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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
EDSON ARTHUR SCHERER
Estudo de neurotransmissores relacionados à depressão e psicose
em amostras de cérebro humano de pacientes submetidos à cirurgia
por epilepsia de lobo temporal
Ribeirão Preto
2008
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EDSON ARTHUR SCHERER
Estudo de neurotransmissores relacionados à depressão e psicose
em amostras de cérebro humano de pacientes submetidos à cirurgia
por epilepsia de lobo temporal
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Doutor em Ciências Médicas.
Área de Concentração: Patologia Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Jorge Eduardo Moreira.
Ribeirão Preto
2008
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FICHA CATALOGRÁFICA
Scherer, Edson Arthur
Estudo de neurotransmissores relacionados à depressão e psicose em
amostras de cérebro humano de pacientes submetidos à cirurgia por
epilepsia de lobo temporal. Ribeirão Preto, 2008.
115 p.; 30cm.
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Patologia Experimental
Orientador: Moreira, Jorge Eduardo
1. Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa. 2.
Epilepsia do lobo temporal. 3. Hipocampo. 4. Depressão. 5.
Transtornos psicóticos. 6. Receptores de neurotransmissores.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Edson Arthur Scherer
Estudo de neurotransmissores relacionados à depressão e psicose em amostras de cérebro
humano de pacientes submetidos à cirurgia por epilepsia de lobo temporal
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do
título de Doutor em Ciências Médicas.
Área de Concentração: Patologia Experimental.
Aprovado em: _______/_______/_______
Banca Examinadora
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: _________________________Assinatura: ______________________
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: _________________________Assinatura: ______________________
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: _________________________Assinatura: ______________________
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: _________________________Assinatura: ______________________
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: _________________________Assinatura: ______________________
DEDICATÓRIA
À minha querida Zeyne, companheira em
todos os momentos. Obrigado pelo olhar, atos
e cumplicidade que sempre nos uniram.
Aos nossos pequeninos, Nikolas e Raissa que
mesmo sem a compreensão exata deste estudo,
vibraram com as conclusões.
Aos meus pais, Erny e Edy pelos incentivos
nos passos iniciais de minha carreira.
É com imenso prazer que lhes dedico este
trabalho.
AGRADECIMENTOS
Esta tese é dedicada aos pacientes e seus familiares que
generosamente contribuíram com o estudo.
À Profa. Dra. Zeyne Alves Pires Scherer pelo
incentivo, apoio e presença na construção deste estudo.
Ao Prof. Dr. Jorge Eduardo Moreira, pela orientação,
paciência, disponibilidade, incentivo e contribuições ao
longo da construção desta tese.
Ao Centro de Cirurgia de Epilepsia (CIREP) do e ao
banco de amostras de tecido cerebral do HC-FMRP-
USP, coordenado pelo Prof. Dr. Carlos G. Carlotti Jr,
que proveram os dados e amostras dos pacientes.
Ao Prof. Dr. Carlos Scrideli pelas sugestões na escolha
do método de real time PCR e por disponibilizar os
equipamentos do Laboratório de Biologia Molecular do
Departamento de Pediatria da FMRP – USP.
Aos colegas pós-graduandos Daniel L. G. Gitaí e
Janaina Brusco do Departamento de Biologia Celular e
Molecular e Bioagentes Patogênicos da FMRP – USP
pelo auxílio nos procedimentos de extração do mRNA.
Aos colegas pós-graduandos Agda K. B. Lucio-
Eterovic e Vanessa S. S. Andrade do Departamento de
Pediatria da FMRP-USP pela ajuda nos procedimentos
de TacMan real time PCR.
Ao Centro de Métodos Quantitativos (CEMEQ) da
FMRP-USP pela assessoria estatística.
Aos professores da Banca Examinadora, por suas
contribuições para o aperfeiçoamento deste estudo.
A todas as pessoas que direta ou indiretamente
ajudaram para a concretização deste trabalho.
Obrigado!
“Depois disso o Todo podia ser finalmente visto, como sempre sonharam os
cientistas da mente desde Freud, como maior que a soma das partes. O
objetivo final não é usar o reducionismo apenas para separar as coisas nos
seus constituintes, mas também juntá-las de novo. Temos de ser reducionistas
e holistas ao mesmo tempo”
E. R. Kandel.
“Não é isso que importa, que eu tenha uma opinião diferente da do outro;
mas sim, que o outro venha a encontrar o certo, a partir de si próprio,
se eu contribuir um pouco para tal.”
R. Steiner.
RESUMO
SCHERER, E.A. Estudo de neurotransmissores relacionados à depressão e psicose em
amostras de cérebro humano de pacientes submetidos à cirurgia por epilepsia de lobo
temporal. 2008. 115 f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2008.
A epilepsia é um transtorno do funcionamento cerebral caracterizado por crises epilépticas
recorrentes que acomete cerca de 1 a 2% da população mundial. A epilepsia do lobo temporal
(ELT) é o subtipo mais prevalente. A refratariedade aos medicamentos é comum e cerca de 40
% destes pacientes apresentam transtornos psiquiátricos. Neste trabalho utilizamos o método
de TacMan real time PCR para quantificar o mRNA de subtipos dos receptores de
noradrenalina, dopamina, serotonina e substância P em hipocampos cirurgicamente removidos
de pacientes com ELT para conhecer o papel destes na ELT com ou sem comorbidade
psiquiátrica (depressão ou psicose). Nossa amostra foi de 48 pacientes com ELT sem
(Epilepsia - 24) ou com comorbidade psicótica (Psicose - 10) ou depressiva (Depressão - 14) e
8 Controles (necrópsias). O receptor adrenérgico-α2A (AD2A) apresentou diferença entre os
grupos (p = 0,0059) com significância para a variável Antiepiléptico (p = 0,0374) e pós-teste
significante de maior expressão do mRNA de AD2A no grupo Epilepsia comparado com
Controle e com Psicose. A ativação dos receptores α2A no hipocampo pelos antiepilépticos
pode explicar nossos achados do grupo Epilepsia comparado ao Controle, corroborando a
literatura acerca do AD2A na epilepsia e em relação aos antiepilépticos. O AD2C mostrou
diferença entre os grupos (p = 0,0016), sem significância nas variáveis de controle e
significante maior expressão do mRNA de AD2C no grupo Epilepsia comparado ao Controle
e Psicose. O AD2C é encontrado em áreas que processam informações sensoriais e controlam
atividades motoras e emocionais relacionadas, o que pode explicar nossos resultados. Parece
ser importante na patologia relacionada à ELT e merece ser estudado. A não diferença entre
Epilepsia e Depressão para AD2A e AD2C, parecem confirmar uma relação bi-direcional ou
um mecanismo patogênico comum entre epilepsia e depressão, enquanto a menor expressão
de AD2A e AD2C nos psicóticos parece indicar diferenças nos mecanismos adrenérgicos
ligados a psicose e epilepsia. D2 mostrou diferença entre os grupos (p = 0,0125) com
resultado significativo para a variável Subtipo de Diagnóstico Psiquiátrico (p = 0,0239),
provavelmente devido a cronicidade da doença e a quantidade de episódios depressivos
apresentados pelos sujeitos. Quanto maior a freqüência das crises (p = 0,0381) maior a
expressão do D2 no grupo Epilepsia e no Depressão comparados ao Controle. Estes achados
sugerem a participação deste receptor na depressão comórbida na ELT; corroboram que o
monitoramento dopaminérgico límbico pode ser útil para desenvolver novos antidepressivos e
propõem pesquisas futuras sobre D2 em epilépticos. A participação de 5-HT2A na ELT é
indicada, pois, sua maior expressão no grupo Epilepsia em relação ao Controle foi
significativa (p = 0,0273). Quanto maior a freqüência das crises epilépticas maior a expressão
do 5-HT2A (p = 0, 0433). Não encontramos resultados significativos referentes aos receptores
D4, 5-HT1A, 5-HT2C e NK1. Nossos resultados mostraram a possibilidade da aplicação do
TacMan real time PCR no estudo de receptores de neurotransmissores, sugeriu a importância
dos receptores estudados na ELT e comorbidades psiquiátricas, e que outras estruturas
límbicas, como a amígdala, sejam focos de investigação.
Palavras-chave: reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa; epilepsia do lobo
temporal; hipocampo; depressão; transtornos psicóticos; receptores de neurotransmissores.
ABSTRACT
SCHERER, E.A. Neurotransmitters related to depression and psychosis in human brain
samples of patients submitted to surgery for temporal lobe epilepsy study. 2008. 115 p.
Doctoral Thesis – University of São Paulo at Ribeirão Preto Medicine University School,
Ribeirão Preto, 2008.
Epilepsy is a mental functional disorder characterized by recurrent seizures that affect about 1
to 2% of world population. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most prevalent subtype. The
refractory to medication is common and about 40% of these patients have psychiatric
disorders. This study used the TacMan real time PCR method to quantify noradrenergic,
dopaminergic, serotoninergic and substance P receptors subtypes mRNA expression in
hippocampus surgically removed from patients with TLE to know their role in TLE with or
without psychiatric commorbity (depression or psychosis). Our sample consisted of 48 TLE
patients without (Epilepsy - 24) or with psychotic (Psychosis - 10) or depressive (Depression -
14) commorbity and 8 Controls (necropsies). The α2A adrenergic receptor (AD2A) showed
difference between groups (p = 0.0059) with significance for Antiepileptic Medication
variable (p = 0.0374) and post-hoc test significantly greater AD2A mRNA expression of
Epilepsy group compared with Control and Psychosis. The activation of hippocampus α2A
receptors by antiepileptic drugs can explain our findings of the Epilepsy group compared with
Control, corroborating the literature about the AD2A in epilepsy and for antiepileptic drugs.
The AD2C showed differences between groups (p = 0.0016) without significance in the
variables of control and significantly greater AD2C mRNA expression of the Epilepsy group
compared to Control and Psychosis. The AD2C is found in areas that process sensory
information and control motor and emotional related activities, which may explain our results.
It seems to be important in the pathology related to TLE and deserves to be studied. No
differences between Epilepsy and Depression to AD2A and AD2C seem to confirm a bi-
directional relation or a common pathogenic mechanism between epilepsy and depression,
while the lowest AD2A and AD2C expression within psychotics seem suggests differences in
adrenergic mechanisms linked to psychosis and epilepsy. D2 showed differences between
groups (p = 0.0125) with significant results for the variable Subtype of Psychiatric Diagnosis
(p = 0.0239), probably due to chronic disease and the number of depressive episodes
presented by subjects. The higher the frequency of seizures (p = 0.0381) the higher was the
D2 expression within Epilepsy group compared with Control and Depression compared to
Control. These findings suggest the involvement of this receptor in TLE commorbid
depression; corroborate that limbic dopaminergic monitoring may be useful in developing
new antidepressants and propose future research on D2 in epileptics. The participation of 5-
HT2A in TLE is indicated, therefore its significant higher expression in the Epilepsy group in
relation to Control (p = 0.0273). The higher the frequency of seizures the higher was the 5-
HT2A expression (p = 0.0433). We found no significant results for the D4, 5-HT1A, 5-HT2C
and NK1 receptors. Our results showed the possibility of TacMan real time PCR method
application in TLE neurotransmission receptors study, suggested the importance of the
studied receptors in TLE and psychiatric commorbities and that other limbic structures, as the
amygdala, should be investigation targets.
Keywords: reverse transcriptase polymerase chain reaction; epilepsy, temporal lobe;
depression; psychotic disorders; hippocampus; receptors, neurotransmitter.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Distribuição dos sujeitos por grupos......................................................
55
Tabela 2 – Perfil social dos sujeitos estudados por grupo.......................................
56
Tabela 3 – Valores do slope e do intercept dos primers..........................................
61
Tabela 4 – Dados diagnósticos por grupo................................................................
67
Tabela 5 – Diagnóstico Patológico em relação ao de epilepsia e aos de subtipo
psiquiátrico...............................................................................................................
68
Tabela 6 – Classe de medicamento em uso, até o dia anterior a cirurgia, por
diagnóstico de epilepsia e por subtipo de diagnóstico psiquiátrico.........................
68
Tabela 7 – Distribuição das diferentes substâncias antiepilépticas em uso pelos
sujeitos.....................................................................................................................
69
Tabela 8 - Descrição das variáveis de interesse.......................................................
70
Tabela 9 - Resultados do modelo de ANOVA – AD2A..........................................
75
Tabela 10 - Comparações entre os grupos pelo pós-teste de Tukey – AD2A.........
76
Tabela 11 - Resultados do modelo de ANOVA – AD2C........................................
76
Tabela 12 - Comparações entre os grupos pelo pós-teste de Tukey – AD2C......... 77
Tabela 13 - Resultados do modelo de ANOVA – D2..............................................
77
Tabela 14 - Comparações entre os grupos pelo pós-teste de Tukey – D2...............
78
Tabela 15 - Resultados do modelo de ANOVA – D4..............................................
78
Tabela 16 - Resultados do modelo de ANOVA – 5-HT2A.....................................
79
Tabela 17 - Comparações entre os grupos pelo pós-teste de Tukey – 5-HT2A...... 79
Tabela 18 - Resultados do modelo de ANOVA – 5-HT1A.....................................
80
Tabela 19 - Resultados do modelo de ANOVA – 5-HT2C.....................................
80
Tabela 20 - Resultados do modelo de ANOVA – NK1...........................................
80
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Figura 1 - Esquema do método TaqMan real time RT-PCR...................................
59
Figura 2 – A: Curva-padrão para o gene 5-HT1A. B: Reta obtida pela curva-
padrão para o gene 5-HT1A.....................................................................................
62
Figura 3 - Gráfico de dispersão da variável AD2A.................................................
71
Figura 4 - Gráfico de dispersão da variável AD2C................................................. 71
Figura 5 - Gráfico de dispersão da variável D2.......................................................
72
Figura 6 - Gráfico de dispersão da variável D4.......................................................
72
Figura 7 - Gráfico de dispersão da variável 5-HT1A..............................................
73
Figura 8 - Gráfico de dispersão da variável 5-HT2A..............................................
73
Figura 9 - Gráfico de dispersão da variável 5-HT2C.............................................. 74
Figura 10 - Gráfico de dispersão da variável NK1..................................................
74
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................
11
1.1. Epilepsia............................................................................................ 13
1.2. Epilepsia e comorbidade psiquiátrica................................................
15
1.3. Anormalidades no hipocampo...........................................................
24
1.4. Receptores adrenérgicos....................................................................
26
1.5. Receptores dopaminérgicos...............................................................
30
1.6. Receptores serotoninérgicos..............................................................
37
1.7. Receptores de substância P...............................................................
45
2. HIPÓTESE...........................................................................................................
50
3. OBJETIVOS........................................................................................................
51
4. MATERIAL e MÉTODO....................................................................................
52
4.1. Sujeitos...............................................................................................
52
4.2. Local.................................................................................................. 57
4.3. Procedimentos....................................................................................
57
4.3.1. Extração do RNA...................................................................
57
4.3.2. Obtenção de cDNA................................................................
58
4.3.3. Oligonucleotídeos..................................................................
58
4.3.4. Quantificação da expressão gênica........................................
63
4.4. Análise estatística.............................................................................. 64
4.5. Aspectos éticos.................................................................................. 66
4.6. Recursos Financeiros.........................................................................
66
5. RESULTADOS................................................................................................... 67
5.1. Análise Estatística..............................................................................
70
6. DISCUSSÃO.......................................................................................................
81
6.1. Receptores adrenérgicos....................................................................
82
6.2. Receptores dopaminérgicos...............................................................
85
6.3. Receptores serotoninérgicos..............................................................
88
6.4. Receptores de substância P................................................................
89
6.5. Limites do estudo...............................................................................
91
7. CONCLUSÕES...................................................................................................
94
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 96
9. APÊNDICES....................................................................................................... 113
11
1. INTRODUÇÃO
Apesar das grandes descobertas desde que os neurônios eram considerados “condutos
do fluxo do espírito”, como descrito em 1664 por Croone (CROONE, 1966), as células
nervosas individuais foram descritas somente em 1837 por Purkinje (1837), particularmente
porque ele observou um tipo de neurônio encontrado no cerebelo dos mamíferos (“célula de
Purkinje”) que é tão grande que pode ser dissecado a mão sob uma simples lupa.
Em 1888 Ramón y Cajal (RAMÓN Y CAJAL, 1995) propôs, pela primeira vez, a
teoria neuronal que até agora forma o centro da neurociência. A hipótese da transmissão
sináptica como transmissão química foi proposta 50 anos atrás (BROCK et al., 1952) e dos
neurotransmissores há pouco mais de 40 anos por Julius Axelrod
1
(HERTTING; AXELROD,
1961). O descobrimento dos neurotransmissores foi um evento fundamental para o
desenvolvimento da neurociência.
Na década de 70, entrevistado sobre a importância das suas descobertas, o Dr. Axelrod disse:
“... teremos novas drogas para recuperar doenças mentais... fármacos para eliminar
preconceitos, para suprimir a memória, para armazenar memória, para aumentar a inteligência
e todas as viagens psicodélicas (desde que possamos controlá-las) serão boas viagens”
(AXELROD, 1971). Embora estas predições parecessem desafiantes e até mesmo algo
sarcásticas, o Dr. Axelrod teve a felicidade de ser testemunha do quanto o seu trabalho sobre
o metabolismo e função dos neurotransmissores originaram a chamada “revolução silenciosa”
na psiquiatria de anos recentes.
A descoberta da recaptação pelo terminal pré-sináptico produziu um novo modelo para
a compreensão do metabolismo dos neurotransmissores. Os resultados de Axelrod
1
O Dr. Axelrod foi premiado com o Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1970, juntamente com o sueco Ulf
Svante von Euler e o britânico Sir Bernard Katz, pelas pesquisas nos mecanismos que regulam a formação do
hormônio noradrenalina como um importante transmissor de impulsos nervosos.
12
(HERTTING; AXELROD, 1961) sugeriam que os estados mentais eram o fruto de uma
complicada combinação de mecanismos fisiológicos e bioquímicos do cérebro, mais do que o
resultado de fatores psicológicos ou ambientais. Estes descobrimentos conduziram à era dos
fármacos desenhados para inibir ou estimular determinados neurotransmissores no Sistema
Nervoso Central (SNC).
Os aspectos mais provocantes da pesquisa em neurociência apontam, no entanto, a
compreensão das mais altas funções cognitivas. Entender a conexão entre células nervosas
(sinapses), que tornam possíveis pensamentos e emoções é como começar a entender as bases
físicas da consciência, dos processos mentais pelos quais percebemos, atuamos, aprendemos e
lembramos.
Quando se consideram os logros intelectuais da humanidade nos últimos 3000 anos, é
surpreendente que a neurociência, que representa o nosso maior legado como Homo sapiens,
está entre as mais recentes das chamadas “hard sciences” (LLINÁS, 1999).
Ao olhar retrospectivamente para os avanços tecnológicos desde o começo do século
XIX, parece que nossa compreensão atual do sistema nervoso foi alcançada em duas grandes
etapas. A primeira derivada da aplicação dos conhecimentos da física, em particular os
trabalhos sobre eletricidade que serviram de base para a descrição eletrofisiológica dos
neurônios (estudos da condução nervosa). A segunda etapa do conhecimento começou com a
fusão da eletrofisiologia com o novo campo da biologia molecular (KANDEL; SCHWARTZ;
JESSEL, 2000; YUDOFSKY; HALES, 2006).
O desafio agora é o de usar o conhecimento disponível nestas duas disciplinas na
procura do intrincado processo da comunicação química transcelular. Frente a milhares de
publicações com a sinapse como tema maior, o foco destas pesquisas está sendo colocado em
regiões particulares da sinapse, localizáveis ultraestruturalmente e bioquímica e
fisiologicamente mensuráveis.
13
A função cerebral depende do controle dos níveis ou da resultante interação dos
receptores dos mais diversos neurotransmissores reconhecidos e que participam da regulação
do processo de transmissão (comunicação) sináptica. Estes receptores têm sido investigados
por seu potencial papel relacionado ao controle do desenvolvimento de plasticidade neuronal,
ao estado de despertar, ao ciclo sono-vigília e nas mais variadas manifestações de distúrbios
neuropsiquiátricos, como comportamentos de “procura de novidades”, transtorno do déficit de
atenção e hiperatividade, ansiedade, depressão, distúrbio afetivo, esquizofrenia, distúrbio
obsessivo compulsivo, dependência alcoólica, anorexia nervosa e recuperação após lesão
cerebral traumática, doença de Parkinson, isquemia e epilepsia (TAKEDA et al., 1991;
MIGUEL; RAUCH; LECKMAN, 1998; ALBERTS et al., 1999; DE LA GARZA; MADRAS,
2000; KANDEL; SCHWARTZ; JESSEL, 2000; LÓPEZ-FIGUEROA et al., 2004;
TIMMONS et al., 2004; BOZZI; BORRELLI, 2006; HALES; YUDOFSKY, 2006;
YUDOFSKY; HALES, 2006).
1.1. Epilepsia
A epilepsia, dentre os distúrbios neurológicos, é um transtorno do funcionamento
cerebral caracterizado por crises epilépticas recorrentes, na ausência de condições tóxico-
metabólicas ou febris (ENGEL; PEDLEY, 1998; MCNAMARA, 1999; BROMFIELD;
CAVAZOS; SIRVEN, 2006). É um distúrbio que acomete cerca de 1 a 2% da população
mundial (ENGEL; PEDLEY, 1998; MCNAMARA, 1999; BROMFIELD; CAVAZOS;
SIRVEN, 2006; YUDOFSKY; HALES, 2006). Quando a pessoa acometida mostra
refratariedade aos tratamentos medicamentosos, ou seja, não responde favoravelmente a estes
(não obtém controle das crises), esta passa a vivenciar dificuldades no convívio e inserção
social, apresentando desde restrições em suas atividades de trabalho (por exemplo, operar
14
máquinas), lazer, estudo, além de problemas nos relacionamentos com família, amigos e
sociedade. Ainda é uma doença estigmatizada. Há uma compreensão mística das crises
epilépticas e indivíduos que acreditam ser doença contagiosa (ENGEL; PEDLEY, 1998;
MCNAMARA, 1999; KANDEL; SCHWARTZ; JESSEL, 2000; CARLOTTI, 2003;
MARCHETTI; CREMONESE; CASTRO, 2004; BROMFIELD; CAVAZOS; SIRVEN,
2006; YUDOFSKY; HALES, 2006).
A despeito dos avanços científicos das últimas décadas pouco se sabe acerca dos mecanismos
envolvidos na epilepsia (ENGEL; PEDLEY 1998; MCNAMARA, 1999; BROMFIELD;
CAVAZOS; SIRVEN, 2006). Achados de estudos recentes têm apontado para alterações da
função sináptica e propriedades intrínsecas dos neurônios como mecanismos subjacentes a
hiperexcitabilidade nas diversas formas da epilepsia (ENGEL; PEDLEY 1998;
MCNAMARA, 1999; BROMFIELD; CAVAZOS; SIRVEN, 2006). A epilepsia do lobo
temporal (ELT) aparece como a com maior prevalência dentre os subtipos de epilepsias
descritos (ENGEL, 2001; CARLOTTI, 2003).
