contratilidade intestinal. A

contração intestinal em resposta a acetilcolina foi avaliada em ratos não

infectados e infectados no 12° dia de infecção por

S.venezuelensis. Resultados

são mostrados como porcentagem de aumento da tensão em comparação aos

valores basais, depois de cada sucessiva dose de acetilcolina. Os resultados

foram expressos como média ± erro padrão de 6 a 8 animais. *** p<0.01,

comparando-se aos grupos controle e controle mais salbutamol em relação aos

grupos infectado e infectado tratado com salbutamol.

-6 -5 -4 -3 -2

100

Controle

Controle + Salbutamol

Infectado

Infectado + salbutamol

***

Log [aceticolina] M

% Contração intestinal

3) Efeito do tratamento com salbutamol na inflamação pulmonar induzida

pelo parasito

O tratamento com salbutamol não alterou os níveis basais de citocinas

nos pulmões de ratos não infectados. Os níveis de IFN-γ foram abaixo do limite

de detecção para o ensaio. Os níveis de citocinas IL-6 e TNF-α não aumentaram

significantemente nos ratos infectados quando comparados aos ratos não

infectados, porém o salbutamol não afetou os níveis dessas citocinas (Figura 11

A). A concentração da IL-10 foi aumentada em ambos os grupos infectados, no

entanto, ocorreu um grande aumento no grupo tratado com salbutamol (Figura

11 C). Os níveis de IL-4 aumentaram para ambos os grupos infectados e

novamente o grupo tratado com salbutamol teve um aumento mais pronunciado

(Figura 11 B).

A migração das larvas induziu um aumento no número total de células no

lavado broncoalveolar ao 2° e 5° dias após a infecção, mas não houve diferença

entre o grupo tratado com salbutamol e o não tratado (Figura 12 A). O número

de eosinófilos no lavado broncoalveolar aumentou depois da infecção,

especialmente ao 5º dia depois da infecção (Figura 12 B), ocorreu também um

aumento da atividade da peroxidase eosinofílica (Figura 12 C). O tratamento

com salbutamol aumentou significantemente o número de eosinófilos e atividade

da peroxidase eosinofílica no lavado broncoalveolar apenas no 5° dia após a

infecção (Figura 12 C)

A patologia pulmonar no grupo infectado e tratado com salbutamol foi diferente

dos animais infectados não tratados, apresentando infiltrado pulmonar difuso e

mais evidente, ao contrário dos animais infectados com S. venezuelensis que

apresentam infiltrado mais local (Figura 13).

100

200

300

2 DAI

5 DAI

IL-4 (pg/100 mg de

tecido pulmonar)

250

500

750

2 DAI

5 DAI

Infectado

Infectado + Salbutamol

IL-6(pg/100 mg

de tecido pulmonar)

Figura 11: Efeito do tratamento com salbutamol na produção de citocinas em

ratos infectados com

S. venezuelensis. Níveis de IL-6 (A), IL-4(B) e IL-10 (C)

registrados no homogenato do tecido pulmonar nos 2° e 5° dias após infecção.

Níveis de citocinas foram mensurados por ELISA como descrito nos Materiais e

Métodos. As linhas tracejadas indicam os níveis basais de IL-6, IL-4 e IL-10 em

ratos não infectados (normais). Os resultados foram expressos como média ±

erro padrão de 6 a 8 animais. ** p<0.001, comparando-se grupo infectado

relação ao grupo infectado tratado com salbutamol.

500

1000

1500

2000

2500

2 DAI

5 DAI

IL-10 (pg/100 mg

tecido pulmonar)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

2 DAI

5 DAI

Eosinófilos (x 10

)/LBA

2 DAI 5 DAI

Infectado

Infectado + Salbutamol

Células ( x 10

)/ LBA

Figura 12: Efeitos do tratamento com salbutamol na inflamação pulmonar de

ratos infectados com

S. venezuelensis. O número de células totais (A) e

eosinófilos (B) no LBA foram avaliados ao 5° e 12° dias após infecção;

nível de

peroxidase eosinofílica (EPO) no tecido pulmonar de ratos foi avaliada 5° dia

após infecção (C). As linhas tracejadas indicam os níveis basais de células e

eosinófilos totais e EPO em ratos não infectados. Os níveis de eosinófilos totais

de animais normais foram significativamente diferentes dos de animais tratados

e não tratados com salbutamol ao 2° e 5° dia após infecção. Níveis de EPO no

pulmão de ratos normais foram significativamente diferentes dos de animais

tratados com salbutamol ao 5° dia após infecção. Os resultados foram expressos

como média ± erro padrão de 6 a 8 animais. * p<0.05, comparando-se grupo

infectado em relação grupo infectado tratado com salbutamol

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

5 dias após infecção

Unidade Arbritária

(492 nm)

Figura 13: Corte histológico do pulmão de rato no 2° dia após a infecção com

venezuelensis.

O corte foi corado com PAS. As fotos histológicas do painel A, B

e C (animal sem infecção, infectado e infectado tratado com salbutamol,

respectivamente). As fotos D, E e F (animal sem infecção, infectado e infectado

tratado com salbutamol, respectivamente). Os cortes histológicos B e C estão no

aumento de 20 X, A e D no aumento de 40 X e E e F no aumento de 60 X. As

setas indicam para células caliciformes do epitélio respiratório.

