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LIDIANA LOVATO
ESTUDOS MORFOLÓGICOS E ANÁLISES DE SEQÜÊNCIAS DO GENE
MITOCONDRIAL CITOCROMO OXIDASE I (COI) EM POPULAÇÕES DE Atta
cephalotes (L., 1758)
Curitiba
2006
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LIDIANA LOVATO
ESTUDOS MORFOLÓGICOS E ANÁLISES DE SEQÜÊNCIAS DO GENE
MITOCONDRIAL CITOCROMO OXIDASE I (COI) EM POPULAÇÕES DE Atta
cephalotes (L., 1758)
Curitiba
2006
Tese apresentada à Coordenação do
Curso de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas, Área de concentração em
Entomologia, da Universidade Federal do
Paraná, como requisito parcial para a
obtenção do Título de Mestre em Ciências
Biológicas.
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ii
LIDIANA LOVATO
“ESTUDOS MORFOLÓGICOS E ANÁLISES DE SEQÜÊNCIAS DO GENE
MITOCONDRIAL CITOCROMO OXIDASE I (COI) EM POPULAÇÕES DE Atta
cephalotes (L., 1758)”
Dissertação aprovada como requisito parcial para a obtenção do grau de “Mestre em
Ciências Biológicas”, no Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, Área
de Concentração em Entomologia, da Universidade Federal do Paraná, pela
comissão formada pelos professores:
Dr. Luiz Gonzaga Esteves Vieira (Orientador)
IAPAR – Londrina PR
Dr. Alfredo Otávio Rodrigues de Carvalho
IAPAR – Londrina PR
Profa. Dra. Danúncia Urban
UFPR
Curitiba, 10 de fevereiro de 2006.
iii
Aos meus avós Bento
(in memoriam) e Palmira
por serem eles os maiores
culpados por eu ser hoje,
quem sou.
DEDICO
Aos meus pais Irineu e
Lidia por todo o amor, carinho,
compreensão e oportunidades
que me proporcionaram.
OFEREÇO
iv
AGRADECIMENTOS
Ao Cara lá de cima por estar presente em todos os momentos.
Ao Dr. Luiz Gonzaga Esteves Vieira (Santista) pela orientação e presença
constante no desenvolvimento deste trabalho, período em que pude reconhecer sua
competência e dedicação profissional bem como o respeito dedicado à sua equipe e
orientados.
À Universidade Federal do Paraná - UFPR e Instituto Agronômico do
Paraná – IAPAR pela oportunidade de realização deste curso.
Aos Docentes do Departamento de Entomologia e Zoologia pelos
conhecimentos repassados e contribuição para minha formação.
Aos colaboradores Dr. Jacques Hubert Charles Delabie, Dra. Rosaly Ale-
Rocha, Dra. Joana D’Arc Ribeiro, Dra. Suzana Ketelhut, Dr. John Lattke, Dr. Klaus
Jaffé, Dr. Manoel Solis, Dr. Jean Maes, Ms. Adriana Mendonça e respectivas
instituições pelo apoio prestado na obtenção dos espécimes que possibilitaram a
realização deste trabalho.
Aos pesquisadores Dr. Carlos R. Brandão do Museu de Zoologia da USP
e Dr. Antonio José Mayhé-Nunes do Departamento de Biologia Animal da UFRRJ,
pelo auxílio durante a visita e consultas a estas instituições.
Ao professor Dr. Amarildo Pasini e a Universidade Estadual de Londrina –
UEL pelos ensinamentos passados durante a realização da disciplina Prática de
Docência Zoologia/ Entomologia I.
Ao Dr. Alfredo O. R. de Carvalho por sua colaboração para com este
trabalho.
À professora Danúncia Urban por todo carinho, amizade e dedicação
durante todas as fases de desenvolvimento deste trabalho.
v
Ao colega Dalton R. dos Santos, um excelente profissional, por toda a
ajuda e dedicação.
Aos colegas Dr. Marcelo Lopes da Silva e Dra. Regina Célia Zonta de
Carvalho por toda a sua dedicação durante a primeira fase de desenvolvimento
deste trabalho.
Ao Dr. Celso Luiz Hohmann pela amizade e interesse para com o
desenvolvimento deste trabalho.
Aos atuais e antigos amigos do Laboratório de Biotecnologia, Lucélia,
Sandra, Eliane, Cherri, Marília, Tiago Benedito, Thiago Falda, Jane, Ilara, Iris,
Mônika, Bete, Diogo, Alessandra, Nelson, Lucia, Juliana e Humberto pela
convivência, companheirismo, boas risadas e apoio, durante o período que
convivemos. Especialmente ao Hugo por toda a paciência e ensinamentos durante
os primeiros dias de trabalho no laboratório.
Ao mais que amigo Dr. Laurival Antônio Vilas-Boas (Lori), por ter caído
como um anjo na realização deste trabalho, pelos ensinamentos, paciência e
principalmente compreensão nos momentos de maior dificuldade.
Aos Amigos que fiz no mestrado Ozana, Joaquim, Juliana, Eduardo e
Stela pela convivência e amizade que tornou a distância de casa menor e me fez
sentir saudades de Curitiba.
À minha família por compreender os momentos de ausência e apoiar
minhas escolhas.
E a pessoa que indiscutivelmente viveu cada momento deste trabalho
comigo, esteve presente nas ocasiões de alegrias, angustias e ansiedade. Foi
companheiro dando apoio e alento em todos os momentos, apoio sem o qual não
acredito ter sido capaz de percorrer esta jornada. Will, muito obrigada!
A todos que direta e indiretamente colaboraram para o desenvolvimento
deste trabalho... OBRIGADA!!!!!!!!!
vi
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ..............................................................................................vii
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................. viii
RESUMO ................................................................................................................ x
ABSTRACT ..............................................................................................................xi
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 1
1.1 IMPORTÂNMCIA DO GÊNERO ......................................................................... 1
1.2 POSIÇÃO TAXONÔMICA .................................................................................. 2
1.3 SAÚVAS E BIODIVERSIDADE .......................................................................... 5
1.4 DNA MITOCONDRIAL ....................................................................................... 8
2 OBJETIVOS ........................................................................................................ 11
3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 12
3.1 OBTENÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DOS ESPÉCIMES ....................................... 12
3.2 ESTUDOS MOLECULARES ............................................................................ 13
3.2.1 Extração de DNA ........................................................................................... 13
3.2.2 Reação de PCR ............................................................................................ 14
3.3 MORFOLOGIA ................................................................................................. 14
3.3.1 Escolha dos Espécimes, Confecção das Pranchas e Microscopia ............... 14
3.4 ANÁLISE DOS DADOS .................................................................................... 15
4 RESULTADOS .................................................................................................... 16
4.1 ESTUDOS MOLECULARES ............................................................................ 16
4.2 MORFOLOGIA ................................................................................................. 21
5 DISCUSSÕES ..................................................................................................... 28
6 CONCLUSÕES ................................................................................................... 32
REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 33
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – ESPÉCIES UTILIZADAS, LOCAL DE COLETA DOS ESPÉCIMES,
NÚMERO DE POPULAÇÕES E COLABORADORES ..........................12
TABELA 2 – POSIÇÕES VARIÁVEIS (ARRANJADAS VERTICALMENTE) DE
SEQÜÊNCIAS DE COI DE Atta cephalotes, ORIUNDAS DOS ESTADOS
DA BAHIA, DE ALAGOAS , DO AMAZONAS; DA NICARÁGUA, DA
COLÔMBIA E DA VENEZUELA ............................................................18
TABELA 3 – DISTÂNCIA DE NUCLEOTÍDEOS (%) ESTIMADA EM 500 PARES DE
BASES (pb) PARA SEQÜÊNCIAS DE COI DE INDIVÍDUOS DE Atta
cephalotes E Atta sexdens sexdens (outgroup). DISTÂNCIA
CALCULADA DENTRO E ENTRE OS GRUPOS POR 2P ....................21
viii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – GENOMA MITOCONDRIAL COM APROXIMADAMENTE 17 Kb. SETA
INDICA POSIÇÃO DE GENE MITOCONDRIAL CITOCOROMO
OXIDASE I (COI). (Barcodes of life <http://www.barcodinglife.org>) .......9
FIGURA 2 – LOCAL DE COLETA DE Atta cephalotes e Atta sexdens sexdens ....13
FIGURA 3 – RELAÇÕES FILOGENÉTICAS INFERIDAS POR “NEIGHBOR-
JOINING” UTILIZANDO 500 PARES DE BASE (pb). VALORES DE
“BOOTSTRAP”, BASEADO EM 1000 REPLICAÇÕES, MAIORES QUE
50%, SÃO APRESENTADOS NOS RAMOS DAS ÁRVORES; NÚMEROS
ENTRE PARÊNTESES REPRESENTAM SEQÜÊNCIAS DE Atta
cephalotes e Atta sexdens sexdens ......................................................20
FIGURA 4 – VISTA LATERAL DE Atta cephalotes (exemplar de Manaus-AM).
