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Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
ANA CARULINA GUIMARÃES BELCHIOR
ESTUDO DA INFLUÊNCIA DA APLICAÇÃO DO LASER DE BAIXA
POTÊNCIA ARSENIETO DE GÁLIO E ALUMÍNIO (660 nm) SOBRE A
RECUPERAÇÃO FUNCIONAL E MORFOLÓGICA DO NERVO CIÁTICO
DE RATOS APÓS LESÃO POR ESMAGAMENTO
São José dos Campos, SP
2006
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ANA CARULINA GUIMARÃES BELCHIOR
ESTUDO DA INFLUÊNCIA DA APLICAÇÃO DO LASER DE BAIXA
POTÊNCIA ARSENIETO DE GÁLIO E ALUMÍNIO (660 nm) SOBRE A
RECUPERAÇÃO FUNCIONAL E MORFOLÓGICA DO NERVO CIÁTICO
DE RATOS APÓS LESÃO POR ESMAGAMENTO
Influence of laser therapy (GaAsAl – 660 nm) on nerve regeneration after
compression lesion
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Bioengenharia da Universidade do Vale do Paraíba,
como complementação dos créditos necessários para
obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
Orientadora: Profa.Dra. Renata Amadei Nicolau
São José dos Campos, SP
2006
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Dedico
À minha saudosa mãe que nos momentos de desmotivação e desânimo sua
lembrança de perseverança e luta me inspiravam e ao meu pai que sempre me
proporcionou uma imagem de perseverança e sucesso, além de instigar os meus
sonhos
Agradecimentos
À minha orientadora Profa. Renata Amadei Nicolau, pela inspiração, auxílio, incentivo e
amizade. Sua sabedoria, humildade e profissionalismo são exemplos de sucesso para mim, além
de sua prestatividade e por estar presente em todos os momentos necessários.
Ao meu eterno professor, amigo e co-orientador, Prof. Paulo de Tarso Camillo de Carvalho, por
ter principalmente possibilitado a realização deste trabalho, desde o auxílio para a obtenção da
amostra, até a facilitação de uso dos laboratórios da Instituição que prezamos e respeitamos, a
Universidade para o Desenvolvimento do Estado e da Região do Pantanal – UNIDERP, Campo
Grande / MS.
À Profa. Iandara S. Silva pela imensa colaboração com a realização dos procedimentos cirúrgicos
e sua prestatividade, abdicando de momentos familiares para disponibilizar sua ajuda nesta
pesquisa.
Aos professores e colegas de trabalho que me substituíram nas semanas de aula para o
cumprimento dos créditos, principalmente o Prof. Rogério Padilha, que sempre se demonstrou
prestativo e amigo nestes momentos.
Ao professor e amigo, Augusto Ken Sakihama, que me incentivou na carreira cientifica.
Ao tio Mauro, tia Dilze, Tiago e Pedro, pelo carinho, acolhimento, prestatividade e amparo em
todos os momentos em que estive em São José dos Campos / SP. Vocês passaram a fazer parte da
minha família e vou ser eternamente grata pela colaboração.
Ao meu noivo, Filipe Abdalla dos Reis, que sempre me acompanhou nas aventuras, em particular
meu ingresso para aprimorar o conhecimento acadêmico. Gostaria de agradecer pela pessoa
alegre e extrovertida que você é, além do seu contagiamento.
À minha irmã, pelo amor e incentivo que sempre proporcionou, além de cuidar dos meus afazeres
pessoais enquanto estive ausente.
À minha madrasta, Marlene Dantas de Oliveira, pelo carinho e disponibilidade em ajudar quando
obstáculos apareceram no caminho.
A todos os professores, colegas e funcionários do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da
Universidade do Vale da Paraíba, que em algum momento solicitei informação e auxílio.
E principalmente a Deus, por ser grandioso o suficiente para deixar que os sonhos possam
tornar-se realidade.
"Cada pessoa que passa em nossa vida, passa sozinha,
é porque cada pessoa é única e nenhuma substitui a outra.
Cada pessoa que passa em nossa vida passa sozinha, e não nos deixa só,
porque deixa um pouco de si e leva um pouquinho de nós.
Essa é a mais bela responsabilidade da vida e a prova
de que as pessoas não se encontram por acaso”.
Charles Chaplin
ESTUDO DA INFLUÊNCIA DA APLICAÇÃO DO LASER DE BAIXA
POTÊNCIA ARSENIETO DE GÁLIO E ALUMÍNIO (660 nm) SOBRE A
RECUPERAÇÃO FUNCIONAL E MORFOLÓGICA DO NERVO CIÁTICO DE
RATOS APÓS LESÃO POR ESMAGAMENTO
RESUMO
As lesões nervosas periféricas podem resultar em perda ou diminuição de sensibilidade e/ou
motricidade no território inervado, ocasionando o comprometimento das atividades diárias.
Conseqüentemente, torna-se importante investigar o uso de instrumentos eletroterapêuticos nos
processos regenerativos, tal como a laserterapia, buscando a recuperação precoce destes
pacientes. Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a influência da aplicação do LBP
Arsenieto de Gálio e Alumínio (660 nm) sobre a recuperação funcional (IFC) e histomorfológica
do nervo ciático de ratos após lesão por esmagamento. Os nervos ciáticos de 12 ratos Wistar
foram submetidos à lesão por esmagamento e divididos em 2 grupos: controle e laser. Após a
lesão, utilizou-se o laser AsGaAl, 660 nm, 4 J/cm
2
, 26,3 mW, feixe de 0,63 cm
2
, em 3 pontos
eqüidistantes sobre a lesão, por 20 dias. Os dados da análise histomorfométrica e IFC foram
submetidos à análise estatística para obtenção das médias e desvios padrões e, em seguida,
aplicou-se a análise comparativa (ANOVA) entre o grupo controle e laser, para os diferentes dias
de coleta do IFC, enquanto as áreas de bainha de mielina obtidos nos dois grupos, foram
aplicados o teste t studant com nível de significância de 5% (p<0,05) para ambos os testes. A
comparação dos valores do IFC entre os dois grupos resultou numa diferença significativa apenas
entre o valor pré-lesão da laserterapia em relação ao 21° dia pós-operatório do grupo controle
(p<0,001). Na análise histomorfométrica das áreas de bainha de mielina obteve-se o valor de p =
0,46. Pode concluir que a utilização do LBP com Arsenieto de Gálio e Alumínio (660 nm) foi
positiva sobre a recuperação funcional, porém não propiciou mudanças significativas na área da
bainha de mielina quando avaliada histomorfometricamente, em nervo ciático de ratos após lesão
por esmagamento.
Palavras-chaves: Regeneração Nervosa / efeitos de radiação, Lasers / uso terapêutico, Terapia a
Laser de Baixa Intensidade.
INFLUENCE OF LASER THERAPY (GAASAL – 660 NM) ON NERVE
REGENERATION BEFORE COMPRESSION LESION
ABSTRACT
Background and Objectives: Peripheral nerve lesions may compromise individuals’ daily
activities. With the aim of accelerating the regenerative processes, the objective here was to study
the influence of applying GaAlAs laser (660 nm) on functional and histomorphological recovery
of the sciatic nerve in rats. Study Design/Materials and Methods: Twelve 12 Wistar rats were
subjected to crushing lesion on their sciatic nerve and were divided into two groups: placebo and
laser therapy. For the latter, GaAlAs laser was utilized (660 nm, 4 J/cm
2
, 26.3 mW and 0.63 cm
2
beam), at three equidistant points on the lesion, for 20 days. Results and Conclusions:
Comparison of the sciatic functional index (SFI) showed that there was a significant difference
only between the pre-lesion value of the laser therapy group and the 21
st
day after the operation
for the control group, while there was no statistical difference between the groups in the
histomorphometric analysis. It is concluded that the parameters and methods utilized demonstrate
positive results regarding the SFI, but do not bring significant changes with regard to nerve
morphometry over the time period evaluated.
Key-words: Nerve Regeneration / radiation effects, Lasers / therapeutic use, Laser Therapy, Low-
Level.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura
Página
1 Principais estruturas que formam o nervo periférico.
Fonte:http://www.msd-brazil.com/msd43/m_manual/mm_sec6_68.htm
adaptado por Belchior (2006)
4
2 Figura esquemática dos componentes participantes do canal de sódio:
Internodo e Nodo de Ranvier no nervo periférico.
5
3 Nódulos de Ranvier
Fonte: http://www.afh.bio.br/nervoso/nervoso1.asp
6
4 Composição do nervo periférico, observar em A) epineuro, B) perineuro
e C) endoneuro. Nervo incluído em parafina, corado com tetraóxido de
ósmio, aumento de 40x.
7
5 Desenho esquemático do feixe nervoso, observar em A) bainha de
mielina; B) axônio; C) endoneuro. Coloração Tetraóxido de ósmio.
Aumento 400X.
8
6 Célula de Schwann (azul) em nervo ciático de rato e núcleos (rosa).
Técnica de fluorescência.
Fonte: Radtke et al. (2005).
10
7 Tipos de lesões nervosas: A) neuropraxia, B) axoniotmese e C)
neurotmese.
12
8 Esquema da impressão em papel da pata de um rato normal com as
medidas ITS (espaço entre o segundo e quarto dedo), TS (espaço entre
o primeiro e quinto dedo), e PL (espaço entre o calcanhar e o terceiro
dedo).
22
9 Efeitos físicos da interação laser-tecido.
24
10 Coeficiente de absorção para alguns comprimentos de onda
Fonte: Cotton (2004)
25
11 Ilustração da extensão da incisão longitudinal na face lateral da coxa
direita após a tricotomia.
37
12 Foto do procedimento cirúrgico no momento em que era realizada a
lesão por esmagamento do nervo ciático com auxílio de pinça
38
hemostática
13 Aplicação da laserterapia sobre a lesão do nervo ciático, em 3 pontos
eqüidistantes, com auxílio de luva de borracha para contenção do
animal.
39
14 Passarela de marcha de madeira (5 x 7 x 42 cm) utilizada para a coleta
do IFC.
40
15 Figura esquemática da lâmina e as regiões dos 5 quadrantes avaliados
histomorfometricamente.
42
16 Imagem ilustrativa do programa Image-Pro Plus. Notar em A)
quadrante, B) 350 x 350, C) medida em µm e D) ferramenta perform
segmentation.
43
17 Imagem ilustrativa do programa Image-Pro Plus. Notar em A)
ferramenta count and measure objects , B) Meansure, C) Count, D)
Auto-classification, E) Statistics, F) Mean (média dos valores).
43
18 Valores expressos em média e desvio padrão do IFC dos grupos 1
(controle) e grupo 2 (laser) nos quatro dias de avaliação. * p < 0,001
45
19 Imagens histológicas do terceiro quadrante, onde A - B são imagens do
grupo controle, e C - D do grupo laser. Notar: Epineuro (Ep), Perineuro
(Pn), Endoneuro (Em) e a bainha de mielina (BhM).
46
LISTA DE TABELAS
Tabela
Apêndice
1 Valores individuais do IFC do grupo 1 (controle) e grupo 2 (laser)
nos quatro períodos de avaliação, com as respectivas médias e
desvios padrões. Notar a análise comparativa dos valores dos IFC
entre os diversos grupos, onde:
a
x
b
,
a
x
c
,
a
x
d
,
f
x
g
,
g
x
h
,
d
x
h
<
0,001;
e
x
f
< 0,01;
e
x
g
< 0,05 e demais comparações sem diferença
significativa.
1
2 Valores individuais da área de bainha de mielina nos 5 campos
analisados em cada amostra do grupo 1 (controle) após o 21° dia de
pós-operatório, com as respectivas médias e desvios padrões.
2
3 Valores individuais da área de bainha de mielina nos 5 campos
analisados em cada amostra do grupo 2 (laser) após o 21° dia de
pós-operatório, com as respectivas médias e desvios padrões.
3
4 Revisão da literatura sobre o efeito da laserterapia de baixa potência
na regeneração nervosa.
4
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% Porcentagem
°C Graus Celsius
µs Micro Segundos
ATP Adenosina Trifosfato
ATPase Enzima Adenosina Trifosfato
BDNF Brain-derived Neurotrophic Factor
Ca
+
Íon de Cálcio
ClO
-
Óxido de Cloro
cm Centímetros
cm
2
Centímetros Quadrados
CO
2
Dió xido de Carbono
Cu Cobre
DNA Ácido Desoxirribonucléico
GaAlAs Arsenieto de Gálio e Alumínio
GaAs Arsenieto de Gálio
GAP-43 Proteína-43 associada ao Crescimento
GDNF Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor
H
+
Íon de Hidrogênio
H
2
O
2
Peróxido de Hidrogênio
HeNe Hélio Neônio
IFC Índice Funcional do Ciático
IGF Insulin-like Growth Factor
ITS Espaço entre a Segunda e a Quarta Falange Distal
J Joule
J/cm
2
Joule por Centímetro Quadrado
K
+
Íon de Potássio
L Lombar
LBP Laserterapia de Baixa Potência
mg/Kg Miligrama por kilograma
MPa Mega Pascal
mW Mili Watt
Na
+
Íon de Sódio
NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
NGF Nerve Growth Factor
nm Nanômetros
NO Óxido Nítrico
ns Nano Segundos
NT Neurotrofinas
O
2
Oxigênio
p Nível de Significância
PGF Platelet-derived Growth Factor
PL Espaço entre a Borda Proximal do Pé e a Terceira Falange Distal
RNA Ácido Ribonucléico
SNC Sistema Nervoso Central
SNP Sistema Nervoso Periférico
TGF-ß Transforming Growth Factor ß
TS Espaço entre a Primeira e a Quinta Falange Distal
W Watt
W/cm
2
Watt por Centímetro Quadrado
Zn Zinco
SUMÁRIO
1. Introdução 01
2. Objetivos 03
3. Revisão da Literatura 04
3.1 Anatomia do nervo periférico e processo de reparação 04
3.2 Papel da bainha de mielina 08
3.3 Células de Schwann 09
3.4 Lâmina basal 10
3.5 Tipos de lesões 11
3.6 Processos decorrentes à lesão nervosa 13
3.7 Resposta do Corpo Celular 16
3.8 Brotamento 16
3.9 Modelos experimentais para o estudo da regeneração nervosa 18
3.10 Análise Morfométrica 19
3.11 Análise Funcional 20
3.12 Laser 22
3.12.1
Aspectos Gerais 22
3.12.2
Laser em Nervos Periféricos 30
4. Material e Métodos 36
4.1 Animais 36
4.2 Procedimento cirúrgico e terapia 36
4.2.1 Método Cirúrgico Geral 36
4.2.2 Aplicação do Laser Diodo Arsenieto de Gálio e Alumínio (GaAlAs) 38
4.2.3 Análise Funcional 39
4.2.4 Obtenção de Amostra e Análise Histológica 40
4.2.5 Análise Histomorfométrica 41
4.3 Forma de análise dos resultados 44
5. Resultados 45
5.1 Índice Funcional do Ciático (IFC) 45
5.2 Análise Histomorfométrica 46
6. Discussão 47
7. Conclusão 55
Referências 56
APÊNDICE A
APÊNDICE B
APÊNDICE C
APÊNDICE D
ANEXO
1
1. INTRODUÇÃO
O tratamento das lesões nervosas periféricas constitui um importante problema
funcional e, embora haja certa recuperação na maioria das lesões, ocorrem lentamente e de
forma incompleta (ROCHKIND; QUAKNINE, 1992).