OBJETIVO 3: AVALIAR O PAPEL DA IL-13 NAS ALTERAÇÕES

FUNCIONAIS PULMONARES E NA INFECÇÃO INDUZIDAS POR S.

venezuelensis EM RATOS

1) O tratamento com anticorpo monoclonal anti-IL-13 não alterou a

hiperreatividade das vias aéreas à acetilcolina ao 5º dia após infecção com

S. venezuelensis

A administração i.v. de doses crescentes de acetilcolina induziu grandes

alterações na resistência das vias aéreas em ratos infectados que receberam

tratamento com anti-IL-13 e em ratos que não receberam tratamento. A IL-13

parece não participar do aumento da resistência das vias aéreas ao 5º dia após

a infecção (Figura 14).

Figura 14: Efeitos do tratamento com anticorpo monoclonal anti-IL13 na

hiperreatividade brônquica de ratos infectados com

S.venezuelensis. Avaliamos

a variação da pressão intratraqueal em resposta à acetilcolina (10, 30, 100, 300

ug/kg) em ratos infectados (5 dias após infecção), tratados com veículo, e

infectados (5 dias após infecção), tratados com anti-IL13. Os resultados foram

expressos como média ± erro padrão de 4 a 5 animais

10 100 1000

Controle

Infectado +Veículo

Infectado + anti-IL-13

Acetilcolina (ug/Kg)

Variação da pressão

das vias reas (%)

2) Efeito do tratamento com anticorpo monoclonal anti-IL-13 na inflamação

pulmonar induzida pelo parasito

A migração de larvas através dos pulmões levou ao aumento de células

totais, eosinófilos e neutrófilos no fluido do lavado broncoalveolar ao 5º após

infecção, mas não causou diferença entre o grupo infectado tratado com anti-IL-

13 e o veículo no número de células totais e neutrófilos, apenas no número de

eosinófilos (figura 15). O tratamento com anti-IL13 não alterou o nível de

peroxidase eosinofílica nos pulmões de animais infectados (Figura 15).

Os níveis de IFN-γ e IL-6 apresentaram-se abaixo dos limites de detecção

do ensaio. Os níveis pulmonares de IL-10, IL-4 e TNF-α foram acentuados nos

animais infectados quando comparados a animais não infectados, porém o

tratamento com anti-IL-13 alterou apenas os níveis de IL-4 (Figura 16). A IL-13

foi dosada ao 5° dia após infecção no tecido pulmonar de animais infectados

(93.04 ± 2.4, n=4) onde foi significativamente maior que animais não infectados

(29.74 ± 9.9, n=5), dados não apresentados.

A infecção por

S.venezuelensis aumentou o número de células

caliciformes no epitélio respiratório. O tratamento com anti-IL-13 reduziu o

número de células caliciformes induzida pela infecção (Figura 17).

5 dias após infecção

Neutrófilos( X 10

)/LBA

Infectado + Veiculo

Controle

Infectado + anti-IL-13

5 dias após infecção

Células(x 10

)/LBA

Figura 15: Efeito do tratamento com anticorpo monoclonal anti-IL-13 na

inflamação pulmonar de ratos infectados com

S. venezuelensis. O número de

células (A), neutrófilos (B) e eosinófilos (C) no LBA e nível de peroxidase

eosinofílica (EPO, figura D) no tecido pulmonar avaliado ao 5° dia após infecção.

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão de 4 a 5 animais.

*p<0.05, comparando-se grupo infectado

em relação ao grupo infectado tratado

comanti-IL-13; linha rachurada representa o grupo controle em D.

0.000

0.025

0.050

0.075

0.100

5 dias após infecção

Eosinófilos (x 10

)/ LBA

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

5 dias após infecção

Unidade Arbritária

(492 nm)

100

200

300

400

5 dias após infecção

Infectado + Veículo

Infectado + anti-IL-13

IL-10(pg/100 mg de

tecido pulmonar)

250

500

750

5 dias após infecção

IL-4(pg/100 mg de

tecido pulmonar)

Figura 16: Efeitos do tratamento com anticorpo monoclonal anti-IL-13 na

produção de citocinas pulmonares de ratos infectados com

S.venezuelensis.

Níveis de IL-10, IL-4 e TNF-α registrados no homogenato do tecido pulmonar no

5° dias após infecção. Níveis de citocinas foram mensurados por ELISA como

descrito nos Materiais e Métodos. Os resultados foram expressos como média ±

erro padrão de 4 a 5 animais.* p<0.05, comparando-se grupo infectado em

relação ao grupo infectado tratado com anti-IL13; linha rachurada representa o

grupo controle.

100

200

300

400

5 dias após infecção

TNF-

(pg/100 mg de

tecido pulmonar)

Figura 17: Quantificação de células caliciformes. O tratamento com anticorpo

monoclonal anti-IL-13 inibiu a hiperplasia de células caliciformes pulmonares ao

5° dia de infecção por

S. venezuelensis. Os resultados foram expressos como

média ± erro padrão de 4 a 5 animais. *** p<0.001, comparando-se grupo

infectado em relação ao

grupo infectado tratado com anti-IL-13.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

Controle

Infectado + Veículo

Infectado + anti-IL13

5 dia após infecção

***

Área do parênquima/ área ocupada

por células caliciformes

3) Efeito do tratamento com anticorpo monoclonal anti-IL-13 no

número de parasitos e ovos

O número de vermes recuperados do intestino delgado no 12° dia após

infecção com

S. venezuelensis nos ratos tratados com anti-IL-13 foi similar aos

animais tratados com veículo (figura 18). Em adição, o número de ovos

eliminados no grupo tratado com anti-IL13 e tratado com veículo foi similar no 5°

e 12° dia após infecção. Por outro lado, ratos tratados com anti-IL-13 eliminaram

um número maior de ovos quando comparados aos animais tratados com

veículo no 7°e 10° dia após infecção (figura 19). A fecundidade foi similar entre

os grupos ao 12° dia após infecção.

