( PDF ) Composição bioquímica e hormonal do líquido amniótico de fetos bovinos oriundos de inseminação artificial (IA), transferência de embriões (TE) e produção in vitro (PIV)

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MARCELO PIAGENTINI

COMPOSIÇÃO BIOQUÍMICA E HORMONAL DO LÍQUIDO AMNIÓTICO DE FETOS

BOVINOS ORIUNDOS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL (IA), TRANSFERÊNCIA

DE EMBRIÕES (TE) E PRODUÇÃO IN VITRO (PIV)

Tese

Doutorado

Botucatu

2008

MARCELO PIAGENTINI

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COMPOSIÇÃO BIOQUÍMICA E HORMONAL DO LÍQUIDO AMNIÓTICO DE

FETOS BOVINOS ORIUNDOS DE INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL (IA), TRANSFE-

RÊNCIA DE EMBRIÕES (TE) E PRODUÇÃO IN VITRO (PIV)

Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária

e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de

Mesquita”, campus de Botucatu, para obtenção

do título Doutor em Reprodução Animal.

Orientador: Prof. Dr. Nereu Carlos Prestes

Botucatu

2008

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Dedicatória

Aos meus pais por tudo que fizeram por mim, pelos conselhos,

pela paciência, pela lição de vida e amor.

A minha amada esposa Luciane pelo incentivo e compreensão

durante o desenvolvimento deste trabalho.

Aos meus filhos Guilherme “in memorian” e Miguel sempre

alegre e brincalhão.

SUMÁRIO

1. Introdução.....................................................................................................

2. Revisão da Literatura...................................................................................

2.1. Membranas e líquidos fetais............................................................... 17

2.2. Técnica de colheita para aminocentese............................................... 26

2.3. Perdas embrionárias e fetais de embriões produzidos in vivo.............

2.4. Perdas embrionárias e fetais de embriões produzidos in vitro.............

3. Objetivo......................................................................................................... 33

4. Material e Métodos....................................................................................... 35

4.1. Animais................................................................................................. 36

4.2. Análises laboratoriais............................................................................

4.3. Análise estatística................................................................................. 38

5. Resultados.................................................................................................... 39

6. Discussão..................................................................................................... 53

7. Conclusões................................................................................................... 57

8. Referências................................................................................................... 59

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Valores médios de alguns constituintes do fluido amniótico ovino

durante três estágios de gestação....................................................................

Tabela 2 -

Resultados dos parâmetros avaliados na análise bioquímica do

liquido amniótico no momento do parto no grupo 01 (IA)....................................

Tabela 3 - Resultados dos parâmetros avaliados na análise bioquímica do

liquido amniótico no momento do parto no grupo 02 (TE).................................

Tabela 4 -

Resultados dos parâmetros avaliados na análise bioquímica do

liquido amniótico no momento do parto no grupo 03 (PIV)..................

................

Tabela 5 - Média e desvio padrão dos parâmetros avaliados na análise bio-

química do liquido amniótico no momento do parto nos diferentes grupos..

Tabela 6 - Resultados obtidos de progesterona e testosterona do liquido a

niótico no momento do parto no grupo 01..........................................................

Tabela 7 - Resultados obtidos de progesterona e testosterona do liquido am-

niótico no momento do parto no grupo 02....................................................

Tabela 8 - Resultados obtidos de progesterona e testosterona do liquido am-

niótico no momento do parto no grupo 03 .......................................................

Tabela 9 - Média e desvio padrão dos parâmetros hormonais avaliados no

liquido amniótico no momento do parto nos diferentes grupos..........................

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 - Acompanhamento do trabalho de parto no piquete maternidade......

Figura 02 - Fotografia dos kits comerciais de radioimunoensaio para dosagens

de progesterona e testosterona no líquido amniótico nos três grupos.................

Figura 03 - Fotografia do aparelho para dosagens de proteína total, creatinina,

uréia, glicose, GGT e cloreto no líquido amniótico nos três grupos.....................

Figura 04 - Fotografia do aparelho para dosagens de sódio e potássio no lí-

quido amniótico nos três grupos......................................................................... 52

LISTA DE ABREVIATURAS

ANOVA: Análise de Variância

Ca: Cálcio

Cl: Cloro

CIV: Cultivo in vitro

FIV: Fecundação in vitro

GGT: Gama-glutamiltransferase

IA: Inseminação Artificial

K: Potássio

Mg: Magnésio

MIV: Maturação in vitro

Na: Sódio

P: Fósforo

PIV: Produção in vitro

P4: Progesterona

PO: Puro de Origem

PT: Proteína Total

RIA: Radioimunoensaio

SRD: Sem Raça Definida

T: Testosterona

TE: Transferência de embrião

RESUMO

O presente trabalho teve por objetivo comparar a composição bioquímica

e as concentrações de testosterona e progesterona no líquido amniótico de fetos

bovino da raça Nelore produzidos por fecundação in vivo, fecundação in vivo com

transferência de embrião (TE) e produção in vitro (PIV). Os problemas fetais obser-

vados ao momento do parto e pós-parto imediato em animais oriundos de PIV e a

escassez de pesquisas que determinem a composição do líquido amniótico associa-

da aos três sistemas de produção embrionária permitiram o desenvolvimento deste

trabalho. Utilizaram-se 60 animais divididos em: grupo 01 - vacas Nelore gestando

bezerros oriundos de inseminação artificial (IA) (n=20); grupo 02 - receptoras ges-

tando bezerros Nelore provenientes de inovulações de embriões oriundos de doado-

ras superovuladas pelo método convencional (n=20); grupo 03 - receptoras de em-

briões gestando bezerros Nelore originados de inovulações de embriões oriundos de

doadoras pelo método de aspiração folicular (n=20). No momento do parto, após a

visualização das bolsas, colheram-se 15mL de líquido amniótico por punção da bol-

sa com agulha e seringa adequadas. As amostras foram processadas e analisadas

no serviço de laboratório clínico do Departamento de Clínica Veterinária da

FMVZ/UNESP de Botucatu-SP e no Laboratório de Endocrinologia do departamento

de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária. Para análise bioquímica foram utili-

zados Kits comerciais seguindo a técnica recomendada pelo fabricante. A dosagem

hormonal de progesterona (P4) e testosterona (T) foi determinada por meio de radio-

imunoensaio em fase sólida com a leitura realizada em contador Gama Count Cobra

II. Os dados obtidos na avaliação bioquímica e no perfil hormonal foram submetidos

à análise de variância (ANOVA) e, uma vez demonstrada diferença estatística por

esse teste aplicou-se o Método de Tukey, com 5% de nível de significância. Os re-

sultados obtidos na análise bioquímica no momento do parto nos três grupos foram:

as médias de glicose (4,4mg/dL para IA; 6,7mg/dL para TE e 4,4mg/dL para PIV) e

proteína total (0,27g/dL para IA; 0,36g/dL para TE e 0,45g/dL para PIV) não diferiram

entre os três grupos; os valores de uréia dos grupos TE (38,3mg/dL) e PIV

(40,3mg/dL) foram superiores ao grupo de IA (28,1mg/dL); a concentração de creati-

nina foi maior no grupo PIV (8,0mg/dL), porém o grupo de TE (5,9mg/dL) apresentou

resultado semelhante ao grupo de IA (5,2mg/dL) e PIV; para gama-

glutamiltransferase (GGT) a média do grupo IA (35,0UI/L) foi superior ao grupo de

PIV (17,2UI/L), e o grupo de TE (22,6UI/L) obteve resultado similar ao grupo de IA e

PIV. Em relação aos eletrólitos dosados, o sódio nos grupos IA (74,4mmol/L) e TE

(77,7mmol/L) apresentou menor valor em relação grupo PIV (94,8mmol/L); a concen-

tração média de cloreto não diferiu entre o grupo IA (101,1mmol/L) e TE

(88,8mmol/L), porém esses foram superiores ao grupo PIV (63,7mmol/L) e para os

valores de potássio o grupo PIV (8,3mmol/L) obteve maior média em relação ao gru-

po TE (3,9mmol/L) sendo que no grupo IA (5,9mmol/L) encontrou-se valor semelhan-

te aos dois grupos. Na análise hormonal no momento do parto não foi detectada di-

ferença significativa para as concentrações médias de testosterona e progesterona.

