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UNIVERSIDADE DE TAUBATÉ
Sandra Maria Carvalhal Berla
ATIVIDADE INIBITÓRIA IN VITRO DE
EXTRATOS DE Arrabidaea chica (Verlot.)
SOBRE Candida albicans
Taubaté - SP
2008
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UNIVERSIDADE DE TAUBATÉ
Sandra Maria Carvalhal Berla
ATIVIDADE INIBITÓRIA IN VITRO DE
EXTRATOS DE Arrabidaea chica (Verlot.)
SOBRE Candida albicans
Dissertação apresentada para obtenção do
Título de Mestre pelo Programa de Pós-
Graduação em Odontologia do Departamento
de Odontologia da Universidade de Taubaté.
Área de concentração: Biologia Odontológica
Orientadora: Profa. Dra. Silvana Soléo Ferreira
dos Santos
Taubaté - SP
2008
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Berla, Sandra Maria Carvalhal
Atividade inibitória in vitro de extratos de Arrabidaea chica (Verlot.)
sobre Candida albicans / Sandra Maria Carvalhal Berla.− 2008. 63f. :
il.
Dissertação (Mestrado) – Universidade de Taubaté, Departamento
de Odontologia.
Orientação: Profa. Dra. Silvana Soléo Ferreira dos Santos,
Departamento de Odontologia, 2008
1. Fitoterapia 2.Candida albicans 3. Arrabidaea chica (Verlot) 4.
Plantas medicinais −Dissertação.
I. Universidade de Taubaté. Departamento de Odontologia
II. Título.
SANDRA MARIA CARVALHAL BERLA
ATIVIDADE INIBITÓRIA IN VITRO DE EXTRATOS DE Arrabidaea chica (Verlot.)
SOBRE Candida albicans
Dissertação apresentada para obtenção do
Título de Mestre pelo Programa de Pós-
Graduação em Odontologia do Departamento
de Odontologia da Universidade de Taubaté.
Área de concentração: Biologia Odontológica.
Data: 22 de julho de 2008
Resultado:____________________
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Silvana Soléo Ferreira dos Santos da Universidade de Taubaté
Assinatura______________________________
Profa. Dra. Mariella Vieira Pereira Leão da Universidade de Taubaté
Assinatura______________________________
Profa. Dra. Juliana Campos Junqueira Universidade Julio Mesquita Filho
Assinatura______________________________
Dedico este trabalho a Deus, que sabe o que é útil para mim e
conhece minhas necessidades.
Às minhas filhas Daniela e Carolina, ao meu
neto Rafael, à minha irmã Sônia e ao meu
sobrinho Sergio Paulo, pelo incentivo e apoio
nesta jornada.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Profa. Dra. Silvana Soléo Ferreira dos Santos, pela dedicação
em me orientar na dissertação, mesmo à distância, dando apoio e incentivo
necessários para o término do trabalho.
Ao Prof. Ms. Ivan da Silva de Faria e à Profa. Ms. Jane Rose Dias Dionísio
Rodrigues, auxiliares docentes de Microbiologia da Universidade de Taubaté, pela
atenção e dedicação com que me auxiliaram na execução laboratorial deste
trabalho.
Às funcionárias do Laboratório de Microbiologia da Universidade de Taubaté,
Cristiane de Moura, Luiza Poulard Monteiro e Marisa Fátima dos Santos Silva, pela
importante ajuda e carinho.
Ao Prof. Ms. Lincoln M. Lourenço Cardoso, do Laboratório de Farmacognosia da
Faculdade de Pindamonhangaba, por ter submetido o extrato hidroalcoólico
percolado ao processo de rotaevaporação.
Ao Prof. Dr. Anselmo Henrique F. Hernandez, do laboratório de Fitoquímica da
Faculdade São Lucas (RO), pelo auxílio na execução da cromatografia de camada
delgada.
À farmacêutica Leila L. Lopes, às irmãs e funcionárias da Casa de Saúde Santa
Marcelina de Porto Velho (RO), que disponibilizaram seus espaços para coleta,
secagem e moagem do crajirú.
À amiga e Profa. Ms. Assessora Pedagógica da ULBRA - Centro Universitário
Luterano de Ji-Paraná, Alessandra C. S. M. Dias, pela ajuda, incentivo e
companheirismo neste trabalho e na vida acadêmica ao longo dos últimos anos.
Aos amigos e colegas que estiveram nesta caminhada comigo.
E, em especial, à Ms. Tânia Cristina Sumita, supervisora dos laboratórios de
Microbiologia, Imunologia, Parasitologia e Histologia, do Instituto Básico de
Biociências da Universidade de Taubaté, que não mediu esforços para me ajudar e
ainda me incentivou com palavras de ânimo.
Minhas imperfeições e fracassos são como uma bênção de
Deus, assim como meus sucessos e meus talentos, eu coloco
ambos a Seus pés.
Mahatma Gandhi
RESUMO
É grande o interesse em substâncias que apresentem ação inibitória sobre leveduras
do gênero Candida. Várias plantas utilizadas na medicina popular têm sido
estudadas, com esta finalidade. O presente trabalho teve por finalidade avaliar a
atividade inibitória in vitro de extratos de Arrabidaea chica (Verlot.), conhecida
popularmente por crajirú em Rondônia (Brasil), sobre Candida albicans. Foi avaliada
a concentração inibitória mínima (CIM) de extratos aquoso e hidroalcoólico,
autoclavados e filtrados, utilizando a técnica de diluição em ágar, sobre vinte e cinco
cepas de C. albicans. Os extratos brutos foram submetidos à Cromatografia de
Camada Delgada (CCD). O extrato hidroalcoólico apresentou sete componentes e o
aquoso autoclavado, dois. Tanto o extrato hidroalcoólico autoclavado quanto o
filtrado inibiram todas as cepas de C. albicans na concentração de 20%. O extrato
aquoso filtrado não apresentou efeito inibitório até a concentração de 50% e o
extrato autoclavado, na concentração de 30%, inibiu 84% das cepas testadas. Os
extratos, hidroalcoólico e aquoso, apresentaram atividade sobre C. albicans. O
extrato hidroalcoólico apresentou desempenho superior, em menor concentração e
maior número de componentes.
Palavras-chave: Fitoterapia. Candida albicans. Arrabidaea chica. Plantas medicinais.
ABSTRACT
There is a great interest in substances that have inhibitory action on yeasts of the genus
Candida. Several plants, used in popular medicine, have been studied for this purpose.
This aim of this work was to evaluate in vitro the inhibitory activity of Arrabidaea chica
(Verlot.) extracts, known in Rondônia (Brazil) as crajirú, against Candida albicans. The
minimum inhibitory concentration (MIC) of aqueous and hydroalcoholic extracts,
autoclaved and filtered was assessed, using the technique of agar dilution. Twenty-five
strains of C. albicans were studied. The crude extracts were submitted to a Fine
Chromatography Analysis (FCA). The hydroalcoholic extract presented seven compounds
and the aqueous autoclaved extract two. Hydroalcoholic extracts inhibited all strains of C.
albicans in the concentration of 20%. The aqueous filtered extract not showed inhibitory
effect until 50%. The aqueous autoclaved extract, in the concentration of 30%, inhibited
84% of the strains. Hydroalcoholic and aqueous extracts showed activity against C.
albicans. The hydroalcoholic extract presented superior performance in a lower
concentration and had a greater number of compounds.
Key-words: Fitoterapy. Candida albicans. Arrabidaea chica. Medicinal plants.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Arrabidaea chica (Verlot.), crajirú (comunidade Santa Marcelina,
rodovia BR 364 Km 17, zona rural de Porto Velho, Ro, BR)
18
Figura 2 - Folha verde de Arrabidaea chica (Verlot.) 33
Figura 3 - Folha seca de Arrabidaea chica (Verlot.) 33
Figura 4 - Fases da Cromatografia em Camada Delgada 36
Figura 5 - Preparo dos meios de cultura adicionados de extratos de
A.Chica (Verlot) em diversas concentrações
38
Figura 6 - Processo de filtração dos extratos
38
Figura 7 - A: suspensão de C. albicans transferida para um orifício do
replicador de Steers e B: semeadura
40
Figura 8 - A: controle positivo e B: controle negativo, após incubação
por 24 h/ 37 ºC.
41
Figura 9 - Gráfico da concentração inibitória mínima (CIM) para os
extratos hidroalcoólico e aquosos filtrados e autoclavados
43
Figura 10 - Cromatografia em Camada Delgada dos extratos
hidroalcoólico (A) e aquoso (B)
45
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Freqüência da concentração inibitória mínima (CIM) de Candida
albicans para o extrato hidroalcoólico esterilizado por filtração e
em autoclave 42
Tabela 2 - Freqüência da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Candida
albicans para o extrato aquoso autoclavado
43
Tabela 3 - Relação de retenção (Rf) para o extrato hidroalcoólico e aquoso
de Arrabidaea chica (Verlot.)
