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DANIEL CURY OGATA
FOCO DE CRIPTAS ABERRANTES E CÂNCER
COLORRETAL: análise da via Wnt/ β-catenina.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação Stricto Sensu em Cirurgia da
Pontifícia Universidade Católica do Paraná,
como pré-requisito para a obtenção do título
de Mestre em Cirurgia.
Orientador: Prof. Dr. Fernando Hintz Greca
Curitiba
2008
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Livros Grátis
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho à minha esposa, Aline Bianca Mendonça Ogata, devota
companheira, que sempre esteve ao meu lado e sempre me incentivou.
À minha filha, Gabrielle Mendonça Ogata, razão dos meus esforços.
Aos meus pais pela educação e por mostrar o caminho da dignidade.
Ao meu irmão, exemplo de profissional, que sempre foi considerado por mim
o ideal a ser alcançado.
II
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AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu orientador, Prof. Dr. Fernando Hintz Greca, pela ajuda e
apoio.
Agradeço ao Prof. Dr. Sérgio Ossamu Ioshii, pelo incentivo.
Agradeço a todos do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia da PUC-PR,
que propiciaram as condições necessárias para a realização deste projeto.
III
SUMÁRIO
LISTA DE TABELA..................................................................................................... V
LISTA DE QUADROS ................................................................................................ V
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. VI
ABREVIATURAS...................................................................................................... VII
RESUMO................................................................................................................. VIII
ABSTRACT ............................................................................................................... IX
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................11
1.1 OBJETIVOS......................................................................................................................13
2 LITERATURA ........................................................................................................14
2.1 RELAÇÃO COM A β-CATENINA .................................................................................18
2.1.1 β-Catenina e Foco de Criptas Aberrantes.......................................................................22
2.1.2 β-Catenina e Câncer Colorretal ......................................................................................23
2.2 RELAÇÃO COM O KI-67 (MIB-1) .................................................................................24
2.3 TISSUE MICROARRAY .................................................................................................25
3 MÉTODOS ............................................................................................................27
4 RESULTADOS ......................................................................................................39
5 DISCUSSÃO .........................................................................................................45
5.1 FOCO DE CRIPTAS ABERRANTES..............................................................................45
5.2 β-CATENINA E CCR.......................................................................................................46
5.3 β-CATENINA E FOCO DE CRIPTAS ABERRANTES ..................................................47
5.4 TISSUE MICROARRAY .................................................................................................48
6 CONCLUSÕES .....................................................................................................49
7 REFERÊNCIAS.....................................................................................................50
8 ANEXOS ...............................................................................................................54
IV
LISTA DE TABELA
Tabela 1 - Coeficiente de concordância (Kappa) entre a β-catenina e o Ki-67: 0,38
(fraca concordância)..................................................................................................41
Tabela 2 - Coeficiente de concordância (Kappa) entre a β-catenina nuclear e
membrana citoplasmática: 0,40 (fraca concordância) ...............................................42
Tabela 3 - Freqüência de displasia nos FCA ........................................................43
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Genes alvos transcritos relacionados com a B-catenina..................22
Quadro 2 - Quadro 2 - Freqüência dos FCA em relação ao tumor.....................42
Quadro 3 - Quadro 3- Síntese do padrão de distribuição dos FCA e perfil da
expressão dos anticorpos..........................................................................................44
V
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Ilustração esquemática da via Wnt/ β-catenina, representando a
destruição da molécula de β-catenina na ausência de ligantes Wnt pelo complexo de
ataque. ......................................................................................................................20
Figura 2 - Ilustração esquemática mostrando a dissociação do complexo de ataque,
na presença de ligantes Wnt, acúmulo citoplasmático da β-catenina e posterior
translocação em direção ao núcleo. No núcleo a β-catenina trabalha como co-fator
para a transcrição do T cell factor (TCF) e lymphoid enhancing factor (LEF),
modulando a expressão de um amplo espectro de genes alvos...............................21
Figura 3 - Cilindro de aço com superfície cortante de 1 cm
2
.....................................28
Figura 4 - Segmento de intestino grosso, aberto longitudinalmente e evidenciando
neoplasia colorretal ...................................................................................................28
Figura 5 - O mesmo espécime cirúrgico da figura 3 após a coleta dos fragmentos a
1 e 5 cm proximais da lesão e 1 e 5 cm distais da lesão ..........................................29
Figura 6 - Fotomicrografia de cólon, mostrando cripta aumentada de tamanho, lúmen
com aspecto de dente de serra e células caliciformes hiperdistendidas (asterisco)
(HE 200x). .................................................................................................................30
Figura 7 - Fotomicrografia revelando cripta aberrante com redução na produção de
mucina, além de pseudoestratificação (asterisco) (HE 400x)....................................31
Figura 8 – Bloco doador ...........................................................................................32
Figura 9 – Matriz ordenada por letras nas colunas (A) e números nas linhas (B).....32
Figura 10 – Desenho esquemático do bloco receptor...............................................33
Figura 11 – A pinça, previamente aquecida, é introduzida no bloco doador .............33
Figura 12 – Colocação de um fragmento na matriz...................................................34
Figura 13 – Montagem do bloco receptor..................................................................34
Figura 14 – Após a colocação dos fragmentos na forma (A), coloca-se um cassete
para formar a base (B). O resultado final é um bloco multi-amostral, contendo um
fragmento de tecido hepático como marcador para a leitura das lâminas (C) ..........35
Figura 15 – Lâminas dos blocos receptores..............................................................35
Figura 16 – Desenho esquemático dos blocos receptores do grupo tumor ..............36
Figura 17 – Desenho esquemático do bloco receptor do grupo P1...........................37
Figura 18 – Desenho esquemático dos blocos receptores restantes, P5, D1 e D5...37
Figura 19 - Fotomicrografia mostrando imunorreação para a β-catenina (coloração
acastanhada- seta). Controle mesenquimal negativo (asterisco) (β-catenina 200x).39
Figura 20 - Fotomicrografia realçando imunorreatividade nuclear (coloração
acastanhada- seta) para a β-catenina (β-catenina 1000x)........................................40
Figura 21 - Fotomicrografia mostrando imunorreatividade nuclear (coloração
acastanhada- seta) para o Ki-67 (Ki-67 200x)...........................................................41
Figura 22 - Gráfico mostrando distribuição dos FCA ao redor do tumor ...................43
VI
ABREVIATURAS
AOM - Azoximetano.
CA - Criptas aberrantes.
CCR - Câncer colorretal.
CEA - Antígeno carcinoembrionário.
Cish - Hibridização in situ cromogênica.
DD - Doença diverticular.
DMH - 1,2 dimetilhidrazina.
FCA - Foco de criptas aberrantes.
Fish - Hibridização in situ fluorescente.
GSK-3β - Glicogênio sintetase quinase 3β.
HE - Hematoxilina e eosina.
PUC-PR - Pontifícia Universidade Católica do Paraná.
STAT3 - Transdutores de sinais e ativadores de transcrição.
TMA - Tissue microarray.
VII
RESUMO
Introdução: o câncer colorretal (CCR) é uma das neoplasias mais incidentes no
Brasil. Vários estudos têm sido realizados para elucidação das vias que levam à
carcinogênese, entre eles a via Wnt/ β-catenina. Alguns autores postularam a
existência de criptas anormalmente alargadas e correlacionaram a presença delas
com o CCR. Essas criptas foram denominadas de criptas aberrantes (CA).
Objetivos: correlacionar a presença de foco de criptas aberrantes (FCA) próximas a
um tumor de região colorretal, avaliando o papel desta entidade na carcinogênese
desses órgãos, por meio da expressão da β-catenina no núcleo dos colonócitos.
Métodos: utilizaram-se 21 espécimes cirúrgicos contendo adenocarcinoma colônico.
Foram coletadas amostras localizadas a 1 cm proximal e distal e 5 cm proximal e
distal ao tumor, bem como um fragmento da própria neoplasia. Os FCA foram
identificados e, posteriormente, realizou-se a técnica de tissue microarray (TMA)
para esses focos e a neoplasia. Os anticorpos utilizados foram a β-catenina e o Ki-
67. Resultados: a expressão da β-catenina nuclear nos colonócitos dos
adenocarcinomas atingiu freqüência de 81%. O Ki-67 obteve a mesma freqüência.
