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MARCELO DE MEIRA SANTOS LIMA
ESTUDO DA PARTICIPAÇÃO DA CICLOOXIGENASE-2 EM
MODELOS ANIMAIS DE PARKINSONISMO
CURITIBA
2005
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-Graduação em Farmacologia,
Setor de Ciências Biológicas,
Universidade Federal do Paraná, como
requisito parcial à obtenção do título de
Mestre em Farmacologia.
Orientadora: Profª. Drª. Maria
Aparecida Barbato Frazão Vital.
Co-orientador: Prof. Dr. Hidevaldo
Bueno Machado.
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iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por nos dotar de capacidade para tentarmos compreender
sua criação, e chamarmos a isso de ciência.
Agradeço a vida de todos os animais utilizados neste trabalho, e dizer que
elas não foram tiradas em vão e sim para um bem maior.
Agradeço a minha esposa Ângela por estar a meu lado em todos os
momentos, me amando e me dando força. Sem você seria impossível.
Agradeço a meus pais João e Irene por me educarem e amarem, permitindo
e incentivando, desde minha infância, que eu fizesse com dedicação aquilo
que eu amo.
Agradeço a minha orientadora e amiga Profa. Dra. Maria Vital pela
orientação e confiança, mesmo quando os experimentos teimavam em não
funcionar. Você é um grande exemplo.
Agradeço ao meu co-orientador Prof. Dr. Hidevaldo Bueno Machado que
mesmo estando em outro continente sempre esteve presente em nosso
trabalho.
Agradeço ao Prof. Dr. Sívio Marques Zanata pela amizade, bom humor e
disponibilidade em nos auxiliar, sempre com seu laboratório de portas
abertas.
Agradeço a todos os professores do Departamento de Farmacologia pelos
grandes exemplos de profissionalismo, amor à ciência e doação pessoal. Em
especial ao Prof. Dr. Roberto Andreatini e Prof. Dr. Cláudio da Cunha, que
me acolheram como a um orientado, participando com grandes idéias e
sugestões neste trabalho.
Agradeço aos funcionários do Departamento de Farmacologia, inclusive aos
da limpeza, pois eles nos possibilitam condições adequadas de trabalho e são
parte dele.
Agradeço a todos os meus amigos pós-graduandos, tanto do
Departamento de Farmacologia, quanto do Departamento de Patologia
Básica (lab. Prof. Dr. Zanata). Vocês fazem parte deste trabalho. Agradeço ao
CNPq por proporcionar suporte financeiro para a realização deste trabalho.
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iv
SUMÁRIO
SUMÁRIO..................................................................................................................ii
LISTA DE ABREVIATURAS....................................................................................vii
LISTA DE FIGURAS................................................................................................ix
RESUMO..................................................................................................................xi
ABSTRACT............................................................................................................xiv
1. INTRODUÇÃO...............................................................................................1
1.1.
D
OENÇA DE
P
ARKINSON
.......................................................................................1
1.2.
A
LTERAÇÕES COGNITIVAS E
D
OENÇA DE
P
ARKINSON
..............................................2
1.3.
E
TIOLOGIA
...........................................................................................................3
1.4.
I
NFLUÊNCIA DO PROCESSO INFLAMATÓRIO NA
D
OENÇA DE
P
ARKINSON
.....................4
1.4.1.
Características estruturais das enzimas COX-1 e COX-2........................7
1.4.2.
COX-2 um modulador neuronal multifuncional..........................................8
1.4.3. Cascatas regulatórias.............................................................................10
1.4.4. A reação neuroinflamatória em pacientes parkinsonianos.....................13
1.4.5.
Antiinflamatórios......................................................................................14
1.5. M
ODELOS ANIMAIS DA DOEMÇA DE
P
ARKINSON
.................................................16
1.5.1. MPTP .................................................................................................. 16
1.5.2. 6-OHDA.................................................................................................18
1.5.3. LPS ...................................................................................................... 20
2. OBJETIVOS.................................................................................................21
2.1. O
JETIVO GERAL
.............................................................................................21
2.2.
O
BJETIVOS
E
SPECÍFICOS
................................................................................21
v
3.
METODOLOGIA…………………………………………………………………22
3.1.
A
NIMAIS
…………………………………………………………………………….22
3.2.
D
ROGAS
…………………………………………………………………………....22
3.3.
C
IRURGIA
E
STEREOTÁXICA
………………………………………………………...22
3.4. T
RATAMENTO
F
ARMACOLÓGICO
………………………………………………..…23
3.5.
O
BSERVAÇÕES
C
OMPORTAMENTAIS
………………………………………………24
3.5.1. Campo aberto………………………………………………………………...24
3.6. E
NSAIOS
B
IOQUÍMICOS
……………………………………………………………..25
3.6.1.
Extração de proteínas…….……………………………………….…………25
3.6.2. Dosagem de proteínas…………….....……………………………………..25
3.6.3. Precipitação de proteínas…………………………………………………...25
3.6.4.
Western blotting………………………………………………………………26
3.7.
A
NÁLISE DENSITOMÉTRICA
……………...................………..…………………..26
3.8.
A
NÁLISE ESTATÍSTICA
…………………………………………………………….27
4.
RESULTADOS
……………………………………………................…………28
4.1.
C
OMPARAÇÃO ENTRE MODELOS ANIMAIS
:
LPS,
MPTP
E
6-OHDA…………...…28
4.1.1. Análise comportamental (Campo aberto)..............…………........………28
4.1.2. Perfil de expressão de COX-2 induzida por LPS, MPTP e 6-OHDA......32
4.1.3. Tratamento com indometacina dos animais lesados por MPTP………..40
5. DISCUSSÃO...............................................................................................44
6. CONCLUSÕES ..........................................................................................50
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................52
8. ANEXO.........................................................................................................63
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
ACh - Acetilcolina
AINE - Antiinflamatório não esteroidal
AIE - Antiinflamatório esteroidal
ATV - Área tegmental ventral
COX-1 - Ciclooxigenase tipo 1
COX-2 - Ciclooxigenase tipo 2
DA - Dopamina
DOPAC - Ácido 3,4-dihidroxifenilacético
DP - Doença de Parkinson
HVA - Ácido homovanílico
HOX - Endoperoxidase
Ig - Imunoglobulina
IL-1 - Interleucina 1
iNOS - Óxido nítrico sintetase indutível
vii
INF-γ - Interferon-γ
LPS - Lipopolissacarídeo
MPTP - 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina
MPP
+ -
1-metil-4-fenilpiridina
NA - Noradrenalina
NO - Óxido nítrico
PGE
2
-
Prostaglandina E
2
ROS - Espécies reativas do oxigênio
SNpc - Substância Negra parte compacta
TCA - Ácido tricloroacético
TNF- α - Fator de necrose tumoral-α
TH - Tirosina Hidroxilase
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Neuroinflamação constitui-se como um componente responsável pela
degeneração dos neurônios dopaminérgicos na DP................................................6
Figura 2: Diferenças estruturais entre as enzimas COX-1 e COX-2.......................8
Figura 3: Via de biossíntese de prostaglandinas...................................................12
Figura 4: Representação esquemática do metabolismo do MPTP e das vias do
MPP
+
intracelular ...................................................................................................17
Figura 5: Campo aberto.........................................................................................24
Figura 6: Comparação entre os tempos de latência de grupos lesados por MPTP,
6-OHDA e LPS........................................................................................................27
Figura 7: Comparação entre as freqüências de locomoção de grupos lesados por
MPTP, 6-OHDA e LPS............................................................................................28
Figura 8: Comparação entre as freqüências de levantar de grupos lesados por
MPTP, 6-OHDA e LPS............................................................................................29
Figura 9: Comparação entre os tempos de imobilidade de grupos lesados por
MPTP, 6-OHDA e LPS............................................................................................30
Figura 10: Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 na SN após procedimento Sham................................................................31
Figura 11: Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 no estriado após procedimento Sham........................................................32
ix
Figura 12: Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 na SN após infusão de LPS........................................................................33
Figura 13: Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 no estriado após infusão de LPS................................................................34
Figura 14: Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 na SN após infusão de MPTP.....................................................................35
Figura 15: Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 no estriado após infusão de MPTP.............................................................36
Figura 16: Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e COX-1 na SN
após infusão de 6-OHDA........................................................................................37
Figura 17: Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 no estriado após infusão de 6-OHDA.........................................................38
Figura 18: Efeitos da administração de IND no tempo de latência de ratos tratados
com MPTP e submetidos ao campo aberto............................................................39
Figura 19: Efeitos da administração de IND na freqüência de locomoção de ratos
tratados com MPTP e submetidos ao campo aberto..............................................40
Figura 20: Efeitos da administração de IND na freqüência de levantar de ratos
tratados com MPTP e submetidos ao campo aberto..............................................41
Figura 21: Efeitos da administração de IND no tempo de imobilidade de ratos
tratados com MPTP e submetidos ao campo aberto..............................................42
x
RESUMO
A doença de Parkinson (DP) é uma das mais comuns patologias
neurodegenerativas. Diversas evidências dão suporte há existência de
mecanismos relacionados à inflamação encefálica (neuroinflamação) em
pacientes com DP.
A DP assim como seus modelos animais induzidos por 1-metil-4-fenil-
1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP), 6-hidroxidopamina (6-OHDA) e
lipopolissacarídeo (LPS) possuem como característica induzirem o aumento da
expressão da enzima ciclooxigenase tipo 2 (COX-2). A expressão aumentada
desta enzima tem sido observada em neurônios lesados e degenerados, o que
sugere que a COX-2 contribua para o dano neuronal. Observamos que o LPS
gerou aumento dos parâmetros exploratórios, enquanto que MPTP e 6-OHDA
apresentaram efeitos prejudiciais nesta função. Também verificamos que o LPS
gerou aumento de expressão de COX-2, na SN, 8 e 16 h após sua infusão. Já o
MPTP provocou o aumento de expressão 16 h após sua infusão, enquanto que a
6-OHDA demonstrou maior intensidade nesse efeito, suscitando a indução de
COX-2 de 4 a 24 h após a cirurgia. Não observamos qualquer variação
significativa na expressão de COX-2 no estriado dos animais. Sugerimos que o
LPS configurou-se como um modelo adequado da DP, do ponto de vista
neuroinflamatório, por outro lado não gerou prejuízos motores. MPTP e 6-OHDA
produziram alterações motoras e inflamatórias, de maneira tempo dependente.
Visando compreender melhor os mecanismos da doença, utilizamos a
indometacina no modelo do MPTP. Foi observado, 24 h após a infusão da
neurotoxina, um possível efeito neuroprotetor. No entanto, 7 dias após verificou-se
um prejuízo motor sugerindo alguma modulação na função dopaminérgica.
Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que a neuroinflamção está
presente nestes modelos animais de parkinsonismo. Mais ainda, o uso de
antiinflamatórios deve ser melhor investigado para entender a participação destas
drogas como possíveis agentes terapêuticos.
xi
ABSTRACT
Parkinson’s disease (PD) is the one of the most commons
neurodegenerative disorders. Several evidences indicated the existence of
neuroinflammatory mechanisms, both in animal models and in human patients.
One common characteristic shared between MPTP, 6-OHDA, LPS PD
models, and the disease is the ciclooxigenase-2 (COX-2) up-regulation in the
brain. The increase on COX-2 expression has been reported in deleterious
processes witch leads the brain tissue to a neuronal damage. According to this, we
investigated the participation of COX-2 in the three different PD models described
previously.
Our results indicated that LPS caused an induction increase of COX-2, in
the SN, 8 and 16 h after the infusion. Besides, MPTP provoked that kind o
increase, 16 h after their infusion, in addition, 6-OHDA demonstrated more
intensity in that effect, with increased of COX-2 expression observed between 4 to
24 h after surgery. In the other hand, we did not detected variation on the COX-2
expression in the striatum of the rats.
Behavioral analyses, made for each tested model in the open field, shown
that LPS induced an increase in the exploratory parameters, in an opposite way,
MPTP and 6-OHDA evoked an impairment in that function.
Taken together, we suggest that LPS configurate as an adequate PD model,
according to the neuroinflammatory point of view, nevertheless, LPS could not
mimic the locomotor impairment associated with the disease. MPTP, and 6-OHDA
models, satisfied both criteria: induction of COX-2 expression, in a time dependent
manner, and reduction of locomotor activity.
We also tested indomethacin 10 mg/kg one hour before the surgery
prevented the locomotor impairment elicit by MPTP, otherwise, a daily treatment
was initiated (1 mg/kg) 24 h after surgery until seven days after, with a marked
reduction of locomotor in the seven day. We suggest an interaction of
indomethacin in the dopaminergic function of the rats, causing initially a beneficial
effect, and finally impairment, observed seven days after the infusion of MPTP.
xii
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Doença de Parkinson
A doença de Parkinson (DP) é uma patologia neurodegenerativa
progressiva que primariamente é caracterizada por uma degeneração dos
neurônios dopaminérgicos da substância negra parte compacta (SNpc),
evidenciada macroscopicamente por uma despigmentação na porção ventrolateral
desta estrutura (LANG e LOZANO, 1998; DUNNETT & BJORKLUND, 1999).
As características patológicas são referentes à perda de neurônios
dopaminérgicos no estriado levando a uma depleção de dopamina (DA), bem
como de seus metabólitos como o ácido homovanílico (HVA) e ácido 3,4-
dihidroxifenilacético (DOPAC) (LANG & LOZANO, 1998; DUNNETT &
BJORKLUND, 1999). Outra característica patológica importante é a presença de
inclusões eosinofílicas intracitoplasmáticas, constituídas por várias estruturas de
natureza protéica, denominadas corpos de Lewy (SHASTRY, 2001).
Em pacientes parkinsonianos, além do decréscimo de DA na via
nigroestriatal, pode ocorrer também degeneração de neurônios dopaminérgicos na
área tegmental ventral (ATV) (AGID et al., 1990), redução de noradrenalina (NA)
nos neurônios do locus coeruleus (STOFF et al., 1999), perda de serotonina (5-
HT) no núcleo da rafe e redução de acetilcolina (ACh) no núcleo basal de Meynert
(CANDY et al., 1983).
O completo desenvolvimento da DP é definido por uma tríade de sinais tais
como acinesia, rigidez e tremor muscular levando a instabilidade postural, no
entanto, nem sempre se observa igual magnitude de manifestações. Estes sinais
cardinais podem ser acompanhados por anormalidades posturais, sintomas
vegetativos (aumento da salivação, seborréia, constipação, rubor, sudorese e
distúrbios circulatórios), e distúrbios psico-orgânicos como depressão e demência
(GERLACH & RIEDERER, 1996). O aparecimento desses sinais clínicos pode ser
explicado pelas principais alterações morfológicas encontradas em cérebros
2
autopsiados de pacientes que sofriam de DP. Ou seja, esses pacientes
apresentaram 60-75% de perda de neurônios dopaminérgicos na SNpc
(JELLINGER, 1988). Por outro lado, pacientes com DP que manifestaram
previamente quadros de demência, apresentaram 60-77% de perda de neurônios
colinérgicos presentes no núcleo basal de Meynert, em comparação com
indivíduos de igual idade, porém sem sintomas neurológicos ou fisiológicos
aparentes (JELLINGER, 1991).
1.2. Alterações cognitivas e Doença de Parkinson
Além das alterações motoras e autonômicas, já foi demonstrado que os
pacientes com DP apresentam redução dos processos cognitivos (LINDNER et al.,
1999). Segundo DUBOIS e PILLON (1997), a demência é encontrada em 15-20%
dos casos de DP idiopático. Além disso, testes realizados com pacientes
parkinsonianos verificaram a presença de quadros de depressão e ansiedade que
provavelmente estão associados ao curso da doença (VALLDEORIOLA et al.,
1997).
Enquanto a DP é tradicionalmente descrita como um distúrbio motor,
atualmente sabe-se que os sintomas não motores contribuem para a
incapacitação dos pacientes. A deficiência cognitiva é um sintoma comum em
pacientes com DP e tem sido frequentemente descrita nos estágios iniciais da
doença quando as alterações motoras ainda não são evidentes (CALNE, 2001).
Os sintomas característicos da DP ocorrem somente após uma extensa
degeneração da via nigroestriatal, e estas alterações motoras são resultado de
uma progressiva perda neuronal associada a um declínio da neuroplasticidade e
de mecanismos compensatórios (GERLACH & RIEDERER, 1996).
As alterações cognitivas encontradas nos pacientes com DP envolvem
lentidão no processamento de informações e prejuízo na aquisição das memórias
a curto prazo (VALLDERIOLA et al., 1997).
3
1.3. Etiologia da DP
Apesar de vários esforços feitos para esclarecer a origem da doença sua
etiologia permanece um mistério, dificultando desta forma a prevenção de sua
ocorrência (HUNOT et al., 2001; FERGER & TEISMANN, 2001).
De 5 a 10% dos casos da DP observa-se ligação entre a ocorrência da
doença e mutações em um pequeno número de genes (forma familiar) (VILA &
PRZEDBORSKI, 2004; HALD & LOTHARIUS, 2005).
Mutações na α-sinucleína são herdadas de maneira autossômica
dependente, e as formas mutantes desta proteína apresentam uma ação tóxica
nas células dopaminérgicas (DAWSON & DAWSON, 2003; ERIKSEN et al., 2005).
Uma completa supressão da α-sinucleína não resulta no desenvolvimento do
fenótipo da DP (ERIKSEN et al., 2005). Além do mais, CHANDRA et al., (2004),
demonstraram que a redução dos níveis da α-sinucleína é terapeuticamente
possível, pois a redução da expressão desta proteína em camundongos é bem
tolerada. A redução da expressão da α-sinucleína foi benéfica, pois preveniu a
neurotoxicidade dopaminérgica mediada pelos altos níveis desta proteína
prevenindo também a neurotoxicidade pela neurotoxina 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-
tetraidropiridina (MPTP) em camundongos (DAUER, 2002).
Tem-se demonstrado que a forma monogênica do parkinsonismo causado
por mutações da parkina, uma proteína responsável pela via de ubiquitinização e
degradação de proteínas associadas a formação de corpúsculos de Lewy,
representa uma importante causa do parkinsonismo precoce sem histórico
familiar, especialmente antes dos 30 anos de idade (Dawson, 2000). Entretanto,
mesmo quando o início dos sintomas ocorre entre idades de 30 e 45 anos, a
parkina ainda é responsável por 8% dos casos isolados de parkinsonismo. O
fenótipo gerado pela parkina é variável, porém não pode ser distinguido de casos
não derivados dela (PERIQUET et al., 2003).
Apesar das diferentes características clínicas e patológicas das formas de
manifestações da DP, ambas apresentam as mesmas anormalidades bioquímicas,
4
principalmente em relação à depleção do conteúdo de DA mesencefálico
(PRZEDBORSKI, 2005).
Teoricamente, a neurodegeneração progressiva pode ser provocada por
uma exposição crônica a neurotoxinas dopaminérgicas, ou por uma breve
exposição que leva ao início de uma cascata de eventos deletérios (DAUER &
PRZEDBORSKI, 2003). O fato de que um grupo de jovens intoxicados com MPTP
desenvolveu uma síndrome semelhante à DP (LANGSTON, 1983) é um exemplo
de como uma toxina exógena pode mimetizar as características clínicas e
patológicas da doença. Além do MPTP, alguns fatores ambientais e ocupacionais
como o herbicida paraquat, que é similar estruturalmente ao MPP
+
(1-metil-4-
fenilpiridina) (MPP
+
é o metabólito ativo do MPTP) e o inseticida rotenona, que
apresenta toxicidade mitocondrial semelhante ao MPP
+
, são largamente utilizados
e distribuídos no meio-ambiente e estão associados com um aumento da
prevalência da doença (GORELL et al, 2004).