Palavras-chave: líquido amniótico, análise bioquímica, dosagem hormonal, Nelore,

bovino.

ABSTRACT

The present work had for objective to compare the biochemical

composition and the concentrations of testosterone and progesterone in the amniotic

fluid of fetuses of the Nelore cows produced by in vivo fecundation, in vivo

fecundation at embryo transfer (ET) and in vitro production (IVP). The fetal problems

observed at the delivery moment and at the immediate post-partum in animals

originating from IVP and the shortage of researches that determine the composition

of the amniotic fluid associated to the three systems of embryonic production allowed

the development of this work, adding results to the studies that are being done by

other researchers with the placenta of IVP animals. Sixty animals were used divided

into 3 groups: Group 1 - Nelore cows pregnant with calves conceived by artificial

insemination (AI) (n=20); Group 2 – receptor cows pregnant with Nelore calves

provement from superovulation of embryo donors (n=20); Group 3 – receptor cows

pregnant with Nelore calves obtained by in vitro production after follicular aspiration

(n=20). At the delivery moment, after the visualization of the sacs, 15mL of amniotic

liquid were collected by puncture. The samples were processed and analyzed in the

service of clinical laboratory of the Department of Veterinary Clinic of FMVZ/UNESP

of Botucatu-SP and in the Laboratory of Endocrinology of the department of Animal

Reproduction and Veterinary Radiology. For biochemical analysis commercial kits

were used following the technique recommended by the manufacturer. The hormonal

determinaton of progesterone (P4) and testosterone (T) was performed through

radioimmunossay (RIA) in solid phase with the reading accomplished in accountant

Gama Count Collects II. The data obtained in the biochemical evaluation and in the

hormonal profile were submitted to the variance analysis (ANOVA) and, once

demonstrated a statistic difference by that method the Tukey test was applied, with a

5% of level significancy. The results obtained in the biochemical analysis in the

delivery moment in the three groups were: the mean concentration glucose and total

protein didn't differ among the three groups; the mean values of urea of the groups

ET and IVP were higher than the group of AI; the mean concentration of creatinine

was higher in the group IVP, however the of the result group ET was similar to the

group of AI and IVP; for gamma-glutamyltransferase (GGT) the mean of the group AI

was higher than the group IVP, and the group ET showed similar result to the group

of AI and IVP. In relation to the electrolytes, the mean concentration of sodium of the

group AI and ET was smaller than the group IVP; the mean concentration of chloride

didn't differ among the group AI and ET, however those were higher than the group

IVP. The mean concentration of potassium the group IVP obtained higher than the

group ET and group AI the mean concentration was similar to the two groups. There

was not significant difference detected for the mean concentrations of testosterone

and progesterone in the delivery moment.

Keywords: amniotic fluid, biochemical profile, hormonal concentration, Nelore,

bovine

1. INTRODUÇÃO

Com as pressões impostas pela globalização e o aumento da competitivi-

dade, tornou-se essencial que a pecuária de corte brasileira buscasse o aumento da

eficiência reprodutiva e produtiva. Sendo assim, o ganho genético nos últimos 20

anos deve-se, basicamente, ao aumento da intensidade e acurácia da seleção das

raças. O impulso inicial para a seleção em bovinos foi dado pela inseminação artifi-

cial (IA) e pelos programas de teste de progênie e posteriormente, pela transferência

de embriões (TE). Incremento ainda maior pôde ser obtido com o desenvolvimento

da técnica de produção in vitro (PIV) e sua incorporação no setor produtivo.

A técnica de transferência de embriões bovinos no Brasil foi difundida a

partir da década de 80 e sua importância básica para a produção animal consiste na

possibilidade de uma fêmea produzir um número de descendentes muito superior ao

que seria possível obter fisiologicamente durante a sua vida reprodutiva. Para o me-

lhoramento zootécnico, ela é um importante instrumento, pois acelera e confere mai-

or precisão no processo de seleção animal. Além disso, a TE pode ser empregada

para obter descendentes de animais com distúrbios reprodutivos adquiridos sem co-

notação genética, impedindo em alguns casos o descarte precoce de fêmeas gene-

ticamente superiores (REICHENBACH et al., 2002).

A produção in vitro (PIV) vem apresentando avanços consideráveis e está

sendo incorporada aos projetos de produção. Com o desenvolvimento do método

de punção folicular, tornou-se possível à recuperação de oócitos de fêmeas para

fecundação in vitro (FIV), abrindo novos caminhos para a multiplicação de animais

de interesse econômico superando os atuais índices da transferência de embriões

clássica no que diz respeito ao número de bezerros/vaca/ano. Esta técnica pode ser

utilizada em animais jovens, senis, gestantes ou lactantes e animais com problemas

de fertilidade adquiridos (TERVIT, 1996; GOODHAND et al., 1999; MALARD et al.,

1999; TANEJA et al., 2000).

O Brasil supera qualquer país do mundo nessa biotecnologia de reprodu-

ção de bovinos e a estimativa é que para cada dois nascimentos por PIV no mundo,

um ocorre em território brasileiro. A PIV serve também para pesquisar fenômenos

biológicos que ocorrem durante a maturação, fecundação e cultivo in vitro de oóci-

tos, além de eventos relacionados ao início do desenvolvimento embrionário na fase

de pré-implantação (GONÇALVES et al., 2007).

O uso comercial em larga escala e sem critérios da técnica de PIV em bo-

vinos podem estar relacionados a distúrbios no terço final da gestação, como bezer-

ros com maior peso ao nascimento (Síndrome do bezerro gigante), período de ges-

tação prolongado, aumento na incidência de abortamentos, aumento da mortalidade

perinatal e aumento de anormalidades congênitas (LEIBFRIED-RUTLEDGE, 1999;

WAGTENDONK-DELEEUW et al., 2000).

Tendo em vista, a inconsistência dos resultados, a incidência de proble-

mas fetais ligados ao momento do parto e pós-parto e a escassez de pesquisas que

determinem a composição do líquido amniótico comparando os diferentes sistemas

de produção embrionária, este trabalho teve como objetivo, avaliar a composição

bioquímica e hormonal do líquido amniótico de bezerros produzidos in vivo, in vivo

com transferência de embriões e produção in vitro.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Membranas e líquidos fetais

O útero gravídico é uma estrutura única devido a sua organização e com-

plexidade dos seus componentes. Os pesquisadores e obstetras sempre questiona-

ram a função dos envoltórios fetais e papel dos fluidos e seus anexos. Relatos sobre

a origem, função e composição nos seres humanos fornecem informações importan-

tes sobre a fisiologia materno-fetal (DORAN et al., 1970; WILLIAMS, 1993).

Quando o trofoblasto entra em contato ou se fixa no endométrio (17 a 20

dias) com o objetivo de realizar trocas fisiológicas, ocorre a formação da placenta e

dos envoltórios fetais (28 dias), compreendendo o âmnion, saco vitelínico, alantóide

e córion (PERRY, 1981).

O crescimento fetal necessita de elementos orgânicos e inorgânicos e

com a análise dos fluidos fetais torna-se possível uma melhor compreensão de todo

processo bioquímico que envolve a formação e o metabolismo do concepto

(KJELDSBERG & KNIGHT, 1993).

Os líquidos fetais são estudados com objetivo conhecer a fisiologia da

gestação, acompanhar a viabilidade fetal, determinar o sexo do feto e possíveis a-

berrações cromossômicas (DOMINGUES et al., 1990).

As mudanças dos constituintes bioquímicos do fluido amniótico associa-

das à idade gestacional em ovinos foram estudadas por Assali et al. (1968). Até os

dias atuais não existem dados que descrevam totalmente a composição e as modifi-

cações do líquido amniótico na espécie bovina.

O âmnio forma-se cerca de 13 a 16 dias após a concepção em vacas e

ovelhas. Torna-se uma bolsa de parede dupla que contorna completamente o feto,

exceto no anel umbilical. A membrana amniótica é transparente e consideravelmen-

te resistente e seu conteúdo é de coloração amarelo claro a pardo e viscoso, perfa-

zendo um volume final de 2 a 8 litros para a espécie bovina. O alantóide aparece 14

a 21 dias após a fertilização como uma protuberância do intestino embrionário poste-

rior, e nos bovinos, a bolsa alantoideana apresenta coloração relativamente escura,

com reflexos azulados e conteúdo aquoso de coloração amarelo âmbar, com aspec-

to transparente perfazendo um volume final de 4 a 15 litros (GRUNERT & BIRGEL,

1984).

