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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAIBA
CENTRO DE TECNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DE
ALIMENTOS
GISELY MARIA FREIRE ABÍLIO
AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS BIOQUÍMICOS E DA
ATIVIDADE DA BROMELINA EM CULTIVARES PARAIBANOS
DE ABACAXI
JOÃO PESSOA - PB
2008
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17
GISELY MARIA FREIRE ABÍLIO
AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS BIOQUÍMICOS E DA ATIVIDADE DA BROMELINA
EM CULTIVARES PARAIBANOS DE ABACAXI
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências e Tecnologia de
Alimentos da Universidade Federal da
Paraíba em cumprimento as exigências para
obtenção do título de Mestre em Ciências e
Tecnologia de Alimentos.
Orientador:
Dr. HEINZ JOHANN HOLSCHUH
JOÃO PESSOA – PB
2008
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18
A148a Abílio, Gisely Maria Freire.
Avaliação de parâmetros bioquímicos e da
atividade da bromelina em cultivares paraibanos de
abacaxi. / Gisely Maria Freire Abílio.-
João Pessoa,
2008.
109p.
Orientador: Heinz Johann Holschuh
Dissertação (mestrado) – UFPB/CT
1. Tecnologia de alimentos. 2. Abacaxi -
bioquímica – avaliação. 3. Abacaxi – cultivo – Paraíba.
UFPB/BC CDU: 664(043)
19
GISELY MARIA FREIRE ABÍLIO
AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS BIOQUÍMICOS E DA ATIVIDADE DA
BROMELINA EM CULTIVARES PARAIBANOS DE ABACAXI
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Ciências e Tecnologia de
Alimentos da Universidade Federal da
Paraíba em cumprimento as exigências para
obtenção do título de Mestre em Ciências e
Tecnologia de Alimentos.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________________________
Prof. Dr. Heinz Johann Holschuh
Orientador
_________________________________________________________
Prof. Dr. Vicente Queiroga Neto
Examinador Externo
_________________________________________________________
Prof. Dr. Pushkar Singh Bora
Examinador Interno
20
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho
aos meus irmãos
Vanessa e Gustavo Abílio, por toda
amizade e carinho.
21
AGRADECIMENTOS
Ao meu Deus e a nossa Senhora pela presença constante em todos os
momentos da minha vida e por me dar força e coragem para superar todos os
obstáculos.
Ao Prof. Dr. Heinz Johann Holschuh, pela orientação deste trabalho.
Aos meus pais Celson e Maria do Carmo pela dedicação e incentivo, durante
todas as etapas da minha vida.
Ao meu esposo Ricardo Castro pelo incentivo e amor.
Aos meus melhores amigos, meus irmãos Vanessa e Gustavo Abílio, por todo
companheirismo.
Aos meus avós Francisco e Elza Freire (in memoriam), por me ensinarem a ter fé
e que com ela tudo se consegue.
A Empresa Estadual de Pesquisa Agropecuária da Paraíba, por permitir a
realização deste trabalho, fornecendo todas amostras.
Ao pesquisador Eliazar Oliveira, minha imensa gratidão, pela fundamental
colaboração durante as coletas deste estudo.
A todos os funcionários da EMEPA-pb, por toda gentileza com que sempre me
trataram.
Aos Professores Pushkar Singh Bora e Vicente Queiroga Neto pelas sugestões e
pela disponibilidade em me auxiliar na elaboração deste trabalho.
Ao meu amigo Robson, por toda paciência e boa vontade na realização das
análises estatísticas.
A todos os meus colegas de turma, principalmente Michele, Valéria, Bernadete,
Cláudia, João Paulo, Vanessa, Paloma e Vinícius que se fizeram presentes em todas
as etapas.
Em especial aos meus amigos Sérgio Lucena e Juan Letelier, pela presença,
carinho e apoio durante os momentos mais complicados deste trabalho, sem vocês
tudo teria sido mais difícil, obrigada!!!!!!!!
22
Aos meus irmãos de coração Núbia Ribeiro e Edilson Sobral, por estarem
sempre perto de mim, me dando forças para superar os momentos mais difíceis da
minha vida.
A Lúcia, por todo carinho com que sempre cuidou de mim e das minhas coisas e
por me ajudar a descascar os abacaxis.
A Gilvandro, pela atenção e apoio nas horas mais delicadas dos experimentos.
A Elck Carvalho, pelos pela ajuda e contribuição.
A Mônica Calvacanti, minha colega de trabalho, pela ajuda e compreensão nos
momentos em que precisei me ausentar para concluir mais esta etapa, obrigada!!!!
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudo e a Universidade Federal da
Paraíba pela formação e oportunidades.
A todos que me ajudaram e torceram para que eu concluísse mais esta etapa da
minha vida.
23
ABÍLIO, G. M. F Avaliação da atividade da bromelina e de parâmetros bioquímicos em cultivares
paraibanos de abacaxi.
RESUMO
Apesar da boa produção e aceitação dos abacaxis produzidos na Paraíba a
empresa Estadual de Pesquisa Agropecuária da Paraíba – Emepa-pb disponibiliza
material genético de abacaxizeiro (Ananás comosus L.) diversificado, na tentativa de
solucionar os problemas relativos a vulnerabilidade genética decorrentes do plantio de
apenas dois cultivares (Pérola e Smooth Cayenne) suscetíveis a pragas como a
fusariose. Dentre os híbridos fornecidos pela Emepa-pb destaca-se o Emepa-01,
Imperial e MD-2. Objetivando a caracterização bioquímica dos novos híbridos
paraibanos, este estudo avaliou parâmetros bioquímicos da polpa e da casca dos
cultivares Emepa-01, Imperial, MD-2, Pérola e Smooth Cayenne além da atividade da
bromelina, proteína e atividade específica da enzima no extrato bruto e em frações
obtidas com sulfato de amônio. O abacaxi Smooth Cayenne apresenta o menor pH
(3,44 para polpa e 3,91 para a casca) e a maior acidez titulável, (0,56% de ácido cítrico
para polpa e 0,52% de ácido cítrico para casca), configurando o cultivar mais ácido.
Dentre as polpas, evidencia-se que a dos abacaxis Pérola e Smooth Cayenne
apresentam porcentagem de açúcares totais, redutor e não redutor significativamente
maiores (p< 0,05) do que os híbridos produzidos na Paraíba, apesar destes obterem
valores mais elevados (maior que 30,00) da relação sólidos solúveis e acidez titulável, e
conseqüentemente, maior aceitação pelo consumidor. O cultivar Imperial apresenta
maior atividade proteolítica e de proteínas tanto para a polpa (56,41 U/mL de extrato
bruto e 7,50 mg de proteínas/ mL de extrato bruto) quanto para a casca (68,56 U/ mL
de extrato bruto e 10,40 mg de proteínas /mL de extrato bruto). Para a atividade
específica, a casca do abacaxi Pérola (10,01 U/ mg de proteínas) fornece valores
significativamente (p<0,05) mais elevados que os apresentados pelas outras amostras,
no entanto dentre as polpas a do cultivar Imperial (7,49 U/ mg de proteína) apresenta
atividade específica significativamente superior as demais. O abacaxi Smooth Cayenne
apresentou os maiores índices de fator de purificação tanto na polpa (33,02) quanto na
casca (14,85), quando submetido à precipitação fracionada de sulfato de amônio no
intervalo de 20-40% de saturação.
Palavras chave: abacaxi, bioquímica, atividade, bromelina.
24
ABILIO, G.M.F. Assessment of biochemical parameters and bromelain activity in Paraiban cultivars of
pineapple.
ABSTRACT
In spite of good production and acceptation of pineapples produced in Paraíba
the company Emepa - PB – Empresa Estadual de Pesquisa Agropecuária da Paraíba –
makes diversified genetic material of pineapple tree available (Ananás comosus L.), on
a trial to sort out related problems to genetic vulnerability decurrent of planting of only
two cultivars susceptible to plagues such as Fusarium wilt disease. Among the hybrids
provided by Emepa- PB, the highlighted ones are Emepa – 01, Imperial e MD-2. Aiming
the biochemical characterization of new Paraiban hybrids, this work assessed
biochemicals parameters of pulp and peel of cultivars Emepa 01, Imperial, MD-2, Pérola
and Smooth Cayenne beyond bromelain activity, protein and specific activity of enzyme
in brute extract and in obtained fractions with ammonium sulfate. Smooth Cayenne
pineapple variety introduces the smallest Ph (3,44 for pulp e 3,91 for peel) and the
biggest titled acidity (0,56% of citric acid for pulp and 0,52% of citric acid for peel),setting
up the most acid cultivar. Among the pulps we can make evident that Pérola and
Smooth Cayenne varieties present percentages of total sugars, reducer and non-
reducer significantly bigger (p< 0,05) than the hybrids produced in Paraíba, in spite of
obtaining more elevated values (bigger than 30,00) of soluble solids relation and titled
acidity, it consequently results on a better acceptation of consumers. The imperial
cultivar introduces bigger proteolytic and proteined activity on the pulp (56,41 U/mL of
brute extract and 7,50 mg of proteins/ mL of brute extract) as well as on the peel (68,56
U/ mL of brute extract and 10,40 mg of proteins /mL of brute extract). For specific
activity, the peel of Pérola pineapple variety (10,01 U/ mg of proteins) provides more
significantly elevated values (p<0,05) than those ones presented in other samples,
however the pulp from Imperial cultivar (7,49 U/ mg of protein) presented considerably
superior activity if compared to the rest. Smooth Cayenne pineapple variety introduced
the biggest indexes of purification on the pulp (33,02) as well as on the peel
(14,85),when submitted to fractionated precipitation of ammonium sulfate in a 20-40%-
interval of saturation.
Key words: pineapple, biochemical, activity, bromelain.
25
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Abacaxizeiro.
20
Figura 2 Abacaxizal.
22
Figura 3 Abacaxi Smooth Cayenne.
24
Figura 4 Abacaxi Pérola.
25
Figura 5 Abacaxi Emepa 01.
27
Figura 6 Abacaxi MD-2.
28
Figura 7 Abacaxi Imperial.
29
Figura 8 Parte de uma cadeia protéica mostrando as ligações peptídicas.
43
Figura 9 Estrutura tridimensional da protease.
44
Figura 10 Esquema representativo do complexo enzima e substrato.
44
Figura 11 Reação de Michaelis-Menton para catálise das proteínas pelas
proteases.
45
Figura 12 Mecanismo de reação da acilação e deacilação de proteínas pelas
proteases.
45
Figura 13 Fluxograma das atividades realizadas.
51
Figura 14 Fluxograma da extração e semi-purificação da bromelina.
55
Figura 15 Fluxograma das analises realizadas nas frações.
57
Figura 16 Atividade das frações concentradas com sulfato de amônia das
polpas dos cultivares analisados.
75
Figura 17 Atividade das frações concentradas com sulfato de amônia das
cascas dos cultivares analisados.
76
Figura 18 Proteína das frações concentradas com sulfato de amônia das
polpas dos cultivares analisados.
77
Figura 19 Proteína das frações concentradas com sulfato de amônia das
cascas dos cultivares analisados.
78
26
Figura 20 Atividade específica das frações concentradas com sulfato de
amônia das polpas dos cultivares analisados.
82
Figura 21 Atividade específica das frações concentradas com sulfato de
amônia das cascas dos cultivares analisados.
83
Figura 22 Fator de purificação das frações das polpas que obtiveram
atividade específica.
84
Figura 23 Fator de purificação das frações das cascas que obtiveram
atividade específica.
85
27
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Composição centesimal da polpa do abacaxi Pérola.
34
Tabela 2 Valores dos nutrientes da casca do abacaxi Pérola.
35
Tabela 3 Saturação do sulfato de amônio (NH
4
)
2
SO
4
g/litros da amostra.
54
Tabela 4 Valores médios dos teores de sólidos solúveis totais das polpas e
cascas dos cultivares analisados.
58
Tabela 5 Valores médios de pH das polpas e cascas dos cultivares
analisados.
60
Tabela 6 Valores médios de acidez titulável das polpas e das cascas dos
cultivares analisados.
61
Tabela 7 Resultados da relação sólidos solúveis totais e acidez titulável
(SST/AT) nas polpas dos cultivares analisados.
63
Tabela 8 Valores médios dos teores de açúcar redutor das polpas e das
cascas dos cultivares analisados.
64
Tabela 9 Valores médios dos teores de açúcar total das polpas e das
cascas dos cultivares analisados.
66
Tabela 10 Valores médios dos teores de açúcar não redutor das polpas e
das cascas dos cultivares analisados.
67
Tabela 11 Valores médios de atividade proteolítica das polpas e das cascas
dos cultivares analisados.
68
Tabela 12 Valores médios de proteínas das polpas e das cascas dos
cultivares analisados.
70
Tabela 13 Valores médios de atividade específica das polpas e das cascas
dos cultivares analisados.
73
Tabela 14 Rendimento protéico (RT) em porcentagem, nas frações derivadas
da precipitação fracionada com sulfato de amônio das polpas dos
cultivares analisados.
79
Tabela 15 Rendimento em atividade enzimática (AP) em porcentagem, nas
frações derivadas da precipitação fracionada com sulfato de
amônio das polpas dos cultivares analisados.
79
28
Tabela 16 Rendimento protéico (RT) em porcentagem, nas frações derivadas
da precipitação fracionada com sulfato de amônio das cascas dos
cultivares analisados.
80
Tabela 17 Rendimento em atividade enzimática (AP) em porcentagem, nas
frações derivadas da precipitação fracionada com sulfato de
amônio das cascas dos cultivares analisados.
81
29
LISTA DE ABREVIATURAS, SIMBOLOS E SIGLAS
AP – Rendimento em atividade enzimática
F.P – Fator de purificação da bromelina
RT – Rendimento em proteínas totais
S.A – Sulfato de amônia
SST – Sólidos Solúveis Totais
SS/AT – Relação sólidos solúveis totais e acidez titulável
TCA – Ácido Tricloroacético
30
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
16
2. OBJETIVOS
18
2.1 Geral
18
2.2 Específicos
18
3. REVISÃO DE LITERATURA
19
3.1 Abacaxi.
19
3.1.Abacaxizeiro.
19
3.1.2 Cultivo e colheita.
20
3.1.3 Cultivares.
23
3.1.3.1 Smooth Cayenne.
23
3.1.3.2 Pérola.
24
3.1.3.3 Híbridos cultivados na Paraíba.
25
3.1.3.3.1 Emepa 01.
26
3.1.3.3.2 MD-2. 27
3.1.3.3.3 Imperial. 29
3.1.4 Caracterização do fruto.
30
3.1.4.1 Composição química do abacaxi
32
3.1.4.2 Processamento da fruta
35
3.2 Enzimas. 36
3.2.1 Aspectos gerais. 36
3.2.2 Proteína . 37
3.2.2.1 Desnaturação. 37
3.2.2.2 Recuperação e purificação de proteínas. 39
3.2.3 Bromelina. 40
3.2.3.1 Mecanismo de ação das proteases. 42
3.2.3.2 Utilidades da bromelina. 45
3.3 Perfil do consumidor de abacaxi. 47
4. MATERIAL E MÉTODOS
49
31
4.1 Matéria-prima.
49
4.2 Métodos.
49
4.2.1 Preparo da amostra.
49
4.2.2 Determinação de sólidos solúveis.
49
4.2.3 Determinação do pH.
50
4.2.4 Determinação da acidez titulável.
50
4.2.5 Determinação da relação sólidos solúveis totais e acidez titulável.
50
4.2.6 Determinação do teor de açúcares.
50
4.2.6.1 Determinação de açúcares redutores.
50
4.2.6.2 Determinação do teor de açúcares totais.
51
4.2.6.3 Determinação de açúcares não redutores.
51
4.2.7 Obtenção do extrato bruto da enzima.
52
4.2.8 Determinação da atividade proteolítica (bromelina).
52
4.2.9 Determinação do teor de proteínas.
53
4.2.10 Determinação da atividade específica da bromelina.
53
4.2.11 Precipitação fracionada com sulfato de amônio.
53
4.2.12 Rendimento em atividade enzimática (AP).
55
4.2.13 Rendimento em Proteína total (RT)
56
4.2.14 Fator de purificação da bromelina.
56
4.4 Análise estatística.
57
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
58
5.1 Sólidos solúveis totais (SST)
58
5.2 pH.
59
5.3 Acidez titulável.
60
5.4 Relação sólidos solúveis totais e acidez titulável.
62
5.5 Açúcares.
64
5.5.1 Açúcares redutores.
64
5.5.2 Açúcares totais.
66
5.5.3 Açúcares não redutores.
67
5.6 Atividade proteolítica (bromelina).
68
32
5.7 Proteínas.
70
5.8 Atividade específica da bromelina.
72
5.9 Precipitação fracionada com sulfato de amônio.
74
5.9.1 Atividade proteolítica da bromelina
74
5.9.2 Proteína.
76
5.9.3 Rendimento protéico (RT) e em atividade enzimática (AP)
79
5.9.4 Atividade específica.
81
5.9.5 Fator de purificação.
84
6. CONCLUSÕES
86
7. REFERÊNCIAS
88
APÊNDICE
94
16
1. INTRODUÇÃO
O abacaxi (Ananas comosus L.) é uma fruta das regiões tropicais e subtropicais,
consumido em todo mundo, tanto ao natural quanto na forma de produtos
industrializados. Este fruto é extensivamente cultivado no Havaí, nas Filipinas, no
Caribe, Malásia, Austrália, México, África do Sul e no Brasil (SÃO PAULO, 2007). A
produção brasileira de abacaxis atingiu mais de 1,70 bilhões de frutos em 2007, e a
estimativa para 2008 é de cerca de 1,75 bilhões de unidades. Esse incremento
representa um acréscimo de 2,54% na produção nacional (IBGE, 2008),
caracterizando-o como um dos grandes produtores mundiais de abacaxi, sobretudo das
espécies Pérola e Smooth Cayenne. As principais áreas de cultivo são as regiões
amazônica e nordeste, entretanto sua produção abrange todo território nacional (SÃO
PAULO, 2007).
