( PDF ) A expressão diferencial da telomerase e do fator de crescimento vascular endotelial pode contribuir para o comportamento mais agressivo dos carcinomas mamários p63 positivos

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA

Heveline Becker de Moura

A expressão diferencial da telomerase e do fator de

crescimento vascular endotelial pode contribuir para o

comportamento mais agressivo dos carcinomas

mamários p63 positivos.

Ribeirão Preto

2008

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Heveline Becker de Moura

A expressão diferencial da telomerase e do fator de

crescimento vascular endotelial pode contribuir para o

comportamento mais agressivo dos carcinomas mamários p63

positivos.

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Departamento de Patologia da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto da Universidade

de São Paulo para obtenção do título de

Mestre em Patologia Humana

Orientador: Prof. Dr. Alfredo Ribeiro-Silva

Ribeirão Preto

2008

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FICHA CATALOGRÁFICA

Moura, Heveline Becker de

A expressão diferencial da telomerase e do pode contribuir para

o comportamento mais agressivo dos carcinomas mamários

p63 positivos.

115 p.: il.; 30 cm

Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Medicina

de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo. Área de

Concentração: Patologia.

Orientadora: Prof. Dr. Afredo Ribeiro-Silva

1. p63 2. carcimoma mamário 3. imuno-histoquímica

4. Telomerase 5. fator de crescimento vascular endotelial

"Grandes realizações não são feitas por impulso, mas por uma soma de

pequenas realizações."

Vincent Van Gogh

Dedicatórias

À minha mãe, Ana Cândida Becker Campos, pelo apoio e amor

incondicional para com os filhos, que possibilitaram o meu

desenvolvimento profissional.

A meu pai, Estevido José Moura, pelos bons momentos da minha infância.

A meu irmão, Newton Célio Becker de Moura, pela amizade e carinho

constantes.

Ao Doug e Juca, pela alegria que sempre trazem a minha vida.

À minha prima e madrinha, Jaqueline, pela iniciação no mundo das artes.

Às minhas Tias, que sempre acompanharam meus passos com carinho,

amor e atenção.

À minhas primas e aos meus primos, pela amizade.

Aos meus avós e avôs, pelas lembranças encantadoras da vida;

A toda minha família, que apesar da distância, sempre prezou pelo

sentimento de união.

Aos amigos de Ribeirão Preto, Fernanda, Gyl, Raquel, Luciana, Vinicius,

Isabel, Igor e Guilherme, pelos bons momentos vividos nesta saudosa

cidade.

À Dra Catarina Schaletich, pelo acolhimento, pelos ensinamentos

de patologia e pela amizade que tornaram inesquecíveis os momentos que

morei em Ribeirão Preto;

Ao meu amigo e companheiro, Régis Eric Maia Barros, pelo amor,

paciência e a vida que construímos juntos.

Agradecimentos

Agradeço a todos que contribuíram

para a realização deste trabalho

Agradeço ao meu Orientador, Prof. Dr. Alfredo Ribeiro-Silva, por ter

acreditado no meu potencial;

Agradeço a Deisy Mara da Silva pelo apoio técnico na realização dos

exames de imuno-histoquímica;

Agradeço aos Residentes e Médicos Assistentes do Serviço de Patologia os

quais e aos docentes do Departamento de Patologia da FMRP/USP, através do

convívio diário, transformaram a rotina do trabalho em algo especial, estimulante e

prazeroso;

Agradeço ao Prof. Dr. Sérgio Zucoloto, Chefe do Departamento de Patologia

da FMRP/USP, ao Prof. Dr. Roberto Silva Costa, Coordenador do Serviço de

Patologia do HCFMRP/USP, e ao Dr. Daniel Ferracioli Brandão, Diretor Técnico

do Serviço de Patologia do HCFMRP/USP, por terem fornecido as condições

necessárias para a realização do projeto;

Agradeço à histotécnica Deisy Mara da Silva pelo suporte técnico na

realização do método imuno-histoquímico;

Agradeço aos arquivistas do Serviço de Patologia do HCFMRP/USP, Décio

Antônio Barrionovo Filho e César Alberto Brigato Júnior, pela presteza em

separar dos arquivos as lâminas e blocos de parafina utilizados no projeto;

Agradeço ao Prof. Dr. Sérgio Britto Garcia, coordenador do Programa de

pós-graduação do Departamento de Patologia da FMRP/USP, pelo apoio em todas as

atividades acadêmicas relacionadas à pós-graduação;

Agradeço às secretárias, aos técnicos do laboratório e da sala de necropsia do

Serviço de Patologia da FMRP/USP que contribuíram que os estudos da residência

de patologia cirúrgica continuassem na pós-graduação;

Agradeço à saudosa Edna Pio, pelo apoio em todas as atividades da

residência de patologia da FMRP/USP e da pós-graduação;

Agradeço às secretárias do Departamento de Patologia da FMRP/USP, Neide

Terezinha Gonçalves e Rosângela Mazzucoto Castania de Paiva, pela solicitude.

Este trabalho contou com apoio financeiro da

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

(FAPESP- Processo 2003/02532-8)

Este trabalho resultou na seguinte publicação

The differential regulation of human telomerase reverse

transcriptase and vascular endothelial growth factor may contribute

to the clinically more aggressive behavior of p63-positive breast

carcinomas

The International Journal of Biological Markers 2005; 20: 1-8.

Sumário

LISTA DE TABELAS

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

LISTA DE ABREVIATURAS

RESUMO

SUMMARY

1. INTRODUÇÃO......................................................................................................1

2. REVISÃO DA LITERATURA............................................................................. 3

2.1 A família do gene p53 ................................................................................... 3

2.1.1 A estrutura dos membros da família p53............................................ 4

2.1.2 As isoformas da família p53: funções e vias metabólicas ................. 5

2.1.3 A família p53 e a carcinogênese......................................................... 6

2.2 O gene p63..................................................................................................... 8

2.2.1 Estrutura do gene p63......................................................................... 8

2.2.2 Função do gene p63............................................................................ 9

2.2.2.1 O gene p63 como fator de transcrição ................................ 9

2.2.2.2 O gene p63 na regulação do ciclo celular e apoptose ....... 10

2.2.2.3 p63: Oncogene ou gene supressor tumoral? ..................... 11

2.2.3 A relação do gene p63 com o desenvolvimento embrionário e

com os tecidos epiteliais ........................................................................... 13

2.2.4 Expressão da proteína p63 em tecidos normais ............................... 14

2.2.5 O p63 em síndromes humanas ......................................................... 18

2.2.6 O p63 e neoplasias de células escamosas ........................................ 19

2.2.7 O p63 em neoplasia de cabeça e pescoço ........................................ 20

2.2.8 O p63 em neoplasias uroepiteliais ................................................... 23

2.2.9 O p63 em neoplasias ginecológicas ................................................. 24

2.2.10 O p63 e outras neoplasias .............................................................. 26

2.2.11 O p63 em patologia mamária.......................................................... 27

2.3 A biologia molecular do câncer ................................................................... 32

2.3.1 O Ciclo celular e genes que regulam o ciclo celular ........................ 32

2.4. Alterações essenciais para a transformação maligna.................................. 35

2.5. Transformação maligna na mama............................................................... 38

2.5.1 Auto-suficiência nos sinais de crescimento ..................................... 38

2.5.2 Insensibilidade aos sinais inibidores ................................................ 41

2.5.3 Potencial infinito de replicação: Telomerase.................................... 45

2.5.4 Angiogênese ..................................................................................... 46

2.5.5 Invasão tecidual e Metástase ............................................................ 48

2.6 Fatores prognósticos em câncer de mama ................................................... 52

2.6.1 Fatores clínico-patológicos e prognósticos utilizados na rotina de

patologia mamária ..................................................................................... 53

2.6.2 Marcadores imuno-histoquímicos não definidos quanto ao seu

papel ou com papel secundário na rotina de patologia mamária............... 58

3. JUSTIFICATIVA................................................................................................. 62

4. OBJETIVOS.........................................................................................................66

5. METODOLOGIA................................................................................................67

5.1 Sujeito .......................................................................................................... 67

5.2 Imuno-histoquímica..................................................................................... 69

5.3 Controles da imuno-histoquímica................................................................ 72

5.4 Interpretação das reações de imuno-histoquímica ....................................... 72

5.5 Análise estatística......................................................................................... 81

6. RESULTADOS.....................................................................................................82

7. DISCUSSÃO......................................................................................................... 91

8. CONCLUSÕES.................................................................................................. 101

9. BIBLIOGRAFIA................................................................................................102

Lista de tabelas

Tab. 1

Distribuição da proteína p63 em tecidos adultos normais..................... 17

Tab. 2

Concentrações, clones, diluições e fabricantes dos anticorpos

utilizados................................................................................................ 71

Tab. 3

Interpretação da positividade dos anticorpos utilizados no estudo........ 75

Tab. 4

Padrão de imunomarcação e escores utilizados para a avaliação de

expressão do c-erbB-2 ........................................................................... 76

Tab. 5

Interpretação imuno-histoquímica do ki-67 .......................................... 77

Tab.6

Padrão de imunomarcação e escores utilizados para a avaliação de

expressão do EMMPRIN, MMP1, MMP2, PAI, TIMP1 e TIMP2....... 78

Tab. 7

Estudo imuno-histoquímico dos fatores clínico-patológicos e

prognósticos utilizados na rotina de patologia mamária........................ 83

Tab. 8

Relação da expressão da proteína p63 nos carcinoma ductais

invasores com fatores clínico-patológicos............................................. 85

Tab. 9

Positividade da reação de imuno-histoquímica para as proteínas que

atuam como reguladores do ciclo celular nos carcinomas ductais

invasores. ............................................................................................... 86

Tab. 10

Relação entre a expressão de fatores reguladores do ciclo celular e a

expressão da proteína p63 nos carcinoma ductais invasores................. 87

Tab. 11

Positividade da reação de imuno-histoquímica para as proteínas que

atuam como reguladores da apoptose nos carcinomas ductais

invasores. ............................................................................................... 88

Tab.12

Relação entre a expressão imuno-histoquímica de fatores

reguladores da apoptose e a expressão da proteína p63 nos

carcinoma ductais invasores .................................................................. 88

Tab.13

Positividade da reação de imuno-histoquímica para as proteínas que

atuam no processo de invasão e metástase nos carcinomas ductais

invasores ................................................................................................ 89

Tab.14

Relação da proteína p63 com o VEGF e com outras proteínas

envolvidas no processo de invasão e metástase nos carcinomas

ductais invasores ................................................................................... 90

Lista de ilustrações

Figura 1

Marcação nuclear da proteína p63............................................. 79

Figura 2

Exemplo de marcação nuclear................................................... 79

Figura 3

Exemplo de marcação citoplasmática........................................ 80

Figura 4

Exemplo de marcação de membrana ......................................... 80

Lista de abreviaturas

Akt: proteína da família serina/treonina quinase;

APAF-1: protease apoptótica ativadora do fator 1 (“apoptotic protease

activating factor 1”);

APO-1: proteína indutora de apoptose 1(“apoptosis inducing protein 1”);

ATP: adenosina tri-fosfato;

Bad: proteína que está ligada à membrana mitocondrial de membros anti-

apoptóticos da família Bcl-2;

Bag-1: proteína anti-apoptótica da família bcl-2. O gene que codifica esta

proteína está em itálico (Bag-1);

Bax: proteína pró-apoptótica da família bcl-2 (bcl-2 associated X protein

antibody). O gene que codifica esta proteína está em itálico (Bax);

Bcl-2: gene que está localizado na membrana mitocondrial interna de

numerosos tipos celulares. Considerado um proto-oncogene;

Bcl-2: proteína codificada pelo gene bcl-2 e promove a sobrevivência

celular, inibindo a ocorrência de apoptose;

BRCA-1: gene “breast cancer 1” responsável pela reparação do DNA;

BRCA-2: gene “breast cancer 2” responsável pela reparação do DNA;

CDK: quinases ciclina-dependentes;

C-erbB-2: produto do oncogene HER-2/neu(c-erbB-2);

Chk-2: proteína responsável pela parada do ciclo celular ou apoptose quando

o DNA celular sofre danos;

Cip/Kip: inibidores de quinases ciclina-dependentes. A família Cip/Kip é

constituída pelas proteínas p21, p27 e p57;

COOH-terminal: carboxiterminal;

CpG: são citosinas que são seguidas imediatamente por uma guanina

(dinucleotídeos CpG).

DAB: diamino-benzidina;

DBD: domínio de ligação ao DNA (“Domain Binding DNA”);

DNA: ácido desoxirribonucléico;

E2F: proteína E2F regula a expressão de vários genes promotores de

crescimento

EGFR: Receptor do fator de crescimento epitelial.

EMMPRIN: Indutor das metaloproteinases da matriz extracelular ;

FAK: quinase de adesão focal intracitoplasmática;

FAS: proteína codificada pelo gene Fas e é um membro da família dos

receptores TNF;

FMRP: Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto;

G1: fase pré-sintética do ciclo celular;

G2: fase pré-mitótica do ciclo celular;

HCFMRP: Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto;

HER-1, HER-2, HER-3, HER-4: são membros da família de receptores HER

(factor de crescimento epidérmico humano-

EGFR);

hTERT: sub-unidade catalítica com atividade transcriptase reversa da

telomerase; hTP: sub-unidade da telomerase que desempenha papel

estrutural;

hTR: sub-unidade de RNA da telomerase;

INK4a/ARF: gene que codifica proteínas inibidoras da quinase ciclina-

dependentes;

Ki-67: indicador de proliferação celular;

LOH: perda da heterozigosidade;

M: fase mitótica do ciclo celular;

MDM2: proteína importante na via de degradação da p53. Abreviação de

“Mouse double minute 2”;

MMP: metaloproteinases;

-terminal: aminoterminal;

NOXA: gene pró-apoptótico depedente do p53;

NOS: sem outra especificação (“nother otherwise specified”);

OD: domínio de oligomerização (“oligomerization domain”);

OPN: osteopontina;

PAI: Inibidor do ativador do plasminogênio;

PBS: solução salina fosfatada e tamponada;

PCR: reação de polimerase em cadeia;

PERP: gene pró-apoptótico depedente do p53;

PI-3 quinase: fosfatidil-inositol-3-quinase. Importante na regulação da mitogênese;

PIK3CA: enzima fosfoinositídeo 3-quinase;

P14ARF: proteína reguladora do ciclo celular e produzida no locus INK4A;

P16INK4a: proteína reguladora do ciclo celular e produzida no locus CDKN2A

(INK4A);

p21, p27, p57: proteínas reguladoras do ciclo celular. Atuam como inibidoras das

quinases ciclina-dependentes;

P53: gene supressor tumoral. Codifica a proteína p53;

p53

: célula sem alelos p53;

p63: gene da família p53. Codifica a proteína p63;

p63

: célula sem alelos p63;

p73: gene da família p53. Codifica a proteína p73;

Rb: proteína de susceptibilidade ao retinoblastoma que atua na regulação

do ciclo celular;

RE: Receptor de estrógeno;

RET: proto-oncogene. Abreviação de "rearranged during transfection”;

RNA: Ácido ribonucléico;

RP: Receptor de progesterona;

RT-PCR: reverso da transcrição da reação em cadeia de polimerase;

S-100: proteína utilizada em reações de imuno-hsitoquímica;

SAM: domínio de interação proteína-proteína conhecido como “sterile

alpha motive” das proteínas p63

(TAp63 e ∆Np63);

Síndrome ADULT: “acro-dermato-ungual–lacrimal–tooth syndrome”;

Síndrome AEC: “ankyloblepharon-ectodermal dysplasia-clefting syndrome”;

Síndrome EEC: “ectodermal dysplasia, ectrodactyly and clefting syndrome”;

Síndrome LMS: “limb-mammary syndrome”;

Síndrome SHFM: “split hand/split foot malformation syndrome”;

SV40/H-ras: oncogene. Abreviação de “simian virus 40” e “harvey rat sarcoma

viral oncogene homolog”, respectivamente;

TAD (TA): domínio de transativação (“transactivation domain”) ;

TAp63α, TAp63β, TAp63γ: proteínas que codificam o domínio de transativação

(TA) do p63;

TIMP-1: Inibidor da metaloproteinase tipo 1;

TIMP-2: Inibidor da metaloproteinase tipo 2;

tPA: ativador de plasminogênio do tipo tecidual;

TNF: Fator de necrose tumoral;

TNM: sistema usado para o estadiamento de neoplasias;

TRAP: protocolo da amplificação repetida da telomerase;

USP: Universidade de São Paulo;

uPA: ativador de plasminogênio do tipo uroquinase;

VEGF: Fator de crescimento endotelial vascular;

VEGFR: Receptor do fator de crescimento endotelial vascular.

∆Np63α, ∆Np63β, ∆Np63γ: proteínas que não apresentam o domínio de

transativação (∆N) do p63;

34βE12: citoqueratina de baixo peso molecular.

Resumo

O p63, homólogo do p53, é marcador de células mioepiteliais nas glândulas

mamárias normais e pode ser encontrada em cerca de 11% dos carcinomas mamários

invasivos. O objetivo deste trabalho é estudar a relação entre a expressão da p63,

fatores clínico-patológicos e marcadores utilizados em patologia mamária, incluindo

reguladores do ciclo celular, oncogenes, proteínas relacionadas a apoptose,

metaloproteinases e inibidores das metaloproteinases. Foi realizado estudo imuno-

histoquímico com 27 anticorpos primários em 100 casos de carcinomas ductais

invasores. Células p63 positivas foram encontradas em 16% dos carcinomas. Os

carcinomas p63-positivos são pouco diferenciados, negativos para receptores

hormonais e apresentam índice de proliferação elevado. Estes carcinomas também

apresentam correlação com estadiamento patológico avançado, tamanho tumoral e

expressão de hTERT, TIMP1 e VEGF. A expressão de TIMP1 sugere que o estímulo

antiproteolítico pode estar presente nos carcinomas p63 positivos. A atividade do

hTERT está associada com metástase para linfonodos e proliferação celular. O

VEGF regula a angiogênese que é um evento fundamental para o processo de

crescimento tumoral e disseminação metastática. Portanto a expressão do hTERT e

do VEGF nos carcinomas p63 positivos pode contribuir para o comportamento

clínico mais agressivo destes carcinomas

Summary

p63, a p53 homologue, is a myoepithelial cell marker in the normal mammary

gland but p63-positive neoplastic cells may be found in up to 11% of invasive breast

carcinomas. This study aims to verify the relationship between p63 expression and

several clinicopathological features and tumor markers of clinical significance in

breast pathology including key regulators of the cell cycle, oncogenes, apoptosis-

related proteins, metalloproteinases and their inhibitors. Immunohistochemistry with

27 primary antibodies was performed in 100 formalin-fixed paraffin-embedded

samples of invasive ductal carcinomas. p63-positive cells were found in 16% of

carcinomas. p63-positive carcinomas were poorly differentiated, hormone receptor-

negative neoplasms with a high proliferation rate. p63 also correlated with advanced

pathological stage, tumor size, and the expression of human telomerase reverse

transcriptase (hTERT), tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 (TIMP1) and

vascular endothelial growth factor (VEGF). The expression of TIMP1 suggests that

the anti-proteolytic stimuli may be preponderant in p63-positive carcinomas. hTERT

activity is associated with nodal metastases and cellular proliferation. VEGF

regulates angiogenesis, which is also a fundamental event in the process of tumor

growth and metastatic dissemination. Thus, the differential regulation of hTERT and

VEGF in p63-positive breast carcinomas may contribute to the clinically more

aggressive behavior of these neoplasms.

Introdução 1

1. INTRODUÇÃO

O p63 é um homólogo do gene p53 localizado no cromossomo 3q27-29 (Osada

et al., 1998; Yang et al., 1998). Ele faz parte da família do gene p53, mas codifica

proteínas com propriedades distintas dos outros genes de sua família. O p53 é

considerado como gene supressor tumoral, no entanto o p63 apresenta atividade

biológica diversa, complexa e pouco definida (Moll; Slade, 2004; Westfall; Pietenpol,

2004). Em condições normais, a proteína p63 é expressa nos tecidos embrionários e no

núcleo de células basais de muitos tecidos epiteliais em adultos como a epiderme, o

epitélio glandular mamário, o epitélio oral, o epitélio glandular prostático e o urotélio

(Di Como et al., 2002; Signoretti et al., 2000; Westfall; Pietenpol, 2004). O gene p63

está envolvido no desenvolvimento de órgãos que contêm tecidos epiteliais, membros,

estruturas crânio-faciais e anexos. De fato, camundongos deficientes em p63

apresentam anomalias no desenvolvimento embrionário, como ausência de folículos

pilosos, dentes, glândulas mamárias, salivares e lacrimais (Mills et al., 1999; Yang et

al., 1999).

Em patologia mamária, a proteína p63 é considerada um marcador com alta

especificidade e sensibilidade para células mioepiteliais, tanto em cortes histológicos

como em estudos citológicos (Barbareschi et al., 2001; Batistatou et al., 2003). Através

de estudos imuno-histoquímicos, a proteína p63 é expressa por um padrão de marcação

contínua nas células mioepiteliais do tecido glandular mamário normal. Na hiperplasia

ductal florida e no carcinoma ductal in situ são observadas raras células p63-positivas.

Os carcinomas ductais invasivos geralmente são negativos para a proteína p63. Estes

dados sugerem associação entre a perda da expressão da proteína p63 com a progressão

do carcinoma ductal (Ribeiro-Silva et al., 2003; Stefanou et al., 2004; Wang et al.,

Introdução 2

2002). Entretanto, uma positividade de até 11% é observada em células neoplásicas de

carcinomas mamários (Barbareschi et al., 2001; Ribeiro-Silva et al., 2003; Stefanou et

al., 2004).

O papel da proteína p63 na regulação do ciclo celular, na apoptose, em

síndromes genéticas e na carcinogênese ainda é pouco conhecido. Este estudo tem por

finalidade investigar, em carcinomas ductais invasores, a relação entre a expressão da

proteína p63, fatores clínico-patológicos e prognósticos utilizados na rotina de patologia

mamária e proteínas envolvidas na progressão tumoral, incluindo proteínas reguladoras

do ciclo celular, da apoptose, da angiogênese, da metástase e invasão tumoral, além de

produtos de oncogenes.

Revisão da Literatura 3

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 A família do gene p53

O gene p53 está localizado no braço curto do cromossomo 17 e codifica a

proteína nuclear 53-kd. Este gene exerce função de supressor tumoral em mamíferos.

Ele pode se apresentar na forma selvagem e na forma mutada. O tipo selvagem

encontra-se no núcleo de todas as células dos mamíferos. Está envolvido na regulação

do ciclo celular e na indução da apoptose quando há agressão ao DNA celular. A forma

mutada ou a inativação do gene p53 estão relacionadas com eventos que resultam no

desenvolvimento e progressão tumoral (Moll; Slade, 2004;Yang et al., 1998).

Em 1997 e 1998 foram identificados genes homólogos ao p53 denominados p63

e p73 (Osada et al., 1998; Yang et al., 1998). O p63 e o p73 apresentam estrutura

semelhante a do p53, funções relacionadas com as do p53 e funções diferentes das

exercidas pelo p53. As funções relacionadas ao p53 ainda podem ser sinérgicas ou de

interferência (Moll; Slade, 2004). Por exemplo, camundongos deficientes em p73

apresentam taxas de apoptose aumentadas, sugerindo que em condições normais o p73

tem uma atividade anti-apoptose, contrapondo-se ao efeito pró-apoptose do p53. Esta

seria a função de inteferência relacionadas ao p53 (Moll; Slade, 2004; Ribeiro-Silva;

Zucoloto, 2003). Entretanto, de maneira similar ao p53, o p73 e o p63 podem bloquear o

ciclo celular e desencadear apoptose quando há lesão ao DNA, exemplificando a função

sinérgica relacionadas ao p53 (Moll; Slade, 2004; Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003).

