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Thais Mara Manfrin
IMUNOMARCAÇÃO DAS PROTEÍNAS
OPG, RANK E RANKL EM DENTES
REIMPLANTADOS DE RATO.
Tese apresentada à Faculdade de
Odontologia do Câmpus de Araçatuba –
Unesp, para a obtenção do Grau de “Doutor
em Odontologia” – Área de Clínica Integrada
Orientador: Prof. Adj. Wilson Roberto Poi
Co-orientadora: Prof. Voluntária Dra.Roberta Okamoto
ARAÇATUBA – SP
- 2007 -
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Milhares de livros grátis para download.
Dados Curriculares
NASCIMENTO ..... :
06.06.1977 – São Caetano do Sul/SP
FILIAÇÃO.............. :
Antonio José Manfrin
Cléria Aparecida Lourenço Manfrin
1997/2000.............. :
Curso de Graduação na Faculdade de
Odontologia de Araçatuba -UNESP
2002 .......................... :
Estagiária do Departamento de Cirurgia e
Clínica Integrada, Disciplina de Cirurgia
e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial na
Faculdade de Odontologia de Araçatuba –
UNESP
2003/2004.............. :
Curso de Pós-Graduação em Odontologia,
Área de Cirurgia e Traumatologia Buco-
Maxilo-Facial, nível de Mestrado, na
Faculdade de Odontologia de Araçatuba –
UNESP
2005 ......................... :
Professora da Disciplina de Cirurgia da
Fundação Municipal de Educação e Cultura
de Santa Fé do Sul (FUNEC)
2005/2007............... :
Curso de Pós-Graduação em Odontologia,
Área de Clínica Integrada, nível de
Doutorado, na Faculdade de Odontologia
de Araçatuba – UNESP
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Dedicatória
Dedicatória
“É, só eu sei quanto amor eu guardei
Sem saber
Que era só pra você
É, só tinha de ser com você
Havia de ser pra você
Se não era mais uma dor
Se não não seria o amor
Aquele que a gente não vê
Amor que chegou para dar
O que ninguém deu pra você
É, você que é feito de azul
Me deixa morar nesse azul
Me deixa encontrar minha paz
Você que é bonito demais
Se ao menos pudesse saber
Que eu sempre fui só de você
Você sempre foi só de mim...”
Ao meu marido Kiko, com todo meu amor.
Agradecimentos Especiais
Agradecimentos Especiais
À Deus -
pela oportunidade da vida e do aprendizado
diário. Agradeço pelas pessoas especiais que coloca em me
u
caminho.
À minha família: meus pais Cléria e Antonio, e irmãos
Marcos e Márcio. Simplesmente essenciais na minha vida.
Ao Meu Orientador Wilson Roberto Poi
Obrigada pela paciência, compreensão e apoio em todas
as etapas. Obrigada pela confianç
a e liberdade. Nossa parceria
começou muito cedo, desde 1999. Desde então, só posso
agradecer todas as oportunidades que me foram
proporcionadas, crescimento pessoal e profissional, além de
contribuição decisiva na minha formação. Não posso deixar
de dizer
que trabalhar com você é muito prazeroso, bem como
compartilhar sua amizade.
Todo o meu carinho e admiração.
À Minha Co-orientadora Roberta Okamoto
Alguém muito jovem que é apaixonada pelo que faz.
Sempre disponível e prestativa, paciente e minunciosa.
Acima de tudo, muito humana.
Tenho plena certeza que você colherá ainda muitos frutos na
sua vida profissional.
Aos professores da Disciplina de Clínica Integrada:
Sônia Regina Panzarini, Celso Koogi Sonoda, Denise
Pedrini,
José Carlos Monteiro de Castro, Daniela Atili Brandini.
Obrigada pela acolhida carinhosa, sabedoria e disposição
para o ensino. Sempre me senti orientada de cada um de
vocês.
Agradecimentos
Agradecimentos
Á Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba –
UNESP, na pessoa de seu diretor, Prof Tit Pedro Felício
Estrada Barnebé pelas condições oferecidas para o
desenvolvimento deste trabalho.
Às amigas Carolina Chiantelli Cláudio Cou
tinho, Eloá
Luvizuto e Thalyta Ribeiro Neves da Cruz. Meus
agradecimentos pela colaboração durante a realização da
parte experimental e laboratorial deste trabalho.
Às minhas companheiras de república e de curso: Lívia
Guimarães Zina, Melaine de
Almeida Lawall, Márcia Regina
Negri, Cláudia Letícia Vendrami, Thais da Silveira Rodrigues.
Partilhamos muitos bons momentos juntas!!!! Obrigada por
toda ajuda e apoio, sempre!
À Isabel Cristina Lui Poi, por toda ajuda e pela sua
amizade.
À Comissão de Ética na Experimentação Animal
(CEEA) e funcionários do Biotério da FOA – UNESP.
10
À disciplina de Cirurgia e Traumatologia Buco
Maxilo Facial, professores: Tetuo Okamoto,
Michel Saad Neto,
Idelmo Rangel Garcia Júnior,
Osvaldo Magro Filho,
Alessandra Aranega, Cristiane Mara Ruiz de Sousa Fattah.
Aos funcionários do Departamento de Cirurgia e
Clínica Integrada da Faculdade de O
dontologia de Araçatuba
– UNESP: Cleide Lemos Caldazilla, Glauco José de Carvalho
,
Maria Dirce C. Boatto, Gilmar Martins de Oliveira,
Bernadete Maria Nunes Kimura e Antônia.
Aos funcionários da Seção de Pós-
Graduação da
Faculdade de Odontologia do Câmpus de Araçatuba –
Unesp:
Marina, Valéria e Diogo, que sempre nos auxiliam com boa
vontade.
Aos funcionários da Biblioteca da Faculdade de
Odontologia do Câmpus de Araçatuba –
Unesp: Helena, Ana
Cláudia, Isabel, Izamar, Cláudio, Ivone, Cláudia, Luzia,
Patrícia, Maria Cláudia, Marina e Marta pelo carinho,
atenção com que nos atendem e
disponibilidade durante o
curso.
Aos colegas do Curso de pós-
graduação pela amizade e
companheirismo durante esta jornada:
Leandro Carvalho
Cardoso, Jéssica Lemos Guilinelli, Thallita Pereira Queiroz,
11
Sheila Mônica Damásio, Edmar Ferreira da Silva,
José
Carlos Monteiro de Castro, Célia Tomiko Hamata Matida,
Mara Antônio, Lithiene Ribeiro Castilho, Albanir Gabriel
Borrasca, Camila Benez Ricieri, Francislei Ávila de Souza,
Flávia Priscila Pereira, Marcos Heidy Guskuma, André Dotto
Sottovia, Paulo Alme
ida Júnior, Paulo Domingos Ribeiro
Júnior, Eleonor Álvaro Garbin, Liliane Sheidegger da Silva
Zanete.
Aos ex-colegas do Curso de pós-
graduação pela
amizade e ensinamentos: Ana Paula Farnezi Bassi, Daniela
Ponzoni, e Vanessa Cristina Mendes
Aos amigos Siguimi Tanigute e Raquel Arantes pela
amizade, ensinamentos e incentivo na minha carreira
profissional.
À CNPQ (Conselho Nacional de Desenvolvimento
Cinetífico e Tecnológico), pelo auxílio financeiro que
viabilizou a realização desse trabalho de pesquisa.
Aos animais utilizados neste experimento, que
contribuíram com suas vidas para a realização deste
trabalho.
À todos que direta ou indiretamente contribuíram
para a realização deste trabalho.
12
Epígrafe
13
Epígrafe
“ Sei que meu trabalho é uma gota no oceano, mas sem ele, o
oceano seria menor. “
Madre Teresa de Calcutá
14
Sumário
Lista de Abreviaturas 15
Lista de Figuras 16
Resumo 18
Abstract 21
1. Introdução 24
2. Proposição 28
3. Material e Método 30
4. Resultados 36
5. Discussão 41
6. Conclusão 46
7. Referências 48
8. Figuras 55
Anexos 63
15
Lista de Abreviaturas
Osteoprotegerina OPG
Ativador do Receptor Nuclear Kappa-B
RANK
Ligante do Ativador Nuclear Kappa-B RANKL
Tampão fosfato de sódio PBS
Micrometros
µm
Microlitros
µl
16
Lista de Figuras
Figura 1 - Grupo Controle – Ratos em que o reimplante dentário
não foi realizado.
