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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Expressão de metalotioneínas e de fator
de crescimento vascular endotelial na
oncogênese experimental da medula
espinhal em ratos
Júlio César Fernandes da Silva
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, para
concorrer ao Título de Doutor, pelo curso de Pós-
Graduação em Ciências Médicas – Área de
concentração: patologia experimental.
Ribeirão Preto
2008
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Expressão de metalotioneínas e de
fator de crescimento vascular endotelial
na oncogênese experimental da medula
espinhal de ratos
Júlio César Fernandes da Silva
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, para
concorrer ao Título de Doutor, pelo curso de Pós-
Graduação em Ciências Médicas – Área de
concentração: patologia experimental.
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Britto Garcia
Ribeirão Preto
2008
Ao meu irmão,
Luiz Henrique Fernandes da Silva “in memoria”
pelo exemplo de dedicação e determinação.
Agradecimentos
Ao amigo e orientador Prof. Dr. Sérgio Britto Garcia pela reiterada
confiança na minha capacidade;
Ao Prof. Dr. Luciano Netter Serafini pelos importantes ensinamentos;
Aos pós-graduandos Aline Turatti, Patrícia Modiano e Vinícius Kannen
Cardoso pela colaboração na execução deste projeto;
À Sra. Rosangela Orlandin Lopes pela esmero e dedicação no seu trabalho;
À Sra. Izilda.Rodrigues Biolante pela sua disposição em colaborar,
À Sra. Neide Terezinha Gonçalves e à Srta. Camila de Luca Zambonini;
atentas aos trâmites necessários ao programa de pós-graduação,
A todos os amigos e pós-graduandos do Departamento de Patologia;
Aos professores e colegas do Departamento de Neurocirurgia pela
colaboração em minha formação;
Aos meus familiares pelo apoio nas minhas empreitadas;
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuiram com a execução
do presente estudo.
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO-------------------------------------------------
01
2
REVISÃO DE LITERATURA------------------------------ 05
2.1 Oncogênese experimental do sistema nervoso central pela N-etil-N-
nitrosourea -------------------------------------------------------------------
06
2.1.1
mecanismo de ação---------------------------------------------------------- 07
2.1.2
modelo experimental de neoplasia intramedular------------------------ 08
2.2 Fator de crescimento vascular endotelial--------------------------------- 10
2.2.1
mecanismos de neovascularização tumoral------------------------------ 11
2.2.2
expressão no sistema nervoso e em neoplasias-------------------------- 13
2.3 Metalotioneínas-------------------------------------------------------------- 15
2.3.1
mecanismos de ação---------------------------------------------------------
18
2.3.2
metalotioneínas no sistema nervoso central----------------------------- 20
2.3.3
metalotioneínas e neoplasias----------------------------------------------- 22
2.3.4
metalotioneínas e células-tronco------------------------------------------ 25
2.4 Gliomas e células-tronco tumorais---------------------------------------- 27
2.4.1
células-tronco neurais------------------------------------------------------- 27
2.4.2
glia radial--------------------------------------------------------------------- 29
2.4.3
células-tronco tumorais----------------------------------------------------- 31
3
OBJETIVO----------------------------------------------------- 34
4
MATERIAIS E MÉTODOS--------------------------------- 36
4.1 Animais e ambiente de experimentação---------------------------------- 37
4.2 Delineamento experimental------------------------------------------------ 37
4.3 Preparo e administração da N-etil-N-nitrosourea----------------------- 38
4.4 Eutanásia e coleta de amostras-------------------------------------------- 39
4.5 Fixação e inclusão----------------------------------------------------------- 40
4.6 Análise histológica--------------------------------------------------------- 40
4.7 Avaliação imuno-histoquímica------------------------------------------- 41
4.8 Reação de imuno-histoquímica para metalotioneínas e fator de
crescimento vascular endotelial-------------------------------------------
42
4.9 Contagem de células – metalotioneínas e fator de crescimento
vascular endotelial----------------------------------------------------------
44
4.10 Análise estatística----------------------------------------------------------- 45
5
RESULTADOS------------------------------------------------- 46
5.1 Duração do experimento--------------------------------------------------- 47
5.2 Peso corporal---------------------------------------------------------------- 47
5.3 Incidência de neoplasias--------------------------------------------------- 50
5.4 Caracterização das neoplasias intramedulares-------------------------- 52
5.5 Análise da expressão do fator de crescimento vascular endotelial--- 52
5.6 Análise da expressão de metalotioneínas------------------------------ 54
6
DISCUSSÃO---------------------------------------------------- 58
7
CONCLUSÕES-------------------------------------------------
70
8
ANEXOS--------------------------------------------------------- 72
9
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS--------------------- 80
10
FONTES CONSULTADAS---------------------------------- 109
SUMMARY------------------------------------------------------------------- 111
Resumo
SILVA, J.C.F. Expressão de metalotioneinas e fator de crescimento
vascular endotelial na oncogênese experimental da medula espinhal em ratos.
2008, 111p. Dissertação de Doutorado – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto –
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
Introdução – Evidências clínicas e experimentais demonstraram que as
metalotioneinas (MT) e o fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) estão
envolvidos na carcinogênese do cólon , fígado e outros órgãos.
Materias e métodos – A expressão de MT, uma proteína de baixo peso molecular
com propriedades anti-oxidantes foi estudada em modelo de carcinogênese
experimental do sistema nervoso através do uso de N-etil-N-nitrosourea (ENU) e
correlacionada com a expressão de VEGF. Os animais foram eutanasiados com
idade de 4 e 24 semanas ou tão logo surgissem sinais de comprometimento
neurológico. Amostras de tecido de medula espinhal normal e de neoplasias
intramedulares foram fixadas em formalina e incluídas em parafina e analisadas e
quantificadas para expressão de MT utilizando anticorpos anti-MT comercialmente
disponíveis. A expressão de VEGF foi analisada em amostras correspondentes e a
marcação dos vasos quantificada.
Resultados – Todas as neoplasias mostraram imunopositividade para VEGF e
MT. Os animais controle não tratados apresentaram baixo número de células MT
positivas nas regiões analisadas. No grupo que recebeu ENU o número de
células MT positivas foi significativamente maior do que nos não tratados. A
marcação imuno-histoquímica para MT nos animais tratados foi observada na
região subpial tanto no núcleo quanto no citoplasma de células de tecido
nervoso aparentemente normal. Nos animais controle a marcação para MT foi
fraca e restrita ao citoplasma
. A administração de ENU resultou em aumento
significativo no número de vasos marcados na região subpial da medula espinhal em
relação aos controles.
Conclusões – Os resultados fornecem evidência que indicam aumento na produção
de MT e VEGF associada ao modelo de gênese de gliomas. O padrão de marcação
encontrado pode estar relacionado com células-tronco mutantes envolvidas no
processo de oncogênese da medula espinhal
Palavras chave: medula espinhal, ENU, glioma, metalotioneína, fator de
crescimento vascular endotelial, neoplasias intramedulares.
1
1 Introdução
2
O surgimento de neoplasia primária no sistema nervoso central é evento
complexo e que implica em interação entre o tipo celular que origina a neoplasia, o
microambiente tumoral e alterações genéticas específicas (Gilbertson & Gutmann,
2007). Tumores originários de células da glia representam as neoplasias primárias
mais comuns do sistema nervoso central (Galderisi et al, 2006).
A maioria das neoplasias intramedulares origina-se de células da glia ou do
epêndima, são mais prevalentes em crianças do que em adultos e representam de
20% a 30% por cento das neoplasias intradurais (Henson et al, 2001). Em linhas
gerais, a resseção cirúrgica permanece como tratamento de escolha para esses
pacientes e a ressecção macroscópica total é o objetivo final do tratamento cirúrgico
(Traul, 2007). Porém, em decorrência da natureza infiltrativa das lesões, da presença
de tecido nervoso normal circunvizinho e de situações freqüentes em que o plano de
clivagem não é nítido, a ressecção macroscópica total pode não ser alcançada em
muitos casos (Kane, et al, 1999). A radioterapia é usada freqüentemente como
tratamento coadjuvante para tumores de alto grau (Sandalcioglu et al, 2005), porém
com eficácia variável. A taxa de sobrevida em dois anos para pacientes com
astrocitomas de alto grau que receberam radioterapia pós-operatória variou de
0%(Chun et al, 1990) até 40% (Linstadt et al, 1989). A sobrevida em dez anos para
pacientes com astrocitomas de baixo grau variou de 40% (Linstadt et al, 1989) até
90% (Shirato et al, 1995). A utilização de quimioterapia é controversa (Parsa et al,
2004). Devido à natureza infiltrativa dessas lesões, à alta taxa de recorrência e as
limitações inerentes às opções de tratamento (Sandler et al, 1992; Townsend et al,
2004), a possibilidade de cura das neoplasias intramedulares é limitada (Bowers &
Weprin, 2003).
3
Existem vários modelos experimentais para neoplasias intracranianas, porém,
no caso das neoplasias intramedulares, eles são relativamente escassos (Caplan et al,
2006). Modelos experimentais com implantação de linhagens de células neoplásicas
conhecidas no parênquima da medula espinhal (Caplan et al, 2006; Salcman et al,
1984; Mavincurve et al, 2005) são particularmente úteis para testes de alternativas
terapêuticas, porém possuem limitações ao estudo das etapas biológicas básicas
durante o desenvolvimento da neoplasia. Por outro lado, a indução de neoplasias pela
utilização de N-etil-N-nitrosourea apresenta similaridades com as neoplasias de
ocorrência espontânea no sistema nervoso central de mamíferos e permite estudos
seqüenciais do desenvolvimento tumoral (Pilkington, 2005).
Com o aprimoramento das técnicas de biologia molecular, muitas alterações
genéticas foram descritas em gliomas (Shapiro, 2001). Mutações, por vezes
sucessivas, e intrincadas alterações moleculares levam ao desenvolvimento neoplásico
que ocorre por etapas, através da iniciação, promoção e progressão da neoplasia
(Rempel, 2001). Evidências recentes provenientes de diferentes grupos de pesquisas
têm apontado que neoplasias do sistema nervoso central têm origem em células com
propriedades progenitoras da neuroglia, apresentando similaridades com células-
tronco neurais (Singh & Dirks, 2007). A região subependimária dos ventrículos
laterais abriga células-tronco neurais e tem sido implicada no surgimento de gliomas
no encéfalo (Sanai et al, 2005), inclusive daqueles experimentalmente induzidos de
localização mais periférica (Vick et al, 1977). Similarmente, células subependimárias
na região do canal central da medula espinhal apresentariam certas propriedades
proliferativas similares às células-tronco (Fu et al, 2003), porém, estudos dos
processos iniciais do surgimento de gliomas da medula espinhal são escassos em
comparação com aqueles de gliomas intracranianos. A caracterização detalhada dos
4
eventos relacionados ao surgimento das neoplasias medulares pode colaborar com o
conhecimento da doença e com o desenvolvimento de novas oportunidades
terapêuticas.
5
2 Revisão da Literatura
6
2.1 Oncogênese experimental do sistema nervoso
central pela N-ethyl-N-nitrosourea
A introdução de compostos nitrosos na oncologia experimental na década de
60 permitiu uma nova era no estudo do desenvolvimento e biologia dos tumores do
sistema nervoso. Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos utilizados previamente
necessitavam ser implantados diretamente no cérebro causando trauma cirúrgico
considerável, inflamação no local do implante e ocasionando distribuição artificial
das neoplasias (Lantos, 1986).
O potencial carcinogênico dos compostos nitrosos foi descoberto na década de
50 com o estudo da dimetil-nitrosoamina (Magee & Barnes, 1956). Os compostos
nitrosos têm estrutura química simples, com radicais R1 e R2 que podem ser
substituídos por diferentes grupos (Fig 1).
Figura 1 – Estrutura química de compostos nitrosos
R
1
R2
N N=O
7
Certas nitrosamidas, particularmente nitrosoureas, possuem forte propensão a
produzir neoplasias no sistema nervoso e cerca de 65 compostos nitrosos com
capacidade para gerar neoplasias de sistema nervoso foram descritos. Esses
compostos são carcinógenos não seletivos e podem ocasionar modificações genéticas
em outros órgãos além do sistema nervoso como mama, fígado, glândulas salivares e
esôfago (Papathanasiou et al, 2005). Dois desses carcinógenos, N-methyl-N-
nitrosourea (MNU) e N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) tornaram-se os carcinógenos de
escolha na oncologia experimental do sistema nervoso (Mennel et al, 2004). Esses
compostos induzem alta incidência de neoplasias preferencialmente no sistema
nervoso, podem ser administrados por diferentes vias e as neoplasias mantêm
similaridades biológicas com as que ocorrem naturalmente em humanos e animais
(Bulnes-Sesma, et al 2002). Porém, enquanto o NMU deve ser administrado aos
animais adultos em doses pequenas e repetidas a ENU possui preferencialmente ação
neonatal ou transplacentária (Silker et al, 2004).
2.1.1 Mecanismo de ação
A ENU causa mutações aleatórias com alteração de um único par de bases por
meio de ação alquilante direta sobre ácidos nucléicos (Justice et al, 1999). Durante a
replicação do DNA, esse par de bases modificado pelo radical “etil” é erroneamente
identificado e ocasiona mutação de ponto (Cordes, 2005). Ocasionalmente, pequenas
deleções podem ocorrer (Shibuya & Morimoto, 1993)
No camundongo as mutações mais freqüentes são transversões “AT-TA” ou
transições “AT-GC”. Sabe-se que a ENU produz alquilação no O
6
da guanina (G) e
no O
2
da timina (T). A guanina (G) alquilada liga-se com uma timina (T) ao invés de
uma citosina (C) durante a fase de replicação. Na próxima replicação a timina (T)
8
ligar-se-á a uma adenina (A), ocasionando uma mutação chamada “GC-AT”
transição. Da mesma forma, a timina alquilada liga-se a outra timina na primeira
replicação ao invés de ligar-se a uma adenina. Como resultado, na segunda
replicação, a timina (T) não alquilada liga-se a uma adenina (A) produzindo uma
transversão “TA-AT” (Cordes, 2005). As células afetadas inibem a replicação
ativando enzimas de reparo como a “O
6
-alkylguanine-DNA-alkyltransferase” que
elimina a O
6
-guanina alquilada. Entretanto, não há enzima de reparo detectada para a
O
2
-timina alquilada, o que implica na geração contínua de transversões (Katayama et
al, 2005).
