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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas:
Fisiologia e Farmacologia
Estudo da participação de neuropeptídeos
endógenos, aminas biogênicas e da via do ácido
araquidônico nas respostas nociceptiva e
edematogênica à formalina em ratas da linhagem
Holtzman
LUIZ CLÁUDIO NOMAN FERREIRA
Orientadora: Profª Drª Janetti Nogueira de Francischi
1
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LUIZ CLÁUDIO NOMAN FERREIRA
Estudo da participação de neuropeptídeos
endógenos, aminas biogênicas e da via do ácido
araquidônico nas respostas nociceptiva e
edematogênica à formalina em ratas da linhagem
Holtzman
Tese de doutorado apresentada ao Curso
de Pós-Graduação em Ciências Biológicas –
Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal
de Minas Gerais, como requisito parcial para
a obtenção do grau de doutor em ciências Biológicas.
Orientadora: Profª Drª Janetti Nogueira de Francischi
BELO HORIZONTE
2006
2
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DEDICATÓRIA
A estas pessoas que eu amo do fundo do meu coração, dedico este trabalho, sem vocês
tudo seria mais difícil, senão impossível.
À FLÁVIA, minha esposa, amiga, esteio que em momento algum deixou de dar seu apoio,
carinho e amor.
À minha Mãe, Lenita, obrigado por me dar a oportunidade de ser, viver e aprender com
seus exemplos.
Ao meu Pai, Carlos, pelos exemplos de retidão e honestidade e por todo seu apoio.
À minha Irmã, Sônia , e a todos os meus familiares, em especial meus Tios Oswaldo,
Fuad, Hélio e Márcia e seus familiares, que a todo momento me deram o incentivo para
seguir em frente.
3
AGRADECIMENTOS:
À Professora Janetti, minha orientadora, por toda a dedicação na orientação deste
trabalho, e principalmente pelo apoio nos momentos mais difíceis.
Ao professor Dalton, pelos ensinamentos compartilhados durante o trabalho e também
pelos bons almoços.
Ao professor Orivaldo, do departamento de Patologia do ICB-UFMG, pelo auxílio na
avaliação histopatológica realizada neste estudo.
Aos professores do departamento de Farmacologia do ICB-UFMG, que de alguma
forma, auxiliaram e participaram na realização deste estudo.
Ao amigo Webster, por tudo aquilo que ele fez e faz por todos os estudantes do laboratório
de Inflamação e dor.
Aos amigos do laboratório de Inflamação e Dor, em especial Júlia, Dorothéa, Gustavo,
Kátia, Vanderson, Cinthia e Rafael, que em todos os momentos compartilharam amizade,
carinho e experiência.
Aos amigos do Biotério, em especial, Rinaldo e Franck, pela dedicação e boa-vontade com
que atendem àqueles que deles precisam.
Ao professor Ozair Leite, que além da amizade, acreditou em mim no início desta longa
caminhada pela vida acadêmica.
Aos amigos da Faculdade de Odontologia da UFMG, em especial, Carlos Eduardo,
Evandro, Cláudio, Edgard e Luiz César, que nunca deixaram de dar seu apoio para que eu
pudesse seguir em frente.
Ao Dr Y. S. Bachle, pela importante contribuição dada para o desenvolvimento deste
estudo.
Às Agências, CNPq, CAPES e FAPEMIG, pelo financiamento deste estudo.
4
ÍNDICE
PÁGINAS
SUMMARY 01
LISTA DE ABREVIATURAS 03
LISTA DE FIGURAS 06
LISTA DE TABEAS 11
1.0- INTRODUÇÃO 12
1.1- A dor e os nociceptores 12
1.2- Resposta neurogênica induzida pela formalina em animais de
experimentação 13
1.3-Participação da substância P e neurocinina A na resposta à formalina 16
1.4- Participação das aminas biogênicas na resposta à formalina 19
1.4.1- Histamina 19
1.4.2- Serotonina 20
1.5- Participação da via do ácido araquidônico na resposta à formalina 21
1.6- Avaliação histopatológica da reação tissular na resposta à formalina 22
2.0- OBJETIVOS 23
2.1- Objetivo geral 23
2.2- Objetivos específicos 23
3.0- MATERIAIS E MÉTODOS 25
3.1-Animais de experimentação: 25
3.2- Preparo e administração da formalina 26
3.3-Avaliação da resposta nociceptiva no teste de formalina 26
3.4-Avaliação do edema no teste da formalina 27
3.5- Pré-tratamento dos animais com capsaicina 28
5
3.6- Estudo do componente neurogênico da resposta nociceptiva e
edematogênica à formalina 28
3.7- Estudo da participação das aminas biogênicas, histamina e serotonina, na
resposta nociceptiva e edematogênica à formalina 29
3.8- Estudo da participação da via do ácido araquidônico na resposta à
formalina 30
3.9- Estudo da participação da substância P associada à histamina na resposta
à formalina 31
3.10- Estudo histopatológico das patas de ratos injetadas com formalina 31
3.11- Drogas, reagentes e solventes utilizados 32
3.12- Modo de preparo das drogas 33
3.13- Análise estatística 33
4.0- RESULTADOS 34
4.1- Padronização das respostas nociceptiva e edematogênica à formalina em
ratos 34
4.2- Comparação das respostas nociceptiva e edematogênica à formalina entre
ratos machos e fêmeas da linhagem Holtzman 38
4.3- Efeito dos tratamentos com capsaicina neonatal, do antagonista de
receptor NK
1
(SR 140333) e NK
2
(SR 48968) nas respostas nociceptiva e
edematogênica à formalina em ratas 41
4.4- Efeito de antagonistas de histamina (pirilamina) e serotonina (pizotifeno)
nas respostas nociceptiva e edematogênica à formalina 56
4.5- Efeito dos inibidores não seletivos de ciclooxigenases (piroxicam, dipirona
e paracetamol) nas respostas nociceptiva e edematogênica à formalina 69
4.6- Efeito de inibidores seletivos de ciclooxigenases tipo 1 e 2 nas respostas
nociceptiva e edematogênica à formalina injetada na pata de ratos 76
6
4.7. Efeito da associação de pré-tratamento neonatal com capsaicina ou de
antagonista de receptores NK
1
com antagonista de receptores H
1
nas respostas
nociceptiva e edematogênica à formalina injetada na pata de ratos 93
4.8- Estudo histopatológico das patas de ratas injetadas com formalina 98
5.0- DISCUSSÃO 101
6.0- CONCLUSÕES 108
7.0- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 110
7
SUMMARY
This study verified initially the responses of both female and male Holtzman rats to
intraplantar injection of formalin, observing both nociception and paw edema. In order to
do so, increasing doses of formalin were subcutaneously injected into the intraplantar
region of the hind paws. The nociceptive response was evaluated by the time, expressed in
minutes, spent by the animals lifting their paws from the floor. The edematogenic response
was evaluated by hidropletismometry, being shown as the area under the curve (AUC).
Given the similarity between male and female responses, and the availability of female, we
chose to use female rats in our further experiments. We then studied the role of endogenous
neuropeptides in the response to injected formalin. To evaluate the role of substance P in
this response, the animals were neonatally treated either with capsaicin, or a NK
1
receptor
antagonist SR 140333 or their vehicles. The role of neurokinin A was evaluated using the
NK
2
receptor antagonist, SR 48968. Moreover, we studied the role of the biogenic amines,
histamine and serotonin in the same model. For that, the specific antagonists of the H
1
e 5-
HT
2
receptors (pirilamine and pizotifen), respectively, were used. In addition, the role of
arachidonic acid products in the formalin method was also evaluated, using unselective and
selective inhibitors of the cyclooxygenase isoforms 1 and 2 (piroxicam, dipyrone,
paracetamol, SC 560, celecoxib, rofecoxib and SC 236). A histopathological analysis of the
rat paws injected with 1.25 and 2.5% formalin and its vehicle was undertaken in order to
evaluate the tissue damage caused by the injection. The results of such studies showed that:
1- The formalin model was reproduced in the Holtzman rats as it occurs using other rat
strains. 2- The neuropeptides, P substance and neurokinin A, are involved in the
nociceptive and edematogenic responses to formalin, by activation of NK
1
receptors; 3-
8
Histamine plays an important role in the responses to formalin, confirming previous data
from the literature. However, serotonin 5-HT2 receptors do not seem to be involved in this
model. We also concluded from the current data that: 1) the use of non-selective inhibitors
of cyclooxygenase enzymes 1 and 2 reduced the 2
nd
phase response to formalin, as well as
the edema produced, showing the importance of the arachidonic acid products in these
responses. 2) The drug combination (neonatal capsaicina or SR 140 333) with pirilamine
reduced the nociceptive and edematogenic responses to formalin, especially when
compared with the SR 140333 capsaicin, alone; 3) The histopathological study showed that
the formalin intraplantar injection produces a dose-dependent tissue damage, associated
with a characteristic mast cell degranulation, compatible with the in vivo findings.
9
LISTA DE ABREVIATURAS:
5-HT 5-htdroxitriptamina (serotonina)
5-HT
2
Receptor de serotonina tipo 2
40x Quarenta vezes
% Porcentagem
AINEs Anti-inflamatorios não esteroidais
ANOVA Análise de variância
AUC Área sob a Curva
CEBIO Centro de bioterismo
CETEA Comitê de Ética em Experimentação Animal
Cg Carragenina
CGRP Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
Cm Centímetro
COX Ciclooxigenase
COX-1 Ciclooxigenase tipo 1
COX-2 Ciclooxigenase tipo 2
EPM erro padrão da média
g Grama
ICB Instituto de Ciências Biológica
i-COX-1 Inibidor de cicloxigenase tipo 1
i-COX-2 Inibidor de cicloxigenase tipo 2
IASP Associação Internacional par o Estudo da Dor
i.pl. Intraplantar
10
Kg Kilograma
mg Miligrama
mg/Kg Miligrama por kilograma
mL Mililitro
NaCl Cloreto de sódio
NK
1
Receptor de neurocinina do tipo 1
NK
2
Receptor de neurocinina do tipo 2
NK
3
Receptor de neurocinina do tipo 3
NK-A Neurocinina A
NK-B Neurocinina B
NO Óxido nítrico
pmoles picomoles
Piril Pirilamina
Pizot Pizotifeno
Pizot + Ser Pizotifeno mais serotonina
PGI
2
Prostaciclina
PGs Prostaglandinas
PGE
2
Prostaglandina E
2
Ser Serotonina
SNC Sistema nervoso central
SP Substância P
UFMG Universidade Federal de Minas Gerais
v/v volume por volume
11
VR1 Receptor vaniloide tipo 1
μg Micrograma
μL Microlitro
12
LISTA DE FIGURAS
FIGURAS PÁGINAS
Figura 1- Comparação da resposta nociceptiva entre ratas da linhagem Holtzman e Wistar
após injeção intraplantar de formalina.-------------------------------------------------------------36
Figura 2- Comparação da resposta edematogênica entre ratas da linhagem Holtzman e
Wistar após injeção intraplantar de formalina.----------------------------------------------------37
Figura 3- Comparação da resposta nociceptiva, comportamental (1ª e 2ª fases), entre
machos e fêmeas da linhagem Holtzman, após injeção de formalina.-------------------------39
Figura 4- Comparação da resposta edematogênica entre machos e fêmeas da linhagem
Holtzman, após injeção de formalina 1,25%.------------------------------------------------------40
Figura 5- Efeito da capsaicina, administrada por via subcutânea (neonatal), na resposta
nociceptiva, produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas. -----------------------------44
Figura 6- Resposta edematogênica induzida por injeção de diferentes substâncias em patas
de ratas.-------------------------------------------------------------------------------------------------45
Figura 7- Resposta nociceptiva, produzida por injeção intraplantar de neurocinina A em
ratas.-----------------------------------------------------------------------------------------------------46
Figura 8- Resposta edematogênica porduzida por injeção intraplantar de neurocinina A e
do antagonista do receptor NK
2
(SR 48968).------------------------------------------------------47
Figura 9- Efeito do pré-tratamento com o antagonista do receptor NK
1
(SR 140333),
injetado por via intramuscular, na resposta nociceptiva produzida por injeção de formalina
1,25% em ratas.----------------------------------------------------------------------------------------48
Figura 10- Efeito do pré-tratamento com SR 140333, injetado por via intramuscular, na
resposta edematogênica produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas.---------------49
13
Figura 11- Efeito do pré-tratamento com SR 140333, injetado localmente, na resposta
nociceptiva produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas.------------------------------50
Figura 12- Efeito dopré-tratamento com SR 140333, injetado localmente, na resposta
edematogênica produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas.--------------------------51
Figura 13- Comparação da resposta nociceptiva à formalina 1,25% em animais pré-
tratados, via intra-plantar, com o antagonista de receptor NK
1
, SR 140333 ------------------52
Figura 14- Comparação da resposta edematogênica à formalina 1,25% em animais pré-
tratados, via intraplantar, com o antagonista de receptor NK
1
, SR 140333 -------------------53
Figura 15- Efeito do pré-tratamento com SR 48968, via intramuscular, na resposta
nociceptiva produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas.------------------------------54
Figura 16- Efeito do pré-tratamento com SR 48968, via intramuscular, na resposta
edematogênica produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas.--------------------------55
Figura 17- Efeito do pré-tratamento com pirilamina, via sub-cutânea, na resposta
edematogênica produzida por histamina em ratas.------------------------------------------------59
Figura 18- Efeito do pré-tratamento com pirilamina, via sub-cutânea, na resposta
nociceptiva produzida por injeção de formalina em ratas.---------------------------------------60
Figura 19- Efeito do pré-tratamento com pirilamina, via sub-cutânea, na resposta
edematogênica produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em ratas------------61
Figura 20- Efeito do pré-tratamento com pirilamina, via intraplantar, na resposta
nociceptiva produzida por injeção de formalina em ratas.---------------------------------------62
Figura 21-Efeito do pré-tratamento com pirilamina, via intraplantar, na resposta
edematogênica produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25%, em ratas.-----------63
Figura 22- Comparação do efeito do pré-tratamento com pirilamina, via intraplantar, nas
patas ipsi ou contra-lateral, na resposta nociceptiva à formalina 1,25%, em ratas.----------64
14
Figura 23- Comparação do efeito do pré-tratamento com pirilamina, via intraplantar, nas
patas ipsi ou contra-lateral, na resposta edematogênica à formalina 1,25% em ratas--------65
Figura 24- Efeito do pré-tratamento com pizotifeno, via sub-cutânea, na resposta
nociceptiva produzida por injeção de serotonina em ratas.--------------------------------------66
Figura 25- Efeito do pré-tratamento com pizotifeno, via sub-cutânea, na resposta
nociceptiva produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas.------------------------------67
Figura 26- Efeito do pré-tratamento com pizotifeno, via subcutânea, na resposta
edematogênica produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas.--------------------------68
Figura 27-. Efeito do pré-tratamento com piroxicam, via oral, na resposta nociceptiva
produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas..--------------------------------------------70
Figura 28-. Efeito do pré-tratamento com piroxicam, via oral, na resposta edematogênica
produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas.---------------------------------------------71
Figura 29- Efeito do pré-tratamento com dipirona, via oral, na resposta nociceptiva
produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas.---------------------------------------------72
Figura 30- Efeito do pré-tratamento com dipirona, via oral, na resposta edematogênica
produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas.---------------------------------------------73
Figura 31- Efeito do pré-tratamento com paracetamol, via oral, na resposta nociceptiva
produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas ---------------------------------------------74
Figura 32- Efeito do pré-tratamento com paracetamol, via oral, na resposta edematogênica
produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas ---------------------------------------------75
Figura 33- Efeito do pré-tratamento com SC 560, via sub-cutânea, na resposta nociceptiva
produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas --------------------------------------------79
Figura 34- Efeito do pré-tratamento com SC 560, via sub-cutânea, na resposta
edematogênica produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas.--------------------------80
15
Figura 35- Comparação da resposta nociceptiva à formalina 1,25% em animais pré-
tratados com SC 560, via intraplantar--------------------------------------------------------------81
Figura 36- Comparação da resposta nociceptiva à formalina 1,25% em animais pré-
tratados com SC 560, via intraplantar-------------------------------------------------------------82
Figura 37- Efeito do pré-tratamento com celecoxibe, via oral, na resposta nociceptiva
produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas --------------------------------------------83
Figura 38- Efeito do pré-tratamento com celecoxibe, via sub-cutânea, na resposta
edematogênica produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas---------------------------84
Figura 39- Efeito do pré-tratamento com rofecoxibe, via oral, na resposta nociceptiva
produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas --------------------------------------------85
Figura 40- Efeito do pré-tratamento com rofecoxibe, via oral, na resposta edematogênica
produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas---------------------------------------------86
Figura 41- Efeito do pré-tratamento com SC 236, via sub-cutânea, na resposta nociceptiva
produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas ---------------------------------------------87
Figura 42- Efeito do pré-tratamento com SC 236, via sub-cutânea, na resposta
edematogênica produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas --------------------------88
Figura 43- Efeito do pré-tratamento com SC 236, via intraplantar, na resposta nociceptiva
produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas ---------------------------------------------89
Figura 44-Efeito do pré-tratamento com SC 236, via intraplantar, na resposta
edematogênica produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas---------------------------90
Figura 45- Comparação da resposta nociceptiva à formalina 1,25% em animais pré-
tratados com SC 236, via intraplantar.-------------------------------------------------------------91
Figura 46-. Comparação da respostaedematogênica à formalina 1,25% em animais pré-
tratados com SC 236, via intraplantar-------------------------------------------------------------92
16
Figura 47-Efeito do pré-tratamento com pirilamina, via intraplantar em animais pré-
tratados com capsaicina neonatal na resposta nociceptiva produzida por injeção de
formalina 1,25% em ratas----------------------------------------------------------------------------95
Figura 48- Efeito do pré-tratamento com pirilamina, via intraplantar. em animais pré-
tratados com capsaicina neonatal na resposta edematogênica produzida por injeção de
formalina 1,25% em ratas----------------------------------------------------------------------------96
Figura 49- Efeito do pré-tratamento com pirilamina, via intraplantar, em animais pré-
tratados com capsaicina neonatal, na resposta edematogênica produzida por injeção de
formalina 1,25% em ratas----------------------------------------------------------------------------97
Figura 50- Efeito do pré-tratamento com pirilamina,via intraplantar, co-administrada com
o antagonista de receptor NK
1
,via intra-muscular na resposta edematogênica produzida por
injeção de formalina 1,25% em ratas---------------------------------------------------------------98
17
LISTA DE TABELAS:
Tabela 1-----------------------------------------------------------------------------------------------100
Tabela 2 ----------------------------------------------------------------------------------------------100
18
1.0- INTRODUÇÃO
1.1- A dor e os nociceptores
A dor é conceituada como “uma experiência sensorial e emocional desagradável a
qual está associada a lesões reais ou potenciais ou descrita em termos de tais lesões” (IASP
– Associação Internacional para o Estudo da Dor, 1986).