Apesar disso, o coeficiente de concordância (Kappa) foi de 0,38, revelando fraca
concordância. A expressão da β-catenina citoplasmática nos colonócitos dos
adenocarcinomas alcançou freqüência de 66,7%. Em relação aos FCA, foram
observados 20, distribuídos em 11 dos 21 segmentos intestinais, sendo que 8
estavam a 1 cm proximal e 5 localizavam-se a 5 cm proximais ao tumor. A displasia
foi observada em apenas 2 casos, localizados a 1 cm proximal, e outro, a 1 cm distal
ao tumor. Nenhum dos FCA apresentou imunorreação para a β-catenina e Ki-67.
Conclusões: nas áreas situadas a 1 cm da neoplasia colorretal, foi observada maior
concentração de FCA em relação às áreas situadas a 5 cm do tumor. No entanto,
não se observou correlação entre a expressão da β-catenina nos colonócitos das CA
nas áreas estudadas.
DESCRITORES: Lesões pré-cancerosas, Neoplasias colorretais.
VIII
ABSTRACT
Background: the colorectal cancer (CRC) is a more incidents of cancer in Brazil.
Several studies have been conducted for elucidation of the pathways leading to
carcinogenesis, including by Wnt / β-catenina. Some authors’ postulate the existence
of crypts unusually extended and the presence of them correlated with colorectal
cancer. These crypts were called aberrant crypt (AC). Objectives: to analyze the
mutation of Wnt pathway and accumulation of β-catenina in the nucleus of colorectal
adenocarcinomas of the junction and assess the presence of an outbreak of aberrant
crypt foci (ACF) in the vicinity of the tumor, correlating them with the carcinogenic
progression. Methods: it was used 21 surgical specimens containing colonic
adenocarcinoma. We collected samples located within 1 cm proximal and distal and
5 cm proximal and distal to the tumor and a fragment of the neoplasia. The ACF were
identified and subsequently took up the technique of tissue microarray (TMA) for
these outbreaks and cancer. We have used the antibodies β-catenina and Ki-67.
Results: the nuclear expression of β-catenina in the colonocyts of adenocarcinoma
has reached 81%. The Ki-67 returned the same frequency. Despite that the
coefficient of agreement (Kappa) was 0.38, indicating weak agreement. The
cytoplasmatic expression of β-catenina in the colonocyts of adenocarcinomas
reached 66.7%. For ACF, were found 20, distributed in 11 of 21 colons and that 8
were 1 cm proximal and 5 located up to 5 cm proximal to the tumor. The dysplasia
was observed in only 2 cases, located at 1 cm proximal and another to 1 cm distal to
the tumor. None of the ACF presented immunoreaction for β-catenina and Ki-67.
Conclusions: in areas located within 1 cm of colorectal neoplasm was observed
highest concentration of ACF for areas to 5 cm from the tumor. However there was
no correlation between the expression of β-catenina in colonocyts of ACF in the
areas studied.
DESCRIPTORS: Conditions precancerous, colorectal neoplasm.
IX
1 INTRODUÇÃO
O câncer colorretal (CCR) é a quinta neoplasia maligna mais comum em
homens e a quarta em mulheres. A faixa etária de maior incidência situa-se entre os
50 e 70 anos, todavia não é raro o surgimento desse tumor em pacientes mais
jovens, abaixo dos 40 anos
1
.
No Brasil, a incidência para CCR varia amplamente dependendo da região,
segundo dados dos registros de câncer local. No sul do país, existem
aproximadamente 21 casos novos para cada 100.000 habitantes ao ano, enquanto
que no norte esse número é de aproximadamente três casos novos para cada grupo
de 100.000 residentes, durante o mesmo período
1
.
O processo evolutivo do CCR envolve uma série de etapas que estão
relacionados com o acúmulo de mutações genéticas
2
. Essas mutações podem
ocorrer tanto em oncogenes como em genes supressores de tumor. Mutações nos
genes K-ras e APC, por exemplo, têm importante papel na carcinogênese colorretal.
O gene APC atua principalmente na regulação de uma proteína denominada β-
catenina
3
. Essa proteína, cuja função é a de aderência celular, é degradada no
citoplasma por meio de proteólise pelo complexo de ataque APC/ axina/ Glicogênio
sintetase quinase 3β (GSK-3β). A mutação do gene APC pode ativar uma via que
dissolve o complexo de ataque. Com isso, a proteólise da β-catenina não ocorre e
essa molécula torna-se estável no citoplasma, podendo posteriormente alcançar o
núcleo. No núcleo, a β-catenina pode modular a expressão de vários genes alvos
que favorecem a carcinogênese. Assim, a partir de um epitélio normal, dá-se início à
proliferação celular, passando pela etapa de adenoma até carcinoma invasor
4, 5, 6
.
Apesar do conhecido papel da β-catenina na carcinogênese do cólon, a identificação
dessa proteína no núcleo de células neoplásicas de adenocarcinoma não é
constante
2, 7, 8
.
12
Recentemente foram observadas criptas colônicas anormalmente alargadas,
identificadas em cólon humano após serem coradas com azul de metileno. Essas
criptas tinham similaridade àquelas observadas em roedores, quando expostos ao
azoximetano (AOM), um carcinógeno específico para cólon. Bird, em 1988, foi quem
primeiro descreveu essas criptas, chamando-as de FCA, além de reconhecê-las
como lesões precoces e precursoras do CCR
9
.
Na colonoscopia, os FCA podem ser evidenciados quando a mucosa é
submetida à coloração com azul de metileno. As áreas suspeitas de apresentarem
FCA coram-se com uma tonalidade de azul que contrasta com a cor da mucosa
adjacente
10
.
Alguns autores acreditam que os FCA podem ser precursores do CCR. Em
humanos, a maior concentração de CA coincide justamente com as áreas mais
distais do cólon, em que o CCR é mais freqüente, aliás, situação essa também
verificada em estudos animais, quando adenocarcinomas foram induzidos em cólon
de ratos. O tamanho dessas lesões tende aumentar com o tempo. A presença de
displasia foi um marco na evolução de tais lesões para a progressão neoplásica
11-17
.
As mutações dos genes APC e K-ras, alterações importantes observadas em
pacientes com CCR, também foram identificadas em pacientes com FCA
12
.
Contudo, a expressão nuclear da β-catenina em FCA é controversa. Alguns autores
classificam as criptas que acumulam β-catenina nuclear como entidade distinta.
Outros defendem a expressão nuclear dessa proteína em FCA
18, 19, 20
.
As alterações moleculares, os achados morfológicos e o padrão de
crescimento têm contemplado a hipótese de que os FCA são lesões precursoras
iniciais do CCR. Alguns autores sugerem que a tradicional seqüência adenoma-
carcinoma na progressão tumoral do intestino grosso pode ser estendida para a
seqüência FCA-adenoma-carcinoma
10
.
A natureza pré neoplásica dos FCA parece já estar bem estabelecida
11-17
. No
entanto, estudos que mostrassem a distribuição, a densidade e a dimensão dessas
criptas, no cólon de populações de risco, constituiriam importante contribuição na
profilaxia do CCR.
13
1.1 OBJETIVOS
Avaliar a presença de FCA próximas a um adenocarcinoma colorretal,
correlacionando-as com a carcinogênese, por meio da expressão da β-catenina no
núcleo dos colonócitos.
2 LITERATURA
Em 1987, foram identificados em modelos experimentais (murinos),
submetidos à exposição a carcinógenos, criptas anormalmente alargadas, com
camada epitelial espessada e aumento na zona peri-críptica. Essas criptas foram
denominadas CA. Essas alterações morfológicas podiam ser induzidas em murinos
expostos de maneira dose-dependente, durante duas semanas a uma dosagem
baixa de carcinógeno. Observou-se que seu crescimento era afetado por
modificações dietéticas e sua distribuição estava amplamente localizada em cólon
distal
9
.