57
Figura 2 - Grupo I – Reimplante imediato (10 dias)
58
Figura 3 - Grupo II – Reimplante tardio sem tratamento (10 dias)
59
Figura 4 - Grupo III – Reimplante tardio com tratamento (10 dias)
60
Figura 5 - Grupo I – Reimplante imediato (60 dias) 61
Figura 6 - Grupo II – Reimplante tardio sem tratamento (60 dias) 62
Figura 7 - Grupo III – Reimplante tardio com tratamento (60 dias) 63
17
Resumo
18
Resumo
Resumo
MANFRIN, TM. Imunomarcação das proteínas OPG, RANK e RANKL em
dentes reimplantados de rato, [tese]. Araçatuba: Universidade Estadual
Paulista Júlio de Mesquita Filho; 2007
O sistema OPG, RANK e RANKL é uma das mais importantes descobertas da
biologia óssea. Essas proteínas regulam as atividades celulares na remodelação
do tecido ósseo e na literatura há diversas investigações nos tecidos dentários.
No entanto, no reimplante dentário, ainda não foram encontrados relatos. Foi
objetivo deste trabalho, avaliar a imunomarcação das proteínas OPG, RANK e
RANKL em dentes reimplantados de rato. Um grupo controle foi formado com
quatro ratos no qual o reimplante dentário não foi realizado. Vinte e quatro
ratos (Rattus norvegicus, albinus) tiveram seu incisivo superior extraído e depois
reimplantado formando os seguintes grupos: grupo I – reimplante imediato;
grupo II - reimplante tardio sem tratamento e grupo III - reimplante tardio com
tratamento endodôntico (ressecção da papila dentária e preenchimento do canal
com pasta de hidróxido de cálcio) e tratamento da superfície radicular (raspagem
mecânica do ligamento periodontal necrosado e imersão em solução de flúor
fosfato acidulado de sódio a 2,5%). Ao final dos períodos experimentais (10 e 60
dias) os ratos foram eutanasiados. Foram obtidos cortes longitudinais
parafinados com 6µm de espessura. Os cortes foram submetidos à reação
19
imunoístoquímica mediante a utilização de anticorpos primários para OPG,
RANK e RANKL. Os resultados mostraram que a imunomarcação de OPG e
RANKL ocorreu em todos os grupos e períodos estudados, muito embora
RANKL não tenha sido observada no grupo reimplante imediato aos 60 dias.
RANK foi observada somente aos 10 dias de todos os grupos no qual o
reimplante foi realizado. A análise qualitativa dos resultados demonstrou que o
sistema OPG, RANK e RANKL apresentou marcação evidente no reimplante
tardio, sugerindo a efetiva participação no início do processo de reabsorção
radicular, uma vez que aos 60 dias a imunomarcação foi discreta.
Palavras chave: imunoistoquímica, osteoprotegerina, RANK, RANKL,
reabsorção da raiz, reimplante dentário.
20
Abstract
21
Abstract
Abstract
MANFRIN TM. A immunolabeling study of OPG, RANK and RANKL in
replanted teeth in rats, [thesis] Araçatuba: Universidade Estadual Paulista;
2007.
The OPG, RANK and RANKL system is one of the most important discoveries
in bone biology. These proteins are key regulators of bone remodeling and in
the literature there are several studies of tooth resorption. However, in tooth
replantation, reports have not been found. The purpose of this study was to
determine the immunolabeling of OPG, RANK and RANKL in replanted teeth
in rats, using immunohistochemistry methodology. A control group (no
replanted teeth) was formed by four rats. Twenty-four rats (Rattus norvegicus,
albinus) were submitted to the extraction of their upper right incisors. The
replantation was performed according to the groups below: group I – immediate
replantation; group II – delay replantation without treatment and group III –
delay replantation with endodontic treatment (extirpation of papilla and the
root canal filled with calcium hydroxide) and root surface treatment
(periodontal ligament was removed with scalpel and teeth were immersed in 2%
acidulated phosphate sodium fluoride). The animals were euthanized at the end
of the experimental periods (10 and 60 days). Longitudinal 6µm slices embedded
in paraffin were obtained. The slices were submitted to immunohistochemistry
reaction by means of the primary antibodies for OPG, RANK and RANKL
22
proteins. The results showed the expression of OPG in all groups and periods.
RANKL expression was observed in all groups, except in the immediate
replanted teeth group (60 days). RANK expression was observed only at 10
days in all groups which replantation was performed. The qualitative analysis of
our findings indicated that the system OPG, RANK and RANKL presented
strong expression in delayed replantation, suggesting effective participation at
the beginning of root resorption, since at 60 days the immunostained cells were
discreet.
Keywords: immunohistochemistry, osteoprotegerin, RANK, RANKL, root
resorption, tooth replantation.
23
Introdução
24
1 Introdução
a Odontologia, as reabsorções dentárias representam
um capítulo presente na rotina dos cirurgiões-dentistas.
As reabsorções em dentes permanentes são consideradas patológicas, como na
reabsorção por movimentação ortodôntica; na doença periodontal avançada;
reabsorção causada por cistos, neoplasias e dentes inclusos; reabsorção radicular
interna e radicular externa. (1) Muito embora para cada tipo seja preconizado
um tratamento específico, as seqüelas resultantes das reabsorções dentárias
estão normalmente associadas à reabsorção dos tecidos duros: ósseo ou dentário.
Particularmente no reimplante dentário, identificar o padrão das
reabsorções radiculares não têm sido uma tarefa fácil. É necessário realizar o
diagnóstico precoce, tratamento adequado, acompanhamento clínico e
radiográfico periódico, aliados ao entendimento dos fenômenos biológicos. (2)
O tipo de reabsorção radicular instalada (reabsorção de superfície,
inflamatória, anquilose e reabsorção por substituição) está diretamente
relacionado com a integridade da camada de cemento, viabilidade das células do
ligamento periodontal e a condição da polpa, além da intensidade do trauma e a
natureza do estímulo desenvolvido. (3-5) Uma série de fatores locais e
sistêmicos interage determinando se o balanço final deste processo será em
favor do reparo por regeneração ou cicatrização. (6)
N
ON
25
Uma das hipóteses apresentadas para a ativação dos clastos é a ação de
três proteínas celulares intimamente ligadas à dinâmica dos processos de
remodelação do tecido ósseo. (7-9) Estas proteínas pertencem à família do Fator
de Necrose Tumoral (TNF) e são conhecidas como:
• OPG (Osteoprotegerina). A OPG, molécula de superfície sintetizada
por osteoblastos e por células do estroma é uma proteína solúvel
circulante e tem como maior ação biológica inibir a diferenciação de
osteoclastos a partir da ligação com RANKL. (10-15)
• RANK (Ativador do receptor nuclear kappa-B). Este receptor localiza-
se nos precursores hematopoiéticos de osteoclastos (monócitos e
macrófagos), em osteoclastos, linfócitos T e B, células dendríticas e
fibroblastos. (12-16)
• RANKL (Ligante do ativador nuclear kappa-B). (12,16) É uma
proteína trans-membrana expressa primariamente em tecidos linfóides e
células de linhagem T. Pode ser encontrada em osteoblastos maduros e
células do estroma, bem como na forma solúvel. O maior papel de
RANKL no tecido ósseo é estimulação da osteoclasia a partir do contato
célula-célula. A reabsorção óssea é ativada com a ligação de RANK à
RANKL. (12, 14-16)
Diversos estudos têm demonstrado a participação dessas proteínas na
reabsorção dos tecidos dentários. (16-24) Recentemente têm sido sugerido que a
reabsorção fisiológica dos dentes decíduos é um fenômeno regulado pelos
mesmos mecanismos observados no processo de remodelação do tecido ósseo.
(16-18) Fukushima et al. (17) verificaram, nas células do ligamento periodontal
26
de dentes decíduos humanos em processo de reabsorção, expressão aumentada
de RANKL e níveis baixos de OPG. Em contraste, em dentes permanentes ou
decíduos (com cronologia anterior ao processo de exfoliação) houve abundante
expressão de OPG, mas nenhuma de RANKL.
Em condições patológicas, Kumomoto & Ooya (19) verificaram a
expressão de RANKL e OPG predominante em células do estroma de
ameloblastomas humanos benignos ou malignos sugerindo a participação destas
moléculas na patogênese das lesões ósseas, que também parecem ter participação
nos cistos periapicais e granulomas. (20) Na movimentação dentária induzida
(21,22) a administração local de OPG em ratos inibe a osteoclasia e a
movimentação dentária, resultando numa melhor quantidade óssea durante a
ancoragem ortodôntica. Um outro estudo revelou altos níveis de RANKL e
baixos níveis de OPG no fluído do sulco gengival coletado de pacientes
submetidos à movimentação ortodôntica, sobretudo nas primeiras 24 horas (23).