Os nervos periféricos são altamente vulneráveis ao trauma, como esmagamento e
seccionamento. É estimada que a incidência anual das lesões traumáticas ocorra em mais de
500.000 pacientes em alguns países (RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ; NAVARRO, 2004)
e que 2,8% destes pacientes adquirem limitações vitalícias (NOBLE et al., 1998). Este fato
justifica o contínuo desenvolvimento de terapias as quais permitam reduzir o nível de lesão e
as limitações (MENDONÇA; BARBIERE; MAZZER, 2003; RASO et al., 2005).
A quantidade de lesão provocada depende do nervo específico envolvido, a magnitude
e o tipo de pressão exercida, além do tempo de duração da compressão (INSERRA; BLOCH;
TERRIS, 1998) e tem como resultados comuns após a lesão: degeneração axonial,
degeneração retrógrada dos neurônios correspondentes da medula espinhal seguidos de uma
regeneração muito lenta (ROCHKIND et al., 2001).
A lesão da estrutura nervosa resulta em perda ou diminuição de sensibilidade e/ou
motricidade no território inervado, ocasionando o comprometimento das atividades diárias
dos pacientes lesionados, sendo um fator determinante para o estabelecimento de objetivos
para a recuperação precoce dos mesmos (FERRIGNO et al., 2005).
A utilização de instrumentos eletroterapêuticos com finalidade regenerativa é prática
comum na fisioterapia. Têm sido empregadas estimulações elétricas (MENDONÇA;
BARBIERE; MAZZER, 2003), ultra-som (RASO et al., 2005) e laser de baixa potência
(LBP) a fim de acelerar os processos regenerativos, buscando restaurar a funcionalidade do
paciente.
2
O laser aplicado no processo de regeneração e recuperação funcional de lesões
nervosas periféricas começou a ser investigado na década de 70, havendo várias divergências
sobre os resultados obtidos até os dias de hoje (BASFORD, 1995).
Em 2005, Gigo-Benato, Geuna e Rochkind realizaram uma revisão da literatura sobre
a fototerapia no reparo do nervo periférico, verificando que o emprego do laser baseia-se em
vários comprimentos de ondas (632 – 904nm), tipos de lesões (esmagamento, neurorrafias e
tubulações), tipo de amostra, tempo e forma de emissão e tipos de mensurações tais como:
eletrofisiológicas, morfométricas e funcionais.
Considerando a baixa reprodutibilidade de inúmeros trabalhos citados na literatura,
somado à insatisfatória descrição metodológica e ausência de contraposição de dados
previamente observados, estudos se fazem necessários acerca do emprego da laserterapia de
baixa potência sobre o processo de reparação de nervo ciático. A investigação de um modelo
experimental ligada à análise da avaliação da recuperação funcional, correlacionada à análise
histológica pode fornecer dados relevantes para um uso clínico futuro visando o tratamento de
lesões nervosas. Assim, justifica-se o estudo da influência da aplicação do LBP Arsenieto de
Gálio e Alumínio (660 nm) sobre a recuperação funcional e morfológica do nervo ciático de
ratos após lesão por esmagamento (axoniotmese).
3
2.OBJETIVO
Este trabalho teve o objetivo estudar a influência da aplicação do LBP Arsenieto de
Gálio e Alumínio (660 nm) sobre a recuperação funcional e morfológica do nervo ciático de
ratos após lesão por esmagamento.
4
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Anatomia do nervo periférico e processo de reparação
A unidade básica do nervo periférico é o axônio que é uma extensão do corpo da
célula nervosa. O nervo periférico é composto internamente por axoplasma que é uma
extensão do citoplasma do corpo celular nervoso que objetiva o transporte de nutrientes e
componentes bioquímicos essenciais do corpo da célula nervosa para o seu axônio e
terminações neuro-musculares (JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005).
A membrana celular que circunda o axoplasma é denominada axolema que é
circundada pela célula de Schwann. A célula de Schwann pode envolver uma ou mais
unidades axoplasmáticas e sua membrana plasmática é em forma de lâmina (JOHNSON;
ZOUBOS; SOUCACOS, 2005) (figura 1).
Figura 1: Principais estruturas que formam o nervo periférico
Fonte: http://www.msd-brazil.com/msd43/m_manual/mm_sec6_68.htm adaptado por Belchior (2006)
O neurônio possui uma comunicação com seu órgão alvo através do transporte axonial
que ocorre através de microtúbulos, sendo direcionado desde o corpo celular à periferia
(transporte anterógrado), como do terminal axônico ao corpo celular (transporte retrógrado)
(DAHLIN, 2004).
5
A bainha de mielina que é produzida pela célula de Schwann, apresenta-se como
espiral dupla de lipoproteína e está em contato com a membrana plasmática do corpo desta
célula, ambas envolvem uma zona histológica distinta chamada internodo. Entre dois
internodos aparecem lacunas referentes aos nodos de Ranvier que são canais de sódio de alto
“circuito” (GUYTON, 1988) (figura 2).
Figura 2: Figura esquemática dos componentes participantes do canal de sódio: Internodo e Nodo de Ranvier no
nervo periférico.
Revestindo a unidade axônio-célula de Schwann temos a membrana basal composta
por moléculas de matriz extracelular (colágeno tipo IV e laminina), que serve como uma
demarcação histológica entre elementos teciduais neurais e os conectivos do nervo periférico
(DAHLIN, 2004; JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005).
Nas fibras mielinizadas, cada célula de Schwann forma sua própria bainha de mielina
internodal que é separada de um internodo adjacente pelo nódulo de Ranvier. Embora as
células de Schwann sejam alinhadas com descontinuidades, a lâmina basal é continua entre as
células de Schwann, nos nodos de Hanvier e fibras não mielinizadas (IDE, 1996; JOHNSON;
ZOUBOS; SOUCACOS, 2005).
A chegada de um potencial de ação em um nódulo despolariza a membrana, abrindo
os canais de sódio induzindo um fluxo de íons sódio para dentro do axônio, gerando um
impulso elétrico que é propagado distalmente até o próximo nódulo de Ranvier. Este processo
é chamado de condução saltatória e permite não apenas aumento na velocidade da transmissão
6
do impulso nervoso, mas também reduz a necessidade de energia empregada nesta
transmissão (figura 3) (RUMMLER; PAUL; GUPTA, 2004; IDE, 1996).
Figura 3: Nódulos de Ranvier
Fonte: Amabis e Martho (2001).
A junção neuromuscular é a zona de transição do nervo periférico e o sistema
músculo-esquelético, onde ocorre o término da bainha de mielina e das células de Schwann.
Nesta região a membrana celular do axônio expande-se para formar junções neurais terminais
em associação com a membrana do sarcolema em uma fenda de 200nm a 300nm. É
presenciada na avaliação histológica referindo-se à fenda sináptica. Na margem terminal
nervosa, vesículas sinápticas preenchidas com acetilcolina encontram-se nas invaginações da
membrana do sarcolema. Desta região, a liberação da acetilcolina e a combinação química dos
receptores gera um gradiente iônico responsável pela geração e propagação dos impulsos
nervosos para o sistema músculo-esquelético (GUYTON, 1988).
O nervo periférico é composto por 3 camadas principais: epineuro, perineuro e
endoneuro (figura 4). O epineuro é uma camada de tecido conectivo de colágeno que circunda
os limites externos do nervo periférico e protege o nervo de estresses externos, dividindo-se
7
em duas camadas: o epineuro interno e externo. A principal função do epineuro externo é
proteger o nervo do ambiente adjacente, enquanto, a camada interna protege os fascículos
dentro do nervo, permitindo que se movam livremente, um em relação ao outro (DAHLIN,
2004; RUMMLER; PAUL; GUPTA, 2004).
Figura 4: Composição do nervo periférico, observar em A) epineuro, B) perineuro e C) endoneuro.
Nervo incluído em parafina, corado com tetraóxido de ósmio, aumento de 40x.
O perineuro é uma extensão da barreira dos vasos cerebrais e são conhecidos como a
barreira sanguíneo-nervosa. É composto por camadas concêntricas de fibroblastos que
formam uma bainha em volta de cada fascículo. São membranas proeminentes com
numerosas junções firmes que controlam o ambiente intraneural, restringindo a difusão entre
os fascículos e tornam a camada neural mais resistente à tração longitudinal, propiciando
assim as propriedades elásticas dos nervos periféricos (DAHLIN, 2004; RUMMLER; PAUL;
GUPTA, 2004).
A camada interna é denominada endoneuro e consiste de uma coleção de tecido de
colágeno, substância mucopolissacarídeos, fibroblastos, macrófagos e mastócitos, que
circundam cada axônio individualmente. Dentro do endoneuro estão os axônios que se
associam com as células de Schwann (DAHLIN, 2004; RUMMLER; PAUL; GUPTA, 2004).
8
3.2 Papel da bainha de mielina
Uma das funções primárias da bainha de mielina é gerar maior eficiência na
transmissão do impulso nervoso, atuando como isolante e reduzindo a dissipação do potencial
de ação enquanto propaga pelo axônio (IDE, 1996; RUMMLER; PAUL; GUPTA, 2004)
(figura 5).
Figura 5: Desenho esquemático do feixe nervoso: A) bainha de mielina; B) axônio; C) endoneuro.
Coloração Tetraóxido de ósmio. Aumento 400X.
Uma característica que difere o Sistema Nervoso Periférico (SNP) do Sistema Nervoso
Central (SNC) é a maior capacidade de regeneração devido à organização celular diferente
dos dois sistemas e por isso, após uma lesão nervosa, os axônios de ambos podem se
regenerar. No SNC, os axônios não crescem através de uma área de degeneração Walleriana,
além de se apresentarem inibidos por substâncias e pelo microambiente desfavorável. Já as
fibras nervosas do SNP, mielinizadas ou não, possuem ao seu redor células de Schwann, uma
lâmina basal, revestindo o compartimento tecidual conectivo endoneural, o que promove um
território favorável à regeneração nervosa (IDE, 1996; LENT, 2004; JOHNSON; ZOUBOS;
SOUCACOS, 2005).
9
Pelo fato das células de Schwann realizarem a síntese de bainha de mielina e
participarem na formação de um canal que auxilia a regeneração axonal, a investigação da
área de bainha de mielina é importante para inferir o processo de regeneração nervosa,
conforme utilizado em alguns trabalhos de Medinaceli (1995), Happak et al. (2000), Adalbert
et al. (2005) e Ünal et al. (2005).
3.3 Células de Schwann
As células de Schwann, dos nervos mielinizados ou não, possuem núcleo rico em
heterocromatina e citoplasma eletro-denso. Entretanto, após axoniotmese, as células de
Schwann no segmento nervoso distal passam por intensas mudanças através da degeneração
axonial (IDE, 1996).
As bainhas de mielina são degradadas pela fagocitose de macrófagos, em formas de
esferas, dentro das células de Schwann e durante esta fase, os núcleos celulares de Schwann
tornam-se esféricos e claros, contendo menor quantidade de heterocromatina e o citoplasma
aparece relativamente translúcido (IDE, 1996; BELKAS; SHOICHET; MIDHA, 2004;
MARTINS et al., 2005).
As células de Schwann proliferam na fase inicial da degeneração Walleriana,
estimulada por macrófagos, que secretam várias citocinas, incluindo a Interleucina 1,
conhecida como promotora da regeneração nervosa, enquanto os processos citoplasmáticos
estendem-se, formam os filamentos celulares chamados de coluna de células de Schwann, que
servem como meio de crescimento para os axônios em regeneração (BELKAS; SHOICHET;
MIDHA, 2004; DAHLIN; 2004; JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005).
As células de Schwann possuem 2 funções: formar um esqueleto para a regeneração
axonial pelas moléculas de adesão na superfície da membrana plasmática e produzir vários
10
fatores tróficos para a regeneração axonial (BEAU; ELLISMAN; POWELL, 1988; IDE,
1996; JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005; MARTINS et al., 2005).
As células de Schwann também proliferam no coto proximal. Tal “proliferação” ou
“reação” migra pelo axônio em regeneração, embora a base molecular para este fenômeno não
seja clara (IDE, 1996; BEIROWSKI et al., 2005) (figura 6).
Figura 6. Célula de Schwann (azul) em nervo ciático de rato e núcleos (rosa). Técnica de fluorescência.
Fonte: Radtke et al. (2005).
3.4 Lâmina basal
A célula de Schwann de nervos maduros normais ou em degeneração Walleriana é
coberta pela lâmina basal cujo papel está após a entrada de macrófagos no tubo da lâmina
seguida pela fagocitose da bainha de mielina, deixando a lâmina basal integra, na forma de
tubo vazio (IDE, 1996; JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005).
Assim, os axônios com regeneração do coto proximal crescem vigorosamente através
dos tubos vazios da lâmina basal, não migrando para o compartimento tecidual endoneural
conectivo (IDE, 1996; JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005).
11
3.5. Tipos de lesões
As lesões dos nervos periféricos resultam muitas vezes em perda motora, sensorial e
autonômica, parcial ou total, no segmento corporal envolvido, sendo que a re-inervação dos
alvos desnervados são alcançadas pela regeneração do axônio lesado ou pelo ramo colateral
de um axônio não-lesado adjacente (BELKAS; SHOICHET; MIDHA, 2004; DAHLIN, 2004;
RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ; NAVARRO, 2004).
Após a lesão nervosa periférica, a capacidade de regeneração e recuperação funcional
dos axônios dependerá do local, tipo de lesão e da distância nas quais os axônios deverão
crescer. O tronco nervoso lesionado, o tipo e a severidade da lesão determinam a necessidade
de reparo cirúrgico e o prognóstico de retorno funcional (BEAU; ELLISMAN; POWELL,
1988; RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ; NAVARRO, 2004).
Os tecidos desprovidos de inervação sofrem um processo de atrofia que está
diretamente relacionado com o tempo de recuperação (SCOTT, 1991; DAHLIN, 2004). As
placas motoras e as fibras musculares tornam-se atróficas, sendo o tecido muscular substituído
por tecido fibrótico no período de 12 a 24 meses após a lesão do nervo (MARTINS et al.,
2005).
Os tipos de lesões mais comuns são: esmagamento ou “freeze injury” que induzem
interrupção axonial preservando bainhas conectivas (axoniotmese), secção completa
(neurotmese) e a ressecção de um segmento nervoso (RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ;
NAVARRO, 2004). Predominantemente, existem três tipos de lesões de fibras nervosas:
neuropraxia, axoniotmese e neurotmese (SEDDON, 1943 apud FERREIRA, 2001) (figura 7).
12
Figura 7: Tipos de lesões nervosas: A) neuropraxia, B) axoniotmese e C) neurotmese.
Após a lesão nervosa por esmagamento (axoniotmese), a regeneração deve-se a um
território favorável provido por células de Schwann reativas e a preservação da continuidade
dos túbulos endoneurais (BEAU; ELLISMAN; POWELL, 1988; DAHLIN, 2004;
JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005). Ambos fatos aumentam o prolongamento
axonial e facilita uma adequada re-inervação do alvo. Após uma pequena latência (1 ou 2
dias), os axônios regeneram linearmente (LENT, 2004; RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ;
NAVARRO, 2004). Neste tipo de lesão, um bloqueio de condução do impulso nervoso está
presente podendo ou não estar associada uma desmielinização, pois esta está relacionada com
a permanência da força compressiva, gerando isquemia, deslocamento do axoplasma e
obstrução dos nódulos de Ranvier (FERREIRA, 2001).
