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FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE
PÓS-GRADUAÇÃO EM OCEANOGRAFIA BIOLÓGICA
FILOGENIA DA REGIÃO CONTROLE DO DNA
MITOCONDRIAL E AVALIAÇÃO DA
CONTAMINAÇÃO POR METAIS NA PELE DO
LEÃO-MARINHO (Otaria flavescens)
ENCALHADOS NO RIO GRANDE DO SUL
LIANE DE OLIVEIRA ARTICO
Tese apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Oceanografia Biológica da
Fundação Universidade Federal do Rio
Grande, como requisito parcial à obtenção do
título de MESTRE
Orientador: Prof. Dr. Adalto Bianchini
Co-orientador: Prof. Dr. Luis Fernando Marins
RIO GRANDE
07/2007
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Milhares de livros grátis para download.
III
Aos meus pais.
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IV
Agradecimentos
Gostaria de agradecer a todos que colaboraram para realização deste trabalho
contribuindo imensamente para meu crescimento profissional e pessoal.
Ao meu orientador Adalto Bianchini por acreditar na proposta de trabalho, pelo
apoio e otimismo em todas as horas.
Ao meu co-orientador Luís Fernando Marins pela oportunidade de realizar esse
trabalho, pela dedicação, discussões e paciência nestes anos de trabalho e
convivência.
A todos os membros do Laboratório de Bioquímica Marinha da FURG, que fazem
parte de uma excelente equipe de colegas, profissionais e grandes amigos!
A toda Equipe do NEMA pelo fornecimento do material para realizar este
trabalho, pelo apoio, interesse e muita emoção nas coletas!
A equipe do Laboratório de Zoofisiologia da FURG pela amizade e ajuda em
especial à Sandrinha.
Ao Centro de Biologia Genômica e Molecular da PUC/Porto Alegre pelas
análises genéticas e apoio, em especial ao Sandro Bonatto, Cladinéia, Raquel e a
Larissa pelas sugestões, questionamentos e interesse.
Ao Professor Kinas pela disposição e colaboração nas análises estatísticas. Ao
Joamar Laurino pela parte inicial do seqüenciamento do material.
As minhas eternas amigas que mesmo longe são fundamentais e sempre
presentes: Lu Bavaresco, Beta Basso, Beti Careli, Ro Carrer, Di Bordin, Lu Aver e
Fer Barea. As amigas Dani Volcan, Tati Ávila, Ka Meyer e Lupe por todos os
momentos divididos, parceria, crescimento, apoio, alegrias e paciência, sendo
minha segunda família nesse tempo em Rio Grande. Aos amigos João Pedro,
Ilka Filipini e Caro Schio pelo incentivo na direção marinha.
Aos amigos Frederico Ceccon, Márcio Azevedo, Ju Sandrini, Nino, Bruna, Jesus
pela ajuda, companheirismo e amizade. A Maíra pela amizade e ajuda no
trabalho com traduções e discussões. Ao meu amigo Marcelo pelas fotos que
foram gentilmente cedidas e quase raptadas. As amigas Lea e Malu pelos
ensinamentos, oportunidades de crescimento e harmonização.
Ao Leo por dividir as dificuldades e alegrias das minhas escolhas com muito
carinho e muita paciência!
Às famílias Artico, Paim, Bertelli, Bernardi, Castilhos e Volcan pelo apoio,
torcida e muito carinho. Ao meu querido irmão Mauri, a Ana Carpegiani e a
minha tia Jussara pelo carinho e apoio;
Ao Tiago pela grande ajuda na confecção dos mapas, do banco de dados,
correções e discussões em geral, mas principalmente pelo carinho, dedicação,
amor e todos os momentos especiais compartilhados na etapa final!
Aos meus Pais por todo respeito e confiança, pelo apoio e incentivo em todos
os momentos, pelas oportunidades que me proporcionaram, pelo amor
incondicional, por tudo!!!
À Fundação Universidade do Rio Grande (FURG) pela qualidade do ensino
público e gratuito, à SANC e seus motoristas pelas saídas à campo. Ao
Programa de Pós-graduação em Oceanografia Biológica. Ao Conselho
Nacional de Pesquisa (CNPQ) pela bolsa de estudo.
Ao apoio da Fundação O Boticário e IBAMA para realização deste trabalho.
V
ÍNDICE
LISTA DE TABELAS______________________________________________________________ VI
LISTA DE FIGURAS ______________________________________________________________VII
Resumo ________________________________________________________________________ VIII
Abstract__________________________________________________________________________ X
1. Introdução _____________________________________________________________________ 1
1.2. Justificativa_________________________________________________________________ 6
1.3. Hipótese____________________________________________________________________ 7
1.4. Objetivos ___________________________________________________________________ 7
1.2.1 Objetivo Geral ___________________________________________________________ 7
1.2.2. Objetivos específicos ____________________________________________________ 8
2. Capítulo I: VARIABILIDADE GENÉTICA DA REGIÃO CONTROLE DO mtDNA DO LEÃO-
MARINHO (Otaria flavescens, SHAW 1800) E ANÁLISE FILOGENÉTICA ENTRE
REPRESENTANTES DE OTARIIDAE. ________________________________________________ 9
2.1. Introdução__________________________________________________________________ 9
2.2. Materiais e Métodos ________________________________________________________ 11
2.2.1. Área de Estudo_________________________________________________________ 11
2.2.3. Extração de DNA e Seqüenciamento _____________________________________ 13
2.2.4. Análise do mtDNA ______________________________________________________ 14
2.2.5. Árvore Filogenética_____________________________________________________ 15
2.3. Resultados ________________________________________________________________ 15
2.3.1. Banco de Dados________________________________________________________ 15
2.3.3. Árvore Filogenética_____________________________________________________ 18
2.4. Discussão _________________________________________________________________ 23
2.5. Conclusões________________________________________________________________ 29
2.6. Recomendações _____________________________________________________________ 30
3. Capítulo II: CONCENTRAÇÃO DE METAIS NO EPITÉLIO DO LEÃO-MARINHO (Otaria
flavescens, SHAW 1800) NO LITORAL DO RIO GRANDE DO SUL (BRASIL). ____________ 31
3.1. Introdução_________________________________________________________________ 31
3.2. Materiais e Métodos ________________________________________________________ 35
3.2.1. Área de Estudo_________________________________________________________ 35
3.2.2. Dados de Coleta________________________________________________________ 35
3.2.3. Análise de Metais_______________________________________________________ 36
3.2.4. Análise Estatística______________________________________________________ 36
3.3. Resultados ________________________________________________________________ 38
3.3.1. Banco de Dados________________________________________________________ 38
3.3.2. Variações Sazonais_____________________________________________________ 41
3.3.3. Variação Genética ______________________________________________________ 43
3.3.4 Variações Sexuais e Biométricas_________________________________________ 44
3.3.5. Grau de decomposição da amostra ______________________________________ 45
3.4. Discussão _________________________________________________________________ 46
3.5. Conclusões________________________________________________________________ 52
4. Conclusão Geral_______________________________________________________________ 53
5. Referências Bibliográficas______________________________________________________ 53
VI
LISTA DE TABELAS
Tabela Título Página
1
Haplótipos descritos no presente trabalho (OFA1-7) para região controle do
mtDNA de Otaria flavescens na costa do Rio Grande do Sul (Sul do Brasil).
Juntamente com os haplótipos presentes no GenBank para outras espécies
de leão-marinho.
18
2
Haplótipos descritos para o gene do Citocromo b do mtDNA, presentes no
GenBank para diferentes espécies de leão-marinho.
18
3
Concentração média (± erro padrão) de metais na pele do leão-marinho
Otaria flavescens amostrados no litoral sul do Rio Grande do Sul, no
inverno. Não foi observada diferença significativa (P>0,05) entre os grupos
haplotípicos para cada metal analisado.
42
4
Concentração média (± erro padrão) de metais na pele do leão-marinho
Otaria flavescens amostrados no litoral sul do Rio Grande do Sul no
inverno, em função do sexo. Não houve diferença significativa (P>0,05)
entre os sexos para cada metal analisado.
43
5
Valores dos coeficientes de correlação de Spearman (R) e da probabilidade
(P) entre o comprimento total e a concentração de metais na pele de leões-
marinhos Otaria flavescens amostrados no litoral sul do Rio Grande do Sul,
no inverno (n = 21).
44
6
Concentração média (± erro padrão) de metais na pele do leão-marinho
Otaria flavescens amostrados no litoral sul do Rio Grande do Sul no
inverno, conforme o grau de decomposição da amostra (G1: animal recém-
morto; G2: carcaça intacta e rigor mortis; G3: carcaça com forte cheiro e
líquidos escorrendo e G4: carcaça em processo de putrefação com grandes
danos no corpo). Não houve diferença significativa (P>0,05) entre os
grupos de amostras para cada metal analisado.
45
7
Concentrações médias de metais (µg/g de peso seco) na pele de diferentes
espécies de mamíferos marinhos.
48
VII
LISTA DE FIGURAS
Figura Título Página
1
Indivíduo adulto de Otaria flavescens no Molhe Leste da Barra de Rio
Grande (RS).
2
2
Área de estudo que compreende a Barra da Lagoa do Peixe em Mostardas
até a Barra do Chuí (Chuí). As amostras de leão-marinho estão plotadas no
mapa de acordo com seus dados de encalhe para o litoral do Rio Grande
do Sul (Brasil).
12
3
a) Leões-marinhos no REVIS do Molhe Leste, b) Leão-marinho morto na
praia do Cassino, c) Coleta de tecido para análise de metais e genética.
14
4
Rede contendo as 56 seqüências de Otaria flavescens com os respectivos
haplótipos do mtDNA encontrados na costa do Rio Grande do Sul (Brasil).
O quadrado preto indica um haplótipo ancestral intermediário. O tamanho
dos círculos é proporcional ao número de indivíduos identificados para cada
haplótipo.
17
5
Resultado da análise filogenética de representantes da família Otariidae,
baseado na máxima parsimônia. A árvore foi construída a partir de um
fragmento de 287pb da região controle do mtDNA contendo os sete novos
haplótipos de O. flavescens descritos neste trabalho. Os valores dos
bootstrap para os grupos principais estão indicados nos ramos com 1000
interações. As seqüências utilizadas para análise foram retiradas do
GenBank e como grupo externo foi adotado o Callorhinus ursinus.