Revisão da Literatura 4

2.1.1 A estrutura dos membros da família p53

Os membros da família p53 apresentam homologia estrutural. Todos possuem

um domínio de transativação (TAD–“transactivation domain”) próximo ao

aminoterminal (NH

-terminal), um domínio de ligação ao DNA (DBD–“DNA binding

domain”) e um domínio de oligomerização (OD–“oligomerization domain”) próximo ao

carboxiterminal (COOH-terminal). O mais alto grau de homologia entre os genes da

família p53 é verificado no DBD (63% da seqüência de aminoácidos são idênticos entre

o p53 e o p73 e 60% são idênticos entre o p53 e o p63) (Di Como et al., 2001; Moll;

Slade, 2004; Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004).

As proteínas codificadas pelos genes podem possuir ou não o domínio de

transativação. As proteínas que codificam o domínio de transativação são denominadas

TA (TAp53, TAp63 e TAp73). As proteínas que não apresentam o domínio de

transativação são denominadas ∆N (∆Np53, ∆Np63 e ∆Np73) (Di Como et al., 2001;

Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004). Segundo Moll e Slade (2004), as

proteínas com o domínio TA simulam as funções do p53 em culturas de células,

incluindo a ativação de genes alvo do p53 e a indução da apoptose. As proteínas

denominadas ∆N atuam como inibidores de membros da família p53 (Moll; Slade,

2004).

As proteínas derivadas dos genes p63 e p73 podem acrescentar emendas no

COOH-terminal e dar origem a diferentes produtos conhecidos como isoformas destes

genes. O p73, por exemplo, pode formar isoformas produzindo pelo menos seis

proteínas diferentes que foram identificadas com letras gregas de α a ζ . As proteínas

codificadas pelo p73 podem apresentar o domínio de transativação: TAp73α a TAp63ζ.

As proteínas que não apresentam o domínio de transativação são denominadas de

Revisão da Literatura 5

∆Np73α a ∆Np73ζ (Di Como et al., 2001; Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003; Yang et al.,

1998; Westfall; Pietenpol, 2004).

O p63 e o p73 exibem estrutura mais complexa do que a do p53. Eles possuem

no COOH-terminal um domínio denominado “sterile alpha motif” (SAM) que não está

presente nos produtos derivados do p53. Foi descrito que este domínio está envolvido

no processo de desenvolvimento embrionário, de apoptose e na ativação de transcrição

(Westfall; Pietenpol, 2004). O p63 e o p73 ainda possuem um domínio inibidor nas

isoformas “α” e dois promotores. O promotor P1 produz isoformas TA que possuem

atividade transcricional e o promotor P2 produz isoformas ∆N que possuem atividade

de dominante negativo (Moll; Slade, 2004).

2.1.2 As isoformas da família p53: funções e vias metabólicas

A depender da isoforma atuante, os produtos dos genes da família p53 podem

exercer funções diferentes. Por exemplo, estruturalmente as isoformas “γ” dos genes

p63 e p73 são as que mais se assemelham ao gene p53. A isoforma TAp63γ possui

atividade de transcrição e de indução da apoptose tão potente quanto ao do p53. No

entanto, a isoforma TAp73γ exerce as mesmas atividades da TAp63γ de forma menos

intensa. Já a isoforma TAp73α exerce as atividade de transcrição e de indução da

apoptose de forma mais intensa que a da TAp63α (Moll; Slade, 2004).

As isoformas da família p53 exercem atividades diversificadas, pois atuam sobre

proteínas-alvo e vias metabólicas diferentes que serão pormenorizados no decorrer do

texto (Moll; Slade, 2004). Por exemplo, o p53 age em diferentes vias. Entre elas

encontram-se as que envolvem as proteínas p21, bax, bcl-2 e ChK2. Atuando como

reparador do DNA, o p53 induz a proteína p21. Esta promove parada do ciclo celular

Revisão da Literatura 6

para que o DNA possa ser reparado. Quando ocorre dano grave ao DNA e este não pode

ser reparado, o p53 induz a apoptose, regulando positivamente o bax e negativamente o

bcl-2(Rieger, 2004). A proteína ChK2, também conhecida como quinase de estresse,

ativa o p53 quando ocorre ação dano ao DNA celular (Ahn et al., 2004; Moll; Slade,

2004). O p53 ainda exerce ação inibitória sobre o VEGF (fator de crescimento

endotelial vascular) (Hanahan; Weinberg, 2000; Moll; Slade, 2004; Rieger, 2004).

Outras vias como a da proteína p14ARF aumenta os níveis da proteína p53 através da

inibição da atividade da MDM2 (“mouse double minute 2”), proteína que promove a

degradação do p53 (Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger, 2004).

O p73 age na via das proteínas p21, 14-3-3σ e p16. Esta última exerce sua atividade

sobre membros anti-apoptótico da família bcl-2. O p73 a induz a formação do MDM2. Ao

estimular a formação do MDM2, o p73 deve exercer o que Moll e Slade (2004)

denominaram de função de interferência relacionada ao p53. Portanto, o p73 deve exercer

algum tipo de efeito inibitório sobre o p53 (Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003; Moll; Slade,

2004). Moll e Slade (2004) descreveram que alguns oncogenes, como o c-Myc, podem

induzir isoformas do p73. Este gene ainda inibe o VEGF e interage com várias ciclinas e

quinases ciclina-dependentes (Garcia et al., 2004; Ishimoto et al., 2002; Moll; Slade, 2004).

Em relação à embriogênese, o p63 parece ser essencial ao desenvolvimento e à

diferenciação de determinados tecidos epiteliais. Já o p73 está envolvido no

desenvolvimento de estruturas e células do sistema nervoso (Moll; Slade, 2004, Yang et al.,

1998).

2.1.3 A família p53 e a carcinogênese

Em relação à carcinogênese, o supressor tumoral p53, é um dos genes mais

freqüentemente mutado em todos os cânceres humanos. Neoplasias de cólon, mama,

Revisão da Literatura 7

cérebro e pulmão mostram mutação de sentido trocado (“missense”) do p53. Outras

neoplasias malignas, como os sarcomas, não apresentam alterações no p53, mas

apresentam superexpressão da proteína MDM2 (“mouse double minute 2”), que

promove a degradação da proteína p53 (Yang et al., 1998).

O p73 foi mapeado no cromossomo 1p36, uma região em que a perda da

heterozigosidade é freqüentemente observada em tumores humanos, como câncer de

mama, cólon, neuroblastomas, oligodendrogliomas e melanoma (Moll; Slade, 2004;

Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003). A perda de alelos no braço 1p é observada em 13% a

75% dos carcinomas mamários, conforme o intervalo gênico estudado. Tumores

mamários com estas perdas apresentam pior prognóstico, apresentando alto grau

histológico, invasão angiolinfática peritumoral e ausência de receptores hormonais

(Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003). A superexpressão do gene p73 é encontrada em

leucemia linfóide crônica de células B, meningiomas, neuroblastomas, câncer de mama,

de pulmão, de esôfago e em diversos outros tumores (Moll; Slade, 2004).

Estudos de mutação realizados em diferentes tumores humanos detectaram raras

mutações do p73 aparentemente sem significado. Vários tumores expressam altos níveis

da proteína p73 quando comparados com o tecido normal que os origina, sugerindo que,

na realidade, possa ocorrer uma expressão alterada do p73, e não a perda de sua função,

como ocorre com o p53 (Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003).

Nos carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço, tanto o p53 como as

isoformas do p63 e do p73 são expressas, sugerindo que tanto o p63 quanto o p73

tenham participação importante na carcinogênese dos tumores escamosos da cabeça e

pescoço, atuando como oncogenes (Gwosdz et al., 2005).

Apesar de estar presente em diversos tumores, a função do p73 na carcinogênese

não é bem definida. Alguns estudos denominam o p73 e, por vezes, o p63 como

Revisão da Literatura 8

oncogenes. Outros estudos descrevem estes genes como supressores tumorais (Ishimoto

et al., 2002; Moll; Slade, 2004). Pesquisas adicionais são necessárias para melhor

compreensão das funções, interações, identificação das proteínas-alvo e das vias

metabólicas dos membros da família p53 (Moll; Slade, 2004).

2.2 O gene p63

O p63, clonado em 1998, é alvo de várias pesquisas que tentam elucidar as

complexas interações entre os membros da família p53 (Osada et al., 1998; Trink et al.,

1998; Yang et al., 1998). Clonado por vários grupos de forma independente, o gene p63

apresenta nomenclatura diversa, a depender da isoforma expressa: KET, p51A, p51B,

p40 e p73L (Westfall; Pientepol, 2004).

Apesar de ser considerado o membro mais novo da família p53, estudos

filogenéticos demonstram que o p63 é predecessor do p53 e do p73 e a sua organização

genômica está altamente conservada entre as diferentes espécies (Yang et al., 1998).

Como já foi dito, os três membros da família p53 apresentam alto grau de homologia

entre si. No entanto as proteínas codificadas pelos genes desta família são similares,

mas não idênticas. Os produtos do gene p63 compartilham algumas funções, mas o

papel fisiológico nas células parece ser diferente (Yang et al., 1998).

2.2.1 Estrutura do gene p63

O gene p63 está localizado no braço longo do cromossomo 3, no locus 3q27-29

(Osada et al., 1998; Trink et al. 1998; Yang et al., 1998). Como todos os membros da

família p53, possui um domínio de transativação (TAD), um domínio de ligação ao

Revisão da Literatura 9

DNA (DBD), um domínio de oligomerização (OD), um domínio SAM, um domínio

inibidor nas suas isoformas “α” e dois promotores (P1 e P2) (Di Como et al., 2001;

Moll; Slade, 2004; Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004).

As proteínas derivadas do gene p63 podem acrescentar emendas no COOH-terminal e

dar origem a pelo menos diferentes seis proteínas diferentes: TAp63α, TAp63β,

TAp63γ, ∆Np63α, ∆Np63β e ∆Np63γ (Di Como et al., 2001; Yang et al., 1998;

Westfall; Pietenpol, 2004). As isoformas com o domínio TA do p63(TAp63α, TAp63β,

TAp63γ) possuem a habilidade de ativar o gene p53 e, com isso, induzir apoptose e

bloquear o ciclo celular. Entretanto os outros três isotipos (∆Np63α, ∆Np63β e

∆Np63γ), agem como dominante negativo à ação supressora tanto do p53 (Di Como et

al., 2001; Moll; Slade, 2004; Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004).

2.2.2 Função do gene p63

2.2.2.1 O gene p63 como fator de transcrição

O gene p63 exerce função de transativação que atua de forma diferente a depender

da isoforma expressa. As isoformas com o domínio TA do p63 (TAp63α, TAp63β,

TAp63γ) possuem a habilidade de transativação sobre o gene p53 ou sobre proteínas-alvo

do p53, com isso, podem induzir apoptose e bloquear o ciclo celular (Moll; Slade, 2004;

Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003). Entretanto, existem variações da atividade de transativação

entre as isoformas TA. Por exemplo, a isoforma TAp63γ estimula a transcrição de outros

genes de forma semelhante à do gene p53. Porém, a isoforma TAp63α mostra pouca ou

nenhuma atividade de transativação sobre suas proteínas-alvo (Reis-Filho; Schmitt, 2001;

Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003; Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004).

Revisão da Literatura 10

As isoformas sem o domínio TA, principalmente as isoformas ∆Np63α e

∆Np63γ, agem como dominante negativo, inibindo a transativação do p53, proteínas-

alvo do gene p53 e outras isoformas TAp63, principalmente a TAp63γ. A variante

∆Np63α mostra uma atividade supressora da transativação mais intensa que a variante

∆Np63γ (Yang et al., 1998).

Estudos identificaram um domínio de inibição da transativação que é

responsável pela atividade das isoformas “α” da p63. Sugere-se que este domínio de

inibição interaja com as formas TA do p63 em uma região homóloga ao sítio do MDM2

do p53. Este sítio impede a formação de proteínas co-ativadoras, não havendo, portanto,

a transativação (Westfall; Pietenpol, 2004). Outra hipótese é que as isoformas ∆Np63α

e ∆Np63γ competem com sítios do p53 responsáveis pela transativação, inibindo este

processo por competição inibitória (Yang et al., 1998).

2.2.2.2 O gene p63 na regulação do ciclo celular e apoptose

As isoformas TA, principalmente a TAp63γ,

e a isoforma ∆Np63γ podem

induzir parada do ciclo celular e apoptose. Corroborando com estes dados, foram

descritas variantes TA e ∆Np63γ em células p53

causando parada do ciclo celular e

apoptose através da regulação (“up-regulation”) de proteínas-alvo do gene p53.

Entretanto, a porcentagem de células que entram em apoptose induzidas pela isoforma

∆Np63γ é menor que as induzidas pelas isoformas TA (Yang et al., 1998; Westfall;

Pietenpol, 2004).

Westfall e Pietenpol (2004) demonstraram que a perda da expressão do p63 resulta

no impedimento da célula entrar em apoptose após dano do DNA, mesmo em células

contendo o gene p53. Foi descrito que células p63

encontram-se alteradas em relação à

Revisão da Literatura 11

indução dos genes bax, NOXA e PERP, que são responsáveis pelo processo de apoptose

dependente do p53. Isto sugere que de alguma forma o p53 é afetado pela perda do p63 e os

genes responsáveis pela apoptose são regulados através de interações entre os membros da

família p53 (Moll; Slade, 2004; Westfall; Pietenpol, 2004). Por outro lado, Reis-Filho e

Schmitt (2001) descreveram, em seus estudos, ratos p63

que apresentavam p53 normal e

possuiam resposta adequada ao processo de apoptose, seja este induzido ou espontâneo. Por

outro lado, as células que apresentavam mutação do p53 entravam em apoptose em pequena

porcentagem após lesão do DNA (Yang et al., 1998).

Estudos adicionais das variantes TA e ∆Np63γ são necessários para melhor

entendimento da função do gene p63 no ciclo celular, na apoptose e na interação com os

outros membros da família p53 (Westfall; Pietenpol, 2004).

2.2.2.3 p63: Oncogene ou gene supressor tumoral?

De forma semelhante ao gene p73, as diversas propriedades das isoformas do

p63 mostram sua complexidade e não definem claramente o papel deste gene. Estudos

descrevem o p63 ora como oncogene, ora como gene supressor tumoral, a depender da

isoforma atuante.

A isoforma TAp63γ pode causar parada do ciclo celular e induzir apoptose. Este

processo é semelhante à função exercida pelo gene p53 no ciclo celular, que o classifica

como gene supressor tumoral (Yang et al., 1998). Por outro lado, o p63 também possui

várias propriedades que poderiam classificá-lo como oncogene. Por exemplo, as isoformas

da p63 (∆Np63α e ∆Np63γ) podem inibir a função de transativação do p53 e de outras

isoformas da p63. Esta atividade inibitória sugere que, de alguma forma, as isoformas

∆Np63α e ∆Np63γ podem induzir a proliferação celular contínua. Outra propriedade

oncogênica estaria relacionada às isoformas ∆Np63 que estariam amplificadas nos

Revisão da Literatura 12

carcinomas de células escamosas do colo uterino, de cabeça e pescoço, do pulmão e,

conseqüentemente, envolvidas na carcinogênese (Yang et al., 1998). Estes dados, segundo

Westfall e Pietenpol (2004), sugerem que o p63 não funciona como um gene supressor

tumoral, mas como um oncogene (Westfall; Pietenpol, 2004). Por outro lado, Osada e

colaboradores (1998) estudaram a seqüência do gene p63 de vários tumores humanos e

descreveram que este gene é raramente expresso nos tumores analisados.

Reforçando o papel de oncogene do p63, Burstein e colaboradores (2004)

propuseram um modelo que envolve o p63 na carcinogênese dos carcinomas papilíferos

da tireóide. O modelo sugere que os remanescentes embrionários p63-positivos

contribuem de forma mais significativa na origem dos carcinomas papilíferos da

tireóide do que as células epiteliais foliculares maduras alteradas pelo gene RET

(Burstein et al., 2004).

O gene p53 está associado à perda da heterozigosidade (LOH) em tumores

humanos. O gene p63, em humanos, encontra-se no locus 3q27-9. Em camundongos,

encontra-se o locus denominado loh2. O loh2 está associado à perda de heterozigosidade de

modo semelhante ao que ocorre em tumores humanos que possuem esta alteração

relacionada ao p53 LOH. As semelhanças estruturais e funcionais dos genes p53 e p63 em

humanos e camundongos sugerem que o p63 possa contribuir de alguma forma com a

carcinogênese (Yang et al., 1998). No entanto, mutações no p63 são raras e seu papel na

carcinogênese ainda necessita ser mais bem explorado (Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003).

Diversas funções são descritas como pertinentes ao p63, porém devido à

complexidade deste gene e a sua interação com os outros membros da família p53,

estudos complementares são necessários para sua melhor compreensão e definição do

seu papel na biologia celular (Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003).

Revisão da Literatura 13

2.2.3 A relação do gene p63 com o desenvolvimento embrionário e com os tecidos

epiteliais

O desenvolvimento epitelial em humanos é um processo complexo, no qual

muitas etapas biológicas ainda não foram elucidadas. Estudos com camundongos

sugerem que a proteína p63 exerça papel importante no desenvolvimento dos tecidos

epiteliais (Westfall; Pietenpol, 2004). Enquanto camundongos p53

apresentam

desenvolvimento embrionário normal, os camundongos p63

apresentam anomalias

severas no seu desenvolvimento embrionário (Osada et al., 1998; Trink et al., 1998;

Yang et al., 1998). Os camundongos p63

mostram defeitos no desenvolvimento dos

membros e tecidos epiteliais como a epiderme, o epitélio glandular prostático, o epitélio

glandular mamário, o urotélio, o epitélio da mucosa lingual e o epitélio da mucosa

gástrica (Reis-Filho; Schmitt, 2001; Westfall; Pietenpol, 2004).

Várias estruturas embrionárias relacionadas ao desenvolvimento epitelial

expressam a proteína p63. Em estágios iniciais da embriogênese, a p63 é expressa no

ectoderma dos folhetos embrionários, na crista ectodérmica apical e na superfície

ectodérmica que envolve os arcos branquiais. A integridade da crista ectodérmica apical

possibilita o desenvolvimento dos membros. Os arcos branquiais são responsáveis pelo

desenvolvimento crânio-facial e por vários tecidos de partes moles (Reis-Filho; Schmitt,

2001; Westfall; Pietenpol, 2004).

A isoforma TAp63 parece ser necessária para a iniciação do programa de

estratificação epitelial, e a isoforma ∆Np63, principalmente a variante ∆Np63α,

promove a manutenção da epiderme madura. As células epidérmicas de embriões de

camundongos, que apresentam a função das variantes ∆Np63 bloqueada, mostram

falhas na proliferação de tecidos epiteliais (Westfall; Pietenpol, 2004).

Revisão da Literatura 14

Estudos imuno-histoquímicos mostram a proteína p63 em células basais/

progenitoras de muitos tecidos epiteliais como a epiderme, folículos pilosos, glândulas

sudoríparas, ectocérvice, língua, esôfago, glândulas mamárias, próstata e urotélio. Nestes

tecidos epiteliais, a expressão da isoforma ∆Np63α é predominante. Portanto o gene p63 é

responsável tanto pelo desenvolvimento como pela manutenção da população de células-

tronco (“stem cells”) de vários tecidos epiteliais. (Reis-Filho; Schmitt, 2001; Ribeiro-Silva;

Zucoloto, 2003; Yang et al.,1998; Westfall; Pietenpol, 2004).

2.2.4 Expressão da proteína p63 em tecidos normais

A proteína p63 é expressa em tecidos humanos e murinos normais,

particularmente no núcleo das células basais ou mioepiteliais dos tecidos epiteliais

(Barbareschi et al., 2001; Batistatou et al., 2003; Reis-Filho; Schmitt, 2001). As células

mioepiteliais expressam o fenótipo epitelial e miogênico (Barbareschi et al., 2001; Reis-

Filho et al., 2003). Elas constituem a camada basal de vários tecidos epiteliais normais,

principalmente nos lóbulos e nos ductos do tecido mamário. A identificação destas

células é utilizada em patologia mamária para diferenciar neoplasias benignas de

malignas invasoras, já que estas últimas não apresentam células mioepiteliais

(Barbareschi et al., 2001; Batistatou et al., 2003; Reis-Filho; Schmitt, 2001).

Os anticorpos S-100, actina de músculo liso, actina músculo-específica, calponina,

citoqueratinas 5/6, citoqueratina 14 e 34βE12 são marcadores de células mioepiteliais. O S-

100 apresenta alta sensibilidade, porém baixa especificidade para as células mioepiteliais. A

maioria dos anticorpos relacionados com diferenciação de músculo liso, sobretudo a actina

músculo-específica e a calponina, apresenta baixa especificidade, pois pode marcar células

estromais e miofibroblastos. As citoqueratinas apresentam baixa sensibilidade para as

Revisão da Literatura 15

células mioepitelias, principalmente as localizadas nos lóbulos mamários, pois, neste local,

podem marcar as células epiteliais, secretórias e neoplásicas de vários carcinomas

(Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho et al., 2003; Stefanou et al., 2004).

A proteína p63 é o primeiro marcador nuclear de células mioepiteliais, sendo

considerado um marcador com sensibilidade de 100% e especificidade de 95% na

identificação destas células (Barbareschi et al., 2001). A expressão nuclear da p63

facilita identificar a presença das células mioepiteliais em relação a outros marcadores

que, na sua maioria, marcam o citoplasma (Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho et al.,

2003; Yang et al., 1998). Entretanto, Bratthauer e colaboradores (2005) demonstraram

uma forte expressão citoplasmática da proteína p63 em células com alterações

secretórias e carcinomas secretores da mama. Estes últimos apresentam alterações no

cromossomo 3q, onde se encontra o gene p63 (Bratthauer et al., 2005).

Além de marcar células mioepiteliais, a p63 apresenta expressão imuno-

histoquímica variável em tecidos normais de mamíferos adultos. Quatro diferentes

anticorpos anti-p63 foram desenvolvidos: 4A4, p6302, H137 e PC424. Os anticorpos

4A4, P6302 e H137 reconhecem todas as diferentes isoformas do p63. O PC424

reconhece as isoformas ∆Np63. O anticorpo monoclonal 4A4, além de abranger todas

as isoformas da p63, mostra uma marcação imuno-histoquímica mais intensa em relação

aos outros clones (Reis-Filho; Schmitt, 2001).

Os epitélios estratificados pavimentosos escamosos, queratinizados ou não, são

organizados em várias camadas de células escamosas e uma camada de células basais. As

células tornam-se maduras à medida que se distanciam das células basais. Di Como e

colaboradores (2002) demonstraram através de estudos imuno-histoquímicos que todos os

epitélios estratificados pavimentosos escamosos, incluindo o epitélio da pele, das tonsilas,

do esôfago e da ectocérvice, apresentam positividade nuclear de moderada a intensa para a

Revisão da Literatura 16

p63 nas células basais e uma positividade nuclear que diminui gradativamente nas células

escamosas à medida que elas vão se diferenciando. Portanto, as células que se diferenciam

perdem a expressão da p63 (Burstein et al., 2004). As células dos epitélios transicionais

encontrados nos cálices renais, ureteres, bexiga e uretra apresentam intensa expressão

nuclear da p63, com exceção das “umbrella cells” (Di Como et al., 2002).

O epitélio prostático normal apresenta três tipos de células: as basais, as

secretórias e as neuroendócrinas. Os ácinos e ductos da próstata expressam em suas

células basais marcação nuclear de moderada a intensa da p63, principalmente da

isoforma ∆Np63α. Este dado sugere que o gene p63 pode exercer papel importante no

desenvolvimento prostático e manutenção da população de células-tronco. As células

secretórias e neuroendócrinas não apresentam reatividade para a proteína p63

(Signoretti et al., 2000). Expressão semelhante à da próstata é observada nas células

basais de glândulas sebáceas e sudoríparas da pele (Ivan et al., 2005).