Lesões com 10 mm de distância entre os cotos, sem continuidade do tubo endoneural,
também apresentam processos de regeneração curtos, porém este não é acompanhado com
uma boa condução dos impulsos nervosos nem função nervosa (BEAU; ELLISMAN;
POWELL, 1988).
Lesões completas e distantes dos alvos possibilitam a ocorrência de processos
regenerativos frustrantes, pois os cones de crescimento podem se perder pelo caminho a
percorrer, para alcançar o coto distal, tendo a neurorrafia (união cirúrgica dos cotos), um
papel extremamente importante (FERRIRA, 2001; LENT, 2004; McDONALD et al., 2005).
13
Lesões por esmagamento são adequadas na investigação de eventos celulares e
moleculares intrínsecos que intervêm na regeneração dos nervos periféricos, e, no acesso de
fatores, como drogas que podem aumentar a velocidade de regeneração e a efetividade de re-
inervação (RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ; NAVARRO, 2004).
3.6 Processos decorrentes à lesão nervosa
Após qualquer lesão nervosa periférica, ocorrem modificações nos trajetos de
sinalização dos neurônios, células de Schwann e órgão alvo, sendo estes sinais mediados por
mensageiros secundários que ativam posteriormente proteínas que alteram o processo celular
e a transcrição de genes, associados com perturbação no transporte axonial (DAHLIN, 2004).
Os axônios e a bainha de mielina distal à lesão são degradados. Os produtos
degenerados são eliminados pela ação cooperativa das células de Schwann desnervadas e pelo
infiltrado de macrófagos (RUBINSTEIN; SHRAGER, 1990; FERREIRA, 2001;
RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ; NAVARRO, 2004; MARTINS et al., 2005).
A degeneração Walleriana serve para criar um micro-ambiente, favorecendo o
crescimento axonial. Os neurônios que sofrem axoniotmese mudam de um estado de
transmissão para um estado regenerador. Então, seus axônios geram cones de crescimento que
progridem do coto proximal na direção do nervo distal (RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ;
NAVARRO, 2004).
Na axoniotmese, o espaço entre os cotos é preenchido por tecido conectivo e vasos
sanguíneos, dificultando a regeneração (McDONALD et al., 2005).
Para a regeneração axonial é necessário um substrato adequado de fatores trópicos e
tróficos, providos pelas Células de Schwann reativas, macrófagos e matriz extracelular dentro
do nervo em regeneração. O processo regenerativo, entretanto, geralmente não reconstitui
14
uma estrutura nervosa normal nem mesmo permite re-conexão distal normal após lesões
severas (JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005; MARTINS et al., 2005).
Quando há uma lesão, fazendo o axônio perder sua ligação com o corpo celular, ocorre
no segmento distal à lesão uma degeneração gradual chamada de degeneração Walleriana. As
células de Schwann que estão privadas do contato com os axônios, transitoriamente
proliferado, formam um filamento celular chamado de coluna celular de Schwann ou banda
de Büngner dentro do tubo da lâmina basal (FERREIRA, 2001; BELKAS; SHOICHET;
MIDHA, 2004; DAHLIN, 2004; JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005).
As colunas de células de Schwann formadas após as bainhas de mielina são removidas
por macrófagos. Isto é um caminho imprescindível através do qual os axônios regenerados
crescem até o alvo. Se os axônios regenerados escaparem, de qualquer maneira, das colunas
de células de Schwann e entrarem no compartimento de tecido conectivo, eles cessam o
crescimento (JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005).
A lâmina basal de células de Schwann possuem um papel importante na regeneração
axonial. Os axônios regenerados crescem pela superfície da intima da lâmina basal da qual
células de Schwann foram removidas (JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005). Esta
lâmina contém uma variedade de moléculas de adesão como a laminina, que é utilizada pelos
axônios na regeneração para fixação na superfície da íntima, assim como as células de
Schwann possuem em sua membrana plasmática, moléculas da família de imunoglobulinas e
das Caderinas (IDE, 1996; BELKAS; SHOICHET; MIDHA, 2004; DAHLIN, 2004;
MARTINS et al., 2005).
O crescimento axonial segue com o depósito de laminina justapostas às células de
Schwann e quando não estão expostos a este ambiente possuem uma extensão limitada
(McDONALD et al., 2005).
15
A coluna de células de Schwann é uma fonte de fatores tróficos para a regeneração
axonial, especialmente as células que estão associadas à degeneração Walleriana, assim como
a lâmina basal destas células já que podem conter fatores de crescimento de fibroblasto que se
ligam à proteoglicanas de sulfato de heparina da lamina basal (IDE, 1996; DAHLIN, 2004;
JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005). Em adição a estes fatores externos, os cones de
crescimento que estão envolvidos com o crescimento dinâmico da regeneração axonial
possuem moléculas associadas com o seu crescimento, incluindo proteínas associadas à
vesículas tais como a proteína GAP-43, proteína quinase C, tirosina quinase, sinaptofisina, a
sinaptotagmina e a sinapsina (IDE, 1996; SHIN et al., 2003; BELKAS; SHOICHET;
MIDHA, 2004; DAHLIN, 2004; MARTINS et al., 2005; McDONALD et al., 2005).
A resposta neuronal e regeneração axonial requerem uma interação complexa de vários
tipos de células e mudanças na expressão de várias moléculas com vários padrões espaciais e
temporais. Por essa razão, uma larga variedade de métodos são utilizados em estudos
experimentais, dependendo do objetivo de cada estudo morfológico e/ou funcional (DAHLIN,
2004; RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ; NAVARRO, 2004; BEIROWSKI et al., 2005;
(McDONALD et al., 2005).
Várias substâncias produzidas no local da lesão atuam como fatores neurotróficos, tais
como o fator de crescimento nervoso (NGF), o fator neutrófico derivado do cérebro (BDNF),
o fator-ß de crescimento de transformação (TGF-ß), o fator neurotrófico derivado das células
glias (GDNF), o fator de crescimento insulínico (IGF), o fator de crscimento derivado de
“platelet” (PGF) e as neurotrofinas (NT) (IDE, 1996; BELKAS; SHOICHET; MIDHA, 2004;
JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005; MARTINS et al. 2005).
A produção dos fatores neurotróficos, após a lesão, obedece a uma ordem temporal, ou
seja, esses fatores são secretados à medida em que sinais celulares atingem o DNA da célula
(neurônio ou célula de Schwann) e induzem à produção de RNA, responsável pela síntese da
16
proteína relacionada, por exemplo, a produção da fosfatase ácida lissosomal que é responsável
pela dispersão dos grânulos de Nissl (DAHLIN, 2004; MARTINS et al., 2005; JOHNSON;
ZOUBOS; SOUCACOS, 2005).
3.7 Resposta do Corpo Celular
Nas primeiras horas após a lesão do axônio, o corpo celular passa a apresentar uma
série de alterações denominadas de cromatólise, que se caracterizam histologicamente por
ingurgitamento da célula, degeneração da substância de Nissl (retículo endoplasmático rugoso
do neurônio) e migração do núcleo do centro para a periferia. Estas alterações visam à
produção de proteínas (actina e tubulina) relacionadas à regeneração do citoesqueleto do
axônio, em detrimento da produção de neurotransmissores, tanto relacionadas ao transporte
intracelular e à movimentação do cone de crescimento (FERREIRA, 2001; DAHLIN; 2004;
LENT, 2004; JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005; MARTINS et al., 2005).
A morte celular (apoptose) inicia-se dentro das 24 horas após a lesão, indicando que
qualquer terapia deve ser iniciada antes deste período (DAHLIN, 2004).
3.8 Brotamento
Axônios em regeneração são geralmente produzidos no nódulo de Ranvier, localizado
perto do coto proximal da lesão (MARTINS et al., 2005). Após a lesão, o axolema no nódulo
de Ranvier perde sua base, ocasionando uma protusão que é denominada brotamento, que
pode ser observado até 5 horas após a lesão, contendo vesículas de vários tamanhos e
desenvolvendo dentro de cones de crescimento (FERREIRA, 2001; JOHNSON; ZOUBOS;
SOUCACOS, 2005; MARTINS et al., 2005).
17
Embora não exista diferença nas propriedades entre os brotos e os cones de
crescimento, o broto se refere a uma protusão inicial do axolema contendo poucas vesículas e
mitocôndrias, enquanto o cone refere-se à extremidade de um axônio já bem desenvolvido,
contendo vesículas e mitocôndrias em abundância (IDE, 1996).
Os brotos estendem através do tubo da lâmina basal no segmento proximal, atravessam
a estreita fenda do tecido conectivo entre os cotos proximal e distal e, finalmente, entra no
segmento nervoso distal (BELKAS; SHOICHET; MIDHA, 2004; McDONALD et al., 2005).
Brotos dos nódulos de Ranvier podem ser formados sem a influência do corpo celular,
porém o seu crescimento necessita do transporte de constituintes do corpo celular pelo
transporte axonial (IDE, 1996; DAHLIN, 2004).
Grande parte dos brotos é absorvida, permanecendo um único dominante que continua
em expansão distal, denominado cone de crescimento (FERREIRA, 2001; JOHNSON;
ZOUBOS; SOUCACOS, 2005).
Todos os axônios terminais inapropriados são eliminados, resultando em apenas um
axônio denominado neurônio motor que é o responsável pela inervação dos órgãos alvos e
formação da conexão sináptica (DENBURG; POWELL; MURPHY, 1988).
No processo de regeneração do nervo, receptores específicos estão presentes em maior
quantidade na região do cone de crescimento, os quais se unem os fatores neurotróficos
específicos que são transportados retrogradamente ao corpo celular e atuam modulando a
interação entre enzimas denominadas caspases e proteínas pró-apoptóticas mediante a
ocorrência de reações de fosforilação. A inibição dessas enzimas, que são consideradas as
principais efetoras da morte celular, possibilita a manutenção da fisiologia normal da célula
(DAHLIN, 2004; MARTINS et al., 2005).
Em 1993, Anders et al. avaliaram a ação do laser HeNe (632,8 nm, 8,5 mW, 162
J/cm
2
, 45,9 J, 90’) sobre o transporte retrógrado no nervo facial de ratos através da análise da
18
proteína exógena horse-radish tracer peroxidase. Verificaram que a terapia aumentou a
regeneração nervosa já que havia um maior depósito desta proteína no corpo celular do núcleo
motor do nervo.
Após a neurotmese, a mielinazação de fibras regeneradas ocorrem entre 14 a 21 dias
após a lesão (BEAU; ELLISMAN; POWELL, 1988). Para que tal processo ocorra não é
necessária comunicação do coto distal com o corpo celular nervoso (RUBINSTEIN;
SHRAGER, 1990; JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005).
Independentemente do tipo de lesão, os resultados finais da regeneração nervosa ainda
não são completamente satisfatórios e dentre os fatores contribuintes tem-se: 1) perda das
células neuronais motoras e sensitivas; 2) crescimento axonial desorientado, insuficientes e
lentos; 3) rápidas mudanças que persistem por muito tempo no sistema nervoso central; 4)
experiência de dor e alodinia na região lesada (DAHLIN, 2004).
3.9 Modelos experimentais para o estudo da regeneração nervosa
Uma larga variedade de modelos de animais e nervos tem sido usada em pesquisa com
regeneração nervosa periférica. Roedores, principalmente camundongos e ratos, tornaram-se
os modelos mais freqüentemente utilizados devido o baixo custo de manutenção e sua
distribuição de troncos nervosos similares aos humanos (RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ;
NAVARRO, 2004).
Lesões em roedores têm sido analisadas em diferentes nervos (nervo femoral,
mediano, braquial e raízes espinhais lombares). O modelo do nervo ciático representa um
tronco nervoso com adequado comprimento e espaço no meio da coxa para procedimentos
cirúrgicos e introdução de enxertos ou guias, dividindo na região da fossa poplítea em três
ramos: tibial, fibular e sural. Cada um destes ramos conduz proporções diferentes de axônios
19
motores, sensórios e autonômicos em direção ao músculo, receptores de pele, vasos ou
glândulas sudoríparas, localizados em territórios definidos do membro traseiro
(RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ; NAVARRO, 2004).
Embora a lesão de nervos ciáticos em humanos seja rara, este modelo prove um banco
de teste para lesões que envolvem nervos pluri-fasciculares com axônios de tamanhos e tipos
diferentes competindo no alcance dos tubos endoneurais distais e alvos de re-inervação
(RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ; NAVARRO, 2004).
Devido à dificuldade da regeneração nervosa após uma lesão, vários instrumentos
eletroterapêuticos com finalidade regenerativa têm sido estudados, tais como estimulações
elétricas (MENDONÇA; BARBIERE; MAZZER, 2003), ultra-som (RASO et al., 2005) e
LBP a fim de acelerar os processos regenerativos, buscando restaurar a funcionalidade do
paciente.
3.10 Análise Morfométrica
De Medinaceli (1995) afirmou que para a realização do estudo morfométrico de
estruturas nervosas é necessário o conhecimento detalhado anatômico. Através de lesão por
esmagamento (30 segundos) verifica-se que após 1 mês e meio a 2 meses da lesão a
recuperação funcional nervosa alcançava o seu platô apesar de não ocorrer nenhuma mudança
significativa morfometricamente. As mensurações histológicas avaliavam o número de fibras
nervosas por área do nervo, a média do diâmetro de cada neurite, a média da espessura da
bainha de mielina e as áreas de tecido conjuntivo.
Existem dois pré-requisitos para uma função nervosa adequada:
20
1) Neurites individuais que possuem capacidade de transmitir impulsos nervosos, embora em
menor quantidade do que era antes do trauma, sendo a morfometria uma excelente ferramenta
para monitorar este requisito;
2) A organização global do nervo não pode ser descontínua, pois brotamentos de regeneração
de forma cruzada podem levar a caminhos errados em direção as fibras e pode resultar em
severa perda de função sendo que a morfometria não promove informação coerente de toda a
função nervosa. Por essa razão, apenas nos casos em que axônios individuais ou pequenos
fascículos nervosos restauram sua função, torna-se possível a comparação com resultados
histológicos. Se forem fascículos largos e em todos os nervos, a correlação desaparece. Uma
neurotizaçao insuficiente e re-mielinização insatisfatória continua a ser correlacionada com
função insatisfatória, mas o contrário pode não ser verdadeiro. Nenhuma morfometria ou
eletrofisiologia pode mensurar o mais importante fator funcional, que é a proporção de fibras
regenerada que alcançam apropriadamente o seu alvo. Assim, a análise morfométrica, após
lesões traumáticas experimentais, permite uma imagem confiável das condições tróficas nos
nervos regenerados, mas não auxiliam no entendimento da função (MEDINACELI, 1995).
3.11 Análise Funcional
Para avaliação do nível de lesão nervosa, em situações experimentais, a avaliação
funcional da marcha tem-se demonstrado um método confiável e reproduzível (DIJKSTRA et
al., 2000; KOKA; HADLOCK, 2001; VAREJÃO et al., 2003). Em 1982, De Medinacelli,
Fedinacelli, Freed e Wyatt propuseram a utilização de um método de avaliação denominado
de Índice Funcional do Ciático (IFC) baseado em mensurações das patas traseiras de ratos.
Este método foi realizado entre um grupo controle (normal) e grupos experimentais, após
secção e esmagamento do nervo ciático, apresentando boa confiabilidade e reprodutibilidade.
21
O experimento consistia em obter as imagens das pegadas dos animais, quando estes
caminhassem numa passarela construída especificamente para esse fim, sendo estas imagens
registradas e analisadas.