4) Efeito do tratamento com anticorpo monoclonal anti-IL-13 na inflamação

intestinal induzida pelo parasito

Os níveis de IFN-γ e IL-4 apresentaram-se abaixo dos limites de detecção

do ensaio. O nível de IL-13 intestinal (dados não apresentados) foi acentuado

nos animais infectados (68.8 ± 8.8, n=4) quando comparados a animais não

infectados (0, n=4) ao 7° dia após infecção. O nível intestinal de TNF-α foi

acentuado nos animais infectados quando comparados a animais não

infectados, porém tratamento com anti-IL-13 não alterou o nível dessa

interleucina durante a infecção(figura 19).

A infecção com

S. venezuelensis aumentou o nível de peroxidase

eosinofílica e o tratamento com anti-IL-13 reduziu esse aumento ao 7° dia após

a infecção (figura 20).

A análise histológica das células caliciformes do tecido intestinal foi

realizada qualitativamente e não demonstrou diferença entre o grupo infectado

tratado com veículo e tratado com anti-IL-13.

300

600

900

1200

1500

12 dias após infecção

Infectado

Infectado + anti-IL-13

Vermes/intestino

Figura 18: Efeito do tratamento com anti-IL-13 no número de vermes

recuperados do intestino e ovos após infecção com

S. venezuelensis. Avaliamos

o total de números de vermes adultos no intestino (A) ao 12° dia após infecção e

de ovos (B) ao 5°, 7°, 10°, 12° dia após infecção(dai) foram avaliados. Todos

esses parâmetros foram avaliados em animais infectados e animais infectados

mas tratados com anti-IL-13 durante o 2°, 4°, 6°, 8° e 10° dia após infecção . Os

resultados foram expressos como média ± erro padrão de 5 animais. * p<0.05,

comparando-se o grupo infectado em relação

ao grupo infectado tratado com

anti-IL-13

5000

10000

15000

20000

5dai 7dai

10dai

12dai

Infectado + veículo

Infectado + anti-IL-13

ovos/g fezes

Figura 19: Efeitos do tratamento com anticorpo monoclonal anti-IL-13 na

produção de citocina intestinal de ratos infectados com

S.venezuelensis. Níveis

de TNF-α registrado no homogenato do tecido intestinal ao 5° e 7° dia após

infecção (DAI). Nível de TNF-α foi mensurado por ELISA como descrito nos

Materiais e Métodos. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão

de 4 a 5 animais. Linha rachurada representa o grupo controle.

250

500

750

Infectado+ veiculo

5 DAI

7 DAI

Infectado + anti-IL-13

TNF(pg/100 mg do

tecido intestinal)

Figura 20: Efeito do tratamento com anticorpo monoclonal anti-IL-13 nos níveis

de peroxidase eosinofílica intestinal de ratos infectados com

S. venezuelensis.

O nível de peroxidase eosinofílica (EPO) no tecido intestinal avaliado ao 7° dia

após infecção. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão de 4 a

5 animais. *p<0.05, comparando-se grupo infectado em relação

ao grupo

infectado tratado com anti-IL-13. Linha rachurada representa o grupo controle.

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Infectado + Veiculo

Infectado + anti-IL-13

7 dias após infecção

Unidade Arbritária

(492 nm)

OBJETIVO 4: AVALIAR O PAPEL DAS FIBRAS SENSITIVAS SENSÍVEIS A

CAPSAICINA NAS ALTERAÇÕES FUNCIONAIS PULMONARES INDUZIDAS

POR S.

venezuelensis EM RATO

1) Avaliação da depleção das fibras aferentes desmielinizadas pelo

tratamento neonatal com capsaicina

Avaliou-se a depleção dos nervos sensoriais sensitivos à capsaicina pelo

teste da formalina. Os animais tratados com capsaicina no período neonatal

mostraram significante redução do teste comportamental denominado “licking

time” quando comparado ao grupo veículo. (figura 21).

Figura 21: Efeito da administração intraplantar de formalina sobre o “licking

time”. Os animais tratados com capsaicina e veículo infectado com

venezuelensis

(5° dia após infecção) receberam uma injeção intraplantar de

formalina 3% (100 µL) e o efeito comportamental foi avaliado por 10 min (1ª

fase). Os resultados são apresentados como média ± erro padrão de 4-5

animais em cada grupo.** P < 0,01, em relação ao grupo controle.

Controle Capsaicina

100

200

300

400

500

600

Licking-time (seg)

2) O tratamento neonatal com capsaicina atenuou o aumento da

responsividade das vias aéreas à acetilcolina ao 5º dia após infecção com

S. venezuelensis

A administração i.v. de doses crescentes de acetilcolina induziu grandes

alterações na resistência das vias aéreas em ratos que receberam capsaicina

durante o período neonatal e foram infectados por

S.venezuelensis (Negrao-

Correa

et al., 2003) mostraram que a infecção por S.venezuelensis foi

acompanhada por um significante aumento na resistência das vias aéreas à

acetilcolina ao 5º dia após a infecção.

Os animais tratados com capsaicina e infectados com S. venezuelensis

apresentaram atenuação da hiperreatividade brônquica ao 5º dia após

infecção quando comparados com ratos infectados não tratados com

capsaicina (figura 22); logo, as fibras C são importantes para

hiperreatividade brônquica induzida por helminto.

Figura 22: Efeitos do tratamento com capsaicina na hiperreatividade brônquica

de ratos infectados com

S.venezuelensis. Variação da pressão intratraqueal em

resposta à acetilcolina (10, 30, 100, 300 ug/kg) em animais infectados (5 dias

após infecção) tratados com veículo e infectados (5 dias após infecção) tratados

com capsaicina no período pré-natal. Os resultados foram expressos como

média ± erro padrão de 4 a 5 animais.;*** p<0.001 comparando-se o grupo

infectado em relação ao infectado tratado com capsaicina e controle. * p<0.05,

comparando-se o grupo infectado

em relação ao tratado com capsaicina mais

infectado.