21
6
Resultado da análise filogenética de representantes da família Otariidae,
baseado na máxima parsimônia. A árvore foi construída a partir de um
fragmento de 360pb da região do Citocromo b do mtDNA contendo as
seqüências presentes no GenBank. Os valores dos bootstrap para os
grupos principais estão indicados nos ramos com 1000 interações. A
seqüência utilizada para representar o grupo externo foi o Callorhinus
ursinus.
22
7
Área de estudo com o local de coleta das amostras de leão-marinho Otaria
flavescens e plotadas conforme as respectivas concentrações de Cd, Fe e
Pb.
38
8
Área de estudo com o local de coleta das amostras de leão-marinho Otaria
flavescens e plotadas conforme as respectivas concentrações de Ag, Cu e
Zn.
39
9
Concentração de metais na pele de leões-marinhos Otaria flavescens
amostrados no litoral sul do Rio Grande do Sul (n = 49) no outono (n = 9),
inverno (n = 24), primavera (n = 9) e verão (n = 7).
41
VIII
Resumo
Ao longo da costa brasileira existem dois locais de agregação do leão-
marinho Otaria flavescens (Ilha dos Lobos e Molhe Leste da Barra do Rio
Grande), ambos no Rio Grande do Sul. Esses locais estão sob constante
influência de impactos naturais e antrópicos (poluição e pesca), que oferecem
riscos aos animais aquáticos (toxicidade e perda de variabilidade genética).
Devido a bioacumulação e persistência dos metais, suas concentrações nos
tecidos de mamíferos podem caracterizar grupos ecológicos distintos a partir
de um perfil de contaminação ambiental. No presente estudo, o grau de
diferenciação entre leões-marinhos encontrados mortos no litoral Sul do Rio
Grande do Sul, entre maio de 2005 e setembro de 2006, foi avaliado através da
variação genética na seqüência da região controle do DNA mitocondrial em um
fragmento de 287pb. Foram descritos 7 novos haplótipos para os leões-
marinhos do Atlântico Sul Ocidental, sendo o haplótipo OFA1 o mais freqüente
(52%). A diversidade nucleotídica foi moderada (π= 0,00615) e a haplotípica
relativamente baixa (67%). Além disso, foi observado um valor significativo
(93%) entre as relações filogenéticas do D-loop mitocondrial entre as
populações de O. flavescens do oceano Atlântico e do oceano Pacífico. Quanto
aos estudos de contaminação por metais, as concentrações médias (µg/g de
peso seco) de Ag (0,34), Cu (0,93), Fe (68,25), Cd (0,43), Pb (4,95) e Zn (9,81)
na pele dos leões-marinhos amostrados indicaram níveis elevados de Ag, Cd,
Pb e Fe. De forma geral, os maiores níveis de contaminação foram observados
nos animais coletados próximos à desembocadura dos estuários da Lagoa dos
Patos (Rio Grande, RS) e Arroio Chuí (Chuí, RS). Além disso, foram
IX
observadas variações sazonais nos níveis de contaminação por Ag e Zn.
Porém, estes níveis não dependeram do haplótipo, sexo e biometria do animal,
bem como do grau de decomposição da amostra. Os resultados genéticos
sugerem que os leões-marinhos que ocupam o litoral sul do Rio Grande do Sul
para alimentação e repouso têm origens de distintas colônias reprodutivas. No
entanto, os dados de contaminação por metais sugerem que estes animais
estão compartilhando o mesmo habitat ou habitats com perfis semelhantes de
contaminação ambiental.
Palavras-chave: concentração de metais, filogenia, leão-marinho, mtDNA,
Otaria flavescens, pele, poluição, variabilidade genética.
X
Abstract
Along the Brazilian coastline, there are only two rockeries for the South
American sea lion (Otaria flavescens): the “Refúgio da Vida Silvestre da Ilha
dos Lobos” and the “Refúgio da Vida Silvestre do Molhe Leste”. Both refuges
are in the Rio Grande do Sul state (Southern Brazil). They are under constant
influence of both natural and anthropogenic (pollution and fisheries) impacts,
which can offer risks to the aquatic animals (toxicity and loss of genetic
variability). Metal concentrations in mammal tissues can characterize different
ecological groups associated with the environmental contamination profile due
to the bioaccumulation and persistence of these elements. In the present study,
the degree of differentiation between individuals of the south American sea lion
found dead along the Southern coast of the Rio Grande do Sul, sampled
between May 2005 and September 2006, was evaluated through genetic
analyses. The genetic variation in the mitochondrial control region (D-loop) was
evaluated in a fragment of 287bp. Seven new haplotypes were described for the
South American sea lion of the Southern coast of the Rio Grande do Sul.
Haplotype OFA1 was the most frequent (52%). The nucleotidic diversity was
moderate (π= 0.00615) and the haplotypic diversity was relatively low (67%).
Furthermore, a significant value (93%) was observed in the mtDNA (D-loop)
phylogenetic relationships between populations of O. flavescens from the
Atlantic ocean and Pacific ocean. Regarding the metal contamination studies,
mean concentrations (µg/g dry weight) of Ag (0.34), Cu (0.93), Fe (68.25), Cd
(0.43), Pb (4.95) and Zn (9.81) in the skin of sea lions sampled indicated high
levels of Ag, Cd, Pb and Fe. In a broad view, the higher levels of contamination
XI
were observed in animals sampled next to the mouth of the Lagoa dos Patos
(Rio Grande, RS) and Arroio Chuí (Chuí, RS). Furthermore, seasonal variations
were observed in the Ag and Zn levels. However, these levels did not change
according to the sex and total length of the animal, as well as to the degree of
sample decomposition. Genetic data suggest that South American sea lion
using the Southern coast of the Rio Grande do Sul for feeding and resting are
originated from distinct reproductive colonies. However, metal contamination
data suggest that these animals are sharing the same habitat or different
habitats with similar degrees of environmental contamination.
Key-words: genetic variability, metal concentrations, mtDNA, Otaria
flavescens, phylogeny, pollution, sea lion, skin.
1
1. Introdução
Recentemente, Arnason et al. (2006) elaboraram uma nova hipótese
sobre a origem e dispersão dos pinípedes, a partir de resultados filogenéticos
em conjunto com dados moleculares e novas ferramentas de paleontologia e
climatologia. A monofilia dos Pinnipedia e a ocorrência de fósseis de focídeos
no Atlântico e de otarídeos no Pacífico, na costa da América do Norte, sugerem
que os Pinípedes se originaram neste continente. Após uma fase inicial
(ocupação de lagos, rios e estuários), os organismos penetraram o ambiente
marinho. Ancestrais de Phocidae se deslocaram em direção ao leste de águas
Atlânticas e representantes de Otarioides (Otaridae e Odobenidae)
dispersaram-se em direção oeste do Pacífico. Os ancestrais de Otaria
colonizaram a costa oeste da América do Sul e mais tarde se dispersaram para
costa sul do Atlântico, formando colônias reprodutivas ao longo destes
deslocamentos.
O leão-marinho do sul Otaria flavescens (Shaw, 1800), também
conhecido como lobo-marinho de um pêlo, pertence à família Otariidae (Figura
1). Caracteriza-se pelo focinho curto, achatado e voltado para cima, bem como
pela presença de uma juba nos machos adultos (Vaz-Ferreira, 1981). No
Uruguai, o comprimento máximo registrado para machos e fêmeas adultas foi
de 245 e 200 cm, respectivamente (Vaz-Ferreira, 1981). No Rio Grande do Sul,
estes valores foram de 266 e 204 cm, respectivamente (Rosas, 1989).
Alimentam-se principalmente de peixes, crustáceos e moluscos (Vaz-Ferreira,
1981; Crespo et al., 1990; Alonso et al., 2000). A longevidade está em torno
dos 16 anos (Rosas et al., 1993).
2
A distribuição geográfica de O. flavescens para a costa da América do
Sul vai de 6°S no Oceano Pacífico até 29°S no Oceano Atlântico (Vaz-Ferreira,
1981) com uma ocorrência de 13ºS na Bahia (Castello, 1984). No Atlântico Sul,
as colônias reprodutivas estão no Uruguai e Argentina, enquanto no Pacífico
reproduzem-se no Chile e Peru (Vaz-Ferreira, 1981). A espécie não é
considerada migratória, porém movimentos sazonais ocorrem quando machos
adultos, após o período de reprodução, deslocam-se para o mar em busca de
alimento (Vaz-Ferreira, 1981; Pinedo, 1992).
Vaz-Ferreira (1981) estima que a população mundial é composta por
275.000 leões-marinhos do sul, enquanto Reijnders et al. (1993) afirmaram
haver apenas 210.000 indivíduos. Censos realizados na região costeira, onde
estão localizadas as colônias de reprodução, apontam um total de 15.000
indivíduos no Uruguai (Szapkievich et al., 1999), 22.157 na costa sul da
Argentina (Schiavini et al., 2004), 24.912 no norte da Argentina (Dans et al.,
2004), 2.747 filhotes nas Ilhas Falklands (Thompson et al., 2005), 94.535 no
Chile (Venegas et al., 2002) e 118.220 no Peru (Márquez et al., 2006).
Figura 1. Indivíduo adulto de Otaria flavescens no Molhe Leste da Barra de Rio Grande (RS).
3
Pavês et al. (2005) sugerem a existência de uma relação entre as
condições ambientais locais e a biologia reprodutiva de otarídeos. Entre as
temporadas reprodutivas de 1996-1997 e 1997-1998, estes autores
observaram alterações nos padrões intraespecíficos de conduta frente a
modificações ambientais locais em uma colônia na costa do Chile. Essas
perturbações resultaram na diminuição do número de haréns, alteração na
distribuição espacial destes haréns e diminuição da proporção etária da
população.