As medidas coletadas foram: 1) espaço entre a segunda e a quarta falange distal (ITS),
2) espaço entre a primeira e a quinta falange distal (TS) e 3) espaço entre a borda proximal do
pé e a terceira falange distal (PL). Após obter os valores dessas variáveis, estes eram
introduzidos numa equação matemática em que os resultados representavam o percentual do
déficit do lado lesado (E – pata de estudo), comparado ao lado normal (N – pata normal). A
função normal, ausência de lesão, é indicada por um índice de 0% enquanto que –100%
representa a perda completa da função, lesão total do nervo (ABREU; WEI; ZUMIOTTI,
2002; LAGO Jr et al., 2005) (figura 8).
Figura 8: Esquema da impressão em papel da pata de um rato normal com as medidas ITS (espaço entre
o segundo e quarto dedo), TS (espaço entre o primeiro e quinto dedo) e PL (espaço entre o calcanhar e o terceiro
dedo).
Segue abaixo a fórmula utilizada do Índice Funcional do Ciátio (IFC):
IFC = –38.3 (EPL -NPL) / NPL + 109.5 (ETS-NTS) / NTS + 13.3 (EITS-NITS) / NITS–
8.8.
22
Há uma relação direta entre a distribuição e a contribuição das fibras de nervos
espinhais que formam o nervo ciático e a alteração dos índices funcionais para os nervos
ciático, tibial e fibular. O ramo L-4 contribui quase que inteiramente para o nervo fibular, o L-
5 para o nervo tibial e o L-6 e outros ramos para o nervo sural. Após a lesão de L-4 uma
redução significativa na função do índice do nervo fibular foi observada com redução do
comprimento da imagem (PL). Na lesão de L-5, notou-se uma redução significativa do índice
do nervo ciático e tibial, com aumento em PL e redução no espalhamento entre os dedos
opostos (TS). Na lesão de ambos, L-4 e L-5 há redução significativa em todos os índices
mensurados, aumento em PL, e redução no dedo intermediário (ITS) e dos valores de TS
(MONTOYA et al., 2002).
Lago Junior et al. (2005) avaliaram o reparo da transecção aguda produzida no nervo
ciático de ratos após a aplicação de cola de fibrina, em comparação com sutura epineural e a
associação das duas técnicas. A avaliação funcional demonstrou resultados melhores no grupo
que empregou uma sutura associada à cola de fibrina, em relação à aplicação das técnicas
isoladamente.
3.12 Laser
3.12.1 Aspectos Gerais
A luz tem sido utilizada como fonte promotora de efeitos biológicos desde a
antiguidade. Os gregos já acreditavam que a luz solar provocava a cura e fortalecimento do
corpo. Na idade média, era utilizada para combater pragas e no século XIX a radiação UV
tratava a tuberculose cutânea (BASFORD, 1995).
23
A palavra laser é um acrônimo para amplificação da luz por emissão estimulada de
radiação, sendo esta postulada por Einstein em 1917 (BAXTER, 1998; ORTIZ et al., 2001;
SALIBA; FOREMAN, 2002; COTTON, 2004).
Algumas características físicas diferem o laser da luz comum, entre elas tem-se: a)
monocromaticidade (mesmo comprimento de onda), b) colimação (mínima divergência) e c)
coerência (ondas em fase temporal e espacial) (BASFORD, 1995; BAXTER, 1998; LOW,
REED, 2001; ORTIZ et al., 2001; SALIBA; FOREMAN, 2002; PASCU, 2000; COTTON,
2004).
A coerência e a colimação não são cruciais durante a irradiação cutânea, pois quando a
luz atinge a pele, estas características são perdidas pelo espalhamento nas primeiras camadas
(BASFORD, 1995; VLADIMIROV; OSIPOV; KLEBANOV, 2004, COTTON, 2004).
Quando fótons interagem com o tecido, os efeitos são: espalhamento ou absorção.
Dentro do espalhamento estão presentes: reflexão, refração e dispersão (transmissão) (LOW;
REED, 2001; SALIBA; FOREMAN, 2002). Quanto maior o comprimento de onda, na região
visível, menor o espalhamento e maior a penetração na pele (COTTON, 2004) (figura 9).
Figura 9: Efeitos físicos da interação laser-tecido.
O princípio básico da terapia a laser é o fato que a irradiação, através da característica
de monocromaticidade, possui capacidade de alterar o comportamento celular sem que seja
necessária a presença de aquecimento. Por isso é chamada de terapia de baixa potência ou
24
baixa intensidade. Este fenômeno, apesar de ser primeiramente denominado de
bioestimulante, apresentou um efeito inibitório sobre ações celulares em certos momentos
tendo assim a sua terminologia modificada para biomodulador (BASFORD, 1995; BAXTER,
1998; VLADIMIROV; OSIPOV; KLEBANOV, 2004).
A absorção da luz incidente ocorre em cromóforos, considerados biomoléculas
capazes de serem excitadas pelos fótons incidentes, sendo estas a base fotobiológica da
laserterapia. Sem esta, não seriam possíveis os efeitos biológicos (BAXTER, 1998).
A absorção é particular de cada comprimento de onda e seu respectivo cromóforo.
Para laseres de 488 e 515 nm (laser de Argônio) tem-se a hemoblobina, enquanto para 10.600
(laser de CO
2
) a água. Para o HeNe (632,8 nm), GaAlAs (630-830 nm) e o GaAs (904 nm),
ou seja, os comprimentos de onda na região do vermelho e infravermelho próximo se
encontram numa região intermediária do espectro e não apresentam fortes cromóforos, o que
possibilita maior capacidade de penetração (BASFORD, 1995; VLADIMIROV; OSIPOV;
KLEBANOV, 2004; COTTON, 2004) (figura 10).
Figura 10: Coeficiente de absorção para alguns comprimentos de onda
Fonte: Cotton (2004)
A laserterapia possui diversos parâmetros tais como: comprimento de onda, potência
média, potência de pico (radiante), densidade de potência (irradiância), forma da onda
(contínua, pulsada, Q-switched), densidade de energia (dose, fluência ou exposição radiante),
25
área do feixe, forma de aplicação (contato ou varredura), polaridade, área irradiada
(BASFORD, 1995; ORTIZ et al., 2001; SALIBA; FOREMAN, 2002; PASCU, 2000;
COTTON, 2004).
Na clínica, a terapia emprega doses de 1 a 4 J/cm
2
, associado com potência de saída
entre 10 a 90 mW sendo amplamente utilizada em diversas lesões músculo-esqueléticas,
assim como em processos algicos e inflamatórios (BASFORD, 1995).
Karu (1988) verificou que a irradiação de mitocôndrias induzia alterações na
homeostasia celular resultando em reações em cascata. Sugeriu que alguns componentes da
cadeia respiratória (citocromos e flavinas desidrogenase) seriam os fotoreceptores ou
cromóforos primários, ou seja, as substâncias capazes de absorver luz em um determinado
comprimento de onda, ativando a cadeia respiratória. Assim, isto poderia resultar no aumento
da síntese de adenosina trifosfato (ATP), afetando os níveis de hidrogênio da célula, ativando
outros íons transportados como sódio e potássio, além de alterar o fluxo de cálcio entre as
mitocôndrias e o citoplasma.
Em 1999, Karu confirmou a hipótese que o citocromo-c-oxidase da mitocôndria,
enzima terminal da cadeia respiratória, é um fotorreceptor da luz na região do vermelho. A
absorção da luz por esta enzima aceleraria o transporte de elétrons na cadeia respiratória que
levaria ao aumento de potencial elétrico trans-membrana, ativando a síntese de ATP,
conseqüentemente, o metabolismo celular (MANTEIFEL; KARU, 2005).
Karu, Pyatibrat e Afanasyeva (2004) descreveram sobre a atividade da radiação do
cobre α (Cu
A
) e o cobre ß (Cu
B
) como cromóforos do citocromo-c-oxidase. Nestes estudos,
foi verificado que a luz induz sinalizações mitocondriais, regulando a ligação direta ao centro
catalítico do citocromo-c-oxidase (N
3
, NO), assim como ligações químicas específicas a
enzimas da membrana plasmática, o que promove maior fixação de culturas celulares ao
substrato.
26
Karu, Pyatibrat e Kalendo (2004) afirmaram sobre a existência de três sinalizadores
entre a mitocôndria, a membrana plasmática e o núcleo celular envolvidos com a adesão
celular que é uma importante condição relacionada com a síntese de ATP. Os sinalizadores
eram: a cadeia respiratória; a Na
+
/ K
+
- ATPase e o N
+
/H
+
“exchangers” (grupo de proteínas
trans-membrana que regulam o pH intracelular, volume celular, transporte iônico e
proliferação celular).
Rochkind e Quaknine (1992) relataram que os efeitos do LBP são dependentes da dose
de luz, pois baixas doses causam a regulação da oxi-redução do metabolismo celular e, em
altas ocorrem danos foto-dinâmicos. Após analisarem diferentes comprimentos de ondas e
doses de energia aplicadas sobre células de fibroblastos, verificou-se que o comprimento de
onda de 630 nm possibilita a obtenção de maior número de mitoses em comparação a 360 nm
e 780 nm, enquanto que o pico era alcançado com dose de 15 J/cm
2
. Acima de 60 J/cm
2
,
observou-se uma redução da reprodução celular.
Manteifel e Karu (2005) estudaram a ação do laser HeNe (632,8 nm) sobre a estrutura
da mitocôndria e a atividade da cadeia respiratória em culturas de células de levedura.
Realizaram exposição a 460 J/cm
2
o que acarretou o aceleramento da proliferação celular,
ativação das enzimas da cadeia respiratória (citocromo-c-oxidase e NADH desidrogenase),
modificações na macroestrutura da mitocôndria (expansão dos túbulos, aumento da área de
superfície das cristas). Notou-se também que o número de associações entre a mitocôndria e o
retículo endoplasmático aumentaram o que refletiu numa maior capacidade de adquirir Ca
2+
,
melhorando o transporte de energia e propagação de Ca
2+
no citoplasma. Porém, quando
irradiada a 1150 J/cm
2
, induzia a fragmentação e danos estruturais a esta organela.
Klebanov et al. (2001) descreveram as porfirinas endógenas como absorvedoras da luz
na parte vermelha do espectro eletromagnético servindo como cromóforos da irradiação laser,
atuando como fotosensibilizadores, induzindo reações de radicais livres (incluindo a
27
peroxidação lipídica com formação predominante de hidroperóxido de ácidos gorduras não
saturados nos fosfolipídeos). Após a absorção do quantum de energia, ocorreu um aumento da
permeabilidade iônica da membrana plasmática, em particular, dos íons cálcio em leucócitos
que ativaria processos dependentes de Ca
2+
e finalmente incrementaria o potencial funcional
celular. Este processo é acompanhado pela reunião de NADPH-oxidases na membrana no
estado ativo de espera e pela expressão de receptores de superfície.
O aumento do potencial funcional dos leucócitos também é acompanhado pela
produção de agentes bioativos como O
2
, H
2
O
2
, ClO
-
, NO e várias citocinas. Alguns possuem
propriedades bactericidas enquanto outros afetam a microcirculação sanguínea. Além disto, a
participação do citrocromo-c-oxidase e do Ca
2+
-ATPase atuantes como cromóforos, não
explicam todos os efeitos da irradiação infravermelha (KLEBANOV et al., 2001).
Almeida-Lopes et al. (2001) notaram que a proliferação de fibroblastos gengivais é
aumentada pela aplicação da terapia laser, e que a utilização da mesma densidade de energia
(2J/cm
2
) em diferentes comprimentos de onda (670, 780, 692, 782 nm) obtêm resultados
superiores na região do infra-vermelho comparada a região do vermelho. Porém, laseres com
potências de saídas similares possuem o mesmo efeito sobre o crescimento celular,
independentemente do comprimento de onda. Concluiu-se que quanto menor o tempo de
exposição, maior é a proliferação dos fibroblastos.
Greco et al. (2001) identificaram aumento do potencial de membrana e a
hiperpolarização da membrana da mitocôndria, associados com o aumento da concentração
intracelular de Ca
2+
nesta organela, quando hepatócitos eram irradiados com laser de HeNe
(632,8 nm, 0,24 J/cm
2
).
Vladimirov, Osipov e Klebanov (2004) consideraram que os efeitos antiinflamatórios
observados pela aplicação do laser, assim como a aceleração da regeneração tecidual e a
melhoria da circulação sanguínea devem-se aos seguintes efeitos: a) aumento da atividade de
28
algumas células tais como leucócitos e fagócitos, e tal como o aumento de cálcio no
citoplasma celular, b) aceleração da divisão celular e crescimento, c) ativação da síntese de
proteínas e citocinas, d) relaxamento das paredes dos vasos (vasodilatação). Em estudos
antecedentes dos próprios autores, justificaram-se os efeitos terapêuticos do laser através de
três reações: a) ação fotodinâmica nas membranas acompanhado pelo aumento de cálcio
intracelular e estimulação celular, b) ativação fotoreativa do superóxido desmutase de cobre e
zinco (removedor de radicais livres), c) fotólise de complexos de metais de NO
(vasodilatador). Conseqüentemente, postulou-se que estas reações levavam a efeitos indiretos
como: bactericida, regenerativo e vasodilatador.
Karu, Pyatibrat e Afanasyeva (2005) afirmaram que o NO é um mediador dos efeitos
celulares decorrentes da terapia com LBP sendo este responsável pelo incremento da ligação
celular, estando associado à produção de energia, estimulação da biogênese de mitocôndrias e
apoptose, estando envolvido com efeitos analgésicos e aumentando a microcirculação.
Karu et al. (2005) investigaram o envolvimento do citocromo-c-oxidade como
fotorreceptor na alteração do metabolismo celular. Os dados revelaram que comprimentos de
onda de 710 a 790 nm provocam uma redução do fotorreceptor enquanto de 650 a 680 nm
induzia oxidação. Caracterizaram a região entre 760 e 665nm como estado redox, causando a
redução do fotorreceptor.
O espectro ativo é a representação da eficácia de diferentes comprimentos de onda
gerando respostas biológicas específicas e que, sob estas condições, assemelha-se ao espectro
de absorção de moléculas absorvedoras de luz cujo efeito fotoquímico causa efeitos
biológicos. Karu e Kolyakov (2005) analisaram o espectro ativo para várias respostas
biológicas com células HeLa, irradiadas com luz monocromática em sete diferentes
comprimentos de ondas situados entre 580 e 860 nm. Verificaram a existência de quatro
regiões “ativas”, mas a posição de pico não era a mesma para todos os espectros.
29
A laserterapia possui aplicabilidade em vários tipos de células e tecidos. Jia e Guo
(2004) verificaram o aumento da atividade de proliferação celular de condrócitos articulares
de coelhos após irradiação com laser HeNe (632,8 nm, 2-12 mW, 1-6 J/cm
2
) através da
avaliação colorimétrica assim como imunocitoquímica.
Ihsan (2005) avaliou o efeito do laser de GaAlAs (904 nm, 10 mW) em coelhos, após
3 sessões de tratamento. Para a irradiação, a artéria femoral foi ocluída através de ligadura.
Foram colhidas amostras sanguíneas para análise dos níveis de adenosina, hormônio de
crescimento e fator de crescimento de fibroblasto, assim como coleta de tecidos para exame
histopatológico para avaliação da quantidade de fibras e diâmetro dos capilares. Concluiu-se
que a laserterapia acelerou a circulação colateral e aumentou a microcirculação, normalizando
funcionalmente a área lesionada.