McLellan e Bird
21
avaliaram a especificidade de indução de CA, utilizando
dois grupos diferentes de camundongos. Usando seis carcinógenos de cólon, três
agentes carcinógenos não relacionados a cólon e cinco agentes não carcinógenos,
chegaram à conclusão de que a formação de CA era específica para carcinógenos
de cólon. Apenas dois dos seis carcinógenos específicos de cólon obtiveram
resultados negativos. Um deles não resultou em CA em um dos grupos de
camundongos, e o outro carcinógeno não induziu a formação de CA em ambos os
grupos de camundongos. Essas falhas podem ter ocorrido devido à já conhecida
ação reduzida desses carcinógenos em cólon de murinos. Esse mesmo estudo
expôs grupos de 10 camundongos à irradiação gama para avaliação da
especificidade. Nenhum camundongo exposto à irradiação apresentou indução de
CA.
Outro estudo utilizando o carcinógeno azoximetano (AOM) avaliou se as
características das CA suportam a hipótese de que elas são lesões pré-neoplásicas
potenciais. Esse modelo experimental utilizou dois tipos diferentes de camundongos.
O estudo foi dividido em três fases. A primeira foi desenhada para determinar a
ocorrência e o número de CA. A segunda procurou avaliar se a indução dessas
criptas era dose-dependente e a última avaliou o efeito da dieta rica em gorduras na
15
formação dessas lesões. Na primeira fase, foi observada a ocorrência de FCA nos
ratos expostos ao carcinógeno a partir da segunda semana. Na segunda, foi
revelado aumento evidente de FCA em resposta ao aumento nas dosagens de
AOM. Nessa etapa também foi notado que os ratos expostos a doses maiores de
AOM apresentaram um relativo aumento de FCA em direção ao ceco. A última fase
comparou ratos submetidos à dieta pobre com dieta rica em gorduras. Os resultados
dessa fase mostraram que todos os ratos que tiveram dieta rica em gordura
apresentaram número aumentado de FCA quando comparado aos ratos expostos à
dieta pobre em gordura. No entanto, a diferença estatística foi significativa apenas
nos ratos sacrificados na 16ª semana
22
.
McLellan et al.
13
observaram a análise seqüencial de crescimento e
características morfológicas dos FCA. O estudo foi realizado em ratos submetidos à
injeção única de 1,2-dimetilhidrazina (DMH). Esses animais foram sacrificados em
grupos de cinco roedores nos intervalos 2, 6, 12, 19, 32, 41 e 57 semanas após
receberem o carcinógeno. O número e multiplicidade das criptas nos oito
centímetros distais do cólon foram avaliados. Os achados nucleares foram
graduados de 0-4. O grau 0 consistia em criptas de formato arredondado e sem
estratificação nuclear. O grau 1 possuía poucos núcleos alongados e nenhuma
estratificação nuclear. O grau 2 já apresentava núcleos alongados espalhados pela
cripta e ausência de estratificação nuclear. O grau 3 continha núcleos alongados
espalhados pela cripta e discreta estratificação nuclear. Por fim, o grau 4 mostrava
alongamento e estratificação nucleares distribuídas difusamente pela cripta.
Nenhuma lesão macroscópica foi observada nos ratos sacrificados antes da 57ª
semana. No entanto, dois dos cinco ratos sacrificados na 57ª semana apresentaram
adenocarcinoma invasor medindo de 1 a 2 cm de diâmetro. Os cólons dos ratos
examinados, nas duas semanas após a exposição ao DMH, continham FCA
consistindo principalmente de 1 a 2 criptas. A porcentagem de FCA que apresentava
quatro ou mais criptas foi significativamente maior nos grupos sacrificados na 19ª,
32ª e 41ª semanas após a exposição ao carcinógeno. A porcentagem de FCA
exibindo atipias nucleares de mais alto grau aumentou marcantemente no grupo
sacrificado na 19ª semana em diante. Segundo McLellan, devido ao fato das
displasias serem geralmente consideradas como um achado significativo no
16
processo carcinogênico, as observações desse estudo apresentam fortes evidências
de que os FCA com displasia representam lesões precursoras.
Siu et al.
11
estudaram o padrão de displasia nos FCA de cólon humano. Essa
pesquisa envolveu 50 FCA de 28 pacientes. Os FCA com displasia leve foram
determinados por aumento nuclear, redução de mucina e discreta pseudo-
estratificação. As lesões que apresentaram displasia moderada exibiam núcleos
mais pleomórficos e estratificados, além de um grau mais avançado de depleção de
mucina. Os casos com displasia severa ou carcinoma in situ exibiam núcleos
altamente pleomórficos e estratificados, um grau ainda mais acentuado de depleção
de mucina e ocasionalmente aumento da atividade mitótica. Os resultados desse
estudo também mostraram uma maior freqüência de FCA no lado esquerdo do
cólon. Ainda foi observada uma tendência dessas lesões em aumentar de tamanho
com o avanço da idade dos pacientes. Os FCA do cólon direito eram maiores que os
do cólon esquerdo, e os casos com displasia eram maiores do que aqueles que não
tinham displasia.
Para Roncucci et al.
12
, a densidade de FCA em humanos (por exemplo, o
número de FCA por cm
2
de superfície mucosa) depende da doença colônica, sendo
mais alta em sujeitos com alto risco para malignidade como, por exemplo, pacientes
com polipose adenomatosa familiar e CCR, e mais baixo em pacientes com
diverticulose ou outras doenças benignas de cólon e/ou reto.
Takayama et al.
16
realizaram estudo envolvendo 370 pacientes, sendo que
49 deles tinham CCR, 142 possuíam adenoma e 179 estavam normais (não
apresentavam lesões aparentes de cólon na endoscopia). Nesse estudo foi utilizado
endoscopia de magnificação com solução de azul de metileno. Os indivíduos
normais mostraram prevalência de CA de 10% para aqueles que tinham menos de
40 anos, 53,6% para a faixa de 40-49 anos e de 65,7% para os indivíduos com
idades entre 60-69 anos. Nos pacientes com CCR, a prevalência foi de 100%. O
risco relativo estimado de focos displásicos para pacientes com adenoma e CCR,
quando comparados com indivíduos normais, foi de 4,26 e 18,14, respectivamente, e
o risco relativo estimado de focos não displásicos foi de 1,14 e 1,29,
respectivamente.
17
Nascimbeni et al.
17
analisaram 105 espécimes de ressecção colorretal, sendo
78 amostras de pacientes com CCR e 27 com doença diverticular (DD). Foram
identificados 666 FCA nos pacientes com CCR e apenas 56 casos nos pacientes
com DD. Lesões que excederam 110 criptas foram consideradas
macroscopicamente detectáveis e, portanto, não se enquadraram como FCA. Além
das alterações morfológicas já conhecidas, que caracterizam os FCA, os autores
ainda agruparam os FCA em dois grupos: displásicos e hiperplásicos. O grupo que
continha displasia foi então subdividido em displásico puro, ou microadenoma, e
misto hiperplásico-displásico, que apresentava várias proporções de padrão
adenomatoso e hiperplásico puro. Os FCA com displasia foram encontrados em 24
pacientes com CCR, dois dos quais eram microadenomas puros e 34 eram
compostos por padrões mistos hiperplásicos e adenomatosos. No grupo com DD,
apenas um caso de FCA com displasia foi identificado e caracterizado como padrão
misto hiperplásico e adenomatoso. As proporções de FCA displásicos foi maior nos
cólons ascendente, ceco e reto do que em outras topografias. O padrão misto foi
quatro vezes maior no reto do que no cólon sigmóide. Os casos com displasia foram
baixos entre os focos com 10-19, 20-49 e 50-99 criptas e maiores naqueles casos
com 100-110 criptas. Observou-se também alta prevalência de FCA hiperplásicas no
cólon esquerdo (91,8%), e proporções mais altas de FCA displásicas no cólon direito
(33,3%), local onde a multiplicidade foi muito maior.
Rodrigues et al.
