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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO OESTE DO PARANÁ
CAMPUS DE MARECHAL CÂNDIDO RONDON
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
NÍVEL MESTRADO
SANDRA LUISA TOILLIER
CONTROLE DE CRESTAMENTO BACTERIANO COMUM
(Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli) E ALTERAÇÕES
BIOQUÍMICAS EM FEIJOEIRO INDUZIDAS POR Pycnoporus
sanguineus
MARECHAL CÂNDIDO RONDON
AGOSTO/2008
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1
SANDRA LUISA TOILLIER
CONTROLE DE CRESTAMENTO BACTERIANO COMUM
(Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli) E ALTERAÇÕES
BIOQUÍMICAS EM FEIJOEIRO INDUZIDAS POR Pycnoporus
sanguineus
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual do Oeste do Paraná, como parte
das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia - Nível
Mestrado, para obtenção do título de
Mestre.
ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ
RENATO STANGARLIN.
MARECHAL CÂNDIDO RONDON
AGOSTO/2008
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2
Aos meus pais, Tarcísio Luiz e Ires
Maria Toillier, e às minhas irmãs, Carla
e Fernanda,
Dedico
3
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e a Nossa Senhora pela companhia e pela força;
Aos meus pais e minhas irmãs, por acreditarem em mim, além de todo o apoio que
sempre me deram;
Ao professor Dr. José Renato Stangarlin, pela orientação e pela paciência, pelos
ensinamentos e conselhos, que me proporcionaram crescimento pessoal e profissional,
além da conclusão deste trabalho;
Ao prof. Dr. Odair José Kuhn (co-orientador), por sua amizade e por suas
importantes contribuições no desenvolvimento deste trabalho;
A UNIOESTE – Campus de Marechal Cândido Rondon, pelo programa de Pós-
graduação, por disponibilizar a estrutura, o laboratório e todo o material necessário para a
conclusão da pesquisa;
Aos amigos do laboratório da UNIOESTE: Gilmar, Clair, Luciana, Mauricele, Cris,
Érica, Viviane, Wiviany, Simone, pela amizade, companhia e apoio, cada um, em
determinadas fases do experimento;
A todos os professores do mestrado, pelos ensinamentos;
As amigas, Anelisa (Aninha) Fabiane (Fabi) e Renata (Rê), da UNIOESTE –
Extensão de Santa Helena, por terem contribuído ao estágio remunerado, o qual
proporcionou financeiramente, a continuidade da minha caminhada, além do apoio
psicológico que sempre me deram;
Aos colegas de trabalho que tive durante o estágio, Janete, Lucimara, Luci, Lucélia,
Bianchecci, Gumercindo (Guma), João, Karina, por dividir comigo muitos momentos. E aos
novos colegas de trabalho, Dilson, Tânia, Joéslei, André, Almir e Jeferson, pelo exemplo de
profissionalismo e amizade;
À família Kumm, que me acompanha nesta caminhada e sempre me incentivou e
me apoiou;
Meu carinho em especial, a amiga Ana Beatriz Cóttica, parceira de todos os
momentos; à amiga Tatiani Chapla, que mesmo virtualmente, foi essencial em muitos
momentos da elaboração do trabalho e ao amigo Lindomar Elsinga (Max), pelos consertos
no computador, quando precisei e por sempre estar disposto a ajudar;
A amiga Eliane Márcia Tormes e ao Antonio Benítez Cariño, pelo apoio e carinho
que me deram nos momentos mais críticos e por sempre acreditarem em mim;
E por fim, expressar reconhecimento a todas as pessoas que de uma forma ou de
outra, contribuíram para a concretização deste estudo.
4
SUMÁRIO
RESUMO.......................................................................................................................i
ABSTRACT...................................................................................................................ii
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................. iii
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................10
2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................11
2.1 A CULTURA DO FEIJOEIRO............................................................................. 11
2.1.1 Crestamento bacteriano comum (Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli)......13
2.1.2 Sintomas..........................................................................................................13
2.1.3 Etiologia e sintomatologia ................................................................................14
2.1.4 Controle do crestamento bacteriano comum.....................................................14
2.2 CONTROLE DE DOENÇAS.................................................................................15
2.2.1 Controle alternativo de doenças...................................................................... 16
2.2.1.1 Indução de resistência.................................................................................. 16
2.2.1.1.1 Alterações fisiológicas da indução de resistência .................................... 17
2.2.1.1.1.1 Proteínas ................................................................................................ 17
2.2.1.1.2 Alterações bioquímicas da indução de resistência ................................... 17
2.2.1.1.2.1 Peroxidase ............................................................................................. 17
2.2.1.1.1.2 Polifenoloxidase ..................................................................................... 18
2.2.1.1.1.3 Fenilalanina amônia-liase.........................................................................19
2.2.1.1.1.4 β-1,3 glucanase...................................................................................... 20
2.2.1.2 Indutores de resistência ............................................................................... 20
2.2.2 Potencial de cogumelos no controle de doenças..............................................22
2.2.2.1 Pycnoporus sanguineus (L. ex Fr.).................................................................22
2.2.2.2 Potencial de P.sanguineus no controle de doenças......................................24
3 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 25
3.1 DESCRIÇÃO DO LOCAL E DO DELINEAMENTO DOS EXPERIMENTOS.......25
3.2 ISOLAMENTO DA BACTÉRIA............................................................................26
3.3 OBTENÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO............................26
3.4 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS............................................................................27
3.4.1 Obtenção de extrato bruto aquoso de P. sanguineus ..................................... 27
3.4.2 Micélio de P. sanguineus obtido do cultivo em meio líquido............................ 28
3.4.3 Extrato do filtrado da cultura de P. sanguineus............................................... 28
5
3.5 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA......................................................................... 28
3.6 INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA ............................................................................ 29
3.7 ANÁLISES BIOQUÍMICAS................................................................................. 30
3.7.1 Coleta de amostras para análise bioquímica................................................... 30
3.7.2 Obtenção dos extratos protéicos..................................................................... 30
3.7.3 Teor de proteína.............................................................................................. 30
3.7.4 Determinação da atividade de peroxidase ...................................................... 31
3.7.5 Determinação da atividade de polifenoloxidase .............................................. 31
3.7.6 Determinação da atividade de fenilalanina amônia-liase................................. 32
3.7.7 Determinação da atividade de β-1,3 glucanase................................................32
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................................ 33
4.1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ........................................................................ 33
4.2 AVALIAÇÃO DA SEVERIDADE ......................................................................... 36
4.3 ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS DA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA................... 38
4.3.1 Teor de proteína.............................................................................................. 38
4.4 ALTERAÇÕES BIOQUÍMICAS DA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA .................... 40
4.4.1 Atividade de peroxidase ................................................................................. 40
4.4.2 Atividade de polifenoloxidase ......................................................................... 42
4.4.3 Atividade de fenilalanina amônia-liase..............................................................44
4.4.3 Atividade de β-1,3 glucanase .......................................................................... 46
5 CONCLUSÕES..................................................................................................... 49
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................50
6
i
RESUMO
A cultura do feijão (Phaseolus vulgaris) está entre uma das principais da
agricultura nacional e pode ser afetada por várias doenças, como o crestamento
bacteriano comum causado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. O
entendimento desse patossistema pode contribuir para que sejam desenvolvidos
métodos alternativos para o controle desta doença. O objetivo deste trabalho foi
verificar as atividades antibacteriana e indutora de resistência de extratos de
Pycnoporus sanguineus para controle desta doença em feijoeiro. O estudo in vitro foi
realizado no Laboratório de Fitopatologia da Universidade Estadual do Oeste do
Paraná (UNIOESTE) – Campus de Marechal Cândido Rondon – PR e foram
utilizados extratos aquosos de basidiocarpo, micélio e filtrado de cultura de P.
sanguineus nas concentrações de 1, 5, 10, 15 e 20%, além das testemunhas, água,
acibenzolar-S-metil (ASM - 125 mg i.a. L
-1
) e antibiótico (22,5 mg L
-1
de
oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina). Para o teste in vivo, foi realizada a
avaliação de severidade e atividade de peroxidase, polifenoloxidase, β-1,3
glucanase e fenilalanina amônia-liase, com o uso de extrato de micélio, basidiocarpo
e filtrado de cultura de P. sanguineus a 5 e 10%, sendo estes ensaios conduzidos
em estufa na área pertencente ao Complexo de Controle Biológico e Cultivo
Protegido Mário César Lopes da UNIOESTE, Campus de Marechal Cândido
Rondon. In vitro verificou-se atividade antibacteriana apenas para o filtrado de
cultura em concentrações acima de 15% e para o extrato de basidiocarpo em todas
as concentrações avaliadas. In vivo, os resultados indicaram o potencial de extratos
de basidiocarpos de P. sanguineus para o controle de Xanthomonas axonopodis pv.
phaseoli em feijoeiro, o que pode ocorrer tanto por atividade antimicrobiana direta
quanto por indução de resistência envolvendo a ativação das enzimas de defesa
vegetal estudadas.
Palavras-chave: controle alternativo, indução de resistência, proteínas relacionadas
à patogênese, atividade antimicrobiana.
7
ii
ABSTRACT
Control of bacterial blight (Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli) and
biochemical analyses of bean resistance treated with Pycnoporus sanguineus
extracts
Bean (Phaseolus vulgaris) is among one of the main Brazilian crops and can
be affected by several diseases, such as common bacterial blight caused by
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. The study of this interaction can contribute to
development of alternative methods to control this disease. The aim of this work was
to verify the antimicrobial and resistance induction activities of Pycnoporus
sanguineus extracts for the control of this bean disease. The in vitro assays was
conducted at the Laboratory of Plant of the State University of West of Paraná
(UNIOESTE) - Campus of Marechal Cândido Rondon - PR and were used aqueous
extracts from basidiocarp, mycelium and culture filtrate of P. sanguineus in
concentrations of 1, 5, 10, 15 and 20%, with water, acibenzolar-S-methyl (ASM - 125
mg a.i. L
-1
) and antibiotic (oxytetracycline 22.5 mg L
-1
+ streptomycin 225 mg L
-1
) as
control treatments. For in vivo assays were evaluated disease severity and the
activities of peroxidase, polyphenol oxidase, β-1,3 glucanase and phenylalanine
ammonia-lyase, using extracts of mycelium, basidiocarp and culture filtrate of P.
sanguineus at 5 and 10%, these tests being conducted in greenhouses in the area
belonging to the Complex Biological Control and Protected Cultivation Mario Cesar
Lopes of UNIOESTE, Campus of Marechal Cândido Rondon. In vitro was verified
antibacterial activity only for culture filtrate in concentrations up 15% and for all
concentrations of basidiocarp extract. In vivo the results indicated the potential of
basidiocarps extracts from P. sanguineus for the control of Xanthomonas axonopodis
pv. phaseoli in bean, which can occur either by direct antimicrobial activity and
resistance induction involving the activation of enzymes studied.
Key words: alternative control, resistance induction, pathogenesis related proteins,
antimicrobial activity.
8
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Basidiocarpos de Pycnoporus sanguineus. Fonte: TOILLIER, S. L.........27
Figura 2 Efeito de diferentes concentrações de extrato aquoso de micélio de
Pycnoporus sanguineus sobre o crescimento de Xanthomonas
axonopodis pv. phaseoli e sua comparação com efeito de antibiótico
(agrimicina: 22,5 mg L
-1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina)
e acibenzolar-s-metil (ASM) (125 mg i.a. L
-1
), no crescimento bacteriano.