Na Paraíba, o tradicional cultivo de abacaxi, confere ao estado a credibilidade de
um dos maiores produtores nacionais. Em 2005, este estado retomou o posto de maior
produtor nacional, com uma produção de 325,6 milhões de unidades em uma área
colhida de 11.102 hectares, representando 22% do que o país produziu (IBGE, 2008).
Apesar da boa produção e aceitação dos abacaxis produzidos na Paraíba, a
empresa Estadual de Pesquisa Agropecuária da Paraíba – EMEPA-PB vem
trabalhando, há uma década, no sentido de oferecer materiais genéticos de
abacaxizeiro (Ananás comosus (L.) Merril.) diversificados, visando atender a novos
segmentos de mercado. Por questões relacionadas à ocorrência de doenças,
compreendem-se os riscos e as limitações advindos do cultivo exclusivo de apenas
uma ou duas cultivares (BARREIRO NETO, 2002). Entre essas novas cultivares
destacam-se o MD-2, Emepa 1 e Imperial.
O abacaxi, considerado por muitos como uma fruta inteira, é na verdade uma
infrutescência, em que diversos frutos independentes se fundem em um único corpo em
volta do talo fibroso (CAMPOS, 2007). A qualidade dos frutos é atribuída às suas
características físicas externas (coloração da casca, tamanho e forma do fruto), e
internas conferidas por uma ampla faixa de constituintes, dependente do estado
maturacional do fruto e fatores agronômicos e ambientais. Destacam-se na sua rica
17
composição química os altos teores de amido, proteína e enzimas proteolíticas
(bromelinas) (CAMPOS, 2007; FREIMAN e SABAA SRUR, 1999).
A Bromelina é um conjunto de enzimas proteolíticas encontradas nos vegetais da
família Bromeliaceae, da qual o abacaxi é o mais conhecido. Ela apresenta diversos
usos, todos baseados em sua atividade proteolítica, dentre as quais destacam-se a
propriedade de facilitar a digestão de proteínas, sendo por isso aproveitada para a
fabricação de medicamentos, e a capacidade de amaciamento de carnes (BORRACINI,
2006).
O amplo domínio no mercado nacional, exercido pelos cultivares Pérola e
Smooth Cayenne contribui para uma vulnerabilidade genética da atividade com base
em tão poucos cultivares. Este fato, aliado a demanda de mercado por produtos
ecologicamente e constitucionalmente mais sadios, ressalta a importância do plantio de
novos cultivares, e conseqüentemente a avaliação dos seus componentes químicos,
incluindo sua protease.
18
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar parâmetros bioquímicos, inclusive a atividade da bromelina extraída da
polpa e da casca dos cultivares de abacaxis, tradicionalmente comercializados
na Paraíba (Pérola e Smooth Cayenne), bem como dos novos cultivares
produzidos no estado (Emepa 01, Imperial e MD-2).
2.2 Objetivos específicos
Determinar para todas as polpas e cascas dos cultivares analisados os seguintes
parâmetros:
Sólidos Solúveis Totais (SST);
pH;
Acidez tiulável;
Relação sólidos solúveis totais e acidez titulável (SS/AT);
Açúcares redutores, não redutores e totais;
Teor de proteínas, atividade proteolítica e específica da bromelina nos
respectivos extratos bruto;
Determinar para as frações derivadas da precipitação fracionada com Sulfato de
amônio dos extratos brutos das polpas e das cascas os seguintes parâmetros:
Teor de proteínas;
Atividade proteolítica e específica da bromelina;
Fator de purificação da enzima;
Rendimento protéico e de atividade enzimática.
19
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Abacaxi
3.1.1 Abacaxizeiro
O abacaxizeiro (Ananás comosus L. Merr.) é uma planta monocotiledônea,
herbácea perene, da família Bromeliaceae, da qual não se tem registro de ocorrência
do ancestral silvestre que lhe deu origem, como parece ser o caso de várias plantas
econômicas que foram domesticadas em tempos pré-históricos. Abrange todas as
cultivares plantadas nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. É uma espécie de
ampla variabilidade genética, com muitas formas cultivadas (MATOS, et. al., 1999).
A planta que dá como fruto o abacaxi compõe-se de um caule (talo) curto e
grosso em cuja volta crescem folhas planas, esverdeadas, com parte superior em calha
que, no término do desenvolvimento, dá origem a 150 a 200 flores brancas ou branco-
roxas em espigas (Fig. 1). Estas originam 100-200 frutos pequenos (bagas), com
pontas na casca, colados entre si, formando a infrutescência (fruto inteiro), que assim
como toda a planta é formada por um espiral de baixo para cima, de modo que os
frutilhos na parte inferior têm idade fisiológica maior que os das partes mediana e
superior, o que pode resultar em variações muito significativas nos atributos de
qualidade da polpa do fruto (BARREIRO NETO, 2006; REINHARDT, et. al., 2004;
SEAGRI, 2007).
O abacaxizeiro apresenta em seu fruto cerca de 23% de polpa, que é comestível
e industrializada. O restante é constituído pela casca, coroa, talos e folhas, que
correspondem a um percentual elevado de 70%. Estas partes da planta, consideradas
como resíduo agrícola, constituem matéria-prima para obtenção de bromelina, amido,
fibras, álcool etílico e rações animais (BALDINI et. al., 1993).
O fruto inteiro tem forma cilíndrica ou cônica (frutos maiores na base), com
rebentos na base e coroa de folhas no ápice. O sistema radicular é fasciculado,
superficial e fibroso, encontrado em geral à profundidade de até 30cm e, raramente, a
mais de 60cm da superfície do solo. A planta adulta das variedades cultivadas mede
20
1,00-1,20m de altura e 1,30-1,50m de diâmetro (BARREIRO NETO, 2006; SEAGRI,
2007).
Figura 1: Abacaxizeiro.
Fonte: Autoria própria.
3.1.2 Cultivo e colheita
O abacaxizeiro, uma planta tropical originária de regiões de clima quente e seco
ou de pluviosidade irregular, era até poucos anos cultivado geralmente em áreas
virgens, recém-desmatadas. Por essa razão, sempre foi tido como uma planta rústica,
requerendo poucos tratos culturais para crescer e produzir. Esta planta é muito sensível
ao frio, mas pode sobreviver a longos períodos de seca, graças à sua capacidade de
reter água nas folhas e também devido ao baixo consumo de água, a planta pode
sobreviver sob baixo conteúdo de água no solo. Entretanto, em termos de exploração
econômica, o abacaxizeiro é uma planta exigente em tratos culturais freqüentes
(BARREIRO NETO, 2006).
Devido a sua sensibilidade ao frio, o abacaxizeiro exige clima quente ou
mesotérmico, onde não há perigo de ocorrência de geadas. A temperatura média
21
favorável situa-se entre 21 a 27°C. Quando a temperatura se mantém acima de 32°C,
verificam-se danos à planta devido à transpiração excessiva, quando a temperatura cai
abaixo de 20°C, a planta entra em estado de inatividade (MEDINA, 1978).
Portanto o Brasil, e mais especificamente a Paraíba, com temperatura em cerca
de 28ºC o ano inteiro, possui um clima muito favorável para o plantio do fruto, dando ao
país o segundo lugar no ranking da produção de abacaxi, contribuindo com 13% da
produção mundial (CAMPESE, 2004), e ao estado o primeiro lugar no raking da
produção nacional, contribuindo com 22% da produção brasileira (JORNAL A UNIÃO,
2007). No ano de 2006 a produção paraibana alcançou mais de 340 milhões de frutos,
em uma área plantada e colhida de 11.466 hectares, com rendimento de 29,94 frutos
por hectare. Estima-se que esta produção corresponda a um incremento de 146,5
milhões de reais na economia do estado (IBGE, 2008).
O abacaxizeiro frutifica dentro de 24 meses após o plantio, e de modo geral,
pode-se obter de 15 a 20 mil frutos por hectare, em cada safra, servindo este valor
como média para as variedade (CAMPESE, 2004).
A época de colheita está intimamente relacionada à época de plantio e ao tipo e
idade da muda (CAMPESE, 2004). A produção do Estado da Paraíba se concentra do
mês de agosto a janeiro do ano seguinte, totalizando 78,59% da produção. A
entressafra vai de fevereiro a julho, totalizando 21,32% (JORNAL A UNIÃO, 2007).
Os frutos colhidos durante o verão apresentam melhor qualidade do que os
amadurecidos durante o inverno. Aqueles se apresentam mais aromáticos e mais ricos
em sólidos solúveis, devido ao maior número de horas diárias de sol, e menos ácidos e
com maior conteúdo de óleos voláteis, decorrentes da menor diferença de temperatura
entre o dia e a noite (CÉSAR, 2000; CÉSAR, 2005).
O momento da colheita depende do fim a que se destinam os frutos. Se for para
a fabricação de conservas, deve-se aguardar até que os frutos fiquem maduros, ou
seja, o momento em que suas qualidades organolépticas sejam ótimas. Mas, se
destina-se à exportação como fruta fresca, a colheita deve ser feita com antecipação
para que sua maturação total não ocorra até o momento em que seja ofertado ao
consumidor. É preciso, contudo, neste caso, não colher frutos demasiado verdes
(CÉSAR, 2000; CÉSAR, 2005).
22
A coloração da casca é habitualmente tomada como indicação para julgar se um
fruto está ou não maduro. A madureza da polpa e a coloração da casca ocorrem
progressivamente, iniciando-se ambas pela base do fruto e se estendendo
paulatinamente para o ápice. Tal avaliação, contudo, é muito mais difícil do que parece
à primeira vista, pois há necessidade de se levar em conta o tamanho do fruto, as
condições ecológicas, por ocasião da sua maturação e variedade do produto (CÉSAR,
2000; CÉSAR, 2005).
As colheitas das frutas de um abacaxizal (Fig. 2) não podem ser feitas por meios
mecânicos, pois as frutas não amadurecem todas ao mesmo tempo. No Brasil, o
trabalho de colheita geralmente é feito com auxílio de um facão, com o coletor tendo as
mãos protegidas por luvas e lona grossa. O coletor deve seccionar a haste a 5-6cm
abaixo da fruta (BORRACINI, 2006).
Figura 2: Abacaxizal.
Fonte: Autoria própria.
23
3.1.3 Cultivares
As cultivares de abacaxi mais conhecidas e comercializadas nas Américas são o
Smooth Cayenne e o Pérola. Essas cultivares são classificadas de acordo com o
conjunto de caracteres comuns relativos ao porte da planta, à forma do fruto, à
importância das brácteas e as características morfológicas das folhas (MATOS, et. al.,
1999).
3.1.3.1 Smooth Cayenne
Conhecida comercialmente como abacaxi havaiano, é a cultivar mais plantada no
mundo, tanto em termos de área quanto de faixa de latitude, sendo considerada, a
rainha das cultivares de abacaxi, porque possui muitos caracteres favoráveis (MATOS,
et. al., 1999).
A Cultivar Smooth Cayenne é uma planta robusta, de porte ereto, cujas folhas não
apresentam espinhos, a não ser alguns encontrados nas extremidades apicais. O fruto
é atraente tem forma cilíndrica, pesando de 1,5Kg a 2,5Kg, com casca de cor amarelo-
alaranjada na maturação, polpa amarela, rica em açúcares 13 a 19º Brix e de acidez
maior do que as outras cultivares (Fig. 3). Essas características fazem-na adequada
para a industrialização e exportação como fruta fresca. A coroa é relativamente
pequena e a planta produz poucos filhotes. Em condições de clima úmido e quente,
produz fruto frágil para transporte e processamento industrial, sendo suscetível a
fusariose em qualquer condição climática (MATOS, et. al., 1999).
24
Figura 3: Abacaxi Smooth Cayenne.
Fonte: Autoria própria.
Segundo Matos et. al. (1999), o predomínio do plantio da cultivar Smooth Cayenne
nos principais países produtores de abacaxi do mundo representa um perigo de perda
da variabilidade genética da espécie, além de impedir, ocasionalmente, a expansão de
plantios de algumas variedades de importância local ou regional.
3.1.3.2 Pérola
Cultivada exclusivamente no Brasil a planta desta cultivar é também conhecida
como ‘Pernambuco’ ou ‘Branco-de-pernambuco’. A planta apresenta porte
médio,crescimento ereto, folhas com cerca de 65 cm de comprimento e espinhos nos
bordos, além de pedúnculo longo (cerca de 30 cm). Produz muitos filhotes (10-15)
presos ao pedúnculo, próximo da base do fruto, que apresenta forma cônica, casca
amarela (quando maduro), polpa branca, suculenta, com teor de açúcar de 14 a 16º
Brix, e pouca ácida, agradável ao paladar brasileiro (Fig.4). O fruto pesa de 1,0 Kg a 1,5
Kg, possui coroa grande e apesar de suas características organolépticas, é pouco
25
apropriado para a industrialização e exportação “in natura”. É suscetível a fusariose
(MATOS, et. al., 1999).
Figura 4: Abacaxi Pérola.
Fonte: Autoria própria.
3.1.3.3 Híbridos cultivados na Paraíba
O amplo domínio nacional, exercido pelas cultivares Pérola e Smooth Cayenne,
continua sendo uma das principais causas do pouco interesse por novos e promissores
materiais, em vias de utilização, introduzidos por empresas do setor privado ou mesmo
originados de outros centros de pesquisa e região produtora (BARREIRO NETO, et. al.
1998).
A vulnerabilidade genética da atividade com base em tão poucas cultivares, aliada
a demanda de mercado por produtos ecologicamente mais sadios e de melhor controle
ambiental, apontam para a necessidade de diversificação do plantio de cultivares para
múltiplas finalidades. No estado da Paraíba desde 1996, já se dispõe de dados sobre o
comportamento desses materiais introduzidos e selecionados que foram avaliados
durante ciclos de produção, em condições de irrigação complementar (BARREIRO
NETO et. al., 2002).
26
No estado da Paraíba, vem-se realizando um programa de seleção e cruzamentos
envolvendo as mais representativas cultivares disponíveis, originadas de instituições
públicas e de empresas privadas (BARREIRO NETO et. el, 2002). Estudando o
comportamento de híbridos de abacaxizeiro, Barreiro Neto et. al. (1998 e 1999)
verificaram haver grande variabilidade entre os híbridos testados, para as principais
características econômicas: peso do fruto, porcentagem do suco, ° brix (teor de sólidos
solúveis totais), acidez e resistência a fusariose (Fusarium subglutinans).
As informações existentes na literatura a respeito de abacaxizeiro híbrido são
muito escassas devido ao amplo domínio do mercado brasileiro, exercido pelas
cultivares Pérola e Smooth Cayenne. Isto se traduz em fraca motivação para
desenvolvimento de novos materiais, constituindo-se um desafio permanente à
colocação das cultivares e híbridos recém criados para diversificação do mercado
(BARREIRO NETO, et. al., 2002).
Dentre os vários híbridos testados pela Empresa de Pesquisa Agropecuária da
Paraíba (Emepa-pb) destacaram-se o MD-2, Emepa 01 e Imperial.
3.1.3.3.1 Emepa 01
Apesar da pouca literatura relatada sobre o cultivar Emepa 01 (fig. 4), sabe-se que
o respectivo fruto apresenta elevado valor de sólidos solúveis totais, baixa acidez e
grande capacidade de produção de filhotes (BARREIRO NETO et. al., 2002).
27
Figura 5: Abacaxi Emepa 01.
Fonte: Autoria própria.
3.1.3.3.2 MD-2
O abacaxi MD2 é um duplo híbrido, isto é, um descendente de híbridos da
variedade Smooth Cayenne. Essa variedade, que já é conhecida a mais de dez anos na
América Central, apresenta menor teor de acidez e formato mais uniforme (fig. 5); razão
pela qual têm atraído interesses para a exportação. As únicas experiências de plantio
no Brasil têm sido realizadas no Ceará e na Paraíba e poucas informações se têm
sobre as pesquisas desenvolvidas nestas áreas de domínio privado (SBRT, 2006).
28
Figura 6: Abacaxi MD-2.
Fonte: Autoria própria.
A cultivar MD-2 representa material promissor e de amplas possibilidades de
aumento expressivo de área na abacaxicultura irrigada do Nordeste. Esta cultivar foi
disponibilizada a Emepa pela empresa Brasfrutas, no ano de 1995, tendo a partir de
então sido avaliada conjuntamente com outras cultivares e híbridos de diversos
programas de melhoramento. Além das características do fruto como peso, forma,
ausência de espinhosidade de sua coroa e nas folhas, destacam-se o rendimento de
suco e a excelência de sua qualidade com boa relação Brix / acidez (BARREIRO
NETO, 2007).
A cultura desta variedade se difere em muito pouco das outras variedades de
abacaxi, sendo bastante suscetível à bucha fitospora e a fusariose, problema que pode
ser superado com cuidados com a irrigação – o solo não deve encharcar - e com o pH
que deverá manter-se entre 4,5 e 5,6. Para a obtenção de mudas recomenda-se
importá-las da Costa Rica ou consegui-las diretamente de laboratórios. Tanto o
mercado interno quanto o externo apresentam grandes potenciais de aceitação do
MD2. A aposta na variedade é que sua colheita seja antecipada em relação às outras e
a sua resistência ao transporte seja mais eficiente (SBRT, 2006).
29
3.1.3.3.3 Imperial
Este híbrido (Perolera x Smooth Cayenne-56), lançado com o nome ‘Imperial’, é a
primeira variedade comercial brasileira de abacaxi com resistência completa (frutos,
mudas e demais partes da planta) à principal doença desta cultura, a fusariose, que tem
causado enormes prejuízos em muitas regiões produtoras. Esta variedade produz frutos
de boa qualidade, sendo uma alternativa para plantio em regiões adequadas à
abacaxicultura, especialmente onde a fusariose é fator limitante para a produção. Além
de ser resistente à fusariose, a planta tem porte médio e apresenta folha de cor verde
escuro, sem espinhos nas bordas (Fig. 6). A planta produz número médio de mudas dos
tipos filhote e rebentão. O fruto é de tamanho pequeno a médio, cilíndrico, com frutilhos
mais proeminentes e apresenta casca de cor amarela na maturação. A polpa é
amarela, apresentando elevado teor de açúcar, superior à variedade Pérola, acidez
moderada, alto conteúdo em ácido ascórbico (vitamina C) e excelente sabor. A casca
do fruto é mais firme que a da ‘Pérola’, dando maior resistência ao transporte e na fase
pós-colheita (MATOS & CABRAL, 2005). Este cultivar também evidenciou reação de
resistência ao escurecimento interno (CABRAL & MATOS, 2007).