Os sucessivos ciclos de replicação do DNA durante o desenvolvimento levam a
produção de mutações que afetam a expressão de certos oncogenes, como neu/erb B-
2, Rãs, p53, genes para caspaze 9 (Bulnes-Sesma, et al 2002) e c-kit (Huan et al,
2005).
2.1.2 Modelo experimental de neoplasia intramedular
A ação da ENU sofre influência da dose administrada, da idade do animal, da
via de administração e do estado fisiológico (prenhez). A ENU pode ser administrada
por via endovenosa, intraperitoneal ou subcutânea de acordo com a idade do animal e
com o objetivo do experimento.
A administração de ENU em ratas prenhas até o décimo quinto dia resulta em
baixa incidência de neoplasias e predomino de efeito teratogênico sobre a prole, com
grande incidência de malformação de patas (Duckrey etal, 1966). A susceptibilidade
do sistema nervoso diminui drasticamente com o aumento da idade, de forma que o
acometimento neoplásico do sistema nervoso é menor que dez por cento ao fim do
primeiro mês de vida e no rato adulto o sistema hematopoiético é o mais envolvido
(Lantos, 1986). A administração endovenosa de ENU na dose de 50mg/kg de peso
9
corporal na veia lateral da cauda de ratas Sprague-Dawley no vigésimo dia de
prenhez levou ao surgimento de neoplasias do sistema nervoso central em 100% da
prole. Cinqüenta e dois por cento eram neoplasias intracranianas, e destas, todas
aquelas de localização intra-axial eram gliomas (Koestner et al, 1971). Quando
administrada na segunda quinzena da prenhez de ratas, a ENU apresenta as maiores
incidências de acometimento tumoral do sistema nervoso central com doses de 40 a
80 mg/kg de peso (Martinez et al, 1974).
Em experimento designado para verificar o efeito da idade na oncogênese pela
ENU, foi observado que a maior incidência de neoplasias da medula espinhal ocorreu
com a administração subcutânea no primeiro dia de vida de ratos Wistar na dose de 40
mg/kg de peso corporal (Naito et al, agosto de 1981). Utilizando a mesma dose de
ENU em ratos Wistar no primeiro dia de vida observou-se, após seis meses,
incidência de 64% de tumores intramedulares com discreto predomino da incidência
no segmento torácico da medula espinhal. As neoplasias eram originárias da
substância branca medular e em cerca de 11% delas a classificação histológica não foi
possível e, entre as demais (89%) a quase totalidade foi classificada como
oligodendrogliomas ou ependimomas (Naito et al, fevereiro de 1981). A injeção
intratecal pós-natal de 0,2mg de ENU/animal resultou em neoplasias intramedulares
em 50% dos ratos Wistar tratados (Pfaffenroth & Das, 1979).
A indução transplacentária de neoplasias cerebrais pela ENU ocasionou
inicialmente pequenos focos de células anormais compostos por células pouco
diferenciadas na placa subependimária adjacente aos ventrículos laterais e, os
tumores encontrados de forma tardia mantinham-se preferencialmente adjacentes aos
ventrículos laterais e na substância branca subcortical justa hipocampal (Pilkington
& Lantos, 1979). Foram identificadas neoplasias das linhagens astrocitárias,
10
oligodendrogliais e ependimárias (Lantos & Pilkington, 1979). A exposição intra-
uterina de células precursoras neurais da zona subpendimária à ação da ENU atuou
sinergicamente com anormalidades genéticas específicas para produzir gliomas em
cérebro de ratos adultos (Leonardi et al, 2001), assim como células da zona
subventricular após exposição transplacentária à ENU, tornaram-se imortalizadas em
cultura (Savarese et al, 2005). Por outro lado, a indução de neoplasias
intramedulares pela administração subcutânea de 40mg/kg de peso corporal em ratos
Wistar, do primeiro ao oitavo dia de vida resultou em surgimento de neoplasias na
substância branca e 93% destas foram encontradas na região subpial e classificadas
como oligodendrogliomas. Células gliais imaturas que são encontradas na região
subpial dos ratos neonatos devem ser alvos da carcinogênese induzida pela ENU
(Naito et al, 1984).
2.2 Fator de crescimento vascular endotelial
O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) foi inicialmente descrito
como um fator de permeabilidade vascular secretado por neoplasias (Senger et al,
1983). Após a purificação e seqüenciamento, foi descoberta a capacidade de induzir
a formação de novos vasos sangüíneos (Ferrara & Henael, 1989).
O VEGF, ou VEGFA, é uma proteína de 46 kDa (Robinson & Stringer 2001)
que pertence a uma família de fatores de crescimento que inclui o fator de
crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento placentário e os
homólogos do VEGF que são os fatores VEGF B, C, D e E ( McDonald &
11
Hendrickson, 1993). O gene que codifica o VEGF encontra-se no cromossomo
6p21.3 (Vicente t al, 1996).
O VEGF liga-se a dois receptores do tipo tirosina-quinase, VGEFR1 e
VEGFR2 respectivamente. O VEGFR2 é o principal mediador dos efeitos do VEGF
sobre a permeabilidade vascular, mitose das células endoteliais e angiogênese
(Brockington, 2004).
Desde a descoberta do VEGF, grande quantidade de informação foi produzida
sobre sua importância durante o desenvolvimento do embrião e na promoção de
angiogênese em numerosas situações de doença. Sua ação foi explicitada em
situações variadas como crescimento tumoral, artrite reumatoide, psoriase e
retinopatia diabética (Brockington et al, 2004).
Os principais fatores que regulam a neovascularização tumoral são o fator de
crescimento vascular endotelial (VEGF) e o fator de crescimento de fibroblastos
(FGF) (Cross & Claesson-Welsh, 2001). Os mecanismos pelos quais o VEGF atua
incluem o estímulo para a proliferação e sobrevivência de células endoteliais,
estimulo para a formação de estruturas vasculares, vasodilatação dependente do
óxido nítrico e aumento da permeabilidade vascular (Ferrara et al, 2003).
2.2.1 Mecanismos de neovascularização tumoral
A vasculatura de tecidos normais não é capaz de dar suporte ao crescimento de
tumores com mais de dois milímetros de diâmetro (Folkman, 2001), de maneira que
a formação de novos vasos sangüíneos é necessária para o desenvolvimento do
tumor, para a sua capacidade de invadir os tecidos adjacentes e originar metástases.
As células endoteliais no adulto são, em geral, quiescentes com exceção da
vasculatura endometrial durante o ciclo menstrual (Hider & Stancel, 1999).
12
O processo de angiogênese é regulado por receptores na superfície da célula e
por fatores extracelulares. Essas características fazem da neovascularização tumoral
um interessante alvo para tratamento antitumoral, já que, a princípio, drogas que
interfiram com a neovascularização tumoral não necessitariam de captação
intracelular (Conti, 2002).
A neovascularização tumoral ocorre através da coaptação de vasos
circunvizinhos ao tumor, da angiogênese propriamente dita e por meio de estímulos
que mantêm a angiogênese. Esses mecanismos são influenciados pelo tipo de
neoplasia, pelo estágio de desenvolvimento do tumor e a pela localização da
neoplasia (Conti et al, 2002).
A coaptação de vasos sangüíneos circunvizinhos foi demonstrada através de
modelos experimentais (Holashi & Maisonpierre, 1999) e é um mecanismo relevante
no crescimento dos linfomas. A neoplasia é capaz de utilizar vasos sangüíneos de
tecidos normais para o seu crescimento inicial, porém quando a neoplasia atingir
tamanho crítico esses vasos serão insuficientes para manter o tumor. Esse mecanismo
é possivelmente irrelevante para a maioria dos tumores sólidos visto que eles
crescem como uma massa, enquanto nos linfomas as células são capazes de guiar sua
proliferação pelos vasos existentes (Conti, 2002).
Vasculogênese é o mecanismo pelo qual os vasos são formados no embrião.
Células precursoras hematopoiéticas agrupam-se de forma que aquelas localizadas
centralmente originam hemácias e as periféricas diferenciam-se em células
endoteliais (Risau & Flamme, 1995). Células precursoras da medula óssea alcançam
a neoplasia através da circulação e dão origem a processo similar em modelo
experimental, porém a importância desse mecanismo em tumores de humanos não é
conhecida (Asahara, 1999).
13
A angiogênese é o processo essencial para a neovascularização tumoral e é
induzido quando existe desequilíbrio entre os fatores pró-angiogênicos e anti-
angiogênicos. Esse desequilíbrio pode ocorrer por hipóxia, e é mediado pelo fator de
transcrição induzido pela hipóxia ou HIF (Pichiule et al, 2003) ou por mutações que
ativem oncogenes e inativem genes supressores de tumor (Rak et al, 2000). Células
endoteliais ativadas degradam a matriz extracelular, migram através da matriz e
proliferam. As novas células organizam-se em tubos que se anastomosam para
formar capilares (Risau, 1997).
2.2.2 Expressão no sistema nervoso central e em
neoplasias
Em células endoteliais de roedores adultos, a expressão de VEGFR1 e
VEGFR2 ocorre em níveis muito inferiores aos encontrados durante o
desenvolvimento embrionário (Breier et al, 1992). O VEGF é fortemente expresso no
cérebro do rato adulto no epêndima ventricular, no plexo coróide e também é
expresso em células da glia e neurônios da medula espinhal e do encéfalo (Monacci
et al, 1993). Adicionalmente, a hipóxia resulta em aumento na expressão do VEGF
em neurônios e células da glia, principalmente no córtex e hipocampo do rato adulto
(Pichiule, 2003; Brockington, 2004). O padrão de expressão de VEGF no sistema
nervoso de roedores adultos varia consideravelmente e esse fato pode ocorrer devido
a utilização de diferentes técnicas laboratoriais para avaliar a expressão do VEGF
(Millauer et al, 1994; Lee et al, 1999).
Os mecanismos de angiogênese e permeabilidade nos tumores cerebrais têm
recebido grande atenção, pois a extensão do edema vasogênico peritumoral e o grau
de vascularização são relacionados com a morbidade e mortalidade de neoplasias
14
malignas e de algumas neoplasias benignas do sistema nervoso central (Jain, 2007).
O VEGF é expresso em muitas neoplasias primárias do sistema nervoso, mas a
maioria das investigações dedicou-se aos padrões de expressão em gliomas,
meningeomas e hemangiomas (Machein & Plate, 2000). A expressão de VEGF foi
identificada também em adenomas de hipófise, germinomas (Nishikawa et al, 1998),
neuroblastomas (Meister et al, 1999) e neoplasias metastáticas (Strugar et al, 1994).
A proteína VEGF é detectada nas células tumorais que produzem RNAm para
VEGF, porém a maior quantidade da proteína é detectada na vasculatura.
Provavelmente o VEGF que é secretado pelas células tumorais liga-se aos receptores
presentes no endotélio estimulando a angiogênese por mecanismo parácrino (Plate et
al, 1994).
Análise por meio de técnica de hibridização “in situ”, mostrou que RNAm para
VEGF é encontrado em nível muito baixo no cérebro normal, aumentado nos
gliomas de baixo grau e apresenta aumento significativamente maior nas células
tumorais ao redor de áreas necróticas em gliobastomas multiforme (Plate et al, 1994).
A expressão de RNAm para VEGF no gliobastoma supera em 50 vezes aquela
encontrada em tecido cerebral normal (Plate et al, 1992). A hipótese para explicar a
ausência de proliferação vascular em astrocitomas de baixo grau (Strugar et al, 1995)
é que embora ocorra aumento da expressão do VEGF, os receptores das células
endoteliais podem não ser expressos (Machein et al, 2000). Foi observada forte
expressão de VEGF em ependimomas (Pietsch et al, 1997) e em oligodendrogliomas
a imunoreatividade para VEGF foi encontrada em 91% dos casos, porém com
marcação mais intensa nos casos de grau III pela classificação da “World Healthy
Organization” (Christov et al, 1998). Entretanto, a imunorreatividade em
15
oligodendrogliomas não foi confirmada por outro grupo de pesquisadores
(Nishikawa et al, 1998).
A administração intraperitoneal de 50mg/kg de peso corporal de ENU em ratas
Sprague-Dawley no décimo-quinto dia de prenhez foi realizada com a finalidade de
estudar o papel do VEGF nos estágios iniciais de gliomas encefálicos induzidos pela
ENU. Os tumores mostraram marcação imuno-histoquímica para VEGF, mesmo
naqueles menores de 1 mm (Yoshimura et al, 1998). Inferiu-se que a produção de
VEGF pelas células do tumor pode levar a indução da angiogênese e formação de
microvasos, permitindo o estabelecimento da neoplasia e fornecendo nutrição para a
multiplicação das células neoplásicas (Yoshimura et al, 1998; Okimoto et al, 1997).
Adicionalmente, fatores de crescimento de vasos, como o VEGF, são capazes de
afetar “in vitro” a capacidade de células de gliomas migrarem e invadirem (Chicoine
et al, 1995), assim como a migração de células de glioma é fortemente associada ao
processo de angiogênese induzida pelo glioma “in vivo” (Vajkoczy, 1999).
2.3 Metalotioneínas
As metalotioneínas (MT) foram descritas pela primeira vez em 1957 em rins de
eqüinos como proteínas com alta afinidade ao cadmium (Margoshes & Vallee, 1957).
A denominação de metalotioneína passou a ser utilizada a partir de 1960 devido a
alta afinidade dessa proteína por metais e, em 1966, foi isolada em tecido humano
(Miles et al, 2000). Metalotioneínas (MT) são proteínas com peso molecular que
varia de 61kDa até 69kDa, ricas em cisteína e que possuem alta afinidade por íons
divalentes de metais pesados (Thirumoorthy et al, 2007). Em humanos, são
codificadas por uma família de genes localizada no cromossomo 16q13 (West et al,
16
1990) que origina cerca de dez isoformas funcionais habitualmente divididas em
quatro grupos: MT-1, MT-2, MT-3 e MT-4 (Kagi & Schaffer, 1988). Enquanto um
único gene, MT-2A codifica a proteína MT-2, os diversos subtipos da proteína MT-1
são conseqüência do envolvimento de vários genes - MT-1A, MT-1B, MT-1E, MT-
H, MT-F e MT-X (Kagi & Schaffer, 1988). É muito provável que os diferentes genes
codifiquem proteínas com características funcionais específicas para cada etapa do
desenvolvimento embrionário ou condição fisiológica específica (Thirumoorthy et al,
2007).