A dor pode ocorrer por estímulos nocivos que podem ter origem térmica, mecânica
ou química. Os estímulos são percebidos por terminações nervosas especiais denominadas
nociceptores, que são componentes de neurônios aferentes sensoriais primários. Suas fibras
podem ser de médio calibre e mielinizadas, fibras Aδ, ou de pequeno calibre amielinizadas,
denominadas fibras C. Os nociceptores constituem as principais terminações nervosas de
neurônios sensoriais periféricos e em sua maioria respondem aos vários estímulos, sendo
por isso chamados de nociceptores polimodais (Dray, 1992; Raja et al., 1999; Bevan,
1999). A ativação de nociceptores polimodais gera reflexos axônicos nas terminações dos
neurônios aferentes primários. Esses reflexos fazem com que as fibras C liberem os
neuropeptídeos que iniciam a reação inflamatória.
Dentre estes neuropeptídeos se encontram a substância P, a neurocinina A,
neurocinina B e o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina. Esses neuropeptídeos atuam
diretamente sobre a musculatura lisa dos vasos ou indiretamente, através da liberação de
histamina dos mastócitos, como no caso da substância P (Levine e Reichling, 1999; Olsen
et al., 2002).
O papel dos nervos periféricos na produção da inflamação neurogênica tem sido
estudado em laboratório. Determinados estímulos, de origem térmica, mecânica ou química
19
podem gerar trauma tissular e produzir resposta inflamatória mediada por produtos da
ciclooxigenase. O presente trabalho tem como foco de interesse as respostas nociceptivas e
edematogênica induzidas pela formalina, um reconhecido agente capaz de estimular as
terminações nervosas periféricas sensitivas, ocasionando a chamada “inflamação
neurogênica” (Maggi, 1996).
1.2- Resposta neurogênica induzida pela formalina em animais de experimentação
O teste da formalina foi desenvolvido por Dubuisson e Dennis em 1977, com o
objetivo de estabelecer um novo modelo experimental para o estudo da dor. Os modelos até
então utilizados visavam estimular mecanorreceptores (teste da retirada da pata ou teste de
Randall e Sellito), e termorreceptores (teste da placa quente). Estes testes apresentam
basicamente dois inconvenientes a saber: 1) Estes testes medem ou avaliam apenas dor
transitória, ou seja, estímulos aplicados por um breve momento, o que rotineiramente não é
observado clinicamente ou seja, dores, em geral de origem patológica, são contínuas.
Portanto os resultados obtidos por observação desta dor fásica podem não refletir aqueles
obtidos por estímulos de longa duração; 2) estes testes requerem que os animais sejam
contidos durante todo o experimento, de modo a assegurar uma medida adequada.
Entretanto, o medo e o desconforto produzido pela contenção pode potenciar a dor, bem
como a presença de fatores estressantes no ambiente pode levar a uma diminuição dos
escores da dor (Abbott et al., 1995). A injeção subcutânea ou profunda de substâncias
irritantes tem sido utilizada para medir dor ou analgesia. O teste da formalina é um teste de
avaliação de dor que elimina algumas destas dificuldades. O teste consiste na injeção
20
subcutânea de formalina a 5% na pata dos animais de experimentação, gatos e ratos,
(Dubuisson e Dennis, 1977).
A formalina é uma solução de formaldeido (H2=C=O) 37%, diluída em salina
fisiológica estéril. Esta solução é injetada por via subcutânea, sendo que a injeção pode ser
feita tanto na região dorsal como na região plantar da pata dos animais (Tjolsen et al.,
1992), em variadas concentrações, que dependem do objetivo do estudo (Rosland et al,
1990).
Antes da injeção de formalina, os animais devem ser adequadamente
ambientalizados ao teste no laboratório (Saddi e Abbott, 2000).
Após a injeção da formalina os animais desenvolvem uma resposta comportamental,
que se caracteriza por repouso, elevação, lambida e agitação da pata injetada. Esta resposta
é avaliada como resposta nociceptiva. A resposta comportamental dos animais é avaliada
de acordo com um protocolo previamente elaborado, conforme descrito a seguir:
0 - Pata injetada firmemente apoiada no piso.
1- Pata injetada suavemente apoiada no piso ou parede.
2- Pata injetada elevada e sem contato com qualquer superfície e
3- Pata injetada é lambida, mordida ou agitada (Dubuisson e Dennis, 1977; Coderre
et al., 1993).
O teste da formalina se caracteriza por apresentar uma resposta bifásica em ratos
(Shibata et al., 1989; Teng et al., 1998). Esta resposta consiste em uma fase inicial aguda,
imediatamente após a injeção da solução de formaldeido com duração média de 0 a 5
minutos, seguida por um breve período de latência que dura de 10 a 20 minutos, iniciando a
seguir a segunda fase da resposta que dura de 30 a 50 minutos (Wheeler-Aceto et al., 1990;
21
Sakurada et al, 1995; Abbott et al., 1997; Fu et al., 2000). Deste modo, o teste da formalina
possibilita a medida da resposta a um estímulo nociceptivo de longa duração onde 2 tipos
de dor foram postuladas: 1) dor de curta duração determinada por efeito direto da formalina
sobre nociceptores e 2) dor de longa duração causada por inflamação (Rosland et al., 1990;
Lee e Jeong, 2002).
Na primeira fase da resposta, a dor mediada por estímulo químico gerado por
formalina ativa diretamente as terminações nervosas sensoriais aferentes (Watkins et al.,
1997; Damas e Liégeois, 1999), que produzem a liberação de neuropeptídeos locais e
produz ainda vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular, além de provocar dor e
hiperalgesia (Brain, 1997; Fu et al., 2000).
A segunda fase se caracteriza por uma resposta inflamatória, com dor inflamatória
que pode ser inibida por drogas anti-inflamatórias, o que sugere a participação dos produtos
do ácido araquidônico em sua gênese (Hunskaar et al., 1987; Tjolsen et al., 1992).
O teste de formalina é um método conveniente para produzir e quantificar a resposta
nociceptiva, já que a intensidade da dor é observada a partir de um comportamento
objetivo. Além disso, possibilita avaliar a resposta causada por dano tissular moderado e
pode produzir um estado que mais se aproxima das condições clínicas (Tjolsen et al.,
1992).
Além de produzir resposta comportamental, a injeção subcutânea intraplantar de
formalina também produz edema (Wheeler-Aceto et al., 1990; Fu et al., 2000; Sawynok et
al., 2002) que pode ser causado pela resposta inflamatória decorrente do dano tissular.
Usando microscópio óptico, as patas das ratas injetadas com formalina 5% apresentaram
alterações típicas de inflamação aguda, iniciando com degranulação de mastócitos e edema
22
30 minutos após a injeção, seguida da invasão de granulócitos com o aumento do tempo de
observação (Rosland et al., 1990).
1.3- Participação da substância P e da neurocinina A na resposta à formalina
Uma forma de avaliar a participação de neurotransmissores na resposta
comportamental e edematogênica produzida por injeção subcutânea de formalina é
bloquear a ação destes neuropeptídeos, em especial da substância P e neurocinina A, por
degeneração seletiva de fibras ou por tratamento com antagonistas específicos.
A capsaicina é uma neurotoxina, “irritante”, algógena, cuja molécula é obtida a
partir do extrato de pimentas vermelhas (Laird et al., 2001). A capsaicina possui a
capacidade de induzir uma degeneração seletiva de fibras aferentes sensoriais primárias
quimio-sensitivas (Jancsó et al., 1967; Brain, 1997). Esta degeneração ocorre
principalmente nas fibras C amielinizadas, em especial nos receptores polimodais (Shibata
et al., 1989). Estes receptores expressam neuropeptídeos como substância P (SP),
neurocinina A (NKA), neurocinina B (NKB), somatostatina, e peptídeo relacionado ao gene
da calcitonina (CGRP), que são liberados na medula espinal (Dray, 1992; Laird et al., 2001;
Omar e Salam, 2002; Massaad et al., 2004).
A degeneração de neurônios aferentes primários após dose única de capsaicina em
ratos recém-nascidos pode reduzir em 70% o número de fibras amielinizadas no nervo
safenoso de ratos adultos. Em alguns casos, pode ocorrer completa perda de fibras da raiz
dorsal (Nagy et al., 1983b). Repetidas administrações de capsaicina produzem
desensibilização e inativação de neurônios sensoriais, sendo que vários mecanismos
parecem estar envolvidos nestas condições. Eles incluem a inativação do receptor, bloqueio
23
dos canais de cálcio ativados por voltagem, acúmulo de íons intracelularmente, produzindo
alterações osmóticas e ativação de enzimas proteolíticas (Dray, 1992; Caterina et al., 2000).
A capsaicina, assim como os demais compostos vanilóides, se liga em um receptor
específico denominado receptor vaniloide tipo 1 (VR1). O receptor vaniloide é um canal
catiônico que se expressa em neurônios sensoriais primários da via da dor (Szallasi e Di
Marzo, 2000; Cortight and Szallasi, 2004).
Em estudos realizados por Jessel et al., (1978), o pré-tratamento dos ratos com
capsaicina reduziu em 48% a concentração de substância P no corno dorsal dos animais
tratados, quando comparados ao grupo controle. Em outro estudo, a injeção prévia de
capsaicina inibiu 50% da primeira fase da resposta nociceptiva produzida por injeção
subcutânea de formalina (Shibata et al., 1989).
O pré-tratamento de ratos com capsaicina pode ser feito de várias maneiras. Em seu
trabalho original, Jancsó et al., (1967) pré-tratou ratos adultos com doses crescentes de
capsaicina. Doses de 4, 8 e 15 mg/kg em intervalos de 6 horas ou dose única de 10 a 20
mg/animal, sendo os animais utilizados para os experimentos 1 ou 2 dias após a(s)
injeção(ões) de capsaicina. Em outro estudo, Jessel et al., (1978) dessensibilizou animais da
linhagem Wistar, adultos, utilizando doses diárias crescentes de capsaicina (50, 100, 200,
200 e 400 mg/kg, uma dose por dia durante 5 dias), realizando seus trabalhos experimentais
10 dias após a última injeção.
O pré-tratamento dos animais com capsaicina também pode ser feito com animais
recém-nascidos. Doses de capsaicina que variam de 5 a 100 mg/kg, em ratos da linhagem
Sprague-Dawley, podem ser capazes de desensibilizar neurônios aferentes de modo dose-
dependente nessa faixa de doses (Nagy et al., 1983 a e b; Ohtori et al., 2000). Em trabalho
experimental realizado por Chen et al. (2001), foi demonstrado que neurônios aferentes
24
primários sensíveis à capsaicina foram destruídos após aplicação tópica de capsaicina no
nervo ciático e/ou safenoso por 30 minutos. A concentração de capsaicina (1,5%) foi
selecionada de um estudo piloto na qual o animal perdeu totalmente a sensibilidade térmica
da pata tratada com capsaicina (Wheeler-Aceto e Cowan, 1991).
Outra maneira de bloquear a ação da substância P e outros neuropeptídeos liberados
pela ação da formalina, seria a utilização de antagonistas específicos de receptores para
estas substâncias. A substância P é o ligante endógeno que se liga preferencialmente ao
receptor NK
1
(Seguin et. Al, 1195; Dionne et al., 1998). Este receptor está amplamente
distribuído no sistema nervoso central (SNC). Na medula espinal, o receptor NK
1
se
distribui principalmente no corno dorsal, particularmente nas lâminas I e II (Gonzáles et al.,
2000; Baulmann et al., 2000; Bellucci et al., 2002).
No caso específico da SP, o composto SR 140333, é um potente antagonista do
receptor NK
1
(Emonds-Alt et al., 1993; Oury-Donat et al.,1994). Este composto pode
representar uma nova classe de antagonistas não-peptídeos que interage especificamente
com os receptores NK
1
.
A neurocinina A deriva do mesmo gene da SP (Yashpal et al., 1996; Trafton et al.,
2001), se distribui amplamente, porém são particularmente encontradas em neurônios
aferentes primários. A neurocinina A ativa preferencialmente os receptores do tipo NK
2
(Sivam e Krause, 1992; Laird et al., 2001; Trafton et al., 2001). O composto SR 48968 é
um antagonista específico de receptores NK
2
, portanto antagoniza a ação da neurocinina A
liberada (Beaujouan et al., 2004).
25
1.4- Participação das aminas biogênicas na resposta à formalina
1.4.1- Histamina
A histamina é uma amina vasoativa básica formada a partir da histidina. É
encontrada na maioria dos tecidos do corpo, e em nível celular encontra-se estocada
principalmente nos mastócitos, dos quais é liberada durante reações inflamatórias ou
alérgicas (Guo et al., 1997; Rang et al., 2001). Produz, por ação direta, o aumento da
permeabilidade vascular, agindo, principalmente em vênulas pós-capilares, onde abre
espaços entre células endoteliais com extravasamento de proteínas plasmáticas (Amann et
al., 1995). Produz sua ação por efeito direto sobre receptores histaminérgicos específicos
H
1
, H
2
, H
3
.
Em estudo realizado por Hong e Abbott (1994), foi observado que a injeção
intraplantar de histamina ou serotonina produziu resposta nociceptiva. Neste estudo, todos
os mediadores inflamatórios utilizados (5-HT, PGE
2
, bradicinina, substância P, nor-
adrenalina e histamina) apresentaram uma resposta comportamental, de modo dose-
dependente. Esta resposta consistia no rato repousar levemente a pata injetada no piso, e o
animal mantinha-se em posição de repouso. Entretanto, a serotonina, além da PGE
2
e
bradicinina produziu também resposta comportamental caracterizada por elevar e lamber a
pata injetada.
A histamina é capaz de estimular fibras C, mecanorreceptores e nociceptores
polimodais (Chia et al., 2004), assim como potenciar sua resposta a outros estímulos, como
o calor, por exemplo. Esta ação é mediada via receptores H
1
, os quais estão normalmente
presentes em 5 – 10 % das fibras de pequeno calibre (Olsen et al., 2002).