23
induziram FCA em murinos, utilizando o carcinógeno DMH,
com o objetivo de comparar e analisar os FCA e CCR a curto e médio prazo. Nessa
pesquisa, os animais foram divididos em quatro grupos, sendo que em dois grupos
foram administrados DMH e nos dois restantes EDTA como controle. Um grupo
exposto ao DMH e outro exposto ao EDTA foram sacrificados na 4ª semana. Os dois
grupos restantes foram sacrificados na 30ª semana. Observou-se que os FCA não
são lesões randômicas, apresentando predileção pelo cólon médio e distal. O
número de criptas por foco apresentava aumento significativo entre os grupos
sacrificados na 4ª e 30ª semanas. Os FCA com três ou mais criptas na 4ª e 30ª
semanas foram respectivamente 8,5% e 46,9%. Esse dado pode corresponder à
promoção da carcinogênese de cólon. As mudanças histológicas também
apresentaram mudanças progressivas. No grupo sacrificado na 4ª semana, os
18
achados correspondiam a alterações hiperplásicas, ao passo que, na 30ª semana,
as criptas já exibiam displasia moderada e severa. Nos ratos expostos ao DMH e
sacrificados na 30ª semana, foram observados nove adenocarcinomas bem
diferenciados em 8 dos 10 ratos. Sete desses tumores estavam localizados no cólon
distal e dois no cólon médio. Curiosamente, essas topografias foram as mesmas em
que se pode observar os FCA com mais freqüência. Tais achados indicam que os
FCA podem ser considerados marcadores morfológicos na via carcinogênica em
tumores bem diferenciados de cólon.
Várias mutações em proto-oncogenes e genes supressores de tumor são
descritas durante a progressão tumoral. Mutações nos genes K-ras e APC têm
importante papel na carcinogênese colorretal. As mutações no gene APC são
provavelmente o evento mais precoce em CCR. Sua presença tem sido descrita
desde em adenomas macroscópicos até lesões com menos de 0,3 cm de diâmetro.
No entanto, mutações no gene APC não têm sido identificadas em FCA em
humanos
3
. Pretlow et al.
24
realizaram estudo utilizando ratos com mutação induzida
no gene APC e sugeriram que a mutação desse gene está implicada na iniciação
dos FCA, mas não na progressão. Já em estudos prévios, foram observadas
mutações nos genes ras em ratos e em uma pequena série de FCA em humanos
3
.
2.1 RELAÇÃO COM A β-CATENINA
As células epiteliais normais deixam de se multiplicar assim que estabelecem
contato com a célula vizinha. Isso é conhecido como inibição de contato. Elas
aderem-se umas às outras por meio de moléculas de adesão celular. Nas células
tumorais, essa comunicação intercelular pode estar interrompida, devido à
expressão defeituosa de alguns genes. Essa situação conduz as células tumorais a
exibir um crescimento “anti-social” destrutivo
25
.
A catenina é uma família de genes, cujo primeiro integrante descrito, definido
como α-catenina, tem a função de ligar a molécula caderina ao citoesqueleto,
resultando em aderência celular
25
. A β-catenina é um outro representante dessa
família, com função semelhante, responsável em se ligar a outros tipos de proteína,
não apenas a α-catenina e a actina, mas também a axina, caderina, fatores de
19
transcrição e ligantes Wnt. Em células normais, a β-catenina é responsável pela
adesão celular e, quando se encontra livre no citoplasma, é fosforilada e degradada
pelo complexo APC/Axina/GSK 3β
4-6, 25
. O gene APC é o gene supressor de tumor.
A axina é um gene que age concomitantemente com o glicogênio sintetase kinase 3
(GSK-3). Essa última é uma proteína que media a adição das moléculas de fosfato e
trabalha com a via de sinalização Wnt na fosforilação da β-catenina
4
. Na ausência
dos ligantes Wnt, as proteínas APC e Axina seqüestram a β-catenina, permitindo
que a caseína quinase 1 (CK-1) fosforile o seu N terminal em Seronina/Treonina.
Após isso, ocorre na seqüência a ubiquitinização e condução da β-catenina à
proteólise pelo complexo de ataque (Figura 1). Alguns estudos sugerem que a
ativação da via da β-catenina tem sido responsável pela iniciação da maioria dos
cânceres colorretal. Em mais de 80% dos pacientes com essa neoplasia, o gene
APC é inativado por mutações, resultando em ativação dos ligantes Wnt. Esses
ligantes unem-se à proteína trans-membrana da família Frizzled, ativando outra
proteína, denominada Dishevelled. Esta inibe o complexo APC/Axina/GSK 3β,
fazendo com que a molécula da β-catenina não sofra proteólise. Assim, essa
molécula torna-se estável, acumula-se no citoplasma e posteriormente alcança o
núcleo, transcrevendo subseqüentemente genes alvos (Figura 2). Essa programação
carcinogênica culmina na transcrição de diversos genes alvos da via Wnt (Quadro 1)
5, 26
.
20
Figura 1 - Ilustração esquemática da via Wnt/ β-catenina, representando a
destruição da molécula de β-catenina na ausência de ligantes Wnt pelo
complexo de ataque.
21
Fonte: Autor
Figura 2 - Ilustração esquemática mostrando a dissociação do complexo de ataque,
na presença de ligantes Wnt, acúmulo citoplasmático da β-catenina e
posterior translocação em direção ao núcleo. No núcleo a β-catenina
trabalha como co-fator para a transcrição do T cell factor (TCF) e
lymphoid enhancing factor (LEF), modulando a expressão de um amplo
espectro de genes alvos.
22
Quadro 1 - Genes alvos transcritos relacionados com a B-catenina
Função Gene alvo
Proliferação celular c-myc; ciclina D1
Inibição da apoptose MDR1/PGP; Cox-2; PPRd
Progressão do tumor MMPs; UPAR; UPA; CD44; Laminina g2; NrCAM
Fatores de crescimento c-met; VEGF; WISP1; BMP-4
Fatores de transcrição c-jun; Fra-1; ITF-2; Id2; AF-17
Alvos
feedback
negativo
conductina; Tcf-1; Nkd
Fonte: Huang D, Du X. World J Gastroenterol 2008; 14(12): 1823-1827.
2.1.1 β-Catenina e Foco de Criptas Aberrantes
Yamada et al. realizaram estudo experimental com ratos, administrando AOM
para indução de CA. Eles utilizaram endoscópio de magnificação e observaram dois
tipos de criptas. O primeiro tipo lembrava endoscopicamente FCA, sendo distinguida
pelo seu tamanho aumentado, espessamento epitelial e aumento do espaço peri-
criptico. O segundo tipo de criptas alteradas não tinha aparência de FCA, devido ao
seu tamanho reduzido. Foram realizados estudos imunoistoquímicos dessas lesões,
que detectaram super expressão da β-catenina citoplasmática em 13 de 15 criptas.
Também se observou, em quase todos os casos, localização anômala da β-catenina
no núcleo. Essas lesões foram denominadas “criptas com acúmulo de β-catenina”,
sendo enquadradas como entidade distinta. Naquelas criptas semelhantes aos FCA,
a expressividade da β-catenina não revelou acúmulo citoplasmático, tampouco
translocação em direção ao núcleo
18, 19
.
Para Pretlow e Bird
20
, os resultados de Yamada et al.
18
são controversos. Os
autores questionaram o fato de o grupo “criptas com acúmulo de β-catenina” ser
uma entidade independente dos FCA. Segundo esses autores, as criptas com
acúmulo de β-catenina têm características semelhantes a um subgrupo de FCA, que
inclui a maioria dos FCA com displasia. Pretlow e Bird
24
referiram, ainda, que as
preparações “en face”, ou seja, com a superfície luminal voltada para baixo, podiam
mostrar FCA em diferentes níveis de secção histológica e tal situação poderia
explicar o tamanho reduzido nas criptas observadas.
23
2.1.2 β-Catenina e Câncer Colorretal
Bondi et al.