Os grupos MT-1 e MT-2 podem ser distinguíveis pelas cargas elétricas,
enquanto MT-3 e MT-4 são encontrados em topografias específicas (Cloug et al,
1986). As isoformas MT-1 e MT-2 estão presentes no citoplasma e no núcleo de
grande variedade de células normais e são abundantes em astrócitos (Aschner, 1996).
A MT-3 é expressa em neurônios, ausente nas células da glia (Maier et al, 1997) e,
em quantidades menores, é presente no pâncreas e intestino (Ebadi et al, 1995). A
forma MT4 é encontrada em epitélio escamoso estratificado (Quaife et al, 1994). A
resposta das formas MT-3 e MT-4 aos glicocorticóides, metais pesados, endotoxinas
sistêmicas e mediadores de estresse é pobre, quando comparada às formas MT-1 e
MT-2 (Palmiter et al, 1992).
A maioria dos tecidos de mamíferos adultos contém níveis basais de
metalotioneínas que variam de acordo com o tipo de tecido e com a idade do animal.
A metalotioneína hepática possui alto conteúdo de zinco e cobre, enquanto a renal
contém cádmio, cobre e zinco (Cherian et al, 2003). É bem documentado que
metalotioneínas existem em grande quantidade e estão ligadas ao cobre e ao zinco no
fígado de mamíferos durante o período embrionário e no período pós-natal imediato
(Clough et al, 1986; Panemangarole et al, 1983). A metalotioneína pode, desta forma,
17
apresentar papel temporário como reservatório de metais essenciais durante o
desenvolvimento fetal. Em indivíduos adultos, a metalotioneína é essencialmente
uma proteína encontrada no citoplasma, embora no período fetal e neonatal seja
detectada também no núcleo celular (Chan & Cherian, 1993).
As formas MT-1 e MT-2 são expressas em resposta a ampla gama de
mediadores de estresse incluindo interleucina 1, interleucina 6, fator de necrose
tumoral, radicais livres, esteróides, lipopolissacarídeos, catecolaminas, metais
pesados (Kägi, 1991) e óxido nítrico (Arizono et al, 1995). Estímulos diversos como
herbicidas, solventes, exercício físico intenso, exposição ao frio também levam ao
aumento da expressão de metalotioneínas (Miles et al, 2000). A síntese das
metalotioneínas estimulada pela dexametasona ou pelo zinco em sua forma iônica
alcança o máximo em cinco ou seis horas e após a remoção desses agentes
estimuladores é degradada de maneira bifásica com meia vida de 12 horas e 38 horas
respectivamente. Adicionalmente a presença constante de zinco ou dexametasona é
responsável pela manutenção da produção de metalotioneínas, e a inibição da
degradação de metalotioneínas por meio da inibição da poliadenilação resulta em
síntese prolongada (Karin et al, 1981). Assim, a indução da produção de
metalotioneínas pela presença prolongada de patógenos ou pela inibição da
poliadenilação pode resultar em envolvimento com processos crônicos de doença
(Simpkins, 2000).
O processo de degradação não é bem compreendido, mas depende da
localização intracelular da metalotioneína e do tipo de tecido envolvido (Mile et al
2000). È conhecido que a degradação lisossomal ocorre de maneira mais eficiente
que a citosólica (Hahn et al, 2001).
18
O papel da metalotioneína e suas isoformas na homeostase não é bem
determinado. Camundongos com deleção dos genes para expressão de
metalotioneínas (camundongos “knockout”) apresentaram apenas aumento no apetite
e discreto aumento no peso corporal, sem evidências de quaisquer outras alterações
(Beattie er al, 1998). Porém, em situações de estresse diversas como exposição aos
metais pesados (Klaassen & Liu, 1998) e estresse oxidativo (Schwarz et al, 1994), a
conseqüente resposta de aumento na produção de metalotioneínas foi relacionada a
aumento na sobrevida dos ratos normais quando comparados aos ratos“ knockout”.
2.3.1 Mecanismos de ação
Os mecanismos pelos quais as metalotioneínas são envolvidas na resposta ao
estresse não são totalmente esclarecidos, porém evidências sugerem alguns processos
nos quais as metalotioneínas participam e que podem estar envolvidos em situações
de doença (Simpkins, 2000).
As espécies reativas de oxigênio são produzidas continuamente durante o
metabolismo aeróbio. O óxido nítrico (NO) atua na manutenção da permeabilidade
vascular (Murad, 1998; Munzel et al, 1997) e juntamente com o radical peróxido
(O
2
¯) influi na regulação do diâmetro das vias aéreas (De Boer et al, 1998) e
sinalização entre plaquetas (Schaeffer et al, 1999). Em condições adversas ou durante
a invasão de um agente patogênico, esses mediadores e seus metabólitos mais
reativos, peróxido nitrito (-OONO) e radical hidroxila (-OH) são produzidos em
larga escala e proporcionam efeitos benéficos como atividade bactericida (Hampton
et al, 1996; Johnson & Biliar, 1998). Quando ocorre desequilíbrio entre a produção
de espécies reativas de oxigênio e os antioxidantes endógenos surgem efeitos
deletérios. Esses mediadores gasosos e seus derivados reagem com a camada dupla
19
de lipídeos das membranas celulares e das organelas intracelulares (Munzel et al,
1997), com moléculas metabolicamente ativas (Kronche et al, 1994) e com fatores de
transcrição contendo cisteína (Squadrito & Pryor, 1998) e causam danos ao DNA
(Thirumoorthy et al, 2007). Desta forma, a liberação inapropriada ou excessiva dos
mesmos pode levar à morte celular, aberrações cromossômicas e câncer. As
metalotioneínas reagem com esses mediadores gasosos com a formação de um
complexo irreversível ou então reagem reversivelmente, liberando metais da
molécula de metalotioneína e formando apometalotioneína oxidada (Thornalley &
Vasak, 1985; Plonka et al, 1982). A isoforma MT-1 é a forma mais ativa no
decréscimo das espécies reativas de oxigênio com especial afinidade pelo radical
hidroxila (Kumari et al, 1998). Sob condições de estresse oxidativo, o aumento na
produção de metaliotioneínas e a afinidade da mesma pelos radicais peróxido (O
2
¯) e
hidroxila (-OH) podem levar a diminuição dos radicais livres e, portanto, diminuir o
dano às enzimas intracelulares e aos tecidos (Simpkins, 2000). A reação da
metalotioneína com O
2
¯ e –OH ocasiona a liberação do metal a ela ligado.
A apometalotioneína (apoMT), que é o produto de transcrição do gene MT na
forma livre de metais, possui alta afinidade pela ligação com metais pesados
formando pontes através da cisteína presente em sua fórmula. As metalotioneínas
possuem alta afinidade para zinco e cobre que são metais abundantes e
biologicamente essenciais no meio intracelular (Nordberg & Nordberg, 2000). Além
disso, ligam-se aos elementos traço como cadmium, mercúrio, platina e prata (Kondo
et al, 1995). As metalotioneínas podem atuar como quelantes de metais pesados
quando esses estão presentes em excesso (Kaji, 1991) e o aumento de expressão
resulta em proteção adicional contra o envenenamento por metais pesados (Klaassen
& Liu, 1997). A habilidade da apoM em aceitar metais pesados de fatores de
20
transcrição e metaloenzimas (Nartey et al, 1987) e cedê-los para outra moléculas
biologicamente ativas pode permitir atuação na redistribuição intracelular de zinco e
outros metais (Vallee, 1995; Kondo 1995). O nível basal de metalotioneínas
intracelular em células normais é, em geral, associado à desintoxicação por metais
pesados (Thirumoorthy et al, 2007) e dieta deficiente em zinco, em ratos, ocasionou
prejuízo da atividade da metalotioneína em determinadas regiões do cérebro (Giralt
et al, 2000).
2.3.2 Metalotioneínas no sistema nervoso central
MT-1 e MT-2 são expressas predominantemente em células da glia, como
astrócitos da substância branca, porém podem ser expressas em qualquer outra
localização e tipo celular no cérebro e medula espinhal (Penkiwa, 2006). Sugere-se
que possam atuar como moduladores do metabolismo de metais pesados no sistema
nervoso central e fornecer proteção ao estresse oxidativo causado por metais pesados
(West et al, 2004). O aumento da expressão de MT-1 em neurônios “in vitro” exerceu
efeito protetor contra o estresse oxidativo induzido pelo paraquat (Taylor et al, 2004)
e atenuou os efeitos do estresse oxidativo em modelo experimental de doença de
Parkinson e em cultura de neurônios dopaminérgicos (Ebadi & Sharma, 2006).
MT-1 e MT-2 reduzem a ativação e recrutamento de monócitos, macrófagos e
linfócitos T no cérebro em diversas condições patológicas, exercendo atividade anti-
inflamatória (Stankovic et al, 2007). O aumento da expressão de metalotioneínas tem
apresentado efeitos benéficos em modelos experimentais de esclerose múltipla
(Puttaparthi et al, 2002) e encefalomielite auto-imune (Penkowa & Hidalgo, 2003), e
a expressão de metalotioneínas é reduzida em modelo animal de esclerose lateral
21
amiotrófica (Gong & Elliot, 2000). Esse efeito pode ser mediado pela inibição de
linfócitos T CD4+ pela MT-1 e MT-2 (Stankovic et al, 2007).
A redução de danos ao tecido cerebral e a diminuição da morte de células,
assim como a angiogênese e o efeito reparador no dano cerebral têm sido relatados
em vários estudos (Chung et al, 2008). MT-1 e MT-2 foram caracterizadas como
agentes neurotróficos, aumentado a sobrevida de neurônios e a regeneração axonal
em culturas de neurônios corticais, do hipocampo ou dopaminérgicos (Chung et al,
2003) e a ausência afetou a capacidade reparadora do cérebro após lesão cortical
induzida pelo frio (Penkowa, et al, 1999). Adicionalmente, apresentaram efeito
benéfico na regeneração axonal após lesão experimental do nervo ciático (Ceballos et
all, 2003).
A isoforma MT-3 foi isolada pela primeira vez como Fator Inibidor de
Crescimento (“growth inhibiting factor”) em neurônios cerebrais (Uchida et al, 1991).
O significado funcional da MT-3 não é bem estabelecido na literatura e dados
divergentes foram relatados pelos pesquisadores (Stankovic, 2007). Há evidências de
que seu efeito sobre o estresse oxidativo e apoptose são mínimos ao contrário das
formas MT-1 e MT-2 (Penkowa et al, 2006). MT-3 é particularmente abundante em
neurônios hipocampais e sua expressão é reduzida em modelos de doença de
Alzheimer (Aschner, 1996) de maneira que o papel das metalotioneínas na
neuromodulação dos eventos que levam ao estabelecimento da doença de Alzheimer
(Hidalgo et al, 2001) necessita ser melhor estabelecido. Existem evidências de que a
MT-3 aumenta a produção de VEGF em células endoteliais do cérebro de forma
indireta, através do aumento da estabilidade do fator induzido por hipóxia 1α - HIF-
1α (Kim et al, 2008).
22
2.3.3 Metalotioneínas e neoplasias
A metalotioneína é detectada em neoplasias de localização variada por meio de
técnicas imuno-histoquímicas (Cherian et al, 2003). A expressão de metalotioneínas
foi identificada em neoplasias de tireóide (Nartey et al, 1987), testículos
(Kontozoglou et al, 1989), fígado (Deng et al, 1998), glândula salivar (Alves et al,
2007), mama (Schmid et al, 1993), próstata (Moussa et al, 1997), cólon (Ioashin,
1999), ovário (Murphy et al, 1991) e de origem glial (Hiura et al, 1998), dentre
outros (Cherian et al, 2003).
A expressão de metalotioneínas em células neoplásicas foi correlacionada com
resistência ao tratamento quimioterápico (Satho et al 1994). A resistência aos
quimioterápicos foi identificada no seguimento clínico de pacientes com neoplasia de
ovário (Germain et al, 1996), em experimentos laboratoriais e em células em cultura
(Bakka el al, 1981). As metalotioneínas têm sido consideradas como potenciais
marcadores com importância prognóstica no carcinoma ductal invasivo da mama
(Schimid et al, 1993), melanoma (Zelger et al, 1992; Weinlich et al, 2006), pâncreas
(Ohshio et al, 1996) e cérvix uterino (McCluggage , et al, 1998). A maior parte dos
estudos aponta a expressão de MT como fator de pior prognóstico, em geral
relacionada aos tumores de maior grau, ainda que existam dados divergentes
(Cherian et al, 2003).
Os mecanismos moleculares propostos para explicar a indução de
quimiorresistência em tumores são variados. As metalotioneínas podem atuar como
“doadoras” de zinco para diversos fatores de transcrição envolvidos na oncogênese e
farmacorresistência (Cherian et al, 2003) como, por exemplo, o fator de transcrição
Sp1 (Zeng et al, 2004). Existe correlação significativa entre a expressão de
metalotioneína e expressão do gene p53 no carcinoma de pequenas células do
23
pulmão (Joseph et al, 2001). A metalotioneína é capaz de modular a transcrição do
gene p53 “in vitro” através de sua atividade como agente quelante de zinco (Meplan
et al, 2000). O aumento de expressão de metalotioneínas em células tumorais induz
efeitos antiapoptóticos (Shimoda et al, 2003) e a ausência de metalotioneínas em
células incapazes de produzi-la (“null cells”) aumenta a susceptibilidade de morte
celular por apoptose após exposição a certas drogas anticâncer (Kondo et al, 1995).
A capacidade da metalotioneína de ligar-se às espécies reativas de oxigênio, por sua
vez, reduziria a possibilidade de dano ao DNA da célula, e também seria fator de
resistência às terapias coadjuvantes, pois a geração de radicais livres é, entre outras,
conseqüência de radioterapia e quimioterapia. Assim, o aumento da expressão de
metalotioneína reduziria o risco de apoptose induzida por lesão oxidativa induzida
pela quimioterapia (Thirumoorphy et al, 2007).