Apesar da otimização cuidadosa do tratamento com medicamentos antiepilépticos,
uma proporção considerável dos pacientes com epilepsia (cerca de 30%) continuam a sofrer
crises epilépticas (SCHAUB; UEBACHS; BECK, 2007). Nestes casos é, muitas vezes,
indicado o tratamento com o procedimento cirúrgico de lobectomia (CARLOTTI, 2003). Uma
das explicações para o desenvolvimento desta farmacoresistência é a de que mudanças
relacionadas à epilepsia nas propriedades dos alvos das drogas no sistema nervoso central
resultam em insensibilidade destes alvos a tais medicamentos. Os resultados de Schaub,
Uebachs e Beck (2007) em experimento com ratos mostrou que a sensibilidade a corrente de
sódio dos antiepilépticos está reduzida na epilepsia crônica. A redução nesta sensibilidade é
devida a diferentes mecanismos biofísicos para a carbamazepina e a difenilhidantoína
(medicamentos antiepilépticos testados por estes autores). Estes pesquisadores sugeriram,
15
também, que a perda da sensibilidade destas drogas é menor nos neurônios de CA1 do que
nos neurônios da camada granulosa do giro dentado da formação hipocampal. Portanto, de
acordo com Schaub, Uebachs e Beck (2007), o mecanismo alvo para a resistência
farmacológica na epilepsia seria o tipo celular e o medicamento antiepiléptico específico.
1.2. Epilepsia e comorbidade psiquiátrica
Desde a Antigüidade, a associação entre epilepsia e sintomas psiquiátricos vem sendo
descrita. Até o desenvolvimento do eletroencefalograma (EEG), as crises epilépticas eram
classificadas como transtornos mentais (YUDOFSKY; HALES, 2006). Chegou-se a acreditar
que uma deterioração da personalidade era conseqüência inevitável da epilepsia. Hoje se sabe
que isto não é verdade, mas, estima-se que cerca de 40 % destes pacientes apresentam
transtornos psiquiátricos que requerem tratamento. Estes transtornos estariam associados com
a presença de lesões cerebrais focais, principalmente de lobos temporais e frontais, e com
crises parciais complexas (ALMEIDA; DRATCU; LARANJEIRA, 1996; ADACHI et al.,
2002; GUARNIERI et al., 2004; MARCHETTI; CREMONESE; CASTRO, 2004;
BEYENBURG; SCHMIDT, 2006; YUDOFSKY; HALES, 2006).
Manchanda et al. (1996) estudaram a ocorrência de morbidade psiquiátrica em 300
pacientes com epilepsia refratária ao tratamento. Com base nos critérios diagnósticos do
DSM-III-R, 142 (47%) foram considerados como casos psiquiátricos. Diagnósticos de eixo I
foram feitos em 88 pacientes (29,3%) pacientes, tendo sido mais comuns (10,7%) os
distúrbios de ansiedade. O diagnóstico de transtornos psicóticos foi feito em 13 (4,3%)
pessoas, sendo a maioria destes do grupo de pacientes com epilepsia temporal. Os transtornos
de eixo II foram atribuídos a 54 (18%) dos sujeitos, com predomínio de traços dependentes e
de evitação. Não houve significância nos resultados nas seguintes situações: quando
16
comparados com pessoas portadoras de distúrbios epilépticos generalizados e multifocais;
entre os diferentes grupos de foco epiléptico nos pacientes com escores neuróticos; e nos
dados relacionados à lateralidade do foco epiléptico e escores de neurose ou psicose. Dados
da literatura mostram que cerca de 30 a 50% dos epilépticos tem alguma comorbidade
psiquiátrica (TORTA; KELLER, 1999).
No entanto, apesar da evidência da associação e da maior incidência de psicopatologia
e de transtornos epilépticos, a etiologia exata destas condições ainda não está clara. O
transtorno do comportamento (psicótico, depressivo ou ansioso) pode ser evento pré-ictal,
ictal ou pós-ictal (YUDOFSKY; HALES, 2006). Sintomas de distúrbios psiquiátricos pós-
ictais são comuns entre pacientes com epilepsia parcial refratária e a severidade dos sintomas
psiquiátricos e cognitivos interictais comumente piora durante o período pós-ictal (KANNER;
SOTO; GROSS-KANNER, 2004). Há a sugestão de que existiriam eventos elétricos sub-
ictais patológicos no cérebro, ocasionando manifestações comportamentais (YUDOFSKY;
HALES, 2006). Outros sugerem que as crises epilépticas geram uma síndrome cerebral
orgânica relacionada a processo difuso subjacente ou advinda de danos focais ativos
(YUDOFSKY; HALES, 2006). Os medicamentos antiepilépticos foram, também,
relacionados como possíveis fatores causais de psicopatologia, devido a sua toxicidade
observada quando as pessoas eram supermedicadas. Com a disponibilidade do monitoramento
dos níveis sangüíneos a freqüência de ocorrência de confusão mental ou distúrbios de
comportamentos associados aos medicamentos diminuiu (ADACHI et al., 2002;
YUDOFSKY; HALES, 2006; SACHDEV, 2007).
Outra variável a ser considerada é o fato de que os estudos científicos são realizados,
em sua maioria, em hospitais universitários, onde há a tendência de maior concentração de
pacientes mais complicados. Além disso, a maioria dos estudos limita-se a relatos de casos.
17
Os de larga escala são geralmente feitos com populações que buscam atendimento
psiquiátrico e não com amostras da comunidade.
Os quadros psicóticos em epilépticos não são infreqüentes, especialmente na ELT
(SHERWIN et al., 1982; DEVINSKY; VAZQUEZ, 1993; ANDO et al., 2004;
MARCHETTI;
CREMONESE; CASTRO, 2004; GUARNIERI et al., 2005; YUDOFSKY; HALES, 2006).
Os sintomas são referidos pelos próprios indivíduos como egodistônicos, ou seja, percebidos
como se não fizessem parte deles, como algo que lhes contraria, perturba, parece estranho e
imposto como uma doença física (YUDOFSKY; HALES, 2006). A maioria dos que
apresentam tais sintomas aparentam estar com seu funcionamento mental intacto,
especialmente entre dois episódios psicóticos. Portanto, é importante que o profissional fique
atento quando seu cliente traz algum relato de experiências perceptivas alteradas que não
satisfazem os critérios diagnósticos das classificações psiquiátricas utilizadas (SHERWIN et
al., 1982; DEVINSKY; VAZQUEZ, 1993; ANDO et al., 2004;
MARCHETTI;
CREMONESE; CASTRO, 2004; YUDOFSKY; HALES, 2006).
Vários fatores de risco têm sido implicados na psicose tipo esquizofrenia em ELT,
incluindo a duração da epilepsia, a epilepsia grave e intratável, a epilepsia de início precoce, a
generalização secundária das crises epilépticas, certos antiepilépticos, a neuropatologia e a
lobectomia do lobo temporal (SACHDEV, 1998; ANDO et al., 2004; SACHDEV, 2007). Em
estudo retrospectivo de um grupo de pacientes tratados cirurgicamente por epilepsia de difícil
controle, Sherwin et al. (1982), confirmaram que os portadores de lesões de lobo temporal
esquerdo tem maior risco de desenvolver psicose. Em seus achados encontraram aumento de
prevalência de pessoas sinistras no grupo de pacientes psicóticos. A epilepsia envolvendo o
hemisfério dominante na origem do distúrbio epiléptico parece ser fator de risco significativo
para a comorbidade psicótica. Os achados indicaram que é improvável o desenvolvimento de
psicose nas epilepsias não temporais. Com base neste estudo, a prevalência de psicose em
18
ELT de difícil controle foi estimada em aproximadamente 10 a 15%, dentro da faixa de 4 a
27% encontradas em diferentes relatos disponíveis na literatura especializada (SHERWIN et
al., 1982; DEVINSKY; VAZQUEZ, 1993; MARCHETTI; CREMONESE; CASTRO, 2004;
YUDOFSKY; HALES, 2006). Outros dados referentes a risco de instalação de quadros
psicóticos tipo esquizofrenia foram os do trabalho de Shaw et al. (2004) que encontraram no
grupo de pacientes que se tornaram psicóticos mais anormalidades de EEG bilaterais no pré-
operatório, outras patologias além da Esclerose Mesial Temporal (EMT) no lobo exsisado e
uma amígdala menor no lado não operado. Os sintomas tiveram início no primeiro ano
seguindo a cirurgia e não houve relação entre a atividade epiléptica pós-operatória e
flutuações nos sintomas psicóticos que emergiram.
Na intenção de clarear a duração de episódios psicóticos pós-ictais e identificar fatores
que influenciam esta duração, Adachi et al. (2007) acompanharam 58 pacientes (32 homens e
26 mulheres) epilépticos que exibiram 151 crises psicóticas em período de 12,8 anos. 46
destes tinham diagnóstico de ELT, 7 de epilepsia de lobo frontal, 2 de lobo occipital e 3 de
multilobular ou de localização indeterminada. A maioria (aproximadamente 95%) dos
episódios de psicose duraram menos de 1 mês. Algumas características pessoais dos sujeitos,
como a história de psicose interictal, história familiar de psicose e funcionamento intelectual,
tiveram associação com a duração dos episódios psicóticos. Sexo, idade de início da epilepsia,
tipo de epilepsia, lateralidade, comorbidade psiquiátrica e EMT na RNM não foram
significativos. A administração de medicamento antipsicótico alterou a duração das crises,
contudo, outras variáveis relacionadas à psicose pós-ictal, como intervalo lúcido, número de
crises epilépticas anteriores, uso de drogas antiepilépticas, freqüência habitual das crises
epilépticas, tipo de crise epiléptica e idade no momento das crises, não mostraram associação
com a duração dos episódios.
19
O alto índice de cronificação das psicoses torna necessária a discussão quanto à
necessidade de tratamento mais incisivo da mesma na epilepsia (MARCHETTI;
CREMONESE; CASTRO, 2004). Este tratamento, de acordo com Guarnieri et al. (2004),
deve ser realizado com cuidado devido à propensão dos antipsicóticos causarem crises
epilépticas e o risco de interação farmacocinética com os medicamentos antiepilépticos, entre
eles o aumento do metabolismo que estes causam nos antipsicóticos.
Na busca de anormalidades em regiões cerebrais especificas, Guarnieri et al. (2005)
fizeram uma comparação, através de SPECT, do fluxo sangüíneo regional de 21 pacientes
com psicose epiléptica e 23 controles. Encontraram uma tendência a aumento do fluxo
sangüíneo regional do cíngulo posterior direito no grupo de psicóticos que pode estar em
concordância, segundo os autores, com achados de anormalidades no cíngulo de outras
pesquisas, sugerindo que esta função anormal nesta região pode estar associada com o
fenômeno da psicose.
A categorização da psicose epiléptica em ictal, pós-ictal, interictal é alternativa
clinicamente útil, no entanto, não implica em patofisiologia distinta para cada subcategoria
(SACHDEV, 1998; DEVINSKY, 2003; GUARNIERI et al., 2005; SACHDEV, 2007).
Estudos neuropatológicos sugerem a presença de disgenesia cortical ou lesão cerebral difusa
em ambas, epilepsia e psicose, o que pode explicar a associação entre estas duas morbidades.
Os neurotransmissores que de alguma forma participam na psicose epiléptica parecem ser o
GABA, as catecolaminas, os opiáceos, a adenosina, o glutamato e o óxido nítrico
(SACHDEV, 1998; SACHDEV, 2007).
Em quase todas as doenças crônicas, limitantes ou incapacitantes, há uma relação
direta com humor depressivo. Por vezes, há a instalação de claros quadros de distúrbios
depressivos que necessitam de tratamento específico. De acordo com a estimativa da
Organização Mundial de Saúde, a depressão poderá ser a segunda maior doença em uma
20
perspectiva de custos mundiais com enfermidades, por volta do ano de 2020, perdendo apenas
para as doenças isquêmicas do coração (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 1996).
Os distúrbios depressivos são comorbidades psiquiátricas freqüentes em patologias
neurológicas como esclerose múltipla, acidente vascular cerebral (AVC), demência,
enxaqueca, doença de Parkinson e epilepsia. No referente à epilepsia, a depressão é a
comorbidade psiquiátrica mais comum (KANNER; BALBANOV, 2002; KANNER, 2003a,
2003b; HARDEN; GOLDSTEIN, 2002; GREENLEE et al., 2003; GILLIAM et al., 2004;
DUDRA-JASTRZEBSKA et al., 2007). Sua prevalência tem sido estimada entre 6 e 30% em
estudos populacionais e até 50% entre pessoas seguidas em centros terciários de tratamento. O
risco de suicídio tem sido estimado como sendo 10 vezes maior do que o da população em
geral (KANNER, 2003b).
A apresentação clinica da depressão na epilepsia pode ser idêntica a dos pacientes não
epilépticos, incluindo depressão maior, bipolar ou distimia. O não diagnóstico de depressão
em epilépticos pode ser devido ao fato de nem sempre os sintomas depressivos clássicos
estarem presentes nesta clientela (DUDRA-JASTRZEBSKA et al., 2007). Portanto,
apresentações atípicas podem dificultar seu diagnóstico. Outro dado a ser considerado é o fato
de haver uma lacuna de estudos científicos sobre o tratamento farmacológico da depressão em
epilépticos, o que aponta para uma forma empírica de tratar estes casos. Ao contrário do
temor clínico, a maioria dos antidepressivos é segura em pacientes com epilepsia (KANNER;
BALBANOV, 2002). Os antidepressivos em doses terapêuticas podem apresentar risco de
crises epilépticas e alguns, em especial em doses menores, podem mostrar efeitos
antiepilépticos (mecanismo ainda desconhecido). Os inibidores seletivos da recaptação de
serotonina (ISRS) podem causar um aumento na concentração plasmática das drogas
antiepilépticas. Por outro lado, fenobarbital, fenitoína e carbamazepina estimulam a
degradação catabólica dos tricíclicos e estes têm um efeito inibitório na eliminação dos
21
antiepilépticos (DUDRA-JASTRZEBSKA et al., 2007). Entre os tratamentos com
antidepressivos em epilépticos estão indicados os medicamentos ISRS (como o citalopram) e
drogas que agem em múltiplos receptores (como nefazodona e venlafaxina). Medicamentos
com maior risco de crises epilépticas como bupropiona, clomipramina e maprotilina devem
ser usados com cautela nestes casos (HARDEN; GOLDSTEIN, 2002).
A combinação de fatores psicossociais e neurológicos, ainda não totalmente
compreendida, pode ser o motivo para que as pessoas que sofrem de epilepsia sejam
consideradas como de maior risco para a instalação de quadros depressivos. A depressão
interictal é uma condição subtratada, em parte devido ao consenso sobre as interações
medicamentosas e o possível risco de exacerbação das crises epilépticas com os tratamentos
antidepressivos (HARDEN; GOLDSTEIN, 2002). Apesar do distúrbio bipolar não ser
descrito com freqüência maior do que a esperada na população de epilépticos, a ocorrência de
índices altos de depressão e suicídio nestes faz necessária uma maior consideração quanto ao
tratamento deste grupo de pacientes de risco (KANNER, 2003b; HARDEN; GOLDSTEIN,
2002). Fatores neurológicos como o local do foco epiléptico e a lateralidade mostram relação
com depressão (HARDEN; GOLDSTEIN, 2002). O surgimento de quadro depressivo pode
ser induzido iatrogenicamente pelos tratamentos antiepilépticos medicamentosos, mas, é
difícil determinar se tais sintomas são devidos ao medicamento ou a outros múltiplos fatores
(MULA; SANDER, 2007). Barbitúricos, vigabatrina e topiramato mostram maior associação
com a ocorrência de sintomas depressivos, chegando a 10% dos pacientes e até mais em
pessoas suscetíveis (KANNER, 2003b; MULA; SANDER, 2007). Na maioria dos casos, a
monoterapia com esquemas de titulações pequenas podem reduzir significativamente a
incidência destes distúrbios de humor. Fenitoína, etosuximida, carbamazepina, oxcarbazepina,
gabapentina, valproato de sódio, pregabalina e lamotrigina são associados com baixo risco de
depressão (<1%) e muitas destas substâncias parecem ter efeito positivo no humor (MULA;
22
SANDER, 2007). Os anti-epilépticos podem afetar o humor e o comportamento
negativamente por mecanismos diferentes como potencializarão de neurotransmissão GABA,
deficiência de folato, interações farmacodinâmicas com outros anti-epilépticos em politerapia
e paradoxalmente pela normalização forçada na qual alguns pacientes obtém o súbito controle
das crises com o tratamento medicamentoso anti-epiléptico (HARDEN; GOLDSTEIN, 2002;
MULA; SANDER, 2007). Indivíduos com história pessoal ou familiar de depressão devem
ser seguidos de perto após início de tratamento com um novo anti-epiléptico, especialmente se
houver presença de anormalidade estrutural cerebral como esclerose hipocampal (MULA;
SANDER, 2007).
História familiar de depressão é freqüente em pessoas com epilepsia (predisposição
genética). Estudos de neuroimagem e neurofisiológicos mostram disfunção concomitante em
lobo frontal e estruturas mesiais temporais em distúrbios depressivos, que ocorrem mais em
pacientes com crises parciais pouco controladas (KANNER; BALBANOV, 2002; KANNER,
2003b). A história de distúrbios depressivos precedendo o início dos sintomas epilépticos é
mais comum nestes pacientes do que no grupo controle (KANNER; BALBANOV, 2002). Um
achado consistente em imagens de tomografia por emissão de pósitrons (PET) em depressões
não epilépticas é o hipometabolismo no lobo frontal (KANNER; BALBANOV, 2002). Em
estudo com 23 pacientes com ELT refratária aos tratamentos medicamentosos submetidos à
lobectomia temporal, Salzberg et al. (2006) compararam 9 deles que tinham historia pré-
operatória de depressão com 14 outros sem depressão e, adicionalmente, 13 pacientes com
depressão no período pós-operatório versus 10 que não a desenvolveram. Tanto os pacientes
que tiveram depressão em qualquer período antes da cirurgia como os que a desenvolveram
depois mostraram hipometabolismo na região orbitofrontal ipsilateral, área implicada na
patofisiologia da depressão em não epilépticos. Apesar de ser estudo com limites, onde outras
explicações merecem consideração, parece que a disfunção do córtex orbitofrontal pode ser
23
relevante para a expressão de depressão em pacientes com ELT antes e após lobectomia
temporal. Estes dados sugerem ou uma relação bi-direcional entre estes distúrbios ou a
presença de um mecanismo patogênico comum que facilita a ocorrência de um na presença do
outro (KANNER; BALBANOV, 2002; KANNER, 2003b). Em acréscimo, dados de modelos
animais mostram que a atividade diminuída de serotonina, noradrenalina, dopamina e GABA
facilita o processo de excitação do foco epiléptico, piora a freqüência e severidade das crises
epilépticas, e pode ser revertida ou bloqueada por medicamentos antidepressivos (KANNER;
BALBANOV, 2002).
A ressecção cirúrgica do foco epiléptico pode levar a melhora psiquiátrica, contudo,
alguns pacientes podem ter complicações pós-operatórias do ponto de vista psiquiátrico
(GREENLEE et al., 2003; KANNER, 2003b). De acordo com os achados de Wrench, Wilson
e Bladin (2004), no pré-cirúrgico tanto pacientes com foco temporal como extratemporal
tiveram histórias psiquiátricas semelhantes e índices altos de depressão. Depois da cirurgia o
grupo com lesão temporal mostrou maior índice de depressão e desajustes psicossociais e a
lateralidade mostrou tendência em aumentar o risco de desencadeamento de distúrbios
depressivos. Pesquisadores têm realizado estudos para confirmar a relação da lateralidade do
foco epiléptico antes e após a lobectomia temporal com a apresentação de diagnósticos de
distúrbios depressivos. Kohler et al. (1999) encontrou, em uma amostra de 49 pacientes com
ELT antes de serem submetidos a cirurgia, índices mais proeminentes de depressão nas
pessoas com lesão a direita e em mulheres. A diferença de gênero, segundo o autor, parece
refletir a maior incidência de quadros depressivos na população feminina, enquanto que os
dados referentes à lateralidade contrastam com achados recentes em epilepsia, AVC e trauma
que associam depressão com lesões hemisféricas esquerdas. Glosser et al. (2000) encontraram
diagnóstico do eixo I do DSM-III-R em 65% dos indivíduos antes e após 6 meses do
procedimento cirúrgico. Os diagnósticos mais comuns foram depressão, ansiedade e
24
distúrbios orgânicos de humor e personalidade. Houve tendência de maior índice de
diagnósticos psiquiátricos nos pacientes com lesão direita em relação à lateralidade esquerda.
No grupo como um todo, a severidade dos sintomas psiquiátricos foi menor 6 meses após a
cirurgia do que antes da mesma. Quigg et al. (2003) em estudo com 107 epilépticos (53 com
foco direito e 54 com esquerdo) concluíram que os pacientes que foram submetidos a
ressecção direita e que apresentavam maior morbidade depressiva pré-cirurgica estavam mais
suscetíveis a desenvolver depressão clínica após a cirurgia.
1.3. Anormalidades no Hipocampo
O achado anátomo-patológico mais comum nos casos de ELT é a esclerose
hipocampal. O hipocampo é uma estrutura cerebral localizada na porção medial do lobo
temporal. Muitas vezes tem sido utilizada a expressão Esclerose Mesial Temporal (EMT)
devido à freqüente perda neuronal de áreas próximas ao hipocampo, como o córtex entorinal e
a amígdala (estruturas pertencentes à porção mesial do lobo temporal). (ENGEL; PEDLEY
1998; MCNAMARA, 1999; KANDEL; SCHWARTZ; JESSEL, 2000; ENGEL, 2001;
CARLOTTI, 2003; BROMFIELD; CAVAZOS; SIRVEN, 2006).
Por sua vez, Mathern et al. (2002) realizaram um estudo sobre o dano neuronal no
hipocampo em 572 pacientes com ELT, comparado-os com 73 sujeitos com crises epilépticas
e patologia extra-temporal, para saber se a esclerose hipocampal e a perda neuronal são causa
ou conseqüência das crises epilépticas. Concluíram que a esclerose hipocampal parece ser
uma patologia adquirida e que a perda neuronal, em sua maioria, ocorre com uma lesão
precipitante inicial. Portanto, segundo os autores, a perda neuronal do hipocampo pode ser a
conseqüência de crises epilépticas límbicas repetidas ao longo de 30 anos ou mais e pouco
provavelmente seria a causa da esclerose hipocampal, a menos que também haja uma lesão
25
precipitante inicial. Acrescido a isto, em analise retrospectiva, De Lanerolle et al. (2003),
observaram que os hipocampos de pessoas com ELT podem ser divididos em diversos grupos
com base na patofisiologia, em especial relacionando a ocorrência ou não de esclerose e a
região do hipocampo com perda neuronal associada. Este fato pode ser mecanismo de
refratariedade da ELT e ser preditivo de sua resposta ao tratamento cirúrgico.