Na investigação de pacientes com periodontite, Crotti et al. (24) observaram a
expressão de RANKL em linfócitos e macrófagos, enquanto OPG estava
associada com células endoteliais.
No reimplante dentário não foram encontrados na literatura relatos da
observância dessas proteínas sinalizadoras da remodelação óssea. Diante dessas
considerações e buscando melhor entendimento desses fenômenos, é oportuno o
estudo da expressão destas proteínas no reimplante dentário.
27
Proposição
28
2 Proposição
objetivo deste trabalho foi avaliar a
imunomarcação das proteínas OPG, RANK e RANKL em dentes reimplantados
de rato.
O
29
Material e Método
30
3 Material e Método
3. Material e Método
reviamente à sua realização, a metodologia empregada
neste trabalho foi submetida ao Comitê de Ética em
Experimentação Animal da Faculdade de Odontologia de Araçatuba (FOA-
UNESP) – Protocolo no.50/05. (Anexo A)
1. Animais
Para o desenvolvimento deste trabalho foram utilizados 28 ratos (Rattus
norvegicus, albinus), machos, adultos, com peso entre 200 g e 250 g,
aproximadamente. Os animais foram alimentados com ração sólida triturada
(Ração Ativada Produtor®, Anderson & Clayton S.A. - Laboratório Abbot do
Brasil Ltda, São Paulo, SP, Brasil) durante todo o experimento e água a vontade,
exceto no período das doze horas antecedentes ao ato cirúrgico. A etapa
cirúrgica foi realizada sob anestesia geral, administrando por via intramuscular
a combinação de cloridato de xilazina (Coopazine® - Coopers Brasil Ltda, Cotia,
SP, Brasil) na dosagem de 0,03 ml para cada 100 g de peso corporal,
promovendo o relaxamento muscular. Na seqüência, o cloridrato de ketamina
(Vetaset® - Fort Dodge Animal Health, Iowa, USA) foi utilizado na dosagem de
0,07 ml para cada 100 g de peso corporal para a indução anestésica. Após a
anestesia do animal, foi realizada a anti-sepsia da porção anterior da maxila com
polivinilpirrolidona iodada (PVPI Tópico 10%, Riodeine®, Riodeine Indústria
P
31
Química e Farmacêutica Rio Química, Ltda, São José do Rio Preto, SP, Brasil) e
em seguida, foi realizada a sindesmotomia, luxação e extração do incisivo
superior direito com o auxílio de instrumental especialmente adaptado. (25) A
seguir, foram formados três Grupos com oito animais cada um, enquanto o
grupo controle foi formado com apenas quatro ratos. O reimplante dentário foi
realizado de acordo com as propostas de tratamento para cada um dos Grupos
descritos abaixo:
• Grupo Controle – ratos em que o reimplante dentário não foi realizado;
• Grupo I – o reimplante foi realizado imediatamente após a extração
dentária;
• Grupo II – o reimplante foi realizado após 60 minutos (reimplante tardio)
da exodontia;
• Grupo III - o reimplante foi realizado após 60 minutos (reimplante
tardio) da exodontia com tratamento.
Nos Grupos II e III os dentes foram mantidos em meio seco, presos pela
coroa dental, em uma lâmina de cera utilidade, por 60 minutos. Finalizado o
período extra-alveolar, os dentes do grupo II foram reimplantados e os dentes
do Grupo III foram submetidos à remoção da papila dentária e do órgão do
esmalte com auxílio de lâmina de bisturi n
o
15 (Embramac Exp. E Imp.,
Campinas, SP, Brasil). O início da terapia endodôntica consistiu na pulpectomia,
por via retrógrada, empregando-se lima tipo Hedstron n
o
35 (Sybron Kerr,
Glendora, Califórnia, USA) ligeiramente curvada. O canal radicular foi irrigado
e aspirado, respectivamente com soro fisiológico (Ariston Ind. Quim. e Farm.
Ltda, São Paulo, SP, Brasil) e seringa descartável acoplada a agulha 25X6.
32
Os dentes tiveram a superfície radicular raspada com lâmina de bisturi n
o
15 (Embramac Exp.e Imp., Campinas, SP, Brasil) para a remoção mecânica do
remanescente do ligamento periodontal. A lâmina foi conduzida
perpendicularmente no sentido coroa ápice, apenas uma vez em todo o sentido
lingual. (26) Os dentes foram imersos em 20 ml de solução de flúor fosfato
acidulado de sódio a 2%, pH 5,5 (Farmácia Aphoticário – Araçatuba, SP, Brasil)
por 20 minutos. Após o tratamento da superfície radicular, o conteúdo dos
canais radiculares foram aspirados com seringa descartável acoplada em agulha
25X6, secos com cone de papel (Dentisply Ind e Com Ltda, Petrópolis, RJ,
Brasil) e preenchidos com pasta de hidróxido de cálcio acondicionada em tubete
anestésico (5ml de propilenoglicol, 5 g de Ca(OH)
2
, 2 g de óxido de zinco, 0,015
g de colofônia – Disciplina de Endodontia de Araçatuba) por via retrógrada,
com o auxílio de uma seringa carpule e agulha longa pré-curvada, após a
remoção do bisel (G27 – Terumo Corporation, Tóquio, Japão).
Os alvéolos dos Grupos II e III foram irrigados com soro fisiológico
previamente ao reimplante dentário. Todos os animais submetidos ao
procedimento cirúrgico receberam dose única de 20.000 U.I. de Penicilina G
Benzatina (Fort Dodge Animal Health, Iowa, USA), por via intra-muscular. Os
períodos experimentais estabelecidos foram de 10 e 60 dias.
2. Imunoistoquímica
Decorridos 10 e 60 dias do reimplante, os ratos (quatro para cada período
experimental, por grupo) foram eutanasiados por sobredosagem anestésica (Aos
10 dias os ratos do Grupo Controle também foram eutanasiados). A maxila
33
direita foi separada da esquerda na linha mediana com auxílio de uma lâmina de
bisturi no. 15 (Embramac Exp.E Imp., Campinas, SP, Brasil). Um corte com
tesoura reta na porção distal do 3º molar possibilitou a obtenção da área da
maxila contendo o dente reimplantado. As peças obtidas foram fixadas em
solução de formalina a 10% por 24 horas e descalcificadas em solução de EDTA
4,13% (Ácido Etileno Diamino Tetracético - pH 7,0, Merck®, Darmstadt,
Alemanha) por um período de três meses. Após a descalcificação, foram
embebidas em parafina e submetidas a cortes longitudinais de 6µm de espessura.
As lâminas foram preparadas para o processamento imunoistoquímico
(Anexo B) previamente à adição dos anticorpos. Como anticorpos primários
foram utilizados a Osteoprotegerina – OPG (goat anti OPG polyclonal antibody
– Santa Cruz Biotechnology® – SC 21038, Califórnia, USA), a RANK (goat anti
RANK polyclonal antibody – Santa Cruz Biotechnology® – SC 7626, Califórnia,
USA) e a RANKL (goat anti RANKL polyclonal antibody – Santa Cruz
Biotechnology® – SC 7627, Califórnia, USA). O anticorpo secundário utilizado
foi o biotinilado anti-cabras, produzido em coelhos (Pierce Biotechnology®,
Illinois, USA).
O sinal da reação imunoistoquímica foi amplificado com o sistema avidina-
biotina (Kit DAKO, Glostrup, Dinamarca) e a reação foi revelada utilizando a
diaminobenzidina (DAB, DAKO Co., Califórnia, USA) como cromógeno. A
coloração foi obtida com a hematoxilina de Harris (Merck®, Darmstadt,
Alemanha).
Para todos os grupos foram realizados controles imunoistoquímicos. A
lâmina passa por todo o processamento convencional, mas somente o anticorpo
34
secundário é adicionado. O objetivo é avaliar a efetividade e especificidade das
reações de OPG, RANK e RANKL. Assim, funciona como uma contra-prova: se
houver marcação no controle, provavelmente a imunomarcação das outras
proteínas são inespecíficas. Não havendo marcação no controle, as marcações
das demais proteínas são consideradas específicas.
3. Análise qualitativa
As análises foram realizadas qualitativamente em microscópio de luz.