Figura 7: Abacaxi Imperial.
Fonte: Autoria própria.
30
Como características consideradas desfavoráveis observadas nesta cultivar
Imperial podem ser citadas as seguintes: crescimento lento, pedúnculo de diâmetro
delgado, fruto pequeno, perfil do frutilho (olho) proeminente, produção de três a cinco
mudas tipo filhote presas a base do fruto. O plantio do abacaxi Imperial dispensa a
utilização de fungicidas para o controle da fusariose, possibilitando a redução nos
custos de produção por hectare, referente à aquisição de fungicidas e custos de
aplicação, além de contribuir para redução da poluição ambiental e aumento na
segurança alimentar (CABRAL e MATOS, 2007).
3.1.4 Caracterização do fruto
Devido à sua excelente qualidade organoléptica, sua beleza e à existência da
coroa, desde há muito tempo o abacaxi faz juz ao cognome de rei dos frutos. É
autêntico produto de regiões tropicais e subtropicais, altamente consumido em todo o
mundo, estando quase a totalidade dos frutos destinados ao consumo “in natura” e
apenas uma pequena parcela (cerca de 3%) destinada ao processamento, em especial
para a extração de sucos. Além disso, presta-se também para a fabricação de
compotas, doces cristalizados, sorvetes, geléias e pudins (ROSA, 2006).
A produção brasileira de abacaxi é quase toda destinada ao mercado interno,
com predomínio do consumo do produto na forma “in natura”, sendo que o restante é
destinado à industrialização e exportação (MIGUEL et. al., 2007).
Em vista da grande comercialização do abacaxi, tanto no mercado interno como
internacional, e também para a indústria, e cuja produção agrícola vem aumentando de
ano para ano, os produtores devem procurar manter um padrão de qualidade da fruta a
fim de garantir sua comercialização (CAMPESE, 2004; CÉSAR, 2005).
Para isso, é necessário que sejam observadas as seguintes características:
-COR: a cor revela nas frutas o seu grau de maturação, o que, apesar de ser uma
apreciação subjetiva, permite distinguir a qualidade do produto. O abacaxi deverá
31
apresentar uma coloração uniforme, porém sem estar muito maduro, o que é
indesejável, tanto para a indústria como para o mercado consumidor.
-TAMANHO: a uniformidade de tamanho é bastante importante, principalmente para a
indústria, onde os diferentes comprimentos e diâmetros das frutas afetam a regulagem
das máquinas (ginaca, principalmente).
- SABOR: é importante conhecer a relação Brix/acidez total titulável da variedade que
vai ser comercializada ou industrializada, visto que este é o parâmetro que mais se
relaciona a palatabilidade, e conseqüentemente a aceitação dos frutos pelo
consumidor. Essa relação varia de ano para ano, de acordo com as condições
climáticas (principalmente), e também com a estação do ano. Há, portanto, grandes
variações entre as safras de verão e de inverno.
-FORMA: esta característica afeta o descascamento mecânico e, portanto, o
rendimento, devendo ser a fruta de forma cilíndrica para evitar uma perda excessiva de
polpa nessa operação. A variedade Smooth Cayenne de origem havaiana, apresenta
frutas mais uniformes e cilíndricas do que a variedade Pérola (brasileira), que vem
facilitar e muito o trabalho das ginacas e um menor desperdício de fruto na indústria de
compotas (CAMPESE, 2004; CÉSAR, 2005).
O fruto do abacaxizeiro apresenta a seguinte classificação científica (ROSA,
2006):
Reino: Plantae
Divisão: Magnoliophyta
Classe: Liliopsida
Ordem: Poales
Família: Bromeliaceae
Gênero: Ananás
Espécie: comosus
32
O abacaxi geralmente atinge 15cm de comprimento, tem polpa abundante,
suculenta e de sabor agradável, quando atinge a maturação. Uma característica
marcante da espécie é a ausência ou escassez de sementes (MATOS, et. al., 1999).
3.1.4.1 Composição química do abacaxi
O abacaxi apresenta uma variação muito grande na sua composição química, de
acordo com a época em que é produzido. De modo geral, a sua produção ocorre no
verão, sendo sua colheita uniformizada através da indução química do seu
florescimento. Neste caso, as frutas apresentam maior teor de açúcares e menor
acidez, decorrentes respectivamente do grande número de horas diárias de sol e da
menor diferença de temperatura entre o dia e a noite. Por outro lado, as frutas
produzidas fora de época (inverno), ou seja, as frutas temporãs apresentam alta acidez
e baixo teor de açúcares (CAMPESE, 2004; BORRACINI, 2006).
Segundo Reinhard e colaboradores (2004), frutos pequenos apresentaram
maiores teores de Sólidos solúveis totais (SST) e Acidez titulável (AT), atributos
positivos para o seu uso na indústria de sucos e também para o consumidor do fruto “in
natura”. No entanto, a menor relação SST/AT e o menor teor de vitamina C são fatores
desfavoráveis ao seu consumo. O menor pH nos frutos pequenos está de acordo com a
sua maior acidez em relação aos frutos grandes. Ocorrem mudanças esperadas para o
avanço da maturação, com os frutos coloridos apresentando valores mais altos para o
teor de SST, o pH e a relação SST/AT, bem como valores menores para AT e vitamina
C.
O valor nutricional do abacaxi depende, principalmente, dos seus açúcares
solúveis, das vitaminas e dos sais minerais, uma vez que os teores de proteínas e de
lipídios são relativamente baixos (tabela 1). O teor de açúcares varia em geral em torno
de 12 a 15%. As cinzas, que apresentam 0,4 a 0,6% do peso total, são ricas
principalmente em potássio, ao qual seguem o magnésio e o cálcio, geralmente em
partes iguais, e essas características permanecem em sua maioria nos resíduos
triturados do abacaxi para o processamento da bromelina, sendo então este resíduo de
33
grande interesse por suas características de alta riqueza nutricional (CAMPESE, 2004;
BORRACINI, 2006).
34
Tabela 1: Composição centesimal da polpa do abacaxi Pérola.
Nutrientes Relacionados Unidade Valor por 100g
Água g 86.459999
Calorias kcal 48
Proteínas g 0,54
Lipídios totais (gordura) g 0,12
Carboidratos, por diferença g 12,63
Fibra total dietética g 1,4
Cinzas g 0,24
Minerais
Cálcio, Ca mg 13
Ferro, Fé mg 0,28
Magnésio, Mg mg 12
Fósforo, P mg 8
Potássio, K mg 115
Sódio, Na mg 1
Zinco, Zn mg 0,1
Cobre, Cu mg 0,099
Manganês, Mn mg 1,177
Selênio, Se mcg 0,1
Vitaminas
Vitamina C, ácido ascórbico total mg 36,200001
Tiamina mg 0,079
Riboflavina mg 0,031
Niacina mg 0,489
Ácido Pantotênico mg 0,205
Vitamina B6 mg 0,11
Folato total mcg 15
Vitamina B12 mcg 0
Vitamina A UI 56
Vitamina A, ERA mcg ERA 3
Lipídios
Ácidos graxos, total saturados g 0,009
Ácidos graxos, total mono-insaturados g 0,014
Ácidos graxos, total poli-insaturados g 0,042
Colesterol mg 0
Fonte: USDA, 2001.
35
O Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) do Brasil
regulamentou por portaria, em 2002, a classificação e padrões de comercialização de
frutos de abacaxi para todo o território nacional, incluindo exigências qualitativas
específicas, tais como o teor mínimo de açúcares correspondente a 12 °Brix (12%),
além de critérios de tamanhos e graus de maturação aparente dos frutos (BRASIL,
2002).
Tabela 2: Valores dos nutrientes da casca do abacaxi Pérola.
Parâmetro
100g de amostra “in natura” da
casca de abacaxi
Umidade (g) 78,13
Cinzas (g) 1,03
Lipídeos (g) 0,55
Proteínas (g) 1,45
Fibras (g) 3,89
Carboidratos (g) 14,95
Calorias (Kcal) 70,55
Cálcio (mg) 76,44
Ferro (mg) 0,71
Sódio (mg) 62,63
Magnésio (mg) 26,79
Zinco (mg) 0,45
Cobre (mg) 0,11
Potássio (mg) 285,87
Fonte: GONDIM, et. al., 2005.
3.1.4.2 Processamento da fruta
O fruto presta-se tanto para consumo ao natural como para processamento
industrial em suas mais diversas formas (pedaços em calda, suco, pedaços
cristalizados, geléias, licor, vinho, vinagre e aguardente). Como subproduto da sua
36
industrialização, pode-se obter álcool, ácidos cítrico, málico e ascórbico, rações para
animais e bromelina (enzima proteolítica de uso medicinal). O talo da planta pode ser
aproveitado para extração de bromelina, sendo também fonte de amido. As folhas
podem ser utilizadas para a obtenção de fibras (CÉSAR, 2005).
3.2 Enzimas
3.2.1 Aspectos gerais
A maior parte da história da bioquímica é a história da pesquisa sobre enzimas. A
catálise biológica foi inicialmente descrita e reconhecida no início do século XIX, em
estudos sobre a digestão da carne por secreções do estômago e a conversão do amido
em açúcares simples pela saliva e por vários extratos vegetais. Na década de 50, do
século XIX, Louis Pasteur concluiu que a fermentação do açúcar em álcool pela
levedura é catalisada por fermentos. Ele postulou que esses fermentos, depois
nomeados de enzimas, eram inseparáveis da estrutura das células vivas do levedo,
uma hipótese que prevaleceu por muitos anos. Em 1897, Eduard Buchner descobriu
que extratos de levedo podiam fermentar o açúcar até o álcool, provando que as
enzimas envolvidas na fermentação continuavam funcionando mesmo quando
removidas da estrutura das células vivas. Desde então, numerosos estudos vêm sendo
realizados na tentativa do isolamento das numerosas enzimas diferentes e o estudo de
suas propriedades catalíticas (BORRACINI, 2006).
A catálise enzimática das reações é essencial para os sistemas vivos. Sob
condições biológicas relevantes, as reações não catalisadas tendem a ser lentas. A
maioria das moléculas biológicas são muito estáveis no ambiente aquoso de pH neutro
e temperatura moderada encontrado no interior das células. Muitas reações
bioquímicas comuns envolvem eventos químicos que são muito improváveis nas
condições do ambiente celular, como a formação transiente de intermediários
eletricamente carregados e instáveis ou a colisão de duas ou mais moléculas com a
orientação precisa e necessária para que ocorra a reação (LEHNINGER, 1995).
37
As reações necessárias para digerir alimentos, enviar sinais através de nervos, ou
contrair um músculo simplesmente não ocorrem em velocidade útil sem catálise
(LEHNINGER, 1995).
Uma enzima contorna os problemas de baixa velocidade das reações bioquímicas,
fornecendo um ambiente específico dentro do qual uma reação dada é energeticamente
mais favorável. A característica distintiva de uma reação catalisada enzimaticamente é
que ela ocorre no interior dos limites de uma cavidade, ou fenda, na estrutura molecular
da enzima chamado sítio ativo. A molécula que se liga ao sítio ativo e que sofre a ação
da enzima é chamada substrato. O complexo enzima-substrato tem papel central na
reação enzimática, ele é o ponto de partida para os tratamentos matemáticos que
definem o comportamento cinético das reações catalisadas enzimaticamente e para as
descrições teóricas dos mecanismos enzimáticos (BORRACINI, 2006).
3.2.2 Proteína
As proteínas, dentre as quais inclui-se as enzimas, são as moléculas orgânicas
mais abundantes nas células e constituem 50% ou mais de seu peso seco. São
encontradas em todas as partes de todas as células, uma vez que são fundamentais
sob todos os aspectos da estrutura e função celular. Existem muitas espécies diferentes
de proteínas, cada uma especializada em determinada função biológica diferente
(BORRACINI, 2006).
3.2.2.1 Desnaturação
Todas as moléculas de uma mesma proteína apresentam, em condições
fisiológicas, a mesma conformação que é denominada de nativa. Esta é a conformação
mais estável que a molécula pode assumir naquelas condições e reflete um equilíbrio
delicado entre as interações ocorridas no interior da molécula protéica e entre esta e o
seu ambiente (CAMPESE, 2004).
38
Ao se proceder ao isolamento e purificação de uma proteína, são introduzidas
alterações físico-químicas no seu meio ambiente, que podem afetar sua estrutura
espacial a ponto de ocasionar a perda da sua função biológica. A proteína é dita então
desnaturada. A desnaturação pode ser provocada por diversos tipos de tratamento
(CAMPESE, 2004).
O aquecimento de proteínas nativa provoca o rompimento de ligações não-
covalentes. Assim, quando uma solução aquosa de uma enzima, por exemplo, é
aquecida até seu ponto de ebulição por uns minutos e depois resfriada, a enzima torna-
se insolúvel e, principalmente, não mais apresenta atividade catalítica (BORRACINI,
2006; CAMPESE, 2004).
As principais causas de desnaturação das proteínas estão relacionadas a baixo:
pH : Valores de pH muito baixos ou muito altos afetam a ionização dos
grupamentos da proteína conferindo-lhe uma elevada carga positiva ou negativa
ocasionando repulsão intramolar, com exposição do interior hidrofóbico.
Solventes orgânicos e solutos: A adição de solventes orgânicos polares (álcoois,
por exemplo) ou de compostos com grande capacidade de formarem pontes de
hidrogênio (uréia, por exemplo) determina a desnaturação da proteína, porque
estes últimos agentes estabelecem pontes de hidrogênio com radicais da
proteína, substituindo ligações que mantêm a proteína nativa.
Exposição a detergentes
Agitação vigorosa da solução
Presença de certos íons ou sais caotrópicos na solução protéica
Oxidação
Força iônica
39
Cada uma das formas citadas como causa de desnaturação pode ser considerada
como tratamento relativamente suave, isto é, a desnaturação pode ocorrer em
condições amenas, não há necessidade de ocorrer em condições drásticas. As
moléculas de proteína nativa são frágeis e facilmente desorganizadas pelo calor e
outros tratamentos aparentemente suaves.
Retiradas as condições desnaturantes, muitas proteínas podem reassumir sua
conformação nativa. A este processo chama-se renaturação. A renaturação demonstra
que a estrutura tridimensional (nativa) de uma proteína é conseqüência da sua estrutura
primaria. Para a maioria das proteínas, entretanto, a desnaturação é irreversível
(CAMPESE, 2004; YAO et. al., 2002) .
3.2.2.2 Recuperação e purificação de proteínas
Muitas técnicas tem sido utilizadas para a recuperação e purificação de proteínas e
enzimas de origem animal, vegetal ou microbiana. Técnicas mais antigas como a
precipitação, extração com solventes e filtração geralmente tem alto poder de
concentração e baixa purificação e técnicas mais modernas como a cromatografia de
afinidade, troca iônica ou gel-filtração, eletroforese, extração em duas fases aquosas,
extração com micela reversa, recuperam e purificam, muitas vezes até a
homogeneidade (CÉSAR, 2005).
A grande questão ao se iniciar um processo de purificação é o grau de pureza
exigido para a proteína. Proteínas para fins terapêuticos ou de uso direto em humanos
necessitam de um alto grau de pureza, o que não é necessário para as enzimas
aplicadas em processos industriais. Em uma purificação em larga escala o processo
consiste de 4 a 6 etapas divididas em dois grupos. O primeiro formado pelos processos
de recuperação da proteína: separação e ruptura de células, separação dos fragmentos
e concentração da proteína. No segundo, o objetivo é purificar a proteína, através das
seguintes etapas: pré-tratamento, purificação e refinamento do produto final
(ASENJO,1994).
A separação de proteínas de meios aquosos por precipitação é um dos métodos
mais tradicionais para a recuperação e parcial purificação dessas biomoléculas. Este
40
método implica na alteração da estrutura tridimensional da proteína, desconformando-a,
e pode ser agressivo, sendo aplicado somente quando a ressolubilização do precipitado
é possível. Os precipitados de proteínas são agregados de moléculas protéicas,
grandes o suficiente para serem decantados ou centrifugados. É uma técnica de fácil
ampliação de escala e com viabilidade para operação contínua a custos aceitáveis para
grandes volumes. Porém, é uma técnica mais de concentração do que propriamente de
purificação (BERTEVELLE, 2001; CÉSAR, 2005).
A solubilidade das proteínas depende da distribuição de grupos ionizáveis,
hidrofóbicos e hidrofílicos na superfície da molécula. Tais características são
responsáveis por interações polares com o solvente aquoso, interações iônicas com os
sais presentes no meio, além da repulsão eletrostática entre as moléculas de mesma
carga. A presença de sais, solventes orgânicos e pH são fatores importantes na
solubilidade das proteínas (SCOPES, 1994).
De modo geral, a precipitação por qualquer método escolhido é facilitada no ponto
isoelétrico da proteína. A adição de sais neutros, principalmente (NH4)2 SO4 a elevadas
concentrações 1,5 a 3,0 M, reduz a disponibilidade da água devido à hidratação dos
íons, criando condições para a precipitação, a qual ocorre principalmente por interação
das zonas hidrófobas. O sal e outros precipitantes não provocam a precipitação de
todas as proteínas, pois o seu efeito é o de reduzir a solubilidade. Com isso, a
concentração de sal ou solvente que provoca a precipitação varia com a concentração
da proteína e a presença de outras proteínas contaminantes. Este fato é aproveitado
para a realização de um fracionamento (CÉSAR, 1999; CÉSAR, 2005).
