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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Controle hormonal do crescimento de raízes de tomateiro
(Lycopersicon esculentum cv. Micro-Tom) em condições de déficit
hídrico.
Angélica Maria de Campos Machado Pitelli
Dissertação apresentada para obtenção do titulo de
Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Fitotecnia
Piracicaba
2006
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Angélica Maria de Campos Machado Pitelli
Engenheiro Agrônomo
Controle hormonal do crescimento de raízes de tomateiro (Lycopersicon
esculentum cv. Micro-Tom) em condições de déficit hídrico.
Orientador:
Prof. Dr. PAULO ROBERTO DE CAMARGO E
CASTRO
Dissertação apresentada para obtenção do titulo de
Mestre em Agronomia. Área de concentração:
Fitotecnia
Piracicaba
2006
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Dados I nt ernaci onai s de Catal ogação na Publ i cação ( CI P)
DI VI SÃO DE BI BLI OTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/ USP
Pitelli, Angélica Maria de Campos Machado
Controle hormonal do crescimento de raízes de tomateiro (Lycopersicon esculentum
cv. Micro-Tom) em condições de déficit hídrico / Angélica Maria de Campos Machado. - -
Piracicaba, 2006.
54 p. : il.
Dissertação (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2006.
1. Crescimento vegetal 2. Hormônio vegetal 3. Mutação genética 4. Raiz 5. Tomate
I. Título
CDD 635.642
“Per mi t i da a cópi a t ot al ou par ci al dest e document o, desde que ci t ada a
f ont e – O aut or”
3
Aos meus pais Robinson Antonio e Maria Angélica
Por todo apoio, confiança e incentivo
E por serem meu exemplo de vida
Com todo amor
OFEREÇO
Ao meu irmão Robinson Luiz
Pela amizade e ajuda
DEDICO
4
Agradecimentos
Agradeço a Deus por ter me dado a oportunidade de viver e realizar meus sonhos.
Ao Prof. Dr. Paulo Roberto de Camargo e Castro pela orientação, pela ética profissional
e pela amizade, durante todo este tempo.
Ao Prof. Dr. Lázaro Eustáquio Pereira Peres pelo apoio, pela paciência, pela amizade e
pelo exemplo de profissionalismo.
Á secretária de Programa de Pós-graduação da Fitotecnia Luciane Aparecida Lopes
Toledo pela amizade, apoio e excelência profissional.
Á CAPES pela concessão de bolsa de estudo.
Aos funcionários do Departamento de Ciências Biológicas Alexandre e Romeu pela
ajuda e apoio inestimáveis.
Aos professores Pedro Jacob Christoffoleti, Marcos Silveira Bernardes e Francisco
Mourão Filho pela coordenação das atividades realizadas no Programa de Fitotecnia.
Aos amigos e companheiros de sala André, Ana Claudia, Stella, Chryz e Silvio pela
amizade, companheirismo e paciência.
Aos companheiros do Laboratório de Controle Hormonal e Desenvolvimento Vegetal,
Joni, Lílian, Augustin, Simone e Fernando por todo o apoio e ajuda na realização dos
experimentos.
Ao amigo e companheiro do Laboratório de Controle Hormonal e Desenvolvimento
Vegetal, Rogério Falleiros Carvalho por toda a ajuda, amizade, incentivo e apoio
incondicional na realização deste trabalho.
5
A amiga Dolorice pelo apoio inestimável e amizade durantes estes anos.
Aos amigos da Esalq, Alexandra, Fernanda De Simoni, Virtual, Russo, Fernanda
Salvador, Fernando, Hector, José Geraldo, Vanessa Toledo, Bardy, Vanessa Benez,
Patrícia Favoretto, Kumprido, Roberta, Reinaldo, Thomas, Henriquinho, André
(Sapateiro), Evandro, Guy, Paulo, Juliano, Cláudio, Cristiano, pela amizade e
companheirismo.
A todos os alunos e funcionários dos Programas de Pós - graduação da Fitotecnia e da
Fisiologia e Bioquímica de Plantas pelo companheirismo.
A minha prima Stella Maris Pitelli pela amizade, pelos conselhos, e paciência.
A amiga Silvia Scarassatti pela amizade e ajuda nos momentos mais difíceis.
A todos os professores e funcionários da Escola Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz, USP, Piracicaba pelo profissionalismo e exemplo.
6
“Pouco conhecimento faz com que as criaturas
se sintam orgulhosas.
Muito conhecimento, que se sintam humildes.
É assim que as espigas sem grãos erguem
desdenhosamente a cabeça para o céu, enquanto que
as cheias a baixam para a terra, sua mãe.”
Leonardo Da Vinci
7
SUMÁRIO
RESUMO.................................................................................................................. 09
ABSTRACT............................................................................................................... 11
LISTA DE FIGURAS................................................................................................. 12
LISTA DE ABREVIATURAS..................................................................................... 13
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................... 14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................................. 15
2.1 Hormônios e crescimento radicular.................................................................... 15
2.2 Estresse hídrico e crescimento radicular............................................................ 19
2.3 Controle hormonal do crescimento radicular sob estresse hídrico..................... 20
2.4 Abordagem para o estudo da ação de hormônios............................................. 23
3 MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................... 26
3.1 Material vegetal.................................................................................................. 26
3.2 Desinfestação e germinação de sementes........................................................ 27
3.3 Avaliação da regulação hormonal múltipla do crescimento radicular sob
estresse osmótico..................................................................................................... 28
3.4 Efeito da adição de etileno no crescimento de raízes com diferentes balanços
ABA/IAA ou respostas a ele..................................................................................... 28
3.5 Efeito da inibição da ação do etileno no crescimento radicular em condições
de estresse osmótico................................................................................................ 29
3.6 Efeito da inibição do ABA no crescimento radicular em condições de estresse
osmótico................................................................................................................... 30
3.7 Análise dos resultados....................................................................................... 31
4 RESULTADOS DISCUSSÃO................................................................................ 32
4.1 Avaliação da regulação hormonal múltipla do crescimento radicular sob
estresse osmótico..................................................................................................... 32
4.2 Efeito da adição de etileno no crescimento de raízes com diferentes balanços
ABA/IAA ou respostas a ele..................................................................................... 36
8
4.3 Efeito da inibição da ação do etileno no crescimento radicular em condições
de estresse osmótico................................................................................................
39
4.4 Efeito da inibição do ABA no crescimento radicular em condições de estresse
osmótico.................................................................................................................... 41
5 CONCLUSÕES E PERPECTIVAS........................................................................ 45
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 47
9
RESUMO
CONTROLE HORMONAL DO CRESCIMENTO DE RAÍZES DE TOMATEIRO
(Lycopersicon esculentum cv. MICRO-TOM) EM CONDIÇÕES DE DÉFICIT
HÍDRICO
A deficencia hídrica é o principal fator de estresse para o crescimento vegetal..
Dentre os mecanismos de resistência à seca tem-se a resposta de crescimento
radicular sob condições de déficit hídrico. Esta resposta assume-se ser regulada por
hormônios vegetais. Uma abordagem interessante para o estudo de processos
regulados por hormônios é a utilização de mutantes hormonais em um modelo genético.