TANNER (1992) demonstrou em estudos epidemiológicos em humanos,
que há um aumento no risco de desenvolvimento da DP em residentes rurais
expostos a herbicidas e pesticidas. Por outro lado, HERNAN et al., (2002)
demonstram que fumantes e bebedores de café estão inversamente associados
com o risco de desenvolver a doença. Reforçando desta maneira o conceito de
que fatores ambientais podem interferir na susceptilidade do desenvolvimento da
DP (DAUER & PRZEDBORSKI, 2003).
Outra possibilidade para a causa, além das hipóteses genéticas e
ambientais, é a neurodegeneração causada por toxinas endógenas, que podem
ser originadas em virtude de erros em algumas vias metabólicas e que fatores,
incluindo a inflamação, também estariam envolvidos na patogênese da doença
(SAIRAM et al., 2002).
1.4. Influência do processo inflamatório na Doença de Parkinson
A inflamação é a primeira linha de defesa do organismo contra injúrias
teciduais ou infecções, no entanto, uma resposta inflamatória excessiva pode
5
tornar-se fonte de uma lesão tecidual ainda maior do que a provocada pelo
estímulo inicial. Os neurônios, como resultado de uma grande diferenciação
celular, apresentam pouca ou nenhuma habilidade em se dividirem além de uma
fraca capacidade de recuperação frente a lesões, tornam-se, portanto
extremamente vulneráveis a processos auto-destrutivos, tais como os processos
imune e inflamatório (GAO et al., 2003). Diversas evidências dão suporte há
existência de mecanismos relacionados à inflamação encefálica (neuroinflamação)
em pacientes com DP. A etapa inicial dessa resposta ocorre pela ativação da
população das células da glia, mais especificamente microglia. Outros tipos
celulares como oligodendrócitos, que também compõe a população de células da
glia no encéfalo, não são implicados neste tipo de ativação. A microglia, que por
sua vez compõe o montante de células imunes residentes no encéfalo, é sensível
as menores variações de fatores neurotóxicos, citocinas inflamatórias, radicais
livres, aminoácidos excitatórios e proteases na SN, podendo tornar-se ativada
durante a maioria das condições neuropatológicas como doença de Alzheimer,
esclerose múltipla, AIDS, demência, traumas e DP (GAO et al., 2003).
A ativação da microglia contribui para o aumento do dano neuronal,
particularmente em doenças neurodegenerativas, onde a liberação de substâncias
pró-inflamatórias e neurotoxinas acaba por potencializar a lesão (GAO et al.,
2002). As substâncias responsáveis por essa cadeia de eventos incluem citocinas
pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral α (TNF-α), interleucina 1 (IL-1),
espécies reativas do oxigênio (ROS), eicosanóides e aminoácidos excitatórios .
No entanto muitos aspectos de uma inflamação são essenciais para o
combate de uma doença. Diferentes populações de células da glia auxiliam na
remoção de restos celulares, destruição de patógenos e liberação de fatores
neurotróficos. Ou seja, a ativação da microglia pode fazer com que seja
desempenhado um papel neuroprotetor através da promoção da sobrevivência
neuronal, recuperação de neurônios lesados, eliminação de substâncias tóxicas e
reparação tecidual (Figura 1).
6
Figura 1: Neuroinflamação constitui-se como um componente responsável pela
degeneração dos neurônios dopaminérgicos na DP. Notar o papel dual da glia,
que por um lado pode ser benéfica ao tecido, e por outro, deletéria. (Adaptado de
GAO et al., 2003).
Agentes infecciosos tais como bactérias, vírus, lipopolissacarídeos (LPS), e
toxinas ambientais (metais pesados e pesticidas) podem ativar diretamente a
microglia. A microglia ativada libera uma gama de neurotoxinas que
subsequentemente induzem inflamação e posterior morte celular neuronal. No
entanto, acredita-se que uma pré-disposição genética, somada ou não a presença
de neurotoxinas ambientais, disparariam processos que acarretam em lesões
neuronais. A morte neuronal é uma conseqüência das lesões inflamatórias ou das
Pré
-
disposição genética
Agentes ambientais
Ativação
glial
Agentes infecciosos
(bactérias, vírus)
Morte
neuronal
Ativação
microglial
* Citocinas
inflamatórias
Astrogliose
reativa
- Liberação de fatores neurotróficos
- Eliminação de substâncias tóxicas
- Promoção de reparo tecidual
-Liberação de citocinas inflamtórias
* Liberação de fatores neurotóxicos
citocinas inflamatórias (TNF-α, IL-1),
radicais livres (NO°, O
2-,
-
OH),
eicosanóides, aminoácidos excitatórios
- agentes
infecciosos
- metais pesados
- pesticidas
Reativação
microglial
7
lesões neuronais diretas, que por sua vez também estimulam uma resposta
inflamatória incluindo microgliose e astrogliose. A microgliose pode resultar em
novos danos neuronais. A astrogliose pode exacerbar os danos devido à presença
de citocinas pró-inflamatórias. Portanto o dano neuronal e a neuroinflamação
amplificam-se mutuamente, formando um círculo vicioso (GAO et al., 2003).
A DP, assim como seu modelo animal induzido por MPTP, possuem como
característica a indução do aumento da expressão da enzima ciclooxigenase tipo
2 (COX-2), que por sua vez catalisa a produção de prostaglandina E
2
(PGE
2
)
(TEISMANN et al., 2003).
De acordo com essa premissa, processos inflamatórios associados ao
aumento da expressão de COX-2 e, portanto, níveis elevados de PGE
2
,
relacionam-se a eventos deletérios levando a neurodegeneração em várias
condições patológicas (NOGAWA et al., 1997; ALMER et al., 2001;
ANDREASSON et al., 2001).
1.4.1. Características estruturais das enzimas COX-1 e COX-2
A enzima prostaglandina G
2
/H
2
sintetase catalisa a conversão do ácido
araquidônico em intermediários (prostaglandinas endoperóxidos) PGG
2
e PGH
2
.
Essa proteína bifuncional apresenta tanto atividade de ciclooxigenase (COX)
quanto de hidroperoxidase (HOX), sendo coloquialmente chamada de
ciclooxigenase (COX). Drogas como aspirina, um tradicional antiinflamatório não
esteroidal (AINE), inibem a atividade PGG
2
/H
2
sintetases-1 e –2, similarmente,
inibidores seletivos de COX-2 preferencialmente inibem a função PGG
2
/H
2
sintetase-2 (Figura 2) (BAZAN, 2001).
8
Figura 2: Diferenças estruturais entre as enzimas COX-1 e COX-2. A gravura da
esquerda mostra um diagrama esquemático do sítio de ligação de AINES da COX-
1. Uma região altamente conservada Arg120 e Tyr355 (1 e 8) estabiliza o grupo
carboxilato que está presente na maioria dos AINEs. O resíduo Tyr385 está
próximo ao sítio peroxidase que forma um radical tirosil que é crucial para a
introdução do oxigênio molecular no ácido araquidônico (substrato). A gravura da
direita mostra o sítio de ligação da COX-2. Os resíduos altamente conservados (1
e 8) são mostrados como anteriormente. O resíduo 2 é constituído por Val523 na
COX-2 que por sua vez permite uma ramificação na molécula. Essa ramificação
pode acomodar grupos análogos aos inibidores da COX-2, que são estabilizados
pela ligação ao hidrogênio ao resíduo 7 (Arg513). De maneira geral o espaço
disponível na ramificação, presente na COX-2 é 25% maior que o sítio de ligação
na COX-1 (Adaptado de: (BAZAN, 2001)).
1.4.2. COX-2 um modulador neuronal multifuncional.
Muitas questões permanecem obscuras a respeito do significado da COX-2
neuronal. Uma destas questões recai sobre onde estão as diferenças entre as
formas fisiológica e patológica da enzima. Em contraste com a indução patológica
da COX-2, que ocorre em diversos órgãos, no cérebro sua expressão acontece
sob condições fisiológicas normais. Observa-se elevação dos níveis de COX-2
neuronal durante o desenvolvimento e remodelação da atividade sináptica. Ou
seja, um aumento na quantidade dessa enzima pode ser visualizado em situações
de maior atividade sináptica, porém não se sabe exatamente se esse aumento é
um produto de uma superexpressão da enzima, ou se já há um transcrito pronto
9
para dar origem a uma maior quantidade do produto protéico então formado
(Yamagata et al., 1993). De fato, há uma elevação muito acima dos níveis normais
de COX-2, que em situação normal se encontra praticamente fora do alcance de
detecção de métodos convencionais, para atingir níveis extremamente elevados, o
que é um forte indício a favor da hipótese de superexpressão (MARCHESELLI &
BAZAN, 1996).
O tecido neuronal produz IL1-β em resposta a inflamações periféricas, no
entanto, não está claro qual fator circulante realiza a comunicação entre a corrente
circulatória e o sistema nervoso central (BAZAN, 2001).
A enzima COX converte o ácido araquidônico em PGH
2
, este por sua vez é
precursor de PGE
2
e de muitos outros prostanóides. Em células eucarióticas há
duas principais isoformas dessa enzima, sendo que a COX-1 é expressa
constitutivamente e a COX-2 é prontamente induzida em tecidos inflamados. No
entanto ambas as isoformas da enzima sintetizam PGH
2
, porém a COX-1 envolve-
se primariamente na produção de prostanóides relevantes em processos
fisiológicos, enquanto que a COX-2 é majoritariamente responsável pela produção
de prostanóides ligados a eventos patológicos (O´BANNION, 1999).
A indução da expressão de COX-2 contribui para o processo
neurodegenerativo na DP, haja vista que em análises postmortem de encéfalos de
indivíduos portadores de DP, verificou-se a superexpressão de COX-2
especificamente nos núcleos da base. Corroborando a favor desse achado,
verificou-se o mesmo tipo de indução em modelos animais que tiveram a SNpc
lesada por MPTP (TEISMANN et al., 2003). O resultado fisiológico ou patológico
da ativação da COX-2 parece depender de seus níveis de expressão. Baixos
níveis de expressão da enzima são produzidos durante o funcionamento normal
das células, por outro lado, um aumento de expressão está associado a condições
patológicas. Uma crise epiléptica causa um aumento de 10 vezes na expressão de
COX-2, sendo que uma condição de status epilepticus induzida pelo ácido kaínico
em modelos animais, resulta numa indução de 70 vezes da enzima no hipocampo
(BAZAN, 2001).
10
Além disso, a inativação genética (nocaute) ou farmacológica da enzima
óxido nítrico sintetase indutível (iNOS) reduziu a toxicidade induzida por MPTP.
Adicionalmente, a inativação de genes envolvidos na inflamação, como os que
codificam para COX-2, NADPH oxidase e receptores para TNF-α, protege os
neurônios dopaminérgicos contra a neurotoxicidade induzida por MPTP, indicando
que a inflamação é um importante componente dos processos neurodegenerativos
causados por MPTP (GAO et al., 2003). Ou seja, o significado de tais descobertas
torna a DP uma doença de caráter multifatorial, possuidora de uma enorme
versatilidade para desencadear processos lesivos às células nervosas, tanto
neurônios quanto glia, resultando quase que invariavelmente na destruição de
ambas. No entanto, ainda não podemos definir qual desses processos é o mais
importante, ou então qual é o inicialmente ativado. Mais independente disso,
sabemos com clareza que o processo neuroinflamatório é de suma importância na
cadeia de eventos deletérios. Tal fato sugere que o uso de drogas
antiinflamatórias seja útil na terapêutica, fato este que experimentalmente parece
fazer sentido.
Evidências experimentais indicam que a inibição do processo inflamatório
correlaciona-se com uma diminuição de lesões neuronais, fato este que suporta a
idéia de que a inflamação possui um papel reforçador da neurodegeneração na
DP (GAO et al., 2003). Sugere-se que a inibição da COX-2 seja um valioso
mecanismo para o desenvolvimento de novas terapias para DP, haja vista o papel
central desta enzima em todo o processo inflamatório (TEISMANN et al., 2003).
1.4.3. Cascatas regulatórias
Em teoria, ácidos graxos livres como o ácido araquidônico, podem ser
formados a partir de diversas fontes, no entanto, o araquidonato ligado a
fosfolipídio é provavelmente a fonte mais significante. Fosfolipases, em especial a
fosfolipase A
2
(cPLA2) citossólica, são enzimas altamente reguladas pela via da
MAP quinase (MAPK) que libera araquidonato, que por sua vez é transformado
pelo complexo da ciclooxigenase (COX). O mecanismo desta reação é complexo
11
(2 mols de oxigênio molecular são introduzidos sequencialmente por uma reação
da lipoxigenase, seguida pela reação da COX. Isto gera PGG
2
, uma 15-hidro-
peróxido prostaglandina, que é reduzida a PGH
2
, o produto hidróxi
correspondente. Estes intermediários apresentam pequena meia vida, e atividades
biológicas independentes. No entanto, ainda não está claro até onde esta
atividade independente é significativa in vivo. Uma bateria de enzimas transforma
PGH
2
em uma variedade de produtos, alguns destes como o tromboxano sintetase
(TX) e prostaciclina sintetase (PGI
2
) apresentam marcada localização tecidual (ex:
TX sintetase em plaquetas e PGI
2
sintetase no endotélio vascular) (FLOWER,
2003).
Os mediadores de maior destaque para o processo inflamatório são PGE
2
,
devido a sua importância na gênese do processo, gerando febre e dor, PGI
2
devido a seu efeito inibidor da agregação plaquetária e possível ação na
hiperalgesia e TXA
2
em virtude de sua importante atuação na agregação
plaquetária.
12
⊕
Figura 3: Via de biossíntese de prostaglandinas (Adaptado de: (BAZAN, 2001)).
Outros
araquidonatos
estereficados
Araquidonato
livre
Araquidonato
fosfolipídico
Mitogenos, citocinas e outros
estímulos.
Esterases
Fosfolipases
PGG
2
PGH
2
Complexo
Ciclooxigenase
TXA
2
PGF
2α
αα
α
PGE
2
PGD
2
PGI
2
Tromboxano
sintetase
Prostaciclina
sintetase
13
1.4.4. A reação neuroinflamatória em pacientes parkinsonianos
O termo inflamação é genericamente usado para descrever um acúmulo
local de fluidos, proteínas plasmáticas e células brancas do sangue, que é iniciado
por uma lesão física, infecção ou reação imune local (HUNOT et al., 2001).
Enquanto que respostas inflamatórias agudas denotam um rápido e
frequentemente transitório efeito, inflamações crônicas ocorrem quando há uma
infecção persistente, ou durante uma resposta auto-imune. Em estágios mais
avançados as vias efetoras imunológicas levam a inflamações crônicas, e
posteriores lesões teciduais.
Como citado anteriormente, efeitos lesivos no SNC, como os mediados por
respostas imunes, estão implicados na patogênese de doenças como a esclerose
múltipla. Nesta doença, a ativação de células microgliais, produtoras de citocinas
próinflamatórias (IFN-γ, TNF-α), por células T-CD4 infiltradas cronicamente está
envolvida com a morte celular de oligodendrócitos e subsequente desmielinização
de fibras nervosas, gerando os efeitos clínicos da doença (fraqueza muscular,
dificuldade de movimentação, etc) (HUNOT et al., 2001).
Na DP sugere-se que anormalidades imunológicas possibilitem a existência
de um caráter auto-imune à doença. Diversos estudos têm apontado
imunoglobulinas (Igs) reagindo com tecidos catecolaminérgicos, incluindo auto
anticorpos contra neurônios dopaminérgicos no fluido cefalorraquidiano e plasma
de pacientes portadores da DP (MCRAE-DEGUEURCE et al., 1986). No entanto,
os antígenos específicos para estas Igs ainda não se encontram claramente
caracterizados (HUNOT et al., 2001). Estudos com subgrupos de pacientes
parkinsonianos (sete de vinte e um casos) mostraram que estes exibiram uma
resposta específica com produção de IgG frente a proteínas dopamina-o-quinonas
modificadas, também conhecidas como quinoproteínas. Esta resposta pareceu ser
específica para a DP, pois não foi observada em pacientes com doença de
Alzheimer ou esclerose lateral amiotrófica. De forma significativa, uma resposta
similar foi observada em pacientes parkinsonianos que não foram tratados com L-
DOPA, indicando que a reatividade não poderia ser em decorrência da terapia, e
14
sim um fenômeno associado com o mecanismo primário da patogênese (ROWE et
al., 1998).
As primeiras evidências da neuroinflamação reportaram um aumento
significativo nos níveis de citocinas no estriado e fluido cefalorraquidiano de
pacientes parkinsonianos comparados com indivíduos controle. Essas citocinas
incluem TNF-α, IL1-β, IL-6, citocina associada à ativação de célula T (IL-2),
citocinas antiinflamatórias (IL-4) e diversos fatores de crescimento. Este aumento
nos níveis de citocinas, aparentemente, é específico para a via nigroestriatal não
sendo observado em regiões corticais, sugerindo que a produção de citocinas é
estritamente confinada à região da lesão (NAGATSU et al., 2000). Entretanto,
como a produção de citocinas no estriado não alcança a SN, onde os neurônios
dopaminérgicos degeneram na DP, este dado dificilmente pode indicar como esta
produção pode estar diretamente ligada à DP.
O que há de consenso é que as citocinas pró-inflamatórias são produzidas
na vizinhança dos neurônios dopaminérgicos devendo estar implicadas na
patogênese da doença (HUNOT et al., 2001).
1.4.5. Antiinflamatórios
O processo neuroinflamatório é caracterizado como um importante fator
que contribui ao processo neurodegenerativo crônico na DP, assim como em seus
modelos animais (MPTP, MPP
+
, 6-OHDA (6-hidroxidopamina)). De fato,
evidências experimentais demonstram que a inibição da resposta
neuroinflamatória, com o uso de drogas antiinflamatórias, pode ser uma estratégia
neuroprotetora, havendo atenuação da degeneração de neurônios
dopaminérgicos, observada experimentalmente (GAO et al., 2003).
O tratamento com drogas antiinflamatórias baseia-se na inibição da enzima
COX-2, haja vista que o aumento de expressão desta enzima acarrete num
recrudescimento dos processos deletérios aos neurônios (FERGER & TEISMANN,
2001). A dexametasona, um antiinflamatório esteroidal (AIE), tem sido descrita
com uma droga que possui atividade de inibir parcialmente a reação microglial,
15
levando a um decréscimo na produção de citocinas pró-inflamatórias e de óxido
nítrico (NO), o que resulta numa atenuação da lesão gerada por MPTP
(KURKOWSKA-JASTRZEBSKA et al., 1999) ou LPS (CASTANO et al., 2002). No
entanto há evidências contrárias ao possível efeito neuroproteror supostamente
conferido à dexametasona, no modelo animal do MPTP (AUBIN et al., 1998). Uma
eventual terapia a longo prazo, utilizando AIEs, tornar-se-ia limitada levando-se
em conta os efeitos colaterais (principalmente imunossupressão) dessa classe de
drogas. Tendo isso posto, o foco das possibilidades terapêuticas vira-se em
direção aos AINEs, drogas estas que apresentam um bom potencial neuroprotetor,
porém ainda a ser melhor explorado (GAO et al., 2003).
Agentes inibidores não seletivos da enzima COX, como o salicilato de
sódio, demonstraram atenuar significativamente a depleção dopaminérgica
induzida por MPP
+
em camundongos, sendo este um efeito independente de PGs,
e sim associado a inativação de radicais hidroxil (SAIRAM et al., 2003). Além
disso, sugere-se que inibidores da COX-2 bloqueiam a degeneração do conteúdo
de DA dos neurônios, induzida por MPTP (TEISMANN & FERGER, 2001) ou LPS
(ARAKI et al., 2001).