8
analisaram, retrospectivamente, 162 adenocarcinomas
emblocados em parafina, todos os casos com Dukes variando de A a C. Esses
casos foram submetidos a estudo imunoistoquímico com várias proteínas, incluindo
o c-myc e a β-catenina. A análise da expressão dessas proteínas foi quantitativa. A
β-catenina apresentou positividade nuclear global de apenas 22,2%. A mucosa
adjacente ao tumor revelou, em todos os casos, forte expressão nas membranas
celulares. O c-myc revelou positividade nuclear global de 29%. Nesse mesmo estudo
foi realizada análise de sobrevida para os casos em que houve expressão de duas
ou mais proteínas. Utilizando uma análise univariada, apenas a expressão
concomitante da β-catenina nuclear e c-myc estavam associados à redução da
sobrevida global dos pacientes, quando comparados com a imunoexpressão nuclear
da β-catenina isolada. Essa pesquisa também revelou que, nos pacientes tratados
apenas cirurgicamente para doença localizada (Dukes A ou B), a expressão nuclear
de β-catenina estava significativamente associada com metástases.
Kim et al.
7
estudaram 124 pacientes com diagnóstico de adenocarcinoma de
intestino grosso com estadio de Dukes, variando de A a D, avaliando a expressão
nuclear de β-catenina e a expressão de Pin1. Essa proteína tem sido expressa em
alguns tumores malignos, estando estritamente correlacionada com o aumento dos
níveis de ciclina D1. Esta controla o início e a progressão do ciclo celular. Os autores
encontraram expressividade de Pin1 em 18,5% (23 dos 124 casos) dos
adenocarcinomas. A mucosa normal adjacente não apresentou imunorreatividade
para esse anticorpo. Não houve correlação entre a hiperexpressão de Pin1 e o
estadio de Dukes. A hiperexpressão nuclear da β-catenina ocorreu em 40,3% (50
dos 124 casos) dos adenocarcinomas de intestino grosso. Esse estudo não
observou correlação entre a expressão nuclear da β-catenina e parâmetros clínico-
patológicos como metástase linfonodal, estadio tumoral e sobrevida após a cirurgia.
Essa pesquisa também revelou correlação positiva entre a expressão de Pin1 e da
β-catenina nuclear.
Chen et al.
2
realizaram estudo com amostras de CCR, pólipos adenomatosos
e mucosa normal situada a menos de 5 cm do respectivo tumor. Essas amostras
24
foram submetidas a um amplo estudo imunoistoquímico com proteínas-alvo
implicadas em processo de tumorigênese, incluindo a β-catenina e o c-myc. A
metodologia dessa pesquisa envolveu a construção de blocos de TMA. Os
resultados desse trabalho mostraram que dos 85 adenocarcinomas, 70 revelaram
positividade nuclear para β-catenina, revelando freqüência de 82,3%. Os adenomas
e a mucosa normal apresentaram, respectivamente, 72,2% e 44,4% de
imunoexpressão da β-catenina. Os autores também observaram correlação positiva
entre a expressão da β-catenina e c-myc. Com esses dados, esse estudo sugeriu a
existência de um forte papel da via Wnt na carcinogênese do CCR.
Kawada et al.
27
observaram em seu estudo a relação dos transdutores de
sinais e ativadores de transcrição (STAT3), reconhecidamente promotores de vários
tumores humanos, com o acúmulo de β-catenina no núcleo de colonócitos de
adenocarcinomas. Entre os 90 casos estudados, 40 (44,4%) expressaram
positividade nuclear para o STAT3, e 63 pacientes (70%) apresentaram
imunorreatividade nuclear para a β-catenina. Essa situação foi observada
essencialmente nas amostras tissulares periféricas das neoplasias, representando a
fronte de invasão. Um fato importante nos resultados deste estudo foi a forte relação
da expressão da STAT3 com a β-catenina nuclear. Dos 40 casos imunorreativos
para o STAT3, 37 também foram positivos para a β-catenina nuclear. Ainda nesse
estudo, foi observado que expressão nuclear da β-catenina estava significativamente
correlacionada com a invasão linfática e estadio TNM, mas não com a invasão
artério-venosa.
2.2 RELAÇÃO COM O KI-67 (MIB-1)
O Ki67 é um anticorpo expresso no núcleo durante todas as fases do ciclo
celular, exceto a fase G0, e é amplamente utilizado como marcador de proliferação
celular. Em criptas normais, a população de células com proliferação aumentada
está restrita ao terço inferior do seu maior eixo. É extremamente incomum que
células da metade superior da cripta exibam imunorreação para o Ki67
28
.
Siu et al.
11
também observaram que a zona de proliferação das criptas,
corada pelo marcador Ki-67, está restrita ao terço inferior das criptas nos casos de
25
FCA não displásicas ou com displasia leve. Uma marcante extensão da zona de
proliferação em direção ao lúmen do cólon foi vista em três dos quatro FCA com
displasia moderada e em todos os três casos de FCA com displasia severa.
2.3 TISSUE MICROARRAY
Um grande problema para pesquisadores que realizam estudo
imunoistoquímico em grande escala é o seu custo elevado. Para otimizar e
minimizar custos, Kononen et al.
29
desenvolveram uma técnica de construção de
blocos, constituído de um arranjo de amostras tissulares, ou TMA. Essa técnica nada
mais é do que a confecção de um bloco de parafina, contendo fragmentos cilíndricos
de amostras teciduais, oriundos de vários outros blocos de parafina originais. Esses
cilindros são distribuídos no bloco receptor, seguindo uma ordem pré-estabelecida.
O TMA pode ser utilizado em estudos imunoistoquímicos, hibridização in situ
cromogênica (Cish) ou fluorescente (Fish). A principal vantagem do TMA é a
possibilidade de analisar a expressão de um determinado anticorpo, ou uma
determinada amplificação, ou translocação cromossômica de centenas de amostras
de tecido ao custo de uma única reação.
Existem apenas duas máquinas disponíveis no mercado para a construção de
TMA. A pioneira desses aparelhos foi a Beecher Instruments Inc. O arrayer manual
tem a vantagem de baixo custo e facilidades no manuseio e manutenção. Os
modelos semi-automatizados acrescentam poucas facilidades em relação ao modelo
manual, contudo, apresentam acréscimo substancial no preço
30
.
Em um país como o nosso, em que os recursos para pesquisa são escassos,
modelos criativos e com baixo custo surgiram. Um dos métodos consiste em uma
mini-retífica comercial, acoplada a agulhas grossas de biópsias, e outro utilizou
material de máquina de costura overloque
29-31
. Como o processo de confecção do
TMA é simples, o departamento de Patologia Experimental da Pontifícia
Universidade Católica do Paraná (PUC-PR) desenvolveu uma técnica exclusiva. Ela
é realizada por meio de uma pinça para biópsias do tipo punch, que depois de
aquecida é introduzida na área marcada do bloco de parafina doador, sendo então
retirado um fragmento cilíndrico de tecido e introduzido em uma matriz
32
. Essas
26
alternativas são bastante interessantes e baratas e têm sido utilizadas
satisfatoriamente em inúmeros projetos
29-32
.
3 MÉTODOS
Foram coletados 21 espécimes cirúrgicos de pacientes submetidos a
retossigmoidectomia, com idades variando de 36 a 82 anos e diagnóstico prévio de
adenocarcinoma colorretal. Essa coleta foi realizada durante o período de novembro
de 2006 a julho de 2007, no departamento de Anatomia Patológica do Hospital
Erasto Gaertner.
As peças cirúrgicas foram abertas longitudinalmente e colocadas em solução
de formalina a 10%, durante pelo menos 24 horas em temperatura ambiente.
Posteriormente, utilizando um cilindro de aço inoxidável com área cortante de 1 cm
2
,
foram retirados de três a quatro fragmentos (dependendo do diâmetro do órgão),
situados a 1 cm e 5 cm do bordo inferior e superior do tumor, dependendo da
extensão do espécime, bem como um fragmento da própria neoplasia (figura 3).
Esses fragmentos foram acondicionados por pelo menos 2 meses em frascos
contendo solução de formalina a 10% e rotulados com o número do exame
anátomo-patológico do paciente, seguido de P1, para os fragmentos localizados a 1
cm proximal ao tumor, P5 para 5 cm proximais, D1 para os fragmentos distantes a 1
cm distal à lesão e D5 para 5 cm distais ao tumor (figuras 4 e 5).