Valores seguidos de mesma letra (maiúscula para comparação com ASM
e minúscula para comparação com antibiótico) não diferem
estatisticamente pelo teste de Tukey a 5%..............................................33
Figura 3 Efeito de diferentes concentrações de extrato aquoso de filtrado de
Pycnoporus sanguineus sobre o crescimento de Xanthomonas
axonopodis pv. phaseoli e sua comparação com efeito de antibiótico
(agrimicina: 22,5 mg L
-1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina)
e acibenzolar-s-metil (ASM) (125 mg i.a. L
-1
), no crescimento bacteriano.
Valores seguidos de mesma letra (maiúscula para comparação com ASM
e minúscula para comparação com antibiótico) não diferem
estatisticamente pelo teste de Tukey a 5%..............................................34
Figura 4 Efeito de diferentes concentrações de extrato aquoso de basidiocarpos
de Pycnoporus sanguineus sobre o crescimento de Xanthomonas
axonopodis pv phaseoli e sua comparação com efeito de antibiótico
(agrimicina: 22,5 mg L
-1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina)
e acibenzolar-s-metil (ASM) (125 mg i.a. L
-1
), no crescimento bacteriano.
Valores seguidos de mesma letra (maiúscula para comparação com ASM
e minúscula para comparação com antibiótico) não diferem
estatisticamente pelo teste de Tukey a 5%..............................................34
Figura 5 Severidade para crestamento bacteriano comum causado por X.
axonopodis pv. phaseolus em feijoeiro em função dos tratamentos com
extratos aquosos de basidiocarpo (B) e de micélio (M) e filtrado de cultura
(F) de P. sanguineus em concentrações de 5 e 10%, na primeira folha
tratada e inoculada (A) e na segunda folha (B) apenas inoculada, em
condições de casa de vegetação. Agr: antibiótico (22,5 mg L
-1
de
oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina); ASM: acibenzolar-s-metil
(125 mg i.a. L
-1
); Água: testemunha. Médias seguidas de mesma letra
(a/b), não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a 5%..37
Figura 6 Teor de proteína em plantas de feijoeiro inoculadas com Xanthomonas
axonopodis pv. phaseoli três dias após os tratamentos com os controles
água (●), antibiótico (Agrimicina: 22,5 mg L
-1
de oxitetraciclina + 225 mg
L
-1
de estreptomicina) (■), acibenzolar-S-metil (ASM 125 mg i.a. L
-1
) (▲) e
os extratos aquosos de Pycnoporus sanguineus obtidos do basidiocarpo
a 5 e 10% (♦ e ▼), filtrado de cultura a 5 e 10% (♦ e ▼ ) e micélio a 5 e
10% (♦ e ▼). (a) e (b) representam respectivamente a 1ª folha tratada
9
iv
inoculada, e a 2ª folha apenas inoculada. Barras indicam a média +/– o
erro padrão........................................................................................39
Figura 7 Atividade específica de peroxidase em plantas de feijoeiro inoculadas
com Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli três dias após os tratamentos
com os controles água (●), antibiótico (Agrimicina: 22,5 mg L
-1
de
oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina) (■), acibenzolar-S-metil
(ASM 125 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos de Pycnoporus
sanguineus obtidos do basidiocarpo a 5 e 10% (♦ e ▼), filtrado de cultura
a 5 e 10% (♦ e ▼ ) e micélio a 5 e 10% (♦ e ▼). (a) e (b) representam
respectivamente a 1ª folha tratada e inoculada, e a 2ª folha apenas
inoculada. Barras indicam a média +/– o erro padrão ..........................41
Figura 8 Atividade específica de polifenoloxidase em plantas de feijoeiro
inoculadas com Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli três dias após os
tratamentos com os controles água (●), antibiótico (Agrimicina: 22,5 mg L
-
1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina) (■), acibenzolar-S-
metil (ASM 125 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos de Pycnoporus
sanguineus obtidos do basidiocarpo a 5 e 10% (♦ e ▼), filtrado de cultura
a 5 e 10% (♦ e ▼ ) e micélio a 5 e 10% (♦ e ▼)(a) e (b) representam
respectivamente a 1ª folha tratada e inoculada, e a 2ª folha apenas
inoculada. Barras indicam a média +/– o erro padrão.............................43
Figura 9 Atividade específica de fenilalanina amônia-liase em plantas de feijoeiro
inoculadas com Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli três dias após os
tratamentos com os controles água (●), antibiótico (Agrimicina: 22,5 mg L
-
1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina) (■), acibenzolar-S-
metil (ASM 125 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos de Pycnoporus
sanguineus obtidos do basidiocarpo a 5 e 10% (♦ e ▼), filtrado de cultura
a 5 e 10% (♦ e ▼ ) e micélio a 5 e 10% (♦ e ▼)(a) e (b) representam
respectivamente a 1ª folha tratada e inoculada, e a 2ª folha apenas
inoculada. Barras indicam a média +/– o erro padrão..... .......................45
Figura10 Atividade específica de β-1,3-glucanase em plantas de feijoeiro
inoculadas com Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli três dias após os
tratamentos com os controles água (●), antibiótico (Agrimicina: 22,5 mg L
-
1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina) (■), acibenzolar-S-
metil (ASM 125 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos de Pycnoporus
sanguineus obtidos do basidiocarpo a 5 e 10% (♦ e ▼), filtrado de cultura
a 5 e 10% (♦ e ▼ ) e micélio a 5 e 10% (♦ e ▼)(a) e (b) representam
respectivamente a 1ª folha tratada e inoculada, e a 2ª folha apenas
inoculada. Barras indicam a média +/– o erro
padrão.......................................................................................................47
10
1 INTRODUÇÃO
A cultura do feijão (Phaseolus vulgaris L.) está entre uma das principais da
agricultura nacional e pode ser afetada por várias doenças, como o crestamento
bacteriano comum, causado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Smith)
Vanterin, Hoste, Kersters e Swinger (Xap). A maioria dos cultivares de feijoeiro em
uso nas diferentes regiões do país é suscetível a esta bactéria e a eficácia do
controle químico com bactericidas é contraditória.
Atualmente busca-se a produção de alimentos orgânicos, ou seja, isenta da
utilização de produtos químicos. Nesse cenário, encontramos o controle alternativo
de doenças, que envolve o controle biológico (uso de microrganismos antagônicos),
a indução de resistência (ativação de mecanismos de defesa latentes das plantas) e
o uso de produtos naturais com atividades antimicrobiana direta e/ou indutora de
resistência. Entre esses produtos naturais, estão os óleos essenciais, extratos de
plantas medicinais e de cogumelos.
Com relação aos cogumelos, têm-se o controle de mancha marrom e
ferrugem em trigo e de antracnose em pepino com extratos dos basidiomicetos
Lentinula edodes (Shiitake) e Agaricus blazei (Cogumelo do Sol). Trabalhos
preliminares têm indicado o potencial de extratos aquosos de basidiocarpos de
Pycnoporus sanguineus (fungo saprófita, decompositor de madeira e com
propriedades medicinais) para o controle da antracnose causada por Colletotrichum
lindemuthianum em feijoeiro, o que pode ocorrer tanto por atividade antimicrobiana,
através da inibição da germinação de conídios, quanto por indução de resistência
local e sistêmica, através da ativação de peroxidases.
Dessa forma, o melhor entendimento da interação feijoeiro – P. sanguineus -
X. axonopodis pv. phaseoli, pode contribuir para que sejam desenvolvidos métodos
alternativos ao químico para o controle desta doença. Diante do exposto, este
trabalho teve como objetivos estudar possíveis mecanismos de defesa do feijoeiro a
este patógeno, como o envolvimento de proteínas relacionadas à patogênese,
quando tratado com extratos de basidiocarpo, micélio ou filtrado de cultura de P.
sanguineus, o que poderá auxiliar na condução de pesquisas futuras para se obter
um controle mais adequado ou eficiente desta doença.
11
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 A CULTURA DO FEIJOEIRO
O feijoeiro pertence ao gênero Phaseolus, que inclui aproximadamente 100
espécies, sendo cultivadas apenas quatro: P. vulgaris L. (feijão comum), P.
coccineus L. (feijão ayocote), P. acutifolius F. (feijão tepari) e P. lunatus L. (feijão de
lima). O feijoeiro comum é a principal espécie deste gênero. É uma planta anual
herbácea e termófila, isto é, não suporta geada, sendo que seu cultivo visa
principalmente a produção de grãos (VIEIRA & HEMP, 1992), o qual constitui um
dos alimentos básicos da população brasileira e um dos principais produtos
fornecedores de proteína na dieta alimentar bem como, rico em ferro (VIEIRA et al.,
2006).
Considerando somente o gênero Phaseolus, o Brasil é o maior produtor,
seguido do México. Mas a produção brasileira de feijão tem sido insuficiente para
abastecer o mercado interno, devido à redução na área plantada, da ordem de 35%,
nos últimos 17 anos. Mesmo o aumento de 48% na produtividade, verificado neste
período, ainda resultou numa diminuição de 4% na produção, portanto, não sendo
suficiente para atender a demanda (YOKOYAMA, 2003).
A área ocupada pelo feijoeiro anualmente no Brasil está em torno de 4
milhões de hectares, produzindo mais de três milhões de toneladas, considerando
as três épocas de produção (águas, seca e inverno com irrigação), sendo cultivado
tanto por pequenos agricultores que utilizam baixo nível tecnológico no processo
produtivo, quanto por empresários rurais altamente tecnificados (IBGE, 2008).
O Brasil é o maior produtor mundial de feijão-comum e também o maior
consumidor dessa leguminosa, com um consumo per capita em 2003, de cerca de
16 kg/ano (VIEIRA et al., 2006). É produzido em praticamente toda a área nacional,
com destaque para Paraná, Minas Gerais, Bahia, São Paulo, Goiás, Santa Catarina,
Rio Grande do Sul, Ceará, Pernambuco e Pará, sendo que os cinco primeiros são
responsáveis por praticamente 65% da produção nacional. A região Sul contribuiu
no ano de 2004, com 32% da produção nacional, representando mais de 953 mil
toneladas. O Estado do Paraná foi responsável por 22% da produção brasileira de
feijão em 2004, com mais de 668 mil toneladas, onde se destacam: Curitiba, Ponta
12
Grossa, Irati, Guarapuava, União da Vitória, Jacarezinho, Cascavel, Pato Branco e
Umuarama (FNP, 2005).
O Paraná consegue colher parte da safra das águas a partir de outubro,
sendo que a maior concentração ocorre em dezembro e janeiro. Nos outros meses
do ano, o índice de colheita em relação ao restante do país é menos significativo,
com exceção de março e abril (com vantagem da colheita ser contínua). Colhe-se
uma terceira safra no noroeste paranaense, sendo assim, pode-se verificar que este
Estado sempre oferta feijão novo e é o que mais contribui para o abastecimento
nacional. Na colheita da primeira safra, cerca de 50% do feijão produzido é do tipo
preto, enquanto na 2ª e 3ª safras o destaque é para o feijão de cores (FERREIRA et
al., 2002).
No ano de 2007, a produção nacional total de feijão em grãos foi reduzida em
2,8% de área plantada (3.907.467 ha), 3,1% da produção (3.330,435 t) e 0,5% da
produtividade (852 kg/ha) (IBGE, 2007). As condições climáticas e problemas
fitossanitários da cultura podem ser responsáveis pela queda da produção agrícola
de feijão no Brasil (BORÉM & CARNEIRO, 2006).
O feijoeiro é afetado por mais de 300 doenças causadas por vírus, bactérias,
fungos e nematóides, as quais contribuem para o seu baixo rendimento, em todas as
regiões do mundo onde é praticada (SARTORATO et al., 1996). Muitas destas
doenças podem causar, de acordo com as condições do ambiente, danos totais na
produção ou, dependendo do nível de contaminação, tornar inviáveis determinadas
áreas para o cultivo (PAULA JUNIOR & ZAMBOLIM, 1998).