Entretanto nem todos estes efeitos neuroprotetores conferidos aos
inibidores seletivos da COX-2 (p.e. rofecoxib, parecoxib) estão associados à
diminuição da resposta neuroinflamatória, havendo também a existência de um
efeito anti-oxidante, conferido a estes agentes (TEISMANN et al. 2003). Até o
momento, não existem evidências clínicas dando suporte ao possível efeito
neuroprotetor dessas drogas, ou seja, ainda não se considera o fato de incluir um
antiinflamatório no leque de possibilidades terapêuticas disponíveis para o
tratamento da DP. Em oposição a isso, há estudos epidemiológicos que sugerem
a existência de um correlação entre o uso de AINEs e a redução na incidência de
casos da doença de Alzheimer (MCGEER & MCGEER, 2001).
16
1.5. Modelos animais da doença de Parkinson
Estudos in vivo, onde algumas das características relevantes da doença
podem ser mimetizadas, fornecem informações cruciais sobre os mecanismos da
doença e, além disso, proporcionam uma forma de avaliação de possíveis terapias
a serem empregadas. Desta forma, os modelos animais da DP podem ser úteis
tanto para o estudo da fisiopatologia como para a busca de novos tratamentos.
1.5.1 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP)
A neurotoxina MPTP foi descoberta em 1982 quando um grupo de
dependentes de drogas desenvolveu um parkinsonismo severo. A síndrome foi
causada por uma auto-administração de um análogo de heroína sintética, que por
sua vez continha como contaminante o MPTP, sendo este altamente lipossolúvel,
fato que lhe confere a grande capacidade de cruzar a barreira hemato-encefélica
(LANGSTON, 1983; BALLARD, 1985). Uma vez no encéfalo, a pró-toxina MPTP é
oxidada a 1-metil-4-fenil-2,3-dihidropiridium (MPDP
+
) pela MAO-B nas células da
glia e em neurônios serotoninérgicos. Em seguida, o MPDP
+
é convertido a MPP
+
(provavelmente por oxidação espontânea), essa molécula então, através de um
mecanismo desconhecido, atravessa o espaço extracelular. Como a molécula do
MPP
+
é polar, ela depende de carreadores de membrana plasmática para entrar
nas células. O MPP
+
é um substrato de alta afinidade para o transportador de
dopamina (DAT), bem como para o transportador de noradrenalina e serotonina
(PRZEDBORSKI et al, 2001; DAUER & PRZEDBORSKI, 2003).
17
Figura 4: Representação esquemática do metabolismo do MPTP e das vias do
MPP
+
intracelular. Retirado de: (DAUER & PRZEDBORSKI, 2003).
Dentro dos neurônios, o MPP
+
pode seguir por três rotas (Figura 4): (1)
Pode se ligar ao transportador vesicular da monoamina 2 (VMAT-2), que
transporta o MPP
+
para dentro das vesículas sinaptossomais ; esse seqüestro do
MPP
+
ocorre para proteger as células da neurodegeneração induzida por MPTP, a
toxina seqüestrada previne seu acesso à mitocôndria. (2) Pode se concentrar
dentro da mitocôndria; quando isso ocorre, o MPP
+
bloqueia o complexo I, que
interrompe a transferência de elétrons para a ubiquinona. Essa perturbação
aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e diminui a síntese
de adenosina trifosfato (ATP). (3) Pode permanecer no citossol, interagindo com
enzimas citossólicas, especialmente as que são carregadas negativamente
(DAUER & PRZEDBORSKI, 2003).
Camundongos que apresentam ausência do transportador de DA foram
protegidos da atividade neurotóxica do MPTP (SHIMOHAMA et al., 2003). Uma
vez absorvido o MPP
+
concentra-se nas mitocôndrias onde possui a capacidade
de inibir o complexo Ι da cadeia transportadora de elétrons, reduzindo assim a
geração de ATP e causando a produção de ROS, induzindo a apoptose dos
18
neurônios dopaminérgicos (KITAMURA, 2000; SPECIALE, 2002; KITAMURA,
2003).
Ocorrem, de maneira geral, variações de suscetibilidade ao MPTP, sendo
elas de caráter individual (de acordo com variações genéticas) ou referente à
idade. Portanto, diferentes métodos de administração da mesma dose de MPTP,
produzem diferentes resultados (GERLACH & RIEDERER, 1996).
1.5.2. 6-hidroxidopamina (6-OHDA)
A 6-OHDA foi o primeiro agente usado num modelo animal de
parkinsonismo. Aplicações de pequenas doses direto no ventrículo lateral (150
µg), ou em várias estruturas encefálicas (8 µg), levam a destruição seletiva dos
neurônios catecolaminérgicos (UNGERSTEDT, 1971). A maneira mais comum de
utilização, desta neurotoxina, envolve a injeção unilateral de 6-OHDA diretamente
na SN, haja vista que ela não atravessa a barreira hematoencefálica, levando a
rápida morte celular similar ao modelo do MPTP. Dessa forma a lesão ocorre em
decorrência da geração de radicais hidroxil e peróxido de hidrogênio, que
presumivelmente inicia-se devido a um metal de transição, como o ferro. A
confirmação do processo de formação de radicais livres, derivados do peróxido de
hidrogênio, fica evidente experimentalmente com a infusão intranigral de Ferro (ΙΙΙ)
que por sua vez produz efeitos neurotóxicos similares aos produzidos pela 6-
OHDA (BEN-SHACHAR & YODIM, 1991).
Demonstrou-se que ratos deficientes em ferro são resistentes à toxicidade da
6-OHDA (GLINKA et al., 1996). Estes estudos sugerem que um aumento de ferro
no encéfalo pode estar associado com a neurodegeneração da DP (KAUR &
ANDERSEN, 2004).
Pode-se, também, injetar a 6-OHDA diretamente no estriado, causando
assim uma degeneração retrógrada dos neurônios da SN. Isso gera uma lesão
parcial que progride lentamente ao longo das semanas, fato este que simula o
avanço progressivo da lesão na DP (BEAL, 2001). Devido à lesão, esses animais
apresentam comportamento motor assimétrico quando submetidos a um forte
19
estresse ou com a aplicação de agonistas de receptores da dopamina (GERLACH
& RIEDERER, 1996). Agonistas diretos, como apomorfina, provocam rotações
contra-laterais, enquanto que agonistas indiretos, tais como a anfetamina, que
induz a liberação de catecolaminas, produzem rotações ipsilaterais (GERLACH &
RIEDERER, 1996). Esse comportamento pode ser explicado pela hiperexpressão
dos receptores dopaminérgicos na porção lesada do estriado. Ou seja, as drogas
agonistas terão seu efeito potencializado pela supersensibilização dos receptores
(GERLACH & RIEDERER, 1996).
Esses achados experimentais com 6-OHDA foram descritos em ratos, no
entanto, outras espécies de roedores e de não roedores como macacos
apresentam o mesmo comportamento mediante exposição a esta neurotoxina
(GERLACH e RIEDERER, 1996).
Além da degeneração dopaminérgica causada pela neurotoxicidade da 6-
OHDA, essa toxina também gera uma resposta microglial associada à via
nigroestriatal (CICCHETTI., et al., 2002). Elevados níveis de TNF-α foram
observados tanto no estriado quanto na SN de ratos injetados com 6-OHDA
(MOGI et al., 1999). As maiores vantagens do uso desse modelo animal são para
a quantificação de déficit motor e a avaliação de efeitos antiparkinsonianos de
novas drogas (SHIMOHAMA et al., 2003). Ademais, também foi demonstrado que
ratos lesionados com 6-OHDA apresentaram prejuízos de memória (FERRO et al.,
2005), demonstrando também que o modelo produz alterações cognitivas em
animais.
20
1.5.3. Lipopolissacarídeo (LPS)
LPS é o imunoestimulante ativo presente na parede celular de bactérias
gram-negativas, sendo responsável por iniciar a cascata de eventos seguintes à
infecção bacteriana (HOLST et al., 1996), incluindo a produção de citocinas
(MATHISON et al., 1988). Estudos anteriores demonstraram que a infusão
intranigral de LPS foi capaz de reduzir significativamente os níveis estriatais de
DA, além de gerar morte em neurônios dopaminérgicos (CASTAÑO et al., 1998).
Outros trabalhos verificaram uma maior suscetibilidade dos neurônios da SNpc
frente a neurotoxicidade do LPS, em detrimento de neurônios de outras regiões
encefálicas (HERRERA et al., 2000; KIM et al., 2000). Dessa forma é possível
afirmar que o LPS pode ser considerado um modelo animal da DP, pois mimetiza
aspectos fisiopatológicos inerentes à doença, além de propiciar um ambiente de
níveis crescentes de estresse oxidativo aos neurônios, que por sua vez é um
fenômeno presente na doença.
Neste estudo utilizamos modelos animais que potencialmente devam
induzir o processo neuroinflamatório, para isso os modelos escolhidos foram: LPS,
MPTP e 6-OHDA. Os dois últimos estão bem estabelecidos na literatura como
bons modelos comportamentais da DP. No entanto não se sabe ao certo se estes
modelos mimetizam adequadamente o processo neuroinflamatório, e se este é por
si só capaz de levar a uma alteração motora. Para tanto utilizamos o LPS como
um controle positivo para o processo neuroinflamatório. Além disso, apesar de
alguns dados presentes na literatura, não há consenso quanto o papel do LPS
como um possível modelo comportamental para a DP.
Deste modo, o presente estudo pretende investigar a possível correlação
entre modelos animais de parkinsonismo e o aumento da expressão da COX-2 na
SN e no estriado de ratos.
21
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
O objetivo geral do presente estudo foi investigar a influência do processo
inflamatório em modelos animais de parkinsonismo induzidos por infusão
intranigral de MPTP, 6-OHDA e LPS.
2.2. Objetivos específicos
Verificar os efeitos da administração intranigral de MPTP, 6-OHDA e LPS
na atividade geral de ratos, utilizando o campo aberto.
Determinar o perfil de expressão, em diferentes tempos de observação, da
proteína COX-2 na SN e estriado de ratos tratados com as neurotoxinas
MPTP, 6-OHDA e LPS.
Determinar a existência ou ausência de uma relação entre o perfil de
expressão de COX-2, com os efeitos produzidos pelas neurotoxinas na
atividade geral.
Verificar os efeitos da administração intraperitoneal de antiinflamatórios
esteroidais (indometacina e piroxicam) na atividade geral de ratos tratados
com MPTP intranigral.
22
3. METODOLOGIA
3.1. Animais
Os animais utilizados foram ratos Wistar machos, de 3 meses de idade, da
mesma linhagem, obtidos através de cruzamentos sucessivos de matrizes
provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do Paraná (UFPR).
Os animais são mantidos em uma sala com temperatura controlada (22 ±
2°C), com ciclo de claro-escuro de 12h (7:00-19:00 h). Água e comida foram
fornecidas à vontade aos animais durante todos os experimentos.
3.2. Drogas
Solução salina (NaCl 0,9%) estéril;
MPTP (100µg/µL; Sigma Chemical Co., EUA), dissolvido em solução
salina (NaCl 0,9%) estéril;
6-OHDA (6µg/µL; Sigma Chemical Co., EUA), dissolvido em líquido
céfalo raquidiano (LCR) estéril;
LPS (2µg/µL; Escherichia coli, serotype 0111:B4 Sigma Chemical Co.,
EUA), dissolvido em solução salina (NaCl 0,9%) estéril;
Indometacina (Sigma Chemical Co., EUA), dissolvido em solução salina
(NaCl 0,9%) estéil;
3.3. Cirurgia Estereotáxica
Os animais submetidos à cirurgia estereotáxica foram inicialmente
anestesiados com Equitesin (0,3mg/kg – i.p.). Após a anestesia administrou-se
0,10 mL de penicilina G-procaína (20.000 U/0,05 mL – i.m.), sulfato de atropina
(0,4 mg/kg – i.p.) e o anestésico local (lidocaína 0,2 mL com 2% de vasoconstritor
– s.c.) na derme que recobre o crânio dos ratos.
23
Os ratos foram submetidos à cirurgia estereotáxica (estereotáxico -
David Kopf, modelo 957L) e receberam a microinfusão bilateral de MPTP, 6-OHDA
ou LPS diretamente na SN. Para a cirurgia foram utilizadas as seguintes
coordenadas estereotáxicas: antero-posterior (AP): 5.0 mm a partir do bregma;
médio-lateral (ML): ±2.1 mm a partir da linha média e dorso-ventral (DV): -7.7 mm
a partir da calota craniana e foram injetados um volume de 1 µl de neurotoxina
utilizando-se um fluxo de 0,33 µl/min.
A microinfusão de neurotoxina foi realizada com auxílio de uma agulha
(30 gauge) conectada a um tubo de polietileno adaptado a uma micro-seringa de
10 µL (Hamilton, EUA) que por sua vez, foi encaixada em uma bomba de infusão
(Harvard Apparatus, EUA). Após o término da microinfusão a agulha foi mantida
no local por mais 2 minutos para evitar refluxo da neurotoxina. Em seguida, o
escalpo foi suturado e os animais retirados do estereotáxico. Os ratos então foram
colocados em suas gaiolas de contenção.
Os animais do grupo Sham foram submetidos ao mesmo procedimento
cirúrgico. No entanto, os animais não receberam a neurotoxina, sendo somente
introduzida à agulha nas mesmas coordenadas estereotáxicas. Os ratos do grupo
controle não foram submetidos à cirurgia estereotáxica, mas foram retirados da
gaiola de moradia para manuseio durante alguns minutos. Os animais operados
com as diferentes neurotoxinas apresentaram boa recuperação pós-cirúrgica, não
havendo sido observado mortalidade estatisticamente significativa em nenhum dos
grupos.
3.4. Tratamento farmacológico
O AINE indometacina foi administrado 1h antes da cirurgia estereotáxica na
dose de 10 mg/kg e em intervalos de 24h na dose de 1 mg/kg, perfazendo 7 dias
de tratamento.
24
3.5. Observações comportamentais
3.5.1. Campo aberto
O campo aberto é um aparelho que consiste em uma arena de metal
circular com 97 centímetros de diâmetro e 32,5 centímetros de altura, pintada de
branco, com o chão dividido por linhas pretas em um círculo central e trapézios ao
redor deste, somando um total de 19 unidades. O campo aberto foi construído de
acordo com a descrição de BROADHURST, (1960).
Figura 5: Campo aberto.
Os animais foram submetidos a este teste após a cirurgia, os grupos
controles foram submetidos ao teste nas mesmas condições. Os animais foram
colocados no círculo central do campo aberto e seu comportamento foi avaliado
durante 5 minutos. Essa avaliação inclui quantificar os parâmetros de freqüência
de locomoção, freqüência de levantar, duração de imobilidade e tempo de latência
para o início do movimento. Cada animal foi avaliado individualmente sendo que o
aparelho foi limpo entre um animal e outro com solução de etanol 5%.
25
3.6. Ensaios bioquímicos
3.6.1. Extração de proteínas
Foram utilizados três animais por grupo para cada tempo analisado sendo
eles 4 h, 8 h, 16 h, 24 h, 3 e 7 dias após cirurgia esterotáxica. Após a decapitação
os encéfalos foram dissecados rapidamente para a retirada bilateral da SN e
estriado. Estas estruturas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido,
evitando assim a degradação de seus conteúdos protéicos. Após isso, os tecidos
isolados foram homogeneizado por sonicação em tampão de lise gelado (pH 7,4)
contendo 50 mM de Tris-HCl, 120 mM de NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,25%
deoxicolato de sódio, 0,25% de DTT, 20 µM de PMSF e tablete completo de
inibidor de proteases (Roche). O extrato foi então centrifugado a 10.000 x g, 4°C
por 20 minutos.
O sobrenadante corresponde ao extrato protéico total que por sua vez foi
pipetado e congelado a -80°C em alíquotas para posterior dosagem.
3.6.2. Dosagem de proteínas
A concentração de proteínas no extrato foi determinada pelo método de
Lowry (LOWRY et al. 1951). A dosagem de proteínas foi realizado após lise do
tecido (item 3.6.1). Uma solução de soro albumina bovina (1 mg/mL) foi utilizada
como padrão.
3.6.3. Precipitação de proteínas
Devido às baixas concentrações de proteínas totais obtidas, em virtude da
pequena massa de tecido utilizada nos ensaios, resolveu-se aplicar uma técnica
de precipitação de proteínas que empregou o ácido tricloroacético (TCA) a 10%
(The QIA expressionist., 2003). Nesse protocolo adicionou-se TCA 10% 1:1 em
relação às alíquotas das amostras de extrato protéico. As proteínas, mediante
26
baixa temperatura (4°C) precipitaram por 10 minutos. Após isso, centrifugou-se as
amostras a 10.000 x g, 4°C por 5 minutos, havendo formação de pellets de
proteínas. Esses pellets foram lavados por 2 vezes em acetona gelada,
novamente centrifugados nas mesmas condições e, então, a acetona foi
descartada, restando apenas os pellets que então foram secos ao ar e
ressuspensos em tampão de amostra 5 x. As amostras foram então sonicadas por
10 segundos (em gelo) e em seguida fervidas por 10 minutos para uma completa
desnaturação das proteínas. Após isso, as amostras foram centrifugadas por 10
segundos e aplicou-se o sobrenadante no gel de poliacrilamida-SDS a 10%.
3.6.4. Western blotting
Para o experimento de imunodetecção (western blotting), foi utilizada
metodologia padrão conforme descrito por SAMBROOK et al., 1989. De forma
breve, será descrito a seguir: amostras de 50 µg de proteína foram aplicadas em
gel de poliacrilamida-SDS a 10%. Após eletroforese, as proteínas foram
transferidas para membrana de PVDF, as quais foram reagidas com anticorpos
específicos contra COX-1 (1:100 sc-1754, Santa Cruz Biotechnology) e COX-2
(1:500 sc-1747, Santa Cruz Biotechnology), e a seguir com o anticorpo secundário
conjugado com peroxidase (donkey anti-goat IgG HRP 1:1000 sc-2033, Santa
Cruz Biotechnology). A visualização foi realizada com o sistema de
quimioluminescência (ECL, Santa Cruz Biotechnology).
3.7. Análise densitométrica
Utilizou-se filmes de raios-X Kodak T-MAT, revelador e fixador Kodak em
concentrações apropriadas. Após a revelação e secagem dos filmes, as bandas
foram quantificadas por análise computadorizada de imagem (com auxílio do
software ImageJ versão 1.32j http://rsb.info.nih.gov.ij/) onde a densidade ótica de
cada banda foi aferida. Inicialmente o sistema de análise calcula a média dos
valores de densidade ótica para a região delimitada pelo operador. Esta região
27
deve ter uma área suficiente para abrigar todas as bandas (uma de cada vez)
visíveis no filme, não devendo ser alterada, quando passa-se a analisar uma outra
banda. O valor final de intensidade relativa pode ser expresso de forma absoluta
ou como razão, quando comparada com a intensidade relativa de outras bandas.
3.8. Análise estatística
Para avaliar a atividade geral dos animais (campo aberto) foi utilizado a
ANOVA de Kruskall-Wallis. Para avaliar os ensaios de western blotting foi utilizado
ANOVA de uma via e quando esta mostra diferença significativa fez-se
comparações pareadas entre as médias utilizando teste post hoc de Newman-
Keuls. Considerou-se o nível de significância de 0,05 para que se rejeite a
hipótese de nulidade. O software INSTAT versão 3.06 (2003) foi empregado para
efetuar todas as análises.