Snyder et al. (2002) comprovaram que a irradiação com laser (633 nm, 162 J/cm
2
)
regulou o aumento do peptídeo relacionado ao gene calcitonina, que serve como um indicador
da regeneração nervosa após a lesão e a sobrevivência neuronal.
Schwartz et al. (2002) verificaram que após a irradiação de culturas de células
musculares (632,8 nm, 3 J/cm
2
, 20 mW) ocorreu uma elevação do fator de crescimento
nervoso, que é um fator neurotrófico secretado pelo músculo esquelético, além de influenciar
a sobrevivência e regeneração de neurônios simpáticos e sensitivos no sistema nervoso
periférico.
3.12.2 Laser em Nervos Periféricos
30
Em 1988a, Rochkind et al. fizeram menção a estudos prévios do mesmo grupo, acerca
da irradiação com LBP, mais especificamente empregando laser HeNe (632,8 nm) e sua
capacidade de aumentar o potencial de ação do nervo ciático normal de rato, além de
minimizar a degeneração muscular seguida pela ruptura do nervo sendo estes efeitos
observados pelo menos em um ano. Concomitantemente, este tipo de irradiação quando foi
aplicada no nervo ciático com lesão por esmagamento, preveniu a queda do potencial de ação
e formação de fibrose cicatricial, além de acelerar o processo regenerativo e atenuar as
mudanças degenerativas nos segmentos correspondentes na medula espinhal que estão
presentes após a lesão nervosa.
Em 1986, Rochkind et al. verificaram resultados eletrofisiológicos positivos quanto à
aplicação da laserterapia em ratos quando submetidos à neurotmese (com fenda de 0,5 cm) em
nervo ciático tratados com HeNe (16 mW, 8 J/cm
2
, 30’, 20 dias).
Rochkind et al. (1988b) realizaram lesões bilaterais por esmagamento em nervo ciático
de ratos, sendo as feridas suturadas e o lado direito tratado imediatamente transcutâneamente,
sobre a lesão e ao nível da medula espinhal (L4-S2) com irradiação a laser com HeNe (632,8
nm, 16 mW), Argônio (40 mW) ou Dye laser pulsado (20 mW), durante 20 dias consecutivos.
Verificaram que houve a promoção da aceleração do processo de regeneração em relação ao
controle e que estes efeitos reduziam conforme a redução do comprimento de onda de 632 nm
para 465 nm. Neste mesmo estudo, relataram uma influência benéfica do uso da irradiação a
laser quando aplicada à medula espinhal após laminectomia no segmento de D12-L1,
precedida pela implantação de enxerto autólogo do nervo ciático esquerdo em cães. Com
irradiação por 21 dias, o grupo irradiado foi capaz de ficar em pé primeiro do que o grupo não
irradiado. Segundo os autores não está claro se este benefício ocorreu devido uma real
regeneração ou apenas pela aceleração da presença do automatismo medular distal e
31
sugeriram a realização de novos estudos com marcadores histoquímicos para comprovar a
regeneração funcional.
Estudos empregando laser terapêutico, na faixa de 630 nm, em feridas cutâneas,
queimaduras e lesão de nervo ciático, os quais foram realizados bilateralmente, demonstram
um efeito tanto local como sistêmico. Observou-se que lesões não tratadas, do lado contra-
lateral às feridas tratadas, apresentam melhor reparação que os animais do grupo controle.
Porém, os resultados foram menos evidentes, do que nas lesões irradiadas. Nestes estudos, os
autores verificaram a efetiva ação do laser, reduzindo a degeneração retrógrada dos neurônios
motores da medula espinhal, esperada após uma lesão nervosa periférica (ROCHKIND et al.,
1989).
Rochkind e Quaknine (1992) afirmaram que a irradiação com LBP com um
determinado comprimento de onda e densidade de energia específico mantém a atividade
eletro-fisiológica de nervos periféricos lesionados em ratos, prevenindo a formação cicatricial
no local da lesão, assim como mudanças degenerativas dos neurônios motores,
correspondentes na medula espinhal, induziram o brotamento axonial e estimularam os
capilares em transplantes nervosos.
Khullar et al. (1995) analisaram o efeito do laser GaAlAs (830 nm, 48 J/cm
2
) em ratos
submetidos à axoniotmese, tratados por 28 dias, avaliando a recuperação funcional pelo
Índice Funcional do Ciático, a regeneração nervosa pelo Potencial de Ação Composto, além
da análise histomorfométrica através da contagem das bainhas de mielina. Verificaram uma
diferença significativa na recuperação funcional e eletrofisiológica em relação ao grupo
placebo, porém na análise histológica não houve recuperação significativa.
Chelyshev et al. (1996) demonstraram que o laser a 890 nm (0,33 J/cm
2
) não interferia
na quantidade de fibras mielinizadas do segmento distal em processo regenerativo. Além
disto, o aumento da dose para 9,33 J/cm
2
causava uma redução em 49% do número de fibras
32
mielinizadas. Essa supressão ao processo regenerativo também foi encontrada com o laser de
1220 nm (0,98 J/cm
2
) e não houve influência do laser HeNe (7 J/cm
2
) sobre a quantidade de
fibras.
Em 1996, Khullar et al. examinaram a ação do laser GaAlAs (830 nm, 46 J/cm
2
, 6 J,
70 mW, 538 mW/cm
2
, feixe de 0,13 cm
2
,
por 10 dias) em nervos alveolares inferiores da
polpa do dente, primeiro molar, em ratos, submetidos a neurotmese. Utilizando análises
imucitoquímicas do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, encontraram uma grande
quantidade desta proteína no grupo tratado em ralação ao controle. Concluíram que o aumento
da inervação nervosa quando utilizado a laserterapia poderia ser pelo aceleramento da
regeneração nervosa, re-inervação colateral ou combinação de ambas respostas.
A ação supressora na condução do impulso em nervos sensórios periféricos
amielinados foi verificada após a irradiação do laser HeNe (632,8 nm, 1 mW, 100 Hz, 10’,
feixe de 40 mm de diâmetro) em nervo sural de coelhos avaliados eletrofisiologicamente
(resposta nervosa evocada) (KASAI et al., 1996).
Walsh, Baxter e Allen (2000) demonstraram que o laser GaAlAs pulsado (820 nm, 50
mW, 9,55 J/cm
2
, 3 pontos) aplicado sobre a pele correspondente ao trajeto do nervo radial em
humanos, não produzia nenhum efeito neurofisiológico (potencial ativo antidrômico) assim
como alteração da temperatura da área irradiada.
Após a lesão do nervo ciático por esmagamento em ratos e aplicação transcutânea de
laser (632,8 nm, 16 mW, 180 J/cm
2
) sobre o segmento da medula espinhal ao nível de T12-L1
em 4 pontos, por 21 dias consecutivos, por 30 minutos de sessão diária de tratamento foi
capaz de restaurar 90% do potencial de ação normal em relação ao valor pré-lesão. O grupo
controle, não irradiado, reduziu em 20% e apresentou os primeiros sinais de recuperação
somente após 30 dias da lesão (ROCHKIND et al., 2001).
33
A terapia com laser em 780 nm gerou bons resultados em nervos ciáticos de ratos após
completa secção seguida de anastomose. A aplicação diária por 30 minutos em 21 dias
consecutivos, transcutâneamente sobre os segmentos correspondentes da medula espinhal e na
região lesionada promoveram respostas somato-sensórias positivas em 69,2% em ratos
irradiados contra 18,2% de animais controle. O estudo histocitoquímico demonstrou aumento
da quantidade do número de axônios e melhor qualidade do processo regenerativo devido à
presença de axônios com maior diâmetro comparado ao grupo controle (SHAMIR et al.,
2001).
Em 2002, Bagis et al. avaliaram os efeitos eletrofisiológicos agudos da irradiação
pulsada do laser GaAs (904 nm, duração de pulso de 220 ns, 27 W, feixe de 0,28 cm
2
, 0,005-
2,5 J/cm
2
, 4-128 Hz, 1-15’) em nervo ciático de sapos (in vitro) através da mensuração
eletrofisiológica da latência do potencial de ação e duração da despolarização, não sendo
encontradas diferenças significativas.
Miloro et al. (2002) investigaram o efeito do LBP (AsGa, 820 a 830 nm, 70 mW, 6,0
J/cm
2
) na regeneração do nervo alveolar inferior de coelhos associado com tubos Gore-Tex.
Após 10 dias de aplicação, os segmentos foram analisados histo-morfometricamente por
microscopia a luz sendo que o grupo tratado com laser demonstrou maior densidade axonal,
sugerindo ser um método não-invasivo e benéfico na cura de lesões nervosas.
Bagis et al. (2003) ao utilizarem o laser GaAs (904 nm, duração do pulso de 220 ns,
0,28 cm
2
, 2,48 e 19 J/cm
2
) durante 21 dias consecutivos após a lesão do nervo ciático por
esmagamento, não verificaram diferença estatisticamente significante entre os resultados
histomorfológicos nem eletrofisiológicos, comparando animais controle e irradiados.
Empregando o IFC associado a imunocitoquímica, Shin et al. (2003) analisaram o
efeito terapêutico do laser (650 nm, 5 mW) em lesões do tipo axoniotmese do nervo ciático de
ratos seguidos apenas por 4 dias consecutivos de tratamento. Os autores verificaram que o
34
grupo tratado com laser além de apresentarem um índice funcional mais elevado, possuía
maior número de proteína-43 associada ao crescimento (GAP-43), proteína envolvida no
processo de regeneração nervosa, nas fases iniciais da recuperação nervosa, mas após a 5ª
semana não apresentava diferença estatisticamente significativa entre o grupo tratado e o
controle. Porém, não relatam a densidade de energia empregada.
Gigo-Benato et al. (2004) avaliaram a ação de dois tipos diferentes de emissão a laser
após a lesão por transecção do nervo mediano seguida pela neurorrafia com o nervo ulnar
(doador) em ratos. Verificaram que quando aplicado o laser de 808 nm (contínuo, 416 mW,
454 µs, 1,100 Hz, 39’’, 0,28 cm
2
, 29 J/cm
2
) associado com o de 905 nm (pulsado, 28 W, 200
ns, 10 KHz, 1’12’’, 0,1 cm
2
, 40J/cm
2
) obtinham melhores resultados funcionais, recuperação
da massa muscular e maior número de fibras nervosas regeneradas em relação quando
aplicados separadamente, porém apresentando resultados significantemente positivos da
irradiação.
Nicolau et al. (2004a) ao analisarem o efeito do laser GaAlAs (655nm, 1-12J/cm
2
) na
liberação de neurotransmissores na junção neuromuscular em 39 camundongos não
encontraram nenhum efeito fisiológico na placa motora terminal. Contudo observou-se que
com 12 J/cm
2
e comprimento de onda de 830 nm obteve-se redução da neurotransmissão
(NICOLAU et al., 2004b).
Considerando a pouca reprodutibilidade de inúmeros trabalhos citados na literatura,
somado à insatisfatória descrição metodológica e ausência de contraposição de dados
previamente observados, estudos se fazem necessários acerca do emprego da laserterapia de
baixa potência sobre o processo de reparação de nervo ciático. A investigação de um modelo
experimental ligada à análise da avaliação da recuperação funcional, correlacionada à análise
histológica pode fornecer dados relevantes para uma base de aplicabilidade clínica futura de
tratamento de lesões nervosas. Assim justifica-se o estudo da influência da aplicação do LBP
35
Arsenieto de Gálio e Alumínio (660 nm) sobre a recuperação funcional e morfológica do
nervo ciático de ratos após lesão por esmagamento (axoniotmese).
36
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais
Foram utilizados 12 ratos machos adultos, da linhagem Wistar, com peso corporal
variando de 300 a 350 gramas, provenientes do Biotério Central da Universidade do Estado e
da Região do Pantanal - UNIDERP, os quais foram mantidos em condições controladas de
luminosidade e temperatura, seis animais por gaiola, com alimentação padrão e água ad
libitum.
Todos os procedimentos experimentais foram de acordo com as normas do Colégio
Brasileiro de Experimentação animal – COBEA, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
da Universidade do Vale do Paraíba – UNIVAP, sob número L184/2005/CEP (anexo).
Neste trabalho, os animais foram divididos em dois grupos experimentais:
- Grupo 1 (controle): constituído por seis animais submetidos à lesão do nervo ciático
unilateral, por esmagamento e não-irradiados.
- Grupo 2 (laser): composto por seis animais submetidos à lesão do nervo ciático
unilateral, por esmagamento e subseqüente irradiação com o laser, na região lesionada, por 20
dias consecutivos.
4.2 Procedimento cirúrgico e terapia
4.2.1 Método Cirúrgico Geral
Os animais foram anestesiados com administração de pré-anestésico Butorfanol
(Turbogesic, 2mg/kg) (KOZHAKHMETOV, 1993) associado a Acepromazina (Acepran,
1mg/kg), ambos em dose única via intramuscular. Após 15 minutos, administrou-se
Zolazepan e Tiletamina (Zoletil 50, 40mg/kg) (ALMEIDA, 2000).
37
Após o procedimento anestésico, realizou-se a tricotomia da face lateral da coxa
direita com o auxílio de lâmina de barbear, estéril, em extensão suficiente para permitir a
visualização da região a ser abordada.
O animal foi, então, posicionado em decúbito ventral, mantendo-se as patas dianteiras
e traseiras em abdução, e o local da incisão preparado com anti-sepsia (álcool-iodado).
O nervo ciático foi abordado através de uma incisão longitudinal na face lateral da
coxa direita, indo desde a altura do trocânter maior até o joelho (figura 11).
Figura 11: Ilustração da extensão da incisão longitudinal na face lateral da coxa direita após a
tricotomia.
Com auxílio de lupa, a cerca de 3 mm distal a sua emergência, foi realizada uma lesão
nervosa por esmagamento do nervo ciático utilizando uma pinça hemostática com aplicação
perpendicular ao trajeto nervoso, utilizando o primeiro dente da pinça para padronização da
pressão, mantendo-se a compressão por 30 segundos (figura 12).
38
3 mm
Pinça hemostática
3 mm
Pinça hemostática
Figura 12: Foto do procedimento cirúrgico no momento em que era realizado a lesão por esmagamento
do nervo ciático com auxílio de pinça hemostática
Após a realização da lesão, os tecidos moles foram suturados com pontos simples de
nylon monofilamento (Mononylon 5/0, Ethicon®) e, em seguida, o animal recebeu uma dose
única de antibiótico (Penicilina associada à estreptomicina) para profilaxia de infecções e
outra dose de Fentanil® por via intra-peritoneal (0,032 mg/kg) (PRIVADO et al., 2004), para
a promoção analgésica. Nos dois dias consecutivos, de 12/12 horas após a lesão, foi mantida a
administração do analgésico.
4.2.2 Aplicação do Laser Diodo Arsenieto de Gálio e Alumínio (GaAlAs)
Utilizou-se o Laser Arsenieto de Gálio e Alumínio (GaAlAs) da marca KLD® modelo
Endophoton, com comprimento de onda de 660 nm, contínuo, potência de 26.3 mW e área do
feixe de 0,63 cm
2
. A forma de aplicação deu-se pelo método transcutâneo pontual e em
contato, com densidade de energia de 4 J/cm
2
, densidade de potência de 0,0413 W/cm
2
e
tempo de 96,7 segundos. A intensidade do equipamento foi aferida previamente ao
39
experimento com o auxílio do medidor de potência (2-Watt Broadband Power/Energy Meter,
Modelo 13 PEM 001/J, Holanda).