Para a obstetrícia veterinária, os líquidos fetais são importantes por cau-

sar distensão do útero e, a partir daí, possibilitar o diagnóstico de gestação precoce

por palpação retal, com 35 dias em bovinos (ARTHUR, 1969).

Na espécie bovina, Hammond (1927) relatou que ocorre um pequeno au-

mento no peso do fluido fetal bovino após o quinto mês de gestação. Observou um

peso de 6510 gramas até o quinto mês e 6840 gramas até o oitavo mês gestacional.

Bergmann (1922) citou para os mesmos períodos gestacionais 7600 gramas e 9100

gramas, respectivamente. Sweet et al. (1948) observaram pesos de 10084 gramas

aos 226 dias; 11907 gramas aos 255 dias e 15536 gramas aos 276 dias.

Arthur (1957), em um estudo sobre fluidos fetais de bovino baseado no

exame de fetos de 74 vacas variando entre 30 a 284 dias de gestação, definiu que a

quantidade de fluido fetal aumenta progressivamente durante a gestação e o volume

ao final da gestação (15 a 20 litros) pode ser até cinco vezes maior do que o encon-

trado ao final do quinto mês de gestação. Aumentos abruptos na quantidade total

ocorrem entre 40 e 65 dias, entre 105 dias e 120 dias e entre 6,5 meses a 7,5 me-

ses.

Além disso, os líquidos fetais permitem ao feto adotar situação eutócica

para o parto (HAFEZ & HAFEZ, 2000), protegem contra traumatismo, desidratação e

variações de temperatura, permitem o crescimento do feto e seus movimentos sem

prejudicar o útero, promovem a dilatação do cérvix, vagina e vulva durante o parto;

aumentam a lubrificação da vagina após o rompimento das bolsas facilitando a pas-

sagem do produto, apresentam papel bactericida e evitam aderências (GRUNERT &

BIRGEL, 1984; PRESTES & LANDIM-ALVARENGA, 2006).

O fluido amniótico representa um meio de proteção para o feto e lhe per-

mite, em um estado de gestação mais avançado, efetuar as rotações necessárias

para a adaptação à posição mais favorável para o parto. São notórias as proprieda-

des lubrificantes atribuídas ao fluido amniótico da gestação a termo, facilitando a

passagem do feto através do canal do parto (ROBERTS, 1986). O papel mais im-

portante é de ordem nutricional, formando parte integrante do sistema circulatório

fetal. Deglutido pelo feto, entra na constituição do mecônio, contribui na produção de

líquidos intra e extracelulares dos tecidos fetais e passa pela circulação sanguínea e

linfática para terminar na placenta. Protege o feto contra choques externos, previne

aderências e promove dilatação cervical (HAFEZ & HAFEZ, 2000).

Dentre as funções do fluido alantoideano pode-se destacar armazena-

mento de produtos que o feto excreta e que não se difundem para a mãe, manuten-

ção da pressão osmótica entre a circulação materno-fetal e prevenção da desidrata-

ção do concepto (ROBERTS, 1986; HAFEZ & HAFEZ, 2000).

De acordo com Baetz et al. (1976), a unidade feto-placentária é um siste-

ma dinâmico, com constantes trocas de água e constituintes do fluidos fetais e a cir-

culação materna. Os metabólitos produzidos pelo feto durante seu desenvolvimento

são eliminados por meio das trocas realizadas entre a placenta materna e a placenta

do concepto.

O líquido amniótico dos animais domésticos é considerado como produto

de secreção das paredes ou folhetos amnióticos, bem como pela saliva, secreção

nasal do feto e, temporariamente, por urina eliminada pela uretra. O volume deste

fluido é regulado por deglutição do feto e tal ocorrência é observada em todas as

espécies domésticas. Os principais componentes do fluido amniótico são: mucina,

pequenas quantidades de K, Mg, glicose, creatinina, lipídios e proteínas, ácido úrico

e uréia. Por outro lado, contêm grandes quantidades de Na, Cl, P, frutose, hormô-

nios (estrógeno e progesterona). O controle da excreção de sódio e potássio pela

urina é regulado pelos mineralocorticóides produzidos pela glândula adrenal fetal,

aumentando as concentrações de potássio e diminuindo as concentrações de sódio

na urina, sendo um indicativo da maturidade renal (PRESTES et al., 2001). Segundo

Evrard et al. (1997), na espécie ovina, a concentração de sódio e cloreto no líquido

amniótico depende das secreções orais e nasais do feto durante a gestação.

O feto está envolto diretamente pelo fluido amniótico, por isso podem ser

encontrados pêlos, células epiteliais, restos de escamação cutânea e, nos fetos

traumatizados, há possibilidades da presença de mecônio (GRUNERT & BIRGEL,

1984).

O líquido alantoideano é de origem renal geralmente composto pela urina

fetal, com pequenas quantidades de Na, Cl e glicose e altas quantidades de K, Mg,

Ca, frutose, creatinina, ácido úrico e uréia (BAETZ et al., 1976; BASHA et al., 1980;

SIMÕES, 1984; ROBERTS, 1986; HAFEZ & HAFEZ, 2000).

Segundo Strayer (1995), as proteínas são essenciais para todos os seres

vivos, dentre suas funções principais estão: a catálise enzimática, transporte e ar-

mazenamento de moléculas e íons, sustentação mecânica, proteção imunitária, ge-

ração e transmissão dos impulsos nervosos e controle do crescimento da célula. As

proteínas do feto são sintetizadas na placenta ou no próprio organismo a partir de

aminoácidos da mãe. As membranas fetais são ativas na síntese de proteínas sendo

que nos fluido fetais elas têm origem urinária.

De acordo com Hervey & Slater (1967) e Votta (1975) a creatinina é um

dos elementos bioquímicos mais estudados para determinar a maturidade fetal e

suas variações durante a gestação. Sua presença é explicada pela simples difusão,

por diferença de gradiente, pelos corioâmnios (cordão umbilical, mucosa digestiva e

mucosa bronquial) em ambas as direções. Esta é uma substância nitrogenada não

protéica excretada pela filtração glomerular, que atravessa totalmente esta membra-

na, de onde se pode concluir que a maturidade renal aumenta sua concentração no

líquido amniótico. A determinação da concentração de uréia tem sido usada na ava-

liação da função renal juntamente com a creatinina, tanto em medicina veterinária

como na humana.

A glicose é o principal açúcar sangüíneo do feto, sendo, portanto a mais

importante fonte de energia. A maior parte da glicose utilizada pelo feto é fornecida

pela mãe, sendo mínima a produção endógena. Porém, o concepto pode sintetizar,

pela glicogênese: frutose, galactose ou pela gliconeogênese: piruvato, lactato e ala-

nina. A concentração de glicogênio placentário é elevada durante o início da gesta-

ção, decrescendo com o seu avanço. À medida que isto ocorre, o feto começa ter

sua própria glicogênese e passa a armazenar o glicogênio na forma de reserva he-

pática (REZENDE & MONTENEGRO, 1995).

Baetz et al. (1976) encontraram na espécie bovina uma concentração

média de 6,8mg/dL de glicose, 22,2mg/dL de uréia, 7,1mg/dL de creatinina, 0,14g/dL

de proteína total, 124,5mEq/L de sódio, 5,7mEq/L de potássio e 109mEq/L de cloro

no líquido amniótico de fetos oriundos de abatedouro entre 120 e 245 dias de gesta-

ção.

De acordo com Aidasani et al. (1992), na espécie caprina, o líquido am-

niótico apresenta uma concentração de glicose de 180,40mg/dL, de proteína total

de 164,32mg/dL e de creatinina 15,88mg/dL. Contudo Chauhan et al. (1992) rela-

taram uma concentração de 310,00mg/dL e de 20,70mg/dL de proteína total e

creatinina, respectivamente, em cabras. Esses mesmos autores encontraram no lí-

quido amniótico uma concentração média de 67,17mEq/L de sódio e de

15,33mEq/L de potássio no terço final da gestação. Prestes et al. (2001) relataram

as concentrações médias dos componentes bioquímicos do líquido amniótico de fe-

tos ovinos em três fases da gestação, conforme descrito na tabela 01.