O papel da metalotioneína no desenvolvimento de quimiorresistência
permanece controverso. A metalotioneína tem efeito protetor para as células tumorais
de diferentes órgãos, porém existem estudos que não dão suporte a essa
possibilidade. Entretanto, as metalotioneinas são apenas um dos fatores envolvidos
no complexo e multifatorial mecanismo de quimiorresistência, de forma que é difícil
estabelecer inequivocamente essa relação nos pacientes com câncer (Thirumoorphy
et al, 2007).
Durante o processo de oncogênese, agressões ao DNA da célula e demais
estímulos para o surgimento da neoplasia somam-se e a acumulação dessas lesões
leva a alteração de função de vários ou de um único gene e pode resultar na expansão
clonal da célula afetada. Porém, nem todas as células submetidas aos estímulos
oncogênicos durante a fase de iniciação e o período de latência originariam
neoplasias, e a grande parte desaparece espontaneamente. Esse é um processo
24
dinâmico no qual a regulação da atividade gênica ocorre não somente na fase inicial
do processo, mas pode intervir ativamente e alterar o curso da doença (Jin et al,
2002). Certas proteínas como a alfa-fetoproteína são normalmente expressas no
período embrionário e fetal e, ocasionalmente voltam a ser expressas em algumas
células tumorais. A presença dessas proteínas em tumores pode ser relacionada com
a origem embrionária do tumor e dessa forma podem ser usadas como marcadores
(Cherian et al, 2003).
O aumento da síntese de metalotioneínas em tecidos que se proliferam
rapidamente sugere papel significativo na proliferação celular e na carcinogênese
(Jin et al, 2002). A metalotioneína é detectada no núcleo de células de mamíferos no
período fetal ou pós-natal (Chan & Cherian, 1993) e, no individuo adulto, passa ser a
encontrada predominantemente no citoplasma das células (Cherian et al, 2003).
Porém, sob certas condições como proliferação e diferenciação celular, a
metalotioneína é encontrada novamente no núcleo celular (Cherian & Apostolova,
2000). A indução da transcrição de metalotioneínas e mudanças no padrão de
localização (citoplasmático ou nuclear) durante a proliferação e diferenciação celular
podem ser esperadas em situações em que exista proliferação celular anormal, como
é o caso em neoplasias. Diversos tumores apresentam mudanças no padrão
intracelular de localização de metalotioneínas (Cherian et al, 2003). A análise imuno-
histoquímica para detecção de metalotioneínas em neoplasia de tireóide mostrou que
31 neoplasias, benignas ou malignas, em um total de 34 examinadas apresentavam
mudança no padrão de expressão da metalotioneína em relação ao tecido normal da
tireóide, passando a ser localizada no citoplasma e no núcleo das células tumorais
(Nartey et al, 1987). Desta maneira, estímulos que ocasionam o surgimento de
neoplasias podem acarretar mudanças no padrão de localização intracelular de
25
metalotioneína, tornando-se semelhante ao padrão de localização intracelular
relatado na vida fetal e pós-natal imediata.
Alguns estudos foram realizados com objetivo de determinar a expressão de
metalotioneínas em gliomas e a relação dessa expressão com fatores de prognóstico e
resposta à quimioterapia. A expressão de metalotioneínas em gliomas de alto grau foi
significativamente maior do que em gliomas de menor grau (Mayer et al, 1997;
Florianczyk et al, 2005) e o aumento ocorreu predominantemente nas subfrações
mitocondriais e nuclear na comparação entre astrocitomas (grau II WHO) e
glioblastomas multiforme (Florianczyk et al, 2003). O aumento da expressão de
metalotioneínas correlacionou-se com o aumento do grau de neoplasias astrocitárias
e notou-se tendência de aumento concomitante de ki-67 (Hiura et al, 1998). Houve
também diferença estatísticamente significativa da sobrevida a favor daqueles
pacientes com astrocitoma anaplásico que não expressaram metalotioneínas (Hiura et
al, 1998). Por outro lado, entre ependimomas, o aumento na expressão de
metalotioneínas foi maior nos tumores de baixo grau e a expressão de metalotioneína
foi maior entre os casos pediátricos do que nos adultos os quais sabidamente têm
melhor prognóstico (Korshunov et al, 2000). Porém, a correlação entre expressão de
metalotioneinas e agressividade da neoplasia em grupo heterogêneo de neoplasias
cerebrais primárias não foi detectada por outros autores (Korshunov et al, 2000).
2.3.4. Metalotioneínas e células-tronco
O mecanismo básico que leva a transformação maligna no cólon é a mutação
somática de células-tronco. Pouco após estímulo que leve a mutação, as criptas
afetadas apresentam células com o fenótipo normal e células com o fenótipo mutante
simultaneamente e, com o decorrer do tempo, todas as criptas afetadas serão
26
compostas apenas do fenótipo mutante que envolverá todas as células da cripta.
Assim, mutação em um gene da célula-tronco, cujo produto de transcrição possa
levar a alteração fenotípica identificável, poderá caracterizar um marcador de
células-tronco (Cook et al, 2000).
A imunorreatividade para metalotioneína é evento detectado em
adenocarcinoma de cólon em humanos. (Ioachim et al, 1999). Foi observado que em
tecido colônico normal de pacientes com câncer de cólon existia marcação imuno-
histoquímica para metalotioneína restrita a algumas criptas (Jasani et al, 1998). Em
modelo experimental em camundongos, observou-se que após a administração do
carcinógeno dimetilhidrazina ocorria o surgimento de marcação imuno-histoquímica
restrita a algumas criptas do cólon (Jasani et al, 1998). A imunopositividade restrita à
cripta para metalotioneina em cólon foi validada como marcador de célula-tronco
mutante em modelo experimental de focos de criptas aberrantes (Donelli et al, 2005)
e na comparação com expressão de glicose-6-fostato-desidrogenase (Cook et al,
2000).
O aumento da expressão de metalotioneínas foi verificado no câncer
gástrico, ocorrendo na metaplasia e displasia intestinal, assim como na mucosa
gástrica de parentes em primeiro grau de pacientes com câncer gástrico. A
expressão de metalotioneínas pode ter relação com o processo inicial de
transformação maligna na mucosa gástrica (Ebert et al, 2000). Evidências também
sugerem que a metalotioneína é expressa durante os estágios iniciais do carcinoma
hepatocelular (Chakraborty et al, 2007).
27
2.4. Gliomas e células tronco-tumorais
O conceito de que não havia gênese de novas células no sistema nervoso
central em indivíduos adultos influenciou profundamente o entendimento e os
estudos do desenvolvimento de tumores primários. A descoberta de que novos
neurônios e células da glia são produzidos durante a vida toda a partir de célula-
tronco neurais possibilitou que novas células fossem elegíveis como possíveis fontes
de neoplasias (Vescovi et al, 2006). Assim, os mecanismos genéticos e celulares que
controlam a neurogênese no adulto podem contribuir para a gênese de tumores e
fornecer novos alvos para a terapêutica.
2.4.1 Células-tronco neurais
Estudos na década de noventa oriundos de diversos laboratórios foram
categóricos em afirmar que novos neurônios são gerados no indivíduo adulto,
inclusive no cérebro humano (Galderisi et al, 2005). Refutou-se a idéia de que a
gênese de neurônios era restrita ao período embrionário e neonatal imediato (Gage,
2000; Reynolds & Weiss, 1992).
Essas células são auto-renováveis, de forma que um “pool” de células-tronco
neurais é mantido ao longo do tempo, e isso implica em equilíbrio entre proliferação,
diferenciação e morte celular. Possuem capacidade primordial de dar origem a
variedade de células diferenciadas (Galderesi et al, 2005).
O modelo “in vitro” mais difundido para o estudo da neurogênese é baseado na
cultura de neuroesferas. Células isoladas do sistema nervoso central no período
embrionário, neonatal ou de indivíduos adultos podem crescer e proliferar em
suspensão, levando ao surgimento de agregados celulares clonais denominados
neuroesferas (Gage, 2000). Esses agregados celulares podem ser dissociados e
28
células individuais são capazes de produzir progérie diferenciada, de maneira que
neuroesferas mantêm capacidades de se auto-renovar e de se diferenciar em
neurônios, astrócitos e oligodendrócitos (Galderisi et al, 2005).
As células-tronco neurais e glia radial representam uma continuação da
linhagem das células embrionárias multipotenciais e podem exibir proteínas
expressas durante o desenvolvimento cerebral e durante a diferenciação da neuroglia
(Pollard & Conti, 2007; Gilbertson & Gutmann, 2007). Apesar de não existir
marcador que seja específico da célula tronco neural normal (Sanai & Berger, 2008)
marcadores imuno-histoquímicos têm sido úteis para determinar o comportamento
biológico destas células. Dentre os anticorpos utilizados para detectar populações de
células-tronco e determinar a diferenciação em células-tronco neurais estão CD 133,
nestina, CD44 e Mushashi-1 (Pilkington, 2005).
As células-tronco neurais no cérebro de mamíferos adultos localizam-se
primariamente no giro denteado do hipocampo e na zona subventricular e, desta
podem migrar para o bulbo olfatório (Taupin, 2006). Na medula espinhal foram
identificadas primariamente em localização subependimária pericanal central (Okano
et al, 2005).
Nas zonas subventricular dos ventrículos laterais e subgranular do hipocampo,
as células progenitoras neurais se agrupam em estruturas denominadas “nichos” de
maneira que a capacidade de geração de neurônios é limitada a estas estruturas
(Riquelme et al, 2008). Células do epêndima estabelecem o limite com o líqüido
cefalorraquidiano, e as células que compõe os nichos têm características ultra-
estruturais e inumo-histoquímicas de linhagem astrocitária (Doetsche, 2003). Existe
discussão se algumas das células da glia radial deixariam de ser diferenciadas em
astrócitos no período pós-natal e seriam mantidas como células-tronco neurais no
29
interior dos nichos (Merkle et al, 2004). A gênese de neurônios ocorre em
proximidade com vasos sanguíneos (Palmer et al, 2000) e evidências sugerem que as
células endoteliais possuem papel crítico na regulação da auto-renovação das células
do nicho e coordenação da neurogênese (Riquelme et al 2008). Por fim, a matriz
extracelular cria um microambiente favorável e organiza a arquitetura do nicho
(Riquelme et al, 2008).
O microambiente ao redor da célula-tronco estabelece inter-relações que
auxiliam a dirigir o comportamento e diferenciação das mesmas (Kulbatski et al,
2007). Células-tronco neurais de diferentes regiões têm capacidades proliferativas
distintas e capacidades diferenciadas de gerar tipos celulares diversos, como
neurônios, astrócitos e oligodendrócitos (Gilbertson & Gutmann, 2007).
Neuroesferas derivadas da região subependimária pericanal central da medula
espinhal de ratos adultos originam preferencialmente células da glia radial e
oligodendrócitos, além de novas neuroesferas, neurônios e astrócitos. Neuroesferas
originárias da substancia branca da medula espinhal de ratos adultos originaram
apenas precursores restritos à glia (Klbatski et al, 2007). Células subependimárias
com marcação para nestina da região pericanal central de ratos adultos proliferam-se
vigorosamente após lesão traumática da medula espinhal e migram para o local da
lesão diferenciando-se em astrócitos e não em neurônios ou oligodendrócitos (Okano
et al, 2005).
2.4.2 Glia Radial
Células neuroepiteliais são as primeiras células precursoras do tecido nervoso
durante a embriogênese e as células da glia radial são o primeiro fenótipo que se
diferencia do neuroepitélio (Mc Dermottt et al, 2005). Possui morfologia bipolar e é
30
encontrada por todo o sistema nervoso em desenvolvimento (Mc Dermott et al,
2005). Possui um processo curto que conecta o corpo celular na região
periventricular ao lúmem ventrícular lateral e um processo alongado que alcança a
pia mater (Rakic, 1995). Na medula espinhal, o processo curto direciona-se ao canal
central enquanto o processo longo estende-se de maneira radial para a periferia em
orientação perpendicular ao longo eixo da medula espinhal (Mac Dermott et al,
2005).
Células da glia radial exibem, em humanos, características astrocitárias como a
presença de grânulos de gliocogênio e expressão de GFAP (Hartfuss et al, 2005).
Apresentam também marcadores de células neuroepiteliais como nestina e vimentina
(Frederiksen & Mc Kay, 1988). No final da neurogênese sofrem alterações
morfológicas com perda do processo longo e inibição da expressão de marcadores
como nestina e vimentina dando origem à astrócitos no período pósnatal (Voigt,
1989; Moreels et al, 2005).
São consideradas progenitoras de células da glia (Moreels et al, 2005) e seu
processo longo radial tem sido tradicionalmente considerado como um guia para a
migração de neurônios durante a neurogênese (Rakic, 1972). Porém, estudos recentes
têm estabelecido que a glia radial também é capaz de gerar neurônios durante a
embriogênese (Noctor et al, 2001; Tamamaki et al, 2001; Götz et al, 2002). A glia
radial apresenta duas fases distintas no desenvolvimento do sistema nervoso: uma
fase neurogênica em que origina neurônios e guia a migração dos mesmos; e uma
fase gliogênica em que dá origem às células da glia (Weissman et al, 2003).
Em vertebrados não mamíferos a glia radial persiste em grande número por
todo o sistema nervoso (Zupanc & Clint, 2003), e tem função de células-tronco
neurais, sendo responsável pelo crescimento e capacidade regenerativa do sistema
31
nervoso destas espécies (Pollardi & Conti, 2007). Evidências dão suporte à hipótese
de que astrócitos presentes na região subventricular em mamíferos adultos têm
origem nas células da glia radial (Jackson et al, 2006) e possuem características
intermediárias entre astrocitos normais e células da glia radial (Liu et al, 2006).
Assim células progenitoras neurais de período embrionário, células da glia radial e os
astrocitos da zona subventricular representam uma continuidade de linhagem de
células que apresentam potencial de diferenciação neural (Alvarez-Buylla et al, 2001;
Merkel et al, 2004). Processo inverso ao da diferenciação de células da zona
subventricular de adultos em glia radial pode ocorrer “in vitro” e marcadores de glia
radial podem ser readquiridos “in vivo” em certas condições como no trauma da
medula espinhal (Shibuya et al, 2003).