Somente a face lingual da raiz foi considerada, já que o rato apresenta ligamento
periodontal apenas nesta face. Observou-se as características do ligamento
periodontal, osso alveolar, cemento, dentina, além da ocorrência de reabsorção
inflamatória, anquilose e reabsorção por substituição. O padrão de
imunomarcação de cada proteína (OPG, RANK e RANKL) foi observado para
cada grupo e período estudado. Dividiu-se a extensão da superfície radicular na
lâmina em três terços demarcados (Anexo C). O terço médio foi escolhido para a
análise, em virtude da interferência do ato cirúrgico no terço cervical e apical,
respectivamente, pelo uso do fórceps na exodontia e lâmina de bisturi na
remoção da papila dentária. Em seguida, para a captura da imagem, utilizou-se o
microscópio óptico com objetiva de aumento 20X Leica Aristoplan
Microsystems (Leitz, Benshein, Alemanha) acoplado a uma câmera de captação
da imagem (Leica DFC 300FX, Leica microsystems, Heerbrug, Switzerland)
conectada a um microcomputador Pentium III com um software analisador de
imagens digitalizadas (Leica Câmera Software Box, Leica Imaging Manager –
IM 50 Demo software).
35
Resultados
36
4 Resultados
4. Resultado
Grupo Controle – ratos em que o reimplante dentário não foi realizado
Estruturas dentárias preservadas. A camada de cemento está disposta ao longo
da dentina, enquanto as células do ligamento periodontal apresentam-se
agrupadas paralelamente ao cemento. Osteócitos no interior do tecido ósseo e
osteoblastos na superfície (face periodontal) do osso alveolar.
Controle: Negativo para as imunomarcações. Áreas coradas em marrom são
inespecíficas (Figura 1A).
OPG: Imunomarcação de OPG no cemento (mudança discreta da coloração da
linha basófila) e no ligamento periodontal. Vê-se ainda discreta marcação nos
osteócitos no tecido ósseo alveolar (Figura 1B).
RANK: Imunomarcações inespecíficas ou ausentes de RANK (Figura 1C).
RANKL: Imunomarcação discreta de RANKL no ligamento periodontal e no
tecido ósseo, marcando algumas células (Figura 1D).
GRUPO I – Reimplante Imediato – 10 dias
Padrão histológico semelhante ao do Grupo Controle – ratos em que o
reimplante dentário não foi realizado.
Controle: Negativo para as imunomarcações (Figura 2A).
OPG: Imunomarcação discreta no ligamento periodontal, osteócitos no interior
do tecido ósseo (Figura 2B).
37
RANK: Imunomarcação de RANK no cemento (mudança da coloração da linha
basófila) e em algumas células do ligamento periodontal (Figura 2C).
RANKL: Imunomarcação de RANKL no cemento (mudança da coloração da
linha basófila) e em algumas células do ligamento periodontal (Figura 2D).
GRUPO II – Reimplante tardio sem tratamento – 10 dias
Este grupo apresenta imunomarcação evidente. O cemento e a dentina não estão
íntegros em toda a sua extensão, havendo algumas áreas reabsorção radicular,
sugestivas de reabsorção inflamatória.
Controle: Negativo para as imunomarcações (Figura 3A).
OPG: Imunomarcação intensa de OPG tanto no ligamento periodontal quanto
no tecido ósseo (Figura 3B).
RANK: Imunomarcação de RANK tanto no ligamento periodontal quanto no
tecido ósseo (Figura 3C).
RANKL: Imunomarcação bem definida de RANKL no tecido ósseo (Figura 3D).
GRUPO III – Reimplante tardio com tratamento – 10 dias
A camada de cemento (linha basófila) está integra e disposta ao longo da
dentina. O espaço do ligamento periodontal está preenchido por um tecido
conjuntivo que parece se reorganizar em direção à superfície radicular.
Osteócitos no interior do tecido ósseo e osteoblastos na superfície (face
periodontal) do osso alveolar.
Controle: Negativo para as imunomarcações (Figura 4A).
38
OPG: Imunomarcação de OPG no tecido ósseo (Figura 4B).
RANK: Imunomarcação de RANK no tecido ósseo (Figura 4C).
RANKL: Imunomarcação de RANKL no tecido ósseo (Figura 4D).
GRUPO I – Reimplante Imediato – 60 DIAS
Camada de dentina e cemento preservadas. Muitas células no ligamento
periodontal. As fibras do ligamento periodontal parecem estar bem inseridas.
Osteócitos no interior do tecido ósseo e osteoblastos na superfície (face
periodontal) do osso alveolar.
Controle: Negativo para as imunomarcações (Figura 5A).
OPG: Imunomarcação no cemento, ligamento periodontal e tecido ósseo
(Figura 5B).
RANK: Imunomarcações inespecíficas ou ausentes de RANK (Figura 5C).
RANKL: Imunomarcações inespecíficas ou ausentes de RANKL (Figura 5D).
GRUPO II – Reimplante tardio sem tratamento – 60 dias
Este grupo apresenta imunomarcação evidente. O cemento e a dentina
apresentam áreas de reabsorção inflamatória, áreas onde o tecido ósseo
encontra-se em contato direto com o cemento (anquilose) e áreas onde houve a
substituição das estruturas dentárias por tecido ósseo, caracterizando a
reabsorção por substituição.
Controle: Negativo para as imunomarcações (Figura 6A).
OPG: Imunomarcação no tecido ósseo (Figura 6B).
RANK: Imunomarcações inespecíficas ou ausentes de RANK (Figura 6C).
39
RANKL: Tecido ósseo bem marcado com RANKL (Figura 6D).
GRUPO III – Reimplante tardio com tratamento - 60 dias
Este grupo é marcado pela anquilose e reabsorção por substituição. Na maioria
dos espécimes, não se verifica integridade da camada de cemento ou dentina.
Verifica-se a anquilose em áreas em que há o contato direto do cemento com o
tecido ósseo, e substituição das estruturas dentárias (cemento, dentina) por
tecido ósseo (reabsorção por substituição).
Controle: Negativo para as imunomarcações (Figura 7A).
OPG: Imunomarcação discreta de OPG no tecido ósseo (Figura 7B).
RANK: Imunomarcações inespecíficas ou ausentes de RANK (Figura 7C).
RANKL: Imunomarcações dispersas no tecido ósseo e em algumas células do
tecido conjuntivo preenchendo o espaço do ligamento periodontal (Figura 7D).
40
Discussão
41
5 Discussão
5. Discussão
s reabsorções radiculares são complicações
possivelmente esperadas após a realização do reimplante
dentário. Achados clínicos e radiográficos (2, 5) podem
ser utilizados na prática clínica para diagnosticar o padrão das reabsorções, bem
como tratá-las quando oportuno. No entanto, como os eventos celulares
observados histologicamente ocorrem muito antes de termos evidências clínicas
ou radiográficas, o entendimento dos fenômenos biológicos é necessário para o
planejamento de procedimentos clínicos adequados.
Neste trabalho o reimplante dentário foi realizado de acordo com os
protocolos de atendimento para dentes avulsionados permanentes disponíveis na
literatura.(28-30) Reconhecidamente, o tempo extra-alveolar é um dos fatores
determinantes no prognóstico do reimplante dentário. (31, 32)
Partindo deste pressuposto, os melhores resultados podem ser atribuídos
ao grupo em que foi realizado o reimplante imediato, já que nos períodos
estudados não foi constatada a presença de reabsorções radiculares. O padrão
histológico apresentado pelo Grupo I aos 10 dias é semelhante ao observado no
Grupo Controle (ratos em que o reimplante dentário não foi realizado), o que é
referência da situação de normalidade. Com relação às imunomarcações, no
Grupo Controle há marcações de OPG e RANKL. Neste grupo, parece haver
um equilíbrio das interações celulares, uma vez que no tecido ósseo o balanço
A
42
entre a expressão de OPG e RANKL é um importante determinante da massa
óssea e integridade do esqueleto. (33)
Em contrapartida, no Grupo I aos 10 dias, além da presença de OPG e
RANKL, há imunomarcações de RANK. Os estudos que descrevem a expressão
da proteína RANK citam marcações específicas dessa proteína em pré-
osteoclastos e fibroblastos. (12-16) Como o ligamento periodontal é ricamente
vascularizado e propicia o imediato desencadeamento do processo inflamatório,
cujo exudato e infiltrado determinam a presença de vários mediadores, (1) a
sinalização destas proteínas pode indicar a reorganização desse tecido frente ao
rompimento das fibras periodontais ocasionado pela avulsão dentária.
No Grupo I aos 60 dias, há predominância da marcação de OPG no
cemento, ligamento periodontal e tecido ósseo, enquanto não se verifica
imunomarcações de RANK e RANKL. Comparativamente ao Grupo Controle, a
ausência completa de RANKL sugere uma situação de desequilíbrio metabólico,
muito embora histologicamente observou-se estruturas dentárias preservadas e
com aspecto de normalidade.