Fenômenos climáticos como El Niño (ENSO – El Niño Southern
Oscilation) e La Niña (LNSO – La Niña Southern Oscilation) são descritos como
fatores responsáveis por alterações populacionais em mamíferos marinhos
(Riedman, 1990; Fiedler, 2002; Majluf et al., 2002; Trites et al., 2003; Soto et
al., 2004; Turner, 2004; Soto et al., 2006). Márquez et al. (2006), analisaram o
tamanho e a distribuição populacional de Arctocephalus australis e O.
flavescens no Peru, influenciados pela variabilidade ambiental no período de
1971-2006. O maior decréscimo observado para A. australis foi após o evento
El Niño de 1997-1998, com a diminuição de 24.481 indivíduos para 6.257
(74%). O mesmo ocorreu com o leão-marinho O. flavescens, onde houve uma
redução de 81%, passando de 144.087 indivíduos em 1997 para 27.998 em
1998. Oliveira (1999) através da caracterização das ocorrências de pinípedes
no litoral norte do Rio Grande do Sul, entre 1993 e 1998, observou uma
possível relação entre os anos de maior ocorrência de Arctocephalus tropicalis
com anos de ocorrência dos fenômenos oceanográficos El Niño e La Niña. De
acordo com a autora, nas duas últimas décadas foram registrados picos de
4
ocorrência de A. tropicalis para a costa Atlântica da América do Sul nos anos
de 1984, 1988, 1992, 1994 e 1998. A ocorrência da espécie aconteceu nos
anos marcados pelo fim do fenômeno do ENSO e pelo início do LNSO. Já os
registros ocorridos em 1992 e 1994 foram marcados exclusivamente pelo
ENSO. Esses resultados sugerem, segundo a autora, que em anos de
ocorrência do fenômeno ENSO as condições ambientais (tróficas) do Oceano
Austral poderiam ser afetadas em larga escala. De fato, a dieta de muitos
pinípedes, especialmente otarídeos que vivem em regiões de clima temperado
e tropical, varia de acordo com a ocorrência de fenômenos climáticos. Essa
variação é causada principalmente pelo El Niño, afetando diretamente a
abundância de recursos alimentares (Riedman, 1990).
Ao longo dos 8.000 km de costa do litoral brasileiro existem apenas dois
locais de agregação de pinípedes: o Refúgio de Vida Silvestre da Ilha dos
Lobos (REVIS) (29
0
20’S, 49
0
43’W) em Torres (Vaz-Ferreira, 1981) e o
Refúgio de Vida Silvestre do Molhe Leste da Barra do Rio Grande
(32°10’S/52°06’W) na Lagoa dos Patos, ambos no Rio Grande do Sul (Rosas,
1989; Rosas et al., 1994).
O leão-marinho O. flavescens ocorre com maior freqüência no Brasil
principalmente durante o inverno e primavera (Pinedo, 1986; Rosas, 1989;
Rosas et al., 1993). Sua presença está associada geralmente à abundância de
alimento e à influência da corrente fria das Malvinas (Pinedo, 1986). Em sua
maioria, os indivíduos são machos adultos (Rosas, 1989). As colônias de
reprodução no Atlântico Sul ocidental ocorrem ao longo da costa do Uruguai,
Argentina e Ilhas Malvinas, onde são formados haréns no verão (Pinedo et al.,
5
1992). Fora do período reprodutivo, os leões-marinhos deslocam-se para o
norte e sul, em busca de alimento (Pinedo, 1986; Rosas et al., 1994).
Os refúgios no litoral gaúcho, entre outros locais de ocorrência da
espécie, estão sob constante influência de impactos naturais e antrópicos, tais
como poluição e atividades relacionadas com a pesca (Grübel, 2004). Por
exemplo, Rosas (1989) verificou que 29,8% dos 292 indivíduos de O.
flavescens registrados de 1977 à 1986 apresentavam ferimentos decorrentes
da ação humana. Por outro lado, os níveis crescentes de poluição marinha
podem caracterizar a ameaça mais séria à sobrevivência de populações de
mamíferos marinhos em muitas partes do mundo. Segundo Niencheski et al.
(1994), um dos principais problemas dessa poluição é a contaminação por
metais, os quais podem ser introduzidos no ambiente aquático principalmente
por descargas de efluentes industriais, atividades de mineração e precipitação
atmosférica.
A introdução de metais na água do mar causa, inevitavelmente, a sua
contaminação. Por sua vez, os organismos aquáticos tendem a acumular estes
metais em seus tecidos, mesmo quando a água possui níveis desses
elementos abaixo da concentração máxima permitida pela legislação. Em
peixes, os quais constituem a principal fonte de alimento dos leões-marinhos, a
ingestão de alimento e água é a principal rota de entrada de contaminantes,
sendo que esses se acumulam diferentemente em cada tecido, de acordo com
suas características e em função dos processos bioquímicos internos do
indivíduo (Niencheski & Fillmann, 2006). Esta bioacumulação leva, sem dúvida,
a grandes riscos de contaminação da cadeia trófica. Tendo em vista que os
6
mamíferos marinhos são animais de alta longevidade, predadores de topo de
cadeia trófica e mantêm reservas de energia sob forma de gordura, altos níveis
de substâncias potencialmente tóxicas, como os metais, podem então ser
detectados nos tecidos destes organismos, devido à biomagnificação destes
compostos (Becker, 2000).
Apesar dos impactos aos quais as populações de O. flavescens estão
expostas, colônias reprodutivas do norte da Argentina apresentam um aumento
populacional significativo. Entre os anos de 1983 a 2002 foi observado um
incremento no número total de indivíduos (5,7%), no número de nascimento por
ano, tanto em colônias mais antigas (3,4%), como em colônias formadas
recentemente (Dans et al., 2004). De fato, O. flavescens é considerada uma
espécie em baixo risco de extinção (IUCN, 2006). No entanto, sua conservação
em unidades ambientais distantes das colônias reprodutivas e sujeitas à
impactos antrópicos, como ocorre na costa do Rio Grande do Sul, exigem o
estabelecimento de estratégias bem definidas. Como forma de subsidiar o
estabelecimento destas estratégias de conservação faz-se necessária a
realização de estudos que determinem a origem e diversidade genética, bem
como avaliem os níveis de exposição aos contaminantes nos leões-marinhos
que ocorrem no litoral do Rio Grande do Sul.
1.2. Justificativa
Devido à escassez de informação genética envolvendo as populações
de leão-marinho da América do Sul, o presente trabalho pretende contribuir
fornecendo dados de diversidade genética que auxiliem na caracterização da
7
população e avaliar a contaminação aquática. Esta caracterização será
baseada em dados de diversidade genética, filogenia e níveis de contaminação
da pele por metais em indivíduos que utilizam o litoral gaúcho como refúgio e
zona de alimentação ao longo de todo ano.
1.3. Hipótese
Considerando que diferentes grupos genéticos podem ocupar diferentes
habitats, que o perfil de contaminação dos indivíduos por contaminantes
aquáticos pode estar relacionado ao habitat ocupado e que os metais são
bioacumulados e biomagnificados em mamíferos marinhos, grupos genéticos
distintos de leões-marinhos do Sul coletados na costa do Rio Grande do Sul
apresentarão perfis também distintos de contaminação da pele por metais. As
análises genéticas de filogenia e diversidade poderão contribuir para
caracterização genética e origem da população que ocorre no litoral gaúcho.
1.4. Objetivos
1.2.1 Objetivo Geral
Gerar dados sobre a genética e o nível de contaminação por metais que
auxiliem na caracterização da população de leões-marinhos Otaria flavescens
que utilizam a costa do Rio Grande do Sul como refúgio e zona de alimentação.
8
1.2.2. Objetivos específicos
• Analisar a variabilidade genética na população de Otaria flavescens que
ocorre no litoral Sul do Rio Grande do Sul utilizando a região controle (D-loop)
do mtDNA;
• Analisar as relações filogenéticas entre as espécies de leões-marinhos
comparando genes mitocondriais;
• Avaliar a concentração de metais pesados (cobre, prata, cádmio, zinco,
ferro e chumbo) no tecido epitelial dos leões-marinhos encontrados mortos no
litoral sul do Rio Grande do Sul;
9
2. Capítulo I: VARIABILIDADE GENÉTICA DA REGIÃO CONTROLE DO
mtDNA DO LEÃO-MARINHO (Otaria flavescens, SHAW 1800) E ANÁLISE
FILOGENÉTICA ENTRE REPRESENTANTES DE OTARIIDAE.
2.1. Introdução
Métodos moleculares aplicados em estudos de conservação biológica
têm aberto novas perspectivas para utilização de técnicas que permitem
analisar a escala evolutiva de diferenciação genética de um determinado
organismo, sendo que a magnitude e o parentesco dessa diversidade genética
podem ser avaliados. Estudos baseados em filogenias intraespecíficas de
linhagens do DNA mitocondrial (mtDNA) com transmissão materna utilizam
uma região específica do genoma mitocondrial para o estudo de estrutura e
fluxo gênico de uma população. Estes são capazes de identificar a estrutura
geográfica e subdivisões históricas ou atuais (Avise, 1996). O DNA mitocondrial
pode modificar-se com o tempo e a estimativa da sua evolução varia de acordo
com a região do genoma analisada e depende do organismo em questão,
como foi demonstrado por Saccone et al. (2000). A região controle do mtDNA
foi utilizada no presente trabalho (D-loop ou alça D) devido sua taxa de
mutação ser mais elevada que o restante da molécula.
As principais vantagens que justificam o uso difundido do DNA
mitocondrial, em estudos de populações animais, são a herança matrilinear e a
concomitante transmissão de haplótipos, os quais fornecem informações sobre
a história evolutiva das fêmeas. Sbisà et al. (1997) analisaram a estrutura da
região controle (D-loop) do DNA mitocondrial, a fim de comparar em nível
10
molecular, dez diferentes classes de mamíferos com radiação de 150 milhões
de anos. Foram encontradas novas seqüências conservadas com importância
evolutiva e funcional entre as espécies.
As relações filogenéticas entre os representantes da ordem Carnivora,
baseadas em estudos mais atuais, suportam uma divisão entre Phocidae
(focas), Otariidae (lobos e leões-marinhos) e Odobenidae (morsas). Uma
associação entre as famílias Otariidae e Odobenidae suporta a formação de
uma superfamília denominada de Otaroidea (Davis et al., 2004, Flynn et al.,
2005, Arnason et al, 2006). A família Otariidae é fortemente suportada por uma
monofilia, sendo que a divisão em duas subfamílias: Otariinae (leões-marinhos)
e Arctocephalinae (lobos-marinhos) não é considerada por muitos autores,
sugerindo que ambas são parafiléticas (Wynen et al., 2001, Davis et al., 2004 e
Delisle & Strobeck, 2005). As relações filogenéticas entre estes animais ainda
não estão claras, como exemplo da divisão entre lobos e leões-marinhos,
demonstrando a necessidade de estudos moleculares adicionais (Wynen et al.,
2001 e Fulton et al., 2006). Atualmente cinco espécies de leão-marinho estão
descritas: Zalophus californianus, com três subespécies representadas por Z. c.
californianus (leão-marinho da Califórnia), Z. c. wollebaeki (leão-marinho de
Galápagos), Z. c. japonicus (leão-marinho do Japão) e as demais espécies
Eumetopias jubatus (leão-marinho do Alaska), Neophoca cinerea (leão-marinho
da Austrália), Phocarctos hookeri (leão-marinho da Nova Zelândia) e Otaria
flavescens, também denominada Otaria byronia (leão-marinho do sul), sendo
que ambos pertencem à mesma espécie e atualmente as duas nomenclaturas
são utilizadas. Deste modo, o presente estudo tem como objetivo analisar as
11
relações filogenéticas entre representantes de Otariidae e avaliar a diversidade
populacional de Otaria flavescens encalhados no litoral sul do Rio Grande do
Sul. Devido à falta de estudos genéticos envolvendo as populações da América
do Sul, é importante que sejam empregadas novas ferramentas moleculares
que auxiliem em um conhecimento maior das espécies que ocorrem em nosso
litoral, como é o caso da região controle do mtDNA.