28
Figura 3 - Cilindro de aço com superfície cortante de 1 cm
2
Figura 4 - Segmento de intestino grosso, aberto longitudinalmente e evidenciando
neoplasia colorretal
29
igura 5 - O mesmo espécime cirúrgico da figura 3 após a coleta dos fragmentos a
sse período de fixação, os espécimes foram posicionados com a
F
1 e 5 cm proximais da lesão e 1 cm distal da lesão. Neste espécime
não foi possível a retirada dos fragmentos localizados a 5 cm distais da
lesão.
Após e
superfície mucosa (luminal), voltada para baixo, em cassetes identificados com o
número do respectivo rótulo do frasco. Em seguida, esses cassetes foram
processados, através de um histotécnico, marca Leica TP 1020. Finalmente, os
fragmentos foram incluídos no próprio cassete em parafina e rotulados, utilizando
placa resfriadora, marca Leica EG 1160. Os blocos de parafina foram desbastados e
submetidos a cortes de 5 µm de espessura, utilizando micrótomo rotativo marca
Leica 2125 RT. Foram confeccionadas lâminas histológicas, coradas pelo método
hematoxilina e eosina (HE) para cada um dos blocos de parafina. Essas lâminas
foram analisadas utilizando um microscópio Olympus BX-41, na objetiva de 100
vezes e luminosidade nível cinco (numa escala que vai de zero a dez). O
30
microscópio estava acoplado a uma câmera digital Samsung DSC 415, ligada a uma
placa de vídeo, conectado a um computador Pentium com 512 MB de memória ram.
Todo o processamento técnico foi realizado no Laboratório de Patologia
Experimental da PUC-PR.
Os FCA foram identificados pelo alargamento das criptas, aumento do espaço
peri-cr
igura 6 - Fotomicrografia de cólon, mostrando cripta aumentada de tamanho, lúmen
A displasia foi caracterizada por células hipercromáticas, núcleos alongados,
estrati
íptico e espessamento epitelial (figura 6).
*
F
com aspecto de dente de serra e células caliciformes hiperdistendidas
(asterisco) (HE 200x).
ficação nuclear e redução na produção de mucina (figura 7).
31
igura 7 - Fotomicrografia revelando cripta aberrante com redução na produção de
tilizou-se a técnica de TMA. Para substituir o aparelho de TMA, foi utilizada
uma p
o das áreas nas lâminas coradas em HE, que continham FCA, sendo
• , foram realizadas as
*
F
mucina, além de pseudoestratificação (asterisco) (HE 400x)
U
inça do tipo punch de 2 mm, usada rotineiramente em biópsias de pele. A
técnica completa para a montagem dos blocos de TMA seguiu os passos abaixo
relacionados:
• Seleçã
essas áreas marcadas com caneta de retroprojetor.
Baseando-se nas marcações feitas nas lâminas
mesmas marcações nos respectivos blocos de parafina. Esses blocos foram
denominados doadores (figura 8).
32
Figura 8 – Bloco doador
• O bloco de TMA foi feito através de um mapa cartesiano, semelhante a um
jogo de batalha naval, que orientava a disposição dos orifícios. Nesse mapa,
as colunas foram identificadas com letras e as linhas com números. O bloco
foi denominado de receptor (figura 9).
Figura 9 – Matriz ordenada por letras nas colunas (A) e números nas linhas (B)
• Uma vez montado esse mapa, os blocos doadores foram organizados
seqüencialmente em uma bancada anexa àquela da montagem do bloco
receptor. Essa seqüência obedeceu à ordem de entrada no mapa, sendo que
cada fragmento recebeu um código constituído por uma letra e um número.
Tal codificação anulou erros na localização das amostras durante o processo
de leitura da lâmina do bloco receptor (figura 10).
33
Figura 10 – Desenho esquemático do bloco receptor
• Em cada array foi também colocado um fragmento de tecido hepático de rato,
oriundo de um banco de tecidos, para marcar o início da leitura.
• Cada bloco foi feito com nove orifícios e, às vezes, um extra, contendo
fragmento de tecido hepático, ou ao lado do espaço C3, quando os nove
orifícios estavam ocupados, ou ao lado do último orifício ocupado.
A técnica de confecção dos blocos receptores consistiu em 6 passos:
• Aquecimento da pinça do tipo punch.
• Penetração da pinça aquecida na área demarcada no bloco doador.
• Pressão e torção aplicada na pinça para corte e retirada do fragmento do
bloco (figura 11).
Figura 11 – A pinça, previamente aquecida, é introduzida no bloco doador
34
• Retirada da pinça contendo fragmento.
• Retirada do fragmento da pinça (figura 12).
Figura 12 – Colocação de um fragmento na matriz
• Montagem do bloco receptor (figura 13 e 14).
Figura 13 – Montagem do bloco receptor
35
Figura 14 – Após a colocação dos fragmentos na forma (A), coloca-se um cassete
para formar a base (B). O resultado final é um bloco multi-amostral,
contendo um fragmento de tecido hepático como marcador para a
leitura das lâminas (C)
Figura 15 – Lâminas dos blocos receptores.
Foram confeccionados três blocos de tumores, rotulados como bloco A, bloco
B e bloco C (figura 15). O fragmento de tumor do caso 1, por exemplo, ocupou o
espaço A1 do bloco A. Quando todos os espaços do bloco estavam ocupados,
36
passava-se à confecção do bloco seguinte. O fragmento de tumor do caso 14, por
exemplo, ocupou o espaço B2 do bloco B e assim por diante (figura 16).
Figura 16 – Desenho esquemático dos blocos receptores do grupo tumor
Nos casos em que foram observados FCA, a lógica de montagem dos blocos
receptores era a mesma. Nos casos distando 1 cm do bordo superior ao tumor, o
bloco receptor foi rotulado como P1. Nessa localização, foram observados FCA em
uma área do caso 1, sendo, então, que esse fragmento foi alocado no espaço A1 do
bloco P1, uma área do caso 2, na qual esse fragmento ocupou o espaço B1 do
mesmo bloco. Os casos 3 e 4 não continham FCA na localização P1, sendo assim,
eles não ocuparam nenhum espaço nesse bloco. O caso seguinte a conter FCA em
P1 foi o número 5, este ocupando o espaço seguinte, C1 e assim por diante.
Naqueles casos contendo mais de um FCA em P1, os fragmentos ocuparam
espaços consecutivos. Por exemplo, o caso 19 apresentou duas áreas com FCA em
P1, ocupando um dos fragmentos o orifício B3 e o outro C3 (figura 17).
37
Figura 17 – Desenho esquemático do bloco receptor do grupo P1
O bloco dos casos localizados a 5 cm do bordo superior ao tumor foi rotulado
como P5, o bloco dos casos localizados a 1 cm do bordo inferior ao tumor foi
denominado D1 e a 5 cm do bordo inferior ao tumor, D5. O raciocínio de montagem
desses blocos foi o mesmo utilizado em P1 (figura 18).
Figura 18 – Desenho esquemático dos blocos receptores restantes, P5, D1 e D5
Os blocos receptores foram cortados à espessura de 4 µm, sendo
confeccionadas quatro lâminas, uma delas corada em HE e as restantes submetidas
ao processamento imunoistoquímico. As lâminas preparadas para esse fim foram
submetidas ao processo de imunoistoquímica pela técnica da imunoperoxidase.
Esse processo passa por uma fase de padronização da técnica de pesquisa de
antígenos específicos em material parafinado. O protocolo apresenta fases distintas
38
como desparafinização e re-hidratação, primeiro e segundo bloqueios da peroxidase
endógena, recuperação antigênica, incubação com anticorpo primário e secundário,
revelação, contra-coloração, desidratação, clarificação e montagem. A
desparafinização é realizada com xilol quente à 37°C, e a re-hidratação, com banhos
sucessivos de álcool, em concentrações decrescentes, conforme técnicas
convencionais. Todos os casos foram corados em duplicata, utilizando-se uma
lâmina como controle negativo, na qual não houve a adição do anticorpo primário.