O tipo de tratamento a ser indicado no reimplante depende, além do
tempo extra-alveolar, de outros fatores como meio de conservação, (31, 32)
manipulação do dente avulsionado, (28-30) ou ainda rizogênese completa ou
incompleta. (34, 35) Didaticamente, o reimplante pode ser classificado como
mediato ou tardio quando são realizados após 60 minutos da avulsão. (28-30)
Assim, nestes casos, uma série de medidas como tratamento da superfície
radicular, (26, 36) tratamento endodôntico, (34, 35) contenção (37, 38) e ajuste
oclusal, (39) entre outras, devem ser tomadas a fim de se controlar a reabsorção
43
radicular inflamatória (35, 40) ou protelar a ocorrência da anquilose e
reabsorção por substituição. (41, 42) Certamente, além das classificações e
protocolos disponíveis, deve-se aliar o bom senso separando o reimplante em
favorável ou desfavorável. (39)
Com relação às imunomarcações no reimplante tardio (sem e com
tratamento), verifica-se uma constante aos 10 dias. Observa-se a marcação
intensa das três proteínas, indicando que este é o período de maior atividade
metabólica. Neste período observamos a expressão marcante de RANK, que
teoricamente se expressa predominantemente em clastos. (12-16) Portanto, no
reimplante tardio, a imunomarcação de RANK parece sinalizar o início do
processo de reabsorção radicular.
No reimplante tardio, aos 60 dias, as reabsorções radiculares podem ser
observadas claramente. No grupo em que o tratamento endodôntico não foi
realizado observou-se predominância da reabsorção radicular inflamatória, uma
vez que essa terapia é indicada no controle e tratamento deste tipo de
reabsorção. (4, 5, 35, 40) Por sua vez, a anquilose e reabsorção por substituição
são situações aguardadas nos grupos em que o reimplante tardio foi realizado.
(41, 42) Contudo, no reimplante tardio sem tratamento a destruição das
estruturas dentárias é ainda maior. Claramente, o Grupo II (aos 10 e 60 dias) foi
o que apresentou imunomarcação mais evidente.
Aos 60 dias, não se observou a imunomarcação de RANK nos Grupos II e
III e comparativamente com os grupos dos 10 dias, houve significante
diminuição da marcação de OPG e RANKL. Aparentemente, neste período há
uma tendência para a estagnação da fase ativa das reabsorções radiculares.
44
Então, por que os dentes continuam sendo reabsorvidos ao longo dos anos? A
partir da análise dos resultados, sugere-se que a participação do sistema OPG,
RANK e RANKL está relacionada ao início do processo de reabsorção, enquanto
que a manutenção deste processo pode estar relacionada à ação de outros
sinalizadores.
A proposta do sistema OPG, RANK e RANKL no reimplante dentário foi
baseada em evidências dessas proteínas nos tecidos dentários em condições
fisiológicas (16-18) e patológicas. (19-24) No presente trabalho, a
imunomarcação destas proteínas reforça essa hipótese, a despeito das limitações
da metodologia empregada. Para melhor traçar o perfil de cada proteína nos
grupos estudados, seria ideal acrescentar um período experimental
intermediário entre 10 e 60 dias. Ainda, novos estudos devem ser realizados com
o intuito de se quantificar essas proteínas, aliando os resultados à análise
descritiva.
Considerando a ação destas proteínas no metabolismo ósseo e as
suas investigações nos tecidos dentários, o sistema OPG-RANK-RANKL pode
ser um dos diversos reguladores das reabsorções radiculares no reimplante
dentário, contribuindo para este complexo processo.
45
Conclusão
46
6 Conclusão
6. Conclusão
sistema OPG, RANK e RANKL apresentou
imunomarcação evidente no reimplante tardio,
sugerindo a sua efetiva participação no início do processo de reabsorção
radicular, uma vez que aos 60 dias a imunomarcação foi discreta.
O
47
Referências
48
7 Referências
7. Referências Bibliográficas
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54
Figuras
55
56
57
58
59
60
61
62
Anexos
63
ANEXO A - Autorização do Comitê de Ética em Pesquisa - FOA -UNESP
64
ANEXO B – PROTOCOLO DE IMUNOÍSTOQUÍMICA – TÉCNICA DA
IMUNOPEROXIDASE (www.erviegas.com.br)
1° dia: começar os 2 dias no mesmo horário
a- colocar as lâminas na estufa a 60° por 15 minutos para amolecer a
parafina
b- colocar as lâminas na grade:
1- Passar no Xilol 1, 2, 3 (5 minutos cada)
2- Passar no Álcool absoluto 1, 2, 3 (2 minutos cada)
3- Passar no Álcool 70% por 2 minutos (hidrata)
4- Lavar em PBS: 3 banhos de 1,5 minutos cada (5 minutos no total)
PBS com Triton – para lavar (pode usar os mesmos frascos, só lavar com água
corrente entre as trocas)
PBS sem Triton – para diluir o anticorpo
c- H
2
O
2
a 30% (20mL) em 180mL de PBS sem Triton (a solução final fica a
3%). Fazer esta solução e deixar e deixar as lâminas por 45 minutos, no
escuro, para não perder a ação (diminuir a atividade da peroxidase). Para
deixar no escuro, cobrir com um tupperware de cor opaca.
d- Lavar com PBS + Triton por 5 minutos – 3 banhos de 1,5 minuto
e- Tampão citrato (preparar na hora). Não precisa ser no escuro. Aquecer
antes, até atingir 95-100°. Então colocar as lâminas e deixar por 20
minutos. Depois deixar 20 minutos esfriando na bancada.
f- Não lavar as lâminas aqui. Ir para a etapa do leite molico.
g- Colocar as lâminas no leite molico desnatado. Preparar na hora. O leite
tem muita avidina que consome a biotina endógena. Preparo: Misturar
8g de leite em pó com 200mL de H2O destilada. Agitar sem medir o pH e
deixar as lâminas por 20 minutos.
h- Não lavar, só secar com papel filtro. Delimitar com caneta, o corte.
i- Pipetar em cima do corte 50 ou 100µL de anticorpo primário. Preparo do
PBS.BSA a 0,1%: Para obtermos BSA 0,1%, coloca-se 0,1 g de BSA em
100 mL de PSB sem Triton. Então para 30mL de PBS sem Triton coloco
0,03g de BSA. Diluição do anticorpo primário com PBS.BSA 0,1%:
Começo sempre da menor concentração:
- 1:50
- 1:100
65
- 1:200
- 1:400
- 1:500 (padronizar)
Um exemplo: 1:50 = 10µL de anticorpo + 490µL PBS.BSA 0,1%. Isto
corresponde a 20 µL de anticorpo primário + 980 µL de PBS.BSA 0,1%.
Para fazer este cálculo faço o seguinte: 1:50 = 1000:50 = 20 µL. Esta será
a quantidade de anticorpo para o restante de PBS.BSA. Ou seja, o que
falta para completar 1mL (980 µL). Depois de feito isso, calculo o total de
lâminas e quanto de cada anticorpo vou pipetar nos cortes, para saber qto
de anticorpo diluído vou precisar (ex: se para cada corte gasto 50 µL, qdo
tiver 10 cortes, gastarei 500 µL).
j- Repousar em geladeira (ou ambiente) por 18hs, dentro de um suporte
fechado com tampa.
2° dia: começar os 2 dias no mesmo horário
Observações: Controles + e –. Lavar sempre em potes separados para não
contaminar com anticorpo as lâminas que estão sem anticorpo.
- Para cada reação (independente do número de lâminas e cortes) eu corro 3
lâminas separadas. Ex: 10 lâminas minhas que serão o controle positivo, ou seja,
receberão anticorpo. Mais: 1 lâmina minha sem anticorpo (controle negativo),
uma lâmina com tumor e anticorpo (controle positivo) e uma lâmina com tumor
e sem anticorpo (controle negativo).
a- Lavar as lâminas em PBS com Triton por 5 minutos (2,5minutos cada)
b- Secar as lâminas com papel filtro ou lenço de papel e colocar no porta
lâminas
c- Pipetar o anticorpo secundário já diluído = 50 µL. A diluição vem
descrita na bula.
d- Deixar 1 hora em temperatura ambiente. Depois lavar por 5 minutos em
PBS + Triton (3 vezes de 1,5 minuto, com total de 5 minutos).
e- Depois de 15 minutos (faltando 45 minutos para completar 1 hora) já
preparo o complexo. Preparo do complexo para 20 lâminas: Ver no kit.