PILOSIDADE DE MESOSOMA E GÁSTER FOI OMITIDA. cab =
CABEÇA; ant = ESCAPO DA ANTENA; c1, c2 e c3 = Coxa 1, 2 E 3; emt
= ESPINHO METAPLEURAL; eocp = ESPINHO OCCIPITAL; et =
ESTERNO; ems = ESPINHO MESOSOMAL; f = FRONTE; mes =
MESOSOMA; o = OLHO; ocp = OCCIPÍCIO; p = PECÍOLO; tr = TERGO;
ga = GÁSTER; epr = ESPINHO PRONOTAL; v = VÉRTICE. TODAS AS
BARRAS, DOS DESENHOS, CORRESPONDEM A 2MM ....................24
FIGURA 5 – VISTA SUPERIOR DA CABEÇA DE OPERÁRIA MÁXIMA DE Atta
cephalotes. A, CLADO 1; B, CLADO 2. ocp = OCCIPÍCIO; v = VÉRTICE.
BARRA = 0,025 MM ..............................................................................25
FIGURA 6 – VISTA LATERAL DA CABEÇA DE OPERÁRIA MÁXIMA DE Atta
cephalotes. A e B, CLADO 1; C e D, CLADO 2. cf = CARENA FRONTAL;
eocp = ESPINHO OCCIPITAL; f = FRONTE; mocp = MARGEM
OCCIPITAL; sop = SULCO OCCIPITAL; v = VÉRITICE ......................26
FIGRUA 7 – VISTA FRONTAL, POR MICROSCOPIA, DA CABEÇADE OPERÁRIA
MÁXIMA DE Atta cephalotes. A, CLADO 1; B, CLADO 2. cf = CARENA
FRONTAL; f = FRONTE; mocp = MARGEM OCCIPITAL; socp = SULCO
OCCIPITAL; v = VÉRTICE ....................................................................27
FIGRUA 8 – VISTA LATERAL DE MESOSOMA DE OPERÁRIA MÁXIMA DE Atta
cephalotes. A e B, CLADO 1; C e D, CLADO 2. ems = ESPINHO
MESONOTAL; emt = ESPINHO METAPLEURAL; epr = ESPINHO
ix
PRONOTAL ...........................................................................................28
x
RESUMO
ESTUDOS MORFOLÓGICOS E ANÁLISES DE SEQÜÊNCIAS DO GENE
MITOCONDRIAL CITOCROMO OXIDASE I (COI) EM POPULAÇÕES DE Atta
cephalotes (L., 1758)
Atta cephalotes é uma espécie de formiga cortadeira considerada florestal, sendo a
mais exigente quanto à umidade de solo entre as Atta. Nas América Central e do
Sul, é responsável por danos agrícolas devido ao hábito de cortar, principalmente,
dicotiledôneas. Com a fragmentação da Mata Atlântica e a degradação da área de
ocorrência, vem sofrendo redução em suas populações, sobretudo no nordeste
brasileiro. Neste trabalho, foram examinadas seqüências de DNA do gene
mitocondrial citocromo oxidase I (COI) de diversas populações de A. cephalotes com
o objetivo de examinar as relações filogenéticas entre populações coletadas em
duas áreas de distribuição desta espécie. Também foram investigadas variações
morfológicas em operárias maiores (soldados). A análise de um segmento de 500 pb
do gene COI sugere a existência de subestruturação genética entre as populações
da espécie nominal, dividindo o grupo em dois clados. Estes clados são totalmente
isolados geograficamente, sendo o primeiro ocorrendo na América Central e do Sul e
o outro no nordeste do Brasil. Além disso, as diferenças morfológicas encontradas
sustentam a formação dos clados e sugerem a necessidade de revisão taxonômica
desta espécie.
Palavras-chave: formiga cortadeira, COI, DNAmt, morfologia, taxonomia
xi
ABSTRACT
MORPHOLOGICAL STUDIES AND ANALYSIS OF THE MITOCHONDRIAL GENE
CYTOCHROME OXIDASE I (COI) IN POPULATIONS OF Atta cephalotes (L.,
1758)
Atta cephalotes is a forestry leaf-cutting ant and is the most demanding in relation to
soil moisture among Atta species. In Central and South America, it is considered an
agricultural pest due to cutting damage in dicotyledonous crops. With the
fragmentation of the Brazilian Atlantic forest and the degradation of its habitat, this
species is suffering a population decline, mainly in the Brazilian northeast. In this
work, DNA sequences of the mtDNA cytochrome oxidase I (COI) were examined of
several populations of A. cephalotes with the objective of examining the phylogenetic
relationship among populations collected in two distribution areas of this species.
Morphological variations were also investigated in larger workers (soldiers). The
analysis of a 500 pb segment of the gene COI suggests the existence of a genetic
substructure of the nominal species, dividing the populations in two clades. These
clades are totally geographically isolated, the first occurring in Central and South
America and the other in northeastern Brazil. Also, morphological differences found
in the studied specimens support the formation of the two clades and indicate the
need for taxonomical revision in this species.
Key words: leaf-cutting ant, COI, mtDNA, morphology, taxonomy.
INTRODUÇÃO
1.1 Importância do Gênero
As formigas (Hymenoptera, Formicidae) mantêm seu sucesso ecológico
há mais de 50 milhões de anos segundo Hölldobler e Wilson (1990). Esse sucesso
parece decorrer especialmente do fato de terem sido o primeiro grupo predador
social explorando o solo e a vegetação.
O comportamento eussocial das formigas, aliado ao pequeno tamanho de
suas forrageiras, lhes permite penetrar em locais de difícil acesso a outros insetos
sociais, tais como vespas e abelhas, e obter alimentos. Extremamente importante ao
sucesso das formigas é o refinamento de suas especializações, de tal forma que
grupos de indivíduos executam todos a mesma tarefa. Por exemplo, um primeiro
grupo busca alimento, enquanto um segundo recebe este alimento e transfere para
as larvas.
As formigas cortadeiras (Tribo Attini) fornecem vantagens singulares para
investigar algumas questões biológicas, populacionais e evolutivas. A colônia pode
ser considerada como um superorganismo, onde os indivíduos ocupam os lugares
de células. Assim, pode-se estudar, através da divisão de tarefas e da existência de
castas morfológicas, comportamentais e fisiológicas, quais os processos envolvidos
nessa diferenciação, e de que modo, a combinação da divisão de trabalho e das
castas favorece um maior sucesso (Sudd e Franks, 1987; Hölldobler e Wilson,
1990).