O tomateiro cv. Micro-Tom por seu porte reduzido e ciclo de vida curto constitui em bom
modelo genético. Mutantes hormonais em tomateiro com baixo nível endógeno de ABA
(sit, flacca), insensível a etileno (Nr), com superprodução de etileno (epi) e insensível à
auxina (dgt) constituem-se valiosas ferramentas para o estudo da ação hormonal na
regulação de processos fisiológicos. O presente trabalho teve como objetivo estudar a
interação hormonal na regulação do processo de crescimento radicular em condições
de déficit hídrico no cultivar Micro-Tom de tomateiro. Sementes germinadas de MT e
dos mutantes sit, dgt, epi, e Nr foram colocadas em caixas Gerbox pretas contendo
água e soluções de PEG apresentando potenciais de – 0,3; -0,6; -0,9; -1,2 MPa. Após
cinco dias foi avaliado o comprimento da raiz e do hipocótilo. Também foram realizados
experimentos com sementes de MT e dos mutantes em Gerbox contendo inibidores da
biossíntese de ABA (fluridone), da ação do etileno, o tiossulfato de prata (STS) e um
liberador desse mesmo hormônio, o ácido 2-cloro-etil-fosofonico (CEPA) em água e em
solução de PEG com potencial osmótico de – 0,6 MPa. O comprimento das raízes foi
avaliado após cinco dias. O potencial osmótico de – 0,6 MPa favoreceu o crescimento
radicular nos genótipos MT, dgt e epi e em menor grau em Nr. Esse crescimento não
ocorreu nos genótipos sit. No mutante sit há um inchaço semelhante ao provocado por
excesso de etileno. Quando foi adicionado o CEPA (etileno), houve inibição severa do
crescimento radicular em água em MT e em sit. A inibição foi menor em dgt. Em
potencial de -0,6 MPa a inibição foi mais severa do que em água no MT. A inibição do
etileno provocada pelo STS, causou uma maior diferença entre o crescimento em água
e no potencial de -0,6 MPa no MT à medida em que se aumentava a concentração de
STS. Em dgt tais diferenças não foram observadas. Quando se adicionou fluridone, à
medida que se aumentou a dose, houve uma maior inibição do crescimento radicular,
sendo que esta inibição foi menos acentuada em Nr e dgt. Em potencial de – 0,6 MPa a
inibição foi mais acentuada mas seguiu a mesma tendência observada em água. Em
altas concentrações de fluridone houve ramificação das raízes, interferindo no
comprimento radicular. Pode-se concluir que em condições de déficit hídrico moderado
há um aumento do crescimento radicular quando comparado a condições normais de
10
suprimento hídrico. Esse crescimento provavelmente é controlado por um balanço
ABA/IAA, o qual modula a resposta ao etileno.
Palavras chave: Lycopersicon, mutantes hormonais, crescimento radicular, hormônio
vegetal.
11
ABSTRACT
HORMONAL CONTROL OF ROOT GROWTH OF MICRO - TOMATO (Lycopersicon
esculentum cv. MICRO-TOM) UNDER WATER DEFICIT CONDITION
Drought is the major abiotic plant stress factor. Among the mechanisms of water
deficit resistance the root growth response has expressive importance. This response
seems to be regulated by hormones. An interesting method to study hormone regulated
processes is the use of hormonal mutants. The tomato cultivar Micro-Tom (MT) have
reduced size and short life cycle and therefore constitutes an excellent genetic model for
physiology studies. Hormonal mutants in MT with low endogenous ABA (sit and flc),
ethylene insensitivity (Nr), ethylene overproduction (epi) and auxin insensitivity (dgt)
constitute valuable tools to study hormone action in plant development.The present work
aimed to study the hormonal interaction in the control of root growth of tomato MT
subjected to water deficit. Germinated seeds of MT and mutants epi, sit, Nr, e dgt were
placed in a black Ger-Box containing water and PEG 6000 solutions with potentials of -
0,3; -0,6; -0,9 e 1,2 MPa. After 5 days the length of root and hypocotyls were measured.
Others experiments were conducted in Ger-Box containing ethylene action inhibitor,
silver thiosulphate (STS), ABA biosynthesis inhibitor (Fluridone) and an ethylene
releaser, 2-chloroethyl-phosphonic acid (CEPA) in different concentrations in water and
in a -0,6 MPa osmotic potential PEG solution. After 5 days the length of the roots were
measured. The PEG solution of – 0,6 MPa promoted root growth in MT, dgt, epi and in
with less intensity in Nr . The promotion of root growth did not occur in sit. In the mutant
sit, low potential caused a swelling in the roots similar to excess ethylene symptoms.
When CEPA was used, a severe inhibition of root growth occurred. The inhibition was
less intense in dgt. In the – 0,6 MPa solution the inhibition was more severe than
occurred in water in MT. When ethylene action was inhibited by the application of STS, a
greater difference of root growth between water and – 0,6 MPa PEG solution occurred
as the STS concentration increased. In the mutant dgt these differences were not
observed. In the experiment with fluridone as the dose increased the inhibition in the
root growth increased concomitantly. The inhibition was less severe in Nr and dgt. In
higher doses of fluridone root ramification occurred, interfering in the primary root
length. By these results it can be concluded that a moderate water deficit promotes root
growth better than in a normal water supply condition. Probably this growth is regulated
by an ABA/IAA balance which modulates ethylene response.
Key words: Lycopersicon; hormonal mutants; water stress; root elongation; plant
hormones
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Efeito do estresse osmótico no comprimento de raízes e caules
(hipocótilos) de tomateiro cultivar Micro-Tom (MT) e dos mutantes sitiens
(sit), diagetropica (dgt), Never ripe (Nr) e epinastic
(epi)............................................................................................................. 34
Figura 2 - Efeito da aplicação de CEPA (liberador de etileno) sobre o comprimento
de raízes em água (A) e sob estresse osmótico moderado (B) em MT e
nos mutantes sit e dgt................................................................................. 37
Figura 3 - Aspecto das plântulas de MT, sit e dgt em água e em potencial de – 0,6
MPa nas concentrações de 0 e 500 µM de CEPA...................................... 38
Figura 4 - Efeito de um inibidor da ação de etileno (STS) no comprimento de raízes
com e sem estresse osmótico em MT (A) e no mutante dgt
(B)................................................................................................................ 40
Figura 5 - Aspecto de plântulas de MTe dgt em água e em potencial de – 0,6 MPa
em diferentes concentrações de STS......................................................... 41
Figura 6 - Efeito de um inibidor de ABA (fluridone) no comprimento de raízes sem
estresse osmótico (A) e com estresse osmótico (B) em MT e nos
mutantes dgt, epi e Nr................................................................................. 42
Figura 7 - Aspectos de plântulas de MT dgt, epi e Nr em água e em potencial de –
0,6 MPa em diferentes concentrações de
fluridone....................................................................................................... 44
Figura 8 - Uma hipótese para a modulação do crescimento do sistema radicular
pelo balanço entre auxina e ácido abscísico............................................... 45
13
LISTA DE ABREVIATURAS
ABA = ácido abscísico
CEPA = ácido cloro-etil-fosfônico
dgt = mutante diagetropica
epi = mutante epinastic
IAA = ácido indolilacético
MT = Micro-Tom
Nr = mutante Never ripe
PEG = polietileno glicol
sit = mutante sitiens
STS = tiosulfato de prata
14
1 INTRODUÇÃO
Plantas freqüentemente encontram estresses ambientais, condições externas
que afetam o desenvolvimento ou crescimento de órgãos isolados, que podem ter
impacto na produtividade de culturas. Esses estresses ativam variadas respostas nas
plantas desde alteração na expressão gênica e no metabolismo até mudanças na taxa
de crescimento e produtividade.
A seca é o principal fator de estresse abiótico que limita a produtividade em todo
o mundo e o entendimento dos mecanismos que controlam a resistência à seca é
importante recurso para a biologia vegetal. A medida que a água para irrigação se torna
escassa, o desenvolvimento de linhagens resistentes a seca converte-se em prioridade.
Um aspecto de importante em relação à tolerância à seca é a resposta de crescimento
radicular sob condições de estresse hídrico.
Em plantas crescendo em solos secos, o desenvolvimento do sistema radicular é
normalmente menos inibido que a parte aérea, e pode até ser promovido (SHARP;
DAVIES, 1989). Essa resposta do sistema radicular ao déficit hídrico assume-se ser
devido à atuação e o balanço de hormônios vegetais como o ácido abscísico (SHARP,
2002), a auxina (RIBAUT; PILET, 1994) e o etileno (SPOLLEN et al., 2000).
A manutenção do crescimento do sistema radicular durante déficits hídricos é um
beneficio obvio para manter um adequado suprimento hídrico e os mecanismos que
levam a essa resposta devem ser estudados. Uma abordagem para estudar esse
crescimento radicular em condições de estresse hídrico é o uso de um modelo genético
no qual mutantes hormonais estão disponíveis. É o caso do tomateiro cultivar Micro-
Tom, que apresenta características de modelo genético e apresenta mutantes
hormonais (PERES et al., 2004),
O uso destes modelos genéticos e mutantes em diferentes classes hormonais
tem sido pouco explorado no estudo de estresse hídrico, entretanto podem tornar-se
importante ferramenta na elucidação dos mecanismos fisiológicos deste processo.