3.2.3 Bromelina
A bromelina é um conjunto de enzimas proteolíticas encontradas nos vegetais da
família Bromeliaceae, da qual o abacaxi é o mais conhecido. Ela apresenta diversos
usos, todos baseados em sua atividade proteolítica, como nas indústrias alimentícias e
farmacêuticas, no amaciamento de carnes, na clarificação de cervejas, na fabricação de
queijos, no preparo de alimentos infantis e dietéticos, no pré-tratamento de soja, no
41
tratamento de distúrbios digestivos, feridas e inflamações, preparo de colágeno
hidrolisado, etc (BORRACINI, 2006).
Esta enzima é encontrada na polpa do fruto, nas cascas, no talo, no caule, nas
folhas, nas raízes do abacaxizeiro e em resíduos industriais do processamento do fruto,
com massa molar próxima de 31 KDa (CÉSAR, 2005; MARTINS et. al., 1992). No talo,
tem-se uma enzima sulfidrílica que recebe o nome de bromelina do talo e tem o número
sistemático EC 3.4.22.4, enquanto que, no fruto, tem-se uma proteína ácida que é
chamada de bromelina do fruto ou, simplesmente, bromelina, com o número sistemático
EC 3.4.22.5 (CÉSAR, 2000; BERTEVELO, 2001).
Foi verificado por Rowan et. al. (1990) que a bromelina do fruto tem uma atividade
proteolítica maior que a bromelina do talo em diversos substratos protéicos, e a sua
atividade é máxima em pH 8,0 e a temperatura 70 ºC. A bromelina do talo apresentou
atividade máxima a 60 ºC e pH 7,0. A forma de bromelina comercialmente encontrada é
a bromelina do talo, apesar da grande quantidade de resíduos de abacaxi fruto
proveniente das indústrias de conservas de abacaxi, fato decorrente da fácil
disponibilidade dos talos, graças à renovação das plantações.
A enzima não está presente nos primeiros estágios de desenvolvimento do fruto,
porém, seu nível aumenta rapidamente, mantendo-se elevado até o amadurecimento,
onde tem um pequeno decréscimo. A queda marcante de atividade da protease durante
o período final da maturação não é acompanhada por uma mudança correspondente na
concentração de proteínas.
Parece razoável supor que a bromelina seja transformada em uma outra proteína
com função metabólica diferente, como enzima produtora de sabor e aroma, uma vez
que os constituintes voláteis responsáveis pelo aroma são formados quando a atividade
de protease está diminuindo.
Apesar da diminuição da atividade proteolítica durante a maturação, o abacaxi é o
único fruto que possui concentrações relativamente altas de proteases no estado
maduro. Essa é uma das vantagens da utilização das proteases do abacaxi em
comparação com outras proteases vegetais. No mamão e no figo, tanto a papaína
como a ficina, somente são encontradas em altos níveis quando o fruto está verde; com
42
o completo amadurecimento, a concentração de proteases praticamente desaparece
(BALDINI et. al., 1993).
As preparações de bromelina são impuras e geralmente as principais enzimas
contaminantes são outras enzimas proteolíticas e enzimas não proteolíticas, tais como:
fosfatases, peroxidases, celulases e outras glicosidases (MURACHI, 1976).
César (1999) realizou as análises de proteína total, açúcares redutores e atividade
enzimática de amostras preparadas da polpa do fruto, da casca e do talo para a
caracterização do meio inicial. O fruto e talo apresentaram o mesmo teor de proteína
total, porém o talo apresentou cerca de 60% menor quantidade de enzimas
proteolíticas. Foi observado que por meio da precipitação em um estágio com 80%
(%v/v) de etanol a 5ºC, é possível recuperar praticamente toda a enzima originalmente
presente, aumentando de 3 a 5 vezes a atividade específica inicial.
Segundo Baldini et. al. (1993), a bromelina é uma enzima sulfídrica e como
característica das enzimas pertencentes a esse grupo, requer grupamentos sulfídricos
livres para sua atividade catalítica. Agentes redutores como a cisteína, sulfetos, sulfitos
e também cianetos atuam como ativadores da ação enzimática de acordo com diversos
autores citados em seu trabalho.
Arroyo-Reyna et. al. (1995) estudaram a desnaturação térmica da bromelina, que é
uma proteína globular. Estudos cinéticos da desnaturação da bromelina a uma
temperatura constante foram realizadas a pH 3,40. A análise da fração de proteína
nativa (fN) mostra que esta varia com o tempo, sendo que a temperaturas elevadas,
esta diminui mais rapidamente. Este estudo indica que a desnaturação térmica da
Bromelina segue um modelo de dois estados irreversível com cinética de 1ª ordem.
Neste estudo a desnaturação é determinada por mudanças na conformação da enzima.
3.2.3.1 Mecanismo de ação das proteases
As proteases, onde se inclui a bromelina, são enzimas que possuem como substrato
as proteínas, que se constituem de vários aminoácidos unidos entre si através de
ligações peptídicas (Fig. 8). Tais enzimas atuam quebrando ligações peptídicas após
43
aminoácidos preferenciais, gerando pequenos fragmentos de proteínas. A bromelina
apresenta como aminoácidos preferenciais para clivagem, a Lisina (Lys), Alanina (Ala),
Tirosina (Tyr), Glicina (Gly) e Asparagina (Asn) (ARAI & FUJIMAKI, 1991).
Figura 8: Parte de uma cadeia protéica mostrando as ligações peptídicas (WIKPÉDIA,
2008).
A cadeia protéica apresenta uma extremidade N-terminal (finalizada por um grupo
NH
2
) e outra C-terminal (finalizada por um grupo COOH). O sítio ativo da protease
localiza-se próximo da extremidade C-terminal em uma leve depressão na superfície da
enzima, sendo composto por uma Serina catalítica (Ser 221), uma Histidina 64 (His 64),
um Ácido aspártico (Asp 32) e uma Asparagina (Asp 155), que se encontra camuflada
por outras estruturas da enzima (Fig. 9) (WONG, 1995).
44
Figura 9: Estrutura tridimensional de uma protease (WONG, 1995).
No sitio ativo das proteases são encontrados seis subsítios de S
4
a S
’
2
(fig. 9), onde
a catálise ocorre entre os subsítios S
1
e S
’
1
. Portanto o substrato (NH
2
– P
n
– P
1
– P
’
1
- -
- - P
’
n
– COOH) após a clivagem libera o segmento N-terminal, enquanto que o
segmento C-terminal permanece ligado à enzima, formando a acyl-enzima, para
posteriormente liberar o segmento C. A figura 10 demonstra a reação de Michaelis-
Menten para catálise das proteínas pelas proteases, com liberação de dois produtos,
onde P
1
é o segmento N-terminal e P
2
o segmento C-terminal. Desta forma, o
mecanismo geral de ação das proteases é representado por duas reações: Acilação e
deacilação (Fig. 11) (WONG, 1995).
Figura 10: Esquema representativo do complexo enzima e substrato (WONG, 1995).
45
Figura 11: Reação de Michaelis-Menton para catálise das proteínas pelas proteases
(WONG, 1995).
Figura 12: Mecanismo de reação da acilação e deacilação de proteínas pelas
proteases (WONG, 1995).
3.2.3.2 Utilidades da bromelina
A utilização de compostos de origem vegetal, como as enzimas, é uma tendência
do mundo moderno e com isso a extração e purificação destas é um dos focos do
desenvolvimento da biotecnologia.
46
Neste contexto, a bromelina tem diversos usos, todos baseados em sua
atividade proteolítica, como na indústria de alimentos para o amaciamento de carnes
vermelhas; na produção de pães e biscoitos a partir de farinhas de trigo; na produção
de ovos desidratados; na preparação de leite de soja e isolados protéicos; na indústria
cervejeira para hidrolisar certos complexos proteína-taninos; na fabricação de queijos;
no preparo de alimentos infantis e dietéticos; no pré-tratamento da soja; na indústria
têxtil para o tratamento do couro, lã e da seda; na medicina para a digestão de vermes,
como ascaris e trichuris; na suturação de feridas; nas queimaduras principalmente as
de 3° grau; para solubilizar mucos e melhorar a eficiência de raio X no útero; para
minimizar as dores menstruais; como anti-inflamatório de origem vegetal em cirurgias e,
principalmente, na indústria farmacêutica (BORRACINI, 2006; ROSSI JUNIOR e
TAMBOURGI, 2005).
Para a utilização da bromelina, a indústria alimentícia não se apresenta como um
mercado atrativo, pois, vem sendo largamente utilizada a papaína no amaciamento de
carnes e a grande barreira seria romper o cartel de indústrias produtoras da enzima,
pois o consumidor só compra a carne amaciada ou o amaciante de carnes sem
preocupar-se com o princípio ativo do produto. A África do sul vem produzindo e
exportando papaína a preços sem concorrência a princípio (BORRACINI, 2006).
A indústria de cervejas, onde a bromelina pode ser usada como clarificante, aboliu
a utilização da mesma, alegando que esta enzima produz resíduos de difícil retirada
dos tanques de armazenagem do produto (BORRACINI, 2006).
A concentração principal da utilização da bromelina está na indústria
farmacêutica, uma das indústrias que mais investe em tecnologias e novos produtos
nos últimos tempos.
No segmento de análises clínicas, por exemplo, a bromelina é utilizada, em
solução aquosa, no pré-tratamento de amostras de sangue a serem tipadas para o
Grupo ABO/Rh. A solução de enzima em contato com a superfície das hemácias
propicia a retirada das proteínas de superfície, expondo melhor os antígenos
eritrocitários, que responderão melhor ao teste analítico de tipagem. Assim, é relevante
que se conheça as condições que esta solução enzimática deve ser preparada e
47
armazenada, a fim de mantê-la estável por um período maior de tempo, facilitando a
rotina dos laboratórios que utilizam este procedimento (MURACHI, 1976).
3.3 Perfil do consumidor de abacaxi
Nos últimos anos, tem ocorrido mudança significativa nos hábitos alimentares da
população brasileira. A busca da longevidade e da qualidade de vida faz com que as
pessoas procurem alimentos mais saudáveis, aumentando o consumo de frutas e
hortaliças frescas em detrimento dos produtos industrializado (MIGUEL et. al., 2007).
O abacaxi é muito apreciado por grande parte dos consumidores de frutas, mas
por outro lado, esta é com certeza uma das frutas comercializadas que apresentam
maior dificuldade de escolha pelo consumidor, principalmente pela aparência externa
(MIGUEL et. al., 2007).
De acordo com estudo realizado por Miguel et. al. (2007), no Mercado Municipal
de Piracicaba (SP), o motivo pelo qual o consumidor é levado a adquirir abacaxi, é a
maior intenção de consumo de abacaxi na forma “in natura”, correspondendo a 74,3%
da preferência. Enquanto que 51,4% dos consumidores compram abacaxi para o
preparo de sucos e 25,7% adquirem abacaxi para confecção de doces. A preferência
do consumidor de abacaxi para consumo “in natura”, reforça a idéia de garantir a
manutenção da qualidade do produto, haja vista que a aparência do mesmo constitui
um fator decisivo da compra.
A maioria dos consumidores entrevistados (82,9%) tinha conhecimento das
cultivares comercializadas, sendo as mais citadas pelos consumidores, a Pérola e a
Smooth Cayenne, indicada por 45,7% dos entrevistados; 31,4% disseram que apenas
conheciam a Pérola e 5,7% apenas a Smooth Cayenne . Ao serem questionados sobre
a preferência, 74,3% dos entrevistados afirmaram que preferiam o abacaxi Pérola; 5,7%
elegeram o abacaxi Havaí e 20% afirmaram que não têm preferência. Quando
indagados sobre o motivo da preferência do abacaxi Pérola, os consumidores
enumeraram as seguintes características: doçura, maciez, odor agradável, baixa acidez
e sabor agradável. Entre os que preferiam o Havaí, os entrevistados destacaram a
48
baixa acidez do mesmo. Durante o período da pesquisa, 80,1% dos consumidores
estavam insatisfeitos quanto à qualidade do abacaxi, apontando a elevada acidez como
a principal causa do descontentamento, seguido do abacaxi com presença de danos
físicos (incluindo amassados, manchas escuras, podridões) e frutas passadas (MIGUEL
et. al., 2007).
49
4. MATERIAL E MÉTODO
4.1 Matéria-prima
Neste estudo foram analisados a polpa e a casca das seguintes espécies de
abacaxi: Smooth Cayenne, Pérola, MD-2, Emepa 01 e Imperial. As amostras
apresentavam aproximadamente mesmo peso e tamanho e foram gentilmente cedidas
pela Empresa Estadual de Pesquisa Agropecuária da Paraíba (Emepa-pb).
Foram coletados 5 frutos de cada cultivar no estágio de maturação adequado para o
consumo, no período de agosto a novembro de 2007.
Todas as análises foram realizadas nos laboratórios do Departamento de
Tecnologia Química e de Alimentos, no Centro de Tecnologia da UFPB, campos I, João
Pessoa.
4.2 Métodos
4.2.1 Preparo da amostra
Após a higienização das amostras, estas foram separadas em partes, polpa e
casca. As amostras foram cortadas em cubos de aproximadamente 1 cm
3
, sendo
armazenadas em pacotes com aproximadamente 100g cada e acondicionados em
temperatura de -5°C. Para os ensaios as amostras foram descongeladas e utilizadas no
mesmo dia.
4.2.2 Determinação de sólidos solúveis
O teor de sólidos solúveis foi determinado por refratometria, e os resultados
foram expressos em Graus Brix (São Paulo, 1985).
50
4.2.3 Determinação do pH
Esta analise foi realizada segundo a metodologia descrita pelo São Paulo (1985).
4.2.4 Determinação da acidez titulável
Para esta determinação foi utilizado o método descrito pelo São Paulo (1985). Os
resultados foram expressos em % de ácido cítrico anidro.
4.2.5 Determinação da relação sólidos solúveis totais e acidez titulável
A relação sólidos solúveis totais (ºBrix)/acidez total titulável foi calculada pela
razão de sólidos solúveis totais/acidez total titulável. Os valores de sólidos solúveis e
acidez total titulável utilizados nesta determinação foram as respectivas médias
estatísticas.
4.2.6 Determinação do teor de açúcares
4.2.6.1 Determinação de açúcares redutores
O teor de açúcares redutores foi determinado segundo metodologia descrita por
São Paulo (1985). Nesta análise titulomêtrica os açúcares redutores reduzem a solução
de Fehling, e os resultados foram expressos em percentagem.
51
4.2.6.2 Determinação do teor de açúcares totais
Nesta análise os açúcares não redutores foram submetidos à hidrolise ácida com
ácido clorídrico, transformando-se em açúcares redutores, que posteriormente foram
submetidos a titulação, onde reduziram a solução de Fehling (método idêntico a
determinação de açúcares redutores). Os resultados foram expressos em percentagem.
4.2.6.3 Determinação de açúcares não redutores
Os açúcares não redutores foram estimados através da subtração dos açúcares
redutores dos açúcares totais e consecutivamente multiplicando-se este valor pelo fator
de conversão da glicose em sacarose (0,95).
Figura 13: Fluxograma das atividades realizadas.
Coleta das amostras
Preparo das amostras
Análises químicas
Determinação de
Sólidos solúveis
Extração da bromelina
Determinação da
acidez
titulável
Determinação
do teor de açúcares
Relação Sólidos
solúveis e
acidez titulável
Determinação
do pH
52
4.2.7 Obtenção do extrato bruto da enzima
A obtenção do extrato bruto da bromelina foi realizado conforme o método
descrito por Lopes et. al. (2005) com modificações. Às amostras, foi adicionado tampão
fosfato-fosfato 1 M, em proporção de 1:1 (p/v). A solução tampão foi preparada a partir
de soluções de estoque de fosfato monobásico de potássio e fosfato dibásico de
potássio, conforme descrito por Morita e Assumpção (1986). A mistura foi
homogeinizada em liquidificador doméstico a velocidade máxima durante 3 minutos.
Posteriormente a mistura foi submetida à filtração a vácuo para retenção de sólidos
dispersos e de fibras, e em seguida o pH do meio foi ajustado para 7,5 com NaOH 1 M.
4.2.8 Determinação da atividade proteolítica (bromelina)
A atividade proteolítica da bromelina foi estimada de acordo com o método de
Kunitz (1947) e Walter (1984) modificado, usando caseína 2% (p/v) em tampão fosfato
0,1 M (pH 7,5) como substrato. 0,2 mL de amostra foi adicionada a um tubo contendo
2,5 mL de solução de caseína, onde ficou por 10 minutos em repouso a 37 ºC, a reação
foi interrompida pela adição de 5 ml de ácido tricloroacético (TCA), que promove a
precipitação do substrato não hidrolisado, e deixada em repouso por 10 minutos a
temperatura ambiente. Após centrifugação, a quantidade de produtos hidrolíticos não
precipitados, ou seja, de peptídeos solúveis em TCA foi determinada a 280 nm contra
um branco do substrato e outro da amostra.
Uma unidade de atividade enzimática corresponde à quantidade de enzima
capaz de variar em uma unidade a leitura de absorbância a 280 nm, durante 10 min a
37°C.
A atividade enzimática foi expressa como unidades de enzima por ml de extrato
bruto.
53
4.2.9 Determinação do teor de proteínas
O teor de proteínas foi determinado conforme descrito por Lowry, et. al. (1951). A
amostra foi incubada a temperatura ambiente por 10min, com 2,5 ml de reagente
cuproalcalino, constituído de solução A (carbonato de sódio 2% em NaOH 0,1 M),
solução B (Cu SO
4
. 5H
2
O 0,5% em solução de tartarato de Na e K a 1%) na proporção
de 50:1 v/v, respectivamente.
Em seguida foram adicionados 25µl da solução diluída (1:1) de Folin- Ciocalteau,
e deixando por 30 min. Posteriormente foi lida a absorbância à 660 nm. A concentração
de proteína foi deferida usando curva padrão de soro de albumina bovina (Produto
químico sigma chemical CO., Louis, MO).
Os resultado foram expressos em mg/mL de extrato bruto.