Tabela 01: Valores médios de alguns constituintes do fluido amniótico ovino durante

três estágios de gestação.

Constituintes 70 dias 100 dias 145 dias

pH 8,36 7,54 7,37

Glicose (g/dL) 16,06 8,58 3,79

Uréia (mg/dL) 42,68 33,53 25,49

Creatinina (g/dL) 0,85 5,04 11,25

Gama GT (UI/L) 12,58 14,20 12,30

Sódio (mmol/L) 146,50 129,42 103,85

Potássio(mmol/L) 9,79 6,15 8,65

Cloro (mmol/L) 96,59 85,28 65,35

Proteína (g/dL) 0,14 0,23 0,24

Fonte: Prestes et al., 2001

Brace et al. (2004) avaliando ovelhas de gestação simples determinaram

à concentração de alguns constituintes bioquímicos do fluido amniótico como

126,6mmol/L de sódio, 5,46mmol/L de potássio, 100,9mmol/L de cloro e 0,28mmol/L

de glicose. Valores semelhantes foram descritos por Gagnon et al. (2002) sendo

120,3mmol/L de sódio, 7,3mmol/L de potássio, 99,3mmol/L de cloro e 0,30mmol/L de

glicose e por Dickson & Harding (1994) sendo 117,2mmol/L de sódio e 96,5mmol/L

de cloro no líquido amniótico de fetos da espécie ovina no final da gestação. Esses

dados sugerem que ocorrem trocas entre os fluidos fetais aumentando a osmolari-

dade do líquido amniótico.

Ainda em ovelhas, Mellor & Slater (1971) analisando o fluido amniótico no

final da gestação, encontraram uma concentração média de 141mEq/L de sódio,

5,8mEq/L de potássio, 105mEq/L de cloro e 4,55mmol/L de uréia.

Kochhar et al. (1997) relataram que o fluido amniótico de potros no mo-

mento do parto possui, em média, 0,91g/dL de proteína total, 19,38mg/dL de creati-

nina, 146,00mEq/L de sódio, 9,2mEq/L de potássio e 20,1mg/dL de glicose.

Reddy et al. (1995) analisaram as mudanças bioquímicas do líquido am-

niótico de ovinos e atribuíram os baixos níveis de proteína no líquido amniótico à

ausência de fibrinogênio e de outras proteínas ligadas ao mecanismo de coagulação

sangüínea. As proteínas solúveis aumentariam significativamente do primeiro ao

quarto mês de gestação. A atividade da fosfatase ácida aumentaria durante os pri-

meiros três meses de gestação devido à liberação de íons de fósforo e a diminuição

dos níveis no quarto mês ocorrendo devido à rápida utilização dos íons de fósforo

para o desenvolvimento do sistema esquelético fetal (REDDY et al., 1995). Os ní-

veis de fosfatase alcalina exibiriam uma tendência não significativa de variação du-

rante o período gestacional. Dados similares foram encontrados em bovinos por

Baetz et al. (1976) e em humanos por Lim & Paul (1987). Níveis de aminoácidos

livres no fluido amniótico aumentariam do primeiro ao terceiro mês de gestação e

diminuiriam durante o terceiro mês (WALES & MURDOCH, 1973). As diferenças

nos níveis totais de carboidratos presentes no líquido amniótico de ovelhas não se

alterariam significativamente. O decréscimo nas concentrações de glicose observa-

das durante o terceiro e quarto mês de gestação poderiam ser devido ao aumento

no consumo de fluido amniótico conseqüente ao desenvolvimento do reflexo de de-

glutição. O aumento progressivo no total de lipídeos do fluido amniótico foi evidente

do primeiro ao quarto mês de gestação (REDDY et al., 1995).

Estudos sobre a esteroidogênese fetal gonadal e as concentrações de

hormônios esteróides nos fluidos fetais nas diferentes espécies de animais têm sido

relatados na literatura com pouca freqüência (DOMINGUES et al., 1990). Bongso e

Basrur (1975) relataram que a diferença na concentração de esteróides nos fluidos

fetais pode ser usada para identificar o sexo fetal através da técnica de amniocente-

se.

De acordo com Domingues et al. (1990), os níveis de testosterona no flui-

do amniótico são maiores nos fetos macho em relação aos fetos fêmea durante toda

a gestação. Esses pesquisadores descreveram que devido ao contato do liquido

amniótico e o feto, as concentrações de testosterona secretada pelos testículos fetal

são maiores nesse fluido do que no alantoideano. Essa diferença entre os fluidos se

deve pela necessidade do feto macho em manter níveis elevados de testosterona,

pois há grande necessidade desse hormônio durante o período de diferenciação se-

xual.

Maia et al. (2004) encontraram no fluido amniótico de bovino uma concen-

tração média de testosterona de 51,80±3,62ng/dL para fetos machos e

26,60±5,40ng/dL para fetos fêmeas no terço final da gestação. A concentração mé-

dia de progesterona no fluido amniótico de fetos machos foi de 1,3±0,14ng/mL e de

1,5±0,22ng/mL para fêmeas.

2.2. Técnica de colheita por amniocentese

A amniocentese, colheita do líquido amniótico por aspiração transvaginal,

é um procedimento amplamente conhecido e utilizado na espécie humana, para mo-

nitorar a viabilidade e maturidade fetal, determinar precocemente o sexo do feto, pa-

ra estudos placentários, para diagnóstico de anomalias cromossômicas, para estimar

a maturidade pulmonar, detectar a presença de bactérias e efetuar diagnósticos de

distúrbios bioquímicos (PRESTES & LANDIM-ALVARENGA, 2006).

Com o advento da técnica de transferência de embriões como prática de

rotina comercial em rebanhos bovinos, adicionada ao desenvolvimento da técnica de

amniocentese foi possível não só fazer a determinação do sexo bem como o diag-

nóstico de defeitos citogenéticos no feto (GARCIA & SALAHEDDINE, 1997).

A metodologia é relativamente simples até o quarto mês de gestação

(ROBERTS, 1971). Após esse período a manipulação via retal do útero e localiza-

ção do envoltório fetal é dificultada.

A utilização da técnica de amniocentese requer avaliação de diversos fa-

tores: possibilidade de danos à mãe, danos ao feto durante a gestação, complica-

ções no período perinatal, anormalidades manifestadas durante o nascimento e acu-

rácia do diagnóstico. Existem especulações sobre os riscos de abortamento e mal

formações congênitas decorrentes da utilização da técnica, que poderiam ser míni-

mos com a manipulação apropriada do feto (BONGSO & BASRUR, 1975).

2.3. Perdas embrionárias e fetais de embriões produzidos in vivo

Pouco é conhecido sobre a incidência de abortamento em bovinos em

gestações provenientes de inseminação artificial e transferência de embriões (LEIBO

& RALL, 1989). Entretanto um estudo retrospectivo realizado por King et al. (1985)

demonstrou que as taxas de abortamento em gestações provenientes do processo

de TE, encontravam-se em torno de 5,3% para os sete primeiros meses. Uma perda

adicional de 2,7% ocorreu dos sete meses até o momento do nascimento, totalizan-

do uma perda de 8%. No mesmo trabalho foi observado que 13% de 223 gestações

em vacas expostas a amniocentese culminaram em abortamento espontâneo.

Em bovinos, as maiores taxas de perdas durante a gestação são no perí-

odo embrionário (1º ao 42º dia), quando comparadas ao período fetal (42º ao 280º

dia) ou período neonatal (parto ao 28º dia de vida) de acordo com Hubbert, (1974).

Especificamente, a morte embrionária precoce entre o dia oito e dezoito de prenhez

responde por aproximadamente 40% de todas as perdas gestacionais (AYALON,

1978; DISKIN & SREENAN,1980). Nesse período, a perda está relacionada com o

reconhecimento materno da gestação e liberação do interferon-tau (ROBERTS et al.,

1999).