O presente trabalho teve como proposta estudar a interação hormonal no
controle do crescimento radicular em condições de estresse hídrico através do uso de
um modelo genético, o cultivar de tomateiro Micro-Tom, e seus mutantes hormonais.
15
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Hormônios e crescimento radicular
O entendimento do desenvolvimento e do crescimento das raízes se faz
relevante nas espécies de interesse agronômico, uma vez que a produtividade de
qualquer cultura é dependente da absorção de água e nutrientes por esse órgão
(GABELMAN et al., 1986).
Dentre outros fatores, o crescimento radicular é controlado por hormônios
endógenos, cuja interação parece essencial (PERES; KERBAUY, 2000).
A auxina (IAA) é o hormônio responsável pela indução de raízes adventícias.
Entretanto, sabe-se que também provoca inibição do crescimento radicular em
tratamentos exógenos. Pilet; Elliott e Moloney (1979) confirmaram que, quando aplicado
em alta concentração, o IAA inibiu o crescimento radicular de milho.
Entretanto, também foi verificado que este hormônio em baixa concentração
promove crescimento de raízes intactas. Pilet; Elliott e Moloney (1979), trabalhando
com raízes de milho, mostraram que o conteúdo endógeno de auxina nas raízes
intactas costuma se elevar durante seu crescimento, de tal forma que após alcançar
uma concentração supra-ótima a aplicação de auxina causa uma inibição do
crescimento, corroborando os resultados anteriores.
O ácido abscisico (ABA) também é um conhecido inibidor do crescimento
radicular (PILET; SAUGY, 1987). Além dos trabalhos de Pilet em raízes de milho, pode
se citar, entre vários outros, que em Lactuva sativa, a aplicação de 38-41 µM de ABA
induziu a uma inibição de cerca de 30 % do crescimento radicular (ASPINALL; PALEG;
ADDICOTT, 1967). Para tomateiro cultivado in vitro, a aplicação de 0,1 µM de ABA
provocou uma inibição no crescimento de cerca de 50% (STREET, 1969). Entretanto,
existem alguns trabalhos que indicam um efeito estimulante no alongamento celular
promovido pelo ABA (PILET, 1998). A exemplo disso, o crescimento radicular de Pisum
sativum foi aumentado em 29% quando houve aplicação de 1 µM de ABA (GAITHER;
LUTZ; FORRENCE, 1975).
16
Pilet e Saugy (1987), notando a similaridade das respostas do crescimento
radicular em relação a IAA e ao ABA, em experimento com raízes de milho,
compararam o efeito de IAA e ABA endógeno e aplicado no crescimento radicular. Foi
observado que as raízes com crescimento lento foram inibidas pelos hormônios
aplicados em qualquer concentração, enquanto que raízes com crescimento rápido
tiveram seu crescimento aumentado por ambos os hormônios em baixa concentração,
sendo que o efeito do IAA no alongamento radicular é mais intenso que o do ABA.
Esses mesmo autores quantificaram o nível destes hormônios em raízes em
crescimento. As raízes foram divididas em grupos com diferentes taxas de crescimento
a fim de relacionar taxa de crescimento radicular e nível endógeno de IAA e ABA.
Observou-se que há uma clara relação entre os parâmetros, mostrando que quanto
menor o nível endógeno destes hormônios maior é o crescimento radicular, sendo que
no caso de raízes com crescimento lento, foi encontrado mais IAA na zona de extensão.
Pode-se entender que as raízes com rápido crescimento apresentam concentrações
sub-ótimas de IAA e ABA, o que permite o crescimento radicular quando há a aplicação
de baixas concentrações destes hormônios.
Como ambos os hormônios provocam o mesmo comportamento, apesar de em
diferente intensidade, há também a interpretação de que a resposta à auxina pode estar
sendo influenciada pelo conteúdo endógeno de ABA e vice-versa. Em outras palavras,
a regulação do crescimento radicular poderia se dar através de um balanço entre IAA e
ABA (PERES; KERBAUY, 2000).
As citocininas são sintetizadas nos ápices radiculares e são transportadas até a
parte aérea via xilema (VAN STADEN; DAVEY, 1979). Já se considerou que apesar de
estarem presentes em alta concentração no ápice das raízes, as citocininas não estão
envolvidas na regulação do crescimento radicular (TORREY, 1976). Entretanto alguns
experimentos sugerem que as citocininas endógenas, em concentrações fisiológicas
normais inibem o crescimento da raiz (SAKAI et al., 2001). Pode-se citar como exemplo
o fato de que tanto um mutante deficiente para um dos receptores de citocinina, quanto
um mutante com um alelo com perda de função para um elemento sinalizador de
citocinina, apresentam raízes mais longas do que o tipo selvagem (SAKAI et al., 2001).
Outro exemplo é a planta de tabaco transgênica, que super expressa a citocinina
17
oxidase e assim reduz os níveis de citocinina, apresentando também raízes mais longas
do que o seu tipo selvagem (WERNER et al., 2001). Tais resultados indicam que as
citocininas endógenas podem regular negativamente o alongamento das raízes.
Existem também vários relatos da resposta das raízes à aplicação de citocinina
exógena. Stenlid (1982) observou que adicionando citocinina à solução de crescimento
houve inibição do alongamento radicular. Bertell; Bolander e Eliasson, (1990) também
observaram que uma resposta comum a aplicação exógena de citocinina é um aumento
na no diâmetro das raízes. Bertell e Eliasson (1992), estudaram como a citocinina, o
etileno e a auxina interagem no alongamento das raízes, confirmando que as raízes são
afetadas pela citocinina, inibindo o crescimento radicular e induzindo a um inchaço das
raízes, assim como a auxina e o etileno. Tal inchaço pode ser facilmente interpretado
como sendo característico do efeito da auxina e da citocinina na indução da produção
de etileno. Hashimoto (1961 apud BERTELL; ELIASSON, 1992) demonstrou que a
citocinina causava inchaço em ervilha somente na presença de auxina. Bertell;
Bolander e Eliasson, (1990) também notaram essa interação sinergística em raízes de
ervilha, sugerindo que o nível endógeno de auxina pode ser um fator importante
determinando se a aplicação de citocinina vai resultar ou não no inchaço das raízes.
Hoje sabemos que auxina e citocininas possuem funções complementares na
biossíntese do etileno, sendo a primeira classe hormonal indutora da transcrição do
gene da sintase do ACC (uma enzima chave na biossíntese do etileno) e a citocinina
age pós - transcricionalmente favorecendo o acúmulo da proteína para a sintase do
ACC (RASHOTTE et al., 2005). Um evento que pode favorecer esse sigergismo é a
constatação de que tratamentos com citocinina normalmente aumentam o conteúdo de
auxina dos tecidos das plantas (NOOR SALEH, 1981).
Stenlid (1982) já havia sugerido que o efeito inibitório da citocinina no
crescimento é mediado pelo aumento na produção de etileno. Cary; Liu e Howell (1995)
examinaram a relação entre as respostas em Arabidopsis da aplicação de citocinina e
de etileno e descobriram que o etileno é mediador de uma série de respostas da planta
a citocinina, como a inibição do crescimento radicular e do hipocótilo. Segundo os
autores, a citocinina estimula a produção de etileno, que por sua vez, inibi o
18
crescimento radicular, e por isso o efeito inibitório da citocinina pode ser bloqueado, em
parte, pela ação de inibidores de etileno ou por mutantes defectivos em etileno.
O etileno é conhecido por ter um papel importante na regulação de diversos
processos fisiológicos, como senescência foliar, abscisão de órgãos, amadurecimento
de frutos, entre outros. Entretanto, desde a descoberta de que o etileno apresenta efeito
estimulante na formação de raízes adventícias em diversas espécies (ZIMMERMAN;
HITCHCOCK apud CLARK et al., 1999), vários experimentos têm sido conduzidos com
o intuito de verificar o papel deste hormônio na iniciação e desenvolvimento das raízes
(CLARK et al., 1999).
Os resultados têm se apresentados contraditórios. Em experimentos com
tomateiro (Lycopersicon esculentum) usando aplicação exógena de etileno, verificaram-
se efeitos estimulantes (PHATAK; JAWORSKI; LIPTAY, 1981) e inibitórios (COLEMAN
et al., 1980).