Geralmente são 3 soluções A + B + C (anticorpo). Pegar 10 µL A + 10
µL B + 1680 µL de PBS.BSA. Pipetar o complexo sobre os cortes e deixar
66
por 45 minutos. A quantidade de pipetagem é a mesma para os cortes.
Desde o início ao fim.
f- Lavar 5 minutos em PBS + Triton. Não secar.
g- Aplicar a DAB (1mL de substrato + 1 gota de DAB) para 20 lâminas.
Fica cor de laranja. Esta deve ser preparada na hora. Aplicar 50 µL de
cromógeno na “ câmara escura” por 5 minutos.
h- Lavar em H
2
O destilada – colocar em cuba com água para paralisar a
reação e pode corar imediatamente.
i- Corar só com Hematoxilina sem Eosina, pela técnica convencional com
os tempos normais para HE. Após a Hematoxilina, lava por 10 mins em
água corrente, depois já passa pelos álcoois e xilol, e monta as lâminas.
Reconstituição do anticorpo secundário: Coloco 1mL de água destilada. Para
calcular quanto dele uso (diluição), vejo na bula que recomenda: 2-10 µL/mL.
Se pretendo usar 1:200, vou analisar se está dentro da faixa recomendada.
Pego a quantidade total de pó que reconstitui (1,5mg) e divido pela diluição que
quero: 200.Então, 1,5mg:200= 0,0075mg em 1mL. Ou seja, 7,5 µg/mL.
PREPARO DAS SOLUÇÕES DE TAMPÃO PARA IMUNO:
Tampão Fosfato Salino (PBS) – pH 7.2 a 7.4
1 Litro de água destilada
1,38g NaH
2
PO
4.
H
2
O (fosfato monobásico de sódio monohidrato)
6,96g K
2
HPO4
7,2g NaCl (cloreto de sódio)
Conferir o pH
Para facilitar, preparar concentrado 10 vezes e diluir no momento do uso.
PBS + Triton
Para cada litro de PBS, adicionar 1mL de triton
67
H2O2 3%
180mL de PBS sem triton
20mL de H
2
O
2
30% (estoque)
Tampão Fosfato-Citrato – pH 6.0
200mL de água destilada
1,42g de fosfato dibásico de sódio anidro
0,96g de ácido cítrico
Conferir o pH
Este tampão deve começar a ser aquecido enquanto as lâminas estiverem na
água oxigenada, para que no momento da incubação a solução tenha atingido a
temperatura ideal.
Todas as soluções, exceto o PBS, devem ser preparadas no momento do uso. Os
reagentes podem ser previamente pesados e armazenados na quantidade certa.
68
ANEXO C – Demarcação do terço médio no dente de rato para análise dos
resultados.
69
ANEXO D – Ilustração do Material e Método
Fig. 1 – Aferição do peso do animal. Fig. 2 – Anestesia intra-muscular.
Fig. 3– Anti-sepsia com polivinilpirrolidona
iodada.
Fig. 4– Sindesmotomia e luxação do incisivo
superior direito.
Fig. 5 – Extração do incisivo superior direito. Fig. 6 Dente extraído.
70
Fig. 7 – Dentes extraídos fixados em cera utilidade.
Fig. 8- Remoção da papila dentária e do órgão do
esmalte com auxílio de lâmina de bisturi no. 15.
Fig. 9 - Pulpectomia, por via retrógrada, com lima
tipo Hedstron no. 35.
Fig. 10 – Irrigação do canal radicular com soro
fisiológico.
Fig. 11- Remoção mecânica do ligamento
periodontal remanescente com lâmina no.15.
Fig.12 – Dente imerso em solução de fluoreto de
sódio fosfato acidulado a 2%.
Fig. 13 – Irrigação com soro fisiológico. Fig. 14 – Secagem do canal radicular com cone de
papel absorvente.
71
Fig.15– Pasta de hidróxido de cálcio em tubete e
propilenoglicol em tubete.
Fig.16 – Preenchimento do canal radicular com
pasta de hidróxido de cálcio.
Fig.17– Reimplante Dentário Fig.18 – Antibiótico utilizado.
72
ANEXO E – Normas para publicação
ARCHIVES OF ORAL BIOLOGY
Jornal Multidisciplinar de Ciência Oral e Craniofacial
Submissões
Solicitam-se aos autores submeter o artigo original e as figuras online via Gerente Editorial [substitua
por EES]. O EES é um serviço disponibilizado pela web para submissão e revisão dos artigos. Os
autores podem submeter os manuscritos e acompanhar o progresso da avaliação para publicação.
Revisores podem fazer download dos artigos e enviar suas opniões para o editor. Os editores podem
gerenciar toda a submissão, revisão, ou processo de publicação.
Por favor registre neste endereço: http://ees.elsevier.com/aob
Editores-chefe:
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c/o Libby Calvert, Administrative Editor, Archives of Oral Biology, Elsevier, The Boulevard, Langford
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considerado para publicação em outro lugar, e se aceito não deverá ser publicado em nenhum lugar
sem o consentimento informado do autor, em inglês ou qualquer outro idioma. Cada artigo deve vir
acompanhado por um declaração assinada pelo autores correspondentes de que o manuscrito foi lido e
aprovado pelos demais autores. Autores devem fornecer detalhes de artigos correlatos em submissão
ou recentemente publicados em outro lugar.
Se há relatos no artigo de experimentos ou observações em animais ou em humanos um parágrafo deve
ser incluído na carta de submissão indicando que o protocolo foi examinado e aprovado pelo Comitê
de Ética da Instituição.
Convidamos os autores a sugerir três ou mais nomes adequados para revisão. O endereço completo e e-
mail devem ser incluídos. Os editores podem ou não, utilizar as sugestões dos revisores.
Padrões Científicos
O objetivo dos editores e revisores é manter um alto padrão de comunicação científica. Normalmente
os artigos são acessados por dois revisores selecionados pelo Editor, e as decisões com relação à
aceitação da revista são baseadas nas orientações dos revisores. Quando apropriado, as considerações
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provavelmente será mal entendido pelos leitores também.
Tipo de Contribuições
Artigos originais e artigos de revisão são bem-vindos. Não haverá diferença com base na extensão do
artigo, ou seja, comunicação longa ou curta. Todas as submissões devem serão revisadas. Revisões
podem ser submetidas em esboço antes da submissão do artigo completo.
Preparo do Artigo
Os artigos devem ser concisos tanto quanto for possível e, em vista da característica internacional da
revista, o uso do inglês pode apresentar dificuldades aos leitores cujo primeiro idioma não é o inglês.
As ortografias podem ser usadas em inglês britânico ou americano, mas devem ser consistentes com o
artigo. Os autores devem expressar seus próprios achados no tempo passado e usar tempo presente
quando a referência citada é feita a um conhecimento existente, ou onde o autor está declarando o que
é conhecido ou concluído. Artigos originais devem seguir o seguinte padrão: Introdução, Materiais e
Métodos, Resultados ou Achados, Discussão.
Autores poderão receber bastante assistência consultando o livro: Edward J. Huth, Scientific Style and
Format (Sixth Edition). The Council of Biology Editors Manual for Authors, Editors and Publishers,
Cambridge.
Os Editores reservam o direito de revisar a linguagem dos artigos sob os interesses dos padrões
de clareza e concisão da revista.
Geral
Manuscritos devem estar em formato Word for Windows (preferencialmente no formato Word),
espaço duplo com margens largas e tamanho de fonte 12 ou 10 pt. Para submissões em disco rígido
(disquete, CD), boa qualidade das impressões são necessárias. O autor para correspondência deve ser
identificado (incluindo um número de fax e endereço de e-mail). Os endereços completos para
73
correspondência dos co-autores devem ser fornecidos. Por favor verifique o estilo corrente do jornal,
particularmente o estilo de referência (norma Vancouver), e evite excessiva estilização do layout, a
maioria dos códigos serão removidos ou substituídos durante o processamento do seu artigo. Em
adição, não use opções do word como separação de sílabas automática, texto justificado, colunas
duplas ou numeração automática dos parágrafos (especialmente para referências numeradas). Os
editores reservam o direito de adequar o texto a determinados padrões de estilo e uniformidade. Os
autores devem guardar cópias de todas as versões do manuscrito submetidas à revista. Os autores são
especialmente solicitados para serem vigilantes sobre o processo de submissão da versão correta do
manuscrito durante os vários estágios do processo editorial.