26
1.4.2- Serotonina
A serotonina (5-HT) também é uma amina vasoativa com ampla distribuição
tissular, perifericamente está associada às plaquetas e em ratos está estocada em vesículas
de mastócitos (Parada et al., 2001). Pode atuar tanto como neurotrasmissor, como hormônio
local. É formada a partir do triptofano da dieta (Rang et al., 2001). A serotonina é um dos
vários mediadores que são liberados em casos de injúria e inflamação tissular, sendo por si
só, capaz de induzir extravasamento de proteínas plasmáticas e hiperalgesia (Abbott et al.,
1995; Abbott et al., 1996), e sendo aplicada exogenamente pode estimular reação
inflamatória em humanos e ratos (Doak e Sawynok, 1997).
A serotonina tem um papel importante na modulação nociceptiva, podendo diminuir
a resposta comportamental à formalina em suas duas fases (Jeong et al., 2004). Alguns
antagonistas de 5-HT diminuem significativamente a 1ª fase da resposta à formalina
(Correa et al., 1993; Doak et al, 1997). Outros antagonistas de receptores 5-HT
(Tropisetron e WAY 100,135) podem reduzir significativamente ambas fases da resposta à
formalina (Parada et al., 2001; Sasaki et al, 2003). Entretanto, a contribuição dos diferentes
sub-tipos de receptores de 5-HT é controversa (Abbott et al., 1997; Bardim et al., 2001;
Nadeson e Goodchild, 2002). O pizotifeno é um antagonista de receptores 5-HT
2
, que
podem estar envolvidos na resposta nociceptiva e edematogênica produzida por formalina
em camundongos/ratos. Por outro lado, o uso de agonistas de receptor 5-HT
2
produz
resposta nociceptiva (Nadeson e Goodchild, 2002).
27
1.5- Participação da via do ácido araquidônico na resposta à formalina
As prostaglandinas (PGs) e a prostaciclina (PGI
2
) são importantes mediadores
lipídicos da inflamação e da dor. As PGs são formadas a partir do ácido araquidônico, por
ação das enzimas ciclooxigenases (COX-1 e COX-2). Após estimulação nociceptiva, esses
mediadores lipídicos são liberados no local da injúria onde sofrem ação das enzimas
ciclooxigenases (Julius e Basbaum, 2001; Tegeder et al., 2001). Por outro lado, a inibição
da produção de PGs por ação local ou sistêmica de anti-inflamatórios não esteroidais
(AINEs) leva à redução da resposta nociceptiva (Vane et al., 1971; Gierse et al., 1996),
principalmente na 2ª fase da resposta à formalina (Chichorro et al., 2004).
A enzima COX-1 é denominada isoforma “constitutiva” estando expressa em vários
tecidos e células (Smith et al., 1998) e a COX-2 é a isoforma denominada “indutível”
(Masferrer, et al., 1994; Yamamoto e Nozaki-Taguchi, 1996; Vane et al., 1998; Dannahardt
e Kiefer, 2001; Sandrini et al., 2002; Pinheiro e Calixto, 2002). A enzima COX-2 não é
detectada na maioria dos tecidos quiescentes, porém, na presença de estímulos
inflamatórios pode ser rapidamente sintetizada e produzir PGs (Dudhgaonkar et al., 2004).
Outros estudos têm demonstrado que a COX-1 pode ser expressa também durante a
inflamação (Smith et al., 1998) e que a COX-2 pode ser encontrada constitutivamente em
alguns tecidos (Yamamoto e Nozaki-Taguchi, 1996; Dirig et al., 1997). Em estudo
realizado, Yaksh et al. (2001) demonstraram que ambas isoformas estão expressas no corno
dorsal da medula espinal e gânglio da raiz dorsal de ratos. Isto indica que pode ser
necessária a inibição de ambas as enzimas para reduzir dor e edema produzidos por PGs
durante o desenvolvimento de processos inflamatórios. Além disso, tem sido mostrado que
a inibição destas enzimas pode induzir efeitos colaterais (Wallace, 1999 a e b). A potência e
28
a efetividade de anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), com diferentes seletividades
por isoformas de COXs, precisa ser melhor esclarecida (Mazário et al., 2001).
1.6- Avaliação histopatológica da reação tissular na resposta à formalina
Experimentalmente, a injeção intraplantar de formalina produz uma resposta
inflamatória que se caracteriza principalmente por edema. O edema formado tem seu pico
entre a 1ª e a 2ª hora e se caracteriza pelo aumento da permeabilidade microvascular, como
conseqüência do efeito vasodilatador das PGs, potenciando o efeito de outros mediadores
como a bradicinina, substância P e histamina (Guo et al., 1977). Histologicamente a injeção
intraplantar de formalina produz edema, hiperemia e aumento do número de células
inflamatórias, em especial mastócitos e linfocitos e macrófagos.
29
2.0- OBJETIVOS
2.1- Objetivo geral
Estudar a resposta comportamental (nociceptiva) e inflamatória (edematogênica)
que se desenvolve concomitantemente após a injeção intraplantar de formalina na pata de
ratos, bem como avaliar a participação de neuropeptídeos endógenos (substância P e
neurocinina A), aminas biogênicas (histamina e serotonina) e produto da via do ácido
araquidônico (prostaglandina) através da utilização de drogas de mecanismo de ação
conhecido, em particular de antagonistas dos mediadores descritos e inibidores de
ciclooxigenases no mesmo modelo experimental.
2.2- Objetivos específicos
Vários objetivos específicos foram desenvolvidos no presente trabalho, que
incluíram:
2.2.1- Avaliar se a resposta nociceptiva e edematogênica à formalina ocorre
efetivamente nas condições do nosso laboratório e se ela seria adequada para os estudos de
ação de drogas analgésicas e anti-inflamatórias de mecanismo de ação conhecido, em
experimentos subseqüentes.
2.2.2- Avaliar se a linhagem Holtzman pode ser usada neste modelo experimental e
verificar se existiriam diferenças nas respostas estudadas em relação ao gênero dos animais.
30
2.2.3- Avaliar se as respostas nociceptiva e edematogênica ocorrem de forma
concomitante e quais os mecanismos estão envolvidos nessas respostas, através da
utilização de drogas de mecanismo de ação já estabelecido.
2.2.4- Avaliar a participação das neurocininas substância P e neurocinina A, das
aminas biogênicas histamina, serotonina e da via do ácio araquidônico nas respostas
nociceptiva e edematogênica induzida por injeção de formalina na pata de ratas, a partir do
uso de drogas com mecanismo de ação já estabelecidos.
2.2.5- Confirmar, através de estudo histopatológico, as características do dano
tissular decorrente da injeção de formalina na pata de ratas.
31
3.0- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1-Animais de experimentação:
Para o estabelecimento da linhagem e do gênero de animais a serem utilizados nos
experimentos, inicialmente foram usados ratos albinos novérgicos, machos e fêmeas das
linhagens Holtzman e Wistar, obtidos junto ao Centro de Bioterismo do Instituto de
Ciências Biológicas da UFMG (CEBIO-ICB-UFMG). Os animais adultos foram usados nos
experimentos com 140 a 180 gramas de peso. Os animais que foram pré-tratados com
capsaicina receberam o pré-tratamento com 2-3 dias de vida e foram utilizados nos
experimentos posteriores quando pesavam entre 140 e 180 gramas. Para a realização do
teste, os animas foram colocados para ambientalização na sala de experimentos 24 horas
antes. A temperatura da sala variou entre 23 e 25° C, já que temperatura inferiores a 20ºC
ou superiores a 28 ºC podem interferir na 2ª fase da resposta à formalina (Rosland, 1991),
com ciclo claro escuro de 12 horas, com os animais tendo livre acesso à água e alimento.
Trinta minutos antes do início do experimento, os animais foram colocados em caixas
transparentes para ambientalização. As caixas, de vidro, com medidas de 30 x 20 x 20 cm,
foram colocadas em suportes com espelhos posicionados a 15 cm da base e com inclinação
de 45°, de modo a permitir a visualização adequada dos animais. Todos os experimentos
foram realizados entre 9:00 e 16:00 horas. Após os experimentos, os animais foram
separados e sacrificados.
Todos os estudos foram previamente aprovados pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal (CETEA/UFMG – 0028/2002).
32
3.2- Preparo e administração da formalina
De uma solução inicial de formaldeido 37%, diferentes diluições de formalina
foram preparadas, de modo a se obter concentrações finais de 0,625%, 1,25% e 2,5% em 50
μL de salina fisiológica estéril. Conforme considerado anteriormente, a injeção intraplantar
de formalina produz uma resposta nociceptiva (comportamental), caracterizada por 2 fases
distintas, uma com início rápido e outra tardio. Concentrações de formalina superiores a 1%
produzem ambas as fases da resposta (Rosland et al.,1990). Para a realização do teste, os
animais receberam injetações com as diferentes concentrações de formalina, na região
intraplantar da pata traseira direita. Como controle os animais receberam injeções na região
intraplantar da pata traseira esquerda com o mesmo volume de veículo, ou seja, salina
fisiológica estéril. Em alguns experimentos as drogas teste foram pré-administradas na
mesma pata injetada com formalina ou na pata contra-lateral, conforme indicado nos
resultados.
3.3-Avaliação da resposta nociceptiva no teste de formalina
Após a injeção da formalina, cada animal foi colocado em uma caixa de vidro, que
foram monitorados por um período contínuo de 2 horas. Foi considerada como resposta
nociceptiva (comportamental), a retirada da pata de seu apoio do assoalho da caixa, ou seja,
ao remover a pata do piso o cronômetro era acionado, sendo desligado quando o animal
voltava a apoiar a pata. A resposta nociceptiva ao teste da formalina, foi determinada nos
tempos: 0 a 5 minutos e 10 a 70 minutos, e foram considerados os tempos de elevação da
pata observados em cada fase e expressos em minutos ± erro padrão da média (epm).
33
3.4-Avaliação do edema no teste da formalina
Para a verificação da medida de volume das patas dos animais utilizados nos vários
experimentos foi utilizado o hidropletismômetro Ugo Basile, modelo 7140. A
hidropletismometria consiste na avaliação da variação do volume das patas traseiras dos
animais, em relação ao tempo, sendo expresso em mililitros (mL). Para tal, as patas
traseiras foram imersas em uma cubeta que contém solução salina detergente, que se
encontra em comunicação com uma segunda cubeta. Esta última possui eletrodos que são
sensíveis às variações de volume das patas. O volume das patas pode ser lido no monitor
digital do aparelho. Este monitor está acoplado ao transdutor de sinal que é ligado aos
eletrodos que transformam o sinal elétrico em eletrônico. Após o posicionamento da pata
do animal, o examinador aciona um pedal que marca o volume final. Os volumes das patas
posteriores foram registrados nos tempos 0, 5, 15, 30, e 1, 2, 3 e 4 horas, respectivamente
após a injeção de formalina 1,25%. Os resultados foram expressos como a média da
diferença entre os volumes das patas traseiras (em mililitros) ± erro padrão da média. Os
valores foram posteriormente convertidos e expressos em área sob a curva (AUC),
conforme apresentados nos resultados, para facilitar a comparação posterior das diferentes
doses de cada droga utilizada.
34
3.5- Pré-tratamento dos animais com capsaicina
Para fazer o pré-tratamento dos animais com capsaicina, ratas recém-nascidas (2 a 3
dias de vida), foram afastadas de suas mães por um breve período. No grupo de animais
tratados, a capsaicina, na dose de 25 mg/kg, diluída em etanol (10%), Tween 85 (10%) e
salina fisiológica estéril (80%) foi injetada por via subcutânea com volume final de 50 µL.
O grupo controle recebeu injeção com o mesmo volume do veículo utilizado na diluição da
capsaicina (etanol, tween 85 e salina 1: 1: 8 v/v). O grupo naive não recebeu nenhum tipo
de injeção
Os animais recém-nascidos, após a injeção com capsaicina ou veículo, foram
recolocados junto às mães para amamentação. O desmame foi realizado com 30 dias após
as injeções. Os animais foram utilizados nos experimentos quando atingiram o peso
exigido, sendo que isto ocorria em torno de 90 a 120 dias (140 a 180 g).
3.6- Estudo do componente neurogênico da resposta nociceptiva e edematogênica à
formalina
Para estudar o componente neurogênico da resposta nociceptiva e edematogênica à
formalina, antagonistas específicos para receptores NK
1
e NK
2
(SR 140333 e SR 48968),
respectivamente, receberam injeções por via intra-muscular (NK
2
) e intra-muscular e
intraplantar (NK
1
) em doses descritas conforme estudo de Santos et al., (2004). Quando
utilizadas localmente, a dose inicial do antagonista foi 1/10 da menor dose sistêmica
utilizada. Para verificar a eficácia dos antagonistas utilizados, foi realizada a injeção do
agonista padrão por via intraplantar, em experimento paralelo, isto é, realizado no mesmo
35
dia. A injeção dos agonistas era precedida de doses de tais antagonistas, conforme descrito
por Hong e Abbott, (1994). Assim substância P ou neurocinina A foi administrada
intraplantarmente 30 minutos após a injeção de SR 140333 e SR 48968, respectivamente e
as respostas nociceptivas e edematogênicas foram determinados antes, e , 5, 15, 30 minutos
e 1, 2, 3 e 4 horas. A substância P foi utilizada nas doses de 0,4, 4,0 e 40 µg/pata em 50
µL. via intra-plantar e a neurocinina A nas doses de 800, 1600 e 3200 pmoles/pata no
mesmo volume e na mesma via que a substância P. Animais controle receberam injeções
com o mesmo volume (50 µL) de veículo na zero hora.
3.7- Estudo da participação das aminas biogênicas, histamina e serotonina, na
resposta nociceptiva e edematogênica à formalina
Para estudar a participação das aminas biogênicas, histamina e serotonina, na
resposta nociceptiva e edematogênica à formalina, as mesmas foram injetadas por via
intraplantar nas patas de ratas (50µL/pata). Estas injeções tinham como objetivo de
observar se tais substâncias produziriam resposta nociceptiva e/ou edematogênica. Em
seguida, outros grupos foram pré-tratados com antagonistas específicos de receptores destas
substâncias, ou seja: Antagonista específico de receptor H
-1
(pirilamina) nas doses de 2, 4 e
8 mg/kg, por via subcutânea ou 50, 100 e 200 µg/pata, por via intraplantar. O antagonista
de receptor 5-HT
2
(pizotifeno) nas doses de 2, 4 e 8 mg/kg, também foi utilizado por via
subcutânea ou 50, 100 e 200 µg/pata, por via intraplantar.
36
3.8- Estudo da participação da via do ácido araquidônico na resposta à formalina
Para estudar a participação da via do ácido araquidônico na resposta nociceptiva e
edematogênica à formalina, foram utilizadas as seguintes drogas inibidoras não-seletivas
das enzimas ciclooxigenases: piroxicam nas doses de 3, 20 e 40 mg/kg conforme Francischi
et al. (2002), paracetamol nas doses de 12, 120 e 360 mg/kg e dipirona nas doses de 60, 120
e 180 mg/kg (Lorenzetti & Ferreira, 1985), por via oral. Para avaliar a participação da
enzima COX-1, foi utilizado um inibidor específico desta enzima, o composto SC 560 nas
doses de 5, 10 e 20 mg/kg, por via subcutânea conforme descrito em Smith et al. (1995).
Finalmente, para avaliar a participação da enzima COX-2 na resposta à formalina
utilizamos os seguintes inibidores específicos desta enzima: celecoxibe nas doses de 3, 6 e
12 mg/kg, rofecoxibe nas doses de 0.7, 1.4 e 2.8 mg/kg, ambos por via oral e o composto
SC 236 nas doses de 6, 12 e 24 mg/kg, por via subcutânea ou 10, 100 e 200 µg/pata, por via
intraplantar. Os antagonistas descritos acima receberam injeções 30 minutos antes da
injeção intraplantar de formalina.
Nos grupos de animais em que as drogas foram injetadas intraplantarmente, foi
realizado um grupo controle, onde o pré-tratamento com inibidores foi feito na pata contra
lateral, ou seja, na pata esquerda, na dose de 100 µg/pata, enquanto a formalina foi injetada
na pata direita.
37
3.9- Estudo da participação da substância P associada à histamina na resposta à
formalina
Para estudar a participação da substância P juntamente com a histamina na resposta
nociceptiva e edematogênica à formalina, foram utilizados animais pré-tratados
neonatalmente com capsaicina conforme descrito anteriormente. Os animais foram pré-
tratados com o antagonista de receptor H
1
(pirilamina) na dose de 100 µg/pata (volume
final: 50 µL), 30 minutos antes da injeção intraplantar de formalina. Utilizamos animais
que não foram tratados com capsaicina e que foram pré-tratados (30 minutos) com o
antagonista específico de receptores NK
1
(SR 140333) na dose de 2,0 mg/kg, por via intra
muscular. Nesse grupo, os animais foram pré-tratados com o antagonista de receptor H
1
(pirilamina), na dose de 100 µg/pata (volume final: 50 µL), tendo o grupo contrôle recebido
injeção de salina fisiológica estéril no mesmo volume (50 µL).