Na maior parte dos trabalhos publicados, o etileno é citado como inibidor do
crescimento radicular. Whalen e Feldman (1988) confirmaram esta hipótese, ao
verificarem o controle do crescimento primário de raízes de milho pelo etileno e
observarem que em concentrações de etileno iguais ou maiores que 0,1 µL/L o
alongamento radicular foi inibido por 24 horas, sendo este recuperado após 15 minutos
da remoção do hormônio.
Entretanto Konings e Jackson (1979 apud FELDMAN, 1984) trabalhando com
raízes intactas de arroz, mostarda branca e diversas variedades de tomateiros,
mostraram que as raízes com maiores taxas de alongamento também mantinham as
maiores taxas de etileno endógeno. Esses mesmos autores também observaram que
quando raízes com níveis conhecidos de etileno endógeno eram expostas a etileno
exógeno, a natureza da resposta dependia da concentração externa do hormônio. Em
condições de baixa concentração de etileno (0,02-0,1 ppm), o alongamento era
estimulado em todas as raízes examinadas. Entretanto quando a concentração passava
de 0,1 ppm, podia-se observar inibição de algumas raízes, sendo que à concentração
de 1 ppm, todas as raízes eram inibidas. Pode-se concluir que a planta precisa de uma
concentração ótima de etileno endógeno sendo que, enquanto não se atinge essa
concentração, a aplicação de etileno exógeno promove o crescimento radicular. Depois
19
de atingida esta concentração, o etileno passa a servir como inibidor do crescimento
radicular.
O hormônio giberelina é considerado um regulador muito importante no controle
do crescimento da parte aérea (HEDDEN; PROEBSTING, 1999). Entretanto, evidências
em várias espécies indicam que as giberelinas são também requeridas para o
desenvolvimento normal das raízes (Yaxley et al., 2001). Inada et al. (2000) em estudo
com Lemna minor, mostrou que o crescimento radicular foi inibido pelo uniconazole-P,
um inibidor da biossíntese de giberelina, e que a inibição pode ser suavizada pela
aplicação de GA
3
, indicando que a giberelina endógena está envolvida no controle do
crescimento radicular.
Yaxley et al. (2001), em experimento com mutantes em giberelina de ervilha
(Pisum sativum), mostraram que a deficiência em giberelina era acompanhada de
menor alongamento radicular, e que estes mutantes respondem à aplicação exógena
de giberelina. Esses autores também mostraram que no tipo selvagem de ervilha, a
aplicação exógena de giberelina não aumenta o comprimento radicular, apoiando os
resultados de Tanimoto (1988) que demonstraram a inabilidade da aplicação de GA
promover maior alongamento radicular em ervilhas do tipo selvagem a não ser nas que
foram previamente tratadas com inibidor de biossíntese de GA. Esses resultados
sugerem que o nível de GA nas raízes de genótipos não mutantes é suficiente para o
crescimento máximo das raízes. Recentemente foi demonstrado, através do uso de
mutantes de Arabidopsis, que a promoção do crescimento radicular pela auxina
endógena é através da desestabilização de proteínas repressoras (DELLA proteins) da
resposta ao GA (FU; HARBERD, 2003). Tais resultados evidenciam que pelo menos
parte do efeito da auxina na promoção do crescimento radicular é mediado por GA.
2.2 Estresse hídrico e crescimento radicular
Entre os vários fatores limitantes da produção vegetal, o déficit hídrico ocupa
posição de destaque, pois além de afetar as relações hídricas nas plantas, alterando-
lhes o metabolismo, é fenômeno que ocorre em grandes extensões de áreas cultiváveis
(NOGUEIRA; MORAES; BURITY, 2001).
20
As respostas das plantas ao déficit hídrico dependem, entre outros, das
características das plantas, incluindo órgão ou tecido atingido, estádio de
desenvolvimento e genótipo.
Uma característica importante da resposta do sistema radicular ao estresse
hídrico é a capacidade de algumas raízes de continuar o alongamento em potenciais
hídricos que são baixos o suficiente para inibir completamente o crescimento da parte
aérea (SHARP; DAVIES, 1979). Esses mesmos autores observaram esse processo em
raízes adventícias de milho, que precisam penetrar na camada seca da superfície do
solo. Sharp; Silk e Hsiao (1988) observaram um maior crescimento de raízes primárias
em diversas espécies sob condições de estresse hídrico, o que proporcionava o
estabelecimento das plântulas, uma vez que assegurava o suprimento de água antes
da emergência da parte aérea.
2.3 Controle hormonal do crescimento radicular sob estresse hídrico
Os mecanismos que determinam a diferente sensibilidade das raízes e da parte
aérea ao estresse hídrico não são bem entendidos. Os hormônios parecem ter
importante papel regulatório. Entretanto, pouco se conhece sobre o papel dos
hormônios e suas possíveis interações no controle deste crescimento radicular sob
condições de estresse hídrico.
O hormônio mais estudado neste aspecto é o acido abscísico (ABA). Tem sido
mostrado que para manter o crescimento de raízes primarias de milho sob condições de
baixo potencial hídrico é necessário o acumulo de ácido abscísico (SHARP, 2002).
Esse mesmo autor observou que quando plântulas de milho são conduzidas sob
potenciais hídricos de – 1,6 MPa, o conteúdo de ABA na zona de crescimento da raiz
aumenta cerca de cinco vezes.
Ribaut e Pilet (1991) em estudo com raízes de milho, observaram que à medida
que aumentava a severidade do estresse hídrico, ao conteúdo de ABA nas raízes
também aumentava, atingindo o máximo valor no nível de estresse correspondente a
um potencial hídrico de – 1,09 MPa.
21
Saab at al. (1990), com o objetivo de reduzir o acúmulo de ABA endógeno em
plântulas crescendo sob baixo potencial hídrico, utilizaram-se de duas técnicas: um
mutante de milho (vp5) deficiente na biossíntese de ABA, e uma substância inibidora da
biossíntese de carotenóide (fluridone), a qual é precursor de ABA (Taylor at al., 2000).
No tratamento com fluridone, houve uma redução no crescimento das raízes primárias
sob condições de baixo potencial hídrico. A taxa de alongamento das plântulas tratadas
com fluridone foi reduzida em 83% nas primeiras 30 horas após o transplantio para
vermiculita com baixo potencial hídrico. Nas plântulas não tratadas, a taxa de
alongamento foi reduzida em apenas 55% no mesmo potencial hídrico. O tratamento
com fluridone teve pouco efeito na taxa de alongamento em condições de alto potencial
hídrico (6-16% de redução no experimento). No experimento com o mutante vp5, a taxa
de alongamento do mutante, sob baixo potencial hídrico, foi reduzida em 86%
comparada com o genótipo selvagem. Como era esperado, baixo potencial hídrico
induziu um significativo aumento no conteúdo de ABA nas plântulas não tratadas e de
genótipo selvagem. Nas plântulas tratadas com fluridone e nos mutantes, no mesmo
potencial hídrico, o acúmulo de ABA foi reduzido consideravelmente. Os autores
sugerem que a redução no acumulo de ABA foi responsável pela inibição severa do
alongamento nas plântulas tratadas com fluridone e nos mutantes vp5 em condições de
baixo potencial hídrico. Isto indica que o acúmulo de ABA tem papel direto na
manutenção do crescimento da raiz primária em condições de estresse hídrico.
Estudos recentes têm demonstrado que uma importante função do ABA
endógeno na manutenção do crescimento da raiz primária em condições de baixo
potencial hídrico é prevenir o excesso de produção de etileno (SHARP, 2002). A
produção de etileno pelas plantas é aumentada por diversos tipos de estresse biótico ou
abiótico (ABELES, 1973). Déficit hídrico é um dos fatores que tem sido extensivamente
associado com elevada produção de etileno (GRAVES; GLADON, 1985).
Gertman e Fuchs (1972) estudando o efeito do ABA na produção de etileno em
plântulas de ervilha (Pisum sativum) e suas interações com IAA, cinetina e ácido
giberélico, mostraram que o ABA em concentração de 0,1 µM a 1 µM inibiu a produção
de etileno nas plântulas. Já o IAA e a cinetina induziram a produção de etileno.