Desde a semeadura até quando os grãos estão secos nas vagens ou
armazenados, podem-se observar danos causados pelas pragas e doenças na
cultura do feijoeiro (EMBRAPA, 2004), as quais constituem uma das principais
causas da sua baixa produtividade no Brasil (VIEIRA et al., 2006). Como é uma
planta que apresenta ciclo curto, pode ser cultivado duas a três vezes no mesmo
ano agrícola, ficando sujeito a diversos fatores que interferem na sua produção,
além de depreciar a qualidade do produto (EMBRAPA, 2004), dentre os quais está o
crestamento bacteriano comum.
13
2.1.1 Crestamento bacteriano comum (Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli)
O crestamento bacteriano comum é uma doença cosmopolita que ocorre na
cultura do feijoeiro, principalmente nas regiões úmidas e quentes do globo,
ocorrendo no Brasil também nessas regiões. Tem sido problemática na Região
Sudeste, Sul e Centro-oeste, principalmente na safra das águas. Não existem
estimativas de danos que esta doença acarreta na produção sob as condições
brasileiras. Trabalhos desenvolvidos no exterior mostraram que podem variar de 0,2
a 45% (BIANCHINI et al., 2005).
2.1.2 Sintomas
Os sintomas típicos da doença são visíveis em toda parte aérea da planta.
Nas folhas, as lesões inicialmente são visíveis na face inferior, onde são pequenas e
encharcadas e à medida que se desenvolvem, os tecidos tornam-se secos e
quebradiços, circundados por um halo amarelo facilmente observado na face
superior das folhas. As lesões nos caules das plantas novas são deprimidas e
iniciam-se sob a forma de manchas aquosas, que aumentam gradualmente de
tamanho e tomam a aparência de riscos vermelhos que se estendem ao longo do
caule, cuja superfície normalmente racha, podendo o exsudato bacteriano acumular-
se na lesão. Nas vagens, as lesões inicialmente são encharcadas, circulares a
irregulares, apresentando ou não exsudato bacteriano de cor amarela para depois
se tornarem secas e avermelhadas, sendo a infecção normalmente observada na
sutura das vagens. As sementes infectadas podem se apresentar descoloridas,
enrugadas ou simplesmente não apresentar sintomas visíveis (OLIVEIRA & SOUZA,
1997).
O principal modo de disseminação da bactéria de uma área para a outra se
faz através de sementes contaminadas, e dentro de uma plantação, através de
respingos de chuva, implementos agrícolas e insetos. As plantas originárias de
sementes infectadas podem desenvolver lesões que circundam o nó cotiledonar,
provocando o seu enfraquecimento e a quebra do caule, o qual não suporta o peso
das vagens (ROSOLEM et al., 1994).
14
2.1.3 Etiologia e epidemiologia
O agente causal do crestamento bacteriano comum do feijoeiro é atualmente
denominado Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. Esta bactéria, quando cultivada
em meio nutriente-ágar contendo glicose ou sacarose, forma colônias amareladas
de bordos lisos, convexas, brilhantes e circulares. A bactéria é baciliforme, gram-
negativa, possui um flagelo polar e cresce a 37 ºC (BIANCHINI et al., 2005).
X. axonopodis pv. phaseoli sobrevive de diferentes formas. Em sementes,
pode sobreviver por períodos variáveis de dois a 15 anos, no estado hipobiótico
(latente), podendo estar localizada interna ou externamente à semente, sem perder
sua patogenicidade. Algumas ervas-daninhas são hospedeiras da bactéria como
Acalypha aloperoides, Ambrosia artemisifolia, Amaranthus spp., A. retroflexus,
Chenopodium album, Cyperus rotundus, Physalis sp., Portulaca oleraceae, Sida
rhombifolia, Ruellia tuberosa, Strophostyles helvola, Vicia sativa e V. villosa (RAVA &
SARTORATO, 1994).
2.1.4 Controle do crestamento bacteriano comum
Devido à sua ampla distribuição, à capacidade de reduzir a produção de
forma significativa e às dificuldades de controle do crestamento bacteriano comum
do feijoeiro (TEBALDI et al., 2007), este é realizado através da adoção de várias
medidas simultaneamente, onde o emprego de sementes de boa qualidade sanitária
é primordial (BIANCHINI et al., 2005).
Alguns países como Estados Unidos, Canadá, França e Holanda, têm como
rotina, o exame sanitário de sementes de feijoeiro, visando a certificação para X.
axonopodis pv. phaseoli e outros patógenos de importância econômica para a
cultura. Embora existam várias técnicas de detecção para este patógeno, no Brasil
não há o emprego rotineiro da análise de sementes de feijoeiro, para certificação
das sementes para esta bactéria. Além de que a produção de sementes deve ser
realizada sob condições climáticas desfavoráveis à doença (BIANCHINI et al., 2005).
Outro problema sério são as lavouras de subsistência, onde pouca ou
nenhuma tecnologia é empregada, utilizando sementes próprias, o que facilita a
perpetuação do patógeno de um cultivo para outro. Algumas medidas que também
15
podem ser adotadas são: incorporação de restos culturais infectados a uma
profundidade de 15-20 cm, rotação de cultura com plantas não hospedeiras da
bactéria por um período mínimo de um ano, eliminação de ervas daninhas e
voluntárias, além do controle de insetos disseminadores desta bactéria. Infelizmente,
a maioria dos cultivares de feijoeiro em uso nas diferentes regiões do país é
suscetível a essa bacteriose (OLIVEIRA & SOUZA, 1997). Têm-se disponíveis
algumas variedades com níveis moderados de resistência, tais como: Bambrei, BR
IPAGRO 44, BRS MG Talismã, Diamante negro e Safira (BIANCHINI et al., 2005).
A eficácia do controle químico dessa doença, com a pulverização das plantas
com produtos bactericidas, é muito contraditória. Pesquisas desenvolvidas no Brasil,
mais especificamente no Estado do Paraná, evidenciaram a ineficácia de três
pulverizações dos produtos oxicloreto de cobre, sulfato de estreptomicina +
oxitetraciclina, oxicloreto de cobre + maneb e oxicloreto de cobre + zineb no controle
da doença nas folhas e vagens e na redução da transmissão da bactéria por
sementes (BIANCHINI et al., 2005).
2.2 CONTROLE DE DOENÇAS
Na maior parte dos casos, o controle químico de doenças de plantas, é o
único método eficiente e economicamente viável para garantir a alta produtividade e
a qualidade da produção (KIMATI, 1995). Como conseqüência, o uso indiscriminado
desses produtos, pode acarretar, em determinado tempo, o surgimento de isolados
de fitopatógenos resistentes às substâncias químicas utilizadas (GHINI & KIMATI,
2000), além do ressurgimento de pragas, contaminação de alimentos e do meio
ambiente, intoxicação de homens e animais (BURG & MAYER, 1998).
Visando minimizar os impactos causados no ambiente e na saúde dos seres
vivos, atualmente, buscam-se alternativas para o manejo adequado de pragas e
doenças.
16
2.2.1 Controle alternativo de doenças
Na agricultura orgânica, o controle alternativo de pragas e doenças é aquele
que inclui o controle biológico, a indução de resistência em plantas (MORAES, 1992)
e o uso de extratos naturais com propriedades antimicrobianas e/ou indutores de
resistência (SCHWAN-ESTRADA et al., 2003).
O controle biológico pode ser definido como o controle de um microrganismo
antagônico, o qual pode atuar por meio de antibiose, parasitismo, competição,
predação ou hipovirulência (COOK & BAKER, 1983).
2.2.1.1 Indução de resistência
Segundo Moraes (1992), a expressão “indução de resistência” serve tanto
para designar proteção local, ou seja, a indução de resistência apenas nos tecidos
em que foi realizado o tratamento com agente indutor (onde se manifesta), ou
sistêmica, quando manifesta-se longe do local onde foi aplicado o agente indutor.
Segundo Lyon et al. (1995), a indução de resistência pode ser considerada como
uma estratégia potencial para o controle fitossanitário.
A resistência induzida já foi verificada em diversas plantas, como
monocotiledôneas e dicotiledôneas (SCHNEIDER et al., 1996). Esse tipo de
proteção vai depender do intervalo de tempo entre o tratamento com o indutor e a
subseqüente inoculação do patógeno (PASCHOLATI & LEITE, 1995). Essa
dependência indica que mudanças específicas no metabolismo da planta,
envolvendo a síntese ou acúmulo de substâncias, são importantes no fenômeno da
resistência induzida.
A resistência induzida envolve a ativação de mecanismos de defesa latentes
existentes nas plantas em resposta ao tratamento com agentes bióticos, como
microrganismos viáveis ou inativos, ou abióticos, como ácido aminobutírico (COHEN,
1996), ácido 2,6-dicloroisonicotínico (HIJWEGWN et al., 1996) e acibenzolar-S-metil
(RESENDE et al., 2001), além de metais pesados, luz ultravioleta, ácido salicílico,
fosfitos e silicatos, entre outros (CAVALCANTI et al., 2005a). Esses mecanismos de
resistência podem incluir o acúmulo de compostos fenólicos, fitoalexinas e proteínas
17
relacionadas à patogênese (como β-1,3 glucanase, quitinase e peroxidase)
(PASCHOLATI & LEITE, 1995; CAVALCANTI et al., 2005b).
2.2.1.1.1 Alterações fisiológicas da indução de resistência
2.2.1.1.1.1 Proteínas
Entre as proteínas, existem as relacionadas à patogênese (Proteínas-RP),
que são definidas como proteínas vegetais que são induzidas nos tecidos vegetais
sistemicamente ou em parte destes, e acumulam-se após o ataque por um patógeno
ou situações relacionadas, como o tratamento com certos agentes químicos e outros
tipos de estresses (físicos) que simulam o efeito de patógenos (VAN LOON et al.,
1994 apud GUZZO, 2003). A ativação da síntese protéica leva a uma fase de
resistência da planta (LARCHER, 2000).
Kuhn (2007) verificou redução no teor de proteínas em plantas de feijão
quando tratadas com Bacillus cereus, tendência contrária ao tratamento com
acibenzolar-S-metil, demonstrando a especificidade na resposta fisiológica do
hospedeiro ao tratamento.
2.2.1.1.2 Alterações bioquímicas da indução de resistência
2.2.1.1.2.1 Peroxidase
As peroxidases são classificadas como proteínas relacionadas à patogênese
(Proteínas-RP), pertencentes à família PR-9 (VAN LOON & VAN STRIEN, 1999).
Mudanças na atividade das peroxidases têm sido freqüentemente correlacionadas a
resposta de resistência ou suscetibilidade em diferentes patossistemas (BONATTI et
al., 1994).
A enzima peroxidase (E.C. 1.11.1.7) e suas isoformas participam de várias
mudanças nos processos fisiológicos de plantas submetidas a estresses,
catalisando a oxidação e a eventual polimerização de álcool hidroxicinâmico
(remoção de átomos de hidrogênio dos grupos álcoois hidroxicinâmicos) na
18
presença de peróxido de hidrogênio, originando lignina (polímero complexo formado
principalmente de unidades de fenilpropanóides). Esse polímero, juntamente com
celulose e outros polissacarídeos que ocorrem na parede celular das plantas
superiores, funciona como uma barreira física à penetração do patógeno (GASPAR
et al., 1982; GASPAR et al., 1985; PASCHOLATI & LEITE, 1994).