As formigas cultivadoras de fungos (Formicidae, Myrmicinae, Attini)
ocorrem exclusivamente no Novo Mundo, indicando que sua origem, e subseqüente
radiação por toda a região neotropical, ocorreu depois da separação da América do
Sul da África (Weber, 1972). As espécies estão distribuídas desde os Estados
Unidos da América (latitude 40º N) até a Argentina (latitude 44º S) (Weber, 1970;
Farji-Brener e Ruggiero, 1994). Na América do Sul não estão presentes nas regiões
transandinas (Weber, 1972; Farji-Brener e Ruggiero, 1994), e na América Central
não ocorrem em algumas ilhas das Antilhas (Mariconi, 1970; Weber, 1972; Della
Lucia, 1993).
2
A tribo Attini atualmente é composta por 13 gêneros e 216 espécies
nominais descritas (Brown, 2000; Brandão e Mayhé-Nunes, 2001). Schultz e Méier
(1995) salientam que alguns gêneros necessitam de revisão taxonômica devido à
existência de muitas espécies. No Brasil, são encontradas 10 espécies e três
subespécies do gênero Atta (Mariconi, 1970; Della Lucia, 1993), com distribuição
geográfica registrada para todo o território nacional.
O gênero Atta Fabricius, 1804 (Hymenoptera: Formicidae; Myrmicinae;
Attini) compreende as formigas cultivadoras de fungos conhecidas popularmente
como saúvas. São consideradas pragas da agricultura brasileira e de outros países
da América do Sul e Central por possuírem o hábito de cortar e transportar
fragmentos de diversos vegetais causando danos em plantas cultivadas, gramíneas
forrageiras e essências florestais (Abreu, 1986; Anjos et al., 1993). No entanto,
desempenham um importante papel ecológico; devido à biomassa das colônias e à
quantidade de terra removida, as saúvas são, geralmente, os organismos
dominantes na maioria dos ecossistemas neotropicais sendo responsáveis pela
maior parte do fluxo de energia e nutrientes nestes ecossistemas, somente
tornando-se pragas com a introdução da agricultura. As saúvas também são muito
importantes na incorporação de matéria orgânica no solo, sendo consideradas
importante agente deste fenômeno (Fowler, 1991).
1.2 Posição Taxonômica
O Brasil possui o maior número de espécies do gênero Atta e a Amazônia
é considerada o centro de dispersão destas espécies (Borgmeier, 1950). Apesar
disso, há no país uma escassez de especialistas e de trabalhos taxonômicos
(Carvalho, 2000) com este gênero. O número de trabalhos sobre ecologia, biologia,
comportamento e controle é muito maior em relação ao número de trabalhos na área
taxonômica. Isso se dá devido às dificuldades na identificação dos espécimes, pois
isto se baseia em alguns caracteres diagnósticos de operárias - fêmeas
degeneradas - que são polimórficas e de tamanho muito variável (Borgmeier, 1959).
Apesar das grandes revisões do gênero terem sido feitas com base em
características de genitálias de machos, indivíduos sexuados não costumam ser
3
empregados em trabalhos de taxonomia devido à dificuldade de obtê-los e relacioná-
los aos seus operários, além de não haver muito destes indivíduos conservados em
museus (Gonçalves, 1942).
Levando em consideração a gravidade dos problemas causados pelas
saúvas, torna-se muito importante uma correta identificação. Além das dificuldades
já citadas para taxonomia do gênero, durante um longo período, para sua
classificação foi utilizado um sistema pentanominal onde eram determinados o
gênero, subgênero, espécie, subespécie e variedade/ forma. Isso colaborou para
que diversas espécies sofressem várias alterações em sua classificação, o que,
conseqüentemente, gerou constantes alterações nas coleções de referência e
confusões no reconhecimento das espécies.
Dentre as espécies de saúva, Atta cephalotes (L. 1758), que inicialmente
foi descrita como Formica cephalotes L., 1758 e, posteriormente, transferida para o
gênero Atta Fabricius, em 1804, foi uma das espécies que mais sofreu alterações
em sua classificação. Esta espécie é considerada florestal e, entre as cortadeiras, a
mais exigente quanto à umidade de solo (Weber, 1937). Esta espécie se caracteriza
por possuir tufos de pêlos frontais, na cabeça da operária máxima, abundantemente
pilosos; espinhos occipitais geralmente bem definidos, tuberculiformes ou
pontiagudos; espinhos mesonotais anteriores tuberculiformes ou cônicos e
alongados; parte superior da cabeça muito brilhante, com pontuação microscópica
pouco visível ou esparsa; espinhos epinotais cônicos, aguçados, pouco mais longos
que os mesonotais anteriores, pouco divergentes e voltados para trás quase na
mesma direção do plano superior do epinoto; cor parda clara ou escura, a cabeça
geralmente pouco mais escura que o resto do corpo (Gonçalves, 1942).
Na primeira grande revisão do gênero Borgmeier (1939) listou 26
espécies, subespécies e variedades. Entre, as espécies, em A. cephalotes, foram
reconhecidas três subespécies: A. cephalotes integrior Forel, 1904, A. cephalotes
opaca Forel, 1904 e A. cephalotes erecta Santschi, 1929. Gonçalves (1942) através
da observação de genitálias masculinas dividiu Atta em três subgêneros: Archeata,
Neoatta e Atta, e em sua listagem dos taxons reconheceu seis subespécies: A.
cephalotes integrior, A. cephalotes opaca, A. cephalotes polita Emery, 1905, A.
cephalotes erecta, A. cephalotes isthmicola Weber, 1941 e A. cephalotes
oaxaquensis Gonçalves, 1942.
4
Após minuciosa comparação da genitália das espécies e subespécies,
Borgmeier (1950) descreveu mais dois subgêneros, Paleatta e Neoatta, dividindo o
gênero em cinco subgêneros. Nessa classificação foram nomeadas cinco
subespécies: A. cephalotes integrior, A. cephalotes opaca, A. cephalotes erecta, A.
cephalotes isthmicola e A. cephalotes oaxaquensis.
Em uma nova revisão, Borgmeier (1959) manteve apenas quatro
subgêneros e apresentou A. cephalotes integrior, A. cephalotes opaca, A.
cephalotes polita, A. cephalotes erecta, A. cephalotes isthmicola e A. cephalotes
oaxaquensis. Após todas as classificações propostas, A. cephalotes passou a ser
considerada espécie sem denominação subespecífica (Mariconi, 1970; Della Lucia,
1993).
Pela revisão da literatura taxonômica de Atta observa-se que a espécie
sofreu alterações ao nível de subespécie devido às variações morfológicas
reconhecidas pêlos taxonomistas, o que demonstra uma enorme falta de consenso.
A espécie A. cephalotes está presente no México, América Central e
América do Sul ocorrendo nas Guianas, Suriname, Venezuela, Colômbia, Equador,
Peru, Bolívia e Brasil. No Brasil, nos estados do Amazonas, de Roraima, de
Rondônia, do Pará, do Amapá, do Maranhão, de Pernambuco, da Bahia, do Acre, do
Mato Grosso (Della Lucia, 1993), de Sergipe (Delabie, 1997) e de Alagoas (Corrêa et
al., 2005).