O reconhecimento de que a glia radial é a ancestral da célula-tronco neural da
região subventricular determina que essa célula possa estar implicada na origem das
células-tronco tumorais em neoplasias do sistema nervoso central (Pollardi & Conti,
2007).
2.4.3 Células-tronco tumorais
A hipótese de que praticamente todas as células de um crescimento neoplásico
são capazes de se proliferarem para manter a neoplasia tem sido contestada por
evidências contrárias. Observações em leucemia (Hope et al, 2004), melanoma (Fang
et al, 2005), neoplasia de pulmão (Kim et al, 2005) e de mama (Ponti et al, 2005)
evidenciam que apenas uma subpopulação das células do tumor é capaz de proliferar
extensivamente e manter o crescimento e progressão da neoplasia (Vescovi et al,
2006). Desta maneira, a neoplasia apresenta certa hierarquização, e uma
subpopulação das células neoplásicas é capaz de proliferar-se indefinidamente,
32
devido ao prejuízo da regulação da sua capacidade de auto-renovar, e adicionalmente
dar origem às diferentes subpopulações de células neoplásicas implicando em
similaridades com células-tronco normais e originando o conceito de célula-tronco
tumoral (Galderesi et al, 2006).
Células extraídas de neoplasias cerebrais primárias diversas foram capazes de
originar neuroesferas e expressarem nestina e CD 133 (Hemmati et al, 2003; Singh et
al, 2003). Apesar de nem todas as células de uma neuroesfera apresentarem a
capacidade de originar diferentes tipos celulares, algumas células apresentaram-se
multipotenciais e expressaram nestina, um neurofilamento típico de células
precursoras neurais, sugerindo que neoplasias cerebrais podem ser originárias de
células com propriedades de progenitoras de células da neuroglia, ou células-tronco
tumorais (Gardesi et al, 2006). Gliomas histologicamente idênticos, originários de
diferentes regiões do sistema nervoso central mostraram perfil de expressão de genes
semelhantes àqueles vistos nas populações de células precursoras da neuroglia (glia
radial e células-tronco neurais) das regiões correspondentes do sistema nervoso
(Gilbertson & Gutmann, 2007 ).
Algumas evidências indicam que a neoplasia encefálica é resultado de
transformação de precursores celulares indiferenciados os quais são encontrados não
somente no cérebro em desenvolvimento, mas também em áreas do cérebro maduro
em regiões onde a neurogênese persiste (Vescovi et al, 2006). Entre essas, a zona
subventricular surge como a mais provável fonte de gliomas (Sanai et al, 2005).
Muitos tumores desenvolvem-se na proximidade desta região e exposição a vírus
oncogênicos ou carcinógenos químicos resulta em formação de neoplasias
preferencialmente próximas às áreas germinativas, em oposição ao parênquima
cerebral normal (Sanai et al, 2005). Células-tronco somáticas são células perenes
33
com potencial significativo de auto-renovação e proliferação que persiste durante
toda a vida do animal. Desta forma, as células-tronco neurais somáticas podem ser
alvos preferenciais para a gênese de tumores, pois mutações com potencial
oncogênico poderiam se acumular ao longo do tempo (Vescovi et al, 2006).
O microambiente das células-tronco somáticas permite que os potenciais de
proliferação e diferenciação sejam mantidos (Jandial et al, 2008). Alterações
genéticas em células do estroma (células endoteliais, fibroblastos e células
inflamatórias) são essenciais para o desenvolvimento de neoplasias (Kenny et al,
2007; Ishiguro et al, 2006). Em glioblastoma multiforme, um nicho vascular
aberrante que mimetiza o nicho de células-tronco neurais somáticas é essencial para
a progressão do tumor (Jandial et al, 2008). Células-tronco tumorais devem ser
consideradas um fenômeno disfuncional que não ocorre individualmente, mas em
conjunto com alterações tecido que fornece suporte à neoplasia (Gilbertson & Rich,
2007).
34
3 Objetivos
35
O objetivo deste estudo é analisar a expressão de metalotioneínas (MT) e fator
de crescimento vascular endotelial (VEGF) na medula espinhal de ratos tratados com
N-etil–N-nitrosourea (ENU).
36
4 Materiais e Métodos
37
4.1 Animais e ambiente de experimentação
Foram utilizados ratos recém-nascidos, machos, da linhagem Wistar
provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo. Os animais foram fornecidos com as matrizes no
primeiro dia de vida e mantidos no biotério do Departamento de Patologia, em
condições de temperatura ambiente constante, com ciclo noite - dia de 12 horas. Foi
fornecida ração padrão Purina
para ratos e água de torneira “ad libitum”.
Inicialmente os animais foram acomodados em gaiolas coletivas contendo uma
matriz e sua prole e, após o desmame que ocorreu no vigésimo primeiro dia de vida,
os ratos foram acomodados em gaiolas individuais sob as mesmas condições
descritas previamente. As matrizes foram destinadas para atividades experimentais e
didáticas do departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
Os animais de experimentação foram mantidos de acordo com as diretrizes do
Committee on Care and Uses of Laboratory Animals of the National Research
Council of the NIH (USA).
4.2 Delineamento Experimental
Dezoito ratos recém-nascidos receberam administração subcutânea de solução
de N-etil-N-nitrosourea na dose de 40mg/kg de peso corporal nas primeiras 24h e
foram pesados semanalmente. Os grupos experimentais foram formados de acordo
com o tempo decorrido para a eutanásia, a saber: G1 - 4 semanas, G2 - 24 semanas,
G3 - mortos ao surgirem sinais de adoecimento ou de comprometimento neurológico.
Os animais do grupo controle foram submetidos à injeção de solução salina no
subcutâneo do dorso de forma a obter-se três grupos que foram submetidos à
eutanásia em tempos semelhantes aos dos grupos experimentais. A saber: Grupo C1 -
38
quatro semanas, grupo C2 - 24 semanas e grupo C3 - mortos com idade igual à idade
média do grupo G3 no momento da eutanásia.
Os grupos (C1, C2, C3, G1, G2 e G3) foram compostos de seis ratos, e
eventuais óbitos durante o período de experimentação seriam repostos com outros
animais até que fossem totalizados seis animais (n=6) para cada grupo experimental.
Todos os ratos, e em especial os animais do grupo G3 foram pesados semanalmente e
acompanhados diariamente. Na presença de sinais de adoecimento, como
emagrecimento, prejuízo dos pêlos, redução da atividade ou surgimento de sinais de
comprometimento neurológico o animal era submetido à eutanásia imediatamente.
4.3 Preparo e administração da N-etil-N-nitrosourea
Foi utilizado o carcinógeno N-Ethyl-N-Nitrosourea, ou ENU (Sigma Co) que
permaneceu armazenado em temperatura de zero grau centígrado e era retirado da
geladeira somente no momento da manipulação.
A manipulação foi realizada em pequenas quantidades observando as normas
universais de segurança. Durante o preparo utilizou-se avental, máscara, luva e gorro.
Após manipulação da droga o material utilizado foi imerso em solução neutralizante
saturada de permanganato de potássio. A ENU era dissolvida na concentração de
8mg/10ml de solução de água destilada e preparada imediatamente antes de cada
administração.
Os animais recém-nascidos dos grupos experimentais foram submetidos à
administração de N-etil-N-nitrosourea em dose única de 40mg/kg de peso corporal.
A administração deu-se por meio de injeção no subcutâneo da região dorsal
utilizando seringa de 1ml e agulha hipodérmica de 13X4,5. Em seguida os animais
eram acomodados em gaiolas coletivas juntamente com a matriz.
39
Procedimento análogo era realizado para os animais do grupo controle com a
diferença que era realizada a administração subcutânea de solução salina no volume
0,05ml/g de peso corporal.
4.4 Eutanásia e coleta de amostras
Decorrido o tempo do experimento, os animais foram anestesiados através de
administração intramuscular de quetamina (11,5g/100ml) na dose de 1ml/kg e
xilazina (concentração de 200mg/ml) na dose de 0,7ml/kg. Em seguida foram
posicionados em decúbito dorsal e fixados em prancha rígida.
Em seqüência, os animais foram submetidos à toracotomia bilateral com
exposição do coração. O ventrículo esquerdo foi puncionado e uma via de saída
estabelecida por meio de incisão no átrio direito. Em seguida procedia-se perfusão
por gravidade utilizando solução salina no volume de 1ml/g de peso corporal, e
através de laparotomia foi realizada a verificação visual da eficácia do método de
perfusão, por meio da inspeção da coloração do fígado e órgãos abdominais. Em
seguida realizou-se a perfusão por gravidade com o agente fixador, utilizando-se
paraformoldeido em solução a 4% no volume de 1ml/g de peso corporal.
Para a coleta de amostras realizou-se a ectoscopia do animal a fim de identificar
tumorações suspeitas. As cavidades torácica e abdominal foram inspecionadas para
identificar lesões sugestivas de neoplasias. Amostras de pulmão, coração fígado,
intestino grosso, intestino delgado, rim e baço foram coletadas.
O corpo do animal foi em seguida posicionado em decúbito ventral e o dorso
incisado, interessando pele e subcutâneo, desde a região occipital até a raiz da cauda.
A musculatura paravertebral foi dissecada em toda a extensão do dorso a fim de expor
as lâminas das vértebras em toda extensão da coluna vertebral (ANEXOS, Figura
40
2A). Em seguida realizou-se laminectomia de todos os segmentos da coluna vertebral
expostos e durotomia e, então, a medula espinhal era exposta, desde a transição crânio
cervical até as raízes da cauda eqüina (ANEXOS, Figura 2B) A medula espinhal foi
submetida à análise macroscópica com o objetivo de identificar lesões de caráter
neoplásico e quaisquer outras lesões eventuais, com especial atenção aos animais do
grupo G3.
A medula espinhal foi seccionada transversalmente para obtenção das seguintes
amostras: medula espinhal cervical, medula espinhal dorsal, medula espinhal lombar
e cone medular, cauda eqüina.
Posteriormente o animal foi incisado na linha média, na região da calvária,
interessando todos os planos, de pele até o pericrânio. Com a exposição ampla da
calvária foram submetidos à craniectomia total do vértice e durotomia para a retirada
do encéfalo do interior da caixa craniana. O encéfalo obtido foi seccionado tanto na
linha mediana quanto no plano coronal na sua porção média e a presença de lesões
macroscopicamente identificáveis e distorções ou herniações da estrutura encefálica
foram relatadas.
4.5 Fixação e inclusão
O material obtido foi fixado em paraformoldeido 4% por período de 4 horas.
Posteriormente as amostras de medula espinhal foram seccionadas axialmente e
acomodadas em recipientes plásticos próprios para inclusão em parafina, submersas
em álcool 70% e incluidas em parafina no dia seguinte. As amostras de órgão
abdominais e torácicos foram incluídas de modo semelhante.
4.6 Análise histológica
41
A análise histológica foi realizada a partir de secções transversas de 5 µ obtidas dos
segmentos cervical, torácico e lombar. Para os animais do grupo C3, cortes das lesões
neoplásicas identificadas na macroscopia foram analisados. As secções foram coradas
por hematoxilina e eosina e analisadas sob microscopia de luz (40X). Procedeu-se a
descrição das alterações histológicas identificadas. Secções de órgão torácicos e
abdominais foram processadas para hematoxilina e eosina.
4.7 Avaliação imuno-histoquímica das neoplasias
intramedulares
Os tumores identificados na macroscopia e submetidos à analise histológica
pelo método de hematoxlina e eosina foram submetidos à análise imuno-
histoquímica através de reações para identificação de “glial fibrilary acidic
protein”(GFAP) e “anti leucocyte common antigen” (LCA). Tendo em vista o
objetivo do presente estudo, somente foram analisadas aquelas neoplasias
caracterizadas como intramedulares de maneira que neoplasias oriundas de raízes
nervosas não foram objeto de avaliação.
Reação de Imuno-Histoquímica para GFAP
As reações imuno-histoquímicas foram realizadas a partir dos cortes
histológicos de medula espinhal por meio de reação antígeno-anticorpo seguida de
revelação da reação com marcador visível ao microscópio. As lâminas desparafinadas
e hidratadas foram recuperadas antigenicamente através de incubação em panela a
vapor em meio tamponado por 40 minutos. Em seguida, peroxidases teciduais
endógenas foram removidas pela adição de peróxido de hidrogênio e ligações
inespecíficas do anticorpo primário foram evitadas por adição de soro de cavalo. As
lâminas foram então incubadas com anticorpo primário GFAP clone GFP/GF2 (Novo
42
Casro laboratories) diluído 1:400, por 12 horas em câmara úmida que reagiu com o
antígeno formando um imunocomplexo. A reação foi identificada após a revelação
por tratamento com Diamno Benzina (DAB, Sigma-Aldrich Inc., USA) por cinco
minutos e contra coloração com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das
lâminas. As reações de imuno-histoquímica foram avaliadas com microscopia de luz
e a imunoreatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloração no
citoplasma e ou no núcleo das células.
Reação Imuno-Histoquímica para LCA
Utilizou-se o anticorpo primário LCA monoclonal PD7/26/16 e 2B11 (DAKO
corporation) na diluição 1:200 . As etapas laboratoriais para a detecção de LCA
foram semelhantes às acima descritas para o GFAP.
4.8 Reação de imuno-histoquímica para avaliação de
expressão de metalotioneínas e de fator de
crescimentovascular endotelial
Dos blocos de parafina foram feitos cortes em micrótomo com espessura de
cinco micrômetros. Foram analisados 2 cortes por segmento de medula espinhal -
cervical, torácico e lombar – totalizando 6 cortes por animal. Apenas cortes com
tecido de medula espinhal de aspecto normal foram utilizados neste estudo.
Reação Imuno´-Histoquímica para detecção da proteína metalotioneína
Reação imuno-histoquímica para detecção da proteína metalotioneína (MT)
em cortes de medula espinhal incluídos em parafina foi realizada pelo método de
imuno peroxidase estereptavidina-avidina-biotina (Jin et al, 2002). Cortes de 5 µm de
espessura foram desparafinizados e re-hidratados. A atividade da peroxidase
endógena foi bloqueada com H2O2 1% em solução 0.1 mol/L de Tris-NaCl (pH 7.6)
43
por 30 min. Após incubação com soro de cabra normal a 5% por 1h a 37ºC, os cortes
foram incubados com anticorpo de coelho anti MT-1 de rato em BSA 1% com
diluição 1:50. Posteriormente os cortes foram incubados com anticorpo de cabra anti
IGg de Coelho (Sigma) em diluição de 1:200 por 30 minutos à 37ºC Os cortes foram
em seguida incubados com peroxidase-estreptavidina (1:100) for 1 h e processados
com 3, 3′-diamino benzedrine tetra hydrochloride (DAB) a 5% e H2O2 0,33% em
solução 0.5 mol/L de Tris- NaCl como substrato. Os cortes foram contra corados
com hematoxilina de Harris (H&E), em seguida desidratados e montados.