44
Tabela 4 - Coloração das manchas dos extratos hidroalcoólico e aquoso,
após cromatografia de camada delgada, observadas à luz
natural e depois de reveladas na câmara de iodo 45
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
13
2 REVISÃO DA LITERATURA
15
2.1 REGULAMENTAÇÕES DA FITOTERAPIA 15
2.2 USOS DA Arrabidaea chica (Verlot.) 17
2.2.1 Conhecimento popular
17
2.2.2 Dados científicos
17
2.3 Candida albicans 21
2.4 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE PLANTAS MEDICINAIS 26
3 PROPOSIÇÃO
31
4 MATERIAL E MÉTODO
32
4.1 COLETA, IDENTIFICAÇÃO E PREPARO DO MATERIAL VEGETAL 32
4.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DE Arrabidaea chica (Verlot.) 33
4.2.1 Extrato hidroalcoólico
33
4.2.2 Extrato aquoso
35
4.3 CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA 35
4.4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA 36
4.4.1 Preparo dos meios de cultura contendo extratos de
Arradibaea chica (Verlot.)
37
4.5 PREPARO DAS SUSPENSÕES DE Candida albicans
39
4.6 SEMEADURA, INCUBAÇÃO E LEITURA 40
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA 41
5 RESULTADOS
42
5.1 CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA 42
5.2 CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA 44
6 DISCUSSÃO
46
7 CONCLUSÕES
53
REFERÊNCIAS
54
13
1 INTRODUÇÃO
O Brasil possui uma das maiores biodiversidades do mundo. Entretanto, este
patrimônio genético e o seu potencial medicinal são pouco conhecidos. De acordo
com o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), em 2004, foram
identificadas, na Amazônia Legal, em torno de 650 espécies vegetais farmacológicas
de valor econômico. O estado do Pará foi o que mais se destacou, seguido dos
estados do Amazonas, Mato Grosso, Amapá, Rondônia, Acre, Roraima, Maranhão e
Tocantins (FEDERAÇÃO DAS INDÚSTRIAS DO ESTADO DO AMAZONAS, 2007).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) define fitoterápico como uma
substância ativa presente no extrato de uma planta como um todo ou em parte dela
e que apresente ação farmacológica. Os constituintes responsáveis pela atividade
farmacológica são, em geral, pouco conhecidos e acredita-se que a ação
farmacológica desses produtos envolva a interação de inúmeras moléculas
presentes no extrato (CALIXTO, 2001).
O conhecimento tradicional das populações locais é fundamental para o
reconhecimento do potencial da planta medicinal, pois por várias gerações, o
conhecimento sobre a aplicação e fórmula do fitoterápico foram preservados
regionalmente e aproveitados por estas populações. Paradoxalmente a esta
ideologia, o uso indevido de ervas pode acarretar sérios danos à saúde do
consumidor. Portanto, a necessidade de se conhecer o tipo e a maneira correta de
administrar os fitoterápicos adquire importância cada vez maior (BRASIL, 2006b).
A espécie Arrabidaea chica (Verlot), mais conhecida popularmente por
“crajirú”, é utilizada, em muitas comunidades, como único recurso terapêutico. É uma
planta largamente encontrada na região Norte do Brasil e comumente utilizada pela
14
população amazônica no sentido de fazer lavagens vaginais e banhos de assento,
para aliviar e até resolver problemas de infecção, queimadura e cicatrização de
feridas (PAES, 2004; RODRIGUES, 2006).
Candidose, doença causada por leveduras do gênero Candida, tem assumido
papel de destaque entre as entidades mórbidas que afetam a saúde e o bem estar
da população. Isto se deve a uma série de fatores intrínsecos como endocrinopatias,
desnutrição, senilidade, gravidez, nascimentos prematuros, câncer,
imunodeficiências e outros, ou extrínsecos como uso indiscriminado de antibióticos,
imunossupressores, ou ainda de fatores locais como umidade ou maceração
constante da pele e mucosa. Estes fatores provocam um aumento na incidência de
infecções por estas leveduras, principalmente Candida albicans (LACAZ et al.,
2004).
A candidose pode ser tratada por agentes antifúngicos específicos,
entretanto, o crescente surgimento de cepas resistentes coloca em risco a
eficácia terapêutica (ZARDO; MEZZARI, 2004).
Diante da prevalência desta patologia e da possibilidade de viabilizar
outras formas de tratamento, partindo de dados disponíveis na literatura sobre
Arrabidaea chica (Verlot.) e sua aplicação popular para tratamento de inflamação e
infecção bucal e ginecológica das mulheres amazônicas, este trabalho avaliou a
atividade antifúngica in vitro dos extratos dessa planta sobre Candida albicans e
quantificou por Cromatografia de Camada Delgada componentes químicos dos
extratos aquoso e hidroalcoólico.
15
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 REGULAMENTAÇÕES DA FITOTERAPIA
A utilização de plantas medicinais cujas propriedades terapêuticas tenham
sido cientificamente comprovadas é muito útil nos programas de atenção primária à
saúde (TOMAZZONI; NEGRELLE; CENTA, 2006).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que aproximadamente 65% a
80 % da população mundial utilizem práticas tradicionais baseadas principalmente
no uso de plantas medicinais e derivados. Contudo a OMS recomenda o
planejamento de estudos para avaliar a segurança e eficácia de produtos fiterápicos
a fim de promover o uso correto pela população (BRASIL, 2004; CALIXTO, 2000).
As Resoluções da Comissão Interministerial de Planejamento e Coordenação
– Ciplan – nº 4, 5, 6, 7 e 8, de 1988, fixaram normas e diretrizes para o atendimento
em homeopatia, acupuntura, termalismo social, técnicas alternativas de saúde
mental e fitoterapia (BRASIL, 1988).
O mercado de fitoterápico e fitocosmético vem movimentando bilhões de
dólares a cada ano. O Brasil contribui com cerca de 70% de toda a flora mundial e
não apresenta tradição científica no uso de medicamentos vegetais, sendo a
fitoterapia praticada principalmente por caboclos, curandeiros e xamãs. O lado
obscuro do interesse pela fitoterapia pelas multinacionais na Amazônia é a
"biopirataria". Para evitá-la, nas últimas décadas, observa-se uma movimentação
nacional no sentido da legalização e controle de fitoterápicos da flora nacional
(HOMMA, 2006).
16
A pesquisa na área de fitoterápicos vem recebendo atenção especial com a
aprovação do decreto de Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos
(PNPMF) nº 5.813, de 22 de junho de 2006 (BRASIL, 2006c), e com a Portaria nº
971, de 03 de maio de 2006, que aprova a Política Nacional de Práticas Integrativas
e Complementares (PNPIC). O objetivo desta Política Nacional é garantir à
população brasileira o acesso seguro e racional às plantas medicinais e fitoterápicos,
promovendo o uso sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia
produtiva e da indústria nacional (BRASIL, 2006a).
Silva, Silva e Matos (2007) mapearam as ocorrências naturais das espécies
de vegetais úteis na Amazônia. A investigação foi feita em nos herbários, internet e
bibliotecas, foram escolhidas 29 espécies e distribuídas em seis grupos: aromáticas,
florestais, frutíferes, medicinais, palmeiras e outros. No grupo das medicais foram
citadas, Arrabidaea chica (Humb. & Bonpl.) B. Verl (Crajiru), Croton cajucara Benth.
(Sacaca), Piper peltatum L. (Caapeba), Piper aduncum L. (Pimenta de Medicinais) e
Myrcia multiflora (Lam.)DC (Pedra Ume Caá). Houve ocorrência das espécies dos
diferentes grupos por todos os estados da Amazônia Legal, de modo geral, com
exceção do Tocantins. A maior ocorrência foi no estado do Amazonas e a maior
parte das informações foi obtida no herbário do INPA desse estado. Esses
resultados mostraram as lacunas e as necessidades de mais estudos relativos à
distribuição e utilização das espécies e outras fontes de dados complementares.
17
2.2 USOS DA Arrabidaea chica (Verlot)
2.2.1. Conhecimento popular
Das folhas do crajirú se extraí uma tinta nobre, um corante vermelho-tijolo ou
vermelho-ocre usado no tingimento de balaios artísticos de várias tribos da
Amazônia brasileira, venezuelana e colombiana (PAES, 2004; PAULETTI; BOLZANI;
YOUNG, 2003
; VEGA, 2001).