Na mama, as células mioepiteliais dos lóbulos e ductos mostram intensa expressão da

p63 no núcleo, porém as células luminais não apresentam reatividade para esta proteína (Reis-

Filho; Schmitt, 2001). A proteína p63 não é detectável em estruturas de origem mesenquimal,

como células endoteliais, células de músculo liso e fibroblastos. Entretanto, Di Como e

colaboradores (2002) demonstraram, através de reação em cadeia de polimerase (PCR), que

células do músculo esquelético expressam um dos isotipos da p63. Osada e colaboradores

(1998) também demonstraram expressão da p63 em células do músculo esquelético. Células

neuronais, gliais e neuroendócrinas de tecidos normais não expressam a p63 (Di como et al.,

2002). A tabela 1 mostra a expressão da p63 nos tecidos normais de adultos.

Revisão da Literatura 17

Tabela 1 - Distribuição da proteína p63 em tecidos adultos normais.

Órgão Escore*

Componente positivo

Sistema Nervoso Central

Córtex

Trato Digestivo

Esôfago

Estômago

Intestino Delgado

Cólon

(-)

(++)

(-)

Epitélio escamoso

Glândulas do trato digestivo

Pâncreas

Fígado

(-)

Sistema Endócrino

Adrenal

Tireóide

(-)

Sistema Linfóide

Linfonodos

Baço

Tonsilas

(+/-)

(-)

(++)

Células do centro germinativo

Células epiteliais escamosas

Tecido Muscular

Músculo estriado esquelético

Sistema reprodutivo feminino

Mama

(-)

(++)

Epitélio basal

Endocérvice

Endométrio

Ovário

Placenta

Cordão umbilical

(++)

(-)

(+)

(-)

Epitélio escamoso

Citotrofoblasto

Sistema reprodutivo masculino

Próstata

Testículo

(++)

(+/-)

Epitélio basal

Células do túbulo seminífero

Sistema respiratório

Laringe

Pulmão

(++)

Mucosa e epitélio glandular

Epitélio bronquiolar

Pele

Epiderme

Folículos Pilosos

Glândulas sudoríparas

Sistema urinário

Bexiga

Rim

(++)

(+/-)

Epitélio transicional

Células epiteliais da cápsula de Bownman

*- indetectável; +/- ocasional; + moderado; ++ forte.

Adaptado de Di Como et al: p63 expression profiles in Human Normal and Tumor Tissue, 2002. Clinical Cancer

Research 495: 8, 2003.

Revisão da Literatura 18

2.2.5 O p63 em síndromes humanas

As mutações do p53 podem ser encontradas tanto em células germinativas

quanto em células somáticas (Di Como et al., 2002). As mutações do gene p53 em

células da linhagem germinativa estão associadas com a síndrome de Li Fraumeni. Esta

síndrome tem como característica principal a alta prevalência de sarcomas de partes

moles, linfomas, tumores do sistema nervoso central e carcinomas mamários (Reis-

Filho; Schmitt, 2001).

Mutações do gene p63 em células somáticas são raras (Di Como et al., 2002).

Em seres humanos, foram descritas mutações do p63 em células de linhagens

germinativas que estão relacionadas a anormalidades congênitas. Estas são

caracterizadas por desenvolvimento anormal de extremidades e displasia ectodérmica

(Westfall; Pietenpol, 2004). Diferente do p53, segundo Reis-Filho e Schmitt (2001) as

mutações do p63 que ocorrem nas células de linhagem germinativa não apresentam

predisposição à formação de neoplasias (Reis-Filho; Schmitt, 2001).

Mutação do gene p63 foi encontrada na síndrome EEC-“ectrodactyly-ectodermal

dysplasia”. A mutação da EEC foi identificada no locus do cromossomo 3q27,

coincidindo com a localização do p63 (Westfall; Pietenpol, 2004). Outras desordens

relacionadas ao desenvolvimento envolvem o p63, como a síndrome de AEC-

“ankyloblepharon ectodermal dysplasia and clefting”- ou Síndrome de Hay-Wells; a

síndrome ADULT-“acro-dermato-ungueal-lacrimal-tooth”; a LMS-“limb-mammary

syndrome”- e a síndrome SHFM-“split hand/split foot malformation” (Reis-Filho;

Schimitt, 2001; Westfall; Pietenpol, 2004).

As síndromes EEC e ADULT estão relacionadas à mutação pontual no domínio

de transativação do gene p63 (Di Como et al., 2002; Westfall; Pietenpol, 2004). A

Revisão da Literatura 19

síndrome AEC e a LMS estão relacionadas à mutação pontual no domínio SAM. A

SHFM é encontrada quando o gene p63 é mutado por completo. Estes dados sugerem

que existam diversos mecanismos que provocam alteração do gene p63 (Westfall;

Pietenpol, 2004).

2.2.6 O p63 e neoplasias de células escamosas

Como citado anteriormente, a proteína p63 está expressa em grande parte dos

epitélios estratificados pavimentosos escamosos, incluindo a epiderme, o epitélio das

tonsilas, do esôfago e da ectocérvice. Eles apresentam positividade nuclear de moderada

a intensa para a p63 nas células basais e uma positividade nuclear que diminui

gradativamente nas células escamosas à medida que elas vão se diferenciando. Como no

epitélio normal, os carcinomas de células escamosas localizados em cabeça e pescoço,

esôfago, pulmão e pele expressam de forma consistente a p63. Em adenocarcinomas de

esôfago, próstata e mama, a p63 é negativa ou apresenta expressão mínima (Hara et al.,

2004; Reis-Filho et al., 2003; Reis-Filho; Schmitt, 2001).

O gene p63 foi mapeado no cromossomo 3q27-28, um região frequentemente

amplificada em carcinomas escamosos, carcinomas cervicais, carcinomas prostáticos e

neoplasias pulmonares (Hara et al., 2004; Moll; Slade, 2004; Reis-Filho et al., 2003;

Westfall; Pietenpol, 2004). A ∆Np63α é a isoforma que está expressa em muitos

carcinomas escamosos, como, por exemplo, nos orais e nos carcinomas do trato

respiratório superior (Reis-Filho; Schmitt, 2001; Yang et al., 1998). A região do

cromossomo 3q27-28, onde o p63 está localizado, contém também o gene PIK3CA, que

é um regulador positivo da via phosphoinositide-3-quinase. A isoforma ∆Np63α é

regulada por esta via, explicando a superexpressão da isoforma ∆Np63α nos carcinomas

Revisão da Literatura 20

de células escamosas (Westfall; Pietenpol, 2004). As isoformas ∆Np63, segundo Moll e

Slade, fazem com que as células permaneçam com o fenótipo de células tronco,

promovendo proliferação celular intensa e contribuindo para o crescimento tumoral.

Segundo estudos realizados por Hara e colaboradores (2004), a expressão da p63

nos carcinomas escamosos não pode ser utilizada como fator prognóstico, pois não

apresenta relação com características clinico-patológicas. No entanto, pesquisas de

Uramoto e colaboradores (2006), envolvendo membros da família p53, descrevem a

relação destes genes com variáveis clínicas e prognósticas em câncer de pulmão. Dentre

estes carcinomas a forma ∆Np63 encontrava-se expressa nos carcinomas escamosos de

pulmão (Uramoto et al., 2006). Lo Muzio e colaboradores (2007) relataram que a

expressão do anticorpo p63 em carcinomas escamosos orais é um indicador de grau

histológico e marcador de mau prognóstico. Outros estudos envolvendo a p63 com

carcinomas escamosos e sua relação com fatores prognósticos são descritos na literatura

(de Oliveira et al., 2007; Takahashi et al., 2006).

2.2.7 O p63 em neoplasia de cabeça e pescoço

O modelo de oncogênese clássico proposto para o carcinoma papilífero da

tireóide sugere que a origem desta neoplasia estaria relacionada à alteração do gene RET

nas células tireoidianas epiteliais foliculares maduras. Burstein e colaboradores (2003)

propuseram outro modelo que envolve o p63 na carcinogênese dos carcinomas

papilíferos da tireóide. O modelo propõe que os remanescentes embrionários p63-

positivos contribuam de forma mais significativa que as células epiteliais foliculares

maduras para a origem dos carcinomas papilíferos da tireóide (Burstein et al., 2003).

Revisão da Literatura 21

Dentre os remanescentes embrionários, estão os ninhos sólidos celulares/grupos

sólidos celulares (“solid cell nest”), que são estruturas celulares não foliculares

encontradas em 61% a 89% das tireóides. Considerados remanescentes embrionários

relacionados ao corpo ultimobranquial, os ninhos sólidos celulares podem apresentar

células com diferenciação escamosa, glandular, microcística e ciliada, além de outras

linhagens de diferenciação celular. Durante o desenvolvimento embrionário o corpo

ultimobranquial contribui para formação de grande parte dos lobos laterais da tireóide e

das células que se encontram nestes lobos (células epiteliais foliculares e células C).

Outro remanescente embrionário é o ducto tireoglosso. Ele é derivado do divertículo

tireoidiano e responsável pela formação do istmo (Burstein et al., 2003).

Burstein e colaboradores (2003) observaram em seu estudo morfológico da

tireóide a presença de ninhos celulares não foliculares em pacientes com tireoidite de

Hashimoto, com carcinoma papilífero e em pacientes com a associação destas duas

patologias. Estes ninhos expressavam a proteína p63 e eram morfologicamente

compatíveis com ninhos sólidos celulares (remanescentes embrionários). Segundo

Burstein e colaboradores (2003), a proteína p63 é um marcador sensível para detectar os

ninhos sólidos celulares.

O modelo de carcingênese proposto por estes autores considera estes ninhos

sólidos celulares p63-positivos como células pluripotentes, e a expressão da p63 nestas

células seria responsável pela manutenção desta população celular indiferenciada

(Burstein et al., 2003; Reis-Filho; Schmitt, 2001; Yang et al.,1998; Westfall; Pietenpol,

2004). As células pluripotentes podem seguir caminhos diferentes. Elas poderiam

permanecer indiferenciadas ou poderiam sofrer diferenciação celular (diferenciação

escamosa ou diferenciação para células epiteliais foliculares da tireóide). Entretanto, a

persistência destas células pluripotentes, consideradas células lábeis e mais susceptíveis

Revisão da Literatura 22

às alterações do conteúdo genômico, dariam origem aos carcinomas papilíferos da

tireóide (Burstein et al., 2003).

Segundo o novo modelo carcinogênico, a razão do carcinoma papilífero da

tireóide ser multifocal não está associada a metástases intra-tireoideanas, mas à

transformação carcinogênica de remanescentes embrionários p63-positivos. Sugere-se

também que os focos de diferenciação escamosa, freqüentes na tireoidite de Hashimoto,

no carcinoma papilífero e nos ninhos sólidos celulares, ocorram devido à presença de

remanescentes embrionários contendo células pluripotentes p63-positivas que se

diferenciam em células de linhagem escamosa. A existência de células pluripotentes

embrionárias residuais na tireóide pode ser a base biológica que explicaria a

predisposição de pacientes com tireoidite de Hashimoto para desenvolver carcinoma

papilífero (Burstein et al., 2003).

Burstein e colaboradores (2003) também descrevem que o carcinoma muco-

epidermóide da tireóide tem sua origem nos ninhos sólidos celulares, já que estes

últimos podem apresentar mucina e diferenciação escamosa. Entretanto o carcinoma

muco-epidermóide surge geralmente no istmo, local onde os ninhos sólidos celulares

não são detectados. O corpo ultimobranquial só contribui para a formação dos ninhos

nas porções laterais dos lobos da tireóide e não no istmo (Burstein et al., 2003). Na

pesquisa, porém, os autores detectaram a presença de células p63-positivas no istmo, em

estruturas sólidas (ninhos sólidos símile) e císticas da parede do ducto tireoglosso. O

modelo destes autores propõe que, a partir das estruturas embrionárias remanescentes

(células progenitoras pluripotentes do corpo ultimobranquial e do divertículo

tireoideano), surjam os carcinomas papilíferos, escamosos e muco-epidermóides da

tireóide (Burstein et al., 2003).

Revisão da Literatura 23

Nos carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço, tanto o p53 como as

isoformas do p63 e do p73 são expressas, sugerindo que tanto o p63 quanto o p73

tenham participação importante na carcinogênese dos tumores escamosos da cabeça e

pescoço, atuando como oncogenes (de Oliveira et al., 2007; Gwosdz et al., 2005; Lo

Muzio et al., 2007). É observada também a expressão da p63 em tumores mioepiteliais

de glândulas salivares (Reis-Filho; Schmitt, 2001).

2.2.8 O p63 em neoplasias uroepiteliais

Na próstata, o produto do gene p63 marca as células basais do tecido epitelial

glandular normal, da hiperplasia prostática e das neoplasias intra-epiteliais de baixo e

alto grau. Nos carcinomas, sua expressão só é verificada em menos de 1% dos

espécimes provenientes de prostatectomia radical (Signoretti et al., 2000; Reis-Filho;

Schmitt, 2001).

A maioria dos carcinomas de próstata expressa marcadores de células

secretórias, como o receptor de androgênio e o antígeno prostático específico, sugerindo

que o câncer de próstata é resultado da transformação maligna de células secretórias

(Signoretti et al., 2000). Na glândula prostática, a proteína p63 é expressa nas células

basais do epitélio glandular e não apresenta reatividade nas células de fenótipo secretor

(Signoretti et al., 2000).

Os carcinomas de próstata são caracterizados pela ausência de células basais e

pela presença de alterações arquiteturais das glândulas. Como nos carcinomas invasores

da mama, a expressão da p63 nas células basais das glândulas prostáticas pode ser

utilizada na diferenciação entre lesões benignas e malignas (Signoretti et al., 2000;

Reis-Filho; Schmitt, 2001).

Revisão da Literatura 24

Quanto aos tumores de urotélio, estudos indicam que os genes da família p53,

incluindo o p63 estão relacionados com a carcinogênese de neoplasias uroteliais,

principalmente com os localizados na bexiga (Compérat et al., 2007; Mhawech-

Fauceglia et al., 2006). Segundo Zigeuner e colaboradores (2004), a p63 é expressa no

tanto no urotélio normal, como nos carcinomas invasivos de células transisionais. No

entanto as isoformas expressas nestes dois locais são diferentes e, em alguns carcinomas

invasivos de células transicionais da bexiga, observa-se perda da expressão da p63. O

urotélio normal da bexiga expressa as isoformas TAp63. No entanto, os carcinomas de

bexiga apresentam diminuição da expressão das isoformas TAp63 e começam a

apresentar a expressão das isoformas ∆Np63 (Reis-Filho; Schmitt, 2001; Zigeuner et al.,

2004). Zigeuner e colaboradores (2004) demonstraram que a diminuição da reatividade

da p63 e a superexpressão da p53 nos carcinomas de células transicionais da bexiga

estão associadas com estágio tumoral avançado e pior prognóstico (Zigeuner et al.,

2004).

2.2.9 O p63 em neoplasias ginecológicas

Estudos demonstraram que a p63 é expressa nas células basais/progenitoras do

epitélio escamoso e do epitélio colunar da zona de transformação do colo uterino, como

também nas células escamosas imaturas do epitélio cervical. O gene p63 foi mapeado

no cromossomo 3q27-29, região que se encontra alterada nas neoplasias de colo uterino

(Hara et al., 2004; Westfall; Pietenpol, 2004).

No colo uterino, a p63 é expressa em carcinomas de células escamosas, mas não

em adenocarcinomas (Di Como et al., 2002; Reis-Filho; Schmitt, 2001). Carcinomas

adenoescamosos do colo uterino apresentam expressão da p63 no componente

Revisão da Literatura 25

escamoso. Considerado variante do carcinoma de células escamosas, o carcinoma

linfoepitelioma-símile do colo uterino também expressa p63. Segundo Reis-Filho e

Schmitt (2001), os carcinomas indiferenciados do colo uterino não expressam a proteína

p63 (Reis-Filho; Schmitt, 2001). A isoforma ∆Np63 é considerada, nos carcinomas de

colo uterino, marcadora de diferenciação escamosa, sendo utilizada na exclusão de

diferenciação glandular e neuroendócrina (Linz et al., 2006). Portanto, a p63 tem sido

utilizada em patologia ginecológica para identificar neoplasias epiteliais do colo uterino

cuja presença de diferenciação escamosa é duvidosa (Reis-Filho; Schmitt, 2001).

A associação entre infecções virais e a expressão da proteína p63 em neoplasias

ainda necessita ser mais investigado. Dados experimentais mostram que existe uma

forte correlação entre infecção pelo papilomavírus humano (HPV) do tipo 16 e

expressão do produto do gene p63 no carcinoma escamoso invasor do colo uterino.

Nestes, o locus do p63 encontra-se amplificado (Westfall; Pietenpol, 2004). Em relação

ao p53, as proteínas E6 do gene HPV podem interromper o processo de morte celular ao

se ligarem à proteína p53. Após esta ligação, a E6 induz rápida degradação da p53 por

meio de proteólise dependente de ubiquitina. Estes dados sugerem a existência de dois

eventos que contribuem para a carcinogênese dos carcinomas cervicais. Um deles seria

a perda da função da p53 pela degradação mediada pela O outro seria o aumento da

atividade oncogênica do p63, devido à sua superexpressão (Westfall; Pietenpol, 2004).

No entanto, Moll e Slade (2004), descrevem que nenhuma interação entre a p63 e a via

da proteína E6 foi encontrada.

A região do cromossomo 3q27-29, onde se encontra o p63, também está alterada

nas neoplasias do ovário (Hara et al., 2004; Westfall; Pietenpol, 2004). Liao e

colaboradores (2007) descrevem que a p63 encontra-se expressa em tumores de Brenner

benignos e boderlines do ovário. Nos tumores de células transicionais do ovário a p63

Revisão da Literatura 26

não é expressa. A p63 pode ser utilizada para auxiliar no diagnóstico diferencial destes

tumores (Liao et al., 2007). O p63 é expresso em 25% e 12,9% dos carcinomas

endometrióides e serosos do ovário, respectivamente (Reis-Filho et al., 2003).

Segundo Reis-Filho e Schmitt, o produto do gene p63 não é expresso em

carcinomas endometriais, mas está presente na metaplasia escamosa do tecido

endometrial. Stefansson e colaboradores (2006) não encontraram expressão da p63 em

carcinomas endometrióides do endométrio. Contradizendo a informação de que a p63

não é expressa em carcinomas do endométrio, a expressão desta proteína foi descrita em

carcinoma de células escamosas papilar do endométrio com diferenciação de células

transicionais (Ribeiro-Silva, 2007). A expressão da p63 também foi descritas em focos

de endometriose, adenomiose e pólipos endometriais (Nogueira et al., 2006; Poli Neto

et al., 2007).

2.2.10 O p63 e outras neoplasias

Na pele, a p63 é expresso intensamente em 65% e moderadamente em 35% dos

tumores de anexo benignos. Todos os carcinomas cutâneos primários, incluindo os

adenocarcinomas, expressam a proteína p63. Em contraste, nenhum adenocarcinoma

metastático localizado na pele apresenta a expressão da p63. Portanto, a presença desta

proteína pode auxiliar na diferenciação entre adenocarcinomas primários e metastáticos

da pele (Ivan et al., 2005).

Em relação às neoplasias de linhagem hematológica, os linfomas não Hodgkin

de células B, assim como o linfoma folicular, expressam a p63. Porém, linfomas de

Hodgkin são negativos para esta proteína (Di Como et al., 2002). Os timomas

expressam p63 principalmente no componente neoplásico epitelial (Di Como et al.,

Revisão da Literatura 27

2002; Dotto et al., 2007). Mutações no gene p63 geralmente ocorrem entre os códons

151-170 e estão associados à crise blástica na leucemia mielóide crônica (Yang et al.,

1998).

Apesar da proteína p63 não estar expressa na maioria dos tecidos mesenquimais,

Di Como e colaboradores (2002) demonstraram positividade da p63 em 2 de 31

rabdomiossarcomas (Di Como et al., 2002). Reis-Filho e colaboradores (2003)

descreveram positividade da p63 em 10% dos melanomas e 12% dos glioblastomas

(Reis-Filho et al., 2003). Todas estas informações sugerem que o p63 esteja associado a

vários tipos de tumores, além dos carcinomas de células escamosas (Reis-Filho et al.,

2003).

2.2.11 O p63 em patologia mamária

No Brasil, o câncer de mama é considerado uma das neoplasias malignas mais

incidentes em mulheres. Quando diagnosticado precocemente, o câncer de mama pode

ser potencialmente curável. Ele está associado a vários fatores de risco para seu

desenvolvimento. Os principais são os hormonais e os genéticos. O carcinoma é a

neoplasia maligna mais freqüente da mama e pode ser dividido em esporádicos,

possivelmente relacionados com a exposição hormonal, e casos hereditários, associados

às mutações da linhagem germinativa (Abreu; Koifman, 2002; Esteva; Hortobagyi,

2004).

A mutação do gene p53 é um evento comum, encontrado em 15 a 50% dos

carcinomas mamários. A expressão da proteína p53 nestes carcinomas pode ser

observada através de estudos imuno-histoquímicos e está associada a prognóstico

reservado (Ribeiro-Silva et al., 2003).

Revisão da Literatura 28

A identificação de células mioepiteliais nas glândulas mamárias é um recurso

diagnóstico valioso em patologia cirúrgica. As células mioepiteliais estão presentes na

camada basal do epitélio glandular normal, nas lesões benignas e nos carcinomas in situ

da mama. No entanto, estão ausentes nos carcinomas invasores (Barbareschi et al.,

2001; Harton et al., 2007; Reis-Filho; Schmitt, 2001; Stefanou et al., 2004). Nos cortes

histológicos corados por hematoxilina e eosina, a identificação das células mioepiteliais

pode ser difícil devido à presença de desmoplasia estromal e de infiltrado inflamatório

periglandular (Ribeiro-Silva et al., 2003). Nos estudos citológicos, as células

mioepiteliais podem ser confundidas com células apoptóticas, macrófagos e células

estromais. Desse modo, com base no fenótipo epitelial e miogênico das células

mioepiteliais, vários marcadores imuno-histoquímicos foram desenvolvidos, a maioria

com expressão citoplasmática (Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho et al., 2003).

Através de estudos imuno-histoquímicos, a expressão da proteína p63 pode ser

observada no núcleo de células mioepiteliais/ basais de vários tecidos epiteliais

(Barbareschi et al., 2001; Batistatou et al., 2003; Reis-Filho; Schmitt, 2001). A

localização e a morfologia das células p63-positivas na mama normal são

correspondentes às das células mioepiteliais. Através da dupla marcação imuno-

histoquímica, experimentos mostram que células com expressão nuclear da p63

apresentam co-expressão com marcadores imuno-histoquímicos citoplasmáticos nas

células mioepiteliais. Menos de 1% das células mioepiteliais expressaram a p63 na

ausência de marcadores mioepiteliais citoplasmáticos (Barbareschi et al., 2001; Reis-

Filho; Schmitt, 2001; Stefanou et al., 2004).

A proteína p63 é um marcador nuclear de células mioepiteliais, com

sensibilidade de 100% e especificidade de 95% na identificação destas células

(Barbareschi et al., 2001). A expressão nuclear da p63 facilita identificar a presença das

Revisão da Literatura 29

células mioepiteliais em relação a outros marcadores que, na sua maioria, marcam o

citoplasma (Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho et al., 2003; Yang et al., 1998).

Entretanto, Bratthauer e colaboradores (2005) demonstraram uma forte expressão

citoplasmática da proteína p63 em células com alterações secretórias e carcinomas

secretores da mama. Estes últimos apresentam alterações no cromossomo 3q, onde se

encontra o gene p63 (Bratthauer et al., 2005).