Texto
Siga esta ordem quando digitar o manuscrito: Título, Autores, Afiliações, Resumo, Palavras-chave,
Texto principal, Agradecimentos, Apêndice, Referências, Currículos, Legendas e então Tabelas. Não
insira figuras ou tabelas dentro do texto. O autor para correspondência deve ser identificado com um
asterisco e nota de rodapé. Todas as outras notas de rodapé devem ser identificadas (exceto notas de
rodapé para as tabelas) devem ser identificadas com números arábicos superscritos.
Página do Título
Como os títulos freqüentemente permanecem sozinhos nos índices, revistas bibliográficas, etc., e a
indexação dos artigos estão, de uma maneira geral, se tornando computadorizada a partir de palavras-
chave no título, é importante que os títulos sejam concisos e informativos tanto quanto possível.
Assim, a espécie animal a qual as observações se referem devem sempre ser dadas e é indicado o tipo
de método em que as observações são baseadas, por exemplo, químico, bacteriológico, microscopia
eletrônica ou histoquímica, etc. Um “título rápido” com não mais de 40 letras e espaços deve ser
fornecido. Um índice de palavras-chave deve ser fornecido para cada artigo.
Resumos estruturados
O artigo deve ter como prefácio um resumo com objetivo de dar uma idéia do trabalho inteiro em
miniatura. Resumos não devem ser mais longos que 250 palavras e devem ser estruturados de acordo
com os manuais publicados no Journal of the American Medical Association (JAMA 1995;273: 27-
34). Em resumo, o resumo deve ser dividido em seções incluindo os seguintes ítens: (1) Objetivo; (2)
Tipo –se o trabalho é laboratorial ou de campo, seleção de pacientes, detalhes da intervenção, medidas
de resultados, etc.; se é pesquisa laboratorial incluir detalhes do método; (3) Resultados; (4)
Conclusões.
Recebimento/Datas do Aceitação
A data de recebimento será adicionada a todos os artigos quando forem recebidas pelo Editor. A data
de aceite será também adicionada quando os artigos forem recebidos no escritório de publicação.
Introdução
Deve ser uma declaração sucinta do problema investigado dentro do contexto com uma breve revisão
da literatura relevante.
A literatura diretamente relevante para qualquer inferência ou argumentos apresentados na discussão
deve em geral ser reservada para esta seção. A introdução deve ser concluída com a razão da
realização do trabalho, mas não deverá revelar o que foi feito ou os achados.
Materiais e Métodos
Detalhe suficiente deve ser fornecido aqui a fim de que outro pesquisador possa repetir exatamente os
procedimentos. Quando os materiais e métodos forem exatamente iguais a um artigo prévio, não é
necessário repetir todos os detalhes, mas deve haver informação o suficiente para que o leitor
compreenda o que foi feito sem ter que consultar o trabalho anterior.
Solicita-se aos autores esclarecer que as condições do experimento animal foram humanas; por
exemplo, o tipo da anestesia e sacrifício deve ser especificado. Na experimentação em humanos, os
autores devem falar brevemente que os pacientes receberam consentimento informado e esclarecido, e
preferencialmente. O trabalho deve ter sido aprovado por um comitê de ética apropriado.
Resultados ou achados
Devem ser claros e concisos. Deve-se tomar cuidado para evitar delinear inferências que pertencem à
discussão. Os dados devem ser apresentados em formulários como histogramas ou tabelas, mas em
vista da questão de espaço, a apresentação do mesmo dado em mais de um formulário é inaceitável.
É geralmente necessário analisar os resultados numéricos estatisticamente. Uma declaração dos
números, seu valor médio e algumas medidas apropriadas da sua variabilidade são geralmente
suficientes. O método de análise seguido deve ser indicado. A declaração da diferença entre os valores
médios de dois grupos de dados é estatisticamente significante, deve fornecer o nível provável
colocado como significante pelo pesquisador e indicar o teste estatístico usado. Não é suficiente citar o
uso de um pacote estatístico sem nomear os testes utilizados.
Discussão
74
Esta seção apresenta inferências delineadas a partir dos resultados: estes devem ser recapitulados
somente para tornar o argumento claro.
Agradecimentos
Quando for apropriado.
Referências:
Todos os manuscritos devem usar a norma 'Vancouver' para as referências, as quais devem ser
numeradas consecutivamente na ordem em que são citadas pela primeira vez no texto e listadas
ao final do artigo.
Para referências de revistas, todos os autores devem ser incluídos quando forem seis ou menos (os seis
primeiros seguidos “et al.” quando houver sete ou mais) acompanhados pelo título do artigo, nome do
jornal abreviado de acordo com os padrões British Standard 4148: 1975, ano, volume, e primeira e
última páginas.
Exemplo:
1. Dezan CC, Nicolau J, Souza DN, Walter LRF. Flow rate, amylase activity, and protein and sialic
acid concentrations of saliva from children aged 18, 30 and 42 months attending a baby clinic.
Arch. Oral Biol 2002; 47: 423?427
Para referências de livros, os autor(es) devem ser seguidos pelo título do capítulo (se apropriado),
editor (aplicável ou não), título do livro, local de publicação, editora, ano e número de páginas. Por
exemplo:
2. Gorlin RJ, Pindborg JJ, Cohen MM Jr. Syndromes of the Head and Neck, 2nd Edition. New York:
McGraw-Hill, 1976.
Artigos no decurso da publicação não devem ser inscritas nas referências se o artigo foi aceito por uma
revista, e então acrescentar no texto e na lista de referências com as palavras "In press" acompanhado
do nome do jornal.
Unidades e Símbolos
Em geral, Archives of Oral Biology irá usar as unidades e símbolos do recomendado sistema
internacional de medidas (SI). O uso do litro, geralmente melhor escrito por extenso, ao invés de SI
dm
3
e ml
3
no lugar de SI cm, continuará sendo aceito. Para detalhes dos símbolos SI, os autores podem
consultar o: Symbols, Signs and Abbreviations (1969) by the Royal Society of Metric and Decimal
Systems in Council of Biology Editors Style Manual (1978) 4th edn, publicado pela Council of
Biology Editors Inc. Unidades da atividade enzimática devem ser claramente definidas,
preferencialmente usando unidades do sistema SI. A força centrífuga deve ser descrita em múltiplos de
g, ao invés de rev/min.
Unidades e abreviações
Os Archives of Oral Biology é um jornal com um grupo de leitores multidisciplinar, abreviações,
exceto aquelas compreendidas universalmente como mm, g, min. u.v., w/v e aquelas listadas abaixo
devem ser evitadas se possível.Exemplos de abreviações podem talves serem usadas sem definição:
ADP,
AMP,
ATP
DEAE-cellulose
DNA,
RNA
EDTA
EMG
tris
Outras abreviações usadas para melhorar a legibilidade devem estar listadas como nota de rodapé na
página do título.
Símbolos químicos devem ser usados para elementos, grupos e compostos simples, mas o uso
escessivo deve ser evitado. Abreviações diferentes das citadas acima não devem ser usadas nos títulos.
Nomenclatura das bactérias. Os organismos devem ser citados pelos seus nomes científicos de
acordo com o sistema binômio. Quando mencionado pela primeira vez deve ser o nome completo deve
ser digitado, sublinhado e grifado em italico. Depois o gênero deve ser abreviado para a sua letra
inicial, exemplo: 'S. aureus' e não 'Staph. aureus'. Se a abreviação pode causar confusão ou tornar o
significado pretendido não claro, os nomes completes dos micróbios devem ser citados por extenso.
Somente aqueles nomes que foram incluídos na Lista Aprovada de Nomes Bacteriológicos, Int J Syst
Bacteriol 1980; 30: 225?420 e aqueles que foram validados e publicados no Int J Syst Bacteriol since 1
January 1980 possuem nomenclatura reconhecida. Se há uma boa razão para usar um nome que não
está na nomenclatura, estes nomes devem estar entre aspas e uma justificativa apropriada deve ser feita
no texto. (por exemplo veja em Int J Syst Bacteriol 1980; 30: 547?556). Quando o gene sozinho é
75
usado como substantivo ou adjetivo, use letra minúscula (caixa baixa) sem ser sublinhada, por
exemplo, 'organismos eram estafilococcus' e `infecção por estreptococcus'. Se o gênero for citado
especificamente (sublinhe) por exemplo 'organismos do gênero Estafilococcus'. Para gênero no plural,
use caixa baixa, por exemplo 'salmonellae'; plurais podem ser anglicizados. Para nomes triviais, use
caixa baixa, por exemplo 'meningococcus'.