22
Foi observado que raízes de plântulas deficientes em ABA, crescendo em
condições de baixo potencial hídrico apresentam, não somente menor crescimento,
como também engrossamento da raiz acima dos 2 mm apicais. Etileno exógeno inibe a
alongamento e causa um quadro similar de engrossamento das raízes em condições de
alto potencial hídrico (WHALEN; FELDMAN,1988).
Alem disso, foi demonstrado que sob estresse hídrico, a produção de etileno de
plântulas deficientes em ABA foi significativamente maior que nas plantas controle, e
esse efeito foi completamente revertido quando o conteúdo de ABA foi restaurado
através da aplicação exógena, juntamente com a retomada do crescimento das raízes
(SPOLLEN et al. 2000). Assim, pode-se deduzir que um aumento na concentração de
ABA em raízes sob condições de estresse hídrico é suficiente para prevenir a produção
excessiva de etileno, de acordo com os resultados já demonstrados que as raízes em
condições de baixo potencial hídrico necessitam de um conteúdo ótimo de ABA para a
manutenção do crescimento.
Alguns autores já discutem um possível papel do IAA na manutenção do
crescimento radicular sob estresse hídrico. Ribaut e Pilet (1994) investigaram se
existem mudanças nos níveis de auxina (livre e conjugada) em raízes de milho intactas
e isoladas em condições estresse hídrico. Foram realizadas medidas de peso, conteúdo
de água, crescimento e nível de IAA destas raízes. Observou-se que com o aumento do
estresse hídrico houve um aumento no nível de auxina. O maior aumento no nível de
auxina (cerca de 2,7 vezes mais que o controle) foi observado quando as raízes foram
submetidas a um estresse correspondente a um potencial osmótico de -1,39 MPa na
solução. O aumento dos níveis de auxina não diferiu entre as raízes intactas e as
isoladas. Considerando os resultados os autores chegaram à conclusão que o IAA
parece ter importante papel na regulação do metabolismo e crescimento das raízes em
condições de estresse hídrico.
Pode-se concluir, então, que os hormônios ABA, auxina e etileno controlam o
crescimento radicular sob estresse hídrico, interagindo de um modo dinâmico e
complexo e ainda não elucidado. Assim, é de extrema importância a realização de mais
estudos, utilizando novas abordagens, para lançar luzes novas ao entendimento do
controle hormonal do crescimento radicular sob déficit hídric
23
2.4 Abordagem para o estudo da ação dos hormônios
Para o estudo do papel dos hormônios no crescimento e no desenvolvimento
como um todo das plantas, existem três abordagens experimentais: a aplicação
exógena do hormônio ou do inibidor do hormônio; a realização de dosagens de
hormônios endógenos e a utilização de mutantes ou plantas transgênicas. Como se
verá adiante, todas essas abordagens são válidas e têm dado ou já deram
consideráveis contribuições ao entendimento que temos hoje sobre os hormônios
vegetais. Contudo, há limitações intrínsecas de cada abordagem que precisam ser
levadas em conta antes de utilizá-las.
A técnica de aplicação de hormônios ou inibidores é normalmente utilizada
quando o objetivo é buscar respostas específicas para cada classe hormonal e construir
curvas de dose-resposta para se testar a sensibilidade de um genótipo ou determinar
uma dose limite em um processo. A aplicação exógena do hormônio tem como
limitação o fato de que há necessidade de se ter o hormônio purificado, o qual,
dependendo da classe química, pode ser muito onerosos (ex. brassinoesteróides).
Outro fator que encarece a purificação de hormônios é a presença de isomeria óptica
(ex. forma + de ABA) e de posição (forma cis de ABA e trans de zeatina) na
determinação da forma realmente ativa. Além disso, há pouco conhecimento
relacionando as quantidades aplicadas com o que realmente é absorvido pelo tecido
teste e sobre os possíveis efeitos do hormônio aplicado na biossíntese ou inativação
dos hormônios endógenos. No caso do uso de inibidores, estes não são disponíveis
para todas as classes hormonais e nem sempre são específicos. Desse modo, embora
exista uma gama de inibidores para GA (RADEMACHER, 2000) e etileno (McKEON;
FERNÁNDEZ-MACULET; YANG, 1995), inibidores inequivocamente relacionados com
auxina só são disponíveis para bloquear seu transporte (exemplo TIBA e NPA). Como
já mencionado anteriormente, inibidores da biossíntese de carotenóides podem ser
utilizados para inibir a biossíntese de ABA, mas são obviamente inespecíficos. No caso
das citocininas, já se relatou a produção de inibidores de sua biossíntese (SHIMIZU et
al., 1989; SKOOG et al., 1973; SKOOG et al., 1975), mas estudos posteriores têm
demonstrado que não são verdadeiros (PERES, comunicação pessoal).
24
Já a metodologia de dosagens hormonais consiste na utilização de métodos
físico-químicos como a cromatografia gasosa, a HPLC e o teste ELISA, para a medição
do conteúdo endógeno de hormônios em ensaios biológicos. Como os hormônios estão
em baixa concentração nos tecidos vegetais, as técnicas existentes precisam ser muito
sensíveis, o que demanda equipamentos e reagentes onerosos, além da técnica em si
se tornar trabalhosa. Além disso, não se tem controle e/ ou conhecimento se o que esta
sendo dosado estava realmente ativo. Ou seja, toda dosagem envolve uma etapa de
extração e purificação que pode gerar artefatos ativando hormônios antes inativos por
conjugação. Há que se ter em conta que a própria maceração durante a extração
mistura tecidos, células e compartimentos celulares com características distintas e faz
com que se perca a informação sobre ativação ou desativação por
compartimentarização. Nesse contexto, uma técnica de dosagem que parece ser
promissora é a imunolocalização do hormônio ou, alternativamente, das proteínas ou
transcritos (mRNAs) envolvidas no metabolismo (proteínas de biossíntese e inativação)
ou sensibilidade (proteínas receptoras ou componentes da via de transdução de sinal).
Atualmente, uma das principais abordagens para o estudo do controle hormonal
do desenvolvimento tem sido o uso de genótipos contrastantes, sejam eles mutantes,
plantas transgênicas ou variação genética natural. Os mutantes podem ser encontrados
espontaneamente ou podem ser obtidos através da indução artificial, que consiste na
aplicação de substâncias químicas (EMS) ou de radiação (raio gama, raios-X ou
nêutrons) e posterior triagem ou “screening”.
Tais estudos são geralmente realizados em um reduzido número de espécies
vegetais, as quais possuem uma série de requisitos que as tornam bons modelos
genéticos para estudos fisiológicos. Dentre as espécies que preenchem tais requisitos,
o tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) está sendo amplamente utilizado. O
tomateiro possui genoma relativamente pequeno (7,1 x 108 pb), facilidade de
manipulação in vitro e obtenção de plantas transgênicas (PERES; MAJEROWICS;
KERBAUY, 2001), além de uma ampla riqueza de germoplasma constituída por
diversas mutações e pela possibilidade de introgressão de variação genética natural
vinda de 9 espécies selvagens de Lycopersicon que podem ser cruzadas com o
tomateiro cultivado (STEVENS; RICK, 1986). Entre as várias mutações já descritas em
25
tomateiro, encontram-se mutantes com alterações no metabolismo e/ou sensibilidade
de auxina (HICKS; RAYLE; LOMAX, 1989; KELLY; BRADFORD, 1986), ácido abscísico
(TAYLOR; BURBIDGE; THOMPSON, 2000; BURBIDGE et al., 1999), giberelinas
(JONES, 1987; BENSEN; ZEEVAART, 1990; KOORNNEEF et al., 1990), etileno
(FUJINO et al., 1988; WIKINSON et al., 1995) e brassinoesteróides (BISHOP et al.,
1999; KOKA et al., 2000), além de vários que alteram o desenvolvimento do sistema
radicular (STEVENS; RICK, 1986).
Para uma abordagem genética do controle hormonal do desenvolvimento está
sendo desenvolvida (pela equipe do prof. Lázaro E. P. Peres, ESALQ/USP) uma
produção de linhagens isogênicas contendo diversas mutações hormonais, plantas
transgênicas e variação genética natural no “background” do cultivar de tomateiro
Micro-Tom. O cultivar miniatura de tomateiro, proposto por Meissner et al. (1997) como
modelo genético, produz frutos e sementes viáveis em vasos de apenas 50-100 mL de
substrato, completando seu ciclo em 70-90 dias. Com essas características, o cultivar
Micro-Tom pode crescer em laboratório na mesma estrutura mínima requerida para
Arabidopsis (PERES, 2001).