Uma revisão sistemática de publicações do período de 1992 a 2006 de trabalhos
realizados com RNM com objetivo de melhor compreender as correlações de vulnerabilidade
neurobiológica à psicose mostrou redução de volume no hipocampo. (FUSAR-POLIA et al.,
2007). Em outro artigo Gur et al. (2007) analisaram os resultados de pesquisas de diferentes
métodos de neuroimagem e encontraram a redução de volume do hipocampo em pacientes
psicóticos. Na psicose esquizofrênica foram demonstradas associações entre dificuldades de
memória e sintomas psicóticos positivos e o tamanho do hipocampo, do giro temporal
superior e do lobo temporal como um todo (GUR et al., 2007).
Pacientes com depressão podem apresentar anormalidades estruturais e morfológicas
no hipocampo (BANASR; DUMAN, 2007). Vollmert et al. (2004) em artigo de revisão sobre
estudos com imagens funcionais realizados com pacientes deprimidos encontraram achados
consistentes com alterações morfológicas no gânglio basal, córtex frontal e sistema límbico,
envolvendo o hipocampo e a amígdala. Um estudo de RNM comparando 27 pacientes
portadores de distúrbio depressivo maior com 42 controles normais encontrou diferenças na
forma do hipocampo e não em seu volume nos sujeitos deprimidos (POSENER et al., 2003).
Na pesquisa de Briellmann, Hopwood e Jackson (2007) com 34 pacientes com ELT por
esclerose hipocampal os autores não encontraram relação desta lesão do hipocampo com a
presença de depressão, mas, a relativa preservação da amígdala contralateral mostrou
associação com esta doença.
26
Avanços recentes na biologia celular e molecular trazem a promessa de tratamentos
mais eficazes para as diferentes formas de psicopatologia humana. Ao atingir alvos
moleculares específicos dentro dos neurônios, estas abordagens possibilitam meios precisos,
poderosos e efetivos de influenciar a função cerebral. Embora o cérebro adulto tenha sido
considerado como refratário a regeneração e neurogênese, pesquisas recentes revelaram que o
hipocampo e o bulbo olfatório continuam a gerar novos neurônios durante toda a vida do ser
humano. Isto tem um significado enorme se considerarmos as perdas neuronais
acompanhadas por situações de trauma, doenças degenerativas e mesmo a idade (JACOBS;
VAN PRAAG; GAGE, 2000; SANTARELLI et al., 2003).
Pesquisas experimentais e clínicas (neuroimagem) têm enfocado o estudo da
transmissão sináptica, especialmente dos receptores pré e pós-sinápticos dos
neurotransmissores cerebrais. Entre os objetivos destes estudos estão o melhor entendimento
da neuropatologia relacionada aos distintos receptores, sua distribuição em diferentes regiões
no cérebro e a conseqüente possibilidade do desenvolvimento de medicamentos para tratar os
transtornos epilépticos e psiquiátricos. Entre os neurotransmissores relacionados à epilepsia e
aos distúrbios psicóticos e depressivos encontramos os adrenérgicos, os dopaminérgicos, os
serotoninérgicos e os da substância P.
1.4. Receptores adrenérgicos
Os receptores adrenérgicos que medeiam ações da adrenalina e noradrenalina podem
ser encontrados perifericamente e centralmente. No sistema nervoso central humano e de
ratos, são encontrados no hipocampo, contudo em regiões diferentes, o que sugere cautela em
extrapolar os resultados acerca destes receptores em ratos para humanos (SZOT et al., 2004;
SZOT et al., 2005). O receptor adrenérgico
α2C, em camundongos, é encontrado em regiões
27
cerebrais envolvidas no processo de informações sensoriais e no controle de atividades
motoras e emocionais relacionadas, como os núcleos acumbens, caudado e putamen,
tubérculo olfatório, septo lateral, hipocampo, amígdala e os córtex frontal e somatosensório
(HOLMBERG; FAGELHOLM; SCHEININ, 2003).
A noradrenalina tem sido relacionada ao controle do desenvolvimento da plasticidade,
ao estado de despertar e ao ciclo sono-vigília. O funcionamento noradrenérgico alterado tem
sido implicado em distúrbios como transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH),
depressão, ansiedade e recuperação após lesão cerebral traumática (TIMMONS et al., 2004).
A hipótese monoaminérgica, baseada no mecanismo de ação dos antidepressivos
tricíclicos e dos inibidores da mono-amino-oxidase (IMAOs), postulava que a depleção de
noradrenalina na fenda sináptica seria o substrato biológico da depressão (SCHILDKRAUT,
1965; KALIA, 2005; HALES; YUDOFSKY, 2006). Certos componentes do sistema
noradrenérgico parecem estar envolvidos com excitação e medo, enquanto outros, em
conjunto com componentes mesolímbicos dopaminérgicos, com motivação e prazer. Assim, a
ansiedade e a perda de prazer características da melancolia e da depressão atípica podem estar
relacionadas à desregulação do sistema noradrenérgico. (SCHILDKRAUT, 1965; KANDEL;
SCHWARTZ; JESSEL, 2000; KALIA, 2005; HALES; YUDOFSKY, 2006; YUDOFSKY;
HALES, 2006).
O receptor adrenérgico α2A está desregulado em distúrbio depressivo maior, onde os
pacientes têm maior densidade de receptor α2A que os controles normais (GURGUIS et al.,
1999). Achados obtidos com uma substância ligante agonista seletiva a proteínas G em
cérebros de pessoas com depressão que cometeram suicídio comparados com controles sem
depressão sugerem o envolvimento dos receptores α2-adrenérgicos na patogênese do distúrbio
de humor (GONZÁLES-MAESO et al., 2002).
28
Estudos com psicofármacos têm possibilitado, também, alguns achados relevantes
acerca do funcionamento dos receptores de neurotransmissores cerebrais. O lento início do
efeito das drogas antidepressivas parece refletir o tempo requerido para o desenvolvimento de
mudanças adaptativas com a dessensibilização dos autoreceptores pré-sinápticos controlando
a liberação de neurotransmissores. Pesquisa com o antidepressivo reboxetina, inibidor seletivo
da recaptação de noradrenalina, por exemplo, indicou que o tratamento crônico aumenta
marcadamente o efeito da reboxetina na noradrenalina extracelular no hipocampo dorsal de
ratos e que este efeito pode ser secundário a dessensibilização dos α2-adrenoreceptores
hipocampais (PARINI et al., 2005).
O sistema adrenérgico tem papel importante na esquizofrenia. Antagonistas dos
receptores adrenérgicos α1A e α2A têm sido relacionados a efeito antipsicótico. (BOLONNA
et al., 2000). Com base em observações clínicas de pacientes psicóticos durante tratamento
com drogas bloqueadoras adrenérgicas foi postulado que as atividades de dois sistemas,
bloqueio beta-adrenérgico e bloqueio alfa-adrenérgico, estão balanceadas. A psicose pode
acontecer quando a atividade plena de ambos está muito alta ou muito baixa, ou quando o
balanceamento está afetado (BLUM; ATSMON, 1976).
O bloqueio do receptor α1-adrenérgico central tem sido relacionado ao efeito
antipsicótico atípico do medicamento clozapina (WADENBERG et al., 2000). Wadenberg et
al. (2000) estudaram o efeito do bloqueio combinado de um α1-adrenoceptor (prazosin) e de
um receptor dopaminérgico D2 (racoplide) em ratos. Observaram, nestes, o desempenho da
resposta de evitação condicionada como índice de atividade antispicótica e a indução de
catalepsia como teste de efeito colateral extrapiramidal. Foi sugerido que na presença de baixa
ocupação dos receptores D2, o bloqueio α1-adrenérgico adicional pode aumentar a eficácia
antipsicótica e, por isso, aumentar a janela terapêutica relacionada ao parkinsonismo.
29
A noradrenalina tem, também, participação na epilepsia. Tem sido sugerido que ela
tem propriedades pró e antiepilépticas. Rutecki (1995) estudou os efeitos de agonistas e
antagonistas seletivos adrenérgicos em descarga epiléptica de ocorrência espontânea,
produzida por picrotocina (um convulsivante que prejudica a inibição GABAA-mediada) ou
pela elevação do potássio extracelular, em fatias da região CA3 de hipocampos de ratos. Os
resultados confirmaram que a ativação de receptores β-adrenérgicos aumenta o índice de
descargas epileptiformes e a ativação de receptores α-adrenérgicos lentificou o índice de
descargas epileptiformes. Em estudo da atividade epileptiforme do receptor adrenérgico no
hipocampo, Jurgens et al. (2005) concluíram que, sob condições de inibição GABAérgica
prejudicada, os efeitos excitatórios e inibitórios da noradrenalina na atividade epileptiforme
no hipocampo são mediadas pelas vias β e α2A, respectivamente. De acordo com seus
resultados, o efeito antiepiléptico de ativação do receptor α2A no hipocampo não depende do
sistema GABAérgico.
O sistema alfa-adrenérgico está envolvido no mecanismo de ação da substância
antiepiléptica difenilhidantoína. Poncelet et al. (1984) demonstraram que o prazosin, um
bloqueador de receptores alfa-adrenérgicos pós-sinápticos, antagonizou a atividade
antiepiléptica em 3 modelos animais de crises epilépticas. Em estudo com o prazosin em ratos
(PONCELET et al., 1986) foi relatado que este agente reverte o efeito exercido pela
difenilhidantoína em testes que são preditivos de atividade antidepressiva nestes animais:
ptose induzida por reserpina e imobilidade que são causados por situações aversivas e
inescapáveis. Os mecanismos noradrenérgicos têm explicado, também, os efeitos
antiepilépticos e psicotrópicos da carbamazepina (POST et al., 1985). O déficit adrenérgico
comum a epilepsia e depressão é confirmado pela eficácia dos antiepilépticos no manejo de
distúrbios de humor, enquanto algumas evidências sugerem que os antidepressivos têm efeitos
antiepilépticos (GIORGI et al., 2004). A estimulação dos receptores
α2A-pós-sinápticos é
30
responsável pelo efeito antiepiléptico, possivelmente pela supressão da liberação de
neurotransmissores excitatórios em regiões como o hipocampo, córtex e amígdala (SZOT et
al., 2004). Um estudo em ratos de modelo de dor inflamatória indicou que os efeitos anti-
hiperalgésicos da carbamazepina e oxcarbazepina são, pelo menos em parte, mediados pela
ativação de receptores α2-adrenérgicos (VUCKOVIC et al., 2006).
Fischer e Müller (1988) realizaram pesquisa sobre a influência de várias substâncias
modulando a atividade dos sistemas neurotransmissores centrais noradrenérgicos,
serotoninérgicos e dopaminérgicos na efetividade antiepiléptica de fenobarbital, feintoína e
carbamazepina em camundongos com o teste de crises epilépticas induzidas por eletrochoque
máximo. Os resultados mostraram que o sistema noradrenérgico pode ter um papel
predominante na modulação da eficiência dos medicamentos antiepilépticos testados. A
estimulação farmacológica com diferentes drogas simpatomiméticas (como metanfetamina,
maprotilina, tranilcipromina, yoimbina) aumentou a atividade antiepiléptica
significativamente. A supressão do sistema noradrenérgico (com, por exemplo, 6-
hidroxidopamina, fenoxybenzamina) reduziu a atividade antiepiléptica. A manipulação do
sistema serotoninérgico não foi tão pronunciada. Contudo, substâncias como a serotonina,
clomipramina, citalopram, zimelidina, mostraram, também, efeitos antiepilépticos aditivos. O
sistema dopaminérgico pareceu não exercer influência significativa neste sentido. Estes
achados confirmaram que o sistema noradrenérgico pode ter um papel marcante, via função
inibitória da noradrenalina no SNC, na supressão da atividade epiléptica e revela, também,
aspectos interessantes para uma possível co-medicação em distúrbios epilépticos.
1.5. Receptores dopaminérgicos
31
Os receptores de dopamina foram divididos historicamente em dois subtipos
principais, chamados D1 e D2 (NIZNIK; VAN TOL, 1992; MIGUEL; RAUCH; LECKMAN,
1998; KANDEL; SCHWARTZ; JESSEL, 2000; HALES; YUDOFSKY, 2006; YUDOFSKY;
HALES, 2006; MOREIRA; GUIMARÃES, 2007). São diferentes quanto a sua ligação às
proteínas G, distribuição no SNC e farmacologicamente. Atualmente, técnicas modernas de
biologia molecular permitiram o reconhecimento da existência de 5 receptores de dopamina,
descritos como subfamílias dos receptores do grupo D1 (D1 e D5) e do grupo D2 (D2, D3 e
D4) (NIZNIK; VAN TOL, 1992; MIGUEL; RAUCH; LECKMAN, 1998; KANDEL;
SCHWARTZ; JESSEL, 2000; HALES; YUDOFSKY, 2006; YUDOFSKY; HALES, 2006;
MOREIRA; GUIMARÃES, 2007). A definição desses dois grupos está baseada na ligação
com os mecanismos de transdução. Os pertencentes ao grupo D1 estimulam a enzima
adenilato ciclase e aumentam o nível intracelular de AMP cíclico enquanto os do grupo D2
inibem essa enzima e diminuem o AMP cíclico intracelular (NIZNIK; VAN TOL, 1992;
MOREIRA; GUIMARÃES, 2007).
A síntese de dopamina é feita por neurônios do tronco cerebral que se projetam por
diferentes vias (via meso-límbico-cortical - da área tegmental ventral para o núcleo acúmbens;
via túbero-infundibular; e a via que se projeta da substância negra para o estriado dorsal -
“sistema extrapiramidal”) (MIGUEL; RAUCH; LECKMAN, 1998; KANDEL; SCHWARTZ;
JESSEL, 2000; HALES; YUDOFSKY, 2006; YUDOFSKY; HALES, 2006; MOREIRA;
GUIMARÃES, 2007). Acerca da distribuição destes receptores, um estudo de atualização
mostrou que D1 e D2 são amplamente expressos em vários sistemas neurais, D3 e D4
parecem estar concentrados no sistema límbico e D5 tem uma distribuição limitada e
incomum (MEADOR-WOODRUFF, 1994). Pesquisa post-mortem da distribuição da família
dos receptores dopaminérgicos D2 com ligantes específicos em tecido cerebral humano
permitiu inferir que a distribuição de D2 é maior no putamen, caudado e núcleo accumbens,
32
de D3 no núcleo accumbens e de D4 em áreas corticais e hipocampo (LAHTI; ROBERTS;
TAMMINGA, 1995). O uso de ligante seletivo de D4 em cérebros humanos post-mortem
mostrou alta afinidade em algumas regiões, incluindo o hipocampo, o hipotálamo, o tálamo
dorsal e medial, o córtex entorinal, o córtex préfrontal e o núcleo septal lateral
(MATSUMOTO et al., 1995; PRIMUS et al., 1997; KHAN et. al., 1998; LAHTI et al., 1998;
STEFANIS et al., 1998; DE LA GARZA; MADRAS, 2000).
O entendimento sobre o substrato neuroquímico e neuroanatômico de diferentes
distúrbios mentais é facilitado pela distinta distribuição de cada um dos receptores de
dopamina no cérebro. Isto permite, também, uma compreensão acerca dos efeitos terapêuticos
e colaterais observados com os medicamentos dopaminérgicos e prôve elementos para
desenvolver novas drogas com ação no sistema dopaminérgico (KEYSER, 1993). A
subfamília de receptores D2 (D2, D3 e D4), por exemplo, tem expressão no sistema límbico e
está associada à esquizofrenia (MIGUEL; RAUCH; LECKMAN, 1998; KANDEL;
SCHWARTZ; JESSEL, 2000; HALES; YUDOFSKY, 2006; YUDOFSKY; HALES, 2006;
MOREIRA; GUIMARÃES, 2007).
A esquizofrenia passou a ser mais bem compreendida com a introdução dos
antipsicóticos em meados da década de 50 (HALES; YUDOFSKY, 2006; MOREIRA;
GUIMARÃES, 2007). Estes medicamentos são antagonistas pós-sinápticos de dopamina,
sendo que os tradicionais (típicos, “neurolépticos”) agem, principalmente, no receptor D2
(MULCRONE; KERWIN, 1996; MIGUEL; RAUCH; LECKMAN, 1998; KANDEL;
SCHWARTZ; JESSEL, 2000; HALES; YUDOFSKY, 2006; YUDOFSKY; HALES, 2006;
MOREIRA; GUIMARÃES, 2007). Este achado constituiu a base da teoria dopaminérgica da
esquizofrenia, segundo a qual os sintomas positivos (delírios e alucinações) parecem decorrer
de uma atividade excessiva de dopamina em receptores D2 no núcleo acúmbens, enquanto os
sintomas negativos (embotamento afetivo e déficits cognitivos) seriam decorrentes de uma
33
redução na ativação de receptores dopaminérgicos no córtex pré-frontal (MOREIRA;
GUIMARÃES, 2007). Um antipsicótico ideal deveria, portanto, reduzir a atividade
dopaminérgica no núcleo acúmbens, atenuando os sintomas positivos, e intensificá-la no
córtex pré-frontal, atenuando os sintomas negativos (MOREIRA; GUIMARÃES, 2007). No
entanto, estes medicamentos ao antagonizarem a via do “sistema extrapiramidal”, acabam
induzindo efeitos colaterais extrapiramidais (“síndrome Parkinsoniana” - alterações motoras
como bradicinesia e acatisia) e ao antagonizarem a via dopaminérgica túbero-infundibular
podem provocar hiperprolactinemia e galactorréia, dentre outras alterações endócrinas
(HALES; YUDOFSKY, 2006; MOREIRA; GUIMARÃES, 2007).
Um fato histórico curioso sobre as substâncias antipsicóticas é o da crença que houve
entre os profissionais médicos de que a presença de efeitos colaterais extrapiramidais fosse
um pré-requisito para a atividade terapêutica destes fármacos. Esta crença fez com que o
primeiro antipsicótico de segunda geração ou atípico Clozapina fosse visto com ceticismo,
uma vez que ele não induzia efeitos extrapiramidais (MOREIRA; GUIMARÃES, 2007). O
principal critério para que um antipsicótico seja considerado atípico é uma diferença
significativa entre as doses necessárias para induzir efeitos antipsicóticos e efeitos
extrapiramidais (HALES; YUDOFSKY, 2006; MOREIRA; GUIMARÃES, 2007). Outros
critérios de interesse são a eficácia sobre os sintomas negativos e a propensão do composto de
induzir galactorréia, ganho de peso e outras alterações metabólicas. Antipsicóticos de segunda
geração tem maior bloqueio de D3 e D4 e antagonismo de 5-HT2A e 5-HT2C (inibem as
atividades dopaminérgicas mesolímbica e nigroestriatal) (HALES; YUDOFSKY, 2006;
MOREIRA; GUIMARÃES, 2007). A maior expressão do mRNA do receptor D4 inclui o
córtex frontal, o mesencéfalo, a medula e a amígdala (CARLSSON et al., 2000; HALES;
YUDOFSKY, 2006; MOREIRA; GUIMARÃES, 2007). Estudo post-mortem de expressão do
mRNA de D4 em córtex frontal de nove controles e oito esquizofrênicos com o método de
34
RT-PCR, não encontrou, por outro lado, diferenças significativas na referida expressão do
mRNA entre os dois grupos (MULCRONE; KERWIN, 1996).
O controle dos níveis ou da resultante interação dos receptores de dopamina é
essencial para a função cerebral. A dopamina tem sido responsabilizada por produzir efeitos
tanto protetores quanto tóxicos nos neurônios, embora ainda seja pouco claro se estes efeitos
são receptor-dependentes e, se o são, qual receptor de dopamina pode estar envolvido
(BOZZI; BORRELLI, 2006). O receptor D4 de dopamina tem sido investigado por seu
potencial papel em distúrbios neuropsiquiátricos, comportamentos de “procura de novidades”
e efeitos produzidos por alguns psicoestimulantes (DE LA GARZA; MADRAS, 2000). O D2
pode ser neuroprotetor em doenças como Parkinson, isquemia e epilepsia. O papel ainda não
elucidado dos receptores D2 na morte e duração neuronal pode ser central para entender os
mecanismos subjacentes a algumas neuropatologias (BOZZI; BORRELLI, 2006).
Os pacientes com ELT podem apresentar psicose tipo esquizofrenia. O
neurotransmissor dopamina está relacionado, de alguma forma, aos quadros epilépticos e aos
psicóticos. Os antagonistas da dopamina são antipsicóticos e ligeiramente epileptogênicos,
enquanto os seus agonistas são psicoticogênicos e ligeiramente antiepilépticos (YUDOFSKY;
HALES, 2006). Para investigar o mecanismo biológico da psicose epiléptica Ando et al.
(2004) examinaram alterações dos sistema dopaminérgico central no modelo de ELT induzida
por kainato em ratos adultos. Concluíram que a hipersensibilidade do sistema dopaminérgico
desenvolve-se na fase crônica do modelo de ELT induzida por kainato, o que pode ser
responsável pelo mecanismo da psicose epiléptica.
Diferentes estudos com cobaias têm sido realizados com o objetivo de entender o
papel antiepiléptico dos neurotransmissores monoaminérgicos. Freitas et al. (2005)
investigaram as densidades de receptores muscarínicos, dopaminérgicos e serotoninérgicos
em hipocampo e estriado de ratos Wistar depois de status epilepticus induzido por
35
pilocarpina. Seus resultados permitiram sugerir que mudanças na constante de dissociação
podem ser responsáveis pelo status epilepticus induzido pela pilocarpina ao alterar a afinidade
de neurotransmissores como a acetilcolina, a dopamina e a serotonina.
Pesquisa de Clinckers et al. (2004) buscou avaliar a atividade antiepiléptica da
dopamina e da serotonina extracelulares com o acesso concomitante das possíveis interações
mútuas destas monoaminas. Foram avaliados os efeitos antiepilépticos das concentrações de
dopamina e serotonina aplicadas intrahipocampalmente contra crises epilépticas induzidas por
pilocarpina em ratos conscientes (movendo-se livremente). Os ratos foram protegidos das
crises epilépticas límbicas pela perfusão dos transmissores dopaminérgicos e serotoninérgicos
enquanto suas concentrações variaram, respectivamente, entre 70-400% e 80-350% de
aumento comparado com os níveis basais. A co-perfusão com bloqueadores D2 ou de 5-
HT1A aboliram claramente todos os efeitos antiepilépticos. O bloqueio simultâneo de D2 e 5-
HT1A ou concentrações altas (> 900% de aumento de 5-HT e > 1000% de aumento de DA)
agravou significativamente as crises epilépticas induzidas pela pilocarpina. Efeitos pró-
epilépticos tardios foram associados com aumentos significativos do glutamato extracelular e
aumento mútuo nas monoaminas extracelulares. Os resultados sugeriram que, dentro de certo
nível de concentração, dopamina e serotonina contribuem independentemente para a
prevenção da epileptogênese hipocampal via, respectivamente, ativação de receptores D2 e 5-
HT1A.