Foram aplicados 3 pontos sobre a incisão cirúrgica: um ponto em cada extremidade e
outro no ponto centro (figura 13).
Figura 13: Aplicação da laserterapia sobre a lesão do nervo ciático com auxílio de luva de borracha para
contenção do animal em 3 pontos eqüidistantes.
A aplicação foi iniciada no primeiro dia de pós-operatório e durante os 20 dias
consecutivos sobre a região da lesão no grupo experimental 2.
Os animais do grupo 1 foram submetidos ao mesmo procedimento sem que houvesse a
irradiação a laser (placebo).
O pesquisador não tinha conhecimento de qual grupo pertencia cada animal durante os
testes.
4.2.3 Análise Funcional
As impressões das pegadas dos animais foram obtidas antes do procedimento
cirúrgico, através do emprego de tiras de papel milimetrados acopladas em uma passarela de
marcha construída de acordo com proposta de Dijkstra et al. (2000).
40
Após o treino de marcha inicial (5 minutos), as patas dos animais foram pintadas com
tinta nanquim, registrando-se a impressão das pegadas. Após a formação das imagens, as
medidas do Índice Funcional do Ciático foram realizadas (figura 14).
Figura 14: Passarela de marcha de madeira (5 x 7 x 42 cm) utilizada para a coleta do IFC.
Novas medidas do IFC foram realizadas no 7°, 14° e no 21° dia de pós-operatório.
O pesquisador não tinha conhecimento de qual grupo pertencia cada animal durante os
testes.
4.2.4 Obtenção de Amostra e Análise Histológica
A região lesionada dos animais foi acompanhada diariamente através de avaliação
clínica. O avaliador não tinha conhecimento de qual grupo pertencia cada animal durante os
testes. Realizou-se administração de pré-anestésico Butorfanol (Turbogesic, 2mg/kg)
associado à Acepromazina (Acepran, 1mg/kg) ambos administrados em dose única via
intramuscular e após 15 minutos, Zolazepan e Tiletamina (Zoletil 50, 40mg/kg). O sacrifício
deu-se com dose letal de cloreto de potássio (0,4ml/100g de peso) via intra-cardíaca. Após o
sacrifício dos animais, no 21° dia pós-operatório, foram feitas análises histomorfométricas
dos nervos ciáticos.
41
Antes da retirada do material para análise histomorfométrica, este foi embebido em
uma solução de glutaraldeído a 25% e cacodilato de sódio 0,025M, por dois minutos, para a
pré-fixação. Em seguida, foram removidos e mergulhados na mesma solução
supramencionada, onde permaneceram por 12 horas, em geladeira à 6°C para a fixação.
Depois deste período foi feita a pós-fixação do segmento com teróxido de ósmio a 2%,
acrescido de cacodilato de sódio 0,2%, por um período de 8 horas. Posteriormente, os
segmentos foram lavados em solução tampão de cacodilato de sódio isotônico e desidratados
em soluções de concentração crescente de etanol e óxido de propileno. Finalmente, foram
embutidos em resina plástica (EPON 812) por 48h a 60°, em estufa.
Obtidos os blocos, realizaram-se cortes finos (2,0 µm de espessura) que foram
analisados em microscópio de luz. As imagens das fibras nervosas foram obtidas no mesmo
microscópio óptico(Leica
®
Slandasd), que é dotado de uma câmara de vídeo CCD acoplada a
um microcomputador, com auxílio do programa Leica Q-Win
®
.
4.2.5 Análise Histomorfométrica
A análise histomorfométrica foi realizada com o auxílio do programa Image Pro Plus
(versão 4.5.0.29). Cada animal foi avaliado a partir de uma lâmina, onde cada amostra foi
fotografada em cinco quadrantes, sendo quatro periféricos e um central (Figura 15). Em cada
quadrante, selecionou-se uma área retangular de 350 x 350 µm
e, a partir desta área, foi
realizada a contagem da área total de bainha de mielina.
42
Figura 15: Figura esquemática da lâmina e as regiões dos 5 quadrantes avaliados
histomorfometricamente.
Os passos para a análise foram: a) carregar a figura a ser analisada no programa Image
Pro Plus; b) selecionar o quadrante conforme ilustrado na figura acima; c) selecionar a
ferramenta perform segmentation; d) abrindo o histograma básico, foi padronizado o valor de
coloração de 150; e) abriu-se a ferramenta count and measure objects; f) entrou-se na
ferramenta meansure-select measurements, utilizando como filtro a área de bainha de mielina;
g) fechou-se a ferramenta perform segmentation; h) prosseguiu-se com a contagem (count); i)
selecionou-se novamente meansure, auto-classification, j) selecionou-se a opção view e
statistics, k) finalmente, observou-se o valor médio da área de bainha de mielina (figuras 16 e
17).
43
Figura 16: Imagem ilustrativa do programa Image-Pro Plus. Notar em A) quadrante, B) 350 x 350, C) medida em
µm e D) ferramenta perform segmentation.
Figura 17: Imagem ilustrativa do programa Image-Pro Plus. Notar em A) ferramenta count and measure objects ,
B) Meansure, C) Count, D) Auto-classification, E) Statistics, F) Mean (média dos valores).
44
4.3 Forma de análise dos resultados
Os dados resultantes da análise histomorfométrica e IFC foram submetidos a análise
estatística para obtenção das médias e desvio padrão. Em seguida, aplicou-se a análise
comparativa (ANOVA) entre o grupo controle e laser, para os diferentes dias de coleta do IFC
enquanto os valores das áreas de bainha de mielina, obtidos nos dois grupos, foram aplicados
o teste t studant com nível de significância de 5% (p<0,05), para ambos os testes.
45
5. RESULTADOS
5.1 Índice Funcional do Ciático (IFC)
No grupo 1 (controle), o IFC foi em média de -7,2 (± 23,5) para os valores coletados
no dia pré-lesão, -116.7 (± 27.9) no 7° dia de pós-operatório, -124,0 (± 27,1) no 14° dia e de -
117,7 (± 15,7) no 21° dia. No grupo 2 (laserterapia), obteve-se o valor médio de -0,3 (± 11,3)
para os valores coletas no dia pré-lesão, -90,6 (± 54,0) no 7° dia de pós-operatório, -83,1 (±
57,5) no 14° dia e de -57,8 (± 57,4) no 21° dia (apêndice A).
A análise estatística comparativa (ANOVA) do grupo controle, entre os diferentes dias
de coleta do IFC, mostrou que apenas os valores da pré-lesão foram significativos, quando
comparados com os demais dias (p < 0,001).
No grupo de laserterapia, os valores pré-lesão comparados com os valores do 7° e 14°
dias pós-operatórios apresentaram diferenças significativas (p<0,01 e p<0,05). Porém, os
resultados não foram estatisticamente diferentes quando comparado com o 21° dia (p>0,05).
Houve também diferença estatística entre os valores do 7° dia de pós-operatório em relação ao
14°, assim como do 14° em relação ao 21° dia. (p<0,01).
Comparando-se os dois grupos (controle X laserterapia), notou-se uma diferença
significativa apenas entre o valor pré-lesão da laserterapia em relação ao 21° pós-operatório
do grupo controle (p<0,001) (figura 18).
Figura 18: Valores expressos em média e desvio padrão do IFC dos grupos 1 (controle) e grupo 2 (laser) nos
quatro dias de avaliação. * p < 0,001
46
5.2 Análise Histomorfométrica
Primeiramente os valores individuais da área de bainha de mielina (nos 5 quadrantes
analisados) de amostras do grupo 1 (controle) (apêndice B) e grupo 2 (laser) (apêndice C)
foram medidos após o 21° dia de pós-operatório e tabulados. Assim, obtiveram-se os valores
médios e desvios padrões (figura 19).
Em seguida, com os valores das médias e desvios padrões das áreas de bainha de
mielina, foi aplicado o teste t student com nível de significância de 0,05, sendo obtido o valor
de p = 0,46.
Figura 19: Imagens histológicas do terceiro quadrante, onde A - B são imagens do grupo controle, e C - D do
grupo laser. Notar: Epineuro (Ep), Perineuro (Pn), Endoneuro (Em) e a bainha de mielina (BhM).
Pn
Pn
Pn
Pn
En
Ep
En
En
En
Ep
Ep
Ep
BhM
BhM
BhM
BhM
A C
B D
47
6. DISCUSSÃO
A escolha do rato como animal de experimentação deu-se pela fácil aquisição e
manuseio, além do fato que os roedores, principalmente camundongos e ratos, tornaram-se os
modelos mais freqüentemente utilizados devido o baixo custo de manutenção e sua
distribuição de troncos nervosos similares aos humanos (RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ;
NAVARRO, 2004). Além disto, o modelo do nervo ciático representa um tronco nervoso com
adequada característica anatômica para procedimentos cirúrgicos.
Embora a lesão de nervo ciático em humanos seja rara, este modelo fornece um banco
de teste para lesões que envolve nervos pluri-fasciculares com axônios de tamanhos e tipos
diferentes competindo no alcance dos tubos endoneurais distais e alvos de re-inervação
(RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ; NAVARRO, 2004).
A lesão por esmagamento foi selecionada, pois a regeneração acontece em um
território favorável provido pelas células de Schwann reativas e a preservação da continuidade
dos túbulos endoneurais (BEAU; ELLISMAN; POWELL, 1988; DAHLIN, 2004;
JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005). Ambos os fatos aumentam o prolongamento
axonial e facilita uma adequada re-inervação do alvo. Após uma pequena latência (1 ou 2
dias), os axônios regeneram linearmente (LENT, 2004; RODRÍGUEZ; VALERO-CABRÉ;
NAVARRO, 2004).
Rodríguez, Valero-Cabré e Navarro (2004) afirmaram que as lesões por esmagamento
são adequadas na investigação de eventos celulares e moleculares intrínsecos que intervêm na
regeneração dos nervos periféricos, e para acessar fatores, como drogas que podem aumentar
a velocidade de regeneração e a efetividade de re-inervação.
A forma de produzir a lesão por esmagamento, utilizando uma pinça hemostática, foi
realizada por diversos trabalhos (ROCHKIND et al., 1988; ROCHKIND; VOGLER; BARR-
NEA, 1990; ANDERS et al., 1993; KHULLAR et al., 1995, ROCHKIND et al., 2001; BAGIS
48
et al., 2003; SHIN et al., 2003). O tempo de compressão é variado, mas 30 segundos é o mais
utilizado entre os trabalhos supracitados, exceto Khullar et al. (1995) que utilizou o tempo 10
minutos e Anders et al. (1993), 90 segundos.
O laser de HeNe (632, 8 nm) na região de emissão vermelha do espectro
eletromagnético é o comprimento de onda mais estudado em biomodulação da resposta
biológica em processo de reparação (ROCHKIND et al., 1986; ROCHKIND et al., 1988;
ROCHKIND; VOGLER; BARR-NEA, 1990; ANDERS et al., 1993; SOTELO et al., 1996;
ROCHKIND et al., 2001; SCHWARTZ et al., 2002; SNYDER et al., 2002). Atualmente,
outros comprimentos de onda estão sendo desenvolvidos e pesquisados, como os laseres
emitindo em 650 -830 nm (Arsenieto de Gálio e Alumínio) (KHULLAR et al., 1995;
KHULLAR et al., 1999; WALSH; BAXTER; ALLEN, 2000; SHAMIR et al.; 2001;
MILORO et al., 2002; SHIN et al., 2003; GIGO-BENATO et al., 2004; NICOLAU, et al.,
2004a; BYRNES et al.; 2005) e o de 904 nm (Arsenieto de Gálio) (BAGIS et al., 2002;
BAGIS et al. 2003; GIGO-BENATO et al., 2004).
O laser GaAlAs (660 nm) foi selecionado por ser de baixa potência e com um
comprimento de onda comum na prática clínica. Entretanto, não foi encontrado na literatura
um número expressivo de estudos antecedentes neste comprimento de onda (SHIN et al.,
2003; NICOLAU, et al., 2004a).
Na clínica, a terapia com laser de baixa potência emprega doses de 1 a 4 J/cm
2
,
associado com potência de saída entre 10 a 90 mW, sendo amplamente utilizada em diversas
lesões músculo-esqueléticas, assim como em processos algicos e inflamatórios (BASFORD,
1995). Baseado neste fato justificou-se a densidade de 4 J/cm
2
nesta pesquisa. É importante
salientar que este parâmetro é extremamente variável nas pesquisas de laserterapia em
regeneração nervosa.
49
A utilização do laser como um instrumento biomodulador benéfico nos eventos de
regeneração nervosa ainda é controverso, pois alguns estudos possuem evidências positivas
(ROCHKIND et al., 1988a; ROCHKIND et al., 1988b; ROCHKIND et al., 1986; ANDERS et
al., 1993; KHULLAR et al., 1995; SOTELO et al., 1996; KHULLAR et al., 1999;
ROCHKIND et al., 2001; SHAMIR et al., 2001; SCHWARTZ et al.; 2002; SNYDER et al.,
2002; MILORO et al., 2002; SHIN et al., 2003; GIGO-BENATO et al., 2004; BYRNES et al.,
2005), enquanto outros não (ROCHKIND; VOGLER; BARR-NEA, 1990; CHELYSHEV et
al., 1996; BAGIS et al., 2002; BAGIS et al., 2003; WALSH; BAXTER; ALLEN, 2000;
NICOLAU et al., 2004a). Muitas destas pesquisas não descrevem todos os parâmetros
necessários como dose, potência média do aparelho, tempo de aplicação e modo de aplicação,
promovendo a difícil compreensão metodológica para a reprodução dos resultados e
dificuldades comparativas entre os estudos (apêndice D).
Os resultados obtidos neste trabalho, quanto ao IFC, demonstram que após a lesão
nervosa por esmagamento, ocorre uma perda funcional severa nos dois grupos no 7° dia pós-
operatório. Porém, no grupo controle, o índice de função reduziu ainda mais no 14° dia
enquanto que o grupo de laserterapia apresentava uma melhora funcional neste período. Os
baixos valores de IFC do grupo irradiado no 7° dia pós-operatório pode ter ocorrido devido o
fato que nas primeiras horas após a lesão do axônio, o corpo celular passa a apresentar uma
série de alterações denominadas de cromatólise, que se caracterizam histologicamente pelo
ingurgitamento da célula, degeneração da substância de Nissl (retículo endoplasmático rugoso
do neurônio) e migração do núcleo do centro para a periferia. Estas alterações visam à
produção de proteínas (actina e tubulina) relacionadas à regeneração do citoesqueleto do
axônio, em detrimento da produção de neurotransmissores, estando relacionadas ao transporte
intracelular e à movimentação do cone de crescimento (FERREIRA, 2001; DAHLIN, 2004;
LENT, 2004; JOHNSON; ZOUBOS; SOUCACOS, 2005; MARTINS et al., 2005).
50
Provavelmente, o período de 7 dias após a lesão está marcado por estes eventos, mas a
utilização da laserterapia dentro das 24 horas após a lesão, reduz a perda funcional imediata,
demonstrando que a terapia deve ser iniciada neste período, o que está de acordo com a
afirmação de Dahlin (2004).
Após o 14° dia pós-operatório, ambos os grupos (controle e laser) apresentam uma
linha de tendência positiva quanto à melhora da função. Porém, esta foi mais acentuada e com
valores melhores no grupo tratado, conforme demonstrado no gráfico 1.