Barbareschi e colaboradores (2001) descreveram que na camada basal do tecido

epitelial glandular mamário, além das células mioepiteliais, encontram-se células

progenitoras responsáveis pela manutenção epitelial (Barbareschi et al., 2001). A

proteína p63 é considerada um marcador de células mioepiteliais e de células

progenitoras (Osada et al.,1998; Trink et al.,1998; Yang et al., 1998). A isoforma

∆Np63, proteína responsável pela manutenção das células progenitoras, é expressa nas

células mioepiteliais dos tecidos mamários normais, sugerindo que exista correlação

entre as células mioepiteliais e células progenitoras (Barbareschi et al., 2001; Reis-

Filho; Schmitt, 2001). Barbareschi e colaboradores (2001), no entanto, questionaram

como a proteína p63 pode ser considerada marcadora de células progenitoras e, ao

mesmo tempo, ser considerada marcadora de células mioepiteliais, que são células bem

diferenciadas e especializadas (Barbareschi et al., 2001).

No tecido mamário normal e nas lesões benignas, a p63 mostra positividade

contínua nas células basais dos ductos e ácinos. Nas células estromais, incluindo os

miofibroblastos, a proteína p63 é negativa. Raras células epiteliais luminais da

hiperplasia ductal florida expressam a p63. Nos carcinomas, a expressão da p63 é

controversa. Carcinomas ductais e lobulares in situ apresentam positividade contínua ou

focalmente descontínua da p63 em suas células mioepiteliais. As células luminais destes

carcinomas são negativas (Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho et al., 2003; Stefanou et

Revisão da Literatura 30

al., 2004). No entanto, Reis-Filho e colaboradores (2003) descreveram células p63-

positivas em carcinomas ductais in situ em estudos imuno-histoquímicos de citologias.

Carcinomas ductais invasivos são geralmente p63-negativos (Ribeiro-Silva et al., 2003,

Stefanou et al., 2004; Wang et al., 2002). Porém, Barbareschi e colaboradores (2001)

descreveram que 4,6% a 11% dos carcinomas mamários expressaram, por meio de

estudos imuno-histoquímicos, a proteína p63 em cerca de 5% a 15% das células

neoplásicas (Barbareschi et al., 2001). Através de pesquisa semelhante, Reis-Filho e

colaboradores (2003) demonstraram em estudos citológicos que 23% dos carcinomas

mamários expressaram a proteína p63 em cerca de 1% a 5% das células neoplásicas. Em

13% dos carcinomas mamários, as células neoplásicas eram positivas em mais de 5%

das células (Reis-Filho et al., 2003). Nos carcinomas mamários invasores grau III da

graduação de Nottingham, as neoplasias com contagem de mitose elevada, menor

formação tubular e atipias celulares acentuadas apresentam mais células p63-positivas

que as neoplasias de contagem menos elevadas (Ribeiro-Silva et al., 2003).

Ribeiro-Silva e colaboradores (2003) descreveram que a positividade da p63 em

células de carcinomas mamários está relacionada com vários fatores de mau

prognóstico, incluindo tamanho tumoral, estadiamento patológico, grau histológico,

metástases para linfonodos e negatividade para receptores de estrógeno. Estes autores

demonstraram que em 10 casos de carcinomas ductais mamários positivos para a p63,

apenas um dos casos expressou a proteína p53. Segundo Ribeiro-Silva e colaboradores

(2003), estes resultados são contraditórios, pois a p63 geralmente é expressa em

carcinomas ductais pouco diferenciados, nos quais a expressão da p53 é freqüente. Os

autores sugeriram que o p63 poderia exercer indiretamente função de oncogene inibindo

o p53. Estes dados poderiam explicar a correlação da expressão da proteína p63 com

indicadores de mau prognóstico (Ribeiro-Silva et al., 2003).

Revisão da Literatura 31

A proteína p63, p-caderina e CK5, marcadores de diferenciação basal e

mioepitelial, encontram-se expressos em câncer de mama com história familiar (Dufloth

et al., 2007). Mais de 18% dos carcinomas ductais invasores mamários de alto grau

expressam diferenciação basal-símile ou mioepitelial-símile. Este dado é constatado

pela positividade que as células neoplásicas expressam para marcadores mioepiteliais

(actina de músculo liso, citoceratina 14, proteína S100 e calponina) em estudos imuno-

histoquímicos (Reis-Filho; Schmitt, 2001; Reis-Filho et al., 2003). Pesquisas

propuseram a hipótese de que a presença das células neoplásicas p63-positivas seria

explicada pela expressão aberrante de diferenciação basal-símile ou mioepitelial-símile

durante a expressão clonal (Reis-Filho et al., 2003; Stefanou et al., 2004). Outra

hipótese seria que as células neoplásicas p63-positivas fossem originadas de células

progenitoras, que pudessem expressar fenótipo miogênico (Ribeiro-Silva et al., 2003).

A maioria das células dos carcinomas adenóide-císticos, dos mioepiteliomas e

dos tumores mistos, que são neoplasias de diferenciação mioepitelial, expressa a

proteína p63 (Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho; Schmitt, 2001). Ela também é

expressa em neoplasias com morfologia papilar (papilomas e carcinomas papilíferos),

sugerindo que elas apresentem diferenciação mioepitelial (Stefanou et al., 2004). A p63

pode ser utilizada no diagnóstico diferencial das lesões papilares da mama (Troxell et

al., 2007; Tse et al., 2007).

Carcinomas metaplásicos apresentam positividade da proteína p63 no

componente neoplásico escamoso (Barbareschi et al., 2001). A p63 é um marcador

sensível e específico para os carcinomas metaplásicos da mama, principalmente aqueles

constituídos de células fusiformes e com áreas escamosas. Esta proteína pode ser

utilizada em painel imuno-histoquímico para diferenciar carcinomas metaplásicos de

lesões com componente mesenquimal como tumor filóide, o osteossarcoma primário da

Revisão da Literatura 32

mama e a fibromatose (Koker; Kleer, 2004; Tse et al., 2006). A proteína p63 é negativa

nas células neoplásicas dos carcinomas tubulares e medulares (Ribeiro-Silva et al.,

2003).

Em relação ao tratamento dos carcinomas mamários, estudos de Leong e

colaboradores (2007) relatam que as vias dos genes p63/p73 estão relacionadas à

sensibilidade a cisplatina nos carcinomas mamários associados ao BRCA-1 e negativos

para RE, RP e c-erbB-2. Estes autores ainda descrevem que a isoforma ∆Np63 se liga a

TAp73, promovendo a sobrevivência das células neoplásicas nos carcinomas mamários

através da inibição da atividade pró-apoptótica da TAp73 (Leong et al., 2007).

2.3 A biologia molecular do câncer

2.3.1 O Ciclo celular e genes que regulam o ciclo celular

Diferenças estruturais e bioquímicas foram estabelecidas entre células normais e

cancerosas. As células normais mantêm a integridade do seu DNA através de vias que

regulam o ciclo celular. O ciclo celular é dividido em fases: G

(pré-sintética), S

(sintética), G

(pré-mitótica) e M (mitótica). A progressão ordenada das células através

das fases do ciclo celular é controlada pelas ciclinas, quinases ciclina-dependentes

(CDK) e seus inibidores (Rieger, 2004).

As ciclinas são responsáveis pela fosforilação de proteínas-alvo que permitem a

progressão das fases do ciclo celular. A ciclina D é a primeira a entrar no ciclo celular e

as ciclinas E, A e B aparecem seqüencialmente durante as fases subseqüentes. As

proteínas-alvo são as CDK, que, junto com as ciclinas, formam complexos moleculares

permitindo à célula atravessar os pontos de verificação do ciclo celular. Nos pontos de

Revisão da Literatura 33

verificação, os genes percebem e reparam a lesão causada ao DNA celular (Rieger,

2004). Um defeito nos componentes destes pontos causa instabilidade genômica,

favorecendo proliferação celular descontrolada, um dos princípios fundamentais da

fisiologia celular para a carcinogênese (Rieger, 2004). Existem dois principais pontos de

verificação, um na transição de G

/S e outro em G

/M. Resumindo, os pontos de

verificação checam possíveis danos ao DNA celular e decidem se a célula pode

prosseguir no ciclo celular (Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger, 2004).

Durante a fase G

a ciclina D se liga e ativa a quinase cliclina-dependente 4

(CDK4), formando um complexo ciclina D-CDK4. Este complexo tem papel importante

no ciclo celular, pois promove a fosforilação da proteína de susceptibilidade ao

retinoblastoma (Rb), eliminando a principal barreira do ciclo celular. A proteína Rb é

ligada a um complexo de proteínas que contêm o fator de transcrição E2F. A

fosforilação da Rb dissocia esse complexo, ativando a transcrição dos genes-alvo de

E2F. A atividade da E2F promove a transcrição da ciclina E, da ciclina A e de outras

proteínas, tornando possível a passagem do ponto de restrição no final de G

ciclinas A e B regulam alguns eventos críticos na transição G

/M. Em estado

hipofosforilado, a Rb impede a replicação celular ao formar um complexo inativo com o

fator de transcrição E2F. Após ultrapassar as etapas do ciclo celular, as células recém

divididas podem retornar a G

ou entrarem em período de latência (Hanahan; Weinberg,

2000; Rieger, 2004).

A atividade dos complexos de ciclina e CDK é regulada também por inibidores

de CDK. Estes inibidores apresentam duas classes de genes: as famílias Cip/Kip e

INK4a/ARF. A família Cip/Kip tem três componentes: p21, p27 e p57. Estas proteínas

se ligam às CDKs e as inativam. A p21, componente da família Cip/Kip, tem sua

atividade sob controle do gene p53. Quando ocorre lesão no DNA celular, a proteína

Revisão da Literatura 34

p53 pode seguir por duas vias. A primeira via promove parada do ciclo celular através

do inibidor p21 para que o DNA possa ser reparado. A p21 inibe a ligação das ciclinas

da fase G1 com as CDKs, bloqueando a continuação do ciclo celular. Caso a p53 não

promova a ação da p21 e se a célula com lesões no DNA continuar a proliferar

desordenadamente, podem originar células neoplásicas. Na segunda via, ocorre dano

grave ao DNA e este não pode ser reparado. Portanto, a proteína p53 induz apoptose

através da indução da transcrição de genes pró-apoptóticos como o bax. No G

/S a

parada do ciclo celular envolve mecanismos tanto dependentes como independentes do

gene p53 (Rieger, 2004).

O gene INK4a/ARF codifica duas proteínas: p16INK4a e p14ARF. A p16INK4a

compete com a ciclina D na ligação com CDK4 e inibe o complexo ciclina D-CDK4 de

fosforilar Rb, causando uma parada celular no final de G

A p16INK4a pode sofrer

mutação e hipermetilação nos tumores humanos. A p14ARF aumenta os níveis de p53

através da inibição da atividade da MDM2, proteína que promove a degradação do p53

(Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger, 2004).

Os principais alvos de lesão genética são os genes que estão relacionados com a

regulação do ciclo celular. Dentre estes genes, encontram-se os proto-oncogenes, os

supressores do tumor, os que regulam a morte celular (apoptose) e os genes envolvidos

no reparo do DNA (Rieger, 2004).

Proto-oncogenes são genes celulares normais que participam do controle das

funções celulares vitais como proliferação, diferenciação, migração e morte celular

(apoptose). Quando estes genes se encontram mutados ou sua expressão encontra-se

descontrolada por alguns dos mecanismos de lesão gênica (amplificação gênica,

mutação pontual e rearranjo gênico), diz-se que estão ativados, e passam a receber o

nome de oncogenes (Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger, 2004).

Revisão da Literatura 35

Genes supressores de tumores codificam proteínas com funções específicas que

atuam impedindo o acúmulo de mutações no genoma da célula, garantindo sua

integridade. Entre os supressores tumorais estão: o produto do gene p53, que controla a

progressão da célula ao longo das fases do ciclo celular, o produto do gene Rb e os

inibidores das quinases ciclina-dependentes. Alguns genes supressores de tumor são

conhecidos como guardiões (“gatekeeper”). Eles regulam a entrada das células nas vias

carcinogênicas inibindo a proliferação ou promovendo a apoptose. O Rb e aqueles

envolvidos na síndrome de Von Hippel-Lindau são considerados genes guardiões. As

mutações que ocorrem nos genes supressores do tumor causam perda de função ou

inativação. A transformação neoplásica que envolve estes genes pode se originar devido

metilação ou perda de uma grande porção da seqüência genética (Rieger, 2004).

Em relação aos genes que regulam a apoptose e reparam o DNA, podemos citar

o p53. Este é um dos genes que, quando existe lesão no DNA, pode provocar em G

parada do ciclo celular ou indução da apoptose. Em G2/M o p53 pode induz os genes

envolvidos no reparo do DNA. Muitas neoplasias, portanto, possuem alteração no p53

(Rieger, 2004).

2.4. Alterações essenciais para a transformação maligna

O desenvolvimento do câncer é considerado um processo multifatorial. Os

efeitos cumulativos de alterações genéticas, juntamente com as alterações ocorridas em

conseqüência do estilo de vida e dos efeitos do meio ambiente, proporcionam uma

transição gradual de tecido normal para tecido neoplásico (Rieger, 2004).

As alterações genéticas podem ser adquiridas através de mutações. Estas podem

ser divididas em duas categorias: as mutações pontuais e alterações cromossomiais. As

Revisão da Literatura 36

mutações pontuais são alterações que causam substituição de um único nucleotídeo,

podendo alterar a seqüência de trinucleotídeos. Esta mutação pode levar a produção de

um produto gênico com alterações físico-químicas ou a interrupção da produção do

produto. As alterações cromossomiais podem envolver segmentos ou cromossomos

inteiros e podem ser detectadas em exame de cariótipo. As translocações e inversões

cromossomiais são exemplos destas alterações (Rieger, 2004).

A amplificação gênica e as alterações epigenéticas são consideradas alterações

cromossomiais. A amplificação

gênica é mecanismo que leva produção de múltiplas

cópias de um gene.

O aumento do número de cópias de um alelo pode levar ao aumento

da proteína expressa por esse gene. A depender da função da proteína que se encontra

aumentada, a célula pode desregular o ciclo celular e entrar no processo de

carcinogênese. Esta alteração pode ocorrer em adenocarcinomas de mama, onde o gene

c-erbB-2 encontra-se amplificado (Rieger, 2004).

As alterações epigenéticas são definidas como modificações na regulação da

expressão gênica. Estas alterações podem persistir por uma ou mais gerações. Não são

consideradas como mutação, pois não causam mudança na seqüência de DNA. Tem

como principais exemplos a metilação do DNA e a acetilação das histonas. A metilação

do DNA é a alteração epigenética mais estudada e corresponde à adição de um grupo

metil ao carbono na posição 5 da citosina. Ela modifica o fenótipo celular, pois provoca

inibição de funções gênicas, mas sem produzir alteração na seqüência do DNA (Rieger,

2004). A metilação pode fazer parte do processo de carcinogênese quando provoca a

metilação de ilhas CpG no DNA. Estas ilhas constituem pequenas porções de DNA que

normalmente não são metiladas. Elas são constituídas por dinucleotídeos formados por

citosinas seguidas por uma guanina (Rieger, 2004).

Revisão da Literatura 37

A maioria das alterações genéticas é adquirida através de mutações das células

somáticas. Os tumores que apresentam estas mutações são conhecidos como

esporádicos (Rieger, 2004). As mutações que ocorrem nas células germinativas são

conhecidas como hereditárias e estão associadas às diversas síndromes humanas. As

mutações hereditárias estão presentes em cerca de 5% a 10% dos tumores sólidos

humanos (Rieger, 2004).

Em 1971, a hipótese da oncogênese em “duas etapas” de Kunudson foi proposta

para explicar a ocorrência esporádica e hereditária de um tumor: o retinoblastoma. O

desenvolvimento deste é possível pela inativação de ambos os alelos normais no locus

Rb. A hipótese sugere que, nos casos hereditários, uma alteração genética é herdada de

um dos pais afetados e está presente em todas as células somáticas do corpo. Esta seria

a primeira etapa. Portanto, a criança é portadora de um alelo mutante Rb em todas as

células somáticas e apresenta fenótipo normal. A heterozigosidade para o gene Rb não

afeta o comportamento celular. A segunda etapa seria a ocorrência de uma segunda

mutação numa das muitas células da retina, que já são portadores da primeira mutação.

O câncer se desenvolve quando a célula perde a heterozigosidade, uma condição

conhecida como LOH. Nos casos esporádicos, as duas etapas ocorreriam dentro de uma

única célula somática da retina, cuja proliferação formaria o tumor (Rieger, 2004).

Um tumor, então, é o resultado de diversos ciclos de replicação celular, acúmulo

de mutações e expansão clonal (Rieger, 2004). De acordo com o conceito proposto por

Hanahan e Weinberg (2000), com as alterações gênicas acumuladas ao longo do tempo

no processo de carcinogênese, as células tumorais adquirem progressivamente

habilidades que as distinguem das células normais. Estas habilidades adquiridas,

comuns a todas as neoplasias, são enumeradas como: auto-suficiência de sinais de

crescimento, insensibilidade a sinais inibitórios, escape dos mecanismos de apoptose,

Revisão da Literatura 38

potencial de replicação ilimitado, angiogênese sustentada, capacidade de invasão e

metástases. A ordem temporal pelas quais essas habilidades são adquiridas é variável. O

repertório de alterações capazes de fazer a célula adquirir tais habilidades são múltiplos

e o conhecimento acerca destes está se acumulando rapidamente na literatura

oncológica, principalmente através de estudos que avaliam a expressão gênica

(Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger 2004)

2.5. Transformação maligna na mama

2.5.1 Auto-suficiência nos sinais de crescimento

As células neoplásicas são resultantes de proliferação desordenada pelas quais as

células adquirem novas habilidades e acumulam alterações no seu DNA. Uma destas

habilidades é a auto-suficiência de crescimento. No câncer de mama as células

desenvolvem auto-suficiência do crescimento adquirindo a capacidade de sintetizar

fatores de crescimento e seus receptores, além de outros sinalizadores mitogênicos

como proteínas transdutoras de sinal, fatores de transcrição, ciclinas e quinases ciclina-

dependentes. Estas substâncias podem interagir entre si formando uma rede de

sinalizações que levam as células a entrar no ciclo celular e proliferar

desordenadamente, formando clones de células neoplásicas (Hanahan; Weinberg, 2000;

Rieger 2004).

A auto-suficiência do câncer de mama é resultado da produção pelas células

neoplásicas de receptores de estrógeno (RE), receptores de progesterona (RP), membros

da família do receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) e reguladores do

Revisão da Literatura 39

ciclo celular como a ciclina D1, a p21, a p16, a p27 e a “Checkpoint Kinase 2” (Chk 2)

(Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger 2004).

As células neoplásicas que expressam RE agem como reguladores

transcricionais hormônio-dependentes. Existem dois tipos de RE: o REα e REβ. A

pesquisa do REα tem valor prognóstico estabelecido na terapia hormonal, porém o REβ

não tem valor prognóstico definido no câncer de mama (Esteva; Hortobagyi, 2004).

Estudos mostram que o REα e REβ estão associados a diferentes variáveis clínico-

patológicas, mas estudos adicionais precisam ser realizados para verificar as funções

destes receptores. O RP tem um papel funcional, pois indica a integridade da via

estrogênica nas células neoplásicas (Esteva; Hortobagyi, 2004).

O receptor do fator de crescimento epitelial (EGFR) é um membro da família de

fatores de crescimento EGFR ou família do receptor tirosino-quinase do tipo I. Esta

família é constituída pelo HER1, HER2, HER3 e HER4. É descrito que esta família está

envolvida no desenvolvimento e progressão dos carcinomas mamários. O EGFR,

também conhecido como c-erbB-1, ErbB-1 e HER-1, está relacionado com pior

prognóstico nos carcinomas mamários e a sua expressão indica menor sobrevida, maior

potencial metastático e negatividade para receptor de estrógeno. O HER2, também

conhecido como c-erbB-2, HER2/neu e ErbB-2, é o produto do do oncogene HER2 que

está relacionado com menor sobrevida e alto grau histológico. A literatura é pouco

informativa quanto à relação entre os carcinomas mamários e o HER-3 e o HER-4

(Srinivasan et al., 2000). É descrito que o estudo dos quatros membros da família EGFR

oferece informações mais precisas sobre o comportamento tumoral do que apenas o

estudo isolado de cada componente (El-Rehim et al., 2004; Lebeau et al., 2003).

A ciclina D1 é um regulador do ponto de restrição em G1. A superexpressão da

ciclina D1 torna o crescimento das células menos dependente dos fatores de

Revisão da Literatura 40

crescimento usuais e aceleram a passagem de G1 no ciclo celular. Ela é considerada, por

alguns autores, um oncogene em potencial (Umekita et al., 2002).

Estudos relataram que a ciclina D1 contribui para a carcinogênese mamária. Ela

é expressa em 40% a 60% dos carcinomas mamários, porém o valor prognóstico da

ciclina D1 em relação a estas neoplasias ainda é incerto. É proposto pela literatura que a

expressão da ciclina D1 em neoplasias é induzida por estrógenos. Corroborando com

estes dados, vários trabalhos descreveram que tumores com superexpressão de ciclina

D1 são mais propensos a apresentarem RE positivos (Lebeau et al., 2003; Umekita et

al., 2002).

A proteína p21 é considerada inibidora das quinases ciclina-dependentes e

reguladora da transição da fase G1 para S (Lebeau et al., 2003). Esta proteína liga-se às

ciclinas D e E, inibindo as quinases dependentes destas ciclinas (CDK 2 e CDK 4)

necessárias para a progressão do ciclo celular (Hanahan; Weinberg, 2000; Rieger 2004).

Lebeau e colaboradores (2003). Em carcinomas de mama a expressão da p21 é

relacionada às neoplasias que apresentam alto grau histológico (Lebeau et al., 2003).

Sobre os carcinomas de mama, estes autores ainda escreveram que a regulação da p21 é

complexa e não apenas regulada pela p53, mas por outras vias independentes desta

proteína (Lebeau et al., 2003).

A proteína p16

atua inibindo as quinases dependentes de ciclina. Ela se liga a

CDK 4, inibe sua ação e provoca parada do ciclo celular na fase G1. É considerada

como proteína, cuja função é inibir a proliferação celular (Hanahan; Weinberg, 2000). O

gene p16 pertence à família INK4a e está localizado no cromossomo 9p21, uma região

que sofre deleções freqüentes em cânceres humanos, inclusive nos carcinomas

mamários. Está ligada a fatores clínicos associados com pior prognóstico (Milde-

Langosch et al., 2000).

Revisão da Literatura 41

A p27 é também um regulador do ciclo celular que atua inibindo as quinases

ciclina-dependentes, provocando parada do ciclo celular em G1. A expressão do p27

confere um comportamento mais agressivo aos tumores (Milde-Langosch et al., 2000).

A Chk 2 é uma proteína responsável pela parada do ciclo celular ou apoptose

quando o DNA celular sofre danos, envolvendo mecanismos que promovem a

fosforilação do p53. Mutações no Chk 2 estão presentes em pacientes com síndrome de

Li-Fraumeni, sugerindo que este gene esteja relacionado com a inativação do p53. Ahn

e colaboradores (2004) descreveram que mutações no Chk 2 são responsáveis pelo

aumento do risco de adquirir câncer de mama, independente da presença de mutação do

gene BRCA-1 e BRCA-2 (Ahn et al., 2004). O Chk2 é denominado por alguns autores

como supressor tumoral, mas na tumorigênese do câncer mamário sua função ainda não

é bem compreendida (Ahn et al., 2004).

2.5.2 Insensibilidade aos sinais inibidores

Apoptose é um mecanismo de morte celular programada, que participa de várias

situações fisiológicas tais como o colapso endometrial durante a menstruação e a

deleção de células durante a embriogênese. A apoptose atua na manutenção da

homeostase tecidual, controlando o equilíbrio entre a proliferação e a morte celular.

Este processo é importante em certas condições patológicas como o câncer (Sirvent et

al., 2004).

A apoptose é controlada por vários genes que determinam a sobrevida da célula.

Alguns destes genes são: bcl-2, bax, survivin, p53, bag-1. Eles induzem a ativação de

enzimas que degradam o DNA e as proteínas citoplasmáticas (Sirvent et al., 2004).