28
4. RESULTADOS
4.1. Comparação entre modelos animais: LPS, MPTP e 6-OHDA.
4.1.1. Análise comportamental (campo aberto).
A figura 6 apresenta os dados referentes à comparação comportamental
entre os modelos animais de parkinsonismo, MPTP, 6-OHDA e LPS, frente ao
parâmetro de latência medido 24 h, 3 e 7 dias após cirurgia estereotáxica. A
ANOVA de uma via mostrou que o grupo 6-OHDA apresentou tempo de latência
aumentado em comparação a todos os demais grupos nos três dias testados
(P<0,001).
L a tên c ia
0
1 0
2 0
Não operado
S ham
MP TP
6-OHD A
LPS
24 h 3 dias 7 dias
Tempo de latência (s)
Figura 6: Comparação entre os tempos de latência de grupos lesados por MPTP,
6-OHDA e LPS. Os animais foram tratados com MPTP 100µg/µL, 6-OHDA 6 µg/µL
e LPS 2 µg/µL e analisados em campo aberto 24 h, 3 e 7 dias após a cirurgia
estereotáxica. Os valores representam à média ± S.E.M. (n = 10 por grupo).
P<0,001 comparado ao grupo controle não operado. Utilizou-se ANOVA de uma
via para medidas repetidas seguido pelo teste de Tukey.
29
A figura 7 ilustra os dados referentes à comparação comportamental entre
os modelos animais de parkinsonismo, MPTP, 6-OHDA e LPS, frente ao
parâmetro de locomoção medido 24 h, 3 e 7 dias após cirurgia estereotáxica. A
ANOVA mostrou que 24 h após houve redução significativa (P<0,05), no
parâmetro de locomoção, dos grupos MPTP e 6-OHDA em comparação aos
grupos não operado e sham. Já três dias após houve uma recuperação motora por
parte dos grupos MPTP e 6-OHDA. No sétimo dia o grupo MPTP apresentava
hiperlocomoção, em comparação ao grupo não operado (P<0,05), de maneira
semelhante ao grupo LPS que já apresentava hiperlocomoção no terceiro dia, em
comparação aos grupos: não operado, sham e 6-OHDA (P<0,05).
Locomoção
0
50
100
150
Não operado
Sham
MPTP
6-OHDA
LPS
24 h 3 dias 7 dias
Frequência de
locomoção
Figura 7: Comparação entre as freqüências de locomoção de grupos lesados por
MPTP, 6-OHDA e LPS. Os animais foram tratados com MPTP 100 µg/µL, 6-OHDA
6 µg/µL e LPS 2 µg/µL e analisados em campo aberto 24 h, 3 e 7 dias após a
cirurgia estereotáxica. Os valores representam a média ± S.E.M. (n = 10 por
grupo). P<0,05 comparado ao grupo controle não operado. Utilizou-se ANOVA
de uma via para medidas repetidas seguido pelo teste de Tukey.
30
A figura 8 mostra os dados referentes à comparação comportamental entre
os modelos animais de parkinsonismo, MPTP, 6-OHDA e LPS, frente ao
parâmetro de freqüência de levantar, medido 24 h, 3 e 7 dias após cirurgia
estereotáxica. A ANOVA mostrou que o grupo 6-OHDA apresentou redução
significativa (P<0,01), no parâmetro de freqüência de levantar, em comparação ao
grupo não operado nos três dias testados.
Levan tar
0
10
20
30
40
Não operado
Sham
MP TP
6-OHD A
LP S
24 h 3 dias 7 dias
Frequência de levantar
Figura 8: Comparação entre as freqüências de levantar de grupos lesados por
MPTP, 6-OHDA e LPS. Os animais foram tratados com MPTP 100 µg/µL, 6-OHDA
6 µg/µL e LPS 2 µg/µL e analisados em campo aberto 24 h, 3 e 7 dias após a
cirurgia estereotáxica. Os valores representam à média ± S.E.M. (n = 10 por
grupo). P<0,01 comparado ao grupo controle não operado. Utilizou-se ANOVA
de uma via para medidas repetidas seguido pelo teste de Tukey.
31
A figura 9 mostra os dados referentes à comparação comportamental entre os
modelos animais de parkinsonismo, MPTP, 6-OHDA e LPS, frente ao parâmetro
de tempo de imobilidade medido 24 h, 3 e 7 dias após cirurgia estereotáxica. A
ANOVA mostrou que o grupo 6-OHDA apresentou aumento significativo (P<0,001)
do tempo de imobilidade em comparação aos demais grupos nos tempos de 24 h
e 3 dias após a cirurgia estereotáxica.
Im o b ilid ad e
0
50
100
150
Não operado
Sham
MP TP
6-OHD A
LP S
24 h 3 dias 7 dias
Tempo de imobilidade
(s)
Figura 9: Comparação entre os tempos de imobilidade de grupos lesados por
MPTP, 6-OHDA e LPS. Os animais foram tratados com MPTP 100 µg/µL, 6-OHDA
6 µg/µL e LPS 2 µg/µL e analisados em campo aberto 24h, 3 e 7 dias após a
cirurgia estereotáxica. Os valores representam à média ± S.E.M. (n = 10 por
grupo). P<0,001comparado ao grupo controle não operado. Utilizou-se ANOVA
de uma via para medidas repetidas seguido pelo teste de Tukey.
32
4.1.2. Perfil de expressão de COX-2 induzida por LPS, MPTP e 6-OHDA.
A figura 10 apresenta a análise da expressão da proteína COX-2 na SN
após o procedimento cirúrgico Sham, ao longo dos tempos observados. Os
valores de intensidade relativa, expressos em unidades arbitrárias, são a razão da
densidade ótica das bandas da COX-2 pelos valores de densidade ótica das
bandas da COX-1. Não verificou-se indução aumentada da expressão de COX-2
na SN, em nenhum dos tempo observados.
0.0
0.5
1.0
1.5
Não operado
Sham
4h 8h 16h 24h 3d 7d
Tempo após cirurgia
Razão COX-2/COX-1
(Intensidade relativa)
Figura 10: Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 na SN após procedimento Sham. A. Os extratos celulares dos tecidos
analisados foram preparados de acordo com os tempos indicados. Os valores
representam média ± S.E.M. utilizando-se 3 animais para cada tempo de
observação. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos.
COX-2 72 kDa
COX-1
74 kDa
33
A figura 11 apresenta a análise da expressão da proteína COX-2 no
estriado após o procedimento cirúrgico Sham, ao longo dos tempos observados.
Os valores de intensidade relativa, expressos em unidades arbitrárias, são a razão
da densidade ótica das bandas da COX-2 pelos valores de densidade ótica das
bandas da COX-1. Não verificou-se indução aumentada da expressão de COX-2
no estriado, em nenhum dos tempos observados.
0.0
0.5
1.0
1.5
Não operado
Sham
4h 8h 16h 24h 3d 7d
Tempo após cirurgia
Razão COX-2/COX-1
(Intensidade relativa)
Figura 11:
Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 no estriado após procedimento Sham. Os extratos celulares dos tecidos
analisados foram preparados de acordo com os tempos indicados. Os valores
representam média ± S.E.M. utilizando-se 3 animais para cada tempo de
observação. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos.
COX-2
72 kDa
COX-1
74 kDa
34
A figura 12 apresenta a análise da expressão da proteína COX-2 na SN
após o procedimento infusão intranigral de LPS, ao longo dos tempos observados.
Os valores de intensidade relativa, expressos em unidades arbitrárias, são a razão
da densidade ótica das bandas da COX-2 pelos valores de densidade ótica das
bandas da COX-1. Observou-se aumento significativo na indução de COX-2 na
SN (
P
<0.01) 8h e (
P
<0.05) 16h após a infusão intranigral de LPS.
0
1
2
Não operado
LPS
4h 8h 16h 24h 3d 7d
Tempo após LPS
Razão COX-2/COX-1
(Intensidade relativa)
Figura 12: Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 na SN após infusão de LPS. Os extratos celulares dos tecidos analisados
foram preparados de acordo com os tempos indicados. Os valores representam
média ± S.E.M. utilizando-se 3 animais para cada tempo de observação. P<0.05
comparado ao grupo não-operado; P<0.01 comparado ao grupo não-operado.
ANOVA seguido por teste de Newman-Keuls.
COX-2
72 kDa
COX-1 74 kDa
35
A figura 13 apresenta a análise da expressão da proteína COX-2 no
estriado, após o procedimento infusão intranigral de LPS, ao longo dos tempos
observados. Os valores de intensidade relativa, expressos em unidades
arbitrárias, são a razão da densidade ótica das bandas da COX-2 pelos valores de
densidade ótica das bandas da COX-1. Não detectou-se nenhuma diferença
significativa na expressão de COX-2 no estriado ao longo dos tempo de
observação.
0.0
0.5
1.0
1.5
Não operado
LPS
4h 8h 16h 24h 3d 7d
Tempo após LPS
Razão COX-2/COX-1
(Intensidade relativa)
Figura 13: Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 no estriado após infusão de LPS. Os extratos celulares dos tecidos
analisados foram preparados de acordo com os tempos indicados. Os valores
representam média ± S.E.M. utilizando-se 3 animais para cada tempo de
observação. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos.
COX-2 72 kDa
COX-1
74 kDa
36
A figura 14 apresenta a análise da expressão da proteína COX-2 na SN,
após o procedimento infusão intranigral de MPTP, ao longo dos tempos
observados. Os valores de intensidade relativa, expressos em unidades
arbitrárias, são a razão da densidade ótica das bandas da COX-2 pelos valores de
densidade ótica das bandas da COX-1. Verificou-se aumento significativo (P<0.05)
na indução de COX-2, na SN, 16 h após infusão intranigral de MPTP.
0
1
2
3
Não operado
MPTP
4h 8h 16h 24h 3d 7d
Tempo após MPTP
Razão COX-2/COX-1
(Intensidade relativa)
Figura 14: Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 na SN após infusão de MPTP. Os extratos celulares dos tecidos
analisados foram preparados de acordo com os tempos indicados. Os valores
representam média ± S.E.M. utilizando-se 3 animais para cada tempo de
observação. P<0.05 comparado ao grupo não-operado. ANOVA seguido por
teste de Newman-Keuls.
COX-1
74 kDa
COX-2
72 kDa
37
A figura 15 apresenta a análise da expressão da proteína COX-2 no
estriado, após o procedimento infusão intranigral de MPTP, ao longo dos tempos
observados. Os valores de intensidade relativa, expressos em unidades
arbitrárias, são a razão da densidade ótica das bandas da COX-2 pelos valores de
densidade ótica das bandas da COX-1. Não detectou-se nenhuma diferença
significativa na expressão de COX-2 no estriado, ao longo dos tempos de
observação
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Não operado
MPTP
4h 8h 16h 24h 3d 7d
Tempo após MPTP
Razão COX-2/COX-1
(Intensidade relativa)
Figura 15: Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 no estriado após infusão de MPTP. Os extratos celulares dos tecidos
analisados foram preparados de acordo com os tempos indicados. Os valores
representam média ± S.E.M. utilizando-se 3 animais para cada tempo de
observação. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos.
COX-2 72 kDa
COX-1
74 kDa
38
A figura 16 apresenta a análise da expressão da proteína COX-2 na SN e
estriado, após o procedimento infusão intranigral de 6-OHDA, ao longo dos
tempos observados. Os valores de intensidade relativa, expressos em unidades
arbitrárias, são a razão da densidade ótica das bandas da COX-2 pelos valores de
densidade ótica das bandas da COX-1. Verificou-se aumento significativo na
indução de COX-2 na SN, 4 (P<0.001), 8 (P<0.001), 16 (P<0.001) e 24h (P<0.01)
após infusão intranigral de 6-OHDA.
0
1
2
Não operado
6-OHDA
4h 8h 16h 24h 3d 7d
Tempo após 6-OHDA
Razão COX-2/COX-1
(Intensidade relativa)
Figura 16:
Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e COX-1 na SN
após infusão de 6-OHDA. Os extratos celulares dos tecidos analisados foram
preparados de acordo com os tempos indicados. Os valores representam média ±
S.E.M. utilizando-se 3 animais para cada tempo de observação.
P
<0.05
comparado ao grupo não-operado;
P
<0.01 comparado ao grupo não-operado;
P
<0.001 comparado ao grupo não-operado. ANOVA seguido por teste de
Newman-Keuls.
COX-2
72 kDa
COX-1
74 kDa
39
A figura 17 apresenta a análise da expressão da proteína COX-2 no
estriado, após o procedimento infusão intranigral de 6-OHDA, ao longo dos
tempos observados. Os valores de intensidade relativa, expressos em unidades
arbitrárias, são a razão da densidade ótica das bandas da COX-2 pelos valores de
densidade ótica das bandas da COX-1. Não detectou-se nenhuma diferença
significativa na expressão de COX-2 no estriado, ao longo dos tempos de
observação.
0.0
0.5
1.0
1.5
Não operado
6-OHDA
4h 8h 16h 24h 3d 7d
Tempo após 6-OHDA
Razão COX-2/COX-1
(Intensidade relativa)
Figura 17:
Detecção por western blotting da expressão de COX-2 e
COX-1 no estriado após infusão de 6-OHDA. Os extratos celulares dos tecidos
analisados foram preparados de acordo com os tempos indicados. Os valores
representam média ± S.E.M. utilizando-se 3 animais para cada tempo de
observação. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os grupos.
COX-2
72 kDa
74 kDa
COX-1
40
4.1.3. Tratamento com indometacina dos animais lesados por MPTP
A figura 18 apresenta os dados referentes ao parâmetro de tempo de
latência para o início dos movimentos, 24 horas e 7 dias após a cirurgia
estereotáxica. A ANOVA de uma via mostrou que 24 h após a cirurgia os grupos
Sham +salina, Sham + IND e MPTP + salina apresentaram seus tempos de
latência aumentados (
P
<0,05) em comparação ao controle + salina, sendo que o
grupo MPTP + IND não apresentou diferença estatística, quando comparado ao
grupo controle + salina. No sétimo dia apenas o grupo MPTP + salina não
apresenta diferença estatística em comparação aos demais grupos, embora não
seja diferente do grupo controle + salina.
Latência
0.0
2.5
5.0
7.5
Controle + salina
Controle + IND
Sham + salina
Sham + IND
MPTP + salina
MPTP + IND
24h 7 dias
Tempo de latência (s)
Figura 18: Efeitos da administração de IND no tempo de latência de ratos tratados
com MPTP e submetidos ao campo aberto. Os animais foram tratados com IND
(10 mg/kg) 1 hora antes da cirurgia estereotáxica. O teste de campo aberto foi
realizado 24 horas e 7 dias após a cirurgia, sendo que nesse período os animais
foram tratados com IND (1 mg/kg) uma vez ao dia. Os valores representam a
média
±
desvio padrão (
n =
10 por grupo).
P
<0.05 comparado ao grupo controle
+ salina. Utilizou-se ANOVA de uma via seguido pelo teste de Tukey.
41
A figura 19 mostra os dados referentes à administração de IND no modelo
do MPTP. A avaliação do parâmetro de freqüência de locomoção foi feita 24 horas
e 7 dias após a cirurgia estereotáxica. A ANOVA de uma via mostrou que o grupo
MPTP + salina apresentou hipolocomoção em comparação aos grupos controle +
salina, controle + IND, sham + salina, sham + IND (
P
<0,05), e que o grupo MPTP
+ IND apresentou aumento significativo na freqüência de locomoção (
P
<0,05),
frente ao grupo MPTP + salina e que esta locomoção não foi diferente dos demais
grupos.
No sétimo dia todos os grupos que receberam IND, incluindo os controles,
apresentaram redução significativa de ambulação (
P<
0,001), em comparação ao
grupo controle + salina. Também observou-se redução significativa (
P
<0,05) da
freqüência de locomoção do grupo MPTP + IND no sétimo dia em comparação ao
mesmo grupo 24 horas após a cirurgia.
Locomoção
0
25
50
75
100
Controle + salina
Controle + IND
Sham + salina
Sham + IND
MPTP + salina
MPTP + IND
24h
7 dias
Frequência de locomoção
Figura 19: Efeitos da administração de IND na freqüência de locomoção de ratos
tratados com MPTP e submetidos ao campo aberto. Os animais foram tratados
com IND (10 mg/kg) 1 hora antes da cirurgia estereotáxica. O teste de campo
42
aberto foi realizado 24 horas e 7 dias após a cirurgia, sendo que nesse período os
animais foram tratados com IND (1 mg/kg) uma vez ao dia. Os valores
representam a média ± desvio padrão (n=10 por grupo). P<0,001 comparado ao
grupo controle salina. Utilizou-se ANOVA de uma via seguido pelo teste de Tukey.
A figura 20 apresenta os dados referentes à administração de IND no
modelo do MPTP. As medições do parâmetro de freqüência levantar foram feitas
24 horas e 7 dias após a cirurgia estereotáxica. A ANOVA mostrou que 24 h após
a cirurgia houve redução significativa da freqüência de levantar dos grupos
controle + IND (P<0,05), MPTP + salina (P<0,001) e MPTP + IND (P<0,001) em
comparação ao grupo controle + salina. No sétimo dia apenas o grupo controle +
IND apresentou redução significativa (P<0,05) em comparação ao grupo controle
+ salina.
Levantar
0
10
20
30
Controle + salina
Controle + IND
Sham + SAL
Sham + IND
MPTP + salina
MPTP + IND
24h 7 dias
Frequência de levantar
Figura 20: Efeitos da administração de IND na freqüência de levantar de ratos
tratados com MPTP e submetidos ao campo aberto. Os animais foram tratados
com IND (10 mg/kg) 1 hora antes da cirurgia estereotáxica. O teste de campo
aberto foi realizado 24 horas e 7 dias após a cirurgia, sendo que nesse período os
animais foram tratados com IND (1 mg/kg) uma vez ao dia. Os valores
representam à média
±
desvio padrão (
n=
10 por grupo).
P
<0,05;
P
<0,001
43
comparado ao grupo controle + salina. Utilizou-se ANOVA de uma via seguido
pelo teste de Tukey.
A figura 21 mostra os dados referentes à administração de IND no modelo
do MPTP. As medições do parâmetro de tempo de imobilidade foram feitas 24
horas e 7 dias após a cirurgia estereotáxica. A ANOVA de uma via mostrou que 24
horas após a cirurgia o grupo MPTP + IND apresentou aumento (
P
<0,05)
estatisticamente significativo no tempo de imobilidade em comparação ao grupo
controle + salina. No sétimo dia não foram observadas diferenças estatísticas
entre os grupos.
Imobilidade
0
50
100
150
CONT + SAL
CONT + IND
SHAM + SAL
SHAM + IND
MPTP + SAL
MPTP + IND
24h 7dias
Tempo de imobilidade
(s)
Figura 21: Efeitos da administração de IND no tempo de imobilidade de ratos
tratados com MPTP e submetidos ao campo aberto. Os animais foram tratados
com IND (10 mg/kg) 1 hora antes da cirurgia estereotáxica. O teste de campo
aberto foi realizado 24 horas e 7 dias após a cirurgia, sendo que nesse período os
animais foram tratados com IND (1 mg/kg) uma vez ao dia. Os valores
representam a média
±
desvio padrão (
n=
10 por grupo).
P
<0,05 comparado ao
grupo controle + salina Utilizou-se ANOVA de uma via seguido pelo teste de
Tukey.