Gonçalves (1951, 1960 e 1967) afirma que a ocorrência da espécie no sul
do estado da Bahia constitui um interessante problema zoogeográfico, por ser a
saúva mais exigente de umidade no solo, não podendo viver nos cerrados do centro
do Brasil e nem nas caatingas do nordeste. Carvalho (2000) através da utilização da
técnica de RAPD – PCR conseguiu determinar marcadores moleculares que podem
colaborar para uma correta identificação das diferentes espécies do gênero Atta. Ao
comparar populações de A. cephalotes oriundas de Caracas-Venezuela e Ilhéus -
Bahia o autor encontrou diferenças no padrão de bandas na digestão da região ITS
entre os espécimes estudados. Estas observações, associadas às afirmações de
Gonçalves (1967), sugerem um possível isolamento geográfico das populações de
A. cephalotes da Bahia.
5
1.3. Saúvas e Biodiversidade
A Mata Atlântica é uma das florestas tropicais mais ameaçadas do mundo,
sendo o ecossistema brasileiro que mais sofreu com os impactos ambientais dos
ciclos econômicos da história do país. Um dos motivos para preservar o que restou
dessa floresta é a rica biodiversidade, incluindo espécies vegetais e animais, para
sua conservação e manejo (World Wildlife Fund – WWF, 2001). Para se ter uma
idéia da situação de risco em que a Mata Atlântica se encontra, basta saber que há
época do descobrimento do Brasil ela possuía área equivalente a um terço da
Amazônia, ocupando uma área de 1.300.000 Km
2
, estendendo-se do Rio Grande do
Norte ao Rio Grande do Sul. Atualmente, está reduzida a apenas 5% de sua área
original, ou seja, 65.000 Km
2
(Ramos, 2001; Silva, 2001; World Wildlife Fund - WWF,
2001).
A expansão do uso da terra, que acompanha o crescimento da população
humana, resulta na fragmentação dos habitats naturais com a formação de
fragmentos florestais de diferentes tamanhos e formas. Essas alterações podem
segundo Bierrgaard et al., (1992), resultar no isolamento de populações e até
extinção de espécies, reduzindo a biodiversidade local em função, principalmente,
da perda de habitats e de maior incidência de raios solares entre os fragmentos
(Wilcox e Murphy, 1985).
Nas florestas tropicais, a maioria das espécies é muito suscetível a
processos de extinção, uma vez que essas espécies ocorrem em densidades
populacionais muito baixas e participam de interações ecológicas às vezes muito
estreitas e complexas com outras espécies, com as plantas floríferas e seus
polinizadores, os predadores e suas presas. Assim, a extinção de uma espécie, que
mantém relações de dependência com outras, pode promover o desaparecimento de
várias outras com as quais ela interage (Myers, 1987).
Na maioria dos casos relatados de fragmentação de florestas tropicais,
houve perda de espécies por meio da destruição do habitat natural, redução do
tamanho da população, inibição ou redução da migração, efeito de borda alterando o
microclima, eliminação de espécies dependentes de outras já extintas e imigração
de espécies exóticas para as áreas desmatadas circundantes e, posteriormente,
para o fragmento. Espécies raras e com pequena área de distribuição, assim como
6
aqueles que necessitam de habitats muito amplos ou especializados, parecem mais
suscetíveis aos efeitos da fragmentação (Turner, 1996).
Os insetos são adequados para uso em estudos de avaliação de impacto
ambiental de efeitos de fragmentação florestal, pois, além de ser o grupo de animais
mais numeroso do globo terrestre, com elevadas densidades populacionais,
apresentam grande diversidade, em termos de espécies e de habitats, grande
variedade de habilidades para dispersão, seleção de hospedeiros e de respostas à
qualidade e quantidade de recursos disponíveis, além de sua dinâmica populacional
ser altamente influenciada pela heterogeneidade dentro de um mesmo habitat.
Também são importantes pêlo seu papel no funcionamento dos ecossistemas
naturais, atuando como predadores, parasitóides, fitófagos, saprófagos,
polinizadores entre outros (Ehrlich et al., 1980; Boer, 1981; Rosenberg et al., 1986;
Souza e Brown, 1994; Schoereder, 1997).
De acordo com Brandão (1999), as formigas estão entre os organismos
mais conspícuos dos ecossistemas brasileiros. Além de sua abundância local
relativamente alta, são especialmente ricas em espécies e diversificadas quanto aos
hábitos de forrageamento, nidificação etc. As formigas são insetos utilizados como
bioindicadores ecológicos por diversos atributos: dominância no ecossistema, ampla
distribuição geográfica, abundância local elevada, riqueza de espécies local e global
altas, muitos táxons especializados, facilmente amostradas e separadas em
morfoespécies e sensíveis às mudanças ambientais (Majer, 1983).
Corrêa et al. (2005) ao relatarem a ocorrência de A. cephalotes no estado
de Alagoas verificaram, mais uma vez, o quanto esta espécie é sensível à ação
antrópica e, que ainda existe um leque de informações básicas a serem conhecidas
a respeito de Atta. Concordando com Mariconi (1970) e Kempf (1972), Corrêa et al.
(2005) relata a distribuição disjunta desta espécie na região amazônica e nordeste
do Brasil. Ao avaliarem 42 remanescentes de floresta Atlântica verificaram a
presença de A. cephalotes em apenas sete, estes considerados áreas prioritárias
para conservação da Mata Atlântica (Ministério do Meio Ambiente - MMA, 2002),
mostrou claramente uma forte relação da espécie com áreas florestais bem
conservadas.
O fato de o nordeste do país ser caracterizado por altos níveis de
fragmentação de florestas (Ranta et al., 1998) leva a acreditar que esta espécie está
sujeita a um drástico declínio populacional nas florestas úmidas da região. Além
7
disso, outra espécie A.sexdens, de conduta de forrageamento mais generalista, vem
repetidamente substituindo A. cephalotes em fragmentos secundários da Floresta
Atlântica no nordeste. Uma tendência semelhante a essa pode ser observada na
restinga onde Atta robusta Borgmeier, 1939 está sendo substituída por Atta sexdens
rubropilosa Forel, 1908 (Fowler, 1995; Fowler et al., 1996). Isso demonstra que A.
cephalotes é uma espécie de formiga cortadeira sensível à fragmentação (Corrêa et
al, 2005).
8
1.4 DNA mitocondrial
Informações moleculares são fontes de caracteres e muitas vezes
permitem a resolução de relações filogenéticas em situações em que a morfologia
não pode resolver. De acordo com Avise (1997) é comum estudos de DNA
mitocondrial (DNAmt) revelarem variações entre populações de diferentes áreas
geográficas.
Desde a década de 1970 a análise do DNAmt tem se estabelecido como
uma poderosa ferramenta para estudos evolutivos em animais (Moritz et al., 1987).
O genoma mitocondrial dos animais é, na grande maioria dos casos, constituído por
uma molécula de DNA circular pequena, com conteúdo gênico conservado (apenas
37 genes) e estrutura gênica simples (não possui DNA repetitivo, transposons, intros
ou pseudogenes) (Moritz et al., 1987). Essa extrema economia de conteúdo da
maioria dos genomas mitocondriais animais é atribuída a uma intensa seleção a
favor de um genoma pequeno (Moritz et al., 1987).
Por outro lado, essa molécula apresenta uma alta taxa de evolução por
mutação (Brown, 1985), cerca de cinco a 10 vezes mais rápida do que a taxa de
mutação de um gene nuclear de cópia única (Moritz et al., 1987; Harrison, 1989).
Estima-se que em primatas, a evolução do DNAmt seja até dez vezes maior do que
a evolução de um gene nuclear de cópia única (Brown et al., 1979; Moritz et al.,
1987). No entanto, genes nucleares, envolvidos na biogênese mitocondrial, evoluem
mais rapidamente que os demais, possuindo a mesma taxa de evolução do DNAmt
(Pietromnaco et al., 1986; Moritz et al., 1987). Ainda, alguns organismos possuem a
taxa de evolução do genoma mitocondrial igual a de um gene nuclear de cópia
única, como por exemplo, em Drosophila (Powell et al., 1986).