Com base nos achados do estudo acima, Clinckers et al. (2005a) realizaram
experimento com perfusão de glutamato e monoaminas. Com a perfusão isolada de glutamato
não houve crises epilépticas. Mediante a perfusão simultânea de monoaminas e glutamato
antes da injeção de pilocarpina houve a produção de crises epilépticas, ou seja, o efeito
antiepiléptico das monoaminas foi perdido. Por sua vez, a perfusão de glutamato após a
infusão da pilocarpina não afetou o efeito de proteção antiepiléptico das monoaminas.
36
Portanto, o aumento isolado do glutamato extracelular não induz crises epilépticas, mas, ele
pode modular o efeito antiepiléptico exercido pelas monoaminas (dopamina e serotonina)
hipocampais.
Em outra pesquisa, Clinckers et al. (2005b) utilizaram a microdiálise como método
para investigar como a oxacarbazepina e seu metabólito ativo 10,11-dihidro-10-
hidroxicarbamazepina promovem a liberação de monoaminas hipocampais. As concentrações
limiares de oxacarbazepina e seu metabólito ativo foram associadas com 140% e 205% de
aumento na dopamina hipocampal e 288% e 176% de aumento na concentração de serotonina.
A coperfusão de antagonista dos receptores D2 e 5-HT1A aboliu todos os efeitos
antiepilépticos. A conclusão foi de que a oxacarbazepina e seu metabólito ativo exercem
importante efeito promotor das monoaminas e os efeitos nos níveis da serotonina e da
dopamina são propostos como marcadores para a atividade antiepiléptica destes compostos.
Werhahn et al. (2006) quantificaram a densidade de receptores de dopamina D2 e D3
em 7 pacientes com ELT e 9 controles com PET utilizando um ligante específico para tais
receptores. Observaram redução no lobo temporal epileptogênico de todos os pacientes, nas
áreas ao redor da zona de início da crise epiléptica no pólo e lateral do lobo temporal, quando
comparados com o grupo controle. Segundo os autores, isto indica que os receptores D2/D3
podem ter um papel específico na patofisiologia da EMT.
Por outro lado, dois sintomas essenciais da depressão, a anedonia e a desmotivação,
têm o envolvimento dos sistemas dopaminérgicos mesocorticais e mesolímbicos
(FRIEDMAN et al., 2007). A letargia e a fadiga, incluindo não somente o retardo motor, mas,
a falha e a lentidão da memória, atenção e concentração são sugeridas por Nutt et al. (2006)
como áreas de interesse para pesquisas relacionadas aos receptores dopaminérgicos na
depressão e seu tratamento. Os achados de Friedman et al. (2007) em ratos Flinder sensitive
37
line indicaram que o monitoramento da dinâmica dopaminérgica límbica pode ser útil no
desenvolvimento de futuras drogas antidepressivas.
Muitos dos antidepressivos em uso atualmente são descendentes do inibidor da
monoamino oxidase iproniazida e do agente tricíclico imipramina. Ambos foram
desenvolvidos para outras indicações, tendo sido sua ação como antidepressivos determinada
ao acaso. A elucidação do seu mecanismo de ação nos leva a teoria monoaminergica da
depressão. Nas ultimas décadas, os estudos para clarear o papel dos neurotransmissores
dopamina, norepinefrina e serotonina na depressão incluiu estudos em animais, biológicos e
post-mortem em humanos, inferências a partir das ações dos antidepressivos, pesquisas de
estímulo ou redução; e, mais recentemente, estudos de imagem cerebral. Há algumas
evidencias do efeito antidepressivo dos agentes dopaminérgicos e evidencias claras do efeito
dos agentes serotoninérgicos e noradrenérgicos (NUTT, 2006).
1.6. Receptores serotoninérgicos
A serotonina tem sido relacionada a vários distúrbios psiquiátricos além da
esquizofrenia, como a depressão, o distúrbio bipolar, o transtorno de ansiedade generalizada,
o transtorno do pânico, a dependência de álcool, a anorexia nervosa e o transtorno obsessivo-
compulsivo (CARLSSON et al., 2000; HALES; YUDOFSKY, 2006; YUDOFSKY; HALES,
2006). É um dos neurotransmissores que influencia o balanço excitatorio/inibitório cortical e
subcortical e participa em vários processos fisiológicos e patológicos do cérebro, incluindo a
epilepsia (SULLIVAN et al., 2004; JAMALI et al., 2006). Os receptores de serotonina
encontrados nos seres humanos, até o momento, incluem: 5-HT1A, 5-HT1B, 5-HT1D, 5-
HT1E, 5-HT1F, 5-HT2A, 5-HT2B, 5-HT2C, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT5, 5-HT6, e 5-HT7
38
(MIGUEL; RAUCH; LECKMAN, 1998; KANDEL; SCHWARTZ; JESSEL, 2000;
YUDOFSKY; HALES, 2006).
Anormalidades específicas de receptores de serotonina nos distúrbios neurológicos e
psiquiátricos têm sido intensivamente estudadas, contudo, uma falta de consenso nas
pesquisas tem trazido dificuldades em estabelecer uma conclusão definitiva (MIGUEL;
RAUCH; LECKMAN, 1998; AGHAJANIAN; MAREK, 2000; CARLSSON et al., 2000;
KANDEL; SCHWARTZ; JESSEL, 2000; LÓPEZ-FIGUEROA et al., 2004; PUCADYIL;
KALIPATNAPU; CHATTOPADHYAY, 2005; JAMALI et al., 2006). Desta forma, os
receptores 5-HT1A, 5-HT2A e 5-HT2C são considerados como possivelmente relacionados
aos quadros depressivos (MIGUEL; RAUCH; LECKMAN, 1998; HALES; YUDOFSKY,
2006; YUDOFSKY; HALES, 2006). O receptor 5-HT1A mostra presença diminuída em
pacientes com ELT e o papel do 5-HT2A na epilepsia tem sido fortemente considerado
(SULLIVAN et al., 2004; JAMALI et al., 2006).
A distribuição de 5-HT1A, 5-HT2A e 5-HT2C em cérebro humano post-mortem foi
estudada por histoquímica de hibridização in situ. Neste, o 5-HT1A estava presente em todas
as áreas do hipocampo (células granulares do giro dentado e piramidais do corno de Ammon)
e em certos núcleos da amígdala, dentre outras regiões; o 5-HT2A foi observado em níveis
intermediários na formação hipocampal (células piramidais de CA1 e do corno de Ammon) e
com predomínio na amígdala; e o 5-HT2C teve o hipocampo e o hipotálamo como os
principais locais de expressão. Foi sugerido, portanto, que estes receptores podem estar
envolvidos na regulação de diferentes funções do hipocampo (BURNET; EASTWOOD;
HARRISON, 1995; PASQUALETTI et al., 1996; DWIVEDI; PANDEY, 1998; MIGUEL;
RAUCH; LECKMAN, 1998; PASQUALETTI et al., 1999; JAMALI et al., 2006).
A ativação dos receptores serotoninérgicos, encontrados em alta densidade no córtex
temporal e hipocampo, exerce efeito antiepiléptico em vários modelos experimentais
39
(TOCZEK et al., 2003). Em geral, agentes que elevam os níveis extracelulares de serotonina,
como o 5-hidroxitriptofano e os bloqueadores de recaptação da serotonina, inibem as crises
epilépticas focais e generalizadas. Foi, também, demonstrado que alguns antiepilépticos
aumentam a concentração de serotonina extracelular. O papel de, pelo menos, 5-HT1A, 5-
HT2C, 5-HT3 e 5-HT7 na epileptogênese tem sido descrito (BAGDY et al., 2007).
O 5-HT1A é o receptor de serotonina mais extensivamente estudado, o qual mostra
disponibilidade menor em pessoas com ELT comparado com sujeitos normais. Esta diferença
está correlacionada ao grau de epileptogenicidade de áreas corticais exploradas por registros
intracerebrais e não reflete somente mudanças patológicas ou perda neuronal no foco
epiléptico (MERLET et al., 2004; PUCADYIL; KALIPATNAPU; CHATTOPADHYAY,
2005; JAMALI et al., 2006). Pesquisadores (TOCZEK et al., 2003; SAVIC et al., 2004; ITO
et al., 2007) utilizando RNM e PET em pacientes com ELT demonstraram consistentemente
que o potencial ligante do receptor 5-HT1A estava reduzido no hipocampo epileptogênico,
amígdala e outras regiões como o cíngulo anterior, insular, córtex temporal lateral ipsilaterais
ao foco e hipocampo, amígdala e núcleo da rafe contralaterais, comparados ao controle.
Reduções no potencial ligante de 5-HT1A nas áreas insulares e cingulares sugerem um
mecanismo pelo qual podem aparecer sintomas afetivos na ELT.
Giovacchini et al. (2005) utilizaram PET com um antagonista do receptor 5-HT1A
corrigido para o efeito de volume parcial devido a atrofia estrutural e confirmaram as
reduções significativas do potencial ligante deste receptor dos estudos anteriores. Os
pesquisadores avaliaram, também, sintomas psiquiátricos baseados na Escala de Inventario de
Depressão de Beck e concluíram que a redução do potencial ligante do receptor 5-HT1A no
hipocampo ispilateral pode contribuir para os sintomas depressivos. Em outros estudos sobre
ligantes para visualizar o 5-HT1A no cérebro foi possível concluir que este receptor está
envolvido na modulação da emoção e, portanto, implicado na patogênese de distúrbios de
40
ansiedade, depressão, humor, alimentar, comportamento alucinatório e esquizofrenia (ITO;
HALLDIN; FARDE, 1999; PASSCHIER; WAARDE, 2001).
Estudo de Theodore et al. (2007) obteve evidências de que o potencial ligante de 5-
HT1A pode estar relacionado a incidência aumentada de depressão em pacientes com
epilepsia. Sugere que a epilepsia e a depressão podem ter processo patofisiológico comum. Os
achados sugeriram que a depressão pode contribuir na redução da neurotransmissão
serotoninérgica no foco epiléptico hipocampal. Neste estudo, o lado do foco, a presença de
EMT e o gênero do paciente não influenciaram os resultados significativamente.
O possível papel do receptor 5-HT2A na epilepsia tem sido firmemente considerado.
Este receptor pode ser um importante alvo para drogas anti-epilépticas, já que o ácido
valpróico leva ao aumenta de sua atividade (SULLIVAN et al., 2004). Níveis diminuídos de
5-HT2A na zona epiléptica podem levar a diminuição da atividade de drogas antiepilépticas e,
por isso, este receptor pode ter participação na fármacoresistência classicamente associada à
ELT (JAMALI et al., 2006).
O receptor 5-HT2C tem sido implicado na epilepsia. O achado recente de que um
agonista dos receptores 5-HT2B/2C tem efeito antiepiléptico provocou o interesse na
investigação do subtipo de receptor serotoninérgico 5-HT2C como possível alvo para o
tratamento da epilepsia (ISAAC, 2005).
Um interessante tema de investigação é o suicídio em pacientes psiquiátricos e sua
associação com disfunção serotoninérgica central. Esta é uma preocupação especial
considerando que os níveis de suicídio e de tentativas de suicídio são elevados em pessoas
com ELT (JONES et al., 2003; MANN, 2003; MAZZA et al., 2004). Mann (2003) reportou
regulação para cima de receptores pós-sinápticos de serotonina 5-HT1A e 5-HT2A no córtex
pré-frontal de vítimas de suicídio, o que pode ser uma resposta compensatória para a baixa
atividade dos neurônios serotoninérgicos. No caso do 5-HT2A esta regulação para cima
41
envolve aumento da expressão do mRNA. No mesmo sentido, Hrdina et al. (1993)
comprovaram que a densidade do receptor 5-HT2 está significativamente aumentada no
córtex pré-frontal e amígdala post-mortem de pacientes depressivos e suicidas comparado
com controles. Com relação ao receptor 5-HT2C Pandey et al. (2006) comparando a
distribuição regional deste receptor em cérebros post-mortem de suicidas e controles
sugeriram que eles estão ricamente distribuídos por todo o cérebro com níveis maiores no
plexo coróide e que anormalidades na expressão protéica do receptor no córtex pré-frontal
podem estar associadas ao suicídio.
Trabalhos prévios têm demonstrado como tratamentos antidepressivos podem alterar
diferentemente alguns sistemas neurotransmissores em varias áreas cerebrais. Inibidores
seletivos da recaptação de serotonina são as drogas antidepressivas mais frequentemente
prescritas, por não terem efeitos colaterais severos e serem bem tolerados. Eles bloqueiam
rapidamente a recaptação de serotonina, embora o início de sua ação terapêutica requeira
semanas de tratamento, como resultado de mecanismos adaptativos pré e pós-sinapticos
secundários a inibição da recaptação. O bloqueio dos receptores 5-HT2A parece aumentar o
efeito clínico destes antidepressivos. Seu bloqueio pode afetar a função dos circuitos pré-
frontais subcorticais, um efeito que provavelmente é a base dos efeitos benéficos da adição de
drogas antipsicóticas atípicas, que são antagonistas 5-HT2A, aos antidepressivos no
tratamento de pacientes resistentes (CELADA et al., 2004).
McMahon et al. (2006) em estudo com pacientes portadores de distúrbio depressivo
maior que foram tratados com o antidepressivo citalopram, detectaram associação
significativa e reproduzível entre a resposta ao tratamento e um marcador para 5-HT2A que é
regulado para baixo pelo citalopram. Junto com achados neurobiológicos anteriores, este dado
genético acaba compelindo para um papel chave do 5-HT2A no mecanismo da ação
antidepressiva (MCMAHON et al., 2006). Outro estudo indica que receptores 5-HT2A
42
aumentados pode estar associado com a patofisiologia do distúrbio bipolar. Tratamento com
lítio promove aumento da densidade dos receptores 5-HT2A. Não é claro se este aumento
causado pelo lítio e associado com o mecanismo de ação terapêutico e se o aumento do
mesmo receptor em pacientes bipolares ou esquizoafetivos ou em suicidas bipolares ou
esquizoafetivos, é um traço ou um marcador fixo (PANDEY et al., 2003).
O receptor 5-HT2C tem sido relacionado a diferentes distúrbios neurológicos e
psiquiátricos, entre eles, epilepsia, esclerose lateral amiotrófica, enxaqueca, disfunção erétil,
obesidade, ansiedade, distúrbio obsessivo-compulsivo, depressão e esquizofrenia. Tem
recebido, portanto, atenção considerável como alvo para a descoberta de novos
medicamentos. Outros fatores ou enzimas, além da adenosina deaminase agindo no RNA
(ADAR) que devem controlar ou influenciar a pré edição de mRNA dos receptores 5-HT2C e
de Glutamato em neurônios nativos, variam entre indivíduos e podem ser prognóstico de
doença psiquiátrica (SERGEEVA; AMBERGER; HAAS, 2007). Efeitos inibitórios
significativos da estimulação do receptor 5-HT2C têm sido observados nos feixes
dopaminérgicos límbicos e estriatais, o que pode contribuir para os efeitos da manipulação
experimental deste receptor na resposta a drogas psicoestimulantes, antipsicóticas atípicas e
antidepressivas (GIORGETTI; TECOTT, 2004). Em uma revisão do WAY-163909, um novo
agonista seletivo do receptor 5-HT2C, foi descoberto que o mesmo apresenta forte efeito
dose-dependente em modelos animais de obesidade, comportamento do tipo psicótico ou
depressão (DUNLOP et al., 2006).
A edição do mRNA do receptor 5-HT2C pela provável alteração da deaminase durante
um estado patológico na depressão tem sido relatada, recentemente, como participante na
patogênese da doença depressiva (THODA; NOMURA; NOMURA, 2006). A regulação para
baixo de longo prazo dos receptores 5-HT2C está associada com suas interações com algumas
drogas inibidoras da recaptação de serotonina e pode levar a desinibição do sistema
43
dopaminérgico mesolímbico, que pode ser parcialmente responsável por sua ação
antidepressiva. Contudo, evidência atual não permite definição completa das funções e
propriedades do receptor 5-HT2C (SERRETTI; ARTIOLI; DE TRONCHI, 2004).
Até o momento, os distúrbios psicóticos são geralmente aceitos como sendo
oligogênicos, ou seja, determinados por dois ou três genes maiores (GOLIMBET et al., 2001).
Alguns dos assim chamados genes com efeito pequeno podem, também, estar envolvidos com
a expressão do caráter quantitativamente variável que predispõe a doença ou em sua
patogênese. Receptores 5-HT2A, entre estes, são considerados como os que têm o papel
principal no desenvolvimento da psicose. O número de receptores 5-HT2A está diminuído na
região pré-frontal de cérebros post-mortem de pacientes esquizofrênicos (VERHOEFF et al.,
2000; GOLIMBET et al., 2001). Em estudo de neuroimagem com pacientes esquizofrênicos
Verhoeff et al. (2000) não encontraram, no entanto, diferenças entre pacientes com
esquizofrenia e controles normais quanto ao potencial ligante de 5-HT2A.
Tem sido demonstrado que os receptores 5-HT2A se ligam a algumas drogas
antipsicóticas que retardam o desenvolvimento de sintomas negativos em esquizofrênicos
(GOLIMBET et al., 2001). O interesse pelo papel da serotonina na ação de drogas
antipsicóticas é baseado principalmente no fato de que antipsicóticos como clozapina,
olanzapina, quetiapina, sertindole e ziprasidona são potentes antagonistas do receptor 5-HT2A
e relativamente fracos antagonistas D2 (HALES; YUDOFSKY, 2006; MOREIRA;
GUIMARÃES, 2007). Estes agentes antipsicóticos atípicos compartilham baixos efeitos
colaterais extrapiramidais em doses clinicamente efetivas, possivelmente maior eficácia para
reduzir sintomas negativos, um efeito superior na função cognitiva e maior habilidade para
tratar sintomas de humor em pacientes com esquizofrenia ou distúrbios afetivos do que os
antipsicóticos típicos. Eles variam em suas afinidades para outros receptores serotoninérgicos,
bem como para dopaminérgicos, muscarínicos, adrenérgicos e histaminérgicos, alguns, ou
44
todos os quais podem contribuir por suas diferenças nos perfis de eficácia e efeitos colaterais
(MELTZER, 1999; HALES; YUDOFSKY, 2006; MOREIRA; GUIMARÃES, 2007).
Os receptores 5-HT1A e 5-HT2C são outros fortes candidatos para contribuir na ação
antipsicótica dos medicamentos e no perfil baixo de efeitos colaterais extrapiramidais
(MELTZER et al., 2003; HALES; YUDOFSKY, 2006; MOREIRA; GUIMARÃES, 2007).
Os receptores 5-HT6 e 5-HT7 podem, também, ser de alguma importância (MELTZER et al.,
2003). A estimulação do receptor 5-HT1A parece produzir os mesmos efeitos que o
antagonismo do 5-HT2A enquanto o antagonismo do 5-HT2C parece diminuir algumas das
ações do antagonismo do 5-HT2A. Os receptores 5-HT1A e 5-HT2A localizados em
neurônios piramidais glutamatérgicos no córtex e hipocampo, 5-HT2A nos corpos celulares
de neurônios dopaminérgicos no tegmento ventral e substancia negra e interneuronios
gabaérgicos no córtex e hipocampo, e 5-HT1A no núcleo da rafe são provavelmente
importantes sítios de ação dos agentes antipsicóticos atípicos. Portanto, o futuro
desenvolvimento de drogas antipsicóticas pode incluir múltiplos subtipos de receptores de
serotonina como alvos (MELTZER, 1999; MELTZER et al., 2003).
Estudo comparou as quantidades de mRNA dos receptores 5-HT1A e 5-HT2A por
hibridização histoquímica in situ e densidades locais ligantes (autoradiografia com radio
ligantes aos receptores) em varias regiões neocorticais e hipocampais de esquizofrênicos e
sujeitos controle (BURNET; EASTWOOD; HARRISON, 1996). Nos esquizofrênicos as
densidades locais ligantes do receptor 5-HT1A estavam aumentadas no córtex pré-frontal
dorsolateral e no giro do cíngulo anterior, mas estes aumentos não foram acompanhados de
qualquer mudança nas quantidades de mRNA deste receptor. Nenhuma diferença foi
encontrada com o grupo controle no giro temporal superior, córtex estriado ou hipocampo. As
densidades locais ligantes do receptor 5-HT2A estavam diminuídas no córtex pré-frontal
dorsolateral, giro parahipocampal e giro do cíngulo de esquizofrênicos, mas não no giro
45
temporal superior ou córtex estriado. O mRNA do receptor 5-HT2A estava reduzido no córtex
pré-frontal dorsolateral, temporal superior, cíngulo anterior e estriado, mas não no giro
parahipocampal nas amostras de esquizofrenia.
LÓPEZ-FIGUEROA et al. (2004) utilizando hibridização in situ quantificaram níveis
de mRNA dos receptores 5-HT1A, 5-HT1B, e 5-HT2A no hipocampo e de 5-HT1A e 5-
HT2A no córtex pré-frontal dorsolateral de sujeitos com historia de depressão maior, distúrbio
bipolar, esquizofrenia e um grupo controle de comparação, sendo 15 sujeitos por grupo.
Encontraram uma diminuição significativa no mRNA de 5-HT1A dos sujeitos com depressão
maior e no mRNA de 5-HT2A dos sujeitos com distúrbio bipolar no córtex pré-frontal
dorsolateral; um significativo decréscimo no mRNA de 5-HT1A no hipocampo dos pacientes
com depressão maior; um nível aumentado de mRNA de 5-HT1B e uma diminuição
significativa no mRNA de 5-HT2A na formação hipocampal dos sujeitos com distúrbio
bipolar e esquizofrenia. Estas alterações nos cérebros dos sujeitos com distúrbio de humor e
esquizofrenia contribuem para a hipótese da desregulação do sistema serotonérgico nestes
distúrbios psiquiátricos.
1.7. Receptores de substância P
Outro neuropeptídeo que tem recebido atenção nos estudos de ansiedade e depressão é
a substância P. Trata-se de um peptídeo da família das taquiquininas. A substância P é
relativamente seletiva aos receptores de neurokinina-1 (NK1), que são expressos em áreas
cerebrais relacionadas ao stress, ao medo, a respostas afetivas (córtex frontal, hipotálamo,
amígdala e hipocampo) e recebem inervação monoaminérgica convergente (TAKEDA et al.,
1991; TAKAHASHI et al., 1992; KRAMER et al., 1998; RUPNIAK, 2002; HERPFER;
LIEB, 2005; MCLEAN, 2005; HALES; YUDOFSKY, 2006; YUDOFSKY; HALES, 2006).