44
5. DISCUSSÃO
Os resultados deste estudo provêm evidências de que a infusão intranigral
de LPS, MPTP ou 6-OHDA gera alterações comportamentais, e também,
up-
regulation
da proteína COX-2, de uma maneira dependente de tempo. Além disso,
verificamos, através do campo aberto, um efeito neuroprotetor conferido pela IND
em animais lesados por MPTP.
A infusão intranigral bilateral de LPS produziu um aumento na freqüência de
locomoção, observada no campo aberto, no terceiro e sétimo dias de observação
(Figura 7). Além disso, os achados de western blotting referentes às amostras de
SN obtidas do grupo LPS demonstraram uma up-regulation de COX-2 8 e 16 h
após a cirurgia (figura 12). Em seguida, os níveis nigrais de COX-2 retornaram ao
normal 24 h após a cirurgia. Por outro lado, no estriado, a COX-2 não diferiu em
comparação ao grupo não-operado, ao longo dos tempos observados (Figura 13).
Nossos resultados mostram que esta reação inflamatória desencadeada pelo LPS
na SN foi mais intensa em comparação ao encontrado no estriado. Havendo
grande indução de COX-2 de 8 h até o tempo de 16 h após a infusão. Este
resultado corrobora, muitos outros da literatura. De acordo com HERRERA
et al
.,
(2000), a reação inflamatória, induzida por infusão intranigral de LPS, é mais forte
na SN do que no estriado, havendo grande recrutamento de células
mononucleares através dos vasos sanguíneos. Diversos estudos têm mostrado
que infusões intranigrais de LPS resultam na redução de DA e seus metabólitos
no estriado, além de redução no número de neurônios TH-positivos na SN
(CASTAÑO
et al
., 1998; HERRERA
et al
., 2000; IRAVANI
et al
., 2002). Neurônios
dopaminérgicos mostraram-se sensíveis ao LPS
in vivo
, e esta sensibilidade
ocorre exclusivamente quando o LPS é infundido diretamente na SN (CASTAÑO
et al
., 1998).
A indução de COX-2 produzida por LPS sugere um aumento no estresse
oxidativo na SN, não corroborada por um equivalente prejuízo motor, o que por
sua vez, poderia ser interpretado como uma manifestação do dano no sistema
dopaminérgico. Por outro lado, o aumento na locomoção induzido por LPS 3 e 7
45
dias após a cirurgia (Figura 7), pode ser interpretado como um mecanismo
compensatório por parte dos neurônios que sobreviveram à lesão.
É bem estabelecido que a COX-1 é constitutivamente expressa em
praticamente todos os tecidos, incluindo o encéfalo, em neurônios e astrócitos
(HEWETT
et al
., 2000). A COX-2, entretanto, é uma proteína de caráter indutível,
sendo constitutivamente expressa em apenas alguns poucos tecidos, incluindo
particularmente o encéfalo em diferentes regiões como o córtex, amígdala,
hipocampo e corno dorsal da medula (YAMAGATA
et al
., 1993; BREDER
et al
.,
1995). Além disso, a COX-2 encontra-se induzida 1 – 8 h após processos
convulsivos, traumas, hemorragia intracerebral e doenças neurodegenerativas
(YAMAGATA
et al
., 1993; NOGAWA
et al
., 1998; KNOTT
et al
., 2000; KIM
et al
.,
2001; GONG
et al
., 2001).
Ativação microglial pode ser desencadeada por ativação modificada de
proteínas através de processos patogênicos, por antígenos provenientes de
agentes infecciosos (como o LPS), príons, ou por uma combinação complexa de
moléculas incluindo ATP, AMP
c
, interleucinas (IL)-1
β
, IL-6 e IL-10 (HANISH, 2002;
NAKAMURA, 2002). Nesta linha, há um aumento na microglia reativa na SN e
estriado de pacientes com DP idiopática (MCGEER
et al
., 1998; MIRZA
et al
.,
2002). Além disso, a área do encéfalo que engloba a SN (mesencéfalo) abriga a
maior densidade da microglia no encéfalo (KIM
et al
., 2000).
Em investigações
postmortem
de encéfalos humanos expostos ao MPTP,
foi detectada a presença de microglia ativada até 16 anos após a última exposição
à neurotoxina (LANGSTON
et al
., 1999). A microglia ativada e perda de neurônios
dopaminérgicos são também encontrados na SN de primatas anos após
tratamento com MPTP (MCGEER
et al
.,2003). Além disso, uma reação microglial
transitória foi verificada do primeiro ao 14º dia na SN e no estriado de
camundongos que receberam injeções intraperitoneais de MPTP (KOHUTNICKA
et al
., 1998). Estes achados sugerem que a microglia participa ativamente na
etiologia da DP, dessa forma, podendo perpetuar a degeneração dos neurônios
dopaminérgicos, uma que ativada (HALD & LOTHARIUS, 2005).
46
O modelo de parkinsonismo induzido por MPTP pode ser considerado um
bom modelo para estudar o prejuízo na atividade motora associada à DP. Este
estabelecido modelo tem sido reproduzido em nosso grupo, havendo redução
significativa nos níveis estriatais de DA além de hipolocomoção verificadas em
animais lesados por MPTP (DA CUNHA
et al
., 2001; GEVAERD
et al
., 2001;
MIYOSHI
et al
., 2002; PERRY
et al
., 2004). Nossos resultados comportamentais
corroboram estes dados, sendo que o grupo lesado com MPTP mostrou prejuízo
motor indicado pela diminuição nas freqüências de locomoção e levantar 24 h
após a cirurgia (Figuras 7 e 8). A expressão máxima de COX-2, observada na SN
para o modelo do MPTP, foi às 16 h. A expressão de COX-2 é induzida
específicamente em neurônios dopaminérgicos da SNpc em amostras postmortem
de pacientes portadores de DP e também no modelo animal que utiliza injeções
intraperitoneais de MPTP em camundongos (TEISMANN
et al
., 2003). Também
reporta-se que a redução ou a inibição de COX-2 atenuam o processo de
neurodegeneração induzido por MPTP (TEISMANN
et al
., 2003). Em nossos
resultados, não observamos nenhum aumento na expressão de COX-2 no
estriado. Por outro lado, PRZYBYŁKOWSKI
et al.
(2004) demonstraram que a
administração de MPTP em camundongos, produziu degeneração dos neurônios
dopaminérgicos nigroestriatais, levando ao aumento na expressão da proteína
COX-2 no estriado 3 a 7 dias após a administração de MPTP. Nós sugerimos que
esta discrepância na expressão estriatal de COX-2 esteja provavelmente
relacionada às diferentes espécies utilizadas e, portanto nas doses de MPTP
administradas. Entretanto estes achados provêm maiores evidências de que o
MPTP é um modelo capaz de mimetizar prejuízos neuroquímicos e motores, além
do processo neuroinflamatório, especialmente 16 h (Figura 14) após a cirurgia, em
nosso modelo.
A 6-OHDA é outra neurotoxina capaz de induzir degeneração nigroestriatal
regional, quando infundida em roedores, em um padrão topográfico muito similar a
DP idiopática (RODRIGUEZ
et al
., 2001). Administração intraestriatal de 6-OHDA
em camundongos causa ativação microglial na SN nos primeiros 3 dias após a
infusão (ORR
et al
., 2002).
47
Os presentes resultados indicam que a infusão de 6-OHDA causou severo
prejuízo motor, indicado pelo decréscimo nas freqüências de locomoção (24 h,
Figura 7) e levantar (24 h, 3 e 7 dias, Figura 8). Paralelamente, estes animais
apresentaram aumento nos tempos de latência (24 h, 3 e 7 dias, Figura 6) e
imobilidade (24 h 3 e 7 dias, Figura 9). Também demonstramos uma indução
aguda de COX-2, iniciada 4 h após a cirurgia na SN sendo detectada até 24 h
(Figura 16). Por outro lado, não foi detectada indução de COX-2 no estriado, ao
longo dos diferentes tempos observados (Figura 17).
Em resumo, sugerimos que o LPS pode ser considerado um modelo do
processo neuroinflamatório ocorrido na DP, em função da indução de expressão
de COX-2 poucas horas após a exposição. Surpreendentemente, o LPS não foi
capaz de produzir prejuízo motor, que por sua vez é a característica mais
marcante na doença. Por outro lado, o modelo induzido por MPTP mimetizou o
prejuízo motor, além da reposta neuroinflamatório, gerando um pico de indução de
COX-2 16 h após a cirurgia, desta forma caracterizando-se um modelo de fase
inicial da DP. Já 6-OHDA produziu a mais longa indução de COX-2 (4-24 h após
cirurgia), o que indica que o processo neuroinflamatório foi mais severo, em
comparação as outras neurotoxinas. Desta maneira, os presentes dados
corroboram os resultados da literatura que indicam que tanto a infusão intranigral
de 6-OHDA quanto à de MPTP apresentam características desejáveis para um
modelo animal de DP. Os animais apresentam evidentes prejuízos motores nas
primeiras horas após a lesão, além de expressão aumentada de COX-2. O que
sugere um aumento do processo inflamatório na via nigroestriatal.
A SN foi muito mais sensível, em termos de indução da expressão de COX-
2, do que o estriado para todas as neurotoxinas avaliadas. De acordo com o
protocolo empregado as neurotoxinas em questão geram apenas uma pequena
lesão nigral. Segundo FERRO
et al
., (2005), a infusão intranigral de 6-OHDA
causa perda mais pronunciada de neurônios dopaminérgicos do que o mesmo
procedimento com MPTP. Entretanto a lesão gerada por 6-OHDA não causa uma
grau de depleção proporcional a maior morte neuronal, em comparação ao MPTP.
48
De fato, estes resultados correspondem com nossos dados quanto à ausência de
indução de COX-2, observada no estriado.
Após a confirmação da indução da expressão de COX-2 mediada pela
infusão intranigral de MPTP, avaliamos a IND, um AINE com atividade inibitória
não seletiva para a COX, ou seja, ambas as isoformas são inibidas por esta droga.
Desta forma, esperou-se bloquear totalmente o processo neuroinflamatório, que
em teoria, deveria ser gerado pela infusão bilateral de MPTP na SNpc. Nossa
hipótese é que bloqueando a neuroinflamação deve-se observar algum grau de
neuroproteção que foi visualizado e quantificado comportamentalmente utilizando-
se o teste do campo aberto.
Os resultados sugerem que o grupo MPTP+salina mostrou redução
significativa nos parâmetros de locomoção e levantar, além de aumento
significativo no parâmetro de latência 24 horas após a cirurgia, em comparação ao
grupo controle+salina. O grupo de animais tratados concomitantemente com
MPTP e indometacina (MPTP + IND) apresentou aumento significativo dos
parâmetros de locomoção (Figura 19), e frequência de levantar (Figura 20) e
redução no tempo de latência em comparação ao grupo MPTP+salina 24 horas
após a cirurgia (Figura 18). No entanto, observou-se um efeito de hipolocomoção
e de aumento no tempo de imobilidade nos grupos tratados com este
antiinflamatório, 7 dias após a cirurgia (Figuras 19 e 21).
Sugerimos que a indometacina atenuou os efeitos de alteração motora
provocados pelo MPTP 24 horas após a cirurgia estereotáxica. A indometacina
pareceu ser seletiva, ao que tange o seu possível efeito neuroprotetor, pois
apenas os grupos lesados que foram administrados com este antiinflamatório,
apresentaram os parâmetros de freqüência de locomoção (Figura 19), freqüência
de levantar (Figura 20) e tempo de latência (Figura 18) preservados frente ao
grupo lesado por MPTP e que apenas recebeu salina. Entretanto, este
antiinflamatório causou redução significativa no parâmetro de freqüência de
locomoção desses animais, quando testados no campo aberto sete dias após a
cirurgia (Figura 19). Este fato pode ter ocorrido em virtude de um possível efeito
depletor de dopamina (KURSKOWSKA-JASTRZEBSKA
et al
., 2002) provocado
49
pelo antiinflamatório ao longo do tratamento. Sugerimos que este efeito não seja
dependente da inibição das isoformas da COX, pois a dose pré-operatória de 10
mg/kg de indometacina foi efetiva para fazer este efeito inibitório. Portanto algum
prejuízo motor dever-se-ia ser observado no teste realizado 24 horas após a
cirurgia estereotáxica.
Tomados em conjunto, nossos dados indicam que nos três modelos
animais de parkinsonismo avaliados, ocorreu
up-regulation
da proteína COX-2
após infusão das neurotoxinas. Este resultado corrobora dados da literatura que
apontam à inflamação como um agente etiológico envolvido nos mecanismos de
lesão dos neurônios dopaminérgicos. Entretanto, outros mediadores do processo
inflamatório deverão ser investigados para que haja uma maior compreensão da
relação existente entre inflamação e DP. As análises comportamentais, dos
animais que receberam as toxinas, mostram que o LPS não alterou o
comportamento motor dos ratos; o MPTP produziu alterações reversíveis e a 6-
OHDA produziu prejuízo motor intenso nos animais. Mais ainda, os resultados da
presente investigação indicam que a indometacina impediu a ocorrência de
prejuízo motor, uma decorrência da lesão por MPTP, sugerindo um efeito
neuroprotetor mediado pela inibição da COX-2.
50
6. CONCLUSÕES
•
Os modelos animais de parkinsonismo induzidos por MPTP e 6-OHDA
demonstraram-se eficazes quanto a promover prejuízos motores 24 horas
após suas infusões na SNpc.
•
O modelo de parkinsonismo induzido por LPS não se mostrou adequado
em reproduzir os efeitos de prejuízo motor, observados no campo aberto.
•
A infusão intranigral de LPS induziu aumento de expressão de COX-2 na
SN, nos tempos de 8 e 16 h, indicando o surgimento de um processo
neuroinflamatório. Desta forma sugerimos que o modelo de parkinsonismo
induzido por LPS é adequado para mimetizar um processo
neuroinflamatório, semelhante ao ocorrido na doença, embora essa
neurotoxina não foi capaz de gerar o prejuízo motor, característico da
doença. Nenhuma alteração de expressão de COX-2 foi verificada no
estriado.
•
A infusão intranigral de MPTP causou aumento de expressão de COX-2
observado 16 h após a lesão na SN. Nenhuma alteração de expressão foi
verificada no estriado.
•
A infusão intranigral de 6-OHDA produziu aumento de expressão de COX-2
observada de 4 a 24 h após a cirurgia. Nenhuma alteração de expressão foi
verificada no estriado.
•
Sugerimos que o fato de não ser possível identificar nenhuma alteração nos
níveis de expressão de COX-2 no estriado, nos três modelos estudados,
seja em decorrência de uma pequena extensão da lesão gerada pelas
neurotoxinas.
51
•
A indometacina demonstrou-se eficiente em prevenir o prejuízo motor,
gerado pela infusão intranigral de MPTP, 24h após a cirurgia. No entanto
verificamos um prejuízo motor 7 dias após a cirurgia, sendo um indicativo
de alteração no sistema dopaminérgico.
52
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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63
8. ANEXO
64
Different parkinsonism models induce a time dependent
induction of COX-2 in the brain
Marcelo de Meira Santos Lima
1
, Angela Reksidler Braga
1
, Sílvio Marques Zanata
2
,
Hidevaldo Bueno Machado
1‡
, Sergio Tufik
3
and Maria A. B. F. Vital
1†
(1) Departamento de Farmacologia, Universidade Federal do Paraná, Curitiba,
PR, Brasil;
(2) Departamento de Patologia Básica, Universidade Federal do Paraná, Curitiba,
PR, Brasil;
(3) Departamento de Psicobiologia, Universidade Federal de São Paulo, SP,
Brasil;
†Corresponding Author
Dr. Maria A. B. F. Vital
Universidade Federal do Paraná
Setor de Ciências Biológicas
Departamento de Farmacologia
Av. Francisco H. dos Santos s/n
CEP: 81.531 – 990
Caixa Postal: 19031
Curitiba – Paraná – Brasil
FAX number: 0055-041-266 2042
‡ Present address: Department of Molecular and Medical Pharmacology,
University of California - Los Angeles, USA.
65
ABSTRACT
The present study investigated the effects on general activity and COX-2
protein expression of intranigral LPS (lipopolysaccharide), MPTP (1-methyl-4-
phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) and 6-OHDA (6-hydroxydopamine) infusion on
rats. The results indicate that LPS produced an increase in locomotion frequency
(3 and 7 days after surgery), and a strong up-regulation of COX-2 protein 16 h and
24 h after surgery, as observed in the Substantia nigra (SN). The MPTP model
generated impairment in locomotion and rearing frequencies 24 h after surgery.
Besides this, MPTP caused a marked up-regulation in COX-2 protein, observed in
the SN, 16 h after surgery. Moreover, the 6-OHDA model produced severe motor
impairment indicated by the decrease in locomotion (24 h) and rearing (24 h, 3
and 7 days) frequencies, and also an increase in latency (24 h, 3 and 7 days) and
immobility (24 h and 3 days) times. We also demonstrated an up-regulation of
COX-2, which occurred in the SN 4-24 h after surgery.
For all the models analyzed, we observed no statistic differences in the expression
of COX-2 in the striatum along the time points. The results of the present study
suggest that different patterns of COX-2 induction appeared according to the
neurotoxin tested. Nevertheless that time dependent induction was relatively
constant, which by itself, is significant considering the importance of
neuroinflammatory process in Parkinson’s disease (PD).
Keywords:
LPS (lipopolysaccharide), MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-
tetrahydropyridine), 6-OHDA (6-hydroxydopamine), neuroinflammation, COX-2
(cyclooxygenase-2), Parkinson’s disease.
66
INTRODUCTION
Parkinson’s disease (PD) is one of the most common chronic progressive
neurological disorders, affecting 3% of the population over the age of 65 [26].
Research into the pathogenesis of PD has been rapidly advanced by the
development of animal models that also permit the investigation of new treatments.
Some of these models are achieved by the use of neurotoxins, in particular MPTP
(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine), 6-OHDA (6-hydroxydopamine), and
recently LPS (lipopolysaccharide).
Currently, none of the models fully recapitulate all of the clinical key and
neuropathologic features of PD. However, because each of the models do
recapitulate significant pathological features of PD and represent parts of the same
puzzle, combinatorial study of multiple models are warranted to provide a more
fully developed view of PD pathogenesis [8].
Several factors including neuroinflammation are believed to be involved in the
pathogenesis of PD. Thus, epidemiological studies suggest that inflammation
increases the risk of developing a neurodegenerative condition such as
Alzheimer’s disease (AD) and PD [48]. Inflammatory processes associated with an
increased expression of the enzyme cyclooxygenase type 2 (COX-2) and elevated
levels of prostaglandin E
2
(PGE
2
) have been implicated in the cascade of
deleterious events leading to a neurodegeneration. COX-2 expression has been
shown to be induced specifically in SNpc dopaminergic neurons in human
postmortem PD specimens and in the MPTP mouse model of PD during the
destruction of the nigrostriatal pathway [47].
COX-2 is strongly suspected of playing a detrimental role in
neurodegeneration and the stimulation of an inflammatory process following
neuronal death. COX-2 may aggravate the degenerative process through pro-
inflammatory mechanisms, and also by ROS formation [18,47]. It has been shown
that COX-2 expression in neurons correlates with their apoptosis and is involved in
the neuronal response to stress [37]. The increase in COX-2 expression and
activity appears very early after the onset of stress, and accounts, at least in part,
67
for the accumulation of oxidative mediators in this condition [30]. The inhibition of
COX-2 alone or both COX-1 and 2, by selective and non-selective nonsteroidal
anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in models of neural injury was shown to provide
neuroprotective effect [2,35,45,25]. COX-2 may also play an important role in
MPTP toxicity, since COX-2 knockout animals are less susceptible to MPTP insult
than their wild type relatives. About 20% greater preservation of neurons in the SN
and twice the tyrosine hydroxylase (TH) expression in the striatum has been
observed in COX-2 gene-deficient mice as compared to the wild type after MPTP
intoxication [10].