Na TE, além da utilização da IA, há a necessidade da transferência dos

embriões colhidos para o trato reprodutivo de fêmeas receptoras. O estabelecimen-

to de gestações em receptoras é um evento multifatorial que envolve interações

hormonais, bioquímicas e fatores fisiológicos. Os fatores que podem influenciar o

sucesso das gestações em programas de transferência de embriões produzidos in

vivo incluem sincronização do estágio de desenvolvimento embrionário com o ciclo

estral de receptoras, número de embriões transferidos, qualidade dos embriões,

condições fisiológicas, reprodutivas, corporais e tamanhos das receptoras e a técni-

ca de transferência empregada (BETTERIDGE & LOSKUTOFF, 1993; HASLER et

al., 1987), além dos fatores ambientais como o estresse calórico (PUTNEY et al.,

1989).

Um trabalho realizado por King et al. (1985) revelou que as perdas fetais

nos terços médio e final da gestação não foram influenciadas pelo estágio embrioná-

rio, qualidade do embrião, tempo entre a colheita e transferência, pela assincronia

entre as receptoras e as doadoras, resposta ovariana ao tratamento de gonadotrofi-

nas ou histórico de infertilidade. As perdas embrionárias e fetais destes embriões

produzidos in vivo podem ser devido a causas infecciosas, como metrite e não infec-

ciosas como cistos ovarianos e idade das doadoras.

Segundo King (1990), a freqüência de anormalidades cromossômicas em

embriões resultantes de TE parecem ser elevadas e são as maiores causas de per-

das na gestação e podem responder por 20% do total das perdas embrionárias e

fetais. Estas anormalidades cromossômicas podem ser originadas pela penetração

de mais de um espermatozóide (polispermia) durante o processo de fertilização.

Esse mesmo autor realizou a cariotipagem de 683 embriões bovinos, sendo que

10,4% apresentaram cariótipos anormais embora a mãe e o pai possuíssem carióti-

pos normais. Vinte e cinco por cento destas anormalidades foram atribuídas a erros

que ocorrem durante a meiose (estresse térmico) e setenta e cinco por cento duran-

te a fertilização. Segundo Christianson (1992), as causas não infecciosas são res-

ponsáveis por mais de 70% das perdas embrionárias.

2.4. Perdas embrionárias e fetais de embriões produzidos in vitro

A múltipla ovulação e TE têm sido utilizadas com êxito por vários anos pa-

ra aumentar o potencial de exploração de animais de genética superior. Entretanto,

não se tem verificado progresso no aumento no número de embriões de boa quali-

dade para a transferência. Sabe-se também que repetidas superovulações podem

levar a problemas reprodutivos nas doadoras. Por outro lado, devido a recentes a-

vanços na PIV, esta técnica tem sido utilizada comercialmente por algumas empre-

sas com resultados inconstantes. O principal objetivo da PIV comercial visa a ob-

tenção de embriões viáveis de fêmeas que não estão mais aptas a produzirem des-

cendentes pelas técnicas convencionais, como em vacas doadoras que apresentam

infertilidade provocada pelo tratamento com gonadotrofinas ou por distúrbios patoló-

gicos no sistema reprodutor feminino. Fêmeas a partir dos seis meses de idade,

gestantes até o terceiro mês e mesmo pós-parto (duas a três semanas) podem ser

utilizadas como doadoras na PIV. Outra vantagem da aspiração folicular guiada por

ultra-sonografia na PIV está no fato de que não é necessário o uso de hormônios

para a recuperação de oócitos (GARCIA et al., 2003).

Após a recuperação dos oócitos por aspiração folicular, três passos bioló-

gicos que ocorrem in vivo devem ser simulados in vitro para a produção de embri-

ões: maturação in vitro (MIV), fecundação in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV). O de-

senvolvimento embrionário in vitro é avaliado no sexto dia de cultivo visualizando-se

a compactação dos blastômeros e início da formação da blastocele, sendo que no

sétimo dia é feita a seleção e avaliação final dos embriões para a transferência a

fresco ou congelação (GARCIA et al., 2003).

Diferentes fontes de oócitos, técnicas de preparação espermática, matu-

ração, fertilização e cultivo embrionário são fatores que influenciam diretamente o

desenvolvimento, produção e qualidade embrionária (FARIN et al., 2001). As taxas

de gestação com relação à produção in vitro de embriões podem ser bastante in-

constantes. Esta inconstância está ligada à qualidade dos embriões, havendo inter-

ferência das condições de cultivo e meios usados durante todas as fases da PIV, da

avaliação subjetiva e seleção dos embriões para a transferência, além do estado

reprodutivo e nutricional das receptoras. As taxas de gestação aos 60 dias têm vari-

ado, em geral, entre 40 a 60% de acordo com o sistema de produção in vitro utiliza-

do pelos diferentes laboratórios (GARCIA et al., 2003).

A utilização de meios de cultivo complexos como TCM 199 associada a

soro fetal bovino no cultivo de embriões bovinos é eficiente e utilizada na produção

embrionária quantitativa, porém a utilização de meios mais definidos (SOF) pode ser

mais eficiente para a qualidade do embrião (HASLER et al., 1995). Outros fatores

podem influenciar a sobrevivência de embriões produzidos utilizando o sistema in

vitro, incluindo a composição do meio (THOMPSON, 2000), atmosfera gasosa

(WATSON et al., 1994), qualidade oocitária e genótipo embrionário (BLONDIM &

SIRARD, 1995).

Em contraste aos embriões bovinos produzidos in vivo, aqueles produzi-

dos in vitro possuem diversas características únicas de desenvolvimento. Os em

briões machos produzidos in vitro tendem a se desenvolver mais rapidamente em

relação aos embriões fêmeas (YOUNG & FAIRBURN, 2000). Avaliações genéticas

realizadas durante o desenvolvimento embrionário não diferem na porcentagem de

machos e fêmeas (50%) (AGCA et al., 1998). As mórulas produzidas in vitro possu-

em compactação menos pronunciada em relação às produzidas in vivo (VAN SOON

et al., 1992a), granulações escurecidas em blastômeros e menor espaço perivitelíni-

co (VAN SOON et al., 1992b).

A influência do sistema de cultivo in vitro sobre o embrião bovino e desen-

volvimento do concepto parece ocorrer logo após a transferência. Tem-se observa-

do um significante aumento (2x) do tamanho do concepto detectado aos 10 dias

após a transferência de blastocistos produzidos in vitro comparado com os produzi-

dos in vivo (FARIN et al., 1999). Tal alteração pode estar relacionada a elevados

níveis de progesterona (GARRET et al., 1988) e amônia (McEVOY et al., 1999) du-

rante o período inicial de cultivo in vitro. O desenvolvimento normal do feto bovino é

primariamente controlado pelo genótipo fetal e juntamente com a placenta influen-

ciados pelo acasalamento, sexo e número de fetos no útero e ambiente uterino

(FERRELL, 1991).

As placentas resultantes de procedimentos in vitro têm apresentado defei-

tos de desenvolvimento, como menor número de placentônios associados com a

diminuição do contato materno-fetal e prejudicando as trocas gasosas e de nutrien-

tes, ocasionando o estresse fetal, o qual pode resultar em abortamento (FARIN et

al., 2000; PRESTES, 2005).

Avelino et al. (2002) realizaram um experimento de aspiração folicular

guiada por ultra-sonografia e PIV em vacas de diversas raças, obtendo uma taxa de

34,5% de gestação aos 30 dias, sendo que por meio da sexagem fetal diagnosticou-

se uma incidência de 64% de machos. Houve uma taxa de mortalidade de 12% até

os 60 dias de gestação, e 9% de mortalidade pós-natal com quadro de dispnéia e

hipertermia. Neste experimento, esses autores observaram algumas anormalidades

placentárias, como hidroalantóide e menor número de placentônios. Ao nascimento

constatou-se que 13% dos bezerros nascidos vivos apresentavam mais de 50Kg de

peso corporal, sendo dois destes xifópagos e um diplocéfalo. De acordo com Pres-

tes (2005), algumas anormalidades são descritas em prenhez provenientes de em-

briões de PIV como gestação prolongada, anormalidades congênitas, produtos ab-

solutos grandes e maiores taxas de abortamento e de mortalidade do neonato. Ta-

xas de abortamento de 7 a 13% têm sido relatadas para receptoras de embriões

produzidos in vitro no terço médio e final de gestação (HASLER, 2000) e, em alguns

trabalhos as perdas chegam a 20% ou mais (THOMPSON et al., 1998). Li et al.

(2005) descreveram que a homeostase eletrolítica está comprometida em menor ou

maior grau sugerindo problemas na atividade renal fetal dos produtos de PIV.