46
Ela facilita a atividade epiléptica das células principais no hipocampo. O tratamento com um
antagonista do receptor NK1 mostrou propriedade inibidora de crises epilépticas induzidas
com uma substância ácida em ratos e parece ter protegido a morte neuronal que seria esperada
como conseqüência do uso deste ácido (ZACHRISSON; LINDEFORS; BRENE, 1998).
Wasterlain et al. (2000) comprovaram que a auto-sustentação de status epilepticus em ratos é
realçada pela substância P e seus agonistas e bloqueada pelos seus antagonistas, o que pode
contribuir, segundo os autores, com a modulação da excitabilidade hipocampal durante as
crises epilépticas. No entanto, de forma paradoxal, em alguns modelos animais a ativação do
seu receptor expresso nos interneurônios foi referida como protetora contra crises epilépticas.
Portanto, estas células parecem ter um papel importante na gênese e regulação das crises
epilépticas.
Tóth et al. (2007) fizeram um estudo das características de entrada sináptica,
morfológicas, número e distribuição dos interneurônios hipocampais que expressam o
receptor da substância P em 28 sujeitos submetidos a cirurgia por ELT e 8 hipocampos
controle. Nos hipocampos epilépticos houve alterações morfológicas destas células com
aumento da arborização dentrítica, nas regiões com esclerose seu número estava diminuído e
houve aumento da relação simétrica da entrada sináptica nestas células. Estes achados, de
acordo com os autores, podem sugerir um funcionamento alterado e eficácia realçada do
sistema da substância P no hipocampo epiléptico humano. Sendo assim, sugerem estes
pesquisadores, a substância P pode provar ser um novo alvo para a farmacoterapia da
epilepsia.
Antagonistas do receptor NK1 parecem ter utilidade no tratamento da depressão. Em
estudos pré-clínicos, os antagonistas da substância P são bem tolerados e não induzem
sedação ou prejuízo motor (TAKEDA et al., 1991; TAKAHASHI et al., 1992; KRAMER et
al., 1998). Resultados da pesquisa de Caberlotto et al. (2003) da localização anatômica dos
47
receptores NK-1 mostraram haver uma forte associação destes receptores com sistemas
neuronais relevantes para a regulação do humor: locus coeruleus, estriado ventral, córtex
visual, hipocampo e núcleos amigdalóides. Stockmeier et al. (2002) mediram o receptor NK-1
de 23 sujeitos (12 com depressão maior e 11 controles normais) em áreas
citoarquitetonicamente definidas do córtex orbitofrontal. Os pacientes com depressão
mostraram diminuição na ligação aos receptores NK-1 em todas as áreas estudadas.
Pesquisas em animais têm demonstrado que a substância P e seu receptor NK1 podem
ser alvos para novas terapias ansiolíticas e antidepressivas. Van Der Hart et al. (2004)
investigaram o efeito de um antagonista do receptor NK1 e do antidepressivo tricíclico
clomipramina no paradigma de stress psicossocial crônico em um pequeno animal semelhante
ao camundongo (tree shrews). Os resultados sugeriram que, apesar das diferenças de perfil
farmacológico, o antagonista NK1 tem eficácia neurobiológica comparável ao de
antidepressivos tricíclicos como a clomipramina. O sistema do receptor NK1 da substância P
tem papel regulador na modulação do comportamento afetivo e seus efeitos são mediados,
pelo menos em parte, via sistema serotoninérgico (SANTARELLI et al., 2002). Em animais
de laboratório, segundo Blier et al. (2004), os antagonistas da NK1 atenuam a responsividade
dos neurônios serotoninérgicos e noradrenérgicos aos agonistas de seus autoreceptores, como
é o caso de alguns antidepressivos de uso clínico. O antagonismo de receptores NK1 de longo
prazo em ratos aumenta a transmissão serotoninérgica no hipocampo, uma propriedade
comum a todos os tratamentos antidepressivos testados. Camundongos que tiveram o receptor
NK1 deletado de seu código genético têm, também, um aumento na mesma taxa.
Em seres humanos encontramos o trabalho de Bondy et al. (2003) que realizaram uma
análise dos níveis séricos da substância P em 23 pacientes com depressão maior e 33 controles
saudáveis antes (linha de base) e depois de 2 a 4 semanas de tratamento antidepressivo.
Observaram que os níveis séricos de substância P estão aumentados em uma proporção dos
48
pacientes com depressão maior comparados ao grupo controle, o que pode, assim, indicar um
subgrupo do distúrbio nos quais o neuropeptídeo tem um papel chave. Alguns pacientes
deprimidos (37%) exibiram uma diminuição de 15 a 50 % da substância P depois do
tratamento, achado este que pode ser correlacionado a uma melhor resposta a droga. Estudos
futuros são necessários para clarificar se o decréscimo da substância P nos que responderam
ao tratamento pode ser atribuído a uma classe específica de drogas. Kramer et al. (1998) em
estudo placebo-controlado com pacientes com depressão moderada a severa observaram
efeitos antidepressivos consistentes do antagonista MK-869 da substância P.
Em trabalho de revisão da literatura sobre o envolvimento da substância P em
distúrbios mentais, especialmente esquizofrenia Takeuchi et al. (1988) concluíram que, como
a via nigroestriatal é uma das principais vias da substância P no cérebro, a administração de
drogas antipsicóticas diminui sua concentração na substância negra. Alguns estudos
postmortem de esquizofrênicos, segundo estes autores, mostraram concentração elevada da
substância P em algumas regiões cerebrais o que é indicador de que ela pode estar envolvida
na patofisiologia da esquizofrenia. Uma pesquisa com a droga esquizofrenicomimética
phencyclidine (PCP) que avaliou o conteúdo de substância P no cérebro de ratos com o
método de enzima-imunoensaio encontrou redução da substância P na região frontal causada
pelo uso de haloperidol (SHIRAYAMA et al., 2000). De acordo com estes pesquisadores a
substância P pode estar envolvida em certos sintomas de resistência neuroléptica ao PCP, à
psicose por PCP ou à esquizofrenia. Tooney, Crawter e Chahl (2001) utilizaram um anticorpo
específico contra a NK1 e encontraram imunoreatividade aumentada no córtex pré-frontal de
esquizofrênicos, o que traz implicações para a patofisiologia e tratamento deste distúrbio.
Neste trabalho estudamos a expressão do mRNA de subtipos de receptores para os
neurotransmissores adrenérgicos, dopaminérgicos, serotoninérgicos e de substância P em
49
amostras de hipocampos de pacientes com ou sem história de diagnósticos de distúrbios
depressivos ou psicóticos submetidos a tratamento cirúrgico para ELT.
50
2. HIPÓTESE
Em pacientes com epilepsia de lobo temporal (ELT) com ou sem história de
diagnóstico associado a distúrbio depressivo ou psicótico pode haver diferenças na
quantificação da expressão do mRNA para subtipos de receptores dos neurotransmissores de
noradrenalina, dopamina, serotonina e substância P.
51
3. OBJETIVOS
Quantificar o mRNA de subtipos dos receptores de noradrenalina, dopamina,
serotonina e substância P em hipocampos de pacientes com ELT através de real-time PCR
(quantitativo).
Conhecer o papel dos receptores de noradrenalina, dopamina, serotonina e substância
P na ELT com ou sem comorbidade psiquiátrica de distúrbios depressivos ou psicóticos.
52
4. MATERIAL E MÉTODO
4.1. Sujeitos
Um total de 48 pessoas com ELT resistentes a tratamentos farmacológicos e
submetidos ao tratamento cirúrgico no Centro de Cirurgia de Epilepsia (CIREP) do Hospital
das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HC-
FMRP-USP) foram incluídos como sujeitos nesta pesquisa. A seleção dos pacientes foi feita
mediante pesquisa do banco de dados do CIREP e consulta de seus prontuários medico-
hospitalares. Todos os indivíduos inscritos no CIREP são submetidos a um protocolo de
avaliação pré-cirúrgico (CARLOTTI, 2003; GUARNIERI et al., 2005) que inclui
monitoramento por vídeo-eletroencefalograma (vídeo-EEG), ressonância nuclear magnética
(RNM), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), avaliação
neuropsicológica, psiquiátrica e social. A avaliação psiquiátrica de distúrbios comórbidos é
baseada nos critérios do DSM-IV (“Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,
4th edition”) da Associação Psiquiátrica Americana (APA).
Os pacientes foram submetidos ao procedimento cirúrgico de lobectomia anterior
(padrão ou individualizada) ou de amigdalohipocampectomia seletiva, descritas a seguir
(CARLOTTI, 2003). Na lobectomia padrão há diferença nos limites posteriores em relação ao
lado operado, qual seja, de 5 a 6 cm da ponta do lobo temporal medido ao longo do giro
temporal médio na ressecção de hemisfério não dominante, e de 4 a 4,5 cm da ponta do lobo
temporal quando de hemisfério dominante. O comprometimento da visão e da fala foi evitado
com o respeito dos parâmetros anatômicos. A diferença entre a lobectomia padrão e a
individualizada reside no fato de que nesta a ressecção posterior do córtex e do hipocampo
53
devem ser baseadas em dados da atividade elétrica pré ou intracirúrgicas, enquanto que na
primeira não há necessidade de monitorização intraoperatória. O procedimento de
amigdalohipocampectomia seletiva, indicado quando há evidencia de que a origem das
descargas epileptiformes é exclusiva das estruturas mesiais temporais, é realizada através de
acesso transcortical ou transventricular pelo giro temporal médio ou sulco circular na fissura
silviana, respectivamente, preservando o neocórtex. O hipocampo teve sua aracnóide
preservada e cerca de 3 cm de seu eixo maior foi excisado cirurgicamente. Uma amostra deste
tecido foi enviada para análise anátomo-patológica. O material colhido para o presente estudo
foi imediatamente retirado da porção mais posterior do hipocampo, congelado e armazenado
em nitrogênio liquido a -80°C em um banco de amostras de tecido cerebral do HC-FMRP-
USP (HCRP 7645/1999, aprovado em 17/08/2005, coordenado pelo Prof. Dr. Carlos Gilberto
Carlotti Jr) até seu uso. A autorização para utilização do material deste banco de amostras
para estudos, sob forma de pesquisas científicas, consta de termo de consentimento livre e
esclarecido assinado pelos sujeitos doadores (APÊNDICE A).
Como grupo controle utilizamos 8 hipocampos removidos durante autópsias de
pacientes não epilépticos realizadas no serviço de Patologia do HC-FMRP-USP. Este material
foi retirado com intervalo de tempo post-mortem inferior a 8 horas e imediatamente congelado
em nitrogênio líquido e armazenado a -80°C no Laboratório de Estrutura Sináptica do
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto – USP até sua posterior utilização nesta pesquisa. A autorização
para utilização do material destas necropsias para estudos, sob forma de pesquisas científicas,
consta de termo de consentimento livre e esclarecido assinado pelos familiares dos sujeitos
doadores (APÊNDICE B).
Estes hipocampos foram provenientes de necrópsias de pessoas sem diagnósticos ou
antecedentes pessoais de epilepsia, psicose, depressão ou outros distúrbios psiquiátricos. Os
54
diagnósticos patológicos necropsiais de cada um destes e os medicamentos que estavam em
uso por ocasião dos óbitos foram: paciente 1 - pneumonia bilateral, em uso de antibióticos;
paciente 2 - pulmão de choque, pneumonia, em uso de antibióticos; paciente 3 - recidiva de
câncer de esôfago, broncopneumonia aspirativa, em uso de antibióticos, vasodilatador
coronariano, inibidor da enzima conversora da angiotensina (IECA) e anti-adesivo
plaquetário; paciente 4 - edema agudo de pulmão, cardiopatia chagásica, em uso de β-
bloqueador adrenérgico, IECA e diurético (hidroclorotiazida); paciente 5 - choque
cardiogênico, hipertensão arterial sistêmica, broncopneumonia, em uso de antibióticos, β-
bloqueador adrenérgico e IECA; paciente 6 – trombose de artéria mesentérica, em uso de β-
bloqueador adrenérgico e IECA; paciente 7 - broncopneumonia, em uso de antibióticos; e
paciente 8 - broncopneumonia, em uso de antibióticos. Nenhuma destas pessoas apresentava
história recente ou passada de distúrbio psiquiátrico de humor e/ou psicótico. No que se
refere, portanto, ao uso de medicamentos que poderiam causar interferência no nosso estudo,
apenas os controles 4, 5 e 6 estavam em uso de β-bloqueadores adrenérgicos.
O total de 56 sujeitos do nosso estudo foi distribuído em quatro grupos: Controle (8
hipocampos de necropsias); Epilepsia (24 hipocampos de ressecções cirúrgicas de ELT);
Psicose (10 hipocampos de ressecções cirúrgicas de ELT com história de psicose); e
Depressão (14 hipocampos de ressecções cirúrgicas de ELT com história de depressão). O
numero de amostras por grupo e suas freqüências percentuais são apresentados na Tabela 1.
55
Tabela 1 – Distribuição dos sujeitos por grupos
Grupos n %
Controle 8 14,3
Epilepsia 24 42,9
Psicose 10 17,9
Depressão 14 25,0
Total 56 100,0
Conforme esclarecido, o diagnóstico psiquiátrico foi feito com base nos critérios
diagnósticos do DSM-IV (APA). Os sujeitos foram incluídos nestes grupos ao atenderem o
critério de presença de diagnóstico de um destes distúrbios no momento em que foram
submetidos ao procedimento cirúrgico para tratar sua epilepsia ou se tiveram história de
episódios no decorrer da vida. Estes indivíduos foram divididos, no nosso estudo, em
subcategorias que denominamos de subtipo psiquiátrico. No que se refere ao diagnóstico de
psicose 5 tinham historia de episódios psicóticos pós-ictais e 5 de interictais (total de 10). Dos
pacientes com depressão 11 atenderam aos critérios de episódio depressivo maior (separados
neste estudo em 9 com história passada e 2 com episódio atual, no momento da cirurgia) e 3
de distúrbio depressivo maior recorrente.
Na Tabela 2 mostramos o perfil social dos sujeitos estudados por grupo.
56
Tabela 2 – Perfil social dos sujeitos estudados por grupo
Grupo
Variável
Controle Epilepsia Psicose Depressão Total
Idade (anos)
Média 52 36 43 38
Desvio
Padrão
21 9 9 10
Mínima 23 18 33 19
Máxima 82 52 62 58
n % n % n % n % n %
Gênero
Masculino 3 37,5 13 54,2 5 50,0 4 28,6 25 44,6
Feminino 5 62,5 11 45,8 5 50,0 10
71,4 31 55,4
Total 8 100,0 24 100,0 10 100,0 14
100,0 56 100,0
Cor
Branca 6 75,0 19 79,2 10 100,0 13
92,9 48 85,7
Negra 2 25,0 5 20,8 0 0,0 1 7,1 8 14,3
Total 8 100,0 24 100,0 10 100,0 14
100,0 56 100,0
Profissão
Inativo 1 12,5 9 37,5 4 40,0 3 21,4 17 30,4
Básico 6 75,0 10 41,7 4 40,0 7 50,0 27 48,2
Médio 0 0,0 2 8,3 1 10,0 2 14,3 5 8,9
Superior 1 12,5 1 4,2 0 0,0 1 7,1 3 5,4
Aposentado 0 0,0 2 8,3 1 10,0 1 7,1 4 7,1
Total 8 100,0 24 100,0 10 100,0 14
100,0 56 100,0
Estado Civil
Solteiro 3 37,5 7 29,2 4 40,0 7 50,0 21 37,5
Casado 3 37,5 15 62,5 6 60,0 6 42,9 30 53,6
Separado 1 12,5 2 8,3 0 0,0 0 0,0 3 5,4
Viúvo 1 12,5 0 0,0 0 0,0 1 7,1 2 3,6
Total 8 100,0 24 100,0 10 100,0 14
100,0 56 100,0
Religião
Sem religião 0 0,0 0 0,0 1 10,0 1 7,1 2 3,6
Católico 5 62,5 17 70,8 6 60,0 9 64,4 37 66,1
Pentecostal 3 37,5 7 29,2 1 10,0 3 21,4 14 25,0
Protestante 0 0,0 0 0,0 0 0,0 1 7,1 1 1,8
Espírita 0 0,0 0 0,0 2 20,0 0 0,0 2 3,6
Total 8 100,0 24 100,0 10 100,0 14
100,0 56 100,0
Escolaridade
Analfabeto 1 12,5 0 0,0 1 10,0 0 0,0 2 3,6
Básico 5 62,5 11 45,8 6 60,0 4 28,6 26 46,4
Fundamental 1 12,5 5 20,8 0 0,0 3 21,4 9 16,1
Médio 0 0,0 6 25,1 3 30,0 4 28,6 13 23,2
Superior 1 12,5 2 8,3 0 0,0 3 21,4 6 10,7
Total 8 100,0 24 100,0 10 100,0 14
100,0 56 100,0
57
O presente estudo configurou-se, portanto, como retrospectivo, no qual a amostra
dependeu da disponibilidade de pacientes com as condições desejadas e aliadas a assinatura
do termo de consentimento livre e esclarecido. Não foi possível, também, proceder ao
pareamento prévio da população estudada.
4.2. Local
Os procedimentos de extração do RNA e armazenagem do material obtido nas
necrópsias foi feito no Laboratório de Estrutura Sináptica do Departamento de Biologia
Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto –
USP.
A obtenção do cDNA, testes dos oligonucleotídeos e a quantificação relativa da
expressão dos mRNA foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular do
Departamento de Pediatria da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
4.3. Procedimentos
4.3.1. Extração do RNA
As amostras congeladas de tecido hipocampal foram homogeneizadas, sem
descongelamento prévio, em 1mL do reagente TRIZOL (Gibco BRL Life Technologies,
USA) e processadas segundo as especificações do protocolo do fabricante. Fase de separação:
foram adicionados 200µL de clorofórmio para cada 1 mL de TRIZOL utilizado; após agitação
por 15 segundos, os tubos foram centrifugados a 12.000 rpm por 15 minutos à 4ºC; a fase
aquosa foi coletada e transferida para um novo tubo. Fase de precipitação: adicionados ao
58
tubo 500µL de álcool isopropílico e mantido à –20ºC por 18 horas; centrifugação a 12.000
rpm por 10 minutos à 4ºC com precipitação do “pellet” no fundo do tubo. Fase de lavagem:
foi desprezado o sobrenadante e o “pellet” foi lavado com 1mL de etanol 75%; centrifugação
à 7.500 rpm por 5 minutos à 4ºC; desprezo do sobrenadante, secagem do “pellet” em vácuo.
Fase de ressuspensão do RNA: o “pellet” foi diluído em 50µL de água tratada com DEPC. A
integridade do RNA foi, então, confirmada com eletroforese em gel de agarose.
4.3.2. Obtenção de cDNA
Os cDNAs utilizados neste trabalho foram obtidos utilizando-se o kit High Capacity®
(Applied Biossystems, CA, USA) seguindo-se as instruções do fabricante. A concentração
inicial de RNA utilizada foi de 1 µg.
4.3.3. Oligonucleotídeos
A introdução da tecnologia de real-time PCR no campo do diagnóstico molecular
simplificou, sem dúvida, a quantificação de ácidos nucléicos. Grandes quantidades de dados
podem ser geradas dentro de curto prazo. Apesar disto, o sucesso da aplicação do real-time
PCR depende de um entendimento claro dos problemas práticos (quantidade e qualidade do
mRNA, obtenção do cDNA com método que empregue número menor de reações para evitar
manuseio e risco de contaminação do material, uso de método padronizado de PCR, uso de
controles internos – housekeeping - para normalização, a obtenção de curvas padrão com
diluições seriadas para testar a eficiência do PCR, desenho do primer e tamanho do amplicon,
disponiblidade de equipamento apropriado) e cuidadosos desenho experimental (tipo de
estudo – diagnóstico clinico, análise de mutação, clonagem ou expressão; obtenção da
59
amostra; pareamento). A aplicação e a validação permanecem, assim, essenciais para a
medida quantitativa acurada da transcrição obtida no procedimento e pela precisão e
reprodutibilidade do real-time PCR (BUSTIN, 2000; 2002).
Para o nosso trabalho resolvemos optar pelo método TaqMan real time RT-PCR que
apresenta vantagem sobre o método SYBR Green pelo fato das sondas serem desenhadas e
previamente testadas pelo fabricante.
A seguir apresentamos esquema do método TaqMan real time RT-PCR (Figura 1).
Figura 1 - Esquema do método TaqMan real time RT-PCR. 1) Desnaturação da fita dupla do
DNA, separando-a em fitas simples. A desnaturação é necessária porque o DNA nas etapas
seguintes irá aderir à membrana e irá parear com a sonda. A técnica de TacMan envolve duas
sondas repórter que hibridizam especificamente para um dos dois alelos. Uma extremidade de
cada sonda está rotulada com um marcador fluorescente. Uma molécula extinga é unida a
outra extremidade da sonda. 2) Durante a reação de PCR a atividade inerente a 5’-nuclease da
PCR polimerase separa a sonda repórter que hibridiza perfeitamente ao DNA genômico. 3)
Esta separação libera o marcador fluorescente e o separa da molécula extinga, tornando a
fluorescência detectável.
Copyright 2006, TAKARA MIRUS BIO INC. (www.takarabiousa.com/html/PCR RTPCR
INTRO.html)
60
Os oligonucleotídeos utilizados neste trabalho foram obtidos da companhia Applied
Biosystems (CA, USA), juntamente com as respectivas sondas TaqMan
®
marcadas. Para os
genes alvos: receptor adrenérgico-α2A (AD2A - ID Hs00265081_s1), receptor adrenérgico-
α2C (AD2C - ID Hs01896125_s1), receptor dopaminérgico D2 (D2 - ID Hs00241436_m1),
receptor dopaminérgico D4 (D4 - ID Hs00609526_m1), receptor serotoninérgico 1A (5-
HT1A - ID Hs00265014_s1), receptor serotoninérgico 2A (5-HT2A - ID Hs00167241_m1),
receptor serotoninérgico 2C (5-HT2C - ID Hs00168365_m1) e receptor da substância P
(neurokinina-1 – NK1 - ID Hs00185530_m1) foi utilizada a sonda MGB com repórter FAM.
O controle endógeno (housekeeping) utilizado foi o gene hipoxantina fosforibosiltransferase
(HPRT - ID 4310890E), também obtido da companhia Applied Biosystems (CA, USA) sendo
utilizado para a detecção do mesmo o repórter VIC/ TAMRA.
Um normalizador é necessário para a interpretação das medidas quantitativas de
expressão dos mRNA em amostras de tecidos no sentido de corrigir dados da expressão para
diferenças no consumo celular e qualidade do RNA entre as amostras. Em muitas pesquisas
um controle endógeno (housekeeping) único é utilizado para tal. O gene hipoxantina
fosforibosiltransferase (HPRT) é expresso estruturalmente em baixos níveis na maioria dos
tecidos, mas, em níveis maiores no cérebro. Parece que diferentes interações de fatores
ligantes de DNA com o elemento regulador têm um papel crucial nesta expressão preferencial
cerebral do gene HPRT. O HPRT mostrou ser um dos melhores genes e alternativa econômica
para ser utilizado como controle endógeno em diferentes estudos de comparações entre
diversos controles endógenos (RINCÓN-LIMAS et al., 1995; JIRALERSPONG; PATEL,
1996; VANDESOMPELE et al., 2002; KOK et al., 2005).