1 10 100 1000

Infectado

Infectado + Capsaicina

Controle

Acetilcolina(ug/mL)

Variação da

pressão intratraqueal (%)

***

3) Efeito do tratamento neonatal com capsaicina na inflamação pulmonar

induzida pelo parasito

O tratamento com capsaicina não teve efeito significativo na expressão basal de

citocinas nos pulmões de ratos não infectados (dados não apresentados). Os

níveis de INF-γ e IL-10 apresentaram-se abaixo dos limites de detecção do

ensaio. Os níveis pulmonares de IL-6, IL-4 e TNF-α foram acentuados nos

animais infectados quando comparados a animais não infectados, porém o

tratamento com capsaicina não alterou os níveis dessas citocinas (figura 23). A

migração de larvas através dos pulmões levou ao aumento de células totais,

eosinófilos e neutrófilos no fluido do lavado broncoalveolar ao 5º após infecção,

mas não causou diferença entre o grupo infectado tratado com capsaicina e o

veículo (figura 24). Porém, o tratamento com capsaicina aumenta o nível de

peroxidase eosinofílica nos pulmões de animais infectados (figura 24).

A figura histológica mostra que os animais infectados e tratados com capsaicina

apresentam um número maior de eosinófilos quando comparado ao grupo

infectado tratado com veículo (figura 25).

Figura 23: Efeitos do tratamento com capsaicina nos níveis de citocinas

pulmonares de ratos infectados com

S.venezuelensis. Avaliamos os níveis de IL-

4, TNF-α e IL-6 registrados no homogenato do tecido pulmonar no 5° dia após

infecção. Níveis de citocinas foram mensurados por ELISA como descrito nos

Material e Métodos. Os resultados foram expressos como média ± ERRO

PADRÃO de 4 a 5 animais.

100

150

200

250

300

350

IL-4

TNF-α IL-6

Infectado + capsaicina

Controle

Infectado

Níveis de citocinas

(pg/100 mg de tecido pulmonar)

Figura 24: Efeitos do tratamento com capsaicina nos níveis inflamação

pulmonar de ratos infectados com

S.venezuelensis. O número de células totais,

neutrófilos e eosinófilos no LBA (A) e nível de peroxidase eosinofílica (EPO) (B)

no tecido pulmonar foi avaliado ao 5° dia após infecção. Os resultados foram

expressos como média ± erro padrão de 4 a 5 animais. *p<0.05, comparando-se

grupo infectado

em relação ao grupo infectado tratado com capsaicina; linha

rachurada representa o grupo controle

Totais EosinófilosNeutrófilos

Controle

Infectado

Infectado +Capsaicina

Células( X 10

)/LBA

5 dia após infecção

Unidade Arbritária

(492 nm)

Figura 25: Corte histológico do pulmão de rato ao 5° dia após a infecção com

venezuelensis. O corte foi corado com H&E. As fotos histológicas do painel A e

B estão no aumento de 20X (animal infectado e infectado tratado com

capsaicina, respectivamente). As fotos C e D estão no aumento de 40X

(infectado e infectado tratado com capsaicina, respectivamente).

4) A infecção dos animais foi avaliada pelo número de ovos nas fezes

A infecção dos animais por S.

venezuelensis foi comprovada pela presença de

ovos nas fezes (figura 26).

Figura 26: Número de ovos de animais infectados e tratados com capsaicina. O

total de números de ovos no intestino foi avaliado ao 12° dia após infecção em

animais tratados com capsaicina e tratados com veículo. Os resultados foram

expressos como média ± erro padrão de 4 a 5 animais.

1000

2000

3000

12 dias apos infecção

Infectado

Infectado + Capsaicina

Ovos g/fezes

Discussão

1) Importância das alterações funcionais pulmonares na infecção causada

por

S. venezuelensis

Strongyloides venezuelensis é um parasito gastrointestinal que apresenta

uma fase obrigatória de passagem pulmonar antes de se estabelecer na mucosa

intestinal de ratos (Silveira

et al., 2002). As infecções por nematódeos induzem

uma significante mudança na função das vias aéreas do hospedeiro, como por

exemplo, aumento da HRB em resposta à acetilcolina (Silveira

et al., 2002).

Alguns estudos clínicos têm demonstrado que mudanças na função pulmonar

podem ocorrer após a infecção por parasitos com ciclo pulmonar (Miller, 1979;

Phills

et al., 1972), incluindo infecção por S. stercolalis (Ochoa et al., 2003;

Wehner

et al., 1994). Nossos resultados mostram que o tratamento com droga

broncodilatadora durante os primeiros dois dias de infecção preveniu a HRB

induzida pela infecção e facilita o ciclo parasitário, ou seja, um maior número de

parasitas consegue chegar ao intestino. O tratamento com salbutamol também

diminui a resposta contráctil do intestino em resposta a acetilcolina no 2° dia

após infecção. Porém, ao mesmo tempo, a resposta intestinal dos animais

infectados foi muito mais baixa e não foi diferente da dos animais sem infecção.