As peroxidases também oxidam compostos fenólicos, participam da
biossíntese do hormônio vegetal etileno em resposta ao ataque de patógenos,
regulam o nível de ácido indolacético (AIA) e a dormência das sementes
(LAGRIMINI et al., 1987; ABELES & BILES, 1991; ASADA, 1992; GUZZO, 2003).
2.2.1.1.2.2 Polifenoloxidase
As polifenoloxidases (E.C. 1.14.18.1), PPO, também conhecidas como
tirosinases, cresolases, catecolases, difenolases e fenolases, são enzimas
intracelulares que ocorrem em plantas, animais e fungos (WHITAKER, 1994;
ZAWISTOWSKI, 1991). Estas enzimas contêm cobre no centro ativo e catalisam
dois tipos de reações, ambas envolvendo oxigênio. A primeira reação corresponde à
hidroxilação de monofenóis formando orto-difenóis e a segunda à oxidação de orto-
difenóis formando orto-quinonas (VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981).
As polifenoloxidases agrupam um conjunto de enzimas responsáveis pela
catálise da reação de oxidação de polifenóis originando quinonas altamente tóxicas
aos microrganismos (PASCHOLATI & LEITE, 1995) e a insetos. Neste último,
taninos na forma fenólica são oxidados a quinonas apresentando alta reatividade
com as proteínas na dieta do inseto, impedindo que este possa digeri-las (TAIZ &
ZEIGER, 2006).
As polifenoloxidases geralmente mantêm-se inativas no interior da célula
vegetal, compartimentalizadas nos tilacóides dos cloroplastos, sendo liberadas e
iniciando a oxidação dos compostos fenólicos somente quando a planta hospedeira
sofre o ataque de insetos ou patógenos (MOHAMMADI & KAZEMI, 2002).
19
2.2.1.1.2.3 Fenilalanina amônia-liase
As plantas produzem uma grande variedade de produtos secundários
chamados de compostos fenólicos, que agem como compostos de defesa contra
patógenos, suporte mecânico da planta proporcionado pela lignina (DIXON & PAIVA,
1995; WHETTEN & SEEDEROFF, 1995) e proteção contra radiação UV (DIXON &
PAIVA, 1995). A classe mais abundante de compostos fenólicos é derivada da
fenilalanina, por meio da eliminação de uma molécula de amônia para formar o ácido
trans-cinâmico, esta reação é catalisada pela enzima fenilalanina amônia-liase (FAL)
(TAIZ & ZEIGER, 2006). O ácido trans-cinâmico pode ser incorporado em diferentes
compostos fenólicos (ácido 4-cumárico, ácido caféico, ácido ferúlico e ácido
sinápico), os quais estão presentes na formação de ésteres (CAVALCANTI et al.,
2005b).
A fenilalanina amônia-liase (E.C. 4.3.1.5) é a primeira enzima do
metabolismo fenilpropanóide na maioria das plantas e tem sido indicada por seu
importante papel no controle de acúmulos fenólicos em resposta à infecções
(STRACK, 1997). É uma enzima largamente estudada por fisiologistas por causa de
sua importância chave no metabolismo secundário das plantas, e em meio ao
fenômeno da indução de resistência, também é uma das enzimas mais estudadas
(KUHN, 2007). A FAL tem sido encontrada principalmente em plantas superiores,
mas também está presente em fungos (RÖSLER et al., 1997) e bactérias (XIANG &
MOORE, 2005). A invasão de patógenos, por exemplo, desencadeia a transcrição
do RNA mensageiro que codifica FAL, aumentando a quantidade desta enzima na
planta e estimulando a síntese de compostos fenólicos (TAIZ & ZEIGER, 2006).
A rota biossintética do AS apresenta seu início com a conversão da
fenilalanina a ácido trans-cinâmico (t-CA), sendo catalisada pela enzima fenilalanina
amônia-liase (PAL). O t-CA é convertido em AS, este produto do metabolismo de
fenilpropanóides, pode ter papel fundamental na transmissão de sinais para ativar a
SAR (SILVA, 2002; MORAES, 1998). Campos et al. (2003) induziram resistência em
quatro cultivares de feijoeiro com ácido salicílico (AS) e um isolado de Colletotrichum
lindemuthianum avirulento e observaram que o fungo e o AS induziram a atividade
de fenilalanina amônia-liase, porém a magnitude desta atividade variou em função
do cultivar.
20
Latunde-Dada & Lucas (2001) verificaram que em plantas de Vigna
unguiculata inoculadas com Colletotrichum destructivum, o aumento da resistência
em tecidos induzidos por ASM foi associado com um rápido e efetivo aumento nas
atividades de duas enzimas-chave na via de fenilpropanóides (fenilalanina amônia-
liase e chalcona isomerase) que levou a um acelerado acúmulo de substâncias do
grupo dos flavonóides, kievitonas e faseolidina.
2.2.1.1.2.4 β-1,3 glucanases
As proteínas relacionadas à patogênese como as β-1,3 glucanases (E.C.
3.2.1.39) (STINTIZI et al., 1993) pertencem à família PR-2 e são agrupadas em pelo
menos três classes distintas, com base nas seqüências de aminoácidos de suas
estruturas primárias. As glucanases de classe I são proteínas básicas localizadas no
vacúolo da célula vegetal, especialmente na epiderme das folhas inferiores e nas
raízes de plantas sadias, enquanto que as classes II e III incluem as proteínas
ácidas extracelulares (SELITRENNIKOFF, 2001 apud GUZZO, 2003).
As β-1,3 glucanases têm sido relatadas principalmente como inibidoras do
crescimento fúngico (VAN LOON & VAN STRIEN, 1999), pois hidrolisam polímeros
de β-1,3 glucana, composto que juntamente com a quitina são os principais
componentes da parede celular dos fungos (CORNELISSEN & MELCHERS, 1993).
Na indução de resistência, o incremento da β-1,3 glucanase está relacionado
com a defesa da planta. Kuhn (2007) verificou aumento significativo da enzima,
quando as plantas de feijão foram tratadas com acibenzolar-S-metil (indutor de
resistência comercial), e Stangarlin & Pascholati (2000) observaram aumento na
produção de β1,3-glucanase em plantas de feijão (cv. Carioca), quando infectadas
com Uromyces appendiculatus.
2.2.1.2 Indutores de resistência
A resistência de um hospedeiro a um patógeno pode ser definida como a
capacidade da planta em atrasar ou evitar a entrada e a posterior atividade de um
patógeno em seus tecidos (PASCHOLATI & LEITE, 1995).
21
Segundo Pascholati & Leite (1995), os mecanismos de resistência das
plantas são divididos em duas categorias, os pré-formados - presentes na planta
antes do contato com o patógeno e os pós-formados - produzidos ou ativados em
resposta à presença do patógeno. Ainda segundo esses autores, cada grupo de
mecanismo compreende, por exemplo:
• Pré-formados (passivos; constitutivos):
a) estruturais: cutículas, tricomas, estômatos, fibras/vasos condutores;
b) bioquímicos: fenóis, alcalóides glicosídeos, lactonas, glicosídeos fenólicos e
cianogênicos, inibidores protéicos, fitoalexinas.
• Pós-formados (ativos; induzíveis):
a) estruturais: papilas, halos, lignificação, camadas de cortiça e tiloses;
b) bioquímicos: fitoalexinas, proteínas relacionadas à patogênese.
Os mecanismos de defesa das plantas contra fitopatógenos envolvem
alterações metabólicas correlacionadas a mudanças na atividade de enzimas
chaves, como a peroxidase e fenilalanina amônia-liase, nos metabolismos primário e
secundário, assim como enzimas relacionadas diretamente na atividade de defesa,
como as β-1,3 glucanases (CAVALCANTI et al., 2005b).
Os elicitores são moléculas de origem biótica ou abiótica, capazes de ativar
e/ou induzir qualquer resposta de defesa nas plantas (SMITH, 1996). Dentre os
elicitores não convencionais, podem-se incluir os extratos de plantas medicinais e
óleos essenciais (compostos secundários) com propriedades antimicrobianas ou
indutoras de resistência (STANGARLIN et al., 1999; SCHWAN-ESTRADA et al.,
2003; SCHWAN-ESTRADA & STANGARLIN, 2005), bem como os extratos obtidos
de cogumelos (DI PIERO et al., 2005).
Apesar dos resultados promissores do ponto de vista de controle de
fitopatógenos, tem-se que avaliar ainda se a aplicação destes produtos interfere no
desenvolvimento vegetativo e no rendimento da cultura em condições de campo.
Estudos têm demonstrado que a resposta aos elicitores envolve uma série de
alterações metabólicas nas plantas, como a síntese de compostos secundários e
para tal, a indução da resistência pode alterar a partição de carbono e o
desenvolvimento vegetal (ANTONIAZZI, 2005). Segundo Herrmmann & Weaver
(1999), a rota do chiquimato, responsável pela formação de grande parte destes
compostos, é considerada uma das vias principais de fluxo de carbono em plantas.
22
2.2.2 Potencial de cogumelos no controle de doenças de plantas
Segundo Fiori-Tutida et al. (2007), são escassos os trabalhos que têm
utilizado cogumelos para o controle de doenças em plantas, mas os estudos
realizados até o momento, têm apresentado resultados animadores, demonstrando a
importância dos cogumelos no mercado mundial, levando-se em consideração o seu
valor nutricional e as possíveis aplicações na área médica e industrial e, mais
recentemente, na área agrícola, para o controle de doenças de plantas.
Di Piero & Pascholati (2004) demonstraram redução parcial na severidade da
antracnose foliar em plantas de pepino pré-tratadas com os extratos de L. edodes e
A. blazei, bem como sistematicamente. O efeito protetor foi dependente da
concentração do extrato de cogumelo utilizado e, em menor grau, do intervalo de
tempo entre indução-inoculação e das condições do ambiente.
Fiori-Tutida (2003) verificou através dos extratos brutos dos cogumelos L.
edodes e A. blazei, potencial destes fungos como eliciadores de respostas de defesa
em plântulas, pois estimularam a produção de fitoalexinas em soja e em sorgo,
indução de proteínas relacionadas à patogênese - RP (glucanase e peroxidase) em
trigo e rotas metabólicas para a formação de papilas em mesocótilos de trigo.
2.2.2.1 Pycnoporus sanguineus (L. ex Fr.)
Os basidiomicetos constituem a classe dos fungos mais evoluídos,
apresentando geralmente micélio com hifas septadas. Uma das características do
grupo é a presença de estruturas especiais de reprodução – os basídios – que
formam os basidiósporos. Os basídios podem ser formados diretamente sobre o
micélio ou na parte inferior do “chapéu” ou píleo do corpo de frutificação,
denominado basidiocarpo. Este, na maioria das espécies, forma o cogumelo quando
o basidiocarpo apresenta haste ou estipe. Quando o basidiocarpo não apresenta
haste e o píleo é de consistência lenhosa, têm-se as “orelhas-de-pau” (KRUGNER &
BACHI, 1995).
Esta espécie apresenta uma frutificação semicircular e encontra-se distribuída
horizontalmente contra os caules das árvores. Sua superfície é lisa e ligeiramente
23
marcada em zonas concêntricas de coloração vermelho-alaranjada (LEPP, 2005) e
apresenta a capacidade de produção de alfa-amilase (SIQUEIRA et al., 1997).