2.2. Materiais e Métodos
2.2.1. Área de Estudo
Amostras de tecido epitelial de 52 indivíduos de leões-marinhos (Otaria
flavescens) encontrados mortos foram coletadas através de monitoramentos
mensais realizados de maio de 2005 a setembro de 2006. Além destes, mais
12 indivíduos foram utilizados para análise genética, provenientes do banco de
amostras do NEMA (Núcleo de Educação e Monitoramento Ambiental)
referentes à monitoramentos mensais realizados de junho de 2002 a junho de
2004. A área de estudo compreende o litoral sul do Estado do Rio Grande do
Sul, entre a Barra da Lagoa do Peixe em Mostardas (31°21' 31.9” S, 51°02’
19.6” W) até o Molhe Leste (32°09’35.9”/52°05’52.8”) (135 km) e do Molhe
Oeste (32°10’S/52°06’W) até a Barra do Chuí (33°44’37.7”/53°22’10.5”) (220
km) (Figura 2) totalizando de 355 km de praia. A licença Nº 065/2004 para
pesquisa em Unidade de Conservação corresponde ao processo Nº
02001.007206/03-37.
12
Figura 2. Área de estudo que compreende a Barra da Lagoa do Peixe em Mostardas até a
Barra do Chuí (Chuí). As amostras de leão-marinho estão plotadas no mapa de acordo com
seus dados de encalhe para o litoral do Rio Grande do Sul (Brasil).
13
2.2.2. Dados de Coleta
Após avistado o encalhe durante o monitoramento de praia, o local
escolhido para retirada do tecido epitelial foi lavado com água destilada para
retirada da areia e do sal. Aproximadamente um grama de pele foi retirada do
animal morto com bisturi de aço inoxidável, pinça plástica e novamente lavada
com água destilada. Para cada espécime coletado foi registrado sempre que
possível data da coleta, estação do ano, comprimento total (da ponta do
focinho ao final da cauda), posição geográfica, sexo (características
morfológicas externas), grau de decomposição (G1: recém-morto; G2: carcaça
intacta e rigor mortis; G3: carcaça com forte cheiro e líquidos escorrendo; G4:
carcaça em processo de putrefação com grandes danos no corpo e G5:
carcaça putrificada com partes do corpo faltando). Essas informações foram
organizadas em um banco de dados para elaboração de um Sistema de
Informações Geográficas (SIG). As amostras de tecido foram depositadas no
laboratório de Bioquímica Marinha da FURG e acondicionadas em frascos de
vidro com álcool 95% a -10º
C para posterior análise de genética.
2.2.3. Extração de DNA e Seqüenciamento
Foram utilizadas para análise genética um total de 56 amostras de tecido
epitelial de leão-marinho encontrados mortos na praia (Figura 3). O DNA das
amostras foi extraído de acordo com Sambrook et al. (1989) e amplificado por
Reação em Cadeia da Polimerase (“Polymerase Chain Reaction”). Foram
utilizados “primers” universais selecionados para amplificar a região controle do
DNA mitocondrial, com base em estudos já realizados com mamíferos e peixes
(Hoelzel, 1994), contendo as seqüências de nucleotídeos DL-FOR (5'-
14
TTCCCCGGTCTTGTAAACC- 3') e DL-REV (5'- ATTTTCAGTGTCTTGCTTT-
3'). A corrida eletroforética foi realizada em gel de agarose 1%, corado com 1,5
µl de brometo de etídio, sob voltagem constante de 100 V, durante 30 minutos
e visualizado em luz ultravioleta. Os produtos de PCRs foram analisados no
seqüenciador automático MegaBace 1000 no Centro de Biologia Genômica e
Molecular da Pontíficia Universidade Católica do Rio Grande do Sul em Porto
Alegre.
Figura 3. a) Leões-marinhos no REVIS do Molhe Leste, b) Leão-marinho morto na praia do
Cassino, c) Coleta de tecido para análise de metais e genética.
2.2.4. Análise do mtDNA
As seqüências de nucleotídeos foram alinhadas utilizando o programa
CLUSTAL X 1.83 (Thompson et al., 1997). Os dados de polimorfismo,
diversidade nucleotídica (Equação 17, Nei e Tajima, 1981) e diversidade
haplotípica (Equação 7, Nei e Tajima, 1981), foram obtidos utilizando os
programas Arlequin 2.0 (Schneider et al., 1999) e DNASP 4.0 (Rozas et al.,
2003). A rede contendo as variações entre os haplótipos observados foi
construída com o programa TCS 1.21 (Clement et al., 2000).
15
2.2.5. Árvore Filogenética
As análises filogenéticas foram processadas usando o pacote PHYLYP
3.6 (Phylogeny Inference Package) (Felsenstein, 1993). Os alinhamentos das
seqüências nucleotídicas foram utilizados para gerar as árvores filogenéticas
com o método de máxima parsimônia (DNAPARS). Uma análise de
bootstrapping com 1000 interações foi conduzida utilizando o programa
SEQBOOT. Na primeira árvore, foram utilizadas as seqüências nucleotídicas
do D-loop dos sete haplótipos dos 56 indivíduos de O. flavescens. Juntamente
com outras espécies de leões-marinhos, foi utilizada para análise uma matriz
de dados de 289 caracteres, respectivos às seqüências nucleotídicas de uma
região homóloga do D-loop, retiradas do GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html) e que estão representadas
na tabela 1. Como grupo externo foi adotado a seqüência de Callorhinus
ursinus.
Para gerar a segunda árvore filogenética foi utilizado um fragmento de
360pb do Citocromo b de 15 seqüências nucleotídicas presentes no GenBank,
representadas na tabela 2. Como grupo externo foi adotado a seqüência de
Callorhinus ursinus.
2.3. Resultados
2.3.1. Banco de Dados
As informações de cada amostra referente ao haplótipo, sentido, data,
estação, comprimento, grau de decomposição, sexo, coordenada geográfica,
foram reunidas em um banco de dados no software MS Access para a posterior
16
inserção em um Sistema de Informações Geográficas (SIG). Em alguns casos,
faltavam os registros das coordenadas geográficas, que foram obtidas através
conversão da distância percorrida dos molhes até o animal. A inserção de
todas as informações associadas aos pontos no SIG possibilitou a visualização
espacial de todos os atributos (Figura 2).
2.3.2. Análise do mtDNA
Utilizou-se para análise 56 seqüências do fragmento de 287 pares de
bases da região controle do genoma mitocondrial do leão-marinho Otaria
flavescens. O alinhamento múltiplo das seqüências revelou sete novos
haplótipos de mtDNA e sete sítios polimórficos envolvendo somente transições
(C-35-T, C-97-T, T-100-C, G-122-A, G-123-A, A-204-G e C-216-T) (Figura 4). A
seqüência nucleotídica correspondente a cada haplótipo encontrado foi
depositada no Genbank (Tabela 1). A diversidade nucleotídica foi de
0,00615±0,00067 e a diversidade haplotípica encontrada foi de 0,670±0,051.
A maior freqüência observada foi do haplótipo OFA1 representando
51,78% (29/56) da população, seguido do haplótipo OFA2 com 19,64% (11/56),
OFA3 com 17,85% (10/56), OFA4 e OFA5 com 3,57% (2/56) e OFA6 e OFA7
com 1,78% (1/56) (Figura 4).
17
Figura 4. Rede contendo as 56 seqüências de Otaria flavescens com os respectivos haplótipos
do mtDNA encontrados na costa do Rio Grande do Sul (Brasil). O quadrado preto indica um
haplótipo ancestral intermediário. O tamanho dos círculos é proporcional ao número de
indivíduos identificados para cada haplótipo.
18
Tabela 1. Haplótipos descritos no presente trabalho (OFA1-7) para região controle do mtDNA de
Otaria flavescens na costa do Rio Grande do Sul (Sul do Brasil). Juntamente com os haplótipos
presentes no GenBank para outras espécies de leão-marinho.
Espécie Haplótipo Número de acesso
Otaria flavescens
OFA1-7 EU044835-41
Otaria byronia
OB2 AF384420
OB4 AF384422
OB5 AF384423
Zalophus c. japonicus
ZCJA-D AB262362-65
Z. californianus
ZCSN1 L37032
ZSM26 L37028
ZCSM34 L37031
PB2 L37025
PB3 L37026
Z. c. wollebaeki
ZCWGE1 AM422167
ZCWFH17 AM422171
ZCWSF25 AM422166
ZCWIB14 AM422169
Eumetopias jubatus
EJ1-5 AF384414-18
Phocarctos hookeri
PH7 AF384413
Neophoca cinerea
NC1-5 AF384408-12
Callorhinus ursinus
CU AF384387
Tabela 2. Haplótipos descritos para o gene do Citocromo b do mtDNA, presentes no GenBank
para diferentes espécies de leão-marinho.
Espécie Haplótipo Número de acesso
Otaria flavescens
OFHA AY713014
OFHB AY713017
OFHC AY713032
OFHD AY713034
O. byronia OB1-2 AF380906-7
N. cinerea
NC1 AF380911
P. hookeri
PH7 AF380919
Z. californianus
ZCM02 AM422163
ZCF03 AM422154
Z. c. wollebaeki
ZWMO1 AM422145
ZWGE1 AM422148
E. jubatus
EJ1 AF380920
EJ5 AF380924
C. ursinus
CU AF380888
2.3.3. Árvore Filogenética
Os resultados obtidos a partir da árvore filogenética com as seqüências
nucleotídicas do D-loop para os 35 haplótipos representantes de otarídeos
estão representadas na figura 5. A análise demonstra haver a formação de dois
19
grupos genéticos agrupados com um valor de bootstrap (~70%) entre os
haplótipos da região controle do mtDNA (OFA1-OFA7) para Otaria flavescens
analisados nesse estudo, descritos pela primeira vez para o Atlântico Sul
Ocidental. Esses haplótipos diferem dos encontrados para mesma região
mitocondrial que estão descritos para Otaria byronia de indivíduos provenientes
de Punta San Juán, Perú, (OB2, OB4 e OB5) incluídos nesta análise.