Sabe-se que a maioria das larvas do

S. venezuelensis alcança o intestino 60

horas após a infecção subcutânea (Silveira

et al., 2002). Somado a este fato, o

salbutamol é rapidamente metabolizado pelo hospedeiro, sua meia-vida é

calculada em 3.4 ± 1.1 horas em ratos (Narasimha & Hiremath, 2004), o que

justifica a falta de efeito da droga nas alterações funcionais pulmonares ao 5° dia

após infecção e na contratilidade intestinal observada em animais tratados e

infectados ao 12° dia após infecção. Logo, esta claro que nenhum efeito precoce

do salbutamol teria efeito no intestino e no estabelecimento do verme no

intestino. Esses resultados indicam que a indução da contração das vias aéreas

poderia afetar a progressão da larva através dos pulmões e facilitar a morte por

mecanismos das imunidades inata e adquirida.

A falta de efeitos diretos do salbutamol no verme e a falta de efeitos do

tratamento precoce com salbutamol na resposta intestinal tardia favorecem a

hipótese apresentada acima. O mecanismo que explicaria a habilidade de o

tratamento com salbutamol aumentar a infecção poderia ser a inibição da

inflamação no pulmão, conseqüentemente facilitando a progressão das larvas.

Vários estudos têm demonstrado claramente a habilidade do tratamento com

salbutamol por curto período e outros B2-adrenoreceptores agonista para inibir o

influxo de eosinófilos

in vivo (Teixeira et al., 1995) e produção de citocinas

(Sekut

et al., 1995). Porém, no nosso modelo experimental o tratamento com

salbutamol induz um significante aumento na produção de citocinas (IL-10 e IL4)

desenvolvido por aumento do infiltrado inflamatório nos pulmões de ratos

infectados. Os dados presentes confirmam os prévios estudos do nosso

laboratório segundo os quais a produção da IL-10 coincide com a passagem do

parasito através dos pulmões e reduz ao 5º dia após a infecção, quando a

inflamação pulmonar é mais evidente. Como o salbutamol parece facilitar a

passagem do parasito através dos pulmões, o aumento nos níveis de IL-10

reflete o grande número de parasitos (Negrao-Correa

et al., 2003; Silveira et al.,

2002). Uma explicação para o aumento dos níveis de IL-10 observados depois

do tratamento com salbutamol seria corroborado por estudos do nosso grupo,

mostrando que ligantes TLR2 induz produção de IL-10 por macrófagos na

presença de agentes que elevam o AMP cíclico, tais com salbutamol (Procopio

et al., 1999). Embora agonista TLR2 do S. venezuelensis não tenha sido

demonstrado, outros helmintos, tais como

S. mansoni, expressam ligantes para

TLR2 e induzem a expressão de IL-10 por células dendríticas (van der

et al.,

2002). O tratamento com salbutamol também aumentou a expressão de IL-4 nos

pulmões de ratos infectados em estágios precoces da infecção. Embora poucos

estudos demonstrem que agonistas В2-adrenoreceptores favoreçam a resposta

Th2 (Lang

et al., 1988), uma possível explicação para este aumento da IL-4

poderia ser o tratamento com salbutamol somado à infecção por

venezuelensis. Além disso, agonistas B2- adrenérgicos têm demonstrado

facilitar o aumento de histamina e liberação de IL-4 em células mastócitos em

linhagens de camundongos (Cho

et al., 2001). Embora a IL-4 seja importante

para os mecanismos imunes que controlam o estabelecimento parasitário no

intestino, nossos estudos não mostram um papel precoce dessa citocina no

curso primário da infecção (Negrao-Correa

et al., 2003). Além disso, durante a

migração parasitaria através dos pulmões, o aumento nos níveis de IL-4 não

está associado com aumento da inflamação eosinofílica, possivelmente devido

aos efeitos anti-inflamatórios da IL-10 que foram elevados juntamente com a IL-4

(Negrao-Correa & Teixeira, 2006; Negrao-Correa

et al., 2003). O elevado

número de eosinófilos e maior infiltrado inflamatório foram detectados em ratos

tratados com salbutamol apenas no 5º dia após infecção; neste tempo o parasito

já se estabeleceu no intestino do hospedeiro, logo os mecanismos pelos quais o

tratamento com salbutamol aumentou os níveis de IL-10 e IL4 parecem não ser

importantes para o estabelecimento do parasito no intestino. As ações

broncodilatadoras do salbutamol são o principal mecanismo pelo qual a droga

facilita o estabelecimento do parasito no intestino.

Um inesperado achado foi o número de ovos nas fezes ao 12° dia após

infecção, que diminui nos animais tratados com salbutamol, em conseqüência da

baixa fecundidade neste grupo. Uma possível explicação para esses achados

seria que o aumento do número de parasitos no intestino, em resposta ao

tratamento com salbutamol, poderia levar à competição entre parasitas e,

conseqüentemente, à diminuição da fecundidade. A competição entre parasitos

é um fenômeno bem estabelecido nos estudos em helmintos adultos em seus

hospedeiros (Hesselberg & Andreassen, 1975) e poderia explicar a baixa

fecundidade na presença de um número aumentado de vermes. Outra

alternativa mais especulativa é que os parasitos precisam receber sinais dos

hospedeiros que favoreceriam a maturação e a ovoposição. No caso

dos

animais PAFR-/- infectados por S. venezuelensis , esses exibiram atraso na

eliminação dos vermes e uma diminuição na fecundidade (Negrao-Correa

et al.,

2004). Como o salbutamol facilitou a passagem dos vermes através dos

pulmões, eles podem não ter recebido adequados sinais para sua maturação.

Como conclusão, os nossos dados sugerem que as alterações funcionais

pulmonares são respostas do hospedeiro contra o parasito com ciclo pulmonar,

com papel na prevenção da excessiva infecção. No entanto, ainda não estão

claros os mecanismos genéticos e moleculares envolvidos na hiperreatividade

brônquica causada pelo parasito com ciclo pulmonar.