Algumas tribos preparam uma infusão das folhas, utilizada para tratamento de
conjuntivite aguda. Na forma de pastas (pomadas naturais) eles utilizam contra
ataque de insetos, enfermidades da pele como feridas e úlceras. Como infusão e
decocção são usadas para cólica intestinal, diarréia com sangue, piodermites,
inflamação de útero e ovário, e corrimento vaginal. Há ainda relatos de grande efeito
contra câncer de boca, útero, leucemia e como antiinflamatório (KALIL FILHO;
KALIL; LUZ, 2000; PAES, 2004; VEGA, 2001).
2.2.2 Dados científicos
A família Bignoniaceae é representada por aproximadamente oitocentas
espécies em cento e dez gêneros. São plantas lenhosas, mas também podem ser
arbustivas e arbóreas, distribuídas na América tropical e África. Entre os
representantes pode-se citar os ipês do Brasil (Tabebuia sp.) e Jacarandá
(Jacaranda sp.) (PAULETTI; BOLZANI; YOUNG, 2003).
A espécie Arrabidaea chica (Verlot.) pertence à família Bignoniaceae (Figura
1). É conhecida popularmente por vários nomes nas diversas etnias e tribos
18
indígenas: Carajirú, Cipó cruz (Brasil: Amazonas); Chica, Piranga, Bija, Caballito
(Colômbia); Curi, Curi-huasca, Cudio (Colômbia: Siona, Ingano, Huitoto); Nea-curi,
Ma-kuri, Koo-ri (Equador: Siona); Taii (Equador: Ashuar-Jívaro); Puca panga, Barqui
(Peru); Barqui (Venezuela) (VEGA, 2001).
Takemura et al. (1995), por cromatografia de coluna, isolaram do extrato
metanólico das folhas da Arrabidaea chica f. cuprea o composto 6,7,30,40-
tetrahidroxi-5-metoxi-flavilina , conhecido como carajuflavona.
Zorn et al. (2001) isolaram de extratos aquosos e hidroalcoólicos das folhas
de A. chica (Verlot) os dois compostos 3-desoxiantocianidinas: 6,7,30-trihidroxi-
5,40-dimetoxi-flavilina, 6,7,30,40-tetrahidroxi-5-metoxi-flavilina, e os compostos 6,7-
dihidroxi-5,40-dimethoxi-flavilina (carajurina) e 6,7,40-trihidroxi-5-metoxi-flavilina
(carajurona), que são os pigmentos flavonóides responsáveis pela propriedade
tintorial do extrato de A. chica.
Figura 1- Arrabidaea chica (Verlot.), crajirú (comunidade Santa Marcelina, rodovia BR 364
Km 17, zona rural de Porto Velho, Ro, BR)
Dos extratos aquoso e hidroalcoólico de A. chica (Verlot.) foram isoladas
substâncias como saponinas, flavonóides e taninos. O estudo da composição
19
mineral no extrato aquoso identificou a presença de cálcio (4,150 mg%), fósforo (30
ug%), manganês (0,26 ug%) e ferro (12,4 mg%). As altas concentrações de cálcio e
ferro, essenciais no processo de formação de novas células e co-fatores para a
maioria das reações enzimáticas, ligadas ao metabolismo interno do organismo,
encontradas no extrato aquoso, sugerem uma possibilidade do uso dessa planta
como anti-anêmico (ANDRADE, 1997; KALIL FILHO; KALIL; LUZ, 2000; PAES,
2004; SANTOS, 1997).
As características dos taninos hidrolisáveis e condensados estão ligadas à
capacidade de complexar macromoléculas de natureza proteica (enzimas digestivas,
proteínas fúngicas ou virais). Clinicamente o uso interno tem efeito antidiarréico e
uso externo tem ação cicatrizante, devido ao seu efeito de impermeabilizar as
camadas da pele. Possui efeito vasoconstritor sobre os capilares, limitando a perda
de fluidos em queimaduras, feridas e outras. Também mostram potencialidades de
bloquear os radicais livres e formação de íon superóxido, de forma similar aos
flavonóides (CUNHA; SILVA; ROQUE, 2003; SANTOS, 2003).
Os taninos também são indicados para problemas da boca e garganta, a
inibição enzimática da glucosiltransferase pode justificar esta utilização. Sua ação
antimicrobiana ocorre provavelmente por modificação do metabolismo microbiano
(ação sobre a membranas celulares das bactérias e de fungos) ou complexação
com os substratos de enzimas ou decréscimo de íons essenciais ao metabolismo
das bactérias e fungos, devido à complexação desses íons com os taninos (CUNHA,
2005).
A Fundação Centro de Análise, Pesquisa e Inovação Tecnológica (FUCAPI)
e o Instituto de Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA) têm projetos em
20
desenvolvimento com A. chica (Verlot) para atender o segmento de Fitocosmético
(LASMAR, 2005).
Amaral et al. (2006) encontraram na composição química das folhas de A.
chica (Verlot.), flavonóides, antocianidinas (que, de acordo com Degáspari e
Waszczynskyj (2004), pertencem ao grupo dos flavonóides e tem ação antioxidante
e antiflamatória), taninos e fitoesterois. Dentre os flavonóides (grupo de substâncias
naturais que possuem atividade biológica diversificada), foi verificada a presença de
luteolina que possui capacidade de seqüestrarem radicais livres, demonstrando
potencial antioxidante (PAULETTI; BOLZANI; YOUNG, 2003; SIMÕES, 2003).
O crajirú já foi empregado como antiinflamatório uterino e vaginal,
antianêmico, antihemorrágico e cicatrizante (MENDES, 2002; VEGA, 2001).
Westphal et al. (2007) avaliaram as alterações anatomopatológicas e
histopatológicas da pleura e do parênquima pulmonar de ratos, após a injeção de
óleo de copaíba, extrato aquoso de crajirú e polivinilpirrolidona iodado (PVPI), no
espaço pleural dos ratos. Macroscopicamente observaram que a copaíba mostrou-
se muito irritante, o PVPI moderadamente irritante e o extrato aquoso de crajirú
induziu pouca reação inflamatória. Tal achado é sugestivo de baixa toxicidade do
crajirú.
Estudos mostram que não há toxicidade aguda com aplicação de extratos de
folhas de A. chica (Verlot.), por gavagem, em ratos Wistar machos adultos. Os
autores utilizaram extrato aquoso de A. chica solubilizados em Dimetilsulfóxido
(DMSO). O grupo controle recebeu a mesma quantidade do solvente. O extrato
aquoso de A. chica apresentou-se parcialmente solúvel em DMSO e levemente
alcalino. Após a primeira hora e, nos sete dias seguintes os animais foram
anestesiados e autopsiados. Os grupos que receberam extrato aquoso de A. chica
21
(Verlot.) não apresentaram efeitos tóxicos sobre os órgãos do sistema reprodutor
(VASQUES; CARNEIRO, 2007).
Resultados obtidos com o extrato de A. chica diclorometânico demonstraram
atividade farmacológica contra as leveduras. Com 24 horas, seis cepas ainda
estavam crescendo, enquanto quatro apresentavam sensibilidade; e com 48 horas,
com exceção de duas cepas que foram resistentes, as leveduras foram inibidas por
esse extrato, nas concentrações variando entre 0,0078 a 0,0312 mg/mL. O extrato
metanólico apresentou atividade fungistática, mas não fungicida (ANIBAL, 2007).
Yang et al. (2008) pesquisou o efeito da luteolina em ratos com carcinoma
bucal e verificou que a luteolina tem propriedades anti-tumorais e poderia ser um
agente quimioterapêutico eficaz para o tratamento de carcinoma epidermóide bucal.
2.3 Candida albicans
O gênero Candida engloba leveduras que filamentam em determinadas
condições. Apresenta várias espécies, sendo que as espécies patogênicas para o
homem são: C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. pseudotropicalis, C. krusei, C.
guilliermondii, C. lusitaniae e C. parapsilosis. Candida albicans é a mais estudada.
Essas leveduras, que fazem parte da microbiota normal do homem, são agentes
causais de processos cutâneos e sistêmicos e na maioria das vezes dependem de
fatores predisponentes do hospedeiro para manifestarem patogenicidade
(TRABULSI et al., 2004).
Candida albicans é um fungo Gram positivo, dimórfico apresentando
blastoconídio (leveduras) e formas miceliais (hifas). Faz parte da microbiota bucal
normal em 20% a 60% da população em geral. Em algumas situações, formam
22
estruturas esféricas altamente refringentes chamadas clamidoconídeos, cuja função
exata ainda é desconhecida. Esta estrutura não é encontrada nas leveduras in vivo,
mas são úteis para a identificação laboratorial da espécie (KOGA-ITO; MARTINS;
JORGE, 2006).