Observou-se a formação de dois grupos genéticos distintos entre os
representantes de otarídeos. O primeiro grupo formado pelos haplótipos do
gênero Neophoca e um segundo grupo correspondendo às espécies
pertencentes aos gêneros Zalophus, Eumetopias, Phocarctos e Otaria,
agrupados com um bootstrap de 100%. As demais relações presentes entre os
ramos mais internos da árvore demonstram haver um agrupamento significativo
entre a filogenia representada pelas subespécies do gênero Zalophus com um
valor de bootstrap de 92,9%. O mesmo ocorre entre os representantes do
gênero Otaria com um valor ainda mais elevado, sendo observada a formação
de dois grupos com 93,7% de bootstrap entre os haplótipos descritos para o
Atlântico e para o Pacífico.
As relações filogenéticas presentes entre as espécies representantes de
Otariidae utilizando as seqüências do gene mitocondrial do Citocromo b estão
representadas na figura 6. A análise demonstra haver a formação de dois
grupos filogenéticos com um bootstrap significativo de 100% entre o haplótipo
representante do gênero Neophoca e as demais seqüências presentes na
árvore. Dentro dos ramos mais internos não foi observada a formação de
20
grupos com um valor significativo de bootstrap para o gênero Otaria. Sendo
que o mesmo ocorre para as subespécies que representam o gênero Zalophus.
23
2.4. Discussão
No presente estudo, foi analisado um fragmento de 287pb da região
controle do genoma mitocondrial de 56 leões-marinhos (Otaria flavescens) de
encalhes na costa do Estado do Rio Grande do Sul (Brasil). Os resultados
desta análise demonstraram a presença de sete haplótipos (OFA1-OFA7),
sendo que os mais freqüentes foram OFA1 (51,78%), OFA2 (19,64%) e OFA3
(17,85%). Ou seja, aproximadamente 90% dos indivíduos analisados
compartilham apenas três dos sete haplótipos descritos.
A diversidade genética foi analisada através dos índices de diversidade
haplotípica (h) e diversidade nucleotídica (π). O índice de diversidade
nucleotídica encontrado para O. flavescens foi de 0,006 ± 0,00067. Este valor
está de acordo com os valores descritos por Wynen, et al. (2001) para a
mesma região controle do mtDNA de espécies de leões-marinhos, tais como:
Otaria byronia da costa do Pacífico (π= 0,008), Eumetopias jubatus do Alaska
(π= 0,004) e Phocarctus hookeri da Nova Zelândia (π= 0,004). Entretanto, no
mesmo estudo, os autores encontraram para Zalophus californianus da costa
da Califórnia e Callorhinus ursinus do Alaska, níveis significativamente mais
elevados de diversidade nucleotídica (π= 0,03 e 0,027, respectivamente).
Desta forma, o resultado observado para O. flavescens encontra-se dentro dos
níveis moderados de diversidade nucleotídica descritos para outras espécies
de leões-marinhos.
Em termos de diversidade haplotípica, foi observado um valor
relativamente baixo (h=67%) para O. flavescens, quando comparado para o
mesmo gene de outras espécies de pinípedes. Valores elevados de
24
diversidade haplotípica (h=93%) foram detectados em Eumetopias jubatus
coletados no Alaska por O’Corry-Crowe et al. (2006) em 531pb. Baker, et al.
(2005), observaram para mesma espécie citada anteriormente, uma
diversidade haplotípica de 91% para indivíduos coletados no Norte do Pacífico
e Mar de Behring, em um fragmento de 238pb. Westlake et al. (2002),
descrevem para Phoca vitulina do norte do Pacífico, uma diversidade
haplotípica de h=97% analisando um fragmento de 435pb. Em amostras de
lobos-marinhos (A. philippii) de Ilhas Chilenas, Goldsworthy et al. (2000)
detectaram, em um fragmento de 315pb, um índice elevado (h=90%). Um valor
próximo (h=91,4%) foi observado em amostras de Phocoena phocoena
coletadas no Atlântico (Rosel et al., 1999).
O fato da diversidade haplotípica observada no presente estudo para O.
flavescens apresentar um valor moderado nos indivíduos coletados na costa do
Rio Grande do Sul pode ser explicado por um evento evolutivo que ocorreu
durante o Pleistoceno. Este evento caracterizou-se por uma seqüência de
episódios glaciais que tornaram a costa do Atlântico sul ocidental um lugar
inabitável (Hoelzel et al., 1993). A ocorrência destes episódios glaciais gerou
um impacto nas populações locais, causando um efeito de gargalo, o qual
reduziu drasticamente a variabilidade genética dos mamíferos marinhos que
habitavam esta região há aproximadamente 100.000 anos atrás. Este fato tem
sido demonstrado por Hoelzel et al. (1993) para o elefante-marinho Mirounga
leonina da Península de Valdéz (Argentina) e citado em um estudo mais
recente, realizado por Túnez et al. (2006), com o leão-marinho O. flavescens e
o lobo-marinho Arctocephalus australis. No último estudo, foi observado um
25
baixo nível de diversidade haplotípica para o gene do Citocromo b em ambas
espécies, principalmente nas colônias que habitam a costa do Uruguai. Os
autores atribuem esta diminuição na variabilidade ao fato de que esta região foi
colonizada recentemente por estas espécies, associado ao efeito de gargalo
originado pelos episódios glaciais do Pleistoceno. Desta forma, a redução da
variabilidade parece ter sido um evento comum às espécies de pinípedes que
habitam o Atlântico sul ocidental.
Episódios glaciais normalmente produzem eventos evolutivos
importantes uma vez que se constituem em barreiras físicas à dispersão e ao
fluxo gênico. Este evento, associado à distância geográfica, pode ser o motivo
de uma sensível diminuição no fluxo gênico entre as colônias de leões-
marinhos do Pacífico e do Atlântico sul ocidental. Este fato é evidenciado pela
falta de haplótipos compartilhados entre essas populações, conforme descrito
por Túnez et al. (2006) para o gene do Citocromo b e corroborado pelo
presente estudo para a região controle do mtDNA. Estas evidências genéticas
isoladas não acarretam na determinação imediata de unidades evolutivas
independentes, sendo necessários estudos adicionais com genes nucleares,
análises morfológicas e de comportamento (Moritz, 1994). Entretanto, a
nomenclatura utilizada para o leão-marinho do sul, que ocorre em ambos
oceanos, divergem segundo alguns autores. Desta forma, a descrição
taxonômica do gênero Otaria aponta para a existência de uma mesma espécie
que ocorre nos dois oceanos. Em um estudo realizado por Rodriguez e Bastida
(1993), as características morfológicas do holótipo descrito por Shaw em 1800,
correspondente a um filhote de leão-marinho (O. flavescens) foram
26
comparadas com os dados obtidos do primeiro registro de Otaria byronia
descrito por de Blainville em 1820. O status do nome específico do leão-
marinho é controverso e atualmente os dois nomes estão em uso. Os autores
concluíram que o nome específico que deve ser adotado é Otaria flavescens
devido ao holótipo de Shaw ser oriundo de uma localidade válida e com
prioridade de data sobre O. byronia.
Com o propósito de verificar a ausência de compartilhamento de
haplótipos entre leões-marinhos do Atlântico e do Pacífico, foram realizadas
análises filogenéticas entre os representantes de Otariidae. Para isso, foram
utilizados os haplótipos para a região controle do mtDNA descritos no presente
estudo juntamente com haplótipos disponíveis no GenBank para outras
espécies de leões-marinhos, incluindo os haplótipos de O. byronia da costa do
Perú. Adicionalmente, foram realizadas análises filogenéticas com haplótipos
do gene do Citocromo b, também disponíveis no GenBank, para espécies de
leões-marinhos. O objetivo de utilizar diferentes regiões do mtDNA neste
estudo é avaliar as relações filogenéticas entre os grupos com base em genes
com distintas taxas evolutivas. A região controle apresenta uma taxa evolutiva
cinco vezes maior que a região abrangente do gene do Citocromo b (Bargelloni
et al., 2003). Tal diferença evolutiva proporciona uma avaliação mais sensível a
nível intraespecífico utilizando o D-loop, enquanto que diferenças no Citocromo
b podem ser observadas em estudos que envolvem um nível de variabilidade
interespecífica, o que tem sido utilizado para análises filogenéticas dentro de
Otariidae (Wynen et al., 2001).
27
A análise filogenética realizada com haplótipos da região controle
(Figura 5) mostrou a formação de dois grupos entre os haplótipos do Perú (O.
byronia) e do Atlântico (O. flavescens) com um valor de bootstrap de 93,7%.
Este valor significativo reflete uma possibilidade de diferenciação entre os
leões-marinhos do Atlântico e do Pacífico em nível subespecífico. Eventos de
especiação e subespeciação têm sido descritos em leões-marinhos do gênero
Zalophus. A espécie Zalophus californianus atualmente econtra-se dividida em
três subespécies: Z. c. californianus (Califórnia), Z. c. wollebaeki (Ilhas
Galápagos) e Z. c. japonicus (Japão). Esta última subespécie tem gerado
controvérsia a respeito do seu status taxonômico, visto que Brunner (2004)
sugeriu o nível de espécie para este leão-marinho do Japão. Um estudo
filogenético recente utilizando a região controle do mtDNA (Sakahira et al.,
2007) reporta um valor elevado de bootstrap (98%) entre os ramos formados
entre Z. c. japonicus e Z. c. californianus. Entretanto, os autores sugerem que o
nível de subespécie para o leão-marinho do Japão está adequado, visto que
ele encontra-se geneticamente muito próximo do leão-marinho da Califórnia.
No presente estudo, haplótipos da região controle do mtDNA das três
subespécies de Zalophus foram incorporadas na análise como forma de
calibração para comparar o valor observado entre o gênero Otaria.