2) Papel da IL-13 nas alterações funcionais pulmonares e infecção

induzidas por

S. venezuelensis

A interleucina 13 é uma citocina envolvida em múltiplos processos

fisiológicos e patológicos do organismo. Nossos dados mostram que IL-13 esta

aumentada nos pulmões no 5° dia após a infecção e no intestino no 7° dia após

a infecção por

S. venezuelensis. Muitos dados indicam que a IL-13 tem

importante participação na infecção causada por helmintos (Urban, Jr.

et al.,

1998); no entanto há poucos estudos sobre o papel da IL-13 nas alterações

funcionais pulmonares causadas por parasito. O presente estudo demonstra que

o tratamento com anticorpo monoclonal anti-IL-13 não alterou a HRB induzida

por

S.venezuelensis. Corroborando com os nossos estudos, (Proust et al., 2003)

demonstraram que

a HRB induzida por antígeno pode desenvolver-se

independentemente de IL-4, IL-5, IL-13 e do receptor IL-4α, em camundongos

BALB/c experimentalmente alérgicos. Em contraste, outro estudo mostra que a

inibição da IL-13 pode, quase que completamente, inibir a HRB mesmo com

modesto efeito na inflamação (Leigh

et al., 2004).

O tratamento com anti-IL-13 levou a uma redução no número de

eosinófilos e dos níveis de IL-4. Uma possível explicação para a redução de

eosinófilos é o fato de a IL-13 ser importante para induzir a expressão de

eotaxina nas células epiteliais (Li et al., 1996). Além disso, sabe-se que a

eotaxina estimula eosinófilos a secretar IL-4. Exógena administração (Grunig

al.

, 1998; Singer et al., 2002; Wills-Karp, 2000) ou expressão exagerada de IL-13

induz infiltração celular de neutrófilos, eosinófilos e células mononucleares

dentro dos pulmões com estimulação de muitas quimiocinas, como eotaxina

(CCL11) e KC. O número reduzido de eosinófilos e IL-4 secundários à redução

da IL-13 não causaram alteração na HRB. No entanto, a IL-4, como vem sendo

relatada, está envolvida independentemente de IL-13 na HRB em asma

experimental e na hiperplasia de células caliciformes (Perkins

et al., 2006b).

Além disso, alguns estudos mostram a importância da IL-4 para HRB induzida

por filaria (Mehlotra

et al., 2001) já outros estudos mostram a importância da IL-5

e eosinófilos (Hall

et al., 1998). Em nosso modelo de infecção, a redução da IL-

4, juntamente com a IL-13, não alterou a HRB na infecção causada por

S.venezuelensis. Provavelmente, essas interleucinas não possuem papéis

centrais na hiperreatividade brônquica causada por

S. venezuelensis, mas

podem ter efeitos importantes quando somadas a outros fatores. Ações

conjuntas da IL-13 com TNF- α para produção de eotaxina vêm sendo

demonstrado (Li

et al., 1999). Além disso, receptores de TNF- α são expressos

na musculatura lisa das vias aéreas; em adição o TNF- α aumenta a

contratilidade

in vitro das vias aéreas em camundongos (Chen et al., 2003). De

maneira interessante, os níveis de TNF-α encontram-se aumentados ao 5º dia

após infecção em nosso modelo e coincide com o pico de hiperreatividade

brônquica (Silveira et al., 2002). O tratamento com anti-IL-13 não influenciou os

níveis de TNF- α no pulmão.

Muitos estudos mostram que HRB em modelos experimentais de asma é

dissociada da inflamação; da mesma forma alguns estudos com helmintos

também mostram que a HRB na infecção parasitaria é independente de

eosinófilos (Coyle

et al., 1998). Paralelamente à diminuição da inflamação

eosinofílica, houve uma diminuição de células caliciformes nos animais tratados

com anticorpo monoclonal anti–IL-13 e infectados com

S.venezuelensis quando

comparados a animais infectados sem tratamento. Sabe-se que IL-13 também

apresenta papel importante no remodelamento, das vias áreas de asmáticos,

(Leigh

et al., 2004) caracterizado por hiperplasia de células caliciformes e fibrose

subepitelial. Estudo associa a HRB ao aumento de muco em modelo de asma

experimental (Morcillo & Cortijo, 2006), outros não encontram associação entre

os dois fenômenos (Cohn

et al., 1999). Igualmente, os nossos dados mostram

que a diminuição do muco não causou alterações na hiperreatividade brônquica.

Estudos prévios demonstram que a indução de células caliciformes pela IL-13 é

dependente parcialmente da inflamação (Shim

et al., 2001; Singer et al., 2002).

Logo, a diminuição da inflamação em animais infectados e tratados com anti-IL-

13 pode ter contribuído para a redução de células caliciformes.

Embora a IL-13 possa agravar a eosinofilia em modelos de inflamação

alérgica (Park

et al., 2003; Walter et al., 2001; Wills-Karp, 2000), ela também

pode exibir importantes propriedades anti-inflamatórias. A IL -13 pode induzir a

expressão de antagonista IL-1R (Vannier

et al., 1996) e diminuir a regulação de

citocinas pró-inflamatórias e IL-12 em monócitos. Ela tem sido também

reportada como tendo efeitos anti-inflamatórios em encefalite experimental

autoimune (Cash

et al., 1994), modelos de artrite (Isomaki et al., 1996) e em

alguns modelos de inflamação alérgica aguda (Lentsch

et al., 1999).

Em suma, a IL-13 não é essencial para HRB causada por

venezuelensis. Por outro lado, esses dados diferem da maior parte dos modelos

experimentais de asma que mostram que a IL-13 é fundamental para HRB. Em

seguida, podemos sugerir que no nosso modelo de infecção a hiperreatividade

brônquica não é totalmente dependente de eosinófilo e da produção de muco.