Assim o objetivo do presente trabalho foi utilizar estes modelos genéticos, bem
como sua coleção de mutantes hormonais, a fim de investigar a ação dos hormônios,
bem como suas possíveis interações no processo de crescimento radicular em
condições de estresse hídrico.
26
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material vegetal
No presente trabalho foram utilizadas plantas de tomateiro (Lycopersicon
esculentum): mutantes hormonais dgt, epi, Nr, sit e flc (tabela 1) e o cultivar Micro-Tom
(MT). Os parentais dos mutantes hormonais foram gentilmente cedidos pelo Dr. Roger
Chetelat do Tomato Genetics Research Center (TGRC, University of Califórnia, Davis,
USA) e o parental MT foi doado pelo Dr.A. Levy (Weizmann Institute of Science –
Israel). As mutações acima citadas e outras afetando o metabolismo ou a sensibilidade
a diversas classes hormonais foram obtidas por cruzamentos e retrocruzamentos
sucessivos (introgressão) para um mesmo “background” genético representado pelo
cultivar MT. Esse trabalho vem sendo realizado no Laboratório de Controle Hormonal
do Desenvolvimento da Esalq/USP. Detalhes sobre os processos de cruzamento e
introgressão podem ser vistos em Lima et al. (2004) e no seguinte “site”:
http://www.ciagri.usp.br/~lazaropp/protocol/ManualCruzamento.PDF
27
Tabela 1 - Caracterização dos mutantes de tomateiro com alterações no
metabolismo/sensibilidade hormonal
Mutantes Características Morfológicas e funções
dos genes correspondentes
Referência
diageotropica (dgt) Planta anã, crescimento diageotrópico
dos caules e raízes; raízes em
ramificação. Defectivo na via de sinal de
auxina
Kelly &
Bradford,
1986
Never ripe (Nr) Plântulas não apresentam tríplice
resposta ao serem tratadas com etileno.
Frutos não amadurecem totalmente.
Defectivo para um gene do receptor de
etileno
Winkinson at
al., 1995
epinastic (epi) Epinastia severa; caule e pecíolos
dilatados; raízes muito ramificadas.
Superprodução de etileno.
Fujino et al.,
1988
Sitiens (sit) Planta pequena e fraca, folhas pequenas
com supermurchamento sob estresse.
Sementes tendem a germinar dentro dos
frutos muito maduros (viviparidade).
Defectivo para o gene que codifica uma
ABA - aldeído oxidase.
Taylor et al.,
2000
3.2 Desinfestação e germinação de sementes
As sementes de tomate foram colocadas em uma solução 5% de desinfetante
comercial (Cândida) a qual continha cerca de 2% de hipoclorito de sódio por 5 minutos.
Depois estas sementes foram lavadas com água destilada em abundância. As
sementes já desinfestadas de cada genótipo foram colocadas para germinar em caixas
Gerbox pretas contendo duas folhas papel de filtro embebido em água destilada. Foram
colocadas 100 sementes em cada caixa por genótipo e estas foram deixadas em
temperatura ambiente (25°C ± 2 °C) para germinação no escuro. As sementes foram
deixadas germinar por 02 dias em média, sendo posteriormente transferidas para os
respectivos tratamentos assim que a ponta da radícula fosse visível. Foram utilizadas
caixas pretas para que não houvesse ramificação da raiz primária promovida pela luz.
28
3.3 Avaliação da regulação hormonal múltipla do crescimento radicular sob
estresse osmótico
A sementes germinadas dos mutantes dgt, sit, epi e Nr e do controle MT foram
colocadas em caixas Gerbox pretas contendo 5 folhas de papel toalha comercial mais
uma folha de papel de filtro e 30 ml de cada solução tratamento. As soluções
tratamentos constaram de soluções de PEG 6000 (polietileno Glicol) em diferentes
proporções para se chegar aos seguintes potenciais osmóticos:
1. Água = 100 ml de água destilada + 0 de PEG 6000
2. - 0,3 MPa = 100 ml de água destilada + 15,14 g de PEG 6000
3. - 0,6 MPa = 100 ml de água destilada + 22,37 g de PEG 6000
4. - 0,9 MPa = 100 ml de água destilada + 27,93 g de PEG 6000
5. - 1,2 MPa = 100 ml de água destilada + 32,63 g de PEG 6000
As quantidades de PEG 6000 para atingir os potenciais osmóticos determinados
acima foram obtidas na tabela de potencial osmótico em função da concentração
(molalidade) de PEG calculada por Villela; Filho e Siqueira (1991). Foi considerado 1
MPa = 10 atm ~ 1 bar. As sementes foram deixadas nas caixas contendo os
tratamentos por 5 dias em temperatura ambiente (25°C ± 2 °C) e posteriormente foi
avaliada o comprimento da raiz e do hipocótilo com auxílio de paquímetro.
3.4 Efeito da adição de etileno no crescimento de raízes com diferentes balanços
ABA/IAA ou respostas a ele
Sementes germinadas de MT, sit e dgt foram colocadas em caixas Gerbox pretas
com 5 folhas de papel toalha comercial mais uma folha de papel de filtro com papel de
filtro embebidas com diversas concentrações de CEPA (0, 50, 100, 500 e 1000 µM) em
água e em solução de PEG com potencial osmótico de – 0,6 MPa. A fim de não alterar
o volume já determinado de 30 ml de solução tratamento em cada Gerbox , foram feitas
soluções estoques de CEPA de modo a adicionar somente 30 µl destas para se obter a
29
concentração desejada de CEPA (tabela 2). Após 5 dias, determinou-se o comprimento
das raízes.
Tabela 2 - Memória de cálculo para as soluções de CEPA
Tratamentos Composição
Água 30 ml de água
50 µM de CEPA (em água) 30 ml de água + 30 µl de CEPA 50 mM
100 µM de CEPA (em água) 30 ml de água + 30 µl de CEPA 100 mM
500 µM de CEPA (em água) 30 ml de água + 30 µl de CEPA 500 mM
1000 µM de CEPA (em água) 30 ml de água + 30 µl de CEPA 1000 mM
PEG (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa
50 µM de CEPA (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa + 30 µl de CEPA 50 mM
100 µM de CEPA (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa + 30 µl de CEPA 100 mM
500 µM de CEPA (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa + 30 µl de CEPA 500 mM
1000 µM de CEPA (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa + 30 µl de CEPA 1000 mM
3.5 Efeito da inibição da ação do etileno no crescimento radicular em condições
de estresse osmótico
Sementes germinadas de Mt e dgt foram colocadas em caixas Gerbox pretas com 5
folhas de papel toalha comercial mais uma folha de papel de filtro embebidos com
diversas concentrações de STS (0, 10, 50, 100 e 500 µM) em água e em solução de
PEG com potencial osmótico de – 0,6 MPa.
A solução de 0,02M de STS foi feita através da mistura dos reagentes tiosulfato de
sódio 0,1M (15,8 g/L) e nitrato de prata 0,1M (17 g/L) na proporção 1:4. Como a
molaridade da solução de STS é baixa não foi possível a adição de somente 30 µl da
solução. Portanto foram adicionados diferentes volumes da solução de STS para cada
concentração desejada (tabela 3).
Após cinco dias, determinou-se o comprimento das raízes.
30
Tabela 3 - Memória de cálculo para as soluções de STS
3.6 Efeito da inibição do ABA no crescimento radicular em condições de estresse
osmótico
Sementes germinadas de Mt, dgt, Nr e epi foram colocadas em caixas Gerbox
pretas com 5 folhas de papel toalha comercial mais uma folha de papel de filtro
embebidas com diversas concentrações de fluridone (0, 5, 10, 100 e 500 µM) em água
e em solução de PEG com potencial osmótico de – 0,6 MPa. A fim de não alterar o
volume já determinado de 30 ml de solução tratamento em cada Gerbox, foram feitas
soluções estoques de fluridone de modo a adicionar somente 30 µl destas para se obter
a concentração desejada de fluridone (tabela 4).
Após cinco dias, determinou-se o comprimento das raízes com o auxílio de um
paquímetro.