Uma vez estabelecida à gestação, as perdas durante o primeiro trimestre

podem chegar a 10 a 12% (GALLI et al., 2001). Todavia, os maiores problemas pa-

recem estar ligados ao momento do parto. Existem vários relatos descritos na litera-

tura de prolongamento da gestação, distocia, aumento de mortalidade pré-natal e do

peso corpóreo. Todas estas alterações fazem parte da “Síndrome do bezerro gigan-

te” (YOUNG et al., 1998).

3. OBJETIVO

O objetivo do presente projeto foi avaliar a composição bioquímica e as

concentrações de testosterona e progesterona dos fluído amniótico de bezerros ori-

undos de inseminação artificial, transferência de embriões e produção in vitro.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Animais

Colheram-se amostras de fluido amniótico de 60 animais gestantes sen-

do: 20 animais da raça Nelore P.O. (puro de origem) e 40 animais, receptoras de

embriões sem raça definida (SRD). Os animais pertencentes à Fazenda Monjolinho

(Arandu - SP), Fazenda Campininha e à Fazenda Boi Verde (Avaré-SP), de sanida-

de comprovada e tendo recebido todas as vacinas preconizadas, foram divididos em

03 grupos:

- Grupo 01: n=20 vacas gestantes (Nelore), bezerros oriundos de inseminação artifi-

cial (IA).

- Grupo 02: n=20 vacas gestantes (receptoras), bezerros Nelore PO originados de

inovulações de embriões oriundos de doadoras superovuladas pelo método conven-

cional (TE).

- Grupo 03: n=20 vacas gestantes (receptoras), bezerros Nelore PO originados de

inovulações de embriões oriundos de doadoras pelo método de aspiração folicular

(PIV).

As doadoras da raça Nelore, com idade variando entre 3 a 8 anos, foram

mantidas em piquetes recebendo suplementação mineral e água ad libitum. Todos

os procedimentos do uso da biotecnologia específica a ser utilizada foram executa-

dos por médico veterinário ou empresa privada especializada em transferência de

embriões (TE) ou produção in vitro de embriões (PIV). As receptoras de embriões,

com idade variando entre 1,5 a 4 anos, foram mantidas em piquetes recebendo sila-

gem de milho, suplementação mineral e água ad libitum.

Próximo ao parto, os animais foram transferidos para piquetes-

maternidade. Todos os partos dos animais do experimento foram observados (figura

01). Todos os animais do grupo PIV tiveram seus partos induzidos com 10mg de

flumetazona (Flucortan



, Fort Dodge) IM aos 285 dias de gestação, as receptoras

que não responderam a essa indução receberam 10mg de dexametasona (Azium



Shering Pough) IM aos 292 dias. Durante a fase de expulsão e após a ruptura do

alantocórion, executou-se a punção do âmnion para a colheita de um volume de

15mL de líquido utilizando-se agulhas (40x12) e seringas (20mL) descartáveis da

marca BD Precision Glide



e Plascalp



, respectivamente.

O material foi depositado em tubo plástico de 15mL e imediatamente con-

gelado em freezer (-20ºC) para posterior análise laboratorial.

4.2. Análises Laboratoriais

As análises bioquímicas das amostras de líquido amniótico, colhido nos

três grupos, foram realizadas no laboratório clínico do Departamento de Clínica Ve-

terinária da FMVZ/UNESP-Botucatu. As dosagens hormonais foram realizadas no

Laboratório de Endocrinologia do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia

Veterinária da mesma instituição (figuras 02 a 04).

Para a determinação dos constituintes bioquímicos foram empregados kits

comercias seguindo a técnica recomendada pelo fabricante:

 Glicose – (mg/dL) método colorimétrico (glicose E-Celm) espectrofotômetro Celm

SB - 190.

 Uréia – (mg/dL) método colorimétrico (uréia ES-Celm) espectrofotômetro Celm

SB - 190.

 Creatinina – (mg/dL) método cinético (creatinina cinética – Celm) – espectrofotô-

metro Celm SB - 190.

 Gama-glutamiltransferase (GGT) – (UI/L) método cinético (Gama GT-Celm) es-

pectrofotômetro Celm E-210S.

 Sódio – (mmol/L) fotometria de chama – fotômetro Celm FC-280.

 Potássio – (mmol/L) fotometria de chama – fotômetro de chama Celm FC-280.

 Cloreto – (mmol/L) método colorimétrico (cloretos – Labtest) – espectrofotômetro

Celm SB - 190.

 Proteína Total – (g/dL) método colorimétrico (proteínas totais – Labtest) espectro-

fotômetro Celm SB - 190.

As dosagens de progesterona e testosterona no líquido amniótico foram

determinadas por radioimunoensaio (RIA), utilizando-se kits comerciais em fase

sólida (Diagnostic Products Corporation – DPC da MedLab) e a leitura realizada em

contador Gama Count Cobra II.

4.3 Análise estatística

Os dados obtidos na avaliação bioquímica e hormonal foram analisados

primeiramente pela análise de variância (ANOVA) e, uma vez demonstrada diferença

estatística por esse teste aplicou-se o Método de Tukey, com 5% de nível de signifi-

cância evidenciando-se quais grupos eram estatisticamente diferentes ou semelhan-

tes.

5. RESULTADOS

Os resultados obtidos na análise bioquímica nos três grupos estudados

estão descritos na tabela 02, 03, 04. Na tabela 05 encontram-se a média e desvio

padrão dos parâmetros avaliados.

Analisando cada parâmetro, o grupo 01 obteve média significativamente

inferior de uréia em relação aos grupos 02 e 03, já para valores de creatinina e sódio

o grupo 03 possui maior quantidade dessas variáveis no líquido amniótico em rela-

ção ao grupo 01 (p<0,05), contudo no grupo 02 os resultados foram semelhantes

aos dos grupos 01 e 03 (p>0,05). Para valores de glicose e PT não houve diferença

significativa entre os três grupos. Quanto a variável GGT, o grupo 01 apresentou

média significativamente superior ao grupo 03, e o grupo 02 obteve resultados se-

melhantes a ambos os grupos (p>0,05). Os grupos 01 e 02 não diferiram entre si em

relação ao cloreto, porém possuem média significativamente superior a do grupo 03

para essa variável. Por fim os valores de potássio no grupo 01 apresentaram-se se-

melhantes aos dos grupos 02 e 03, sendo que este último apresentou maior valor

em relação ao grupo 02 (p<0,05).

Tabela 02: Resultados dos parâmetros avaliados na análise bioquímica do liquido

amniótico no momento do parto no grupo 01 (IA).

Amostras

Uréia

(mg/dL)

Creatinina

(mg/dL)

Glicose

(mg/dL)

(g/dL)

GGT

(UI/L)

Cloreto

(mmol/L)

Sódio

(mmol/L)

Potássio

(mmol/L)

IA 01 53,00 15,50 2,00 0,75 87,90 101,20 83,00 4,50

IA 02 60,00 15,20 31,00 0,29 49,20 98,06 91,00 4,90

IA 03 57,00 15,70 9,00 0,27 27,40 107,00 103,00 5,40

IA 04 14,00 5,50 2,00 0,24 19,30 98,70 99,00 4,70

IA 05 14,00 3,90 5,00 1,07 54,80 86,65 92,00 3,60

IA 06 32,00 9,10 1,00 0,12 24,90 76,13 104,00 4,50

IA 07 51,00 6,50 1,00 0,08 23,70 66,33 54,00 3,10

IA 08 50,00 7,30 1,00 0,16 30,50 68,48 63,00 3,00

IA 09 25,00 13,30 3,00 0,20 15,60 66,95 76,00 7,40

IA 10 70,00 10,90 22,00 0,16 22,40 86,51 74,00 6,10

IA 11 15,00 6,40 1,00 0,44 18,70 81,01 74,00 5,00

IA 12 66,00 5,60 1,00 0,20 36,80 102,30 111,00 5,10

IA 13 40,00 13,60 3,00 0,30 16,80 130,60 107,00 5,10

IA 14 26,00 11,20 2,00 0,20 10,60 66,26 139,00 14,00

IA 15 41,00 12,00 4,00 0,30 15,00 49,91 58,00 5,60

IA 16 41,00 12,00 4,00 0,30 15,00 66,95 76,00 7,40

IA 17 25,00 13,30 3,00 0,20 15,60 53,66 66,00 7,10

IA 18 27,00 13,70 3,00 0,20 21,20 68,44 58,00 5,60

IA 19 18,00 3,20 0,00 0,10 23,70 84,00 124,00 6,00

IA 20 33,00 0,10 9,00 1,30 17,40 13,34 8,00 44,10

Tabela 03: Resultados dos parâmetros avaliados na análise bioquímica do liquido

amniótico no momento do parto no grupo 02 (TE).