Para testar a eficiência dos primers, foram feitas curvas padrão com pelo menos 3
diluições amplificadas com eficiência superior a 95%. As diluições seriadas forneceram uma
curva de calibração com informações sobre a fluorescência total emitida versus o ciclo da
61
PCR. Por meio das curvas de calibração de cada gene em estudo, foi fornecida pelo aparelho
de real time PCR uma curva padrão representada por uma relação linear entre ciclo da PCR a
partir do qual a quantidade de fluorescência torna-se significativamente detectável (Ct) versus
o logaritmo da quantidade de cDNA sugerida manualmente.
A partir das curvas-padrão obtidas para cada gene estudado, foram matematicamente
estimados os valores do slope e do intercept. O slope (m)
da curva padrão descreve a
eficiência do PCR, e é definido pela equação
Ct=m (log Q)+c, onde Ct é o ciclo limiar
(representando o numero do ciclo da PCR no qual a fluorescência foi detectável sobre um
limiar arbitrário), Q é o numero da cópia inicial e c é o intercept no eixo y. Somente foram
consideradas curvas-padrão satisfatórias para referência aquelas com slope entre 3,1 e 3,9. Em
todos os nossos primers o slope da curva padrão ficou perto de 3,3 (Tabela 3), indicando
máxima eficiência de amplificação PCR.
Tabela 3 – Valores do slope e do intercept dos primers
PRIMER
slope
intercept
AD2A 3,39 29,9
AD2C 3,49 26,5
D2 3,55 29,0
D4 3,67 28,1
5-HT1A 3,59 23,0
5-HT2A 3,77 24,7
5-HT2C 3,81 25,4
NK1 3,63 28,7
HPRT 3,69 24,6
A figura 2, a seguir, mostra a curva padrão construída para o gene 5-HT1A que serve
como exemplo das curvas obtidas para os demais genes estudados.
62
A
B
Figura 2 – A: Curva-padrão para o gene 5-HT1A. B: Reta obtida pela curva-padrão para o
gene 5-HT1A. Curva e reta fornecidas pelo aparelho ABI 7500 Real-Time PCR System
(Applied Biosystems, CA, USA).
63
4.3.4. Quantificação da expressão dos mRNA
A quantificação da expressão do mRNA foi realizada a partir da análise da técnica de
reação em cadeia da polimerase em tempo real, quantitativa (RQ-PCR), em equipamento ABI
PRISM
TM
7500 Sequence Detection Systems (Applied Biosystems, CA, USA). A amplificação
foi realizada de acordo com as instruções do fabricante em um volume final de 20µL de
reação. A reação continha 10µL do Master Mix, 1µL de sonda e 9µL de cDNA (a partir de
uma diluição de cDNA de 1:50 em água). Os parâmetros utilizados na reação de RQ-PCR
foram: desnaturação inicial a 95ºC por 10 minutos, seguidos por desnaturação 15 segundos a
95ºC e pareamento a 60ºC por 1 minuto por 40 ciclos.
O método de análise dos dados foi a quantificação relativa, calculado através de um
controle endógeno (hipoxantina fosforibosiltransferase - HPRT) e um calibrador (hipocampo
de necropsia não utilizado como controle). As diferenças nas quantidades de cDNA de cada
reação, ou seja, o nível de expressão dos mRNA para cada amostra, foram normalizadas em
relação ao nível de expressão do gene HPRT (controle endógeno). Esta normalização foi
obtida através da divisão dos valores obtidos para cada gene por aquele obtido para o gene
HPRT (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001; APPLIED BIOSYSTEMS, 1997; SCRIDELI et al.,
2003). Para todas as amostras experimentais, a quantidade limiar e determinada da curva
padrão foi dividida pela quantidade limiar do calibrador. Assim, o calibrador tornou-se a
amostra “1 x” e todas as outras quantidades são expressas como uma diferença relativa de n-
vezes do calibrador (SCRIDELI et al., 2003).
64
4.4. Análise estatística
Seguindo as diretrizes propostas para análises estatísticas, iniciamos pelo exame dos
dados disponíveis com a análise exploratória dos mesmos. A análise exploratória de dados
emprega uma variedade de técnicas gráficas e quantitativas, visando maximizar a obtenção de
informações ocultas na sua estrutura, descoberta de variáveis importantes nas suas tendências
e variação, detecção de comportamentos anômalos do fenômeno, teste da validade das
hipóteses assumidas e escolha de modelos e determinação de número otimizado de variáveis.
Os softwares atualmente disponíveis possibilitam que esta técnica constitua-se em uma
ferramenta para descobrir quais tendências, relações e padrões poderiam estar ocultos em uma
coleção de dados analisados. Depois deste procedimento, decidimos sobre qual técnica aplicar
para equacionar o problema e procuramos a equação que melhor os representasse e
interpretasse.
Assim, na análise estatística dos dados colhidos comparamos os grupos Controle,
Epilepsia, Psicose e Depressão nas variáveis de interesse representadas pelos receptores
adrenérgicos (AD2A e AD2C), dopaminérgicos (D2 e D4), serotoninérgicos (5-HT1A, 5-
HT2A e 5-HT2C) e de substância P (NK1). Estas foram controladas pelas seguintes variáveis
de controle selecionadas a partir das informações obtidas na revisão da literatura: Diagnóstico
Patológico (ou Lateralidade) (SHERWIN et al., 1982; KOHLER et al., 1999; GLOSSER et
al., 2000; HARDEN; GOLDSTEIN, 2002; QUIGG et al., 2003; WRENCH; WILSON;
BLADIN, 2004), Subtipo de Diagnóstico Psiquiátrico (SACHDEV, 1998; ADACHI et al.,
2007; SACHDEV, 2007), Droga Antiepiléptica (ADACHI et al., 2002; HARDEN;
GOLDSTEIN, 2002; KANNER, 2003b; YUDOFSKY; HALES,2006; MULA; SANDER,
2007; SACHDEV, 2007), Freqüência das Crises (KANNER; BALBANOV, 2002;
MARCHETTI; CREMONESE; CASTRO, 2004), Tempo de epilepsia (ANDO et al., 2004),
65
Diagnóstico de RNM (HARDEN; GOLDSTEIN, 2002; SHAW et al., 2004) e Hemisfério
Dominante (SHERWIN et al., 1982).
Para atingir o objetivo proposto foi utilizado um modelo de ANOVA (nível de
significância considerado se p < 0,05; MONTGOMERY, 2000; PAGANO; GAVREAU,
2004), dado por:
ijjij
y
εµπζτγϕδβη
+++++++++=
,
em que y
ij
é a observação da variável resposta em questão, para o i-ésimo indivíduo, no j-ésimo
grupo;
η
é o intercepto;
j
β
é o efeito do i-ésimo grupo;
δ
é o efeito médio do Diagnóstico
Patológico (ou Lateralidade);
ϕ
é o efeito médio do Subtipo de Diagnóstico Psiquiátrico;
γ
é o efeito médio da Droga Antiepiléptica;
τ
é efeito médio do Tempo de Epilepsia;
ζ
é o
efeito das Freqüências das Crises;
π
é o efeito do Diagnóstico de RNM;
µ
é o efeito do
Hemisfério Dominante e
ij
ε
é o erro associado com pressuposição de ter uma distribuição
N(0, σ
2
).
Neste modelo de ANOVA o teste foi feito com atenção no resíduo, compreendido
como a diferença entre o valor real e o que foi predito (ajustado) pelo modelo. Desta forma, o
teste não foi feito na variável resposta e, conseqüentemente, os testes de normalidade e de
homogeneidade de variância não foram necessários. Para atender os pressupostos residuais
foram utilizadas transformações logarítmicas que representaram uma mudança na escala,
preservando a magnitude dos dados (MONTGOMERY, 2000; PAGANO; GAVREAU,
2004).
Quando verificadas possíveis diferenças entre os grupos, o pós-teste de Tukey (nível
de significância considerado se p < 0,05) foi aplicado. Utilizou-se o procedimento PROC
66
GLM do software SAS 9.0 na análise (MONTGOMERY, 2000; SAS Institute Inc., 2002;
PAGANO; GAVREAU, 2004).
4.5. Aspectos éticos
O projeto de pesquisa foi analisado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HC-FMRP-
USP, em sua 216ª Reunião Ordinária realizada em 05/12/2005, e enquadrado na categoria
APROVADO, de acordo com o Processo HCRP nº 15174/2005 (APÊNDICE C).
4.6. Recursos financeiros
Os recursos financeiros foram disponibilizados do projeto FAPESP do orientador
desta tese, Prof. Dr. Jorge Eduardo Moreira, intitulado “Preservação da ultra-estrutura
sináptica mantendo a qualidade antigênica para imunolocalização de receptores pós-sinápticos
e mecanoproteínas” (FAPESP 2003/03953-7).
67
5. Resultados
Os dados diagnósticos por grupo são apresentados na tabela (Tabela 4) seguinte.
Tabela 4 – Dados diagnósticos por grupo
Grupo
Variável
Epilepsia Psicose Depressão Total
Tempo de Epilepsia (anos)
Média 27 31 27
Desvio Padrão 9 14 15
Mínimo 9 11 5
Máximo 44 58 52
n % n % n % n %
Tipo de crises
CPS 22 91,6 8 80,0 12 85,7 42 87,4
CPC 1 4,2 1 10,0 0 0,0 2 4,2
CPSim com Generalização 1 4,2 1 10,0 0 0,0 2 4,2
CPSim+CPC 0 0,0 0 0,0 2 14,3 2 4,2
Total 24 100,0 10 100,0 14 100,0 48 100,0
Freqüência das Crises
Sem crises 0 0,0 0 0,0 1 7,1 1 2,1
Diária 2 8,4 2 20,0 4 28,6 8 16,7
Semanal 11 45,8 3 30,0 4 28,6 18 37,5
Quinzenal 4 16,6 0 0,0 0 0,0 4 8,3
Mensal 6 25,0 5 50,0 5 35,7 16 33,3
> Mensal 1 4,2 0 0,0 0 0,0 1 2,1
Total 24 100,0 10 100,0 14 100,0 48 100,0
Hemisfério Dominante
Sim 9 37,4 2 20,0 3 21,4 14 29,2
Não 6 25,0 1 10,0 4 28,6 11 22,9
Rebaixamento Cognitivo
Difuso
7
29,2
4
40,0
3
21,4
14
29,2
Cognitivo Normal 2 8,4 3 30,0 4 28,6 9 18,8
Total 24 100,0 10 100,0 14 100,0 48 100,0
Dominância Motora
Destro 22 91,6 9 90,0 12 85,8 43 89,6
Sinistromano 2 8,4 1 10,0 1 7,1 4 8,3
Ambidestro 0 0,0 0 0,0 1 7,1 1 2,1
Total 24 100,0 10 100,0 14 100,0 48 100,0
Diagnóstico de RNM
EMTE 11 45,8 7 70,0 7 50,0 25 52,1
EMTD 11 45,8 3 30,0 7 50,0 21 43,7
EMTB 2 8,4 0 0,0 0 0,0 2 4,2
Total 24 100,0 10 100,0 14 100,0 48 100,0
Diagnóstico de SPECT
Sem exame 12 50,0 4 40,0 6 42,9 22 45,8
Aumento Esquerdo 4 16,6 5 50,0 3 21,4 12 25,0
Aumento Direito 7 29,2 1 10,0 3 21,4 11 22,9
Aumento Bilateral 1 4,2 0 0,0 2 14,3 3 6,3
Total 24 100,0 10 100,0 14 100,0 48 100,0
Diagnóstico Patológico
EHE 12 50,0 7 70,0 7 50,0 26 54,2
EHD 12 50,0 3 30,0 7 50,0 22 45,8
Total 24 100,0 10 100,0 14 100,0 48 100,0
RNM: EMTE (esclerose mesial temporal esquerda); EMTD (direita); EMTB (bilateral). Diagnóstico Patológico:
EHE (esclerose hipocampal esquerda); EHD (direita). Tipo de crises: CPS (crises parciais sintomáticas); CPC
(crises parciais complexas); CPSim com Generalização (crises parciais simples com generalização).
68
A distribuição dos diagnósticos patológicos em relação ao de epilepsia e aos de
subtipo psiquiátrico foram as apresentadas na Tabela 5.
Tabela 5 – Diagnóstico Patológico em relação ao de epilepsia e aos de subtipo psiquiátrico
Psicose Depressão PQU
PATO
Epilepsia
Pós-ictal Interictal Passado Atual Recorrente
n % n % n % n % n % n %
EHE
12 50,0 4 40,0 3 30,0 4 28,6 1 7,1 1 7,1
EHD
12 50,0 1 10,0 2 20,0 5 35,7 1 7,1 2 14,3
Total
24 100,0 5 50,0 5 50,0 9 64,3 2 14,3 3 21,4
PATO (Diagnóstico Patológico): EHE - Esclerose Hipocampal Esquerda; EHD - Esclerose Hipocampal Direita.
PQU (Subtipo psiquiátrico): psicose pós-ictal; psicose interictal; episódio depressivo maior passado; episódio
depressivo maior atual; distúrbio depressivo maior recorrente.
No grupo controle não houve diferenças entre os sujeitos (intragrupais) na
quantificação da expressão dos mRNA dos receptores estudados, apesar de 3 destes pacientes
estarem usando medicamentos (bloqueadores adrenérgicos) por ocasião do óbito.
Os tipos de medicamentos em uso até o dia anterior a cirurgia, estão representados na
tabela (Tabela 6) a seguir.
Tabela 6 – Classe de medicamento em uso, até o dia anterior a cirurgia, por diagnóstico de
epilepsia e por subtipo de diagnóstico psiquiátrico
Psicose Depressão Grupo
Medicamento
Epilepsia
Pós-ictal Interictal Passado Atual Recorrente
n % n % n % n % n % n %
Droga
Antiepiléptica
24 100,0 5 100,0 4 80,0 9 100,0 2 100,0 3 100,0
Benzodiazepínico
20 83,3 5 100,0 5 100,0 5 55,5 1 50,0 3 100,0
Antipsicótico
0 0,0 1 20,0 2 40,0 0 0,0 0 0,0 1 33,3
Antidepressivo
0 0,0 0 0,0 1 20,0 0 0,0 2 100,0 0 0,0
Quando submetida ao tratamento cirúrgico a quase totalidade dos pacientes estava em
uso de medicamento antiepiléptico. Apenas 1 paciente com psicose interictal associada a
epilepsia não fazia tratamento com medicamento antiepiléptico. Quanto aos
benzodiazepínicos, 39 dos sujeitos vinham em uso, enquanto que 4 do grupo de epilepsia, 4
com história de depressão no passado e 1 com episódio depressivo atual não estavam
ingerindo esta classe de substância. Apenas 4 pacientes usavam antipsicótico: 1 com historia
69
de psicose pós-ictal, 2 com interictal (portanto, 3 de um total de 10 com diagnóstico de
psicose) e 1 com depressão recorrente. Estavam em uso de antidepressivos 3 pacientes, sendo
1 do subgrupo com psicose interictal e dois com história de episódio depressivo atual
(portanto, 2 de um total de 14 com diagnósticos de depressão).
A distribuição das diferentes substâncias antiepilépticas em uso pelos sujeitos do
estudo é mostrada na tabela (Tabela 7) seguinte.
Tabela 7 – Distribuição das diferentes substâncias antiepilépticas em uso pelos sujeitos
Psicose Depressão Grupo
Medicamento
Epilepsia
Pós-ictal
Interictal
Passado
Atual
Recorrente
n % n % n % n % n % n %
Nenhum 0 0,0 0 0,0 1 20,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0
CBZ 19 79,2 2 40,0 3 30,0 3 33,4 1 50,0 2 66,6
DFH 4 16,6 2 40,0 1 20,0 1 11,1 0 0,0 1 33,4
FNB 0 0,0 1 20,0 0 0 1 11,1 0 0,0 0 0,0
CBZ e DFH 1 4,2 0 0,0 0 0 0 0,0 0 0,0 0 0,0
DFH e FNB 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 1 50,0 0 0,0
CBZ e FNB 0 0,0 0 0,0 0 0 2 22,2 0 0,0 0 0,0
CBZ e LAM 0 0,0 0 0,0 0 0 1 11,1 0 0,0 0 0,0
CBZ e TOP 0 0,0 0 0,0 0 0 1 11,1 0 0,0 0 0,0
Total 24 100,0 5 100,0 5 100,0 9 100,0 2 100,0 3 100,0
CBZ – Carbamazepina; DFH – Difenilohidantoína; FNB – Fenobarbital; LAM – Lamotrigina; TOP –
Topiramato.
A carbamazepina (CBZ) isolada ou em associação a outra droga antiepiléptica foi o
medicamento mais utilizado pelos pacientes do estudo: 30 estavam em uso de CBZ em
monoterapia e 5 em associações com outros antiepilépticos (2 com fenobarbital, 1 com
difenilhidantoina, 1 com lamotrigina e 1 com topiramato). A difenilhidantoína (DFH), vem
em seguida, com 9 esquemas de monoterapia e 2 combinadas (1 com CBZ e 1 com
fenobarbital). O fenobarbital (FNB) foi tratamento isolado em dois pacientes e em associação
em 3 (2 com CBZ e 1 com DFH). Os demais medicamentos antiepilépticos que 2 dos sujeitos
usavam usando até a cirurgia, lamotrigina (LAM) e topiramato (TOP), estavam associados a
CBZ.
70
5.1. Análise Estatística
Apresentamos a seguir a análise exploratória com a descrição das variáveis de
interesse na Tabela 8 e os gráficos de dispersão destas (Figuras 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10).
Tabela 8 - Descrição das variáveis de interesse
Variável
1
Grupo
2
Média
Desvio
Padrão
Coef. de
Variação
1º Quartil
Mediana 3º Quartil
AD2A
1 2,29 3,00 130,86 0,85 1,16 2,49
2 48,10 148,30 308,62 3,40 10,60 22,50
3 6,09 8,98 147,28 0,11 4,24 6,10
4 10,60 16,14 152,24 0,86 4,60 15,16
AD2C 1 4,24 3,62 85,21 0,99 3,30 8,00
2 33,50 64,20 191,50 4,80 10,70 31,30
3 3,48 2,69 77,17 0,60 4,27 5,76
4 16,58 33,48 201,97 0,94 4,46 15,07
D2 1 1,50 0,42 28,16 1,15 1,40 1,79
2 4,33 3,82 88,24 2,02 2,54 5,27
3 2,70 1,37 50,84 1,73 2,20 4,19
4 6,97 10,03 143,93 1,93 3,39 7,99
D4 1 1,16 0,84 72,95 0,36 0,91 2,10
2 6,62 8,81 133,05 1,02 3,51 9,27
3 5,56 11,23 202,15 0,49 1,52 5,05
4 3,57 7,13 199,43 0,50 1,47 3,23
5-HT1A 1 1,19 0,84 70,23 0,28 1,21 1,88
2 2,53 3,80 150,13 0,54 1,02 2,93
3 0,69 0,74 107,58 0,22 0,37 1,01
4 1,98 1,94 98,07 0,69 1,14 3,03
5-HT2A 1 1,66 0,38 22,65 1,42 1,67 1,96
2 3,37 4,05 120,20 1,19 1,79 3,54
3 1,49 1,00 66,92 0,76 1,13 2,35
4 3,80 3,02 79,48 1,73 2,42 6,03
5-HT2C 1 2,85 2,03 71,37 0,47 3,38 4,56
2 1,21 1,09 90,36 0,50 0,94 1,47
3 0,90 0,68 75,49 0,42 0,63 1,40
4 1,74 1,67 96,04 0,82 1,00 2,20
NK1 1 1,15 0,78 67,57 0,57 1,04 1,73
2 2,15 2,27 105,87 0,64 1,13 3,23
3 1,44 0,99 68,57 0,76 1,13 2,11
4 3,27 3,05 93,10 1,14 1,94 4,94
1. Variável: AD2A - receptor adrenérgico-α2A; AD2C - receptor adrenérgico-α2C; D2 - receptor
dopaminérgico; D4 - receptor dopaminérgico
4; 5-HT1A - receptor serotoninérgico 1A; 5-HT2A - receptor
serotoninérgico 2A; 5-HT2C - receptor serotoninérgico 2C; NK1 – receptor da substância P (neurokinina-1).
Grupo: 1 – Controle; 2 – Epilepsia; 3 – Psicose; 4 – Depressão.
71
4321
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Grupo
AD2A
Grupo: 1 – Controle; 2 – Epilepsia; 3 – Psicose; 4 – Depressão. AD2A - receptor adrenérgico-α2A: resultado da
quantificação relativa calculada em relação ao controle endógeno (HPRT) e ao calibrador (hipocampo de
necropsia não utilizado como controle), dado como uma diferença relativa de expressão do mRNA de n-vezes do
calibrador para cada amostra (valor sem unidade de medida).
Figura 3 - Gráfico de dispersão da variável AD2A
4321
350
300
250
200
150
100
50
0
Grupo
AD2C
Grupo: 1 – Controle; 2 – Epilepsia; 3 – Psicose; 4 – Depressão. AD2C - receptor adrenérgico-α2C: resultado da
quantificação relativa calculada em relação ao controle endógeno (HPRT) e ao calibrador (hipocampo de
necropsia não utilizado como controle), dado como uma diferença relativa de expressão do mRNA de n-vezes do
calibrador para cada amostra (valor sem unidade de medida).
Figura 4 - Gráfico de dispersão da variável AD2C
72
4321
40
30
20
10
0
Grupo
D2
Grupo: 1 – Controle; 2 – Epilepsia; 3 – Psicose; 4 – Depressão. D2 - receptor dopaminérgico D2: resultado da
quantificação relativa calculada em relação ao controle endógeno (HPRT) e ao calibrador (hipocampo de
necropsia não utilizado como controle), dado como uma diferença relativa de expressão do mRNA de n-vezes do
calibrador para cada amostra (valor sem unidade de medida).
Figura 5 - Gráfico de dispersão da variável D2
4321
40
30
20
10
0
Grupo
D4
Grupo: 1 – Controle; 2 – Epilepsia; 3 – Psicose; 4 – Depressão. D4 - receptor dopaminérgico D4: resultado da
quantificação relativa calculada em relação ao controle endógeno (HPRT) e ao calibrador (hipocampo de
necropsia não utilizado como controle), dado como uma diferença relativa de expressão do mRNA de n-vezes do
calibrador para cada amostra (valor sem unidade de medida).
Figura 6 - Gráfico de dispersão da variável D4
73
4321
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Grupo
SER1A
Grupo: 1 – Controle; 2 – Epilepsia; 3 – Psicose; 4 – Depressão. SER1A - receptor serotoninérgico 1A: resultado
da quantificação relativa calculada em relação ao controle endógeno (HPRT) e ao calibrador (hipocampo de
necropsia não utilizado como controle), dado como uma diferença relativa de expressão do mRNA de n-vezes do
calibrador para cada amostra (valor sem unidade de medida).