O DNAmt (Figura 1) possui genes codificadores para duas subunidades
ribossômicas (12S e 16S), 22 RNAt, três subunidades da enzima citocromo c
oxidase (COI, COII e COIII), citocromo B (cytB), subunidades 6 e 8 de ATP F0
sintase (ATP6 e ATP8) e sete subunidades da NADH desidrogenase (ND1-ND6 e
ND4L). Além de todos esses genes, há uma região rica em A+T (em vertebrados, é
chamada D-loop), não-codificadora e que parece conter o controle da replicação e
transcrição de DNAmt (Wolstenholme, 1992). O tamanho dessa região exibe grande
variação entre os organismos, ao contrário dos genes, que se apresentam similares
9
em tamanho em uma ampla gama de espécies, entre invertebrados e vertebrados
sendo detectado por vezes polimorfismo de tamanho a nível interespecífico (Brown,
1983; Moritz et al., 1987).
Figura 1 - Genoma mitocondrial com aproximadamente 17 Kb. Seta indica posição
do gene da citocromo oxidase subunidade I (COI). (Barcodes of Life
<http://www.barcodinglife.org/>).
Devido ao fato do DNAmt ser de herança materna, estudar a diferenciação
dessa molécula equivale a estudar a população de fêmeas. Isso, combinado com o
fato do DNAmt ser haplóide, faz com que o tamanho efetivo da população estudada
seja quatro vezes menor do que quando se utiliza um marcador molecular diplóide
(Haavie et al., 2000).
A combinação dessas características faz com que o DNAmt seja
amplamente utilizado em estudos de caracterização de populações, subespécies e
espécies, além de estudos de caráter evolutivo e filogenético (Harrison, 1989).
O gene mitocondrial da enzima citocromo oxidase subunidade I (COI)
(Figura 1) vem sendo usado com bastante freqüência em estudos das relações
filogenéticas por apresentar regiões variáveis suficientes para análises de grupos
taxonomicamente relacionados (Sahls e Nyblom, 2000) e devido à disponibilidade de
““primer”s" para amplificar genes inteiros para diferentes grupos de insetos (Simon,
et al., 1994). Desta forma, seqüências de COI têm sido empregadas em muitos
10
trabalhos de relações filogenéticas em insetos (Dobler e Muller, 2000; Sahls e
Nyblom, 2000, Scarpassa et al., 2000).
Caterino et al., (2000) em sua revisão sobre a sistemática molecular de
insetos relatou vários trabalhos relacionados ao uso dos genes COI e COII e em
relação à sistemática molecular de formigas (Ayala et al., 1996; Wetterer et al., 1998;
Chiotis et al., 2000). Entretanto, esta técnica tem sido pouco aplicada para elucidar
problemas taxonômicos para os gêneros Atta e Acromyrmex.
11
2 OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram: 1. elucidar a possibilidade da existência
de espécies diferentes entre as populações de A. cephalotes oriundas da região
amazônica, América Central e nordeste do país através de estudos morfológicos e
moleculares; 2. caracterizar as populações de A. cephalotes utilizando
características morfológicas e moleculares; 3. observar o compartilhamento de
caracteres morfológicos e moleculares entre e dentro das populações.
12
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Obtenção e Identificação dos Espécimes
As amostras de Atta cephalotes e Atta sexdens sexdens foram obtidas
com o auxílio de colaboradores nos locais de ocorrência da espécie (Tabela 1 e
Figura 2).
Os espécimes coletados foram armazenados em álcool 70% em
temperatura ambiente até o recebimento no laboratório, onde foram armazenados
em freezer a -20º C para melhor conservação.
A identificação dos espécimes, utilizados operárias maiores (soldados),
neste estudo, foi realizada através de chaves dicotômicas e o auxílio de
pesquisadores que trabalham com Formicidae. Populações de Atta sexdens sexdens
foram incluídas nas análises como “outgroups” para verificar a relação
interespecífica dentro de A. cephalotes e comparar os níveis de divergência
genética.
Tabela 1 – Espécies de Atta utilizadas, local de coleta dos espécimes, número de
populações e colaboradores.
Espécie Localidade UF
País Nº. de pop.
Colaboradores
Barra do
Rocha
BA
Brasil 5 J. Delabie
Ilhéus BA
Brasil 4 J. Delabie
Águas de
Olivença
BA
Brasil 1 J. Delabie
Maceió AL
Brasil 1 A. Mendonça
Manaus AM
Brasil 2 J.D. Ribeiro
Caracas - Venezuela 1 ?
Aragua - Nicarágua 1 ?
A. cephalotes
Restrepo - Colômbia 1 ?
Barra do
Rocha
BA
Brasil 1 J. Delabie
Campinhos BA
Brasil 1 J. Delabie
Manaus AM
Brasil 1 R. Ale-Rocha
A. s. sexdens
Bananeiras PB
Brasil 1 J. Delabie
13
Figura 2 - Locais de coleta dos espécimes de A. cephalotes e A. s. sexdens.
3.2 Estudos Moleculares
3.2.1 Extração de DNA
A extração de DNA total foi realizada individualmente a partir da cabeça e
pernas dos espécimes conservados em álcool 70% e freezer -20º C, de acordo com
a disponibilidade de material, através do protocolo de Carvalho e Vieira (2001).
*
*
*
*
*
*
*
14
3.2.2 Reação de PCR (Reação de Polimerase em Cadeia)
As reações de PCR foram conduzidas em tubos de microcentrífuga de 0,6
ml em um volume total de 20 µL, contendo em cada, tampão 10x, MgCl
2
(13,3 mM),
dNTPs (0,13 mM), 0,5 µM de cada “primer”, 50ng de DNA total, 5 U de Taq
polimerase e água. As amplificações foram realizadas em termociclador PTC-100
TM
(MJ Research, Inc.) de acordo com Hebert et al., (2003). Foram utilizados os
“primers” 1 (5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’) e 2 (5’-
TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’) conforme sugerido por Folmer et al.
(1994). Os produtos das reações foram visualizados em gel de agarose 1%, corados
em brometo de etídio (0,05%). Amplificações controle (componentes da reação
excluindo DNA) foram montadas para cada grupo de extração, para verificar
possíveis contaminações de DNA. O produto de PCR foi purificado com o Dispositivo
de Ultrafiltração Microcon-P (Millipore) de acordo com instruções do fabricante e
utilizado nas reações de seqüenciamento, utilizando os mesmos “primers”.
Para as reações de seqüenciamento foi utilizado o kit DYEnamic ET Dye
Terminator (Amershan Biosciences). As amostras foram preparadas num volume
total de 10µL, contendo: 100 ng de DNA molde e 6 pmols dos “primers” 1 e 2’ e 4µL
do fluróforo. O programa utilizado para amplificação foi: 95ºC por 20s, 35 ciclos de:
55ºC - 15 s, 60ºC - 1 min e mantido a 4ºC após a reação. Os produtos das reações
de seqüenciamento foram concentrados e purificados usando a precipitação por
etanol. Após amplificação com os “primers” o gene COI foi seqüenciado em
equipamento MegaBace 1000 (Amersham Biosciences).
3.3 Morfologia
3.3.1 Escolha dos Espécimes, Confecção das Pranchas e Microscopia
Após o recebimento das amostras para a caracterização morfológica, dez
exemplares de cada uma das populações foram observados. Os indivíduos foram
15
montados em alfinetes entomológicos para a identificação e localização dos
caracteres que distinguissem corretamente as espécies e caracterizassem as
diferentes populações.
Após minuciosa observação dos espécimes, estes foram desenhados e
fotografados sob microscópio esteroscópico acoplado à câmara clara, da marca
Leica modelo MZ6
Posteriormente, para uma melhor visualização dos caracteres, observados
nos espécimes, foram feitas fotos em Microscopia de Baixo Vácuo no Centro de
Microscopia da Universidade Federal do Paraná - UFPR.