Cortes de fígado humano, que sabidamente expressa MT, foram submetidos
ao procedimento de imuno-histoquímica para serem utilizados como controles
positivos (ANEXOS, Figura 3A e Figura 3B) e, no caso dos controles negativos, o
anticorpo primário foi substituído por PBS. A marcação para MT foi considerada
positiva quando núcleo e o citoplasma das células do tecido nervoso foram marcados
fortemente (marrom avermelhado). O padrão de marcação da MT foi caracterizado
como citoplasmático, nuclear ou celular (citoplasmático e nuclear). As células
marcadas para MT foram quantificadas por campo microscópico com objetiva com
aumento de 40X.
Reação Inumo-Histoquímica para detecção de VEGF
As reações de imuno-histoquímica foram realizadas nos cortes histológicos de
medula espinhal através de reação antígeno-anticorpo seguida de revelação da reação
com marcador visível ao microscópio. As lâminas desparafinadas e hidratadas foram
recuperadas antigenicamente através de incubação em panela a vapor em meio
tamponado por 40 minutos. Em seguida peroxidases teciduais endógenas foram
removidas pela adição de peróxido de hidrogênio e ligações inespecíficas do
anticorpo primário foram evitadas por adição de soro de cavalo. As lâminas foram
44
então incubadas com anticorpo primário VEGF clone A20 (Santa Cruz
Biotechnology inc.) diluído 1:200, por 12 horas em câmara úmida que reagiu com o
antígeno formando um imunocomplexo. A reação foi identificada após a revelação
por tratamento com DAB (Sigma-Aldrich Inc., USA) por cinco minutos e contra
coloração com Hematoxilina de Harris seguida de montagem das lâminas. As reações
de imuno histoquímica foram avaliadas com microscopia de luz e a imuno
reatividade foi considerada positiva quando foi detectada coloração no citoplasma ou
no núcleo das células. O índice de marcação foi determinado pelo número de vasos
marcados na região subpial, por corte histológico.
Cortes de endométrio humano, que sabidamente expressa VEGF, foram
submetidos ao procedimento de imuno-histoquímica para serem utilizados como
controles positivos e, no caso dos controles negativos, o anticorpo primário foi
substituído por PBS (ANEXOS, Figura 3C e Figura 3D).
4.9 Contagem de células marcadas – metalotioneínas e
fator de crescimento vasclar endotelial
Os cortes de medula espinhal submetidos a marcação por reação imuno-
histoquímica para metalotioneína e VEGF foram analisados por meio de microscopia
óptica com aumento de (40X). Para cada animal foram analisados dois cortes de
medula espinhal cervical, dois cortes de medula espinhal torácica e dois cortes de
medula espinhal lombar.
As células foram consideradas marcadas de acordo com os padrões dos
controles positivos. Para a contagem de células marcadas na reação imuno-
histoquímica para MT, no corte axial de medula espinhal foram consideradas três
regiões arbitrariamente definidas como se segue:
45
região subpial – corresponde a área mais periférica do corte histológico de
medula espinhal adjacente a pia mater;
região pericanal central – corresponde a área do corte histológico de medula
expinhal imediatamente circunvizinha ao canal central da medula ;
região do parênquima medular– corresponde a maior área do corte histológico
de medula espinhal compreendida entre a região peri canal central e a região subpial.
Para a análise dos resultados foi considerado o número absoluto de células
marcadas por campo histológico em cada um dos três segmentos observados.
4.10 Análise estatística
Para a análise estatística dos resultados foi utilizado o programa de computador
PRISM, versão 4.0 (Graph Pad Software inc.). Os resultados foram analisados pelo
teste de normalidade a fim de avaliar se os mesmos seguiam distribuição Gausiana.
Para a análise estatística dos resultados referentes ao peso dos animais e à contagem
de células marcadas por MT ou VEGF foi utilizado o teste t. O nível de significância
considerado foi de 5% e os resultados foram relatados como média e desvio padrão.
46
5 Resultados
47
5.1 Duração do experimento
O tempo de sobrevida dos animais do grupo G3 está representado na tabela
abaixo (Tabela 1). Os animais do grupo C3 foram submetidos à eutanásia com 32
semanas.
Tabela 1 – Sobrevida dos animais do grupo G3- média, maior e menor
sobrevida (expresso em semanas e dias)
Grupo G3 Sobrevida
Média (n = 6) 32s e 4d
Menor sobrevida 17s e 5d
Maior sobrevida 45s
n = número de animais, s = semanas, d =dias
Para os demais grupos o tempo de duração do experimento foi aquele definido
no delineamento experimental: 4 semanas (grupos C1 e G1) e 24 semanas (grupos
C2 e G2).
5.2 Peso Corporal
Os animais apresentaram desempenho ponderal adequado para a idade. Ao fim
do experimento o peso dos animais dos grupos tratados com ENU (G) não diferiu
estatisticamente do peso dos animais dos respectivos grupos controles (C).
Tabela 2 - Peso corporal em gramas nos grupos de ratos experimento (G1) e controle
(C1) de 4 semanas de evolução
Grupo Peso Corporal
C1 (n=6) 101,05 ± 4,14
G1 (n=6) 99,83 ± 2,77
P 0,7448
Resultados expressos em media ± desvio padrão, n = número de animais,
p > 0,05 =não significante
48
0 1 2 3 4 5
0
25
50
75
100
125
C1
G1
semanas
peso g
Figura 4 – Evolução ponderal dos grupos de ratos tratados com ENU (G1) e controle
(C1) de 4 semanas
Tabela 3 - Peso corporal em gramas nos grupos de ratos tratados com ENU (G2) e
controle (C2) de 24 semanas de evolução
Grupo Peso Corporal
C2 (n=6) 565,30 ± 18,71
G2 (n=6) 581,20 ± 18,27
P 0,5584
Resultados expressos em media ± desvio padrão, n = número de animais,
p > 0,05 =não significante
49
0 10 20 30
0
100
200
300
400
500
600
700
C2
G2
semanas
peso (g)
Figura 5 – Evolução ponderal dos grupos de ratos tratados com ENU (G2) e
controle (C2) de 24 semanas
Tabela 4 - Peso corporal em gramas nos grupos de ratos tratados com ENU (G3) e
controle (C3)
Grupo Peso Corporal
C3 (n=6) 662,20 ± 27,91
G3 (n=6) 612,70 ± 39,66
P 0,3315
Resultados expressos em media ± desvio padrão, n = número de animais,
p > 0,05 =não significante
50
0 10 20 30 40 50
0
100
200
300
400
500
600
700
800
C3
G3
semanas
peso (g)
Figura 6 – Evolução ponderal dos grupos de ratos tratados com ENU (G3) e controle
(C3)
5.3 Incidência de neoplasias
Os ratos que não receberam a administração de ENU – grupos C1, C2 e C3 -
não apresentaram sinais de adoecimento ou de comprometimento do sistema
nervoso. Durante o procedimento de coleta de amostras não foram identificadas
neoplasias macroscopicamente visíveis.
Naqueles grupos de ratos submetidos ao tratamento com ENU, os ratos que
apresentaram sinais de adoecimento ou sinais neurológicos foram submetidos aos
procedimentos de coleta de amostras e passaram a formar o grupo G3. Os demais
animais compuseram os grupos experimentais G1 (4 semanas) e G2 (24 semanas).
Nos animais dos grupos G1 e G2 não foram identificadas neoplasias macroscopicas
durante o procedimento de coleta de amostras.
Deste modo, o grupo de ratos G3 foi composto de animais que desenvolveram
déficit neurológico durante o decorrer do experimento. O sinal neurológico mais
comumente observado foi paresia das patas traseiras, manifestando-se como
51
paraparesia ou, mais freqüentemente, monoparesia. Observou-se também paresia das
patas dianteiras em rato com neoplasia de medula espinhal cervical. Os animais
foram eutanasiados imediatamente quando o déficit era identificado.
Todos os animais do grupo G3 apresentaram neoplasias acometendo a medula
espinhal. Durante a necropsia não foram identificadas lesões sugestivas de neoplasia
em órgãos torácicos, abdominais ou no encéfalo ao exame macroscópico.
A maior incidência de neoplasias foi no segmento torácico da medula espinhal
(Tabela 5).
Tabela 5 – Incidência de neoplasia por segmento de medula espinhal e em raízes
nervosas no grupo G3.
Segmento Incidência
Cervical 3 (27,27)
Torácica 4 (36,36)
Lombar 2 (18,18)
Cauda eqüina 2 (18,18)
Total 11 (100)
Resultados expressos em número absoluto e porcentagem(%),
Desta forma, o número médio de neoplasias foi de 1,83 neoplasias por rato
(ANEXOS, Figura 7A,B e C). Dois animais apresentaram neoplasias que acometiam
raízes da cauda eqüina que não foram consideradas para a investigação subseqüente
visto que o objetivo do estudo são as neoplasias intramedulares. Os cérebros
analisados não mostraram tumores ao exame macroscópico.
As lesões neoplásicas apresentaram aspecto variado, variando de lesões
irregulares, mal de limitadas e de aspecto infiltrativo até lesões melhor delimitadas,
52
ocorrendo na medula espinhal nos segmentos cervical (ANEXOS, Figura 8 A,),
torácico (ANEXOS, Figura 7B), lombar (ANEXOS, Figura 8B) e em raizes nervosas
(ANEXOS, Figura 7C).
O inventário da cavidade abdominal e torácica não evidenciou tumores
macroscópicos e a análise de amostras dos órgãos na microscopia óptica não
evidenciou neoplasias.
5.4 Caracterização das neoplasias intramedulares
As neoplasias intramedulares foram submetidas ao exame histológico por meio
da técnica de hematoxilina e eosina e reação imuno-histoquímica para identificação
de “glial fibrilary acidic protein” (GFAP) e “anti leucocyte common antigen”
(LCA). Na coloração de hematoxilina-eosina observou-se neoplasia de padrão
neuroepitelial, densamente celular, composta por células arredondadas ou poligonais
com núcleo pequeno fortemente corado e citoplasma eosinofílico (ANEXOS, Figura
9A). Eventualmente foram identificados focos de hemorragia intra tumoral e vasos
neoformados, denotando neoplasia mais agressiva.
Na avaliação imuno-histoquímica, as lesões descritas não apresentam marcação
pelo LCA (Figura 9B), excluindo a possibilidade de neoplasia originária de tecido
linfóide. A reação positiva na análise imuno-histoquímica para GFAP ressalta a
origem glial das neoplasias (Figura 9C).
5.5 Análise da expressão de fator de crescimento
vascular endotelial
A administração de ENU levou ao aumento significativo dos vasos marcados
para VEGF na região subpial nos animais dos grupos experimentais quando
53
comparado aos seus respectivos controles (ANEXOS, figuras 10B, 10C e 10D ). A
presença de células VEGF positivas nos cortes de medula espinhal fora da região
subpial foi mínima e insuficiente para análise estatística.
Tabela 6 – Média do número de células VEGF positivas em medula espinhal de
ratos nos grupos experimento (G1) e controle (C1)
Grupo Número de células*
C1 (n=6) 22,33 ± 2,32
G1 (n=6) 108,80 ± 19,19
P <0,0001
Resultados expressos em media ± desvio padrão, n = número de animais,
p > 0,05 = não significante *dados referem-se ao número médio de células por
campo microscópico por grupo de animais
Tabela 7 – Média do número de células VEGF positivas em medula espinhal de
ratos nos grupos experimento (G2) e controle (C2)
Grupo Número de células*
C2 (n=6) 16,33 ± 3,15
G2 (n=6) 67,50 ± 7,96
P 0,0001
Resultados expressos em media ± desvio padrão, n = número de animais,
p > 0,05 = não significante *dados referem-se ao número médio de células por
campo microscópico por grupo de animais
54
Tabela 8 – Média do número de células VEGF positivas em medula espinhal de
ratos nos grupos experimento (G3) e controle (C3)
Grupo Número de células*
C3 (n=6) 18,33 ± 2,87
G3 (n=6) 85,80 ± 9,71
P <0,0001
Resultados expressos em media ± desvio padrão, n = número de animais,
p > 0,05 = não significante *dados referem-se ao número médio de células por
campo microscópico por grupo de animais
Adicionalmente, foi realizada a análise da marcação para VEGF nas neoplasias
intramedulares dos animais do grupo G3 e se observou células marcadas ao redor do
tumor correspondendo a neovascularização tumoral (ANEXOS, Figura 10A).
5.6 Análise da expressão de metalotioneínas
A administração de ENU levou ao aumento significativo do número de células
marcadas na região subpial nos animais dos grupos tratados com ENU (ANEXOS,
Figura 11E e Figura 11F) quando comparado aos seus respectivos controles (Tabela
9, Tabela 10 e Tabela 11). Não houve diferença significativa no número de células
marcadas para MT na região do parênquima medular quando se desconsidera a
região subpial (Tabela 12, Tabela13, Tabela14). A presença de células MT positivas
nos cortes de medula espinhal ao redor do canal central foi mínima e insuficiente
para análise estatística.
O padrão de marcação das células MT positivas foi diferente nos animais dos
grupos controles (C1, C2 e C3) em comparação com os animais que receberam ENU
55
(G1,G2 e G3). Nos ratos dos grupos controles, a marcação foi menos intensa e
restrita ao citoplasma enquanto as células marcadas para metalotioneinas nos ratos
tratados com ENU foram fortemente marcadas e a marcação ocorreu no núcleo e no
citoplasma. Adicionalmente, foi possível observar no grupo G2 pequenos
agrupamentos de células MT positivas. (ANEXOS, Figura 11D).