Na análise da função do grupo controle, nenhuma diferença significativa foi notada
entre o 7° e o 14° dia pós-operatório, assim como do 14° com o 21° dia. Entretanto, nota-se
diferença em relação ao valor pré-lesão em todos os dias de avaliação após a lesão.
Em relação ao grupo de laserterapia, as análises comparativas do IFC entre os
diferentes dias de avaliação, demonstram diferenças significativas, exceto para o 21° dia após
a lesão em relação ao valor pré-lesão, o que sugere a influência benéfica do laser sobre a
melhora funcional.
Manteifel e Karu (2005) relataram que o citocromo-c-oxidase, enzima terminal da
cadeia respiratória, é um fotoreceptor da luz na região do vermelho, ou seja, a mesma região
do comprimento de onda utilizada neste estudo. A absorção da luz por esta enzima pode
acelerar o transporte de elétrons na cadeia respiratória e conduzir um aumento de potencial
elétrico trans-membrana da mitocôndria, ativando a síntese de ATP, conseqüentemente, o
metabolismo celular.
Rochkind e Quaknine (1992) relataram que os efeitos do LBP são dependentes da dose
de luz, pois baixas doses causam a regulação da oxi-redução do metabolismo celular, e em
altas ocorrem danos foto-dinâmicos. Esta afirmação foi feita após análise sob diferentes
comprimentos de ondas e doses de energia aplicadas sobre células de fibroblastos. Foi
observado que mediante o comprimento de onda de 630 nm ocorria um maior número de
51
mitoses, quando comparado com 360 nm e 780 nm. O maior número de mitoses era alcançado
com dose de 15 J/cm
2
, mas acima de 60 J/cm
2
apresentavam redução da reprodução celular.
Baseado nestes resultados, justificou-se o emprego nesta pesquisa da baixa densidade de 4
J/cm
2
, evitando-se assim os danos foto-dinâmicos e sugerindo o aumento de número de
mitoses sobre os fibroblastos de nossa amostra que são encontrados nas camadas formadoras
no nervo periférico: o epineuro, o perineuro e o endoneuro conforme os trabalhos de Dahlin
(2004), e Rummler, Paul e Gupta (2004).
Apesar da melhora funcional não estar associada com o aumento da área de bainha de
mielina, outros eventos podem justificar este evento tais como: a) melhora do transporte de
energia e propagação de Ca
2+
no citoplasma (MANTEIFEL; KARU, 2005) o que poderia
gerar um incremento o potencial funcional celular (KLEBANOV et al., 2001), b) aceleração
do reparo de ferimentos e ao aumento de resistência do tecido cicatricial (WOODRUFF et al.,
2004), c) ação antiinflamatória, assim como o aceleramento da regeneração tecidual e a
melhora da circulação sanguínea devem-se aos seguintes efeitos: 1) aumento da atividade de
algumas células tais como leucócitos, fagócitos, e aumento de cálcio no citoplasma celular, 2)
aceleramento da divisão celular e crescimento, 3) ativação da síntese de proteínas e citocinas e
4) relaxamento das paredes dos vasos (vasodilatação) por fotólise de complexos como o NO e
conseqüentemente, postulou-se que estas reações levavam os efeitos indiretos como:
bactericida, regenerativo e vasodilatador (VLADIMIROV; OSIPOV; KLEBANOV, 2004).
Karu, Pyatibrat e Afanasyeva (2005) afirmaram que o NO também foi associado à produção
de energia, estimulação da biogênese de mitocôndrias e apoptose, envolvido com efeitos
analgésicos e aumento da micro-circulação.
Schwartz et al. (2002) verificaram que após a irradiação de culturas de células
musculares (632 nm, 3 J/cm
2
, 20 mW) havia uma elevação no nível do fator de crescimento
nervoso (FNC), que é um fator neurotrófico secretado pelo músculo esquelético, além de
52
influenciar a sobrevivência e regeneração de neurônios simpáticos e sensitivos no sistema
nervoso periférico. Outros fatores de crescimento neurotróficos também são bioestimulados
pela laserterapia tal como GAP-43 (SHIN et al., 2003), fator de crescimento de fibroblasto
(IHSAN, 2005) e talvez se deva a estes eventos a melhora do IFC, mas estudos
histocitoquímicos deverão ser realizados.
Acredita-se que a melhora funcional também não se deve à liberação de
neurotransmissores na junção neuromuscular baseado na pesquisa de Nicolau et al. (2004a),
pelo fato da semelhança do comprimento de onda (655 nm) e densidade de energia empregada
(1-12 J/cm
2
).
Apesar da ação benéfica do laser sobre o IFC, o valor no 21° dia pós-lesão comparado
ao pré-lesão não era igual o que sugere que o período de 21 dias ainda não é o suficiente para
que ocorra a regeneração nervosa completa.
Um fato importante a ser mencionado trata-se do IFC pré-lesão em que pode notar-se
que ambos os grupos, neste período de avaliação, não apresentam diferença significativa,
demonstrando uma dispersão dos resultados reduzida.
A lesão do nervo ciático implica em perdas funcionais em relação ao padrão da
marcha devido à relação direta entre a distribuição e a contribuição das fibras de nervos
espinhais que formam o nervo ciático conforme afirma Montoya et al., 2002.
A melhora do IFC utilizando a laserterapia neste estudo corrobora com a pesquisa de
Shin et al. (2003) que empregaram o índice associado à imunocitoquímica, analisando o efeito
terapêutico do laser (650 nm, 5 mW) em lesões do tipo axoniotmese do nervo ciático de ratos
seguidos apenas por 4 dias consecutivos de tratamento. Entretanto, nenhuma diferença
significativa entre o grupo tratado e o controle foi notada após a 5ª semana. É interessante
notar a similaridade no mesmo comprimento de onda, animal e tipo lesão utilizados, além do
efeito positivo em um período em torno de 3 semanas como o aplicado nesse estudo.
53
Todavia, tornam-se necessários mais estudos, observando períodos superiores a 21
dias de tratamento, ou até mesmo mais que 5 semanas.
Apesar da melhora significativa do IFC no grupo laser, a quantidade da área de bainha
de mielina não apresenta valores significantivos na avaliação histomorfométrica. Este
resultado é contraditório com outros estudos da literatura, talvez pelo diferente comprimento
de onda empregado, tal como o de 632,8 nm (SOTELO et al., 1996; SCHWARTZ et al.,
2002; SNYDER et al., 2002), 780 nm (SHAMIR et al., 2001), 808 nm (GIGO-BENATO et
al., 2004) e 820 nm (MILORO et al., 2002) em que encontraram resultados satisfatórios.
Porém, Khullar et al. (1995) ao avaliarem o efeito do laser GaAlAs (820 nm, 70 mW,
6 J por ponto, total de 48 J/cm
2
) em nervos ciáticos de ratos submetidos à axoniotemese,
verificaram ação benéfica nas avaliações funcionais e eletrofisiológicas. Porém, a análise
histológica não demonstrou resultado significativo. Apesar da diferença do comprimento de
onda, potência e dose empregadas neste trabalho, a análise histológica também não foi
significativa.
O resultado histomorfométrico não significativo neste trabalho que utilizou um tempo
de avaliação de 21 dias pode ser justificado por pesquisa de Medinaceli (1995), em que na
lesão tipo axoniotmese (30 segundos) verificou-se que a recuperação funcional nervosa
alcançava o seu platô após 1 mês e meio a 2 meses da lesão apesar de não ocorrer nenhuma
mudança de forma significativa.
Concomitantemente, Beau, Ellisman e Powell (1988) afirmaram que a mielinização
das fibras regeneradas ocorrem entre 14 a 21 dias após a lesão. Porém, o tipo de lesão
utilizada foi a neurotmese, ou seja, os 21 dias aplicados neste estudo não foram suficientes
para identificar a formação de bainha de mielina, apesar da lesão, axoniotmese, ser menos
grave.
54
De qualquer forma, nenhuma morfometria ou eletrofisiologia pode mensurar o mais
importante, ou seja, o IFC, provavelmente devido à proporção de fibras regeneradas que
alcançam apropriadamente o seu alvo. Assim, a análise morfométrica, após lesões traumáticas
experimentais, provê uma imagem confiável das condições tróficas nos nervos regenerados,
mas não auxiliam o entendimento da função (MEDINACELI, 1995).
55
7. CONCLUSÃO
A utilização do LBP com Arsenieto de Gálio e Alumínio (660 nm) demonstra
resultados positivos sobre a recuperação funcional, porém não traz mudanças significativas
quanto à área da bainha de mielina avaliada histomorfometricamente em nervo ciático de
ratos após lesão por esmagamento.
56
REFERÊNCIAS
ABREU, A.A.N.; WEI, T.H.; ZUMIOTTI, A.V. Avaliação dos gangliosídios na regeneração
nervosa de ratos. Revista Brasileira de Ortopedia, v. 37, n. 1/ 2, p. 39-44, 2002.
ADALBERT, R.; GILLINGWATER, T.H.; HALEY, J.E.; BRIDGE, K.; BEIROWSKI, B.;
BEREK, L.; WAGNER, D.; GRUMME, D.; THOMSON, D.; CELIK, A.; ADDICKS, K.;
RIBCHESTER, R.R.; COLEMAN, M.P. A rat model of slow wallerian degeneration (Wld`s)
with improved preservation of neuromuscular synapses. European Journal of Neuroscience,
v. 21, p. 271–277, 2005.
ALMEIDA, E.M.P.; NUNES, N.; FANTINATTI, A.P.; SANTOS, P.S.P.; BOLZAN, A.A.;
REZENDE, M.L. Efeitos cardiorrespiratórios da associação de tiletamina/zolazepam em cães
(Canis familiaris) pré-tratados ou não pela acepromazina. Brazilian Journal of Veterinary
Research and Animal Science, v. 37, n. 3, p. 45-51, 2000.
ALMEIDA-LOPES, L.; RIGAU, J.; ZÂNGARO, R.A.; GUIDUGLI-NETO, J.; JAEGER,
M.M.M. Comparison of the low level laser therapy effects on cultured human gingival
fibroblasts proliferation using different irradiance and same fluence. Laser in Surgery and
Medicine, v. 29, p. 179-84, 2001.
AMABIS, J. M.; MARTHO, G. R. Conceitos de Biologia. São Paulo: Moderna, 2001.
ANDERS, J. J.; BORKE, R. C.; WOOLERY, S. K.; MERWE, W. P. V. Low power laser
irradiation alters the rate of regeneration of the facial nerve. Lasers in Surgery and
Medicine, v. 13, p. 72-82, 1993.
BASFORD, J.R. Low intensity laser therapy: still not an established clinical tool. Laser in
Surgery and Medicine, v. 16, p. 331-42, 1995.
BEAU, J.M.L.; ELLISMAN, M.H.; POWELL, H.C. Ultrastructural and morphometric
analysis of long-term peripheral nerve regeneration through silicone tubes. Journal of
Neurocytology, v. 17, p. 161-72, 1988.
BAGIS, S.; COMELEKOGLU, U.; SAHIN, G.; BUYUKAKILLI, B.; ERDOGAN, C.;
KANIK, A. Acute electrophysiologic effect of pulsed gallium-arsenide low energy laser
irradiation on configuration of compound nerve action potencial and nerve excitability.
Lasers in Surgery and Medicine, v. 30, p. 376-80, 2002.
BAGIS, S.; COMELEKOGLU, U.; COSKUN, B.; MILCAN, A.; BUYUKAKILLI, B.;
SAHIN, G.; OZISIK, S.; ERDOGAN, C. No effect of GA-AS (904 nm) laser irradiation on
57
the intact skin of the injured rat sciatic nerve. Lasers in Medical Science, v. 18, n. 2, p. 83-8,
2003.
BAXTER, D. Laserterapia de Baixa Intensidade. In: KITCHEN, S.; BAZIN, S. Eletroterapia
de Clayton. 10 ed. São Paulo: Manole, 1998. p. 191-210.
BEIROWSKI, B.; ADALBERT, R.; WAGNER, D.; GRUMME, D.S.; ADDICKS, K.;
RIBCHESTER, R.R.; COLEMAN, M.P. The progressive nature of Wallerian degeneration in
wild-type and slow Wallerian degeneration (Wld
s
) nerves. BMC Neuroscience, v. 6, n. 6, p.
1-27, 2005.
BELKAS, J.S.; SCHOICHET, M.S.; MIDHA, R. Axonal guidance channels in peripheral
nerve regeneration. Operative Techiniques in Orthopaedics, n. 14, p. 190-8, 2004.
BERVAR, M. Video analysis of standing – an alternative footprint analysis to assess
functional loss following injury to the rat sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods, v.
102, p. 109-116, 2000.
BYRNES, K.R.; WAYNANT, R.W.; ILEV, I.K.; WU, X.; BARNA, L.; SMITH, K.;
HECKERT, R.; GERST, H.; ANDERS, J.J. Light promotes regeneration and functional
recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in Surgery and
Medicine, v. 36, p. 171-185, 2005.
CHELYSHEV, I.A.; KUBITSKII, A.A.; PLAKSEICHUK, A. Regeneratsiia nervnykh
volokon pri obluchenii nizkointensivnymi lazerami. Morfologiia, v. 110, n. 5, p. 47-50,
1996.
COTTON, A.M. A review of the principles and use of lasers in lower limb problems. Lower
Extremity Wounds, v. 3, n. 3, p. 133-42, 2004.
DAHLIN, L.B. The biology of nerve injury and repair. Journal of the American Society for
Surgery of the Hand, v. 4, n. 3, p.???? 2004.
DE MEDINACELLI, L.; FREED,W.J.; WAYTT, R.J. An index of the functional conduction
of the rat sciatic nerve based on meansurements made from walking tracks. Experimental
Neurology, n. 77, p. 6634-643, 1982.
DENBURG, J.J.; POWELL, S.L.; MURPHY JUNIOR, F. Absence of competitive
interactions among axon terminals of regenerating motor neurons. Journal of Neurobiology,
v. 19, n. 7, p. 656-65, 1988.
58
DIJKSTRA, J.R.; MEEK, M.F.; ROBINSON, P.H.; GRAMSBERGEN, A. Methods to
evaluate functional nerve recovery in adult rats: walking track analysis, video analysis and the
withdrawal reflex. Journal of Neuroscience Methods, v. 96, p. 89-96, 2000.
FERREIRA, A.S. Lesões nervosas periféricas: diagnóstico e tratamento. 2. ed, São Paulo:
Editora Santos, 2001. p. 1-9.
FERRIGNO, I.S.V.; FREITAS, P.P.; FREITAS, A.D. Lesões dos nervos periféricos. In:
FREITAS,P.P. Reabilitação da mão. São Paulo: Atheneu, 2005. p. 211-30.
GIGO-BENATO, D.; GEUNA, S.; RODRIGUES, A.C.; FORNARO, P.T.M.; BOUX, E.;
BATTISTON, B.; GIACOBINI-ROBECCHI, M.G. Low-power laser biostimulation enhances
nerve repair after end-to-side neurorrhaphy: a doublé-blind randomized study in the rat
median nerve model. Laser in Medical Science, v. 19, p. 57-65, 2004.
GRECO, M.; VACCA, R.A.; MORO, L.; PERLINO, E.; PETRAGALLO, V.A.; MARRA,
E.; PASSARELLA, S. Helium-neon laser irradiation of hepatocytes can trigger increase of the
mitochondrial membrane potencial and can stimulate c-fos expression in Ca2+- dependent
manner. Laser in Surgery and Medicine, v. 29, p. 433-41, 2001.