O primeiro bloqueio da peroxidase endógena, realizado antes da recuperação
antigênica, é feito com álcool metílico mais peróxido de hidrogênio na proporção
1:10. Para o segundo bloqueio, que ocorrerá após a recuperação, será utilizado
água destilada e peróxido de hidrogênio.
Os anticorpos utilizados são da marca Novocastra e têm como controle
positivo a reação com amígdala de rato, apresentando as seguintes especificações
(classe e diluições): β-Catenina – IgG classe 2a, na diluição 1:800; Ki-67 clone MIB-
1- IgG classe 1, na diluição 1:50.
A incubação com os anticorpos (β-catenina e Ki-67), nas diluições
determinadas, tem duração de uma hora, em câmara úmida e temperatura ambiente.
O anticorpo secundário, associado ao polímero dextrana (Envision Dual link Dako)
foi incubado com o material por 30 minutos, também em temperatura ambiente.
Para revelação, é adicionado o complexo DAB + substrato sobre as lâminas,
por três minutos, conforme técnicas convencionais.
A contra-coloração deve ser realizada com hematoxilina de Mayer’s, por 1
minuto, seguida de desidratação com banhos de álcool etílico 100% e da clarificação
com xilol em temperatura ambiente.
Para a montagem das lâminas, foi utilizado Bálsamo do Canadá, em técnica
similar à montagem de lâminas em HE.
A validação do estudo imunoistoquímico fundamenta-se no controle
mesenquimal negativo. Isso quer dizer que o tecido conjuntivo adjacente ao tumor
apresenta-se totalmente corado em azul. Cor essa diferente da coloração expressa
pela proteína marcada pelo anticorpo (acastanhado ou cromógeno).
4 RESULTADOS
Foram analisados 21 casos com diagnóstico prévio de adenocarcinoma
colorretal, com idades variando de 36 anos a 82 anos (média de 59,7 anos), sendo
11 mulheres e 10 homens.
A análise da reação dos anticorpos foi qualitativa, analisando apenas a
positividade ou negatividade para os anticorpos utilizados. A expressão da β-
catenina nuclear foi observada em 17 dos 21 adenocarcinomas, atingindo uma
freqüência de 81% (figuras 19 e 20).
*
Figura 19 - Fotomicrografia mostrando imunorreação para a β-catenina (coloração
acastanhada- seta). Controle mesenquimal negativo (asterisco) (β-
catenina 200x)
40
Figura 20 - Fotomicrografia realçando imunorreatividade nuclear (coloração
acastanhada- seta) para a β-catenina (β-catenina 1000x)
O Ki-67 atendeu a essa mesma distribuição, em que 17 dos 21
adenocarcinomas obtiveram expressão (figura 21). Apesar disso, o coeficiente de
concordância (Kappa) foi de 0,38, revelando fraca concordância (tabela 1).
41
Figura 21 - Fotomicrografia mostrando imunorreatividade nuclear (coloração
acastanhada- seta) para o Ki-67 (Ki-67 200x)
Tabela 1 - Coeficiente de concordância (Kappa) entre a β-catenina e o Ki-67: 0,38
(fraca concordância)
Ki-67
β-catenina
nuclear
Presente Ausente
Total
Ausente 2 2 4
Presente 2 15 17
Total 4 17 21
A expressão da β-catenina em membrana citoplasmática revelou positividade
em 14 dos 21 casos, alcançando freqüência de 66,7%. O coeficiente de
concordância (Kappa), quando comparado à expressão desse mesmo anticorpo no
núcleo e membrana, foi de 0,40, revelando fraca concordância (tabela 2).
42
Tabela 2 - Coeficiente de concordância (Kappa) entre a β-catenina nuclear e
membrana citoplasmática: 0,40 (fraca concordância)
β-catenina membrana
citoplasmática
β-catenina
nuclear
Presente Ausente
Total
Ausente 3 1 4
Presente 4 13 17
Total 7 14 21
Em relação aos FCA, foram observados 20, distribuídos em 11 dos 21 cólons,
que atenderam à seguinte distribuição: 8 localizados a 1 cm proximal ao tumor, 5
localizados a 5 cm proximal ao tumor, 5 localizados a 1 cm distal ao tumor e 2
localizados a 5 cm distal ao tumor (figura 22 e quadro 2). A displasia foi observada
em apenas 2 casos, localizados a 1 cm proximal e outro a 1 cm distal ao tumor
(tabela 3).
Quadro 2 - Freqüência dos FCA em relação ao tumor
Região Freqüência de criptas
aberrantes
Percentual
Proximal a 5 cm 5 23,8%
Proximal a 1 cm 8 38,1%
No tumor 21 100%
Distal a 1 cm 5 23,8%
Distal a 5 cm 2 9,5%
43
Tabela 3 - Freqüência de displasia nos FCA
Freqüência
(percentual)
Região n
Ausência Presença
Proximal a 1 cm 8 7 (87,5%) 1 (12,5%)
Proximal a 5 cm 5 5 (100%) 0 (0%)
Distal a 1 cm 5 4 (80%) 1 (20%)
Distal a 5 cm 2 2 (100%) 0 (0%)
Fonte: Quadro 2.
Figura 22 - Gráfico mostrando distribuição dos FCA ao redor do tumor
(T= tumor; P1= 1 cm proximal ao tumor; P5= 5 cm proximais ao tumor; D1= 1 cm distal ao tumor; D5= 5 cm distais ao tumor)
Nenhum dos FCA apresentou expressão dos anticorpos β-catenina nuclear,
β-catenina citoplasmática e Ki-67. O resumo com o padrão de distribuição e a
expressão dos anticorpos estão representados no quadro 3.
44
Quadro 3 - Síntese do padrão de distribuição dos FCA e perfil da expressão dos
anticorpos.
Freqüência (percentual)
Anticorpo Região N
Ausência Presença
Tumor 21 4 (19%) 17 (81%)
Proximal a 1 cm 8 8 (100%) 0 (0%)
Proximal a 5 cm 5 5 (100%) 0 (0%)
Distal a 1 cm 5 5 (100%) 0 (0%)
β-catenina nuclear
Distal a 5 cm 2 2 (100%) 0 (0%)
Tumor 21 7 (33,3%) 14 (66,7%)
Proximal a 1 cm 8 8 (100%) 0 (0%)
Proximal a 5 cm 5 5 (100%) 0 (0%)
Distal a 1 cm 5 5 (100%) 0 (0%)
β-catenina
citoplasmática
Distal a 5 cm 2 2 (100%) 0 (0%)
Tumor 21 4 (19%) 17 (81%)
Proximal a 1 cm 8 8 (100%) 0 (0%)
Proximal a 5 cm 5 5 (100%) 0 (0%)
Distal a 1 cm 5 5 (100%) 0 (0%)
Ki-67
Distal a 5 cm 2 2 (100%) 0 (0%)
5 DISCUSSÃO
O sul do país é a região com maior incidência de CCR no Brasil, sendo
encontrado em 15,09 a 27,68/100000 homens e 16,51 a 28,07/100000 mulheres,
dependendo do estado. A proporção homens: mulheres foi muito próxima, refletindo
os resultados deste trabalho, em que foram observados 1,1 mulheres para cada
homem. A maior incidência dos casos ocorre na faixa etária entre 50 e 70 anos
1
.
Neste estudo apenas três pacientes encontravam-se, no momento do diagnóstico,
com menos de 50 anos.
O tipo histológico mais comum é o adenocarcinoma
1
. Nesta pesquisa todos
os casos incluídos eram de adenocarcinoma de junção colorretal.
5.1 FOCO DE CRIPTAS ABERRANTES
Desde as primeiras descrições dos FCA, várias hipóteses surgiram tentando
correlacionar essas lesões com a carcinogênese de cólon e reto. McLellan e Bird
9,
21, 22
foram os primeiros a descrever essa alteração em cólon de murinos expostos a
carcinógenos. Os mesmos autores observaram maior especificidade dos FCA para
carcinógenos de cólon. Posteriormente, esses pesquisadores
13
concluíram que os
FCA induzidos laboratorialmente aumentavam com o tempo prolongado de
exposição, assim como a freqüência da displasia. Os dados desse trabalho
suportaram a hipótese de que os FCA com displasia representam lesões
precursoras potenciais. A freqüência de FCA é maior na mucosa de cólon distal e
reto, quando comparados ao cólon proximal
14, 15
. Em nosso estudo, foram
observadas, como era esperado, freqüências maiores de FCA nas regiões próximas
ao tumor.