O fungo P. sanguineus, conhecido popularmente como orelha-de-pau,
pertence ao filo Basidiomycota e a família Polyporaceae. Pelo seu hábito saprofítico,
nutre-se de algumas espécies de madeiras nas florestas, sendo que evidências
genéticas e morfológicas indicam a presença de três espécies para o gênero
Pycnoporus: P. cinnabarinus (Jacq. Ex Fr.) Karst., presente em regiões de clima
temperado no hemisfério Norte; P. coccineus (Fr.) Bond & Sing., que ocorre em
regiões de clima temperado do hemisfério Sul e em países vizinhos à Índia e
Oceano Pacífico; e P. sanguineus (L. Ex Fr.) Murr., que ocorre em regiões tropicais e
subtropicais dos hemisférios Norte e Sul (NOBLES & FREW, 1962).
Tornou-se conhecido por suas características fitoterápicas, as quais são
empregadas em tratamentos de reumatismo, artrite e gota. Quando moído e em
infusão é usado contra disenteria, cistos subcutâneos, verrugas e para desinflamar
os pés. Possui ainda atividade adstringente, antimicrobiana e antifúngica (FIDALGO,
1995). Ainda segundo esse autor, alguns indígenas brasileiros usavam P.
sanguineus para estancar hemorragias. Segundo Perez-Silva et al. (1998), o fungo
tem sido usado na medicina popular por tribos indígenas das Américas e da África
para tratamento de diversas injúrias.
Os efeitos medicinais relatados pelo uso de P. sanguineus são devidos à
síntese de uma variedade de metabólitos, como pigmentos vermelho-alaranjados
característicos do tipo 2-amino fenoxazina e esteróis. Entre os diversos pigmentos
isolados e identificados, a cinabarina, o ácido cinabarínico e a tramesanguina são os
mais abundantes, enquanto que entre os esteróis, o ergosterol e o 5,6-
dihidroergosterol são os majoritários. A cinabarina é mais ativa contra bactérias
gram-positiva do que contra gram-negativa tanto de origem alimentar quanto de
origem humana (MARQUES, 2001).
Watanabe et al. (2005) concluíram que P. sanguineus é bom produtor da
enzima lacase e, conseqüentemente, são capazes de tratar o efluente da indústria
farmacêutica. Para Silva et al. (2003), a presença de ligninase, Mn-peroxidase e β-
glicosidase na cepa amazônica de P. sanguineus, indica-o para uso industrial,
especialmente em tratamento de efluentes da indústria papeleira.
24
2.2.2.3 Potencial de P.sanguineus no controle de doenças
Shukla et al. (1996) demonstraram a ação antagonista de P. sanguineus
contra Ganoderma lucidum in vitro, o qual inibiu o crescimento de duas raças deste
patógeno, indicando-o como um agente potencial no controle biológico de
microrganismos fitopatogênicos.
Smânia et al. (1995, 1998), estudaram um antibiótico produzido por P.
sanguineus, mostrando que este basidiomiceto produziu cinabarina – pigmento de
cor laranja ativo contra Bacillus cereus, Enterococcus faecalis, Enterococcus
faecium, Escherichia coli, Klebsiela pneumoniae, Leuconostoc mesenteroides,
Leuconostoc plantarum, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella sp., Salmonella
typhimunium, Staphylococcus aureus e vários Streptococcus spp.
P. sanguineus apresenta potencial biotecnológico para a biorremediação do
solo, produção de enzimas de interesse para a agricultura, indústria de alimentação,
fabricação de detergentes, fungicidas, inseticidas (SILVA et al., 2003) e no controle
alternativo de doenças em plantas (ASSI, 2005; BENINCA, 2007).
Ainda segundo Assi (2005), extratos aquosos de basidiocarpos de P.
sanguineus controlaram a antracnose causada por C. lindemuthianum em feijoeiro, o
que pode ter ocorrido tanto por atividade antimicrobiana, através da inibição da
germinação de conídios, quanto por indução de resistência local e sistêmica, medida
pela ativação de peroxidases.
Beninca (2007) verificou que os extratos orgânicos diclorometânico, hexânico
e etanólico de basidiocarpos de P. sanguineus não possuem atividade indutora de
fitoalexinas em cotilédones de soja, mas induzem a síntese de deoxiantocianidinas
em mesocótilos de sorgo.
25
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 DESCRIÇÃO DO LOCAL E DO DELINEAMENTO DOS EXPERIMENTOS
Para o experimento in vitro foi utilizado o Laboratório de Fitopatologia da
Universidade Estadual do Paraná – UNIOESTE - Campus de Marechal Cândido
Rondon – PR. Foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado (DIC),
organizado em esquema fatorial 3 x 5 + 3 (três tipos de extratos: basidiocarpo,
micélio e filtrado de cultura, cinco concentrações: 1, 5, 10, 15 e 20% e três controles:
ASM, antibiótico e água) com quatro repetições. Foram utilizados os programas
estatísticos Sigma Plot 2000 (construção dos gráficos) e Sisvar para a análise
estatística destes dados.
Os ensaios para a indução de resistência foram conduzidos em estufa na
área pertencente ao Complexo de Controle Biológico e Cultivo Protegido Mário
César Lopes da UNIOESTE, Campus de Marechal Cândido Rondon. As plantas de
feijoeiro cultivar Carioca IAPAR 81 foram cultivadas em vasos plásticos (com
capacidade para 1,5 L) contendo uma mistura de solo, areia e matéria orgânica
(proporção 2:1:1) e mantidas em cultivo protegido (ASSI, 2005). Foram utilizadas
duas plantas por vaso. Para a avaliação de severidade foi utilizado o programa
estatístico STAT.
As análises bioquímicas foram organizadas em esquema fatorial 3 x 2 + 3
(três tipos de extratos: basidiocarpo, micélio e filtrado de cultura; duas
concentrações: 5 e 10%; e três controles: água, antibiótico e ASM). Cada tratamento
apresentava três repetições, sendo que cada repetição foi representada por três
quadrados de tecido vegetal. Foi utilizado o programa estatístico Sigma Plot 2000
(construção dos gráficos) e Sisvar para a análise estatística destes dados.
Os resultados foram submetidos à análise de variância e comparados por
teste de médias ou equações de regressão, conforme a pertinência.
26
3.2 ISOLAMENTO DA BACTÉRIA
Foram coletadas folhas de feijoeiro que apresentavam lesões características
provocadas pela bactéria X. axonopodis pv phaseoli, provenientes de cultivos
comerciais do município de Marechal Cândido Rondon - PR.
O isolamento foi realizado de acordo com a metodologia proposta por Mariano
& Silveira (2000). Para tanto, foram cortados fragmentos da folha (0,5 cm) na área
de transição tecido sadio e tecido doente, o qual foi imerso em álcool 50% por 30
segundos, em seguida em hipoclorito de sódio (três partes de água para uma parte
de hipoclorito) por 1 min e, por fim, em água destilada (para lavagem do material).
Após esta desinfestação superficial, foi realizada a maceração em solução salina
(0,85% de NaCl) esterilizada e então, com alça de platina, transferida uma alíquota
do macerado para placas de Petri contendo meio ágar-nutriente, realizando-se
estrias compostas. Em seguida, as placas foram identificadas, invertidas e
incubadas a 25 ºC, observando-se seu crescimento após 48 h.
3.3 OBTENÇÃO DA CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO
A curva de crescimento bacteriano foi obtida pelo método de determinação da
concentração do inóculo pela contagem em placas, descrito por Mariano & Assis
(2000). Foi preparada uma suspensão da bactéria teste a partir da cultura em placas
com 48 h de incubação. Foram ajustadas concentrações bacterianas para obter
leituras de absorbância a 560 nm de 1,2; 0,8; 0,6; 0,4; 0,2 e 0,0. Cada uma das
suspensões foi diluída até 10
8
, 10
7
e 10
6
.
Foram pipetados 0,05 mL de cada diluição e espalhado uniformemente com
alça de vidro flambada e esfriada em placas de Petri com meio ágar-nutriente,
preparando-se quatro placas para cada diluição, as quais foram invertidas e
incubadas a 25 ºC por 48 h. Foi obtida pelo menos uma série de placas contáveis
(que apresentasse entre 30 a 300 colônias) para cada absorbância. Os dados de
unidades formadoras de colônia (UFCs) foram transformados para uma mesma base
de 10
10
, obtendo-se, posteriormente uma equação de regressão.
27
3.4 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS
3.4.1 Obtenção de extrato bruto aquoso de P. sanguineus
Basidiocarpos de P. sanguineus (Figura 1) foram coletados nas matas da
região Oeste do Paraná e posteriormente secos em temperatura constante de 30 ºC
para serem moídos em moinho de facas. O preparo de extratos aquosos (EA)
constituiu na hidratação do pó seco de basidiocarpos por 24 h à temperatura de 4 ºC
(mantidos em geladeira), na proporção de 14 mL de água destilada para 1g de pó
seco de basidiocarpo, sendo em seguida filtrados em papel filtro Whatman nº 1
(FIORI-TUTIDA, 2003; DI PIERO & PASCHOLATI, 2004). Os filtrados coletados
foram submetidos a uma nova filtragem de esterilização em sistema Millipore com
membrana de 0,45 µm de diâmetro de poro, em câmara de fluxo laminar. Esses
filtrados armazenados em geladeira a 4 ºC foram utilizados após diluições para obter
as concentrações de 1; 5; 10; 15 e 20% para os testes in vitro e nas concentrações
de 5 e 10% para os ensaios de proteção de plantas (ASSI, 2005).
Figura 1. Basidiocarpos de Pycnoporus sanguineus. Fonte: TOILLIER, S. L.
28
3.4.2 Micélio de P. sanguineus obtido do cultivo em meio líquido
Foram preparados 100 mL de meio de cultura BD (batata-dextrose), para
cada frasco, nos quais foram repicados cinco discos contendo meio de cultura mais
micélio de P. sanguineus, crescido por 14 dias em meio BDA e em escuro a 25 ºC,
sob agitação (150 rpm). Após vinte dias, o conteúdo de cada frasco foi filtrado em
papel filtro Whatman nº 1. O micélio retido no filtro foi colocado em estufa a 40 ºC
até obtenção de peso constante e posteriormente macerado em almofariz de
porcelana para obtenção do pó. Esse pó de micélio foi hidratado em água destilada
nas proporções definidas em 3.3.1 e utilizado nos testes in vitro e de proteção de
plantas.
3.4.3 Extrato do filtrado da cultura de P. sanguineus
Foi utilizado o filtrado de cultura de P. sanguineus obtido em 3.3.2,
posteriormente diluído para obter as concentrações indicadas em 3.3.1 e utilizado nos
testes in vitro e de proteção de plantas.
3.5 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
Para este ensaio foi preparado meio de cultura caldo nutriente (extrato de
carne: 3 g; peptona: 5 g; glicose: 15 g; água destilada: 1.000 mL) (MARIANO &
ASSIS, 2000). O meio com as diferentes concentrações do extrato de P. sanguineus
(1, 5, 10, 15 e 20%) foi colocado em tubos de ensaio (10 mL tubo
-1
). Uma alíquota
de 100 µL de suspensão de células bacterianas contendo 10
10
UFC mL
-1
foi
adicionada a cada tubo, os quais foram incubados a 28 ºC por 48 h em estufa
incubadora sob agitação a 150 rpm. A avaliação do número de bactérias foi
realizado por espectrofotômetro, anotando-se a absorbância a 560 nm de cada
amostra e calculando-se o valor de UFCs de acordo com a curva de crescimento
bacteriano previamente elaborada. Apenas o meio de cultura foi utilizado como
tratamento controle. Este procedimento também foi realizado para o extrato de P.
sanguineus esterilizado por filtração (membrana de 0,45 µm de diâmetro de poro).