Tratamentos Composição
Água 30 ml de água
10 µM de STS (em água) 30 ml de água + 45 µl de STS 0,02 M
50 µM de STS (em água) 30 ml de água + 225 µl de STS 0,02 M
100 µM de STS (em água) 30 ml de água + 450 µl de STS 0,02 M
500 µM de STS (em água) 30 ml de água + 2,25 ml de STS 0,02 M
PEG (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa
10 µM de STS (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa + 45 µl de STS 0,02 M
50 µM de STS (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa + 225 µl de STS 0,02 M
100 µM de STS (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa + 450 µl de STS 0,02 M
500 µM de STS (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa + 2,25 ml de STS 0,02 M
31
Tabela 4 - Memória de cálculo para as soluções de fluridone
Tratamentos Composição
Água 30 ml de água
5 µM de fluridone (em água) 30 ml de água + 30 µl de fluridone 5 mM
10 µM de fluridone (em água) 30 ml de água + 30 µl de fluridone 10 mM
100 µM de fluridone (em água) 30 ml de água + 30 µl de fluridone 100 mM
500 µM de fluridone (em água) 30 ml de água + 30 µl de fluridone 500 mM
PEG (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa
5 µM de fluridone (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa + 30 µl de fluridone 5 mM
10 µM de fluridone (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa + 30 µl de fluridone 10 mM
100 µM de fluridone (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa + 30 µl de fluridone 100 mM
500 µM de fluridone (- 0,6 MPa) 30 ml de – 0,6 MPa + 30 µl de fluridone 500 mM
3.7 Análise dos resultados
Os resultados forma avaliados por meio de gráficos e da comparação de médias para
as quais foram calculados os respectivos erros padrões.
32
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação da regulação hormonal múltipla do crescimento sob estresse
osmótico
Ao se submeter plântulas de diferentes genótipos de tomateiro a diferentes
potenciais osmóticos, pôde se observar que baixos potenciais inibem mais o caule do
que a raiz (Figura 1), corroborando observações anteriores em outras espécies
(SHARP; DAVIES, 1979).
Na raiz, verifica-se que quanto menor o potencial osmótico, menor é o
comprimento. Entretanto, o potencial osmótico de – 0,6 MPa, parece ter favorecido o
crescimento radicular no genótipos MT (Figuras 1A e 1B), dgt (Figuras 1E e 1F) e em
menor extensão em epi (Figuras 1I e 1J). Isso não ocorre com o genótipo sit (Figuras
1C e 1D) e, no caso de Nr, embora estresse hídrico moderado ( -0,6 MPa) não tenha
prejudicado muito o crescimento das raízes, esse foi muito inferior ao controle água
(Figuras 1G e 1H). Peres; Kerbauy e Barriguelli (1998), em experimento envolvendo a
incubação de raízes de uma espécie de orquídea em meio de cultura com diferentes
potenciais de água, verificaram que raízes submetidas a um estresse hídrico moderado
cresceram mais que aquelas submetidas a um potencial de água elevado. Esse
fenômeno também foi observado por Spollen et al., (1993) em raízes primárias de
diversas espécies, o que ajudou o estabelecimento de plântulas sob condições de baixa
disponibilidade de água.
A raiz do mutante sit teve a maior inibição, como pode ser observado na figura
1C E 1D. Como sit apresenta baixo nível endógeno de ABA, sugere-se que o ABA seja
necessário para o crescimento radicular sob estresse hídrico, conforme já proposto por
Saab et al. (1990) e Sharp et al. (1994). Sendo assim, pode se especular que nos
demais genótipos, o maior crescimento radicular em potencial de – 0,6 MPa seja
devido, pelo menos em parte, a um acúmulo de ABA. De fato, diversos autores já
demonstraram que o conteúdo endógeno de ABA cresce em raízes sob estresse
hídrico. Ribaut e Pilet (1991) verificaram que o estresse hídrico induziu a um
significativo acúmulo ABA em raízes de milho e Peres; Kerbauy e Barriguelli (1998)
33
observaram que em orquídea, o nível de ABA na raiz apresentou uma correlação
negativa (r = - 0,99) com o conteúdo relativo de água nesses órgãos. Uma vez que há
uma correlação perfeita entre conteúdo de ABA e estresse osmótico, conclui-se que
altos níveis de ABA endógenos podem estar relacionados ao mesmo tempo com dois
processos antagônicos, ou seja, com a indução (em estresse hídrico moderado) e a
inibição (estresse hídrico severo) do crescimento radicular. Tal paradoxo sugere que
embora o aumento no nível endógeno de ABA possa ser condição necessária para o
crescimento radicular sob estresse hídrico, não é condição suficiente.
O mutante Nr, o qual é insensível a etileno, em potencial de -0,6 MPa apresentou
crescimento radicular alto, entretanto em água o crescimento radicular foi mais alto
ainda (Figura 1G). Ao se comparar o crescimento de Nr em água com os demais
genótipos nesse mesmo tratamento, pode - se inferir que o etileno é um dos principais
inibidores do crescimento da raiz. Corroborando isso, observou-se que o mutante epi, o
qual apresenta superprodução de etileno, apresentou pequeno crescimento em todos
os potenciais, inclusive na água (Figura I). Stenlid (1982) já afirmava que o etileno é o
principal inibidor do crescimento de raízes e Whalen e Feldman (1988) observaram que
a aplicação de etileno diminuía o crescimento radicular de raízes primárias de milho.
Esses resultados parecem indicar que o efeito do ABA na promoção do crescimento de
raízes de tomateiro, discutido anteriormente, é justamente inibir o etileno, conforme já
demonstrado por Spollen et al. (2000) para raízes de milho. Esses autores observaram
que sob condições de estresse hídrico, plântulas deficientes em ABA apresentavam
maior produção de etileno e esse efeito era prevenido com a aplicação de ABA,
juntamente com a retomada do crescimento radicular.
34
Figura 1 – Efeito do estresse osmótico no comprimento de raízes e caules (hipocótilos)
de tomateiro cultivar Micro-Tom (MT) e dos mutantes sitiens (sit),
diagetropica (dgt), Never ripe (Nr) e epinastic (epi).
35
Antes mesmo dos trabalhos de Spollen et al. (2000), já se tinha uma idéia de que
o ABA é necessário para a inibição do etileno, uma vez que Tal et al. (1979)
demonstraram que o mutante de tomateiro flacca, que apresenta baixo nível endógeno
de ABA, contém alto conteúdo endógeno de auxina e de etileno. Nesse contexto, é
interessante notar que mutante sit, o qual apresenta baixo nível endógeno de ABA,
apresentou raízes pequenas e mais grossas sob baixo potencial osmótico (Figura 1D).
O engrossamento de raízes é uma resposta típica da aplicação de etileno exógeno ou
de substâncias indutoras da biossíntese desse hormônio, como é o caso de altas
concentrações de auxina.
Por outro lado, o baixo crescimento radicular observado no mutante dgt, que é
insensível a auxina (Figuras 1E e 1F), em todos os tratamentos confirmou a hipótese
proposta por Pilet e Saugy (1987) de que a auxina também é essencial para o
crescimento radicular, tanto em condições ótimas de suprimento de água, como sob
estresse hídrico.
Através dos resultados acima apresentados pode-se concluir que o acúmulo de
ABA é necessário para que a raiz cresça em condições de estresse hídrico,
possivelmente atuando como inibidor do etileno. Também foi discutido que é necessário
o acúmulo de auxina para o crescimento radicular, embora esse hormônio leve a
produção do inibidor etileno. Como ABA e auxina são promotores do crescimento
radicular e têm efeitos contrários no “status” do etileno endógeno, uma hipótese
interessante seria de que o crescimento radicular é controlado por um balanço ABA/IAA
endógeno, conforme já sugerido por Peres; Kerbauy e Barriguelli (1998). Esse balanço
teria um ponto ótimo quando a auxina atuaria somente como um indutor do crescimento
radicular, tendo seu efeito deletério na produção de etileno minimizado, graças a ação
do ABA. Se tal hipótese estiver correta, o efeito deletério do etileno no crescimento
radicular sob estresse osmótico dependerá do balanço ABA/IAA endógeno, o que foi
testado, conforme relatado abaixo.