Figura 7 - Gráfico de dispersão da variável 5-HT1A
4321
20
15
10
5
0
Grupo
SER2A
Grupo: 1 – Controle; 2 – Epilepsia; 3 – Psicose; 4 – Depressão. SER2A - receptor serotoninérgico 2A: resultado
da quantificação relativa calculada em relação ao controle endógeno (HPRT) e ao calibrador (hipocampo de
necropsia não utilizado como controle), dado como uma diferença relativa de expressão do mRNA de n-vezes do
calibrador para cada amostra (valor sem unidade de medida).
Figura 8 - Gráfico de dispersão da variável 5-HT2A
74
4321
6
5
4
3
2
1
0
Grupo
SER2C
Grupo: 1 – Controle; 2 – Epilepsia; 3 – Psicose; 4 – Depressão. SER2C - receptor serotoninérgico 2C: resultado
da quantificação relativa calculada em relação ao controle endógeno (HPRT) e ao calibrador (hipocampo de
necropsia não utilizado como controle), dado como uma diferença relativa de expressão do mRNA de n-vezes do
calibrador para cada amostra (valor sem unidade de medida).
Figura 9 - Gráfico de dispersão da variável 5-HT2C
4321
10
8
6
4
2
0
Grupo
TACR1
Grupo: 1 – Controle; 2 – Epilepsia; 3 – Psicose; 4 – Depressão. TACR1 - receptor da substância P
(neurokinina-1 – NK1): resultado da quantificação relativa calculada em relação ao controle endógeno (HPRT) e
ao calibrador (hipocampo de necropsia não utilizado como controle), dado como uma diferença relativa de
expressão do mRNA de n-vezes do calibrador para cada amostra (valor sem unidade de medida).
Figura 10 - Gráfico de dispersão da variável NK1
75
Como podemos perceber na Tabela 8 e nos gráficos de dispersão das variáveis de
interesse (Figuras 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10), os valores da quantificação da expressão dos mRNA
dos receptores que estudamos mostraram uma distribuição com outliers. Um outlier é
caracterizado pela sua relação de distanciamento com as restantes observações que fazem
parte da amostra e pode ser designado, também, por observação "anormal", contaminante,
estranha, extrema ou aberrante. No nosso estudo estes resultados foram repetidos e, quando
confirmados, mantidos por corresponderem a dados de diferentes amostras (sujeitos) quanto a
expressão de mRNA dos receptores estudados. Diante desta análise inicial foi, então, proposto
e aplicado o modelo de ANOVA descrito no método, seguido pelo pós-teste de Tukey nas
situações em que foram verificadas diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05) entre
os grupos. Estes resultados estão apresentados em tabelas para cada variável de interesse
controlada pelas variáveis de controle.
Os achados da expressão do mRNA referentes ao receptor adrenérgico-α2A (AD2A)
submetidos ao modelo de ANOVA proposto mostraram diferença estatisticamente
significativa entre os grupos (p = 0,0059) com a variável de controle Droga Antiepiléptica
tendo resultado significativo (p = 0,0374), conforme Tabela 9.
Tabela 9 - Resultados do modelo de ANOVA – AD2A
Fonte de Variação Valor de F p-valor
Grupo 5.00 0.0059
Diagnóstico Patológico 0.10 0.7528
Subtipo de Diagnóstico
Psiquiátrico
0.28 0.8363
Droga Antiepiléptica 2.90 0.0374
Freqüência das Crises 1.42 0.2435
Tempo de epilepsia 0.00 0.9749
Diagnóstico de RNM 0.86 0.4319
Hemisfério Dominante 1.04 0.3885
76
Ao aplicarmos o pós-teste de Tukey para os achados da expressão do mRNA
referentes ao receptor AD2A, encontramos diferença estatisticamente significativa de maior
expressão do AD2A no grupo Epilepsia comparado com o grupo Controle e de maior
expressão do mesmo receptor no grupo Epilepsia comparado ao grupo Psicose (Tabela 10).
Tabela 10 - Comparações entre os grupos pelo pós-teste de Tukey – AD2A
Comparações
Diferença
entre médias
Intervalo de
Confiança 95%
Significância
1 - 2 -1.9745 -3.7072
-0.2419 ***
1 - 3 -0.1679 -2.1811
1.8452
1 - 4 -1.0087 -2.9158
0.8984
2 - 3 1.8066 0.2092 3.4040 ***
2 - 4 0.9658 -0.4957
2.4273
3 - 4 -0.8408 -2.6259
0.9443
Grupos: 1 – Controle; 2 – Epilepsia; 3 – Psicose; 4 – Depressão.
Para os resultados da expressão do mRNA referentes ao receptor adrenérgico-α2C
(AD2C) submetidos ao modelo de ANOVA proposto houve diferença estatisticamente
significativa entre os grupos (p = 0,0016) sem resultado significativo, no entanto, para as
variáveis de controle estudadas, conforme possível visualizar na Tabela 11.
Tabela 11 - Resultados do modelo de ANOVA – AD2C
Fonte de Variação Valor de F p-valor
Grupo 6.33 0.0016
Diagnóstico Patológico 0.09 0.7662
Subtipo de Diagnóstico
Psiquiátrico
0.18 0.9076
Droga Antiepiléptica 1.05 0.3982
Freqüência das Crises 1.14 0.3597
Tempo de epilepsia 0.26 0.6129
Diagnóstico de RNM 1.16 0.3252
Hemisfério Dominante 2.39 0.0860
77
O pós-teste de Tukey para os resultados da expressão do mRNA referentes ao receptor
AD2C mostrou diferença estatisticamente significativa na maior expressão do mRNA do
grupo Epilepsia em comparação com o grupo Controle e com o grupo Psicose (Tabela 12).
Tabela 12 - Comparações entre os grupos pelo pós-teste de Tukey – AD2C
Comparações
Diferença
entre médias
Intervalo de
Confiança 95% Significância
1 - 2 -1.8653 -3.1951
-0.5356 ***
1 - 3 -0.2498 -1.9256
1.4259
1 - 4 -0.9021 -2.3649
0.5606
2 - 3 1.6155 0.1732 3.0578 ***
2 - 4 0.9632 -0.2248
2.1513
3 - 4 -0.6523 -2.2180
0.9135
Grupos: 1 – Controle; 2 – Epilepsia; 3 – Psicose; 4 – Depressão.
A análise de ANOVA, segundo o modelo utilizado neste estudo, dos dados da
expressão do mRNA referentes ao receptor dopaminérgico D2 evidenciou diferença
estatisticamente significativa entre os grupos (p = 0,0125) com resultado significativo para as
variáveis de controle Subtipo de Diagnóstico Psiquiátrico (p = 0,0239) e Freqüência das
Crises (p = 0,0381) (Tabela 13).
Tabela 13 - Resultados do modelo de ANOVA – D2
Fonte de Variação Valor de F
p-valor
Grupo 4.22 0.0125
Diagnóstico Patológico 0.48 0.4915
Subtipo de Diagnóstico
Psiquiátrico
3.58 0.0239
Droga Antiepiléptica 0.79 0.5398
Freqüência das Crises 2.69 0.0381
Tempo de epilepsia 1.59 0.2166
Diagnóstico de RNM 0.43 0.6555
Hemisfério Dominante 0.26 0.8565
No pós-teste de Tukey referente ao receptor D2 encontramos diferença
estatisticamente significativa entre a maior expressão do grupo de pacientes com Epilepsia
78
comparado com o grupo Controle e a maior expressão do grupo de pacientes com Depressão
comparado com o grupo Controle (Tabela 14).
Tabela 14 - Comparações entre os grupos pelo pós-teste de Tukey – D2
Comparações
Diferença
entre médias
Intervalo de
Confiança 95% Significância
1 - 2 -0.9879 -1.7988
-0.1770 ***
1 - 3 -0.4956 -1.3635
0.3723
1 - 4 -0.8124 -1.5594
-0.0654 ***
2 - 3 0.4923 -0.2653
1.2499
2 - 4 0.1755 -0.4398
0.7908
3 - 4 -0.3168 -1.0055
0.3718
Grupos: 1 – Controle; 2 – Epilepsia; 3 – Psicose; 4 – Depressão.
Na análise pelo modelo de ANOVA proposto dos achados da expressão do mRNA
referentes ao receptor dopaminérgico D4 não houve evidência de diferença estatisticamente
significativa entre os grupos (p = 0,0501) (Tabela 15). Neste caso, o pós-teste de Tukey não
foi aplicado.
Tabela 15 - Resultados do modelo de ANOVA – D4
Fonte de Variação Valor de F p-valor
Grupo 2.91 0.0501
Diagnóstico Patológico 0.04 0.8353
Subtipo de Diagnóstico
Psiquiátrico
0.38 0.7660
Droga Antiepiléptica 1.62 0.1951
Freqüência das Crises 1.39 0.2536
Tempo de epilepsia 0.18 0.6726
Diagnóstico de RNM 1.33 0.2785
Hemisfério Dominante 0.79 0.5101
A análise pelo modelo de ANOVA proposto dos achados da expressão do mRNA
referentes ao receptor serotoninérgico 2A (5-HT2A) mostraram diferença estatisticamente
significativa entre os grupos (p = 0,0273) com a variável de controle Freqüência das Crises
tendo resultado significativo (p = 0, 0433), conforme Tabela 16.
79
Tabela 16 - Resultados do modelo de ANOVA – 5-HT2A
Fonte de Variação Valor de F
p-valor
Grupo 3.46 0.0273
Diagnóstico Patológico 0.01 0.9310
Subtipo de Diagnóstico
Psiquiátrico
0.53 0.6668
Droga Antiepiléptica 0.89 0.4831
Freqüência das Crises 2.60 0.0433
Tempo de epilepsia 0.08 0.7789
Diagnóstico de RNM 0.35 0.7053
Hemisfério Dominante 1.53 0.2243
Ao aplicarmos o pós-teste de Tukey para os achados da expressão do mRNA
referentes ao receptor 5-HT2A, encontramos diferença estatisticamente significativa entre a
maior expressão no grupo de pacientes com Epilepsia comparado com o grupo Controle
(Tabela 17).
Tabela 17 - Comparações entre os grupos pelo pós-teste de Tukey – 5-HT2A
Comparações
Diferença
entre médias
Intervalo de
Confiança 95%
Significância
1 - 2 -0.8757 -1.6579
-0.0935 ***
1 - 3 -0.2684 -1.1645
0.6278
1 - 4 -0.5811 -1.2922
0.1299
2 - 3 0.6073 -0.2300
1.4446
2 - 4 0.2946 -0.3408
0.9299
3 - 4 -0.3128 -1.0840
0.4585
Grupos: 1 – Controle; 2 – Epilepsia; 3 – Psicose; 4 – Depressão.
Os achados da expressão do mRNA referentes aos receptores serotoninérgicos 1A e
2C (5-HT1A e 5-HT2C) e de substancia P (NK1) submetidos a análise pelo modelo de
ANOVA proposto não mostraram evidência de diferença estatisticamente significativa entre
os grupos (p = 0,0980; p = 0.7142; e p = 0.1664; respectivamente), conforme apresentado nas
Tabela 18, 19, 20. Para estas variáveis o pós-teste de Tukey não foi aplicado.
80
Tabela 18 - Resultados do modelo de ANOVA – 5-HT1A
Fonte de Variação Valor de F
p-valor
Grupo 2.28 0.0980
Diagnóstico Patológico 0.17 0.6853
Subtipo de Diagnóstico
Psiquiátrico
0.41 0.7462
Droga Antiepiléptica 0.73 0.5806
Freqüência das Crises 0.57 0.7248
Tempo de epilepsia 0.01 0.9280
Diagnóstico de RNM 0.08 0.9263
Hemisfério Dominante 0.79 0.5068
Tabela 19 - Resultados do modelo de ANOVA – 5-HT2C
Fonte de Variação Valor de F
p-valor
Grupo 0.46 0.7142
Diagnóstico Patológico 0.00 0.9983
Subtipo de Diagnóstico
Psiquiátrico
0.10 0.9590
Droga Antiepiléptica 0.74 0.5692
Freqüência das Crises 0.85 0.5246
Tempo de epilepsia 0.04 0.8402
Diagnóstico de RNM 0.01 0.9885
Hemisfério Dominante 0.33 0.8054
Tabela 20 - Resultados do modelo de ANOVA – NK1
Fonte de Variação Valor de F
p-valor
Grupo 1.80 0.1664
Diagnóstico Patológico 1.50 0.2293
Subtipo de Diagnóstico
Psiquiátrico
0.27 0.8494
Droga Antiepiléptica 1.20 0.3277
Freqüência das Crises 0.80 0.5610
Tempo de epilepsia 0.84 0.3655
Diagnóstico de RNM 0.03 0.9737
Hemisfério Dominante 0.99 0.4088
81
6. DISCUSSÃO
O tratamento cirúrgico de pacientes com ELT resistentes ao tratamento clínico
proporciona material para a realização de estudos científicos com esta população. Os
benefícios dos progressos científicos alcançados com pesquisas na epilepsia podem ser úteis,
também, para outros distúrbios do sistema nervoso central. A presente tese de doutorado
figura como uma das possibilidades de utilização do tecido cerebral ressecado em lobectomia
por ELT refratária, na qual procuramos averiguar as possíveis diferenças de expressão do
mRNA de receptores relacionados à epilepsia, psicose e depressão em pessoas com ELT com
e sem tais comorbidades.
Neste trabalho utilizamos, portanto, o método TacMan real time PCR para quantificar
de forma relativa a expressão do mRNA de subtipos dos receptores de dopamina, serotonina,
noradrenalina e substância P em hipocampos cirurgicamente removidos de pacientes com
ELT com ou sem comorbidade psicótica ou depressiva. O hipocampo tem papel importante na
patogênese da ELT, depressão e esquizofrenia (MIGUEL; RAUCH; LECKMAN, 1998;
MELTZER, 1999; KANDEL; SCHWARTZ; JESSEL, 2000; HOYER; HANNON;
GRAEME, 2002; LÓPEZ-FIGUEROA et al., 2004;). A maioria dos estudos moleculares
acerca dos receptores de dopamina, serotonina, noradrenalina e substância P no cérebro
humano foi, contudo, realizada com amostras de tecido post-mortem (LAHTI; ROBERTS;
TAMMINGA, 1995; MATSUMOTO et al., 1995; PRIMUS et al., 1997; KHAN et. al., 1998;
LAHTI et al., 1998; STEFANIS et al., 1998; DE LA GARZA; MADRAS, 2000; JAMALI et
al., 2006; NUTT, 2006). Assim, o uso de amostras cirurgicamente removidas em cirurgias
como a da ELT provê uma oportunidade única para estudar tecido do sistema nervoso central
humano não tumoral e não proveniente de necrópsia (JAMALI et al., 2006).
82
Cabe ressaltar que embora seja sabido que a esclerose hipocampal, que
frequentemente ocorre na ELT e que foi o diagnóstico patológico de todos os nossos sujeitos,
pode prejudicar a identificação de defeitos mais sutis no nível molecular, todas as nossas
amostras demonstraram valores de expressão para o mRNA dos diferentes subtipos de
receptores de neurotransmissores estudados, possibilitando que as diferenças entre esta
expressão fosse analisada.
Os achados referentes às variáveis de controle Diagnóstico Patológico (ou
Lateralidade), Tempo de epilepsia, Diagnóstico de RNM e Hemisfério Dominante não
apresentaram resultados significativos para a quantificação relativa da expressão do mRNA
dos receptores pesquisados. As demais variáveis de controle (Subtipo de Diagnóstico
Psiquiátrico, Droga Antiepiléptica e Freqüência das Crises) mostraram significância para os
resultados da quantificação relativa da expressão de mRNA de alguns dos receptores que
estudamos.
A seguir apresentamos a discussão acerca das diferenças encontradas na quantificação
relativa da expressão dos mRNA nos diferentes grupos, controlados pelas variáveis de
controle, em separado para cada tipo de receptor estudado.
6.1. Receptores adrenérgicos
Os achados da expressão do mRNA referentes ao receptor adrenérgico-α2A (AD2A)
mostraram diferença significativa entre os grupos (p = 0,0059 - Tabela 9) com resultado
significativo para a variável de controle Droga Antiepiléptica (p = 0,0374 - Tabela 9). No pós-
teste de Tukey (Tabela 10) encontramos diferença estatisticamente significativa de maior
expressão do AD2A no grupo Epilepsia comparado com o grupo Controle e de maior
expressão do mesmo receptor no grupo Epilepsia comparado ao grupo Psicose.
83
As diferenças significativas referentes à variável de controle Droga Antiepiléptica
foram, provavelmente, influenciadas pelas substâncias antiepilépticos em uso pelos pacientes,
em especial a carbamazepina (CBZ) responsável pela monoterapia de 30 (62,5%) pacientes
dentre os 48 estudados, sendo 19 (79,2%) do grupo Epilepsia, 6 (42,8%) do grupo Depressão
e 5 (50,0%) do grupo Psicose. Foi, também, utilizada em associação com difenilhidantoína,
fenobarbital, lamotrigina ou topiramato em outros 5 pacientes, sendo 1 (4,2%) do grupo
Epilepsia e 4 (28,5%) do grupo Depressão (Tabela 7).
As substâncias antiepilépticas produzem seu efeito ativando os receptores α-
adrenérgicos (PONCELET et al., 1984; POST et al., 1985; PONCELET et al., 1986;
FISCHER; MÜLLER, 1988; RUTECKI, 1995; VUCKOVIC et al., 2006), entre os quais os
α2A no hipocampo (SZOT et al., 2004; JURGENS et al., 2005). Entre os medicamentos
antiepilépticos nos quais o sistema noradrenérgico pode ter um papel predominante na
modulação de sua eficiência encontramos o fenobarbital, a feintoína e a carbamazepina
(PONCELET et al., 1984; POST et al., 1985; PONCELET et al., 1986; FISCHER; MÜLLER,
1988; VUCKOVIC et al., 2006). Portanto, a ativação dos receptores α2A no hipocampo pelas
substâncias antiepilépticas pode explicar nossos achados de maior expressão do mRNA de
AD2A dos pacientes do grupo Epilepsia comparados ao grupo Controle.
Quanto ao receptor adrenérgico-α2C (AD2C), os resultados mostraram diferença
estatisticamente significativa entre os grupos (p = 0,0016 – Tabela 11), mas, não mostraram
significância estatística para as variáveis de controle. O pós-teste de Tukey (Tabela 12)
mostrou significância estatística na maior expressão do mRNA do grupo Epilepsia em
comparação com o grupo Controle e com o grupo Psicose.
A localização do receptor adrenérgico-α2C em áreas cerebrais envolvidas no processo
de informações sensoriais e no controle de atividades motoras e emocionais relacionadas pode
explicar nossos resultados de maior expressão do mRNA do mesmo nas amostras de
84
hipocampos de pacientes com ELT sem comorbidade psiquiátrica quando comparados com o
grupo de hipocampos de necrópsias e de pacientes com psicose associada. Portando, podemos
sugerir que este receptor parece ser de importância nos mecanismos patológicos relacionados
à ELT e que merece ser melhor estudado (HOLMBERG; FAGELHOLM; SCHEININ, 2003;
SZOT et al., 2005)
As diferenças de expressão do mRNA dos receptores AD2A e AD2C pode ter sido
menor no grupo Psicose comparado ao grupo Epilepsia, devido aos mecanismos adrenérgicos
relacionados aos quadros psicóticos. A observação de pacientes psicóticos em tratamento com
bloqueadores adrenérgicos permitiu que Blum e Atsmon (1976) concluíssem que a psicose
pode acontecer quando a atividade plena do sistema α-adrenérgico e β-adrenérgico está muito
alta ou muito baixa, ou quando o balanceamento está afetado. Substâncias antagonistas dos
receptores α1A e α2A têm efeito antipsicótico (BOLONNA et al., 2000). Estudo de Adachi et
al. (2007) com 58 pacientes epilépticos mostrou que o uso de medicamentos antipsicóticos
alterou a duração das crises epilépticas, mas, não foi verificada associação com variáveis
como a freqüência das crises e o uso de drogas antiepilépticas. Dos pacientes do grupo
Psicose, no nosso estudo, apenas 3 (30,0%) estavam em tratamento antipsicótico, os 3 com o
medicamento Haloperidol, uma butirofenona que bolqueia receptores α-adrenérgicos. Os
resultados do nosso estudo parecem indicar, portanto, que os mecanismos adrenérgicos
ligados a psicose são diferentes dos relacionados aos da epilepsia.
Os pacientes com distúrbio depressivo maior têm maior densidade de receptor α2A-
adrenérgico
que controles normais (GURGUIS et al., 1999). Esta diferença, entre o grupo
Depressão e Controle não foi, contudo, significativa no nosso estudo. Não houve, também,
diferença estatisticamente significativa quando comparadas as expressões do AD2A e do
AD2C entre os grupos Epilepsia e Depressão. Uma possível explicação para este achado pode
ser a semelhança entre a depressão e a epilepsia no que diz respeito ao déficit comum
85
noradrenérgico, confirmado pela eficácia das drogas antiepilépticas no manejo de distúrbios
afetivos, incluindo episódios depressivos (GONZÁLES-MAESO et al., 2002; GIORGI et al.,
2004; MULA; SANDER, 2007).
Portanto, nossos resultados das análises da expressão do mRNA dos receptores
adrenérgicos α2A e α2C, onde não houve diferença significativa entre os grupos Epilepsia e
Depressão, parecem estar em concordância com o que foi sugerido na literatura sobre uma
possível relação bi-direcional entre epilepsia e depressão ou a presença de um mecanismo
patogênico comum que poderia facilitar a ocorrência de um na presença do outro (KANNER;
BALBANOV, 2002; KANNER, 2003b).
6.2. Receptores dopaminérgicos
No que se refere à expressão do mRNA do receptor dopaminérgico D4 não
encontramos diferença estatisticamente significativa entre os grupos por nós estudados
(Tabela 15).
Na análise dos dados da expressão do mRNA do receptor D2 evidenciamos diferença
significativa entre os grupos (p = 0,0125 - Tabela 13) com resultado significativo para as
variáveis de controle Subtipo de Diagnóstico Psiquiátrico (p = 0,0239 - Tabela 13) e
Freqüência das Crises (p = 0,0381 - Tabela 13). O pós-teste de Tukey (Tabela 14) mostrou
significância estatística na maior expressão do mRNA de D2 no grupo Epilepsia comparado
com o grupo Controle e na maior expressão do mRNA de D2 no grupo Depressão comparado
com o grupo Controle.