The aim of the present study was to evaluate the behavioral effects and the
COX-2 expression profile in the SN and striatum in rat models of PD induced by
LPS, MPTP or 6-OHDA.
MATERIALS AND METHODS
Animals
One hundred and thirty-four adult male Wistar rats from our colony weighing
280–320 g at the beginning of the experiments were used. The animals were
maintained in a temperature controlled room (22 ± 2°C) on a 12 h light–dark cycle
(lights on 7:00 a.m.) with free access to food and water. All the behavioral
experiments were conducted between 2:00 and 6:00 p.m. The animals used in this
study were maintained and handled in accordance with the guidelines of the
Committee on the Care and Use of Laboratory Animals Resources, National Re-
search Council, USA.
Stereotaxic Surgery
The animals were divided at random and equally into the following groups:
non-operated animals, sham-operated animals, MPTP-injected group, 6-OHDA-
injected group and LPS-injected group. All the operated rats received atropine
sulphate (0.4 mg/kg, intraperitoneal [i.p.]) and penicillin G-procaine (20.000 U in
0.1 ml, intramuscular) and were anesthetized with sodium thiopental (40 mg/kg).
MPTP–HCl (100
µ
g in 1
µ
L of saline; Sigma, St. Louis, MO, USA), 6-OHDA (6
µ
g
68
in 2
µ
L of artificial cerebrospinal fluid, aCSF, supplemented with 0.2% ascorbic
acid; Sigma) and LPS (2
µ
g in 1
µ
L of saline; from
Escherichia coli
, serotype
0111:B4; Sigma) was bilaterally administered through a 30-gauge stainless needle
at a rate of 0.33
µ
L/min, for 3 min, according to the following coordinates:
anteroposterior (AP): - 5.0 mm from bregma; mediolateral (ML): ± 2.1 mm from
midline; dorsoventral (DV): - 7.7 mm from skull, adapted from Paxinos and Watson
[40]. Sham operations followed the same procedure but using 1
µ
L of aCSF for the
bilaterally injection into the SNpc. The composition of the aCSF was as follows:
148 mM NaCl, 2.8 mM KCl, 1.2 mM CaCl
2
, and 0.85 mM MgCl
2
.
Behavioral Tests
To determine behavioral changes in these three models of PD (MPTP, 6-
OHDA and LPS) we chose the open-field as a test of general activity. Fifty rats
were divided into five groups: non-operated (
n
= 10), sham (
n
= 10), MPTP (
n
=
10), 6-OHDA (
n
= 10) and LPS (
n
= 10). Each group, except the non-operated and
sham groups, received a bilateral administration of a neurotoxin. The open-field
was performed 24 hours, 3 and 7 days after the surgeries for all groups.
We employed the open-field constructed according to Broadhurst [5]. The
testing arena was round with a diameter of 97 cm. The circular wall was 32.5 cm
high and was constructed of aluminium sheeting. The arena was situated on a
wood floor. The floor and walls were painted white. The arena floor was divided
into three concentric circles. The small inner circle had a diameter of 23 cm; the
second circle had a diameter of 61 cm and the arena wall defined the outside
circle. Each circle was divided into essentially equal size areas. The number of
areas in the inner circle, middle and outer circles was 1, 6 and 12, respectively. A
100-W ceiling light was situated 48 cm above the arena floor. Cheesecloth was
draped from the ceiling and dropped outside the arena wall. The cloth served to
diffuse the light and functioned as a one-way screen. Rats were observed
individually for 5 min, the different groups were inter-mixed and the animals were
tested in the same order every day. Hand-operated counters were used to score
locomotion frequency (number of floor units entered), rearing frequency (number of
69
times the animals stood on their hind legs), immobility time (number of seconds of
lack of movement during testing) and latency time (time taken to initiate
movement). The apparatus was washed with a water–alcohol (5%) solution before
behavioral testing to eliminate possible bias due to odors left by previous rats.
Preparation of Cytosolic Extract for Western Blotting Analysis
To determine the expression profile of COX-2 and COX-1 we used eighty
four rats divided into the same five groups: non-operated, sham, MPTP, 6-OHDA
and LPS. Three animals were used for each time point (4h, 8h, 16h, 24h, 3 days
and 7 days), that had been determined after the surgeries.
Animals were killed by decapitation, according to the time points, and their
brains were quickly dissected. The SN and striatum
are immediately frozen in liquid
nitrogen until the lysis procedure performed in a 1.5 mL Eppendorf tube by using a
pestle in presence of an ice-cold buffer containing 50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM
NaCl, 1% NP-40, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.25% sodium
deoxycholate, 2 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol (DTT), 20
µ
M phenylmethylsulfonyl
fluoride (PMSF), and protease inhibitors (Complete tablet; Roche, Indianapolis, IN).
After incubation on ice for 30 min extracts were centrifuged at 10 000
g
for 20 min
at 4
°
C, and the supernatants for protein extracts were collected and stored at -
80
°
C for further western blotting analysis. Protein concentrations were measured
by the Lowry method [29].
COX-2 and COX-1 Expression
Protein samples (50
µ
g) were analyzed in 10% SDS-polyacrylamide gels
and transferred to PVDF membranes. The membranes were probed overnight at
4
°
C with rabbit polyclonal antibodies against COX-2 (1:500; Santa Cruz
Biotechnology, Santa Cruz, CA) and COX-1 (1:100; Santa Cruz Biotechnology),
followed by incubation with a secondary horseradish peroxidase-conjugated
antibody (1:10 000; Santa Cruz Biotechnology) for 50 min, and visualized by
chemiluminescence (Santa Cruz Biotechnology). The bands were quantified by
using the software ImageJ 1.32j public domain (http://rsb.info.nih.gov.ij/).
70
Statistical Analysis
The open field data were concluded to be parametric by the Bartlet’s test
[20]. Therefore, two-way analysis of variance (ANOVA) with repeated
measurements was employed to detect differences between the two factors
analyzed, treatments and time. For behavioral data, the Tukey test was used as
post
hoc
when it was indicated by ANOVA. Western blotting data were analyzed by
ANOVA and Newman-Keuls test. Differences were considered significant if
P<0.05. The values were reported as mean ± S.E.M.
RESULTS
Effects of LPS, MPTP and 6-OHDA models in the general activity
Locomotion frequency illustrated in the Figure 1 shows a significant
reduction in the groups that received MPTP (
P
<0.05) and 6-OHDA (
P
<0.001)
injection in comparison to non-operated and sham groups, 24 h after the surgery
[F(4,36) = 15.40;
P
<0.0001]. Three days after the surgery only the LPS group
exhibited an increase in locomotion (
P
<0.01), compared to the non-operated and
sham groups [F(4,36) = 13.24;
P
<0.0001]. On the 7
th
day after the surgery, the
LPS and MPTP groups still showed an increase in locomotion frequency (
P
<0.05)
in comparison to the control groups [F(4,36) = 12.39;
P
<0.0001].
The rearing frequencies presented in Figure 2 indicate that only the 6-OHDA
group showed a significant decrease 24 h [F(4,36) = 5.05;
P
<0.01], 3 [F(4,36) =
9.72;
P
<0.05] and 7 days [F(4,36) = 6.21;
P
<0.05] after surgery, when the animals
were compared to the control groups.
The latency in initiating movement illustrated in Figure 3 only revealed a
significant increase in this parameter for 6-OHDA group at all three time points
measured. Twenty four hours after surgery the latency of the 6-OHDA group was
higher (P<0.001) compared to the control group [F(4.36) = 20.65;
P
<0.0001].
Moreover, 3 and 7 days after the surgery the latency of this group increased in
comparison to the control groups [F(4,36) = 11.63
P
<0.0001; [F(4,36) = 8.86
P
<0.0001, respectively].
71
The immobility time illustrated in Figure 4 only shows a significant increase
in rats from the 6-OHDA group at 24 h [F(4,36) = 4.90;
P
<0.05] and 3 days [F(4,36)
= 13.16;
P
<0.001] after surgery in comparison to the control groups. In contrast,
the analysis of immobility time 7 days [F(2,18) = 1.29;
P
= 0.30] after surgery
indicated no difference in this motor sign.
COX-2 expression induced in SNpc and striatum by intranigral infusion of
LPS, MPTP and 6-OHDA.
We first analyzed the COX-2 expression profile of a sham group to
demonstrate that induction of COX-2 occurs mediated only by a neurotoxin
injection, and not by the surgical procedure. Figure 5a indicates that COX-2 was
not up-regulated through the timepoints in the SN, in comparison to the non-
operated group. At the same level, the surgery procedure did not alter COX-2
expression in the striatum compared to the non-operated group (Figure 5b).
In contrast, intranigral injection of LPS significantly elevated the expression
of COX-2 in the SN 8 h (
P
<0.01) and 16 h (
P
<0.05) after surgery in comparison to
the non-operated group (Figure 6a). Twenty-four hours, 3 and 7 days after surgery,
the levels of COX-2 protein showed no statistical difference when compared to the
non-operated group (Figure 6a). On the other hand, the LPS group did not exhibit
significant variations in COX-2 protein expression in the striatum along the time
points (Figure 6b).
The analysis of the SN obtained after performing the MPTP model revealed
a significant increase in the COX-2 protein expression 16 h after surgery in
comparison to the non-operated group (
P
<0.05) (Figure 7a). After that time point,
the levels of COX-2 decreased until they revealed no statistical differences (24 h, 3
and 7 days) in comparison to the non-operated group. Similarly, to the LPS
treatment, in the MPTP model the COX-2 expression level remained constant in all
time points analyzed (Figure 7b).
The model elicited by 6-OHDA provoked the most drastic up-regulation in
COX-2 protein content in the SN (Figure 8a). The first time point observed (4h)
showed a significant elevation of COX-2 (
P
<0.001) in comparison to the non-
72
operated group. The levels of COX-2 protein were kept high in that tissue for 8 h
(
P
<0.001), 16 h (
P
<0.001) and 24 h (
P
<0.01) after surgery in comparison to the
non-operated group. COX-2 expression decreased to non-significant values at 3
and 7 days when compared to the non-operated group. In the striatum,
nevertheless, COX-2 protein expression did not differ from the non-operated group
(Figure 8b).
DISCUSSION
The results of this study provide evidence that intranigral injection of LPS,
MPTP or 6-OHDA elicits behavioral alterations, and also, up-regulation of COX-2
protein in a time dependent manner after the neurotoxin insult. The bilateral
intranigral injection of LPS produced an increase in the locomotion frequency of the
animals observed in the open-field. Moreover, immunoblotting findings for SN
samples obtained from the LPS group demonstrated an up-regulation of COX-2 8
and 16 h after surgery (Figure 6a). Additionally, the nigral levels of COX-2 returned
to normal 24 h after surgery. On the other hand, COX-2 protein in the striatum did
not differ from the non-operated group throughout the time points (Figure 6b). Our
results show that the inflammatory reaction elicited by LPS in the SN was stronger
than that in the striatum, with a large induction of COX-2 starting at 8 h and
continuing until the time point 16 h. This result corroborates many others from the
literature. According to Herrera and colleagues [16] the inflammatory reaction
induced by intranigral injection of LPS is stronger in the SN than that in the striatum
with a large extension of mononuclear cell recruitment through the blood-vessels.
Several studies have shown that nigral LPS injection results in the reduction of DA
and its metabolites, besides the reduction of nigral TH-positive neurons [6,16,19].
DA neurons were sensitive to LPS
in vivo
and this sensitivity occurs exclusively
when LPS is injected into the SN [6].
The COX-2 induction produced by LPS, suggests an increase in oxidative
stress in the SN, uncorroborated by motor impairment, which, by it self, can be
interpreted as a manifestation of damage in dopaminergic system. Otherwise, the
73
hypermotility induced by LPS, 3 and 7 days after surgery (Figure 1), could be a
compensatory reaction of dopaminergic neurons that survived the lesion.
It is well know that COX-1 is constitutively expressed in nearly all tissues
including the brain, in neurons and astrocytes [17]. COX-2, although an inducible
protein, is constitutively expressed in only a few tissues including the brain,
particularly in neuronal soma, but not in astrocytes, of different regions including
the cortex, amygdale, hippocampal formation, and the dorsal horn of the spinal
cord [4]. It becomes up-regulated briefly – 1 – 8 h after seizure, trauma,
intracerebral hemorrhage, ischemia, or other neurodegenerative diseases
[3,38,23,21,12]. Microglial activation can be triggered by pathogenically-
modified activation of Central Nervous System (CNS) proteins, antigens from
infection agents (such as the gram-negative bacterial cell wall component LPS),
prion proteins, or by a complex combination of molecules including ATP, cAMP,
interleukin (IL)-1
β
, IL-6, and IL-10 [15,36]. In this line, there is an increase in
reactive microglia in the striatum and SN of patients with idiopathic PD [31,33].
Thus, the brain area that encompasses the SN has the highest density of microglia
in the brain [22].
In postmortem, investigations of humans exposed to MPTP, activated
microglia have been detected 16 years after the last drug exposure [27]. Activated
microglia and dopaminergic cell loss are also found in the SN of primates years
after they were treated with MPTP [32]. Moreover, a transient microglial reaction
was verified from the 1
st
until the 14
th
day in the SN and striatum in mice that
received intraperitoneal MPTP injection [24]. These findings suggest that the
microglia play an active role in the pathology of PD and may indeed perpetuate the
degeneration of dopaminergic neurons once activated [14].
The MPTP-induced model can be considered a good animal model to study
the impairment of motor activity associated with Parkinson’s disease. This
established model has been reproduced in our group with a significant reduction of
striatal dopamine levels verified in MPTP-lesioned rats [7,11,34,41]. Our behavioral
results corroborate that data, the MPTP group showed motor impairment indicated
by a decrease in locomotion and rearing frequency 24 h after surgery (Figures 1
74
and 2). The maximum COX-2 expression, observed in the SN for the MPTP model,
was at 16 h. COX-2 expression is induced specifically within SNpc dopaminergic
neurons in human postmortem PD specimens and in the MPTP mouse model of
PD during the destruction of the nigrostriatal pathway. It has also been reported
that COX-2 ablation and inhibition attenuate MPTP-induced nigrostriatal
dopaminergic neurodegeneration [48]. In our results we did not observe any
increase in COX-2 expression in the striatum. On the other hand, Przybyłkowskia
and colleagues [43] demonstrated that MPTP administration in mice, produced a
degeneration of nigrostriatal dopaminergic neurons, leading to the increase of
COX-2 gene and protein expression in the striatum at 3 and 7 days after MPTP
administration but not COX-1. We suggest that this discrepancy in striatal COX-2
expression is probably related to the differences in species and the MPTP doses
administered. Nevertheless, these findings provide further evidence that MPTP is a
model capable of mimicking the neurochemical and motor impairment found in PD
and the neuroinflammatory process, especially 16 h (Figure 7a) after surgery, in
our model.
6-OHDA is another neurotoxin capable of inducing regional nigrostriatal
degeneration in a topographical pattern very similar to idiopathic PD, when injected
into rodents [44]. Intrastriatal administration of 6-OHDA into mice causes microglial
cells to activate and increase in number in the SN for the first three days post-
injection [39].
The present results for the 6-OHDA-induced model demonstrated severe
motor impairment indicated by the decrease in locomotion (24h, Figure 1) and
rearing (24 h, 3 and 7 days, Figure 2) frequencies. Besides this, 6-OHDA-injected
animals showed increases in latency time (24 h, 3 and 7 days, Figure 3) and
immobility time (24 h and 3 days, Figure 4). We also demonstrated an acute up-
regulation of COX-2 protein, which occurred in the SN, as early as 4 h after
surgery, continuing until the time point 24 h (Figure 8a). On the other hand, the
striatum did not show induction of the COX-2 protein throughout the time points
analyzed.
75
Increased expression of COX-2 in microglial cells has been reported in
parkinsonian patients suggesting that COX-2 mediated toxic events may play a
role in dopaminergic degeneration in PD [46].
In summary, we suggest that LPS can be considered a neuroinflammatory
model of PD in terms of the up-regulation of COX-2 few hours after exposure.
Otherwise, LPS was surprisingly unable to replicate the motor impairment, which is
the strongest characteristic of this disease. On the other hand, the MPTP model
mimics the motor impairment and the neuroinflammatory response elicited by
COX-2 16 h after the insult, thus proving it to be adequate as an initial phase
model of PD. Although, 6-OHDA produced a longer COX-2 induction (4-24 h after
surgery) compared to LPS and MPTP, suggesting a stronger neuroinflammatory
reaction elicited by that neurotoxin. 6-OHDA demonstrated to be a good model in
terms of behavior and neuroinflammatory process. We suggest that the MPTP
model corresponds to an acute effect on the dopaminergic system, like the 6-
OHDA model. Nitric oxide (NO) is involved in MPTP toxicity and that modifies
α
-
synuclein and parkin in PD brains suggest that NO plays an important role in the
pathogenesis of PD [49]. It is also to be considerable that changes in NO levels or
nitric oxide synthase (NOS) expression have been described following the
administration of the related neurotoxins [42,28,13,19,1].
The SN was far more sensitive, in terms of COX-2 up-regulation than the striatum
for all neurotoxins evaluated. Nevertheless, immunoblot analysis of TH did not
revealed reductions of TH-content in striatum, for the groups lesioned with the
neurotoxins tested. On the other hand, the TH-content of SN was significant
reduced for the groups lesioned with the same neurotoxins (data not shown). It is
indicating that neurotoxins tested, according to this protocol, only can produce a
small nigral lesion. Intranigral infusion of 6-OHDA causes a more pronounced loss
of dopaminergic cells than MPTP, the 6-OHDA-lesioned rats did not present a
proportional degree of striatal dopamine depletion [9]. In fact, these results
correspond with the absence of induction of COX-2 in the striatum.
In conclusion, we observed different patterns of COX-2 induction in the SN
when distinct models of PD were tested. All neurotoxins tested produced a
76
maximal COX-2 expression between 8-16 h after surgery. That time dependent
induction appear to be relatively constant in these models, which by itself, is
significant considering the importance of neuroinflammatory process in PD.
Acknowledgements
This work was supported by CNPq and CAPES (Brazil). The authors wish to
express their sincere gratitude to Dr. Cláudio da Cunha for kindly supplying 6-
OHDA, and Dr. Aleksander R. Zampronio for providing LPS. The authors would
like to thank Mrs. Silvia N. C. Gennari for her capable technical assistance. SMZ,
ST and MABFV are recipient of CNPq fellowships.
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83
Legend to figures
Fig. 1. Locomotion frequency of rats treated with intranigral LPS, MPTP and 6-
OHDA, and evaluated in an open-field. The values represent mean ± S.E.M. for 10
animals in each group. , P<0.05 compared to the non-operated group; ,
P<0.01 compared to the non-operated group; , P<0.001 compared to the
non-operated group. Two way ANOVA followed by the Tukey test.
Fig.2. Rearing frequency of rats treated with intranigral LPS, MPTP and 6-OHDA,
and evaluated in an open-field. The values represent mean ± S.E.M. for 10 animals
in each group., P<0.05 compared to the non-operated group; , P<0.01
compared to the non-operated group. Two way ANOVA followed by the Tukey test.
Fig. 3. Latency (s) in initiating movement of rats treated with intranigral LPS, MPTP
and 6-OHDA, and evaluated in an open-field. The values represent mean ± S.E.M.
for 10 animals in each group. , P<0.001 compared to the non-operated
group. Two way ANOVA followed by the Tukey test.