4.2.10 Determinação da atividade específica da bromelina
A atividade específica foi calculada pela equação 1:
A
e
= A / P Equação 1
Onde: A é a atividade enzimática em U/mL
P é a concentração de proteínas totais em mg/mL (BORRACINI, 2006).
O resultado foi expresso em U/mg de proteína.
4.2.11 Precipitação fracionada com sulfato de amônio
A precipitação fracionada do extrato bruto foi realizada segundo Collowick e
Kaplan (1955). Neste método, do extrato bruto da enzima, o fracionamento foi realizado
54
pela precipitação com sulfato de amônio, formando os seguintes intervalos de
precipitação: 0-20%, 20-40%, 40-60%, 60-80% e 80-100% de saturação.
Para se obter as frações da enzima correspondentes aos intervalos de
precipitação com sulfato de amônio, a quantidade deste foi adicionada conforme tabela
3, deixando-se a mistura em repouso a 4ºC na geladeira por 6 horas. Após o repouso a
mistura foi centrifugada a 4300g a 5ºC por 20 minutos. O precipitado foi dissolvido em
5ml da solução tampão fosfato 1M, em proporção de 1:1 em pH 7,5.
Tabela 3: Saturação do sulfato de amônio (NH
4
)
2
SO
4
g/litros da amostra.
Concentração inicial
(%)
Concentração final
(%)
Gramas a adicionar de
(NH
4
)
2
SO
4
0 20 114
20 40 123
40 60 132
60 80 143
80 100 156
Fonte: COLLOWICK e KAPLAN, (1955).
A desalinização das amostras foi realizada pela diálise da solução da enzima a
4ºC usando água destilada por 12 horas com uma troca de água e posteriormente
solução tampão fosfato 0,25 M por 12 horas com uma troca de tampão.
A diálise realiza a retirada do sulfato de amônio da amostra após a precipitação e
a estabilização da enzima no tampão de análise.
55
Figura 14: Fluxograma da extração e semi-purificação da bromelina.
4.2.12 Rendimento em atividade enzimática (AP)
O rendimento foi determinado pela razão entre a atividade enzimática total da
bromelina nas frações e a atividade enzimática total da bromelina no extrato bruto:
AP = A
2
/A
1
x 100
A
1
– atividade enzimática total no extrato bruto
A
2
– atividade enzimática total nas frações
Precipitação fracionada com sulfato de amônia
0-20% 20-40% 40-60% 60-80% 80-100%
Frações
Extrato bruto da bromelina
Determinação da atividade
da bromelina
Determinação do teor
de proteínas
Determinação da atividade
específica de bromelina
56
Resultados expressos em percentagem.
4.2.13 Rendimento em Proteína total (RT)
O rendimento foi determinado pela razão entre o teor de proteínas totais nas
frações e o teor de proteínas totais no extrato bruto:
RT = P
2
/P
1
x 100
P
1
– Teor de proteínas totais no extrato bruto
P
2
– Teor de proteínas totais nas frações
Resultados expressos em percentagem.
4.3.14 Fator de purificação da bromelina
O fator de purificação foi definido pela a razão entre a atividade específica
determinada nas frações e a atividade específica determinada no extrato bruto e
representa o aumento da pureza da bromelina (BORRACINI, 2006):
F.P = A
e2
/ A
e1
A
e1
= Atividade específica no extrato bruto
A
e2
= Atividade específica nas frações
57
Figura 15: Fluxograma das analises realizadas nas frações.
4.4 Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas por análise de variância e teste de
Duncan, com 95% de confiança. As polpas e cascas foram analisadas em conjunto.
Frações
Obtenção do precipitado
Diálise
Amostra sem sulfato de amônio
Determinação da
atividade da bromelina
Determinação do teor
de proteínas
Determinação da
atividade
específica de bromelina
Determinação do fator
de purificação
Determinação do rendimento em
atividade enzimática
Determinação do rendimento em
Proteínas totais
58
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Sólidos solúveis totais (SST)
O teor de sólidos solúveis é um parâmetro que tem sido usado como indicador
da qualidade de diversos frutos. Esta determinação é de grande importância nos frutos,
tanto para o consumo "in natura" como para o processamento industrial, visto que
elevados teores desses constituintes na matéria-prima implicam menor adição de
açúcares, menor tempo de evaporação da água, menor gasto de energia e maior
rendimento do produto, resultando em maior economia no processamento (SILVA,
SILVA, SILVA, 2002).
Os resultados dos teores de sólidos solúveis das polpas e cascas dos cultivares
analisados estão expressos na tabela 4.
Tabela 4: Valores médios dos teores de sólidos solúveis totais das polpas e cascas dos
cultivares analisados.
Sólidos solúveis (ºBrix)
Amostras
Polpa Casca
Emepa-01 11,00±2,65
cd
6,50±0,50
f
Imperial 17,67±1,53
a
8,50±0,50
def
MD-2 16,33±1,53
ab
9,17±0,76
def
Pérola 13,67±0,58
bc
10,00±0,00
de
Smooth Cayenne 15,00±3,50
ab
7,50±0,50
ef
Resultados das analises com média de cinco repetições (± desvio padrão). Letras diferentes (na mesma
linha ou coluna) apresentaram diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan.
Os resultados expostos na tabela 4 indicam que as polpas dos híbridos
cultivados na Paraíba, no que se refere ao parâmetro avaliado, não se diferenciam
estatisticamente (p<0,05) das polpas dos cultivares tradicionalmente comercializados, já
que os cultivares Emepa-01 e MD-2 não apresentam diferenças significativas do Pérola,
59
nem o Imperial do Smooth Cayenne. No entanto, o Emepa-01 fornece valores
significativamente menores de sólidos solúveis quando comparado ao MD-2 e Imperial.
Os valores de Sólidos solúveis encontrados por Barreiro Neto et. al. (2002),
foram semelhantes aos expressos neste trabalho, com resultados de 14,54 ° Brix para o
Emepa-01, 16,16 ° Brix para o MD-2, 16,72 ° Brix para o Smooth Cayenne e 15,89 °
Brix para o Pérola. Em ambos os estudos a polpa de menor teor de sólidos solúveis é a
do Emepa-01.
Alguns pesquisadores estudando abacaxis observaram diferentes valores de
sólidos solúveis para polpas de Smooth Cayenne, entre 13 e 19 º Brix (MATOS et. al.,
1999), 12,48º Brix (BARTOLOMÉ; RUPKEZ; FIISTER, 1996) e para polpa do Pérola,
14 a 16º Brix (MATOS et. al., 1999), 15,6 º Brix (CARVALHO, 2007).
Avaliando as cascas dos referidos cultivares quanto aos valores de sólidos
solúveis percebemos que o abacaxi Emepa-01 (6,50 ºBrix) e o Pérola (10,00 ºBrix)
apresentam diferença significativa, representando respectivamente a casca de menor e
maior teor, enquanto que os outros cultivares entre si e com relação aos anteriormente
citados não revelam diferença estatística.
A análise estatística dos valores de sólidos solúveis de todas as amostras
evidencia a formação de dois grupos distintos, polpas e cascas, onde as polpas
apresentam teores significativamente maiores do que as cascas.
5.2 pH
Os resultados das análises de pH para as polpas e cascas dos cultivares
analisados estão expressos na tabela 5.
60
Tabela 5: Valores médios de pH das polpas e cascas dos cultivares analisados.
pH
Amostras
Polpa Casca
Emepa-01 3,93±0,14
c
4,22±0,07
a
Imperial 3,74±0,02
d
3,91±0,01
c
MD-2 3,70±0,02
d
4,11±0,03
b
Pérola 3,68±0,04
d
4,31±0,04
a
Smooth Cayenne 3,44±0,01
e
3,91±0,01
c
Resultados das analises com média de cinco repetições (± desvio padrão). Letras diferentes (na mesma
linha ou coluna) apresentaram diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan.
A avaliação de pH das polpas dos cultivares estudados evidencia a formação de
três grupos estatisticamente diferentes: (1) Emepa-01 (pH - 3,93), cultivar de maior pH;
(2) Imperial (pH – 3,74), MD-2 (pH – 3,70) e Pérola (pH – 3,68), cultivares com pH
intermediário; e Smooth Cayenne (pH – 3,44), cultivar de menor pH.
Alguns autores relatam valores de pH próximos aos encontrados neste estudo,
assim como Carvalho (2007), que relata valores de pH de 4,00 para a polpa do abacaxi
Pérola e Bartolomé, Rupkez, Fiister (1996) que descrevem pH 3,54 para a polpa do
Smooth Cayenne.
A análise estatística do pH das cascas estudadas revela a formação de três
grupos estatisticamente distintos: (1) Emepa-01 (pH – 4,22) e Pérola (pH – 4,31),
cultivares com pH mais elevado; (2) MD-2 (pH – 4,11), cultivar com pH intermediário; (3)
Imperial (pH – 3,91) e Smooth Cayenne (pH – 3,91), cultivares com pH mais baixo.
As polpas analisadas apresentam pH significativamente menor que as
respectivas cascas.
5.3 Acidez titulável
A determinação de acidez titulável pode fornecer um dado valioso na apreciação
do estado de conservação de um produto alimentício. Um processo de decomposição
61
seja por hidrólise, oxidação ou fermentação, altera quase sempre a concentração de
íons hidrogênio (São Paulo, 1985).
Assim como os valores de pH os valores de acidez também relacionam-se com a
palatabilidade dos frutos, já que valores de acidez mais baixos apresentam maior
aceitação pelo consumidor.
Os resultados das análises de acidez para polpas e cascas dos cultivares
analisados estão expressos na tabela 6.
Tabela 6: Valores médios de acidez titulável das polpas e das cascas dos cultivares
analisados.
Acidez titulável (%ácido cítrico)
Amostras
Polpa Casca
Emepa-01 0,35±0,12
cd
0,21±0,02
e
Imperial 0,41±0,03
cd
0,32±0,00
d
MD-2 0,43±0,03
bc
0,38±0,01
cd
Pérola 0,51±0,08
ab
0,22±0,02
e
Smooth Cayenne 0,56±0,04
a
0,52±0,01
a
Resultados das analises com média de cinco repetições (± desvio padrão). Letras diferentes (na
mesma linha ou coluna) apresentaram diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan.
Ao determinarmos a acidez titulável das polpas dos híbridos produzidos na
Paraíba e dos cultivares tradicionalmente comercializados, observamos que os
cultivares Emepa-01 (acidez - 0,35%) e Imperial (acidez - 0,41%) são estatisticamente
iguais, apresentando valores de acidez significativamente menores quando comparados
ao Pérola (acidez - 0,51%) e ao Smooth Cayenne (acidez - 0,56%), que não diferem
estatisticamente entre si.
Matos et. al. (1999) relatam o Smooth Cayenne como de acidez superior aos
outros cultivares e o Pérola como de pouca acidez. No entanto, o presente estudo
mostra que os cultivares em questão apresentam valores próximos de acidez, e que
representam os mais ácidos dentre os analisados.
62
Os resultados do estudo de Barreiro Neto (2002), demonstram valores de acidez
mais elevados que os citados neste trabalho, para as polpas dos cultivares Emepa-01
(0,63%), MD-2 (0,97%) e Smooth Cayenne (0,82%), com exceção da polpa do Pérola,
para qual o estudo de Barreiro Neto (2002) e o de Carvalho (2007) relatam acidez
inferior aos dados expressos na tabela 5, 0,45% e 0,44% respectivamente.
A menor acidez do Emepa-01 e do Imperial, citada neste trabalho é concordante
com as citações de Barreiro Neto (2002) e Matos e Cabral (2005), respectivamente.
Esta propriedade eleva a suscetibilidade destes cultivares ao desenvolvimento de
microrganismos, ao passo que aumenta a sua aceitabilidade pelo consumidor.
O abacaxi MD-2, que apresenta 0,43% de acidez titulável, situa-se
estatisticamente entre o grupo dos híbridos e o Pérola, sendo significativamente menor
que o Smooth Cayenne. SBRT (2006) cita este cultivar como de menor teor de acidez.
Os resultados dos valores de acidez titulável para as cascas demonstram que o
Smooth Cayenne tem significativamente maior acidez que as outras cascas analisadas,
e que o Emepa-01 e o Pérola apresentam significativamente menor teor. As cascas dos
abacaxis Imperial e MD-2 aparecem com valores intermediários de acidez, não diferindo
estatisticamente entre si.
A polpa e casca do cultivar Smooth Cayenne são estatisticamente iguais,
enquanto que o Emepa-01 e o Pérola têm polpas com teores de acidez
significativamente maiores que as respectivas cascas e o abacaxi Imperial e o MD-2
não diferem estatisticamente entre suas polpas e cascas.
5.4 Relação sólidos solúveis totais e acidez titulável (SST/AT)
Segundo Campese (2004) e César (2005) é importante conhecer a relação
Brix/acidez total titulável da variedade que vai ser comercializada ou industrializada,
visto que este é o parâmetro que mais se relaciona a palatabilidade, e
conseqüentemente a aceitação dos frutos pelo consumidor.
63
Muitos estudos mostram que a relação entre os sólidos solúveis totais e acidez
titulável é a medida que melhor traduz a percepção de sabor do consumidor. Um
abacaxi saboroso deve ter SST/AT maior que 20 (RIVELLIS, 2007).
Os resultados das determinações da relação sólidos solúveis e acidez titulável
para polpas e cascas dos cultivares analisados estão expressos na tabela 7. Para estas
análises não foi realizada análise estatística, já que utilizamos para sua determinação a
média estatística dos valores obtidos para sólidos solúveis totais e a média estatística
dos valores de acidez titulável.
Tabela 7: Resultados da relação sólidos solúveis totais e acidez titulável (SST/AT) nas
polpas dos cultivares analisados.
SST/AT
Amostras
Polpa Casca
Emepa-01 31,43 30,95
Imperial 43,10 26,56
MD-2 37,97 24,13
Pérola 26,80 45,45
Smooth Cayenne 26,78 14,42
Os resultados desta análise sugerem que todos as polpas dos abacaxis
avaliados revelam boa aceitabilidade pelo consumidor, já que expressaram SS/AT
maior que 20 (RIVELLIS, 2007). Todas as polpas dos híbridos produzidos na Paraíba
têm SS/AT elevado quando comparados aos cultivares tradicionalmente
comercializados. Neste âmbito, o abacaxi Imperial merece destaque por apresentar um
SS/AT de 43,10, o que corresponde a um valor 60% mais elevado que o SS/AT das
polpas dos abacaxis tradicionais.
Carvalho (2007), discorda dos valores de SS/AT expressos neste trabalho para a
polpa do abacaxi Pérola ao relatar valores de 35,4 para tal amostra.
64
Com relação às cascas, o abacaxi Pérola fornece os maiores valores de SS/AT
(45,45), enquanto que o Smooth Cayenne (14,42) apresenta os valores mais inferiores
deste parâmetro.
5.5 Açúcares
5.5.1 Açúcares redutores
Os açúcares redutores, como a glicose e a frutose, possuem grupos aldeídos e
cetonas, respectivamente, livres na cadeia e são chamados redutores por atuarem
como agentes redutores, isto é, que sofrem oxidação (doam elétrons).
Os resultados das análises de açúcar redutor para polpas e cascas dos
cultivares analisados estão expressos na tabela 8.
Tabela 8: Valores médios dos teores de açúcar redutor das polpas e das cascas dos
cultivares analisados.
Açúcar redutor (g de glicose/100g de
amostra)
Amostras
Polpa Casca
Emepa-01 3,11±0,09
d
2,72±0,15
e
Imperial 4,60±0,05
b
3,22±0,06
d
MD-2 4,56±0,08
bc
3,12±0,29
d
Pérola 5,37±0,41
a
4,19±0,38
c
Smooth Cayenne 5,09±0,16
a
3,04±0,06
de
Resultados das analises com média de cinco repetições (± desvio padrão). Letras diferentes (na
mesma linha ou coluna) apresentaram diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan.
Diante dos resultados expostos na tabela 8 observamos que as polpas dos
abacaxis Pérola e Smooth Cayenne apresentam porcentagem de açúcar redutor
significativamente maior (p< 0,05) do que os híbridos produzidos na Paraíba, com
65
teores de 5,37 g de glicose e 5,09 g de glicose para 100g de amostra respectivamente,
não diferindo entre si.
Carvalho (2007) relata valores de 4,43 g de glicose/ 100g de amostra para a
polpa do Pérola, resultados próximos aos encontrados neste estudo.
Quanto aos resultados expressos pelos híbridos, verifica-se que não existe
diferença estatística (p< 0,05) entre as polpas dos cultivares MD-2 e Imperial. No
entanto a polpa do Emepa-01 aparece com teores significativamente menores (p< 0,05)
de açúcares redutores quando comparados a todas as polpas avaliadas.
As análises de açúcares redutores para as cascas dos abacaxis em questão
(tabela 8) forneceram resultados que demonstram a existência de três grupos
estatisticamente distintos (p< 0,05): (1) Pérola (4,19 g de glicose/100g de amostra),
cultivar com os teores mais elevados; (2) Imperial (3,22 g de glicose/100g de amostra) e
MD-2 (3,12 g de glicose/100g de amostra), que apresentam semelhança estatística
entre si, e apresentam teores intermediários; (3) Emepa-01 (2,72 g de glicose/100g de
amostra), cultivar com os menores teores. A análise estatística deste parâmetro revela
que a casca do Smooth Cayenne apresenta uma média de 3,04 g de glicose/100g de
amostra, valores 50% mais elevados que os encontrados por Bartolomé, Rupkez, Fiister
(1996), 1,45 g de glicose/100g de amostra.
César (1999), ao estudar os açúcares redutores do abacaxi Pérola verificou
valores de 2,22 g de glicose/100g de amostra para o fruto e 1,06 para casca, dados
inferiores aos encontrados neste trabalho. As diferenças citadas entre estes estudos
provavelmente decorre de variações climáticas nas regiões produtoras, evidenciando a
superioridade do Pérola produzido no Estado da Paraíba quanto ao teor de açúcares
redutores.