A participação do receptor D2 na patofisiologia da ELT sugerida em outros estudos
(CLINCKERS et al., 2004; CLINCKERS et al., 2005a; CLINCKERS et al., 2005b; BOZZI;
BORRELLI, 2006; WERHAHN et al. 2006) pode ter influenciado os resultados de maior
86
expressão do mRNA do receptor D2 que encontramos no grupo Epilepsia comparado ao
Controle e permitem sugerir pesquisas futuras sobre este receptor, com amostras maiores, em
pessoas com ELT.
Nossos achados em relação à maior expressão do mRNA do receptor D2 em amostras
hipocampais do grupo Depressão comparado ao grupo Controle sugerem uma possível
participação deste receptor nos quadros depressivos comórbidos em indivíduos com ELT.
Dois sintomas essenciais da depressão, a anedonia e a desmotivação, têm o envolvimento dos
sistemas dopaminérgicos mesocorticais e mesolímbicos (FRIEDMAN et al., 2007). Nutt et al.
(2006) sugerem o estudo da letargia e da fadiga, incluindo não somente o retardo motor, mas,
a falha e a lentidão da memória, atenção e concentração, como áreas de interesse relacionadas
aos receptores dopaminérgicos na depressão e seu tratamento. De acordo com Nutt (2006) há
algumas evidências do efeito antidepressivo dos agentes dopaminérgicos e evidências claras
do efeito dos agentes serotoninérgicos e noradrenérgicos. Desta forma, os nossos resultados
podem corroborar a hipótese do estudo de Friedman et al. (2007) de que o monitoramento da
dinâmica dopaminérgica límbica pode ser útil para o desenvolvimento de novas substâncias
antidepressivas.
Não houve diferenças nas comparações entre os grupos Epilepsia e Depressão quanto
a expressão dos mRNA dos receptores dopaminérgicos pesquisados. Este achado parece
indicar que o papel dos receptores de dopamina na epilepsia e na depressão pode ser devido a
um mecanismo patológico comum ou uma relação bi-direcional entre estes distúrbios
(KANNER; BALBANOV, 2002; KANNER, 2003b). Estudos em animais mostram que a
atividade diminuída de dopamina, entre outros neurotransmissores, facilita o processo de
excitação do foco epiléptico, piora a freqüência e severidade das crises epilépticas e pode ser
revertida ou bloqueada por medicamentos antidepressivos (KANNER; BALBANOV, 2002).
87
As diferenças relacionadas à variável de controle Subtipo de Diagnóstico Psiquiátrico
(Tabela 14) de maior expressão do mRNA de D2 no grupo Depressão em comparação ao
grupo Controle parecem ter sido conseqüentes a maior expressão do mRNA de D2 no
subgrupo de sujeitos com diagnóstico de distúrbio depressivo maior recorrente em relação aos
com diagnóstico de episódio depressivo maior passado e destes em relação aos com episodio
depressivo maior atual. Parece, pois, que as diferenças dentro do subgrupo de pacientes com
depressão foi devida a cronicidade da doença e a quantidade de episódios depressivos
apresentados pelos sujeitos.
Quanto maior a freqüência das crises epilépticas, ou seja, diárias ou semanais, maior a
expressão do D2 nos sujeitos do grupo Epilepsia em comparação com o Controle e do grupo
Depressão em relação ao Controle. Uma possibilidade de explicação para o nosso achado é
encontrada em estudos em modelos animais onde foi visto que a freqüência e severidade das
crises epilépticas podem ser pioradas em conseqüência da atividade diminuída de dopamina,
serotonina, noradrenalina, e GABA, a qual pode, por sua vez, ser revertida ou bloqueada por
medicamentos antidepressivos (KANNER; BALBANOV, 2002).
Estes achados nos levam a refletir acerca do que poderia explicá-los a partir da
observação de um psiquiatra clínico. Uma maior freqüência de crises é, provavelmente,
acompanhada de maior sofrimento do paciente acometido. As pessoas que sofrem de
depressão tendem a manter a capacidade perceptiva e de contato com a realidade e, muitas
vezes, podem vir a intensificar seus sintomas depressivos se acontecerem alterações no
ambiente que as cerca ou em suas capacidades, incluindo piora ou aparecimento de outras
doenças (comorbidades). Os pacientes psicóticos, por sua vez, tendem a ter prejuízos em sua
capacidade de percepção ou mesmo de contato com a realidade, chegando a estados de total
alienação sobre si mesmos e sobre a realidade que os cerca. Desta forma, podemos levantar
como provável hipótese para explicar a não diferença encontrada no que se refere à variável
88
freqüência das crises na expressão do mRNA de D2 entre o grupo Psicose em comparação
com o grupo Controle, a provável limitação imposta pela doença sobre a capacidade
perceptiva e de contato com sua própria realidade, ou seja, a sua provável menor vivência dos
sofrimentos. Os pacientes dos grupos Epilepsia e Depressão, por outro lado, por
possivelmente não apresentarem alterações nas capacidades mencionadas, sofrem com o
aumento de freqüência das crises epilépticas o que poderia ser refletido nos resultados da
expressão do mRNA de D2 nestes grupos.
6.3. Receptores serotoninérgicos
Na nossa pesquisa, não encontramos evidência de diferença significativa entre os
grupos de pacientes com ELT com ou sem comorbidade psiquiátrica (Epilepsia, Psicose e
Depressão) e os controles necropsiais (Controle) na quantificação da expressão do mRNA dos
receptores 5-HT1A (p = 0,0980 - Tabela 18) e 5-HT2C (p = 0.7142 - Tabela 19).
Os resultados da nossa pesquisa acerca da expressão de mRNA dos receptores
serotoninérgicos 5-HT1A e 5-HT2C sem diferenças entre os grupos estudados, podem ser
compreendidos pelos achados de literatura que implicam estes receptores em uma variedade
de distúrbios, inclusive a epilepsia, a depressão e a psicose. No que se refere ao receptor 5-
HT1A, estudos de neuroimagem obtiveram evidências de que o potencial ligante de 5-HT1A
pode estar relacionado a incidência aumentada de depressão em pacientes com epilepsia
(TOCZEK et al., 2003; SAVIC et al., 2004; GIOVACCHINI et al., 2005; ITO et al., 2007;
THEODORE et al., 2007). Os achados destes autores sugeriram que a depressão pode
contribuir na redução da neurotransmissão serotoninérgica no foco epiléptico hipocampal. A
epilepsia e a depressão podem, portanto, ter processo patofisiológico comum quanto ao
receptor 5-HT1A (THEODORE et al., 2007). Este receptor está envolvido na modulação da
89
emoção e, portanto, implicado na patogênese de distúrbios de ansiedade, depressão, humor,
alimentar, comportamento alucinatório e esquizofrenia (ITO; HALLDIN; FARDE, 1999;
MELTZER, 1999; PASSCHIER; WAARDE, 2001; MELTZER et al., 2003). O receptor 5-
HT2C tem sido implicado em uma variedade de condições, inclusive na epilepsia, esclerose
lateral amiotrófica, enxaqueca, disfunção erétil, obesidade, ansiedade, distúrbio obsessivo-
compulsivo, depressão e esquizofrenia (MELTZER, 1999; MELTZER et al., 2003;
GIORGETTI; TECOTT, 2004; ISAAC, 2005; DUNLOP et al., 2006; THODA; NOMURA;
NOMURA, 2006; BAGDY et al., 2007; SERGEEVA; AMBERGER; HAAS, 2007).
Nossos resultados indicam a participação dos receptores de serotonina 5-HT2A nos
quadros de ELT, visto que sua expressão mostrou diferença significativa, com p = 0,0273
(Tabela 16), sendo maior a expressão do mRNA de 5-HT2A no grupo Epilepsia em
comparação ao grupo Controle (Tabela 17). A variável de controle Freqüência das Crises
mostrou resultado significativo (p = 0,0433 - Tabela 16), ou seja, quanto maior foi a
freqüência das crises epilépticas (diárias ou semanais), maior foi a expressão do mRNA do 5-
HT2A. Estes achados corroboram o que encontramos na literatura acerca do receptor 5-HT2A
e seu papel na epilepsia. A diminuição em seus níveis na zona epiléptica pode diminuir a
atividade de medicamentos antiepilépticos, o que confirma sua possível participação na
resistência farmacológica associada à ELT e confirma o 5-HT2A como importante alvo para o
tratamento da epilepsia (SULLIVAN et al., 2004; JAMALI et al., 2006).
6.4. Receptores de substância P
Os achados do presente trabalho acerca da expressão do mRNA do receptor de
substância P (NK1) em pacientes com ELT com ou sem comorbidade psiquiátrica (grupos
90
Epilepsia, Psicose e Depressão) e grupo Controle não mostraram evidência de diferença
significativa entre os grupos (p = 0.1664 - Tabela 20).
Estudos com a substância P mostraram que a mesma parece facilitar a atividade
epiléptica no hipocampo (ZACHRISSON; LINDEFORS; BRENE, 1998; TÓTH et al., 2007).
Antagonistas do receptor NK1 mostraram propriedades antiepilépticas (ZACHRISSON;
LINDEFORS; BRENE, 1998; WASTERLAIN et al., 2000). Pesquisas têm demonstrado o
papel potencial da substância P na esquizofrenia mostrando aumento de concentração ou de
imunoreatividade da mesma em áreas como o córtex pré-frontal de pacientes esquizofrênicos
(TAKEUCHI et al., 1988; SHIRAYAMA et al., 2000; TOONEY; CRAWTER; CHAHL,
2001). A relação da substância P com os distúrbios depressivos tem sido demonstrada, desde
a resposta antidepressiva de antagonistas da mesma, a localização anatômica dos receptores
NK1 em áreas cerebrais relevantes na regulação do humor (locus coeruleus, estriado ventral,
córtex visual, hipocampo e núcleos amigdalóides), até a sua participação na mediação do
sistema serotoninérgico aumentando a transmissão serotoninérgica no hipocampo, uma
propriedade comum aos tratamentos antidepressivos (SANTARELLI et al., 2002; BLIER et
al., 2004). Este perfil da substância P na epilepsia, na depressão e na esquizofrenia pode ser a
justificativa para não termos encontrado diferenças entre os grupos estudados quanto a
expressão do mRNA do receptor NK1, o que sugere semelhanças ou mesmo menor
participação do NK1 na patofisiologia dos distúrbios estudados.
91
6.5. Limites do estudo
Nesta parte do trabalho apresentamos nossa avaliação crítica sobre as limitações do
método que utilizamos e indicações de como estas poderiam ser solucionadas.
A primeira consideração a ser feita diz respeito aos limites de um estudo retrospectivo.
Na nossa pesquisa o número de sujeitos dependeu da disponibilidade de amostras de
hipocampos armazenadas no banco de amostras de tecido cerebral do HC-FMRP-USP de
pacientes com as condições desejadas, aliadas a assinatura do termo de consentimento livre e
esclarecido. Este procedimento acabou nos impossibilitando de fazer o pareamento prévio da
população estudada.
Outro aspecto a ser considerado refere-se à identificação de tipos celulares. O método
que escolhemos, real time PCR, permite a detecção de mRNA extraídos de tecidos, mas não
permite observar a distribuição dos transcritos ou DNA em um tipo de população celular ou
em áreas de tecidos adultos ou em desenvolvimento. Uma alternativa poderia ser a utilização
de um punch para a retirada do material de regiões (núcleos) especificas do hipocampo. O
punch é um instrumento cirúrgico de corte, especialmente projetado para a ralização de
colheita de material que consta de um cabo ou empunhadura e de um tubo cilíndrico que
termina em superfície cortante. Desta forma, a borda do punch é circular com diferentes
variações de diâmetro.
A reação de hibridização in situ (ISH) poderia ser, também, uma opção neste sentido,
pois, permite localizar com precisão no tecido, parafinado ou congelado, um gene específico
ou seus transcritos. A visualização do padrão de expressão de um gene é interessante para a
análise da sua função, e mesmo como marcador da diferenciação celular ou do estímulo
fisiológico recebido pelas células.
92
Outra opção poderia ser a técnica de imunohistoquímica (IHQ), cujo mecanismo
básico é o reconhecimento do antígeno (moléculas teciduais) por um anticorpo associado a
diversos tipos de processos de visualização. Atualmente há disponibilidade de grande número
de anticorpos para uso em tecidos fixados em formol e incluídos em blocos parafina,
permitindo o estudo de blocos arquivados por longos períodos. O uso simultâneo da reação de
ISH com a IHQ, por sua vez, ampliou o campo de aplicação da reação de hibridização in situ,
uma vez que torna possível identificar dois diferentes mRNA ou um gene e seu produto.
Portanto, a visualização da distribuição dos receptores dos neurotransmissores estudados
poderia ser feita mediante microscopia de luz mediante imunofluorescência.
A microscopia eletrônica com técnica de imunogold (imunocitoquímica com ouro
coloidal) seria outra técnica que poderia ser empregada no intuito de permitir a identificação e
visualização das sinapses neuronais e da distribuição dos receptores de interesse do nosso
estudo, possibilitando localizá-los como estruturas pré ou pós-sinápticas. Para esta técnica, no
entanto, seria necessária a utilização de tecido fresco e rapidamente congelado e processado.
O controle endógeno que escolhemos, o HPRT, expresso em níveis baixos em todos os
tecidos, incluindo as células da glia, é expresso em níveis maiores nos neurônios do cérebro
humano (RINCÓN-LIMAS et al., 1995). No entanto, a perda neuronal na ELT pode ser
compensada por reposição glial, ou seja, a expressão do HPRT pode ter acontecido em função
de sua presença em células gliais que compensaram possíveis perdas neuronais nas amostras
estudadas. Apesar disto, resolvemos optar pelo HPRT como controle endógeno único com
base em resultados de estudos de comparações entre diversos controles endógenos
(VANDESOMPELE et al., 2002; KOK et al., 2005).
Outras estruturas cerebrais do sistema límbico, além do hipocampo, constituem-se
como possibilidades para novas pesquisas. Entre estas, a amígdala que, de acordo com a
literatura, tem papel na manifestação de respostas afetivas, apresenta expressão de receptores
93
de adrenalina, dopamina, serotonina e substancia P, e que é, também, parcialmente ressecada
nas cirurgias de ELT.
O uso simultâneo de recursos de neuroimagem com ligantes específicos para os
diferentes receptores estudados poderia ter acrescentado informações interessantes acerca de
sua distribuição no hipocampo e mesmo em outras estruturas cerebrais dos sujeitos da
pesquisa que podem estar, também, implicadas na ELT e comorbidades estudadas. No
entanto, como o estudo foi retrospectivo, este procedimento não foi possível.
94
7. CONCLUSÕES
Os resultados apresentados sugerem que a quantificação relativa do mRNA dos
receptores adrenérgicos, serotoninérgicos e dopaminérgicos, mediante o método TacMan real
time PCR, em pacientes com ELT com ou sem história comórbida de distúrbios psiquiátricos
pode ser um importante foco para a melhor compreensão do papel destes receptores na
epilepsia e nos transtornos psiquiátricos associados.
A substância P, segundo dados da literatura, parece ter papel na epilepsia, na
depressão e na esquizofrenia. A expressão do mRNA de seu receptor no nosso estudo não
evidenciou diferenças significativas entre os grupos pesquisados, sugerindo semelhanças ou
mesmo menor participação do NK1 na patofisiologia dos distúrbios estudados.
As variáveis de controle que mostraram resultados significativos em alguns dos nossos
achados foram: uso de Droga Antiepiléptica – maior expressão do mRNA de AD2A dos
pacientes do grupo Epilepsia comparados ao grupo Controle e ao grupo Psicose,
possivelmente devido a ativação dos receptores α2A no hipocampo pelas substâncias
antiepilépticas e possíveis mecanismos adrenérgicos diferentes relacionados a psicose e a
epilepsia; Subtipo de Diagnóstico Psiquiátrico - maior expressão do mRNA de D2 no grupo
Depressão em comparação ao grupo Controle parecem ter sido conseqüentes cronicidade da
doença e a quantidade de episódios depressivos apresentados pelos sujeitos; Freqüência das
Crises - quanto maior foi a freqüência das crises, maior foi a expressão do mRNA do receptor
dopaminérgico D2 nos sujeitos do grupo Epilepsia em comparação com o Controle e do grupo
Depressão em relação ao Controle; e quanto maior foi a freqüência das crises, maior foi a
expressão do mRNA do receptor serotoninérgico 5-HT2A entre os sujeitos do grupo Epilepsia
comparados ao grupo Controle.
95
As demais variáveis de controle: Diagnóstico Patológico (ou Lateralidade), Tempo de
epilepsia, Diagnóstico de RNM e Hemisfério Dominante não apresentaram resultados
significativos para a quantificação relativa da expressão do mRNA dos receptores
pesquisados.
Para futuros trabalhos científicos com amostras de diferentes estruturas cerebrais do
sistema límbico humano, entre as quais o hipocampo e a amígdala, provenientes de tratamento
cirúrgico de ELT sugerimos que as mesmas sejam feitas de forma prospectiva para
possibilitar a utilização de diferentes métodos e técnicas de forma complementar. Desta
forma, propomos o estudo especifico das regiões das estruturas de interesse com a utilização
de um punch para a retirada do material; a realização de estudos com TacMan real time PCR
para quantificação relativa de mRNA de receptores adrenérgicos, dopaminérgicos,
serotoninérgicos e de substância P; a associação da técnica de imunohistoquímica (IHQ), de
hibridização in situ (ISH) e ou de microscopia eletrônica com imunogold para identificar,
visualizar e localizar a distribuição destes diferentes receptores.
E, no sentido de complementar e integrar os achados moleculares, estruturais e ultra-
estruturais, sugerimos a utilização de recursos de neuroimagem com ligantes específicos para
os diferentes receptores estudados na mesma amostra para obter informações acerca da
distribuição destes receptores nas estruturas cerebrais em estudo e demais que possam estar,
também, implicadas na ELT e comorbidades estudadas
96
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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113
APÊNDICE A
Ribeirão Preto, 04 de novembro de 2005.
Ilmo. Prof. Dr. SÉRGIO PEREIRA DA CUNHA
Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Universidade de São Paulo
Viemos por meio desta solicitar a dispensa de preenchimento de Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido referente ao projeto de pesquisa intitulado Estudo de neurotransmissores
relacionados à depressão e psicose em amostras de cérebro humano de pacientes submetidos à
cirurgia por epilepsia de lobo temporal, visto que o material que será utilizado neste estudo já
dispõe do referido termo assinado pelos doadores. A fonte do material será o Banco de Amostras de
Tecido Cerebral do Laboratório de Investigação em Epilepsia (HCRP 9370/2003, coordenado pelo
Prof. Dr. João Pereira Leite) e o Banco de Amostras de Tecido Cerebral (córtex, amígdala e
hipocampo) ressecado durante cirurgia de epilepsia e de tecido tumoral cerebral (HCRP
7645/1999, aprovado em 17/08/2005, coordenado pelo Prof. Dr. Carlos Gilberto Carlotti Jr).
Sem mais para o momento,
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
"CAMPUS" DE RIBEIRÃO PRETO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Av. Bandeirantes, nº 3900 - Ribeirão Preto - SP
CEP 14049-900 - Telefone: (16) 3602 3013
Fax (16) 3633-1786
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos
Prof. Dr. JORGE EDUARDO MOREIRA
Orientador
Departamento de Biologia Celular e Molecular e
Bioagentes Patogênicos
FMRP – USP
Prof. Dr. CARLOS GILBERTO CARLOTTI Jr
Departamento de Cirurgia e Anatomia – FMRP – USP
Coordenador do Banco de Amostras de Tecido Cerebral
(córtex, amígdala e hipocampo) ressecado durante
cirurgia de epilepsia e de tecido tumoral cerebral (HCRP
7645/1999,
aprovado em 17/08/2005).
EDSON ARTHUR SCHERER
Pesquisador
Aluno de doutorado em Patologia Experimental
FMRP - USP
Prof. Dr. JOÃO PEREIRA LEITE
Departamento de Neurologia, Psiquiatria e
Psicologia Médica – FMRP – USP
Coordenador do Banco de Amostras de Tecido
Cerebral do Laboratório de Investigação em
Epilepsia (HCRP
9370/2003)
114
APÊNDICE B
Termo de Consentimento Pós-Informação
Prezado(a) Sr(a):
Estamos desenvolvendo a pesquisa “
Estudo de neurotransmissores relacionados à
depressão e psicose em amostras de cérebro humano de pacientes submetidos à cirurgia por
epilepsia de lobo temporal”.
Esta pesquisa esta sendo desenvolvida para revelar as possíveis alterações da expressão gênica
dos receptores dos nerotransmissores adrenérgicos, dopaminérgicos, serotoninérgicos e da substancia
P (relacionados à depressão e psicose) em fragmentos de hipocampos retirados de pessoas submetidas
ao tratamento cirúrgico para epilepsia de lobo temporal. Pretendemos obter um maior conhecimento
acerca da epilepsia e dos distúrbios psicóticos e depressivos associados, colaborando com seu
diagnóstico e tratamento. Para que possamos ter um parâmetro de comparação com os resultados que
obtivermos com estas amostras, necessitamos de fragmentos de hipocampos de pessoas que não
tenham tido epilepsia, psicose e depressão ao longo de suas vidas. Este grupo de pessoas será
denominado de grupo controle.
Durante as necropsias são retirados fragmentos de vários tecidos do corpo humano utilizados
em exames anátomo-patológicos para o estabelecimento de um diagnóstico definitivo da causa mortis
e das possíveis doenças associadas presentes na pessoa.
Assim, gostaríamos de contar com sua autorização para, no momento da necropsia de seu
familiar, remover um fragmento do hipocampo do mesmo, pois, este constituirá uma das amostras do
grupo controle desta pesquisa. A obtenção deste fragmento não interferira nos procedimentos de
necropsia. Ele será identificado com código formado por números e letras e, portanto, a privacidade e
identidade de seu familiar serão preservadas. A eventual publicação dos resultados, incluindo os
achados referentes aos doadores, será feita mantendo o anonimato de todos os pacientes envolvidos.
Consentimento Livre e Esclarecido
Eu, ___________________________________________________, _____ anos, RG. nº
________________ estou ciente das informações sobre a pesquisa na qual será utilizado um
fragmento do hipocampo do meu familiar
________________________________________________, por ocasião de sua necropsia.
Estou ciente de que a minha concordância em permitir a retirada deste material do meu familiar,
quando de sua necropsia, não me causará nenhum dano, risco ou ônus. Serão mantidos o sigilo e
anonimato das informações referentes a mim e ao meu familiar. Fui esclarecido, também, de que
não terei quaisquer benefícios ou direitos financeiros sobre os resultados decorrentes desta
pesquisa. A qualquer momento da realização da pesquisa, caso não seja mais de meu interesse,
poderei recusar a participação na mesma, sem prejuízo à minha pessoa.
Concordei, portanto, voluntariamente em autorizar a remoção, durante a necropsia do meu
familiar, do material necessário a este estudo, cujos resultados poderão ser publicados e/ou
apresentados com objetivo científico.
Assinatura: __________________________________________
Data: ________________
Pesquisador responsável: ___________________________________________
Dr Edson Arthur Scherer
Telefone para contato: (16) 3602-2430
115
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