3.10- Estudo histopatológico das patas de ratos injetadas com formalina
Para a realização do estudo histopatológico das patas de ratas injetadas com
formalina, o seguinte protocolo experimental foi estabelecido: Utilizamos ratas Holtzman,
seguindo os mesmos critérios de peso, ambientalização, alimentação e ciclo dia/noite
descritos anteriormente. Os animais, em grupos de 3, receberam injeções intraplantarmente
com formalina 1,25% ou 2,5% (pata direita) ou salina fisiológica estéril (pata esquerda)
com volume final de 50 μl. Após sacrifício dos animais, por deslocamento cervical, as patas
foram removidas na altura do coxim plantar e fixadas em formol 10% tamponado.
38
Realizados os cortes histológicos, as lâminas foram coradas com Hematoxilina-Eosina
(HE). As patas foram retiradas nos tempos 1, 2, 3, 4 horas. Para leitura das lâminas foi
utilizada microscopia óptica com aumentos de 40x.
3.11- Drogas, reagentes e solventes utilizados
1- NaCl (VETEC Química Fina ltda).
2- Formaldeido 37% (VETEC Química Fina ltda).
3- Capsaicina (Sigma-Aldrich).
4- Etanol (VETEC Química Fina ltda).
5- Tween 85 (VETEC Química Fina ltda).
6- Substância P (Sigma-Aldrich ).
7- SR 140333 (Sigma-Aldrich).
8- Neurocinina A (Sigma-Aldrich).
9- SR 48968 (Sigma-Aldrich).
10- Histamina (Sterilin).
11- Pirilamina (Sigma-Aldrich ).
12- Serotonina (Sigma-Aldrich).
13- Pizotifeno (Sigma-Aldrich).
14- Dipirona (EMS Sigma Pharma).
15- Paracetamol (Jansen Cilag).
16- Piroxicam (Pfizer).
17- SC 560 (Cayman Chemicals Company).
18- Celecoxibe (Pharmacia Brasil).
39
19- Rofecoxibe ( Merck Shape Dohme).
20- SC 236 (Cayman Chemicals Company).
3.12- Modo de preparo das drogas
Formalina, substância P, neurocinina A, histamina, pirilamina, serotonina,
pizotifeno, dipirona, paracetamol, piroxicam, celecoxibe e rofecoxibe foram diluídos em
salina fisiológica estéril (SFE). Os compostos SR 140333, SR 48968, SC 236 e SC 560
foram diluídos em etanol (5%) e salina fisiológica estéril (95%). Os animais controle
receberam injeções com os respectivos veículos.
3.13- Análise estatística
Os resultados obtidos das medidas de nocicepção foram representados pelas médias
do tempo de elevação da pata de seu apoio em minutos ± epm. Os resultados de edema
foram expressos com valores obtidos da área sob a curva ± epm. Os resultados obtidos
foram avaliados estatisticamente utilizando-se o teste ANOVA one-way/Bonferroni –
Programa SIGMA STAT – em ambiente Windows (2001). Foram consideradas
significativas as diferenças entre os grupos quando p < 0,05.
40
4.0- RESULTADOS
4.1- Padronização das respostas nociceptiva e edematogênica à formalina em ratos
Para estabelecer a linhagem de animais a ser utilizada no presente trabalho, ratos
Holtzman e Wistar receberam injeções intraplantar com doses crescentes de formalina:
0,625, 1,25 e 2,5 %. Como é possível observar na figura 1, o tempo (em min) em que os
animais apresentaram as patas elevadas de seu apoio, que foi caracterizado como
comportamento nociceptivo após a injeção das diferentes doses de formalina, apresentou-se
similar tanto na fase I quanto na fase II da resposta nas duas linhagens de ratos estudadas
(painéis A, B, C e D). Do total de 5 min de observação relativos à fase I, os animais de
ambas linhagens permaneceram a maior parte do tempo (> 2,5 min) com a pata injetada
elevada (2,87 ±0,08, 4,12 ± 0,21 e 4,13 ±0,25 minutos na linhagem Holtzman e 2,39 ±1,16,
4,15 ± 0,39 e 3,89 ± 0,45 minutos na lingagem Wistar, nas doses de 0,625, 1,25 e 2,5%
respectivamente). Os grupos controle não apresentaram resposta nociceptiva. Na fase II, os
animais foram observados a partir do 10º minuto (total de 60 min de observação), com a
menor dose de formalina valores intermediários de nocicepção foram obtidos
(aproximadamente 15 min), sendo que valores máximos de tempo alcançados com a pata
elevada (> 40 minutos do total), também foram obtidos de maneira similar em ambas
linhagens de animais, com as duas maiores doses de formalina , (16,0 ± 1,61, 40,7 ± 0,89 e
42,2 ± 1,75 minutos na linhagem Holtzman e 14,0 ± 0,92, 39,7 ± 0,75 e 41,8 ± 0,94
minutos na lingagem Wistar, nas doses de 0,625, 1,25 e 2,5% respectivamente).
Em adição, as respostas de edema de animais Holtzman e Wistar (painéis A e B) à
formalina, que apresentaram latência de 15 min para se manifestar (figura 2), também
foram similares em ambas linhagens de animais. Nas duas linhagens, a resposta
41
edematogênica à formalina alcançou um máximo após 2 h da injeção e, dependendo da
dose, perdurou até 24 h após as injeções, no caso da dose 2,5 % de formalina (resultados
não apresentados). Com o objetivo de tornar mais fácil a comparação entre as doses, os
resultados de edema foram também transformados em área sob a curva (área under the
curve, AUC), e se encontram apresentados nos painéis A e B da figura 2, respectivamente
(0,17 ± 0,02, 0,56 ± 0,07, ± 1,0. ± 0,08 e 1,23 ± 0,13 na linhagem Holtzman e 0,18 ± 0,02,
0,8 ± 0,11, 0,95 ± 0,04 e 1,48 ± 0,10 na linhagem Wistar, nas doses de 0,625, 1,25 e 2,5%
respectivamente).
Dada a similaridade de respostas nociceptiva e edematogênica à formalina entre
ratos das linhagens Holtzman e Wistar, decidiu-se pela utilização dos animais da linhagem
Holtzman nos estudos subseqüentes.
Além disso, estabeleceu-se a dose de formalina de 1,25 % como padrão para
indução das respostas nociceptiva e edematogênica nos ensaios seguintes, já que seu efeito
máximo foi similar ao observado com o dobro da dose (2,5 %), de maneira a também
facilitar a detecção de eventual efeito inibitório com as drogas a serem posteriormente
estudadas.
42
A B
Holtzman
Controle 0,625 1,25 2,5
0
1
2
3
4
5
*
*
*
Formalina
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
Wistar
Controle 0,625 1,25 2,5
0
1
2
3
4
5
Formalina
*
*
*
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
C D
Holtzman
Controle 0,625 1,25 2,5
0
20
40
60
Formalina
*
*
*
Tempo de elevação da
pata (min)
2ª fase
Wistar
Controle 0,625 1,25 2,5
0
20
40
60
Formalina
*
*
*
Tempo de elvação da
pata (min)
2ª fase
Figura 1 – Comparação da resposta nociceptiva entre ratas da linhagem Holtzman e
Wistar após injeção intraplantar de formalina. Os animais controle receberam injeções
somenteSFE, sob as mesmas condições experimentais. As doses de formalina foram
expressas em percentual (%). Os painéis A e B correspondem à 1ª fase da resposta
nociceptiva. Os painéis C e D correspondem à 2ª fase da resposta nociceptiva. Tempo de
observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. Cada barra representa a média (±
epm) do tempo de retirada da pata do apoio. Tempo expresso em minutos. (n= 5, 5, 5 e 7
respectivamente).
43
A
Holtzman
Controle 0,625 1,25 2,5
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema de pata (AUC)
Formalina
*
*
*
B
Wistar
Controle 0,625 1,25 2,5
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema de pata (AUC)
Formalina
*
*
*
Figura 2 – Comparação da resposta edematogênica entre ratas da linhagem
Holtzman e Wistar após injeção intraplantar de formalina. Os animais controle receberam
injeções com SFE, sob as mesmas condições experimentais. As doses de formalina foram
expressas em percentual (%). Tempo de observação de 0 a 4 horas. Cada barra representa a
média (± epm) da área sob a curva obtida com o edema. (n= 5, 5, 5 e 7 respectivamente).
44
4.2- Comparação das respostas nociceptiva e edematogênica à formalina entre ratos
machos e fêmeas da linhagem Holtzman
Para verificar se haveria diferenças entre as respostas nociceptiva e edematogênica
de ratos machos e fêmeas da mesma linhagem, formalina 1.25 % foi injetada
intraplantarmente nos animais, e o tempo de elevação da pata nas fases I e II da resposta
foram acompanhados. Como pode se observado nos painéis A e B da figura 3, não houve
diferença dos tempos de elevação da pata injetada nas fases I e II entre machos e fêmeas (
4,24 ± 0,07 e 4,26 ± 0,07 na primeira fase da resposta e 30,17 ± 1,02 e 30,22 ± 0,57
minutos para machos e fêmas respectivamente). Os animais controle não apresentaram
resposta nociceptiva. Não houve, também, diferença das respostas de edema na pata,
considerando-se os dois gêneros estudados (0,02 ± 0,003, 0,91 ± 0,03 e 0,96 ± 0,03 para os
grupos controle, machos e fêmeas respectivamente. Os valores foram expressos como área
sob a curva, conforme pode ser observado na figura 4.
Para verificar uma possível contribuição hormonal na expressão da resposta
nociceptiva à formalina entre machos e fêmeas, três grupos de animais de cada gênero, com
idades similares foram estudados consecutivamente, em três semanas diferentes. Não houve
diferença dos valores de tempo de elevação de pata nas fases I e II entre machos e fêmeas,
(dados não apresentados).
45
A
Controle Machos Fêmeas
0
1
2
3
4
5
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
B
Controle Machos Fêmeas
0
20
40
60
Tempo de elevação da
pata (min)
2ª fase
Figura 3 – Comparação de resposta nociceptiva, comportamental (1ª e 2ª fases),
entre machos e fêmeas da linhagem Holtzman, após injeção de formalina 1,25%. Os
animais controles receberam injeções somente com SFE, sob as mesmas condições
experimentais. Tempo de observação: 1ª fase=5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. Cada barra
representa a média (± epm) do tempo de retirada da pata do apoio. Tempo expresso em
minutos. (n= 4/grupo).
46
Controle Machos Fêmeas
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema da pata (AUC)
Figura 4 – Comparação da resposta edematogênica entre machos e fêmeas da
linhagem Holtzman, após injeção de formalina 1,25%. Os animais do grupo controle
receberam injeções somente com SFE, sob as mesmas condições experimentais. Tempo de
observação de 0 a 4 horas. Cada barra representa a média (± epm) da área sob a curva
obtida com o edema. (n= 4/grupo).
47
4.3- Efeito dos tratamentos com capsaicina neonatal, do antagonista de receptor NK
1
(SR 140333) e NK
2
(SR 48968) nas respostas nociceptiva e edematogênica à formalina
em ratas
A administração subcutânea de capsaicina (25 mg/kg) em ratas neonatas provocou
redução significativa (p< 0,01) da resposta nociceptiva da primeira fase à formalina
(39,4%) em relação à animais naive ou controle injetados com o veículo (4,15 ± 0,25, 4,01
± 0,35 e 2,55 ± 0,27 médias ± epm, em minutos, obtidas para os grupos naive, controle e
capsaicinizados respectivamente), conforme apresentado no painel A da figura 5. No
entanto, os animais não apresentaram qualquer alteração em relação à resposta nociceptiva
de segunda fase (28,6 ± 1,75, 27,7 ± 1,06 e 27,2 ± 2,43 médias ± epm, em minutos, obtidas
para os grupos naive, controle e capsaicinizados respectivamente), conforme apresentado
no painel B da figura. Animais capsaicinizados também não apresentaram alteração com
relação à resposta edematogênica, quando comparados com animais controle ou naive
injetados com formalina (0,89 ± 0,04, 1,11 ± 0,05 e 1,12 ± 0,14, médias ± epm obtidos em
área sob a curva para a resposta edematogênica) conforme apresentado no painel A da
figura 6. Em adição, ratas capsaicinizadas neonatalmente apresentaram resposta
edematogênica à substância P, cuja relação dose-resposta (edematogênica) é mostrada no
painel B da figura 6 (0,64 ± 0,03, 0,61 ± 0,03 e 0,70 ± 0,08 médias ± epm, obtidos em área
sob a curva para a resposta edematogênica), e que foi abolida pelo pré-tratamento dos
animais com o antagonista de receptor NK
1
(SR 140333). A intensidade desse edema foi
similar ao apresentado por animais controle ou animais naive também injetados com a
mesma dose de SP, mas tratados com o veículo da capsaicina (painel C da figura 6).
48
Animais que receberam injeções intraplantares de neurocinina A apresentaram
resposta nociceptiva (comportamental), que foi observada nas maiores doses e em pequena
intensidade, porém significativamente maior que o controle (4,58 ± 0,9 e 3,61 ± 0,78
médias ± epm, em minutos, obtidas para os grupos que receberam injeção de neurocinina A
nas doses de 1600 e 3200 pmoles) conforme apresentado na figura 7. O grupo controle e o
grupo que recebeu injeção de neurocinina A na dose de 800 pmoles não apresentou resposta
nociceptiva. Em contrapartida, a injeção intraplantar de neurocinina A, na maior dose
utilizada (3200 pmoles), produziu resposta edematogênica. Esta resposta foi praticamente
abolida com o pré-tratamento dos animais com o antagonista específico de receptores NK
2
,
o composto SR 48968, (0,37 ± 0,03 e 0,07 ± 0,01 médias ± epm, expressos em minutos,
para o grupo que recebeu injeção de neurocinina A e o grupo pré-tratado com SR 48968
respectivamente), conforme demonstrado nos painéis A e B da figura 8.
Animais pré-tratados sistemicamente (via intramuscular) com o antagonista seletivo
de receptores NK
1
, o composto SR 140333, apresentaram redução significativa da primeira
fase da resposta nociceptiva à formalina ( 4,17 ± 0,29, 2,81 ± 0,23, 2,10 ± 0,27 e 2,11 ±
0,18 respectivamente), que corresponde a uma redução de 33, 50 e 50% em relação ao
grupo controle. Do mesmo modo, houve redução da segunda fase da resposta à formalina
(39,2 ± 1,18, 13,6 ± 3,10, 12,10 ± 4,76 e 12,8 ± 3,35 respectivamente, o que correponde a
uma redução de 65, 70 e 68% em relação ao grupo controle, conforme demonstrado na
figura 9. Esses animais também apresentaram redução da resposta edematogênica à
formalina (1,11 ± 0,03, 0,78 ± 0,02, 0,79 ± 0,02 e 0,63 ± 0,04 respectivamente), que
corresponde a uma redução de 30, 29 e 44% em relação ao grupo controle, conforme
apresentado na Figura 10. Em contraste, a administração intraplantar do antagonista reduziu
de maneira dose-dependente (10 a 200 μg/pata) o tempo de elevação de pata na primeira
49
fase da resposta nociceptiva à formalina (4,77 ± 0,06, 3,96 ± 0,06, 2,89 ± 0,21 e 2,61 ± 0,29
respectivamente), que corresponde a uma redução de 17, 40 e 46% em relação ao grupo
controle (painel A da figura 11). Entretanto, não houve alteração na segunda fase da
resposta nociceptiva à formalina (painel B, Figura 11). Esses animais também apresentaram
significativa redução do edema de pata nas doses testadas ( 1,11 ± 0,03, 0,78 ± 0,02, 0,79 ±
0,02 e 0,91 ± 0,03 respectivamente), que corresponde a uma redução de 30, 29 e 20% em
relação ao grupo controle. (Figura 12).
A injeção intraplantar do antagonista do receptor NK
1
(SR 140333) na pata
ipslateral reduziu sigificativamente a primeira fase da resposta nociceptiva à formalina
(4,57 ± 0,05 e 2,88 ± 0,05 respectivamente), que corresponde a uma redução de 37% em
relação ao grupo controle. Do mesmo modo houve redução na segunda fase da resposta
nociceptiva á formalina (34,5 ± 23,5 ± 1,68 respectivamente), que corresponde a uma
redução de 32% em relação ao grupo controle, conforme demonstrado nos paíneis A e B da
figura 13. Quando o SR 140333 foi injetado na pata contra-lateral não houve alteração na
resposta nociceptiva à formalina (painéis C e D da figura 13). Em adição, a injeção
intraplantar de SR 140333, na pata ipsilateral, reduziu o edema induzido pela injeção de
formalina, (0,93 ± 0,01 e 0,71 ± 0,03 respectivamente), que corresponde as uma redução de
24 % em relação ao grupo controle. Tal redução não ocorreu quando o composto foi
injetado na pata contra-lateral (painéis A e B da figura 14).