Revisão da Literatura 42

Para apoptose iniciar é necessária a presença de estímulos externos ou internos.

Todos os estímulos levam a uma cascata de eventos moleculares que termina na

ativação de enzimas chamadas caspases. As caspases são proteases de cisteína

aspartato-específicas. O nome caspase origina-se de “c” de caspase e “asp” de ácido

aspártico mais o terminal “ase”(c + asp-ase = caspases) (Schimmer, 2004; Zhang et al.,

2004).

As caspases estão presentes nas células em sua forma inativa e precisam que o

programa de morte seja iniciado para serem ativadas. Existem dois tipos de caspases:

caspases iniciadoras e caspases efetoras. As caspases iniciadoras (caspase-8 e caspase-

9) clivam formas inativas das caspases tornando-as ativas. As caspases ativadas são

chamadas de efetoras (caspase-3 e caspase-7). Estas clivam outros substratos protéicos

da célula resultando no processo apoptótico (Schimmer, 2004; Zhang et al., 2004).

A ativação das caspases pode ser deflagrada através de uma via intrínseca ou

extrínseca. A via extrínseca é iniciada por receptores de morte celular, como o fator de

necrose tumoral (TNF) e o FAS, também conhecido por “apoptosis inducing protein 1”

(APO-1). Esta via permite a liberação das pró-caspases, que, após sofrerem auto-

ativação, desencadeiam a liberação de caspases efetoras (Rieger, 2004; Schimmer,

2004; Sirvent et al., 2004).

A via intrínseca é iniciada pela privação de fatores de crescimento e de

hormônios e envolve a ativação da pró-caspase 9. Esta é ativada por eventos de

transição da permeabilidade mitocondrial e culmina com liberação de citocromo c para

o meio intracitoplasmático. Esta via culmina com a ativação da pró-caspase-9, levando

à liberação em cadeia de caspases efetoras. Uma vez ativada, a caspase 9 ativa uma

série de outras pró-caspases (caspase 3, 6 e 7), resultando numa amplificação do sinal

de morte (Rieger, 2004; Schimmer, 2004; Sirvent et al., 2004).

Revisão da Literatura 43

As proteínas intracelulares que regulam diretamente o processo de ativação das

caspases constituem a denominada família bcl-2. Os membros desta família podem ser

divididos em moléculas pró-apoptóticas e antiapoptóticas (Rieger, 2004).

O equilíbrio relativo entre as diferentes proteínas da família bcl-2 define a via de

atuação anti-apoptótica ou pró-apoptótica do mecanismo de morte celular programada

(Rieger, 2004). Este mecanismo é complexo. A proteína bad está acoplada a membrana

mitocondrial e a membros anti-apoptóticos da família bcl-2, inibindo a atividade destes

últimos. A proteína bad fosforilada se liga à proteína 14-3-3σ e vai para o citoplasma

celular, deixando livres os membros anti-apoptótico da família bcl-2 para exercer sua

atividade. Quando ativadas, as proteínas anti-apoptóticas inibem a bax, evitando que o

citocromo c seja liberado para o meio intracitoplasmático e impedem a ativação das

caspases. Do contrário, quando os membros anti-apoptóticos estão ligados a bad, não há

inibição da bax. Esta libera o citocromo c para o meio intracitoplasmático e ativa a via

das caspases (Würtz et al., 2005).

O gene bcl-2 foi clonado em 1985 e sua proteína está localizada na membrana

mitocondrial interna de numerosos tipos celulares. Este gene é considerado um proto-

oncogene e foi descrito pela primeira vez na translocação cromossômica t(14;18), que

ocorre no linfoma folicular de células B. O produto deste gene promove a

sobrevivência, inibindo a ocorrência de apoptose (Sirvent et al., 2004; Zhang et al.,

2004).

A bag-1, também conhecida como RAP46, é uma proteína multifuncional. Uma

de suas funções é proteger a célula da apoptose e permitir a proliferação celular. A

superexpressão da bag-1 é descrita no processo de carcinogênese em várias neoplasias

humanas, entre eles o câncer de mama (Townsend et al., 2005).

Revisão da Literatura 44

Entre as proteínas pró-apoptóticas, a mais conhecida é a bax, que está

relacionado com a bcl-2, com quem pode produzir heterodímeros. Pode também

produzir homodímeros consigo mesma. Ao que parece, a bcl-2 suprime a morte celular

quando heterodimerizada com a bax (bcl-2/bax). Por outro lado, o homodímero bax/bax

promove a morte celular programada (Sirvent et al., 2004; Zhang et al., 2004).

A p53 exibe um mecanismo complexo em relação a apoptose. Quando ocorre

lesão no DNA celular, o gene p53 pode seguir dois caminhos diferentes. Ele pode

promover a parada do ciclo celular em G1 para que o DNA celular possa ser reparado

ou induzir a apoptose, se o dano celular for irreversível. Para que ocorra a apoptose, a

expressão do p53 regula positivamente o bax e negativamente o bcl-2, estimulando a

apoptose. Tumores invasivos de mama mostram positividade imuno-histoquímica para a

p53. Esta positividade reflete a presença do p53 mutado, que é incapaz de induzir a

expressão do bax, não permitindo as células neoplásicas de entrar em apoptose (Sirvent

et al., 2004; Zhang et al., 2004).

O processo de apoptose é controlado por um família de proteínas inibidoras da

apoptose. Estas são proteínas anti-apoptóticas que se ligam às caspases 3, 7 e 9,

inativando-as e impedindo a progressão da cascata de morte celular. A proteína survivin

é um membro das proteínas inibidoras da apoptose. Ela é expressa normalmente em

tecidos fetais, mas não em tecidos adultos. É descrita sua superexpressão em

adenocarcinomas de pulmão, pâncreas, cólon, próstata e mama. A proteína survivin está

sendo investigada como marcador de transformação maligna precoce, já que não é

expresso nas células adultas normais (Schimmer, 2004).

A presença de distúrbios no mecanismo de apoptose é um dos fatores essenciais

para a carcinogênese, pois podem levar a proliferação celular descontrolada (Schimmer,

2004; Sirvent et al., 2004).

Revisão da Literatura 45

2.5.3 Potencial infinito de replicação: Telomerase

Os telômeros são estruturas complexas e especializadas encontrados nas

extremidades dos cromossomos. Eles são formados por repetições de seis nucleotídeos

– TTAGGG – que compreendem até dezenas de quilobases (Bièche et al., 2000;

Kirkpatrick et al., 2004; Mokbel et al., 1999). Os telômeros estabilizam os

cromossomos, protegendo-os da degradação por nucleases. A cada ciclo de replicação

celular, os telômeros progressivamente se encurtam. Ao atingirem um comprimento

criticamente curto de telômero, a célula interrompe a divisão e envelhece. Criou-se a

hipótese de que o telômero funcionaria como um relógio celular e seria um dos fatores

responsáveis pela senescência (Bièche et al., 2000; Kirkpatrick et al., 2004; Mokbel et

al., 1999).

A enzima telomerase é uma ribonucleoproteína que reconhece os terminais dos

telômeros e acrescenta repetições adicionais aos cromossomos (Bièche et al., 2000;

Mokbel et al., 1999). Observou-se que esta enzima é inativa ou inibida na maioria das

células somáticas (Bièche et al., 2000). Nas células germinativas (espermatozóides,

óvulos e em algumas células tronco), a telomerase é uma enzima normalmente ativa.

Esta enzima apresenta atividade bioquímica aumentada em 80 a 90% das neoplasias

(Kirkpatrick et al., 2004). As células neoplásicas que possuem a telomerase ativa podem

replicar-se sem limite. A este processo é dado o nome de imortalização (Ikeda et al.,

2003; Mokbel et al., 1999).

A telomerase possui uma subunidade catalítica com atividade transcriptase

reversa denominada de hTERT-“human telomerase reverse transcriptase”- e uma

subunidade de RNA, denominada de hTR-“human telomerase RNA”. Possui também

um componente hTP-“telomerase associated protein”, que desempenha papel estrutural

Revisão da Literatura 46

(Bièche et al., 2000; Kirkpatrick et al., 2004, Poremba et al., 2002). A hTERT é a

proteína responsável pela atividade da telomerase. A detecção dessa proteína pode ser

realizada através do protocolo da amplificação repetida da telomerase (TRAP-

“telomerase repeat amplification protocol”), reverso da transcrição da reação em cadeia

de polimerase (RT-PCR-“reverse transcription polymerase chain reaction”) e de estudos

imuno-histoquímicos (Bièche et al., 2000). A TRAP e a RT-PCR são métodos

complexos, que exigem maior tempo e não estão associados com parâmetros

morfométricos. A imuno-histoquímica, além de utilizar parâmetros morfológicos, é um

método utilizado na rotina de patologia cirúrgica (Ikeda et al, 2003; Poremba et al.,

2002).

A telomerase tem sido foco de muitas pesquisas, havendo um interesse crescente

no estudo de seu papel na carcinogênese. Em várias publicações, é descrito que a

presença da telomerase está associada com aumento da proliferação celular em cânceres

humanos. O aumento da proliferação celular pode ser mensurado através da detecção

imuno-histoquímica da proteína Ki-67 (Ikeda et al., 2003; Morkbel et al., 1999). Foi

observada correlação entre telomerase e Ki-67 no câncer colo-retal, carcinomas de

pequenas células do pulmão e carcinoma papilífero da tireóide (Ikeda et al., 2003).

2.5.4 Angiogênese

A angiogênese é um mecanismo dinâmico que consiste no desenvolvimento e

crescimento de vasos sanguíneos a partir de outros preexistentes. Este processo

acompanha o indivíduo desde o período embrionário até a vida pós-natal. A

angiogênese pode ser fisiológica ou patológica (angiogênese tumoral) e ambas são

compostas por diversas etapas (Hicklin; Ellis, 2006).

Revisão da Literatura 47

A angiogênese tumoral é semelhante à fisiológica, porém os novos vasos

formados têm algumas particularidades. Eles não possuem pericitos e as paredes

constituídas por células endoteliais são finas, tortuosas, dilatadas e muito permeáveis

devido à presença de diversos poros e à inexistência de membrana basal (Hicklin; Ellis,

2006).

Para que as etapas da angiogênese se processem normalmente, é necessário um

equilíbrio entre os fatores estimuladores e inibidores. Dentre os fatores estimuladores,

detacam-se a família VEGF (factor de crescimento vascular endotelial) e seus

receptores. No processo de inibição, destacam-se as interleucinas e os inibidores

tecidulais das metaloproteinases (TIMP) (Hicklin; Ellis, 2006).

O VEGF também é conhecido como “fator de permeabilidade vascular (VPF)”,

uma vez que permite que os fluidos e as proteínas do plasma extravasem. Muitos

tecidos produzem pequenas concentrações deste fator. Porém, durante a angiogênese,

este fator aumenta consideravelmente. O VEGF tem seis isoformas: VEGF-A, VEGF-B,

VEGF-C, VEGF-D, VEGF-F e o fator de crescimento plaquetário 1 e 2. Possui três

receptores de tirosina quinase: VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. O VEGFR-1 e o

VEGFR-2 estão relacionados com os processo de angiogênese e vasculogênese. O

VEGFR-3 atua na linfangiogênese e é produzido por células endoteliais linfáticas

(Hicklin; Ellis, 2006).

O VEGF interfere em passos essenciais da angiogênese e exerce diversos efeitos

nas células endoteliais. Além do aumento da permeabilidade, ele promove ativação,

aumento da ação mitogênica e inibição da apoptose nas células endoteliais. O VEGF

ainda pode induzir a ativação das metaloproteinases de matriz extracelular (MMP),

facilitando o processo de angiogênese (Hicklin; Ellis, 2006).

Revisão da Literatura 48

A expressão do VEGF pode ser regulada por vários fatores como a hipóxia, as

cicloxigenases, oncogenes e genes supressores tumorais. Nestes dois últimos grupos,

destacam-se o c-erBb 2 e o p53. O c-erbB-2 induz a angiogênese, estimulando a

produção do VEGF. O p53 previne a expressão do VEGF em células do câncer de

mama (Hicklin; Ellis, 2006).

Inibir a angiogênese tumoral através do bloqueio do VEGF é uma estratégia

terapêutica que vem sendo pesquisada, uma vez que este fator pode estar relacionado ao

crescimento, proliferação e resistência ao tratamento tumoral.

2.5.5 Invasão tecidual e Metástase

Durante o processo de tumorigênese, algumas células adquirem fenótipo

agressivo tornando-se capazes de invadir e formar metástases à distância. As células

metastáticas freqüentemente apresentam a expressão de moléculas identificadas como

marcadores de progressão tumoral. Estas moléculas estão sendo utilizadas em estudos

que envolvem a fisiopatologia da disseminação metastática e na descoberta de novos

fatores prognósticos (Baker et al., 2002; Noel et al., 2006).

A metástase é um processo complexo resultante da interação entre as células

tumorais e o tecido onde estas células se encontram. Na disseminação tumoral, as

células neoplásicas devem adquirir habilidades para se soltar do tumor primário, invadir

a matriz extracelular, migrar pelo estroma intersticial, induzir angiogênese, atravessar a

membrana basal e o endotélio dos vasos, alcançar a corrente sanguínea e linfática,

sobreviver na corrente sanguínea, ligar-se ao endotélio vascular, sofrer extravasamento,

e proliferar no parênquima do órgão-alvo (Baker et al., 2002; Noel et al., 2006; Tang et

al., 2005).

Revisão da Literatura 49

Entre as etapas de progressão do processo metastático, destaca-se a degradação

da matriz extracelular. As moléculas efetoras desta etapa são enzimas pertencentes às

metaloproteinases de matriz extracelular (MMP). Estas proteínas pertencem a uma

família de endopeptídeos zinco-dependente que contém mais de 20 membros. Elas

podem estar superexpressas nas células do estroma tumoral em vários tipos de câncer.

Entre as células que expressam o MMP, estão as células endoteliais, fibroblastos e

células mioepiteliais (Baker et al., 2002; Tang et al., 2005).

As MMP são encontradas em sua forma inativa. São ativadas pela plasmina,

principal ativador das MMP. A plasmina resulta da conversão do plasminogênio pelos

membros do sistema ativador do plasminogênio (uPA - Ativador de plasminogênio do

tipo uroquinase; tPA - ativador de plasminogênio do tipo tecidual). Além disso, a

plasmina é regulada pelo inibidor da ativação do plasminogênio (PAI) (Baker et al.,

2002).

As MMP ativadas degradam a matriz extracelular e a membrana basal nas fases

iniciais do processo de carcinogênese e, nas fases tardias deste processo, promovem o

crescimento sustentado, a angiogênese, invasão local e metástase à distância (Tange et

al, 2005). Noel e colaboradores (2006) relataram a associação entre a expressão das

MMP com a invasão tecidual, o crescimento tumoral e o aumento da vascularização

(Noel et al., 2006).

A degradação da matriz extracelular também é regulada pelo equilíbrio entre

moléculas inibidoras e estimuladoras. As moléculas estimuladoras são conhecidas como

indutoras da metaloproteinase da matriz extracelular (EMMPRIN). Estas são membros

da família de imunoglobulinas e estão presentes na superfície de várias células tumorais.

As EMMPRIN estimulam a expressão das MMP nos fibroblastos, nas células

Revisão da Literatura 50

endoteliais e nas células tumorais, por um mecanismo envolvendo interação entre

moléculas de EMMPRIN (Tang et al., 2005).

Além de exercer papel proteolítico, alguns membros da família das MMP

exercem papel importante na regulação da angiogênese. Com a ação proteolítica, as

MMP preparam a matriz extracelular para receber os fatores angiogênicos. Algumas

MMP podem participar da mobilização destes fatores. A MMP-9 pode promover a

mobilização do VEGF de moléculas presentes na matriz extracelular estimulando a

neovascularização. Por outro lado, outras MMP induzem fatores anti-angiogênicos

como a angiostatina e endostatina (Tang et al., 2005).

Dentre os inibidores, destaca-se a família dos inibidores de metaloproteinases

teciduais (TIMP). A família é composta de quatro componentes: TIMP-1, TIMP-2,

TIMP-3 e TIMP-4. Elas estão expressas no estroma peritumoral, em células como

fibroblastos e endotélio vascular (Würtz et al., 2005). Além de inibir as MMP, as TIMP

estimulam o crescimento de vários tipos celulares e modulam negativamente o processo

de angiogênese (Baker et al., 2002). No entanto, Noel e colaboradores (2006)

escreveram que as TIMP são proteínas multifatorias e podem estar relacionadas tanto

aos fatores inibidores quanto aos estimuladores da carcinogênese (Noel et al., 2006).

Segundo estes autores, as TIMP podem induzir proliferação de alguns tipos celulares,

promover angiogênese e ação anti-apoptótica às células tumorais (Noel et al., 2006).

A angiogênse promovida pelas TIMP está relacionada ao fato de que algumas

MMP estimulam fatores anti-angiogênicos (endostatina e angiostatina). As TIMP, sendo

inibidoras da MMP, impediriam a estimulação destes fatores (Würtz et al., 2005). Würtz

e colaboradores (2005) ainda relatam relação das TIMP com a expressão VEGF em

células de carcinomas mamários humanos (Würtz et al., 2005).

Revisão da Literatura 51

A ação anti-apoptótica relacionada às TIMPs envolvem mecanismo dependente

e indepentente das MMP. Würtz e colaboradores (2005) relataram que a integridade da

matriz extracelular e as interações celulares da matriz suprimem a apoptose. Quando

ocorre degradação da matriz pelas MMP, fatores pró-apoptóticas são liberados e

induzem a ativação das caspases. Este seria o mecanismo dependente das MMP, pois

com a TIMP inibindo-as não haveria degradação da matriz extracelular (Würtz et al.,

2005). O mecanismo independente das MMP ainda não é bem estabelecido. Würtz e

colaboradores (2005) sugerem que este último mecanismo seja decorrente da

fosforilação pelas TIMP da quinase de adesão focal (FAK) intracitoplasmática,

iniciando a via PI-3/Akt/bad/bcl-2 (Würtz et al., 2005).

Muitas pesquisas vêm investigando marcadores biológicos que possam

determinar a predisposição metastática tumoral. Entendendo melhor este processo, os

cientistas poderiam descobrir uma forma de controlar a disseminação metastática ou, até

mesmo, erradicá-la (Wang-Rodrigues et al., 2003). A linhagem de células M-4A4

secreta uma proteína chamada osteopontina (OPN). Esta é uma glicoproteína que está

envolvida no desenvolvimento ósseo e na regulação do sistema imune. A OPN é

expressa normalmente em alguns tipos celulares, incluindo leucócitos e células de

linhagem epitelial (Wang-Rodrigues et al., 2003).

De acordo com os estudos preliminares, a OPN parecia se comportar como um

clássico marcador biológico preditor de metástase. No entanto, níveis elevados de OPN

foram detectados em macrófagos e linfócitos localizados no estroma perilesional e

também em condições fisiológicas, como gravidez e amamentação. Dados mais recentes

sugerem que aumento nos níveis de OPN em pacientes com carcinoma primário é uma

etapa necessária, mas não suficiente para a disseminação metastática. Portanto, a

expressão aumentada de OPN pode ser utilizada na diferenciação de lesões benignas e

Revisão da Literatura 52

malignas, mas o seu papel como preditor de metástase ainda não está bem esclarecido

(Wang-Rodrigues et al., 2003).

Os eventos relacionados à invasão tecidual e à metástase são alvos de várias

pesquisas. Estas se propõem a desvendar novos marcadores tumorais que possibilitem

detectar precocemente a tendência dos tumores na produção de metástases.

2.6 Fatores prognósticos em câncer de mama

A história natural do câncer de mama indica que o curso clínico da doença e a

sobrevida variam de paciente para paciente (Abreu; Koifman, 2002). Esta variação é

determinada por uma série de variáveis clínico-patológicas e prognósticas ainda não

completamente compreendidas e que podem estar relacionadas com a condição

imunológica, hormonal, nutricional e genética do paciente. Estes fatores estão sendo

estudados para predizer o prognóstico de pacientes com câncer, incluindo o carcinoma

mamário (Elston; Ellis, 1991; Fitzgibbons et al., 1999).

O termo “fator prognóstico” pode ser definido como um parâmetro possível de

ser mensurado, em um paciente com câncer, no momento do diagnóstico e que servirá

como preditor da sobrevida ou do tempo livre de doença. O aprimoramento do

conhecimento sobre fatores prognósticos é constante. Estudos científicos continuam

publicando novos fatores prognósticos para pacientes com câncer, dos quais muitos são

considerados promissores (Abreu; Koifman, 2002).

Nos tumores mamários, a conduta terapêutica a ser escolhida não é baseada

apenas na avaliação dos fatores prognósticos. A combinação e o conhecimento das

variáveis clínico-patológicas e prognósticas permitem a escolha da terapêutica mais

benéfica e individualizada, com intensidade e efetividade adequadas ao paciente, maior

Revisão da Literatura 53

seletividade na aplicação dos tratamentos adjuvantes, além de reduzir o sofrimento

oriundo dos efeitos colaterais das drogas utilizadas no tratamento do câncer (Abreu;

Koifman, 2002; Elston; Ellis, 1991; Esteva; Hortobagyi, 2004; Fitzgibbons et al., 1999).

2.6.1 Fatores clínico-patológicos e prognósticos utilizados na rotina de patologia

mamária

Estes são fatores clínico-patológicos definidos como de importância prognóstica

em patologia mamária e utilizados no manejo clínico dos pacientes. Alguns fatores

prognósticos clínico-patológicos, como grau e subtipo histológico do tumor, tamanho

tumoral e envolvimento dos linfonodos axilares são fatores prognósticos bem

estabelecidos (Fitzgibbons et al., 1999).

Além dos fatores prognósticos e clínico-patológico, existem marcadores

moleculares detectados por imuno-histoquímica que são considerados importantes para

a avaliação do paciente com câncer. Alguns destes marcadores estão relacionados ao

prognóstico, outros, à resposta terapêutica ou a ambos (Esteva; Hortobagyi, 2004).

Receptores hormonais (RE e RP), c-erbB-2, p53 e ki-67 são marcadores imuno-

histoquímicos utilizados na rotina de patologia mamária. Estes marcadores, embora

apresentem valor prognóstico bem estabelecido em patologia mamária, freqüentemente

estão participando de estudos que tentam verificar as interações com outras variáveis

clínicas, patológicas e terapêuticas (Esteva; Hortobagyi, 2004).

A influência da idade na determinação da sobrevida no câncer de mama

permanece controversa. Esta informação pode ser resultado do pequeno número de

pacientes envolvidos nos estudos realizados, das diferentes formas de estratificação das

idades e da falta de correlação dos óbitos ocorridos por outras causas diferentes do

Revisão da Literatura 54

câncer de mama. Estudos relatam que pacientes com câncer de mama pertencentes a

quarta e quinta décadas de vida apresentam melhor prognóstico. Por outro lado, um pior

prognóstico estaria relacionado ao grupo de mulheres mais jovens (idade igual ou

inferior a 35 anos) e àquelas cujo diagnóstico do câncer venha a ser estabelecido a partir

dos 75 anos de idade (Abreu; Koifman, 2002).

O tamanho tumoral e a condição dos linfonodos axilares são os dois mais

importantes indicadores prognósticos para câncer de mama, tanto que constituem a base

do estadiamento TNM (Abreu; Koifman, 2002). O tamanho tumoral é um importante

preditor do comportamento tumoral (Fitzgibbons et al., 1999). Ele está relacionado ao

desenvolvimento de metástase, recidiva e a indicação do tratamento no momento do

diagnóstico. Na ausência de comprometimento metastático dos linfonodos axilares, o

tamanho do tumor torna-se o melhor preditor da recidiva tumoral (Abreu; Koifman,

2002). Quanto maior o tamanho tumoral, maiores são as chances de comprometimento

metastático dos linfonodos loco-regionais. Os tumores de menor tamanho estão

relacionados a um melhor prognóstico tanto para sobrevida quanto para o tempo livre de

doença (Abreu; Koifman, 2002; Elston; Ellis, 1991; Fitzgibbons et al., 1999).