Tabela 9 – Média do número de células MT positivas na região subpial da medula
espinhal de ratos nos grupos experimento (G1) e controle (C1)
Grupo Número de células*
C1 (n=6) 30,67 ± 7,59
G1 (n=6) 63,33 ± 5,38
P 0,0056
Resultados expressos em media ± desvio padrão, n = número de animais,
p > 0,05 = não significante *dados referem-se ao número médio de células por
campo microscópico por grupo de animais
Tabela 10 – Média do número de células MT positivas na região subpial da medula
espinhal de ratos nos grupos experimento (G2) e controle (C2)
Grupo Número de células*
C2 (n=6) 11,00 ± 2,31
G2 (n=6) 32,50 ± 3,57
P 0,0005
Resultados expressos em media ± desvio padrão, n = número de animais,
p > 0,05 = não significante *dados referem-se ao número médio de células por
campo microscópico por grupo de animais
56
Tabela 11 – Média do número de células MT positivas na região subpial da medula
espinhal de ratos nos grupos experimento (G3) e controle (C3)
Grupo Número de células*
C3 (n=6) 42,00 ± 5,77
G3 (n=6) 101,90 ± 23,76
P 0,0326
Resultados expressos em media ± desvio padrão, n = número de animais,
p > 0,05 = não significante *dados referem-se ao número médio de células por
campo microscópico por grupo de animais
Tabela 12 – Média do número de células MT positivas na região do parênquima da
medula espinhal de ratos nos grupos experimento (G1) e controle (C1)
Grupo Número de células*
C1 (n=6) 28,93 ± 2,24
G1 (n=6) 25,17 ± 5,89
P 0,3386
Resultados expressos em media ± desvio padrão, n = número de animais,
p > 0,05 = não significante *dados referem-se ao número médio de células por
campo microscópico por grupo de animais
Tabela 13 – Número de células MT positivas na região do parênquima da medula
espinhal de ratos nos grupos experimento (G2) e controle (C2)
Grupo
C2 (n=6) 10,45 ± 2,53
G2 (n=6) 17,45 ± 4,91
P 0,2341
Resultados expressos em media ± desvio padrão, n = número de animais,
p > 0,05 = não significante
57
Tabela 14 – Média do número de células MT positivas na região do parênquima da
medula espinhal de ratos nos grupos experimento (G3) e controle (C3)
Grupo Número de células *
C3 (n=6) 38,00 ± 4,65
G3 (n=6) 89,33 ± 26,97
P 0,0902
Resultados expressos em media ± desvio padrão, n = número de animais,
p > 0,05 = não significante *dados referem-se ao número médio de células por
campo microscópico por grupo de animais
A análise da reação imuno-histoquímica para metalotioneínas nas neoplasias
intramedulares do grupo G3 evidenciou padrão bifásico de marcação com poucas
células marcadas na porção central da neoplasia e grande número de células
marcadas ao redor do tumor. As células que exibiam marcação para metalotioneinas
estavam rodeando as bordas da neoplasia e em contato com tecido nervoso normal
(ANEXOS, Figuras 11A e 11B).
58
6 Discussão
59
No presente estudo observou-se que a administração de 40mg/kg de peso
corporal N-ethyl-N-nitrosourea em ratos no primeiro dia de vida acarreta aumento da
expressão de MT e VEGF na região subpial da medula espinhal analisada após
quatro semanas. Foi observado ainda que a administração da ENU ocasionou o
surgimento de neoplasias em todos os segmentos da medula espinhal.
A menor sobrevida entre os animais do grupo G3 foi de 17 semanas e 5 dias e a
maior sobrevida foi de 45 semanas. Em experimento utilizando ratos Wistar que
receberam ENU com a mesma idade e dose do presente experimento, o menor tempo
decorrente para o surgimento de sinais de comprometimento neurológico foi de
quatro meses, ou 16 semanas e todos os animais restantes foram mortos aos seis
meses (Naito et al, fevereiro de 1981). Em estudo utilizando ratos Sprague-Dawley
que receberam ENU por via transplacentária no vigésimo dia de prenhez na dose de
50mg/kg de peso corporal, a maior sobrevida observada foi de 49 semanas e 3 dias, e
a sobrevida média de 30 semanas e 1 dia (Koestner et al, 1971). O tempo de
sobrevida médio dos animais do grupo G3 foi de 32 semanas e 4 dias, de forma que é
possível afirmar que o tempo decorrido para o surgimento de sinais neurológicos e,
portanto, de eutanásia, está de acordo com os dados obtidos na literatura.
O desempenho ponderal dos animais dos grupos experimentais foi semelhante
ao dos respectivos grupos controle. É importante salientar que os animais que
apresentaram sinais neurológicos antes das 24 semanas foram direcionados ao grupo
G3 e, todos os animais sintomáticos foram prontamente eutanasiados evitando, desta
maneira, sinais claros de desnutrição e comprometimento ponderal. Adicionalmente,
o tempo de sobrevida dos animais do grupo C3 foi arbitrariamente definido após o
estabelecimento do tempo médio de sobrevida do grupo G3, com o objetivo único de
que o tempo de sobrevida do grupo C3 fosse compatível com aquele do grupo G3.
60
Os déficits neurológicos observados foram compatíveis com os déficits descritos na
literatura para o acometimento da medula espinhal em ratos e os sinais sugestivos de
hipertensão intracraniana ou compressão do encéfalo não foram observados (Bulnes-
Sesma, 2006).
O segmento medular mais afetado por neoplasias no grupo G3 foi o torácico
(36,36% dos tumores localizavam-se nesse segmento) e no experimento de Naito et
al (fevereiro de 1981) 43% das neoplasias localizavam-se no mesmo segmento. A
maior extensão da medula torácica pode justificar esses achados.
A comparação adequada entre o número total de neoplasias ou número médio
de neoplasias por rato com os dados da literatura é prejudicada por questões
metodológicas. Essas disparidades metodológicas envolvem a dose administrada, o
tempo decorrente para a eutanásia, a busca ativa por neoplasias não identificada no
exame macroscópico (microtumores), a idade do animal quando da administração da
ENU e a região do sistema nervoso estudada. Porém, em estudos com 396 ratos
Wistar, a incidência espontânea de neoplasias foi de 5,8% e de neoplasias intra-axiais
isoladamente foi de 1% (Sumi et al, 1976).
A classificação das neoplasias intra-axiais do sistema nervoso central induzidas
pela ENU em ratos é tema controverso. A quarta edição da classificação dos tumores
do sistema nervoso central de humanos da World Health Organization (WHO)
publicada em 2007 (Louis et al, 2007) engloba sob a classificação de tumores de
tecido neuroepitelial, tumores de origem glial, neuronal e de tecidos embrionários
pouco diferenciados. Por outro lado, o termo “glioma”, utilizado na prática clínica e
rotineiramente em publicações científicas, diz respeito às neoplasias primárias do
sistema nervoso central que são consideradas como originárias das células da glia.
Compreende, em geral, um conjunto heterogêneo de neoplasias compostas por
61
astrocitomas, oligodendrogliomas e ependimomas de diferentes graus e
glioblastomas (McDonald & Rosenblum, 1996).
A análise das neoplasias intra-axiais causadas pela ENU pela microscopia de
luz, descreve, na maioria das vezes, células arredondadas com núcleo homogêneo e
citoplasma claro, sugerindo origem oligodendroglial. Em neoplasias de maior grau
podem ser observadas características sugestivas de gliomas de alto grau como
pleomorfismo celular, células multinucleadas e figuras de mitose, além de necrose e
hemorragia (Bulnes-Sesma, et al, 2006). A análise ultra-estrutural por meio de
microscopia eletrônica identificou células de aspecto heterogêneo com presença de
glioblastos, células ependimárias oligodendroblastos e predominantemente
oligodendrócitos, e todas as neoplasias intra-axiais foram consideradas gliomas
(Koestner et al, 1971; Ikeda et al, 1983).
Marcadores imuno-histoquímicos de células gliais são expressos nas neoplasias
induzidas pela ENU (Bulnes-Sesma, et al, 2006), porém os marcadores são expressos
de maneira variada nos diferentes estudos. O “glial fibrilary acidic protein” ou
GFAP é um neurofilamento de 8 ou 9 mm presente em astrócitos “maduros” (Eng et
al, 2000) e sua marcação por meios imuno-histoquímicos variou de forte até ausente
sendo expressa principalmente naqueles tumores de maior grau (Bulnes-Sesma, et al,
2006; Mennel & Simon, 1985; Giordana et al, 1992; Reifenberg et al, 1989; Yoshino
et al, 1985; Mauro et al, 1985; Giordana, 1990). A vimentina, que é um filamento
presente em células da glia em estágio precoce de diferenciação, é encontrada com
maior regularidade (Giordana et al, 1992; Giordana, 1990), entretanto, estudo
realizado por Reifenberg e colaboradores em 1989 não detectou a presença deste
marcador. Marcadores oligodendrogliais diversos também foram identificados de
maneira inconstante (Yoshino et al, 1985; Bulnes-Sesma, et al, 2006). A
62
positividade para o marcador neuronal sinaptofisina (Vaquero et al, 1992) é evento
raro e não confirmado por outros investigadores (Reifenberg et al, 1989; Bulnes-
Sesma, et al, 2006).
As variações encontradas nos diversos estudos podem ser decorrentes de
diferentes metodologias relacionadas ao uso experimental da ENU e, portanto, das
características e do grau de diferenciação dos tumores originados. Porém, de acordo
com os aspectos histológicos, ultra-estruturais e imuno-histoquímicos é possível
afirmar que existem evidências suficientes para confirmar a origem glial das
neoplasias intra-axiais causadas pela ENU (Bulnes-Sesma, et al, 2006), ainda que o
diagnóstico histopatológico específico dentre os tumores de origem glial seja
controverso.
O aspecto histológico das neoplasias intramedulares induzidas pela ENU no
presente estudo sugere origem oligodendroglial dos tumores, porém, fez-se
necessário diferenciá-las de linfomas. A marcação das células tumorais por métodos
imuno-histoquímicos para antígeno de leucócitos (LCA) foi homogeneamente
ausente em todos os tumores. Alguns tumores apresentaram aspecto histológico de
maior malignidade, com hemorragias intratumorais e atipías celulares. O GFAP foi
expresso nos tumores analisados, sendo que a marcação de maior intensidade ocorreu
naqueles tumores de aspecto histológico mais agressivo. A análise imuno-
histoquímica confirma a origem neuroepitelial das neoplasias obtidas, que podem ser
classificadas como gliomas com características mistas de linhagem astrocitária e
oligodendroglial.
Apesar dos gliomas serem as neoplasias primárias intra-axiais mais freqüentes
no sistema nervoso central, o conhecimento sobre o processo pelo qual o tumor se
desenvolve é limitado (Hulleman & Helin, 2005). Como os estágios iniciais do
63
desenvolvimento dos gliomas são difíceis de observar na prática clínica, modelos
experimentais que permitissem estudar as diferentes etapas do desenvolvimento
tumoral seriam úteis (Bulnes-Sesma et al, 2006). O modelo de carcinogênese do
sistema nervoso pela ENU apresenta período de latência prolongado e permite o
estudo de etapas iniciais do desenvolvimento tumoral.
Como discutido previamente, a metalotioneína é expressa precocemente no
desenvolvimento de neoplasias gástricas, em modelos experimental de câncer do
cólon e na transformação hepatocelular. Apesar da metalotioneína ter sido
demonstrada em gliomas de humanos, o expressão da metalotioneína nas etapas
iniciais do desenvolvimento dessas neoplasias não havia sido objeto de investigação.
No presente estudo, a administração de dose de 40mg/kg de peso corporal em
ratos no primeiro dia de vida levou a expressão de metalotioneínas em células da
região subpial da medula espinhal de ratos após quatro semanas. Observamos ainda
que, concomitantemente, surgem células que expressam VEGF e novos vasos
sangüíneos na região subpial da medula espinhal. Após 24 semanas, a medula
espinhal dos ratos investigados apresentou achados semelhantes.
O nível basal de expressão de metalotioneínas é associado com a função de
combate a intoxicação por metais pesados e atividade antiestresse oxidativo. O
aumento da expressão de metalotioneínas é normalmente associado ao estresse
oxidativo e inflamação, e, nessas circunstâncias a expressão da metalotioneína nos
tecidos afetados é difusa e retorna aos níveis basais cerca de vinte horas após a
exposição (Bremner et al, 1991). A expressão de metalotioneína induzida pela ENU
é diferente desse padrão, pois, é restrita a região subpial e foi encontrada tanto nos
animais com quatro semanas (grupo G1) quanto nos animais com 24 semanas (grupo
64
G2), sugerindo que o aumento da expressão de MT persiste com o passar do tempo
após a administração de ENU.
As células marcadas dos animais dos grupos G1 e G2 apresentavam forte
reatividade tanto no citoplasma quanto no núcleo das células. O mesmo padrão de
marcação foi visualizado em células do tecido nervoso normal ao redor dos tumores
do grupo G3. Células de tecido circunvizinho ao tumor e fortemente marcadas para
metalotioneínas também foram descritas ao redor da neoplasia em amostras de
ependimomas intracranianos de humanos (Korshunov et al, 2000). Esse padrão de
marcação para metalotioneína é descrito em células de tecidos que se proliferam
rapidamente (Apostolova & Cherian, 2000), e é diferente da marcação
principalmente citoplasmática observada em resposta aos processos inflamatórios
(Cherian et al, 2003).
As células-tronco neurais somáticas foram localizadas no cérebro na região
subventricular (Bonfanti & Pereto, 2007) da mesma forma que células-tronco neurais
implicadas no surgimento de neoplasias primárias (Vescovi et al, 2006). Em modelo
de indução de neoplasias cerebrais pela ENU, observaram-se células da região
subventricular como precursoras de neoplasia (Leonardi et al, 2001). Em estudo
utilizando ENU na dose de 40mg/kg de peso corporal para indução de neoplasias
medulares, foi observado que todos os tumores medulares se desenvolveram na
substância branca da medula espinhal e noventa e três por cento deles foram
encontrados na região subpial (Naito et al, 1984). O mesmo estudo relata que existe
um acúmulo de células imaturas na região subpial em ratos do primeiro ao oitavo dia
de vida (Naito et al, 1984). O aumento da expressão de VEGF e MT no presente
estudo foi restrita à região subpial e coincide com a localização das células que
foram alvo da ação da ENU no experimento relatado (Naito et al, 1984).