Amostras

Uréia

(mg/dL)

Creatinina

(mg/dL)

Glicose

(mg/dL)

(g/dL)

GGT

(UI/L)

Cloreto

(mmol/L)

Sódio

(mmol/L)

Potássio

(mmol/L)

TE 01 54,00 16,10 5,00 1,43 35,50

92,50 87,00 4,80

TE 02 47,00 12,70 28,00 0,28 24,30

82,40 86,00 4,70

TE 03 53,00 14,00 26,00 0,37 10,60

87,10 78,00 4,20

TE 04 58,00 14,00 8,00 0,49 22,40

94,30 78,00 4,40

TE 05 63,00 2,00 18,00 2,41 5,60 45,30 51,00 5,80

TE 06 81,00 8,900 7,00 2,17 14,30

61,00 177,00 6,00

TE 07 51,00 4,80 2,00 0,31 31,80

80,80 110,00 3,80

TE 08 57,00 9,80 2,00 0,24 32,40

64,80 138,00 5,80

TE 09 41,00 4,10 10,00 0,33 27,40

100,60 124,00 4,80

TE 10 33,00 6,30 9,00 0,30 39,30

87,60 77,00 4,00

TE 11 74,00 11,70 3,00 0,28 64,80

109,90 100,00 8,70

TE 12 60,00 12,30 3,00 0,24 4,50 78,90 147,00 6,40

TE 13 36,00 2,00 2,00 0,09 13,10

100,60 103,00 6,80

TE 14 57,00 15,80 4,00 0,31 31,80

89,60 82,00 4,50

TE 15 24,00 9,80 10,00 0,20 8,70 47,00 50,00 6,60

TE 16 12,60 1,60 3,00 0,10 4,60 72,30 40,00 2,20

TE 17 4,40 2,40 3,00 0,10 22,00

64,80 60,00 3,20

TE 18 9,00 1,40 1,00 0,10 8,40 92,40 56,00 3,10

TE 19 5,20 2,20 6,00 0,10 13,80

72,10 54,00 2,90

TE 20 5,30 2,50 16,00 0,10 11,50

143,80 54,00 2,90

Tabela 04: Resultados dos parâmetros avaliados na análise bioquímica do liquido

amniótico no momento do parto no grupo 03 (PIV).

Amostras

Uréia

(mg/dL)

Creatinina

(mg/dL)

Glicose

(mg/dL)

(g/dL)

GGT

(UI/L)

Cloreto

(mmol/L)

Sódio

(mmol/L)

Potássio

(mmol/L)

PIV 01 81,00 0,20 16,00 1,70 0,60 5,59 118,00 2,80

PIV 02 37,00 11,60 12,00 0,20 18,70

95,79 122,00 7,00

PIV 03 54,00 6,80 1,00 0,30 15,60

90,55 120,00 6,30

PIV 04 53,00 8,90 2,00 0,30 30,50

89,30 123,00 6,70

PIV 05 34,00 4,60 1,00 0,30 11,20

103,20 117,00 6,30

PIV 06 64,00 11,80 8,00 0,30 10,60

80,08 105,00 6,80

PIV 07 60,00 15,10 8,00 0,70 16,60

88,71 122,00 4,30

PIV 08 62,00 12,40 2,00 0,40 22,40

81,37 11,00 8,50

PIV 09 29,00 5,70 2,00 0,20 3,10 87,19 120,00 4,50

PIV 10 15,00 3,90 1,00 0,30 33,00

91,53 125,00 5,60

PIV 11 25,00 19,20 5,00 0,50 19,90

80,08 117,00 7,50

PIV 12 38,00 8,20 10,00 0,30 17,40

89,48 120,00 4,70

PIV 13 39,00 19,20 2,30 0,60 13,10

67,01 79,00 10,80

PIV 14 47,00 9,80 1,00 0,20 6,20 90,15 121,00 7,80

PIV 15 33,00 6,60 2,00 0,20 6,90 81,19 100,00 7,60

PIV 16 33,00 6,60 2,00 0,20 6,90 81,19 100,00 7,60

PIV 17 58,00 7,50 8,00 0,30 10,00

76,81 100,00 7,00

PIV 18 43,00 6,20 1,00 0,20 3,10 102,20 136,00 7,50

PIV 19 46,00 2,60 1,00 0,10 18,10

79,94 120,00 4,80

PIV 20 40,00 5,10 1,00 0,30 3,70 77,97 121,00 6,10

Tabela 05: Média e desvio padrão dos parâmetros avaliados na análise bioquímica

do liquido amniótico no momento do parto nos diferentes grupos.

Grupo

Variável 01 (IA) 02 (TE) 03 (PIV) Valor de p

Uréia (

mg/dL)

28,1±17,1

38,3±20,5

40,3±16,5

0,004

Creatinina (

mg/dL)

5,2±4,6

5,9±4,9

8,0±5,3

0,003

Glicose (

mg/dL)

4,4±7,1 6,7±7,7 4,4±6,1

0,30

PT (

g/dL)

0,27±0,29 0,36±0,57 0,45±0,46

0,17

GGT (

UI/L)

35,0±42,9

22,6±13,0

17,2±14,6

0,016

Cloreto (

mmol/L)

101,1±43,5

88,8±23,8

63,7±31,5

<0,001

Sódio (

mmol/L)

74,4±33,9

77,7±33,4

94,8±33,6

0,015

Potássio (

mmol/L)

5,9±8,1

3,9±1,8

8,3±7,1

0,02

Médias seguidas de mesma letra não diferem estatisticamente (Teste de Tukey, p<0,05)

Na análise hormonal os valores obtidos por grupo não levou em conside-

ração o sexo fetal. Os resultados obtidos estão descritos na tabela 06, 07 e 08. Na

tabela 09 encontram-se a média e erro padrão de progesterona e testosterona nos

diferentes grupos. Em relação aos resultados de progesterona e testosterona não

houve diferença significativa entre os grupos de IA, TE e PIV (p>0,05).

Tabela 06: Resultados obtidos de progesterona e testosterona do liquido amniótico

no momento do parto no grupo 01 (IA).

Amostras Progesterona (ng/mL)

Testosterona (ng/dL)

IA 01 3,12 3,46

IA 02 22,27 6,44

IA 03 18,57 4,99

IA 04 16,21 3,74

IA 05 5,26 2,50

IA 06 4,53 5,08

IA 07 13,99 2,72

IA 08 7,12 2,32

IA 09 10,36 2,88

IA 10 13,06 14,63

IA 11 9,26 18,04

IA 12 1,27 19,52

IA 13 10,57 2,85

IA 14 1,63 5,77

IA 15 3,59 6,93

IA 16 3,04 5,46

IA 17 3,05 5,05

IA 18 3,06 20,18

IA 19 5,17 3,19

IA 20 3,80 20,51

Tabela 07: Resultados obtidos de progesterona e testosterona do liquido amniótico

no momento do parto no grupo 02 (TE).

Amostras Progesterona (ng/mL)

Testosterona (ng/dL)

TE 01 9,29 8,30

TE 02 16,68 6,53

TE 03 22,06 11,92

TE 04 2,38 6,62

TE 05 1,36 11,79

TE 06 5,94 53,97

TE 07 9,80 3,57

TE 08 2,87 3,90

TE 09 8,97 5,61

TE 10 3,36 1,99

TE 11 8,48 3,49

TE 12 11,24 5,05

TE 13 9,77 5,13

TE 14 15,83 19,29

TE 15 19,97 2,24

TE 16 2,57 10,03

TE 17 2,88 5,42

TE 18 3,71 3,20

TE 19 2,43 2,85

TE 20 2,55 3,69

Tabela 08: Resultados obtidos de progesterona e testosterona do liquido amniótico

no momento do parto no grupo 03 (PIV).