Trata-se de levedura com potencial patogênico bastante conhecido,
apresentando como principais fatores de virulência: capacidade de aderência a
diferentes mucosas, epitélios e materiais artificiais, como sondas, látex, cateteres, e
vários tipos de plástico e resina (JORGE et al., 1997; NISENGARD; NEWMAN,
1994), dimorfismo com produção de estruturas filamentosas que auxiliam a invasão
tissular, termotolerância significativa e produção de enzimas como proteinase e
fosfolipase (LACAZ et al., 2004).
A produção de fosfolipase é também um fator importante no processo da
infecção, variando conforme a cepa. Essa enzima é liberada na superfície da
levedura e na extremidade do tubo germinativo, atua na hidrólise de fosfolipídeos,
dando origem a lisofosfolipídeos que causam dano à célula epitelial. Entre as
espécies de Candida, apenas a C. albicans é capaz de produzir fosfolipase (COSTA;
CANDIDO, 2007).
Esta espécie é naturalmente sensível a todas as drogas antifúngicas de uso
sistêmico, mas casos de resistência adquirida a azólicos são conhecidos em
pacientes que foram expostos prolongadamente a estes medicamentos (COLOMBO
et al., 1995; FONSECA, 1980; O’SULLIVAN et al., 2001; RANG, 2004; ZARDO;
MEZZARI, 2004).
Oliveira et al. (1998) isolaram leveduras do gênero Candida em 25 (56,8%)
dos 44 pacientes com câncer internado em enfermarias de Pediatria de Cabeça e
Pescoço. Os testes de identificação comprovaram, pela produção de tubo
23
germinativo, produção de clamidoconídeos e provas de assimilação de hidratos de
carbono, que 24 (96%) eram C. albicans e 1 (4%), C. krusei. Todas as cepas de C.
albicans isoladas apresentaram alto nível de produção de proteinase e fosfolipase.
Os termos candidose e candidíase são utilizados na literatura para denominar
infecção bucal por fungos do gênero Candida, especialmente C. albicans. Alguns
pesquisadores preferem o termo candidose em razão de o sufixo ose ser geralmente
utilizado na determinação de outras infecções fúngicas, como a
paracoccidioidomicose. O sufixo íase é menos aproprido porque geralmente reflete
uma infecção por protozoários, como a giardíase. No entanto, candidíase é ainda um
termo aceito (COLEMAN, 1998).
Com a utilização dos novos anti-retrovirais na terapia de pacientes HIV ( vírus
da imunodeficiência humana) positivos, passou-se a observar uma redução na
ocorrência de infecções oportunistas, porém, para os pacientes de diagnóstico tardio
ou aqueles que não respondem adequadamente à terapêutica anti-retroviral, a
candidose orofaríngea ainda é muito freqüente (TELLES et al., 2001).
Bosco et al. (2003) demonstram em seus estudos que C. albicans predominou
sobre outras espécies de Candida no grupo de crianças de ambos os gêneros com
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA) que recebiam atendimento
ambulatorial, demonstrando uma maior produção de proteinase e fosfolipase quando
comparada com a produção observada no grupo controle (crianças saudáveis com
gênero e idade similares).
O aumento de infecções fúngicas sistêmicas secundárias graves na década
de 70 foi devido ao uso disseminado de antibióticos de amplo espectro, que
eliminam ou reduzem as populações de bactérias não-patogênicas que normalmente
competem com os fungos (YUJRA et al., 2006). Outro fator refere-se ao número
24
crescente de indivíduos com Síndrome de Imunidade Adquirida (SIDA) que
apresentam uma resposta imunológica baixa ou da ação de agentes
imunossupressores ou agentes quimioterápicos, antineoplásicos, levando uma
prevalência de infecções oportunistas (RANG et al., 2004).
Candidose bucal pseudomembranosa, também conhecida popularmente por
sapinho, é comum em crianças recém-nascidas até cinco anos de idade, isto é
potencializado pela imaturidade imunológica, má higiene bucal, falta de higiene com
os utensílios utilizados pelas crianças (SCHERMA et al., 2004).
As drogas antifúngicas podem ser divididas em duas categorias: as que
afetam a membrana celular e as que atuam intracelularmente, interrompendo
processos celulares vitais como síntese do Ácido Desoxirribonucleico (DNA) e o
Ácido Ribonucleico (RNA) ou proteinas. Os fármacos utilizados no tratamento das
candidoses sistêmicas são anfotericina B, anfotericina lipossomal, flucitosina e
fluconazol. Nas candidoses bucais são utilizados azóis, nistatina e fluconazol
(EPSTEIN; SILVERMAN JÚNIOR; FLEISSCHMANN, 2004).
Podemos citar como efeitos adversos: toxicidade renal, hipocalemia,
hipomagnesemia, amenia e outros no caso da anfotericina. Azóis (fluconazol,
itraconazol, cetoconazol e miconazol) e os azóis de uso tópico (clotrimazol,
econazol, tioconazol e sulconazol), flucitosina, terbinafina, equinocandinas
(micafungina em estudos clínicos mostrou ser eficaz contra Aspergillus e Candida
ssp, até mesmo em pacientes imunocomprometidos e a caspofungina mostrou ter
uma ampla atividade contra vários fungos) risco principal do cetoconazol, que é raro
mas pode acontecer, é hepatotoxicidade e pode ser fatal, outros efeitos com outros
azóis são alterações gastrintestinais, elevação das concentrações plasmáticas,
25
náuseas, cefaléia, dor abdominal, lesões cutâneas, tonturas e outros (BENNETT,
2007; BERGOLD; GEORGIADIS, 2004; RANG et al., 2004).
Nikawa et al. (2005), numa revisão de literatura sobre os fatores de virulência,
aderência e persistência de Candida albicans, suspeitam que a colonização e
subseqüente a formação do biofilme oral, que essas superfícies podem estar
servindo de reservatório para outras infecções, como a pneumonia respiratória e
infecção gastrointestinal.
Menezes, Cavalcante e Farias (2005) verificaram por meio de testes
micológicos que 18% das crianças com até cinco anos de uma creche pública de
Fortaleza, apresentavam leveduras do gênero Candida na cavidade bucal, sendo C.
albicans a espécie mais prevalente (45%). Essa também foi a espécie que
apresentou atividade enzimática (proteinase e fosfolipase), porém, com baixa
virulência.
Gordón-Núñez e Pinto (2005) pesquisaram pacientes pediátricos oncológicos
com mielosssupressão, comprometimento do fluxo salivar e injúrias à mucosa,
quanto a instalação de candidose bucal e lesões de mucosite. Concluiram que a
ocorrência de mucosite e a falta de higiene bucal, entre outros fatores, podem
contribuir com a instalação e desenvolvimento de candidose.
Na área odontológica, trabalhos relatam a capacidade de aderência de
Streptococcus mutans e Candida albicans em associação na superfície dental. Além
disso, aderência ao acrílico de próteses dentárias tem sido freqüentemente
investigada (BARBIERI; VICENTE; FRAIZ, 2007).
26
2.4 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE PLANTAS MEDICINAIS
As plantas medicinais produzem uma grande variedade de metabólitos
secundários. Alguns são bem conhecidos como, por exemplo, os flavonóides, fenóis,
glicosídeos fenólicos, lactonas insaturadas, compostos sulfurados, saponinas,
glicosídeos cianogênicos e glucosinolatos (SIMÕES et al., 2003).
Paccola et al. (2001) avaliaram o potencial inibitório de cinco espécies de
cogumelos comestíveis, Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus, Pholiota nameko,
Macrolepiota bonaerensis e Agaricus blazei no crescimento in vitro de Candida
albicans. Apenas a espécie L. edodes apresentou efeito fungistático sobre C.
albicans. O composto fungistático é termossensível e perde sua atividade após 72
horas.
No estudo de Sartoratto et al. (2004) foi investigada a atividade antimicrobiana
contra bactérias e contra a levedura C. albicans, in vitro, dos óleos essenciais de
Mentha piperita, M. spicata, Thymus vulgaris, Origanum vulgare, O. applii, Aloysia
triphylla, Ocimum gratissimum e O. basilicum, plantas aromáticas usadas no Brasil.
Apenas A. tryphila e M. piperita foram capazes de inibir Candida albicans.
Babayi et al. (2004) testaram in vitro a atividade antimicrobiana de extratos
hidroalcoólicos das folhas do Eucalyptus camaldulensis e Terminalia catappa, pelo
método de diluição em ágar. Os extratos brutos apresentavam saponina, saponina
de glicosídeos, esteróide, glicosídeo cardíaco, tanino, óleos temporários de fenóis e
bálsamo. Candida albicans foi inibida pelo extrato bruto de E. camaldulensis em
baixas concentrações. Após a cromatografia as frações do extrato de T. catappa
foram mais ativas sobre C. albicans que os extratos brutos. A concentração inibitória
mínima (CIM) dos extratos variou de 1,25 a 5 mg/mL.