As polpas dos cultivares em questão apresentam teores de açúcares redutores
significativamente maiores do que suas respectivas cascas.
66
5.5.2 Açúcares totais
Os resultados das análises de açúcar redutor para polpas e cascas dos
cultivares analisados estão expressos na tabela 9.
Tabela 9: Valores médios dos teores de açúcar total das polpas e das cascas dos
cultivares analisados.
Açúcares totais (g/100g de amostra)
Amostras
Polpa Casca
Emepa-01
7,92±0,14
c
4,56±0,08
d
Imperial
10,98±0,40
b
5,79±0,12
c
MD-2
11,03±0,08
b
5,57±0,02
c
Pérola
12,34±0,67
a
5,55±0,53
c
Smooth Cayenne
12,55±0,66
a
5,53±0,07
c
Resultados das analises com média de cinco repetições (± desvio padrão). Letras diferentes (na
mesma linha ou coluna) apresentaram diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan.
A determinação dos teores de açucares totais para as polpas estudadas
demonstra que os tradicionais cultivares comercializados obtiveram valores
significativamente mais elevados (p<0,05) que os híbridos produzidos na Paraíba e que
dentre estes a polpa do Emepa-01 apresenta significativamente os menores (p<0,05)
teores de açúcares totais, 7,92 g/ 100g de amostra.
Os resultados descritos por Matos et.al. (1999) concordam com os encontrados
no presente estudo, no que se refere aos elevados teores de açúcares totais para a
polpa do Smooth Cayenne, no entanto, Matos descreve ainda a polpa do Pérola como
de menor teor de açúcares totais que o Smooth Cayenne discordando dos dados
obtidos neste trabalho que demostram que quanto ao teor de açúcares totais as polpas
dos cultivares Pérola e Smooth Cayenne são estatisticamente iguais.
Segundo Bartolomé, Rupkez, Fiister (1996), a polpa do abacaxi Smooth cayenne
apresenta 8,15 g de açúcares totais por 100g de amostra, valores próximos aos citados
neste trabalho.
67
Com relação a analise de açucares totais das cascas em análise verificou-se que
todos os cultivares analisados são estatisticamente iguais, com exceção do Emepa-01
que apresenta valores significativamente menores (p<0,05) de 4,56 g de açúcares totais
por 100g de amostra.
As polpas dos cultivares analisados apresentam teores de açúcares totais
significativamente maiores do que suas respectivas cascas.
5.5.3 Açúcares não redutores
Açúcares não redutores (como a sacarose) possuem os grupos aldeídos e
cetonas interligados e tornam-se redutores a partir do momento em que sofrem hidrólise
(quebra).
Os resultados das análises de açúcar não redutor para polpas e cascas dos
cultivares analisados estão expressos na tabela 10.
Tabela 10: Valores médios dos teores de açúcar não redutor das polpas e das cascas
dos cultivares analisados.
Açúcar não redutor (g de sacarose/
100g de amostra)
Amostras
Polpa Casca
Emepa-01
4,56±0,13
d
1,75±0,13
e
Imperial
6,06±0,38
c
2,44±0,11
d
MD-2
6,15±0,02
bc
2,37±0,02
d
Pérola
6,62±1,21
ab
1,35±0,23
e
Smooth Cayenne
7,09±0,24
a
3,88±0,06
d
Resultados das analises com média de cinco repetições (± desvio padrão). Letras diferentes (na
mesma linha ou coluna) apresentaram diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan.
A partir dos resultados expostos na tabela 10 observa-se que dentre as polpas
analisadas as dos cultivares Emepa-01 e Imperial apresentam valores de açúcares não
68
redutores significativamente inferiores (p<0,05) quando comparadas as polpas dos
tradicionais cultivares, diferindo estatisticamente entre si.
De acordo com Bartolomé, Rupkez, Fiister (1996), a polpa do abacaxi Smooth
Cayenne apresenta um teor de 4,50 g de sacarose por 100g de amostra, valores
próximos aos encontrados neste estudo.
A análise das cascas dos cultivares avaliados com relação ao teor de açúcares
não redutores revela que os abacaxis Imperial, MD-2 e Smooth Cayenne são
estatisticamente superiores aos cultivares Emepa-01 e Pérola.
As polpas dos cultivares analisados apresentam teores de açúcares não
redutores significativamente maiores do que suas respectivas cascas.
5.6 Atividade proteolítica (bromelina)
Os resultados das análises de atividade proteolítica (bromelina) para polpas e
cascas dos cultivares analisados estão expressos na tabela 11.
Tabela 11: Valores médios de atividade proteolítica do extrato bruto das polpas e das
cascas dos cultivares analisados.
Atividade Proteolítica
(U/mL de Extrato bruto)
Atividade Proteolítica (U/100g de
amostra)
Amostras
Polpa Casca Polpa Casca
Emepa-01 12,93±3,26
d
22,95±1,73
b
2586,00±652,00
d
4590,00±346,00
d
Imperial 56,41±7,07
a
68,56±21,55
a
11282,00±1414,00
a
13712,00±4310,00
a
MD-2 17,09±5,70
c
26,66±7,11
b
3418,00±1140,00
c
5332,00±1422,00
b
Pérola 9,48±2,20
e
61,83±7,40
a
1896,00±440,00
e
12366,00±1480,00
a
Smooth
Cayenne
5,54±1,44
f
23,04±2,74
b
1108,00±288,00
f
48608,00±548,00
b
Resultados das analises com média de cinco repetições (± desvio padrão). Letras diferentes (na
mesma linha ou coluna) apresentaram diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan.
69
Com relação a tal propriedade todas as polpas analisadas apresentam diferença
estatística entre si (p < 0,05). Em ordem decrescente de atividade proteolítica as polpas
estão dispostas da seguinte forma: Imperial (56,41 U/mL), MD-2 (17,09 U/mL), Emepa-
01 (12,93 U/mL), Pérola (9,48 U/mL) e Smooth Cayenne (5,54 U/mL). Esses resultados
mostram que todas as polpas dos híbridos paraibanos são mais ricos quanto a este
parâmetro quando comparados aos cultivares tradicionalmente comercializados.
Destacando-se a polpa do Imperial que apresenta atividade proteolítica 200% maior
que a do MD-2.
Analisando as cascas dos cultivares em questão, observamos que a análise
estatística separou-as em apenas dois grupos: (1) Imperial (68,56 U/mL) e Pérola
(61,83 U/mL), grupo com atividade mais elevada; (2) MD-2 (26,66 U/mL), Smooth
Cayenne (U/mL) e Emepa-01 (22,95 U/mL).
Segundo César (1999), o abacaxi Pérola apresenta atividade proteolítica de 1,43
U/mL para a polpa e de 0,86 U/mL para a casca, valores inferiores aos citados neste
estudo provavelmente são decorrentes das variações climáticas onde os frutos foram
produzidos.
Ao analisar a atividade proteolítica dos talos de abacaxizeiro do cultivar Smooth
Cayenne, de diversas procedências no Estado de São Paulo, Baldini et. al. (1993),
verificaram valores que variaram de 216,1 U/100g de talo a 4848,6 U/100g de talo.
Como neste trabalho cada mL de extrato bruto corresponde a 0,5g de amostras,
obtivemos para o Smooth Cayenne valores de 1108,00 U/100g de polpa e 4608,00 U/
100g de casca. Estes dados revelam que tanto a polpa quanto a casca do Smooth
Cayenne podem ser utilizados com sucesso para obtenção da bromelina, já que estas
partes têm atividade proteolítica semelhante ao talo, que representa a matéria prima
mais empregada para a obtenção da bromelina.
Segundo Costa et. al. (2007), o cultivar Smooth Cayenne apresenta semelhança
em termos protéicos e enzimáticos nos tecidos do caule com a variedade Vitória,
resistente à fusariose, e lançada no mercado em novembro de 2006, no Estado do
Espírito Santo.
70
A tabela 11 revela que o cultivar Imperial apresenta maior atividade da enzima
bromelina na polpa e na casca, quando comparada ao cultivar Pérola. A superioridade
do abacaxi Imperial sobre o Pérola quanto a atividade proteolítica também é
evidenciada em caules e folhas desenvolvidas “in vitro” (LEITE et. al., 2007).
Comparando os resultados das polpas com os das cascas, verificamos que com
exceção da polpa e da casca do abacaxi Imperial que apresentam semelhanças
estatísticas, todas as cascas fornecem valores significativamente mais elevados (p
<0,05) que suas respectivas polpas. Apesar dos talos de abacaxizeiro serem a matéria
prima de escolha para a obtenção da bromelina, devido à fácil disponibilidade, a
elevada atividade proteolítica encontrada nas cascas estudadas sugerem a utilização
deste resíduo agrícola como promissora fonte de bromelina.
5.7 Proteínas
Os resultados das análises de proteínas para polpas e cascas dos cultivares
analisados estão expressos na tabela 12.
Tabela 12: Valores médios de proteínas do extrato bruto das polpas e das cascas dos
cultivares analisados.
Proteínas (mg/mL de
Extrato bruto)
Proteínas (g/100g de amostra)
Amostras
Polpa Casca Polpa Casca
Emepa-01 4,00±1,10
g
6,20±4,00
ef
0,8±0,22
g
1,24±0,80
ef
Imperial 7,50±0,50
c
10,40±0,60
a
1,50±0,10
c
2,08±0,12
a
MD-2 6,50±1,00
de
9,00±0,60
b
1,30±0,20
de
1,80±0,12
b
Pérola 3,80±0,50
g
7,00±0,60
cd
0,76±0,10
g
1,40±0,12
cd
Smooth Cayenne 5,60±0,80
f
8,50±0,40
b
1,12±0,16
f
2,24±0,08
b
Resultados das analises com média de cinco repetições (± desvio padrão). Letras diferentes (na
mesma linha ou coluna) apresentaram diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan.
71
Esta análise dispõe as referidas polpas na seguinte ordem decrescente de teor
de proteínas: Imperial (1,50 g/100g de polpa), MD-2 (1,30 g/100g de polpa), Smooth
Cayenne (1,12 g/100g de polpa) e por fim o Emepa-01 (0,80 g/100g de polpa) e o
Pérola (0,76 g/100g de polpa), que são estatisticamente semelhantes e apresentam
valores significativamente menores com relação às outras amostras. As outras três
polpas estudadas são estatisticamente diferentes (p< 0,05) quanto ao teor de proteínas.
Alguns autores relatam valores de proteína para a polpa do cultivar Pérola
próximos aos citados neste estudo, tais como, Carvalho (2007), que relata 0,44 g de
proteína/ 100g amostra, e USDA (2001), que descreve valores de 0,54 g de proteína/
100g de polpa.
A determinação do teor de proteínas nas cascas dos híbridos paraibanos e dos
cultivares tradicionalmente comercializados revela que após o teste de Duncan as
amostras de MD-2 (1,80 g/ 100g de casca) e de Smooth Cayenne (2,24 g/ 100g de
casca) formam um único grupo e que portanto estas duas cascas expõem semelhança
estatísticas.
As cascas dos cultivares Emepa-01, Imperial e Pérola apresentam diferenças
estatísticas entre si e entre o grupo composto pelas cascas do MD-2 e Smooth
Cayenne. As cascas estão dispostas na seguinte ordem decrescente de teor de
proteínas: Imperial (2,08 g/ 100g de casca), casca com os níveis mais elevados; grupo
formado pelo MD-2 e Smooth Cayenne; Pérola (1,40 g/ 100g de casca) e Emepa-01
(1,24 g/ 100g de casca), casca com os menores níveis.
Gondim, et. al. (2005), concordam com os resultados expostos na tabela 12, no
que se refere à casca do abacaxi Pérola, ao descrever teores 1,45 g de proteína / 100g
de casca.
De acordo com César (1999) a polpa do abacaxi Pérola apresenta teores de
1,13mg de proteína por mL de extrato bruto de amostra, enquanto a casca fornece
teores de 0,84 mg de proteína por mL de extrato bruto de amostra. Portanto, os valores
citados por César (1999) são mais elevados que os valores de 0,38mg de proteína por
mL de extrato bruto para a polpa e de 0,70 mg de proteína por mL de extrato bruto de
72
amostra para a casca. Neste estudo cada mL de extrato bruto corresponde a 0,5 grama
de amostra.
As cascas de todos os cultivares em estudo fornecem teores significativamente
mais elevados (p< 0,05) que suas respectivas polpas. Este fato sugere a utilização dos
resíduos industriais, do qual fazem parte as cascas dos frutos do abacaxizeiro, como
matéria prima para a obtenção de proteína, além da extração da bromelina.
Quanto ao teor de proteínas faz-se necessário destacar o abacaxi Imperial que
apresenta os maiores teores tanto na polpa quanto na casca, representando dentre
todos os cultivares avaliados neste estudo a melhor fonte protéica.
De acordo com Baldini et. al. (1993), os talos dos abacaxis Smooth Cayenne
fornecem teores de proteína que variam entre 0,27g/ 100g de talo e 1,95g/ 100g de talo,
valores próximos aos encontrados neste estudo para a polpa e casca do cultivar
Smooth Cayenne. César (1999) concorda com estes dados ao descrever que o fruto e
talo apresentam o mesmo teor de proteína total.
5.8 Atividade específica da bromelina
Estudou-se o comportamento desta variável pois este é um indicador do grau de
purificação obtida no extrato bruto da atividade enzimática em relação às proteínas
totais no sistema, indicando possivelmente a concentração de bromelina.
Os resultados das análises de atividade específica da bromelina para polpas e
cascas dos cultivares analisados estão expressos na tabelas 13.
73
Tabela 13: Valores médios de atividade específica do extrato bruto das polpas e das
cascas dos cultivares analisados.
Atividade específica (U/mg de proteína)
Amostras
Polpa Casca
Emepa-01 3,09±1,10
c
3,81±0,13
c
Imperial 7,49±0,91
b
6,59±2,16
b
MD-2 2,60±0,59
cd
2,96±0,84
c
Pérola 2,32±0,30
cd
10,01±0,43
a
Smooth Cayenne 1,00±0,21
e
2,72±0,24
c
Resultados das analises com média de cinco repetições (± desvio padrão). Letras diferentes (na
mesma linha ou coluna) apresentaram diferença significativa (p<0,05) pelo teste de Duncan.
Avaliando as polpas dos abacaxis em estudo sob o parâmetro de atividade
específica verificamos que o Imperial (7,49 U/mg de proteína) fornece valores
significativamente maiores (p< 0,05) e o Smooth Cayenne (1,00 U/mg de proteína)
valores significativamente menores (p< 0,05) com relação a todas as polpas analisadas.
A polpa do MD-2 (2,60 U/mg de proteína) e do Pérola (2,32 U/mg de proteína)
formam um único grupo quando submetidas ao teste de Ducan, e portanto são
semelhantes estatisticamente. Este grupo não difere significativamente (p< 0,05) do
Emepa-01 (3,09 U/mg de proteína).
Com relação às análises de atividade específica realizadas para as cascas, a
análise estatística separa-as em três grupos significativamente diferentes (p< 0,05): (1)
Pérola (10,01 U/mg de proteína), casca de teor mais elevado; (2) Imperial (6,59 U/mg
de proteína), casca com teores intermediários e (3) Emepa-01 (3,81 U/mg de proteína),
MD-2 (2,96 U/mg de proteína) e Smooth Cayenne (2,72 U/mg de proteína). Os
membros do grupo 3 não se diferenciam significativamente (p < 0,05).
Os cultivares tradicionalmente comercializados, Pérola e Smooth Cayenne
apresentam significativamente teores mais elevados de atividade específica nas
respectivas cascas do que nas polpas. Enquanto que os híbridos produzidos na
Paraíba, Emepa-01, Imperial e MD-2 não demonstram diferenças estatísticas entre
suas respectivas polpas e cascas, no que se refere a tal propriedade.
74
Baldini et. al. (1993) ao realizar estudo sobre a atividade de bromelina em talos
do cultivar Smooth Cayenne proveniente de varias regiões do Estado de São Paulo,
descreveu valores de atividade específica para o extrato bruto que variaram entre 0,03
U/ mg de proteína e 1,31 U/ mg de proteína. Apesar da literatura citar que o talo do
abacaxizeiro é a fonte preferida para a obtenção comercial de bromelina, os resultados
de Rowan et. al. (1990) e César (1999) confirmam os dados da tabela 13 , ao relatar
que a bromelina do fruto tem uma atividade proteolítica maior que a bromelina do talo,
constituindo portando, uma melhor fonte para a extração desta enzima.
5.9 Precipitação fracionada com sulfato de amônio
A adição de sulfato de amônio ao extrato bruto possibilita a precipitação
fracionada das proteínas da amostra, incluindo as enzimas, separando-as do restante
dos componentes do extrato bruto.
A determinação da atividade da bromelina, do teor de proteínas e da atividade
específica da referida enzima em todos os precipitados foi realizado com o objetivo de
identificar em que intervalo de concentração de sulfato de amônio se concentra mais
atividade enzimática.
5.9.1 Atividade proteolítica da bromelina
Os resultados das análises de atividade proteolítica (bromelina) para as frações
dos concentrados obtidos com sulfato de amônia das polpas e cascas dos cultivares
analisados estão expressos nas figuras 16 e 17 respectivamente e nos apêndices B, C,
D, E, F, G, H, I, J e L.
Todas as amostras submetidas à precipitação fracionada com sulfato de amônio
apresentaram atividade proteolítica concentrada em pelo menos uma das frações,
quando comparadas ao respectivo extrato bruto.
75
12,93
56,41
17,09
9,48
5,54
28,9
39,31
29,32
124,07
38,35
38,9
109,24
123,12
9,89
38,83
0 20 40 60 80 100 120 140
Emepa-01
Imperial
MD-2
Pérola
Smooth Cayenne
20-40% de
saturação
0-20%de
saturação
Extrato bruto
Atividade proteolítica (U/mL de extrato bruto)
Figura 16: Atividade das frações concentradas com sulfato de amônia das polpas dos
cultivares analisados.