Surpreendentemente, o valor de bootstrap obtido na filogenia entre os
haplótipos das subespécies de Zalophus já reconhecidas foi inferior (92,9%) ao
observado no agrupamento entre os haplótipos de O. byronia e O. flavescens.
Na análise filogenética utilizando o Citocromo b os valores de bootstrap
obtidos não demonstram qualquer valor significativo, tanto entre os haplótipos
28
que representam o gênero Otaria quanto ao observado no gênero Zalophus
(Figura 6). Cabe ressaltar que nesta filogenia não foram incluídos haplótipos de
Z. c. japonicus, pois estes não encontravam-se disponíveis no GenBank. De
qualquer forma, este resultado indica que o nível filogenético entre O. byronia e
O. flavescens pode ser considerado como intraespecífico. Para uma definição
mais consistente do nível de diferenciação populacional ou subespecífico entre
os leões-marinhos que ocorrem nas costas do Pacífico e do Atlântico sul
ocidental, serão necessários estudos adicionais envolvendo análises
filogenéticas de genes nucleares, estudos de morfologia, entre outros.
Uma análise entre o agrupamento dos haplótipos de O. flavescens
descritos no presente estudo para o D-loop demonstra haver um agrupamento
com um valor de bootstrap significativo (~70%) formado pelos haplótipos
OFA4, OFA5 e OFA6, e outro formado por OFA1, OFA2, OFA3 e OFA7. Esse
resultado pode refletir uma origem diferente para os dois grupos de haplótipos
divergentes. Túnez et al. (2006), com base na freqüência de haplótipos do
Citocromo b, reportam a presença de dois agrupamentos de colônias
reprodutivas separadas por 1.000 Km, sendo uma localizada no Uruguai e
outra na Patagônia (Argentina). Desta forma, a presença de dois grupos de
haplótipos com uma possível origem filogenética distinta, na costa do Rio
Grande do Sul, pode representar a dispersão de indivíduos a partir dos
diferentes agregados reprodutivos localizados no Uruguai e na Argentina.
Levando-se em consideração o somatório da freqüência dos haplótipos
constituintes de cada grupo gerado na presente análise filogenética, observa-
se que o grupo formado por OFA4, OFA5 e OFA6 representa apenas cerca de
29
9% do total (5/56), enquanto que outro formado por OFA1, OFA2, OFA3 e
OFA7 representa cerca de 91% (51/56). O haplótipo OFA1 é o mais freqüente
(51%) e caracteriza-se como sendo o haplótipo ancestral que deu origem a
todos os outros, conforme demonstra a análise realizada com auxílio do
Programa TCS (Figura 4). Levando em consideração a freqüência dos
haplótipos e a distância geográfica entre as colônias reprodutivas do Uruguai e
Argentina e o litoral do Rio Grande do Sul, sugere-se que a maioria dos
indivíduos que chegam ao sul do Brasil são provenientes de deslocamentos
realizados a partir das colônias reprodutivas localizadas no Uruguai. Portanto,
apenas uma pequena parcela dos animais seriam oriundos de deslocamentos
a partir das colônias Argentinas. Além disso, a menor diversidade haplotípica
observada para os indivíduos analisados no presente estudo corrobora com a
hipótese de dispersão a partir do Uruguai descrita por Túnez et al. (2006), onde
demonstraram uma ausência de variabilidade para os indivíduos oriundos
daquele país, a partir da análise do gene mitocondrial do Citocromo b.
2.5. Conclusões
• Foram identificados sete novos haplótipos de mtDNA descritos pela
primeira vez para o Atlântico sul ocidental. Esses haplótipos diferem dos
encontrados para mesma região mitocondrial descritos por Wynen et al.,
(2001) de indivíduos provenientes de Punta San Juan, Peru.
• Sugere-se que a maioria dos indivíduos que ocupam o litoral do Rio
Grande do Sul sejam provenientes de colônias reprodutivas do Uruguai;
30
• A diversidade nucleotídica encontrada foi similar com estudos já
realizados em outras espécies de pinípedes. A diversidade haplotípica
da região controle do mtDNA foi relativamente baixa (67%).
2.6. Recomendações
• As populações de leões-marinhos vêm sofrendo impactos no decorrer
das décadas pela ação de eventos naturais, poluição, atividades
pesqueiras, entre outros. Esses impactos podem trazer graves
conseqüências para espécie, tais como perda de variabilidade genética,
alterações fisiológicas e mudanças na dinâmica populacional. Desta
forma, torna-se fundamental desenvolver ações para a conservação e o
manejo dos leões-marinhos que ocupam os locais rochosos do nosso
litoral como refúgio e zona de alimentação.
31
3. Capítulo II: CONCENTRAÇÃO DE METAIS NO EPITÉLIO DO LEÃO-
MARINHO (Otaria flavescens, SHAW 1800) NO LITORAL DO RIO GRANDE
DO SUL (BRASIL).
3.1. Introdução
Além da contaminação via direta, ou seja, através do contato com água
e com a atmosfera, os mamíferos aquáticos estão sujeitos aos efeitos da
biomagnificação de contaminantes, podendo adquirir grandes cargas destes
compostos através da ingestão de presas contaminadas (O’ Shea et al., 1999).
Outra importante forma de contaminação destes organismos se dá através da
transferência de contaminantes entre gerações pela lactação e via placentária.
Por exemplo, Miranda (2004) observou que o processo lactacional representa
uma forma notável de transferência de contaminantes das fêmeas lactantes
para os filhotes do elefante-marinho do Sul (Mirounga leonina) nascidos na Ilha
Elefante (Antártica).
Tendo em vista que os mamíferos marinhos são animais de alta
longevidade, predadores de topo de cadeia trófica e mantêm reservas de
energia sob forma de gordura, altos níveis de substâncias potencialmente
tóxicas, como os metais e organoclorados, podem então ser detectados nos
tecidos destes organismos, devido à biomagnificação destes compostos
(Becker, 2000). Portanto, estes organismos são potencialmente vulneráveis à
toxicidade de compostos químicos, como os metais, em longo prazo.
O tipo e a área de alimentação influenciam, em particular, a natureza e o
grau de exposição aos contaminantes. Em geral, populações litorâneas de
32
mamíferos marinhos tendem a apresentar níveis mais elevados de
contaminação do que as populações mais oceânicas, presumivelmente porque
suas cadeias alimentares estão mais expostas às fontes de contaminação de
origem terrestre (O’Shea et al., 1999).
Estudos relacionados aos possíveis efeitos de compostos de origem
antropogênica e de elementos traço em mamíferos marinhos têm aumentado
nos últimos anos, devido ao aumento da freqüência de doenças nestes
organismos. Em geral, são detectados altos níveis de poluentes nos tecidos
dos organismos afetados e evidências de que certos contaminantes causam
efeitos deletérios na reprodução e no sistema imunológico são observadas
(O’Shea et al., 1999; Becker, 2000).
Ikemoto et al. (2004) analisaram a acumulação de 18 metais em três
diferentes espécies: Pusa sibirica, Pusa caspica e Callorhinus ursinus do Lago
Baikal, Mar Cáspio e do Japão, respectivamente. As três espécies
apresentaram concentrações elevadas de Ag no fígado, Cd nos rins, Zn no
músculo e Pb no pêlo. No estudo realizado por Campos (2002), foram
analisadas as concentrações de metais essenciais e não-essenciais no
sangue, plasma e pêlo do elefante-marinho do Sul (M. leonina) na Ilha Elefante
(Antártica), durante o verão austral. Os resultados demonstraram
concentrações elevadas de Fe no sangue, de Cu, Fe, Zn, Cd e Pb no pêlo e de
Fe e Zn no plasma. Observa-se, portanto, que em ambos os estudos o pêlo
demonstrou ser um tecido potencialmente utilizável para o monitoramento da
exposição ambiental de mamíferos marinhos aos poluentes presentes na água
do mar.
33
Por sua vez, a pele também tem sido comumente utilizada como
material biológico para monitoramento e avaliação do impacto da contaminação
de metais em mamíferos marinhos (Saeki et al., 2001; Frodello et al., 2002 ;
Carvalho et al., 2002 ; Fossi et al., 2004). Além disso, tem sido utilizada como
amostra biológica para determinar perfis de contaminação por elementos traço
(Monaci et al., 1998; Kunito et al., 2002) e avaliação genética (Natoli et al.,
2004; Parsons et al., 2006), visando identificar estoques populacionais
distintos.
No que se refere aos estudos de contaminação no litoral Sul do Rio
Grande do Sul, os maiores esforços encontram-se concentrados na região
estuarina da Lagoa dos Patos e costeira adjacente (Rio Grande, RS).
Niencheski et al. (2000) demonstraram que o sedimento da parte sul deste
estuário está enriquecido por metais como Cu, Pb e Zn, os quais são
provenientes de atividades urbanas, industriais e portuárias desenvolvidas no
entorno da região estuarina. Por sua vez, a contaminação do ambiente pode
levar a contaminação dos organismos que o habitam. Said (2003) demonstrou
que as concentrações de Cu e Fe em fezes do leão-marinho O. flavescens no
molhe leste da Barra do Rio Grande são semelhantes àqueles encontrados em
fezes de outros mamíferos de ambientes não contaminados. No entanto, a
autora relatou que os valores observados para Cd, Pb (não-essenciais) e Zn
(essencial), sendo foram maiores que aqueles observados em fezes de outros
mamíferos de ambientes não contaminados, indicando que estes valores estão
de acordo com as concentrações destes metais na água ou com seus fatores
de bioacumulação. Assim, o habitat ocupado por um grupo de indivíduos pode
34
determinar o perfil, bem como o grau de contaminação destes por metais.
Esses fatos demonstram a necessidade de se adequar um plano de manejo e
estratégias para conservação dos mamíferos marinhos, minimizando assim os
impactos antrópicos que oferecem riscos de contaminação e perda de
variabilidade genética da população (Grübel, 2004).
Quanto à genética populacional dos leões-marinhos do litoral sul do Rio
Grande do Sul, observou-se no estudo apresentado no capítulo I a presença de
sete diferentes haplótipos, com um agrupamento significativo (~70%) formado
pelos haplótipos 4, 5 e 6, e um outro ramo formado pelos haplótipos 1, 2, 3 e 7.