27
Araújo et al. (2005) num estudo comparativo, avalairam in vitro a ação
antifúngica do extrato da casca do Anarcardium occidentale linn (caju) sobre
leveduras do gênero Candida. A CIM foi determinada pelo método de difusão em
ágar. A CIMs para o extrato da casca do caju foram 1:8 com halos de inibição que
variaram de 12 a 18 mm e para clorexidina (controle) foi de 1:16 com halos de
inibição que variaram de 11 a 22 mm. Os resultados demonstraram a viabilidade da
terapia alternativa.
Vasconcelos et al. (2006) testaram o gel obtido da Punica granatum Linn.
(romã) e o agente antifúngico miconazol (Daktarin® gel oral) para verificar
concentração inibitória mínima de aderência (CIMA) de três linhagens de
estreptococos (S. mutans ATCC 25175, S. sanguis ATCC 10557 e S. mitis ATCC
9811), S. mutans isolado clinicamente e de cepas de Candida albicans,
separadamente ou associadas. O gel da romã apresentou maior eficácia sobre
associações de três e quatro microrganismos do que o gel do miconazol. Os
achados deste estudo sugerem o emprego desse agente fitoterápico pode ser uma
opção no controle da aderência dos microrganismos testados na cavidade bucal.
Reddy et al. (2007) fizeram um relatório citando os efeitos antioxidantes,
antiplasmódico, antimicrobiano do suco de romã por ser rico em tanino. Os
resultados sugerem um efeito benéfico da ingestão diária de suco de romã como
suplemento dietético para aumentar o sistema imunológico em humanos devido a
ação antioxidantes, antimaláricos e antimicrobianos desse fruto.
Duarte (2006) pesquisou a atividade antimicrobiana de oitenta espécies de
plantas aromáticas, da Coleção de Plantas Medicinais e Aromáticas do Centro
Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas Biológicas e Agrícolas da Universidade de
Campinas, contra diversas bactérias patogênicas e C. albicans. Os autores
28
encontraram que 11 das oitenta espécies apresentaram capacidade de controlar o
crescimento de uma ou mais espécies de microrganismos, mostrando bom potencial
de aplicação medicinal antimicrobiana com inibições importantes, como a observada
para Allium tuberosum sobre C. albicans (MIC de 0,03 mg/mL).
Antunes et al. (2006) testaram a atividade antimicrobiana por meio da
determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de fitoconstituintes de Ocotea
duckei Vattimo contra fungos leveduriformes e os resultados obtidos estimulam o
aprofundamento dos estudos para algumas dessas substâncias, entre elas, as
imidas, que demonstraram atividade antifúngica para C. albicans.
Stefanello et al. (2006) estudaram a atividade antimicrobiana de extratos de
Gochnatia polymorpha ssp. floccosa. Folhas, cascas do tronco e ramos foram
extraídos com hexano, diclorometano e etanol, sucessivamente, sendo obtidos os
respectivos extratos brutos. A atividade antimicrobiana foi determinada pelo método
de difusão em ágar utilizando-se bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e
fungos. O extrato mais ativo foi o das cascas em diclorometano, que inibiu
significativamente o crescimento de quase todas as bactérias Gram-positivas
testadas e do fungo C. albicans. Assim, os resultados obtidos encorajam a
realização de novos estudos com esta espécie vegetal para se determinar quais as
substâncias presentes nos extratos que contribuem para a atividade biológica, como
também para entender seu mecanismo de ação e avaliar sua toxicidade, visando
uma possível aplicação terapêutica.
Oliveira et al. (2007) verificaram a interferência do óleo essencial de
Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng sobre a atividade anti-Candida dos
antifúngicos itraconazol, cetoconazol e anfotericina B utilizados clinicamente.
Verificaram que o óleo essencial de P. amboinicus apresentou potencialidade para
29
interferir na eficácia anti-Candida destes antifúngicos. Pelo motivo exposto, o uso
comitantemente de plantas medicinais e/ou seus derivados com drogas
industrializadas podem interferir no tratamento de muitas doenças, particularmente,
doenças microbianas.
Packer e Luz (2007) utilizando óleos de copaíba, alecrim, melaleuca, alho,
andiroba, propólis, dois ingredientes de origem natural extraídos de folhas de oliva e
o farnesol, mostraram que todos tiveram atividade bacteriostática e fungistática
principalmente contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa e C. albicans.
Botelho et al. (2007) testaram a atividade antibacteriana e antifúngica do óleo
essencial de Lippia sidoides, vulgo alecrim pimenta, e seus componente fenólicos,
timol e carvacrol, que apresentaram bons resultados contra bactérias cariogênicas,
bem como contra Candida albicans.
Nogueira, Diniz e Lima (2008) estudaram e avaliaram a atividade
antibacteriana e antifúngica in vitro dos extratos e/ou óleos essenciais em otite
externa aguda, obtidos das seguintes plantas medicinais: macassá, barbatimão,
cravo-da-índia, capim-santo, camomila, hortelã da folha grossa e arruda contra
Staphylococcus aureus em dez culturas, Pseudomonas aeruginosa em oito,
Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, em associação, em cinco
culturas e Candida albicans e Candida krusei em quatro culturas. P. aeruginosa foi
resistente a todos os extratos e óleos essenciais testados. O óleo essencial de
C. aromaticus e de M. chamomila a 4% inibiu o crescimento de três cepas de S.
aureus e todas as cepas de Candida, sendo esta atividade obtida até a
concentração de 1%, o óleo essencial de R. graveolens a 4% inibiu as cepas de
Candida e quatro cepas de S. aureus e o extrato de P. amboinicus apresentou
30
atividade inibitória sobre sete cepas de S. aureus, com resistência do gênero
Candida.
Sun e Lee (2008) isolaram saponinas de ginseng vermelho coreano e
comprovaram seu efeito antifúngico. Embora o mecanismo exato de ação não tenha
sido totalmente esclarecido, os resultados da pesquisa indicaram que o efeito deva
ser sobre a membrana plasmática.
31
3 PROPOSIÇÃO
O presente trabalho teve por finalidade avaliar a atividade inibitória in vitro
de extratos de Arrabidaea chica (Verlot.), autoclavados e filtrados, sobre Candida
albicans e determinar por cromatografia de camada delgada o número de
componentes dos extratos.
32
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 COLETA, IDENTIFICAÇÃO E PREPARO DO MATERIAL VEGETAL
Folhas de Arrabidaea chica (Verlot.), da região (Porto Velho, RO, Brasil),
foram coletadas e selecionadas em junho (estação de seca) pela manhã, no campo
experimental, controlado pela Unidade de Plantas Medicinais da Casa de Saúde
Santa Marcelina e identificado pela zootecnista, mestre em botânica e curadora do
Herbário da Faculdade São Lucas (Porto-Velho, RO, Brasil), Ana Cristina Ramos de
Souza, com depósito de exsicata no Herbário Dr. Ary Tupinambá Penna Pinheiro da
Faculdade São Lucas. Arrabidaea chica (Verlot), nome vulgar: crajirú - Nº registro
herbário: 5159 (Porto Velho-RO, BR).
Foram utilizadas apenas as folhas coletadas de plantas adultas. As folhas
verdes em boas condições físicas (Figura 2) passaram por higienização com água
potável e foram secas em duas etapas:
9 1ª etapa - as folhas foram secas em sala com ar-condicionado com
desumidificador embutido (Carrier, Miraggio, São Paulo, SP, BR), com temperatura
de 21 ºC por 24 h;
9 2ª etapa - as folhas foram para a estufa de secagem a 40 ºC até a
completa desidratação e mudança de cor para vermelho-escuro (Figura 3) e então
acondicionada em sacos de plástico e mantidas em condições ambientais até
utilização. As folhas foram rasuradas e moídas (liquidificador industrial Metvisa LP-
L.1,5, Metalúrgica VISA, Brusque, SC, BR). O pó recolhido (peneira de aço
inoxidável de malha 80) foi de aproximadamente 1000 g do material vegetal de A.
chica (Verlot.).
33
O material foi devidamente etiquetado e imediatamente embalado em
recipiente de vidro âmbar esterilizado, com dessecante de sílica para controle da
umidade e lacrado até o início do procedimento.
4.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DE Arrabidaea chica (Verlot)
4.2.1 Extrato hidroalcoólico
O extrato hidroalcoólico foi obtido no laboratório de microbiologia da
Universidade de Taubaté (Taubaté, SP, BR) por percolação, processo também
denominado de lixiviação ou descolação.