36
4.2 Efeito da adição de etileno no crescimento de raízes com diferentes balanços
ABA/IAA ou respostas a ele
O efeito da adição de etileno em diferentes balanços ABA/IAA foi testado
adicionando o ácido cloro-etil-fosfônico (CEPA), uma substância liberadora desse
hormônio, em raízes de MT, dgt e sit. Desse modo, considerando-se MT como controle,
o mutante sit representa um balanço ABA/IAA baixo, já que é defectivo para produção
de ABA. Embora dgt não seja um mutante no metabolismo, mas sim na sensibilidade a
IAA, ele pode ser considerado como representante de um balanço ABA/IAA alto, já que
é pouco sensível a IAA. Pode-se observar através das figuras 2A e 3, que a adição do
etileno inibiu profundamente o crescimento radicular em água. A inibição tendeu a ser
menor no mutante dgt, o que sugere que quando o balanço é favorável ao ABA, o efeito
deletério do etileno tende a ser menor. Por outro lado, um baixo balanço ABA/IAA,
representado pelo mutante sit está coerentemente correlacionado com uma maior
inibição do crescimento radicular pela aplicação de etileno (Figura 2A).
37
Figura 2 – Efeito da aplicação de CEPA (liberador de etileno) sobre o comprimento de
raízes em água (A) e sob estresse osmótico moderado (B) em MT e nos
mutantes sit e dgt.
38
Figura 3 – Aspecto das plântulas de MT, sit e dgt em água e em potencial de – 0,6 Mpa
nas concentrações de 0 e 500 µM de CEPA
Em baixo potencial osmótico (Figura 2B), o efeito inibitório do etileno sobre o
crescimento radicular foi mais pronunciado. Em MT o crescimento radicular sob
potencial de -0,6 MPa teve uma queda acentuada com a aplicação de 50 µM de CEPA,
o que não ocorreu em água. Mesmo nestas condições de estresse hídrico o genótipo
com balanço favorável a ABA (dgt) tendeu a um menor efeito inibitório do etileno
(Figuras 2B e 3).
39
Esses resultados sugerem fortemente que o crescimento radicular sob estresse
hídrico depende do balanço ABA/IAA, o qual modula a resposta ao etileno. Contudo,
uma questão que se levanta é se certa quantidade de etileno não seria necessária para
o crescimento radicular. Razões para levantar tal hipótese vêm do fato do etileno estar
intimamente relacionado com a capacidade das plantas de responderem a fatores de
estresse biótico e abiótico (MORGAN; MALCOLM, 1997) e com o fato do etileno poder
ter um efeito tanto positivo quanto negativo no crescimento de órgãos (ROBBINS;
KAYS; DIRR, 1983; GENEVE; HEUSER, 1983).
4.3 Efeito da inibição da ação do etileno no crescimento radicular em condições
de estresse osmótico
Como visto anteriormente, o mutante Nr, o qual é insensível a etileno, não
apresentou um maior crescimento radicular sob estresse hídrico. Esse resultado levanta
a hipótese de que certa quantidade de etileno seria necessária para o crescimento
radicular nessas condições. Desse modo, o efeito da inibição do etileno no crescimento
de raízes em condições de estresse osmótico foi avaliado através da aplicação de um
inibidor da ação do etileno (STS) em MT e em dgt. Pode-se observar que em MT à
medida que se diminui o etileno (aumento da concentração de STS) há uma maior
diferença entre o crescimento em H
2
O e em – 0,6 MPa (Figuras 4A e 5). Isso sugere
que, embora o etileno possa ser um inibidor do crescimento radicular, uma dose mínima
é necessária quando estas estão sob estresse hídrico. De fato, Konings & Jackson
(1979 apud FELDMAN, 1984), já haviam demonstrado que a resposta das raízes a
aplicação de etileno exógeno depende do teor de etileno endógeno, sugerindo que
existe um nível endógeno ótimo de etileno requerido nas raízes das plantas para seu
crescimento. Tal requerimento de etileno parece não ser necessário quando o material
é insensível a IAA (dgt), sugerindo que estímulo ao crescimento por etileno seja via
auxina (figuras 4B e 5).
40
Figura 4 – Efeito de um inibidor da ação de etileno (STS) no comprimento de raízes
com e sem estresse osmótico em MT (A) e no mutante dgt (B)
41
Figura 5 – Aspecto de plântulas de MTe dgt em água e em potencial de – 0,6 MPa em
diferentes concentrações de STS
4.4 Efeito da inibição do ABA no crescimento radicular em condições de estresse
osmótico
O inibidor de ABA fluridone foi aplicado nos mutantes hormonais com o objetivo de
diminuir ABA nas raízes, com isso diminuindo o balanço ABA/IAA (figura 6). A diferença
entre as raízes crescidas em água e aquelas crescidas em condições de baixo potencial
osmótico (-0,6 MPa) é que embora o balanço ABA/IAA seja o mesmo em ambas
condições, ele é alcançado com níveis mais baixos de ambos os hormônios em água e
altos níveis dos hormônios em condições de estresse hídrico, uma vez que tanto o nível
endógeno de ABA quanto de IAA aumentam sob esse estresse (RIBAUT; & PILET,
1994)
42
Figura 6 - Efeito de um inibidor de ABA (fluridone) no comprimento de raízes sem
estresse osmótico (A) e com estresse osmótico (B) em MT e nos mutantes
dgt, epi e Nr
A adição de fluridone diminui o teor de ABA e tem, portanto, o efeito de abaixar o
balanço ABA/IAA, sendo esse efeito mais acentuado em condições de baixo potencial
osmótico já que o nível de ABA necessário para o balanço ideal é alto. Em água fica
claro que à medida que o balanço ABA/IAA diminui, há uma inibição do crescimento
radicular, sendo esta menos acentuada em Nr e em dgt, os quais são mutantes pouco
sensíveis a etileno e auxina, respectivamente (Figuras 6A e 7). Uma interpretação
simples para esse resultado é que a diminuição no nível endógeno de ABA age menos
pela alteração de seu nível absoluto do que pelo deslocamento do balanço ABA/IAA
para auxina, o que é pouco efetivo no mutante dgt. Por outro lado, o efeito final do
43
balanço deletério voltado para auxina seria aumentar a ação inibitória do etileno, o que
é igualmente pouco efetivo no mutante Nr. A inibição do crescimento radicular em –
0,6 MPa (Figura 6B) foi muito acentuada, dificultando a distinção entre os genótipos,
mas de modo geral, os resultados seguiram a mesma tendência observada em água.
Em todos os genótipos, tanto em água quanto em baixo potencial hídrico, altas
concentrações de fluridone (100 e 500 µM) provocaram ramificações nas raízes,
interferindo, portanto, na medição do comprimento radicular. Como tal resultado não é
observado nos mutantes com baixo nível endógeno de ABA (Figura 1D), sugere-se que
seja um efeito colateral do fluridone em si. Nesse sentido, é interessante observar que
recentemente descobriu-se que um inibidor de ramificação pelo menos de caules é
derivado da clivagem de carotenóides (BOOKER et al., 2004), os quais estariam
obviamente em baixos níveis em raízes tratadas com fluridone.
44
Figura 7 – Aspectos de plântulas de MT dgt, epi e Nr em água e em potencial de – 0,6
MPa em diferentes concentrações de fluridone
45
5 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Com base nos resultados obtidos conclui-se que:
• Em condições de déficit hídrico moderado há um aumento do crescimento radicular
quando comparado com o crescimento em condições normais de suprimento de
água.
• O balanço ABA/IAA, o qual modula a resposta ao etileno, é possivelmente o
regulador no crescimento radicular sob estresse hídrico.
• Existe um balanço ABA/IAA ideal, o qual proporcional o maior crescimento sob
estresse hídrico. Quando este balanço é aumentado ou diminuído, por qualquer
motivo, há uma diminuição no crescimento radicular ou mesmo uma inibição deste
crescimento.
Figura 8 – Uma hipótese para a modulação do crescimento do sistema radicular pelo
balanço entre auxina e ácido abscísico
46
Têm-se como perspectivas:
• Obtenção de duplos mutantes hormonais a fim de melhor elucidar a interação
entre os hormônios ABA, Auxina e Etileno no controle do crescimento radicular
sob condições de estresse hídrico.
47
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