O tratamento com anti-IL-13 não afetou a hiperreatividade brônquica

induzida pelo

S. venezuelensis, mas afetou significativamente a produção de

ovos no 7° e 10° dia após a infecção. O número de vermes e ovos no 12° dia

após infecção não foi significativamente afetado pelo tratamento com anti-IL-13.

É bem conhecido o papel dominante da resposta Th2, para expulsão de

um número de parasitos entéricos, incluindo

T. spiralis, N.brasiliensis, H.

polygyrus e T.muris (Akiho et al., 2002; Urban, Jr. et al., 1998)

. As IL-4 e IL-13

quando se ligam ao receptor IL-4 tipo2(IL-4Rα/IL-13α1) são unicamente ligada a

sinalização da STAT 6. A importância da IL-4 e IL-13, na expulsão do parasito é

reforçada por muitos estudos. O nosso grupo estudou camundongos deficientes

em receptor de IL-4 ou STAT 6 e infectados com

S. venezuelensis e mostrou

atraso na eliminação de vermes juntamente com abolição da produção de IgE

mas sem alteração da eosinofilia tecidual induzida pela infecção. O presente

estudo não mostrou significativo atraso na eliminação do parasito no 12°dia após

infecção em ratos tratados com anti-IL-13 pois o número de vermes não foi

diferente entre o grupo tratado com anti-IL-13 e veículo, no entanto não

podemos afirmar que o tratamento com anti-IL-13 não afetaria a expulsão de

parasitos em dias anteriores no 12° dia. Ao 7° e 10° dia após a infecção houve

maior produção de ovos coincidindo com diminuição dos níveis de peroxidase

eosinofílica no intestino no 7° dia.

Esses resultados mostram que a IL-13 é importante para a fase intestinal

da infecção, especialmente na produção de ovos pelo

S. venezuelensis e

eosinofilia intestinal.

3) Papel das fibras nervosas sensíveis à capsaicina na hiperreatividade

brônquica induzida por

S. venezuelensis

O sistema nervoso excitatório e o sistema não adrenérgico e não

colinérgico (NANC) têm-se demonstrado importantes nas mudanças observadas

nas vias aéreas de humanos e animais. A ativação das fibras sensoriais C nas

vias áreas libera neurocininas tais como, substância P e neurocinina A (Barnes,

1996). Esses peptídeos são importantes neuromediadores de efeitos biológicos

dentro dos pulmões, tais como a contratilidade da musculatura lisa das vias

aéreas. A depleção de neurocinína pelo tratamento neonatal com capsaicina

produz irreversível dano das fibras sensoriais, levando à perda permanente e

degeneração de 50 a 90% de todas as fibras não mielinizadas aferentes (Jancso

et al., 1977). As fibras nervosas sensoriais são a maior fonte de taquicininas

(Holzer, 1998).

A infecção por neomatódeos induz uma mudança significante nas

funções das vias aéreas do hospedeiro. O

S. venezuelensis induz HRB com pico

ao 5° dia de infecção (Silveira

et al., 2002). Os nossos dados demonstram que a

perda permanente das fibras C inibe a HRB induzida pelo parasito. Algumas

hipóteses poderiam explicar esses achados. Primeiro, a estimulação das fibras

sensoriais das vias aéreas por helmintos liberaria substância P e neurocinina A

que levariam à broncoconstrição por diferentes mecanismos, tanto pela ativação

direta dos receptores NK2 quanto por estimulação ou facilitação da contração

colinérgica causada por taquicininas ou degranulação de mastócitos. (De Swert

& Joos, 2006). Em segundo, Sakae et al. (1994) sugerem que a acetilcolina

requer nervos sensitivos à capsaicina para realizar seus efeitos no tecido

pulmonar e que, por isso, animais tratados com capsaicina seriam menos

responsivos à metacolina. Por último, e igualmente importante, durante a

infecção por helminto a produção de muco aumenta e isso levaria a HRB, visto

que o aumento de muco pode ser mediado pelas neurocininas (Sakae

et al.,

1994).

No entanto, nossos resultados indicam que a HRB não diminui em

animais que possuem diminuição do muco conseqüente ao tratamento com

anticorpo monoclonal anti-IL-13.

O S. venezuelensis tem uma rápida passagem pelos pulmões (6 a 72

horas).

O número de larvas ao 5° dia após infecção é insignificante. No entanto,

o pico de HRB ocorre no momento

em há um número insignificante de larvas

nos pulmões e não durante o pico de larvas neste órgão

(Silveira et al., 2002).

Quando as vias aéreas são dilatadas durante o período de pico de larvas nos

pulmões (2°dia após infecção), o número de vermes que atingem a maturidade e

de vermes que alcançam o intestino é maior do que na ausência da

broncodilatação, portanto a HRB ao 2º dia após infecção poderia impedir a

passagem de vermes dos pulmões o para intestino. O tratamento neonatal com

capsaicina diminui HRB ao 5°dia após infecção; no entanto, a diminuição da

HRB poderia também acontecer durante o 2º dia após infecção e facilitar a

chegada dos vermes ao intestino. O 2º dia após infecção não foi estudado, pois

objetivamos desvendar o mecanismo da HRB, e o 5º dia após infecção é pico

de HRB, além disso, como já demonstrado (Negrao-Correa

et al., 2003), os

parasitos podem modular alterações na HRB no 2º dia após infecção e poderiam

mascarar os possíveis resultados.