A avaliação da atividade proteolítica para as frações derivadas da precipitação
fracionada do extrato bruto das polpas com sulfato de amônia revela que o Imperial,
MD-2 e o Emepa-01 foram melhor concentradas na fração de 20–40% de saturação,
com atividades de 123,12 U/mL, 109,24 U/mL e 38,90 U/mL de extrato bruto
respectivamente, enquanto para a polpa do Pérola a maior concentração foi obtida na
fração de 0–20% de saturação, com 124,07 U/mL de atividade proteolítica. A polpa do
Smooth Cayenne forneceu maior atividade em duas frações consecutivas, 0-20% e 20-
40%, com atividades respectivas de 38,35 U/mL e 38,83 U/mL.
Nenhuma das polpas analisadas apresentou atividade proteolítica nas frações de
40-60%, 60-80% e 80-100%.
76
22,95
68,56
26,66
61,83
23,04
78,1
90,75
76,9
27,81
42,32
12,39
6,63
6,09
9,82
58,9
0 20 40 60 80 100
Emepa-01
Imperial
MD-2
Pérola
Smooth Cayenne
20-40% de
saturação
0-20% de
saturação
Extrato bruto
Atividade proteolítica
(U/mL de extrato bruto)
Figura 17: Atividade das frações concentradas com sulfato de amônia das cascas dos
cultivares analisados.
Observando os resultados expressos na figura 18, verificamos que as cascas
dos abacaxis Imperial, Emepa-01 e MD-2 foram melhor concentradas quanto a
atividade proteolítica nas frações de 0-20% de sulfato de amônia, com os seguintes
valores: Imperial 90,75 U/mL, Emepa-01 78,10 U/mL e MD-2 76,90 U/mL. A casca do
Smooth Cayenne tem maior atividade na fração 20-40%, com valores de 42,32 U/mL,
enquanto que a casca do Pérola não obteve atividade proteolítica concentrada em
nenhuma das frações.
Não foi verificado atividade em nenhuma das amostras nas frações de 40-60%,
60-80% e 80-100%.
5.9.2 Proteína
Os resultados das análises de proteína para as frações dos concentrados com
sulfato de amônia das polpas dos cultivares analisados estão expressos na figura 18 e
19 respectivamente e nos apêndices B, C, D, E, F, G, H, I, J e L.
77
4
7,5
6,5
3,8
5,6
3,18
1,65
2,83
2,35
2,13
1,67
1,8
2,12
1,53
1,17
0,39
0,17
0,44
0,3
0,44
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Emepa-01
Imperial
MD-2
Pérola
Smooth Cayenne
40-60% de
saturação
20-40% de
saturação
0-20% de
saturação
Extrato bruto
Proteína (mg/mL de extrato bruto)
Figura 18: Proteína das frações concentradas com sulfato de amônia das polpas dos
cultivares analisados.
A determinação do teor de proteínas das frações concentradas das polpas
analisadas mostra que com exceção da polpa do abacaxi Imperial, todas as polpas
obtiveram maior teor de proteínas na fração 0-20%, expressando os seguintes valores
protéicos: Emepa-01 3,18 mg/ mL ; MD-2 2,83 mg/mL ; Pérola 2,35 mg/ mL ; e Smooth
Cayenne 2,13 mg/ mL de extrato bruto. A polpa do cultivar Imperial revelou maior teor
de proteína na fração 20-40%, com 1,80 mg/ mL de extrato bruto. Em nenhuma das
amostras foi identificada a presença de proteínas nas frações 60-80% e 80-100%.
78
6,2
10,4
9
7
8,5
5,29
3,47
3,75
4,79
2,34
2,47
1,06
2,03
3,36
1,46
1,49
0,38
0,7
1,31
0,43
0 2 4 6 8 10 12
Emepa-01
Imperial
MD-2
Pérola
Smooth Cayenne
40-60% de
saturação
20-40% de
saturação
0-20% de
saturação
Extrato bruto
Proteína (mg/mL de extrato bruto)
Figura 19: Proteína das frações concentradas com sulfato de amônia das cascas dos
cultivares analisados.
Em todas as cascas submetidas à precipitação fracionada com sulfato de amônio
foi verificado maior teor de proteínas nas frações 0-20%. Os valores de proteína e
rendimento, em ordem decrescente, expressos pelas frações 0-20% foram os
seguintes: Emepa-01 5,29 mg / mL ; Pérola 4,79 mg/ mL ; MD-2 3,75 mg / mL; Imperial
3,47 mg/ mL; Smooth Cayenne 2,34 mg/ mL de extrato bruto.
Bladini et. al. (1993), descreve valores de proteína para amostras de talos de
abacaxizeiros do cultivar Smooth Cayenne precipitados com etanol, que variam de 1,38
g/ 100g e 0,08 g/ 100g de talo. Como neste trabalho 1 mL de extrato bruto corresponde
a 0,5g de amostra, observamos que a fração 0-20% da polpa do cultivar Smooth
Cayenne apresenta 0,43 g de proteína/ 100g de amostra e a respectiva casca 0,47 g de
proteína/ 100g de amostra, valores intermediários aos expressos por Baldini et. al.
(1993).
79
5.9.3 Rendimento protéico (RT) e em atividade enzimática (AP)
O rendimento protéico e em atividade enzimática das polpas dos cultivares
analisados estão relatados respectivamente na tabelas 14 e 15.
Tabela 14: Rendimento protéico (RT) em porcentagem, nas frações derivadas da
precipitação fracionada com sulfato de amônio das polpas dos cultivares analisados.
Frações Emepa-01 Imperial MD-2 Pérola
Smooth
Cayenne
0-20% 7,95% 3,28% 4,33% 22,63% 2,53%
20-40% 4,17% 2,86% 3,25% 6,82% 1,39%
60-40% 0,01% 0,27% 0,67% 0,79% 0,52%
Total
recuperado*
12,13% 6,41% 8,25% 30,24% 4,44%
* Soma do rendimento de todas as frações
Com relação ao rendimento protéico verificado nas frações obtidas a partir do
extrato bruto das polpas analisadas observou-se a maior recuperação de proteínas na
fração 0-20% do Pérola, 22,63%. Esta polpa também obteve a maior recuperação total
de proteínas, 30,24%.
Tabela 15: Rendimento em atividade enzimática (AP) em porcentagem, nas
frações derivadas da precipitação fracionada com sulfato de amônio das polpas dos
cultivares analisados.
Frações Emepa-01 Imperial MD-2 Pérola
Smooth
Cayenne
0-20% 22,35% 10,44% 17,16% 72,89% 46,15%
20-40% 30,08% 23,23% 72,04% 11,47% 46,72%
Total
recuperado*
52,43% 33,67% 89,20% 84,36% 92,87%
* Soma do rendimento de todas as frações
80
As determinações de atividade proteolítica nas frações derivados da precipitação
fracionada com sulfato de amônio do extrato bruto das cascas dos abacaxis analisados
revelou que as frações 0-20% do Pérola e 20-40% do MD-2 apresentaram os melhores
rendimentos enzimáticos, 72,89 e 72,04% respectivamente.
Com exceção da polpa do abacaxi Imperial todas as outras polpas apresentaram
recuperação total superior a 50%, e dentre as polpas a do abacaxi Smooth Cayenne
apresentou o maior rendimento total de atividade enzimática, 92,87%.
Estes dados tornam evidente que apesar das atividades das polpas de Imperial e
Pérola serem bastante próximas, quando tratamos de rendimento enzimático o Pérola é
superior, isto quer dizer que sob este método de concentração a obtenção da enzima
bromelina é mais eficiente quando realizada a partir da polpa do Pérola.
Tabela 16: Rendimento protéico (RT) em porcentagem, nas frações derivadas da
precipitação fracionada com sulfato de amônio das cascas dos cultivares analisados.
Frações Emepa-01 Imperial MD-2 Pérola
Smooth
Cayenne
0-20% 9,26% 5,29% 5,57% 10,32% 4,81%
20-40% 3,33% 1,48% 3,89% 6,27% 3,00%
40-60% 2,61% 0,48% 1,03% 2,26% 0,88%
Total
recuperado*
15,21% 7,25% 10,49% 18,85% 8,69%
* Soma do rendimento de todas as frações
Assim como nas frações derivadas das polpas, a análise do teor de proteínas
nas frações derivadas das cascas revelaram para o Pérola o maior rendimento protéico
dentre as frações, 10,32% na fração 0-20%, e maior recuperação total de proteínas,
18,85%.
81
Tabela 17: Rendimento em atividade enzimática (AP) em porcentagem, nas frações
derivadas da precipitação fracionada com sulfato de amônio das cascas dos cultivares
analisados.
Frações Emepa-01 Imperial MD-2 Pérola
Smooth
Cayenne
0-20% 36,86% 20,89% 38,46% 6,75% 32,04%
20-40% 4,50% 0,02% 0,04% 2,06% 44,59%
Total
recuperado*
41,36% 20,91% 38,50% 8,81% 76,63%
* Soma do rendimento de todas as frações
Diferentemente das polpas, as determinações de atividade proteolítica nas
frações de cascas derivadas da precipitação fracionada com sulfato de amônio
demonstraram que dentre as frações a 20-40% do Smooth Cayenne obteve maior
recuperação com 44,59% de AP. Esta casca também apresentou o maior rendimento
total com 76,63% de AP.
Apesar do imperial fornecer maior atividade na sua fração pico, os abacaxis
Emepa-01 e MD-2 apresentam maior rendimento.
De acordo com Baldini et. al. (1993), que realizou a recuperação da atividade da
bromelina extraída de talos de abacaxizeiros mediante precipitação com etanol, o AP
variou entre 86,6% e 23,70%, resultados que confirmam o presente estudo que revela
valores de AP de até 72,89%, o que significa que a recuperação da bromelina através
da precipitação com etanol e sulfato de amônio são equivalentes.
5.9.4 Atividade específica
Os resultados das análises de atividade específica (bromelina) para as frações
dos concentrados com sulfato de amônia das polpas e cascas dos cultivares analisados
estão expressos nas figuras 20 e 21 respectivamente e nos apêndices B, C, D, E, F, G,
H, I, J e L.
82
3,09
7,49
2,6
2,32
1
9,1
23,82
10,36
52,79
18
23,29
60,68
58,07
6,46
33,19
0 10 20 30 40 50 60 70
Emepa-01
Imperial
MD-2
Pérola
Smooth Cayenne
20-40% de
saturação
0-20% de
saturação
Extrato
bruto
Atividade específica (U/mg de proteína)
Figura 20: Atividade específica das frações concentradas com sulfato de amônia das
polpas dos cultivares analisados.
A determinação da atividade específica da bromelina nas frações das polpas
concentradas com sulfato de amônia revela que os cultivares Imperial, MD-2, Smooth
Cayenne e Emepa-01 obtiveram maior atividade na fração 20-40%, com atividades
respectivas de 60,69 U/ mg de proteínas, 58,07 U/ mg de proteínas, 33,19 U/ mg de
proteínas e 23,29 U/ mg de proteínas. A polpa do Pérola apresentou pico na fração de
0-20% com atividade de 52,79 U/ mg de proteínas. Valores elevados de atividade
específica da bromelina indicam alto grau de pureza da bromelina.
Nenhuma dessas amostras obteve atividade específica nas frações 40-60%, 60-
80% e 80-100%.
83
3,81
6,49
2,96
10,01
2,72
33,37
26,15
20,51
5,81
18,08
5,02
6,25
3
2,92
40,34
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Emepa-01
Imperial
MD-2
Pérola
Smooth Cayenne
20-40% de
saturação
0-20% de
saturação
Extrato
bruto
Atividade específica (U/mg de proteína)
Figura 21: Atividade específica das frações concentradas com sulfato de amônia das
cascas dos cultivares analisados.
Verifica-se a partir dos dados expostos na figura 22 que a casca do Smooth
Cayenne revela maior atividade específica da bromelina na fração 20-40% com
atividade de 40,34 U/ mg de proteínas, enquanto que as amostras de Imperial, MD-2 e
Emepa-01 mostram pico de atividade específica na fração 0-20% com atividade de
26,15 U/ mg de proteínas, 20,51 U/ mg de proteínas e 14,76 U/ mg de proteínas. A
casca do abacaxi Pérola não obteve atividade específica concentrada por este método.
Nenhuma das amostras apresentou atividade específica nas frações 40-60%, 60-
80% e 80-100%.
Segundo Baldini et. al. (1993), amostras de talo do abacaxizeiro Smooth
Cayenne precipitadas com etanol revelaram atividade específica que variou entre 2,63
e 0,07 U/ mg de proteína. Estes resultados são inferiores aos obtidos neste estudo para
a polpa e casca deste cultivar.
84
5.9.5 Fator de purificação (F.P)
A determinação do fator de purificação expressa a concentração da atividade
enzimática, portanto valores acima de 1, significam aumento na pureza da atividade da
bromelina.
Os valores de fator de purificação para as frações das polpas e cascas dos
cultivares de abacaxis analisados que apresentaram atividade proteolítica estão
expressos nas figuras 22 e 23 respectivamente e nos apêndices B, C, D, E, F, G, H, I, J
e L.
3,02
7,74
3,18
8,10
3,98
22,31
22,74
2,78
17,91
33,01
0
5
10
15
20
25
30
35
0-20% de saturação 20-40% de saturação
Emepa-01
Imperial
MD-2
Pérola
smooth Cayenne
Fator
de
purificação
Figura 22: Fator de purificação das frações das polpas que obtiveram atividade
específica.
A determinação do fator de purificação das frações das polpas com atividade
proteolítica revela que todas as amostras apresentam aumento de pureza da atividade
proteolítica (fator de purificação superior a 1), e que com exceção da polpa do abacaxi
Pérola, todas as polpas obtiveram maior FP na fração 20-40% de saturação. Dentre as
polpas o maior FP foi verificado para o Smooth Cayenne, 33,02 na fração 20-40%.
Para a polpa do cultivar Pérola obtivemos fator de purificação de 22,74, valor
superior ao citado por César (2005), que mostram que com 80% v/v de etanol precipita-
85
se praticamente toda bromelina presente em extrato bruto da polpa do cultivar Pérola, o
que leva a um aumento de pureza de até 5 vezes.
3,87
1,32
3,97
0,95
6,93
1,01
0,58
0,29
6,66
14,85
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0-20% de saturação 20-40% de saturação
Emepa-01
Imperial
MD-2
Pérola
smooth Cayenne
Fator de purificação
Figura 23: Fator de purificação das frações das cascas que obtiveram atividade
específica.
Os resultados expostos na figura 24 mostram que de todos os concentrados de
cascas analisados apenas na do Pérola não foi identificado aumento da pureza na
atividade específica da bromelina (fator de purificação inferior a 1).
Com exceção da casca do Smooth Cayenne que foi melhor concentrada na
fração 20-40% com fator de purificação de 14,85, todas as cascas apresentam maior
fator de purificação nas frações 0-20%.
Entre todas as amostras de polpa e casca submetidas à análise de atividade
específica nos concentrados com sulfato de amônio, destaca-se a polpa do cultivar
Smooth Cayenne, que fornece fator de purificação de 33,02.
A partir dos dados fornecidos por Baldini et. al. (1993), calculamos o fator de purificação
obtido para amostras de talos do abacaxizeiro Smooth Cayenne precipitados com
sulfato de amônio e verificamos que este fator variou entre 2,92 e 1,00.
86
6. CONCLUSÃO
Apesar da superioridade das polpas dos abacaxis tradicionalmente
comercializados sobre os híbridos produzidos na Paraíba no que se refere ao teor de
açúcares, as polpas dos híbridos apresentam maior relação de sólidos solúveis e
acidez titulável, além de um maior teor de bromelina. Este fato aliado à demanda de
novos mercados por abacaxis mais sadios, ressalta os híbridos produzidos na Paraíba
(Emepa-01, Imperial e MD-2) como fonte de investimento para os tradicionais
produtores de abacaxi do Estado.
Neste contexto o abacaxi Imperial estabelece-se como promissor cultivar,
confirmando a sua superioridade sobre os demais analisados, já que além de
apresentar polpa com a maior relação sólidos solúveis e acidez titulável, característica
que quando elevada interfere positivamente na aceitação pelo consumidor, fornece os
mais elevados teores de atividade específica da bromelina contribuindo para a
manutenção da saúde dos seres humanos.
As cascas configuram melhor fonte de bromelina que as polpas. Esta afirmação
ressalta a importância da utilização dos resíduos industriais do processamento do
abacaxi, que usualmente são descartados, para a obtenção da bromelina. Essa prática
representaria uma significativa redução na quantidade de lixo gerado pelas indústrias
de conservas e sucos de abacaxi, contribuindo para a adequada manutenção do meio
ambiente, além de outra fonte de receita para as indústrias que utilizam a bromelina
como matéria-prima.
Todos os híbridos paraibanos apresentaram polpas com maior atividade
específica nas frações concentradas com sulfato de amônio no intervalo de 20-40% de
saturação, enquanto suas cascas revelaram maior atividade específica nas frações 0-
20%.
O abacaxi Pérola apresentou polpa com maior atividade específica na fração 0-
20%, ao passo que a polpa do Smooth Cayenne demonstra maior atividade específica
na fração 20-40%. A atividade específica da casca do Pérola foi menos concentrada
nas frações que no extrato bruto e a casca do Smooth Cayenne tem este parâmetro
concentrado na fração 20-40%.
87
O abacaxi Smooth Cayenne apresentou os maiores índices de fator de
purificação tanto na polpa (33,02) quanto na casca (14,85), ambas na fração 20-40%.
88
7. REFERÊNCIAS
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94
APÊNDICE
APÊNDICE A - Método de Determinação de Atividade Proteolítica
A determinação da atividade proteolítica pode ser realizada conforme
modificações das metodologias propostas por Kunitz (1947) e Walter (1984), como está
descrito a seguir:
A. Reagentes
1. NaOH 1 M: Dissolver 4 g de NaOH em 100 mL de água (destilada ou
deionizada).
2. Tampão fosfato 1 M, pH 7,5, dissolver:
• 34 g de KH2PO4 em 250 mL de água.
• 43,5 g de K2HPO4 ou 57 g K3PO4. 3 H2O em 250 mL de água.