Fig. 4. Immobility time (s) of rats treated with intranigral LPS, MPTP and 6-OHDA,
and evaluated in an open-field. The values represent mean ± S.E.M. for 10 animals
in each group. , P<0.05 compared to the non-operated group; , P<0.001
compared to the non-operated group. Two way ANOVA followed by the Tukey test.
Fig. 5. Immunoblot analyses of COX-2 and COX-1 expressions after Sham
surgery. a, Substantia nigra. b, striatum. Cell extracts from SN or striatum were
prepared at the indicated time points. A representative immunoblot for each tissue
is shown. The values represent the mean ± S.E.M. for 3 animals in each time point.
No significant differences were observed between groups.
Fig. 6. Immunoblot analyses of COX-2 and COX-1 expressions after LPS surgery.
a, Substantia nigra. b, striatum. Cell extracts from SN or striatum were prepared at
the indicated time points. A representative immunoblot for each tissue is shown.
84
The values represent the mean ± S.E.M. for 3 animals in each time point. ,
P<0.05 compared to the non-operated group; , P<0.01 compared to the non-
operated group. ANOVA followed by Newman-Keuls test.
Fig. 7. Immunoblot analyses of COX-2 and COX-1 expressions after MPTP
surgery. a, Substantia nigra. b, striatum. Cell extracts from SN or striatum were
prepared at the indicated time points. A representative immunoblot for each tissue
is shown. The values represent the mean ± S.E.M. for 3 animals in each time point.
, P<0.05 compared to the non-operated group. ANOVA followed by Newman-
Keuls test.
Fig. 8. Immunoblot analyses of COX-2 and COX-1 expressions after 6-OHDA
surgery. a, Substantia nigra. b, striatum. Cell extracts from SN or striatum were
prepared at the indicated time points. A representative immunoblot for each tissue
is shown. The values represent the mean ± S.E.M. for 3 animals in each time point.
, P<0.01 compared to the non-operated group. , P<0.001 compared to
the non-operated group. ANOVA followed by Newman-Keuls test.
85
Figures
Figure 1.
Figure 2.
86
Figure 3.
Figure 4.
87
a
b
Figure 5.
COX-2 72 kDa
COX-1
74 kDa
COX-2
72 kDa
COX-1
74 kDa
88
a
b
Figure 6.
COX-2 72 kDa
COX-2
72 kDa
COX-1 74 kDa
COX-1
74 kDa
89
a
b
Figure 7.
COX-1
74 kDa
COX-2
72 kDa
COX-2 72 kDa
COX-1
74 kDa
90
a
b
Figure 8.
COX-2
72 kDa
COX-1
74 kDa
COX-2
72 kDa
74 kDa
COX-1
91
COX-2 inhibitor parecoxib produces neuroprotective effects in MPTP-
lesioned rats
Angela Reksidler Braga
1
, Marcelo de Meira Santos Lima
1
, Sílvio Marques Zanata
2
,
Hidevaldo Bueno Machado
1‡
, Cláudio da Cunha
1
, Roberto Andreatini
1
, Sergio
Tufik
3
and Maria A. B. F. Vital
1†
(4) Departamento de Farmacologia, Universidade Federal do Paraná, Curitiba,
PR, Brasil;
(5) Departamento de Patologia Básica, Universidade Federal do Paraná, Curitiba,
PR, Brasil;
(6) Departamento de Psicobiologia, Universidade Federal de São Paulo, SP,
Brasil;
†Corresponding Author
Dr. Maria A. B. F. Vital
Universidade Federal do Paraná
Setor de Ciências Biológicas
Departamento de Farmacologia
Av. Francisco H. dos Santos s/n
CEP: 81.531 – 990
Caixa Postal: 19031
Curitiba – Paraná – Brasil
FAX number: 0055-041-266 2042
0055-041-361 1720
E-mail: [email protected]
‡ Present address: Department of Molecular and Medical Pharmacology,
University of California - Los Angeles, USA.
92
Abstract
The present study investigated the potential of parecoxib (Bextra
), a selective
COX-2 inhibitor, to prevent motor and cognitive impairments observed in rats after
an intranigral infusion of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP), a
model of the early phase of Parkinson’s disease. The treatment with parecoxib 10
mg/kg given before the surgery and 2 mg/kg daily for the subsequent 21 days,
prevented the MPTP-treated rats from presenting decreased locomotor and
exploratory behavior, increased immobility, and impairment while performing the
cued version of the Morris water maze. Furthermore, parecoxib treatment also
significantly prevented the reduction of tyrosine hydroxylase protein content in the
substantia nigra pars compacta (7, 14 and 21 days after surgery), and in the
striatum (14 and 21 days after surgery) as immunorevealed by western blotting.
These results strongly suggest a neuroprotective effect of parecoxib that reflect in
the motor and cognitive impairments of this animal model of the early phase of
Parkinson’s disease.
Keywords:
parecoxib, MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine), TH
(tyrosine hydroxylase), COX-2 (cyclooxygenase-2), Parkinson’s disease.
93
1. Introduction
Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative
disorder after Alzheimer’s dementia (Przedborski, 2005). The cardinal clinical
manifestations of Parkinson’s disease include bradykinesia, rest tremor, rigidity,
gait abnormalities and postural instability. These symptoms may be accompanied
by autonomic dysfunction, as well as psycho-organic disturbances, such as
depression, slowness of affect (Birkmayer and Riederer, 1985; Valldeoriola
et al
,
1997), and occasionally prominent dementia in the early stages of the illness
(Birkmayer and Riederer, 1985; Valldeoriola
et al
, 1997; Calne, 2001). The main
pathological characteristic of PD is the loss of pigmented dopamine (DA)-
containing neurons of the substantia nigra pars compacta (SNpc) associated with
the presence of cytoplasmic
α
-synuclein positive inclusions (Lewy bodies)
(Hassler, 1938; Hornykiewicz, 1966). Parkinsonian signs appear when neuronal
death exceeds a critical threshold: 70-80% of DA nerve terminals in the striatum
and 50-60% of SNc DA perikarya (Meissner
et al
, 2004).
To understand the physiopathology of PD, and to develop novel therapies
for improved symptomatic management, it is important to have relevant disease
models of PD, in which new pharmacological agents and treatment strategies can
be assessed before clinical trials are initiated (Beal, 2001; Betarbet
et al
, 2002).
MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) was discovered in 1982,
when a group of drug addicts developed sub-acute severe parkinsonism. The
syndrome was caused by self-administration of a synthetic heroin analog that had
been contaminated by MPTP (Langston
et al
, 1983; Ballard
et al
, 1985), which is
highly lipophilic and readily crosses the blood-brain barrier. MAO-B (monoamine
oxidase-B) in glial cells converts MPTP to MPP
+
(1-methyl-4-phenylpyridinium)
(Chiba
et al
, 1984), which is taken up via the neuronal dopamine transporter (DAT)
and accumulates in dopaminergic neurons (Gainetdinov
et al
, 1997). Mice that lack
this transporter are protected from MPTP toxicity. Absorbed MPP
+
concentrates in
mitochondria, where it inhibits complex
Ι
of the electron transport chain, thereby
reducing ATP generation and causing the production of ROS (reactive oxygen
94
species), inducing apoptotic death of dopaminergic neurons (Kitamura
et al
, 2003;
Speciale, 2002). MPTP is the most widely used and the best investigated model of
Parkinson’s disease (Gerlach and Riederer, 1996).
Numerous neurochemistry studies have shown that MPTP administration
predominately damages the nigrostriatal pathway, causing cell loss in the
substantia nigra (Heikkila
et al
, 1984; Sundström
et al
, 1987; German
et al
, 1996;
Gevaerd
et al
, 2001) and dopamine depletion in the neostriatum (Sonsalla and
Heikkila, 1986; Sundström
et al
, 1987; Da Cunha
et al
, 2001) mimicking in animals
the neurochemical alterations observed in Parkinson’s disease. In most of these
studies, a decrease in locomotion and/or rearing was observed following MPTP
administration (Sedelis
et al
, 2001).
Evidence from human and animal models of PD has suggested an important
role for neuroinflammation in the pathogenesis of the disease. COX-2 expression is
induced specifically within SNpc (substantia nigra pars compacta) dopaminergic
neurons in postmortem PD specimens and the MPTP mouse model of PD during
the destruction of the nigrostriatal pathway (Teismann
et al
, 2003).
Inflammation is the first line of defense against an infection, however, an
excessive inflammatory response can also be a source of additional injury to host
cells (Wyss-Coray and Mucke, 2002). The brain has a relatively low adaptative
immune response, but is vulnerable to innate immune reactions. Neurons, as a
result of a lack of ability to divide and little ability to recover from injury, are
extremely vulnerable to auto destructive immune and inflammation processes
(Compston, 1995; Carson and Sutcliffe, 1999). Inflammation has also been
implicated in the neurodegenerative process in animal models of PD, such as
MPTP. Inactivation of genes involved in inflammation such as those encoding
COX-2 (Feng
et al
, 2002), NADPH oxidase (Wu
et al
, 2003) and both TNF-
α
receptors (Sriram
et al
, 2002) protects dopamine-containing neurons against
MPTP-induced neurotoxicity, indicating that inflammation is an important
component of the MPTP-mediated neurodegenerative process (Gao
et al
, 2003).
The inhibition of COX-2 alone or both COX-1 and 2, by some selective and non-
selective nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in the various models of
95
neural injury, was shown to provide a neuroprotective effect (Aubin
et al
, 1998;
Kurkowska-Jastrz
ę
bska et al, 2002; Mohanakumar
et al
, 2000; Nakayama
et al
,
1998; Scali
et al
, 2000).
COX-2 is strongly suggested to play a detrimental role in neurodegeneration
and stimulation of an inflammatory process following neuronal death. Through
prostaglandin production and pro-inflammatory mechanisms and by ROS
formation, COX-2 may aggravate the degenerative process (Hoozemans
et al
,
2002; Teismann
et al
, 2003). It has been shown that COX-2 expression in neurons
correlates with apoptosis and is involved in neuronal response to stress
(Nakayama, 1995).
In some experiments, pretreatment with NSAIDs such as: indomethacin
(Kurkowska-Jastrzebska
et al
, 2002), acetaminophen, aspirin (Maharaj
et al
,
2004), rofecoxib (Teismann
et al
, 2003), dexamethasone (Kurkowska-Jastrzebska
et al
, 2004) led to partial or total protection against MPTP toxicity, demonstrating
good perspectives for new therapeutic approaches.
Therefore, the objective of the present study was to evaluate the possible
neuroprotective effect of parecoxib in rats that received intranigral infusions of
MPTP performing general activity test, water maze task cued test version and TH-
immunodetection.
2. Material and methods
2.1. Animals
Male Wistar rats from our colony weighing 280–320 g at the beginning of the
experiments were used. The rats were maintained in a temperature controlled
room (22 ± 2°C) on a 12 h light–dark cycle (lights on 7:00 a.m.) with free access to
food and water. All the behavioral experiments were conducted between 2:00 and
6:00 p.m. The animals used in this study were maintained and handled in
accordance with the guidelines of the Committee on Care and Use of Laboratory
Animal Resources, National Research Council, USA.
96
2.3. Procedures
The rats were divided at random and equally into the following groups:
control+saline, control+parecoxib, sham+saline, sham+parecoxib, MPTP+saline
and MPTP+parecoxib. All the groups received intraperitoneal injections of saline or
parecoxib (Bextra
, Pfizer, was freshly prepared by dissolving it in saline) one
hour before surgery (10mg/kg) and daily (2 mg/kg) until the end of the tests.
Experiment 1 – Effects of parecoxib in MPTP-lesioned rats in the general activity
test
To determine changes in motor behavior we choose the open field as a test
of general activity. Sixty rats distributed in groups: control+saline (n =10),
control+parecoxib (n = 10), sham+saline (n = 10), sham+parecoxib (n =10),
MPTP+saline (n =10) and MPTP+parecoxib (n =10), which performed the test 24
h, 7, 14 and 21 days after surgery.
Experiment 2 – Effects of parecoxib on water maze task, cued test version
To verify memory alterations we performed the water maze task, cued test
version, starting one week after surgery until the 18
th
day after surgery. Sixty rats
distributed in the following groups were used: control+saline (n =10),
control+parecoxib (n = 10), sham+saline (n = 10), sham+parecoxib (n =10),
MPTP+saline (n =10) and MPTP+parecoxib (n =10).
Experiment 3 – Effects of parecoxib on TH protein expression
To detect the presence of TH and its possible fluctuations in the SN and
striatum, after neurotoxin injection and during the parecoxib treatment, we used
three different rats per group in a triplicate assay. Tissue samples were obtained
24 h, 7, 14 and 21 days after surgery.
97
2.4. Stereotaxic Surgery
All the operated rats received atropine sulphate (0.4 mg/kg, intraperitoneal
[i.p.]) and penicillin G-procaine (20.000 U in 0.1 ml, intramuscular) and were
anesthetized with sodium thiopental (40 mg/kg). MPTP–HCl, (100
µ
g in 1
µ
L of
saline; Sigma, St. Louis, MO, USA) was bilaterally administered through a 30-
gauge stainless needle at a rate of 0.33
µ
l/min, for 3 min followed by 2 min post
injection for diffusion of the MPTP, according to the following coordinates:
anteroposterior (AP): - 5.0 mm from bregma; mediolateral (ML): ± 2.1 mm from
midline; dorsoventral (DV): - 7.7 mm from skull, adapted from Paxinos and Watson
(1986). Sham operations followed the same procedure but 1
µ
L aCSF instead of
MPTP was injected bilaterally into the SNpc. The composition of the aCSF was as
follows: 8.66 g NaCl, 0.205 mg KCl, 0.176 g CaCl
2
.2H
2
O and 0.173 g MgCl
2
.6H
2
O
in 1 L water.
2.4. General activity test
The general activity test was performed in an open-field constructed
according to Broadhurst (1960). The testing arena was round with a diameter of 97
cm. The circular wall was 32.5 cm high and was constructed of aluminum sheeting.
The arena was situated on a wood floor. The floor and the wall were painted white.
The arena floor was divided into three concentric circles. The small inner circle had
a diameter of 23 cm; the second circle had a diameter of 61 cm and the arena wall
defined the outer circle. Each circle was divided into essentially equal sized areas.
The number of areas in the inner circle, middle and outer circles was 1, 6 and 12,
respectively. A 100-W ceiling light was situated 48 cm above the arena floor.
Cheesecloth was draped from the ceiling and dropped outside the arena wall. The
cloth served to diffuse the light and functioned as a one-way screen. The rats were
observed individually for 5 min and the different groups were inter-mixed;
observations started at 8.00 a.m. and the animals were tested in the same order
every day. Hand-operated counters were used to score locomotion frequency
98
(number of floor units entered), rearing frequency (number of times the rats stood
on their hind legs), immobility time (number of seconds of lack of movement during
testing) and latency time (time taken to initiate movement). The apparatus was
washed with a water–alcohol (5%) solution before behavioral testing to eliminate
possible bias due to odors left by previous rats.
2.5. Memory task
The water maze apparatus consisted of a round tank 170 cm in diameter
and 50 cm high and with a water depth of 32 cm. The water temperature was
maintained at 22
°
C. The four starting positions were located at the intersections of
imaginary quadrants (northwest-NW, northeast-NE, southwest-SW and southeast-
SE). Several distal cues were placed on the walls of the water maze room. During
the experiments, the tank was videotaped and the scores for the latency in
reaching the escape platform, the swimming speed, and the swimming paths were
computed online by an image analyzer (2020 Plus tracking System - HVS Image,
UK).
The rats were submitted to a cued test version of the water maze that models a
stimulus-response habit leaning (implicit memory) known to be affected in
Parkinson’s disease patients (Knowlton
et al
, 1996). This test consisted of 11 days
training with four consecutive trials per day, during which the rats were left in the
pool facing the wall, and allowed to swim freely to a transparent acrylic platform (11
x 14 cm) submerged 2 cm below the water surface. The platform was placed in the
center of one of the four quadrants in the tank. All trials were terminated when the
rat found the platform or after a maximum period of 60 s, when the animal was
gently guided to the platform.
The platform had a cue consisting of 7-cm diameter white ball attached to
the top of the platform and protruding above the water. Furthermore, the position of
the platform was always changed in each trial of the day. After the rat escaped to
the platform, it was allowed to remain on it for 20 s and was then removed from the
tank for 30 s before being placed in the next random initial position (Miyoshi
et al
,
99
2002). Therefore, the rats could find the platform only by associating the visual cue
with the position of the hidden platform.
2.6. TH-immunodetection by western blotting
The rats were killed by decapitation and their brains were quickly dissected.
The SN and striatum
are immediately frozen in liquid nitrogen until the lysis
procedure performed in a 1.5 mL Eppendorf tube by sonication in presence of an
ice-cold buffer containing 50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1%
sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.25% sodium deoxycholate, 2 mM EDTA, 1 mM
dithiothreitol (DTT), 20
µ
M phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), and protease
inhibitors (Complete tablet; Roche, Indianapolis, IN). After incubation on ice for 30
min extracts were centrifuged at 10 000
g
for 20 min at 4
°
C, and the supernatants
for protein extracts were collected and stored at -80
°
C for further analysis. Protein
concentrations were measured by the Lowry method (Lowry
et al
, 1951). Protein
samples containing equal amounts of protein (30
µ
g per lane) were boiled with
SDS sample buffer and loaded onto 10% SDS-polyacrylamide gels. After
electrophoresis, the proteins were transferred to PVDF membranes. Each
membrane was blocked for 1 h with 10% nonfat dry milk/0.5% Tween-20 in Tris-
buffered saline (TBST).
The membranes were probed overnight at 4
°
C with mouse monoclonal antibodies
specific to TH (1:2 000; Sigma, St. Louis, MO, USA). After several washes in TBST
the membranes were incubated with IgG horseradish peroxidase-conjugated (1:5
000; Amersham) for 60 min and visualized by chemiluminescent substrate (Santa
Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Each gel contained lanes from all groups.
The bands were quantified by using the software ImageJ 1.32j public domain
(http://rsb.info.nih.gov.ij/).
2.7. Statistical analysis
For analysis of variance, the Bartlett test (Johnson and Leone, 1974) was
applied to the open field data. It was concluded that all the results were parametric.
Thus, two-way analysis of variance (ANOVA) with repeated measurements was
100
employed to detect differences between the two factors analyzed, treatments and
time. For open field and water maze task data, the Tukey test was used as post
hoc when it was indicated by ANOVA. Western blotting data were analyzed by
ANOVA and the Newman-Keuls test. Differences were considered significant if
P<0.05. The values were reported as mean ± S.E.M.
3. Results
Experiment 1 – Effects of parecoxib in MPTP-lesioned rats in the general activity
test
Table 1 presents the scores of all groups tested in the open field test 24 h,
7, 14 and 21 days after surgery. The results indicated that 24 h after the infusion of
the neurotoxin, MPTP+saline rats exhibited a significant decrease in locomotion in
comparison to the control groups (control+saline, control+parecoxib, sham+saline
and sham+parecoxib) (F(5,47) = 12.29; P < 0.0001). In addition, 7 and 14 days
after the MPTP lesion, MPTP+saline treated rats showed a significant increase in
locomotion when they were compared to the control groups (F
7days
(5,50) = 3.54; P
= 0.008) (F
14days
(5,44) = 4.01; P = 0.0044). Twenty one days after the lesion this
group presented no differences from the others. Surprisingly the MPTP+parecoxib
rats showed a significant increase in locomotion when this group was compared
with all groups 24h after surgery (F(5,47) = 12.29; P < 0.05). These
MPTP+parecoxib animals also showed a significant increase in locomotion
frequency 21 days after the MPTP infusion, in comparison to control+saline and
control+parecoxib rats (F(5,41)= 3.63; P = 0.0082).