Amostras Progesterona (ng/mL)

Testosterona (ng/dL)

PIV 01 3,17 1,56

PIV 02 14,38 14,99

PIV 03 3,65 4,11

PIV 04 6,17 3,15

PIV 05 2,50 1,28

PIV 06 7,64 2,81

PIV 07 1,68 5,34

PIV 08 5,46 1,94

PIV 09 3,23 18,58

PIV 10 9,38 1,88

PIV 11 2,99 8,57

PIV 12 17,39 2,56

PIV 13 20,73 9,46

PIV 14 6,36 7,03

PIV 15 1,67 5,21

PIV 16 3,23 4,30

PIV 17 3,02 3,22

PIV 18 5,27 2,32

PIV 19 1,20 3,22

PIV 20 3,35 1,08

Tabela 09: Média e erro padrão dos parâmetros hormonais avaliados no liquido am-

niótico no momento do parto nos diferentes grupos.

Grupo

Variável 01 (IA) 02 (TE) 03 (PIV) Valor de p

Progesterona (ng/mL)

7,9±6,1 8,1±6,3 6,1±5,4

0,51

Testosterona (ng/dL)

7,8±6,6 8,7±11,4 5,1±4,6

0,35

Figura 01: Acompanhamento do trabalho de parto no piquete maternidade.

Figura 02: Fotografia dos kits comerciais de radioimunoensaio para dosagens de

progesterona e testosterona no líquido amniótico nos três grupos.

Figura 03: Fotografia do aparelho para dosagens de proteína total, creatinina, uréia,

glicose, e cloreto no líquido amniótico nos três grupos.

Figura 04: Fotografia do aparelho para dosagens de GGT, sódio e potássio no líqui-

do amniótico nos três grupos.

6. DISCUSSÃO

O valor de PT encontrado nesse experimento foi inferior, nos três grupos,

em relação ao descrito por Kochhar et al. (1997) no liquido amniótico na espécie e-

qüina, no momento do parto, enquanto que Prestes et al. (2001) relataram na espé-

cie ovina, valor semelhante ao do grupo IA e inferior aos grupos PIV e TE.

A creatinina é um dos elementos bioquímicos mais estudados para de-

terminar a maturidade renal do feto e suas variações durante a gestação. Sua pre-

sença é explicada pela simples difusão, por diferença de gradiente entre o cordão

umbilical, mucosa digestiva e mucosa bronquial em ambas as direções. Esta é uma

substância nitrogenada não protéica excretada pela filtração glomerular, ou seja,

com a maturidade renal aumenta sua concentração no líquido amniótico. A determi-

nação da concentração de uréia tem sido usada na avaliação da função renal junta-

mente com a creatinina, tanto em medicina veterinária como humana (HERVEY &

SLATER, 1967; VOTTA, 1975). Os valores médios de creatinina obtidos no grupo IA

e TE foram inferiores aos descritos por Baetz et al. (1976), em bovinos, porém o

grupo PIV apresentou uma concentração média semelhante. Contudo, Prestes et al.

(2001), em ovelhas encontraram resultados inferiores aos descritos nesse experi-

mento. Aidasani et al. (1992), em cabras e Kochhar et al. (1997), na espécie eqüina

encontraram no liquido amniótico, uma concentração de creatinina superior aos des-

critos nos três grupos. Os valores de uréia do grupo de IA foram semelhantes aos

descritos por Prestes et al. (2001), em ovelhas e por Baetz et al. (1976), em bovinos.

Os resultados obtidos tanto para o creatinina quando para a uréia para o grupo PIV

sugerem que os fetos possuíam maturidade renal.

A glicose é o principal açúcar sangüíneo do feto, sendo, portanto a princi-

pal fonte de energia. A maior parte da glicose utilizada pelo feto é fornecida pelas

trocas entre a placenta fetal e a materna. A concentração média de glicose nos três

grupos foi inferior ao valor relatado por Kochhar et al. (1997), na espécie eqüina,

contrariando os achados de Prestes et al. (2001), na espécie ovina, uma vez que os

níveis de glicose nos grupos de PIV, TE e IA do presente trabalho foram superiores.

A ausência de diferença entre os grupos analisados indicam que as trocas materno-

fetais foram semelhantes em relação à passagem de glicose.

A gama-glutamiltransferase (GGT) é uma enzima que encontrada em

grandes concentrações no rim, fígado e pâncreas, participando no metabolismo co-

mo mediadora de várias funções fisiológicas, como os leucotrienos e as prostaglan-

dinas. Em relação à concentração média de GGT, nesse experimento os grupos de

PIV, TE e IA apresentaram maiores valores do que os encontrados por Prestes et al.

(2001), na espécie ovina.

O controle da excreção de sódio e potássio pela urina é regulado pela al-

dosterona produzida pela glândula adrenal fetal, aumentando as concentrações de

potássio e diminuindo as concentrações de sódio na urina, sendo um indicativo da

maturidade renal. A concentração de sódio e cloreto no líquido amniótico dependa

das secreções oronasais do feto durante a gestação (EVRARD et al., 1997). Brace

et al. (2004) encontraram no liquido amniótico de ovelhas, no final da gestação, uma

concentração de sódio superior às concentrações descritas nos três grupos, o mes-

mo pode ser observado no experimento realizado por Evrard et al. (1997), Prestes et

al. (2001) e Gagnon et al. (2002) na espécie ovina e por Kochhar et al. (1997) na

espécie eqüina.

A concentração de potássio descrita por Brace et al. (2004), na espécie

ovina, foi semelhante a do grupo IA, superior a do grupo de TE e menor do que a

concentração do grupo PIV, embora Prestes et al. (2001), na espécie ovina, relata-

ram valor superior aos três grupos. Comparando o valor de potássio encontrado por

Gagnon et al. (2002), no liquido amniótico de feto, no final da gestação na espécie

ovina, o grupo PIV apresentou uma concentração maior, enquanto que os grupos TE

e IA apresentaram concentrações menores, fato similar foi demonstrado por Kochhar

et al. (1997) na espécie eqüina.

A dosagem de cloreto descrita por Brace et al. (2004), na espécie ovina,

foi semelhante ao grupo IA e superior os resultados dos grupos TE e PIV. Contudo

Gagnon et al. (2002), na espécie ovina, encontraram uma menor concentração de

cloreto em relação ao grupo IA, e uma concentração superior aos grupos PIV e TE.

Já no experimento realizado por Prestes et al. (2001), na espécie ovina, o valor de

cloreto foi inferior aos obtidos aos grupos de IA e TE e superior ao grupo PIV contra-

riando os achados de Evrard et al. (1997) que obtiveram valor de cloreto superior

aos três grupos na espécie ovina.

Os valores médios de testosterona encontrados nos três grupos desse

experimento foram inferiores ao descrito por Maia et al. (2004), sendo

51,80±3,62ng/dL para machos e 26,60±5,40ng/dL para fêmeas, apesar de que em

nosso estudo não foi levado em consideração o sexo do produto. Por outro lado a

concentração média de progesterona descrita nesse experimento foi superior a con-

centração relatada por esse mesmo grupo de pesquisadores, 1,3±0,14ng/mL para

machos e 1,5±0,22ng/mL para fêmeas.

7. CONCLUSÕES

As conclusões obtidas em relação à análise bioquímica do líquido amnió-

tico de bezerros no momento do parto foram:

- Uréia e creatinina: comparando-se os três grupos observou-se que o grupo PIV

obteve maiores valores desses dois metabólitos indicando que a maturidade renal

desses produtos está adequada.

- GGT: o grupo 03 apresentou menor valor em relação ao grupo 01. Esta enzima

está relacionada ao metabolismo, podendo-se inferir que a atividade metabólica está

elevada nos animais de PIV.

- Glicose: A glicose oriunda da circulação materna é a principal fonte de energia para

o feto durante uma gestação normal. Como os valores não diferiram entre os grupos,

sugere-se que as trocas materno-fetais foram apropriadas para o fornecimento de

energia ao feto.

- Eletrólitos: o cloreto apresentou menor concentração no grupo 03. O sódio e po-

tássio foram encontrados em maior quantidade no grupo 03 em relação aos demais

grupos.

Não houve diferença entre os grupos estudados para os valores de tes-

tosterona e progesterona.

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