Os desenhos foram corrigidos e comparados uns com os outros, com a
microscopia e com os espécimes escolhidos, de cada população estudada. A
nomenclatura para descrição das estruturas foi baseada em Bolton (1994), Shattuck
(1999) e Borgmeier (1950).
Foram consultadas as coleções do Museu de Zoologia – USP, onde está
depositada a coleção do frei Kempf, que inclui a do frei Thomas Borgmeier. As
amostras também foram comparadas com a Coleção Costa Lima do Museu da
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro –UFRRJ, onde está depositado o
material de Gonçalves (1942).
3.4 Análise de Dados
As seqüências obtidas foram alinhadas com o auxílio dos programas
BioEdit v. 7.0 (Hall, 1999) e Sequencher v. 4.5 (Genecodes, Inc, Ann Arbor, Michigan
USA) e ajustadas manualmente. A divergência das seqüências de nucleotídeos foi
calculada usando o modelo de Kimura-2-parâmetros (K2P) e a relação filogenética
entre os grupos analisada por “Neighbor-joining” (NJ), ambos utilizando o programa
Mega v. 3.0 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis; Kumar et al, 1993). A árvore
filogenética foi construída com o auxílio do programa Mega v. 3. A robustez dos
resultados foi estimada por ”bootrstrap” (BS) com 1000 replicações utilizando
suportes maiores que 50% (Hebert et al., 2003).
16
4 Resultados
4.1 Estudos Moleculares
A extração de DNA, tanto da cabeça quanto das pernas, produziu
quantidade suficiente de DNA de boa qualidade para a realização das análises. A
utilização de pernas possibilita a extração do material sem que ocorra a perda do
exemplar, como já vem sendo utilizado em estudos realizados com material
depositado de museu (Hebert et al., 2004; Simmons, 2004). Através da utilização
dos “primer” 1 e 2 eram esperadas bandas com 700 pares de base (pb) baseado em
seqüência de DNAmt de drosófila (Simmons, 2004). As amplificações controle, feitas
para cada grupo de extração, apresentaram-se negativas após visualizações dos
géis.
Foram analisadas 16 seqüências, de 500 pares de base (pb) de A.
cephalotes: Nicarágua (1), Venezuela (1), Colômbia (1) e Amazônia (2), Bahia (10) e
Alagoas (1). As seqüências apresentaram uma composição média de 31,4% de A e
T, que é típica de DNA mitocondrial de insetos e do gene COI em particular (Clary e
Wolstenholme, 1985). Após a tradução de cada seqüência foi verificada a não
existência de “stop codons”.
Foram encontrados nove haplótipos (I-IX) (Tabela 2). Dentre os nove
haplótipos observados, não houve haplótipo de ocorrência geral em todas as
localidades onde amostras foram coletadas. Quatro haplótipos foram encontrados
nas cinco populações obtidas da Nicarágua, Venezuela, Colômbia e Manaus,
respectivamente (haplótipos I, II, III, IV) (Tabela 2).
Dentre os indivíduos amostrados na Bahia e em Alagoas, dois haplótipos
foram exclusivos, cada um deles encontrado em apenas um espécime de A.
cephalotes, um do município Barra do Rocha (VIII) e o outro de Ilhéus (IX). Um outro
haplótipo foi formado por indivíduos coletados nos municípios de Ilhéus, Águas de
Olivença e Barra do Rocha (V). Três populações de A. cephalotes oriundas de
Ilhéus, Maceió e Barra do Rocha formaram um sexto haplótipo (VI). Indivíduos das
populações 9 e 10, ambas do município de Barra do Rocha apresentaram o
haplótipo (VII) (Tabela 2).
17
Tabela 2 - Posições variáveis (arranjadas verticalmente) de seqüências de COI de Atta cephalotes oriundas dos estados da Bahia, de
Alagoas, do Amazonas e da Nicarágua, da Colômbia e da Venezuela.
1
Números entre parênteses representam seqüências de A. cephalotes;
2
Pontos representam letras iguais;
3
Algarismos romanos representam haplótipos formados por seqüências de A. cephalotes.
- Representa “gaps” verdadeiros, o que diferencia o haplótipos VI do VII.
Posições variáveis
2
0 0 0 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4
0 4 6 0 9 1 1 2 3 4 6 6 6 7 8 1 3 4 4 5 8 0 0 1 5 6 8
Espécies
1
4 3 1 0 3 2 7 9 8 1 2 5 8 7 9 9 4 0 9 2 5 3 9 8 7 3 1
LOCALIDADES/
HAPLÓTIPOS
A. cephalotes - BA (1)
C
T T C T T G T T G T C T C G C G A G G G T T T T C A
Ilhéus/ V
A. cephalotes - BA (2) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . A. de Olivença/ V
A. cephalotes - BA (7) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ilhéus/ V
A. cephalotes - BA (8) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B. do Rocha/ V
A. cephalotes - AL . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A
. . . . . . . . Maceió/ VI
A. cephalotes - BA (4) . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A
. . . . . . . . Ilhéus/ VI
A. cephalotes - BA (6) . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A
. . . . . . . . B. do Rocha/ VI
A. cephalotes - BA (9) . . - . . . . . . . . . . . . . . .
A
. . . . . . . . B. do Rocha/ VII
A. cephalotes - BA (10) . . - . . . . . . . . . . . . . . .
A
. . . . . . . . B. do Rocha/ VII
A. cephalotes - BA (3) . . . . . . . . . . . . . . . .
A
.
A
. . . . . . . . B. do Rocha/ VIII
A. cephalotes - BA (5) .
C
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ilhéus/ IX
A. cephalotes - AM (1)
T A C T C C
.
C C T
. .
A
.
A T A
.
A A A C C
. . .
T
Manaus/ I
A. cephalotes - AM (2)
T A C T C C
.
C C T
. .
A
.
A T A
.
A A A C C
. . .
T
Manaus/ I
A. cephalotes - VE T A C T C
. .
C C T
. .
A
. .
T A G A . A C C
. . . . Caracas/ II
A. cephalotes - NI
T A
.
T C C A C
.
C C T A T A T A G A . A C C C C T T
Aragua/ III
A. cephalotes - CO
T A C T C C A C
.
T
. .
G
.
A T A
.
A A A C C
. . .
T
Restrepo/ IV
18
A análise da árvore filogenética indica que as populações da espécie A.
cephalotes, como atualmente designadas, formam nitidamente dois grupos
geneticamente distintos. Formigas provenientes do nordeste do Brasil (sul da Bahia e
Maceió-AL) formam um clado bem estruturado, enquanto que espécimes coletados na
Amazônia (AM), Colômbia (CO), Nicarágua (N) e Venezuela (VE) formam outro clado
(clados 2 e 1, respectivamente (Figura 2)). Clado 2, que contém os haplótipos
encontrados exclusivamente na região nordeste e apresenta forte suporte por bootstrap
(99%). Clado 1, que contém somente os haplótipos coletados na região amazônica e na
América Central também apresentaram grande suporte pêlo bootstrap (86%).
19
Figura 3 - Relações filogenéticas inferidas por Neighbor-joining utilizando 500 pares de
bases (pb) de COI. Valores de Bootstrap, baseados em 1000 replicações,
maiores que 50%, são apresentados nos ramos da árvore. Números entre
parênteses representam diferentes populações de A. cephalotes e A. s.
sexdens.
Clado 2
Clado 1
20
As seqüências depois de alinhadas foram analisadas através do modelo de
Kimura-2-Parâmetros (K2P), para que a divergência entre e dentro dos grupos fosse
determinada. Quando foram comparadas entre si, todas as populações de A. cephalotes
apresentaram uma divergência intraespecífica de 3,9% (dados não mostrados),
divergência esta considerada alta entre populações de uma mesma espécie (Simmons,
2004).