Juntar (b) com (a) e ajustar o pH para 7,5.
3. Ácido clorídrico, HCl 1 M: Adicionar 9,8 mL de HCl (a pelo menos 32%) em 72
mL de água.
4. Preparo do substrato tamponado.
• Solução tamponada de caseína (2% m/v; fosfato 0,1 M, pH 7,5):
• Suspender 2 g de caseína com cerca de 5 mL de água em um
frascovolumétrico, adicionar NaOH (1), cerca de 30 mL de água e mexer
bem comagitador magnético até que a caseína esteja completamente
dissolvida. Adicionar 5 mL de tampão fosfato (2) para clarear a solução.
Ajustar o pH 7,5 com HCl (3) e diluir para 100 mL com água. Solução
estável por 1 semana.
5. HCl 0,05 mol/L: Diluir 1 mL da solução (3) com 19 mL de água.
6. Solução estoque de tirosina ( 5 mmol/L): dissolver 45,3 mg de tirosina em 50
mL dasolução de HCl (5) - S0. Diluir para 3 (P0), 2 (P1), 1 (P2), 0,5 (P3) e 0,25
(P4) mM com a solução (5). Homogeneizar a solução antes de diluir.
7. Ácido tricloroacético (TCA) 0,3 mol/L: Dissolver 4,9 g de TCA em 100 mL de
água (ou diluir 30 mL de TCA 15% para 90 mL).
95
8. NaOH 0,5 mol/L: Diluir 50 mL da solução (1) em 50 mL de água.
B. Procedimento
1. Pipetar em tubos de centrífuga separados: 2,5 mL de solução de substrato
(4.1) nos tubos T e B3, 2,5 mL de solução de HCl (5) em B1 e B2 e 2,5 mL de
cada solução padrão de tirosina (6) (Padrões - P0, P1, P2, P3, P4).
2. Deixar em banho por 3 a 5 minutos em temperatura de 37ºC.
3. Adicionar 0,2 mL da amostra (enzima) aos tubos T e B1, e 0,2 mL de HCl 0,05
M (5) aos demais.
4. Misturar e deixar incubando por 10 minutos a 37ºC.
5. Ao fim do tempo adicionar 5 mL de TCA (7a).
6. Misturar e adicionar 0,2 mL de amostra ao branco.
7. Deixar em repouso por 10 minutos a temperatura ambiente.
8. Remover o precipitado por filtração ou centrifugação por 20 minutos a 4000 g.
C. Medida da Atividade
Ler a variação de absorbância a 280 nm (no filtrado ou sobrenadante).
• Absorbância da amostra: AT
• Absorbância do branco B1: AB1
• Absorbância do branco B3: AB3
• Através de AT - AB1 - AB3, encontra-se, na curva de calibração, a
concentração de tirosina, Ctir, produzida pela ação da protease presente em 0,2
mL de amostra em 10 minutos a 37ºC.
O resultado final, em atividade enzimática, é dado por:
Atividade = 0,02 . Ctir (µmol/min)
96
D. Procedimento Esquemático
Tubo T (Teste):
1. 2,5 mL de caseína 2%; pH 7,5; Tampão fosfato 0,1 M.
2. Repouso 37ºC por 3 a 5 min
3. 0,2 mL de amostra
4. Misturar, deixar a 37ºC por 10 min
5. 5 mL de TCA
6. Repouso 10 min, temperatura ambiente
7. Centrifugar a temperatura ambiente, 4000 g, 20 min
8. Ler absorbância do sobrenadante em 280 nm.
Tubo B1 (Branco da amostra):
1. 2,5 mL de HCl 0,05 M
2. Repouso 37ºC por 3 a 5 min
3. 0,2 mL de amostra
4. Misturar, deixar a 37ºC por 10 min
5. 5 mL de TCA
6. Repouso 10 min, temperatura ambiente
7. Centrifugar a temperatura ambiente, 4000 g, 20 min
8. Ler absorbância do sobrenadante em 280 nm.
Tubo B2 (Branco do aparelho):
1. 2,5 mL de HCl 0,05 M
2. Repouso 37ºC por 3 a 5 min
3. 0,2 mL de HCl 0,05 M (em substituição à amostra)
97
4. Misturar, deixar a 37ºC por 10 min
5. 5 mL de TCA
6. Repouso 10 min, temperatura ambiente
7. Centrifugar a temperatura ambiente, 4000 g, 20 min
8. Ler absorbância do sobrenadante em 280 nm
Tubo B3 (Branco do substrato):
1. 2,5 mL de caseína 2%; pH 7,5; Tampão fosfato 0,1 M.
2. Repouso 37ºC por 3 a 5 min
3. 0,2 mL de HCl 0,05 M (em substituição à amostra)
4. Misturar, deixar a 37ºC por 10 min
5. 5 mL de TCA
6. Repouso 10 min, temperatura ambiente
7. Centrifugar a temperatura ambiente, 4000 g, 20 min
8. Ler absorbância do sobrenadante em 280 nm
E. Preparo dos Padrões de Tirosina
Solução Estoque (S
0
): 5 mM
P
0
: 3 mL S
0
+ 2 mL de água = 3 mM de tirosina
P
1
: 2 mL S
0
+ 3 mL de água = 2 mM de tirosina
P
2
: 1 mL S
0
+ 4 mL de água = 1 mM de tirosina
P
3
: 2,5 mL P
2
+ 2,5 mL de água = 0,5 mM de tirosina
P
4
: 2,5 mL P
3
+ 2,5 mL de água = 0,25 mM de tirosina
Tubo P0:
1. 2,5 mL de tirosina 3 mM
98
2. Repouso 37ºC por 3 a 5 min
3. 0,2 mL HCl 0,05 M
4. Misturar, deixar a 37ºC por 10 min
5. 5 mL de TCA
6. Repouso 10 min, temperatura ambiente
7. Centrifugar a temperatura ambiente, 4000 g, 20 min
8. Ler a absorbância do sobrenadante em 280 nm.
Tubo P1:
1. 2,5 mL de tirosina 2 mM
2. Repouso 37ºC por 3 a 5 min
3. 0,2 mL HCl 0,05 M
4. Misturar, deixar a 37ºC por 10 min
5. 5 mL de TCA
6. Repouso 10 min, temperatura ambiente
7. Centrifugar a temperatura ambiente, 4000 g, 20 min
8. Ler a absorbância do sobrenadante em 280 nm.
Tubo P2:
1. 2,5 mL de tirosina 1 mM
2. Repouso 37ºC por 3 a 5 min
3. 0,2 mL HCl 0,05 M
4. Misturar, deixar a 37ºC por 10 min
5. 5 mL de TCA
6. Repouso 10 min, temperatura ambiente
7. Centrifugar a temperatura ambiente, 4000 g, 20 min
8. Ler a absorbância do sobrenadante em 280 nm.
99
Tubo P3:
1. 2,5 mL de tirosina 0,5 mM
2. Repouso 37ºC por 3 a 5 min
3. 0,2 mL HCl 0,05 M
4. Misturar, deixar a 37ºC por 10 min
5. 5 mL de TCA
6. Repouso 10 min, temperatura ambiente
7. Centrifugar a temperatura ambiente, 4000 g, 20 min
8. Ler a absorbância do sobrenadante em 280 nm.
Tubo P4:
1. 2,5 mL de tirosina 0,25 mM
2. Repouso 37ºC por 3 a 5 min
3. 0,2 mL HCl 0,05 M
4. Misturar, deixar a 37ºC por 10 min
5. 5 mL de TCA
6. Repouso 10 min, temperatura ambiente
7. Centrifugar a temperatura ambiente, 4000 g, 20 min
8. Ler a absorbância do sobrenadante em 280 nm.
F. Atividade das Proteases Neutras
• Absorbância da amostra T: AT
• Absorbância do branco B
1
: AB
1
• Absorbância do branco B
3
: AB
3
• Através de AT - AB1 - AB3, encontra-se na curva de calibração, a concentração
de tirosina, Ctir, produzida pela ação da protease presente em 0,2 mL de
amostra em 10 min a 37ºC.
100
APÊNDICE B- Tabela de purificação da bromelina da polpa do cultivar Emepa-01.
Amostras mL
*
Atividade
proteolític
a (U/ml)
U/totais
Proteínas
(mg/mL)
Proteínas
(mg) totais
Atividade
específica
(U/ mg de
proteína)
AP (%) RT (%) FP
Extrato
bruto (E.B)
150,00
12,93 1939,50 4,00 600,00 3,01 - - -
Frações
0-20% 15,00 28,90 433,50 3,18 47,70 9,09 22,35%
7,95% 3,02
20-40% 15,00 38,90 583,50 1,67 25,05 23,29 30,08%
4,17% 7,74
40-60% 15,00 0 0 0,39 5,85 0 0 0,01% 0
60-80% 12,00 0 0 0 0 0 0 0
80-100% 11,00 0 0 0 0 0 0 0
Total 52,43%
12,13%
*mL usados para adicionar Sulfato de amônia.
Para a obtenção do extrato bruto foram utilizadas 100,00g de amostra.
101
APÊNDICE C- Tabela de purificação da bromelina da casca do cultivar Emepa-01.
Amostras mL
*
Atividade
proteolítica
(U/ml)
U/totais
Proteínas
(mg/mL)
Proteinas
(mg) totais
Atividade
específica
(U/ mg de
proteína)
AP (%) RT (%) FP
Extrato
bruto (E.B)
120 22,95 2754,00 6,19
742,80
3,81 - - -
Frações
0-20% 13,00 78,10 1015,30 5,29 68,77 14,76 36,86%
9,26% 3,87
20-40% 10,00 12,39 123,909 2,47 24,70 5,02 4,50% 3,33% 1,31
40-60% 13,00 0 0 1,49 19,37 0 0 2,61% 0
60-80% 13,00 0 0 0 0 0 0 0 0
80-100% 13,00 0 0 0 0 0 0 0 0
Total 41,36%
15,21%
*mL usados para adicionar Sulfato de amônia
Para a obtenção do extrato bruto foram utilizadas 100,00g de amostra.
102
APÊNDICE D- Tabela de purificação da bromelina da polpa do cultivar Imperial.
Amostras mL
*
Atividade
proteolític
a (U/ml)
U/totais
Proteínas
(mg/mL)
Proteínas
(mg) totais
Atividade
específica
(U/ mg de
proteína)
AP(%) RT (%) FP
Extrato
bruto (E.B)
100 56,44 5644,00 7,53 753,00 7,49 - - -
Frações
0-20% 15,00
39,31 589,65 1,65 24,75 23,82 10,44%
3,28% 3,18
20-40% 12,00
109,24 1310,88 1,80 21,60 60,69 23,23%
2,86% 8,10
40-60% 12,00
0 0 0,17 2,04 0 0 0,27% 0
60-80% 12,00
0 0 0 0 0 0 0 0
80-100% 12,00
0 0 0 0 0 0 0
Total 33,67%
6,41%
*mL usados para adicionar Sulfato de amônia.
Para a obtenção do extrato bruto foram utilizadas 117,60g de amostra.
103
APÊNDICE E - Tabela de purificação da bromelina da casca do cultivar Imperial.
Amostras mL
*
Atividade
proteolítica
(U/ml)
U/totais
Proteínas
(mg/mL)
Proteinas
(mg) totais
Atividade
específica
(U/ mg de
proteína)
AP (%) PT (%) FP
Extrato
bruto (E.B)
76 68,56 5210,56 10,36 787,36 6,59 - - -
Frações
0-20% 12,00
90,75 1089,00 3,47 41,64 26,15 20,89%
5,29% 3,97
20-40% 11,00
6,63 72,93 1,06 11,66 6,25 0,02% 1,48% 0,95
40-60% 10,00
0 0 0,38 3,80 0 0 0,48% 0
60-80% 10,00
0 0 0 0 0 0 0 0
80-100% 10,00
0 0 0 0 0 0 0 0
Total 20,91%
7,25%
*mL usados para adicionar Sulfato de amônia.
Para a obtenção do extrato bruto foram utilizadas 96,30g de amostra.
104
APÊNDICE F - Tabela de purificação da bromelina da polpa do cultivar MD-2.
Amostras mL
*
Atividade
proteolítica
(U/ml)
U/totais
Proteínas
(mg/mL)
Proteínas
(mg) totais
Atividade
específica
(U/ mg de
proteína)
AP (%) PT (%) FP
Extrato
bruto (E.B)
100 17,09 1709,00 6,53 653,00 2,60 - - -
Frações
0-20% 10,00
29,32 293,20 2,83 28,30 10,36 17,16%
4,33% 3,98
20-40% 10,00
123,12 1231,20 2,12 21,20 58,07 72,04%
3,25%
22,3
1
40-60% 10,00
0 0 0,44 4,40 0 0 0,67% 0
60-80% 10,00
0 0 0 0 0 0 0 0
80-100% 10,00
0 0 0 0 0 0 0 0
Total 89,20%
8,25%
*mL usados para adicionar Sulfato de amônia.
Para a obtenção do extrato bruto foram utilizadas 102,30g de amostra.
105
APÊNDICE G - Tabela de purificação da bromelina da casca do cultivar MD-2.
Amostras mL
*
Atividade
proteolítica
(U/ml)
U/totais
Proteínas
(mg/mL)
Proteínas
(mg) totais
Atividade
específica
(U/ mg de
proteína)
AP (%) PT (%) FP
Extrato
bruto (E.B)
75 26,66 1999,50 9,03 677,25 2,96 - - -
Frações
0-20% 10,00 76,90 769,00 3,75 37,50 20,51 38,46%
5,57% 6,92
20-40% 13,00 6,09 79,17 2,03 26,39 3,00 0,04% 3,89% 1,01
40-60% 10,00 0 0 0,70 7,00 0 0 1,03% 0
60-80% 10,00 0 0 0 0 0 0 0 0
80-100% 10,00 0 0 0 0 0 0 0 0
Total 38,50%
10,49%
*mL usados para adicionar Sulfato de amônia.
Para a obtenção do extrato bruto foram utilizadas 96,00g de amostra.
106
APÊNDICE H - Tabela de purificação da bromelina da polpa do cultivar Pérola.
Amostras mL
*
Atividade
proteolític
a (U/ml)
U/totais
Proteínas
(mg/mL)
Proteínas
(mg) totais
Atividade
específica
(U/ mg de
proteína)
AP (%) PT (%) FP
Extrato
bruto (E.B)
100 9,48 948,00 3,79 379,00 2,32 - - -
Frações
0-20% 15,00
46,07 691,05 5,72 85,80 52,79 72,89% 22,63%
22,74
20-40% 11,00
9,89 108,79 2,35 25,85 6,46 11,47% 6,82% 2,78
40-60% 10,00
0 0 0,30 3,00 0 0 0,79% 0
60-80% 10,00
0 0 0 0 0 0 0 0
80-100% 10,00
0 0 0 0 0 0 0 0
Total 84,36% 30,24%
*mL usados para adicionar Sulfato de amônia.
Para a obtenção do extrato bruto foram utilizadas 104,34g de amostra.
107
APÊNDICE I - Tabela de purificação da bromelina da casca do cultivar Pérola.
Amostras mL
*
Atividade
proteolític
a (U/ml)
U/totais
Proteínas
(mg/mL de
E.B)
Proteínas
(mg) totais
Atividade
específica
(U/ mg de
proteína)
AP (%) PT (%) FP
Extrato
bruto (E.B)
100,00
61,83 6183,00 6,96 696,00 10,01 - - -
Frações
0-20% 15,00 27,81 417,15 4,79 71,85 5,81 6,75% 10,32% 0,58
20-40% 13,00 9,82 127,66 3,36 43,68 2,92 2,06% 6,27% 0,29
40-60% 12,00 0 0 1,31 15,72 0 0 2,26% 0
60-80% 10,00 0 0 0 0 0 0 0 0
80-100% 10,00 0 0 0 0 0 0 0 0
Total 8,81% 18,85%
*mL usados para adicionar Sulfato de amônia.
Para a obtenção do extrato bruto foram utilizadas 100,00g de amostra.
108
APÊNDICE J - Tabela de purificação da bromelina da polpa do cultivar Smooth Cayenne.
Amostras mL
*
Atividade
proteolític
a (U/ml)
U/totais
Proteínas
(mg/mL)
Proteínas
(mg) totais
Atividade
específica
(U/ mg de
proteína)
AP (%) PT (%) FP
Extrato
bruto (E.B)
150,00
5,54 831,00 5,62 843,00 1,00 - - -
Frações
0-20% 10,00 38,35 383,50 2,13 21,30 18,00 46,15% 2,53% 17,91
20-40% 10,00 38,83 388,30 1,17 11,70 33,18 46,72% 1,39% 33,02
40-60% 10,00 0 0 0,44 4,40 0 0 0,52% 0
60-80% 10,00 0 0 0 0 0 0 0 0
80-100% 10,00 0 0 0 0 0 0 0 0
Total 92,87% 4,44%
*mL usados para adicionar Sulfato de amônia.
Para a obtenção do extrato bruto foram utilizadas 107,20g de amostra.
109
APÊNDICE L - Tabela de purificação da bromelina da casca do cultivar Smooth Cayenne.
Amostras mL
*
Atividade
proteolític
a (U/ml)
U/totais
Proteínas
(mg/mL)
Proteínas
(mg) totais
Atividade
específica
(U/ mg de
proteína)
AP (%) PT (%) FP
Extrato
bruto (E.B)
86,00
23,04 1981,44 8,48 729,28 2,72 - - -
Frações
0-20% 15,00
42,32 634,80 2,34 35,10 18,08 32,04% 4,81% 6,66
20-40% 15,00
58,90 883,50 1,46 21,90 40,34 44,59% 3,00% 14,85
40-60% 15,00
0 0 0,43 6,45 0 0 0,88% 0
60-80% 10,00
0 0 0 0 0 0 0 0
80-100% 10,00
0 0 0 0 0 0 0 0
Total 76,63% 8,69%
*mL usados para adicionar Sulfato de amônia.
Para a obtenção do extrato bruto foram utilizadas 100,50g de amostra.
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