O estudo do envolvimento axilar e do número de linfonodos comprometidos são

informações prognósticas importantes. Os tumores de até 1,0 cm de diâmetro

apresentam de 20% a 30% de chance de apresentarem linfonodos envolvidos pela

doença e os tumores ductais com grau histológico elevado podem até dobrar este

percentual em relação ao comprometimento dos linfonodos (Abreu; Koifman, 2002).

Estudos demonstram que o tamanho tumoral, a sobrevida das pacientes e a recorrência

da doença estão diretamente relacionados ao número de linfonodos comprometidos

(Abreu; Koifman, 2002, Fitzgibbons et al., 1999). Pacientes com linfonodos axilares

negativos apresentam 20% a 30% recorrência, enquanto pacientes com linfonodos

Revisão da Literatura 55

positivos apresentam 70% de recorrência. Pacientes com quatro ou mais linfonodos

acometidos apresentam pior prognóstico (Fitzgibbons et al., 1999).

O prognóstico está relacionado com o subtipo histológico do tumor. O

carcinoma ductal e o carcinoma lobular invasor, na sua apresentação pura ou em

combinação com outros tipos, são as formas mais comuns de carcinoma mamário.

Quando dois ou mais diferentes tipos de tumores estão presentes, a classificação é feita

de acordo com o tipo de tumor que exibe o maior percentual de células neoplásicas

(Abreu; Koifman, 2002). O carcinoma ductal invasor é considerado a neoplasia

mamária maligna de pior prognóstico e com maior envolvimento linfático. De maneira

simplificada e tendo o carcinoma ductal invasor como referencial, o carcinoma tubular

puro, o carcinoma mucinoso e o carcinoma cribiforme invasivo apresentam melhor

prognóstico. O carcinoma lobular e o carcinoma medular apresentam prognóstico

intermediário em relação aos carcinomas ductais invasores (Abreu; Koifman, 2002;

Elston; Ellis, 2001).

O grau histológico reflete o potencial de malignidade do tumor indicando a sua

maior ou menor capacidade de metastatizar, sobrevida, tempo livre de doença, além de

permitir a estratificação de risco e a formulação do estadiamento tumoral para cada

paciente (Abreu; Koifman, 2002; Elston & Ellis, 2001; Fitzgibbons et al., 1999). Porém,

o emprego do grau histológico na determinação prognóstica do câncer da mama

apresenta controvérsias. Isto se deve à dificuldade na reprodutibilidade do diagnóstico

histológico entre diferentes patologistas e entre diferentes serviços, visto a natureza

subjetiva de sua determinação (Abreu; Koifman, 2002; Elston & Ellis, 2001). Esta

variável se tornou mais reprodutível após a graduação de Nottinghan (Esteva;

Hortobagyi, 2004).

Revisão da Literatura 56

A condição do RE e do RP teve sua significância prognóstica estabelecida na

segunda metade dos anos 70 (Abreu; Koifman, 2002; Elston; Ellis, 1991; Esteva;

Hortobagyi, 2004; Fitzgibbons et al., 1999). A partir da introdução do método imuno-

histoquímico, que possibilitou a utilização do tecido fixado em formalina, o estudo dos

receptores hormonais por biópsia tornou-se prático e de custo reduzido. O RE, quando

positivo, está associado com a idade, baixo grau histológico, grau nuclear menor, baixo

índice de proliferação celular e a paciente pode ser beneficiada com a terapia hormonal

adjuvante. Por outro lado, a negatividade do RE está associada com baixa diferenciação

tumoral, alta taxa de proliferação celular e outras variáveis que desfavorecem o

prognóstico das pacientes com câncer de mama (Abreu; Koifman, 2002; Esteva;

Hortobagyi, 2004). Com relação à sobrevida, as pacientes com tumores RE positivos

tendem a ter uma sobrevida maior, e melhor resposta à terapia hormonal do que aquelas

com RE negativos (Abreu; Koifman, 2002; Elston; Ellis, 1991; Esteva; Hortobagyi,

2004; Fitzgibbons et al., 1999).

Estudos demonstram que o bom prognóstico conferido pela positividade do RE

não é sustentável a longo prazo. Trabalhos citados no artigo de Abreu e Koifman (2002)

descrevem que o valor preditivo da condição do RE no tumor primário decresce

aproximadamente 20% ao ano. Outros autores descrevem que a significância estatística

desaparece com 10 anos de seguimento. Se por um lado o RE não se apresenta como um

preditor competente da sobrevida a longo prazo, por outro ele é um forte preditor de

resposta para a terapia endócrina adjuvante (Abreu; Koifman, 2002).

O RP tem sido apresentado, na maioria dos estudos, como portador de um papel

secundário, indicando a integridade da via estrogênica nas células neoplásicas. No

entanto, algumas pesquisas relatam que as pacientes mais idosas com metástase e RP

Revisão da Literatura 57

positivo apresentam maior tempo de intervalo livre de progressão da doença (Abreu;

Koifman, 2002; Esteva; Hortobagyi, 2004).

C-erbB-2 é um oncogene cuja amplificação gênica ou superexpressão são

importantes na patogênese do câncer de mama (Elston; Ellis, 1991; Esteva; Hortobagyi,

2004). Ele está presente em cerca de 20% a 30% dos carcinomas mamários invasores e a

expressão aumentada desta proteína é considerada como indicador de mau prognóstico.

As pacientes com acometimento neoplásico dos linfonodos axilares, que

expressam c-erbB-2, apresentam um alto risco de recidiva precoce, menor sobrevida,

menor tempo livre de doença e alto grau histológico (Abreu; Koifman, 2002; Elston;

Ellis, 1991; Fitzgibbons et al., 1999). Variáveis como sobrevida e tempo livre de doença

estariam relacionadas ao mau prognóstico em carcinomas mamários positivos para c-

erbB-2 devido ao aumento da atividade metastática apresentado pelas células tumorais

que expressam esta proteína (Abreu; Koifman, 2002).

Em relação ao tratamento, existem vários trabalhos com resultados conflitantes.

Um destes relatos descreve pacientes com a expressão aumentada da c-erbB-2

apresentando maior resistência às drogas quimioterápicas (Abreu; Koifman, 2002). No

entanto, é descrito que pacientes com c-erbB-2 positivo apresentam melhor resposta a

alguns quimioterápicos, como a doxorubicina, e pacientes com carcinoma de mama

metastático com c-erbB-2 positivo são fortes candidatos a terapia com anticorpo

monoclonal Trastuzumab (Herceptin ®). Em relação à terapia hormonal, a presença do

c-erbB-2 é controversa (Esteva; Hortobagyi, 2004).

O gene supressor tumoral p53 e suas mutações estão relacionados com um

comportamento mais agressivo do tumor, negatividade para receptores de estrógeno, alto

grau histológico e um prognóstico desfavorável. Outros estudos correlacionaram a

expressão aumentada da p53 em carcinomas de mama com agressividade do tumor, recidiva

Revisão da Literatura 58

ou metástase precoce e menor sobrevida em pacientes com linfonodo axilares negativos

(Abreu; Koifman, 2002; Esteva; Hortobagyi, 2004; Fitzgibbons et al., 1999). As mutações

do p53 em células germinativas, como na síndrome de Li-Fraumeni, aumentam a incidência

para o carcinoma mamário. Nos carcinomas mamários hereditários, é descrito uma

correlação entre o p53 e o BRCA-1 e BRCA-2. As associações verificadas entre os estudos

imuno-histoquímicos e os resultados clínicos em relação à proteína p53 são promissores,

porém muito ainda necessita ser aprendido sobre a função do p53 e suas interações com

seus produtos e outros genes, principalmente com os genes da família p53 (Abreu;

Koifman, 2002; Fitzgibbons et al., 1999).

O Ki-67 é uma proteína nuclear lábil que identifica células nas fases G1, S, G2 e

M, mas não na fase G0. É um importante marcador imuno-histoquímico na detecção de

proliferação celular. Quanto maior a expressão do ki-67 em células neoplásicas, pior é o

prognóstico. Pacientes portadores de carcinoma mamário com mais de 50% das células

neoplásicas positivas para ki-67 apresentam alto risco de desenvolver recorrência

(Esteva; Hortobagyi, 2004; Fitzgibbons et al., 1999). Mokbel e colaboradores (1999)

descreveram que quanto maior a percentagem de células neoplásicas nos carcinomas

mamários, mais indiferenciado é o tumor (Mokbel et al., 1999). Estudos mostram

associação do ki-67 com grau nuclear, idade, contagem mitótica e metástase para

linfonodos (Esteva; Hortobagyi, 2004; Mokbel et al., 1999).

2.6.2 Marcadores imuno-histoquímicos não definidos quanto ao seu papel ou com

papel secundário na rotina de patologia mamária

São marcadores imuno-histoquímicos que não apresentam estudos suficientes

para defini-los como de uso freqüente na rotina de patologia mamária. Entre eles estão o

Revisão da Literatura 59

bcl-2, c-erbB-3, EGFR, VEGF, MMP, EMMPRIN, TIMP, PAI, telomerase,

osteopontina (OPN) e a p63.

Em relação à morte celular, quando as células neoplásicas apresentam baixo

índice apoptótico, espera-se que o tumor tenha um comportamento mais agressivo.

Paradoxalmente, apesar da proteína bcl-2 apresentar função anti-apoptótica, sua

superexpressão está associada ao maior tempo livre de doença. Estudos mostram que

este dado controverso é decorrente da associação da bcl-2 com a presença de RE nos

carcinomas de mama. A presença de RE confere melhor resposta ao tamoxifeno,

explicando a relação da proteína bcl-2 com maior tempo livre de doença. Ela também

está relacionada com a resposta dos tumores ao tratamento quimioterápico. Os tumores

bcl-2 negativos respondem melhor à quimioterapia, enquanto os tumores bcl-2 positivos

geralmente não apresentam boa resposta quimioterápica (Elston; Ellis, 1991).

Srinivasan e colaboradores descrevem que a marcação imuno-histoquímica

nuclear do anticorpo c-erbB-4 está associado a melhor fenótipo dos carcinomas

mamários. Estes autores também relatam a expressão do c-erbB-3 em algumas

neoplasia malignas. O c-erbB-3 encontra-se superexpresso em 20% dos carcinomas

mamários invasores (Srinivasan et al., 2000). No entanto, a literatura é pouco

informativa quanto à relação entre os carcinomas mamários e o HER-3 e o HER-4

(Srinivasan et al., 2000).

O EGFR, quando expresso em carcinomas de mama, tem sido correlacionado

com a negatividade para RE, má resposta ao tratamento com tamoxifeno e tumores com

grau histológico elevado (Elston; Ellis, 1991).

Além da função proteolítica, estudos descrevem que os membros da família das

MMP também participam da angiogênese através da estimulação do VEGF (Würtz at

al., 2005). Com relação à progressão tumoral, a expressão das MMP está aumentada em

Revisão da Literatura 60

várias neoplasias humanas, inclusive em carcinomas mamários, quando comparada à

expressão desta proteína em tecido normal. As neoplasias que apresentam expressão da

MMP aumentada estão relacionadas a um pior prognóstico (Baker et al., 2002).

Paradoxalmente, as TIMP, que são inibidoras das MMP, estão relacionadas a um

pior prognóstico (Baker et al., 2002; Würtz et al., 2005). Para explicar este dado, Würtz

e colaboradores (2005) propuseram que as TIMP estimulariam a proliferação celular

através de mecanismo de receptor de superfície celular ainda não conhecido. Este

mecanismo promoveria a angiogênese e exerceriam função anti-apoptótica, por um

processo dependente e outro independente das MMP (Würtz e al., 2005).

O PAI-1 e uPA, componentes do sistema de ativação do plasminogênio, estão

relacionados com prognóstico desfavorável, menor sobrevida livre de doença e menor

sobrevida global (Baker et al, 2002). Por ser um inibidor do ativador das MMP, a

proteína PAI deveria estar relacionada a bom prognóstico. No entanto, Würtz e

colaboradores (2005) descreveram efeitos anti-apoptóticos e pró-angiogênicos

relacionados a PAI, o que explicaria a sua relação com o prognóstico desfavorável

(Würtz et al., 2005).

O principal estímulo para a angiogênese é a interação entre o VEGF e seus

receptores (Ferrara, 1999). Estudos relatam que a expressão do VEGF se correlaciona

com pior prognóstico, pois em alguns tumores o VEGF estimula o crescimento tumoral,

comportamento mais agressivo, recorrência e metástase, além de estar relacionado à

menor sobrevida (Ferrara, 1999; Linderholm et al., 2001). Devido à importância do

VEGF na angiogênese e na progressão tumoral, a sua inibição é um importante alvo nas

terapias de cânceres experimentais (Weigand et al., 2005).

Estudos relatam correlação entre a expressão da telomerase e maior

agressividade tumoral. Esta agressividade é descrita nos neuroblastomas e nos cânceres

Revisão da Literatura 61

gástricos. Em relação ao prognóstico, a associação entre a telomerase e os carcinomas

mamários é controversa (Poremba et al, 2002). Autores relatam que altos níveis de

telomerase estão associados com a presença de metástase para linfonodos axilares,

recorrência tumoral e aumento da proliferação celular mensurada pelo ki-67 (Ikeda et

al., 2003; Morkbel et al., 1999; Poremba et al., 2002). Outros estudos sugerem que a

telomerase pode ser utilizada como marcador prognóstico, marcador para quimioterapia

anti-câncer e marcador biológico para detecção do câncer, mas estudos adicionais são

necessários para validar essas hipóteses (Mokbel et al., 1999; Poremba et al., 2002).

Através de estudos imuno-histoquímicos e de RT-PCR, foi detectada expressão

aumentada de OPN em tumores primários de mama. Em pacientes com câncer mamário

metastático, níveis elevados da OPN foram detectados no plasma (Wang-Rodrigues et

al., 2003). Porém, como já foi dito, a expressão aumentada de OPN pode ser utilizada

na diferenciação de lesões benignas e malignas, mas o seu papel como preditor de

metástase ainda não está bem esclarecido (Wang-Rodrigues et al., 2003).

Justificativa 62

3. JUSTIFICATIVA

Os três genes da família p53 apresentam alto grau de homologia entre si. No

entanto, apesar da semelhança estrutural e, em parte, funcional entre os genes da família

p53, estudos descrevem funções diversificadas para estes genes a depender da isoforma

e das circunstâncias atuantes.

Os genes da família p53 atuam sobre proteínas-alvo em vias metabólicas

diferentes. Com isso, várias interações entre proteínas-alvo, vias metabólicas e membros

da família p53 podem ser possíveis. Por exemplo, a proteína p21 é alvo de dois

membros da família p53 (o p53 e o p73) e atuam sobre a mesma via metabólica

promovendo parada do ciclo celular para que o DNA celular possa ser reparado. Além

de atuarem em diversas vias metabólicas, algumas das isoformas dos genes da família

p53 também apresentam papel de cooperação e de dependência entre si para poder

exercer suas funções. O conhecimento das proteínas-alvo, das vias biológicas e das

interações entre os membros da família é um desafio, mas que vem progredindo em

diversas pesquisas (Moll; Slade, 2004).

Como o p63 faz parte da família p53, as informações obtidas sobre ele não são

diferentes das demais. Ele apresenta atividade biológica diversa, complexa, pouco

definida, nas quais muitas de suas proteínas-alvo são desconhecidas (Moll; Slade, 2004;

Westfall; Pietenpol, 2004). Algumas destas proteínas-alvo podem ser expressas nas

células e detectadas pela reação de imuno-histoquímica. Como as alterações do p53

estão relacionadas à carcinogênese de vários tumores, seria interessante verificar se o

p63, como membro da família p53, apresentaria também relação com vias ligadas à

progressão tumoral. Utilizamos casos de carcinoma ductal mamário invasor, pois estes

são carcinomas encontrados em grande número no serviço de Patologia do Hospital das

Justificativa 63

Clínicas de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, facilitando a obtenção do “N”e

de informações clínicas completas e padronizadas para o estudo. Além disso, a literatura

descreve que alguns carcinomas ductais invasores expressaram a proteína p63

(Barbareschi et al., 2001; Reis-Filho et al., 2003; Ribeiro-Silva et al., 2003). Para tentar

verificar a relação da p63 com os carcinomas ductais invasores e possíveis proteínas-

alvo, selecionamos vários anticorpos que agem em vias metabólicas diferentes, nas

quais muitos estão relacionados à carcinogênese. Além dos anticorpos, foram inclusos

no estudo, variáveis clínico-patológicas e prognósticas consideradas importantes em

patologia mamária, nas quais a relação com a expressão da proteína p63 não é bem

esclarecida.

Agrupamos os anticorpos em diferentes grupos: anticorpos com importância

clínica-patológica e prognóstica em patologia mamária (RE, RP, p53, c-erbB-2, ki-67),

reguladores do ciclo celular (c-erbB-3, ChK2, ciclina D1, EGFR, p16, p21, p27,

telomerase), reguladores da apoptose (bag-1, bax, bcl-2, caspase-8, p53, survivin) e

proteínas que atuam no processo de invasão e metástase (EMMPRIN, MMP1, MMP2,

OPN, PAI, TIMP1, TIMP2, VEGF). Muitos destes anticorpos são descritos como alvos

do p53 e do p73, mas não do p63. No entanto, devido às interações de funções entre os

genes da família p53, procuramos verificar se haveria relação entre as proteínas-alvo de

vias metabólicas diferentes e a expressão da proteína p63.

Alguns dos anticorpos com importância clínica-patológica em patologia

mamária (RE, RP, p53, c-erbB-2, ki-67) apresentam relação com pelo menos um dos

membros da família p53 e, por esta razão, foram inclusos nos estudo. Outros anticorpos

deste grupo não apresentam interação esclarecida com os membros da família p53 e

para verificar esta relação também foram inclusos no estudo. Por exemplo, a literatura

descreve que presença de RE negativo está relacionada com mutações no p53 (Abreu;

Justificativa 64

Koifman, 2002; Esteva; Hortobagyi, 2004; Fitzgibbons et al., 1999). Portanto, o RE foi

adicionado no estudo. No entanto, o RP, o c-erbB-2 e o ki-67 são anticorpos também

utilizados na rotina de patologia mamária e cuja relação com a p63 é pouco conhecida.

A proteína p53 não poderia ficar fora do estudo, pois é um membro da família p53.

Como os anticorpos com importância clínica-patológica em patologia mamária,

muitos dos anticorpos relacionados à regulação do ciclo celular apresentam interação

com pelo menos um membro da família p53. A p16, p21, ChK2 e algumas ciclinas são

proteínas-alvo do p73 (Garcia et al., 2004; Ishimoto et al., 2002; Moll; Slade, 2004).

Como a literatura é pouco informativa quanto à relação entre os carcinomas mamários e

o c-erbB-3, esta proteína foi incluída no estudo para verificar se havia alguma

correlação com os carcinomas mamários que expressam a p63 (El-Rehim et al., 2004;

Lebeau et al., 2003). O EGFR, a telomerase e a expressão da p27 estão relacionados

com pior prognóstico nos carcinomas mamários e seria importante saber sua relação

com membros da família p53 (Lebeau et al., 2003; Milde-Langosch et al., 2000;

Poremba et al., 2002). No trabalho de Lewis e colaboradores (2006), células sobre a

ação ectópica da telomerase expressaram a proteína p63.

Os três genes da família p53 atuam na regulação da apoptose (Moll; Slade,

2004). Portanto proteínas anti-apoptóticas, como a bag-1, e proteínas pró-apoptóticas,

como a bax, foram adicionadas a este estudo (Sirvent et al., 2004; Townsend et al.,

2005; Zhang et al., 2004).

Em relação às proteínas que atuam no processo de invasão e metástase,

incluímos as MMP por estas estarem expressas nas células mioepiteliais, células onde a

p63 também é expressa (Baker et al., 2002; Tang et al., 2005). Como as proteínas

EMMPRIN, PAI, TIMP1 e TIMP2 estão relacionadas à regulação das MMP também

foram adicionadas ao estudo. Os membros p73 e p53 atuam de forma inibitória no

Justificativa 65

VEGF (Moll; Slade, 2004). Portanto, como o VEGF apresenta interação com membros

da famíla p53, foi acrescentado ao estudo para varificar sua relação com carcinomas

mamários p63-positivos. A OPN, além de estar relacionada a estudos do potencial

metastático, é expressa em células da linhagem epitelial (Wang-Rodrigues et al., 2003).

Como a p63 é expressa em alguns tecidos epiteliais, a OPN foi incluída no estudo para

varificar sua relação com carcinomas mamários p63-positivos.

Entendemos que o número de variáveis do estudo é grande, por isso dividimos

em grupos com área de atuação semelhante. Com estas variáveis tentamos, pelo menos,

compreender quais as possíveis proteínas-alvo e vias metabólicas que poderiam

apresentar relação com a expressão da proteína p63 e com a progressão tumoral dos

carcinomas ductais mamários invasores p63-positivos.

Objetivos 66

4. OBJETIVOS

• Verificar a relação entre a expressão imuno-histoquímica da proteína p63 em

carcinomas mamários com fatores clínico-patológicos de importância

prognóstica;

• Verificar a relação da expressão imuno-histoquímica da proteína p63 em

carcinomas mamários com reguladores do ciclo celular, oncogenes, proteínas

relacionadas a apoptose e a angiogênese tumoral, metaloproteinases e inibidores

das metaloproteinases.

Metodologia 67

5. METODOLOGIA

5.1 Sujeito

Dos arquivos do Serviço de Patologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto (HCFMRP/USP) foram selecionados aleatoriamente laudos

anátomo-patológicos de casos de carcinoma de mama diagnosticados entre 1992 e 1995.

O critério para a inclusão destes laudos no estudo foi baseado no diagnóstico

histopatológico. Os carcinomas mamários deveriam estar laudados como carcinoma

ductal invasor sem outra especificação (“not otherwise specified – NOS”) e apresentar a

graduação histológica segundo a graduação de Nottinghan (Bloom; Richardson, 1957;

Elston; Ellis, 1991; Fitzgibbons et al., 2000).

A partir dos laudos selecionados, foram requisitados os prontuários dos

pacientes. Para inclusão dos pacientes nas pesquisas, eles tinham de preencher os

seguintes requisitos: ser do sexo feminino e apresentar biópsia de carcinoma mamário

com os critérios histológicos citados acima, sem ter sido submetido a qualquer esquema

de tratamento hormonal ou quimioterápico prévios no momento da biópsia. Foi dada

preferência às biópsias excisionais. Caso a paciente não tivesse sido submetida à

exérese da lesão, as biópsias incisionais eram inseridas no estudo se estivessem dentro

dos critérios de inclusão já estabelecidos.

Selecionados os laudos e os prontuários, segundo os critérios de inclusão, os

blocos de parafina e lâminas foram examinados. Os blocos de parafina deveriam

apresentar amostra de tecido com tamanho de pelo menos 1,0 cm no maior eixo. As

lâminas selecionadas deveriam apresentar tecido mamário com células neoplásicas

ocupando, pelo menos, 50% da amostra representada.

Metodologia 68

As informações clínicas foram coletadas dos prontuários médicos do Hospital

das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP. Os dados clínicos

considerados importantes para o prognóstico foram coletados para o estudo. Estes dados

foram: idade, “status menopausal”, presença de metástase para linfonodos e

estadiamento patológico. Quando os dados clínicos do prontuário estavam incompletos,

a paciente era excluída do estudo.

Após a exclusão de pacientes que não se enquadravam nos critérios citados

acima, as lâminas dos laudos histopatológicos inclusos no trabalho foram revisadas

pelos autores deste trabalho, confirmando o tipo e grau histológico. Para determinar

o tipo histológico foi utilizado os critérios da Organização Mundial de Saúde – OMS

(Ellis et al., 2003). O grau histológico foi determinado de acordo com a graduação

de Nottinghan (Bloom; Richardson, 1957; Elston; Ellis, 1991).