Para formulação do extrato foram pesados 400 g do pó de A. chica (Verlot.),
umedecido com 400 mL de álcool etílico de cereais a 70% que ficaram em repouso
até a percolação.
Figura 2 - Folha verde de
Arrabidaea chica (Verlot.)
Figura 3 - Folha seca de
Arrabidaea chica (Verlot.)
34
O macerado foi transferido para o percolador (Permution, Curitiba, PR) e a ele
acrescentado volume de solvente (álcool etílico de cereais a 70%) suficiente para
preencher o percolador. O macerado foi então deixado por algumas horas para a
absorção completa do solvente. A torneira, na parte inferior do percolador, foi aberta
em velocidade moderada (aproximadamente vinte gotas/minuto) iniciando-se por
gravidade o processo de extração.
Em vidro âmbar esterilizado foram separados 340 mL do extrato (primeira
fase do extrato que corresponde a 85% do volume final). O processo de percolação
continuou por 12 dias, adicionando-se solvente suficiente para promover um
abastecimento contínuo do sistema.
O volume gerado nesta fase da percolação foi enviado para o laboratório de
farmacognosia da Faculdade de Pindamonhangaba (Pindamonhangaba, SP, BR),
onde foi concentrado sob vácuo e temperatura de 41 ºC, em evaporador rotativo
(QUIMIS, Curitiba, PR, BR), até a redução do volume. O volume da primeira fase
(340 mL) mais o volume da segunda fase da rotaevaporação foram unidos e feito o
ajuste do volume para 400 mL em banho maria (Hipperquímica, São Caetano do Sul,
SP) em temperatura de 40 ºC, obtendo-se assim um extrato com concentração de
100% ou 1:1.
Depois de confirmada a ausência de álcool no extrato, por meio de
alcoômetro (Incoterm), o extrato foi devidamente etiquetado, armazenado em frasco
de vidro âmbar, vedado com batoque e tampa de rosca, em local com temperatura
controlada, longe do calor e de luz solar direta, aguardando a próxima etapa do
processo (FARMACOPÉIA HOMEOPÁTICA BRASILEIRA, 1976 modificada;
LADEIRA, 2002; PRISTA, 1995).
35
4.2.2 Extrato aquoso
Em um béquer esterilizado foram colocados 300 g de pó de A. chica (Verlot.)
com 300 ml de água fervente. Esta mistura ficou em maceração durante três horas.
Após este período, o macerado foi colocado no percolador (Permution, Curitiba, PR),
e a ele acrescentado 600 ml de água fervente. A torneira, na parte inferior do
percolador, foi aberta em velocidade moderada (aproximadamente vinte
gotas/minuto). Iniciou-se por gravidade o processo de extração até obtenção de 300
ml do extrato (SILVA, 1926).
Esse procedimento foi realizado no laboratório de Microbiologia da
Universidade de Taubaté (Taubaté, SP, BR).
4.3 CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA
A cromatografia de camada delgada foi realizada no laboratório de
fotoquímica da Faculdade São Lucas (Porto Velho, RO, BR). Pequenas gotas dos
extratos autoclavados hidroalcoólico e aquoso foram aplicadas em um ponto próximo
ao extremo inferior de uma placa de vidro cromatográfica (5 x 20 cm) coberta com
camada fina de sílica gel (60G–254, 5-40 µm) (fase estacionária). Depois de seca
(temperatura ambiente) a placa foi colocada em um recipiente contendo uma mistura
de clorofórmio: metanol, na proporção de 95:5, v/v (fase móvel), solvente de média
polaridade.
Como somente a base da placa fica submersa, a fase móvel (solvente) molha
a fase estacionária (placa) e o solvente sobe por capilaridade, o solvente arrasta
36
mais os compostos menos adsorvidos na fase estacionária, separando-os dos mais
adsorvidos.
Depois de corrida a placa cromatográfica, as manchas foram reveladas em
câmara de iodo (DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998; FIESER,1967).
Figura 4 - Fases da Cromatografia em Camada Delgada
4.4 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
A concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos hidroalcoólico e aquoso
de folhas de Arrabidaea chica (Verlot.) foi determinada utilizando-se o método de
diluição em ágar (OPLUSTIL, 2000). Foram preparadas séries de placas contendo
concentrações de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1%, 0,5% e 0,25 % de
cada extrato. Todos os experimentos foram realizados em duplicata.
37
4.4.1 Preparo dos meios de cultura contendo extratos de Arrabidaea chica
(Verlot.)
Foram adicionados aos tubos de ensaio (18 x 180 mm) 1,3 g de ágar
Sabouraud dextrose (OXOID, Basingstoke, Hampshire, England), água destilada e
extrato hidroalcoólico e aquoso nas proporções necessárias para atingir as
concentrações desejadas em 20 mL (Figura 5).
Este procedimento foi realizado em duplicata, totalizando quarenta tubos
para cada extrato. Para controle positivo foi preparado um tubo com 1,3 g de ágar
Sabouraud e 20 mL de água destilada e para o controle negativo foi preparado um
tubo com 1,3 g de ágar Sabouraud e 20 mL de água destilada Anfotericina B na
concentração de 2 µg/mL.
Os vinte tubos de ensaio contendo os meios foram esterilizados em autoclave
a 121 ºC por quinze minutos e outros vinte tubos de ensaio contendo os extratos
foram esterilizados por filtração em membrana de éster celulose de 0,45 µm
(Millipore, São Paulo, SP) e vertidos, assepticamente, em placas de Petri (Figuras 5
e 6).
38
Figura 5 - Preparo dos meios de cultura adicionados de extratos de A. chica (Verlot) em
diversas concentrações
Figura 6 - Processo de filtração dos extratos
39
4.5 PREPARO DAS SUSPENSÕES DE Candida albicans
Foram testadas vinte e quatro cepas de Candida albicans, isoladas da
cavidade bucal em experimentos anteriores e mantidas na coleção de culturas do
Laboratório de Microbiologia da Universidade de Taubaté (CCUT) e uma cepa
padrão (ATCC 18804) adquirida da American Type Culture Collection (Quadro 1).
Quadro 1 – Código e procedência das cepas de Candida albicans testadas
Código Procedência
ATCC 18804 American Type Culture Collection
CCUT
91001, 91002, 91003, 91004,
91005, 91006, 91007, 91008,
91010, 91011, 91012, 91013,
91014, 91015
Enxague bucal de pacientes com periodontite crônica
CCUT
91030, 91031, 91032, 91033,
91034, 91035, 91036, 91037,
91038, 91039
Enxague bucal de pacientes com neoplasia na cavidade
bucal
ATCC: Americam Type Culture Collection; CCUT: Coleção de Culturas da Universidade de Taubaté
As cepas foram semeadas em ágar Sabouraud e incubadas por 24 h a 37 °C.
Após o período de incubação, para cada cepa foi preparada uma suspensão em 10
mL de solução NaCl 0,9 % esterilizada contendo 10
6
células por mL (contagem em
câmara de Newbauer).
40
4.6 SEMEADURA, INCUBAÇÃO E LEITURA
Cem microlitros de cada suspensão de C. albicans foram transferidos para os
orifícios do replicador de Steers e com o auxílio do mesmo, semeados em placas de
Petri contendo ágar Sabouraud adicionado das várias concentrações dos extratos
hidroalcoólicos filtrado, extratos hidroalcoólicos autoclavado, extratos aquosos
filtrado e extratos aquosos autoclavado (Figura 7).
As placas foram incubadas a 37 ºC por 24 h. A leitura das placas foi realizada
após 24 h (Figura 8), pela observação da presença ou ausência de crescimento de
colônias na superfície do ágar (OPLUSTIL et al., 2000; SLOTS; RAMS, 1991).
Figura 7 - A: suspensão de C. albicans transferida para um orifício do replicador
de Steers e B: semeadura
A
B
41
B
Figura 8 – A: controle positivo e B: controle negativo, após incubação
por 24 h/ 37 ºC.
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados experimentais foram ordenados para estudo estatístico descritivo,
empregando análise de freqüência absoluta, acumulada e percentual acumulado.
B A
42
5 RESULTADOS
5.1 CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA
Todas as cepas de C. albicans testadas cresceram no controle positivo e
foram inibidas no controle negativo.
A concentração inibitória mínima (CIM) do extrato hidroalcoólico tanto o
filtrado quanto o submetido à esterilização pelo calor úmido (autoclave), sobre as
cepas de C. albicans foi de 20%, com CIM 50 e CIM 90 também de 20%. Na Tabela
1 podem ser observadas as freqüências da CIM absoluta e acumulada e o
percentual acumulado.