65
Células-tronco neurais embrionárias originam-se do ectoderma do embrião que
forma as células neuroepiteliais. As células neuroepiteliais originam células da glia
radial, as quais produzem células-troncos neurais na vida embrionária e em
indivíduos adultos (Mc Dermott et al, 2005). Além da conhecida capacidade de
diferenciar-se em células da glia, a glia radial é capaz de originar neurônios durante o
desenvolvimento do sistema nervoso central (Weissman et al, 2003). As células da
glia radial são presença uniforme durante a fase neurogênica em todos os vertebrados
que diferenciam. A visão predominante nas últimas décadas era de que as células da
glia radial orientam a migração de neurônios (Rakic, 1972). É claro, atualmente, que
a glia radial representa a principal população de células progenitoras do sistema
nervoso e que sua progérie inclui astrócitos, oligodendrócitos, neurônios,
ependimócitos e células-tronco neurais somáticas (Malatesta et al, 2003).A
elucidação de mecanismos intrínsecos e do microambiente da glia radial são
essenciais para um entendimento amplo da fisiologia e desenvolvimento do sistema
nervoso central (Pollard & Conti, 2007). Através da comparação entre padrões de
expressão gênica de ependimomas com aqueles das células durante o
desenvolvimento normal do sistema nervoso central, foi possível sugerir que células
da glia radial são possíveis células tronco de tumores cerebrais (Gilbertson et al,
2006). As células marcadas por metalotioneínas na região subpial da medula espinhal
de ratos no presente estudo, podem representar células da glia radial, com capacidade
de auto-renovação e diferenciação multipotencial (Okano et al, 2005) ou células com
capacidade multipotenciais derivadas da glia radial que migraram para a região
subpial, como pode ocorrer em resposta a estímulos diversos (Okano et al, 2005).
Os mecanismos biológicos que levam ao aumento da expressão de
metalotioneínas em certos tumores não foram elucidados. É possível que o aumento
66
da expressão induzida por mutação possa interferir com a função de fatores de
transcrição dependentes do zinco (Zeng et al, 1991) os quais têm sido implicados no
controle de vários genes, incluindo o p53 que é envolvido com os mecanismos de
apoptose. Esses efeitos sobre a transcrição de genes poderiam conferir vantagem na
sobrevivência ou proliferação das células mutantes (Bruewer et al, 2002).
No presente estudo ocorreu aumento da expressão de VEGF na região subpial
que guarda similaridades com o aumento de expressão da MT na mesma região.
Ratos com déficit na produção de MT-1 e MT-2 submetidos a uma lesão cortical
apresentaram prejuízo intenso na angiogênese (Penkowa et al, 2000) e desta forma, é
possível que a metalotioneína apresente algum papel regulatório no processo de
angiogênese.
Em neoplasias cerebrais primárias, a expressão de VEGF (Plate et al, 1994;
Strutgar et al, 1995, Plate et al 1992) e a neovascularização são eventos primordiais
para o estabelecimento e crescimento dos tumores (Conti et al, 2002). Tendo em
vista que o modelo de indução de neoplasias de medula espinhal pela ENU ocasiona
o surgimento de neoplasias na substância branca e que a região subpial é alvo da
ação da ENU em ratos (Naito et al, 1984), o aumento na expressão do VEGF pode
contribuir para a formação de um microambiente que suporte o desenvolvimento de
neoplasias.
As neoplasias intra-axiais induzidas pela ENU na medula espinhal de ratos
exibem reatividade imuno-histoquímica para marcadores de células de linhagem
astrocitária (Bulnes-Sesma et al, 2006), oligodendroglial (Yoshino et al, 1985) e
de células gliais pouco deferenciadas (Giordana et al, 2002), e, na análise ultra-
estrutual apresentam diferentes tipos celulares na mesma neoplasia (Ikeda et al,
67
1993). Por outro lado, a metalotioeína é associada a marcação de lesões
neoplásicas precoces e células-tronco tumorais (Cook et al, 2000).
Está bem estabelecido que a metalotioneina apresenta envolvimento na
regulação das células endoteliais, bem como na sua proteção contra agentes
citotóxicos. Os dados de Penkowa et al. (2000) corroboram com a relação entre
metalotioneínas e endotélio. Estes autores examinaram a resposta a lesão por baixa
temperatura no SNC de camundongos normais e outros “knock-out” para
metalotioneínas tipo 1 e tipo 2 (MT-KO). Nos animais MT-KO houve significativa
redução na angiogênese induzida por IL-6, o que sugere que as metalotioneínas
possuem papel regulatório na proliferação endotelial encefálica. Isto provavelmente
também está relacionado à oncogênese e ao comportamento tumoral, visto que a alta
produção de VEGF por células-tronco tumorais que expressam o marcador CD133
em amostras de glioblastoma multiforme de humanos está envolvida na sua
capacidade de formação dessas neoplasias (Gilbertson & RIch, 2007).
Estudos conduzidos nos últimos dez anos identificaram as células-tronco com
capacidade regenerativa no cérebro humano e o seu nicho de suporte. A estrutura
central deste nicho é constituída por capilares em localizações específicas
(Riquelme et al, 2008). Esta organização situa as células-tronco tumorais em grande
proximidade com as células endoteliais, facilitando a sua intercomunicação. Foi
também observado que as células endoteliais de gliomas possuem características
biológicas distintas das células endoteliais normais do cérebro, inclusive por terem
maior capacidade de migração e produzirem constitutivamente maiores quantidades
de fatores de crescimento como o VEGF (Charalamblous et al, 2006). A
identificação e caracterização fenotípica destas células seria crucial para idealizar
estratégias de combate às mesmas (Gragner et al, 2005). Adicionalmente, estas
68
células, quando em cultura, são maiores, mais achatadas e ramificadas do que as
células endoteliais normais (Charalambous et al, 2005), o que se assemelha às
células com marcação imuno-histoquímica para metalotioneina identificadas no
presente estudo.
Ao supor que células com aumento da expressão de metalotioneínas são
células-tronco mutantes, o modelo experimental desenvolvido neste trabalho
fornece uma maneira nova de rastreá-las. As células-tronco mutantes situam-se em
sítios protegidos do corpo chamados de nichos, onde se dividem com freqüência que
varia de acordo com o tecido e estímulos externos às células. Em ferimentos ou em
resposta a outros estímulos normais, células-tronco mutantes mobilizam-se para
deixar o seu nicho e para dividir-se (Okano et al, 2005). As células-tronco mutantes
são atualmente consideradas com sendo cruciais para a carcinogênese. Foi
anteriormente discutido pelo orientador deste trabalho que as células-tronco
mutantes podem se espalhar nos folhetos epiteliais (Garcia et al., 1999), sendo
proposto que este mecanismo explique o processo denominado de “field
cancerization”. Este termo foi empregado para descrever tumores múltiplos que
podem ocorrer simultaneamente em alguns tecidos e com grande probabilidade de
recidiva, como é o caso de alguns tumores do sistema nervoso central. A teoria de
cancerização (ou “field cancerization”) implica que células com alterações
genotípicas, mas aparência histológica normal possam se acumular em tecidos e,
posteriormente, originar neoplasias em decorrência de estímulos oncogênicos
diversos durante a vida do animal.
Dados recentes sugeriram que células-tronco mutantes do glioblastoma
multiforme, um tumor cerebral altamente agressivo, são dependentes de nichos
vasculares (Gilbertson & Rich, 2007). Estes dados têm implicações diretas para o
69
tratamento do câncer, destacando-se, neste sentido, as linhas de investigação que
buscam identificar o microambiente dos tumores como um alvo para terapias novas.
(Gilbertson & Rich, 2007). Neste aspecto o modelo experimental aqui proposto para
se rastrear as células-tronco mutantes pode ser útil para estudos futuros nesta linha
de pesquisa.
Persistem algumas questões fundamentais para serem esclarecidas sobre as
células-tronco tumorais: todas elas requerem a existência de nichos de suporte?
Estes nichos seriam também alterados geneticamente? Os nichos de células-tronco
tumorais seriam os direcionadores do desenvolvimento tumoral ou seriam apenas
consituídos por células recrutadas por células-tronco tumorais pré-formadas? É
possível que o modelo experimental por nós desenvolvido no presente trabalho
através da marcação de possíveis células-tronco tumorais pela metalotioneína possa
ser útil para encontrar pistas que levem até respostas para estas e outra questões. Um
melhor entendimento das características genéticas das células que expressam
metalotioneínas durante a gênese de gliomas poderá ser um caminho importante
para futuras pesquisas. Em suma, no presente trabalho, foi desenvolvido um método
facilmente reprodutível de identificação de possíveis células-tronco mutantes
relacionadas à gênese de gliomas, o qual poderá ser útil para o aprofundamento dos
estudos sobre estas células.
Estudos adicionais serão necessários para que se estabeleçam relações
inequívocas entre as células alvo da ação da ENU na região subpial da medula
espinhal, as células subpiais que expressam metalotioneínas no modelo
experimental da ENU e as células precursoras de elementos gliais na medula
espinhal.
70
7 Conclusões
71
O presente estudo permite concluir que:
1- A administração de N-etil-N-nitrosurourea na dose de 40mg/kg de
peso corporal em ratos no primeiro dia de vida leva a alta incidência
de neoplasias intramedulares;
2- A administração de N-etil-N-nitrosurourea na dose de 40mg/kg de
peso corporal em ratos no primeiro dia de vida leva a aumento da
expressão de metalotioneinas e fator de crescimento vascular
endotelial na região subpial da medula espinhal;
3- O aumento da expressão de metalotioneinas e fator de crescimento
vascular endotelial na região subpial após administração de N-etil-N-
nitrosurourea na dose de 40mg/kg de peso corporal em ratos é evento
precoce no processo de cacinogênese da medula espinhal.
72
8 Anexos
73
Figura 2
-
Exposição da medula espinhal
A-Dissecção do dorso de rato e exposição dorsal da coluna vertebral
B-Dissecção do dorso de rato, e exposição da medula espinhal após
laminectomia e durotomia
A
B
74
A
B
C
D
Figura 3
–
Reações “controle” de imuno
-
histoquímica
A-Metalotioneínas, controle positivo em fígado humano (400X)
B-Metalotioneínas, controle negativo em fígado humano (400X)
C-VEGF, controle positivo em endométrio humano (300X)
D-VEGF, controle negativo em endométrio humano (300X
)
75
C
D
Figura 7 – Neoplasias induzidas pela ENU
A-Exposição dorsal da medula espinhal de rato do grupo G3 após laminectomia
e durotomia
B-Neoplasia intramedular dorsall
C-Neoplasia de raiz nervosa em cauda eqüina no mesmo animal
A
B
C
76
A
D
Figura 8 – Neoplasias induzidas pelo ENU
A-Neoplasia intramedular cervical
B-Neoplasia intramedular em cone medular
A
B
77
Figura 9 – Neoplasia intramedular
A -Neoplasia intramedular no segmento torácico da medula espinhal, com alta densidade
celular e hemorragia intratumoral (50X)
B –reação imuno-histoquímica para LCA não reagente (25X)
C
–
reação imuno
-
histoquímica pra GFAP fortemente reagente(25X)
A
B
C
78
D
Figura10 – Reação imuno-histoquímica para VEGF
A-Neoformação vascular em neoplasia intramedular
B-Marcação para VEGF na região subpial de rato do grupo G1
C-Marcação para VEGF na região subpial de rato do grupo G2
D Marcação para VEGF na região subpial de rato do grupo G3
C
B
C
D
A
79
A
B
C
D
E
F
T
T
Figura 11 – Reação imuno-histoquímica para MT
A e B – células marcadas na borda de neoplasias intramedulares
C – células marcadas próximas a vasos sangüíneos
D- agrupamentos de células marcadas para animal do grupo G2
E – marcação para MT na região subpial de animal do grupo controle
F- marcação para MT na região subpial de animal tratado com ENU
80
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Diretrizes para Apresentação de Teses e Dissertações à USP: documento eletrônico ou
impresso. São Paulo: SIBi/USP, 2001
Norma Técnica ABNT NBR 6023 – Informação e documentação-Referências e
elaboração-Agosto 2000
111
Summary
SILVA, J.C.F. Expression of metallothionein and vascular endothelial
growth factor in a spinal cord experimental oncogenesis. 111 p. Ribeirão Preto
Medical College – University of São Paulo, Ribeirão Preto, Brazil.
BACKGROUND - Established clinical and experimental evidence provides the
basis for the current concept that metallothioneins (MT) and v
ascular endothelial
growth factor (VEGF)
are involved in the carcinogenesis of the gut, liver and other
organs.
MATERIAL AND METHODS -
The expression of MT, an intracellular
ubiquitous low molecular weight protein with antioxidant properties, was
studied in the experimental gliomagenesis with administration of
N-ethyl N-
nitrosourea (ENU) in rats
and correlated with the expression of VEGF. The
animals were
euthanized at the age of 30 and 180 days or soon after the appearing
of signs of the existence of nervous system tumors.
Immunohistochemical staining
of randomly selected, formalin-fixed and paraffin-embedded normal and
malignant samples of the rat spinal cord were analyzed for the expression of MT
and quantifying the Mt over expressing cells (MTEC) using the commercially
available antibody directed against MT. The corresponding VEGF staining
labeling vessels indices were evaluated in sequential samples.
RESULTS - All the tumor sections showed VEGF and MT-immunopositivity.
The
untreated control animals showed a low frequency of MTEC in all the three regions
of the spinal cord that were evaluated. In the ENU-treated groups the frequency of
MTEC was significantly higher than that of non-treated animals. Furthermore, in the
ENU-treated animals, the immunohistochemical localization of MT was
demonstrated in both the cytoplasm and the nuclei of the apparently normal nervous
tissue cells, whereas in the control animals the MT staining was considerably
weaker and localized in the cytoplasm. The administration of ENU led to a
significant increase in number of VEGF positive vessels in the subpial region in
comparison to the control animals.
CONCLUSIONS - These results provided the initial preliminary evidence that
indicated that up regulation of MT and VEGF expression is associated with
gliomagenesis. Furthermore, the pattern of MT expression during experimental
gliomagenesis we found suggests that we may have developed and quantified a
reproducible model for marking putative mutant stem cells related to gliomagenesis.
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