A graduação de Nottinghan baseia-se nas características arquiteturais do

tumor (formação de túbulos), do núcleo (grau nuclear) e na contagem mitótica. As

características arquiteturais são baseadas na formação de túbulos. Se a neoplasia

mostrava formação de túbulos em mais de 50% da amostra, concedeu-se 1 ponto. Se

a formação de túbulos for entre 10% a 50%, concedeu-se 2 pontos. Se as células

mostravam formação de túbulos em menos de 10% da neoplasia, concedeu-se 3

pontos. O grau nuclear foi avaliado da seguinte forma: um ponto foi concedido se os

núcleos mostravam satisfatória uniformidade no tamanho, forma e coloração. Dois

pontos, se estas variações fossem moderadas. Quando a neoplasia apresentava

marcado grau de pleomorfismo ganhava três pontos. Para determinar a contagem

mitótica, as mitoses foram contadas em dez campos de grande aumento – CGA (x

40) com um microscópio da marca Nikkon - Labophot, com diâmetro de campo de

0,44 mm e área do campo de 0,152 mm. Conferiu-se um ponto aos tumores com até

Metodologia 69

10 figuras de mitoses por dez CGA, dois pontos àqueles com 11 a 20 e três pontos

quando mais de 20 foram observadas. Os pontos da formação tubular, grau nuclear e

contagem mitótica foram somados e classificados como: de 3 a 5 pontos seria igual

ao grau I (bem diferenciado); de 6 a 7 pontos seria igual ao grau II (moderadamente

diferenciado); de 8 a 9 pontos seria igual ao grau III (pouco diferenciado) (Bloom;

Richardson, 1957; Elston; Ellis, 1991).

Realizada a revisão das lâminas, foram selecionadas 100 pacientes com carcinoma

ductal invasor sem outra especificação (“not otherwise specified – NOS”). Dentre

estes, 32 eram carcinoma ductal invasor de grau I (bem diferenciado), 39 carcinoma

ductal invasor de grau II (moderadamente diferenciado) e 29 carcinoma ductal invasor

de grau III (pouco diferenciado).

5.2 Imuno-histoquímica

A partir dos blocos de parafina, representativos de cada lesão, foram feitos

cortes histológicos de 3 µm (micrótomo Spencer, modelo 820, série n° 17.797) e

colocados em lâminas de vidro. Estas ficaram expostas à temperatura ambiente por 30

minutos e foram colocadas na estufa para desparafinização, por 2 horas, à temperatura

de 70°C. Saindo da estufa, as lâminas foram desidratadas em xilol e reidratadas em

bateria de álcool de diferentes graduações. A imuno-histoquímica foi realizada

segundo o método do complexo avidina biotina-peroxidase (Novostain Super ABC

kit, Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK). Primeiramente, as lâminas foram

colocadas em solução de tampão citrato na concentração de 10mM e pH 6,0

submetidas à recuperação antigênica por quarenta minutos em panela a vapor. As

lâminas foram resfriadas até temperatura ambiente e lavadas com solução salina de

Metodologia 70

tampão-Tris. Após este processo, os cortes histológicos foram tratados com peróxido

de hidrogênio a 3% (H

) em metanol por 5 minutos para eliminar a atividade

endógena da peroxidase. O soro normal do Novostain Super ABC kit (Novocastra)

foi colocado nas lâminas por 30 minutos para bloquear as ligações não específicas. Os

anticorpos primários foram incubados durante 12 horas (“overnight”) em temperatura

ambiente. As concentrações e diluições dos anticorpos utilizados são mostrados na

tabela 2. Em seguida as lâminas foram lavadas em solução salina fosfatada e

tamponada (PBS) e o anticorpo secundário biotinilado (Novostain Super ABC kit,

Novocastra) foi adicionado, sendo incubado em temperatura ambiente por 30 minutos.

Em seguida, os cortes foram lavados duas vezes com água destilada e tratados com o

reagente do complexo avidina-biotina (Novostain Super ABC kit, Novocastra) por

trinta minutos. Seguindo-se nova lavagem com PBS, os cortes histológicos foram

incubados com diamino-benzidina (DAB) com pH 7,5 e contendo 0,036% de peróxido

de hidrogênio, por 5 minutos. O DAB é aplicado para se obter a visualização do

cromógeno, que indica a positividade da imunomarcação nos cortes histológicos. A

hematoxilina de Mayer foi aplicada como contra-corante. Após a reação, as lâminas

foram cobertas por lamínula, com auxílio de Permount (Fischer

Metodologia 71

Tabela 2. Concentrações, clones, diluições e fabricantes dos anticorpos utilizados.

Anticorpo Clone Fabricante Diluição

Bag-1 5C5 Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:50

Bax

Polyclonal

Dako, carpinteria, CA

1:100

Bcl-2

Bcl-

2/100/D5

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:50

Caspase 8 11B6

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:50

c-erbB-2 CB11

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:300

c-erbB-3 RTJ1

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:100

Checkpoint kinase 2 (Chk2) DCS 270.1

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:50

Cyclin D1 P2D11F11

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:50

Epidermal growth factor receptor (EGFR) EGFR.113

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:50

Extracellular matrix metalloproteinase inducer

(EMMPRIN)

8D6

Santa Cruz, Palo Alto, CA

1:50

Estrogen receptor (ER) 6F11

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:100

Human telomerase reverse transcriptase

(hTERT)

44F12

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:100

Ki67 MM1

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:150

Matrix metalloproteinase 1 (MMP1) 3B6

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:50

Matrix metalloproteinase 2 ( MMP2)

8B4

Santa Cruz, Palo Alto, CA

1:50

Osteopontin (OPN)

AKm2A1

Santa Cruz, Palo Alto, CA

1:100

p16 6H12

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:50

p21 4D10

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:50

p27 1B4

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:50

p53 DO-7

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:100

p63

4A4

Santa Cruz, Palo Alto, CA

1:100

Plasminogen activator inhibitor (PAI) TJA6

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:50

Progesterone receptor 1A6

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:150

Survivin FL-142

Santa Cruz, Palo Alto, CA

1:100

Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1

(TIMP1)

6F6a

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:100

Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2

(TIMP2)

3A4

Novocastra, Newcastle upon

Tyne, UK

1:100

Vascular endothelial growth factor (VEGF) A-20

Santa Cruz, Palo Alto, CA

1:200

Metodologia 72

5.3 Controles da imuno-histoquímica

As amostras utilizadas como controle das reações de imuno-histoquímica foram

selecionadas dos arquivos do serviço de patologia cirúrgica do HCFMRP/USP. Casos

de carcinoma ductal invasivo sabidamente positivo para c-erbB-2, ciclina D1, RE, p16,

p21, p53, PAI, RP e VEGF foram usados como controle positivo para estes anticorpos.

Pele normal foi usada como controle para p63 e EGFR. Tonsilas foram usadas como

controle positivo para bag-1, bax, bcl-2, Ki67 e h-TERT. Amostras de tecido normal de

rim, de intestino grosso e de osso foram usadas como controle positivo para Chk2,

TIMP1 e OPN, respectivamente. Amostras de testículo normal foram usadas como

controle positivo de Caspase 8 e survivin. Amostras de adenocarcinoma colônico foram

usadas como controle positivo para EMMPRIM, MMP1, MMP2 e TIMP2. Como

controles negativos, foram utilizadas as lâminas dos casos de carcinoma mamário

selecionados, sem o anticorpo primário.

5.4 Interpretação das reações de imuno-histoquímica

A interpretação das reações de imuno-histoquímica foi feita através de análise

semiquantitativa e visual por dois observadores. Foi utilizado microscópico de luz

convencional (microscópio da marca Nikkon - Labophot, com diâmetro de campo de

0,44 mm e área do campo de 0,152 mm). No aumento de 100x foi selecionada a área de

maior expressão dos anticorpos no espécime e, com aumento final de 400x, foram

contados as células positivas para a reação de imuno-histoquímica. Para a interpretação

imuno-histoquímica dos anticorpos descritos na tabela 3 foi considerado um valor de

corte representado em porcentagem de células neoplásicas positivas. Os valores de corte

Metodologia 73

de vários anticorpos, como o RE, RP e p53, são padronizados na literatura e na rotina de

patologia mamária (Fitzgibbons et al., 2000; Lebeau et al., 2003). Já outros anticorpos

da tabela 3 não mostram padronização consensual quanto o valor de corte para sua

positividade. Para estes últimos anticorpos, utilizamos os valores de corte descritos na

literatura deste trabalho (Bodey et al., 2004; Chow et al., 2001; El-Rehim et al., 2004;

Gasparini et al., 2000; Ikeda et al., 2003; Lebeau et al., 2003; Mokbel et al., 1999;

Ribeiro-Silva et al., 2006; Shariat et al., 2007; Singh et al., Sirvent et al., 2004; 2004;

Sonh et al., 2006; Srinivasan et al., 2000; Stefanou et al., 2004; Wang-Rodriguez et al.,

2003; Zloblec et al., 2006). Citamos alguns exemplos destes anticorpos cujo valor de

corte não é padronizado. Um deles é a proteína p63. Sobre esta proteína p63, não existe

um valor de corte padronizado em relação ao número ou porcentagem de células que

precisam expressar esta proteína para o resultado da reação de imuno-histoquímica ser

considerado positivo. Nos estudos de Stefanou e colaboradores (2004) e Koker e Kleer

(2004), a reação de imuno-histoquímica a p63 apresentou positividade entre 5% a 10%

nas células epiteliais e luminais, excluindo as células mioepitelias, nas lesões benignas e

malignas da mama. Portanto, utilizou-se o valor de corte de 5% para que a expressão da

p63 fosse considerada positiva. Em várias publicações, é descrito que a presença da

telomerase está associada com aumento da proliferação celular em cânceres humanos. O

aumento da proliferação celular pode ser mensurado através da detecção imuno-

histoquímica da proteína Ki-67 (Ikeda et al., 2003; Morkbel et al., 1999). Como os

valores de corte para a telomerase (hTERT) não são padronizados, utilizamos o valor de

corte de 10%, o mesmo que foi utilizado para o ki-67. Adotamos este valor de corte

porque Mokbel e colaboradores (1999) e Lebeau e colaboradores (2004) consideram

que a expressão do ki-67 indica índice de proliferação celular aumentado quando cerca

de 10% das células são positivas. Os anticorpos caspase-8, p16, survivin apresentaram

Metodologia 74

duas possibilidades de interpretação quanto à positividade da reação imuno-

histoquímica. Foi considerado resultado positivo quando se observou dupla marcação

nas células neoplásicas, isto é, no citoplasma e no núcleo simultaneamente. A outra

possibilidade era a presença de positividade apenas no citoplasma ou apenas no núcleo

(Shariat et al., 2007; Singh et al., 2004; Sonh et al., 2006). O anticorpo EGFR foi

interpretado de maneira semelhante, mas com marcação na membrana citoplasmática e

no citoplasma (Bodey et al., 2004; Chow et al., 2001; El-Rehim et al., 2004; Gasparini

et al., 2000; Ikeda et al., 2003; Lebeau et al., 2003; Mokbel et al., 1999; Ribeiro-Silva et

al., 2006; Shariat et al., 2007; Singh et al., Sirvent et al., 2004; 2004; Sonh et al., 2006;

Srinivasan et al., 2000; Stefanou et al., 2004; Wang-Rodriguez et al., 2003; Zloblec et

al., 2006).

A interpretação da intensidade das reações de imuno-histoquímica é subjetiva,

portanto padronizamos os anticorpos da tabela 3 da seguinte forma: quando a

intensidade da reação se apresentava muito fraca e focal, não atingindo o percentual de

células positivas para o valor de corte do anticorpo (tabela 3), o resultado para a

expressão do anticorpo era considerado negativo. Quando a intensidade do anticorpo era

fraca, independente de se apresentar com distribuição focal ou difusa, se ela atingisse o

percentual de células positivas para o valor de corte dos anticorpos, a reação era

considerada positiva. Quando a intensidade era moderada ou intensa, atingindo o

percentual de células positivas para o valor de corte dos anticorpos, a reação também

era considerada positiva.

Metodologia 75

Tabela 3. Interpretação da positividade dos anticorpos utilizados no estudo.

Anticorpo Marcação celular Padrão de imunomarcação das células neoplásicas

p63 nuclear Pelo menos 5% das células neoplásicas

Bag-1 citoplasmática Pelo menos 10% das células neoplásicas

Bax citoplasmática Pelo menos 10% das células neoplásicas

Bcl-2 citoplasmática Pelo menos 10% das células neoplásicas

Caspase 8 Citoplasmática e/ou nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas

c-erbB-3 citoplasmática Pelo menos 5% das células neoplásicas

ChK2 nuclear Pelo menos 60% das células neoplásicas

Ciclina D1 nuclear Qualquer marcação nas células neoplásicas

independente da porcentagem

EGFR Membrana e/ou citoplasma Pelo menos 5% das células neoplásicas

Osteopontina citoplasmática Pelo menos 50% das células neoplásicas

p16 Citoplasmática e/ou nuclear Pelo menos 5% das células neoplásicas

p21 nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas

p53 nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas

RE nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas

RP nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas

Telomerase nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas

Survivin Citoplasmática e/ou nuclear Pelo menos 10% das células neoplásicas

VEGF citoplasmática Pelo menos 1% das células neoplásicas

Os critérios aplicados para a interpretação imuno-histoquímica da proteína c-

erbB-2 foram baseados no método de escores do HercepTest®. A positividade ou a

negatividade das reações foi evidenciada pela presença ou não de coloração marrom

escura com padrão de membrana citoplasmática, delineando toda a circunferência dos

limites celulares (Barrett et al., 2007; Jacobs et al., 1999; Sales et al., 2004). Os critérios

para a interpretação imuno-histoquímica da c-erbB-2 estão descrito na tabela 4.

Metodologia 76

Tabela 4. Padrão de imunomarcação e escores utilizados para a avaliação de expressão

da proteína c-erbB-2.

Escore Expressão da proteína Padrão de imunomarcação das células neoplásicas

0 Negativa Marcação ausente ou presente em menos de 10% das

células neoplásicas

1+ Negativa Marcação de membrana fraca e parcial em mais de 10%

das células

2+ Positiva

Marcação completa da membrana, fraca ou moderada em

mais de 10% das células

3+ Positiva

Marcação completa e forte da membrana em mais de 10%

das células

Anteriormente, o uso do Ki-67 era restrito aos tecidos frescos, pois o epítope não

resistia à fixação histológica de rotina em formaldeído. O clone utilizado no estudo foi o

MM1, um anticorpo anti-Ki-67 que pode ser empregado em tecidos fixados em

formalina e parafinizados. Para a análise da expressão da proteína Ki-67 foi usado um

método semiquantitativo e visual, utilizando-se um índice de positividade (IP). Foram

consideradas positivas as células cujos núcleos exibiram coloração acastanhada,

independente da intensidade da coloração. No microscópio de luz convencional, em

aumento de 100x foi selecionada a área de maior expressão do Ki-67 no espécime e,

com aumento final de 400x, foram contados os núcleos positivos e negativos. O IP foi

então calculado através da relação do número de células Ki-67 positivas por 1000

células contadas em cada caso estudado, e os valores foram expressos em porcentagem,

segundo a fórmula: IP (%) = número de células imunopositivas/número total de células

contadas (1000) x 100 (adaptado de Spyratos et al., 2002). Segundo Spyratos e

colaboradores (2002) não existe um consenso em relação ao valor de corte para a

interpretação imuno-histoquímica do ki-67, como existe para o c-erbB-2 ou para os

receptores hormonais. No estudo destes autores, foram utilizados seis valores de corte

Metodologia 77

diferentes (≤ 10; 11-20; 21-30; 31-40; 41-50; ≥ 50), expressos em porcentagem, que

foram relacionados com variáveis clínicas. A depender da variável clínica utilizada, os

valores de corte mudavam (Spyratos et al., 2002). Outros trabalhos consideram que a

expressão do ki-67 indica índice de proliferação celular aumentado quando cerca de

10% das células são positivas (Mokbel et al., 1999; Lebeau et al., 2004). Para a

interpretação imuno-histoquímica do ki-67 neste trabalho, foi feita uma adaptação dos

valores de corte utilizados por Spyratos e colaboradores (2002), dos utilizados por

Mokbel e colaboradores (1999) e dos utilizados por Lebeau e colaboradores (2004). No

lugar de seis valores de corte, utilizamos apenas três, como descrito na tabela 5. Outros

estudos, como o de Lyzogubov e colaboradores (2005), também utilizam três valores de

corte para o ki-67, porém com valores diferentes dos utilizados neste trabalho.

Tabela 5. Interpretação imuno-histoquímica do ki-67.

Porcentagem de células positivas para o ki-67

Índice de positividade

<10%

baixo

10-50% intermediário

>50%

alto

Para avaliação do número de células p27 positivas, foram contadas 1.000 células

em diferentes áreas selecionadas de acordo com a maior positividade. Este índice foi

definido como a porcentagem de células tumorais com imunomarcação nuclear positiva

por 1.000 células tumorais contadas (número de células tumorais positivas / 1.000

células tumorais). A quantificação foi feita em microscópio de luz convencional, em

aumento de 100x foi selecionada a área de maior expressão do p27 no espécime e, com

aumento final de 400x, foram contados os núcleos positivos e negativos. Cada célula

Metodologia 78

corada foi considerada positiva quando havia qualquer imunomarcação nuclear

independente da intensidade (Lima et al., 2000).

Os marcadores EMMPRIN, MMP1, MMP2, PAI, TIMP1 e TIMP2 foram

interpretados segundo sistema de graduação proposto na literatura. No microscópio de

luz convencional, em aumento de 100x foi selecionada a área de maior expressão dos

anticorpos da tabela 6 no espécime e, com aumento final de 400x. Foram consideradas

positivas as células cujo citoplasma exibia coloração acastanhada, independente da

intensidade da coloração (Baker et al, 2002; Noel et al., 2006; Tang et al., 2005; Würtz

el al., 2005). Este sistema está descrito na tabela 6.

Tabela 6. Padrão de imunomarcação e escores utilizados para a avaliação de expressão

de EMMPRIN, MMP1, MMP2, PAI, TIMP1 e TIMP2.

Expressão da proteína Padrão de imunomarcação das células neoplásicas

Negativa Marcação ausente nas células neoplásicas

Positiva Menos que 20% de células neoplásicas com marcação

citoplasmática.

Positiva

20% a 50% de células neoplásicas com marcação

citoplasmática

Positiva

Mais de 50% de células neoplásicas com marcação

citoplasmática

Metodologia 79

Figura 1. Marcação nuclear imuno-histoquímica da proteína p63. Os núcleos das

células com a coloração marrom mostram a marcação positiva da reação imuno-

histoquímica para a proteína p63 nas células neoplásicas do carcinoma ductal invasor

grau II, segundo a graduação de Nottinghan .400x

Figura 2. Exemplo de marcação nuclear. Os núcleos das células com a coloração

marrom mostram a marcação positiva da reação imuno-histoquímica para o receptor de

estrógeno em pelo menos 10% das células neoplásicas do carcinoma ductal invasor grau

II segundo a graduação de Nottinghan. 400x

Metodologia 80

Figura 3. Exemplo de marcação citoplasmática. O citoplasma das células com a

coloração marrom mostram a marcação positiva da reação imuno-histoquímica para a

proteína Bcl-2 em pelo menos 10% das células neoplásicas do carcinoma ductal invasor

grau II segundo a graduação de Nottinghan. 400x

Figura 4. Exemplo de marcação de membrana. A membrana das células neoplásicas

com a coloração marrom mostram marcação positiva, completa e forte da membrana em

mais de 10% das células da reação imuno-histoquímica para a proteína c-erbB-2 em

carcinoma ductal invasor grau III segundo a graduação de Nottinghan. 400x

Metodologia 81

5.5 Análise estatística

Os resultados foram submetidos à análise estatística utilizando o software Graph

Pad Prism v.4 (San Diego, CA). Para verificar a associação entre o p63 e as outras

variáveis, foi utilizado o teste exato de Fisher para dois grupos. Na presença de três ou

mais grupos o teste χ2 foi utilizado. As análises estatísticas foram consideradas

significantes para p<0.05 (α=5%).

Resultados 82

6. RESULTADOS

A tabela 7 mostra os resultados referentes aos fatores clínico-patológicos bem

estabelecidos, como idade, período menopausal, tamanho tumoral, graduação de

Nottinghan, condição dos linfonodos axilares, estadiamento tumoral, o estudo imuno-

histoquímico dos receptores de estrógeno e progesterona, da proteína c-erbB-2, da

proteína p53 e do índice de proliferação celular (ki-67). A média de idade das mulheres

(n=100) neste estudo foi de 54,2 anos (25 a 85 anos). Em relação ao status menopausal,

34 pacientes estavam no período de pré-menopausa, 64 estavam na menopausa e 2

pacientes eram histerectomizadas. O tamanho médio dos tumores era de 4,1cm no maior

eixo (0,5 cm a 14 cm). Dezenove mulheres apresentavam tumores que mediam menos

que 2 cm no maior eixo, enquanto 81 mulheres tinham tumores que mediam mais que 2

cm.

Em relação aos linfonodos axilares, 29 mulheres apresentaram linfonodos

negativos e 71 mulheres, linfonodos positivos. Os resultados do estadiamento tumoral e

da classificação histológica segundo a graduação de Nottinghan estão descritos na

tabela 7. O estudo imuno-histoquímico evidenciou positividade nas células neoplásicas

para receptores de estrógeno em 52 carcinomas, para receptor de progesterona em 46

carcinomas e para p53 em 35 carcinomas. A graduação da reação imuno-histoquímica

para c-erbB-2 e Ki-67 nos carcinomas mamários está descrita na tabela 4 e na tabela 5,

respectivamente.

Resultados 83

Tabela 7. Estudo imuno-histoquímico dos fatores clínico-patológicos e prognósticos

utilizados na rotina de patologia mamária.

Fatores clínico-patológicos e prognósticos resultado

Idade (anos)

<30

30-50

50 -70

>70

Status menopausal

Pré-menopausa

Menopausa

Histerectomizadas

Tamanho tumoral (cm)

< 2cm

> 2cm

Graduacão de

Nottinghan

III

Estado dos linfonodos axilares

Linfonodos negativos

1-3 linfonodos positivos

> 3 linfonodos positivos

Estadiamento tumoral

III

Receptores de estrógeno

Negativo

Positivo

Receptores de progesterona

Negativo

Positivo

p53

Negativo

Positivo

c-erbB-2

Ki-67

<10%

10-50%

>50%

Total

100

Resultados 84

A proteína p63 foi positiva em 16 dos 100 carcinomas mamários deste estudo.

No tecido mamário adjacente à neoplasia, a p63 marcou o núcleo das células

mioepiteliais das glândulas mamárias normais. A tabela 8 relaciona a p63 com os

fatores prognósticos. A proteína p63 apresentou relação com o tamanho tumoral (p=

0,0368), com a graduação a graduação de Nottinghan (p= 0,0002) e com o estadiamento

tumoral (p= 0,0003). Não houve relação da p63 com a idade, status menopausal e o

estado dos linfonodos axilares.

Resultados 85

Tabela 8. Relação da expressão da proteína p63 nos carcinoma ductais invasores com

fatores clínico-patológicos.

Fatores clínico-patológicos

P63- P63+ Valor de p

Idade (anos)

<30

30-50

50 -70

>70

0,7723

Status menopausal

Pré-menopausa

Menopausa

Histerectomizadas

0,7817

Tamanho tumoral (cm)

< 2cm

> 2cm

0,0368

Graduação tumoral (Bloom & Richardson)

III

0,0002

Estado dos linfonodos axilares

Linfonodos negativos

1-3 linfonodos positivos

> 3 linfonodos positivos

0,1709

Estadiamento tumoral

III

0,0003

Receptores de estrógeno

Negativo

Positivo

0,0279

Receptores de progesterona

Negativo

Positivo

0,0053

p53

Negativo

Positivo

0,1631

c-erbB-2

0,6269

Ki-67

<10%

10-50%

>50%

0,0002

Total

84 16

Resultados 86

O número de carcinomas ductais invasores positivos para as proteínas

reguladoras do ciclo celular está descrito na tabela 9. Na tabela 10 pode–se verificar que

apenas a telomerase mostrou relação com a proteína p63 (p= 0,0060). A positividade

para a proteína p27 e sua relação com a proteína p63 está descrita na tabela 10.