Animais pré-tratados sistemicamente (via intramuscular) com o antagonista seletivo
de receptores NK
2
, o composto SR 48968, não apresentaram redução na resposta
nociceptiva a formalina em ambas as fases (painéis A e B da figura 15). De modo similar,
este mesmo composto também não alterou a resposta edematogênica causada por injeção
intraplantar de formalina (figura 16).
50
A
Naive Controle
0
1
2
3
4
5
*
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
Capsaicinizados
B
Naive Controle Ca
p
saicina
0
20
40
60
Tempo de elevação de
pata (min)
2ª fase
Figura 5 – Efeito da capsaicina (25 mg/kg), administrada por via subcutânea
(neonatal), na resposta nociceptiva, produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25%
em ratas. O grupo naive não recebeu nenhum tratamento neonatal. O grupo controle,
recebeu injeção subcutânea, neonatal, do veículo (etanol 10%, Tween 85 10% e SFE 80%).
O grupo tratado recebeu injeção subcutânea da solução de capsaicina. * indica diferença
estatisticamente significativa em relação ao grupo controle. Tempo de observação: 1ª fase=
5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. Cada barra representa a média (± epm) do tempo de
retirada da pata do apoio. Tempo expresso em minutos. (n= 5, 5, e 7 respectivamente).
51
A
Naive Controle
0.0
0.5
1.0
1.5
Formalina
Capsaicinizados
Edema de pata (AUC)
B
Naive Controle
0.0
0.5
1.0
1.5
SP
Capsaicinizados
Edema de pata (AUC)
C
Controle SP 0,4 SP 4 SP 40 SP 4
0.0
0.5
1.0
1.5
*
*
SR 140333
#
Edema da pata (AUC)
Figura 6 – (A)= Resposta edematogênica induzida por injeção de formalina em
ratas que receberam injeção subcutânea, neonatal, da solução de capsaicina na dose de
25mg/kg. (n= 5, 5, e 7 respectivamente). (B)= Resposta edematogênica induzida por
injeção local de substância P (4,0 μg/pata) em ratas que receberam injeção subcutânea,
neonatal, da solução de capsaicina. (n= 4, 4 e 5 respectivamente). (C)= Resposta
edematogênica induzida por injeção de substância P em ratas, o grupo pré-tratado com SR
140333 (2,0 mg/kg, via i.m) recebeu injeção i.pl de substância P (4,0 μg/pata). (n= 4). Os
animais controle receberam o veículo da capsaicina (A e B) ou SFE (C). As doses de
substância P estão apresentadas em μg por sítio. Tempo de observação de 0 a 4 horas.
Cada barra representa a média (± epm) da área sob a curva obtida com o edema. * indica
diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle. # indica diferença
estatisticamente significativa em relação ao grupo que recebeu SP (4,0 μg/pata). (n= 4).
52
Controle 800 1600 3200
0
20
40
60
Neurocinina
A
*
*
Tempo de elevação da
pata (min)
Figura 7- Resposta nociceptiva, produzida por injeção intraplantar de neurocinina
A (doses expressas em picomoles) em ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções
com neurocinina A ou seu veículo (SFE 95% e etanol 5%), sob as mesmas condições
experimentais. A dose está apresentada em pmoles/pata. Tempo de observação: 0 a 60
minutos. Cada barra representa a média (± epm) do tempo de retirada da pata do apoio.
Tempo expresso em minutos. * indica diferença estatisticamente significativa em relação ao
grupo controle. (n= 5/grupo)
53
A
Controle 800 1600 3200
0.0
0.5
1.0
Neurocinina A
*
Edema de pata (AUC)
B
Neurocinina A Neurocinina A
0.0
0.5
1.0
*
SR 48968
Edema de pata (AUC)
Figura 8 – (A): Resposta edematogênica produzida por injeção intraplantar de
neurocinina A (3200pmoles/pata), na pata de ratas. (B): Efeito do pré-tratamento (30
minutos) com SR 48968 (2,0 mg/kg, via i.m), na resposta edematogênica produzida por
injeção de neurocinina A. Os grupos teste e controle receberam injeções com SR 48968 ou
seu veículo (SFE 95% e etanol 5%), sob as mesmas condições experimentais. Cada barra
representa a média (± epm) da área sob a curva obtida. Tempo de observação de 0 – 4
horas. * indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle. (n=
5/grupo).
54
A
Controle 2,0 4,0 8,0
0
1
2
3
4
5
SR 140333
*
*
*
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
B
Controle 2,0 4,0 8,0
0
20
40
60
SR140333
*
*
*
Tempo de elevação da
pata (min)
2ª fase
Figura 9 – Efeito do pré-tratamento (30 minutos) com SR 140333 (2, 4 e 8 mg/kg,
via i.m), na resposta nociceptiva induzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em
ratas. O grupo controle recebeu injeções do veículo (SFE 95% e etanol 5%), sob as mesmas
condições experimentais. Cada barra representa a média ± epm do tempo de retirada da
pata do apoio. Tempo expresso em minutos. * indica diferença estatisticamente
significativa em relação ao grupo controle. Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª
fase= 60 minutos. (n= 5, 5, 5 e 7 respectivamente).
55
Controle 2,0 4,0 8,0
0.0
0.5
1.0
1.5
*
*
*
SR 140333
Edema da pata (AUC)
Figura 10 – Efeito do pré-tratamento (30 minutos) com SR 140333 (2, 4 e 8 mg/kg,
via i.m), na resposta edematogênica induzida por injeção intraplantar de formalina 1,25%
em ratas. O grupo controle recebeu injeções do veículo (SFE 95% e etanol 5%), sob as
mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ± epm da área sob a curva
obtida. * indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle.
Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. (n= 5, 5, 5 e 7
respectivamente).
56
A
Controle 10 100 200
0
1
2
3
4
5
SR 140333
*
*
Tempo de elevação de
pata (min)
1ª fase
B
Controle 10 100 200
0
10
20
30
40
50
60
SR 140333
Tempo de elvação da
pata (min)
2ª fase
Figura 11 – Efeito do pré-tratamento (30 minutos) com SR 140333 (1, 10 e 100
µg/pata, via intraplantar), na resposta nociceptiva produzida por injeção de formalina
1,25% em ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções com SR 140333 ou seu
veículo (SFE 95% e etanol 5%), sob as mesmas condições experimentais. Cada barra
representa a média ± epm do tempo de retirada da pata do apoio. * indica diferença
estatisticamente significativa em relação ao grupo controle. Tempo de observação: 1ª fase=
5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. (n= 7, 6, 6 e 7 respectivamente).
57
Controle 10 100 200
0.0
0.5
1.0
1.5
*
*
*
SR 140333
Edema de pata (AUC)
Figura 12 – Efeito do pré-tratamento (30 minutos) com SR 140333 (10, 100 e 100
µg/pata, via intraplantar), na resposta edematogênica produzida por injeção de formalina
1,25% em ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções com SR 140333 ou seu
veículo (SFE 95% e etanol 5%), sob as mesmas condições experimentais. Cada barra
representa a média ± epm da área sob a curva obtida. * indica diferença estatisticamente
significativa em relação ao grupo controle. Tempo de observação: 0 a 4 horas. (n= 7, 6, 6 e
7 respectivamente).
58
A B
Controle Ipsilateral
0
1
2
3
4
5
*
SR 140333
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
Controle Ipsilateral
0
20
40
60
Temp de elevação de
pata (min)
2ª fase
*
SR 140333
C D
Controle Contra-lateral
0
1
2
3
4
5
SR 140333
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
Controle Contra-lateral
0
20
40
60
SR 140333
Temp de elevação da
pata (min)
2ª fase
Figura 13 – Comparação da resposta nociceptiva produzida por injeção intraplantar
de formalina 1,25% em animais pré-tratados com o antagonista de receptor NK
1
, SR
140333 na dose de 100 μg/pata. Em A e B os animais foram pré-tratados, via intraplantar,
na pata ipsilateral. Em C e D os animais foram pré-tratados, via intraplantar, na pata contra-
lateral. Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. (n= 4/grupo).
59
A
Controle Ipsilateral
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema de pata (AUC)
*
SR 140333
B
Controle Contra-lateral
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema de pata (AUC)
SR 140333
Figura 14 – Comparação da resposta edematogênica produzida por injeção
intraplantar de formalina 1,25% em animais pré-tratados com o antagonista de receptor
NK
1
, SR 140333, na dose de 100 μg/pata. Em A os animais foram pré-tratados por via
intraplantar, na pata ipsilateral. Em B, os animais foram pré-tratados, via intraplantar, na
pata contra-lateral. Tempo de observação de 0 – 4 horas.Os animais do grupo controle
foram pr´-tratados com SFE. (n= 4/grupo)
60
A
Controle SR 48968
0
1
2
3
4
5
Tempo de elvação da
pata (min)
1ª fase
B
Controle
SR 48968
0
20
40
60
Tempo de elevação de
pata (min)
2ª fase
Figura 15 - Efeito do pré-tratamento com SR 48968 (2 mg/kg, via i.m), na resposta
nociceptiva induzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em ratas. Os grupos teste
e controle receberam injeções com SR 48968 ou seu veículo (SFE 95% e etanol 5%), sob as
mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ± epm do tempo de
retirada da pata do apoio. Tempo de observação 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60 minutos.
(n= 4).
61
Formalina
SR 48968
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema de pata (AUC)
Figura 16 – Efeito do pré-tratamento (30 minutos) com SR 48968 (2 mg/kg, via
intraplantar, na pata ipsilateral), na resposta edematogênica produzida por injeção
intraplantar de formalina 1,25% em ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções
com SR 48968 ou seu veículo (SFE 95% e etanol 5%), sob as mesmas condições
experimentais. Cada barra representa a média ± epm da área sob a curva obtida. Tempo de
observação: 0 a 4 horas. (n= 4/grupo).
62
4.4- Efeito de antagonistas de histamina (pirilamina) e serotonina (pizotifeno) nas
respostas nociceptiva e edematogênica à formalina
A injeção intraplantar de histamina na dose de 100 μg/pata não produziu resposta
nociceptiva (dados não apresentados), entretanto,a mesma dose produziu edema ( 0,94 ±
0,01 versus 0,11 ± 0,01 do grupo controle). O edema foi abolido quando os animais foram
pré-tratados (30 minutos antes) com o antagonista de receptor H
1
, pirilamina, na dose de
2,0 mg/kg (figura 17). Em adição, a injeção intraplantar de pirilamina não produziu
resposta nociceptiva (dados não apresentados) ou edema (figura 17).
Animais tratados previamente (30 minutos antes) com diferentes doses de
pirilamina (2, 4 e 8 mg/kg) por via subcutânea apresentaram redução significativa da
primeira fase da resposta à formalina, 4,58 ± 0,06, 2,20 ±0,28, 2,46 ± 0,40 e 2,29 ± 0,32
respectivamente), que corresponde a uma redução de 52, 46 e 50% em relação ao grupo
controle. Em adição, também houve redução da segunda fase desta resposta ( 39,2 ± 1,18,
13,6 ± 3,1, 12,1 ± 4,76 e 12,8 ± 3,35 respectivamente), que correpondem a um redução de
65, 69 e 67% em relação ao grupo controle, conforme pode ser observado nos painéis A e B
da figura 18. Estes animais também apresentaram redução do edema de pata ( 0,99 ± 0,04,
0,57 ± 0,05, 0,63 ± 0,06 e 0,57 ± 0,05 (respectivamente), que correspondem a uma
redução de 42, 36 e 42%, em relação ao ghrupo controle.
Animais que foram pré-tratados com diferentes doses de pirilamina por via
intraplantar (10 a 200 μg/pata) também apresentaram redução, de modo dose-dependente,
da primeira fase da resposta nociceptiva à formalina (4,26 ± 0,40, 4,24 ± 0,08, 2,60 ±
0,22, 1,60 ± 0,31 e 1,77 ± 0,55 respectivamente), que correspodem a redução de 0,0, 39,
63
62 e 58% em relação ao grupo controle. Este grupos também apresentaram redução da
segunda fase da resposta nociceptiva à formalina (35,2 ± 0,55, 31,7 ± 1,54, 23,7 ± 1,27,
18,6 ± 2,20 e 19,4 ± 1,43 respectrivamente), que correspondem a redução de 11, 33, 47 e
45% em relação ao grupo controle, conforme observado nos painéis A e B, da figura 20. O
pré-tratamento dos animais com pirilamina, nestas doses, também reduziu o edema
resultante da injeção de formalina (1,01 ± 0,04, 0,77 ± 0,04, 0,70 ± 0,04, 0,70 ± 0,05, 0,63
± 0,06 e 0,57 ± 0,07 respectivamente), que correspondem a redução de 23, 31, 38 e 44% em
relação ao grupo controle, conforme apresentado na figura 21.
O pré-tratamento dos animais com pirilamina, na pata ipsilateral, na dose de 100
μg/pata, conforme já descrito, reduziu a primeira fase da resposta nociceptiva à formalina
(4,27 ± 0,30 e 1,86 ± 1,18 respectivamente), que corresponde a uma redução de 57% em
relação ao grupo controle. Do mesmo modo, houve redução na segunda fase da resposta (
35,2 ± 0,55 e 19,5 ± 1,80 respectivamente), que corresponde a redução de 44% em relação
ao grupo controle, porém quando os animais foram pré-tratados na pata contra-lateral, não
foi detectada redução na resposta nociceptiva, (painéis A, B, C e D, da figura 22). Quando a
pirilamina foi injetada na pata ipsilateral, houve redução na resposta edematogênica (1,10 ±
0,04 e 0,70 ± 0,04 respectivamente), o que corresponde a redução de 37 % em relação ao
grupo controle. Em adição, a resposta edematogênica não foi reduzida quando a pirilamina
foi injetada na pata contra-lateral nessa dose (painéis A e B da figura 23).
A injeção intraplantrar de serotonina na dose de 10 μg/pata não produziu resposta
nociceptiva (dados não apresentados), entretanto, nesta mesma dose os animais
apresentaram edema que foi abolido com o pré-tratamento (30 minutos antes) dos animais
com um antagonista de receptor 5-HT
2
, pizotifeno, na dose de 2,0 mg/kg (figura 24). Em
64
adição, a injeção intraplantar de serotonina não produziu resposta nociceptiva ou
edematogênica (dados não apresentados).
Animais injetados por via subcutânea com doses anti-edematogênicas de pizotifeno,
não apresentaram qualquer alteração nas fases I e II da resposta nociceptiva (painel A e B,
figura 25), bem como não apresentaram alteração na resposta edematogênica à formalina
(Figura 26).
65
Controle Histamina Piril + His
t
Piril
0.0
0.5
1.0
1.5
*
Edema de pata (AUC)
#
Figura 17 – Efeito do pré-tratamento (30 minutos) com pirilamina (2,0 mg/kg, via
s.c) na resposta edematogênica produzida por histamina (100μg/pata) em ratas. O animais
receberam injeções de histamina ou seu veículo (SFE) sob as mesmas condições
experimentais. Cada barra indica a média ± epm da área sob a curva obtida. Tempo de
observação de 0 a 4 horas. * estatisticamente significante em relação controle. #
estatisticamente significante em relação ao grupo tratado com histamina. (n= 4/grupo).
Pilil = pirilamina e His = histamina.
66
A
Controle 2,0 4,0 8,0
0
1
2
3
4
5
Pirilamina
*
*
*
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
B
Controle 2,0 4,0 8,0
0
20
40
60
*
*
*
Pirilamina
Tempo de elevação da
pata (min)
2ª fase
Figura 18 – Efeito do pré-tratamento (30 minutos) com pirilamina (2,0, 4,0 e 8,0
mg/kg, via s.c), na resposta nociceptiva produzida por injeção intraplantar de formalina
1,25% em ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções com pirilamina ou seu
veículo (SFE), sob as mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ±
emp do tempo de elevação da pata do seu apoio. * indica diferença estatisticamente
significativa em relação ao grupo controle. Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª
fase= 60 minutos. (n= 6/grupo).