Tabela 1 - Freqüência da concentração inibitória mínima (CIM) de Candida albicans para o
extrato hidroalcoólico esterilizado por filtração e em autoclave
Candida albicans
CIM (%) Freqüência absoluta Freqüência acumulada % acumulado
10 2 2 8
20 23 25 100
O extrato aquoso filtrado não apresentou efeito inibitório sobre os
microrganismos testados até a concentração de 50%. A CIM do extrato aquoso
autoclavado foi de 30% para vinte e uma cepas (84%) de C. albicans, com CIM 50
também de 30%.
Até a concentração de 50% não houve inibição de 90% das amostras
testadas (CIM 90). As cepas resistentes a este extrato foram CCUT 91005, CCUT
91011, CCUT 91032 e CCUT 91037. A Tabela 2 apresenta as freqüências da CIM
absoluta e acumulada e o percentual acumulado para o extrato aquoso autoclavado.
43
Tabela 2 - Freqüência da Concentração Inibitória Mínima (CIM) de Candida albicans para o
extrato aquoso autoclavado
Candida albicans
CIM (%) Freqüência absoluta Freqüência acumulada % acumulado
20 5 5 20
30 16 21 84
A Figura 9 apresenta a atividade antifúngica exercida pela A. chica (Verlot.)
sobre C. albicans, considerando a CIM para cada extrato testado.
Figura 9 - Gráfico da concentração inibitória mínima (CIM) para os extratos hidroalcoólico e
aquosos filtrados e autoclavados
0,25
0,5
1
2,5
5
10
20
30
40
50
Aquoso Filtrado
Aquoso Autoclavado
Alcóolico Filtrado
Alcóolico Autoclavado
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Inibição (%)
Concentração (%)
Aquoso Filtrado Aquoso Autoclavado Alcóolico Filtrado Alcóolico Autoclavado
44
5.2 CROMATOGRAFIA DE CAMADA DELGADA
Foram detectadas sete manchas no extrato hidroalcoólico e duas no extrato
aquoso. Cada mancha corresponde a um componente, para o qual a relação de
retenção (Rf) foi calculada (Tabela 3).
Tabela 3 – Relação de retenção (Rf) para o extrato
hidroalcoólico e aquoso de Arrabidaea chica (Verlot.)
extrato hidroalcoólico extrato aquoso
Rf
1
= 0,90 ---------------------
Rf
2
= 0,57 Rf
1
= 0,57
Rf
3
= 0,35 Rf
2
= 0,34
Rf
4
= 0,28 ---------------------
Rf
5
= 0,18 ----------------------
Rf
6
= 0,11 ---------------------
Rf
7
= 0,076 ---------------------
Rf : relação de fluxo ou relação de retenção (Rf
= d
c
/ d
s,
onde: d
c
= distância percorrida pelo
componentes da mistura e d
s
= distância percorrida pelo eluente)
A reprodutibilidade dos compostos da extração com a mistura de clorofórmio :
metanol, na proporção de 95:5 (v/v), constatando-se o número dos constituintes
majoritários nos extratos hidroalcoólico (A) e aquoso (B) autoclavados, podem ser
observada na Figura 10.
45
Ponto de aplicação dos extratos
Rf
1
= 0,57
Rf
2
= 0,34
Rf
1
= 0,90
Rf
2
= 0,57
Rf
3
= 0,35
Rf
4.
= 0,28
Rf
5
= 0,18
Rf
6
= 0,11
Rf
7
= 0,076
Ponto de aplicação dos extratos
Rf
1
= 0,57
Rf
Rf
1
= 0,90
Rf
2
= 0,57
Rf
3
= 0,35
Rf
4.
= 0,28
Rf
5
= 0,18
Rf
6
= 0,11
Rf
7
= 0,076
Figura 10 - Cromatografia em Camada Delgada dos extratos hidroalcoólico (A) e aquoso (B)
A coloração das manchas, observadas à luz natural e depois de reveladas na
câmara de iodo, está na Tabela 4.
Tabela 4 - Coloração das manchas dos extratos hidroalcoólico e aquoso, após cromatografia
de camada delgada, observadas à luz natural e depois de reveladas na câmara de iodo
Extrato hidroalcoólico Extrato aquoso
Manchas
Luz natural Câmara de iodo Luz natural Câmara de iodo
1 Verde Verde escuro Bege claro Bege
2 Bege claro Marrom Bege claro Bege
3 Bege esverdeado Verde claro
4 Bege claro Marrom
5 Verde claro Verde
6 Verde Verde escuro
7 Marrom escuro Marrom avermelhado
46
6 DISCUSSÃO
Profissionais da área de saúde têm procurado refletir sobre ações e
ferramentas que possam ser usadas com vistas à promoção e manutenção da saúde
primária e, conseqüentemente, uma melhor qualidade de vida.
O mundo tem voltado cada vez mais os olhos para a busca de plantas
medicinais e/ou seus derivados como agentes terapêuticos naturais. Entretanto,
pesquisas neste segmento ainda são mais difundidas na área médica do que
odontológica.
O estímulo ao uso de fitoterápicos tem como objetivos prevenir, curar ou
minimizar sintomas das doenças, com um custo mais acessível à população, pois os
medicamentos obtidos por síntese química são, em geral, mais caros devido às
patentes tecnológicas.
Produtos naturais podem ser tão eficientes quanto os produzidos pela síntese
química, contudo, são necessários estudos prévios relativos a aspectos
fotoquímicos, farmacológicos e toxicológicos (TOLEDO et al., 2003).
No Brasil, o interesse por pesquisas com fitoterápicos tem sido constatado
pelo aumento de trabalhos publicados em congressos científicos, periódicos
nacionais e internacionais e também pelo surgimento de várias linhas de pesquisa
em programas Strito Sensu de muitas universidades. No entanto, muitos estudos
ainda são preliminares e sem critério científico.
Quando se procura obter substâncias ativas de plantas, um dos principais
aspectos que deve ser observado consiste nas informações da medicina popular.
Dados da literatura revelam que é muito mais provável encontrar atividade biológica
47
em plantas orientadas pelo seu uso na medicina popular do que em plantas
escolhidas ao acaso (CALIXTO, 2001; MONTELLANO, 1975).
A observação do uso popular da Arrabidaea chica (Verlot.) pela comunidade
(urbana e rural) e alguns profissionais da saúde (médicos, enfermeiras, agentes de
saúde, dentistas), moradores da região norte, especificamente Porto Velho (RO),
onde a planta é rotineiramente utilizada, principalmente na forma de “banho de
assento”, por mulheres com problemas ginecológicos (“corrimentos”) e, o
conhecimento de que muitos destes “corrimentos” podem estar relacionados com
candidoses vaginais, cujo principal agente etiológico são leveduras do gênero
Candida, principalmente Candida albicans, despertou interesse em avaliar a
atividade inibitória desta planta sobre C. albicans.
Porto Velho faz parte da Amazônia Ocidental, onde o clima, extremamente
úmido e quente em relação a outras regíon do Brasil, associado às baixas condições
sócio-culturais, financeiras e má higiene, predispõe a ocorrência de candidose.
O aumento da aplicação clínica dos antifúngicos, principalmente em
indivíduos com neoplasias, diabetes melitus, síndrome da imunodeficiência adquirida
e receptores de transplantes, tem aumentado os relatos de resistência in vivo e in
vitro das espécies de Candida (BARKER; ROGERS, 2006).
Neste trabalho, a atividade inibitória de A. chica foi determinada pelo método
de diluição em ágar, que permite definir a menor concentração de uma droga capaz
de inibir o crescimento do microrganismo em estudo (SHEEHAN et al., 1993;
ZACCHINO, 2001).
O método de diluição em ágar consiste na diluição do extrato em meio de
cultivo solidificado. Este é realizado em placas que contêm, cada uma, diferentes
48
concentrações do extrato, onde se inocula o microrganismo. Este método fornece
resultado quantitativo da atividade do extrato (ALVES; CURY, 1992).
Extratos fluidos se caracterizam como preparações líquidas obtidas por
métodos diferenciados e normalmente são misturas hidroalcóolicas em que 1 ml de
extrato contém os constituintes ativos correspondentes a 1 g da droga (TOLEDO et
al., 2003).
No presente estudo optou-se pela mistura etanol:água (70:30 v/v) como
solvente de A. chica, por ser um solvente amplamente utilizado no preparo de
extrato hidroalcoólico (ANDRADE, 1997; PAES, 2004; SANTOS, 1997; ZORN et al.,
2001). Este solvente, a partir de diferentes proporções (etanol:água) é eficiente para
a extração bruta de taninos e saponinas (FALKERNBEG et al., 2002).