Tabela 9. Positividade da reação de imuno-histoquímica para as proteínas que atuam

como reguladores do ciclo celular nos carcinomas ductais invasores.

Proteínas que atuam como

reguladores do ciclo celular

Número de carcinomas ductais invasores

positivos para o anticorpo em estudo (N=100)

c-erbB-3

ChK2

ciclina D1

EGFR

p16

p21

telomerase

Resultados 87

Tabela 10. Relação entre a expressão de fatores reguladores do ciclo celular e a

expressão da proteína p63 nos carcinoma ductais invasores.

Reguladores do ciclo celular

P63- P63+ Valor de p

c-erbB-3

Negativo

Positivo

0,2664

ChK2

Negativo

Positivo

0,3494

Ciclina D1

Negativo

Positivo

1,0000

EGFR

Negativo

Positivo

0,3776

p16

Negativo

Positivo

0,1682

p21

Negativo

Positivo

0,7559

p27

0-25%

26-50%

51-75%

76-100%

0,2277

Telomerase

Negativo

Positivo

0,0060

Total

84 16

O número de carcinomas ductais invasores positivos para as proteínas

relacionadas à apoptose no estudo imuno-histoquímico está demonstrado na tabela 11.

Não houve relação entre a expressão das proteínas reguladores da apoptose e a

expressão da p63 (tabela 12).

Resultados 88

Tabela 11. Positividade da reação de imuno-histoquímica para as proteínas que atuam

como reguladores da apoptose nos carcinomas ductais invasores.

Proteínas que atuam como

reguladores da apoptose

Número de carcinomas ductais invasores positivos

para o anticorpo em estudo (N=100)

Bag-1

Bax

Bcl-2

Caspase 8

Survivin

Tabela 12. Relação entre a expressão imuno-histoquímica de fatores reguladores da

apoptose e a expressão da proteína p63 nos carcinoma ductais invasores.

Reguladores da apoptose

P63- P63+ Valor de p

Bag-1

Negativo

Positivo

0,906

Bax

Negativo

Positivo

0,2038

Bcl-2

Negativo

Positivo

0,4136

Caspase 8

Negativo

Positivo

0,7890

Survivin

Negativo

Positivo

0,2229

Total

84 16 -

O número de carcinomas ductais invasores positivos para as proteínas

relacionadas ao processo de invasão e metástase no estudo imuno-histoquímico está

demonstrado na tabela 13. O VEGF apresentou positividade em 54 dos carcinomas

mamários. O VEGF e a TIMP1 apresentaram relação com a expressão da proteína p63.

A relação entre a p63, o VEGF e as outras proteínas envolvidas no processo de invasão

e metástase está demonstrada na tabela 14.

Resultados 89

Tabela 13. Positividade da reação de imuno-histoquímica para as proteínas que atuam

no processo de invasão e metástase nos carcinomas ductais invasores.

Proteínas que atuam no processo

de invasão e metástase

Número de carcinomas ductais invasores

positivos para o anticorpo em estudo (N=100)

EMMPRIN

MMP1

MMP2

ONP

PAI 7

TIMP1

TIMP2

VEGF

Resultados 90

Tabela 14. Relação da proteína p63 com o VEGF e com outras proteínas envolvidas no

processo de invasão e metástase nos carcinomas ductais invasores.

Proteínas relacionadas ao processo metastático P63- P63+ Valor de p

EMMPRIN

<20%

20–50%

>50%

MMP1

<20%

20–50%

>50%

0,6691

MMP2

<20%

20–50%

>50%

0,4713

Osteopontina

Negativo

Positivo

0,1635

PAI

<20%

20–50%

>50%

0,6644

TIMP1

<20%

20–50%

>50%

0,0173

TIMP2

<20%

20–50%

>50%

0,6772

VEGF

Negativo

Positivo

0,0006

Total

84 16

Discussão 91

7. DISCUSSÃO

Os dados disponíveis até o momento sugerem que, apesar de possuírem

características estruturais similares, os membros da família p53 compartilham menos

funções entre si do que seria esperado. O p53 possui como principal função responder

às agressões ao DNA. O p73 participa da diferenciação de tecidos do sistema nervoso e

da resposta ao dano do DNA, por mecanismo paralelo e independente ao do p53. O p63

parece ser essencial ao desenvolvimento e diferenciação de determinados tecidos

epiteliais (Moll; Slade, 2004; Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003).

Vários relatos na literatura sugerem que o p63 possa de alguma forma, estar

realcionado à carcinogênese. O p63 está localizado no cromossomo 3q27-29 (Osada et

al., 1998; Yang et al., 1998). Esta região cromossômica encontra-se alterada em várias

neoplasias como carcinomas escamosos, carcinomas cervicais, carcinomas prostáticos e

neoplasias pulmonares (Hara et al., 2004; Moll; Slade, 2004; Reis-Filho et al., 2003;

Westfall; Pietenpol, 2004). Pela expressão da proteína p63 e o seu possível

envolvimento na manutenção nas células progenitoras de vários tecidos, surgiu a

hipótese de que o p63 poderia estar envolvido na manutenção de fenótipo

indiferenciado das células, tornando-as mais susceptíveis às alterações gênicas (Moll;

Slade, 2004). Como as alterações do p53 estão relacionadas à carcinogênese de vários

tumores, seria interessante verificar se o p63, como membro da família p53,

apresentaria também relação com vias ligadas à progressão tumoral. Entretanto, assim

como no p73, mutações no p63 são raras e seu papel na carcinogênese ainda necessita

ser mais bem explorado. (Moll; Slade, 2004; Ribeiro-Silva; Zucoloto, 2003).

Para tentar verificar a relação da expressão da proteína p63 com os carcinomas

ductais invasores, variáveis clínico-patológicas e prognósticas consideradas importantes

Discussão 92

em patologia mamária e possíveis proteínas-alvo, selecionamos vários anticorpos que

agem em vias metabólicas diferentes, nas quais muitos estão relacionados à

carcinogênese.

A expressão da p63 em células de carcinomas mamários correlaciona-se com

vários fatores de mau prognóstico, incluindo tamanho tumoral, estadiamento patológico,

grau histológico e negatividade para receptores de estrógeno (Ribeiro-Silva et al, 2003).

No presente trabalho, a expressão da proteína p63 correlacionou-se com algumas

variáveis relacionadas a pior prognóstico, como: tamanho tumoral, estadiamento

patológico avançado, grau histológico elevado, negatividade para receptores hormonais

(estrogênio e progesterona) e índice de proliferação celular elevado.

Dentre as 16 pacientes com carcinoma mamário p63-positivo, uma apresentava

idade menor que 30 anos, 13 tinham idade entre 30 e 70 anos e duas apresentavam idade

maior que 70 anos. A média de idade das mulheres (n=100) foi de 54,2 anos (25 a 85

anos). A idade, como fator prognóstico no momento do diagnóstico do câncer de mama,

permanece ainda controversa. Segundo estudos, pacientes pertencentes a quarta e a

quinta décadas da vida apresentam melhor prognóstico. O pior prognóstico estaria

relacionado ao grupo de mulheres jovens (idade igual ou inferior a 35 anos) e àquelas

em que o diagnóstico é estabelecido a partir dos 75 anos de idade (Abreu; Koifman,

2002). Neste trabalho, os carcinomas mamários p63-positivos não apresentaram

correlação estatística significativa com a idade.

Na tabela 7 observa-se relação da expressão da p63 com vários fatores que

predizem um comportamento tumoral mais agressivo. Dentre eles, encontra-se o

tamanho tumoral. O tamanho tumoral e o acometimento dos linfonodos axilares

constituem a base do estadiamento TNM e são importantes indicadores prognósticos

para câncer de mama (Fitzgibbons et al., 1999). Os resultados descritos na tabela 6

Discussão 93

evidenciaram que 100% dos carcinomas ductais invasores p63-positivo apresentaram

tamanho tumoral maior que 2 cm. Segundo Abreu e Koifman (2002), o tamanho

tumoral está relacionado com o desenvolvimento de metástases e recidivas tumorais

(Abreu; Koifman, 2002).

Em relação à graduação de Nottinghan, a p63 foi expressa nos carcinomas

mamários menos diferenciados, de grau II e III. Nenhum carcinoma mamário com grau

histológico I foi positivo para p63. Esses dados estão de acordo com Ribeiro-Silva e

colaboradores (2003), que verificaram resultados semelhantes. Estes autores também

relataram que carcinomas menos diferenciados apresentam mais células p63-positivas

que as neoplasias de contagem menos elevadas na graduação de Nottinghan (Ribeiro-

Silva et al., 2003). Segundo alguns autores, o grau histológico está relacionado à maior

ou menor capacidade de metastatização, sobrevida e tempo livre de doença (Abreu;

Koifman, 2002, Elston; Ellis, 2001, Fitzgibbons et al., 1999).

Das pacientes com tumores p63-positivo, 75% (12/16) e 87,5% (14/16)

apresentaram negatividade para RE e RP, respectivamente. A negatividade para o RE

está associada com baixa diferenciação tumoral, alta taxa de proliferação celular e

outras variáveis desfavoráveis ao prognóstico das pacientes com câncer de mama. Além

destes fatores de mau prognóstico, as pacientes não se beneficiam com o tratamento

hormonal adjuvante (Esteva; Hortobagyi 2004, Fitzgibbons et al., 1999).

Quanto ao índice de proliferação celular, os resultados mostraram que 50%

(8/16) dos carcinomas p63-positivos apresentaram mais de 50% de células neoplásicas

positivas para ki-67. No estudo de Esteva e Hortobagyi (2004), a positividade do ki-67

em mais de 50% das células tumorais estava relacionada ao alto risco de recorrência

tumoral. Este dado fortalece mais a hipótese de que os carcinomas p63-positivos

apresentam comportamento agressivo.

Discussão 94

A amplificação do c-erbB-2 presente nos carcinomas mamários pode ser

detectada por reação imuno-histoquímica ou por hibridização in situ por fluorescência

(FISH). Segundo estudos que comparam a amplificação do c-erbB-2 detectados pela

reação de imuno-histoquímica e a de FISH nos carcinomas mamários, constatou-se que

muitos carcinomas com escore 2+ no HercepTest® não apresentavam a amplificação do

c-erbB-2 no método de FISH. Para evitar resultados falso-negativos na expressão da

proteína c-erbB-2 para o escore 2+ no HercepTest®, a “American Society of Clinical

Oncology/College of American Pathologists” (ASCO-CAP) recomenda verificar a

presença da amplificação desta proteína pelo FISH (Barrett et al., 2007, Wolff et al.,

2007). O presente trabalho foi realizado antes de 2007, ano que a ASCO-CAP publicou

suas recomendações. Portanto este trabalho apresenta padronização diferente das

recomendações sugeridas pela ASCO-CAP em 2007. Por exemplo, o valor de corte para

o c-erbB-2 foi de 10% (Jacobs et al., 1999; Sales et al., 2004).. Em 2007, o valor de

corte recomendado pela ASCO-CAP para o c-erbB-2 é de 30%. Além disso, o trabalho

não utilizou o método de FISH para verificar a presença da amplificação do c-erbB-2

nos carcinomas ductais invasores com escore 2+ no HercepTest® (Barrett et al., 2007,

Wolff et al., 2007). Neste trabalho, porém, apesar da proteína c-erbB-2 correlacionar-se

com vários fatores de mau prognóstico, os carcinomas ductais invasores p63-positivos

não apresentaram relação com esta proteína.

Quanto à proteína p53, existem vários relatos na literatura que descrevem a

interação desta proteína com os membros da sua família (Osada et al., 1998; Trink et

al.,1998; Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004). No entanto, não foi evidenciada

a relação entre a p53 e a p63 neste trabalho. Estes dados estão de acordo com os

achados de Ribeiro-Silva e colaboradores (2003) que, em uma casuística de 10 casos de

carcinomas ductais mamários positivos para a p63, apenas um expressou a proteína p53.

Discussão 95

Os autores sugeriram que o p63 poderia exercer indiretamente função de oncogene

inibindo o p53. Esta teoria poderia explicar, pelo menos em parte, a relação da

expressão da proteína p63 com indicadores de mau prognóstico.

O comportamento tumoral e as características moleculares dos carcinomas p63-

positivos são pouco compreendidos. Além de estudar a relação da p63 com os fatores

clínico-patológicos e prognósticos discutidos, este trabalho se propôs a investigar a

interação da proteína p63 com marcadores moleculares cujos produtos participam das

etapas da transformação maligna mamária. Dentre estes fatores, estão os reguladores do

ciclo celular, os oncogenes, os genes supressores tumorais, as proteínas relacionadas

com a apoptose, a invasão tecidual, a metástase e a angiogênese.

O p63 é um gene complexo e possui isoformas com propriedades diversas. De

acordo com a literatura, as isoformas que possuem o domínio TA, como a TAp63γ,

podem induzir parada do ciclo celular e apoptose através de mecanismo envolvendo a

p53 (Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol, 2004). Já as isoformas que não possuem o

domínio TA, como a ∆Np63γ, possuem ação anti-apoptótica (Maisse et al., 2003; Yang

et al., 1998). Neste estudo usamos o clone A4 que reconhece todas as isoformas da p63.

Os genes responsáveis pela apoptose são regulados através de interações entre os

membros da família p53. No processo de apoptose, Westfall e Pietenpol (2004)

demonstraram que os mecanismos de apoptose desencadeados pelo p53 são afetados

pela perda do p63 (Westfall; Pietenpol, 2004). Por outro lado, Reis-filho e Schmitt

(2001) descrevem ratos p63

que apresentam p53 normal e possuem resposta normal ao

processo de apoptose, seja este induzido ou espontâneo. Os resultados do presente

trabalho não evidenciaram relação entre as proteínas reguladoras de apoptose e a

expressão da p63, sugerindo que a apoptose possa não ter um papel importante na

carcinogênese dos carcinomas mamários p63-positivos.

Discussão 96

Pesquisas descreveram diversas funções pertinentes ao p63, dentre elas a de

oncogene e de gene supressor tumoral. Porém o p63 é um gene com várias isoformas e

cada isoforma interage com os outros membros da família p53 de maneira diferente,

reforçando a complexidade das funções do p63 (Yang et al., 1998; Westfall; Pietenpol,

2004). No presente trabalho, não houve relação estatística da p63 com a maioria das

proteínas reguladoras do ciclo celular, principalmente as que agem como oncogenes ou

genes supressores tumorais. A expressão da p63 apresentou relação estatística apenas

com a telomerase.

No processo de transformação maligna, a telomerase tem papel fundamental na

etapa de potencial infinito de replicação. A telomerase é uma ribonucleoproteína que

reconhece os terminais dos telômeros e acrescenta repetições adicionais aos

cromossomos (Bièche et al., 2000). Esta enzima é inativa ou inibida na maioria das

células somáticas. Ela apresenta-se aumentada em 80% a 90% das neoplasias, dando

origem a um processo chamado de imortalização (Bièche et al., 2000; Ikeda et al., 2003;

Mokbel et al., 1999; Kirkpatrick et al., 2004). A atividade da enzima é conferida pela

subunidade catalítica hTERT, que pode ser detectada através de estudos imuno-

histoquímicos, do protocolo da TRAP e RT-PCR. A imuno-histoquímica é o método

utilizado de rotina na patologia cirúrgica. Os dois últimos métodos citados são

complexos, exigindo maior tempo para serem realizados, além de não estarem

associados com parâmetros morfométricos (Bièche et al., 2000; Ikeda et al., 2003;

Kirkpatrick et al., 2004; Poremba et al., 2002).

A telomerase está associada com comportamento clínico agressivo em vários

tumores humanos, incluindo o câncer de mama, onde se correlaciona com metástase

para linfonodos e recorrência tumoral (Poremba et al., 2002). A telomerase também

apresenta relação com o aumento da proliferação celular em cânceres humanos, que

Discussão 97

pode ser mensurada através da expressão do Ki-67 (Ikeda et al., 2003; Morkbel et al.,

1999). Diante desses dados, pode-se sugerir que a expressão diferencial da telomerase e

do Ki67 possa contribuir para o comportamento clínico mais agressivo dos carcinomas

mamários p63-positivos.

No processo de transformação maligna, a etapa de invasão tecidual e metástase

determinam a agressividade do comportamento tumoral. A metástase ocorre como

conseqüência de várias etapas do processo de transformação maligna e depende do

estabelecimento de uma interação entre o tumor e o organismo hospedeiro. Esta

interação envolve várias substâncias que atuam na degradação da matriz extracelular e

na angiogênese tumoral. Dentre estas substâncias, destacam-se: EMMPRIN, MMP1,

MMP2, PAI, TIMP1 e TIMP2 e VGFR (Baker et al., 2002; Noel et al., 2006; Tang et

al., 2005).

A degradação da matriz extracelular é uma etapa importante para a progressão

do processo metastático. As proteínas que degradam a matriz são enzimas denominadas

metaloproteinases de matriz extracelular (MMP). Células endoteliais, fibroblastos,

células mioepiteliais do estroma tumoral podem expressar esta proteína em diversos

tipos de câncer (Baker et al., 2002; Tang et al., 2005).

A atividade das MMP depende da regulação exercida por fatores estimuladores,

ativadores, inibidores e do equilíbrio entre estas substâncias. O principal ativador das

MMP é a plasmina, que é regulada pelos membros do sistema ativador do

plasminogênio (uPA - Ativador de plasminogênio do tipo uroquinase; tPA – ativador de

plasminogênio do tipo tecidual) e pelo inibidor da ativação do plasminogênio (PAI)

(Baker et al, 2002). As moléculas estimuladoras são conhecidas como indutoras da

metaloproteinase da matriz extracelular (EMMPRIN). A EMMPRIN estimula a

expressão das MMP nos fibroblastos, nas células endoteliais e nas células tumorais

Discussão 98

(Tange et al., 2005). Além de exercer papel proteolítico, alguns membros da família das

MMP exercem papel importante na regulação da angiogênese. Com a ação proteolítica

as MMP preparam a matriz extracelular para receber os fatores angiogênicos. Um dos

componentes da família das MMP pode promover a mobilização do VEGF de

moléculas presentes na matriz extracelular estimulando a neovascularização (Baker et

al., 2002; Tang et al., 2005). Nos resultados do nosso estudo, não verificamos relação

entre a as MMP, o EMMPRIN e o p63.

Dentre os inibidores das MMP destaca-se a família dos inibidores de

metaloproteinases tecidual (TIMP), que é composta de quatro componentes: TIMP-1,

TIMP-2, TIMP-3 e TIMP-4. Elas estão expressas no estroma peritumoral em células

como fibroblastos e células do endotélio vascular (Würtz et al., 2005). Além de inibir as

MMPs, as TIMP induzem mudança na morfologia da célula, estimulam o crescimento

de vários tipos celulares e modulam negativamente o processo de angiogênese (Baker et

al, 2002). Noel e colaboradores (2006) descreveram que as TIMP são proteínas

multifatoriais que podem estar relacionadas tanto aos fatores inibidores quanto

estimuladores da carcinogênese. Segundo estes autores, as TIMP tanto podem induzir

proliferação de alguns tipos celulares, quanto podem promover angiogênese e ação anti-

apoptótica às células tumorais (Baker et al., 2002).

A angiogênese promovida pelas TIMP está relacionada ao fato de que algumas

MMP estimulam fatores anti-angiogênicos (endostatina e angiostatina). As TIMP, sendo

inibidoras das MMP, impediriam a produção destes fatores anti-angiogênicos (Würtz et

al., 2005). Würtz e colaboradores (2005) ainda relatam relação das TIMP com a

expressão do VEGF em células de carcinomas mamários humanos (Würtz et al., 2005).

No presente trabalho, a p63 correlacionou-se com a expressão da proteína

TIMP-1. Este dado parece ser um aparente paradoxo, pois os carcinomas p63 positivos

Discussão 99

são reconhecidos pela sua agressividade e as TIMP são inibidores das MMP, proteínas

que favorecem a progressão do processo metastático. Na literatura, porém, está descrito

que as TIMP são proteínas multifatoriais e que podem estar relacionadas tanto aos

fatores inibidores ou estimuladores da carcinogênese (Baker et al., 2002; Würtz el al.,

2005).

Para complementar as etapas de crescimento, invasão e metástase tumoral, é

necessário que ocorra a angiogênese. Neste processo, as células neoplásicas liberam

moléculas sinalizadoras que ativam genes presentes nos vasos sangüíneos normais. Os

genes ativados são estimulados a produzir proteínas cuja função está relacionada ao

estímulo para a produção de tecido vascular a partir de vasos preexistentes (Hicklin;

Ellis, 2006).

A angiogênese é composta por várias etapas que são reguladas pelo equilíbrio

entre moléculas inibidoras e estimuladoras. Dentre os fatores estimuladores, detacam-se

a família do VEGF (fator de crescimento vascular endotelial) e seus receptores. No

processo de inibição da angiogênese, destacam-se as interleucinas e os inibidores

teciduais das metaloproteinases (TIMP) (Hicklin; Ellis, 2006).

O VEGF participa da angiogênese agindo sobre as células endoteliais. Ele

exerce, nas células endoteliais, aumento da permeabilidade, promove ativação, aumento

da ação mitogênica, da migração, da diferenciação, além de inibir a apoptose. O VEGF

ainda induz activação das metaloproteinases que permite a remodelação da matriz

extracelular (Hicklin; Elis, 2006).

Além dos fatores etimuladores e inibidores, a expressão do VEGF pode ser

regulada por vários fatores, como a hipóxia, as cicloxigenases, oncogenes e genes

supressores tumorais. Dentre estes, destacam-se o c-erbB-2 e o p53. É descrito que o c-

erbB-2 promove a angiogênese, estimulando a produção do VEGF. Já eventos

Discussão 100

moleculares envolvendo o p53 previne a expressão do VEGF em células do câncer de

mama (Hicklin; Elis, 2006).

Estudos relatam que em neoplasias, incluindo o carcinoma de mama, a expressão

do VEGF se correlaciona com o pior prognóstico (Linderholm et al., 2001). Em muitos

tipos de tumores o VEGF estimula o crescimento tumoral, comportamento agressivo,

recorrência e metástase tumoral, além de estar relacionado com menor sobrevida

(Ferrara, 1999). Nos resultados do presente trabalho, os carcinomas mamários p63

positivos apresentaram relação com o VEGF, fato que também pode contribuir para o

comportamento mais agressivo desses tumores.

Não houve relação estatística do p63 com a osteopontina (OPN). Níveis

aumentados desta proteína são expressos em carcinomas mamários primários e

metastáticos. A OPN tem sido considerada como marcador biológico preditor de

metástase em tumores humanos, portanto vem sendo estudada com a finalidade de

esclarecer melhor o comportamento biológico das neoplasias (Wang-Rodrigues et al.,

2003).

Conclusões 101

8. CONCLUSÕES

• O p63 foi expresso em 16% nos carcinomas mamários ductais infiltrantes e sua

expressão relacionou-se com vários fatores de mau prognóstico, incluindo

tamanho tumoral, alto grau histológico, estadiamento avançado, negatividade

para receptores hormonais e elevada expressão de Ki67.

• Entre os fatores reguladores do ciclo celular e progressão tumoral avaliados

neste estudo, a expressão do p63 relacionou-se apenas com a expressão da

telomerase e do VEGF. A expressão diferencial desses marcadores (telomerase e

VEGF) pode contribuir na fisiopatogênese e no comportamento clínico mais

agressivo dos carcinomas mamários p63-positivos.

Bibliografia 102

9. BIBLIOGRAFIA

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