67
Controle 2,0 4,0 8,0
0.0
0.5
1.0
1.5
*
*
*
Pirilamina
Edema de pata (AUC)
Figura 19 - Efeito do pré-tratamento (30 minutos) com pirilamina (2,0, 4,0 e 8,0
mg/kg, via s.c), na resposta edematogênica produzida por injeção intraplantar de formalina
1,25% em ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções com pirilamina ou seu
veículo (SFE), sob as mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ±
emp da área sob a curva obtida.. * indica diferença estatisticamente significativa em relação
ao grupo controle. Tempo de observação: 0 a 4 horas. (n= 6/grupo).
68
A
Controle 10 50 100 200
0
1
2
3
4
5
*
*
*
Pirilamina
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
B
Controle 10 50 100 200
0
10
20
30
40
50
60
*
*
*
Pirilamina
Tempo de elevação da
pata (min)
2ª fase
Figura 20 - Efeito do pré-tratamento (30 minutos) com pirilamina (10, 50, 100 e
200 µg/pata, via intraplantar, ipsilateral), na resposta nociceptiva produzida por injeção
intraplantar de formalina 1,25% em ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções
com pirilamina ou seu veículo (SFE), sob as mesmas condições experimentais. Cada barra
representa a média ± emp do tempo de elevação da pata do seu apoio. * indica diferença
estatisticamente significativa em relação ao grupo controle. Tempo de observação: 1ª fase=
5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. (n= 7, 6, 6, 6 e 6 respectivamente).
69
Controle 10 50 100 200
0.0
0.5
1.0
1.5
*
*
*
*
Edema de pata (AUC)
Pirilamina
Figura 21 - Efeito do pré-tratamento com pirilamina (10, 50, 100 e 200 µg/pata, via
intraplantar, ipsilateral), na resposta edematogênica produzida por injeção intraplantar de
formalina 1,25% em ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções com pirilamina ou
seu veículo (SFE), sob as mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média
± emp da área sob a curva obtida.. * indica diferença estatisticamente significativa em
relação ao grupo controle. Tempo de observação: 0 a 4 horas. (n= 7, 6, 6 e 6
respectivamente).
70
A B
Controle Ipsilateral
0
1
2
3
4
5
*
Pirilamina
Tempo de elevação de
pata (min)
1ª fase
Controle Ipsilateral
0
20
40
60
Temp de elevação de
pata (min)
2ª fase
*
Pirilamina
C D
Controle Contra-lateral
0
1
2
3
4
5
Pirilamina
Tempo de elevação de
pata (min)
1ª fase
Controle Contra-lateral
0
20
40
60
Temp de elevação de
pata (min)
2ª fase
Pirilamina
Figura 22 – Efeito do pré-tratamento com pirilamina (100 µg/pata, via intraplantar),
na resposta nociceptiva produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25%. Em A e B
os animais foram pré-tratados na pata ipsilateral. Em C e D os animais foram pré-tratados,
na pata contra-lateral.Cada barra representa a média ± epm do tempo de elevação da pata de
seu apoio. Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. (n= 4/grupo).
71
A
Controle Ipsilateral
0.0
0.5
1.0
1.5
*
Pirilamina
Edema de pata (AUC)
B
Controle Contra-lateral
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema de pata (AUC)
Pirilamina
Figura 23 – Efeito do pré-tratamento com pirilamina (100 µg/pata, via intraplantar),
na resposta edematogênica produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25%. Em A os
animais foram pré-tratados na pata ipsilateral. Em B os animais foram pré-tratados, na pata
contra-lateral.Cada barra representa a média ± epm da área sob a curva obtida. Tempo de
elevação da pata de seu apoio. Tempo de observação: 0 a 4 horas. (n= 4).
72
0.0
0.5
1.0
1.5
*
#
Veículo
Edema de pata (AUC)
Ser Pizot + Ser
Pizot
Figura 24 - Efeito da administração sistêmica de pizotifeno, via sub-cutênea, na
resposta edematogênica da serotonina injetada via intraplantar em ratas. Os animais
receberam injeções com SFE ou com 10 μg/pata de serotonina (volume final = 50μl). O
pizotifeno foi administrado por via subcutânea, na dose de 2mg/kg, 30 minutos antes da
administração de SFE ou serotonina. Cada barra representa a média ± epm da área sob a
curva obtida Tempo de observação de 0 a 4 horas. * estatisticamente significante em
relação ao controle. # estatisticamente significante em relação ao grupo pré-tratado com
serotonina. Pizot= pizotifeno. Ser= serotonina. (n= 4/grupo).
73
A
Controle 2,0 4,0 8,0
0
1
2
3
4
5
Tempo de elevação de
pata (min)
1ª fase
Pizotifeno
B
Controle 2,0 4,0 8,0
0
20
40
60
Pizotifeno
Tempo de elevação de
pata (min)
2ª fase
Figura 25 - Efeito do pré-tratamento com pizotifeno, (2, 4 e 8 mg/kg, via sub-
cutânea), na resposta nociceptiva produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em
ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções com pizotifeno ou seu veículo (SFE)
sob as mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ± emp do tempo de
elevação da pata do seu apoio. Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60
minutos. (n= 6, 4, 6 e 6 respectivamente).
74
Controle 2,0 4,0 8,0
0.0
0.5
1.0
1.5
Pizotifeno
Edema de pata (AUC)
Figura 26 - Efeito do pré-tratamento com pizotifeno (2, 4 e 8 mg/kg, via sub-
cutânea), na resposta edematogênica produzida por injeção intraplantar de de formalina
1,25% em ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções com pizotifeno ou seu
veículo (SFE) sob as mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ±
emp da área sob a curva obtida. Tempo de observação: 0 a 4 horas. (n= 6, 4, 6 e 6
respectivamente).
75
4.5- Efeito dos inibidores não seletivos de ciclooxigenases (piroxicam, dipirona e
paracetamol) nas respostas nociceptiva e edematogênica à formalina
A administração subcutânea de piroxicam, em doses analgésica e anti-inflamatória
de 3 e 20 mg/kg, (Francischi et al., 2002) não afetou a primeira fase da resposta
nociceptiva à formalina, embora tenha havido redução significativa na segunda fase da
resposta, apenas na dose de 3,0 mg/kg (47,6 ± 2,20 versus 34,0 ± 1,98) que corresponde a
uma redução de 28,5% em relação ao grupo controle, painéis A e B da figura 27. Com
relação ao edema, apenas a dose de 20 mg/kg reduziu significativamente o edema da pata,
(1,12 ± 0,10 versus 0,70 ± 0,04), que corresponde a uma redução de 37,5% em relação ao
grupo controle (figura 28).
A administração subcutânea de dipirona, em doses analgésica e anti-inflamatória
(60, 120 e 180 mg/kg), não afetou a primeira fase da resposta nociceptiva à formalina
(painel A, figura 29), e apenas na maior dose utilizada, afetou significativamente a segunda
fase da resposta nociceptiva à formalina (40,5 ± 2,8 versus 27,0 ± 3,3 ), que corresponde a
uma redução de 33% em relação ao grupo controle (painel B a figura 29). A dipirona
reduziu significativamente o edema de pata nas doses de 120 e 180 mg/kg (1,07 ± 0,06,
0,58 ± 0,05 e 0,82 ± 0,03 respectivamente), que correspondem a redução 46 e 23,4% em
relação ao grupo controle, conforme figura 30.
Em contraste, o paracetamol, com doses entre 12 a 360 mg/kg, não afetou nenhuma
das fases da resposta nociceptiva à formalina (painéis A e B, figura 31), como tampouco
afetou a resposta edematogênica à formalina (figura 32).
76
A
Controle 3 20
0
1
2
3
4
5
Piroxicam
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
B
Controle 3 20
0
20
40
60
*
Piroxicam
Tempo de elevação da
pata (min)
2ª fase
Figura 27 - Efeito do pré-tratamento com piroxicam (3 e 20 mg/kg, via oral), na
resposta nociceptiva produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em ratas. Os
grupos teste e controle receberam injeções com piroxicam ou seu veículo (SFE), sob as
mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ± emp do tempo de
elevação da pata do seu apoio. * indica diferença estatisticamente significativa em relação
ao grupo controle. Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. (n=
6/grupo).
77
Controle 3 20
0.0
0.5
1.0
1.5
*
Edema de pata (AUC)
Piroxicam
Figura 28 - Efeito do pré-tratamento com piroxicam (3 e 20 mg/kg, via oral), na
resposta edematogênica produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em ratas. Os
grupos teste e controle receberam injeções com piroxicam ou seu veículo (SFE), sob as
mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ± emp da área sob a curva
obtida. Tempo de observação: 0 a 4 horas. (n= 6/grupo).
78
A
Controle 60 120 180
0
1
2
3
4
5
Dipirona
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
B
Controle 60 120 180
0
20
40
60
*
Dipirona
Tempo de elevação da
pata (min)
2ª fase
Figura 29 - Efeito do pré-tratamento com dipirona (60, 120 e 180 mg/kg, via oral),
na resposta nociceptiva produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas. Os grupos teste
e controle receberam injeções com dipirona ou seu veículo (SFE), sob as mesmas condições
experimentais. Cada barra representa a média ± emp do tempo de elevação da pata do seu
apoio. * indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle.
Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. (n= 6/grupo).
79
Controle 60 120 180
0.0
0.5
1.0
1.5
*
*
Dipirona
Edema de pata (AUC)
Figura 30 - Efeito do pré-tratamento com dipirona (60, 120 e 180 mg/kg, via oral),
na resposta edematogênica produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas. Os grupos
teste e controle receberam injeções com dipirona ou seu veículo (SFE), sob as mesmas
condições experimentais. Cada barra representa a média ± emp da área sob a curva obtida.
Tempo de observação: 0 a 4 horas. * indica diferença estatisticamente significativa em
relação ao grupo controle. (n= 6/grupo).
80
A
c 12 120 360
0
1
2
3
4
5
Paracetamol
Tempo de elevação de
pata (min)
1ª fase
B
c 12 120 360
0
20
40
60
Paracetamol
Tempo de elevação de
pata(min)
2ª fase
Figura 31 - Efeito do pré-tratamento com paracetamol (12, 120 e 360 mg/kg, via
oral), na resposta nociceptiva produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas. Os
grupos teste e controle receberam injeções com paracetamol ou seu veículo (SFE), sob as
mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ± emp do tempo de
elevação da pata do seu apoio. Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60
minutos. (n= 6/grupo).
81
Controle 12 120 360
0.0
0.5
1.0
1.5
Paracetamol
Edema de pata (AUC)
Figura 32 - Efeito do pré-tratamento com paracetamol (12, 120 e 360 mg/kg, via
oral), na resposta edematogênica produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas. Os
grupos teste e controle receberam injeções com paracetamol ou seu veículo (SFE), sob as
mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ± emp da área sob a curva
obtida. Tempo de observação: 0 a 4 horas. (n= 6/grupo).
82
4.6- Efeito de inibidores seletivos de ciclooxigenases tipo 1 e 2 nas respostas
nociceptiva e edematogênica à formalina injetada na pata de ratos
O composto experimental SC 560, um inibidor seletivo de ciclooxigenase do tipo 1,
COX-1, (Smith et al., 1998), administrado por via subcutânea, em doses de 1, 5 e 10 mg/kg
em ratos, não alterou a resposta nociceptiva de fase I (painel A, figura 33), embora tenha
afetado significativamente (nas doses de 5 e 10 mg/kg), a segunda fase da resposta
nociceptiva à formalina ( 37,1 ± 1,05, 26,8 ± 1,23 e 28,9 ± 3,88 respectivamente), que
corresponde a uma redução de de 27,2 e 22% emrelação ao grupo controle, conforme
apresentado no painel B da figura 33. Além disso, o SC 560 também afetou
significativamente, nas doses de 5 e 10 mg/kg, a resposta edematogênica à formalina (0,93
± 0,06, 0,53 ± 0,02 e 0,61 ± 0,03 respectivamente), que corresponde a uma redução de 43 e
34% em relação ao grupo controle, (figura 34).
O pré-tratamento dos animais com SC 560 na pata ipsilateral (100 μg/pata, via
intraplantar), reduziu significativamente somente a segunda fase resposta nociceptiva à
formalina ( 39,8 ± ,063 versus 26,0 ± 1,28), que corresponde a uma redução de 34,5% em
relação ao grupo controle. Entretanto, quando os animais foram pré-tratados na pata contra-
lateral, não foi observada redução na resposta nociceptiva, (painéis A, B, C e D da figura
35). A resposta edematogênica também foi reduzida com a injeção na pata ipsilateral (1,02
± 0,05 versus 0,71 ±0,04), que corresponde a uma redução de 30,4% em relação ao grupo
controle. Porém, o edema não foi reduzido quando o SC 560 foi injetado na pata contra-
lateral (figura 36).
O inibidor seletivo de COX-2, o celecoxibe (3, 6 e 12 mg/kg) administrado via oral,
não afetou a primeira fase resposta nociceptiva dos animais à formalina (painel A, figura
83
37), embora tenha diminuído significativamente a segunda fase desta resposta nociceptiva
nas doses de 6 e 12 mg/kg (37,2 ± 1,3, 27,0 ± 1,32 e 28,3 ± 1,69, resectivamente que
corresponde a uma redução de 27 e 24% em relação ao grupo controle, conforme painel B
da figura 37. O celecoxibe não interferiu na resposta edematogênica à formalina (figura
38).
Animais tratados com o inibidor seletivo de COX-2, o rofecoxibe (0,7; 1,4 e 2,8
mg/kg), administrado nas mesmas condições que o celecoxibe, não apresentaram alteração
na prtimeira fase da resposta nociceptiva, mas apresentaram diminuição significativa da
segunda fase da resposta nociceptiva nas doses de 1,4 e 2,8 mg/kg ( 44,4 ± 2,33, 27,8 ±
36,26 e 28,2 ± 2,78 respectivamente), que corresponde a uma redução de 37,6 e 36,5% em
relação ao grupo controle, conforme apresentado nos painéis A e B da figura 39. No
entanto, ocorreu redução significativa do edema (44%), somente no grupo pré-tratado com
a maior dose de rofecoxibe (0,99 ± 0,04 versus 0,52 ± 0,02) que corresponde a uma redução
de 44,0% em relação ao grupo controle, (figura 40).
Animais tratados por via subcutânea com o composto experimental, também
inibidor de COX-2, o SC 236, não apresentaram alteração na primeira fase da resposta
nociceptiva à formalina, embora tenha reduzido significativamente a segunda fase desta
resposta nas maiores doses utilizadsa, ou seja, 12,0 e 24,0 mg/kg (37,0 ± 1,0, 23,2 ± 1,57 e
22,8 ± 3,34 respectivamente), que correspondem a uma redução de 37,3 e 38,4 % em
relação ao grupo controle, conforme painéis A e B da figura 41. O pré-tratamento com o
composto SC 236 reduziu significativamente a resposta edematogênica produzida por
formalina, nas doses de 12 e 24 mg/kg, respectivamente (0,98 ± 0,04, 0,67 ± 0,05 e 0,63 ±
0,05 repectivamente), que corresponde a uma redução de 35 e 36% em relação ao grupo
controle,, conforme apresentado na figura 42.
84
A injeção intraplantar, na pata ipsilateral, do composto SC 236 não afetou a
primeira fase da resposta nociceptiva à formalina em nenhuma das 3 doses utilizadas (10,
100 e 200 μg/pata), conforme apresentado na figura 43. Entretanto, a fase segunda fase
desta resposta foi afetada com o pré-tratamento local com SC 236 (11,6%) apenas com a
dose de 100 μg/pata conforme apresentado na mesma figura. A resposta edematogênica não
foi reduzida significativamente em nenhuma das doses utilizadas (figura 44). Quando o pré-
tratamento com o composto SC 236 (100 μg/pata, via intraplantar) foi administrado
realizado na pata contra-lateral, não houve modificação da respostas nociceptiva e
edematogênica (painéis A, B, C e D da figura 45 e painéis A e B da figura 46).
85
A
Controle 1 5 10
0
1
2
3
4
5
SC 560
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
B
Controle 1 5 10
0
20
40
60
*
*
SC 560
Tempo de levação da
pata (min)
2ª fase
Figura 33 – Efeito do pré-tratamento com SC 560 (1, 5 e 10 mg/kg, via sub-
cutânea) na resposta nociceptiva produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas. Os
grupos teste e controle receberam injeções com SC 560 ou seu veículo (Tween 85 2%,
etanol 8% e SFE 90%), sob as mesmas condições experimentais. Cada barra representa a
média ± emp do tempo de elevação da pata do seu apoio. Tempo de observação: 1ª fase= 5
minutos. 2ª fase= 60 minutos. * indica diferença estatisticamente significativa em relação
ao grupo controle. (n=5/grupo).