HAPPAK, W.; NEUMAYER, C.; HOLAK, G.; KUSBARI, R.; BURGGASSER, G.;
GRUBER, H. Morphometric and functional results after CO2 laser welding of nerves
coaptations. Lasers in Surgery and Medicine, v. 27, p. 66-72, 2000.
IDE, C. Peripheral nerve regeneration, Neuroscience Research, v. 25, p. 101-21, 1996.
IHSAN, F.R.M. Low-level laser therapy accelerates collateral circulation and enhances
microcirculation. Photomedicine and Laser Surgery, v. 23, n. 3, p. 289-94, 2005.
INSERRA, M.M.; BLOCH, D.A.; TERRIS, D.J. Functional indices for sciatic, peronal, and
posterior tibial nerve lesions in the mouse. Microsurgery, v. 18, p. 119-24, 1998.
JIA, Y.; GUO, Z. Effect of low-power He-Ne laser irradiation on rabbit articular chondrocytes
in vitro. Laser in Surgery and Medicine, v. 34, p. 323-28, 2004.
JOHNSON, E.O.; ZOUBOS, A.B.; SOUCACOS, P.N. Regeneration and repair of peripheral
nerves. International Care Injured, v. 36, p. 24-29, 2005.
KARU, T. I. Molecular mechanisms of the therapeutic effect of low-intensity laser irradiation.
Lasers in Life Sciences, v. 2, p. 53-74, 1988.
59
KARU, T.I.; KOLYAKOV, S.F. Exact action spectra for cellular responses relevant to
phototherapy. Photomedicine and Laser Surgery, v. 23, n. 4, p. 355-61, 2005.
KARU, T.I.; PYATIBRAT, L.V; AFANASYEVA, N.I. A novel mitochondrial signaling
pathway activated by visible-to-near infrared radiation. Photochemistry and Photobiology,
v. 80, p. 366-72, 2004.
KARU, T.I.; PYATIBRART, L.V.; KALENDO, G.S. Photobiological modulation of cell
attachment via cytocromo c oxidase. Photochemical & Photobiology Science, v. 3, p. 211-
16, 2004.
KARU, T.I.; PYATIBRAT, L.V; KOLYAKOV, S.F.; AFANASYEVA, N.I. Absortion
measurements of a cell monolayer relevant to phototherapy: reduction of cytochrome c
oxidase under near IR radiation. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology,
v. 81, p. 98-106, 2005.
KARU, T.I.; PYATIBRAT, L.V.; AFANASYEVA, N.I. Cellular effects of low power laser
therapy can be mediated by nitric oxide. Laser in Surgery and Medicine, v. 36, p. 307-14,
2005.
KASAI, S.; KONO, T.; YAMAMOTO, Y.; KOTANI, H.; SAKAMOTO, T.; MITO, M.
Effect of low-power laser irradiation on impulse conduction in anesthetized rabbits. Journal
of Clinical Laser Medicine & Surgery, v. 14, n. 3, p. 107-13, 1996.
KHULLAR, S.M.; BRODIN, P.; MESSELT, E.B.; HAANAES, H.R. The effects of low level
laser treatment on recovery of nerve conduction and motor function after compression injury
in the rat sciatic nerve. European Journal of Oral Sciences, v. 103, p. 299-305, 1995.
KHULLAR, S. M.; BRODIN, P.; FRISTAD, I. KVINNSLAND, I. H. Enhanced sensory
reinnervation of dental target tissues in rats following low level laser (LLL) irradiation.
Lasers in Medicine and Science, v. 14, p. 177-84, 1999.
KLEBANOV, G.I.; KREININA, M.V.; POLTANOV, E.A.; KHRISTOFOROVA, T.V.;
VLADIMIROV, Y.A. Mechanism of therapeutics effect of low-intensity infrared laser
irradiation. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, v. 131, n. 3, p. 286-89, 2001.
KOKA, R.; HADLOCK, T.A. Quantification of functional recovery following rat sciatic
nerve transaction. Experimental Neurology, v. 168, p. 192-95, 2001.
60
KOZHAKHMETOV, A.N. The evaluation of the adequacy of anesthesia during delivery.
Akush Ginekol, v. 2, p. 36-39, 1993.
LAGO JUNIOR, O.; BORTOLLETTO, C.V.; ARAÚJO, A.M.; DONOSO, C.P.M.; KUME,
P.K.; KUME, P.K.; REPKA, J.C.D. Avaliaçao functional e histological do reparo de nervo
ciático utilizando cola de fibrina e sutura em ratos Wistar. Revista Brasileira de Ortopedia,
v. 40, n. 1/2, p. 69-78, 2005.
LENT, R. Cem bilhões de neurônios: conceitos fundamentais da neurociência. 3.ed. São
Paulo: Editora Atheneu, 2004. p. 135-65.
LOW, J.; REED, A. Eletroterapia Explicada: princípios e prática. 3.ed. São Paulo:
Manole, 2001. p. 389-409.
MANTEIFEL, V.M.; KARU, T.I. Structure of mitochondria and activity of their respiratory
chain in successive generations of yeast cells exposed to He-Ne laser light. Biology Bulletin,
v. 32, n. 6, p. 556-66, 2005.
MARTINS, R.S.; SIQUEIRA, R.S.; SILVA, C.F.; PLESE, J.P.P. Mecanismos básicos da
regeneração de nervos. Arquivo Brasileiro de Neurociência, v. 24, n. 1, p. 20-5, 2005.
McDONALD, D.; CHENG, C.; CHEN, Y.; ZOCHODNE, D. Early events of peripheral nerve
regeneration. Neuron Glia Biology, v. 1, p. 1-9, 2005.
MEDINACELI, L. Interpreting nerve morphometry data after experimental traumatic lesions.
Journal of Neuroscience Methods, v. 58, p. 29-37, 1995.
MENDONÇA, A.C.; BARBIERI, C.H.; MAZZER, N. Directly applied low intensity direct
electric current enhances peripheral nerve regeneration in rats. Journal of Neuroscience
Methods, v. 129, p. 183-90, 2003.
MILORO, M.; HALKIAS, L.E.; MALLERY, S.; TRAVERS, S.; RASHID, R.G.; NEB, O.
Low-level laser effect on neural regeneration in Gore-Tex tubes. Oral Surgery Oral
Medicine Oral Pathology, v. 93, n. 1, p. 27-34, 2002.
MONTOYA, J.V.; ARIZA, J.; SUTACHÁN, J.J.; HURTADO, H. Relationship between
functional deficiencias and the contribution of myelin nerve fibers derived from L-4, L-5, and
L-6 spinolumbar branches in adult rat sciatic nerve. Experimental Neurology, v. 173, p. 266-
274, 2002.
61
NICOLAU, R.A.; MARTINEZ, M.S.; RIGAU, J.; TOMÀS, J (a). Effect of power 655 nm
diode laser irradiation on the neuromuscular junctions of the mouse diaphragm. Lasers in
Surgery and Medicine, v. 34, p. 277-84, 2004.
NICOLAU, R.A.; MARTINEZ, M.S.; RIGAU, J.; TOMÀS, J (b). Neurotransmitter release
changes induced by low power 830 nm diode laser irradiation on the
neuromuscular junctions of the mouse. Lasers in Surgery and Medicine, v. 35, n. 3, p.
236-241, 2004.
NOBLE, J.; MUNRO, C.A.; PRASAD, V.S.S.V. Analysis of upper and lower extremity
peripheral nerve injuries in a population of patients with multiple injuries. Journal of
Trauma, n. 45, p. 116-22, 1998.
ORTIZ, M.C.S.; CARRINHO, P.M.; SANTOS, A.A.S.S.; GOLÇALVES, R.C.;
PARIZOTTO, N.A. Laser de baixa intensidade: princípios e generalidades- Parte 1.
Fisioterapia Brasil, v. 2, n. 4, p. 221-38, 2001.
PASCU, M. L. Laser physics. In: SIMUNOVIC, Z. Lasers im Medicine and Dentistry:
basic science and up-date clinical application of low energy-level therapy LLT. Rijeka:
Vitagraf, 2000.
PRIVADO, M.S.; SAKATA, R.K.; ISSY, A.M. Estudo comparativo entre fentanil por vias
peridural e venosa para analgesia de operações ortopédicas. Revista Brasileira de
Anestesiologia, v. 54, n. 5, p. 634-9, 2004.
RASO, V.V.M.; BARBIERI, C.H.; MAZZER, N.; FASAN, V.S. Can therapeutic ultrasound
influence the regeneration of the peripheral nerves?. Journal of Neuroscience Methods, v.
142, p. 185-92, 2005.
HADTKE, C.; AKIYAMA, Y.; LANKFORD, K.L.; VOGT, P.M.; KRAUSE, D.S.;
KOCSISJ.D. Integration of engrafted Schwann cells into injured peripheral nerve: Axonal
association and nodal formation on regenerated axons. Neuroscience Letters, v.387, p.85-89,
2005.
ROCHKIND, S.; NISSAN, M.; RAZON, N.; SCHWARTZ, M.; BARTAL, A.
Electrophysiological effect of HeNe laser on normal and injured sciatic nerve in the rat. Acta
Neurochirurgica, v. 83, p. 125-130, 1986.
ROCHKIND, S.; NISSAN, M.; LUBART, R.; AVRAM, J.; BARTAL, A (a). The in-vivo
nerve response to direct low-energy-laser irradiation. Acta Neurochirurgica, v. 94, p. 74-77,
1988.
62
ROCHKIND, S.; BARR-NEA, L.; BARTAL, A.; NISSAN, M.; LUBART, R.; RAZON, N
(b). New methods on treatment of severely injured sciatic nerve and spinal cord: an
experimental study. Acta Neurochirurgica, n. 43, p. 91-3, 1988.
ROCHKIND, S.; ROUSSO, M.; NISSAN, M.; VILLARREAL, M.; BARR-NEA, L.; REES,
D.G. Systemic effects of low power laser irradiation on the peripheral and central nervous
system, cuttaneous wounds, and burns. Lasers in Surgery and Medicine, v. 9, n. 2, p. 174-
82, 1989.
ROCHKIND, S.; VOGLER, I.; BARR-NEA, L. Spinal cord response to laser treatment of
injured peripheral nerve. Spine, v.15, p. 6-10, 1990.
ROCHKIND, S.; QUAKNINE, G.E. New trend in neuroscience: low-power laser effect on
peripheral and central nervous system (basic science, preclinical and clinical studies).
Neurological Research, v. 14, p. 2-11, 1992.
ROCHKIND, S.; NISSAN, M.; ALON, M.; SHAMIR, M.; SALAME, K. Effects of laser
irradiation on the spinal cord for the regeneration of crushed peripheral nerve in rats. Lasers
in Surgery and Medicine, v. 28, p. 216-19, 2001.
RODRÍGUEZ, F.J.; VALERO-CABRÉ, A.; NAVARRO, X. Regeneration and functional
recovery following peripheral nerve injury. Drug Discovery Today: Disease Models, v. 1, n.
2, p. 177-85, 2004.
RUBINSTEIN, C.T.; SHRAGER, P. Remyelination of nerve fibers in the transected frog
sciatic nerve. Brain Research, v. 524, p. 303-12, 1990.
RUMMLER, L.S.; PAUL, T.D.; GUPTA, R. The anatomy and biochemistry of myelin and
myelination. Operative Techiniques in Orthopaedics, v. 14, p. 146-52, 2004.
SALGADO, J.F.M. Avaliação do processo de regeneração óssea primária, conjugando a
técnica de regeneração óssea guiada com membrana de colágeno aniônico e terapia a
laser de baixa potencia. 2002. 101f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) –
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba, São José dos
Campos, São Paulo, 2002.
SALIBA, E.; FOREMAN, S. Laser de Baixa Potência. In: PRENTICE, W.E. Modalidades
Terapêuticas em Medicina Esportiva. 4 ed. São Paulo: Manole, 2001. p. 246-265.
63
SCOTT, J.J.A. Recovery of denervated muscle receptors following treatments to accelerate
nerve regeneration. Brain Research, v. 563, p. 195-202, 1991.
SCHWARTZ, F.; BRODIE, C.; APPEL, E.; KAZIMIRSKY, G.; SHAINBERG, A. Effect of
helium/neon laser irradiation on nerve growth factor synthesis and secretion in skeletal
muscle cultures. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, v. 66, p. 195-
200, 2002.
SEDDON, H.J. Tree types of nerve injury. Brain, v. 66, n. 237, 1943. In: FERREIRA, A.S.
Lesões nervosas periféricas: diagnóstico e tratamento. 2. ed. São Paulo: Editora Santos,
2001. p. 1-9.
SHAMIR, M.H.; ROCHKIND, S.; SANDBANK, J.; ALON, M. Double-blind randomized
study evaluating regeneration of the rat transected sciatic nerve after suturing and
postoperative low-power laser treatment. Journal of Reconstructive Microsurgery, v.17, n.
2, p. 133-7, 2001.
SHIN, D.H.; LEE, E.; HYUN, J.; LEE, S.J.; CHANG, Y.P.; KIM, J.; CHOI, Y.S.; KWON,
B.S. Growth-associated protein-43 is elevated in the injured rat sciatic nerve after low power
irradiation. Neuroscience Letters, v. 344, p. 71-4, 2003.
SNYDER, S.K.; BYRNES, K.R.; BORKE, R.C.; SANCHES, A.; ANDERS, J.J. Quantitation
of calcitonin gene-related peptide mRNA and Neuronal cell death in facial motor nuclei
following axotomy and 633 nm low power laser. Laser in Surgery and Medicine, v. 31, p.
216-22, 2002.
SOTELO, P.R.; SOSA, V.M.R.; MARTÍNEZ, R.T.; BARRY, H.G. El laser helio-neon en la
regeneración del nervio ciático seccionado y suturado. Revista Cubana de Cirúgia, v. 35, p.
00, 1996.
WALSH, D.M.; BAXTER, G.D.; ALLEN, J.M. Lack of the effect pf pulsed low-intensity
infrared (820 nm) laser irradiation on nerve conduction in the human superficial radial nerve.
Lasers in Surgery and Medicine, v. 26, p. 485-90, 2000.
WOODRUFF, L.D.; BOUNKEO, J.M.; BRANNON, W.M.; DAWES, K.S.; BARHAM,
C.D.; WADDELL, D.L.; ENWEMEKA, C.S. The efficacy of laser therapy in wound repair: a
meta-analysis of the literature. Photomedicine and Laser Surgery, v. 22, n. 3, p. 241-47,
2004.
ÜNAL, B.; TAN, H.; ORBAK, Z.; KIKI, Z.; BILICI, M.; BILICI, N.; ASLAN, H.;
KAPLAN, S. Morphological alterations produced by zinc deficiency in rat sciatic nerve: A
64
histological, electron microscopic, and stereological study. Brain Research, v. 1048, p. 228-
234, 2005.
VAREJÃO, A.S.P.; CABRITA, A.M.; GEUNA, S.; MELO-PINTO, P.; FILIPE, V.M.;
GRAMSBERGEN, A.; MEEK, M.F. Toe out angle: a functional index for the evaluation of
the sciatic nerve recovery in the rat model. Experimental Neurology, v. 183, p 695-99,
2003.
VLADIMIROV, Y.A.; OSIPOV, A.N.; KLEBANOV, G.I. Photobiological principles of
therapeutic applications of laser radiation. Biochemistry, v. 69, n. 1, p. 89-90, 2004.
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