Considerando os aspectos apresentados acima, foram avaliados no
presente estudo os níveis de contaminação por diversos metais na pele dos
leões-marinhos do Sul (Otaria flavescens) que utilizam o litoral sul do Rio
Grande do Sul como área de refúgio e alimentação, visando estabelecer
possíveis perfis de contaminação em função da diferença haplotípica
observada nesta espécie. Objetiva-se, portanto, comparar dados de
sazonalidade, variação genética, comprimento, sexo e decomposição da
amostra. Os resultados poderão auxiliar na caracterização da origem da
população, bem como na identificação de possíveis impactos biológicos
associados à contaminação por metais nestes indivíduos, subsidiando assim o
estabelecimento de estratégias de conservação para a espécie na costa
gaúcha.
35
3.2. Materiais e Métodos
3.2.1. Área de Estudo
Amostras de pele de 49 leões-marinhos (O. flavescens) encalhados
entre a Barra da Lagoa do Peixe em Mostardas (31°21'31.9”S, 51°02’19.6”W)
até o Molhe Leste (32°09’35.9”S, 52°05’52.8”W) e do Molhe Oeste (32°10’S,
52°06’W) até a Barra do Chuí (33°44’37.7”S, 53°22’10.5”W) foram coletadas
através de monitoramentos mensais realizados de maio de 2005 a setembro de
2006 (Figura 2). A licença N
o
065/2004 para pesquisa em Unidade de
Conservação corresponde ao processo N
o
02001.007206/03-37. As amostras
de tecido foram depositadas no laboratório de Bioquímica Marinha da FURG e
acondicionadas a -10ºC para posterior análise de metais.
3.2.2. Dados de Coleta
Após avistado o encalhe durante o monitoramento de praia, o local
escolhido para retirada do tecido epitelial foi lavado com água destilada para
retirada da areia e do sal. Aproximadamente 5g de pele foi retirada do animal
morto com bisturi de aço inoxidável e pinça plástica para evitar a contaminação
do material biológico. Posteriormente a amostra foi novamente lavada com
água destilada abundante. Para cada amostra foram registrados, quando
possível determinar o sexo (características morfológicas externas) e medir o
comprimento total (da ponta do focinho ao final da cauda), bem como a posição
geográfica, data da coleta, estação do ano e grau de decomposição (G1-G5).
36
Essas informações foram organizadas em um banco de dados para elaboração
de um Sistema de Informações Geográficas (SIG).
3.2.3. Análise de Metais
Foram coletadas amostras de tecido epitelial (aproximadamente 5 g) de
cada leão-marinho encontrado na praia. As amostras obtidas foram pesadas e
acondicionadas em coletor plástico universal, os quais foram pré-lavados com
ácido nítrico 65% para eliminação de possíveis contaminantes. Posteriormente,
as amostras foram secas em estufa a 50
o
C durante 15 dias ou até a obtenção
de peso constante. Foram então adicionados 10 ml de HNO
3
(Suprapur, Merck,
EUA), e a amostra permaneceu na estufa a 50
o
C até a digestão completa do
tecido (48-72 h). As concentrações de cobre, ferro, prata, zinco, chumbo e
cádmio no material digerido foram então determinadas por espectrofotometria
de absorção atômica no modo chama (Avanta Plus, GBC, EUA), utilizando-se
as respectivas soluções padrões de metais como referência (CELM, São Paulo,
Brasil).
3.2.4. Análise Estatística
Os dados foram expressos como média ± erro padrão. Diferenças
haplotípicas (7 haplótipos isoladamente), sazonais ou associadas ao grau de
decomposição das amostras foram avaliadas através de Análise de Variância
(ANOVA) de uma via seguida do teste a posteriori de Tukey. Diferenças
sexuais e haplotípicas (grupo A = haplótipos 1, 2, 3 e 7; grupo B = haplótipos 4,
5 e 6) para cada metal analisado foram comparados através de teste t de
37
Student. Correlações entre o comprimento total e o grau de contaminação por
metais foram avaliadas através do Coeficiente de Correlação de Spearman.
Todos os dados foram previamente transformados matematicamente (função
log) visando atender aos pré-requisitos de normalidade dos dados e
homogeneidade das variâncias. As análises estatísticas foram realizadas
utilizando-se o pacote STATISTICA 6.0 (StatSoft, USA). O nível de significância
adotado foi de 95%.
38
3.3. Resultados
3.3.1. Banco de Dados
As informações de cada leão-marinho quanto à data e estação do ano
de coleta, comprimento total, grau de decomposição, sexo, coordenadas
geográficas e concentração de metal na pele foram reunidas em um banco de
dados no software MS Access para a posterior inserção em um Sistema de
Informações Geográficas (SIG). Quando o registro das coordenadas
geográficas não foi possível, estas foram obtidas através da conversão da
distância percorrida entre Molhes da Barra do Rio Grande e o local de coleta.
Considerando-se todos os animais amostrados (n = 49), os valores
médios de concentração (± erro padrão) foram de 0,341 ± 0,039; 0,930 ± 0,131;
68,25 ± 8,40; 0,434 ± 0,042; 4,954 ± 0,295 e 9,807 ± 0,853 µg/g de peso seco,
para Ag, Cu, Fe, Cd, Pb e Zn, respectivamente. Foi observada uma tendência
de maiores concentrações de metais em amostras encalhadas próximo à Barra
do Chuí (Chuí – RS) e aos molhes da Barra da Lagoa dos Patos (Rio Grande,
RS) (Figuras 7 e 8).
41
3.3.2. Variações Sazonais
Para a análise das variações sazonais, foram consideradas todas as
amostras coletadas, uma vez que não foram observadas diferenças
significativas nas concentrações de metais em função do haplótipo, do sexo e
do comprimento total dos animais, bem como do grau de decomposição das
amostras, como será descrito posteriormente.
Menores concentrações de Ag e de Zn foram observadas no inverno,
enquanto maiores níveis de Ag foram observados na primavera (P<0,05). Para
os demais metais não foram observadas variações sazonais significativas
(Figura 9).
42
outono inverno primavera verão
Concentração de Ag (µg / g de peso seco)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
ab
b
a
ab
Ag
outono inverno primavera verão
Concentração de Cu (µg / g de peso seco)
0
1
2
3
4
5
a
a
a
a
Cu
outono inverno primavera verão
Concentração de Fe (µg / g de peso seco)
0
50
100
150
200
a
a
a
a
Fe
outono inverno primavera verão
Concentração de Cd (µg / g de peso seco)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
a
a
a
a
Cd
outono inverno primavera verão
Concentração de Zn (µg / g de peso seco)
0
5
10
15
20
25
30
b
b
ab
a
Zn
outono inverno primavera verão
Concentração de Pb (µg / g de peso seco)
0
2
4
6
8
10
a
a
a
a
Pb
Figura 9. Concentração de metais na pele de leões-marinhos Otaria flavescens amostrados no
litoral sul do Rio Grande do Sul (n = 49) no outono (n = 9), inverno (n = 24), primavera (n = 9) e
verão (n = 7).
43
3.3.3. Variação Genética
Para a análise da possível variação da concentração de metais em
função dos haplótipos dos leões-marinhos, somente foram consideradas as
amostras coletadas no inverno e que tiveram o haplótipo e a concentração de
metais analisados (n = 18; machos e fêmeas). Esta decisão foi tomada com
base nos seguintes fatos: a maioria das amostras foi obtida nesta estação do
ano, todos os leões-marinhos que apresentaram os haplótipos 4, 5 e 6 foram
coletados no inverno e variações sazonais significativas nas concentrações dos
metais foram observadas.
Quando os 7 haplótipos foram considerados individualmente ou
agrupados (grupos A e B), não foram observadas diferenças significativas nas
concentrações dos metais na pele em função do haplótipo ou dos grupos de
haplótipos (Tabela 3).
Tabela 3. Concentração média (± erro padrão) de metais na pele do leão-marinho Otaria
flavescens amostrados no litoral sul do Rio Grande do Sul, no inverno. Não foi observada
diferença significativa (P>0,05) entre os grupos haplotípicos para cada metal analisado.
Metais Grupo haplotípico A
(n=13)
Grupo haplotípico B
(n=5)
Ag 0,266 ± 0,037 0,327 ± 0,077
Cu 0,684 ± 0,163 0,961 ± 0,369
Fe 63,10 ± 17,14 72,99 ± 33,38
Cd 0,529 ± 0,117 0,428 ± 0,107
Pb 5,726 ± 0,708 5,307 ± 0,767
Zn 6,785 ± 1,102 5,829 ± 1,121
44
3.3.4 Variações Sexuais e Biométricas
A possível influência do sexo ou da biometria sobre a concentração dos
metais na pele foi avaliada utilizando-se somente as amostras coletadas no
inverno, tendo em vista que a maioria das amostras de fêmeas foi coletada
somente nesta estação do ano e que houve diferença sazonal significativa na
concentração dos metais.
Não houve diferença significativa entre machos e fêmeas na
concentração dos metais na pele dos leões-marinhos coletados no inverno
(Tabela 4). Também não foram observadas correlações significativas entre o
comprimento total do animal e a concentração de metais (Tabela 5).
Tabela 4. Concentração média (± erro padrão) de metais na pele do leão-marinho Otaria
flavescens amostrados no litoral sul do Rio Grande do Sul no inverno, em função do sexo. Não
houve diferença significativa (P>0,05) entre os sexos para cada metal analisado.
Metais Machos
(n=7)
Fêmeas
(n=4)
Ag 0,235 ± 0,058 0,309 ± 0,105
Cu 0,580 ± 0,165 1,198 ± 0,374
Fe 42,08 ± 8,09 83,23 ± 40,02
Cd 0,623 ± 0,181 0,473 ± 0,133
Pb 5,197 ± 0,945 4,501 ± 0,199
Zn 5,527 ± 0,909 9,424 ± 2,788
45
Tabela 5. Valores dos coeficientes de correlação de Spearman (R) e da probabilidade (P) entre
o comprimento total e a concentração de metais na pele de leões-marinhos Otaria flavescens
amostrados no litoral sul do Rio Grande do Sul, no inverno (n = 21).
Metais R P
Ag -0,170 0,474
Cu -0,216 0,346
Fe 0,089 0,701
Cd -0,016 0,947
Pb 0,178 0,440
Zn -0,231 0,313
3.3.5. Grau de decomposição da amostra
A possível influência do grau de decomposição da amostra sobre a
concentração dos metais na pele foi avaliada utilizando-se somente as
amostras coletadas no inverno (machos e fêmeas), tendo em vista que a
maioria das amostras foi coletada nesta estação do ano e que houve diferença
sazonal significativa na concentração de Zn e Ag.