29
3.6 INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA
Foi realizado o ensaio com X. axonopodis pv. phaseoli com os seguintes
tratamentos: a) testemunha ou controle negativo: plantas tratadas com água
destilada; b) controle positivo nº 1: bactericida sistêmico – agrimicina (22,5 mg L
-1
de
oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina); c) controle positivo nº 2: indutor de
resistência – acibenzolar-S-metil (125 mg i.a. L
-1
); d) extrato bruto aquoso de
basidiocarpos de P. sanguineus; e) extrato do micélio de P. sanguineus e f) extrato
do filtrado da cultura de P. sanguineus. As concentrações dos extratos ficaram
definidas como 5 e 10%. Os tratamentos foram aplicados três dias antes da
inoculação do patógeno.
Os extratos em quantidade de 3 mL foram aplicados na primeira folha
trifoliada. A inoculação do patógeno em questão foi realizada na primeira folha
trifoliada tratada, bem como na segunda folha trifoliada não tratada, para se observar
a ocorrência de proteção local e/ou sistêmica, respectivamente. As inoculações foram
realizadas na parte da manhã, mediante aspersão de suspensão de inóculo contendo
5 X 10
7
UFC mL
-1
(RAVA & SARTORATO, 1994). Após a inoculação, as plantas
foram cobertas com sacos de polipropileno com água destilada aspergida para
simular câmara úmida por 24 h (STANGARLIN & PASCHOLATI, 2000). Após esse
período, a câmara úmida foi removida e as plantas ficaram nas condições ambientais
da casa de vegetação.
No experimento em casa de vegetação com inoculação do patógeno, a
avaliação da severidade do crestamento bacteriano comum foi realizada ao final do
experimento, ou seja, 12 dias após os tratamentos, por determinação da área
lesionada, com o auxílio do sistema computacional QUANT v. 1.0.2 (VALE et al.,
2003).
30
3.7 ANÁLISES BIOQUÍMICAS
3.7.1 Coleta de amostras para análise bioquímica
Foram coletados três quadrados (1 cm
2
) de folha por amostra com no
momento dos tratamentos e também nos 3º, 6º, 9º e 12º dias após os tratamentos.
Durante o procedimento de amostragem, cada amostra foi imediatamente
acondicionada em envelopes de papel alumínio, previamente identificados, e
congeladas. Foram coletadas amostras das primeiras folhas trifoliadas inoculadas
(tratadas), bem como das segundas folhas trifoliadas não-inoculadas (não-tratadas).
3.7.2 Obtenção dos extratos protéicos
As amostras do tecido vegetal coletadas foram homogeneizadas em 4 mL de
tampão fosfato de sódio 0,01 M (pH 6,0) – tampão de extração, em almofariz de
porcelana. O homogeneizado foi centrifugado a 14.500 rpm (20.000 g) durante 25
min a 1 ºC (KUHN, 2007). O sobrenadante obtido, considerado como extrato
enzimático, foi congelado para posterior determinação do conteúdo protéico total e
da atividade enzimática de peroxidase, polifenoloxidase, β-1,3 glucanase,
fenilalanina amônia-liase.
3.7.3 Teor de proteína
O teor de proteínas totais foi avaliado pelo método de Bradford (1976). A
mistura da reação foi constituída de três réplicas, sendo que para cada réplica foi
utilizado 100 µL do extrato enzimático, 700 µL de tampão fosfato de sódio 0,01 M
(pH 6,0) – preparação enzimática, e 200 µL do reagente de Bradford, o qual foi
adicionado sob agitação. Após 5 min realizou-se a leitura de absorbância em
espectrofotômetro a 595 nm. A concentração de proteínas foi expressa em termos
equivalentes de µg albumina de soro bovino (ASB) em um mL de amostra (µg
31
proteína mL
-1
), foi determinada utilizando-se curva padrão de concentrações de
ASB, variando de 0 a 20 µg mL
-1
.
3.7.4 Determinação da atividade da peroxidase
A atividade de peroxidase foi determinada a 30 ºC em banho-maria, através de
método espectrofotométrico direto (HAMMERSCHMIDT et al., 1982).
A mistura da solução consistiu de 2,9 mL de uma solução contendo 250 µL de
guaiacol e 306 µL de peróxido de hidrogênio em 100 mL de tampão fosfato 0,01 M
(pH 6,0) e 0,1 mL de preparação enzimática. A cubeta de referência consistiu de 3,0
mL de solução contendo 250 µL de guaiacol e 306 µL de peróxido de hidrogênio em
100 mL de tampão fosfato 0,01 M (pH 6,0). A reação foi seguida em
espectrofotômetro a 470 nm e as leituras foram realizadas de forma direta por um
período de 2 min. Os resultados foram expressos em unidades de absorbância min
-1
mg
de proteína
-1
.
3.7.5 Determinação da atividade de polifenoloxidase
A atividade de polifenoloxidase (PFO) foi determinada usando-se a
metodologia de Douangmal & Apenten (1999). O ensaio consistiu em mensurar a
oxidação do catecol convertido em quinona, reação esta mediada pela enzima em
estudo. O substrato foi composto por catecol, na concentração de 20 mM, dissolvido
em tampão fosfato de sódio 100 mM (pH 6,8). A reação se desenvolveu misturando-
se 950 µL do substrato e 50 µL do extrato enzimático (item 3.6.2). A temperatura de
reação foi de 30 ºC e as leituras em espectrofotômetro a 420 nm, foram realizadas
de forma direta por um período de 1,3 min. O diferencial entre a última e a primeira
leitura foi utilizado para a determinação da atividade. Os resultados foram expressos
em absorbância min
-1
mg
-1
de proteína
-1
.
32
3.7.6 Determinação da atividade da fenilalanina amônia-liase
A atividade da fenilalanina amônia-liase (FAL) foi determinada a 37 ºC por
espectrofotometria direta medida pela conversão de L-fenilalanina em ácido trans-
cinâmico a 290 nm, por modificação proposta por Stangarlin et al. (2005) na
metodologia de Pascholati et al. (1996) e Peltonem & Karjalein (1995). A mistura de
reação conteve 250 µL do extrato da amostra e 1.250 µL de L-fenilalanina 12 mM
em tampão Tris-HCL 50 mM (pH 8,5). A cubeta de referência continha 250 µL de
tampão Tris-HCl e 1.250 µL de L-fenilalanina 12 mM. A atividade enzimática foi
expressa pela atividade específica (µg de ác. trans-cinâmico h
-1
mg
-1
proteína
-1
)
(STANGARLIN et al., 2005).
3.7.7 Determinação da atividade de β-1,3 glucanase
A atividade de β-1,3 glucanase foi determinada pela quantificação
colorimétrica de glicose liberada da laminarina, através do uso da hidrazida do ácido
p-hidroxibenzóico (HAPHB) (Stangarlin et al., 2000). A mistura da reação, incubada
a 40 ºC por 1 h, continha 50 µL de tampão de extração, 200 µL do extrato protéico e
250 µL de laminarina (4,0 mg mL
-1
). Após esse período, foram acrescentados 1,5 mL
de uma solução de HAPHB (0,5 g dissolvidos em 10 mL de HCL 0,5 M, acrescido de
40 mL de NaOH 0,5 M), sendo em seguida essa mistura aquecida a 100 ºC por 5
min. Após resfriamento em gelo as amostras tiveram a absorbância determinada a
410 nm. As leituras de absorbância foram plotadas em curva padrão para glicose e
os resultados expressos em mg de glicose h
-1
mg proteína
-1
.
33
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
A análise de variância do efeito das concentrações do extrato de P.
sanguineus sobre o crescimento bacteriano de X. axonopodis pv. phaseolus indicou
que o extrato de micélio estimulou o crescimento da bactéria de forma dose-
dependente (Figura 2). O filtrado apenas a 20% reduziu em 21% o crescimento
bacteriano (Figura 3). O extrato de basidiocarpo em 15 e 20% reduziu 91% em
média o crescimento bacteriano, comportando-se estatisticamente igual ao
antibiótico, que reduziu o crescimento em 81% (Figura 4). O acibenzolar-S-metil
(ASM) não apresentou atividade antibiótica (Figuras 2, 3 e 4).
A
S
M
A
g
r
i
m
i
c
i
n
a
Concentração Bacteriana (UFC/mL)
0
2
4
6
8
Concentração (%)
0 5 10 15 20 25
y = 0,0108x + 0,4547
R
2
= 0,4526
A
a
Ab
Ab
Ab
Ab
Ab
Ab
Figura 2. Efeito de diferentes concentrações de extrato aquoso de micélio de Pycnoporus sanguineus
sobre o crescimento de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli e sua comparação com o efeito de
antibiótico (agrimicina: 22,5 mg L
-1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina) e acibenzolar-S-
metil (ASM) (125 mg i.a. L
-1
), no crescimento bacteriano. Valores seguidos de mesma letra (maiúscula
para comparação com ASM e minúscula para comparação com antibiótico) não diferem
estatisticamente pelo teste de Tukey a 5%.
34
A
S
M
A
g
r
i
m
i
c
i
n
a
Concentração Bacteriana (UFC/mL)
0
2
4
6
8
Concentração (%)
0 5 10 15 20 25
y = -0,0035x
2
+ 0,0657x + 0,4647
R
2
= 0,541
A
a
Ab
Ab
Ab
Bb
Ab
Ab
Figura 3. Efeito de diferentes concentrações de filtrado de cultura de Pycnoporus sanguineus sobre o
crescimento de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli e sua comparação com o efeito de antibiótico
(agrimicina: 22,5 mg L
-1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina) e acibenzolar-S-metil
(ASM) (125 mg i.a. L
-1
), no crescimento bacteriano. Valores seguidos de mesma letra (maiúscula para
comparação com ASM e minúscula para comparação com antibiótico) não diferem estatisticamente
pelo teste de Tukey a 5%.
A
S
M
A
g
r
i
m
i
c
i
n
a
Concentração Bacteriana (UFC/mL)
0
2
4
6
8
Concentração (%)
0 5 10 15 20 25
y = -0,0015x
2
+ 0,00008x + 0,5651
R
2
= 0,8445
A
a
Ab
Ab
Ab
Ab
Ba
Ba
Figura 4. Efeito de diferentes concentrações de extrato aquoso de basidiocarpos de Pycnoporus
sanguineus sobre o crescimento de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli e sua comparação com o
efeito de antibiótico (agrimicina: 22,5 mg L
-1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina) e
acibenzolar-S-metil (ASM) (125 mg i.a. L
-1
), no crescimento bacteriano. Valores seguidos de mesma
letra (maiúscula para comparação com ASM e minúscula para comparação com antibiótico) não
diferem estatisticamente pelo teste de Tukey a 5%.
35
Para Baldo (2008a), a análise dos dados do ensaio in vitro da germinação de
esporos de Colletotrichum lindemuthianum Lams-Scrib, revelou que os extratos
aquosos de basidiocarpo de P. sanguineus tiveram efeito inibitório na germinação de
esporos em até 97%, sendo esta inibição muito próxima ao fungicida.
Semelhantemente Assi (2005) observou que extratos aquosos de basidiocarpos de
P. sanguineus reduziram a germinação in vitro de esporos de C. lindemuthianum
com inibições de até 96%.
Viecelli et al. (2008) puderam verificar no ensaio de inibição de germinação de
esporos de Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & Braun, que extratos de
micélio de P. sanguineus a partir da concentração 5% inibiram significativamente a
germinação de esporos, enquanto extratos de basidiocarpos e de filtrado de cultura
de P. sanguineus não apresentaram efeito significativo.
Baldo et al. (2008b) observaram que extratos aquosos de basidiocarpos de P.
sanguineus nas concentrações 5, 10, 15 e 20 % inibiram significativamente (P<0,05)
a germinação de esporos de Uromyces appendiculatus e Phakopsora euvitis, sendo
que o extrato a 5% inibiu em 78,8 % a germinação de P. euvitis e a 20% inibiu em
72,9% a germinação de U. appendiculatus em relação à testemunha água.