Os espécimes do clado 1 (populações coletadas na região amazônica e
Nicarágua) apresentaram uma divergência interna de 2,8%, valor semelhante ao
encontrado para A. s. sexdens e quase o dobro da encontrada entre as populações da
região nordeste que formam o clado 2 (Tabela 3). Quando as populações do clado 1 e
do clado 2 foram comparadas com o “outgroup” (A. s. sexdens) verificou-se que a
divergência entre elas foi semelhante (Tabela 3). Entre as populações de A. cephalotes
do clado 1 e do clado 2 foi encontrada uma divergência de 6,5%, a qual é superior a
duas vezes a divergência encontrada dentro de cada clado (Tabela 3).
Os valores da divergência entre as populações, que formam o clado 1,
ajudam a reforçar a hipótese da existência de espécies crípiticas dentro do que
atualmente é reconhecido como A. cephalotes (Tabela 3).
Tabela 3 - Distância de nucleotídeos (%) e erro padrão (EP) estimada em 500 pares de
bases (pb) para seqüências de COI de indivíduos de A. cephalotes e A. s.
sexdens (outgroup). Distância calculada dentro e entre os grupos por K2P.
Nucleotídeo K2P ± EP (média
entre grupos)
Nucleotídeo K2P ± EP (média
dentro dos grupos)
A. s. sexdens Clado 2
A. s. sexdens
(n=4)
2,6% ± 1,0% - -
Clado 2
(n=11)
1,5% ± 0,3% 18,4% ± 0,4% -
Clado 1
(n=5)
2,8% ± 0,4% 17,2% ± 0,4% 6,5% ± 0,04%
21
4.2 Morfologia
As observações dos caracteres morfológicos (Figura 4) nos espécimes
permitiram verificar que os indivíduos que compõem o clado 1 (populações da
Amazônia, Colômbia, Venezuela e Nicarágua) apresentam vértice e occipício opaco
recobertos por pontuações microscópicas muito próximas (Figura 5A). Diferentemente,
os indivíduos do clado 2 (populações do nordeste brasileiro) apresentam vértice e
occipício muito brilhantes com pontuações microscópicas extremamente esparsas
(Figura 5B). Os pêlos das populações do clado 1 se dispõem em forma de dois tufos
que recobrem a fronte e todo o vértice, deixando à mostra as margens dos lobos
cefálicos, e se estendendo à região atrás dos olhos (Figuras 6AB). Neste clado, os
pêlos dos indivíduos são longos, lanosos e embaraçados, são voltados para diversas
direções sem uniformidade de distribuição (Figura 7A).
As populações do clado 2 também possuem dois tufos de pêlos que não se
encontram, recobrem a fronte e metade do vértice, não alcançando a região dos olhos
(Figura 6CD). Os pêlos curtos, lanosos e pubescentes estão dispostos em tufos
voltados para o clípeo (Figura 7B). Comparativamente, o sulco occipital nos indivíduos
do clado 1 é aprofundado entre os lobos cefálicos (Figura 7A) enquanto, o clado 2
apresenta-o pouco profundo (Figura 7B). Ambos os clados apresentam carena frontal
com um processo espinhoso, porém no clado 1 o processo possui aproximadamente
metade do comprimento horizontal da carena e está voltado para a inserção da antena
(Figura 7A). Já no clado 2, este processo é pontiagudo e de tamanho semelhante ao
comprimento da carena (Figura 7B). Indivíduos de ambos os clados possuem um par de
espinhos occipitais, no clado 1 ele está posicionado acima da linha mediana da cabeça
na direção da ponta do espinho pronotal enquanto, que no clado 2 se localiza próximo à
inserção da cabeça, com mesosoma, e acompanha o contorno da mesma (Figuras
6BD).
Quando foram feitas as comparações entre os mesosomas de cada um dos
clados verificou-se que no clado 1 os espinhos pronotais são longos, pontiagudos e
voltados para a cabeça. Os espinhos mesonotais são mais curtos, aproximadamente
22
um quarto dos pronotais, também pontiagudos, porém voltados para o gáster. Os
espinhos metapleurais são longos, três quartos dos pronotais em comprimento,
pontiagudos e voltados para cima (Figuras 8AB).
Nos espécimes que compõem o clado 2 os espinhos pronotais são
pontiagudos, não alcançando a região média do occipício. Os mesonotais são em forma
de montículos voltados para cima, aproximadamente um terço dos pronotais, e os
espinho metapleurais são longos, pontiagudos e voltados para o gáster, ultrapassando
os pronotais (Figuras 8CD).
O número de dentes, mandibulares, das duas populações é bastante variável
assim como a presença e ausência e o número de ocelos, sendo que estes caracteres
não são discriminantes para diferenciação entre os espécimes dos clados 1 e 2.
23
Figura 4 - Vista lateral de A. cephalotes (Manaus – AM). Pilosidade do mesosoma e gáster foi omitida. cab = cabeça; ant
= antena; c1, c2 e c3 = coxa 1, 2 e 3; emt = espinho metapleural; eocp = espinho occipital; et = esterno; ems
= espinho mesonotal; f =fronte; mes = mesosoma; o = olho; ocp = occipício; p = pecíolo; tr = tergo; ga =
gáster; epr = espinho pronotal; v = vértice. Todas as barras, dos desenhos, correspondem a 2mm.
c1
c2
c3
et
tr
o
ant
mes
cab
p
epr
ga
ems
emt
eocp
ocp
v
f
24
Figura 5 – Vista superior da cabeça de operária máxima de Atta cephalotes. A, clado 1;
B, clado 2. ocp = occipício; v = vértice. Barra = 0,025 mm.
A
v
ocp
B
v
ocp
25
Figura 6 - Vista frontal e lateral da cabeça de operária máxima de A. cephalotes. A e B, clado 1; C e D, clado 2. cf:
carena frontal; eocp = espinho occipital; f = fronte; mocp: margem occipital; sop: sulco occipita; v = vértice.
sop
mo
c
p
v
f
cf
sop
cf
mocp
v
f
eocp
eocp
A
B
C
D
26
Figura 7 - Vista frontal, por microscopia, da cabeça de operária máxima de A.
cephalotes. A, clado 1; B, do clado 2. cf = carena frontal; f = fronte; mocp
= margem occipital; socp = sulco occipital; v = vértice.
socp
mocp
cf
v
f
A
cf
f
v
mocp
B
socp
27
Figura 8 - Vista lateral do mesosoma de operária máxima de A. cephalotes. A e B clado 1; C e D clado 2. ems = espinho
mesonotal; emt = espinho metapleural; epr = espinho pronotal
B
epr
emt
ems
B
epr
ems
emt
D
A
epr
ems
emt
epr
ems
emt
C
5 Discussão
DNA mitocondrial tem se mostrado bastante útil para estudar a variação
genética e os limites taxonômicos entre espécies e complexos de espécies (Landry
et al. 1999; Kruse e Sperling, 2001). Em particular, Hebert et al., (2003) propuseram
que um sistema de código de barras do DNA para o reino animal poderia se basear
na diversidade de uma parte da seqüência do gene da subunidade I da citocromo
oxidase (COI). Esta nova iniciativa é conhecida como “DNA Barcoding” (código de
barras do DNA). Um exemplo prático foi obtido analisando 650 pb do gene COI de
200 indivíduos de várias espécies Lepitodoptera. Os dados obtidos permitiram a
discriminação de espécies proximamente relacionadas, pertencentes a um grupo
considerado com modestas taxas de evolução molecular e alta diversidade (Hebert
et al., 2004).