86
Controle 1 5 10
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema de pata (AUC)
*
*
SC 560
Figura 34 - Efeito do pré-tratamento com SC 560 (1, 5 e 10 mg/kg, via sub-
cutânea) na resposta edematogênica produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas. Os
grupos teste e controle receberam injeções com SC 560 ou seu veículo (Tween 85 2%,
etanol 8% e SFE 90%), sob as mesmas condições experimentais. Cada barra representa a
média ± emp da área sob a curva obtida. Tempo de observação: 0 a 4 horas. * indica
diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle. (n=5/grupo).
87
A B
Controle Ipsilateral
0
1
2
3
4
5
SC 560
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
Controle Ipsilateral
0
20
40
60
*
SC 560
Temp de elevação da
pata (min)
2ª fase
C D
Controle Contra-lateral
0
1
2
3
4
5
SC 560
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
Controle Contra-lateral
0
20
40
60
SC 560
Temp de elevação da
pata (min)
2ª fase
Figura 35 – Comparação da resposta nociceptiva à formalina 1,25% em animais
pré-tratados com SC 560 (100 μg/pata, via intraplantar). Em A e B os animais foram pré-
tratados, na pata ipsilateral, nas mesmas condições experimentais. Em C e D os animais
foram pré-tratados na pata contra-lateral. Os grupos teste e controle receberam injeções
com SC 560 ou seu veículo (tween 85 2%, etanol 8% e SFE 90%), sob as mesmas
condições experimentais. Cada barra representa a média ± emp do tempo de elevação da
pata do seu apoio. Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. * indica
diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle. (n= 4/grupo).
88
A
Controle Ipsilateral
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema de pata (AUC)
*
SC 560
B
Controle Contra-lateral
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema de pata (AUC)
SC 560
Figura 36 – Comparação da resposta edematoênicaa produzida por injeção
intraplantar de formalina 1,25% em animais pré-tratados com SC 560 (100 μg/pata, via
intraplantar). Em A e B os animais foram pré-tratados, na pata ipsilateral, nas mesmas
condições experimentais. Em C e D os animais foram pré-tratados na pata contra-lateral. Os
grupos teste e controle receberam injeções com SC 560 ou seu veículo (Tween 85 2%,
etanol 8% e SFE 90%), sob as mesmas condições experimentais. Cada barra representa a
média ± emp do tempo de elevação da pata do seu apoio. Tempo de observação: 1ª fase= 5
minutos. 2ª fase= 60 minutos. * indica diferença estatisticamente significativa em relação
ao grupo controle. (n= 4/grupo).
89
A
Controle 3 6 12
0
1
2
3
4
5
Celecoxibe
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
B
Controle 3 6 12
0
20
40
60
*
*
Celecoxibe
Tempo de elevação da
pata (min)
2ª fase
Figura 37 - Efeito do pré-tratamento com celecoxibe (3, 6 e 12 mg/kg, via oral), na
resposta nociceptiva produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em ratas. Os
grupos teste e controle receberam injeções com celecoxibe ou seu veículo (SFE), sob as
mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ± emp do tempo de
elevação da pata do seu apoio. Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60
minutos. * indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle.
(n=6/grupo).
90
Controle 3 6 12
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema de pata (AUC)
Celecoxibe
Figura 38 - Efeito do pré-tratamento com celecoxibe (3, 6 e 12 mg/kg, via oral), na
resposta edematogênica produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em ratas. Os
grupos teste e controle receberam injeções com celecoxibe ou seu veículo (SFE), sob as
mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ± emp da área sob a curva
obtida. Tempo de observação: 0 a 4 horas.
(n=6/grupo).
91
A
C 0,7 1,4 2,8
0
1
2
3
4
5
Rofecoxibe
Tempo de elvação da
pata (min)
1ª fase
B
Controle 0,7 1,4 2,8
0
20
40
60
**
Rofecoxibe
Tempo de elevação da
pata (min)
2ª fase
Figura 39 – Efeito do pré-tratamento com rofecoxibe (0,7, 1,4 e 2,8 mg/kg, via
oral), na resposta nociceptiva produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em
ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções com rofecoxibe ou seu veículo (SFE),
sob as mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ± emp do tempo de
elevação da pata do seu apoio. Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60
minutos. * indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle.
(n=6/grupo).
92
Controle 0,7 1,4 2,8
0.0
0.5
1.0
1.5
Rofecoxibe
*
Edema de pata (AUC)
Figura 40 - Efeito do pré-tratamento com rofecoxibe (0,7, 1,4 e 2,8 mg/kg, via oral), na
resposta edematogênica produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em ratas. Os
grupos teste e controle receberam injeções com rofecoxibe ou seu veículo (SFE), sob as
mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ± emp da área sob a curva
obtida. * indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle.
Tempo de observação: 0 a 4 horas.
(n=6/grupo).
93
A
Controle 6 12 24
0
1
2
3
4
5
SC 236
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
B
Controle 6 12 24
0
20
40
60
*
*
SC 236
Tempo de elevação da
pata (min)
2ª fase
Figura 41 - Efeito do pré-tratamento com SC 236 (6, 12 e 24 mg/kg, via sub-
cutânea), na resposta nociceptiva produzida por injeção intraplantar de formalina
1,25% em ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções com SC 236 ou seu
veículo (tween 85 2%, etanol 8% e SFE 90%), sob as mesmas condições
experimentais. Cada barra representa a média ± emp do tempo de elevação da pata
do seu apoio. Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. *
indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle.
(n=5/grupo).
94
Controle 6 12 24
0.0
0.5
1.0
1.5
SC 236
*
*
Edema de pata (AUC)
Figura 42 - Efeito do pré-tratamento com SC 236 (6, 12 e 24 mg/kg, via sub-
cutânea), na resposta edematogênica produzida por injeção de formalina 1,25% em ratas.
Os grupos teste e controle receberam injeções com SC 236 ou seu veículo (tween 85 2%,
etanol 8% e SFE 90%), sob as mesmas condições experimentais. Cada barra representa a
média ± emp da área sob a curva obtida. Tempo de observação: 0 a 4 horas. * indica
diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle. (n=5/grupo).
95
A
Controle 10 100 200
0
1
2
3
4
5
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
SC 236
B
Controle 10 100 200
0
10
20
30
40
50
60
*
Tempo de elevação da
pata (min)
2ª fase
SC 236
Figura 43 - Efeito do pré-tratamento com SC 236 (10, 100 e 200 μg/pata, via
intraplantar, ipsilateral), na resposta nociceptiva produzida por injeção intraplantar de
formalina 1,25% em ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções com SC 236 ou
seu veículo (Tween 85 2%, etanol 8% e SFE 90%), sob as mesmas condições
experimentais. Cada barra representa a média ± emp do tempo de elevação da pata do seu
apoio. * indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle.
Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. (n= 4/grupo).
96
Controle 10 100 200
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema de pata (AUC)
SC 236
Figura 44 - Efeito do pré-tratamento com SC 236 (10, 100 e 200 μg/pata, via
intraplantar, ipsilateral), na resposta edematogênica produzida por injeção intraplantar de
formalina 1,25% em ratas. Os grupos teste e controle receberam injeções com SC 236 ou
seu veículo (Tween 85 2%, etanol 8% e SFE 90%), sob as mesmas condições
experimentais. Cada barra representa a média ± emp da área sob a curva obtida. * indica
diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle. Tempo de
observação: 0 a 4 horas. (n= 4/grupo).
97
A B
Controle Ipsilateral
0
1
2
3
4
5
SC 236
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
Controle Ipsilateral
0
20
40
60
*
SC 236
Temp de elevação da
pata (min)
2ª fase
C D
Controle Contra-lateral
0
1
2
3
4
5
SC 236
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
Controle Contra-lateral
0
20
40
60
SC 236
Temp de elevação da
pata (min)
2ª fase
Figura 45 – Comparação da resposta nociceptiva produzida por injeção intraplantar
de formalina 1,25% em animais pré-tratados com SC 236 (100 μg/pata, via intraplantar).
Em A e B os animais foram pré-tratados, na pata ipsilateral, nas mesmas condições
experimentais. Em C e D os animais foram pré-tratados na pata contra-lateral. Os grupos
teste e controle receberam injeções com SC 236 ou seu veículo (tween 85 2%, etanol 8% e
SFE 90%), sob as mesmas condições experimentais. Cada barra representa a média ± emp
do tempo de elevação da pata do seu apoio. Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª
fase= 60 minutos. * indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo
controle. (n= 4/grupo).
98
A
Controle Ipsilateral
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema de pata (AUC)
*
SC 236
B
Controle Contra-lateral
0.0
0.5
1.0
1.5
Edema de pata (AUC)
SC 236
Figura 46 – Comparação da respostaedematogênica produzida por injeção
intraplantar de formalina 1,25% em animais pré-tratados com SC 236 (100 μg/pata, via
intraplantar). Em A e B os animais foram pré-tratados, na pata ipsilateral, nas mesmas
condições experimentais. Em C e D os animais foram pré-tratados na pata contra-lateral. Os
grupos teste e controle receberam injeções com SC 236 ou seu veículo (tween 85 2%,
etanol 8% e SFE 90%), sob as mesmas condições experimentais. Cada barra representa a
média ± emp do tempo de elevação da pata do seu apoio. Tempo de observação: 1ª fase= 5
minutos. 2ª fase= 60 minutos. * indica diferença estatisticamente significativa em relação
ao grupo controle. (n= 4/grupo).
99
4.7. Efeito da associação de pré-tratamento neonatal com capsaicina ou de antagonista
de receptores NK
1
com antagonista de receptores H
1
nas respostas nociceptiva e
edematogênica à formalina injetada na pata de ratos
A injeção intraplantar de pirilamina na dose de 100μg/pata, em animais que foram
pré-tratados com capsaicina no período neonatal (2 a 3 dias) reduziu significativamente a
primeira fase da resposta nociceptiva à formalina, (4,79 ± 0,06, 4,69 ±0,09 e 1,49 ± 0,19
para os grupos naive, controle e capsaicinizados respectivamente) que corresponde a uma
redução de 69,0% em relação ao grupo controle. Em adição, também houve redução
significativa da segunda fase desta resposta, (40,3 ± 1,42, 38,7 ± 1,29 e 24,0 ± 0,96 para os
grupos naive, controle e capsaicinizados respectivamente) que corresponde a uma redução
de 41,5% em relação ao grupo controle, conforme demonstram os painéis A e B da figura
47. A resposta edematogênica também foi reduzida significativamente(1,01 ± 0,05, 1,00 ±
0,20 e 0,57 ± 0,20 para os grupos naive, controle e capsaicinizados respectivamente) que
corresponde a uma redução de 43,0% em relação ao grupo controle, conforme apresentado
na figura 48.
A injeção intraplantar de pirilamina na dose de 100μg/pata, em animais que foram
pré-tratados por via intra-muscular com o antagonista específico de receptor NK
1
(SR
1403330, 2,0 mg/kg), reduziu significativamente a resposta nociceptiva produzida por
injeção intraplantar de formalina, em ambas as fases. Na primeira fase (4,74 ± 0,01 versus
1,88 ± 0,17) que corresponde a uma redução de 61,0% em relação ao grupo controle.
Também houve redução significativa na segunda fase desta resposta(40,7 ± 1,12 versus
19,0 ± 0,59) que corresponde a uma redução de 55,0% em relação ao grupo controle,
100
conforme apresentado nos painéis A e B da figura 49. A resposta edematogênica também
foi reduzida significativamente (1,02 ± 0,03 versus 0,48 ± 0,03), que corresponde a uma
redução de 53,40% em relação ao grupo controle, conforme a figura 50.
Estas associações de tratamento reduziram de forma significativa a 1ª fase da
resposta nociceptiva e de edema, quando comparados aos resultados obtidos pelo
tratamento neonatal com capsaicina ou pré-tratamento com antagonista específico de
receptor NK
1
(SR 1403330, 2,0 mg/kg). Quando comparada ao pré-tratamento com
pirilamina, a associação reduziu a primeira fase da resposta nociceptiva e o edema (não
significativo).
101
A
Naíve Controle
0
1
2
3
4
5
*
Capsaicinizados
Tempo de elevação da
pata (min)
1ª fase
Pirilamina
B
Naíve Controle
0
20
40
60
*
Tempo de elevação da
pata (min)
2ª fase
Capsaicinizados
Pirilamina
Figura 47 – Efeito do pré-tratamento com pirilamina (100 μg/pata, via intraplantar,
ipsilateral) em animais pré-tratados com capsaicina (25 mg/kg - neonatal) na resposta
nociceptiva produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em ratas. O grupo naíve
não foi pré-tratado com capsaicina.O grupo contrtole recebeu o veículo da capsaicina
(neonatal) e o veículo da pirilamina (SFE) 30 minutos antes do teste. O grupo
capsaicinizados recebeu capsaicina (neonatal) e pirilamina 30 minutos antes do teste, sob as
mesmas condições experimentais. As barras indicam a média ± epm do tempo de elevação
da pata de seu apoio. * indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo
controle. Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. (n= 4/grupo).
102
Naive Controle
0.0
0.5
1.0
1.5
*
Edema de pata (AUC)
Capsaicinizados
Pirilamina
Figura 48 - Efeito do pré-tratamento com pirilamina (100 μg/pata, via intraplantar,
ipsilateral) em animais pré-tratados com capsaicina (25 mg/kg - neonatal) na resposta
edematogênica produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em ratas. O grupos
naíve não foi pré-tratado com capsaicina.O grupo contrtole recebeu o veículo da capsaicina
(neonatal) e o veículo da pirilamina (SFE) 30 minutos antes do teste. O grupo
capsaicinizados recebeu capsaicina (neonatal) e pirilamina 30 minutos antes do teste, sob as
mesmas condições experimentais.As barras indicam a média ± epm da área sob a curva
obtida. * indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle.
Tempo de observação: 0 a 4 horas (n= 4/grupo).
103
A
Controle
0
1
2
3
4
5
*
pirilamina + SR140333
Tempo de elevação de
pata (min)
1ª fase
B
Controle
0
20
40
60
*
Pirilamina + SR140333
Tempo de elevação da
pata (min)
2ª fase
Figura 49 - Efeito do pré-tratamento com pirilamina, (100μg/pata, via intraplantar,
ipsilateral), co-administrada com o antagonista de receptor NK
1
(SR 140333, 2,0 mg/kg –
via i.m.) na resposta nociceptiva produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em
ratas. O grupo controle recebeu injeção com os veículos da pirilamina (SFE, intraplantar) e
do SR 140333 (SFE (95%) e etanol (5%), via i.m), sob as mesmas condições
experimentais. As barras indicam a média ± epm do tempo de elevação da pata de seu
apoio. * indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle.
Tempo de observação: 1ª fase= 5 minutos. 2ª fase= 60 minutos. (n= 4/ghrupo).
104
Controle
0.0
0.5
1.0
1.5
*
Edema de pata (AUC)
pirilamina + SR140333
Figura 50 - Efeito do pré-tratamento com pirilamina, (100μg/pata, via intraplantar,
ipsilateral), co-administrada com o antagonista de receptor NK
1
(2,0 mg/kg, via i.m.) na
resposta edematogênica produzida por injeção intraplantar de formalina 1,25% em ratas. O
grupo controle recebeu injeção com os veículos da pirilamina (SFE, intraplantar) e do SR
140333 (SFE (95%) e etanol (5%), via i.m), sob as mesmas condições experimentais. As
barras indicam a média ± epm da área sob a curva obtida. * indica diferença
estatisticamente significativa em relação ao grupo controle. Tempo de observação: 0 a 4
horas. (n= 4/grupo).
105
4.8- Estudo histopatológico das patas de ratas injetadas com formalina
Nas patas injetadas com salina fisiológica estéril (controle) não foi observado
edema, alterações nos vasos sanguíneos ou infiltrado leucocitário, nos tempos observados.
Conforme observado nas tabelas 1 e 2, o estudo histopatológico confirmou os dados
dos ensaios desenvolvidos no presente trabalho, já que mostraram intensa resposta
inflamatória induzida pela formalina, com formação de edema já na primeira hora de
observação. Além disso, ocorre a presença de infiltrado inflamatório, constituído
principalmente de leucócitos mononucleares, especialmente linfócitos. A formação de
edema, presença de infiltrado inflamatório, mastócitos degranulando e presença de
alterações tissulares foram observadas com mais intensidade na maior dose de formalina.
106
Tabela 1- Estudo histopatológico da resposta à formalina 1,25 % injetada na pata de ratas.
Tempo (h) Edema Infiltrado
inflamatório
Mastócitos
degranulando
Dano tissular
1 + + + +
2 + + + + + + +
3 + + + + + + + +
4 + + + + + + + + + + +
+ = resposta mínima, + + + + = resposta máxima observada.