Na inibição de crescimento micelial de C. lindemuthianum, Baldo (2008a)
notou que para todos os extratos e concentrações avaliadas, não houve inibição
e/ou indução do crescimento micelial em relação aos controles água e ASM. O
fungicida inibiu o crescimento micelial em até 85% quando comparado aos demais
tratamentos. Ao passo de que Assi (2005) pôde verificar que os extratos aquosos de
basidiocarpos de P. sanguineus estimularam o crescimento micelial de C.
lindemuthianum em até 48% quando comparados ao controle água.
Viecelli et al. (2008) observaram que o extrato aquoso de micélio de P.
sanguineus a 20% não inibiu o crescimento micelial de P. griseola quando
comparado ao fungicida azoxystrobin, porém este extrato a 15% foi tão fungitóxico
quanto o ASM.
36
4.2 AVALIAÇÃO DA SEVERIDADE
As condições climáticas no período para inoculação do patógeno em casa de
vegetação não se mostraram favoráveis para o seu desenvolvimento, apresentando
baixa severidade, fato esse também ocorrido nos ensaios de Viecelli (2008) com P.
griseola. Para Baldo (2008a) & Assi (2005), a antracnose apresentou moderada
severidade, determinada pela inoculação realizada com esporos do patógeno e
favorecida pela suscetibilidade do cultivar e pela ocorrência de condições ambientais
favoráveis à doença.
De acordo com os dados apresentados para avaliação de severidade (Figura
5) pode-se perceber que tanto para a primeira folha tratada e inoculada (A) quanto
para a segunda folha apenas inoculada (B), a severidade foi menor nas plantas
tratadas com filtrado de cultura de P. sanguineus a 5 e 10%. Em A, o tratamento de
filtrado de cultura a 5%, a redução da doença, quando comparado à água, foi de
33,44% e com o uso do filtrado de cultura a 10%, foi de 21,73% ao passo de que em
B, tanto o tratamento com filtrado a 5% quanto a 10%, reduziram em 56, 88% a
severidade, quando comparados com a testemunha água. Na folha tratada e
inoculada apenas os tratamentos com extrato de basidiocarpo 5%, filtrado 5 e 10%,
extrato de micélio 10% e antibiótico reduziram significativamente a severidade,
embora sem diferença do extrato de basidiocarpo a 10%, micélio 5% e ASM.
Isso indica que os tratamentos utilizados podem ter induzido tanto resistência
local quanto sistêmica, sendo que nesta última, não houve ocorrência de doença nas
folhas que receberam esses tratamentos, embora sem diferença estatística dos
tratamentos com extratos de basidiocarpo e micélio, antibiótico e ASM.
Os resultados obtidos são semelhantes aos dados apresentados por Assi
(2005), o qual utilizou extratos aquosos de basidiocarpos de P. sanguineus e
verificou que pode ser uma alternativa em cultivos orgânicos, em função destes
apresentaram níveis de controle similares aos obtidos pelo fungicida, além do custo
do controle com estes extratos ser inferior ao controle com fungicidas do cultivo
convencional, fato este que, associado ao melhor preço do feijão cultivado
organicamente, renderia ao produtor um lucro relativamente maior.
37
0
2
4
6
8
10
12
14
T
1
(
á
g
u
a
)
T2 B 5%
T
3
B
10
%
T4 F
5
%
T5
F1
0%
T6 M
5
%
T
7 M10%
T8 A
gr
T9 ASM
% Severidade
a
A
b
ab
b
b
ab
ab
bb
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
T1 (água)
T2
B 5%
T3 B10%
T4 F 5%
T5 F10
%
T6 M 5%
T7 M10%
T8 A
gr
T9 AS
M
% Severidade
B
a
ab
b
bb
bbbb
Figura 5. Severidade para crestamento bacteriano comum causado por X. axonopodis pv. phaseolus
em feijoeiro em função dos tratamentos com extratos aquosos de basidiocarpo (B) e de micélio (M) e
filtrado de cultura (F) de P. sanguineus em concentrações de 5 e 10%, na primeira folha tratada e
inoculada (A) e na segunda folha (B) apenas inoculada, em condições de casa de vegetação. Agr:
antibiótico (22,5 mg L
-1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina); ASM: acibenzolar-S-metil
(125 mg i.a. L
-1
); Água: testemunha. Médias seguidas de mesma letra (a/b), não diferem
significativamente entre si pelo teste de Tukey a 5%.
38
4.3 ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS DA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA
4.3.1 Teor de proteína
Muitos trabalhos são encontrados na literatura, que ressaltam o papel das
proteínas nos mecanismos de defesa das plantas (PASCHOLATI & LEITE, 1995;
MORAES, 1992).
O teor de proteína teve alteração aos 3 DAT (dia após os tratamentos) na 1ª
folha tratada e inoculada com os extratos de basidiocarpo, micélio e de filtrado de
cultura de P. sanguineus (Figura 6), com aumentos de até 40% no incremento da
atividade de proteínas totais quando comparados a testemunha água.
Na 2ª folha apenas inoculada com o patógeno desafiador, os picos de indução
observados pelos extratos aplicados tiveram incrementos na atividade de proteínas
totais de até 130%, quando comparados à testemunha água, podendo indicar
indução de resistência sistêmica.
Viecelli (2008) verificou em seu trabalho com feijoeiro tratado com extratos de
P. sanguineus que houve alteração significativa no conteúdo protéico, dessa forma,
quando as enzimas investigadas no estudo (peroxidase, polifenoloxidase e β-1,3
glucanase) eram divididas pelo conteúdo protéico o resultado foi a redução drástica
das mesmas, quando expressadas pelo peso das amostras, resultado satisfatório foi
verificado, o mesmo encontrado no presente trabalho.
39
Basidiocarpo
036912
0369
Proteína (mg mL)
12
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Proteína (mg mL)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
a
b
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
Filtrado
036912
0369
Proteína (mg mL)
12
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Proteína (mg mL)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
Micélio
036912
03691
Proteína (mg mL)
2
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Proteína (mg mL)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
Figura 6. Teor de proteína em plantas de feijoeiro inoculadas com Xanthomonas axonopodis pv.
phaseoli três dias após os tratamentos com os controles água (●), antibiótico (Agrimicina: 22,5 mg L
-1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina) (■), acibenzolar-S-metil (ASM 125 mg i.a. L
-1
) (▲) e
os extratos aquosos de Pycnoporus sanguineus obtidos do basidiocarpo a 5 e 10% (♦ e ▼), filtrado
de cultura a 5 e 10% (♦ e ▼ ) e micélio a 5 e 10% (♦ e ▼). (a) e (b) representam respectivamente a 1ª
folha tratada e inoculada, e a 2ª folha apenas inoculada. Barras indicam a média +/– o erro padrão.
40
4.4 ALTERAÇÕES BIOQUÍMICAS DA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA
4.4.1 Atividade de peroxidase
As plantas de feijão que receberam extratos de basidiocarpo e de micélio e
filtrado de cultura na 1ª folha, tratada e inoculada, bem como na 2ª folha, não tratada
e inoculada, apresentaram oscilação no incremento da atividade de peroxidase
quando comparados às testemunhas água, antibiótico e ASM (Figura 7).
Para o extrato de basidiocarpo a 10% na 1ª folha, observou-se incremento da
atividade de peroxidase aos 6 DAT, diminuindo sua expressão no 9 DAT e voltando
novamente ao mesmo patamar de expressão observado no 6 DAT para o 12 DAT,
quando comparado às testemunhas e aos demais tratamentos, sendo superior ao
ASM em 90% no 6 DAT e à testemunha água em 135% no 12 DAT, apesar de não
ter diferido estatisticamente das testemunhas. O micélio a 10% foi superior em 200%
à testemunha água aos 6 DAT e o filtrado de cultura a 5% apresentou incrementos
na atividade da peroxidase de forma mais expressiva no 6 DAT, sendo 165%
superior à testemunha água.
No momento da inoculação do patógeno (3 DAT) a maior atividade específica
da peroxidase na 2ª folha foi observada no tratamento com filtrado a 5 e 10%, sendo
que o primeiro foi 76% superior à testemunha água e o segundo, 65%. O EA de
basidiocarpo a 5% e o filtrado a 10%, apresentaram maior atividade aos 6 DAT, com
o primeiro sendo superior à testemunha água em mais de 300% e o segundo em
65%.
Baldo (2008a) observou incremento na atividade da peroxidase em função
dos tratamentos com basidiocarpo, micélio e filtrado de cultura de P. sanguineus em
feijoeiro, na 3ª folha tratada, bem como na 4ª folha não tratada e inoculada,
demonstrando a sistemicidade do efeito em função dos tratamentos, resultado esse
também encontrado por Viecelli (2008).
Para Meinerez et al. (2007), o extrato bruto de basidiocarpo de P. sanguineus
na concentração de 5%, promoveu incremento na atividade de peroxidase de 41%
em cotilédones de soja, ao passo que, o ASM promoveu resultados semelhantes à
testemunha água. Já Iurkiv et al. (2008a), puderam observar que a aplicação de
41
Basidiocarpo
036912
03691
Abs min
-1
mg
-1
proteína
2
0
3
6
9
12
15
Abs min
-1
mg
-1
proteína
0
3
6
9
12
15
a
b
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
Filtrado
036912
03691
Abs min
-1
mg
-1
proteína
2
0
3
6
9
12
15
Abs min
-1
mg
-1
proteína
0
3
6
9
12
15
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
Micélio
036912
03691
Abs min
-1
mg
-1
proteína
2
0
3
6
9
12
15
Abs min
-1
mg
-1
proteína
0
3
6
9
12
15
Figura 7. Atividade específica de peroxidase em plantas de feijoeiro inoculadas com Xanthomonas
axonopodis pv. phaseoli três dias após os tratamentos com os controles água (●), antibiótico
(Agrimicina: 22,5 mg L
-1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina) (■), acibenzolar-S-metil
(ASM 125 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos de Pycnoporus sanguineus obtidos do basidiocarpo
a 5 e 10% (♦ e ▼), filtrado de cultura a 5 e 10% (♦ e ▼ ) e micélio a 5 e 10% (♦ e ▼). (a) e (b)
representam respectivamente a 1ª folha tratada e inoculada, e a 2ª folha apenas inoculada. Barras
indicam a média +/– o erro padrão.
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
42
extrato aquoso de basidiocarpo de P. sanguineus a 20%, apresentou característica
supressora da atividade de peroxidase em cotilédones de soja, proporcionando
redução de 61,6% na atividade em relação a testemunha água.
Beninca (2007), avaliando a indução de peroxidases, verificou que os extratos
diclorometânico, hexânico e etanólico de basidiocarpos de P. sanguineus, em
mesocótilos de sorgo e cotilédones de soja, inibiram a atividade enzimática, sendo
que a indução verificada para o extrato hexânico em sorgo não diferiu do controle
ASM, e em soja a atividade foi inibida pelo extrato etanólico e induzida pelo
hexânico, mas sem diferir do tratamento com ASM.
4.4.2 Atividade de polifenoloxidase
A atividade da polifenoloxidase com aplicação dos EA de P. sanguineus em
plantas de feijão apresentou incremento de forma significativa quando comparados
às testemunhas água, antibiótico e ASM (Figura 8).