Segundo Siu et al.
11
, os FCA do lado direito são maiores que os do lado
esquerdo, assim como as lesões que possuem displasia. O número de FCA por cm
2
de superfície mucosa foi mais alta em pacientes com alto risco de malignidade
12, 16
.
46
Para Nascimbeni et al.
17
, os casos com displasia são observados com mais
freqüência nos pacientes com CCR, quando comparados com doenças benignas.
Esses autores também observaram alta prevalência de FCA hiperplásicos no cólon
esquerdo (91,8%). Em nosso trabalho, foram observados apenas dois casos de FCA
displásicos, localizados a 1 cm proximal e outro distal e 18 casos de FCA
hiperplásicos. Segundo Takayama et al.
16
, a prevalência de FCA em indivíduos
sadios aumenta com a idade. Nos pacientes com CCR, a prevalência de FCA foi de
100%. Em nosso estudo, as análises da mucosa macroscopicamente normal foram
limitadas nas áreas distantes a 1 cm proximal e distal e 5 cm proximal e distal ao
tumor. Isso explica o fato da prevalência não ser de 100%. No estudo realizado por
Takayama et al.
16
, a alta prevalência de FCA, nos pacientes com CCR, foi
alcançada devido ao rastreamento de toda mucosa macroscopicamente normal do
cólon, utilizando endoscopia de magnificação com azul de metileno.
Para Rodrigues et al.
23
, a exposição prolongada e contínua de carcinógenos
na mucosa de cólon leva à formação de FCA, além de causar mudanças
progressivas, tipo displásicas, agindo como promotor na carcinogênese do CCR. O
nosso experimento é transversal não controlado, sendo difícil precisar o tempo de
evolução destes FCA. Contudo, na nossa opinião e baseado nos artigos de revisão,
é provável que algumas dessas lesões possuam potencial de evoluir para a displasia
e conseqüentemente para adenocarcinoma.
5.2 β-CATENINA E CCR
A expressão nuclear desse anticorpo foi extremamente variável. Enquanto
Bondi et al.
8
encontraram expressão no núcleo dos tumores em apenas 22,2% dos
seus casos, Kim et al.
7
obteviveram 40,3% de positividade, Chen et al., 82,3%
2,
e
Kawada et al,
27,
70% . Nosso estudo revelou dados muito próximos ao de Chen et al
2
, com freqüência de 81%. No entanto, todas essas pesquisas foram realizadas
comparando a expressão da β-catenina com outras proteínas implicadas em um
determinado passo da via carcinogênica. Foram feitos comparativos com o c-myc,
proteína atuante na transdução de sinais, o Pin1, cuja função é regular a ciclina D1,
que por sua vez controla o início e a progressão do ciclo celular e, por último, o
47
STAT3, que é um ativador de sinal e transdutor de sinais. Não foi encontrado
nenhum trabalho correlacionando a expressão da β-catenina nuclear nos colonócitos
dos FCA com os respectivos colonócitos dos adenocarcinomas, semelhante ao
modelo experimental realizado no presente estudo. Outra situação que poderia
alterar os resultados dessa pesquisa foi o tamanho da amostra. Enquanto Kim et al.
e Bondi et al.
8
utilizaram respectivamente, 124 e 162 casos, Chen et al.
2
utilizaram
85 pacientes e Kawada et al.
27
, 90 indivíduos. Nosso estudo envolveu apenas 21
casos. Sendo assim, pode-se supor que o aumento da amostragem poderia alterar a
freqüência. Outro dado que pode explicar a ampla variação de resultados
encontrados na literatura foi postulado por Yang et al.
33
. Segundo estes autores, os
mecanismos da função do APC em regular a β-catenina são mais complicados do
que se costumava pensar. No estudo realizado por esses autores, foram obtidos
dados que sugeriram que a degradação da β-catenina era feita por domínios
distintos e mecanismos moleculares separados. Observou-se, em seus
experimentos, que o gene APC, cuja maior função é regular a β-catenina, quando
mutado, bloqueava o complexo de ataque, responsável pela fosforilação dessa
proteína. Apesar de o fato da β-catenina ter sua degradação inibida nas células
tumorais por meio desse mecanismo, ainda observou-se algum grau de fosforilação
da β-catenina. Com isso, os autores partiram da hipótese que as células tumorais
com alto nível de β-catenina podem ter um mecanismo de fosforilação independente
do APC. Nas células com o APC mutante, o índice de fosforilação e degradação da
β-catenina é menor que o de síntese, podendo levar ao acúmulo dessa proteína no
citoplasma e posteriormente no núcleo. Sendo assim, a discrepância, nos resultados
obtidos na literatura mundial, pode ter relação com os diversos mecanismos
responsáveis pelo controle da degradação e síntese da β-catenina.
5.3 β-CATENINA E FOCO DE CRIPTAS ABERRANTES
Segundo Yamada et al.
18, 19
, as criptas que acumulam β-catenina são uma
entidade específica diferente dos FCA. No entanto, Pretlow e Bird
20
não concordam
com essa afirmação e acreditam que questões técnicas, como os níveis dos cortes
histológicos, poderiam causar erros de interpretação. Para esses autores, a
48
descrição histológica das “criptas com acúmulo de β-catenina” é semelhante ao FCA
com displasia.
Em nosso estudo, esperava-se expressão nuclear da β-catenina tanto nos
FCA como nos respectivos adenocarcinomas. Essa expressividade era esperada
pelo menos nos casos em que existia displasia, já que esse é um forte preditor
morfológico de pré-malignidade. A positividade nuclear concomitante poderia indicar
uma via molecular comum, que teria conduzido os FCA para a transformação
maligna. No entanto, nenhum FCA expressou a β-catenina no núcleo. Essa situação
poderia fortalecer a teoria de Yamada et al.
18, 19
, que rotularam as criptas com
acúmulo de β-catenina como entidade distinta. Ou seja, sabendo-se da correlação
dos FCA como lesões precursoras do CCR, a falta de acúmulo da β-catenina
nuclear nos colonócitos das CA poderia favorecer realmente a existência de dois
tipos de criptas, conforme postulado por Yamada et al
18, 19
. No entanto, Pretlow e
Bird
20
, quando rebateram esta teoria, referiram as criptas com acúmulo de β-
catenina como um subtipo de FCA com displasia. Sendo assim, não é possível
separar essas criptas em dois grupos com os dados desta pesquisa, pois foram
observados apenas dois casos de FCA com displasia, tornando-os estatisticamente
insignificantes para esse tipo de afirmação.
5.4 TISSUE MICROARRAY
O método de TMA possibilita a representação multi-amostral em um único
bloco de parafina, minimizando, dessa forma, os custos
29-31
. Atualmente poucas
instituições dispõem de tecnologia para a realização dessa técnica. Curiosamente, a
adversidade enfrentada por diversos pesquisadores brasileiros fez com que algumas
técnicas criativas e de baixo custo surgissem. A forma como os TMA são realizados
na PUC-PR é um bom exemplo disso. Em nosso experimento, a utilização de um
punch, o apoio técnico dos funcionários e a organização do setor de Patologia
Experimental dessa instituição foram suficientes para a confecção de blocos multi-
amostrais de qualidade
32
.
6 CONCLUSÕES
Nas áreas situadas a 1 cm da neoplasia colorretal, foi observada maior
concentração de FCA em relação às áreas situadas a 5 cm do tumor. No entanto,
não se observou correlação entre a expressão da β-catenina nos colonócitos das CA
nas áreas estudadas.
7 REFERÊNCIAS
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8 ANEXOS
Anexo 1
55
Anexo 2
56
Anexo 3
Livros Grátis
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Milhares de Livros para Download:
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