Não foram observadas diferenças significativas nas concentrações dos
metais analisados (Ag, Cu, Fe, Cd, Zn e Pb) entre as classes de amostras
conforme o grau de decomposição das mesmas (Tabela 6).
46
Tabela 6. Concentração média (± erro padrão) de metais na pele do leão-marinho Otaria
flavescens amostrados no litoral sul do Rio Grande do Sul no inverno, conforme o grau de
decomposição da amostra (G1: animal recém-morto; G2: carcaça intacta e rigor mortis; G3:
carcaça com forte cheiro e líquidos escorrendo e G4: carcaça em processo de putrefação com
grandes danos no corpo). Não houve diferença significativa (P>0,05) entre os grupos de
amostras para cada metal analisado.
Metais G1
(n=3)
G2
(n=4)
G3
(n=12)
G4
(n=4)
Ag 0,327 ± 0,090 0,152 ± 0,033 0,261 ± 0,040 0,338 ± 0,094
Cu 0,777 ± 0,075 0,686 ± 0,268 0,566 ± 0,167 1,169 ± 0,387
Fe 48,53 ± 13,62 43,82 ± 13,67 64,04 ± 18,82 80,18 ± 40,63
Cd 0,579 ± 0,103 0,680 ± 0,324 0,385 ± 0,069 0,456 ± 0,139
Pb 7,167 ± 1,444 3,638 ± 0,349 6,048 ± 0,701 4,126 ± 0,511
Zn 6,171 ± 0,648 8,084 ± 3,319 5,448 ± 0,706 6,332 ± 1,158
3.4. Discussão
As concentrações de Ag, Cd, Pb e Fe na pele de leões-marinhos Otaria
flavescens que utilizam o litoral sul do Rio Grande do Sul (RS) como área de
refúgio e alimentação foram consideradas elevadas quando comparadas com
aquelas relatadas em outros estudos envolvendo diversas espécies de
mamíferos marinhos. Por sua vez, as concentrações de Cu e Zn foram
consideradas baixas (Tabela 7).
A pele foi utilizada para esse estudo devido sua capacidade de monitorar
e avaliar a concentração de metais presente nos mamíferos marinhos
apresentando um perfil de contaminação recente do animal, ser um tecido de
fácil coleta e decomposição lenta quando comparado com tecidos mais
internos e também por ser capaz de caracterizar estoques populacionais
distintos em estudos genéticos. As concentrações analisadas em O. flavescens
47
foram comparadas apenas com estudos realizados na pele de diferentes
espécies de mamíferos marinhos e expressas em peso seco. Essa decisão foi
baseada na necessidade de padronizar o material biológico para comparar com
os resultados presentes na literatura.
A média da concentração de Ag na pele dos leões-marinhos encalhados
no litoral gaúcho apresentou um valor elevado (0,34 µg/g). Os valores descritos
por Saeki et al. (2001) para duas fêmeas de Callorhinus ursinus de 7 e 14 anos
de idade foram de 0,0012 e 0,0044 µg/g de prata, respectivamente. As
amostras de pele foram coletadas no norte do Oceano Pacífico e apresentam
baixos níveis de contaminação quando comparadas com os valores descritos
no presente estudo. O valor de Cd (0,43 µg/g) também foi elevado nos leões-
marinhos quando comparado ao maior valor relatado na literatura (0,29 µg/g)
na pele de Ziphius cavirostris do Mediterrâneo (Frodello et al., 2002). Porém, o
valor médio de concentração de Fe nas amostras de pele de O. flavescens no
presente estudo foi de 68,25 µg/g, sendo bem similar àqueles encontrados na
pele de Tursiops truncatus (40 µg/g) e Delfinus delphis (65 µg/g) amostrados
em águas portuguesas no Oceano Atlântico (Carvalho et al., 2002). Além disso,
os valores de Pb relatados por estes autores para T. truncatus (5,2 µg/g) e D.
delphis (5,3 µg/g) também foram bastante semelhantes àqueles observados no
presente estudo para O. flavescens (4,954 µg/g). Essas concentrações,
similares ao encontrado para a costa do Rio Grande do Sul são caracterizadas,
segundo os autores, como níveis elevados de contaminação presente nos
organismos.
48
Geralmente, altas concentrações de metais são encontradas em
espécies coletadas em regiões costeiras. Por exemplo, um estudo direcionado
para avaliar a ocorrência de poluentes em pinípedes e cetáceos que ocorrem
no litoral da Argentina foi desenvolvido por Marcovecchio et al. (1994). Na
maioria dos casos, incluindo o leão-marinho O. flavescens, estes autores
observaram altas concentrações de metais, como é o caso do Cd, em animais
encalhados ou capturados acidentalmente. Neste contexto, as altas
concentrações de Ag, Cd, Fe e Pb encontradas na pele dos leões-marinhos O.
flavescens amostrados no litoral sul do Rio Grande do Sul, corroboram com a
idéia de que a distribuição global de contaminantes está também afetando os
ecossistemas do sudoeste do Oceano Atlântico (Marcovecchio et al., 1994).
50
No entanto, cabe ressaltar que foi observada, uma tendência de
ocorrência de leões marinhos O. flavescens com maiores concentrações de
metais nas desembocaduras dos estuários da Lagoa dos Patos (Rio Grande,
RS) e do Arroio Chuí (Chuí, RS). No que se refere aos resultados obtidos para
os leões-marinhos coletados na desembocadura do estuário da Lagoa dos
Patos, os resultados obtidos estão de acordo com os dados de contaminação
no sedimento do referido estuário. Niencheski et al. (2000) demonstraram no
sedimento da parte sul do estuário da Lagoa dos Patos um enriquecimento por
metais, como é o caso do Pb, oriundos de atividades urbanas, industriais e
portuárias na cidade do Rio Grande (RS). O mesmo é relatado por Said (2003)
onde foram observadas altas concentrações de Pb nas fezes de leões-
marinhos coletados no molhe leste da Barra da Lagoa dos Patos. Neste caso, o
enriquecimento do sedimento com metais, principalmente os não-essenciais,
poderia estar proporcionando uma maior acumulação destes elementos em
animais que utilizam o bentos como fonte de alimento (por exemplo, peixes e
crustáceos) e que, por sua vez, servem de presas para os leões-marinhos
(Frodello et al., 2002).
Neste contexto, diferentes perfis de contaminação dos animais que
utilizam habitats com distintos níveis de contaminação por metais poderiam ser
observados (Kunito et al., 2002). Apesar de ter sido observada um valor
elevado no agrupamento (~70%) entre os haplótipos analisados, não foram
observadas variações significativas nas concentrações de metais na pele dos
leões-marinhos amostrados em função do haplótipo apresentado pelo animal.
Este resultado sugere que, apesar dos dados genéticos indicarem que os
51
indivíduos que ocupam o litoral sul do Rio Grande do Sul para alimentação e
repouso serem provenientes de colônias reprodutivas distintas, estes
indivíduos estariam compartilhando o mesmo habitat ou até mesmo diferentes
habitats, porém com níveis similares de contaminação ambiental por metais.
Os resultados obtidos no presente estudo indicam claramente variações
sazonais nas concentrações de Ag e Zn na pele dos leões-marinhos
analisados, sendo as menores concentrações observadas no inverno. Pelo
menos para os animais coletados próximos às regiões da desembocadura dos
estuários da Lagoa dos Patos e do Arroio Chuí, bem como nas zonas costeiras
adjacentes, estas menores concentrações de Ag e Zn poderiam estar
relacionadas com uma redução nos níveis de metais acumulados na biota em
função da maior capacidade de diluição da concentração destes elementos
durante o inverno, em função dos níveis pluviométricos mais elevados
observados nestas regiões nesta estação do ano (Seeliger et al., 1998). Assim,
menores níveis de biomagnificação estariam acontecendo nos leões-marinhos
que se alimentam destes organismos e, conseqüentemente, menores níveis de
contaminação tecidual estariam sendo observados. Cabe ressaltar que a pele
dos leões-marinhos é renovada anualmente e que a distribuição de elementos
presentes no sangue para este tecido pode ocorrer com certa rapidez, devido
às características do sistema circulatório destes animais. Desta forma, este
tecido estaria indicando níveis relativamente recentes de contaminação por
metais e, consequentemente estar refletindo as concentrações vigentes no
ambiente nas diferentes estações do ano.
52
Por último, os dados de contaminação por metais nos leões-marinhos da
costa sul do Rio Grande do Sul indicam que a pele é um tecido potencialmente
utilizável para monitoramento da contaminação ambiental e avaliação do
impacto de metais nestes animais, uma vez que é de fácil coleta, manutenção
e análise. Além disso, as variabilidades observadas na concentração de metais
neste tecido não estão relacionadas com o haplótipo, sexo e comprimento total
dos animais, bem como com o grau de decomposição das amostradas
coletadas. Portanto, as possíveis variações uma vez observadas, poderiam ser
atribuídas à sazonalidade ou aos níveis de contaminação ambiental. Esta idéia
está de acordo com o fato de que a pele tem sido nos últimos anos utilizada
freqüentemente para avaliação da contaminação de metais em mamíferos
marinhos (Saeki et al., 2001; Frodello et al., 2002 ; Carvalho et al., 2002 ; Fossi et
al., 2004).
3.5. Conclusões
• A pele demonstrou ser um tecido potencialmente utilizável como amostra
biológica para detectar e monitorar as concentrações de metais em leões-
marinhos Otaria flavescens que ocorrem no litoral sul do Rio Grande do Sul.
• O perfil de contaminação na pele dos leões-marinhos O. flavescens do
litoral sul do Rio Grande do Sul parece estar associado com as alterações
ambientais observadas e descritas para regiões potencialmente impactadas por
atividades antropogênicas, uma vez que os animais com maior concentração
de metais na pele foram amostrados próximos a Barra do Chuí e nos molhes
da Barra da Lagoa dos Patos.
53
4. Conclusão Geral
Os dados de diversidade haplotípica e as relações filogenéticas
estabelecidas entre os leões-marinhos Otaria flavescens que utilizam a costa
sul do Rio Grande do Sul para alimentação e repouso sugerem que estes
indivíduos podem ser originários de distintas colônias reprodutivas. Além disso,
indicam a necessidade de estudos genéticos mais específicos para confirmar
os resultados apresentados. Por sua vez, os dados de contaminação da pele
por metais indicam que, apesar das diferenças genéticas observadas, os leões-
marinhos estudados estariam compartilhando habitats similares em termos de
contaminação ambiental por estes elementos.
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