Alguns estudos demonstram que o tratamento neonatal com capsaicina

aumenta a inflamação ao ozônio (Sterner-Kock

et al., 1996) e aumenta a HRB

quando exposto ao gás SO2 (Long

et al., 1997), o mesmo ocorrendo durante a

infecção por

Mycoplasma pulmonis (Bowden et al., 1996) e em ratos

sensibilizados e desafiados com ovalbumina (Medeiros

et al., 2001). Quando as

fibras C são estimuladas por agentes nocivos pode ocorrer uma variedade de

respostas fisiológicas que protegem os pulmões contra possíveis danos; como,

por exemplo, secreção de muco (Richardson & Peatfield, 1987), alteração na

freqüência do batimento ciliar (Eljamal

et al., 1994; Wong et al., 1990; Wong et

al.

, 1991) e tosse; todas essas alterações poderiam auxiliar na expulsão de

agentes nocivos e na limpeza pulmonar. A broncoconstrição das vias aéreas

também é um mecanismo protetor que pode ser ocasionado pela ativação das

fibras C (Bergren & Rendell, 2004). No caso da infecção ocasionada por S.

venezuelensis, a broncoconstrição impediria a progressão da infecção; por outro

lado, a produção de muco, a tosse e o aumento da freqüência do batimento ciliar

poderiam facilitar a saída do parasito dos pulmões para o intestino, e, dessa

forma, não ter um papel protetor para o hospedeiro. Apesar de o muco conter

células responsáveis pela defesa do hospedeiro, não seria surpreendente que o

muco favorece o parasito, como saída do pulmão ao intestino. Essa hipótese

necessita de maior esclarecimento, visto que não há evidências na literatura que

a suportem.

Além da diminuição da HRB, nossos resultados também mostram que o

tratamento neonatal com capsaicina em ratos infectados por

S. venezuelensis

aumentou a peroxidase eosinofílica (EPO). A degranulação de eosinófilos leva a

liberação de proteínas catiônicas, tais como EPO que podem, através da

estimulação das fibras, C levar à inflamação e HRB (Lee

et al., 2001). Nossos

resultados anteriores mostram que eosinófilos não são fundamentais para HRB,

em nosso modelo de infecção. Alguns trabalhos não encontram aumento de

eosinófilo após tratamento neonatal com capsaicina. (Medeiros

et al.; Davies et

al.

, 1994). MEDEIROS et al. (2001) demonstraram que o tratamento neonatal

com capsaicina aumentou o número de neutrófilos, mas não de eosinófilos no

lavado broncoalveolar em ratos sensibilizados e desafiados com ovalbumina.

Outros trabalhos mostram que, após degeneração das fibras C por tratamento

neonatal de capsaicina, ocorre aumento na inflamação, concluindo-se que a

fibra C tem papel protetor contra a inflamação (Vesely

et al., 1999; Lee et al.,

2001; Sterner-Kock et al., 1996). Esses dados estão de acordo com os nossos

resultados que demonstram aumento de eosinófilos no pulmão em animais

infectados com degeneração das fibras C quando comparados a animais

infectados que possuem as fibras C intactas.

Nossos estudos demonstram que HRB ocasionada por

S. venezuelensis

em ratos é independente de eosinófilos, IL-13, IL-4 e muco, e que, a diminuição

da hiperreatividade brônquica em animais infectados e tratados com capsaicina,

não foi acompanhada por queda nos níveis de TNF-α, sugerindo que essa

citocina pode não ter papel fundamental na HRB induzida por

S. venezuelensis

como discutido no tópico acima. Há contradições sobre o efeito do tratamento

pré-natal com capsaicina na inflamação e HRB e isso possivelmente se deva a

uso de diferentes espécies de animais. Em porcos da índia, a SP e NKA são

ambos potentes broncoconstritores; em ratos, dependo da linhagem, as

taquicininas são tanto potentes broncoconstritores (Joos

et al., 1986) quanto

broncodilatadores (Devillier

et al., 1992). Além disso, os diferentes modelos de

inflamação também levam a diferentes resultados sobre o papel da fibra C.

A ausência permanente de fibras C no nosso modelo experimental levou

a um aumento da inflamação; no entanto, houve uma diminuição da HRB,

indicando mais uma vez que essas alterações são independentes no nosso

modelo de hiperreatividade brônquica causada por helminto. Múltiplos estudos,

como os desafios com OVA, demonstram dissociação entre componentes

celulares inflamatórios (particularmente eosinófilos) e HRB (Taube

et al., 2002;

Walter

et al., 2001; Yang et al., 2004).

Em suma, a perda permanente da fibra C reduz a HRB induzida por

helminto ao 5° dia de infecção e aumenta a inflamação, sugerindo novamente

que a HRB induzida por

S.venezuelensis pode ser independente da inflamação.

A relevância das fibras C para alterações funcionais pulmonares durante a

infecção por helminto leva-nos a acreditar que elas seriam importantes para a

infecção e isso vem sendo investigado em nosso laboratório.

Conclusão

Baseando-se nos nossos resultados podemos concluir que:

1. O parasito induz hiperreatividade brônquica e é inóculo-dependente.

2. A broncoconstrição é uma importante alteração funcional pulmonar

durante a infecção, visto que sua diminuição leva a maior passagem de

larvas através do pulmão e a maior recuperação de vermes no intestino

porém reduzido número de ovos.

3. A IL-13 não é fundamental para hiperreatividade brônquica ocasionada

por

S. venezuelensis em ratos, mas é importante para aumento de

células caliciformes no pulmão, aumento de eosinófilos no LBA,

produção de ovos pelo parasito e eosinófilos no intestino durante a

infecção.

4. A hiperreatividade brônquica ocasionada por

S. venezuelensis em ratos é

dependente de terminações sensórias sensitivas, sensíveis à capsaicina.

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