Números, medidas e estatísticas. Números de um a nove são digitados por extenso a não ser que eles
representem medidas (unless they are measurements) (e.g.5mL). Números maiores que nove são
digitados por extenso quando iniciarem uma frase, ou quando exigirem clareza. Números acima ou
igual a 10 000 possuem um espaço, não uma vírgula. Um ponto decimal é precedido por um número
ou cifra e.g. '0.5'. Pontos decimais em colunas devem ser alinhados verticalmente. Datas são
geralmente digitadas completamente: 14 April 1949. Medidas devem ser expressas pelo SI ou unidades
não-métricas.
Use 10 ml/h ao invest de -1 (or per).
Abreviações. Use letras maiúsculas para: MIC, MBC, WBC, RBC, DNA, RNA, Grupo A, B etc. para
antigênicos ou outros grupos, PHLS, CDSC, CDC, WHO, CSF, MSU, EMU, CSU. Use cfu, pfu, mm,
m, min, h, in, ft, g, kg, mL, L, im, iv, iu, P(probabilidade). Use sp. e spp. (espécies, singular e plural).
Use pigmentação de Gram e bacilo Gram-negativo. Use in-vitro (adjetivo) mas in vitro(advérbio),
post-mortem (com hífen - adjetivo) mas post mortem (sem hífen - advérbio). Ortografia. Use ortografia
britânica: Haemophilus, haematology, paediatrics, leucocyte, leukaemia, bacteraemia, sulphonamides,
aetiology; but note neutropenia, fetal. Por favor note que o jornal usa ortografia britânica ( UK 'z'
spelling - e.g., colonizes).
Drogas. Estas devem ser citadas pelos seus nomes aprovados e não pelos nomes comerciais, para
orientação veja o Formulário Nacional Britânico
Nomes Comerciais
Tanto quanto possível, nomes próprios devem ser usados ao invés dos nomes comerciais. Onde é
desejável indicar uma marca particular de preparações, o nome comercial e fonte devem ser indicado
em dentro de parênteses depois nome próprio, por exemplo Testicular hyaluronidase (Testovase,
Bovine Enterprises Ltd, 327 Farm Road, London E23)
Ilustrações
Na submissão inicial online e na fase de revisão, os autores são obrigados a providenciar versões
eletrônicas das figuras. Quando o artigo for aceito, os autores tem que estar preparados para fornecer
todas as ilustrações em versão eletrônica e fotográfica, (apropriado para reprodução, o que pode incluir
redução, sem retoques).
A ferramenta de controle de qualidade de arte está agora disponível aos usuários do sistema de
submissão online. Para ajudar os autores a enviarem ilustrações de alta qualidade logo no início do
processo, esta ferramenta checa a arte submetida e outros tipos de contra as exigências delineadas nas
instruções aos autores disponíveis no endereço www.elsevier.com/arkworkinstructions. A ferramenta
de controle de qualidade checa a arte das figuras quando elas são enviadas pela primeira vez. Cada
arquivo/figura é checado somente uma vez, então somente novos arquivos submetidos serão checados.
Geral: Informação relacionada ao formatos da revista para a Arte e Ilustrações podem ser encontradas
no endereço www.elsevier.com/authors. Fotografias, cartas e diagramas devem ser nomeados como
Figuras(s) e devem ser numeradas consecutivamente em ordem em que são citadas no texto. Elas
devem acompanhar o manuscrito e não serem incluídas dentro do texto. Todas as cópias das
ilustrações devem ser marcadas claramente no verso da figura com o número da mesma e nome do
autor. Todas as figures devem possuir legenda. As legendas podem ser resumidas em um arquivo
separado.
Desenhos: Todas as letras, linhas de gráficos e pontos nos gráficos podem ser largas o suficiente e em
negrito para permitir a reprodução quando o diagram for reduzido para um tamanho adequado para a
inclusão no jornal. (Dye-line) impresses ou xérox não são adequadas para reprodução. Não use
nenhum tipo de sombra nas ilustrações modificadas no computador.
Fotografias: Fotografias originais devem ser fornecidas da maneira como serão reproduzidas (por
exemplo: em preto e branco ou colorida). Se necessário, uma escala deve marcar a fotografia. Por
favor note que xérox das fotografias não serão aceitas.
Cores: Certas ilustrações serão aprovadas para publicação coloridas mas somente se na opnião do
Editor, seja conveniente que as figures não apareçam monocromáticas.
Por favor observe que se as figures forem fornecidas em cores, elas irão automaticamente estar
disponíveis online em cores sem carga (taxa) (at no extra charge), mesmo se a versão da impressão é
monocromática
Tabelas: Tabelas devem ser numeradas consecutivamente e devem possuir uma legenda adequada,
sendo digitadas em um arquivo separado do texto. Notas de rodapé devem ser digitadas abaixo da
76
tabela e devem ser citadas por letras minúsculas superscritas. Linhas verticais não devem ser usadas.
Tabelas não devem duplicar resultados presentes em qualquer lugar do manuscrito. (por exemplo, em
gráficos).
Aceitação
Após a aceitação do trabalho, poderemos solicitar aos autores providenciar versões eletrônicas ou em
CD (disquete) do artigo e das figuras. A cópia eletrônica, no disquete, CD-ROM ou ZIP, deve
corresponder exatamente ao artigo, assim sempre manteremos um backup do arquivo eletrônico para
referência e por segurança. Detalhes completos da submissão e formatos podem ser obtidos no
endereço www.elsevier.com/authors .
Submissões em disco rígido
Os autores devem submeter uma cópia eletrônica da versão final do artigo. A cópia eletrônica
deve corresponder exatamente ao conteúdo do disco rígido. Sempre mantenha uma cópia backup
do arquivo eletrônico para referência e segurança. Detalhes completes da submissão e formatos podem
ser obtidos nos Serviços para os Autores em Elsevier.
Provas
As provas serão enviadas ao autor (o primeiro autor nomeado se nenhum outro for identificado como
autor para correspondência) em PDF quando possível e deve ser devolvido dentro de 48 horas do
recebimento, preferencialmente por e-mail. Correções podem estar restritas a erros de digitação;
qualquer outras alterações feitas serão cobradas dos autores. Qualquer questões devem ser respondidas
por completo. A Elsevier fará tudo que for possível para publicar seu artigo corrigido o mais rápido
possível. Portanto, é importante garantir que todas as suas correções foram encaminhadas a nós via e-
mail ou fax. Correções adicionais subseqüentes não serão possível, então por favor certifique-se que a
sua primeira comunicação está completa. Se preferir enviar suas correções pelo correio, por favor
responda para os eguinte endereço: Log-in Department, Elsevier, Stover Court, Bampfylde Street,
Exeter, Devon EX1 2AH, UK.
Offprints
Vinte cópias serão fornecidas livres de cobrança. Cópias da edição poderão ser pedidas numa taxa
especial usando o formulário enviado para o autor para correspondência após o manuscrito ter sido
aceito. Pedidos realizados tardiamente (após a publicação) paraTwenty-five offprints will be supplied
free of charge. Offprints and copies of the issue can be ordered at a specially reduced rate using the
order form sent to the corresponding author after the manuscript has been accepted. Orders placed late
(after publication) for reimpressões irão incorrer em cobrança adicional de 50%.
Direitos Autorais
Todos os autores devem assinar o acordo de “Transferência de Direitos Autorais” antes que o artigo
possa ser publicado. Esse acordo de transferência habilita a Elsevier Ltd na proteção dos direitos
autorais do material para os autores, mas não renuncia aos direitos de propriedade dos autores. A
transferência dos direitos cobre a exclusividade de reproduzir e distribuir o artigo, incluindo
reimpressões, reproduções fotográficas, microfilmes, ou qualquer outra forma de reprodução de
natureza similar e traduções.
Inclui o direito de adaptar o artigo para uso em conjunção com sistemas de computadores e programas,
incluindo reprodução da publicação em máquinas de forma legível e incorporação em sistemas de
recuperação. Autores são responsáveis pela obtenção dos direitos autorais para reproduzir qualquer
figura para as quais existem direitos autorais.
Informações para os autores
Para informações relacionadas à submissão dos artigos (incluindo submissão eletrônica quando
disponível) por favor visite o site www.elsevier.com/authors. Este website fornece informações na
submissão dos artigos bem como guia detalhado da arte (figures), orientações, informação dos direitos
autorais, perguntas mais freqüentes e mais.
Detalhes de contato para questões após a aceitação de um artigo, especialmente aqueles relacionado às
provas, serão fornecidos após registro do artigo para publicação.
77
Autorizo a reprodução deste trabalho.
Araçatuba, 10 de dezembro de 2007.
Thais Mara Manfrin
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Thais Mara Manfrin
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