Tabela 2- Estudo histopatológico da resposta à formalina 2,5 % injetada na para de ratas.
Tempo (h) Edema Infiltrado
inflamatório
Mastócitos
degranulando
Dano tissular
1 + + + +
2 + + + + + + + +
3 + + + + + + + + + +
4 + + + + + + + + + + + + +
+ = resposta mínima observada, + + + + = resposta máxima observada.
107
5.0- DISCUSSÃO
Nas diferentes espécies animais, a distribuição corporal de fibras nervosas sensoriais
é extensa e pode-se esperar, portanto, que elas contribuam em algum nível para o
desenvolvimento das respostas inflamatórias em geral. Em particular, a injeção de
formalina em animais de experimentação tem sido descrita como um dos exemplos de
metodologia para a indução da inflamação, denominada “neurogênica” (Maggi, 1996). A
grande vantagem da utilização do modelo da formalina, é que o método além de induzir as
respostas inflamatórias e de dor em animais de experimentação, apresentam maior controle
que nos seres humanos e a observação do comportamento de dor dos animais é possível
sem a interferência direta do observador (Dubuisson e Dennis, 1977).
Entretanto, o indicador de desenvolvimento da resposta nociceptiva no modelo da
formalina pode variar dependendo do observador, segundo dados da literatura. Entre tais
indicadores destacam-se: o comportamento de balançar e/ou lamber a pata injetada, além da
própria ocorrência comportamental de elevar a pata de seu ponto de apoio ou ainda o tempo
de início ou de duração de um ou mais destes indicadores (Dubuisson e Dennis, 1977;
Tjolsen et al., 1992; Coderre et al., 1993). No presente trabalho, escolhemos o tempo de
duração da elevação da pata dos animais em resposta à formalina, tanto na fase I como na
fase II. Esta elevação da pata de seu apoio nos pareceu a resposta mais freqüente
apresentada pelos animais de experimentação. Além disso, a medida concomitante do
desenvolvimento de edema na pata dos animais em observação nos permitiria avaliar a
influência da resposta inflamatória na resposta nociceptiva à formalina apresentada pelos
animais. Em nosso levantamento bibliográfico sobre o estudo das respostas induzidas pela
108
formalina, em geral, ou se estuda as respostas nociceptivas ou a resposta edematogênica,
respectivamente.
Primeiramente, para estabelecer a linhagem de animais a ser utilizada no
desenvolvimento do trabalho, estudamos as curvas dose-resposta (nocicepção e edema)
frente às diferentes concentrações de formalina. Como observado, a linhagem Holtzman,
mostrou a mesma sensibilidade nociceptiva e desenvolvimento de edema que a linhagem
Wistar, uma linhagem muito utilizada neste tipo de estudo (Abbott et al., 1995; Watkins et
al., 1997; Aguirre-Bañuelos e Granados-Soto, 1999; Damas e Liégeois, 1999; Baulmann et
al., 2000; Parada et al., 2001; Sandrini et al., 2002; Todd, et al., 2002; Torres-Lopes et al.,
2002; Ashmawi et al., 2003).
Existem, na literatura, vários trabalhos que sugerem que os hormônios gonodais
podem interferir nas respostas comportamentais. Estes trabalhos usaram animais da
linhagem Sprague-Dawley, que foram ganodatectomizados (Gaumond et al., 2005, Kuba et
al., 2005) ou receberam injeções de testosterona (Aloisi et al., 2004; Kuba et al; 2006). Ao
contrário, em nossos experimentos, os animais não receberam qualquer tratamento em
relação aos hormônios gonodais. Ratas demonstram diferenças na nocicepção durante o
ciclo estro (Gaumond et al., 2005, Wiesenfeld-Hallin, 2005). Entretanto em nosso estudo,
utilizamos animais de ambos os sexos, da mesma idade, em experimentos em fases
hormonais diferentes no caso das fêmeas, e não encontramos diferenças nas respostas à
formalina. Não determinamos em qual fase do estro as fêmeas intactas se apresentavam,
pois Kim et al., 1999, Vincler et al., 2001 demonstraram não haver diferenças na resposta
nociceptiva à formalina. Nossos resultados mostram que a sensibilidade das fêmeas da
linhagem Holtzman se mostrou similar à dos machos desta mesma linhagem, em nossas
109
condições experimentais, sugerindo que a variabilidade hormonal apresentada pelas fêmeas
não interfere neste modelo experimental.
Portanto, devido a maior disponibilidade de Holtzman em nosso biotério,
decidimos por desenvolver nosso trabalho utilizando fêmeas desta linhagem de ratos, com a
vantagem adicional de serem animais de menor custo.
Como resultante da inflamação neurogênica, as respostas de dor e inflamação à
formalina podem derivar da liberação e atuação de substâncias químicas presentes nas
terminações nervosas sensitivas e liberadas destas terminações localizadas no sítio de
administração. Entre tais substâncias destacam-se os neuropeptídeos, em particular a
substância P, as neurocininas A e B, o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP)
e a somatostatina (Dray, 1992; Omar e Salam, 2002; Massaad et al., 2004).
Uma das maneiras de se estudar a participação de tais substâncias nas respostas de
dor e edema à formalina, é utilizar compostos que promovem a liberação parcial ou total
destes mediadores das terminações nervosas, ou utilizar antagonistas específicos de seus
receptores.
A capsaicina, um alcalóide purificado de pimentas vermelhas, responsável por seu
efeito pungente (Jancso et al, 1967; Laird et al., 2001), é considerada um depletador de
neuropeptídeos presentes em terminações nervosas sensitivas, particularmente de SP
(Jessell et al., 1978; Holtzer, 1991; Dray, 1992; Ohtori et al., 2000).
Vários protocolos experimentais para o uso de capsaicina estão descritos na
literatura. Alguns protocolos utilizam animais adultos (Jancsó et al., 1967; Jessell et al.,
1978; Chen e Chen, 2000; Ohtori et al., 2000) e outros utilizam animais recém-nascidos
(Nagy e Kooy, 1983; Nagy et al., 1983, Sivam e Krause, 1992; Amann et al., 1995). Em
nosso estudo, optamos por fazer a injeção de capsaicina em animais recém-nascidos (2 a 3
110
dias) com dose única de 50 mg/kg (Sivam e Krause, 1992; Amann et al., 1995). Entretanto,
foi necessário fazer uma adequação na dose de capsaicina administrada neonatalmente, para
evitar que os animais viessem a óbito e prejudicassem nosso estudo. Assim, reduzimos para
a metade a dose de capsaicina preconizada, o que nos sugere que ratas da linhagem
Holtzman seriam menos resistentes à capsaicina que animais de outras linhagens. De fato,
observamos em nosso laboratório que, entre as linhagens Wistar e Holtzman, apenas esta
última desenvolve uma resposta consistente de artrite experimental induzida por adjuvante
(Tatsuo et al., 1994; Francinchi et al., 2000). Se a sensibilidade de ratos Holtzman à
capsaicina tem relação com a quantidade ou qualidade de neuropeptídeos presentes nas
terminações nervosas sensitivas destes animais, é uma questão que merece ser investigada.
Quanto ao nosso protocolo experimental, o tratamento neonatal com capsaicina apenas
afetou parcialmente a 1ª fase da resposta nociceptiva, não afetando a 2ª fase da resposta
nociceptiva e tampouco a resposta edematogênica à formalina. Além disso, como animais
capsaicinizados apresentaram resposta de edema à SP, de intensidade similar a animais não
capsaicinizados, acreditamos que a depleção dos estoques de neuropeptídeos foi pequena,
ou que a SP tenha menor importância nesse modelo e linhagens experimentais. Já que a SP
é considerada como o principal neurotransmissor depletado pela capsaicina na literatura
(Jessell et al., 1978; Holtzer, 1991; Dray, 1992; Santos et. Al. 1997; Ohtori et al., 2000).
Coerente com tais resultados foi a ausência de resposta nociceptiva, observada sob nossas
condições experimentais após a injeção de SP na pata dos animais, em doses efetivas para
causar edema conforme também mostrado.
Nossos resultados indicaram que a SP está envolvida nas respostas nociceptiva e
edematogênica induzidas pela formalina, já que o pré-tratamento dos animais com um
antagonista de receptor NK
1
(SR 140333), reduziu ambas as fases da resposta nociceptiva e
111
também reduziu a resposta edematogênica. De fato, o antagonista de receptores NK
1
, o
composto SR 140333, junto com a pirilamina, se mostrou uma das drogas mais eficientes
para reduzir as respostas nociceptiva e edematogênica à formalina, sob as mesmas
condições experimentais.
Por outro lado, observamos no presente trabalho que a NK A, induziu tanto resposta
nociceptiva como resposta edematogênica após injeção na pata de ratas. A NK A pode
atuar tanto em receptores NK
1
quanto em receptores NK
2
, embora tenha maior afinidade
pelo último tipo (Sivam e Krause, 1992; Laird et al., 2001; Trafton et al., 2001). Assim, no
presente estudo, para determinarmos a eficiência de um antagonista específico para
receptores NK
2
, utilizamos o modelo de edema de pata induzido pela NK A. Estes
resultados indicam que este neuropeptídeo liberado de fibras sensitivas periféricas, pode
estar envolvidos nessas respostas, atuando sobre receptores do tipo NK
1
. No modelo da
formalina em ratos, o antagonista de receptores NK
2
não afetou tal resposta. Nossos dados
são coerentes com aqueles obtidos por Santos, JMM (2006), que usou o modelo de
formalina, porém, injetada na cavidade peritoneal de ratas da mesma linhagem. A
contribuição do CGRP e da NK B não foi avaliada no presente estudo.
Também confirmamos em nosso trabalho, o importante papel da histamina no
modelo experimental da formalina em ratos, conforme verificado por Parada et al., (2001) e
por Ashmawi et al., (2003). A pirilamina, mencionada anteriormente, um antagonista
específico de receptores H
1
, que administrada sistemicamente reduziu de maneira muito
significativa a resposta nociceptivas nas fases I (50%) e II (67%), bem como a resposta
edematogênica (42%) à formalina. O resultado mais significativo foi a demonstração de
que a administração local de pirilamina provocou os mesmos efeitos da administração
sistêmica, de maneira dose-depedente e apenas quando administrada no sítio da inflamação.
112
Em contraste, doses efetivas do antagonista específico de receptores de serotonina
(pizotifeno) não afetou a resposta à formalina, embora a serotonina seja uma importante
amina bioativa encontrada, em conjunto com a histamina, em mastócitos de roedores
(Csaba et al., 2003; Csaba et al., 2005). Em conjunto com os resultados histopatológicos de
nosso estudo, podemos afirmar que a histamina é um dos importantes mediadores das
respostas nociceptiva e edematogênica induzida pela formalina em ratas.
A associação de pré-tratamentos (capsaicina ou SR 140333 com pirilamina), quando
comparado com pré-tratamento com capsaicina (neonatal) ou SR 140333, mostrou uma
redução estatisticamente significativa na 1ª fase da resposta nociceptiva e no edema, assim
como uma redução na 2ª fase da resposta nociceptiva e no edema (não significativa) quando
comparado ao tratamento com pirilamina, isoladamente.
Respostas inflamatórias, por compreenderem alterações vasculares e celulares
certamente refletem alterações nas membranas biológicas das células envolvidas. Nesse
sentido, pode-se esperar que estas alterações promovam a mobilização do ácido
araquidônico, um dos componentes da membrana celular, na resposta inflamatória à
formalina.
De fato, o pré-tratamento dos animais com inibidores não seletivos e seletivos de
ambas as ciclooxigenases descritas em ratos (COX-1 e COX-2), alteraram
significativamente as respostas estudadas no presente trabalho. Foram utilizados compostos
de amplo uso terapêutico e experimental. Entre tais drogas foram usados o piroxicam, a
dipirona e o paracetamol que são considerados inibidores não seletivos de ciclooxigenases.
O paracetamol e a dipirona, embora sejam considerados anti-inflamatórios não esteróides, e
portanto atuam inibindo as ciclooxigenases, apresentam mecanismo de ação diferente e
ainda pouco compreendidos. Por exemplo, o paracetamol, parece ser um pobre inibidor de
113
ciclooxigenase 1 e 2 e parece atuar em condições de baixa concentração de ácido
araquidônico livre (revisado por Graham e Scott, 2005), apresentando baixa atividade anti-
inflamatória (Botting, 2000; Ouellet e Percival, 2001). Foi demonstrado experimentalmente
que a analgesia induzida pela dipirona pode envolver a liberação de opióides endógenos e
outros sistemas (Beirith et al, 1998; Aguirre-Bañuenos e Granados-Soto, 1999) e a ativação
do sistema NO-canais de potássio (Sachs et al., 2004). Os resultados obtidos com inibidores
não seletivos foram variáveis, em geral. Houve redução da fase II da resposta nociceptiva e
do edema (piroxicam e dipirona). Nenhuma das drogas, nas doses utilizadas, atuou sobre a
fase I da resposta à formalina. O paracetamol, nas doses utilizadas, não atuou em nenhuma
das respostas observadas, ao contrário do observado por Bonnefont et al., (2003) e
Bonnefont et al., (2005), em relação à resposta nociceptiva à formalina.
Por outro lado, o tratamento dos animais com inibidores específicos de
ciclooxigenases, tanto para COX-1 (SC 560) como para COX-2 (celecoxibe, rofecoxibe e
SC 236) no modelo da formalina, foi mais consistente. Nenhum deles afetou a fase I da
resposta nociceptiva, assim como todos inibiram a fase II da mesma resposta, similar ao
observado por Dudhgaonkar et al., (2004) e ao contrário do observado por Torres-Lopes et
al (2002) que sugere um papel limitado da COX-2 no teste da formalina. Entretanto, em
estudo realizado em 2002, Yamamoto e Nozaki-Taguchi afirmam que o composto SC 560
(10 a 100 mg/kg, via oral) não apresenta efeitos na resposta comportamental à formalina.
A droga inibidora da COX-1 (i-COX-1) reduziu a resposta edematogênica quando utilizada
em doses mais baixas. Ao contrário, os inibidores de COX-2 (i-COX-2) reduziram a
resposta edematogênica, somente nas doses mais elevadas. Ao contrário do observado por
Yamamoto e Nozaki-Taguchi (2002), a inibição da resposta à formalina com o i-COX-1
também foi observada na literatura (Mazario et al., 2001; Tegeder et al., 2001), consistente
114
portanto com nossos achados. Por outro lado Francischi et al., (2002) mostraram a pobre
eficácia dos i-COX-2 (celecoxibe, rofecoxibe e SC 236) também no modelo de edema
produzido pela carragenina. É interessante notar que os mesmos efeitos inibitórios foram
observados com a administração local dessas mesmas drogas, tanto para i-COX-1 como
para i-COX-2, salientando a importância local de ambas ciclooxigenases na inflamação e
dor induzidas pela formalina. No entanto, uma ação pelo menos parcial, dessas drogas no
sistema nervoso central não pode ser descartada.
Portanto, nosso estudo forneceu dados sobre o efeito de vários antagonistas
específicos de mediadores clássicos da inflamação (histamina, serotonina), de
neuropeptídeos (substância P e neurocinina A), bem como de inibidores de drogas muito
utilizadas terapeuticamente (dipirona, paracetamol, celecoxibe e rofecoxibe) no modelo de
formalina injetada na pata de ratos. Vários desses dados corroboram achados de literatura,
além de terem aberto a possibilidade de ampliar a atual compreensão sobre a participação
dos mencionados neuropeptídeos na inflamação, em particular, a participação da
neurocinina A.
115
6.0- CONCLUSÕES
A injeção intra-plantar de formalina em ratos Holtzman reproduz a resposta
nociceptiva e edematogênica. Nossos resultados mostram que não existem diferenças nas
respostas observadas em animais machos ou fêmeas.
Dentre os neuropeptídeos estudados a SP demonstrou ter importante participação
nas respostas estudadas e os resultados também sugerem a participação de neurocinina A
através da ativação de receptores NK
1
.
A histamina possui um importante papel na resposta nociceptiva e edematogênica
induzida pela formalina, confirmando trabalhos da literatura.
Os receptores 5-HT2 da serotonina, neste modelo experimental não estão
envolvidos na resposta nociceptiva e edematogênica à formalina
A capsaicina ou o composto experimental SR 140333 potenciou o efeito anti-
inflamatório da pirilamina nesse modelo experimental.
As prostaglandinas possuem papel relevante na 2ª fase da resposta nociceptiva e no
edema induzido por formalina, com a participação de ambas isoformas da enzima COX.
Os estudos histopatológicos demonstram que ocorrem alterações tissulares após a
injeção intraplantar de formalina, que confirmam os achados in vivo.
116
7.0- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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