Rearing frequencies 24 h after surgery indicated that MPTP+saline rats
presented a significant reduction in this motor sign only in comparison with the
control+parecoxib group (F(5,50) = 3.066; P = 0.0172). In contrast, MPTP-lesioned
rats showed an increase in rearing in the session performed 7 days after the
surgery when this group was compared to controle+saline (F(5,49) = 2.60; P =
0.0362). Prior long-term treatment with parecoxib did not change the rearing
101
behavior in the control nor in the MPTP-lesioned rats. Fourteen and 21 days after
the surgery there was no difference between the groups.
The immobility time 24 h after surgery for MPTP+saline rats exhibited no
statistical difference from control rats but showed a significant increase in
immobility time in comparison to the MPTP+parecoxib group (F(5,46) = 4.43; P =
0.0022). Moreover, in the session of observation performed 7 days after surgery,
the MPTP+saline group showed a decrease in this parameter when compared to
controle+saline and sham+saline (F(5,45) = 3.43; P = 0.0102). However, 14 days
after the lesion, both groups of MPTP-lesioned rats presented a decrease
compared to the control+saline group (F(5,44) = 4.28; P = 0.0029). Finally, 21 days
after surgery only the rats of the MPTP+parecoxib group showed a reduction in
immobility time when compared to control+saline rats (F(5,39) = 2.97; P = 0.022).
Experiment 2 – Effects of parecoxib on water maze task, cued test version
As can be seen in figure 1, the learning of the cued task can be deduced by
the significant and progressive reduction in the latency in finding the cued platform
(F (11,224) = 235, P<0.0001 – day factor). MPTP-lesioned rats took significantly
longer latency times to find the platform from the 4
th
day to the 9
th
training days and
this effect was prevented by the parecoxib treatment (F (11,191) = 202, P<0.0001
– treatment factor; P<0.05, post-hoc Tukey test). Figure 2 presents representative
trajectories of each group (a: control+saline; b: control+parecoxib; c: Sham+saline;
d: Sham+parecoxib; e: MPTP+saline; f: MPTP+parecoxib) during the 4
th
day of
training in the water maze task cued test version.
Experiment 3 – Effects of parecoxib on TH protein expression
The western blotting analyses of SN revealed a significant reduction of 30%
in the TH-content of the MPTP+saline (P<0.05) and 20% for MPTP+parecoxib
(P<0.05) groups 24 h after surgery (figure 3a). The sham group did not exhibit any
difference in the TH-content in comparison with control+saline group. Striatum
102
response, 24 h after surgery, showed an absence of TH ablation for both the
MPTP+saline and MPTP+parecoxib groups in comparison to the control+saline
group (figure 3b).
As can be seen in figure 4a, the MPTP+saline group presented a significant
reduction (P<0.05) of 20% in TH-content, in comparison with the control+saline
group in the SN 7 days after surgery. The MPTP+parecoxib group exhibited no
difference in comparison to the control+saline group. Figure 4b shows the same
analysis realized in the striatum. No differences in TH content were observed
among the groups.
The data presented in figures 5a and 5b revealed a significant reduction
(P<0.05) of 26% and 24% in TH-content for the MPTP+saline group 14 days after
surgery, in comparison with the control+saline group, observed in SN and striatum
tissues respectively. The MPTP+parecoxib group exhibited no difference in
comparison with the control+saline group for both SN and striatum, 14 days after
surgery.
As can be seen in figures 6a and 6b, the MPTP+saline group presented a
significant reduction (P<0.05) of 28% and 20% in TH-content 21 days after surgery
in comparison with the control+saline group, observed in SN and striatum tissues
respectively. The MPTP+parecoxib group exhibited no difference in comparison
with the control+saline group for both SN and striatum, 21 days after surgery.
4. Discussion
Our data are in agreement with previous studies showing that the infusion of
MPTP into the SNpc can be considered a good animal model for studying the
impairment of motor activity and the early memory impairment associated with
Parkinson’s disease. Thus, this established model is reproduced in our group with
a significant reduction of striatal dopamine levels and a pronounced loss of
dopaminergic cells, verified in MPTP-lesioned rats (Da Cunha
et al
, 2001; Gevaerd
et al
, 2001; Miyoshi
et al
, 2002; Perry
et al
, 2004; Ferro
et al
, 2005).
103
The bilateral intranigral injection of this neurotoxin produced a reduction in
locomotion (P<0.05) and rearing (P<0.05) performances of the rats in the open
field observed 24 h after surgery. This hypokinesia is an important feature of this
model which has face validity with PD. Moreover, the result suggests that the
lesion probably produced significant destruction in the dopaminergic neurons of the
SNpc, which was correlated with a reduction in the TH expression in this region 24
h, 7, 14 and 21 days after the MPTP infusion in MPTP+saline rats. In addition, we
also observed a hypermotility for the MPTP+saline group at 7 and 14 days after
surgery, which could be considered as a dopaminergic adaptative response to the
lesion. This fact can be seen behaviorally by the increase (P<0.05) in locomotion
frequency, accompanied by a decrease in immobility time (P<0.05) at 7 and 14
days after surgery for the MPTP+saline group. This suggests that the rats of this
group had an exacerbated dopaminergic response, which returns to normal 21
days after surgery. These data are in agreement with those from Tanila
et al
,
(1998) and Perry
et al
, (2004) who demonstrated that MPTP treated mice and rats,
respectively, were hyperactive in comparison with their control groups.
In contrast, the MPTP+parecoxib group did not differ from the control rats 24
h, 7 and 14 days after the surgery. This fact is suggestive of a neuroprotective
effect of parecoxib. It is a prodrug of valdecoxib, which is a second generation of
selective COX-2 inhibitor (Satyanarayana
et al
, 2004), revealed to be an effective
way to prevent the hypolocomotion caused by MPTP, 24 h after the lesion and also
able to interfere in other parameters commonly impaired by MPTP-lesion, such as
rearing and immobility, at 24 h, 7, 14 and 21 days after surgery. Seven and 14
days after the surgery, this group did not differ from the control group in any of the
parameters observed in an open-field. Conversely, 21 days after the MPTP
infusion, MPTP+parecoxib exhibited a hyperlocomotion in comparison to the
control+saline group. This result could be interpreted such as reduction in
habituation to the open-field after prolonged administration of parecoxib. However,
the control+parecoxib group showed similar performance to the control rats in this
test. Thus, the results of the cued version indicated that parecoxib also presents a
protective effect in this memory task.
104
A bilateral intranigral injection of MPTP produced a reduction in the
performance of animals in an active avoidance task (Da Cunha
et al
, 2001;
Gevaerd
et al
, 2001; Perry
et al
, 2004), impaired learning in a cued version
(Miyoshi
et al
, 2002; Perry
et al
, 2004) and also in a spatial working memory
version of the water maze (Miyoshi
et al
, 2002).
The analysis of the latency in finding the platform and trajectories in the
cued test showed that the MPTP+saline rats exhibited an increase (4
th
to 9
th
days
of test) in this parameter in comparison to the control group. The impairment of the
ability to perform the cued version of the water maze after MPTP administration in
the MPTP+saline group was probably due to lesioning of the dopaminergic
pathway, since lesioning of the dorsolateral caudate-putamen is known to impair
the ability of rats to perform this task (Packard and McGaugh, 1992; Devan and
McDonald, 1999). However, it is noteworthy that on the 10
th
day after testing these
(animals) rats did not differ from control rats, a result similar that found by Miyoshi
et al,
(2002). It is possible that the partial lesioning of the nigrostriatal dopaminergic
system when learning the cued task can be compensated for by overtraining,
because the performance of the MPTP+saline rats did not differ from control rats
by the 10
th
training day; at the time that MPTP-lesioned rats would have
compensated for the deficit caused by striatal dopamine depletion by using
alternative processing systems or by using a different strategy to find the cued
platform (Miyoshi
et al,
2002). This effect may also be due to the fact that the
lesion is partial. This is a hypothesis that deserves further consideration in future
experiments.
Interestingly, the MPTP+parecoxib rats did not differ from the control group
with respect to the latency in finding the platform in the cued version of the Morris
water maze. Again, this COX-2 inhibitor presented a neuroprotective effect in
MPTP-lesioned rats in preserving the memory system related to this task.
Moreover, swimming velocity was isolated increased (P<0.05) only for the
MPTP+parecoxib group on the 6
th
training day, in comparison to the control+saline
group (data not shown). Data from the literature regarding the effect of parecoxib
on the memory are absent. Moreover, the prolonged administration of parecoxib in
105
the saline+parecoxib group did not differ from the control group in this task.
Nevertheless, Sharifzadeh
et al,
(2005) demonstrated that intrahippocampal
infusion of the COX-2 inhibitor celecoxib impaired spatial memory retention in the
Morris water maze. Bilateral intrahippocampal infusion of celecoxib increased
escape latency and travel distance in rats, indicating significant impairment of
spatial memory retention. Further systematic studies using the COX-2 inhibitors
and memory tasks are necessary to clarify this controversy.
Immunoblotting analyses provide evidence that MPTP provokes a significant
reduction of 30% in the TH-content of the SN 24 h after its bilateral infusion.
Moreover, 7 days after surgery the MPTP-lesioned rats presented a significant
reduction of 20% in the TH-content presented in the SN. Fourteen days after
surgery we observed that the MPTP-lesioned rats still presented a significant
reduction of 26% in the TH-content of the SN, now also accompanied by a
significant reduction of 24% in the TH-content in the striatum. Finally, the last time
point observed (21 days after surgery) both the SN and striatum exhibited
significant reductions in TH-content, 28% and 20% respectively. Interestingly, only
from the 14
th
to the 21
st
day after surgery was a significant reduction in TH-content
in the striatum observed. These results are in agreement with those found by
Czlonkowska
et al,
(1996) who demonstrated that the loss of TH staining in the SN
and striatum up to 14 days after an MPTP injection in C57Bl/6 mice and with
Kurosaki
et al,
(2004). The latter authors showed a reduction in TH immunostaining
both in the SN and striatum up to 7 days after MPTP treatment in mice.
In the current study, parecoxib appears to protect the TH-content from
MPTP-induced lesions in the SN, starting from the 7
th
until the 21
st
day after
surgery. The same effect was observed after 14 and 21 days in the striatum.
Nevertheless 24 h after surgery, parecoxib was unable to prevent the reduction of
TH-content present in the SN. The molecular mechanism of parecoxib that
attenuated TH reduction in the present study is unknown.
Present results suggest a possible neuroprotective effect conferred by
parecoxib on this model of Parkinson’s disease. In agreement with this, several
lines of evidence show that COX-2 contributes to neuronal cell death both in vitro
106
and in vivo. Cyclooxygenase catalyzes the formation of prostaglandins, which
involves the reduction of a hydroperoxide, resulting in the generation of free
radicals (Klivenyi
et al
, 2003). Thus, Przybylkowski
et al,
(2004) showed that
rofecoxib treatment started after an insult failed to protect neurons from MPTP
toxicity. On the other hand, rofecoxib treatment started before MPTP administration
had a clear neuroprotective effect, comparable with that observed in COX-2
knockout mice (Teismann
et al
, 2003). This kind of treatment was demonstrated to
be effective in our model, corroborating the idea of a neuroprotective mechanism
attributed to COX-2 inhibition (Przybylkowski
et al
, 2004). Finally, the possibility
exists that COX-2 up-regulation could amplify the neurodegenerative process
specifically in SNpc dopaminergic neurons, thus rendering these neurons more
prone than other neurons to succumb to MPTP toxicity or Parkinson’s disease
injury (Teismann
et al
, 2003).
Another possible mechanism of neuroprotection conferred by parecoxib
action is the reduction of the oxidative stress caused by MPTP. This neurotoxin is
associated with an increase in ROS. Moreover, MPP
+
translocates into synaptic
vesicles where it stimulates the extrusion of synaptic dopamine (Rollema
et al
,
1988). The resulting excess cytosolic dopamine can readily undergo autoxidation,
thus generating a huge burst of ROS, subjecting nigral neurons to oxidative stress
(Lotharius and O’Malley, 2000). Alternatively, oxidation of cytosolic dopamine can
also be catalyzed by enzymes such as COX-2 (Hastings, 1995), which is
upregulated in the remaining nigral dopaminergic neurons in both MPTP-treated
mice and in human post-mortem samples (Teismann
et al
, 2003). In fact the
neuroprotective effect suggested for parecoxib is probably more strongly linked
with its higher selectivity for COX-2 isoenzyme. Cyclooxygenases has been
implicated in the signaling mechanisms of receptors other than dopamine including
glutamate and GABA, both of which are known to play important roles in motor
behavior (Lazarewicz
et al
, 1990; Mollace
et al
, 1995).
Therapeutically, the use of anti-inflammatory drugs to prevent DA
degeneration in PD has not yet been formally tested in patients. The concept that
anti-inflammatory agents may be beneficial in PD thus relies on pre-clinical studies
107
of in vitro or in vivo models of the disease. In vivo, various compounds, such as
nonsteroidal anti inflammatory drugs (NSAIDs), with their targets COX, NF
κ
B and
others, steroids, immunophilins, thalidomide, and phosphodiesterase
IV inhibitors have been studied with variable results (Hirsch
et al
, 2003).
Finally, parecoxib treatment (10 mg/kg one hour before the surgery and 2
mg/kg daily) was effective in preventing motor deficits 24 h after surgery (observed
in the open field). In fact, parecoxib restored TH-content in the SN 7, 14 and 21
days after surgery, and in the striatum 14 and 21 days after surgery. In addition,
parecoxib treatment reversed memory impairment from the 4
th
to 9
th
day (observed
in the cued test).
In conclusion, the present results are suggestive of some important findings:
1) there is inverse relation between COX-2 and TH; 2) The neurodegenerative
process started in the SN immediately (24h) after the surgery and remain until 21
days after MPTP-lesion (MPTP+saline); 3) Daily parecoxib treatment was able to
protect, or even prevent, the neurodegeneration process in the SN 7 days after the
injury; 4) In the striatum the reduction was detected only 14 days after the lesion
and remain until 21 days after (MPTP+saline group). Future experiments will help
to understand this neuroprotective process.
Acknowledgments
This work was supported by the CAPES and CNPq (Brazil). The authors
would like to thank Mrs. Silvia N. C. Gennari for her capable technical assistance.
SMZ, CC, RA, ST and MABFV are recipients of CNPq fellowships.
108
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Figure Legends
Figure 1. Effects of parecoxib treatment on the latency time (s) of the water maze
task - cued test version (
n
= 10 each group). The animals were submitted to four
daily trials to find a submersed platform with a visual cued for 11 training days.
Data are expressed as mean ± S.E.M. Two-way ANOVA followed by Tukey test
showed a significant difference in comparison to control+saline group.
Figure 2. Representative trajectories of each group (a: control+saline; b:
control+parecoxib; c: Sham+saline; d: Sham+parecoxib; e: MPTP+saline; f:
MPTP+parecoxib) during the 4
th
day of training in the water maze task cued test
version.
Figure 3. Western blotting of TH performed with samples obtained from a the SN
and b the striatum 24 h after surgery with control, sham and MPTP groups treated
with saline or parecoxib. The picture shown is a representative of a triplicate assay
with three different rats per group. Data are expressed as mean
±
S.E.M. *P<0.05
compared to the control+saline group. ANOVA followed by the Neuman-Keuls test.
Figure 4. Western blotting of TH performed with samples obtained from a SN and
b striatum 7 days after surgery with control, sham and MPTP groups treated with
saline or parecoxib. The picture shown is a representative of a triplicate assay with
three different rats per group. Data are expressed as mean
±
S.E.M. *P<0.05
compared to the control+saline group. ANOVA followed by the Neuman-Keuls test.
Figure 5. Western blotting of TH performed with samples obtained from a SN and
b striatum 14 days after surgery with control, sham and MPTP groups treated with
saline or parecoxib. The picture shown is a representative of a triplicate assay with
three different rats per group. Data are expressed as mean
±
S.E.M. *P<0.05
compared to the control+saline group. ANOVA followed by the Neuman-Keuls test.
117
Figure 6. Western blotting of TH performed with samples obtained from a SN and
b striatum 21 days after surgery with control, sham and MPTP groups treated with
saline or parecoxib. The picture shown is a representative of a triplicate assay with
three different rats per group. Data are expressed as mean
±
S.E.M. *P<0.05
compared to the control+saline group. ANOVA followed by the Neuman-Keuls test.
Table 1. Effects of parecoxib treatment in control, sham and MPTP-lesioned
groups of rats observed in the open field 24 h, 7, 14 and 21 days after surgery.
Data are expressed as mean ± S.E.M. (
n
= 10 each group) *P<0.05; **P<0.01.
Two-way ANOVA followed by Tukey test showed a significant difference in
comparison with the control+saline group.
118
Table 1
Locomotion
frequency
Rearing
frequency
Immobility time
(s)
24 h
Control+saline 86.5 ± 7.4 28.0 ± 1.9 47.0 ± 9.8
Control+parecoxib 70.1 ± 7.0 31.1 ± 4.1 40.6 ± 8.8
Sham+saline 86.0 ± 9.1 23.7 ± 3.7 26.7 ± 7.6
Sham+parecoxib 75.3 ± 11.0 25.4 ± 6.6 48.6 ± 9.9
MPTP+saline 32.6 ± 3.8* 12.4 ± 1.9* 58.4 ± 14.9
MPTP+parecoxib 105.0 ± 5.9 21.4 ± 3.0 1.1 ± 0.6*
7
th
day
Control+saline 45.3 ± 9.1 16.1 ± 2.7 76.6 ± 18.8
Control+parecoxib 47.1 ± 7.5 20.4 ± 2.8 72.3 ± 11.1
Sham+saline 68.4 ± 12.2 24.7 ± 4.9 81.1 ± 25.4
Sham+parecoxib 87.4 ± 15.0 28.9 ± 5.8 51.5 ± 15.3
MPTP+saline 102.7 ± 17.4* 32.7 ± 2.6* 15.3 ± 7.6*
MPTP+parecoxib 87.1 ± 11.1 21.8 ± 2.8 31.3 ± 9.0
14
th
day
Control+saline 22.5 ± 4.2 14.3 ± 4.2 156.7 ± 20.8
Control+parecoxib 41.3 ± 7.6 18.7 ± 3.0 95.0 ± 13.2
Sham+saline 55.1 ± 11.8 17.6 ± 4.0 79.6 ± 23.9
Sham+parecoxib 50.2 ± 11.4 14.5 ± 5.0 83.5 ± 21.7
MPTP+saline 92.7 ± 19.8* 20.0 ± 5.3 36.2 ± 15.5**
MPTP+parecoxib 61.8 ± 8.3 27.8 ± 7.0 52.0 ± 15.5**
21
st
day
Control+saline 25.1 ± 5.8 9.7 ± 0.9 125.4 ± 14.5
Control+parecoxib 24.3 ± 6.4 13.6 ± 3.9 103.0 ± 24.7
Sham+saline 52.4 ± 10.2 14.3 ± 2.8 97.9 ± 33.0
Sham+parecoxib 48.7 ± 15 13.9 ± 4.3 66.4 ± 20.0
MPTP+saline 57.1 ± 13.1 17.9 ± 4.4 64.3 ± 22.3
MPTP+parecoxib 90.0 ± 19.6* 25.0 ± 4.1 22.9 ± 11.1*
119
120
Figure 2
121
122
123
124
125
126
127
128