A maior atividade específica de polifenoloxidase na 1ª folha foi com o EA de
basidiocarpo a 5% aos 12 dia, ao passo que na 2ª folha, sua maior atividade foi a
10% no 9 dia comparando-se com todos os tratamentos em ambas as folhas, com o
EA de basidiocarpo a 5% superior ao ASM em 1000% e o basidiocarpo a 10%,
superior em 500% à testemunha água. O filtrado a 10% na 1ª folha, aos 9 DAT foi
superior à testemunha água em 150%. O micélio a 10% na 1ª folha, quando
comparado a testemunha água aos 12 DAT foi superior em 44%. Para o micélio a
5% no momento da inoculação do patógeno (3 DAT) na 2ª folha, a atividade
apresentou-se de forma acentuada, sendo superior à água em 240%, com
estabilização da expressão no decorrer dos dias.
Viecelli (2008) concorda com os resultados obtidos neste trabalho, pois
verificou que a atividade desta proteína foi influenciada pelos tratamentos com
extratos de P. sanguineus, na 3ª folha tratada, bem como na 4ª folha não tratada e
inoculada, demonstrando a sistemicidade do efeito. Por outro lado, Baldo (2008)
pôde observar que a aplicação de EA de P. sanguineus em plantas de feijão não
induziu incrementos significativos na atividade específica de polifenoloxidase.
Baldo (2008) ainda, verificou que pelo somatório da atividade específica da
polifenoloxidase, os extratos testados não induziram o aumento desta enzima, mas
43
Basidiocarpo
036912
Abs min
-1
mg
-1
(proteína)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
036912
Abs min
-1
mg
-1
(proteína)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
a
b
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
Filtrado
036912
Abs min-1 mg-1 (proteína)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
036912
Abs min
-1
mg
-1
(proteína)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
Micélio
036912
Abs min-1 mg-1 (proteína)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
036912
Abs min-1 mg-1 (proteína)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
Figura 8. Atividade específica de polifenoloxidase em plantas de feijoeiro inoculadas com
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli três dias após os tratamentos com os controles água (●),
antibiótico (Agrimicina: 22,5 mg L
-1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina) (■), acibenzolar-
S-metil (ASM 125 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos de Pycnoporus sanguineus obtidos do
basidiocarpo a 5 e 10% (♦ e ▼), filtrado de cultura a 5 e 10% (♦ e ▼ ) e micélio a 5 e 10% (♦ e ▼). (a)
e (b) representam respectivamente a 1ª folha tratada e inoculada, e a 2ª folha apenas inoculada.
Barras indicam a média +/– o erro padrão.
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
44
tiveram uma redução de 37% no tratamento com basidiocarpo a 10% em relação à
água para a 1ª folha. Resultado este semelhante ao encontrado por Meinerz et al.
(2007) com relação ao somatório da atividade específica promovido pelo ASM, onde
a atividade da polifenoloxidase não diferiu estatisticamente da testemunha água,
além do decréscimo da atividade com o aumento da concentração do extrato de
basidiocarpo também ter sido observado.
Kuhn (2007) pôde observar que a atividade específica de polifenoloxidase em
feijoeiro não foi alterada em função dos indutores B. cereus e ASM, enquanto Itako
et al. (2008) observaram indução da atividade específica de polifenoloxidase em
folhas de tomateiro tratadas com óleo essencial de Cymbopogon citratus e
inoculadas com Alternaria solani.
Ainda para Viecelli (2008), a ativação de enzimas de defesa como a
peroxidase e polifenoloxidase nas plantas de feijoeiro expostas aos extratos de P.
sanguineus, caracterizam a indução de resistência e demonstram a eficiência de
produtos naturais na ativação de respostas dos tecidos frente a tentativas de
colonização pelo patógeno.
4.4.3 Atividade de fenilalanina amônia-liase
A atividade específica de fenilalanina amônia-liase em plantas de feijão com
extratos de basidiocarpo, micélio e filtrado de cultura de P. sanguineus, sofreu leve
incremento de atividade no decorrer dos dias em função dos tratamentos com
basidiocarpo, micélio e filtrado de cultura de P. sanguineus, local (1ª folha, tratada e
inoculada) e sistemicamente (2ª folha, apenas inoculada).
Na 1ª folha tratada e inoculada, todos os tratamentos comparados às
testemunhas tiveram comportamento semelhante, verificando aqui, que a indução de
resistência não foi ativada em função dos tratamentos, mas do patógeno desafiador
aplicado. Pode-se observar apenas que o extrato de micélio a 10% proporcionou
incremento na atividade da FAL em 460% quando comparado ao antibiótico.
Na 2ª folha apenas inoculada, a maior expressão da enzima ocorreu aos 9
DAT no tratamento com o EA de basidiocarpo a 10%, superior à testemunha água
em mais de 1000%.
45
Basidiocarpo
036912
0369
µg ácido trans cinâmico h
-1
mg
-1
proteína
12
0
10
20
30
40
50
µg ácido
trans
cinâmico h
-1
mg
-1
proteína
0
10
20
30
40
50
a b
Dias após os tratamentos
Dias após os tratamentos
Filtrado
036912
03691
µg ácido trans cinâmico h
-1
mg
-1
proteína
2
0
10
20
30
40
50
µg ácido trans cinâmico h
-1
mg
-1
proteína
0
10
20
30
40
50
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
Micélio
036912
03691
µg ácido trans cinâmico h
-1
mg
-1
proteína
2
0
10
20
30
40
50
µg ácido trans cinâmico h
-1
mg
-1
proteína
0
10
20
30
40
50
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
Figura 9. Atividade específica de fenilalanina amônia-liase em plantas de feijoeiro inoculadas com
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli três dias após os tratamentos com os controles água (●),
antibiótico (Agrimicina: 22,5 mg L
-1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina) (■), acibenzolar-
S-metil (ASM 125 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos de Pycnoporus sanguineus obtidos do
basidiocarpo a 5 e 10% (♦ e ▼), filtrado de cultura a 5 e 10% (♦ e ▼ ) e micélio a 5 e 10% (♦ e ▼).
Barras indicam a média +/– o erro padrão.
46
De modo geral, a análise estatística indica que não houve incrementos
significativos na atividade específica da FAL com a utilização dos extratos de P.
sanguineus, o mesmo pôde ser observado por Kuhn (2007) em feijoeiros tratados
com Bacillus cereus e ASM. Segundo o autor, isto pode significar que toda a rota
dos fenilpropanóides não sofreu alterações, como por exemplo, os mecanismos de
síntese de lignina, compostos fenólicos, quinonas entre outros.
Por outro lado, Baldo (2008a) pôde observar que a aplicação de extratos de
P. sanguineus em plantas de feijão provocou aumentos local e sistêmico na
atividade específica de fenilalanina amônia-liase, bem como Gális et al. (2004) que
puderam verificar a indução de resistência sistêmica em feijoeiro com ácido salicílico
e o aumento na expressão da FAL.
4.4.4 Atividade de β-1,3 glucanase
Assim como para FAL, a atividade específica de β-1,3 glucanase sofreu leve
incremento de atividade no decorrer dos dias em função dos tratamentos com
basidiocarpo, micélio e filtrado de cultura de P. sanguineus em feijoeiro, local e
sistemicamente.
Observou-se que na 2ª folha apenas inoculada, a expressão da atividade foi
maior aos 9 DAT com o extrato de basidiocarpo a 10%, superior a água em 1200%,
indicando proteção sistêmica. E o filtrado de cultura a 10% foi superior à testemunha
água em 100%.
Estes resultados concordam com Kuhn (2007) que verificou em feijoeiros
tratados com B. cereus o não aumento significativo da atividade específica de β-1,3
glucanases, enquanto que o indutor abiótico ASM aumentou significativamente a
atividade desta enzima. De acordo com Viecelli (2008) a atividade da β-1,3
glucanase foi influenciada pelos tratamentos com extratos de P. sanguineus, na 3ª
folha tratada, bem como na 4ª folha não tratada e inoculada, comprovando a
sistemicidade do efeito também para essa enzima. Guarda & Di Piero (2007)
observaram aumento da atividade de glucanases em plantas de feijão tratadas com
quitosana e inoculadas com C. lindemuthianum, em relação às testemunhas.
Iurkiv et al. (2008b) verificaram que a fração (4º pico protéico) obtida a partir
da aplicação de extrato bruto de basidiocarpo de P. sanguineus em coluna de
47
Basidiocarpo
036912
03691
Abs h
-1
mg
-1
proteína
2
0
10
20
30
40
50
60
70
Abs h
-1
mg
-1
proteína
0
10
20
30
40
50
60
70
a b
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
Filtrado
036912
03691
Abs h
-1
mg
-1
proteína
2
0
10
20
30
40
50
60
70
Abs h
-1
mg
-1
proteína
0
10
20
30
40
50
60
70
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
Micélio
036912
03691
Abs h
-1
mg
-1
proteína
2
0
10
20
30
40
50
60
70
Abs h
-1
mg
-1
proteína
0
10
20
30
40
50
60
70
Dias após os tratamentos Dias após os tratamentos
Figura 10. Atividade específica de β-1,3-glucanase em plantas de feijoeiro inoculadas com
Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli três dias após os tratamentos com os controles água (●),
antibiótico (Agrimicina: 22,5 mg L
-1
de oxitetraciclina + 225 mg L
-1
de estreptomicina) (■), acibenzolar-
S-metil (ASM 125 mg i.a. L
-1
) (▲) e os extratos aquosos de Pycnoporus sanguineus obtidos do
basidiocarpo a 5 e 10% (♦ e ▼), filtrado de cultura a 5 e 10% (♦ e ▼ ) e micélio a 5 e 10% (♦ e ▼).
Barras indicam a média +/– o erro padrão.
48
cromatografia de filtração em gel, induziu a atividade específica de β-1,3 glucanases
em cotilédones de soja, superior em 260,5% à testemunha água.
Fiori-Suzuki et al. (2008) verificaram aumento da atividade de β-1,3
glucanases em maracujazeiros inoculados com Xanthomonas campestris pv.
passiflorae e tratados com extratos de L. edodes e A. blazei nas concentrações 20 e
40%.
Cavalcanti et al. (2006) verificaram que acibenzolar-S-metil (ASM; 0,2 g L-1),
Ecolife (5 mL L-1), suspensão de quitosana (MCp; 200 g L-1) proveniente de micélio
de Crinipellis perniciosa, e extrato aquoso de ramos de lobeira (Solanum
lycocarpum) infectados por C. perniciosa (VLA; 300 g L-1) conferem capacidade
parcial de proteção em plantas de tomateiro desafiadas por Xanthomonas
campestris pv. vesicatoria. Essas substâncias promoveram o aumento na atividade
de quitinase e β-1,3 glucanase, relacionadas à patogênese em folhas de plantas de
tomateiro.
Segundo Stangarlin et al. (2000), plantas de feijoeiro desafiadas com o
hemibiotrófico P. griseola não alteraram a atividade de β-1,3 glucanase, ao passo
que, quando desafiadas com o fungo biotrófico Uromyces appendiculatus, a indução
da atividade de β-1,3 glucanase foi verificada (STANGARLIN & PASCHOLATI,
2000). Dessa forma, supõe-se que existe uma relação entre o tratamento eliciador e
o patógeno desafiante, na ativação dos mecanismos de defesa em plantas. A planta
poderia investir em compostos que normalmente ela ativaria na presença do
patógeno, porém, com maior eficiência quando pré-disposta a um eliciador.
49
5 CONCLUSÕES
Os resultados indicaram o potencial de extratos de basidiocarpos de P.
sanguineus para o controle de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em feijoeiro, o
que pode ocorrer tanto por atividade antimicrobiana direta quanto pela ativação de
enzimas de defesa vegetal como peroxidase, polifenoloxidase, fenilalanina amônia-
liase e β-1,3 glucanase, com conseqüente redução da severidade da doença.
50
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