As dificuldades de identificação das espécies de Atta, a utilização de um
sistema pentanominal de classificação deste gênero no passado (Borgmeier, 1950) e
a escassez de taxonomistas especializados neste gênero (Carvalho, 2000)
colaboraram para que diversas espécies sofressem várias alterações em sua
classificação, o que, conseqüentemente, gerou constantes alterações nas coleções
de referência e confusões no reconhecimento das espécies. Neste caso, a utilização
de seqüências do gene COI mostra enorme potencial para resolver o limite entre
espécies do gênero Atta.
A análise dos dados da seqüência do gene da citocromo oxidase I entre as
populações de A. cephalotes utilizadas neste estudo sugere a presença de dois
grupos evolucionários distintos. Espécimes de A. cephalotes coletados na região
nordeste brasileira formam um clado com forte suporte pêlo bootstrap (99%).
Também, os espécimes da região amazônica e Nicarágua constituem um outro
clado distinto (86%). Este último clado foi composto de quatro haplótipos que são
semelhantes entre si, porém bastantes distintos das populações do nordeste (Tabela
2, Figura 3). Apesar do pequeno número de populações que compõem este clado 2
(cinco), as análises das seqüências de COI destas populações indicam a
possibilidade da existência de espécies crípticas nas populações de A. cephalotes
oriundas da região amazônica e América Central.
29
A divergência encontrada nas seqüências de COI entre os clados 1 e 2 é
superior em quase três vezes a divergência observada dentro de cada clado,
superando a média (2%) sugerida para diferenciação de espécies neotropicais
(Hebert et al., 2004). Essas divergências são suficientes para a construção de
“primers“ diagnósticos para a distinção dos dois grupos, os quais poderão auxiliar
em estudos de estrutura de populações.
De acordo com Juan et al, 1995 e Funk, 1999 uma divergência de 2,3%
entre seqüência de mtDNA é alcançada a cada 1 milhão de anos em DNAmt de
insetos. Já Hebert et al. (2003), adotaram como padrão para a taxa de evolução
molecular do gene COI o valor de 3% para cada milhão de anos. Embora este valor
sofra as limitações comuns às estimativas baseadas em relógio molecular (Hillis et
al, 1996), o valor de divergência encontrado entre os dois clados de A. cephalotes
(6,5%) indica que o clado 1 divergiu do clado 2 há um período de tempo
considerável.
Apesar do claro padrão de divergência encontrado pela análise das
seqüências de COI, não é razoável considerar uma árvore baseada em um único
gene como evidência suficiente para acreditar na presença de uma espécie críptica
(Scheffer, 2000). É possível que a divergência molecular observada na seqüência do
gene da COI represente somente polimorfismo intraespecífico em A. cephalotes.
Entretanto, as características morfológicas analisadas neste trabalho suportam a
presença de espécie críptica dentro da espécie nominal.
Os indivíduos do clado 2 são muitos semelhantes aos exemplares de Atta
cephalotes integrior redescritos por Gonçalves em sua revisão de 1942, (Gonçalves,
1942) apresentando, assim como os exemplares utilizados por ele, “tufos de pêlos
frontais muito fracos, espinhos occipitais reduzidos a tubérculos inconspícuos;
espinhos mesonotais anteriores mais curtos que os epinotais”. Ainda que o
espécime tipo desta subespécie tenha sido descrito no Pará, o material que
Gonçalves observou era oriundo da Bahia. Indivíduos do clado 1 também
concordam com a descrição de A. cephalotes utilizados nas revisões por Gonçalves,
1942 e Borgmeier, 1950, porém não possuem o vértice e o occipício tão brilhantes
(Figura 6A).
Os dados de seqüências de COI e as comparações morfológicas obtidos
neste trabalho suportam a hipótese de Carvalho (2000) que observou diferenças
significativas entre populações de A. cephalotes ao examinar os padrões de bandas
30
obtidos pela restrição enzimática do DNA da região de ITS e pêlo exame de
caracteres morfológicos em espécimes oriundos da região amazônica e da Bahia.
Considerando que o nível de divergência da seqüência da citocromo oxidase I entre
os dois clados situa-se dentro da amplitude observada entre outras espécies de
insetos-pragas proximamente relacionadas (Scheffer, 2000), a facilidade de distinção
dos mesmos por características morfológicas e a diferença em distribuição
geográfica, os resultados obtidos indicam uma subestruturação genética dentro de
A. cephalotes.
Embora as diferenças morfológicas e moleculares encontradas possam
ser evidências de uma espécie não descrita dentro de Atta, um maior número de
exemplares é necessário para confirmar a consistência desses caracteres, tanto
para o clado 1 quanto para o 2. Assim, qualquer revisão da atual taxonomia ainda
seria prematura porque as observações foram feitas baseadas em número reduzido
de operárias máximas (soldados) de cada população estudada.
Devido à falta quase completa de informações sobre as populações da
maioria das espécies do gênero Atta, hipóteses sobre seu estado de conservação
são baseados quase inteiramente no tamanho de sua área de ocorrência e de uma
estimativa geral do estado da destruição do bioma das regiões envolvidas. Tais
decisões são baseadas também nas classificações taxonômicas existentes que
apresentam sérias lacunas, conforme já mencionado anteriormente.
Correa et al. (2005) mostrou claramente uma forte relação da ocorrência
de A. cephalotes na Bahia com áreas florestais bem conservadas, áreas estas
consideradas prioritárias para conservação da Mata Atlântica (MMA, 2002). O fato
do nordeste do país ser caracterizado por altos níveis de fragmentação de florestas
(Ranta et al., 1998) leva a acreditar que a A. cephalotes está sujeita a um drástico
declínio populacional nas florestas úmidas da região. Além disso, outra espécie - A.
sexdens, de conduta de forrageamento mais generalista, vem repetidamente
substituindo A. cephalotes em fragmentos secundários da Floresta Atlântica no
nordeste. Corrêa et al. (2005) ao relatar a ocorrência de A. cephalotes no estado de
Alagoas verificou o quanto esta espécie é sensível à ação antrópica. Também, ao
avaliar 42 remanescentes de floresta Atlântica estes autores verificaram a presença
de A. cephalotes em apenas sete dos remanescentes estudados. Portanto, a
indicação da possível existência de uma espécie críptica em Atta cephalotes serve
como alerta para a importância do estudo das populações do gênero Atta,
31
principalmente devido às escassas informações sobre distribuição geográfica e
abundância dessas populações.
Este estudo representa o ponto inicial para investigações de espécies
crípticas deste gênero amplamente distribuído por todo o território nacional.
Posteriormente, análises utilizando outros genes e maior número de indivíduos,
serão realizados para determinar complementarmente se os clados encontrados
neste estudo refletem polimorfismo intraespecífico ou divergência interespecífica,
como parece ser o caso.
Finalmente, os dados apresentados neste trabalho evidenciam que o
gênero Atta necessita de revisão urgente. Para isso, estudos baseados em
caracteres morfológicos e moleculares embasados em um maior número de
indivíduos de diferentes castas e em novos levantamentos nas áreas de ocorrência
seriam importantes. Também, há necessidade que as coleções de referência para
estudos com o gênero Atta sejam mais bem conservadas e que nestas sejam feitos
levantamentos para que, ao início de novos estudos, se possa saber o que existe de
material de apoio.
32
6 CONCLUSÕES
Análise de fragmento da seqüência do gene mitocondrial citocromo
oxidase I indica uma subestruturação genética dentro da espécie nominal Atta
cephalotes.
Variações morfológicas e moleculares sugerem a presença de dois grupos
evolucionários distintos em Atta cephalotes completamente isolados
geograficamente.
Estudos complementares devem ser feitos para melhor elucidar a
possibilidade de uma espécie nova dentro do gênero Atta.
33
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