Neste experimento, a atividade fungistática, sobre C. albicans, do extrato
hidroalcoólico de A. chica, foi obtida na concentração 20% (200 mg/mL).
Anibal (2007) obteve CIM entre 0,0078 a 0,0312 mg/mL com extrato
diclorometânico (mais apolar) sobre leveduras do gênero Candida e todas as
leveduras foram resistentes as concentrações de extrato metanólico (polar) testadas.
A escolha do extrato aquoso baseou-se na aplicação popular. Entretanto, uma
desvantagem do extrato aquoso é que
deve ser preparado para uso imediato, em
virtude de sua suscetibilidade à degradação (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998).
Além disso, de acordo com Simões et al. (2003), a comprovação da atividade
antimicrobiana in vitro de plantas medicinais em forma de chá ou extratos aquosos
pode ser dificultada por se tratar de misturas complexas e indefinidas de princípios
ativos e substâncias secundarias que, além de variarem constantemente sua
composição, podem se potencializar ou antagonizar.
49
A partir da metodologia proposta, 84% das leveduras testadas foram inibidas
pelo extrato aquoso autoclavado a 30% enquanto o extrato filtrado não foi capaz de
inibir as cepas de C. albicans até a concentração de 50%.
Esta diferença nos resultados entre o extrato aquoso autoclavado e filtrado
pode ter decorrido da apreensão de partículas ativas importantes durante o processo
de filtração, devido à formação de uma densa massa sobre a membrana filtrante, o
que gerou a necessidade do uso de um grande número de membranas durante este
procedimento. Essa hipótese não pôde ser verificada pela cromatografia devido à
perda de grande quantidade do extrato aquoso durante o processo de filtração.
A menor concentração inibitória obtida com o extrato hidroalcoólico quando
comparado ao extrato aquoso talvez possa ser explicada pelo resultado da
cromatografia de camada delgada, onde o extrato hidroalcoólico apresentou maior
número de componentes que o extrato aquoso, pois o etanol, por ser menos polar
que a água, consegue ser um solvente mais adequado (GONÇALVES; WAL;
ALMEIDA, 1988).
Até o momento não foram encontrados trabalhos que abordassem a atividade
antifúngica de extratos aquosos de A. chica, com metodologia similar ou não, para
que pudesse ser realizada uma discussão mais abrangente.
Anfotericina B (2 µg/ml) foi o antifúngico de escolha para o controle negativo
(inibição das cepas testadas), pois a ocorrência de resistência com este antifúngico
não é freqüente nas espécies de Candida e a também por apresentar concentração
inibitória mínima (CIM) em geral baixa (média de 0,5 µg/ml para C. albicans) (AL-
FATTANI; DOUGLAS, 2006).
Anfotericina B é um derivado poliênico que tem afinidade pelo ergosterol,
principal esterol da membrana citoplasmática dos fungos. Depois de ligados, alteram
50
a permeabilidade seletiva da membrana citoplasmática por formarem poros
permeáveis à saída de água e pequenas moléculas (íons potássio e magnésio) e
induzem reações oxidativas, provocando a morte da célula fúngica (FERRARI;
HAMDAN, 2001).
A Cromatografia de Camada Delgada (CCD) é uma técnica onde ocorre
retenção das substâncias devido a adsorção sofrida na superfície da fase
estacionária (sólido). Durante este processo, as substâncias menos polares,
presentes no extrato (líquido), avançam mais rapidamente que as substâncias mais
polares, quando o solvente é uma mistura de média polaridade, como é o caso da
mistura de clorofórmio:metanol (95:5 v/v) e a fase estacionária (silica gel) é mais
polar como o utilizado nesta pesquisa. Essa diferença na velocidade resulta em
uma separação dos componentes do extrato, onde cada mancha na placa (sólido)
corresponde a um componente (DEGANI; CASS; VIEIRA, 1998).
Neste trabalho foram separados por CCD sete componentes no extrato
hidroalcoólico que apresentaram coloração marrom avermelhado, marron e verde
em diferentes tonalidades, e dois no extrato aquoso, de coloração bege. Esta
coloração foi obtida, em placas de sílica gel, após a utilização de revelador de iodo.
Zorn et al. (2001), utilizando CCD e um solvente ácido, isolaram quatro
componentes, sendo dois de coloração amarelo-alaranjado, e dois vermelhos. Estas
colorações foram verificadas em placas de celulose sem adição de reagente.
Amaral et al. (2006) por CCD, confirmaram a presença de luteolina, entre
vários outros flavonóides, em extrato etanólico e de diclorometano das folhas de A.
chica, através da relação de retenção (Rf), parâmetro freqüentemente usado em
cromatografia de camada delgada, Entretanto o Rf obtido não é citado no trabalho.
51
Rf é definido como a razão entre a distância percorrida pela mancha (banda)
do componente e a distância percorrida pelo eluente (DEGANI; CASS; VIEIRA,
1998).
Considerando a polaridade das substâncias e do eluente utilizado nesta
pesquisa, é possível que os Rf
5,
Rf
6
e Rf
7
, do extrato hidroalcoólico sejam polifenóis
(taninos, flavonóides) ou saponinas, pois são os componentes mais polares, e os e
Rf
1
e
Rf
2
do extrato aquoso e os Rf
1
, Rf
2
e
Rf
3
,
do extrato hidroalcoólico, sejam
alcalóides, por serem menos polares.
Dois Rf do extrato hidroalcoólico foram semelhantes aos obtidas no extrato
aquoso (Rf
3
= 0,35 e Rf
2
= 0,34, Rf
2
= 0,57 e Rf
1
= 0,57), todos na faixa (Rf) de
componentes menos polares. Comparando a atividade antifúngica dos extratos,
observamos que estes componentes sozinhos não devem ser os responsáveis pela
total potência antifúngica ou ainda, que estes componentes estejam em menor
quantidade, visto que o extrato aquoso não foi capaz de inibir todas as cepas de
Candida.
Pesquisadores encontraram na composição química das folhas de crajirú,
flavonóides (luteolina), saponinas, taninos, antocianidinas e fitoesterois (ANDRADE,
1997; KALIL FILHO; KALIL; LUZ, 2000; PAES, 2004; SANTOS, 1997; ZORN et al.,
2001).
O mecanismo de ação antimicrobiana dos taninos pode ser explicado por três
hipóteses. A primeira pressupõe que os taninos inibam enzimas bacterianas e
fúngicas pela união com os substratos dessas enzimas; a segunda seria por ação
sobre a membrana celular dos microrganismos, modificando seu metabolismo e a
terceira fundamenta-se na complexão dos taninos com íons metálicos, diminuindo a
52
disponibilidade de íons essenciais para o metabolismo microbiano (CUNHA, 2005;
SCALBERT, 1991).
De acordo com Passos et al. (2002), a ação antifúngica apresentada pela
fração em acetato de etila do extrato bruto etanólico da Caryocar brasiliensis Camb
(Caryocaraceae), que produz o fruto conhecido como pequi, está na sua composição
química majoritariamente composta de taninos condensados (monômeros, dímeros
e trímeros), flavonóides glicosilados e taninos hidrolisáveis.
Além da atividade antifúngica averiguada na A. chica, sabemos que a
presença de flavonóides e taninos como antioxidantes podem melhorar a imunidade,
diminuindo a inflamação (REDDY et al., 2007; SIMÕES et al., 2003) o que pode
colaborar com a normalização das microbiotas vaginal e bucal.
Outras atividades biológicas dos flavonóides são: induzir o interferon
(atividade antiviral), inibir a atividade da tirosina quinase dos produtos oncogênicos,
inibindo assim a proliferação celular anormal (CUNHA,
2005).
Na procura por princípios ativos, não interessa o composto mais fácil de
separar, ou aquele que se encontra em maior concentração, ou ainda, aquele que
possui a estrutura mais complexa. O que realmente interessa é descobrir compostos
que apresentem atividade biológica (CALIXTO, 2003).
Outros trabalhos devem ser realizados para que os compostos, fracionados
por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) sejam testados, isoladamente e
ou em associações, para maior compreensão da atividade da A. chica (Verlot.) sobre
C. albicans.
53
7 CONCLUSÕES
A partir dos resultados do presente trabalho, podemos concluir que:
- Os extratos hidroalcoólicos autoclavados ou filtrados e o extrato aquoso
autoclavado apresentaram atividade sobre Candida albicans;
- Os extratos hidroalcoólicos apresentaram desempenho superior, inibindo
todas as cepas testadas em menor concentração;
- O extrato hidroalcoólico apresentou número superior de componentes em
cromatografia de camada delgada.
54
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